CN101875965B - TaqMan探针实时荧光PCR检测广州管圆线虫感染性螺类 - Google Patents

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Abstract

广州管圆线虫病是一种食源性人畜共患病，主要通过误食疫螺而感染。技术发明“TaqMan探针实时荧光PCR检测广州管圆线虫感染性螺类”是一种基于现代分子生物学技术，应用于螺类感染广州管圆线虫的检测方法。目的：提供一种快速、准确地检测螺类感染广州管圆线虫的方法。技术要点：(1)引物-(上)：5’-TGATGC TTG TGC GGT TTT C-3’，引物-(下)：5’-CCGAAG GCAAAG CACACAC-3’，探针：5’-CGC TATACACGCACATTT GCC GG-3’；(2)反应体系总体积为20μL，其中2×Taq PCRMasterMix 10μL，Taqman探针1μL、上、下游引物各1μL，模板1μL，余下用ddH2O补足；(3)反应程序：94℃预变性3min；94℃10s，60℃30s，循环40次。用途：本发明为食品检疫、疫情调查与监测提供了新的技术手段，对于预防和控制广州管圆线虫病的发生具有重要意义。

Description

TaqMan探针实时荧光PCR检测广州管圆线虫感染性螺类
1技术领域
本发明涉及一种新型分子生物学检测方法，具体来说，是建立一种螺类感染广州管圆线虫(Angiostrongylus cantonensis，AC)的实时荧光PCR检测方法。
2背景技术
广州管圆线虫病是一种新发食源性人畜共患传染病。由于人们误食带疫福寿螺、田螺、环棱螺、褐云玛瑙螺等贝类，导致了本病的频繁暴发。到目前为止仍没有用实时荧光PCR方法从中间宿主中检测广州管圆线虫的报道。传统的检测方法仍停留在人工分离、显微镜检查、专家鉴定等阶段，不但检测周期长、而且灵敏度极低等缺点不能被广泛应用。本申请人已经成功建立常规PCR方法检测螺类感染广州管圆线虫，改进了检测周期和灵敏度，但仍然不能满足致病突发事件的应急处理，也不能满足贝类食品检疫和疫源地疫情调查与监测中快速准确的检测需要。
3发明内容
本发明针对上述现有技术所存在的不足开展研究，旨在提供一种准确性好、灵敏度高、成本低廉的检测方法，应用于广州管圆线虫感染中间宿主螺类的快速检测。
所要解决的关键问题是从感染广州管圆线虫的中间宿主体内快速检测出线虫，从而得到灵敏度高、结果准确的PCR检测方法。
3.1发明所设计的引物和探针：
表1AC的引物和探针
3.2扩增反应体系总体积为20μL，其中2×Taq PCR MasterMix混合液10μL，TaqMan探针1μL、上、下游引物各1μL，模板1μL，余下用灭菌水补足。混匀后放入PCR扩增仪中进行扩增。经过优化后PCR反应体系中Mg2+浓度为4mM、引物浓度为20μM、探针浓度为10μM。
3.3两步法扩增反应程序为：94℃预变性3min；94℃10s，60℃30s，循环40次。
4附图说明
图1荧光PCR扩增后出现较好的扩增曲线注1：阳性福寿螺。
图2电泳后用凝胶成像仪观察出现115bp片段注M：100bp ladder DNAMarker；1：阳性福寿螺。
5具体实施方式
5.1材料的准备
供试螺采自各主要疫源地，采集地点以城郊垃圾堆旁经常有老鼠出没的沟渠菜地为主。
5.2实时荧光PCR方法的建立
5.2.1引物和TaqMan探针的设计合成
用引物设计软件同时设计TaqMan探针及引物，经NCBIBlast检验其特异性。交由上海生工生物技术服务有限公司合成。引物和探针见表1，扩增片段长115bp。TaqMan探针5’端标记荧光报告基团为6-羧荧黄(6-FAM)，3’端标记荧光淬灭基团为四甲基罗丹明(TAMRA)。
5.2.2中间宿主螺类DNA提取
5.2.2.1异硫酸氰胍法：将准备好的阳性样品和阴性对照样品，剪碎后分置于研钵内，加液氮研磨成粉末取50mg，再加入200μL TE，混匀；加入400μL裂解液，涡旋混匀，放置10min；然后加入300μL Tris-饱和酚和300μL氯仿∶异戊醇(24∶1)，剧烈震荡15s，13000r/min离心10min；取上清，加等体积的氯仿∶异戊醇(24∶1)，剧烈震荡15s，13000r/min离心10min；取上清，加等体积的氯仿，剧烈震荡15s，13000r/min，10min；取上清，加0.8倍体积的异丙醇，12000r/min，10min，弃上清；取沉淀，加入70％的的无水乙醇1mL，离心13000r/min，弃上清，后于真空干燥仪中干燥2min，再加入100μL灭菌双蒸水溶解。用核酸蛋白分析仪测定DNA的浓度，置于-20℃保存备用。
5.2.2.2试剂盒提取法：TIANGEN组织基因组DNA提取试剂盒提取，按使用说明书操作提取DNA。
5.3扩增反应总体积为20μL，其中2×Taq PCR MasterMix混合液10μL，Taqman探针1μL、上、下游引物各1μL，模板1μL，余下用灭菌水补足。混匀后放入PCR扩增仪中进行扩增。
5.4两步法扩增反应程序为：94℃预变性3min，94℃10s，60℃30s，循环40次。
5.5PCR产物检测与鉴定：在荧光定量PCR仪上扩增后出现较好的扩增曲线，则说明样品被广州管圆线虫所感染，进一步取PCR产物10μL在1.5％琼脂糖凝胶(含溴化乙锭)上以98V电泳40min，用凝胶成像仪观察。如果观察到在115bp的位置出现条带，则进一步说明所检测的样品为广州管圆线虫所感染。

Claims (3)

1.一种用于检测广州管圆线虫(Angiostrongylus Cantonensis，AC)感染中间宿主螺类的检测方法，其特征是使用特异性探针对分子进行识别，其引物及探针为：AC-(P1)：5’-TGATGCTTGTGCGGTTTTC-3’，AC-(P2)：5’CCGAAGGCAAAGCACACAC-3’，Probe：5’-CGCTATACACGCACATTTGCCGG-3’。
2.根据权利要求1所述的用于检测广州管圆线虫感染中间宿主螺类的检测方法，其特征在于：PCR反应体系中Mg2+浓度为4mM、引物浓度为20μm、探针浓度为10μM，扩增反应总体积为20μL，其中2×Taq PCR MasterMix混合液10μL，TaqMan探针1μL，上、下游引物各1μL，模板1μL，余下用灭菌水补足。
3.根据权利要求2所述的用于检测广州管圆线虫感染中间宿主螺类的检测方法，其特征在于：实时荧光PCR两步法扩增反应程序为：94℃预变性3min；94℃10s，60℃30s，循环40次，结束反应。
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