CN110904196A - 一种raa荧光法检测广州管圆线虫的引物、探针和试剂盒 - Google Patents

一种raa荧光法检测广州管圆线虫的引物、探针和试剂盒 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种RAA荧光法检测广州管圆线虫的引物、探针和试剂盒，属于分子生物学检测技术领域。本发明公开的一种RAA荧光法检测广州管圆线虫的试剂盒，包括引物探针组合物、RAA基础荧光通用反应试剂、反应缓冲液、阴性质控品、阳性质控品和临界阳性质控品。本发明方法快速、简便、特异性强、灵敏度高、性价比好。

Description

一种RAA荧光法检测广州管圆线虫的引物、探针和试剂盒
技术领域
本发明涉及分子生物学检测技术领域，更具体的说是涉及一种RAA荧光法检测广州管圆线虫的引物、探针和试剂盒。
背景技术
广州管圆线虫病是一种由广州管圆线虫感染引起的食源性寄生虫病，在我国的分布十分广泛，北至黑龙江省牡丹江市，南至广东省徐闻县，西到云南省景洪市，东至福建省闽侯县均有病例报道。广州管圆线虫是一种寄生于家鼠或大鼠肺部血管的线虫，食入其Ⅲ期幼虫后可引起人体致病，主要表现为以嗜酸性粒细胞浸润为主的中枢神经系统炎症反应，严重感染时可致患者死亡。广州管圆线虫生活史复杂，成虫寄生于家鼠或大鼠的肺部血管中，中间宿主为软体动物，主要包括陆地蜗牛类、淡水螺类和蛞蝓类等，而蛙、淡水蟹和鱼等可作为其转续宿主。人体主要因生食或半生食含Ⅲ期幼虫(感染性幼虫)的中间宿主或转续宿主而感染；在我国，大多数患者的感染与生食福寿螺和褐云玛瑙螺肉有关，尤其以福寿螺多见。
病原学检测是广州管圆线虫病的确诊依据，但由于患者脑脊液中虫体数量少、分布密度低以及虫体移行等原因，虫体的检出率极低。免疫学诊断方法是目前用于检测广州管圆线虫感染最常用的方法，其中ELISA是一种较为成熟的检测方法，具有较好的敏感性和特异性，但该方法不能鉴别现症和既往感染，假阳性、假阴性和交叉反应也经常出现。随着免疫学技术的发展，纯化抗原和基因工程抗原也广泛应用于广州管圆线虫病的诊断，但抗原的纯化需要足够的虫源，操作比较复杂，限制了该方法的应用。中间宿主(福寿螺等)或转续宿主(蛙、淡水蟹等)体内的幼虫检测目前采用的方法包括“肺检法”、酶消化法和直接研磨法，该类方法操作简便、成本低廉，但对于幼虫的鉴定需要有经验的专业技术人员参与，且操作花费时间较长，不适合现场大规模应用。PCR技术是近年来迅速发展起来的分子生物学检测技术，已广泛地应用于寄生虫学与寄生虫病研究领域，但由于PCR技术检测成本较高、操作繁琐以及检测时间较长等限制了其在现场的大规模应用。因此，提供一种RAA荧光法检测广州管圆线虫的引物、探针和试剂盒，用于快速、简便地检测广州管圆线虫及其幼虫，是本领域技术人员亟需解决的问题。
发明内容
有鉴于此，本发明提供了一种RAA荧光法检测广州管圆线虫的引物、探针和试剂盒，本发明方法快速、简便、特异性强、灵敏度高、性价比好。
为了实现上述目的，本发明采用如下技术方案：
一种RAA荧光法检测广州管圆线虫的引物探针组合物，所述引物序列如下：
上游引物：5’-TACGATCGATGATGTAGTGGTGGGTGGGTGGTTG-3’；SEQ ID NO.1；
下游引物：5’-TAGCGACATAGCCGCCAAATTATCATCACCATC-3’；SEQ ID NO.2；
所述探针在SEQ ID NO.3所示序列的第31位碱基修饰荧光报告基团，第33位碱基修饰淬灭基团，第32位碱基修饰四氢呋喃残基；
5’-TGTGATCAACAACGAGAAACCACCAACACATATACACGTTCACCTAGT-3’；SEQ ID NO.3。
进一步，所述荧光报告基团包括FAM、HEX、TET、JOE、VIC、ROX、Cy3或Cy5。
进一步，所述淬灭基团包括TAMRA、Eclipse、BHQ1、BHQ2、BHQ3或DABCYL。
进一步，一种RAA荧光法检测广州管圆线虫的试剂盒，包括引物探针组合物、RAA基础荧光通用反应试剂、反应缓冲液、阴性质控品、阳性质控品和临界阳性质控品。
本发明试剂盒包括40～80μL的引物探针组合物，优选为50～70μL，更优选为60μL；上游引物和下游引物的浓度分别为0.03～0.07mM，优选为0.04～0.06mM，更优选为0.05mM；探针的浓度为0.01～0.03mM，优选为0.02mM；引物和探针的溶剂优选为ddH2O。
RAA基础荧光通用反应试剂的管数优选为24管，RAA基础荧光通用反应试剂优选以冻干粉的形态提供。本发明对RAA基础荧光通用反应试剂的来源没有特殊限定，本发明的RAA基础荧光通用反应试剂采购自江苏奇天基因生物科技有限公司，货号为F00001。本发明提供的试剂盒包括1000～1800μL的反应缓冲液，优选为1200～1600μL，更优选为1400μL。反应缓冲液的pH值在7.0-8.4，更优选为7.4-8.0，最优选为7.6；反应缓冲液包括：450～550mM的Tris-HCl、200～300mM的MgAc和质量体积百分含量为5～15％的PEG10000；优选包括：480～520mM的Tris-HCl、220～280mM的MgAc和质量体积百分含量为8～12％的PEG10000；更优选包括：500mM的Tris-HCl、250mM的MgAc和质量体积百分含量为10％的PEG10000。
本发明提供的试剂盒优选包括阴性质控品25～35μL，阴性质控品为ddH2O；阴性质控品的体积优选为28～32μL，更优选为30μL。
本发明提供的试剂盒包括浓度为1.0×104～8copies/μL的阳性质控品，优选为1.0×104～6copies/μL，更优选为1.0×105copies/μL。在本发明中，阳性质控品为含有广州管圆线虫DNA片段的质粒，广州管圆线虫DNA片段的序列如SEQ ID NO.4所示。
本发明提供的试剂盒包括浓度为1.0×101～5copies/μL的临界阳性质控品，优选为1.0×101～3copies/μL，更优选为1.0×102copies/μL。在本发明中，临界阳性质控品为含有广州管圆线虫DNA片段的质粒，广州管圆线虫DNA片段的序列如SEQ ID NO.4所示。
RAA荧光法的反应体系为50μL；包括47μL反应缓冲液，2μL引物探针组合物，1μL样品、阴性质控品、阳性质控品或临界阳性质控品。
RAA荧光法的反应条件为：反应温度为25～42℃，优选为35～40℃，更优选为37℃；反应时间为15～25min，优选为18～22min，更优选为20min。
在本发明中，检测广州管圆线虫DNA的结果分析条件设定为：在20min内FAM荧光检测仪器检测到信号明显增强，增加的荧光值达到本底值的30％以上为阳性；在20min内FAM荧光仪器信号无增加，显示扩增结果为阴性。
在本发明中，待测样品为广州管圆线虫III期幼虫的DNA；待测样品的的制备方法包括：用组织样本DNA提取试剂盒提取广州管圆线虫成虫的DNA，操作步骤按照试剂盒说明书进行，得到样品。在试剂盒使用时，样品的量优选为1μL。
经由上述的技术方案可知，与现有技术相比，本发明公开提供了一种RAA荧光法检测广州管圆线虫的引物、探针和试剂盒，本发明方法简便快速：在20min内能够得到检测结果；特异性强、灵敏度高、性价比好。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据提供的附图获得其他的附图。
图1附图为本发明实施例1的检测扩增图；
图2附图为本发明实施例2的检测扩增图；
图3附图为本发明实施例3的检测扩增图；
其中，A1：阴性对照；A2：广州管圆线虫；A3：曼氏血吸虫；A4：似蚓蛔线虫；A5：华支睾吸虫；A 6：细粒棘球绦虫；A7：十二指肠钩口线虫。
具体实施方式
下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
本发明通过NCBI获得广州管圆线虫(Genebank：GU733321)174bp基因序列，具体序列如下所示：
CATCTACGTCGTCGTTACGATCGATGATGTAGTGGTGGGTGGGTGGTTGATGATGAGAGAATGTGATCAACAACGAGAAACCACCAACACATATACACGTTCACCTAGTGTATGATGGTGATGATAATTTGGCGGCTATGTCGCTAAAGTTGGTGGTATCGTCGTATAACACCG；SEQ ID NO.4。
根据SEQ ID NO.4所示的序列委托生工生物工程(上海)股份有限公司合成DNA质粒，质粒大小174bp；根据广州管圆线虫保守序列进行引物、探针设计，得到上游引物、下游引物和探针。
上游引物：5’-TACGATCGATGATGTAGTGGTGGGTGGGTGGTTG-3’；SEQ ID NO.1；
下游引物：5’-TAGCGACATAGCCGCCAAATTATCATCACCATC-3’；SEQ ID NO.2；
所述探针在SEQ ID NO.3所示序列的第31位碱基修饰荧光报告基团，第33位碱基修饰淬灭基团，第32位碱基修饰四氢呋喃残基；
5’-TGTGATCAACAACGAGAAACCACCAACACATATACACGTTCACCTAGT-3’；SEQ ID NO.3。
实施例1试剂盒的组成
表1试剂盒的组成
Figure BDA0002263159930000051
将5μL重组质粒转接大肠杆菌培养并提取出来的浓度为1010copies/μL DNA质粒制成不同梯度的的工作标准品，分别为：
工作标准品1，含有1.0×106copies/μL广州管圆线虫的ITS1基因的非传染性DNA片段。
工作标准品2，含有1.0×105copies/μL广州管圆线虫的ITS1基因的非传染性DNA片段。
工作标准品3，含有1.0×104copies/μL广州管圆线虫的ITS1基因的非传染性DNA片段。
工作标准品4，含有1.0×103copies/μL广州管圆线虫的ITS1基因的非传染性DNA片段。
工作标准品5，含有1.0×102copies/μL广州管圆线虫的ITS1基因的非传染性DNA片段。
工作标准品6，含有10copies/μL广州管圆线虫的ITS1基因的非传染性DNA片段。
反应体系配制：吸取376μL反应缓冲液，加入16μL引物探针组合物，充分混均；吸取混均后的缓冲液49μL试剂分别加入到7个装有RAA基础荧光通用反应试剂的管中，使冻干粉充分溶解并混均；在7个配制好的管中分别加入1μL阴性质控品、标准工作品6、标准工作品5、标准工作品4、标准工作品3、标准工作品2、标准工作品1为模板，每个反应管进行充分混均，每个反应管总体积为50μL；
检测仪器采用江苏奇天基因生物科技有限公司提供的RAA-F1620荧光检测仪；
仪器设置为：反应温度39℃，反应时间20min。
将混均的反应管放入RAA-F1620荧光检测仪中，在39℃反应20min。
检测结果如图1所示。结果显示最快2min明显有扩增，15min内所有标准工作品均有扩增，重复以上实施例，能得到相同的扩增荧光信号，重复性好。能检测到工作标准品6含有10copies/μL的荧光信号。
实施例2
试剂盒的组成与实施例1相同。
样本来源及DNA提取
样本由江苏省血吸虫病防治研究所提供，为广州管圆线虫III期幼虫，DNA提取采用商品化的组织样本DNA提取试剂盒，提取操作步骤按试剂盒说明书进行，提取好的DNA-80℃保存备用。
反应体系配制：取两个反应管，分别按如下操作，吸取47μL反应缓冲液，加入2μL引物探针组合物，充分混均；将混均后的缓冲液49μL试剂加入到装有RAA基础荧光通用反应试剂的管中，使冻干粉充分溶解并混均；在2个配制好的管中分别加入1μL阴性质控品、1μL提取好的样本DNA为模板，每个反应管进行充分混均，每个反应管总体积为50μL；
检测仪器采用江苏奇天基因生物科技有限公司提供的RAA-F1620荧光检测仪；
仪器设置为：反应温度39℃，反应时间20min。
将混均的反应管放入RAA-F1620荧光检测仪中，在39℃反应20min，检测结果如附图2所示。结果显示6min明显有扩增，重复以上实施例，能得到相同的扩增荧光信号，重复性好。
实施例3
试剂盒的组成同实施例1。
样本来源及DNA提取
所有样本均由江苏省血吸虫病防治研究所提供，包括广州管圆线虫III期幼虫、曼氏血吸虫成虫、十二指肠钩口线虫钩蚴、华支睾吸虫成虫、含似蚓蛔线虫虫卵的粪便、细粒棘球绦虫棘球蚴等样本，DNA提取采用QIAGEN试剂盒分别提取组织试剂盒和专用DNA提取试剂盒，提取操作步骤按试剂盒说明书进行，提取好的DNA-80℃保存备用。
反应体系配制：取7个反应管，分别按如下操作，吸取47μL反应缓冲液，加入2μL探针与引物的混合物，充分混均；将混均后的缓冲液49μL试剂加入到装有RAA基础荧光通用反应试剂的管中，使冻干粉充分溶解并混均；在7个配制好的管中分别加入1μL阴性质控品、1μL提取的广州管圆线虫DNA、1μL曼氏血吸虫DNA、1μL十二指肠钩口线虫DNA、1μL华支睾吸虫DNA、1μL似蚓蛔线虫DNA、1μL细粒棘球绦虫DNA作为模板，每个反应管进行充分混均，每个反应管总体积为50μL；
检测仪器采用江苏奇天基因生物科技有限公司提供的RAA-F1620荧光检测仪。
仪器设置为：反应温度39℃，反应时间20min。
将混均的反应管放入RAA-F1620荧光检测仪中，在39℃反应20min。
检测结果如图3所示，结果显示只有广州管圆线虫样本DNA明显有扩增，其他样本及阴性质控品均没有扩增，均为阴性，表明本发明的试剂盒特异性好。重复以上实施例，能得到相同的扩增荧光信号，重复性好。
由以上实施例可以得出，本发明提供的引物探针组合物能够快速检测广州管圆线虫，操作简便，在20min内能够得到检测结果。
对所公开的实施例的上述说明，使本领域专业技术人员能够实现或使用本发明。对这些实施例的多种修改对本领域的专业技术人员来说将是显而易见的，本文中所定义的一般原理可以在不脱离本发明的精神或范围的情况下，在其它实施例中实现。因此，本发明将不会被限制于本文所示的这些实施例，而是要符合与本文所公开的原理和新颖特点相一致的最宽的范围。
序列表
<110> 江苏省血吸虫病防治研究所 江苏奇天基因生物科技有限公司
<120> 一种RAA荧光法检测广州管圆线虫的引物、探针和试剂盒
<160> 4
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 34
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 1
tacgatcgat gatgtagtgg tgggtgggtg gttg 34
<210> 2
<211> 33
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 2
tagcgacata gccgccaaat tatcatcacc atc 33
<210> 3
<211> 48
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 3
tgtgatcaac aacgagaaac caccaacaca tatacacgtt cacctagt 48
<210> 4
<211> 174
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 4
catctacgtc gtcgttacga tcgatgatgt agtggtgggt gggtggttga tgatgagaga 60
atgtgatcaa caacgagaaa ccaccaacac atatacacgt tcacctagtg tatgatggtg 120
atgataattt ggcggctatg tcgctaaagt tggtggtatc gtcgtataac accg 174

Claims (10)

1.一种RAA荧光法检测广州管圆线虫的引物探针组合物，其特征在于，所述引物序列如下：
上游引物：5’-TACGATCGATGATGTAGTGGTGGGTGGGTGGTTG-3’；SEQ ID NO.1；
下游引物：5’-TAGCGACATAGCCGCCAAATTATCATCACCATC-3’；SEQ ID NO.2；
所述探针在SEQ ID NO.3所示序列的第31位碱基修饰荧光报告基团，第33位碱基修饰淬灭基团，第32位碱基修饰四氢呋喃残基；
5’-TGTGATCAACAACGAGAAACCACCAACACATATACACGTTCACCTAGT-3’；SEQ ID NO.3。
2.根据权利要求1所述的一种RAA荧光法检测广州管圆线虫的引物探针组合物，其特征在于，所述荧光报告基团包括FAM、HEX、TET、JOE、VIC、ROX、Cy3或Cy5。
3.根据权利要求1所述的一种RAA荧光法检测广州管圆线虫的引物探针组合物，其特征在于，所述淬灭基团包括TAMRA、Eclipse、BHQ1、BHQ2、BHQ3或DABCYL。
4.一种RAA荧光法检测广州管圆线虫的试剂盒，其特征在于，包括权利要求1～3任一项所述的引物探针组合物、RAA基础荧光通用反应试剂、反应缓冲液、阴性质控品、阳性质控品和临界阳性质控品。
5.根据权利要求4所述的一种RAA荧光法检测广州管圆线虫的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括引物探针组合物40～80μL，所述上游引物和下游引物的浓度分别为0.03～0.07mM，所述探针浓度为0.01～0.03mM；RAA基础荧光通用反应试剂24管冻干粉；反应缓冲液1000～1800μL；阴性质控品25～35μL；浓度为1.0×104～8copies/μL的阳性质控品；浓度为1.0×101～5copies/μL的临界阳性质控品。
6.根据权利要求4或5所述的一种RAA荧光法检测广州管圆线虫的试剂盒，其特征在于，所述阴性质控品为ddH2O。
7.根据权利要求6所述的一种RAA荧光法检测广州管圆线虫的试剂盒，其特征在于，所述阳性质控品和临界阳性质控品均为含有广州管圆线虫DNA片段的质粒；所述广州管圆线虫DNA片段的序列如SEQ ID NO.4所示。
8.根据权利要求7所述的一种RAA荧光法检测广州管圆线虫的试剂盒，其特征在于，所述反应缓冲液包括：450～550mM的Tris-HCl，200～300mM的MgAc和质量体积百分含量为5～15％的PEG10000。
9.根据权利要求8所述的一种RAA荧光法检测广州管圆线虫的试剂盒，其特征在于，所述RAA荧光法的反应体系为50μL；包括47μL反应缓冲液，2μL引物探针组合物，1μL样品、阴性质控品、阳性质控品或临界阳性质控品。
10.根据权利要求8所述的一种RAA荧光法检测广州管圆线虫的试剂盒，其特征在于，所述RAA荧光法的反应条件为：反应温度为25～42℃，反应时间为15～25min。
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