CN112094920A - 检测广州管圆线虫的引物和试剂盒 - Google Patents

Abstract

本发明属于生物检测技术领域，具体涉及一种检测广州管圆线虫的引物和试剂盒。该检测广州管圆线虫的引物，包括：SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所示的引物对。该引物可以基于RPA等温扩增技术对广州管圆线虫特异性核酸片段进行检测，在保持高灵敏度的同时具有很好的特异性，可以应用于广州管圆线虫不同中间宿主的检测，具有灵敏度高、特异性强、无设备可视化检测、快速及操作简单的优点，为广州管圆线虫的现场防治工作提供了高效、快速的技术支撑。

Description

检测广州管圆线虫的引物和试剂盒

技术领域

本发明属于生物检测技术领域，具体涉及一种检测广州管圆线虫的引物和试剂盒。

背景技术

广州管圆线虫(又称广东住血线虫，Angiostrongylus cantonensis)是一种呈世界性分布的人兽共患线虫病，拥有众多中间宿主，可以感染包括人类在内的几乎所有的温血动物。广州管圆线虫可引起人广州管圆线虫病，导致嗜酸性脑膜炎等中枢神经系统疾病，严重时出现认知障碍，精神错乱，嗜睡昏迷以及死亡。广州管圆线虫广泛分布在世界各洲并且集中分布在亚太地区，在中国的云南、浙江、广东、福建等南部地区均有流行。福寿螺、褐云玛瑙螺、藁杆双脐螺及蛞蝓是广州管圆线虫的主要中间宿主，它引发的人畜寄生虫病每年造成巨大的经济损失。与此同时，螺类等水生动物的寄生虫检测在寄生虫病的防控中尤为重要，广州管圆线虫中间宿主具体的检测方法包括病原学诊断法和分子生物学诊断法。如肺检法和胃蛋白酶消化法等病原学检测检出率低，对于低度感染的中间宿主一般很难检查出来，导致较高的漏检率。而要检测低度感染的中间宿主则需要具有高灵敏度优势的实验室方法。

随着分子生物学的迅速发展，DNA探针技术、DNA聚合酶链式反应及实时荧光定量PCR等分子生物学检测技术相继被开发和应用在寄生虫领域。分子生物学诊断技术是指以DNA和RNA为诊断模板，使用分子生物学技术通过检测基因的存在、缺陷或表达异常，从而对疾病作出诊断的技术。它的基本原理是检测受检样本中目标DNA或RNA的含量变化、结构变化及表达功能是否异常，来确定有无基因水平的异常变化，对寄生虫病的防控具有重大意义。目前广州管圆线虫的分子生物学检测技术已经日趋成熟，能够较为精确且可靠的检测感染程度较低的中间宿主。但是，由于分子检测技术需要昂贵的仪器设备、复杂的实验程序及专门的实验室环境等一系列原因，同时广州管圆线虫流行于缺少专业实验室设备支持的亚热带和热带地区及一些岛屿国家，因此野外检测非常困难。

发明内容

本发明的目的在于提供一种检测广州管圆线虫的引物和试剂盒，旨在解决现有广州管圆线虫野外检测困难的技术问题。

为实现上述发明目的，本发明采用的技术方案如下：

本发明一方面提供一种检测广州管圆线虫的引物，包括：SEQ ID NO.1和SEQ IDNO.2所示的引物对。

本发明提供的用于检测广州管圆线虫的引物以广州管圆线虫大亚基核糖体18sRNA基因为模板设计得到，利用该基因高保守高稳定区设计灵敏度高、特异性好的引物对，可以基于重组酶聚合酶扩增(Recombinase Ploymerase Amplification，RPA)的等温扩增技术对广州管圆线虫特异性核酸片段进行检测，在保持高灵敏度的同时具有很好的特异性，可以应用于广州管圆线虫不同中间宿主的检测，具有灵敏度高、特异性强、无设备可视化检测、快速及操作简单的优点，为广州管圆线虫的现场防治工作提供了高效、快速的技术支撑。

本发明另一方面提供一种检测广州管圆线虫的试剂盒，包括扩增广州管圆线虫的引物，所述引物包括：SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所示的引物对。

本发明提供的试剂盒含有用于检测广州管圆线虫的引物，该引物以广州管圆线虫大亚基核糖体18s RNA基因为模板设计得到，利用该基因高保守高稳定区设计灵敏度高、特异性好的引物对，可以基于RPA等温扩增技术对广州管圆线虫特异性核酸片段进行检测，在保持高灵敏度的同时具有很好的特异性，可以应用于广州管圆线虫不同中间宿主的检测，具有灵敏度高、特异性强、无设备可视化检测、快速及操作简单的优点，为广州管圆线虫的现场防治工作提供了高效、快速的技术支撑。

附图说明

图1是本发明实施例的扩增温度对RPA琼脂糖凝胶检测效果的影响；泳道1和泳道13为DL2000 DNA Marker(2000bp，1000bp，750bp，500bp，250bp，100bp)；泳道2为空白对照；泳道3-10反应温度依次为5℃、10℃、15℃、20℃、25℃、30℃、35℃和40℃，扩增产物条带大小为461bp；泳道11为阴性对照；泳道12为阳性质控；

图2是本发明实施例的扩增时间对RPA琼脂糖凝胶检测效果的影响；泳道1和泳道13为DL2000 DNA Marker(2000bp，1000bp，750bp，500bp，250bp，100bp)；泳道2-10的反应时间依次为5min、10min、15min、20min、25min、30min、35min、40min和45min；泳道11为阴性对照；泳道12为阳性质控；

图3是本发明实施例使用不同种属的虫体的总DNA进行RPA琼脂糖凝胶检测方法的特异性评价；泳道1和泳道15为DL2000 DNA Marker(2000bp，1000bp，750bp，500bp，250bp，100bp)；泳道2-11依次为恶性疟原虫、弓形虫、隐孢子虫、鞭毛虫、旋毛虫、蛔虫、异尖线虫、卫氏并殖吸虫、大片吸虫、肝片吸虫的DNA；泳道12为阳性对照；泳道13为阴性对照；泳道14为空白对照；

图4是本发明实施例广州管圆线虫RPA琼脂糖凝胶检测方法灵敏性评价；泳道1，10和12为DL2000 DNA Marker(2000bp，1000bp，750bp，500bp，250bp，100bp)；泳道2-9依次为20ng、2ng、200pg、20pg、2pg、200fg、20fg和2fg的DNA浓度；泳道11为阴性对照；

图5是本发明实施例扩增温度对RPA联合侧流层析试纸条检测效果的影响；试纸条1为空白对照；试纸条2-10反应温度依次为0℃、5℃、10℃、15℃、20℃、25℃、30℃、35℃、40℃；试纸条11为阴性对照；试纸条12为阳性质控；

图6是本发明实施例扩增时间对RPA联合侧流层析试纸条检测效果的影响；试纸条1-9反应时间依次为5min、10min、15min、20min、25min、30min、35min、40min和45min；试纸条10为阴性对照；试纸条11为空白对照。

图7是本发明实施例使用不同种属的虫体的总DNA进行RPA联合侧流层析试纸条检测方法的特异性评价；试纸条1-10依次为恶性疟原虫、弓形虫、隐孢子虫、鞭毛虫、旋毛虫、蛔虫、异尖线虫、卫氏并殖吸虫、大片吸虫、肝片吸虫的DNA；试纸条11为阳性对照；试纸条12为阴性对照；试纸条13为空白对照；试纸条14为试剂盒质控对照。

图8是本发明实施例广州管圆线虫RPA联合侧流层析试纸条检测方法灵敏性评价；试纸条1-8依次为20ng、2ng、200pg、20pg、2pg、200fg、20fg和2fg的DNA浓度；试纸条9为阳性对照。

图9是本发明实施例用普通引物进行普通PCR扩增后产物的琼脂糖凝胶电泳结果；泳道1和5为DL2000 DNA Marker(2000bp，1000bp，750bp，500bp，250bp，100bp)；泳道2-4为广州管圆线虫DNA。

图10是本发明实施例广州管圆线虫RPA琼脂糖凝胶检测方法在褐云玛瑙螺实际样本中的检测结果；泳道1和24为DL2000 DNA Marker(2000bp，1000bp，750bp，500bp，250bp，100bp)；泳道2-19依次为18份褐云玛瑙螺基因组DNA；泳道20为阴性对照；泳道21为空白对照；泳道22为阳性对照；泳道23为试剂盒质控对照。

图11是本发明实施例广州管圆线虫RPA联合侧流层析试纸条检测方法在褐云玛瑙螺实际样本中的检测结果；试纸条1-18依次为18份褐云玛瑙螺基因组DNA；试纸条19为阴性对照；试纸条20为空白对照；试纸条21为阳性对照；

上述图中，空白对照为ddH₂O，阳性对照为广州管圆线虫三期幼虫DNA，阴性对照为未感染广州管圆线虫的褐云玛瑙螺螺肉DNA，阳性质控为试剂盒自带样。

具体实施方式

为了使本发明要解决的技术问题、技术方案及有益效果更加清楚明白，以下结合实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。

一方面，本发明实施例提供了一种检测广州管圆线虫的引物，包括：SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所示的引物对。

具体地，

SEQ ID NO.1：5′-GCCTGTTAATTGATGCTTGTGCGGTTTTCGTCC-3′：

SEQ ID NO.2：5′-CTTCTTTCCCCGCTATTTTTGCCAAGCCCGTTCCC-3′。

本发明实施例提供的用于检测广州管圆线虫的引物以广州管圆线虫大亚基核糖体18s RNA基因(SEQ ID NO：4所示)为模板设计得到，利用该基因高保守高稳定区设计灵敏度高、特异性好的引物对，可以基于RPA等温扩增技术对广州管圆线虫特异性核酸片段进行检测，在保持高灵敏度的同时具有很好的特异性，可以应用于广州管圆线虫不同中间宿主的检测，具有灵敏度高、特异性强、无设备可视化检测、快速及操作简单的优点，为广州管圆线虫的现场防治工作提供了高效、快速的技术支撑。

根据已报道的登录号为AY295821.1的广州管圆线虫大亚基核糖体RNA基因序列(SEQ ID NO.4所示)所设计的一对特异性引物对。

进一步地，所述引物还包括SEQ ID NO.3所示的探针；其中，所述引物对的SEQ IDNO.2序列5端连接有生物素，所述探针的5端连接有荧光素，所述探针的3端连有封闭基团，所述探针从5端开始的第31-32个碱基之间插入有四氢呋喃(THF)。具体地，所述荧光素为FAM，所示封闭基团为C3Spacer。

如下所示：

SEQ ID NO.1：GCCTGTTAATTGATGCTTGTGCGGTTTTCGTCC；

SEQ ID NO.2：biotin-CTTCTTTCCCCGCTATTTTTGCCAAGCCCGTTCCC；

SEQ ID NO.3：

FAM-TAATTGATGCTTGTGCGGTTTTCGTCCGTGG-THF-CGGCAAATGTGCGTGTAT-C3Spacer。

上述引物对和探针可以基于重组酶聚合酶扩增(RPA)技术结合侧流层析(lateralflow，LF)技术检测；RPA可以与侧流动免层析技术相结合，在RPA扩增体系中，需要生物素标记的反向引物(SEQ ID NO.2)和荧光素标记的探针(SEQ ID NO.3)，在距荧光素31个碱基处有一个脱碱基位点(dSpacer)即THF，该位点可被nfo核酶识别、切割，产生新的羟基末端，并在DNA聚合酶作用下延伸，形成带有生物素和荧光素双标记的RPA产物，通过层析膜扩散，被生物素配体和荧光素标记抗体捕获，形成具有颜色的检测线。

另一方面，本发明实施例还提供一种检测广州管圆线虫的试剂盒，包括扩增广州管圆线虫的引物，所述引物包括：SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所示的引物对。

本发明实施例提供的试剂盒含有用于检测广州管圆线虫的引物，该引物以广州管圆线虫大亚基核糖体18s RNA基因为模板设计得到，利用该基因高保守高稳定区设计灵敏度高、特异性好的引物对，可以基于RPA等温扩增技术对广州管圆线虫特异性核酸片段进行检测，在保持高灵敏度的同时具有很好的特异性，可以应用于广州管圆线虫不同中间宿主的检测，具有灵敏度高、特异性强、无设备可视化检测、快速及操作简单的优点，为广州管圆线虫的现场防治工作提供了高效、快速的技术支撑。

本发明实施例提供两种广州管圆线虫RPA分子检测试剂盒。

一种是琼脂糖-RPA等温扩增检测试剂盒，包括：SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所示的引物对，琼脂糖-RPA引物正控混合液、琼脂糖-RPA反应正控DNA模板，醋酸镁溶液和琼脂糖-RPA反应缓冲液。该试剂盒进行重组酶聚合酶扩增反应的体系为：29.5ul RehydrationBuffer缓冲液，11.2ul ddH₂O，2.4ul SEQ ID NO.1所示的上游引物，2.4ul SEQ ID NO.2所示的下游引物，2ul DNA模板，2.5ul 280mM的醋酸镁溶液。

具体检测步骤包括：将待检测核酸样品，琼脂糖-RPA引物混合液，反应缓冲液、醋酸镁溶液等混于反应管中，对待检测核酸样品进行重组酶聚合酶扩增；将RPA反应体系混匀离心，放置37℃水浴锅中充分反应20min后于冰上停止反应；将扩增产物移取7ul至灭菌离心管中，加入3ul的loading buffer充分涡旋混匀，将10ul样品稀释液滴加至配置好的2.5％琼脂糖凝胶的加样孔中，120V电压下电泳15min，采用美国BIO-RAD凝胶成像分析系统进行检测，紫外灯下观察扩增结果；若结果产生一条特异谱带，谱带大小为461bp，则该样品含有广州管圆线虫；若扩增结果没有出现大小为461bp谱带，则该样品中不含有广州管圆线虫。其中，重组酶聚合酶扩增反应的条件为：30-40℃，避光反应15min。

本发明实施例成功建立了对广州管圆线虫快速、灵敏、特异而又简单实用的分子检测方法，与其它传统方法相比，该试剂盒有以下优点：(1)灵敏度高：结果显示在总浓度为200ng/ul的广州管圆线虫阳性DNA稀释到20pg/ul仍能被检测到，即最低DNA检测限度为20pg/ul，而文献报道普通PCR的最低DNA检测限度为1ng/ul。(2)特异性强：1对长达35bp的特异性引物的有效识别，保证了RPA方法扩增的高度特异性。(3)快速省时：用时短，通常在15min内完成反应。(4)反应温度宽泛：扩增反应温度在30-40℃之间，使实验环境容易满足，恒温水浴锅或人体体温37℃即可。(5)检测方法安全。在琼脂糖-RPA方法的电泳过程中使用GOLDVIEW染料代替溴化乙锭(EB)染色，其灵敏度比EB高且无致癌作用，同时避免了EB对环境的污染与人体的损害。(6)检测结果准确性高。在检验该发明引物对的过程中，共实验室比对了18个褐云玛瑙螺生物样本，琼脂糖-RPA试剂盒对广州管圆线虫的检测准确性达100％。(7)稳定性好。通过样品检验，广州管圆线虫样本均能够稳定地扩增出特异谱带。

另一种是LF-RPA检测试剂盒，试剂盒中的引物包括：SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所示的引物对，SEQ ID NO.3所示的探针；其中，引物对的SEQ ID NO.2序列5端连接有生物素，探针的5端连接有荧光素，探针的3端连有封闭基团，探针从5端开始的第31-32个碱基之间插入有四氢呋喃。试剂盒还包括LF-RPA引物探针正控混合液，LF-RPA反应正控DNA模板，醋酸镁溶液，LF-RPA反应缓冲液，横向侧流层析试纸条和横向侧流层析试纸条缓冲液。该试剂盒进行重组酶聚合酶扩增反应的体系为：29.5ul Rehydration Buffer缓冲液，11.2ulddH₂O，2.1ul SEQ ID NO.1所示的上游引物，2.1ul SEQ ID NO.2所示的下游引物，0.6ulSEQ ID NO.3所示探针，2ul DNA模板，2.5ul 280mM的醋酸镁溶液。

具体检测步骤包括：将待检测核酸样品，LF-RPA引物探针混合液，缓冲液、醋酸镁溶液等混于反应管中，对待检测核酸样品进行重组酶聚合酶扩增；将RPA反应体系缓慢涡旋混匀，放置与37℃水浴锅中充分反应20min，在冰上停止反应；将LF-RPA扩增产物移取2ul到灭菌离心管中，加入98ul的运行缓冲液，充分涡旋混匀后，将10ul样品稀释液滴加至侧流层析免疫试纸条末端，并将侧流层析试纸条迅速转移到含有200ul反应缓冲液的1.5mlEP管中，室温反应5-10min，观察结果；如果试纸条同时出现检测线和控制线，表明样品中含有广州管圆线虫基因组DNA；如果试纸条只出现控制线，则该样品中不含广州管圆线虫基因组DNA；同时阴性对照试纸条只出现控制线，不出现检测线；阳性质量控制对照同时出现质控线和检测线。其中，重组酶聚合酶扩增反应的条件为：30-40℃，避光反应15min。

重组酶聚合酶扩增是一种新的基于PCR核酸扩增技术，反应过程简单并且恒定的常温条件下就可以进行扩增，解决了普通PCR反应模板链的热变性过程，本申请同时结合侧流层析试纸条的检测方法解决了普通PCR反应需使用昂贵的专业仪器的弊端。在RPA重组酶聚合酶等温扩增中，使用了生物素标记biotin，生物素标记的反向引物进一步标记了扩增产物，进而与试纸条上包被生物素配体的检测线区域反应。在设计引物和探针时加入的特殊基团分别为：荧光素FAM、四氢呋喃THF、封闭基团C3Spacer。本实验设置了荧光素标记FAM的特异性探针与带有生物素Biotin标记的核酸扩增产物发生特异性结合形成二元复合物，在最后使用横向侧流试纸条检测时，二元复合物与胶体金标记的抗FAM的抗体结合，形成三元复合物，反应液通过层析作用扩散到检测线时，三元复合物被检测区中生物素配体捕获，形成紫红色的检测条带；未杂交的FAM标记探针与胶体金标记的抗FAM的抗体结合，形成不含生物素的两元复合物，结合在质控线上。

本发明实施例在广州管圆线虫琼脂糖-RPA试剂盒的检测方法基础上，成功建立了LF-RPA试剂盒的分子检测方法。更进一步，与普通实验室PCR扩增相比，本发明有以下优点：(1)灵敏度高：结果显示在总浓度为200ng/ul的广州管圆线虫阳性DNA稀释到200pg/ul仍能被检测到。(2)特异性强：1个长达33bp的上游引物，1个设计带有biotin生物素标记的下游引物和探针的3个特异基团的识别，使得LF-RPA方法具有更高的特异性。(3)检测效率高：操作过程简易，用时短，在15min内即可完成反应。(4)反应温度宽泛：扩增反应温度在30-40℃之间，使实验环境容易满足，恒温水浴锅或体温即可。(5)检测方法安全。避免了传统PCR检测和荧光定量PCR检测方法中适用EB作为核酸染色剂，EB会引起环境污染与人体损害。在LF-RPA方法中横向侧流层析试纸条更具有安全性。(6)检测结果简单可靠：结果可直接通过肉眼观察，若试纸条的检测线和质控线均出现紫红色条带即可判定为广州管圆线虫阳性；若试纸条仅有质控线出现条带即为阴性结果。(7)检测结果准确性高。在检验该发明引物对的过程中，共实验室比对了18个褐云玛瑙螺生物样本，LF-RPA方法对广州管圆线虫的检测准确性达100％。(8)稳定性好。通过样品检验，广州管圆线虫样本均能够稳定地扩增出特异谱带。

如今RPA等温扩增技术检测了众多寄生虫病。本研究首次将RPA等温扩增技术应用于广州管圆线虫特异性核酸片段的检测，建立广州管圆线虫特异性基因片段RPA基础反应体系，并对体系进行优化，结合横向侧流试纸条和重组酶聚合酶介导的核酸等温扩增技术，建立广州管圆线虫特异性LF-RPA检测方法，并且在保持高灵敏度的同时具有很好的特异性，将其方法初步应用于广州管圆线虫不同中间宿主的检测，灵敏度高、特异性强、无设备可视化检测、快速及操作简单等优点的RPA检测方法为广州管圆线虫的现场防治工作提供了高效、快速的技术支撑，操作简便及无需仪器的高灵敏度诊断方法，适合于野外检测。

本发明先后进行过多次试验，现举一部分试验结果作为参考对发明进行进一步详细描述，下面结合具体实施例进行详细说明。

本发明实施例所用的材料、试剂等如无特殊说明，均可从商业途径得到。

本发明实施例所用的主要试剂为英国Twist DX公司生产的Twist Amp^TM basicKits和Twist Amp^TM nfo Kits购自英国Twist DX公司；德国Milcnia Biot cc公司生产的侧流层析试纸条(LF-strip)购自苏州达麦迪生物医学科技有限公司；引物和探针由日本Takara公司合成，稀释至10μM备用；PCR扩增反应体系用到所有试剂均购自日本Takara公司；血液、细胞、组织基因组DNA提取试剂盒购自德国Qiagen公司。

本发明实施例所用恶性疟原虫、弓形虫、隐孢子虫、鞭毛虫、旋毛虫、蛔虫、异尖线虫、卫氏并殖吸虫、大片吸虫、肝片吸虫来源于深圳市疾病预防控制中心和上海市疾病预防控制中心，广州管圆线虫感染性褐云玛瑙螺采集于深圳市南山区新屋村。所用虫体样本的来源和主要中间宿主如表1所示。

表1

种类	来源地	主要中间宿主
			广州管圆线虫	上海	螺类
恶性疟原虫	广东深圳	蚊类
			弓形虫	广东深圳	猫科动物
隐孢子虫	广东深圳	哺乳动物
			鞭毛虫	广东深圳	昆虫及哺乳动物
旋毛虫	上海	哺乳动物
			蛔虫	上海	无
异尖线虫	上海	鱼类及螺类
			卫氏并殖吸虫	浙江永嘉	螺类
大片吸虫	广西南宁	螺类
			肝片吸虫	广西南宁	螺类

实施例1

1.DNA提取及纯度检测

(1)取广州管圆线虫三期幼虫放入1.5mgEP管，加入180ul消化液ATL，加20ul蛋白酶K，涡旋混匀，置56℃金属浴直到完全溶解。

(2)加200ul AL Buffer，涡旋混匀置于56℃金属浴10min。

(3)加200ul无水乙醇，涡旋混匀。

(4)吸混合液于DNA柱子中，放入2ml收集管，8000rpm离心1min，弃液体，放新收集管。

(5)加500ul AW1 Buffer，8000rpm离心1min，弃液体，放新收集管。

(6)加500ul AW2 Buffer，14000rpm离心3min，弃液体，转移至新1.5mlEP管。

(7)加200ul AE Buffer滴入柱中心膜上(勿破膜)，室温静置1min，8000rpm离心1min收取DNA。

(8)取收集的广州管圆线虫三期幼虫的总DNA，使用Nanojob核酸分析仪检测A260/A280和A260/A230的比值来分析其纯度及检测核酸浓度，结果显示所提DNA在正常纯度范围之内。

2.引物设计与测序检测

根据GenBank公布的广州管圆线虫(GenBank：AY295821.1)大亚基核糖体RNA基因序列(SEQ ID NO.4所示)为模板，用Primer5和Oligo6软件设计普通PCR引物，进行广州管圆线虫的检测。

上游引物：TGATGCTTGTGCGGTTTTC

下游引物：GTTCCCTTGGCTGTGGTTT；

以广州管圆线虫三期幼虫DNA为模板，使用设计的PCR引物进行聚合酶链式扩增反应，取扩增产物、上下游引物各分装10ul，送深圳百赛生物科技公司测序，测序后的结果在GenBank中比对来验证产物的种属来源。PCR扩增反应程序为98℃预变性1min；9℃变性10s，54℃退火30s，72℃延伸1min，扩增30个循环；然后72℃延伸7min。PCR扩增反应体系为50ul，分别是：DNA模板2ul，上下游引物各1ul，dNTP4ul，Buffer5ul，HS高保真Taq聚合酶0.25ul和ddH₂O 36.75ul。测序显示该引物是高度特异的，只有目标物种DNA能扩增出条带，如图9所示，条带大小与理论分子量相符，经测序验证确定扩增产物为广州管圆线虫DNA。

本实施例证明所用模板均为广州管圆线虫DNA的准确性。因RPA方法所扩增的引物无法测序鉴定，所以设计普通PCR引物进行扩增鉴定，并且选择3对不同的广州管圆线虫引物扩增，鉴定了3次，结果如图9所示，泳道2-4为广州管圆线虫DNA。

3.琼脂糖-RPA反应体系建立

以已报道的登录号为AY295821.1的广州管圆线虫大亚基核糖体RNA基因组序列为模板，根据LF-RPA引物和探针实际原则，设计并合成特异性引物。琼脂糖-RPA扩增反应的上下游引物送至深圳百赛生物科技公司合成，上述的特异性引物和探针序列如表2所示。

表2

引物名称	引物序列
		RPA-F(SEQ ID N0.1)	GCCTGTTAATTGATGCTTGTGCGGTTTTCGTCC
RPA-R(SEQ ID N0.2)	CTTCTTTCCCCGCTATTTTTGCCAAGCCCGTTCCC

琼脂糖-RPA扩增反应的体系为29.5ul Rehydration Buffer缓冲液，11.2ul ddH₂O，2.4ul上游引物，2.4ul下游引物，2ul DNA模板，2.5ul 280mM的醋酸镁溶液。按照反应体系顺序依次加入反应液，将试剂盒中的醋酸镁溶液加入反应管的管盖上，盖上反应管盖并进行短暂离心使醋酸镁溶液同时进入反应管。将反应管缓慢涡旋混匀，放置于37℃恒温箱中充分反应20min后于冰上停止反应。将琼脂糖-RPA扩增产物移取7ul至灭菌离心管中，加入3ul的loading buffer充分涡旋混匀，将10ul样品稀释液滴加至配置好的2.5％琼脂糖凝胶的加样孔中，120V电压下电泳15min，紫外灯下观察扩增结果；若结果产生一条特异谱带，谱带大小为461bp，则该样品含有广州管圆线虫；若扩增结果没有出现大小为461bp谱带，则该样品中不含有广州管圆线虫。

5.LF-RPA反应体系建立

以已报道的登录号为AY295821.1的广州管圆线虫大亚基核糖体RNA基因组序列为模板，根据LF-RPA引物和探针实际原则，设计并合成特异性引物和特异性探针。LF-RPA扩增反应的下游引物5′端用生物素进行标记，特异性探针在上下游引物间的序列内进行设计，探针5′端用荧光素FAM进行标记，探针3′端用阻断聚合酶扩增的集团修饰(C3 Spacer)，探针中间使用四氢呋喃脱碱基位点(THF)取代序列上的一个碱基，从而实现修饰。将设计成功的引物和探针送至深圳百赛生物科技公司合成，上述的特异性引物和探针序列如表3所示。

表3

LF-RPA扩增反应的体系为29.5ul Rehydration Buffer缓冲液，11.2ul dd H₂O，2.1ul上游引物，2.1ul下游引物，0.6ul探针，2ul DNA模板，2.5ul 280mM的醋酸镁溶液。按照反应体系顺序依次加入反应液，将试剂盒中的醋酸镁溶液加入反应管的管盖上，盖上反应管盖并进行短暂离心。将反应管缓慢涡旋混匀，放置于37℃恒温箱中充分反应20min，在冰上停止反应。将LF-RPA扩增产物移取2ul到灭菌离心管中，加入98ul的运行缓冲液，充分涡旋混匀后，将10ul样品稀释液滴加至侧流层析免疫试纸条末端，并将侧流层析试纸条迅速转移到含有200ul反应缓冲液的1.5mlEP管中，室温孵育5-10min，观察结果。如果试纸条同时出现检测线和控制线，表明该样品含有广州管圆线虫DNA。如果试纸条只出现控制线，这该样品不含广州管圆线虫DNA，与此同时阴性对照试纸条只出现控制线，不出现检测线。

实施例2

为确定所建立的琼脂糖-RPA试剂盒最佳反应温度，测定广州管圆线虫DNA浓度和用量，固定已经优化后的浓度为20ng/ul，按照Twist Amp^TM basic Kits试剂盒说明书，配制多个RPA反应管，分别在5℃、10℃、15℃、20℃、25℃、30℃、35℃、40℃条件下进行，反应20min，取扩增产物加于配置好的2.5％琼脂糖凝胶中进行琼脂糖凝胶电泳检测，120V电压20分钟后观察结果。按上述琼脂糖-RPA试剂盒相同步骤，使用RPA nfo试剂来进行LF-RPA试剂盒最佳反应温度的确定，分别在5℃、10℃、15℃、20℃、25℃、30℃、35℃、40℃条件下进行，反应20min，结合侧流层析免疫试纸条检测，观察结果。

在20℃的反应条件下，琼脂糖-RPA方法电泳出现明显条带，而LF-RPA则出现清晰明确的紫红色检测线，随着反应温度的升高，扩增产量也随之增加。为了适应野外快速检测广州管圆线虫，探究人体温度37度是否可以进行扩增，本实验反应温度范围为5℃-40℃，如图1和图5所示：其中最佳反应温度范围为30℃-40℃(图1为8-10泳道，图5为试纸条7-9)。据此，本方法选用最佳反应温度37℃，人体体温即可进行反应。

实施例3

为确定RPA扩增的最佳反应时间，优化好广州管圆线虫DNA和引物的用量，设置反应温度同为37℃，使用RPA basic试剂盒和RPA nfo试剂盒配制多个相同条件的反应管，分别在反应5min、10min、15min、20min、25min、30min、35min、40min和5min这九个时间梯度取出反应管，置于冰上终止反应，在最后一反应管结束后，结合琼脂糖凝胶电泳和侧流层析试纸条的层析技术进行检测，观察扩增反应结果。如图2和图6所示：本实验结果显示，在37℃反应条件下，反应10min已经出现微弱条带(图2为泳道3，图6为试纸条2)，说明RPA反应在10min时已经开始扩增，在20min时即可产生大量可检测到的扩增产物，琼脂糖条带随着反应时间的增加不断加深，确定最适宜反应时间为20min。

实施例4

采用实施例1中的方法提取广州管圆线虫DNA，并将提取的模板DNA以紫外分光光度计测定浓度并稀释DNA浓度至20ng/ul，将提取得到的模板DNA依次进行10倍梯度稀释：10倍稀释、10²倍稀释、10³倍稀释、10⁴倍稀释、10⁵稀释、10⁶稀释、10⁷稀释为梯度浓度的灵敏度。制备浓度梯度模板后，取2ul进行RPA扩增反应并使用侧流横向试纸条进行检测，检测不同种属虫体模板对其灵敏度的影响。结果如图4和图8所示，泳道2-9和试纸条1-8依次为：20ng、2ng、200pg、20pg、2pg、200fg、20fg、2fg。广州管圆线虫DNA的特异性条带清晰、明亮，稀释至200pg时，特异性产物条带均清晰可见，说明本试剂盒灵敏度高，完全满足灵敏度的要求。

对不同种属的虫体的总DNA进行RPA琼脂糖凝胶检测方法的特异性评价，结果如图3和图7所示，通过图3的条带和图7的试纸条可以看出该等温扩增反应特异性很好，特异性引物只有配备相应物种的DNA才能检出阳性，与其它10种寄生虫无交叉反应，提示所建立的两种RPA试剂盒进行广州管圆线虫虫种诊断具有可行性和特异性。

实施例5

采集深圳市南山区新屋村褐云玛瑙螺18份，对褐云玛瑙螺样本进行处理，用试剂盒对实际生物样本进行检测。收集褐云玛瑙螺并称重记录，用锤子砸碎螺壳，取出螺肉。将螺肉放入匀浆机内，加入适量纯水进行研磨，取匀浆放入烧杯中静置20分钟，反复沉淀3次后收集沉淀液于50ml离心管中，5000xg离心30分钟并倒去上清液，收集沉淀于4℃冷藏室保存。采用实施例1中所收集的样本，用组织DNA提取试剂盒提取处理好的褐云玛瑙螺样本基因组DNA。按照对应的RPA反应体系进行扩增，观察RPA产物进行实际生物样本检测。

结果如图10和图11所示，泳道1为DL 2000 DNA Marker；泳道2-19为18份褐云玛瑙螺基因组DNA；泳道20为阴性对照；泳道21为阳性对照。通过图10的条带可以看出第2、3、9和18个生物样本(即分别对应第3、4、10和19泳道)是受到广州管圆线虫感染的褐云玛瑙螺，与微镜下检测广州管圆线虫的结果相同，说明RPA方法的检出率为100％，对实际生物样本进行检测是可行的。

以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (10)

1.一种检测广州管圆线虫的引物，其特征在于，包括：SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所示的引物对。

2.如权利要求1所述的引物，其特征在于，所述引物还包括SEQ ID NO.3所示的探针；其中，所述引物对的SEQ ID NO.2序列5端连接有生物素，所述探针的5端连接有荧光素，所述探针的3端连有封闭基团，所述探针从5端开始的第31-32个碱基之间插入有四氢呋喃。

3.如权利要求2所述的引物，其特征在于，所述荧光素为FAM，所示封闭基团为C3Spacer。

4.一种检测广州管圆线虫的试剂盒，包括扩增广州管圆线虫的引物，其特征在于，所述引物包括：SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所示的引物对。

5.如权利要求4所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒为琼脂糖-RPA等温扩增检测试剂盒，所述试剂盒还包括琼脂糖-RPA引物正控混合液、琼脂糖-RPA反应正控DNA模板，醋酸镁溶液和琼脂糖-RPA反应缓冲液。

6.如权利要求5所述试剂盒，其特征在于，所述试剂盒进行重组酶聚合酶扩增反应的体系为：29.5ul Rehydration Buffer缓冲液，11.2ul ddH₂O，2.4ul SEQ ID NO.1所示的上游引物，2.4ul SEQ ID NO.2所示的下游引物，2ul DNA模板，2.5ul 280mM的醋酸镁溶液。

7.如权利要求4所述的试剂盒，其特征在于，所述引物还包括SEQ ID NO.3所示的探针；其中，所述引物对的SEQ ID NO.2序列5端连接有生物素，所述探针的5端连接有荧光素，所述探针的3端连有封闭基团，所述探针从5端开始的第31-32个碱基之间插入有四氢呋喃。

8.如权利要求7所述的试剂盒，其特征在于，所述荧光素为荧光素，所示封闭基团为C3Spacer。

9.如权利要求7或8所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒为LF-RPA检测试剂盒，所述试剂盒还包括LF-RPA引物探针正控混合液，LF-RPA反应正控DNA模板，醋酸镁溶液，LF-RPA反应缓冲液，横向侧流层析试纸条和横向侧流层析试纸条缓冲液。

10.如权利要求9所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒进行重组酶聚合酶扩增反应的体系为：29.5ul Rehydration Buffer缓冲液，11.2ul ddH₂O，2.1ul SEQ ID NO.1所示的上游引物，2.1ul SEQ ID NO.2所示的下游引物，0.6ul探针，2ul DNA模板，2.5ul 280mM的醋酸镁溶液。

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