CN102827951A - 一种基因c型鸭甲型肝炎病毒定性和定量检测方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种基因C型鸭甲型肝炎病毒定性和定量检测方法，采用一对特异性引物，包括：上游引物DHAV-C FP、下游引物DHAV-C RP；以cDNA为模板，以优化的反应体系和条件进行PCR，扩增位于DHAV-C2C基因4639～4832位点的194bpDHAV-C特异片段，在所述检测的最佳反应体系和反应条件测得Ct值，即可实现对DHAV-C的定性；再由预先建立的荧光定量RT-PCR标准曲线获得所求病毒浓度。本发明可用于DHAV-C感染的快速诊断，并能对被检样本病毒荷载量进行准确定量，具有灵敏度高、特异性强、重复性好、高通量和易于标准化的优点。
Description
技术领域
本发明涉及家禽传染病诊断，具体涉及基因C型鸭甲型肝炎病毒荧光定量RT-PCR方法技术领域。
背景技术
近年来，由基因C型鸭甲型肝炎病毒(DHAV-C)引起的鸭病毒性肝炎广泛流行于韩国和中国，该病毒主要侵害3周龄内雏鸭，发病急，病死率高，严重影响养鸭业的发展。DHAV-C引起的鸭病毒性肝炎与基因A型鸭甲型肝炎病毒(DHAV-A)引起的鸭肝炎在流行病学、临床症状和病理变化等非常相似，只有借助实验室诊断才能鉴别，病毒分离鉴定是传染病病原学诊断的经典方法，但该方法至少需要1～2周才能确诊，费时费力，不能满临床实践中对传染病及早诊断、迅速采取有效措施进行防治的的需求。RT-PCR作为一种常规的分子生物学技术以其快速、灵敏、特异、操作简单等优点广泛用于人类和多种动物病毒病的诊断([1]Pritchard L I，Morrissy C，Van Phuc K，et al.Development of apolymerase chain reaction to detect Vietnamese isolates of duck virus enteritis.[J].Vet Microbiol，1999，68(1-2)：149-156.[2]Keramas G，Bang D D，Lund M，et al.Use of culture，PCR analysis，and DNA microarrays for detection of Campylobacterjejuni and Campylobacter coli from chicken feces.[J].J Clin Microbiol，2004，42(9)：3985-3991.[3]Lund M，Nordentoft S，Pedersen K，et al.Detection of
Campylobacter spp.in chicken fecal samples by real-time PCR.[J].J Clin Microbiol，2004，42(11)：5125-5132.[4]Identifcation of duck plague virus by polymerasechain reaction.[J].1999，43(1)：106-115.)。目前已有RT-PCR用于DHAV-C鸭肝炎的诊断韩国学者Kim等(Kim MC，Kwon YK，Joh SJ，et al.Differentialdiagnosis between type-specifc duck hepatitis virus type 1(DHV-1)and recentKorean DHV-1-like isolates using a multiplex polymerase chain reaction.[J].AvianPathology，2008,37(2)：171-177.)分别针对DHAV-A基因组的DRL-62基因和DHAV-C基因组的AP-04203基因设计了两对引物(AP1：
5’-GTTCCAAATGATGATTATTATG-3’；AP2：
5’-GGATCTGATTAGTACCAGATAAG-3’；CP1：CCC AY(C或T)GTCTAAGTCTTAATGGAT-3’；CP2：5’-CTAAAGGTGTCTGTATCCAAGC-3’)，建立了鉴别诊断DHAV-A和DHAV-C的双重RT-PCR方法，具体操作步骤如下：采集疑似鸭肝炎病毒感染鸭的肝脏，用Triol试剂提取总肝脏总RNA，用反转录试剂将肝脏总RNA反转录成cDNA作为模板，分别扩增DHAV-ADRL-62基因的897～1125位点229bp的特异片段和DHAV-CAP-04203基因的204～514位点311bp的特异片段，该方法对DHAV-C的最低检出量为100pg/反应。研究结果表明，该双重RT-PCR方法可用于DHAV-A和DHAV-C感染临床样本的鉴别诊断。宋永峰等(Levine P P J F.A hitherto-undescribedvirus disease of ducks in North America[J].Cornell Vet，1950(40)：71-76.)根据GenBank中已发表的DHAV-C全基因序列(DQ256134、DQ25613)，在非同源区域设计一对引物P1：5’-CTGAGAAGCGGGATATTAGT-3’；P2：5’-AATCAACCTAGACGGGGAAT-3’)，从其临床分离鉴定的DHAV-C样本中提取总RNA，以反转录得到的cDNA为模板，PCR扩增DHAV-C638bp的基因片段。该学者建立的RT-PCR方法能特异地检出DHAV-C，此方法对DHAV-C的最低检出量为21pg/反应。何冉娅等(Haider SA，Calnek BW.In vitro isolation，propagation，and characterization of duck hepatitis virus type III.[J].Avian Dis，1979，23(3)：715-729.)根据GenBank中已发表的DHAV-C全基因组序列(DQ256134、DQ25613)，应用Primer Primier 5.0设计一对特异性引物(P1：5’-TGTGCCTGAGAAGCGGGATA-3’；P2：5’-CCGAAAGTGGAGATTAGGTG-3’)，从广东省采集到的鸭病毒性肝炎病毒感染鸭的肝脏病料中采用Trizol试剂进行总RNA的提取，并将提取到的RNA反转录成cDNA，以cDNA为模板扩增DHAV-C705bp的基因片段。该学者建立的RT-PCR方法能特异地检出DHAV-C，并且此方法对DHAV-C的最低检出量为2×103pg/反应。另外，本发明申请的发明人(黄秋雪，汤承，聂培婷等.鸭甲型肝炎病毒基因A型和C型双重RT-PCR检测方法的建立[J].中国预防兽医学报，2012，34(2)：120-123.)根据GenBank中公布的DHAV-A和DHAV-C全基因组序列，应用Primer Premier5.0软件，针对DHAV-A的3C、3D和DHAV-C的2C区域分别设计了2对引物(DHAV-A P1：5’-GCAATGGCACTATGGGAGC-3’，DHAV-AP2：5’-GAGGAGGCTGAAACA-3’；DHAV-C P1：5’-TCCAACAGGGTCAAAGC-3’，DHAV-C P2：5’-AACTACTACAAGTCTGCCACG-3’)，扩增DHAV-A(259bp)和DHAV-C(194bp)的特异性片段，从四川省采集到的鸭病毒性肝炎病毒感染鸭的肝脏病料中提取总RNA，并以反转录得到的cDNA为模板，建立检测DHAV-A和DHAV-C的双重RT-PCR方法。该方法可用于临床样本的检测，最低检测限达到3.4×10-3pg/反应。RT-PCR用于病毒病的诊断虽然具有灵敏度高、快速、特异的特点，但是存在无法对检测样品进行准确定量、检测通量不高，且存在电泳等PCR后处理过程，易造成污染而出现假阳性等缺陷，限制了该方法的应用。荧光定量PCR(Real-Time RT-PCR，RRT-PCR)方法通过在反应体系中引入荧光信号，实现了荧光信号和PCR双放大，不仅大大提高了检测的灵敏度，而且不需要电泳等PCR后处理过程，在反应管中一次操作即可完成对数十至数百个样本的定性和定量，易于标准化，有效克服了PCR方法的不足。在传染病诊断中广泛应用(Mackay I M，Arden K E，Nitsche A.Real-time PCR in virology.[J].NucleicAcids Res，2002，30(6)：1292-1305和Heid C A，Stevens J，Livak K J，et al.Real timequantitative PCR.[J].Genome Res，1996，6(10)：986-994.)目前国内外尚未见检测DHAV-C的荧光定量PCR方法报道。
发明内容
鉴于现有技术的以上不足，本发明的目的是设计一种基因C型鸭甲型肝炎病毒荧光定量PT-PCR方法，使之能克服现有技术的缺点，使之能够有更高的灵敏度以降低漏诊率，并能实现对病毒的定量检测。
本发明的目的是通过如下的手段实现的。
一种DHAV-C定性和定量检测方法，采用一对特异性引物，包括：上游引物DHAV-C FP(SEQ ID No1)、下游引物DHAV-C RP(SEQ ID No2)；以cDNA为模板，进行荧光定量RT-PCR，扩增DHAV-C 194bp的特异片段，所述检测的最佳反应体系为20μL，包括：SYBR Green I master mix 10μL；上下游引物各0.4μL；cDNA模板2μL,补充去离子水至20μL；采用的反应条件为95℃预变性3min；95℃变性15s；60℃退火31s，进行30个以内循环，得到Ct值，即可用于DHAV-C感染的定性；由预先建立的的荧光定量RT-PCR反应的标准方程获得所检测病毒的荷载量。
采用本发明的方法，建立的荧光定量RT-PCR对DHAV-C的核酸最低检测限可达到3.4×10-4pg/反应，灵敏度更高，比Kim、宋永峰、何冉娅三位学者建立的RT-PCR对DHAV-C的检测的灵敏度分别高了2.9×105倍、6.2×104倍、5.9×106倍，比本发明人先前建立检测DHAV-A和DHAV-C的双重RT-PCR方法的灵敏度也提高了一个数量级，这保证了本发明方法可直接用于临床样本检测，DHAV-C感染进行定性和定量，与现有方法相比，检出率高，可大大降低漏诊率。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明作进一步说明。
1、主要试剂：
普通PCR试剂盒、荧光定量PCR试剂盒、pMD 19-T Vector、Amp、IPTG、X-Gal均购自宝生物工程(大连)公司；蛋白胨、酵母提取物、琼脂粉均购自Oxoid公司；胶回收试剂盒、质粒提取试剂盒购自北京天根生物有限公司；TrizolRNA提取试剂盒购自Invitrogen公司；反转录试剂盒购自上海博瑞克公司；
其它试剂均为国产分析纯。
主要仪器：
隔水式恒温培养箱：齐欣公司，中国上海
高速离心机：centrifuge 5804，Eppendorf公司，德国
超纯水仪Milli-Q：Millipore公司，法国
核酸蛋白检测仪：DU800，Beckman公司，美国
凝胶成像系统：Doc2000，Bio-Rad公司，美国
恒温水浴器：国华电器，中国江苏
核酸电泳仪：Powerpac universalTM，Bio-Rad公司，美国；
PCR仪：my cyclerTM，Bio-Rad公司，美国
梯度PCR仪：Bio-Rad公司，美国
荧光定量PCR仪：7300型，ABI公司，美国
移液器：Eppendorf公司，德国
2、引物设计和制取
根据20株GenBank登录的DHAV-C 2C基因序列，采用Primer Premier 5.0软件，采用NCBI网站BLAST工具对设计的引物进行检索，初步验证其特异性。引物序列见下表1。引物由上海生工生物工程公司合成。
表1引物信息
3、荧光定量PCR方法标准曲线的建立
将已知浓度的标准阳性质粒经过10倍梯度稀释，采用优化好的反应条件和反应体系进行荧光定量PCR反应。以病毒拷贝数的对数值为横坐标，Ct值为纵坐标，建立标准曲线。从标准曲线可见，本发明建立的实时荧光定量RT-PCR在1.68×104～1.68×109拷贝/μL内有良好的线性关系，其相关系数为0.998，标准方程为：Y=-3.348X+26.310，扩增效率为97.9％。
实施例1、
取16份病死鸭肝脏样本按1∶3加入灭菌的生理盐水后匀浆，反复冻融3次，10000rpm离心15min取上清液，加2000单位/mL双抗后经尿囊腔接种10日龄SPF鸭胚，各接种3枚，0.2mL/枚；空白对照组3枚，注射灭菌生理盐水，0.2mL/枚。37℃孵育，收获死亡鸭胚胚体和尿囊液。根据Invitrogen公司的Trizol说明书提取总RNA，RNA按照反转录试剂盒(日本TAKARA公司)说明书反转录合成cDNA。反应总体系为10μL：5×PrimescriptTM Buffer 2.0μL，PrimescriptTM RT Enzyme Mix I 0.5μL，Random 6 mers 1.0μL，RNA 2.0μL，Rnase Free H2O 4.5μL。混匀后放入PCR仪中进行反转录反应，反应条件为：37℃ 15min，85℃ 5s，4℃ 5min。以反转录得到的cDNA为模板，通过普通PCR反应鉴定这16份病死鸭肝脏样本为DHAV-C阳性。以反转录得到的cDNA为模板，使用Applied Biosystems公司荧光定量PCR仪7300型进行荧光定量PCR检测。反应体系为20μL：SYBR Green I master mix 10μL；取上述已制备的上下游引物各0.4μL；DNA模板2μL，补充去离子水至20μL。反应条件为：95℃预变性3min；95℃变性15s；60℃退火31s，共进行30个循环。实验结果显示，建立的荧光定量PCR方法对已鉴定(病毒分离、普通PCR鉴定)为DHAV-C阳性的16份肝脏临床样本的检出率为100％(16/16)。
实施例2
采用建立的检测DHAV-C的荧光定量PCR方法，对收集的38份临床样本进行检测。结果显示，有22份临床样本为DHAV-C阳性。其中1～5号临床样本检测的Ct值分别是3.43、4.07、9.00、4.37、9.97，代入标准方程Y=-3.348X+26.310，求得X的值，再算出10X，即可得出对DHAV-C的定量结果，依次为6.8×106拷贝/反应、4.4×106拷贝/反应、1.5×105拷贝/反应、3.6×106拷贝/反应和7.6×104拷贝/反应。
实施例3
将42只3日龄SPF雏鸭，饲养于SPF家禽隔离器内，颈部皮下注射DHAV-C，0.2mL/只，于感染后24h、48h及72h各取3只，颈动脉放血处死，取心脏、肝脏、脾脏、肺脏、肾脏、胸腺、法氏囊、胰、肠、脑等组织器官，按照Trizol RNA试剂盒提说明书步骤提组织样本总RNA，并按照反转录试剂盒说明书进行反转录，合成cDNA。以cDNA为模板，用本发明方法与本发明人先前建立检测DHAV-A和DHAV-C的双重RT-PCR方法同时进行检测，结果见表2：
表2：荧光定量RT-PCR和RT-PCR对DHAV-C的检出情况(N＝3)
由表2可看到，本发明方法对DHAV-C阳性样本的检出率为100％(90/90)，现有技术的最好条件只能达到检出率为6.7％(6/90)。本发明方法具有更为良好的检测灵敏度。
Claims (3)
1.一种基因C型鸭甲型肝炎病毒定性和定量检测方法，采用一对特异性引物，包括：上游引物DHAV-C FP、下游引物DHAV-C RP；以cDNA为模板，扩增194bp的目的片段，进行荧光定量PCR检测，所述检测的最佳反应体系为20μL，包括：SYBR Green I master mix 10μL；上下游引物各0.4μL；DNA模板2μL，补充去离子水至20μL；反应条件为95℃预变性3min；95℃变性15s；60℃退火31s，进行30个循环，得到Ct值，即可实现对被检测样本的定性检测；由预先测定的荧光定量标准曲线方程可获得所检测基因C型鸭甲型肝炎病毒拷贝数，实现对被检样本进行定量。
2.根据权利要求1所述一种基因C型鸭甲型肝炎病毒定性和定量检测方法，其特征在于：所述上游引物DHAV-C FP序列为：TCCAACAGGGTCAAAGC，所述下游引物DHAV-C RP序列为：AACTACTACAAGTCTGCCACG，扩增位于DHAV-C 2C基因4639～4832位点的片段。
3.根据权利要求1所述之一种基因C型鸭甲型肝炎病毒定性和定量检测方法，其特征在于，所述荧光定量标准曲线方程为：Y=-3.348X+26.310，X为所测病毒拷贝数，Y为Ct值。
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|---|---|
| CN (1) | CN102827951A (zh) |
Cited By (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN104232798A (zh) * | 2014-09-28 | 2014-12-24 | 武汉中博生物股份有限公司 | 鸭甲型肝炎病毒检测与基因a型和c型鉴别的多重荧光定量pcr方法及试剂盒 |
| CN108586608A (zh) * | 2018-04-13 | 2018-09-28 | 四川农业大学 | 一种dhav-1 2c蛋白多克隆抗体、重组融合蛋白及其制备方法 |
| CN108707696A (zh) * | 2018-06-07 | 2018-10-26 | 西南民族大学 | 一种基于恒温隔绝式荧光pcr平台的基因c型鸭甲肝病毒检测试剂盒及应用 |
Citations (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN102174476A (zh) * | 2010-12-29 | 2011-09-07 | 中国科学院微生物研究所 | 预防鸭病毒性肝炎的灭活疫苗及其制备方法 |
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Patent Citations (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN102174476A (zh) * | 2010-12-29 | 2011-09-07 | 中国科学院微生物研究所 | 预防鸭病毒性肝炎的灭活疫苗及其制备方法 |
Non-Patent Citations (2)
| Title |
|---|
| QIUXUE HUANG, ET AL: "Development of a Real-time Quantitative PCR for Detecting Duck Hepatitis A Virus Genotype C", 《JOURNAL OF CLINICAL MICROBIOLOGY》 * |
| 黄秋雪等: "鸭甲肝病毒基因A 型和C 型双重RT- PCR检测方法的建立", 《中国预防兽医学报》 * |
Cited By (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN104232798A (zh) * | 2014-09-28 | 2014-12-24 | 武汉中博生物股份有限公司 | 鸭甲型肝炎病毒检测与基因a型和c型鉴别的多重荧光定量pcr方法及试剂盒 |
| CN108586608A (zh) * | 2018-04-13 | 2018-09-28 | 四川农业大学 | 一种dhav-1 2c蛋白多克隆抗体、重组融合蛋白及其制备方法 |
| CN108707696A (zh) * | 2018-06-07 | 2018-10-26 | 西南民族大学 | 一种基于恒温隔绝式荧光pcr平台的基因c型鸭甲肝病毒检测试剂盒及应用 |
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