CN102827950A - 一种快速定量检测基因c型鸭甲型肝炎病毒的荧光pcr试剂盒 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种快速定量检测基因C型鸭甲型肝炎病毒的荧光PCR试剂盒，对基因C型鸭甲型肝炎病毒进行定性和定量检测快速地检测，包括：a)RNA裂解液，b)RNA酶抑制剂，c)逆转录酶，d)逆转录反应液，e)荧光定量反应液，f)SYBR

Premix Ex Taq^TM II，g)标准阳性模板，d)逆转录反应液；e)荧光定量反应液含有引物和无菌双蒸水；f)SYBR

Premix Ex TaqTM II含有TaKaRa Ex Taq HS，dNTP Mixture，Mg2+，SYBRGreen I。本发明敏度达到3.36×10³拷贝/反应，完全可以满足基因C型鸭甲型肝炎病毒的快速特异性检测。

Description

一种快速定量检测基因C型鸭甲型肝炎病毒的荧光PCR试剂盒

技术领域

本发明涉及家禽传染病诊断，具体涉及基因C型鸭甲型肝炎病毒荧光定量RT-PCR方法技术领域。

背景技术

近年来，由基因C型鸭甲型肝炎病毒(DHAV-C)引起的鸭病毒性肝炎广泛流行于韩国和中国，该病毒主要侵害3周龄内雏鸭，发病急，病死率高，严重影响养鸭业的发展。DHAV-C引起的鸭病毒性肝炎与基因A型鸭甲型肝炎病毒(DHAV-A)引起的鸭肝炎在流行病学、临床症状和病理变化等非常相似，只有借助实验室诊断才能鉴别，病毒分离鉴定是传染病病原学诊断的经典方法，但该方法至少需要1～2周才能确诊，费时费力，不能满临床实践中对传染病及早诊断、迅速采取有效措施进行防治的的需求。RT-PCR作为一种常规的分子生物学技术以其快速、灵敏、特异、操作简单等优点广泛用于人类和多种动物病毒病的诊断。

以上内容可参阅

[1]Pritchard L I，Morrissy C，Van Phuc K，et al.Development of a polymerasechain reaction to detect Vietnamese isolates of duck virus enteritis.[J].VetMicrobiol，1999，68(1-2149-156.

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目前已有RT-PCR用于DHAV-C鸭肝炎的诊断韩国学者Kim等(Kim MC，Kwon YK，Joh SJ，et al.Differential diagnosis between type-specific duck hepatitisvirus type 1(DHV-1)and recent Korean DHV-1-like isolates using a multiplexpolymerase chain reaction.[J].Avian Pathology，2008，37(2)：171-177.)分别针对DHAV-A基因组的DRL-62基因和DHAV-C基因组的AP-04203基因设计了两对引物(AP1：5’-GTTCCAAATGATGATTATTATG-3’；AP2：5’-GGATCTGATTAGTACCAGATAAG-3’；CP1：CCCAY(C或T)GTCTAAGTCTTAATGGAT-3’；CP2：5’-CTAAAGGTGTCTGTATCCAAGC-3’)，建立了鉴别诊断DHAV-A和DHAV-C的双重RT-PCR方法，具体操作步骤如下：采集疑似鸭肝炎病毒感染鸭的肝脏，用Triol试剂提取总肝脏总RNA，用反转录试剂将肝脏总RNA反转录成cDNA作为模板，分别扩增DHAV-ADRL-62基因的897～1125位点229bp的特异片段和DHAV-CAP-04203基因的204～514位点311bp的特异片段，该方法对DHAV-C的最低检出量为100pg/反应。研究结果表明，该双重RT-PCR方法可用于DHAV-A和DHAV-C感染临床样本的鉴别诊断。宋永峰等(Levine P P J Ahitherto-undescribed virus disease of ducks inNorth America[J].Cornell Vet，1950(40)：71-76.)根据GenBank中已发表的DHAV-C全基因序列(DQ256134、DQ25613)，在非同源区域设计一对引物P1：5’-CTGAGAAGCGGGATATTAGT-3’；P2：5’-AATCAACCTAGACGGGGAAT-3’)，从其临床分离鉴定的DHAV-C样本中提取总RNA，以反转录得到的cDNA为模板，PCR扩增DHAV-C638bp的基因片段。该学者建立的RT-PCR方法能特异地检出DHAV-C，此方法对DHAV-C的最低检出量为21pg/反应。何冉娅等(HaiderSA，Calnek BW.In vitro isolation，propagation，and characterization of duckhepatitis virus typeIII.[J].Avian Dis，1979，23(3)：715-729.)根据GenBank中已发表的DHAV-C全基因组序列(DQ256134、DQ25613)，应用Primer Primier5.0设计一对特异性引物(P1：5’-TGTGCCTGAGAAGCGGGATA-3’；P2：5’-CCGAAAGTGGAGATTAGGTG-3’)，从广东省采集到的鸭病毒性肝炎病毒感染鸭的肝脏病料中采用Trizol试剂进行总RNA的提取，并将提取到的RNA反转录成cDNA，以cDNA为模板扩增DHAV-C 705bp的基因片段。该学者建立的RT-PCR方法能特异地检出DHAV-C，并且此方法对DHAV-C的最低检出量为2×10³pg/反应。另外，本发明申请的发明人(黄秋雪，汤承，聂培婷等.鸭甲型肝炎病毒基因A型和C型双重RT-PCR检测方法的建立[J].中国预防兽医学报，2012，34(2)：120-123.)根据GenBank中公布的DHAV-A和DHAV-C全基因组序列，应用Primer Premier5.0软件，针对DHAV-A的3C、3D和DHAV-C的2C区域分别设计了2对引物(DHAV-AP1：5’-GCAATGGCACTATGGGAGC-3’，DHAV-AP2：5’-GAGGAGGCTGAAACA-3’；DHAV-CP1：5’-TCCAACAGGGTCAAAGC-3’，DHAV-CP2：5’-AACTACTACAAGTCTGCCACG-3’)，扩增DHAV-A(259bp)和DHAV-C(194bp)的特异性片段，从四川省采集到的鸭病毒性肝炎病毒感染鸭的肝脏病料中提取总RNA，并以反转录得到的cDNA为模板，建立检测DHAV-A和DHAV-C的双重RT-PCR方法。该方法可用于临床样本的检测，最低检测限达到3.4×10^-3pg/反应。RT-PCR用于病毒病的诊断虽然具有灵敏度高、快速、特异的特点，但是存在无法对检测样品进行准确定量、检测通量不高，且存在电泳等PCR后处理过程，易造成污染而出现假阳性等缺陷，限制了该方法的应用。荧光定量PCR(Real-Time RT-PCR，RRT-PCR)方法通过在反应体系中引入荧光信号，实现了荧光信号和PCR双放大，不仅大大提高了检测的灵敏度，而且不需要电泳等PCR后处理过程，在反应管中一次操作即可完成对数十至数百个样本的定性和定量，易于标准化，有效克服了PCR方法的不足。在传染病诊断中广泛应用

(Mackay I M，Arden KE，Nitsche A.Real-time PCR in virology.[J].Nucleic AcidsRes，2002，30(6)：1292-1305和Heid C A，Stevens J，Livak K J，et al.Real timequantitative PCR.[J].Genome Res，1996，6(10)：986-994.)目前国内外尚未见检测DHAV-C的荧光定量PCR方法报道。也未见可使检测方便快速实现的相应试剂盒面世和文献报道。

发明内容

鉴于现有的技术的缺点，本发明的目的是提供一种快速定量检测基因C型鸭甲型肝炎病毒的荧光PCR试剂盒，并使之具有使用方便，灵敏度高的优点。

本发明的目的是通过如下的手段实现的：

一种快速定量检测基因C型鸭甲型肝炎病毒的荧光PCR试剂盒，对基因C型鸭甲型肝炎病毒进行定性和定量检测快速地检测，包括：

a)RNA裂解液，b)RNA酶抑制剂，c)逆转录酶，d)逆转录反应液，e)荧光定量反应液，f)荧光染料，g)标准阳性模板；

所述逆转录反应液含有5×PrimeScript

Buffer，引物Random 6 mers和无菌双蒸水；荧光定量反应液含有引物和无菌双蒸水，引物为正向引物和反向引物，分别为5’-TCCAACAGGGTCAAAGC-3’(SEQ ID No1)和5’-AACTACTACAAGTCTGCCACG-3’(SEQ ID No2)所示的核苷酸序列；所述标准阳性模板是含有基因C型鸭甲型肝炎病毒5’端194个核苷酸片段插入pMD19-T载体构成的，且该载体可在大肠杆菌DH5α中增殖；所述荧光染料采用SYBR

PremixExTaq^TM II，含有TaKaRa Ex Taq HS，dNTP Mixture，Mg2+，SYBR

GreenI。

本发明检测基因C型鸭甲型肝炎病毒的荧光PCR试剂盒中，采用了SYBR Green染料。SYBR Green是荧光定量PCR最常用的DNA结合染料，可以与DNA双链结合并发出荧光。在游离状态下，SYBR Green发出微弱的荧光，一旦与PCR产物结合后，其荧光增强到游离状态的1000倍。所以，一个反应发出的全部荧光信号与扩增的PCR产物量成正比，可以根据荧光信号检测出PCR产物的量。对基因C型鸭甲型肝炎病毒的定量可通过与标准品的循环阈值(Ct，Threshold Cycle)相比较得出。Ct值是PCR过程中，荧光信号的积累超过基底荧光量的循环数，Ct值与起始模板数呈一定比例关系，Ct值越小，起始模板数越多，相反，Ct值越大，起始模板数越少。利用阳性梯度标准模板的Ct值制成标准曲线，再根据待测样品的Ct值可准确测出该样品的起始拷贝数。

在本发明的一个优选方案中，标准阳性模板是含有基因C型鸭甲型肝炎病毒5’端194个核苷酸片段插入pMD19-T载体，且该载体可在大肠杆菌DH5α中增殖。储存浓度为1.68×10¹⁰拷贝/μl，使用前系列稀释。实验所用的标准品为含有目的扩增片段的质粒，该质粒转化大肠杆菌DH5α增殖后用碱裂解法提取，经DNA纯化试剂盒纯化，用分光光度计测A260定量并稀释至1.68×10¹⁰拷贝/μl，-20℃保存。

本发明提供检测基因C型鸭甲型肝炎病毒的荧光PCR试剂盒针对基因C型鸭甲型肝炎病毒检测中的特殊性，对不同的靶序列进行反应体系，如引物浓度、退火温度等的优化，并将荧光定量RT-PCR技术和定量检测系统相结合，将其用于基因C型鸭甲型肝炎病毒的定性和定量检测。通过优化方案，反复实验，以及与传统的基因C型鸭甲型肝炎病毒鉴定的方法进行比较，建立了检测基因C型鸭甲型肝炎病毒的定性和定量方法，并研制出基因C型鸭甲型肝炎病毒定性和定量检测的试剂盒，该试剂盒的灵敏度达到3.36×10³拷贝/反应，完全可以满足基因C型鸭甲型肝炎病毒的快速特异性检测。

在发明的另外一个方面，还提供了使用本发明的试剂盒对基因C型鸭甲型肝炎病毒进行检测的方法，该方法包括以下步骤：

1)用c)标准阳性模板制备阳性标准品，并用紫外分光光度计定量；

2)RNA裂解液从待测样本中提取RNA，然后加入逆转录酶、RNA酶抑制剂和逆转录反应液逆转录成cDNA；

3)分别取2)步中的cDNA和同样量系列稀释的1)步中的阳性标准品加入到含荧光定量反应液和SYBR

Premix Ex TaqTM II的PCR反应体系中用荧光定量PCR仪进行检测；

3)通过比较待测样品和阳性标准品的循环阈值而对待测样品的起始拷贝数进行定量。

本发明与现有技术相比具有以下优点和效果：

1、定量准确；

2、检测速度快，仅2小时，加上核酸的提取和cDNA的制备，共仅需4小时左右；

3、步骤简单；

4、可同时进行高通量的样品检测。

具体实施方式

下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应当理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明要求保护的范围。

实施例1基因C型鸭甲型肝炎病毒的荧光PCR试剂盒组成

A)试剂组成：

RNA裂解液、RNA酶抑制剂、逆转录酶、5×PrimeScript

Buffer，引物Random6mers和SYBR

Premix Ex TaqTM II购自大连宝生物公司；

B)SYBR

Premix Ex TaqTM II含有TaKaRa Ex Taq HS，dNTP Mixture，Mg²⁺，SYBR

Green I；

C)逆转录反应液：5×PrimeScriptBuffer 2μL，Random 6 mers 2μL，无菌双蒸水3.5μL；

D)荧光定量反应液：正向引物和反向引物各0.4μL(10μmol/L)，无菌双蒸水7.2μL；

E)自备试剂：氯仿、异丙醇、DEPC处理的无菌双蒸水、用DEPC处理的无菌双蒸水配制的75％乙醇。

实施例2对临床样本的检测

A).将阳性标准品进行10倍系列稀释，分别取荧光定量反应液各8μL，SYBR

Premix Ex TaqTM II各1μL，阳性标准模板各2μL，每个阳性标准模板做三个平行对照，分别加入不同的PCR反应管，在荧光定量PCR仪上平行做PCR检测。反应条件为：95℃预变性3min；95℃变性15s；60℃退火31s，共进行30个循环。

以阳性标准品稀释度的对数为横坐标，Ct值为纵坐标，建立标准曲线。从标准曲线可见，在1.68×10⁴～1.68×10⁹拷贝/μL内有良好的线性关系，其相关系数为0.998，标准方程为：Y＝-3.348X+26.310，扩增效率为97.9％。

B).取待检样品各100mg左右，分别加RNA裂解液1ml混匀，室温静置5min，加0.3ml氯仿，混匀后室温静置5min，于4℃12000r/min离心15min，上清液转移到另一个离心管，加0.5ml异丙醇，室温静置10min，于4℃12000r/min离心10min，轻轻倒出上清，加1ml 75％乙醇于4℃12000r/min离心5min，弃上清，RNA沉淀在室温下自然晾干，加入DEPC处理过的无菌双蒸水20μL溶解RNA。

C).取B)步所提取的RNA各2μL，加入逆转录酶各0.5μL，逆转录反应液各7.5μL。37℃15min；85℃5s，将RNA逆转录成cDNA。

D).分别取荧光定量反应液各8μL，SYBRPremix Ex TaqTM II各10μL和C)步所得cDNA各2μL，分别加入不同的PCR反应管，在荧光定量PCR仪上平行做PCR检测。反应条件为：95℃预变性3min；95℃变性15s；60℃退火31s，共进行30个循环。

C).PCR反应结束后，将获得的Ct值代入标准方程中的Y，求得X，待测样品中基因C型鸭甲型病毒的拷贝数则为10^X，如1～5号临床样本检测的Ct值分别是3.43、4.07、9.00、4.37、9.97，代入标准方程Y＝-3.348X+26.310，求得X的值，再算出10^X，即可得出对DHAV-C的定量结果依次为6.8×10⁶拷贝/反应、4.4×10⁶拷贝/反应、1.5×10⁵拷贝/反应、3.6×10⁶拷贝/反应和7.6×10⁴拷贝/反应。

Claims (2)

1.一种快速定量检测基因C型鸭甲型肝炎病毒的荧光PCR试剂盒，对基因C型鸭甲型肝炎病毒进行定性和定量检测快速地检测，包括：

a)RNA裂解液，b)RNA酶抑制剂，c)逆转录酶，d)逆转录反应液，e)荧光定量反应液，f)荧光染料，g)标准阳性模板；

所述逆转录反应液含有5×PrimeScript

Buffer，引物Random 6 mers和无菌双蒸水；荧光定量反应液含有引物和无菌双蒸水，引物为正向引物和反向引物，分别为5’-TCCAACAGGGTCAAAGC-3’和5’-AACTACTACAAGTCTGCCACG-3’所示的核苷酸序列；所述标准阳性模板是含有基因C型鸭甲型肝炎病毒5’端194个核苷酸片段插入pMD19-T载体构成的，且该载体可在大肠杆菌DH5α中增殖；所述荧光染料采用SYBRPremix Ex Taq^TM II，含有TaKaRa Ex Taq HS，dNTP Mixture，Mg2+，SYBRGreen I。

2.根据权利要求1所述之快速定量检测基因C型鸭甲型肝炎病毒的荧光PCR试剂盒，其特征在于，所述逆转录反应液含有5×PrimeScript

Buffer，引物Random 6 mers和无菌双蒸水。