CN116287441A - 一种常温猴痘病毒检测分型试剂盒 - Google Patents
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Abstract
本发明提供一种常温猴痘病毒检测分型试剂盒，包括：病毒检测分型体系、可视化病毒检测分型体系；所述病毒检测分型体系包括缓冲液I、缓冲液II、缓冲液Ⅲ、病毒检测管I、病毒检测管II、c‑tpye病毒分型管、w‑type病毒分型管、荧光探针；所述可视化病毒检测分型体系包括：Cas专用检测试纸条、缓冲液I、缓冲液II、缓冲液Ⅲ、病毒检测管I、病毒检测管II、c‑tpye病毒分型管、w‑type病毒分型管、Cas12a、试纸条探针。本发明在等温条件下即可完成病毒核酸扩增；可在20分钟内对提取核酸进行快速准确检测，同时CRISPR‑Cas12a检测技术还可以与侧向流试纸条联用，不需要昂贵的qPCR仪等设备实现检测结果肉眼可见。该方法简单、快速、无需大型仪器设备操作，对操作人员专业性要求低。
Description
技术领域
本发明涉及一种DNA病毒快速检测领域，特别是涉及一种猴痘病毒常温检测分型试剂。
背景技术
猴痘是由猴痘病毒(monkeyoox virus，MPXV)感染所致的一种病毒性人畜共患病，临床表现主要为发热、皮疹、淋巴结肿大。其既往主要发生在中非和西非，病死率为1％-10％。MPXV是全长约为197Kb的双链DNA病毒，属于痘病毒科正痘病毒属，外形为圆角砖形或卵圆形，大小为200nm*250nm，外周为30nm的外膜，环绕匀质的核心体。猴痘病毒与天花病毒、痘苗病毒和牛痘病毒是正痘病毒中对人类致病的4种病毒，他们都含有可溶性抗原、核蛋白抗原和红细胞凝集素，抗原性质基本相同有交叉免疫性。猴痘病毒存在西非和刚过盆地两个分支，两者具有明确的流行病学和临床转归差异，西非分支猴痘患者病死率约为3.6％，刚果盆地分支猴痘患者病死率可达10.6％。
猴痘主要和水痘、带状疱疹、单纯疱疹、麻疹、登革热等其它发热出疹性疾病鉴别，还要和皮肤细菌感染、疥疮、梅毒和过敏反应等鉴别。临床上通过症状对猴痘病毒感染进行诊断非常困难，需要实验室的配合检测。
目前猴痘病毒的诊断方法多为qPCR方法或病毒分离鉴定，荧光定量PCR技术，以猴痘病毒基因为靶序列，设计特异性引物和TaqMan探针，通过荧光定量PCR仪进行扩增，从而实现对病毒的检测。PCR的诊断方法耗时时间长，技术要求高，设备昂贵；而病毒分离鉴定需要在BSL-3及以上实验室的生物安全柜进行操作，设施要求高，难普及。现有技术在实际应用中存在明显的不便与缺陷，有必要对检测方法进行改进和创新。
发明内容
鉴于以上所述现有技术的缺点，本发明的目的在于提供一种常温猴痘病毒检测分型试剂盒，用于解决现有技术中诊断方法耗时时间长，技术要求高，设备昂贵的问题。
本发明的思路为开发适合等温扩增、快速检测、肉眼可判读结果的猴痘病原检测方法，本发明利用RPA等温扩增技术，在等温条件下即可完成病毒核酸扩增；利用荧光探针可在20分钟内对提取核酸进行快速准确检测，同时CRISPR-Cas12a检测技术还可以与侧向流试纸条联用，不需要昂贵的qPCR仪等设备实现检测结果肉眼可见。扩增过程和检测过程在同一反应管中进行，该方法简单、快速、无需大型仪器设备操作，对操作人员专业性要求低。
为实现上述目的及其他相关目的，本发明提供一种常温猴痘病毒检测分型试剂盒，包括：病毒检测分型体系、可视化病毒检测分型体系；
优选地，所述病毒检测分型体系包括缓冲液I、缓冲液II、缓冲液Ⅲ、病毒检测管I、病毒检测管II、c-tpye病毒分型管、w-type病毒分型管、荧光探针；所述病毒检测管I包括：检测冻干制剂、猴痘病毒检测冻干制剂I；所述猴痘病毒检测冻干制剂I包括G2Rcom基因检测引物和CrRNA；所述G2Rcom基因检测引物各0.3μM-0.6μM，优选0.4μM；所述G2Rcom基因CrRNA 50nM-200nM，优选100nM；所述病毒检测管II包括：检测冻干制剂、猴痘病毒检测冻干制剂II；所述猴痘病毒检测冻干制剂II包括F3L基因检测引物2对、F3L基因CrRNA I、F3L基因CrRNAII；所述F3L基因检测引物各0.3μM-0.6μM，优选0.4μM；所述F3L基因CrRNA I 50nM-200nM，优选100nM；所述F3L基因CrRNA II 50nM-200nM，优选100nM；所述c-tpye病毒分型管包括：检测冻干制剂、猴痘病毒c-tpye检测冻干制剂；所述c-tpye检测冻干制剂包括c-tpye序列检测引物、c-tpye序列CrRNA；所述c-tpye序列检测引物各0.3μM-0.6μM，优选0.4μM；所述c-tpye序列CrRNA为50nM-200nM，优选100nM；所述w-type病毒分型管包括：检测冻干制剂、猴痘病毒w-type检测冻干制剂；所述w-type检测冻干制剂包括w-type基因检测引物、w-type基因CrRNA；所述w-type基因检测引物各0.3μM-0.6μM，优选0.4μM；w-type基因CrRNA50nM-200nM，优选100nM；所述荧光探针浓度为50nM-150nM，优选100nM；
所述检测冻干制剂包括：磷酸肌酶2ug-4ug、丙酮酸激酶10ug-20ug、重组酶10ug-20ug、RecA蛋白4ug-8ug、单链结合蛋白10ug-20ug、DNA聚合酶I 2ug-4ug、海藻糖1ug-2ug、氯化钠50ug-500ug、氯化钾25ug-250ug、Cas12a 2ug-30ug；
优选地，所述缓冲液I包括：Tris-HCl缓冲液(Ph8.0)20mM、二硫苏糖醇5mM、PEG20004％、ATP 15mM、磷酸肌酸二钠50mM、DNTPs 5mM、磷酸烯醇式丙酮酸20mM、甘露醇20ng/ul；
优选地，所述缓冲液II包括：10倍浓度的NEB 3.1buffer；
优选地，所述缓冲液Ⅲ包括：MgCl 250mM、DTT 10mM、50％甘油、MgAc2280 mM、肝素500μg/mL。
优选地，所述可视化病毒检测分型体系包括：Cas专用检测试纸条、缓冲液I、缓冲液II、缓冲液Ⅲ、病毒检测管I、病毒检测管II、c-tpye病毒分型管、w-type病毒分型管、试纸条探针；所述试纸条探针50nM-150nM，优选100nM；
优选地，所述G2Rcom基因检测引物为：
SEQ ID NO 1G2Rcom forward GAAGCCGTAATCTATGTTGTCTATCGTGTC SEQ ID NO2G2Rcom reverse GATTATTGTGAGATGTAAAGGTATCCGAAC所述G2Rcom基因CrRNA为：
SEQ ID NO 3G2Rcom CrRNA
UAAUUUCUACUAAGUGUAGAUAGAUUAUGUGAUAGCAAGAC
优选地，所述F3L基因检测2对引物分别为：第1对：
SEQ ID NO 4F3L forward I CTCCTCGTTGGTCTACGACAATGGATGCTG SEQ ID NO5F3L reverseII GCGGGATACATCATCTATTATAGCATCAGC所述F3L基因CrRNAI为：
SEQ ID NO 6F3L CrRNAI
UAAUUUCUACUAAGUGUAGAUGAUGCUGAUGCTAUAAUAGA
优选地，所述F3L基因检测第2对引物为
SEQ ID NO 7F3L forwardII CCCTGTCACCGTTATTAATGAGTACTGCC
SEQ ID NO 8F3L reverseII CCTTATCGAATACTCTTCCGTCAATGTCTA优选地，所述F3L基因CrRNAII为：
SEQ ID NO 9F3L CrRNAII
UAAUUUCUACUAAGUGUAGAUATACGAAAAGACCAAT CTC T
优选地，所述c-tpye序列检测引物为
SEQ ID NO 10c-tpye forward AGAGCCAAAGTCTACTCCGCCAATATCAAG SEQ ID NO11c-tpye reverse TCTATGTCTACCTGGATACAGAAAGCAA
优选地，所述c-tpye序列CrRNA为：
SEQ ID NO 12c-tpye CrRNA
UAAUUUCUACUAAGUGUAGAUGCAUAUAUGGGUCCCAUUUU
优选地，所述w-tpye基因检测引物为
SEQ ID NO 13w-tpye forward CGTGTGGTCCCGGAACATATTCTCACACCG SEQ ID NO14w-tpye reverse TTAGTTCCGACGTTGAGATGGATTCGCTGA优选地，所述w-tpye基因CrRNA为：
SEQ ID NO 15w-tpye CrRNA
UAAUUUCUACUAAGUGUAGAUACAGAUAAAUGCGAACCCGUCGU
优选地，所述荧光探针的5’段修饰为FAM，3’端修饰为HBQ1；荧光探针：
SEQ ID NO 16Probe FAM-TTTTTT-BHQ1
所述荧光探针的5’段修饰为FAM，3’端修饰为Biotin；试纸条探针：
SEQ ID NO 17TestProbe FAM-TTTTTT-Biotin
优选地，所述Cas专用检测试纸条包括：PVC背板、样品垫、结合垫、硝酸纤维素膜和吸水纸，所述PVC背板沿水平方向设置，该PVC背板上由左至右依次相连接设置样品垫、结合垫、硝酸纤维素膜和吸水纸，各部分在相邻处重叠设置；所述结合垫上包被胶体金标记物；所述硝酸纤维素膜上沿水平方向平行间隔分别设置质控线C线、检测线T线；所述质控线C线上包被的BSA化生物素的浓度为0.5mg/mL-2mg/mL，优选为1mg/mL，喷量为5ul/cm；所述检测线T线上包被的抗地高辛抗体浓度为0.1mg/mL-0.3mg/mL，优选为0.25mg/mL，喷量为5ul/cm；
优选地，检测样本中是否含有猴痘病毒并分型的步骤为：(1)样本采集；(2)猴痘病毒提取；(3)配制病毒检测分型体系：将提取得到的5ul待测样本核酸、21ul缓冲液I、5ul缓冲液II、5ul荧光探针、11ul ddH2O、3ul缓冲液Ⅲ，混匀后加入病毒检测管I、病毒检测管II、c-tpye病毒分型管、w-type病毒分型管，充分混匀；(4)荧光法结果检测：置于荧光定量PCR仪，25℃-42℃，优选为37℃，1min；10循环-60循环；选择FAM荧光检测通道，每1min收集一次信号，启动检测；使用荧光定量PCR仪进行分析时，按照阈值线刚好超过正常阴性对照品扩增曲线最高点设定阈值，也可根据仪器噪音情况调整阈值；阴性对照无扩增，阳性对照ct值低于10时结果有效；阳性(+)：ct值低于10；结果判读：1)猴痘病毒核酸阳性：病毒检测管I、病毒检测管II同时阳性，判读为猴痘病毒阳性；2)猴痘病毒的刚果株核酸阳性：在猴痘病毒阳性结果基础上，c-tpye病毒分型管阳性，w-type病毒分型管阴性；3)猴痘病毒的西非株核酸阳性：在猴痘病毒阳性结果基础上，c-tpye病毒分型管阴性，w-type病毒分型管阳性；4)猴痘病毒的其他亚型核酸阳性：在猴痘病毒阳性结果基础上，c-tpye病毒分型管阴性，w-type病毒分型管阴性；5)猴痘病毒阴性：病毒检测管I、病毒检测管II、c-tpye病毒分型管、w-type病毒分型管均为阴性结果；6)以下情况需要重新检测：病毒检测管I、病毒检测管II未同时出现阳性，需要重新提取核酸进行检测；(5)配制可视化病毒检测分型体系：将提取得到的5ul待测样本核酸、21ul缓冲液I、5ul缓冲液II、5ul试纸条探针、11ul ddH2O、3ul缓冲液Ⅲ，混匀后加入病毒检测管I、病毒检测管II、c-tpye病毒分型管、w-type病毒分型管，充分混匀；反应管室温静置10min-30min，启动检测；优选为每隔1min混匀检测管；(6)可视化结果检测；将试纸条插入反应管中，液面不得超过结合垫最上端，待判读区全部浸润，质控线C线显色后10min内观察结果；阳性(+)：质控线C线和检测线T线均出现红色条带或试纸条只有检测线T线出现红色条带，上述两种情况均说明Cas12进行有效切割，并激活报告基团显色，结果均可判定为阳性；阴性(-)：质控线C线出现一条红色条带，检测线T线不显色，判定为阴性结果，该结果表明Cas12未能切割报告分子，未能激活报告基团显色；无效：质控线C线和检测线T线均未出现条带，提示所用的试纸条或试剂可能已经损坏、失效或操作有误，此时，应重新扩增和检测；结果判读：1)猴痘病毒核酸阳性：病毒检测管I、病毒检测管II同时阳性，判读为猴痘病毒阳性；2)猴痘病毒的刚果株核酸阳性：在猴痘病毒阳性结果基础上，c-tpye病毒分型管阳性，w-type病毒分型管阴性；3)猴痘病毒的西非株核酸阳性：在猴痘病毒阳性结果基础上，c-tpye病毒分型管阴性，w-type病毒分型管阳性；4)猴痘病毒的其他亚型核酸阳性：在猴痘病毒阳性结果基础上，c-tpye病毒分型管阴性，w-type病毒分型管阴性；5)猴痘病毒阴性：病毒检测管I、病毒检测管II、c-tpye病毒分型管、w-type病毒分型管均为阴性结果；6)以下情况需要重新检测：病毒检测管I、病毒检测管II未同时出现阳性，需要重新提取核酸进行检测；
如上所述，本发明的一种常温猴痘病毒检测分型试剂盒，具有以下有益效果：
(1)本发明的两种检测方法，整个检测反应在常温等温条件下进行，无需额外加热和制冷，减少了对仪器设备的依赖，对仪器兼容性更强。不仅如此，对于配套仪器的设计可以更加小型化、便携化，操作过程更加简易化，适用领域广。
(2)反应速度快。相对于qPCR检测技术，等温扩增技术反应时间由1.5-2小时缩短至20分钟，提高扩增效率。同时Cas12a介导的检测过程和扩增过程同时进行，进一步缩短了检测时间，提高效率。
(3)本发明的将等温扩增、Cas12a介导检测方法与侧向流技术联用可实现检测结果的可视化判读，检测耗时短，室温可实现，不需要荧光定量PCR仪等昂贵的仪器设备，且技术门槛低。
(3)本发明的两种检测方法，特异性和灵敏度高。RPA引物和crRNA只能与靶基因进行特异性结合而完成检测，为检测猴痘病毒同时设有2中不同的检测基因，保证了检测的特异性，对其他相似的病毒无交叉；且明显降低检测下限，达到103copies/mL，远优于现有的各种类型的核酸扩增检测方法。
(4)本发明的两种检测方法，检测的同时能够对MPXV进行分型。设计不同亚型MPXV的通用引物和特异引物，进行检测同时，可以对阳性样品进行分型和溯源分析，结合流调信息，快速精准控制疫情。
(5)本发明的两种检测方法，检测步骤少，过程简易。检测过程在同一反应管进行，所有成分按照说明依次加入即可启动反应。可视化的同时不影响检测敏感性和特异性，对实验技能要求较低，结果判读也相对简单。新方法特别适用于口岸及基层检测机构。
(6)本发明的可视化的检测方法，应用场景多，范围广。具有等温扩增、快速检测、灵敏度特异性高、操作简单等优点，可以匹配多种荧光检测设备，如荧光定量PCR仪、酶标仪等，也可适用于微流控分子检测平台。通过更改探针，结果可以通过试纸条显示，肉眼直接判读结果。
附图说明
图1显示为本发明的一种常温猴痘病毒检测分型试剂盒的发明原理示意图。
图2显示为本发明的一种常温猴痘病毒检测分型试剂盒crRNA结构原理示意图。
图3显示为本发明的病毒检测分型体系检测猴痘病毒敏感性；
图4显示为本发明的病毒检测分型体系c-tpye病毒分型管的敏感性
图5显示为本发明的病毒检测分型体系w-tpye病毒分型管的敏感性
图6显示为本发明的病毒检测分型体系检测猴痘病毒特异性
图7显示为本发明的病毒检测分型体系c-tpye病毒分型管的特异性
图8显示为本发明的病毒检测分型体系w-tpye病毒分型管的特异性
图9显示为本发明的病毒检测分型体系检测猴痘病毒重复性
图10显示为本发明的病毒检测分型体系c-tpye病毒分型管的重复性
图11显示为本发明的病毒检测分型体系w-tpye病毒分型管的重复性
图12显示为本发明的可视化病毒检测分型体系检测猴痘病毒敏感性
图13显示为本发明的可视化病毒检测分型体系c-tpye病毒分型管的敏感性
图14显示为本发明的可视化病毒检测分型体系w-tpye病毒分型管的敏感性
具体实施方式
以下由特定的具体实施例说明本发明的实施方式，熟悉此技术的人士可由本说明书所揭露的内容轻易地了解本发明的其他优点及功效。
为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。
本发明一种常温猴痘病毒检测分型试剂盒包括：病毒检测分型体系、可视化病毒检测分型体系；
具体的，所述病毒检测分型体系包括缓冲液I、缓冲液II、缓冲液Ⅲ、病毒检测管I、病毒检测管II、c-tpye病毒分型管、w-type病毒分型管、荧光探针；所述病毒检测管I包括：检测冻干制剂、猴痘病毒检测冻干制剂I；所述猴痘病毒检测冻干制剂I包括G2Rcom基因检测引物和CrRNA；所述G2Rcom基因检测引物各0.3μM-0.6μM，优选0.4μM；所述G2Rcom基因CrRNA 50nM-200nM，优选100nM；所述病毒检测管II包括：检测冻干制剂、猴痘病毒检测冻干制剂II；所述猴痘病毒检测冻干制剂II包括F3L基因检测引物2对、F3L基因CrRNA I、F3L基因CrRNAII；所述F3L基因检测引物各0.3μM-0.6μM，优选0.4μM；所述F3L基因CrRNA I 50nM-200nM，优选100nM；所述F3L基因CrRNA II 50nM-200nM，优选100nM；所述c-tpye病毒分型管包括：检测冻干制剂、猴痘病毒c-tpye检测冻干制剂；所述c-tpye检测冻干制剂包括c-tpye序列检测引物、c-tpye序列CrRNA；所述c-tpye序列检测引物各0.3μM-0.6μM，优选0.4μM；所述c-tpye序列CrRNA为50nM-200nM，优选100nM；所述w-type病毒分型管包括：检测冻干制剂、猴痘病毒w-type检测冻干制剂；所述w-type检测冻干制剂包括w-type基因检测引物、w-type基因CrRNA；所述w-type基因检测引物各0.3μM-0.6μM，优选0.4μM；w-type基因CrRNA50nM-200nM，优选100nM；所述荧光探针浓度为50nM-150nM，优选100nM；
具体的，所述检测冻干制剂包括：磷酸肌酶2ug-4ug、丙酮酸激酶10ug-20ug、重组酶10ug-20ug、RecA蛋白4ug-8ug、单链结合蛋白10ug-20ug、DNA聚合酶I 2ug-4ug、海藻糖1ug-2ug、氯化钠50ug-500ug、氯化钾25ug-250ug、Cas12a 2ug-30ug；
具体的，所述缓冲液I包括：Tris-HCl缓冲液(Ph8.0)20mM、二硫苏糖醇5mM、PEG20004％、ATP 15mM、磷酸肌酸二钠50mM、DNTPs 5mM、磷酸烯醇式丙酮酸20mM、甘露醇20ng/ul；
具体的，所述缓冲液II包括：10倍浓度的NEB 3.1buffer；
具体的，所述缓冲液Ⅲ包括：MgCl 250mM、DTT 10mM、50％甘油、MgAc2280 mM、肝素500μg/mL。
具体的，所述可视化病毒检测分型体系包括：Cas专用检测试纸条、缓冲液I、缓冲液II、缓冲液Ⅲ、病毒检测管I、病毒检测管II、c-tpye病毒分型管、w-type病毒分型管、试纸条探针；所述试纸条探针50nM-150nM，优选100nM；
具体的，所述G2Rcom基因检测引物为：
SEQ ID NO 1G2Rcom forward GAAGCCGTAATCTATGTTGTCTATCGTGTC
SEQ ID NO 2G2Rcom reverse GATTATTGTGAGATGTAAAGGTATCCGAAC
具体的，所述G2Rcom基因CrRNA为：
SEQ ID NO 3G2Rcom CrRNA
UAAUUUCUACUAAGUGUAGAUAGAUUAUGUGAUAGCAAGAC
具体的，所述F3L基因检测2对引物分别为：第1对：
SEQ ID NO 4F3L forward I CTCCTCGTTGGTCTACGACAATGGATGCTG
SEQ ID NO 5F3L reverseII GCGGGATACATCATCTATTATAGCATCAGC
具体的，所述F3L基因CrRNAI为：
SEQ ID NO 6F3L CrRNAI
UAAUUUCUACUAAGUGUAGAUGAUGCUGAUGCTAUAAUAGA
具体的，所述F3L基因检测第2对引物为
SEQ ID NO 7F3L forwardII CCCTGTCACCGTTATTAATGAGTACTGCC
SEQ ID NO 8F3L reverseII CCTTATCGAATACTCTTCCGTCAATGTCTA
具体的，所述F3L基因CrRNAII为：
SEQ ID NO 9F3L CrRNAII
UAAUUUCUACUAAGUGUAGAUATACGAAAAGACCAAT CTC T
具体的，所述c-tpye序列检测引物为
SEQ ID NO 10c-tpye forward AGAGCCAAAGTCTACTCCGCCAATATCAAG
SEQ ID NO 11c-tpye reverse TCTATGTCTACCTGGATACAGAAAGCAA
具体的，所述c-tpye序列CrRNA为：
SEQ ID NO 12c-tpye CrRNA
UAAUUUCUACUAAGUGUAGAUGCAUAUAUGGGUCCCAUUUU
具体的，所述w-tpye基因检测引物为
SEQ ID NO 13w-tpye forward CGTGTGGTCCCGGAACATATTCTCACACCG
SEQ ID NO 14w-tpye reverse TTAGTTCCGACGTTGAGATGGATTCGCTGA
具体的，所述w-tpye基因CrRNA为：
SEQ ID NO 15w-tpye CrRNA
UAAUUUCUACUAAGUGUAGAUACAGAUAAAUGCGAACCCGUCGU
具体的，所述荧光探针的5’段修饰为FAM，3’端修饰为HBQ1；荧光探针：
SEQ ID NO 16Probe FAM-TTTTTT-BHQ1
具体的，所述荧光探针的5’段修饰为FAM，3’端修饰为Biotin；试纸条探针：
SEQ ID NO 17TestProbe FAM-TTTTTT-Biotin
具体的，所述Cas专用检测试纸条包括：PVC背板、样品垫、结合垫、硝酸纤维素膜和吸水纸，所述PVC背板沿水平方向设置，该PVC背板上由左至右依次相连接设置样品垫、结合垫、硝酸纤维素膜和吸水纸，各部分在相邻处重叠设置；所述结合垫上包被胶体金标记物；所述硝酸纤维素膜上沿水平方向平行间隔分别设置质控线C线、检测线T线；所述质控线C线上包被的BSA化生物素的浓度为0.5mg/mL-2mg/mL，优选为1mg/mL，喷量为5ul/cm；所述检测线T线上包被的抗地高辛抗体浓度为0.1mg/mL-0.3mg/mL，优选为0.25mg/mL，喷量为5ul/cm；
具体的，所述检测样本中是否含有猴痘病毒并分型的步骤为：(1)样本采集；(2)猴痘病毒提取；(3)配制病毒检测分型体系：将提取得到的5ul待测样本核酸、21ul缓冲液I、5ul缓冲液II、5ul荧光探针、11ul ddH2O、3ul缓冲液Ⅲ，混匀后加入病毒检测管I、病毒检测管II、c-tpye病毒分型管、w-type病毒分型管，充分混匀；(4)荧光法结果检测：置于荧光定量PCR仪，25℃-42℃，优选为37℃，1min；10循环-60循环；选择FAM荧光检测通道，每1min收集一次信号，启动检测；使用荧光定量PCR仪进行分析时，按照阈值线刚好超过正常阴性对照品扩增曲线最高点设定阈值，也可根据仪器噪音情况调整阈值；阴性对照无扩增，阳性对照ct值低于10时结果有效；阳性(+)：ct值低于10；结果判读：1)猴痘病毒核酸阳性：病毒检测管I、病毒检测管II同时阳性，判读为猴痘病毒阳性；2)猴痘病毒的刚果株核酸阳性：在猴痘病毒阳性结果基础上，c-tpye病毒分型管阳性，w-type病毒分型管阴性；3)猴痘病毒的西非株核酸阳性：在猴痘病毒阳性结果基础上，c-tpye病毒分型管阴性，w-type病毒分型管阳性；4)猴痘病毒的其他亚型核酸阳性：在猴痘病毒阳性结果基础上，c-tpye病毒分型管阴性，w-type病毒分型管阴性；5)猴痘病毒阴性：病毒检测管I、病毒检测管II、c-tpye病毒分型管、w-type病毒分型管均为阴性结果；6)以下情况需要重新检测：病毒检测管I、病毒检测管II未同时出现阳性，需要重新提取核酸进行检测；(5)配制可视化病毒检测分型体系：将提取得到的5ul待测样本核酸、21ul缓冲液I、5ul缓冲液II、5ul试纸条探针、11ul ddH2O、3ul缓冲液Ⅲ，混匀后加入病毒检测管I、病毒检测管II、c-tpye病毒分型管、w-type病毒分型管，充分混匀；反应管室温静置10min-30min，启动检测；优选为每隔1min混匀检测管；(6)可视化结果检测；将试纸条插入反应管中，液面不得超过结合垫最上端，待判读区全部浸润，质控线C线显色后10min内观察结果；阳性(+)：质控线C线和检测线T线均出现红色条带或试纸条只有检测线T线出现红色条带，上述两种情况均说明Cas12进行有效切割，并激活报告基团显色，结果均可判定为阳性；阴性(-)：质控线C线出现一条红色条带，检测线T线不显色，判定为阴性结果，该结果表明Cas12未能切割报告分子，未能激活报告基团显色；无效：质控线C线和检测线T线均未出现条带，提示所用的试纸条或试剂可能已经损坏、失效或操作有误，此时，应重新扩增和检测；结果判读：1)猴痘病毒核酸阳性：病毒检测管I、病毒检测管II同时阳性，判读为猴痘病毒阳性；2)猴痘病毒的刚果株核酸阳性：在猴痘病毒阳性结果基础上，c-tpye病毒分型管阳性，w-type病毒分型管阴性；3)猴痘病毒的西非株核酸阳性：在猴痘病毒阳性结果基础上，c-tpye病毒分型管阴性，w-type病毒分型管阳性；4)猴痘病毒的其他亚型核酸阳性：在猴痘病毒阳性结果基础上，c-tpye病毒分型管阴性，w-type病毒分型管阴性；5)猴痘病毒阴性：病毒检测管I、病毒检测管II、c-tpye病毒分型管、w-type病毒分型管均为阴性结果；6)以下情况需要重新检测：病毒检测管I、病毒检测管II未同时出现阳性，需要重新提取核酸进行检测；
下面将结合实施例对本发明的实施方案进行详细描述，但是本领域技术人员将会理解，下列实施例仅用于说明本发明，而不应视为限制本发明的范围。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规产品。
实施例一一种常温猴痘病毒检测分型试剂盒
请参阅附图，本发明提供一种常温猴痘病毒检测分型试剂盒，包括：病毒检测分型体系、可视化病毒检测分型体系；
所述病毒检测分型体系包括缓冲液I、缓冲液II、缓冲液Ⅲ、病毒检测管I、病毒检测管II、c-tpye病毒分型管、w-type病毒分型管、荧光探针；所述病毒检测管I包括：检测冻干制剂、猴痘病毒检测冻干制剂I；所述猴痘病毒检测冻干制剂I包括G2Rcom基因检测引物各0.4μM；G2Rcom基因CrRNA 100nM；所述病毒检测管II包括：检测冻干制剂、猴痘病毒检测冻干制剂II；所述猴痘病毒检测冻干制剂II包括F3L基因检测引物各0.4μM，F3L基因CrRNAI 100nM，F3L基因CrRNAII 100nM；所述c-tpye病毒分型管包括：检测冻干制剂、猴痘病毒c-tpye检测冻干制剂；所述c-tpye检测冻干制剂包括c-tpye序列检测引物、c-tpye序列CrRNA；所述c-tpye序列检测引物各0.4μM；所述c-tpye序列CrRNA为100nM；所述w-type病毒分型管包括：检测冻干制剂、猴痘病毒w-type检测冻干制剂；所述w-type检测冻干制剂包括w-type基因检测引物各0.4μM；w-type基因CrRNA 100nM；所述荧光探针浓度为100nM；
所述检测冻干制剂包括：磷酸肌酶2ug、丙酮酸激酶10ug、重组酶15ug、RecA蛋白4ug-、单链结合蛋白15ug、DNA聚合酶I 4ug、海藻糖2ug、氯化钠200ug、氯化钾150ug、Cas12a10ug；
所述缓冲液I包括：Tris-HCl缓冲液(Ph8.0)20mM、二硫苏糖醇5mM、PEG20004％、ATP 15mM、磷酸肌酸二钠50mM、DNTPs 5mM、磷酸烯醇式丙酮酸20mM、甘露醇20ng/ul；
所述缓冲液II包括：10倍浓度的NEB 3.1buffer；
所述缓冲液Ⅲ包括：MgCl 250mM、DTT 10mM、50％甘油、MgAc2280 mM、肝素500μg/mL。
所述可视化病毒检测分型体系包括：Cas专用检测试纸条、缓冲液I、缓冲液II、缓冲液Ⅲ、病毒检测管I、病毒检测管II、c-tpye病毒分型管、w-type病毒分型管、试纸条探针；所述试纸条探针50nM-150nM，优选100nM；
所述G2Rcom基因检测引物为：
SEQ ID NO 1G2Rcom forward GAAGCCGTAATCTATGTTGTCTATCGTGTC
SEQ ID NO 2G2Rcom reverse GATTATTGTGAGATGTAAAGGTATCCGAAC
所述G2Rcom基因CrRNA为：
SEQ ID NO 3G2Rcom CrRNA
UAAUUUCUACUAAGUGUAGAUAGAUUAUGUGAUAGCAAGAC
所述F3L基因检测2对引物分别为：第1对：
SEQ ID NO 4F3L forward I CTCCTCGTTGGTCTACGACAATGGATGCTG
SEQ ID NO 5F3L reverseII GCGGGATACATCATCTATTATAGCATCAGC
所述F3L基因CrRNAI为：
SEQ ID NO 6F3L CrRNAI
UAAUUUCUACUAAGUGUAGAUGAUGCUGAUGCTAUAAUAGA
所述F3L基因检测第2对引物为
SEQ ID NO 7F3L forwardII CCCTGTCACCGTTATTAATGAGTACTGCC
SEQ ID NO 8F3L reverseII CCTTATCGAATACTCTTCCGTCAATGTCTA
所述F3L基因CrRNAII为：
SEQ ID NO 9F3L CrRNAII
UAAUUUCUACUAAGUGUAGAUATACGAAAAGACCAAT CTC T
所述c-tpye序列检测引物为
SEQ ID NO 10c-tpye forward AGAGCCAAAGTCTACTCCGCCAATATCAAG
SEQ ID NO 11c-tpye reverse TCTATGTCTACCTGGATACAGAAAGCAA
所述c-tpye序列CrRNA为：
SEQ ID NO 12c-tpye CrRNA
UAAUUUCUACUAAGUGUAGAUGCAUAUAUGGGUCCCAUUUU
所述w-tpye基因检测引物为
SEQ ID NO 13w-tpye forward CGTGTGGTCCCGGAACATATTCTCACACCG
SEQ ID NO 14w-tpye reverse TTAGTTCCGACGTTGAGATGGATTCGCTGA
所述w-tpye基因CrRNA为：
SEQ ID NO 15w-tpye CrRNA
UAAUUUCUACUAAGUGUAGAUACAGAUAAAUGCGAACCCGUCGU
所述荧光探针的5’段修饰为FAM，3’端修饰为HBQ1；荧光探针：
SEQ ID NO 16Probe FAM-TTTTTT-BHQ1
所述荧光探针的5’段修饰为FAM，3’端修饰为Biotin；试纸条探针：
SEQ ID NO 17TestProbe FAM-TTTTTT-Biotin
所述Cas专用检测试纸条包括：PVC背板、样品垫、结合垫、硝酸纤维素膜和吸水纸，所述PVC背板沿水平方向设置，该PVC背板上由左至右依次相连接设置样品垫、结合垫、硝酸纤维素膜和吸水纸，各部分在相邻处重叠设置；所述结合垫上包被胶体金标记物；所述硝酸纤维素膜上沿水平方向平行间隔分别设置质控线C线、检测线T线；所述质控线C线上包被的BSA化生物素的浓度为1mg/mL，喷量为5ul/cm；所述检测线T线上包被的抗地高辛抗体浓度为0.25mg/mL，喷量为5ul/cm；
所述检测样本中是否含有猴痘病毒并分型的步骤为：(1)样本采集；(2)猴痘病毒核酸提取；(3)配制病毒检测分型体系：将提取得到的5ul待测样本核酸、21ul缓冲液I、5ul缓冲液II、5ul荧光探针、11ul ddH2O、3ul缓冲液Ⅲ，混匀后加入病毒检测管I、病毒检测管II、c-tpye病毒分型管、w-type病毒分型管，充分混匀；(4)荧光法结果检测：置于荧光定量PCR仪，37℃，1min，20循环。选择FAM荧光检测通道，每1min收集一次信号，启动检测；使用荧光定量PCR仪进行分析时，按照阈值线刚好超过正常阴性对照品扩增曲线最高点设定阈值，也可根据仪器噪音情况调整阈值；结果判读：阴性对照无扩增，阳性对照ct值低于10时结果有效；(5)配制可视化病毒检测分型体系：将提取得到的5ul待测样本核酸、21ul缓冲液I、5ul缓冲液II、5ul试纸条探针、11ul ddH2O、3ul缓冲液Ⅲ，混匀后加入病毒检测管I、病毒检测管II、c-tpye病毒分型管、w-type病毒分型管，充分混匀；反应管室温静置10min，启动检测；优选为每隔1min混匀检测管；(6)可视化结果判读；将试纸条插入反应管中，液面不得超过结合垫最上端，待判读区全部浸润，质控线C线显色后10min内观察结果，进行判读；阳性(+)：质控线C线和检测线T线均出现红色条带；试纸条质控线C线不显色，检测线T线出现红色条带。上述两种情况均说明Cas12进行有效切割，并激活报告基团显色，结果均可判定为阳性。阴性(-)：质控线C线出现一条红色条带，检测线T线不显色，判定为阴性结果。该结果表明Cas12未能切割报告分子，未能激活报告基团显色。无效：质控线C线和检测线T线均未出现条带，提示所用的试纸条或试剂可能已经损坏、失效或操作有误，此时，应重新扩增和检测；
实施例二本发明筛选对猴痘病毒进行检测和分型的引物和探针
检测猴痘病毒引物和crRNA设计：从NCBI数据库中检索到猴痘病毒的G2Rcom基因序列和F3L基因序列是猴痘病毒各种亚型的共有基因可以用于猴痘病毒的检测，通过比对数据库中已有序列，选择相对保守区域，利用Primer Premier 5.0软件，参照TwistDx公司说明书上的引物设计原则设计G2Rcom基因序列和F3L基因序列的检测引物和crRNA，通过在NCBI数据库中blast比对和多次实验筛选，选出检测猴痘病毒的引物和crRNA，见表1，引物由上海生工生物工程有限公司合成。
猴痘病毒分型引物和crRNA设计：通过比对NCBI数据库中猴痘病毒多种亚型的基因序列，检索到猴痘病毒的刚果株和西非株两种常见亚型的特异性序列，可以用于猴痘病毒的两种亚型的分型，利用Primer Premier 5.0软件，参照TwistDx公司说明书上的引物设计原则设计两种亚型的检测引物和crRNA，通过在NCBI数据库中blast比对和多次实验筛选，选出引物和crRNA，见表1，引物由上海生工生物工程有限公司合成。
探针设计：根据RPA和Cas检测的探针设计原则，设计荧光检测探针和试纸条探针，见表1。
核酸准备：以猴痘病毒刚果株、猴痘病毒西非株两种亚型的质粒，分别作为猴痘病毒的待测核酸；
配制病毒检测分型体系：5ul猴痘病毒核酸，21ul缓冲液I、5ul缓冲液II、5ul荧光探针、11ul ddH2O、3ul缓冲液Ⅲ，混匀后加入病毒检测管I、病毒检测管II；c-tpye病毒分型管、w-type病毒分型管，充分混匀；
荧光法检测程序：25℃-42℃，1min，10循环-60循环。选择FAM荧光检测通道，每1min收集一次信号，启动检测；
配制可视化病毒检测分型体系：5ul猴痘病毒核酸、21ul缓冲液I、5ul缓冲液II、5ul试纸条探针、11ul ddH2O、3ul缓冲液Ⅲ，混匀后加入病毒检测管I、病毒检测管II、c-tpye病毒分型管、w-type病毒分型管，充分混匀；反应管室温静置10min-30min，启动检测；优选为每隔1min混匀检测管；
结果显示所设计的引物、crRNA、探针的检测结果如下：
(1)病毒检测分型体系的病毒检测管I、病毒检测管II对猴痘病毒刚果株、猴痘病毒西非株两种亚型检测均为阳性结果；c-tpye病毒分型管对猴痘病毒刚果株检测阳性，对猴痘病毒西非株检测阴性；w-type病毒分型管对猴痘病毒刚果株检测阴性，对猴痘病毒西非株检测阳性；空白对照检测结果全阴性；
(2)可视化病毒检测分型体系：检测试纸条检测结果显示病毒检测管I、病毒检测管II对猴痘病毒刚果株、猴痘病毒西非株两种亚型检测均为阳性结果；c-tpye病毒分型管对猴痘病毒刚果株检测阳性，对猴痘病毒西非株检测阴性；w-type病毒分型管对猴痘病毒刚果株检测阴性，对猴痘病毒西非株检测阳性；空白对照检测结果全阴性；
结果表示：所设计的引物和探针的扩增效率高，可以被准确检测且区分猴痘病毒刚果株、猴痘病毒西非株，可以用作为本发明的特异性引物和探针。
表1
实施例三本发明的病毒检测分型体系的检测敏感性
请参阅图3、图4、图5，验证本发明的病毒检测分型体系的检测敏感性
猴痘病毒核酸制备：基因合成的携带G2Rcom基因、F3L基因、c-tpye序列、w-tpye序列的猴痘病毒的阳性质粒为待测猴痘核酸，分别调整质粒浓度为106copies/mL、104copies/mL、103copies/mL、102copies/mL进行检测。
配制病毒检测分型体系：5ul猴痘病毒核酸，21ul缓冲液I、5ul缓冲液II、5ul荧光探针、11ul ddH2O、3ul缓冲液Ⅲ，混匀后加入病毒检测管I、病毒检测管II；c-tpye病毒分型管、w-type病毒分型管，充分混匀；
荧光法检测程序：25℃-42℃，1min，10循环-60循环。选择FAM荧光检测通道，每1min收集一次信号，启动检测；
结果：结果显示如图3、图4、图5，病毒检测管I、病毒检测管II；c-tpye病毒分型管、w-type病毒分型管对浓度为106copies/mL、104copies/mL、103copies/mL的阳性质粒全部检出，而对阴性质控未能检出，且随着阳性质粒浓度的提高，CT值逐渐变小，有明显趋势。因此证明在未对质粒进行富集时，本发明的病毒检测分型体系检出限为103copies/mL。
实施例四本发明的病毒检测分型体系的检测特异性
请参阅图6、图7、图8，验证本发明的病毒检测分型体系的检测特异性
猴痘病毒核酸(MPXV)制备：基因合成的携带G2Rcom基因、F3L基因、c-tpye序列、w-tpye序列的猴痘病毒的阳性质粒为待测猴痘核酸，进行检测。
牛痘病毒核酸(VACV)：基因合成的携带G2Rcom基因、F3L基因的牛痘病毒核酸阳性质粒；
库皮科斯病毒(CPXV)：基因合成的携带G2Rcom基因、F3L基因的库皮科斯病毒核酸阳性质粒；
绵羊痘病毒(SGPV):基因合成的携带G2Rcom基因、F3L基因的绵羊痘病毒核酸阳性质粒；
小鼠鼠痘病毒(ECTV):基因合成的携带G2Rcom基因、F3L基因的小鼠鼠痘病毒核酸阳性质粒；
配制猴痘病毒核酸检测体系：5ul猴痘病毒核酸，21ul缓冲液I、5ul缓冲液II、5ul荧光探针、11ul ddH2O、3ul缓冲液Ⅲ，混匀后加入病毒检测管I、病毒检测管II；c-tpye病毒分型管、w-type病毒分型管，充分混匀；
荧光法检测程序：25℃-42℃，1min，10循环-60循环。选择FAM荧光检测通道，每1min收集一次信号，启动检测；
结果：结果显示如图6、图7、图8，对猴痘病毒核酸，病毒检测管I、病毒检测管II；c-tpye病毒分型管、w-type病毒分型管对猴痘病毒核酸(MPXV)全部检出，而对其他病毒均未能检出；证明本发明的病毒检测分型体系特异性较高，不会与其他病毒有交叉反应。
实施例五本发明的病毒检测分型体系的检测重复性
请参阅图9、图10、图11，验证本发明的病毒检测分型体系的检测重复性
猴痘病毒核酸制备：基因合成的携带G2Rcom基因、F3L基因、c-tpye序列、w-tpye序列的猴痘病毒的阳性质粒为待测猴痘核酸，调整质粒的浓度为104copies/mL、103copies/mL进行检测。
配制病毒检测分型体系：5ul待测核酸，21ul缓冲液I、5ul缓冲液II、5ul荧光探针、11ul ddH2O、3ul缓冲液Ⅲ，混匀后加入病毒检测管I、病毒检测管II；c-tpye病毒分型管、w-type病毒分型管，充分混匀；
重复性检测：在反应体系相同条件下，病毒检测管I对浓度为104copies/mL、103copies/mL的质粒重复检测2遍；病毒检测管II对浓度为104copies/mL、103copies/mL的质粒重复检测2遍；c-tpye病毒分型管对浓度为104copies/mL、103copies/mL的质粒重复检测3遍；w-type病毒分型管对浓度为104copies/mL、103copies/mL的质粒重复检测3遍；
荧光法检测程序：25℃-42℃，1min，10循环-60循环。选择FAM荧光检测通道，每1min收集一次信号，启动检测；
结果：结果显示如图9、图10、图11，病毒检测管I、病毒检测管II；c-tpye病毒分型管、w-type病毒分型管对104copies/mL、103copies/mL的质粒全部检出，证明本发明的病毒检测分型体系重复性较好。
实施例六可视化病毒检测分型体系的检测敏感性
请参阅图12、图13、图14，验证本发明的可视化病毒检测分型体系的检测敏感性
猴痘病毒核酸制备：基因合成的携带G2Rcom基因、F3L基因、c-tpye序列、w-tpye序列的猴痘病毒的阳性质粒为待测猴痘核酸，分别调整质粒浓度为10copies/mL、102copies/mL、103copies/mL、104copies/mL、105copies/mL、106copies/mL进行检测。
配制可视化病毒检测分型体系：5ul猴痘病毒核酸，21ul缓冲液I、5ul缓冲液II、5ul试纸条探针、11ul ddH2O、3ul缓冲液Ⅲ，混匀后加入病毒检测管I、病毒检测管II；c-tpye病毒分型管、w-type病毒分型管，充分混匀；
可视化病毒检测分型体系检测程序：室温静置30分钟，启动检测；优选为每隔1min混匀检测管；将试纸条插入反应管中，液面不得超过结合垫最上端，待判读区全部浸润，质控线C线显色后10min内观察结果，进行判读；
结果：结果显示如图12、图13、图14，样本顺序从左至右为：阴性、10copies/mL、102copies/mL、103copies/mL、104copies/mL、105copies/mL、106copies/mL、106copies/mL，病毒检测管I、病毒检测管II；c-tpye病毒分型管、w-type病毒分型管对浓度102copies/mL以上阳性质粒全部检出，而对阴性质控未能检出，且随着阳性质粒浓度的提高，检测线T线有明显增加趋势，质粒浓度过高时质控线C线会不出现。因此证明在未对质粒进行富集时，本发明的可视化病毒检测分型体系检出限为102copies/mL。
综上所述，本发明利用荧光探针可在30分钟内对提取核酸进行快速准确检测，同时CRISPR-Cas12a检测技术还可以与侧向流试纸条联用，不需要昂贵的qPCR仪等设备，实现检测结果肉眼可见。扩增过程和检测过程在同一反应管中进行，该方法简单、快速、无需大型仪器设备操作，对操作人员专业性要求低。所以，本发明有效克服了现有技术中的种种缺点而具高度产业利用价值。
上述实施例仅例示性说明本发明的原理及其功效，而非用于限制本发明。任何熟悉此技术的人士皆可在不违背本发明的精神及范畴下，对上述实施例进行修饰或改变。因此，举凡所属技术领域中具有通常知识者在未脱离本发明所揭示的精神与技术思想下所完成的一切等效修饰或改变，仍应由本发明的权利要求所涵盖。
Claims (4)
1.一种常温猴痘病毒检测分型试剂盒，其特征在于，所述一种常温猴痘病毒检测分型试剂盒包括：病毒检测分型体系、可视化病毒检测分型体系；
所述病毒检测分型体系包括缓冲液I、缓冲液II、缓冲液Ⅲ、病毒检测管I、病毒检测管II、c-tpye病毒分型管、w-type病毒分型管、荧光探针；所述病毒检测管I包括：检测冻干制剂、猴痘病毒检测冻干制剂I；所述猴痘病毒检测冻干制剂I包括G2Rcom基因检测引物和CrRNA；所述G2Rcom基因检测引物各0.3μM-0.6μM，优选0.4μM；所述G2Rcom基因CrRNA50nM-200nM，优选100nM；所述病毒检测管II包括：检测冻干制剂、猴痘病毒检测冻干制剂II；所述猴痘病毒检测冻干制剂II包括F3L基因检测引物2对、F3L基因CrRNAI、F3L基因CrRNAII；所述F3L基因检测引物各0.3μM-0.6μM，优选0.4μM；所述F3L基因CrRNAI50nM-200nM，优选100nM；所述F3L基因CrRNAII50nM-200nM，优选100nM；所述c-tpye病毒分型管包括：检测冻干制剂、猴痘病毒c-tpye检测冻干制剂；所述c-tpye检测冻干制剂包括c-tpye序列检测引物、c-tpye序列CrRNA；所述c-tpye序列检测引物各0.3μM-0.6μM，优选0.4μM；所述c-tpye序列CrRNA为50nM-200nM，优选100nM；所述w-type病毒分型管包括：检测冻干制剂、猴痘病毒w-type检测冻干制剂；所述w-type检测冻干制剂包括w-type基因检测引物、w-type基因CrRNA；所述w-type基因检测引物各0.3μM-0.6μM，优选0.4μM；w-type基因CrRNA50nM-200nM，优选100nM；所述荧光探针浓度为50nM-150nM，优选100nM；
所述检测冻干制剂包括：磷酸肌酶2ug-4ug、丙酮酸激酶10ug-20ug、重组酶10ug-20ug、RecA蛋白4ug-8ug、单链结合蛋白10ug-20ug、DNA聚合酶I2ug-4ug、海藻糖1ug-2ug、氯化钠50ug-500ug、氯化钾25ug-250ug、Cas12a2ug-30ug；
所述缓冲液I包括：Tris-HCl缓冲液(Ph8.0)20mM、二硫苏糖醇5mM、PEG20004％、ATP15mM、磷酸肌酸二钠50mM、DNTPs5mM、磷酸烯醇式丙酮酸20mM、甘露醇20ng/ul；
所述缓冲液II包括：10倍浓度的NEB3.1buffer；
所述缓冲液Ⅲ包括：MgCl250mM、DTT10mM、50％甘油、MgAc2280mM、肝素500μg/mL；
所述可视化病毒检测分型体系包括：Cas专用检测试纸条、缓冲液I、缓冲液II、缓冲液Ⅲ、病毒检测管I、病毒检测管II、c-tpye病毒分型管、w-type病毒分型管、试纸条探针；所述试纸条探针50nM-150nM，优选100nM。
2.根据权利要求1所述的一种常温猴痘病毒检测分型试剂盒，其特征在于：
所述G2Rcom基因检测引物为：
SEQIDNO1G2RcomforwardGAAGCCGTAATCTATGTTGTCTATCGTGTC SEQIDNO2G2RcomreverseGATTATTGTGAGATGTAAAGGTATCCGAAC所述G2Rcom基因CrRNA为：
SEQIDNO3G2RcomCrRNA
UAAUUUCUACUAAGUGUAGAUAGAUUAUGUGAUAGCAAGAC所述F3L基因检测2对引物分别为：第1对：
SEQIDNO4F3LforwardICTCCTCGTTGGTCTACGACAATGGATGCTG SEQIDNO5F3LreverseIIGCGGGATACATCATCTATTATAGCATCAGC所述F3L基因CrRNAI为：
SEQIDNO6F3LCrRNAI
UAAUUUCUACUAAGUGUAGAUGAUGCUGAUGCTAUAAUAGA所述F3L基因检测第2对引物为SEQIDNO7F3LforwardIICCCTGTCACCGTTATTAATGAGTACTGCC SEQIDNO8F3LreverseIICCTTATCGAATACTCTTCCGTCAATGTCTA所述F3L基因CrRNAII为：
SEQIDNO9F3LCrRNAII
UAAUUUCUACUAAGUGUAGAUATACGAAAAGACCAATCTCT所述c-tpye序列检测引物为SEQIDNO10c-tpyeforwardAGAGCCAAAGTCTACTCCGCCAATATCAAG SEQIDNO11c-tpyereverseTCTATGTCTACCTGGATACAGAAAGCAA所述c-tpye序列CrRNA为：
SEQIDNO12c-tpyeCrRNA
UAAUUUCUACUAAGUGUAGAUGCAUAUAUGGGUCCCAUUUU所述w-tpye基因检测引物为SEQIDNO13w-tpyeforwardCGTGTGGTCCCGGAACATATTCTCACACCG SEQIDNO14w-tpyereverseTTAGTTCCGACGTTGAGATGGATTCGCTGA所述w-tpye基因CrRNA为：
SEQIDNO15w-tpyeCrRNA
UAAUUUCUACUAAGUGUAGAUACAGAUAAAUGCGAACCCGUCGU所述荧光探针的5’段修饰为FAM，3’端修饰为HBQ1；荧光探针：
SEQIDNO16ProbeFAM-TTTTTT-BHQ1
所述荧光探针的5’段修饰为FAM，3’端修饰为Biotin；试纸条探针：
SEQIDNO17TestProbeFAM-TTTTTT-Biotin。
3.根据权利要求1所述的一种常温猴痘病毒检测分型试剂盒，其特征在于：所述Cas专用检测试纸条包括：PVC背板、样品垫、结合垫、硝酸纤维素膜和吸水纸，所述PVC背板沿水平方向设置，该PVC背板上由左至右依次相连接设置样品垫、结合垫、硝酸纤维素膜和吸水纸，各部分在相邻处重叠设置；所述结合垫上包被胶体金标记物；所述硝酸纤维素膜上沿水平方向平行间隔分别设置质控线C线、检测线T线；所述质控线C线上包被的BSA化生物素的浓度为0.5mg/mL-2mg/mL，优选为1mg/mL，喷量为5ul/cm；所述检测线T线上包被的抗地高辛抗体浓度为0.1mg/mL-0.3mg/mL，优选为0.25mg/mL，喷量为5ul/cm。
4.根据权利要求1所述的一种常温猴痘病毒检测分型试剂盒，其特征在于：检测样本中是否含有猴痘病毒并分型的步骤为：(1)样本采集；(2)猴痘病毒提取；(3)配制病毒检测分型体系：将提取得到的5ul待测样本核酸、21ul缓冲液I、5ul缓冲液II、5ul荧光探针、11ulddH2O、3ul缓冲液Ⅲ，混匀后加入病毒检测管I、病毒检测管II、c-tpye病毒分型管、w-type病毒分型管，充分混匀；(4)荧光法结果检测：置于荧光定量PCR仪，25℃-42℃，优选为37℃，1min；10循环-60循环；选择FAM荧光检测通道，每1min收集一次信号，启动检测；使用荧光定量PCR仪进行分析时，按照阈值线刚好超过正常阴性对照品扩增曲线最高点设定阈值，也可根据仪器噪音情况调整阈值；阴性对照无扩增，阳性对照ct值低于10时结果有效；阳性(+)：ct值低于10；结果判读：1)猴痘病毒核酸阳性：病毒检测管I、病毒检测管II同时阳性，判读为猴痘病毒阳性；2)猴痘病毒的刚果株核酸阳性：在猴痘病毒阳性结果基础上，c-tpye病毒分型管阳性，w-type病毒分型管阴性；3)猴痘病毒的西非株核酸阳性：在猴痘病毒阳性结果基础上，c-tpye病毒分型管阴性，w-type病毒分型管阳性；4)猴痘病毒的其他亚型核酸阳性：在猴痘病毒阳性结果基础上，c-tpye病毒分型管阴性，w-type病毒分型管阴性；5)猴痘病毒阴性：病毒检测管I、病毒检测管II、c-tpye病毒分型管、w-type病毒分型管均为阴性结果；6)以下情况需要重新检测：病毒检测管I、病毒检测管II未同时出现阳性，需要重新提取核酸进行检测；(5)配制可视化病毒检测分型体系：将提取得到的5ul待测样本核酸、21ul缓冲液I、5ul缓冲液II、5ul试纸条探针、11ulddH2O、3ul缓冲液Ⅲ，混匀后加入病毒检测管I、病毒检测管II、c-tpye病毒分型管、w-type病毒分型管，充分混匀；反应管室温静置10min-30min，启动检测；优选为每隔1min混匀检测管；(6)可视化结果检测；将试纸条插入反应管中，液面不得超过结合垫最上端，待判读区全部浸润，质控线C线显色后10min内观察结果；阳性(+)：质控线C线和检测线T线均出现红色条带或试纸条只有检测线T线出现红色条带，上述两种情况均说明Cas12进行有效切割，并激活报告基团显色，结果均可判定为阳性；阴性(-)：质控线C线出现一条红色条带，检测线T线不显色，判定为阴性结果，该结果表明Cas12未能切割报告分子，未能激活报告基团显色；无效：质控线C线和检测线T线均未出现条带，提示所用的试纸条或试剂可能已经损坏、失效或操作有误，此时，应重新扩增和检测；结果判读：1)猴痘病毒核酸阳性：病毒检测管I、病毒检测管II同时阳性，判读为猴痘病毒阳性；2)猴痘病毒的刚果株核酸阳性：在猴痘病毒阳性结果基础上，c-tpye病毒分型管阳性，w-type病毒分型管阴性；3)猴痘病毒的西非株核酸阳性：在猴痘病毒阳性结果基础上，c-tpye病毒分型管阴性，w-type病毒分型管阳性；4)猴痘病毒的其他亚型核酸阳性：在猴痘病毒阳性结果基础上，c-tpye病毒分型管阴性，w-type病毒分型管阴性；5)猴痘病毒阴性：病毒检测管I、病毒检测管II、c-tpye病毒分型管、w-type病毒分型管均为阴性结果；6)以下情况需要重新检测：病毒检测管I、病毒检测管II未同时出现阳性，需要重新提取核酸进行检测。
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| CN114292843A (zh) * | 2021-12-03 | 2022-04-08 | 中国科学院精密测量科学与技术创新研究院 | 一种基因兴奋剂的CRISPR/Cas12a检测体系及其应用 |
| CN114752711A (zh) * | 2022-06-15 | 2022-07-15 | 圣湘生物科技股份有限公司 | 检测猴痘病毒并分型的组合物、试剂盒、方法及其用途 |
Non-Patent Citations (1)
| Title |
|---|
| LINGJING MAO等: "Development and Characterization of Recombinase-Based Isothermal Amplification Assays (RPA/RAA) for the Rapid Detection of Monkeypox Virus", VIRUSES, vol. 14, no. 10, 23 September 2022 (2022-09-23), pages 1 - 12 * |
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|---|---|---|---|---|
| CN117965815A (zh) * | 2024-04-02 | 2024-05-03 | 中国人民解放军军事科学院军事医学研究院 | 基于RPA-CRISPR/Cas13a的猴痘病毒核酸检测方法 |
| CN117965815B (zh) * | 2024-04-02 | 2024-06-25 | 中国人民解放军军事科学院军事医学研究院 | 基于RPA-CRISPR/Cas13a的猴痘病毒核酸检测方法 |
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