CN114703322B

CN114703322B - 用于禽白血病病毒p12基因的rt-raa荧光法检测的引物对、试剂盒及检测方法

Info

Publication number: CN114703322B
Application number: CN202210295102.5A
Authority: CN
Inventors: 谢青梅; 张新珩; 巫秀红; 姚梓淇; 陈丽怡
Original assignee: South China Agricultural University
Current assignee: South China Agricultural University
Priority date: 2022-03-23
Filing date: 2022-03-23
Publication date: 2023-03-24
Anticipated expiration: 2042-03-23
Also published as: CN114703322A

Abstract

本发明提出了一种用于禽白血病病毒P12基因的RT‑RAA荧光法检测的引物对、试剂盒及检测方法，该引物对包括正向引物和反向引物；正向引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，反向引物的核苷酸序列如SEQ IDNO.2所示。本发明提供的引物对可以特异性扩增禽白血病病毒P12基因，利用该引物对可以特异性检测禽白血病病毒，检测周期更短且特异性更强。

Description

用于禽白血病病毒P12基因的RT-RAA荧光法检测的引物对、试剂盒及检测方法

技术领域

本发明涉及分子生物学技术领域，具体而言，涉及一种用于禽白血病病毒P12基因的RT-RAA荧光法检测的引物对、试剂盒及检测方法。

背景技术

禽白血病(Avian leukemia)是由隶属反转录病毒科，C型反转录病毒属的禽白血病病毒(Avian leukosis virus，ALV)引起的，在临床上主要以免疫抑制、生长抑制和多器官组织出现肿瘤为特征，免疫抑制还会造成继发感染，影响生产性能，造成鸡淘汰与死亡，给全球的家禽养殖业带来严重的经济损失。

根据ALV囊膜蛋白的特异性、宿主范围、传播途径以及血清学交叉反应的不同将ALV分别命名为ALV-A到ALV-J，其中A、B、C、D、K、E以及J亚群来源于鸡。E亚群为内源性病毒，其致病能力较低甚至没有致病性，但在鸡群中广泛存在；A、B、C、D、K以及J亚群为外源性病毒，引起临床肿瘤性疾病以及严重的继发反应。

ALV作为逆转录病毒，其基因组很容易在不同的亚群之间重组并且整合在宿主的染色体基因组内，从而导致常规检测上出现假阳性的现状。我国针对ALV实行净化方案，在净化方案的中使用的检测标准是病毒分离，需要在DF-1细胞中培养7-9天，再用ELISA试剂盒辅助检测细胞培养上清中p27特异性抗原。这种方法在实际操作中，检测周期长，需要高素质的专业人员和设备才能进行这项试验。

发明内容

本发明的第一目的在于提供一种用于禽白血病病毒P12基因的RT-RAA荧光法检测的引物对，其能够解决现目前结果不精确，容易出现因禽白血病毒基因组整合到宿主基因组引起的假阳性现象这一技术问题。

本发明的第二目的在于提供一种用于禽白血病病毒P12基因的RT-RAA荧光法检测的引物对在制备用于检测禽白血病病毒的试剂和试剂盒中的应用。

本发明的第三目的在于提供一种用于检测禽白血病病毒的试剂盒，其能够解决现目前检测耗时长且操作复杂这一技术问题。

本发明的第四目的在于提供一种检测禽白血病病毒的方法，该方法使用上述试剂盒进行检测，不仅能够大大缩短检测时间，还能够有效提高检测的准确性及效率。

本发明解决其技术问题是采用以下技术方案来实现的。

第一方面，本申请提供了一种用于禽白血病病毒P12基因的RT-RAA荧光法检测的引物对，包括正向引物和反向引物，正向引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，反向引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。本发明提供的引物对可以特异性扩增禽白血病病毒，与新城疫病毒、禽传染性支气管炎病毒、马立克氏病毒、禽传染性法氏囊病毒、禽网状内皮组织增生症病毒和H9N2亚型禽流感病毒的核酸均无交叉反应，特异性强。利用该引物对可以检测痕量的禽白血病病毒核酸且规避因禽白血病毒基因组整合到宿主基因组引起的假阳性现象，克服现有的常规方法的不足之处。

第二方面，本申请还提供了一种用于禽白血病病毒P12基因的RT-RAA荧光法检测的引物对在制备用于检测禽白血病病毒的试剂和试剂盒中的应用。

第三方面，本申请还提供了一种用于检测禽白血病病毒的试剂盒，包括上述引物对。利用该引物对制备的试剂盒可以在恒温条件下30min内完成检测，具有操作简便、成本低、特异性强、灵敏度高等特点，是传统方法所不具备的。

第四方面，本申请还提供了一种检测禽白血病病毒的方法，包括如下步骤，选取待测样本并提取待测样本的RNA，得到RNA样本，使用上述试剂盒对RNA样本进行RT-RAA反应。该方法通过使用上述试剂盒进行检测，不仅能够大大缩短检测的时间，还可以降低操作难度和成本，提高检测的灵敏度并降低假阳性率等。

相对于现有技术，本发明至少具有如下优点或有益效果：

一、本发明提供了一种用于禽白血病病毒P12基因的RT-RAA荧光法检测的引物对，该引物对可以特异性扩增禽白血病病毒，与新城疫病毒、禽传染性支气管炎病毒、马立克氏病毒、禽传染性法氏囊病毒、禽网状内皮组织增生症病毒和H9N2亚型禽流感病毒的核酸均无交叉反应，特异性强。利用该引物对可以检测痕量的禽白血病病毒核酸且规避因禽白血病毒基因组整合到宿主基因组引起的假阳性现象，克服现有的常规方法的不足之处。

二、本发明还提供了一种用于检测禽白血病病毒的试剂盒，利用该引物对制备的试剂盒可以在恒温条件下30min内完成检测，具有操作简便、成本低、特异性强、灵敏度高等特点，是传统方法所不具备的。

三、本发明还提供了一种检测禽白血病病毒的方法，该方法通过使用上述试剂盒进行检测，不仅能够大大缩短检测的时间，还可以降低操作难度和成本，提高检测的灵敏度并降低假阳性率等。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，应当理解，以下附图仅示出了本发明的某些实施例，因此不应被看作是对范围的限定，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他相关的附图。

图1为本发明实施例2中禽白血病病毒P12基因RT-RAA引物对筛选结果图；

图2为本发明实施例3中禽白血病病毒P12基因引物对PCR扩增产物的琼脂糖电泳结果图；

图3为本发明实施例5中禽白血病病毒P12基因引物对和探针荧光RT-RAA检测结果图；

图4为本发明实施例7中本发明的试剂盒灵敏度检测结果图；

图5为本发明实施例8中本发明的试剂盒特异性检测结果图。

具体实施方式

为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。

需要说明的是，在不冲突的情况下，本申请中的实施例及实施例中的特征可以相互组合。下面将参考具体实施例来详细说明本发明。

第三方面，本申请还提供了一种用于检测禽白血病病毒的试剂盒，包括上述引物对。利用该引物对制备的试剂盒可以在恒温条件下30min内完成检测，具有操作简便、成本低、灵敏度高、假阳性率低等特点，是传统方法所不具备的。

上述试剂盒还包括针对禽白血病病毒P12基因设计的探针，该探针的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示。

上述试剂盒还包括阳性对照品，阳性对照品包括含有禽白血病病毒SD1005的核酸，该含有禽白血病病毒SD1005的核酸的扩增碱基序列如SEQ ID NO.4所示。该禽白血病病毒SD1005的核酸的GenBank登录号优选为KF562375.1。通过阳性对照品以对显示禽白血病病毒阳性的样本进行检测和区分。

上述试剂盒还包括阴性对照品，阴性对照品包括ddH₂O。通过阴性对照品以对显示禽白血病病毒阴性的样本进行检测和区分。

上述RNA样本经过RT-RAA反应得到荧光曲线，当荧光信号的出峰时间≤20min或Ct值≤39，则待测样本为禽白血病病毒阳性，当荧光信号的出峰时间＞20min或Ct值＞39，则待测样本为禽白血病病毒阴性。

上述试剂盒中的正向引物、反向引物和探针的工作浓度均为10μM。当工作浓度高于该浓度范围时，可能会导致探针、正向引物和反向引物等与重组酶的不正确结合，当工作浓度低于该浓度范围时，可能会导致荧光吸收值低出现假阴性的结果。

上述RT-RAA的反应温度为39-42℃，RT-RAA的反应时间为25-30min。该反应条件能够保证重组酶与引物紧密结合，形成酶和引物的聚合体。

以下结合实施例对本发明的特征和性能作进一步的详细描述。

实施例1

禽白血病病毒P12基因RT-RAA引物和探针设计针对NCBI数据库中部分禽白血病病毒序列(GenBank登录号：Z46390、MT175600、MF817820、AF052428、HM446005、JX855935、KY581580、MG770235、KP686142、KY851580、MG770235、MT319751、DQ365814、HM452340、KU375453、KY612442、MF926337、AF052428、HM446005、KM873223、D10652)为参考，根据基因比对分析保守区域，经同源性分析后，设计引物探针如下：P12-Probe(序列如SEQ ID NO.3所示，47bp)。其余引物的序列如下：F1(序列如SEQ ID NO.5所示)；F2(序列如SEQ ID NO.6所示)；F3(序列如SEQ ID NO.1所示)；F4(序列如SEQ ID NO.7所示)；R1(序列如SEQ IDNO.2所示)；R2(序列如SEQ ID NO.8所示)；R3(序列如SEQ ID NO.9所示)。

表1序列表

实施例2

禽白血病病毒P12基因RT-RAA引物对筛选

将设计的引物分为12组：F1R1、F1R2、F1R3、F2R1、F2R2、F2R3、F3R1、F3R2、F3R3、F4R1、F4R2、F4R3。构建ALV P12基因阳性标准质粒(GenBank登录号KF562375.1：2172-2285)，将制备好的质粒进行10倍倍比稀释，以10⁴copies/μl稀释浓度的质粒为阳性对照，ddH₂O为阴性对照，12组引物以10²copies/μl为检测模板进行引物筛选(RT-RAA的反应程序为：39℃、40s；39℃、30s，40个循环)。结果如图1所示。在相同条件下，F3R1引物对在10²coupies/μl的条件下扩增效率最高，故选择F3R1为最优引物组。

实施例3

禽白血病病毒P12基因RT-RAA引物对验证

对实施例2筛选的引物对F3R1扩增片段进行验证，模板为禽白血病病毒SD1005核酸(SEQ ID NO.4所示)，反应体系为：正向引物F3(10μM)1.0μL，反向引物R1(10μM)1.0μL，ddH₂O 6.0μL，2x Es Taq MasterMix 10.0μL，模板2μL。反应程序为：95℃预变性3min；95℃变性30s，56℃复性30s，72℃延伸30s，35个循环；72℃延伸2min。将得到的产物进行1％琼脂糖凝胶电泳分析。

结果如图2所示，筛选的引物对扩增片对与预期结果一致大小为114bp，泳道从左往右依次是Marker、禽白血病病毒SD1005核酸、ddH₂O阴性对照。

实施例4

一种检测禽白血病病毒的试剂盒，该试剂盒由以下组分组成：RT-RAA反应干粉、实施例2筛选的正向引物F3、实施例1筛选的反向引物R1、实施例2筛选后修饰的探针P12-Probe、A液、B液、阳性对照品和阴性对照品；其中正向引物和反向引物及探针的摩尔配比为1:1:1；阳性对照品为含有禽白血病病毒SD1005核酸(SEQ ID No.4所示)，阴性对照品为ddH₂O。

RT-RAA反应干粉的组成成分为：MLV逆转录酶、重组酶、单链结合蛋白、聚合酶、ATP、dNTP Mix、氯化镁(MgCl₂)；A液成分为：聚乙二醇(PEG)；B液成分为：醋酸镁(MgAc₂)；所述RT-RAA反应干粉、A液和B液为购自南宁壮博生物科技有限公司的货号为ZBA22001的RT-RAA核酸扩增试剂中的组分。

实施例5

应用实施例4的试剂盒对样本中的禽白血病病毒进行检测，检测方法如下：

按照AxyPrep体液病毒DNA/RNA小量提取试剂盒(购自广州速研生物科技有限公司)的说明书步骤提取待测样本基因组RNA。

RT-RAA反应体系的配制：每个检测样品对应一个RT-RAA反应干粉管，每个RT-RAA反应管中各反应组分和所加入的体积如表2所示。

表2 RT-RAA反应体系配制表

RT-RAA反应体系组分	使用量
		RT-RAA反应干粉	1管
A液	25μL
		B液	2.5μL
F3(浓度为10μM)	2μL
		R1(浓度为10μM)	2μL
P12-Probe(浓度为μM)	0.6μL
		ddH₂O	12.9-15.9μL
RNA模板	2-5μL
		总体积	50μL

将配制好RT-RAA反应体系的反应管上下颠倒6-8次，充分混匀反应液，低速离心数秒使反应液全部离心至管底。将反应管放置于荧光定量仪中，39℃、60s；39℃、30s，40个循环，并收集荧光信号。

扩增结束后根据出峰时间或Ct值判定待检样本结果(如图3所示)，判断标准如下：

(1)阳性对照：有典型的扩增曲线出现，或出峰时间≤20min或Ct值≤39，为有效结果；

(2)阴性对照：无扩增曲线出现，或出峰时间＞20min或Ct值＞39，为有效结果；

(3)检测样本：若出峰时间≤20min(Ct值≤39)，可判断待测样本为禽白血病病毒阳性；若出峰时间＞20min(Ct值＞39)，可判断待测样本为禽白血病病毒阴性。

由图3可知，本发明的阳性对照品和阴性对照品均为有效结果，其中阴性对照的设计能有效验证所用试剂是否受到污染，避免假阳性发生，阳性对照的设计能有效验证所用试剂的有效性，避免假阴性的发生。

实施例6

为验证本发明所述引物、试剂在实际情况下能正常使用，使用本发明的引物、试剂对实际样本进行检测。广东爱健康生物科技有限公司提供的44份临床血浆样品，在长满至80％左右的DF-1细胞中37℃培养7天后收集上清，按照AxyPrep体液病毒DNA/RNA小量提取试剂盒(购自广州速研生物科技有限公司)的说明书步骤提取44份细胞培养上清基因组RNA，用于PCR检测和本发明试剂盒检测。结果如表3所示。

表3临床样品检测结果

样品	PCR	RT-RAA
			阴性(份)	20	18
阳性(份)	24	26
			总计(份)	44	44
阳性率(％)	54.55	59.09

由表3可知，显示本发明试剂盒检测结果与PCR检测结果具有较高的符合性。本发明具有良好的特异性和稳定性，在30min内完成检测、操作简便、成本低、灵敏度高等特点，适合于现场移动检测，是传统方法所不具备的。

实施例7

本发明的试剂盒灵敏度试验

将制备好的ALV P12基因质粒(GenBank登录号MT175600.1：2042-2364)进行10倍比稀释，以5个浓度梯度为模板，分别为10⁵copies/μL、10⁴copies/μL、10³copies/μL、10²copies/μL、10¹copies/μL，并且以ddH₂0为阴性对照，分别取5μL作为反应模板，按照实施例5所述加样方法进行RT-RAA核酸扩增。

检测结果：如图4所示，本发明的试剂盒中引物对和探针能检测的最低浓度为10¹copies/μL以上的模板，检测灵敏度高。

实施例8

本发明的试剂盒的特异性试验

以禽白血病病毒核酸为阳性对照(SEQ ID NO.4所示)，ddH₂O为阴性对照，分别对新城疫病毒、禽传染性支气管炎病毒、马立克氏病毒、禽传染性法氏囊病毒、禽网状内皮组织增生症病毒和H9N2亚型禽流感病毒的核酸5μL进行检测，按照实施例5所述加样方法进行RT-RAA核酸扩增。

检测结果：如图5所示，禽白血病病毒模板对应的试验组出现了正常荧光检测曲线，其他病毒的试验组及阴性对照组均未出现扩增曲线。

结果表明，本发明提供的试剂盒可以实现对禽白血病病毒的特异性检测，且不与新城疫病毒、禽传染性支气管炎病毒、马立克氏病毒、禽传染性法氏囊病毒、禽网状内皮组织增生症病毒和H9N2亚型禽流感病毒发生交叉反应。

综上所述，本发明提供了一种用于禽白血病病毒P12基因的RT-RAA荧光法检测的引物对、试剂盒及检测方法：

二、本发明还提供了一种用于检测禽白血病病毒的试剂盒，利用该引物对制备的试剂盒可以在恒温条件下30min内完成检测，具有操作简便、成本低、灵敏度高、假阳性率低等特点，是传统方法所不具备的。

以上所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。本发明的实施例的详细描述并非旨在限制要求保护的本发明的范围，而是仅仅表示本发明的选定实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

序列表

<110> 华南农业大学

<120> 一种用于禽白血病病毒P12基因的RT-RAA荧光法检测的引物对、试剂盒及检测方法

<160> 9

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 27

<212> DNA

<213> F3(2 Ambystomalaterale x Ambystomajeffersonianum)

<400> 1

ttatcaggcgcagtgcccgaaaaaacg 27

<210> 2

<211> 31

<212> DNA

<213> R1(2 Ambystomalaterale x Ambystomajeffersonianum)

<400> 2

ccctggttgccatcccgctt cctacactgt c 31

<210> 3

<211> 30

<212> DNA

<213> P12-Probe(2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum)

<400> 3

aatcaggaaa cagccgtgag cgatgtcagt 30

<210> 4

<211> 114

<212> DNA

<213> SD1005的核酸的碱基序列(2 Ambystoma laterale x Ambystomajeffersonianum)

<400> 4

ttatcaggcg cagtgcccga aaaaacgaaa gtcaggaaac agccgtgagc gatgtcagct 60

gtgtgacggg atgggacaca acgctaaaca gtgcagaagg cgggatggca acca 114

<210> 5

<211> 34

<212> DNA

<213> F1(2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum)

<400> 5

ctctgctaca cttgtggatc cccgggacat tatc 34

<210> 6

<211> 28

<212> DNA

<213> F2(2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum)

<400> 6

ctctgctaca cttgtggatc cccgggac 28

<210> 7

<211> 30

<212> DNA

<213> F4(2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum)

<400> 7

tacacttgtg gatccccggg acattatcag 30

<210> 8

<211> 28

<212> DNA

<213> R2(2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum)

<400> 8

tggttgccat cccgcttcct acactgtc 28

<210> 9

<211> 27

<212> DNA

<213> R3(2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum)

<400> 9

ggttgccatc ccgcttccta cactgtc 27

Claims

1.一种用于禽白血病病毒P12基因的RT-RAA荧光法检测的引物对，其特征在于，包括正向引物和反向引物，所述正向引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，所述反向引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。

2.一种如权利要求1所述的用于禽白血病病毒P12基因的RT-RAA荧光法检测的引物对在制备用于检测禽白血病病毒的试剂和试剂盒中的应用。

3.一种用于检测禽白血病病毒的试剂盒，其特征在于，包括如权利要求1所述的引物对。

4.根据权利要求3所述的试剂盒，其特征在于，还包括针对所述禽白血病病毒P12基因设计的探针，所述探针的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示。

5.根据权利要求3或4所述的试剂盒，其特征在于，还包括阳性对照品，所述阳性对照品包括含有禽白血病病毒SD1005的核酸，所述含有禽白血病病毒SD1005的核酸的碱基序列如SEQ ID NO.4所示。

6.根据权利要求3或4所述的试剂盒，其特征在于，还包括阴性对照品，所述阴性对照品包括ddH₂O。