CN113930546A - J亚型禽白血病病毒gp85基因的RT-RAA荧光法检测引物对、试剂盒及检测方法 - Google Patents

J亚型禽白血病病毒gp85基因的RT-RAA荧光法检测引物对、试剂盒及检测方法 Download PDF

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Abstract

本发明涉及分子生物学技术领域，特别是涉及J亚型禽白血病病毒gp85基因的RT‑RAA荧光法检测引物对、试剂盒及检测方法。本发明所述引物对包括正向引物和反向引物；所述正向引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，反向引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。本发明提供的引物对可以特异性扩增J亚型禽白血病病毒gp85基因，利用该引物对可以特异性检测J亚型禽白血病病毒，且检测周期更短、特异性更强。

Description

J亚型禽白血病病毒gp85基因的RT-RAA荧光法检测引物对、试 剂盒及检测方法
技术领域
本发明涉及分子生物学技术领域，特别是涉及J亚型禽白血病病毒gp85基因的RT-RAA荧光法检测引物对、试剂盒及检测方法。
背景技术
禽白血病是由反转录病毒科禽反转录病毒属的禽白血病病毒(Avianleukosisvirus，ALV)引起的，以造血细胞增生为主的一类肿瘤性疾病，主要是淋巴细胞性禽白血病，其次是成红细胞性禽白血病、成髓细胞性禽白血病、结缔组织肿瘤、肾瘤、肾胚细胞瘤，以及各种其他上皮性肿瘤、内皮性肿瘤和神经肿瘤。近几年髓细胞样禽白血病呈现逐步上升的趋势，替代淋巴禽白血病成为主要类型。
国内目前各地流行的禽白血病的ALV主要是A、B、J亚群，在这三个亚群中，J型感染程度最为严重，而且在蛋鸡、肉鸡和很多地方品系的鸡群中都有所发现。然而，到目前为止，J亚群禽白血病尚无有效的治疗药物与疫苗。近十年来，ALV-J已经从传染性强的慢性致瘤性病毒演变成传染性很强的急性致瘤性病毒，给ALV-J的防控带来一定困难。
ALV-J的控制和清除在于尽早地诊断病鸡，因此，研究ALV-J的诊断方法十分必要。ALV-J的ELISA诊断方法用于检测群特异性抗原，但却会因为检测到内源性病毒群特异性抗原而出现假阳性。
发明内容
为了解决上述问题，本发明提供了J亚型禽白血病病毒gp85基因的RT-RAA(重组酶介导链替换核酸扩增法)荧光法检测引物对、试剂盒及检测方法。本发明提供的引物对可以特异性扩增J亚型禽白血病病毒gp85基因，利用该引物对可以检测低拷贝模板的J亚型禽白血病病毒核酸且规避因内源性禽白血病毒引起的假阳性现象，特异性更强。与现有的常规检测方法相比，检测周期更短。
为了实现上述目的，本发明提供如下技术方案：
本发明提供了一种J亚型禽白血病病毒gp85基因的RT-RAA荧光法检测引物对，所述引物对包括正向引物和反向引物；所述正向引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，反向引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。
本发明还提供了上述引物对在制备检测J亚型禽白血病病毒的试剂或试剂盒中的应用。
本发明还提供了一种检测J亚型禽白血病病毒的试剂盒，所述试剂盒包括上述的引物对。
优选的，所述试剂盒还包括针对J亚型禽白血病病毒gp85基因设计的探针。
优选的，所述探针包括核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示的探针。
优选的，所述试剂盒还包括阳性对照品和阴性对照品；
所述阳性对照品包括含有J亚型禽白血病病毒SCAU1903的核酸；所述阴性对照品包括ddH2O。
优选的，所述阳性对照品的扩增碱基序列如SEQ ID NO.4所示。
本发明提供了一种非诊断目的的检测J亚型禽白血病病毒的方法，包括如下步骤：
提取待测样本的RNA，以待测样本的RNA为模板，利用上述的试剂盒进行RT-RAA反应；
结果判定：若出峰时间≤19.5min或Ct值≤39，则待测样本为J亚型禽白血病病毒阳性阳性；若出峰时间＞19.5min或Ct值＞39，则待测样本为J亚型禽白血病病毒阳性阴性。
优选的，所述RT-RAA的反应温度为41℃，反应时间为20～30min。
优选的，所述试剂盒中的引物对的正向引物和反向引物的工作浓度均为10μmol/L；所述试剂盒中的探针的工作浓度为10μmol/L。
有益效果：
本发明提供了一种J亚型禽白血病病毒gp85基因的RT-RAA荧光法检测引物对，所述引物对包括正向引物和反向引物；所述正向引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，反向引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。本发明提供的引物对可以特异性扩增J亚型禽白血病病毒gp85基因，与A亚型禽白血病病毒、B亚型禽白血病病毒、C亚型禽白血病病毒、D亚型禽白血病病毒、E亚型禽白血病病毒、K亚型禽白血病病毒、新城疫病毒、禽传染性支气管炎病毒、马立克氏病毒、禽传染性法氏囊病毒、禽网状内皮组织增生症病毒和H9N2亚型禽流感病毒的核酸均无交叉反应，特异性强。利用该引物对可以检测低拷贝的J亚型禽白血病病毒核酸且规避因内源性禽白血病毒引起的假阳性现象，克服现有的常规方法的不足之处；利用该引物对制备的试剂盒可以在20～30min内完成检测、具有操作简便、成本低、灵敏度高、假阳性率低等特点，是传统方法所不具备的。
附图说明
图1为实施例1中初始设计的12组引物对和探针荧光RT-RAA检测结果图；
图2为实施例1中初始设计的12组引物对和探针荧光RT-RAA试剂样品检测结果图；
图3为二次设计的12组引物对和探针荧光RT-RAA检测结果图；
图4为本发明实施例2中J亚型禽白血病病毒gp85基因引物对PCR扩增产物的琼脂糖电泳结果图；
图5为本发明实施例4中J亚型禽白血病病毒gp85基因引物对和探针荧光RT-RAA检测结果图；
图6为本发明实施例5中本发明的试剂盒对实际样品检测结果图；
图7为本发明实施例6中本发明的试剂盒灵敏度检测结果图；
图8为本发明实施例7中本发明的试剂盒特异性检测结果图。
具体实施方式
本发明提供了一种J亚型禽白血病病毒gp85基因的RT-RAA荧光法检测引物对，所述引物对包括正向引物和反向引物；所述正向引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示：CAACAAGCAAGAAAGACCCGGAGAAGACAC，反向引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示：CACACGTTTCCTGGTTGTTGCAATAGATG。
本发明提供的引物对可以特异性扩增J亚型禽白血病病毒gp85基因，与A亚型禽白血病病毒、B亚型禽白血病病毒、C亚型禽白血病病毒、D亚型禽白血病病毒、E亚型禽白血病病毒、K亚型禽白血病病毒、新城疫病毒、禽传染性支气管炎病毒、马立克氏病毒、禽传染性法氏囊病毒、禽网状内皮组织增生症病毒和H9N2亚型禽流感病毒的核酸均无交叉反应，特异性强。利用该引物对可以检测低拷贝的J亚型禽白血病病毒核酸且规避因内源性禽白血病毒引起的假阳性现象，克服现有常规方法的不足之处。
本发明还提供了上述引物对在制备检测J亚型禽白血病病毒的试剂或试剂盒中的应用。本发明通过上述引物对可以特异性扩增J亚型禽白血病病毒gp85基因，且特异性强；利用上述引物对制备的试剂或试剂盒可用于检测J亚型禽白血病病毒。
本发明还提供了一种检测J亚型禽白血病病毒的试剂盒，所述试剂盒包括上述的引物对。
在本发明中，所述试剂盒优选还包括探针；所述探针优选包括核苷酸序列如SEQID NO.3所示：TTCTTTCAAATGATACTTGTGTGCGTGGTTATTATTTCCGTTGTCCCAGG的探针；所述探针更优选包括在核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示的探针基础上经修饰的探针；所述修饰优选包括：在所述核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示的5’端第33位T碱基标记FAM发光基团，第33位碱基后连接脱碱基位点四氢呋喃(Tetrahydrofuran，THF)，第35位碱基标记BHQ1淬灭基团，3’端进行C3-spacer阻断修饰，修饰后的探针优选如下所示：5’-TTCTTTCAAATGATACTTGTGTGCGTGGTTAT/i6FAMdT//THF//iBHQ1dT/TTCCGTTGTCCCAGG[C3-spacer]-3’。本发明修饰后的探针在游离状态下核酸外切酶不识别，当探针和目的基因识别后开始结合，核酸外切酶在识别到缺口后，切除THF并解除C3-spacer生物阻断素，从而使FAM基因和BHQ1基因分离发出荧光被仪器检测到，进而检测出扩增产物。
在本发明中，所述试剂盒优选还包括阳性对照品和阴性对照品；所述阳性对照品优选包括含有J亚型禽白血病病毒SCAU1903的核酸；所述J亚型禽白血病病毒SCAU1903的核酸的GenBank登录号优选为MT175600.1；所述阳性对照品的扩增碱基序列优选如SEQ IDNO.4所示：CAACAAGCAAGAAAGATCCGGAGAAGACACCCTTGCTGCCATCGAGAGGTTACTTCTTCTTTCAAATGATACTTGTGTGCGTGGTTATTATTTCCGTTGTCCCAGGGGTGGGGGGAGTTCATCTGATGCAACAACCAGGAAACGTGTG；所述阴性对照品优选包括ddH2O。本发明为了避免所用试剂失效或受到污染，设置有阳性对照品及阴性对照品，其中阴性对照的设计能有效验证所用试剂是否受到污染，避免假阳性发生，阳性对照的设计能有效验证所用试剂的有效性，避免假阴性的发生。
在本发明中，所述试剂盒优选还包括RT-RAA荧光法通用试剂。本发明对所述RT-RAA荧光法通用试剂的来源没有特殊要求，采用本领域技术人员所熟知市售商品即可。本发明及实施例优选采用南宁壮博生物科技有限公司的货号为ZBA22001的RT-RAA核酸扩增试剂。
本发明还提供了一种非诊断目的的检测J亚型禽白血病病毒的方法，包括如下步骤：
提取待测样本的RNA，以待测样本的RNA为模板，利用上述试剂盒进行RT-RAA反应；
结果判定：若出峰时间≤19.5min或Ct值≤39，则待测样本为J亚型禽白血病病毒阳性阳性；若出峰时间＞19.5min或Ct值＞39，则待测样本为J亚型禽白血病病毒阳性阴性。
在本发明中，所述试剂盒中的阳性对照和阴性对照的判断标准优选为：
阳性对照：有典型的扩增曲线出现，或出峰时间≤19.5min或Ct值≤39，为有效结果；
阴性对照：无扩增曲线出现，或出峰时间＞19.5min或Ct值＞39，为有效结果。
在本发明中，所述RT-RAA荧光法的基本原理优选包括：先利用MLV逆转录酶将RNA转录成DNA，再利用重组酶在常温下，与引物DNA紧密结合，形成酶和引物的聚合体，当引物在模板DNA上搜索到与之完全匹配的互补序列时，在单链DNA结合蛋白的帮助下，打开模板DNA的双链结构，并在DNA聚合酶的作用下，形成新的DNA互补链，扩增产物以指数级增长；利用荧光探针的标记和核酸外切酶酶切，实现定时定性的结果分析。
本发明对所述提取待测样本的RNA的方法没有特殊要求，采用本领域技术人员所熟知的提取方法即可。
在本发明中，所述RT-RAA的反应时间优选为20～30min；所述RT-RAA的反应程序优选包括：41℃40s；41℃30s，40个循环。
在本发明中，所述试剂盒中的引物对的正向引物和反向引物的工作浓度均优选为10μmol/L；所述试剂盒中的探针的工作浓度优选为10μmol/L。
本发明所述检测方法是以非诊断为目的，仅是为了获得待测样本是否含有J亚型禽白血病病毒的中间值。
为了进一步说明本发明，下面结合实施例对本发明提供的J亚型禽白血病病毒gp85基因的RT-RAA荧光法检测引物对、试剂盒及检测方法进行详细地描述，但不能将它们理解为对本发明保护范围的限定。
实施例1
初始引物设计
针对NCBI数据库中J亚型禽白血病病毒gp85基因序列(GenBank登录号：Z46390、MT175600、MN066150、MN066151、MN066152、MK940585、MN066140、JQ935966、JX848322、KC149971、JF932004、KU170199)为参考，根据基因比对分析保守区域，经同源性分析后，设计引物探针(Probe)如下：
Probe:CTCTCTCCTAACTTTACCACCTGGATAACATATGGGCCGAACATTACG(SEQ ID NO.5所示)；该探针经修饰后如下所示：CTCTCTCCTAACTTTACCACCTGGATAACA/i6FAMdT//THF//iBHQ1dT/GGGCCGAACATTACG；
F-1:CCCTGTTATCTAGGACAATTGACTATG(SEQ ID NO.6所示)；
F-2:CACCAGGTATTTTCTTGATTTGTGGGG(SEQ ID NO.7所示)；
F-3:AGGGCCCTGTTATCTAGGACAATTGACTATG(SEQ ID NO.8所示)；
R-1:CACACTCCATAGCTGTAGCTCATCACCGCAG(SEQ ID NO.9所示)；
R-2:CTCCATAGCTGTAGCTCATCACCGCAG(SEQ ID NO.10所示)；
R-3:CATAGCTGTAGCTCATCACCGCAGTCAGGCGAG(SEQ ID NO.11所示)；
R-4:CATAGCTGTAGCTCATCACCGCAGTCAGG(SEQ ID NO.12所示)；
分为12组：F-1/R-1、F-1/R-2、F-1/R-3、F-1/R-4、F-2/R-1、F-2/R-2、F-2/R-3、F-2/R-4、F-3/R-1、F-3/R-2、F-3/R-3、F-3/R-4。
引物筛选
12组引物对以J亚型禽白血病病毒SCAU1903核酸(GenBank登录号MT175600.1：6234-6454)为模板，ddH2O为阴性对照，进行RT-RAA反应(所述RT-RAA的反应程序为：42℃40s；42℃30s，40个循环)，反应结果如图1所示。在引物和探针相同浓度情况下，选择Ct值小，扩增产物量多的一组引物：F-1/R-4。
实际样品测试
根据广东爱健康生物科技有限公司已知临床背景的临床血清样品，取2份阳性样品，2份阴性样品，采用AxyPrep体液病毒DNA/RNA小量提取试剂盒(购自广州速研生物科技有限公司)，按照说明步骤提取待测样本基因组RNA，以ddH2O为阴性对照，进行RT-RAA荧光检测(RT-RAA的反应程序为：42℃40s；42℃30s，40个循环)。
结果显示检测的4份样品都有荧光信号，ddH2O为阴性对照无荧光信号，即F-1/R-4引物探针无法定性分析样品的阴阳性(见图2)。
二次引物设计
针对NCBI数据库中J亚型禽白血病病毒gp85基因序列(GenBank登录号：Z46390、MT175600、MN066150、MN066151、MN066152、MK940585、MN066140、JQ935966、JX848322、KC149971、JF932004、KU170199)为参考，根据基因比对分析保守区域，经同源性分析后，设计引物探针如下：
GB-JP:TTCTTTCAAATGATACTTGTGTGCGTGGTTATTATTTCCGTTGTCCCAGG(SEQ ID NO.3所示)；该探针经修饰后为J P，所述探针J P如下所示：5’-TTCTTTCAAATGATACTTGTGTGCGTGGTTAT/i6FAMdT//THF//iBHQ1dT/TTCCGTTGTCCCAGG[C3-spacer]-3’(49bp)；
F1:CAACAAGCAAGAAAGACCCGGAGAAGACAC(SEQ ID NO.1所示)；
F2:AAGAAGCCGCCAGCAACAAGCAAGAAAGACCCGG(SEQ ID NO.13所示)；
F3:CAAGAAAGACCCGGAGAAGACACCCTTGC(SEQ ID NO.14所示)；
R1：CACACGTTTCCTGGTTGTTGCAATAGATG(SEQ ID NO.2所示)；
R2：AGGTGACCCACACGTTTCCTGGTTGTTGCAATAG(SEQ ID NO.15所示)；
R3：CCCGTCTTATTTGCCCAGGTGACCCACACGTTT(SEQ ID NO.16所示)；
R4：CCCGTCTTATTTGCCCAGGTGACCCACACG(SEQ ID NO.17所示)；
分为12组：F1R1、F1R2、F1R3、F1R4、F2R1、F2R2、F2R3、F2R4、F3R1、F3R2、F3R3、F3R4。
引物筛选
由生工构建ALV-J阳性标准质粒(GenBank登录号MT175600.1：5258-5802)，将制备好的质粒进行10倍倍比稀释，以104copies/μl稀释浓度的质粒为阳性对照，ddH2O为阴性对照，12组引物以101copies/μl为检测模板进行引物筛选(RT-RAA的反应程序为：41℃40s；41℃30s，40个循环)。结果如图3所示。在相同条件下，F1R1引物对在101coupies/μl的条件下扩增效率最高，故选择F1R1为最优引物组。
实施例2
J亚型禽白血病病毒gp85基因RT-RAA检测引物对验证
对实施例1筛选的引物对F1R1扩增片段进行验证，模板为J亚型禽白血病病毒SCAU1903核酸(SEQ ID NO.4所示)，反应体系为：正向引物F1(10μM)1.0μL，反向引物R1(10μM)1.0μL，ddH2O 6.0μL，2x Es Taq MasterMix 10.0μL，模板2μL。反应程序为：95℃预变性3min；95℃变性30s，58℃复性30s，72℃延伸30s，35个循环；72℃延伸2min。将得到的产物进行1％琼脂糖凝胶电泳分析。
结果如图4所示，筛选的引物对扩增片对与预期结果一致大小为148bp，泳道从左往右依次是Marker、J亚型禽白血病病毒SCAU1903核酸、ddH2O阴性对照。
实施例3
一种检测J亚型禽白血病病毒的试剂盒，该试剂盒由以下组分组成：RT-RAA反应干粉、实施例1筛选的正向引物F1、实施例1筛选的反向引物R1、实施例1筛选后修饰的探针JP、A液、B液、阳性对照品和阴性对照品；其中正向引物和反向引物及探针的摩尔配比为1:1:1；阳性对照品为含有J亚型禽白血病病毒SCAU1903核酸(SEQ ID No.4所示)，阴性对照品为ddH2O。
RT-RAA反应干粉的组成成分为：MLV逆转录酶、重组酶、单链结合蛋白、聚合酶、ATP、dNTP Mix、氯化镁(MgCl2)；A液成分为：聚乙二醇(PEG)；B液成分为：醋酸镁(MgAc2)；所述RT-RAA反应干粉、A液和B液为购自南宁壮博生物科技有限公司的货号为ZBA22001的RT-RAA核酸扩增试剂中的组分。
实施例4
应用实施例3的试剂盒对样本中的J亚型禽白血病病毒进行检测，检测方法如下：
按照AxyPrep体液病毒DNA/RNA小量提取试剂盒(购自广州速研生物科技有限公司)的说明书步骤提取待测样本基因组RNA。
RT-RAA反应体系的配制：每个检测样品对应一个RT-RAA反应干粉管，每个RT-RAA反应管中各反应组分和所加入的体积如表1所示。
表1 RAA反应体系配制表
Figure BDA0003318096930000081
Figure BDA0003318096930000091
将配制好RT-RAA反应体系的反应管上下颠倒6～8次，充分混匀反应液，低速离心数秒使反应液全部离心至管底。将反应管放置于荧光定量仪中，41℃60s；41℃30s，40个循环，并收集荧光信号。
扩增结束后根据出峰时间或Ct值判定待检样本结果(如图5所示)，判断标准如下：
(1)阳性对照：有典型的扩增曲线出现，或出峰时间≤19.5min或Ct值≤39，为有效结果；
(2)阴性对照：无扩增曲线出现，或出峰时间＞19.5min或Ct值＞39，为有效结果；
(3)检测样本：若出峰时间≤19.5min(Ct值≤39)，可判断待测样本为J亚型禽白血病病毒阳性；若出峰时间＞19.5min(Ct值＞39)，可判断待测样本为J亚型禽白血病病毒阴性。
由图5可知，本发明的阳性对照品和阴性对照品均为有效结果，其中阴性对照的设计能有效验证所用试剂是否受到污染，避免假阳性发生，阳性对照的设计能有效验证所用试剂的有效性，避免假阴性的发生。
实施例5
为验证本发明所述引物、试剂在实际情况下能正常使用，使用本发明的引物、试剂对实际样本进行检测。根据广东爱健康生物科技有限公司已知临床背景的临床血清样品21份，其中阳性样品13份，阴性样品8份，按照AxyPrep体液病毒DNA/RNA小量提取试剂盒(购自广州速研生物科技有限公司)的说明书步骤提取待测样本基因组RNA。用本发明的试剂盒对提取的21份待测样品RNA进行检测，检测方法同实施例4，结果如图6所示，显示本发明试剂盒检测结果与样本的阴阳性一致，符合率100％。
本发明具有良好的特异性和稳定性，在20～30min内完成检测、操作简便、成本低、灵敏度高、假阳性率低等特点，是传统方法所不具备的。
实施例6
本发明的试剂盒灵敏度试验
参照RNA提取试剂盒说明书提取J亚型禽白血病病毒RNA，采用体外转录的方法测定模板浓度，将模板按10倍倍比稀释，以105copies/μL、104copies/μL、103copies/μL、102copies/μL、101copies/μL 5个浓度梯度为模板并且以ddH20为阴性对照，分别取5μL作为反应模板，按照实施例4所述加样方法进行RT-RAA核酸扩增。
检测结果：如图7所示，本发明的试剂盒中引物对和探针能检测浓度为101copies/μL以上的模板，检测灵敏度高。
实施例7
本发明的试剂盒的特异性试验
以J亚型禽白血病病毒核酸为阳性对照(SEQ ID NO.4所示)，ddH2O为阴性对照，分别对A亚型禽白血病病毒、B亚型禽白血病病毒、C亚型禽白血病病毒、D亚型禽白血病病毒、E亚型禽白血病病毒、K亚型禽白血病病毒、新城疫病毒病毒、禽传染性支气管炎病毒、马立克氏病毒、禽传染性法氏囊病毒、禽网状内皮组织增生症病毒和H9N2亚型禽流感病毒的核酸5μL进行检测，按照实施例4所述加样方法进行RT-RAA核酸扩增。
检测结果：如图8所示，J亚型禽白血病病毒模板对应的试验组出现了正常荧光检测曲线，其他病毒的试验组及阴性对照组均未出现扩增曲线。
结果表明，本发明提供的试剂盒可以实现对J亚型禽白血病病毒的特异性检测，且不与A亚型禽白血病病毒、B亚型禽白血病病毒、C亚型禽白血病病毒、D亚型禽白血病病毒、E亚型禽白血病病毒、K亚型禽白血病病毒、新城疫病毒、禽传染性支气管炎病毒、马立克氏病毒、禽传染性法氏囊病毒、禽网状内皮组织增生症病毒和H9N2亚型禽流感病毒的核酸发生交叉反应。
综上所述，本发明所提供的引物对及试剂盒可以快速、方便、高效、特异地检测样本中是否含有J亚型禽白血病病毒及辅助诊断是否为J亚型禽白血病病毒感染，适宜于临床的鉴别检测、动物疫病检测和净化。
虽然本发明已以较佳的实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可以做各种改动和修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。
序列表
<110> 华南农业大学
<120> J亚型禽白血病病毒gp85基因的RT-RAA荧光法检测引物对、试剂盒及检测方法
<160> 17
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
caacaagcaa gaaagacccg gagaagacac 30
<210> 2
<211> 29
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
cacacgtttc ctggttgttg caatagatg 29
<210> 3
<211> 50
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
ttctttcaaa tgatacttgt gtgcgtggtt attatttccg ttgtcccagg 50
<210> 4
<211> 148
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
caacaagcaa gaaagatccg gagaagacac ccttgctgcc atcgagaggt tacttcttct 60
ttcaaatgat acttgtgtgc gtggttatta tttccgttgt cccaggggtg gggggagttc 120
atctgatgca acaaccagga aacgtgtg 148
<210> 5
<211> 48
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
ctctctccta actttaccac ctggataaca tatgggccga acattacg 48
<210> 6
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
ccctgttatc taggacaatt gactatg 27
<210> 7
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 7
caccaggtat tttcttgatt tgtgggg 27
<210> 8
<211> 31
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 8
agggccctgt tatctaggac aattgactat g 31
<210> 9
<211> 31
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 9
cacactccat agctgtagct catcaccgca g 31
<210> 10
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 10
ctccatagct gtagctcatc accgcag 27
<210> 11
<211> 33
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 11
catagctgta gctcatcacc gcagtcaggc gag 33
<210> 12
<211> 29
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 12
catagctgta gctcatcacc gcagtcagg 29
<210> 13
<211> 34
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 13
aagaagccgc cagcaacaag caagaaagac ccgg 34
<210> 14
<211> 29
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 14
caagaaagac ccggagaaga cacccttgc 29
<210> 15
<211> 34
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 15
aggtgaccca cacgtttcct ggttgttgca atag 34
<210> 16
<211> 33
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 16
cccgtcttat ttgcccaggt gacccacacg ttt 33
<210> 17
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 17
cccgtcttat ttgcccaggt gacccacacg 30

Claims (10)

1.一种J亚型禽白血病病毒gp85基因的RT-RAA荧光法检测引物对，其特征在于，所述引物对包括正向引物和反向引物；所述正向引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，反向引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。
2.权利要求1所述引物对在制备检测J亚型禽白血病病毒的试剂或试剂盒中的应用。
3.一种检测J亚型禽白血病病毒的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括权利要求1所述的引物对。
4.根据权利要求3所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括针对J亚型禽白血病病毒gp85基因设计的探针。
5.根据权利要求4所述的试剂盒，其特征在于，所述探针包括核苷酸序列如SEQ IDNO.3所示的探针。
6.根据权利要求3～5任一项所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括阳性对照品和阴性对照品；
所述阳性对照品包括含有J亚型禽白血病病毒SCAU1903的核酸；所述阴性对照品包括ddH2O。
7.根据权利要求6所述的试剂盒，其特征在于，所述阳性对照品的扩增碱基序列如SEQID NO.4所示。
8.一种非诊断目的的检测J亚型禽白血病病毒的方法，其特征在于，包括如下步骤：
提取待测样本的RNA，以待测样本的RNA为模板，利用3～7任一项所述的试剂盒进行RT-RAA反应；
结果判定：若出峰时间≤19.5min或Ct值≤39，则待测样本为J亚型禽白血病病毒阳性阳性；若出峰时间＞19.5min或Ct值＞39，则待测样本为J亚型禽白血病病毒阳性阴性。
9.根据权利要求8所述的方法，其特征在于，所述RT-RAA的反应温度为41℃，反应时间为20～30min。
10.根据权利要求8所述的方法，其特征在于，所述试剂盒中的引物对的正向引物和反向引物的工作浓度均为10μmol/L；所述试剂盒中的探针的工作浓度为10μmol/L。
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