CN110791576A

CN110791576A - 检测曼氏血吸虫的引物组、探针及试剂盒

Info

Publication number: CN110791576A
Application number: CN201911333862.5A
Authority: CN
Inventors: 杨坤; 李伟; 赵松; 何健; 刘燕红; 应清界
Original assignee: Jiangsu Qitian Gene Biological Science & Technology Co Ltd; Jiangsu Institute of Parasitic Diseases
Current assignee: Jiangsu Qitian Gene Biological Science & Technology Co Ltd; Jiangsu Institute of Parasitic Diseases
Priority date: 2019-12-23
Filing date: 2019-12-23
Publication date: 2020-02-14

Abstract

本发明提供了一种检测曼氏血吸虫的引物组，所述引物组包括上游引物和下游引物；所述上游引物的序列如SEQ ID No.1所示；所述下游引物的序列如SEQ ID No.2所示。上述检测曼氏血吸虫的引物组、探针及试剂盒，操作简便，经试验验证，该检测曼氏血吸虫的引物组、探针及试剂盒用于检测曼氏血吸虫时，特异性强，灵敏度和准确度高，重复性好，能够在20分钟内获得检测结果，对检测条件以及检测人员技术要求不高，检测成本较低。

Description

检测曼氏血吸虫的引物组、探针及试剂盒

技术领域

本发明涉及分子生物学检测技术领域，特别是涉及一种检测曼氏血吸虫的引物组、探针及试剂盒。

背景技术

血吸虫病是严重危害人类健康的全球性寄生虫病。人体血吸虫病主要有5种，即日本、埃及、曼氏、间插和湄公血吸虫病，其中以埃及(Schistosoma haematobium)、曼氏(S.mansoni)和日本血吸虫(S.japonicum)感染引起的血吸虫病流行最为广泛。其中分布最为广泛、病人数最多的是曼氏血吸虫病，其分布于阿拉伯半岛、非洲和拉丁美洲的54个国家，受威胁人数约4～5亿。

随着我国赴境外劳务、援建、经商和旅游等人员的数量逐年增多，国外感染国内发病的输入性曼氏血吸虫病的病例也逐渐增加。20世纪70年代，曾有报道从赤道几内亚援外归国人员中发现大批曼氏血吸虫感染者。近年来，我国又不断有从非洲务工返国人员中发现曼氏血吸虫病输入性病例的报道。

曼氏血吸虫属于扁形动物门。在形态上，成虫表皮细节较小虫卵呈长卵圆形，侧棘长、大，为雌雄异体，雄虫较雌虫为短。雄虫卷曲形成抱雌沟，雌虫常居于抱雌沟内，与雄虫呈合抱状态。曼氏血吸虫生活史复杂，包括有性、无性两个世代，分别在终宿主即脊椎动物(猴、狒狒等灵长类、鼠等)、中间宿主即软体动物(双脐螺)内完成，成虫寄生在哺乳动的肠系膜上静脉或门静脉从而发育成两性成虫。分别经历卵、毛蚴、母胞蚴、子胞蚴、尾蚴、童虫和成虫等6个阶段的形态学及生理学改变。血吸虫病流行主要由以下5个环节构成，即：①传染源排出虫卵；②虫卵在水中孵出毛蚴；③毛蚴侵入中间宿主螺蛳；④螺内发育逸出尾蚴；⑤尾蚴感染终宿主，包括人、畜等哺乳动物。水是血吸虫病流行链中的关键环节，人主要因为接触了被尾蚴污染的水体而感染血吸虫，特别是青少年更容易感染。

血吸虫病的诊断一直处于血吸虫病防治的中心环节，及时有效地诊断血吸虫病患者，以确定吡喹酮化疗的目标人群，不仅可节约化疗成本，避免由于吡喹酮的反复化疗产生抗药性的潜在危险，而且可有效控制传染源，降低虫卵对环境的污染，具有十分重要的作用。经过多年积极有效的防治，血吸虫病的感染率和感染度有了明显的下降，传统的通过检查粪便虫卵的病原学诊断方法(Kato-katz法、毛蚴孵化法等)已无法满足疫区查病的需求，敏感性下降，漏检率增高；而检测抗体的免疫诊断方法，如环卵沉淀试验、间接血凝试验、酶联免疫吸附试验、胶体染料试纸条法等，虽具有较高的敏感性和特异性，且在血吸虫病筛查中发挥了重要的作用，但由于血吸虫感染后宿主体内的特异性抗体水平不会很快消失，且可存在很长一段时间，使得这些方法并不能区分现症感染和既往感染，常出现过度化疗的状况；另一类免疫诊断方法为检测血吸虫循环抗原的方法，从理论上讲可以作为确定现症感染患者的理想方法，但是从已发展的应用单克隆抗体检测血吸虫循环抗原的诸多方法的应用效果看，并不理想，其对慢性患者的检出率低，而且特异性差，无法满足血吸虫病诊断的需求。而近年来发展起来的LAMP(环介导等温核酸扩增技术，Loop-mediated isothermalamplification)以及qPCR(实时荧光定量PCR，Quantitative Real-time PCR)等检测技术具有简单、快速、特异性强等优点，但LAMP技术假阳性高，而qPCR技术需要专门用于热循环反应的温度控制设备，检测时间较长，对检验人员技术要求高，检测成本较高。因此，曼氏血吸虫病的检测急需一种快速简便、特异性强、灵敏度高、性价比好的曼氏血吸虫检测技术。

发明内容

基于此，有必要针对传统的曼氏血吸虫检测方法或病原分离培养繁琐困难，或假阳性高、或成本较高的技术问题，提供一种检测曼氏血吸虫的引物组、探针及试剂盒。

本发明提供的一种检测曼氏血吸虫的引物组，所述引物组包括上游引物和下游引物；

所述上游引物的序列如SEQ ID No.1所示；

所述下游引物的序列如SEQ ID No.2所示。

本发明还提供了一种检测曼氏血吸虫的探针，所述探针为如SEQ ID No.3所示序列经修饰获得。

在其中一个实施例中，所述探针为在SEQ ID No.3所示序列的第31位碱基修饰荧光报告基团、第34位碱基修饰淬灭基团和第33位碱基修饰四氢呋喃残基。

在其中一个实施例中，所述荧光报告基团包括FAM、HEX、TET、JOE、VIC、ROX、Cy3以及Cy5中的任意一种。

在其中一个实施例中，所述猝灭基团包括BHQ1、BHQ2、BHQ3、TAMRA、Eclipse以及DABCYL中的任意一种。

本发明还提供了一种检测曼氏血吸虫的试剂盒，所述试剂盒包括如上所述的引物组以及如上所述的探针组成的引物探针组合物。

在其中一个实施例中，所述试剂盒还包括RAA基础荧光通用反应试剂、反应缓冲液、阴性质控品、阳性质控品以及临界阳性质控品。

在其中一个实施例中，所述反应缓冲液包括450～550mM的Tris-HCl、200～300mM的MgAc以及质量体积百分含量为5％～15％的PEG10000。

在其中一个实施例中，所述阳性对照品为含有曼氏血吸虫DNA片段的质粒，所述临界阳性对照品为含有曼氏血吸虫DNA片段的质粒，所述曼氏血吸虫DNA片段的序列如SEQ IDNo.4所示。

在其中一个实施例中，所述引物探针组合物中，所述上游引物的浓度为0.03～0.07mM；所述下游引物的浓度为0.03～0.07mM；所述探针的浓度为0.01～0.03mM；

所述阳性质控品的浓度为1.0×10^4～8copies/μL；

所述临界阳性质控品的浓度为1.0×10^1～4copies/μL。

上述检测曼氏血吸虫的引物组、探针及试剂盒，操作简便，经试验验证，该检测曼氏血吸虫的引物组、探针及试剂盒用于检测曼氏血吸虫时，特异性强，灵敏度和准确度高，重复性好，能够在20分钟内获得检测结果，对检测条件以及检测人员技术要求不高，检测成本较低。

附图说明

为了更清楚地说明本申请实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明中记载的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，还可以根据这些附图获得其他的附图。

图1为本发明实施例1的敏感性评价试验的检测扩增图；

图2为本发明实施例1的曼氏血吸虫样本检测试验的检测扩增图；

图3为本发明实施例1的特异性评价试验的检测检测扩增图。

具体实施方式

为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下通过实施例，并结合附图，对本发明的瓦斯检测装置的控制方法及控制系统进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。

RAA(重组酶介导等温核酸扩增技术，Recombinase Aided Amplification)技术，是利用重组酶与引物形成酶和引物的聚合体，在模板DNA搜索与引物互补的序列区域，在单链DNA结合蛋白的作用下使模板DNA解链，并在DNA聚合酶的作用下形成新的DNA互补链，因此扩增形成均一的特定长度的基因片段。AA荧光法是RAA技术结合荧光探针的即时检测技术，本发明基于RAA荧光法，设计了检测曼氏血吸虫的引物组及探针，并提供了一种检测曼氏血吸虫的试剂盒，经试验验证，不仅特异性强，灵敏度和准确度高，重复性好，能够在20分钟内获得定性以及定量结果，对检测条件以及检测人员技术要求不高，检测成本较低。

本发明的第一大方面，提供了一种检测曼氏血吸虫的引物组，该引物组包括上游引物和下游引物；

上游引物的序列如SEQ ID No.1所示，具体表示为：5’-TGAATCCGACCAACCGTTCTATGAAAATCGT-3’。

下游引物的序列如SEQ ID No.2所示，具体表示为：5’-TCTTGTTTTATATTAACGCCCACGCTCTCGCA-3’。

本发明的第二大方面，提供了一种检测曼氏血吸虫的探针，该探针为如SEQ IDNo.3所示序列经修饰获得。

作为一种可选实施方式，本发明的探针为在SEQ ID No.3所示序列的第31位碱基修饰荧光报告基团、第34位碱基修饰淬灭基团和第33位碱基修饰四氢呋喃残基。其中，SEQID No.3所示序列具体表示为：5’-GTATCTCCGAAACCACTGGACGGATTTTTATGATGTTTGTTTTAGATTA-3’。

该探针的荧光报告基团修饰在离5’端碱基数31bp位置上，探针的淬灭基团修饰在离3’端碱基数16bp位置上；荧光报告基团与淬灭基团之间第2个碱基位置，由四氢呋喃残基修饰。

可选地，荧光报告基团包括FAM、HEX、TET、JOE、VIC、ROX、Cy3以及Cy5中的任意一种。

可选地，猝灭基团包括BHQ1、BHQ2、BHQ3、TAMRA、Eclipse以及DABCYL中的任意一种。

本发明的第三大方面提供一种检测曼氏血吸虫的试剂盒，试剂盒包括如上所述的引物组以及如上所述的探针组成的引物探针组合物。

作为一种可选实施方式，试剂盒还包括RAA基础荧光通用反应试剂、反应缓冲液、阴性质控品、阳性质控品以及临界阳性质控品。

可选地，阴性质控品为双蒸水。

可选地，反应缓冲液包括450～550mM的Tris-HCl、200～300mM的MgAc以及质量体积百分含量为5％～15％的PEG10000。

可选地，阳性对照品为含有曼氏血吸虫DNA片段的质粒，临界阳性对照品为含有曼氏血吸虫DNA片段的质粒，曼氏血吸虫DNA片段的序列如SEQ ID No.4所示。

在本发明中，通过NCBI(美国国家生物技术信息中心，National Center forBiotechnology Information)获得曼氏血吸虫121bp串联重复序列(Genebank：M61098.1)信息，该序列如SEQ ID NO.4所示，SEQ ID No.4所示序列具体表示为：

GATCTGAATCCGACCAACCGTTCTATGAAAATCGTTGTATCTCCGAAACCACTGGACGGATTTTTATGATGTTTGTTTTAGATTATTTGCGAGAGCGTGGGCGTTAATATAAAACAAGAAT。

在本发明的具体实施例中，含有如SEQ ID No.4所示序列的曼氏血吸虫DNA片段的质粒委托生工生物工程(上海)股份有限公司进行合成，质粒大小121bp。

可选地，引物探针组合物中，上游引物的浓度为0.03～0.07mM；下游引物的浓度为0.03～0.07mM；探针的浓度为0.01～0.03mM；阳性质控品的浓度为1.0×10^4～8copies/μL；临界阳性质控品的浓度为1.0×10^1～4copies/μL。

本发明提供的试剂盒中，包括40～80μL的引物探针组合物；更优选的包括50～70μL的引物探针组合物；更优选的包括60μL的引物探针组合物。

其中，引物探针组合物中，上游引物的浓度为0.03～0.07mM；下游引物的浓度为0.03～0.07mM；更优选的，引物探针组合物中，上游引物的浓度为0.04～0.06mM；下游引物的浓度为0.04～0.06mM。更优选的，引物探针组合物中，上游引物的浓度为0.05mM；下游引物的浓度为0.05mM。探针的浓度为0.01～0.03mM；更优选的，探针的浓度为0.02mM。在本发明中，引物组和探针的溶剂优选为双蒸水。

本发明提供的试剂盒中，包括25～35μL的阴性质控品；优选的包括28～32μL的阴性质控品；更优选的，包括30μL阴性质控品。在本发明中，阴性质控品优选为双蒸水。

本发明提供的试剂盒中，优选的包括浓度为1.0×10^4～8copies/μL的阳性质控品，更优选的包括浓度为1.0×10^4～6copies/μL的阳性质控品，更优选的包括浓度为1.0×10⁵copies/μL的阳性质控品。

本发明提供的试剂盒中，优选包括浓度为1.0×10^1～4copies/μL的临界阳性质控品，更优选的包括浓度为1.0×10^1～3copies/μL的临界阳性质控品，更优选的包括浓度为1.0×10²copies/μL的临界阳性质控品。

本发明提供的试剂盒优选包括RAA基础荧光通用反应试剂，RAA基础荧光通用反应试剂的管数优选为24管，RAA基础荧光通用反应试剂管的规格优选为150～250μL，更优选为200μL；RAA基础荧光通用反应试剂优选以冻干粉的形态提供。

本发明对所述RAA基础荧光通用反应试剂的来源没有特殊限定，本发明实施例中使用的RAA基础荧光通用反应试剂采购自江苏奇天基因生物科技有限公司，货号为F00001。

本发明提供的试剂盒中，优选包括1000～1800μL的反应缓冲液，更优选的包括1200～1600μL的反应缓冲液，更优选的包括1400μL的反应缓冲液。反应缓冲液的pH值优选为7.0～8.4，更优选为7.4～8.0，更优选为7.6。

本发明提供的试剂盒中，优选的反应缓冲液包括：450～550mM的Tris-HCl、200～300mM的MgAc以及质量体积百分含量为5％～15％的PEG10000；更优选的反应缓冲液包括：480～520mM的Tris-HCl、220～280mM的MgAc以及质量体积百分含量为8％～12％的PEG10000；更优选的反应缓冲液包括：500mM的Tris-HCl、250mM的MgAc以及质量体积百分含量为10％的PEG10000。

可选地，本发明的试剂盒在使用时，实时RAA荧光反应体系每50μL包括：47μL反应缓冲液，2μL引物探针组合物，1μL样品(或阴性质控品，或阳性质控品，或临界阳性质控品)。

进一步可选地，本发明的试剂盒在使用时，实时RAA荧光反应的条件如下：

实时RAA荧光反应的温度优选为30～42℃，更优选为35～40℃，更优选为39℃。

实时RAA荧光反应的时间优选为15～25min，更优选为18～22min，更优选为20min。

进一步可选地，本发明的试剂盒在使用时，检测曼氏血吸虫DNA的结果分析条件优选设定为：在20min内荧光检测仪器检测到信号明显增强，增加的荧光值达到本底值的30％以上为阳性；在20min内荧光仪器信号无增加，显示扩增结果为阴性。

在本发明中，待测样品包括曼氏血吸虫的虫卵、毛蚴、胞蚴、尾蚴、童虫及成虫中的任意一种或几种形态的DNA提取物。待测样品优选为曼氏血吸虫成虫的DNA。待测样品的制备方法优选为：用QIAGEN组织样本试剂盒提取曼氏血吸虫的DNA，操作步骤按照试剂盒说明书进行，得到待测样品。在试剂盒使用时，样品的量优选为0.5～1.5μL，样品的量更优选为1μL。

下面结合具体实施例对本发明检测曼氏血吸虫的引物组、探针及试剂盒进一步详细的介绍，本发明的技术方案包括但不限于以下实施例。

实施例1

试剂盒组成如表1所示，其中，本实施例中引物和探针委托生工生物工程(上海)股份有限公司进行合成合成，经过HPLC检测合格，探针的荧光报告基团为FAM，淬灭基团为BHQ1。经过修饰后的探针为GTATCTCCGAAACCACTGGACGGATTTTTA/i6FAMdT/G/idSp//iBHQ1dT/GTTTGTTTTAGATTA。

表1实施例1的试剂盒组成

敏感性评价试验

将5μL曼氏血吸虫基因重组DNA质粒转接大肠杆菌培养并提取出来的浓度为10¹⁰copies/μL DNA质粒制成不同梯度的的工作标准品，分别为：

工作标准品1，含有1.0×10⁶copies/μL曼氏血吸虫的121bp串联重复序列基因的非传染性DNA片段。

工作标准品2，含有1.0×10⁵copies/μL曼氏血吸虫的121bp串联重复序列基因的非传染性DNA片段。

工作标准品3，含有1.0×10⁴copies/μL曼氏血吸虫的121bp串联重复序列基因的非传染性DNA片段。

工作标准品4，含有1.0×10³copies/μL曼氏血吸虫的121bp串联重复序列基因的非传染性DNA片段。

工作标准品5，含有1.0×10²copies/μL曼氏血吸虫的121bp串联重复序列基因的非传染性DNA片段。

工作标准品6，含有1.0×10¹copies/μL曼氏血吸虫的121bp串联重复序列基因的非传染性DNA片段。

反应体系配制：吸取376μL反应缓冲液，加入16μL引物探针组合物，充分混均；吸取混均后的缓冲液49μL试剂分别加入到7个装有RAA基础荧光通用反应试剂的反应管中，使冻干粉充分溶解并混均；在7个配制好的管中分别加入1μL阴性质控品、标准工作品6、标准工作品5、标准工作品4、标准工作品3、标准工作品2、标准工作品1作为模板，反应管进行充分混均，每个反应管总体积为50μL。

检测仪器：采用江苏奇天基因生物科技有限公司提供的RAA-F1620荧光检测仪。

仪器设置为：反应温度39℃，反应时间为20分钟。

将混均的反应管放入RAA-F1620荧光检测仪中，在39℃反应20分钟。

检测结果如附图1所示，结果显示最快2分钟明显有扩增，15分钟内所有标准工作品均有扩增，重复以上实施例，能得到相同的扩增荧光信号，重复性好。并且能检测到工作标准品6含有1.0×10¹Copies/μL的荧光信号，敏感性高。

曼氏血吸虫样本检测试验

样本来源：样本由江苏省血吸虫病防治研究所提供，样本为曼氏血吸虫的成虫。

DNA提取：DNA提取采用商品化的组织样本DNA提取试剂盒，提取操作步骤按试剂盒说明书进行，提取好的DNA于-80℃保存备用。

反应体系配制：取2个反应管，分别按如下操作，吸取47μL反应缓冲液，加入2μL引物探针组合物，充分混均；将混均后的缓冲液49μL试剂加入到装有RAA基础荧光通用反应试剂的管中，使冻干粉充分溶解并混均；在2个配制好的管中分别加入1μL阴性质控品、1μL提取好的DNA作为模板，反应管进行充分混均，每个反应管总体积为50μL。

检测仪器：采用江苏奇天基因生物科技有限公司提供的RAA-F1620荧光检测仪；

仪器设置：反应温度39℃，反应时间20分钟。

将混均的反应管放入RAA-F1620荧光检测仪中，在39℃反应20分钟，检测结果如附图2所示。结果显示6分钟明显有扩增，重复以上实施例，能得到相同的扩增荧光信号，重复性好。

特异性评价试验

样本来源：样本由江苏省血吸虫病防治研究所提供，样本包括曼氏血吸虫成虫、日本血吸虫虫卵，十二指肠钩蚴培养物，肝吸虫样本为感染肝吸虫的鱼样本。

DNA提取：DNA提取采用商品化的组织样本DNA提取试剂盒，提取操作步骤按试剂盒说明书进行，提取好的DNA于-80℃保存备用。本实施例中，试剂盒购自QIAGEN公司。

反应体系配制：取5个反应管，分别按如下操作，吸取47μL反应缓冲液，加入2μL探针与引物的混合物，充分混均；将混均后的缓冲液49μL试剂加入到装有RAA基础荧光通用反应试剂的管中，使冻干粉充分溶解并混均；在5个配制好的管中分别加入1μL阴性质控品、1μL曼氏血吸虫成虫样本DNA、1μL日本血吸虫虫卵样本DNA、1μL十二指肠钩虫样本DNA、1μL肝吸虫样本DNA作为模板，反应管进行充分混均，每个反应管总体积为50μL。

仪器设置为：反应温度39℃，反应时间20分钟。

检测结果如图3所示，结果显示只有曼氏血吸虫成虫样本DNA明显有扩增，其他样本及阴性质控品均没有扩增，均为阴性，表明本发明的试剂盒特异性好。重复以上实施例，能得到相同的扩增荧光信号，重复性好。

由实施例1的以上实验结果可以得出，本发明提供的引物组、探针及相应的试剂盒能够快速检测曼氏血吸虫，操作简便，在20min内能够得到检测结果。

实施例2至8

采用与实施例1相同的试剂盒、相同的方法分别进行敏感性评价试验、曼氏血吸虫样本检测试验以及特异性评价试验，与实施例1不同之处在于仪器设置的反应温度与反应时间不同，具体区别如表2所示。

表2实施例2至8的反应条件

实施例2至8的各试验结果与实施例1相似，敏感性以及特异性高，重复性好。

实施例9

试剂盒组成如表3所示，其中，本实施例探针的荧光报告基团为FAM，淬灭基团为TAMRA。

表3实施例9的试剂盒组成

采用与实施例1相同的方法及试验条件进行敏感性评价试验、曼氏血吸虫样本检测试验以及特异性评价试验，试验结果与实施例1相似，敏感性以及特异性高，重复性好。

实施例10

试剂盒组成如表4所示，其中，本实施例探针的荧光报告基团为FAM，淬灭基团为BHQ1。

表4实施例10的试剂盒组成

实施例11

试剂盒组成如表5所示，其中，本实施例探针的荧光报告基团为FAM，淬灭基团为BHQ1。

表5实施例11的试剂盒组成

实施例12

试剂盒组成如表6所示，其中，本实施例探针的荧光报告基团为FAM，淬灭基团为BHQ1。

表6实施例12试剂盒的组成

实施例13至60

采用与实施例1相同的方法分别进行敏感性评价试验、曼氏血吸虫样本检测试验以及特异性评价试验，与实施例1不同之处仅在于试剂盒中探针的荧光报告基团以及淬灭基团不同，具体区别如表7所示。

表7实施例13至60的探针修饰基团

采用与实施例1相同的方法及试验条件进行敏感性评价试验、曼氏血吸虫样本检测试验以及特异性评价试验，试验结果与实施例1相似，采用本发明公开的荧光报告基团以及淬灭基团修饰的探针，应用在检测曼氏血吸虫的试验中，检测的敏感性以及特异性高，重复性好。

以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对本发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。

序列表

<110> 江苏省血吸虫病防治研究所

江苏奇天基因生物科技有限公司

<120> 检测曼氏血吸虫的引物组、探针及试剂盒

<130> WXI20190122

<160> 4

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 31

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<400> 1

tgaatccgac caaccgttct atgaaaatcg t 31

<210> 2

<211> 32

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<400> 2

tcttgtttta tattaacgcc cacgctctcg ca 32

<210> 3

<211> 49

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<400> 3

gtatctccga aaccactgga cggattttta tgatgtttgt tttagatta 49

<210> 4

<211> 121

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<400> 4

gatctgaatc cgaccaaccg ttctatgaaa atcgttgtat ctccgaaacc actggacgga 60

tttttatgat gtttgtttta gattatttgc gagagcgtgg gcgttaatat aaaacaagaa 120

t 121

Claims

1.一种检测曼氏血吸虫的引物组，其特征在于，所述引物组包括上游引物和下游引物；

所述上游引物的序列如SEQ ID No.1所示；

所述下游引物的序列如SEQ ID No.2所示。

2.一种检测曼氏血吸虫的探针，其特征在于，所述探针为如SEQ ID No.3所示序列经修饰获得。

3.根据权利要求2所述的探针，其特征在于，所述探针为在SEQ ID No.3所示序列的第31位碱基修饰荧光报告基团、第34位碱基修饰淬灭基团和第33位碱基修饰四氢呋喃残基。

4.根据权利要求3所述的探针，其特征在于，所述荧光报告基团包括FAM、HEX、TET、JOE、VIC、ROX、Cy3以及Cy5中的任意一种。

5.根据权利要求3或4所述的探针，其特征在于，所述猝灭基团包括BHQ1、BHQ2、BHQ3、TAMRA、Eclipse以及DABCYL中的任意一种。

6.一种检测曼氏血吸虫的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括如权利要求1所述的引物组以及如权利要求2至5任意一项所述的探针组成的引物探针组合物。

7.根据权利要求6所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括RAA基础荧光通用反应试剂、反应缓冲液、阴性质控品、阳性质控品以及临界阳性质控品。

8.根据权利要求7所述的试剂盒，其特征在于，所述反应缓冲液包括450～550mM的Tris-HCl、200～300mM的MgAc以及质量体积百分含量为5％～15％的PEG10000。

9.根据权利要求7所述的试剂盒，其特征在于，所述阳性对照品为含有曼氏血吸虫DNA片段的质粒，所述临界阳性对照品为含有曼氏血吸虫DNA片段的质粒，所述曼氏血吸虫DNA片段的序列如SEQ ID No.4所示。

10.根据权利要求7至9任意一项所述的试剂盒，其特征在于，所述引物探针组合物中，所述上游引物的浓度为0.03～0.07mM；所述下游引物的浓度为0.03～0.07mM；所述探针的浓度为0.01～0.03mM；

所述阳性质控品的浓度为1.0×10^4～8copies/μL；

所述临界阳性质控品的浓度为1.0×10^1～4copies/μL。