CN103937883A - 检测细菌对氟苯尼考耐药性的lamp方法 - Google Patents

Abstract

本发明根据细菌氟苯尼考耐药性floR基因的序列设计了相应的LAMP引物组，包括外引物对F3和B3、内引物对FIP和BIP，通过材料准备、LAMP引物设计与合成、细菌质粒DNA提取、LAMP反应体系优化等一些列研究工作，发明人建立了检测细菌对氟苯尼考耐药性的LAMP方法。对于未知样品，只需检测其floR基因扩增浊度值达到0.1的时间值，即可判定样品菌对氟苯尼考的耐药性。特异性检测和敏感性检测结果证实，该法特异性扩增细菌的氟苯尼考耐药基因floR灵敏度高，是传统PCR方法的100倍，并可实时监测反应和定量检测出floR基因的拷贝数，快速准确地获得检测结果，为快速检测细菌对氟苯尼考的耐药性带来便利。

Description

检测细菌对氟苯尼考耐药性的LAMP方法

技术领域

本发明属于微生物检测技术领域，尤其涉及一种检测细菌对氟苯尼考耐药性（floR基因）的LAMP方法。 

背景技术

氟苯尼考(Florfenicol，FF)是氯霉素的氟化衍生物，又名氟甲砜霉素，是由美国先灵葆雅公司的Nagabhushan研制的，主要用于治疗动物细菌性疾病的一种抗菌药物。氟苯尼考的抗菌机理主要是与细菌70S核蛋白体的50S亚基上的A位结合，阻碍肽酰基转移酶的转肽反应，抑制肽链的延伸，从而抑制细菌蛋白质的合成。氟苯尼考因其具有抗菌谱广、吸收良好、体内分布广以及无潜在再生障碍性贫血的副作用等优点，在兽医临床上广泛用于预防和治疗动物细菌性疾病。氟苯尼考在1990年首次在日本上市；1993年挪威批准该药可用于治疗鲑的疖病；1995年法国、英国、奥地利、墨西哥及西班牙批准用于治疗牛呼吸系统细菌性疾病；2000年我国通过了该药的审批，系国家二类新兽药，用于畜禽及水生动物的全身感染的治疗，对呼吸系统感染和肠道感染疗效显著。然而，氟苯尼考的长期和不当使用已导致严重的耐药问题。相关调查研究表明，细菌的耐药机制越来越复杂，细菌产生耐药性的速率远远超过新药研发使用的速率，抗生素的持续不当使用将有可能导致无药可用的局面。因此，对氟苯尼考耐药性的持续监测以及近一步深入研究氟苯尼考耐药的产生机制和传播机制，将为临床上科学使用氟苯尼考、减缓耐药菌的产生提供有价值的参考。 

目前，细菌对氟苯尼考的耐药性判定方法有以下两种：一是测定氟苯尼考对菌株的MIC值，依据该值的大小进行判定；二是进行体外药物敏感试验测定抑菌圈大小来判定。这两种检测方法都要消耗大量的实验耗材和进行繁琐的实验操作，费时费力，试验结果主要是通过肉眼观察来判定，增加了人为因素。 

细菌氟苯尼考耐药基因floR编码的蛋白是一种外输泵蛋白，能特异性的将细菌体内的氟苯尼考泵出体外，导致氟苯尼考无法发挥其抑制细菌蛋白质合成的功能，失去其抑制或杀灭细菌的作用。目前对细菌氟苯尼考耐药基因floR检测使用常规的PCR方法，该法准确性较高，但需要复杂的仪器设备，费时，成本高，灵敏度不够高，特异性不够强，扩增产物容易污染PCR仪，不适合流行病学调查中大批量检测。 

LAMP方法具有灵敏性高、特异性好、反应时间短、判定结果方便、不需要昂贵仪器等 优势，目前多数建立的LAMP反应方法多采用琼脂糖凝胶电泳紫外线分析显像来判定结果，只能分析LAMP反应的最终结果，不能进行定量，且存在气溶胶污染实验室的危险，由于缺乏对反应的实时监控很难排除这些干扰因素，不能对检测结果做出准确的判定。 

发明内容

本发明要解决的技术问题是提供一种敏感度高、特异性强、快速准确的检测细菌对氟苯尼考耐药性的LAMP方法，以实现快速、实时、定量检测细菌对氟苯尼考耐药性（floR基因）。 

为解决上述技术问题，本发明采用以下技术方案：检测细菌对氟苯尼考耐药性的LAMP引物组，包括外引物对F3和B3、内引物对FIP和BIP，它们分别具有序列表SEQ.ID.No.1至SEQ.ID.No.4的碱基序列。 

检测细菌对氟苯尼考耐药性的LAMP方法，利用LAMP引物组，在63℃恒温反应条件下，进行环介导恒温扩增反应60min；LAMP引物组包括外引物对F3和B3、内引物对FIP和BIP，它们分别具有序列表SEQ.ID.No.1至SEQ.ID.No.4的碱基序列。 

扩增反应的反应体系以25μL计，包括：2×Reaction Mix12.5μL，Bst DNA Polymerase1μL，Primer FIP40pmol、BIP40pmol、F35pmol、B35pmol，细菌质粒DNA2μL，Distilled Water补足25μL。 

扩增反应在Loopamp实时浊度仪内全程密闭监控进行。 

扩增反应后采用钙黄绿素荧光染料进行荧光检测，荧光染料在反应前加入。 

氟苯尼考耐药基因floR是细菌对氟苯尼考耐药的标志性基因，通过测定氟苯尼考对细菌的MIC，以及对细菌floR基因进行定量，形成floR基因与MIC的关联，通过LAMP方法快速测定floR基因的含量，即可判定细菌对氟苯尼考的耐药性，这将为监测氟苯尼考耐药性提供极大的便利。 

为此，本发明采用环介导等温扩增（LAMP）技术，并根据细菌氟苯尼考耐药性floR基因的序列设计了相应的LAMP引物组，包括外引物对F3和B3、内引物对FIP和BIP，通过材料准备、LAMP引物设计与合成、细菌质粒DNA提取、LAMP反应体系优化等一些列研究工作，发明人建立了检测细菌对氟苯尼考耐药性的LAMP方法。同时，采用测定氟苯尼考对细菌的MIC值，参照美国临床和实验室标准协会（NCCLS）的标准判定细菌对氟苯尼考的敏感性，发明人用本法检测相应菌株的floR基因，对比敏感菌和耐药菌的扩增情况（反应发生与否以及浊度值达到0.1的时间值），制定了检测结果的判定（敏感、中介、耐药）标准。对于未知样品，只需检测其floR基因扩增浊度值达到0.1的时间值，即可 判定样品菌对氟苯尼考的耐药性。特异性检测和敏感性检测结果证实，该法特异性扩增细菌的氟苯尼考耐药基因floR灵敏度高，是传统PCR方法的100倍，而且操作简便，只需按建立的体系加样即可，并可实时监测反应和定量检测出floR基因的拷贝数，快速准确地获得检测结果，为快捷、准确、大批量地检测细菌对氟苯尼考的耐药性带来便利。 

本发明的LAMP方法具有如下突出优点是： 

<1>特异性强——阴性对照样品均无阳性结果出来，与PCR检测结果一致。 

<2>灵敏度高——普通PCR检测方法的灵敏度为2.36×10^-9ng/μL，而用本发明检测限约为2.36×10^-11ng/μL，是普通PCR检测方法的100倍。 

<3>快速获得结果——传统的细菌耐药性检测从实验准备到获得试验结果需要48小时，普通PCR检测方法在24小时左右才能得出结果，目前多数建立的LAMP反应方法在反应结束后须采用琼脂糖凝胶电泳紫外线分析显像来判定结果，而本发明在60分钟内即可完成扩增，且结果判定方式简便，不需要再进行琼脂糖凝胶电泳紫外线分析显像来判定结果，从质粒提取到获得最终结果可在2-3小时内完成。 

<4>不造成污染——目前LAMP方法用于直接观察的荧光染料为反应后加入，而本发明的荧光染料是在反应前加入的钙黄绿素商用染料，检测过程不需要开盖，避免反应产物以气溶胶形式污染实验室。 

<5>可实时定量——本发明利用Loopamp实时浊度仪（如Tubidimeter real-time LA-320浊度仪，日本荣研公司)来实时监测LAMP反应，不同标准样品浓度对应的浊度值的时间绘制成的标准曲线，代入标准曲线方程，即可求出各时间floR基因的拷贝数，达到定量检测目的。 

<6>结果判定简便——依据扩增反应发生与否以及浊度值达到0.1的时间值即可判定样品细菌对氟苯尼考的耐药性。 

附图说明

图1是本发明LAMP方法特异性检测结果，图中：1为阳性对照：重组质粒_pMD18-T-floR；2-4分别为氟苯尼考耐药菌株：大肠杆菌、链球菌、粪肠球菌；5-7分别为氟苯尼考敏感菌株：巴氏杆菌标准株ATCC21955、巴氏杆菌、链球菌；8为阴性对照：灭菌超纯水。 

图2是本发明LAMP方法敏感性检测结果，图中：1、2.36×10²ng/μL，2、2.36×10¹ng/μL，3、2.36×10⁰ng/μL，4、2.36×10^-1ng/μL，5、2.36×10^-2ng/μL，6、2.36×10^-3ng/μL，7、2.36×10^-4ng/μL，8、2.36×10^-5ng/μL，9、2.36×10^-6ng/μL，10、2.36×10^-7ng/μL，11、2.36×10^-8ng/μL。 

图3是传统PCR方法敏感性检测结果，图中：M为DNA标准Marker2；1-11分别为重组质粒pMD18-T-floR连续10倍倍比稀释，即2.36×10²ng/μL、2.36×10¹ng/μL、2.36×10⁰ng/μL、2.36×10^-1ng/μL、2.36×10^-2ng/μL、2.36×10^-3ng/μL、2.36×10^-4ng/μL、2.36×10^-5ng/μL、2.36×10^-6ng/μL、2.36×10^-7ng/μL、2.36×10^-8ng/μL；12是超纯水对照。 

图4是荧光可视化检测结果图。 

图5是本发明pMD18-T-floR定量标准曲线。 

图6是应用本发明LAMP方法检测一系列氟苯尼考敏感性（耐药性）不同的细菌的floR基因含量结果图，图中：1、1μg/mL，2、2μg/mL，3、4μg/mL，4、8μg/mL，5、16μg/mL，6、32μg/mL，7、64μg/mL，8、128μg/mL，9、256μg/mL，10、512μg/mL，11、1024μg/mL。 

具体实施方式

实施例1建立检测细菌对氟苯尼考耐药性（floR基因）的LAMP方法 

1、材料的准备 

氟苯尼考耐药菌包括链球菌、大肠杆菌、粪肠球菌（对氟苯尼考的MIC值分别为128μg/mL、256μg/mL、512μg/mL）；氟苯尼考敏感菌包括巴氏杆菌标准株ATCC21955、巴氏杆菌、链球菌（对氟苯尼考的MIC值分别为2μg/mL、1μg/mL、2μg/mL），均为广西兽医研究所分离（或购买）和保存。细菌质粒DNA提取试剂盒购自北京康为世纪生物科技有限公司，脱氧核糖核酸扩增试剂盒（LAMP法，SLP206）购自北京蓝谱生物科技有限公司。 

2、LAMP引物 

根据GenBank中的细菌氟苯尼考耐药floR基因序列，利用LAMP法引物辅助设计软件PrimerExplorer V4软件设计并合成得到一套LAMP引物，其中F3、B3为外引物，FIP、 

BIP为内引物，其碱基序列如下： 

F3：GCCCTCTGGATCAAGTCAAG（序列表SEQ.ID.No.1）， 

B3：TTACAAGCGCGACAGTGG（序列表SEQ.ID.No.2）， 

FIP：GGCGCTAAAGCCGACAGTGTAATCTGTCTTGCCGATCTTCG（序列表SEQ.ID.No.3）， 

BIP：TCGTCTTCTTCTCGACGGCTCCAAGGCAAAGCTGAATCCGAT（序列表SEQ.ID.No.4）。 

3、细菌质粒DNA提取 

使用试剂盒提取细菌质粒DNA。 

4、LAMP反应体系 

按照试剂盒说明书，按25μL体系配置： 

LAMP反应在Loopamp实时浊度仪(LA-320C，日本荣研公司)内全程密闭监控进行，浊度仪实时显示扩增情况，每个时间点对应一个浊度值，可绘制标准曲线，通过获得未知样品达到0.1的时间值，即可从标准曲线上计算出该样品的起始拷贝数，反应温度使用试剂盒推荐的63℃。 

5、LAMP检测方法的建立 

1）特异性检测 

氟苯尼考耐药菌包括大肠杆菌、链球菌、粪肠球菌；氟苯尼考敏感菌包括巴氏杆菌标准株ATCC21955、巴氏杆菌、链球菌；分别提取其质粒DNA，以此为模板进行LAMP扩增，同时以重组质粒pMD18-T-floR为阳性对照，灭菌超纯水为阴性对照，检验LAMP方法的特异性。 

2）敏感性检测 

以耐氟苯尼考菌株的质粒DNA为模板，PCR扩增floR基因，将PCR扩增得到的floR基因片段连接于载体pMD18-T，转化大肠杆菌感受细胞DH5a，氨苄西林抗性筛选获得单克隆菌，提取重组的质粒DNA，经测序确认是floR基因。测定重组质粒pMD18-T-floR的起始浓度，用灭菌超纯水进行连续10倍倍比稀释至10¹～10^-8共10个稀释度，取各稀释度2μL作为模板进行LAMP扩增，同时以此稀释的质粒为模板进行PCR扩增，对比两种方法的敏感性。 

3）荧光可视化检测 

根据浊度仪监控优化的条件，加入钙黄绿素商用荧光染料（荧光目视检测试剂盒，规格：96次反应装，产品编码SLP221，荣研生物科技（中国）有限公司），荧光染料在反应前加入，反应结束（60分钟）后在紫外灯下观察即可判定结果，阳性结果为绿色，阴性结 果为无色透明，不需要用琼脂糖凝胶电泳紫外线分析显像，避免了开盖跑电泳观察造成的气溶胶污染。 

6、结果判定 

测定氟苯尼考对受试菌的MIC值，参照美国临床和实验室标准协会（NCCLS）的标准判定细菌对氟苯尼考的敏感性（耐药性），再用本方法检测相应菌株的floR基因，对比敏感菌和耐药菌floR基因的有或无以及其含量（反应发生与否以及浊度值达到0.1所需要的时间值），建立检测结果判定（敏感、中介、耐药）的标准。 

实施例2LAMP检测方法的特异性 

以重组质粒pMD18-T-floR为阳性对照，灭菌超纯水为阴性对照，对3株氟苯尼考耐药菌、3株阴性对照菌以及进行LAMP扩增，结果如图1所示，阳性对照反应管在20分钟之后出现浊度的上升曲线，3株细菌氟苯尼考耐药菌反应管在30分钟之后出现浊度的上升曲线，为阳性结果，而3株阴性对照菌和水对照反应管均无扩增情况出现，LAMP呈阴性结果。 

实施例3LAMP检测方法的敏感性 

重组质粒pMD18-T-floR的起始浓度为2.36×10²ng/μL，10倍倍比稀释进行检测，结果如图2和图3所示，LAMP法检测限约为2.36×10^-11ng/μL，而PCR法检测限为2.36×10^-9ng/μL。随着样品浓度的下降，LAMP扩增反应浊度值达到0.1需要的时间值越大。 

实施例4LAMP检测方法的荧光可视化检测 

根据浊度仪监控优化的条件，加入钙黄绿素商用荧光染料，63℃进行LAMP扩增，反应结束（60分钟）后，在紫外灯下观察。图4为观察结果，左管为阴性对照，为阴性结果；右管为以细菌氟苯尼考耐药菌质粒DNA为模板的反应情况，为阳性结果，表明建立的LAMP检测方法操作方法简单，只需使用试剂盒配合本方法设计的LAMP引物，加入样品后，在基层单位可用水浴锅来保持63℃60分钟（一个LAMP反应过程），即可快速观察结果，结果判定方法简便，根据反应的发生与否（反应管观察到绿色荧光与否）即可判定结果，且无需开盖，避免了污染。 

实施例5细菌氟苯尼考耐药floR基因定量标准曲线的绘制（表1、图5） 

设置对照：浓度为2.36×10¹ng/μL、2.36×10⁰ng/μL、2.36×10^-1ng/μL、2.36×10^-2ng/μL、2.36×10^-3ng/μL、2.36×10^-4ng/μL、2.36×10^-5ng/μL、2.36×10^-6ng/μL、2.36×10^-7ng/μL的标准样品（重组质粒pMD18-T-floR）各一个，因为浓度的负对数值与 浊度值为0.1的时间值成线性关系，所以可以浓度的负对数值与浊度仪捕捉到的浊度值为0.1对应的时间值做成标准曲线，获得标准曲线方程y=0.2885x－8.7731，如图5所示。从标准曲线方程来看相关系数R²为0.9991，呈良好的线性关系。以时间为X值，可求出Y值即浓度的负次方数。如某试验样品达到浊度值为0.1的时间为30分钟时，带入所建立的标准曲线方程，求出Y等于－0.1181，则浓度为10^0.1181，再乘以基数2.36，为该试验样品floR基因的起始浓度，即2.36×10^0.1181ng/μL，从而达到定量的效果。 

表1各个稀释度反应管浊度值达到0.1的时间值 

实施例6检测不同的对氟苯尼考耐药菌株的floR基因含量（表2、图6） 

利用本发明的LAMP方法检测一系列对氟苯尼考有不同MIC值的细菌的floR基因含量：结果显示，氟苯尼考对细菌的MIC值从1μg/mL到1024μg/mL，呈2倍梯度递增；以提取的菌株质粒DNA作为LAMP检测模板，MIC值越大的菌株，浊度值达到0.1需要的时间越少（表2），表明其floR基因含量高。因为NCCLS未发布氟苯尼考敏感性判定标准，氟苯尼考是氯霉素的同系物，因此参照NCCLS关于氯霉素敏感性判定的标准来判定细菌对氟苯尼考的敏感性，即MIC值≤8μg/mL，为敏感，MIC值＝16，为中介，MIC值≥32μg/mL，为耐药。利用本发明的LAMP方法进行检测时，当未知样品菌扩增floR基因浊度值达到0.1的时间值≤34.6分钟，判定为菌株对氟苯尼考耐药；当样品菌扩增floR基因浊度值达到0.1的时间值≥35.2分钟，判定为菌株对氟苯尼考敏感。 

表2氟苯尼考敏感性不同的菌株LAMP扩增浊度值达到0.1的时间值 

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Claims (5)

1.检测细菌对氟苯尼考耐药性的LAMP引物组，其特征在于包括外引物对F3和B3、内引物对FIP和BIP，它们分别具有序列表SEQ.ID.No.1至SEQ.ID.No.4的碱基序列。

2.一种检测细菌对氟苯尼考耐药性的LAMP方法，其特征在于：利用LAMP引物组，在63℃恒温反应条件下，进行环介导恒温扩增反应60min；所述LAMP引物组包括外引物对F3和B3、内引物对FIP和BIP，它们分别具有序列表SEQ.ID.No.1至SEQ.ID.No.4的碱基序列。

3.根据权利要求1所述的检测细菌对氟苯尼考耐药性的LAMP方法，其特征在于扩增反应的反应体系以25μL计，包括：2×Reaction Mix12.5μL，Bst DNA Polymerase1μL，Primer FIP40pmol、BIP40pmol、F35pmol、B35pmol，细菌质粒DNA2μL，Distilled Water补足25μL。

4.根据权利要求1所述的检测细菌对氟苯尼考耐药性的LAMP方法，其特征在于：所述扩增反应在Loopamp实时浊度仪内全程密闭监控进行。

5.根据权利要求1所述的检测细菌对氟苯尼考耐药性的LAMP方法，其特征在于：所述扩增反应后采用钙黄绿素荧光染料进行荧光检测，荧光染料在反应前加入。