CN114292843A - 一种基因兴奋剂的CRISPR/Cas12a检测体系及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种基因兴奋剂的CRISPR/Cas12a检测体系及其应用。本发明通过研究筛选出能特异性反映基因兴奋剂的外显子区域，针对该区域设计RPA扩增引物，再针对扩增产物设计特异性crRNA，通过crRNA特异性识别基因兴奋剂靶标并激活Cas12a的反式剪切能力对所加入的报告基团进行剪切，其中crRNA1、crRNA2、crRNA3和crRNA4对于基因兴奋剂靶标的检出有更高的灵敏度，进一步构建了CRISPR/Cas12a快速检测系统，利用荧光或试纸条进行快速检测，实现对基因兴奋剂核酸的高灵敏度、高特异性及快速可视化检测，为临床诊断和实验室研究提供了一个准确、快速、简便的检测方法。

Description

一种基因兴奋剂的CRISPR/Cas12a检测体系及其应用

技术领域

本发明涉及基因检测技术领域，具体涉及一种基因兴奋剂的CRISPR/Cas12a检测体系及其应用。

背景技术

基因兴奋剂的概念是由调查特定基因和体能之间相关性的研究引发的。2003年，世界反兴奋剂机构(WADA)将基因兴奋剂添加到他们的禁止名单中。2021年，WADA将基因兴奋剂定义为“能通过任何方式改变基因组序列和/或改变基因表达的核酸或核酸类似物，包括但不限于基因编辑、基因沉默和基因转移技术”，以及“使用有可能提高运动能力的正常或转基因细胞”。比如EPO是一种由肾脏产生的糖蛋白激素,负责控制红血球生成；临床用于治疗贫血，在体育运动中如果被用作兴奋剂可为肌肉输送更多氧气并增强耐力。目前检测运动员是否注射人工合成EPO是通过尿检的方式来完成的，但现在专家们担心有人通过注射EPO基因进入运动员体内促进EPO在体内的合成，这样常规的检测方法就无法检出。

目前，临床上应用最广泛的核酸检测方法包括实时定量PCR(quantitative real-time PCR,qPCR)、荧光原位杂交(fluorescence in situ hybridization,FISH)和二代测序(next-generation sequencing,NGS)。虽然在过去的几十年里已经有了很大的改进，但这些方法仍然有局限性。qPCR方法是当前临床实验室的主要方法，可以进行定量和精确的疾病诊断；然而它要求严格的多个温度控置，需要专业人员操作，以及严格的实验室环境等，因此削弱了qPCR的普适性，特别是在卫生保健系统薄弱和资源有限的地区。FISH提供了一种细胞内核酸分析的方法，然而FISH探针杂交所需的样品处理时间较长，且用于双链DNA变性的甲酰胺的毒性危害也为使其应用收到很大局限。NGS为大规模并行测序打开了大门，代表了基于个人基因组数据的个性化医学的突出进步，但也受到许多问题的限制，例如复杂的样本处理过程，无法快速得到检测结果，需要昂贵的仪器和试剂，且需要专业人员才能进行操作等。

CRISPR-Cas(Clustered regularly interspaced short palindromic repeats，CRISPRs)是细菌中一种适应性免疫系统，Cas蛋白通过RNA引导的核酸酶靶向降解外来核酸。CRISPR系统已经超越了其以往的基因编辑应用，在过去的五年中，CRISPR系统因其固有的灵敏性、特异性、灵活性和简单性而被重新调整用途，目前已被用于核酸检测和体外诊断。其中，CRISPR-Cas12a属于Cas酶第二家族，用来引导RNA指导双链DNA裂解单个RuvC催化结构域。这一过程中所涉及到两种方式的剪切，其一称为正式剪切(cis-cleavage)，即通过CRISPR RNA(crRNA)与靶标DNA(单链DNA或双链DNA)配对后，激活Cas12a的剪切活性完成对靶标的剪切；另一种方式为Cas12a的反式剪切(trans-cleavage)，即激活的Cas12a还可以剪切其周围溶液中的非目标单链DNA(ssDNA)，但反切能力不能剪切双链DNA(dsDNA)和RNA。最新报道发现，激活的CRISPR-Cas12a可以在约10分钟内反式切割DNA发夹结构，DNA G-三链体(G3)和DNA G-四链体(G4)；与基于ssDNA的CRISPR-Cas12a系统相比，G3报告系统将灵敏度提高了约20倍，对于未扩增和扩增的质粒检测灵敏度分别可达50pM和0.1aM(单拷贝每反应)。

侧向流动试纸(lateral flow dipstick，LFD)作为一种能够快速、方便、简单、无需专业人员和大型仪器设备操作的一种检测核酸的即时检测(Point-of-Care Testing,POCT)方法，已经在临床诊断、环境监测和食品安全等领域得到了广泛的应用研究，LFD可作为资源匮乏的场景下一种理想的读数方式。

目前还未见针对基因兴奋剂的CRISPR-Cas12a检测方法和LFD用于基因兴奋剂检测的报道。

发明内容

本发明的目的在于，针对现有技术的上述不足，提供一种用于基因兴奋剂检测的CRISPR/Cas12a检测体系及其应用。

为实现上述目的，本发明采用如下的技术方案：

本发明提供了一种基因兴奋剂的CRISPR/Cas12a检测体系，所述CRISPR/Cas12a检测体系包括：针对基因兴奋剂靶标的特异性crRNA、CRISPR/Cas12a蛋白和报告分子；

其中，所述特异性crRNA的制备方法包括：筛选能特异性反映基因兴奋剂靶标的多个外显子区域；对外显子连接区域设计RPA扩增引物并对基因兴奋剂靶标进行扩增，得到扩增产物；在扩增产物区域内，根据CRISPR-Cas12a体系中crRNA的设计原则，设计出能够特异性识别基因兴奋剂靶标的crRNA，然后合成crRNA；

所述报告分子包括单链ssDNA、可形成发夹结构的DNA、DNA G-三链体和DNA G-四链体中的任意一种；标记在所述报告分子上的基团包括能发生荧光共振能量转移的一对荧光基团、一个荧光基团和一个淬灭基团、一对基于试纸条方式检测的基团、可发生电化学反应的基团和可发生等离子体共振的基团中的任意一种。

进一步的，所述基因兴奋剂靶标包括EPO，IGF-1和GH-1中的任意一种。

进一步的，所述特异性crRNA包括crRNA1、crRNA2、crRNA3和crRNA4中的任意一种，所述crRNA1的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示，所述crRNA2的核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示；所述crRNA3的核苷酸序列如SEQ ID NO.6所示；所述crRNA4的核苷酸序列如SEQ IDNO.7所示。

进一步的，所述RPA引物包括EPO-2，GH1-1和IGF1-4中任意一种，所述EPO-2引物对核苷酸序列如SEQ ID NO.8-NO.9所示，所述GH1-1引物对核苷酸序列如SEQ ID NO.10-NO.11所示，所述IGF1-4引物对核苷酸序列如SEQ ID NO.12-NO.13所示。

进一步的，所述报告基团为TBA11-FRET、TBA11-FQ和Lateral flow TBA11中的任意一种，标记产物分别为5’-FAM-GGTTGGTGTGG-TAMRA-3’，5’-FAM-GGTTGGTGTGG-BHQ1-3’和5’-FAM-GGTTGGTGTGG-Biotin-3’。

进一步的，所述EPO的外显子区域的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示；所述IGF-1的外显子区域的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示；所述GH-1的外显子区域的核苷酸序列如SEQID NO.3所示。

进一步的，所述Cas12a蛋白为LbCas12a蛋白。

本发明还提供了一种用于基因兴奋剂检测的试剂盒，包括上述用于基因兴奋剂检测的CRISPR/Cas12a检测体系。

本发明还提供了一种基因兴奋剂的检测方法，采用上述的用于基因兴奋剂检测的试剂盒检测。

进一步的，所述基因兴奋剂的检测方法包括以下步骤：

步骤S1、从待测样本中提取核酸；

步骤S2、利用等温扩增引物扩增待测样品中核酸：将步骤S1获得产物，分别利用特异性引物EPO-2，GH1-1和IGF1-4，加入RPA扩增试剂，在37～42℃反应10～30min扩增获得特异性产物；

步骤S3、将步骤S2中产物加入到所述试剂盒的CRISPR/Cas12a检测体系中，于37～42℃反应10～30min；

步骤S4、利用荧光检测法或侧向流动试纸条检测样品中基因兴奋剂核酸。

在使用酶标仪荧光检测时，当CRISPR/Cas12a检测体系中存在基因兴奋剂基因时，在特异性crRNA介导下激活CRISPR/Cas12a的核酸内切酶活性。激活后的CRISPR/Cas12a会切割由荧光基团和淬灭基团标记的TBA11报告分子或ssDNA报告分子，从而使荧光基团释放出荧光，酶标仪可以检测到较强的荧光值。相对应的，待检测样品中不存在基因兴奋剂基因序列时，荧光读数显示为基底值。

在使用侧向流动试纸条检测时，试纸条上的质控线和检测线分别有链霉亲和素和抗兔源抗体的二抗，紧邻加样区的胶体金结合垫上有胶体金标记的抗FAM的兔源抗体；由于TBA11或ssDNA报告分子修饰有生物素与FAM基团，将CRISPR/Cas12a切割后的待检测样品加入到侧向流动试纸条后，报告分子会和金标抗体结合，复合物随液流方向从质控线走向检测线；当样品中不存在待测靶标时，质控线处的链霉亲和素饱和抓获标记有生物素标记的TBA11或ssDNA报告分子并显示质控线条带；当样品中存在待测基因兴奋剂的基因时，会将标记有FAM和生物素的TBA11或ssDNA报告分子切割断开，从而FAM标记的TBA11或ssDNA段(已和FAM抗体结合)会被检测线的二抗捕获而显色。靠近样品涂布垫的单个条带表示阴性结果，而靠近试纸条顶部的单个条带或两个条带表示阳性结果。

本发明提供的技术方案带来的有益效果是：

(1)本发明提供的一种基因兴奋剂的CRISPR/Cas12a检测体系，是通过研究筛选出能特异性反映待测基因兴奋剂靶标的外显子区域，针对该区域设计RPA引物并对目标区域进行等温扩增，然后再针对扩增子的特定区域设计CRISPR-Cas12a的crRNA序列，通过crRNA特异性识别基因兴奋剂靶标并激活Cas12a的反式剪切能力对所加入的报告基团进行剪切，其中crRNA1、crRNA2、crRNA3和crRNA4对于基因兴奋剂靶标的检出有更高的灵敏度，进一步构建CRISPR/Cas12a快速检测基因兴奋剂核酸系统，同时公开了一系列用于基因兴奋剂核酸检测的CRISPR/Cas12a反应体系和crRNA以及RPA扩增引物，其序列依次如SEQ ID NO.4至NO.13所示。上述CRISPR/Cas12a，crRNA和RPA扩增引物组合可用于基因兴奋剂核酸检测。

(2)本发明系首次采用CRISPR/Cas12a检测基因兴奋剂，具有灵敏度高、特异性强、耗时短、高通量、不依赖大型实验设备等优势。

(3)本发明开发的基于CRISPR/Cas12a侧向流动试纸检测方法可实现基因兴奋剂的可视化检测，为以后赛事现场和实验室相关研究提供了一个准确、快速、简便的检测方法。

附图说明

图1为RPA引物筛选的凝胶电泳对比图；

图2CRISPR-Cas12a体系检测基因兴奋剂荧光测试结果图；

图3a为靶标EPO在非扩增条件下利用CRISPR-Cas12a体系检测的灵敏度测试的荧光光谱图；

图3b为靶标IGF1在非扩增条件下利用CRISPR-Cas12a体系中检测的灵敏度测试的荧光光谱图；

图3c为靶标GH1在非扩增条件下利用CRISPR-Cas12a体系中检测的灵敏度测试的荧光光谱图；

图3d为EPO、IGF1和GH1三个靶标DNA在518nm下剂量-反应曲线图；

图4a为靶标EPO经RPA扩增后基于荧光检测表征灵敏度的荧光光谱图；

图4b为靶标GH1经RPA扩增后基于荧光检测表征灵敏度的荧光光谱图；

图5a为靶标EPO经RPA扩增后灵敏度测试图(侧向流动试纸条)；

图5b为靶标GH1经RPA扩增后灵敏度测试图(侧向流动试纸条)；

图6a-6c为CRISPR-Cas12a体系剪切的特异性测试图(荧光光谱图)；

图7为CRISPR-Cas12a体系剪切的特异性测试图(凝胶电泳图)；

图8为CRISPR-Cas12a体系剪切的特异性测试图(侧向流动试纸条)；

图9为293T细胞hEPO基因兴奋剂模型；

图10为双抗体夹心ELISA原理图；

图11为Human EPO ELISA试剂盒标准曲线图；

图12为经hEPO转染的293T细胞使用试剂盒进行检测的结果图(荧光光谱图)；

图13为经hEPO转染的293T细胞使用试剂盒进行检测的结果图(试纸条)；

图14为以人血清为基质，对hEPO进行扩增并检测的结果图(荧光光谱图)；

图15为以人血清为基质，对hEPO进行扩增并使用荧光光谱仪检测，518nm下剂量-反应柱状图；

图16为以人血清为基质，对hEPO进行扩增并检测的结果图(试纸条)；

图17为以人血清为基质，对hEPO进行扩增并使用试纸条检测，试纸条读取TestLine的灰度值图。

具体实施方式

为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚，下面结合具体实施例和附图，对本发明的具体实施方式作进一步详细描述。

本发明构建的基因兴奋剂的CRISPR-Cas12a检测体系技术原理为：天然的基因组DNA(genomic DNA，gDNA)含有外显子和内含子，经过RNA剪接后，外显子区域的序列被保留下来并被表达为蛋白质。出于基因载体系统的安全性考虑以及载体容量的限制，外源导入的转基因(transgenic DNA，tDNA)往往只含有外显子，而没有内含子区域。因此，检测到不含内含子序列的基因常作为外源基因或使用基因兴奋剂的证据。本研究通过数据库比对分析构建出了多个基因外显子区域，据此设计了一系列与外显子-外显子连接处特异性结合的CRISPR-Cas12a crRNA，当crRNA和Cas12a结合形成核糖核蛋白(ribonucleoprotein，RNP)时，对靶标以及报告基团进行剪切，通过报告基团产生的信号变化可以判断是否有外源基因导入。这一方法可准确、特异、灵敏的快速检测基因兴奋剂，并具有所需设备轻巧便携、使用方便等特点，有望广泛用于反基因兴奋剂的快速检测。

构建基因兴奋剂的CRISPR-Cas12a检测体系具体包括如下步骤：

步骤S1，选取基因兴奋剂候选基因并找出外显子区域

本发明选择了三种潜在的基因兴奋剂靶标：EPO，IGF-1以及GH-1。EPO由人体肾脏细胞合成，用来增强耐力，它的机制是促进红细胞的产生并加强氧气运输。选择它的主要原因是它具有代表性，在过去五年，世界反兴奋剂组织报告EPO阳性案例不断增加，占肽类激素的大部分，每年检测约100例。IGF-1主要表达于肝脏和骨骼肌中，促进肌肉生长，增强肌肉对葡萄糖和氨基酸的摄取，提高脂肪代谢速率，促进蛋白质的合成，可以增强力量提高爆发力，选择它的主要原因是IGF-1主要在骨骼肌中表达，传统的兴奋剂检测方法，包括血检和尿检，不适合IGF-1的检测。GH-1能促进骨骼、内脏和全身生长，促进蛋白质合成，增加肌肉的体积和大小，有很多证据表明它也是一种运动员常用的兴奋剂。虽然本方案选择了这三个基因作为靶标，但并不局限于这些基因，对于其他潜在的候选基因也可通过该方法进行检测。挑选好待测基因后，将它们的外显子区域找出，并设计、合成相应出序列以用于后续实验。

步骤S2，设计RPA引物

针对三个靶基因(EPO，IGF-1以及GH-1)的特定外显子区域，其核苷酸序列如SEQID NO.1至NO.3所示，设计RPA引物对靶标进行扩增。RPA引物设计应遵循一定原则以尽量提高扩增的成功率。引物长度一般为30-35nt；5’端的3-5个核苷酸应当避免聚鸟嘌呤，3’末端的3个核苷酸如果为鸟嘌呤和胞嘧啶有助于聚合酶的稳定结合，可以提升引物的扩增性能；引物中最好不要出现长串的聚嘌呤或聚嘧啶，GC含量过高(>70％)或过低(<30％)都不利于RPA扩增；此外，引物设计时应当尽量避免二级结构的形成、发夹结构的序列等。由于RPA引物设计较复杂，为防止部分引物无法扩增出目标序列，针对每个靶标设计了多对引物，在RPA扩增后采用凝胶电泳筛选合适的引物。

步骤S3，设计crRNA

针对待测基因外显子特定区域的序列或其扩增产物，设计了一系列与之特异性结合的crRNA(为防止个别crRNA不工作或效率低)，并兼顾了CRISPR-Cas12a体系中crRNA的设计原则(目标区域上游需要TTTN的PAM区)。crRNA识别靶标基因特定的外显子连接区域后可以激活Cas12a的正切和反切能力。

步骤S4，设计报告基团

根据检测方式选取不通基团修饰的报告分子，报告分子可以为单链ssDNA、可形成发夹结构的DNA、DNA G-三链体和DNA G-四链体中的任意一种。标记在报告分子上的基团可以为能发生荧光共振能量转移的一对荧光基团、一个荧光基团和一个淬灭基团、一对基于试纸条方式检测的基团、可发生电化学反应的基团和可发生等离子体共振的基团中的任意一种。基团可以是官能团、分子、微纳米粒子中的任一种。

本发明设计的报告分子为短的单链DNA(ssDNA)或能形成G-三链体(G3)的TBA11序列(GGTTGGTGTGG)。为进行荧光检测，可将报告分子的两端分别标记FRET探针(5'-FAM和3'-TAMRA)或FQ探针(5'-FAM和3'-BHQ1)。为进行试纸条(LFD)检测，可根据试纸条上修饰的基团设计与之对应的基团进行检测，如将报告分子修饰生物素与FAM基团，与试纸条上的链霉亲和素和FAM的抗体分别结合等。

步骤S5，信号检测

基于CRISPR-Cas12a的crRNA对靶标进行识别后激活Cas12a并剪切报告分子，然后利用荧光检测设备或试纸条进行读数，实时检测结果。

下面结合具体实施例对本发明做进一步详细说明。

本发明中：RPA扩增试剂盒Basic kit购自TwistAmp公司；表达EPO、IGF-1、GH1蛋白的基因质粒、引物、crRNA、TBA11-FQ和TBA11-FRET由北京擎科新业生物技术有限公司提供；常规试剂如Tris-Base，KCl，Tris-HCl，MgCl₂，BSA和甘油等购自ThermoFisher。

本发明的总体技术包括以下4大部分：待检测核酸样品制备、靶基因预扩增，CRISPR/Cas12a检测成分设计制备和体系构建、荧光及侧向流动试纸条设计和结果解读。

实施例1：构建用于基因兴奋剂核酸检测的CRISPR/Cas12a检测体系

1、RPA引物设计

根据RPA引物设计原则，为EPO，IGF1，GH1三个靶标设计了一系列引物，设计引物序列如表1所示。为了验证并选择出最适合的引物序列，使用RPA试剂盒(TwsitAmp BasicKit)对三种靶标进行扩增，对扩增产物进行凝胶电泳分析。

表1针对EPO,GH1,IGF1三靶标设计引物序列

凝胶电泳结果如图1所示，最左列为marker条带，其余10条带分别为以为EPO-1，EPO-2，EPO-3，EPO-4；GH1-1，GH1-2；IGF1-1，IGF1-1，IGF1-2，IGF1-3，IGF1-4引物所扩增的结果。其中EPO-2，GH1-1，IGF1-4显示出较好的扩增效果，最终选择上述三对引物对靶标序列进行扩增。

2、特异性crRNA设计与制备

将靶标核酸进行RPA扩增后，我们采取CRISPR技术对靶标进行检测。具体来说，利用CRISPR-Cas12a系统在crRNA与靶标配对后可以激活其反式剪切的活性，将荧光和淬灭基团双标记的报告分子进行剪切，从而释放出强荧光实现检测。

本发明对三种基因兴奋剂靶标序列的外显子连接部分设计了一系列crRNA。设计基本原则为：含有PAM序列TTTN；PAM序列后的20个核苷酸不含有AAA；综合考虑RPA引物的位置与crRNA所在的区域，确保扩增的产物中有crRNA对应识别的序列。根据以上原则，我们针对EPO，IGF1，GH1基因兴奋剂设计了以下crRNA序列，如表2所示。由于EPO基因兴奋剂在外显子连接处不含有TTT的PAM区域，因此设计了含TT的crRNA两条。通过实验验证所设计的crRNA是否可以与Cas12a结合形成复合物，之后剪切靶标及报告分子。

表2针对EPO,GH1,IGF1三靶标外显子连接设计crRNA

SEQ ID NO.4	CrRNA for EPO-1:	UAAUUUCUACUAAGUGUAGAU AGCACAGCCCGUCGUGAUAU
			SEQ ID NO.5	CrRNA for EPO-2:	UAAUUUCUACUAAGUGUAGAU CUUCUGGGCUCCCAGAGCCC
SEQ ID NO.6	CrRNA for GH1:	UAAUUUCUACUAAGUGUAGAU ACACCUACCAGGAGUUUGAA
			SEQ ID NO.7	CrRNA for IGF1:	UAAUUUCUACUAAGUGUAGAU UUUCAACAAGCCCACAGGGU

将1μL Cas12a(2μM)与32μL缓冲液(10mM Tris,pH 7.9,70mM KCl,10mM MgCl₂)分别与2μL EPO，IGF1，GH1的crRNA(10μM)混合，于37℃下孵育10min；然后在体系中对应加入5μL EPO，IGF1，GH1基因兴奋剂或缓冲液(合成质粒，40ng/μL)和10μL TBA11-FQ(100μM)，在37℃孵育15分钟；其后于65℃下加热10分钟使Cas12a失活；最后用荧光光谱仪测得荧光值(488nm激发，500-750nm收集)。

结果如图2所示，证明设计的crRNA可以与Cas12a结合形成复合物。

3、CRISPR-Cas12a检测体系的灵敏度测试

为了测试检测体系对于没有预扩增的质粒的灵敏度，靶标DNA(EPO/IGF1/GH1，100nM)被稀释到2nM、1nM、0.5nM、0.1nM和0.01nM并进行测试。将Cas12a(1μL，2μM)，crRNA(2μL，1μM)和缓冲液(27μL)混合并在37℃下预孵育10分钟。Cas12a/crRNA复合物形成后，将靶标DNA(10μL)或缓冲液(10μL)和FAM-TBA11-BHQ1(10μL，1μM)加入体系中形成50μL反应溶液，在37℃下孵育15分钟；其后于65℃下加热10分钟使Cas12a失活；最后用荧光光谱仪测得荧光值。

结果如图3a、3b、3c所示，分别为EPO，IGF1，GH1三个靶标不同浓度的荧光值，可见518nm处的荧光值随着浓度的增加而增强。如图3d所示，为三个靶标DNA在518nm下剂量-反应曲线。由此可证实本发明的CRISPR-Cas12a体系可以在待测基因兴奋剂核酸未扩增的情况下灵敏度达到100pM。

4、RPA-LFD快速高灵敏检测基因兴奋剂

根据RPA试剂盒(TwsitAmp Basic Kit)的说明对EPO，GH1靶标序列进行扩增。将靶标DNA(EPO/GH1，100nM)稀释到10^-14M，10^-15M,10^-16M，10^-17M以及10^-18M，并进行测试。RPA扩增反应液由引物(2×2.4μL，10μM)、Primer Free Rehydration buffer(29.5μL)模板DNA(5μL)和ddH₂O(8.2μL)组成，将上述反应液加入到TwistAmp固体试剂盒中，在盖上加MgOAc(2.5μL，280mM)，离心后在39℃下孵育20分钟。将靶标DNA进行RPA扩增后，用CRISPR-Cas12a体系进行剪切实验，采用荧光光谱仪测定荧光强度。除此之外，还采用侧向流动试纸条(LFD)测定，以FAM-TBA11-biotin作为报告基团。

结果如图4a和4b所示，分别为EPO，GH1两个靶标不同浓度的荧光值，可见518nm处的荧光值随着浓度的增加而增强。如图5a和5b所示，分别为EPO，GH1两个靶标在RPA扩增后试纸条测试结果。两者均证实本发明在RPA扩增的情况下灵敏度可以达到10^-18M。

5、CRISPR-Cas12a检测体系的特异性测试

利用CRISPR-Cas12a系统在crRNA与靶标配对后可以激活其反式剪切的活性，而若靶标与crRNA不能匹配则没有剪切活性，reporter选择TBA11序列并用FAM和TAMRA标记。Cas12a剪切反应所用缓冲液的组成为：10mM Tris、70mM KCl、10mM MgCl₂、pH 7.9。实验前，TBA11寡核苷酸先在95℃下加热10分钟，冷却至室温后使用。首先，LbCas12a(1μL，2μM)，crRNA(2μL，1μM)和缓冲液(17μL)混合并在37℃下预孵育10分钟；待LbCas12a/crRNA复合物形成后，将靶标DNA(5μL，100nM)或非靶标DNA(5μL，100nM)或缓冲液(5μL)和TBA11寡核苷酸(25μL，500nM)加入体系中形成50μL反应溶液，在37℃下孵育15分钟。最后于65℃下加热10分钟使Cas12a失活。

荧光共振能量转移(FRET)的光谱图可以揭示标记在寡核苷酸两端的两个荧光基团的距离，可以用于评估Cas12a的剪切活性。为进行荧光检测，FRET(5'-FAM和3'-TAMRA)或FQ(5'-FAM和3'-BHQ1)标记的TBA11序列被稀释到最终浓度为25nM。荧光测量在FluoroMax-4分光光度计(Horiba，日本)上进行(～25℃)。激发和发射狭缝均为5nm。激发光设置为488nm，从500到750nm收集。

本发明还采用了变性聚丙烯酰胺凝胶电泳(Denaturing PAGE)解析剪切后的产物。将反应溶液在含8M尿素的20％Denaturing PAGE中进性电泳(1×TBE缓冲液，120V，约40V/cm，90min，Mini-PROTEAN Tetra Cell system，Bio-Rad)。成像在Bio-rad ChemiDocMP(170–8280)(BioRad公司，中国上海)仪器上进行。

除此之外，还采用侧向流动试纸条测定，以FAM-TBA11-biotin作为报告基团。切割实验结束后，将20μl反应液和80μl Buffer(Milenia杂交检测1，TwistDx)混合在1.5mL试管中。然后将试纸条插入试管，90s后进行读数。靠近样品涂布垫的单个条带表示阴性结果，而靠近试纸条顶部的单个条带或两个条带表示阳性结果。

荧光光谱采集结果如图6a-6c所示，凝胶电泳结果如图7，侧向流试纸条结果如图8所示。当其在样品条件下(含有与crRNA互补的基因兴奋剂)，FRET效率显著降低，表明由于剪切导致两个荧光基团的分离；然而对照条件(包含基因兴奋剂，但与crRNA不匹配)，它们的FRET信号强度未发生明显改变，表明没有发生剪切。由此可见，基于CRISPR-Cas12a体系的基因兴奋剂检测具有良好的特异性。

实施例2：采用实施例1构建的CRISPR-Cas12a检测体系进行293T细胞模型中的基因兴奋剂检测

1、构建293T细胞基因兴奋剂模型

为表征人体注射基因兴奋剂后，使用本申请的技术方案是否可以准确检测，构建了表达hEPO蛋白的质粒转染293T细胞。293T细胞是由293细胞通过基因技术派生出的细胞系，是经过腺病毒E1A基因的转染，能表达SV40大T抗原，含有SV40复制起始点与启动子区。许多真核表达载体如pcDNA3.1中含有SV40病毒的复制起始位点，可以在表达SV40病毒T抗原的细胞系中复制，从而提高外源基因的表达水平。因此293T细胞广泛应用于病毒包装。表达hEPO蛋白的质粒由北京擎科公司提供，其载体为pcDNA3.1，使用Promega公司的转染试剂盒进行转染。设置两个转染梯度及两组对照组如表3所示，转染后24h后，检查细胞状态并收集细胞。

结果如图9所示，使用RIPA提取剂提取293T细胞中的蛋白及核酸。

表3 293T细胞转染条件设置

	样本1	样本2	样本3	样本4
					质粒290ng/μl	6μg(20.7μl)	0.6μg(2.1μl)	0	0
转染试剂/μl	18	18	18	0
					无血清DMEM/μl	261.3	279.9	282	300

2、ELISA检测293T基因兴奋剂细胞模型中EPO浓度

为检测转染是否成功，使用Human EPO ELISA试剂盒(碧云天)，对所提取的上清液中蛋白浓度进行检测。检测原理如图10所示，根据试剂盒说明进行标准曲线绘制(如图11所示)，并检测表1中四种转染方式下293T细胞中EPO蛋白浓度，以判断转染是否成功。通过酶标仪检测450nm处的吸光度值就能实现定量检测。人EPO浓度与A450值呈正比，通过绘制标准曲线，对照样品吸光度值，即可计算出样品中人EPO浓度，结果如表4所示。

表4使用ELISA试剂盒检测样本中hEPO蛋白浓度

	样品1	样品2	样品3	样品4
					HEPO浓度/(ng/μl)	26.41	9.59	0.30	0.07

3、检测293T细胞模型中的基因兴奋剂

检测具体方法同实施例1中一致，将样本1，2稀释至10、100、1000倍以及质粒浓度梯度为0，10，10^-10，5×10^-10，10^-9，5×10^-9，10^-8M的标准样品进行检测，用荧光光谱仪收集数据(gap值设为3)，实验结果如图12所示；使用试纸条检测结果如图13所示，二者均可检测出样本中含有外源导入的基因兴奋剂。这一基因序列结果与上述EOP蛋白检测结果也相互吻合。

由实施例2可以看出，外源EPO基因导入细胞后，一方面会表达出EPO蛋白，另一方面还可以检测到明显的EPO基因序列，证明通过本申请的方法可以实现基因兴奋剂的检测。不过，可能由于在293T细胞模型中进行基因兴奋剂的转染效率很高，虽然使用剂量时参考了试剂盒的说明和文献中所推荐的剂量，但从细胞内提出的EPO基因序列浓度仍然相对较高，无需做扩增即可利用本申请的方法实现其检测。

实施例3：采用实施例1构建的CRISPR-Cas12a体系检测血清中低含量的基因兴奋剂(模拟实际情况下运动员血清中基因兴奋剂的检测)

以人血清为基质，将质粒梯度稀释至0，10^-10，10^-13，10^-16M，进行RPA扩增，并按照实施例1中的方法进行检测，用荧光光谱仪收集500-700nm的数据，结果如图14所示；如图15所示为其在518nm处剂量-反应柱状图。如图16所示为试纸条检测结果，如图17所示为试纸条读取Test Line的灰度值图。

终上所述，CRISPR/Cas12a荧光法和侧向流试纸条均能够实现对样本中基因兴奋剂核酸的灵敏、快速、准确检测。

在不冲突的情况下，本文中上述实施例及实施例中的特征可以相互结合。

以上所述仅为本发明的较佳实施例，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

序列表

<110> 中国科学院精密测量科学与技术创新研究院

<120> 一种基因兴奋剂的CRISPR/Cas12a检测体系及其应用

<141> 2021-11-29

<160> 13

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 579

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 1

atgggggtgc acgaatgtcc tgcctggctg tggcttctcc tgtccctgct gtcgctccct 60

ctgggcctcc cagtcctggg cgccccacca cgcctcatct gtgacagccg agtcctggag 120

aggtacctct tggaggccaa ggaggccgag aatatcacga cgggctgtgc tgaacactgc 180

agcttgaatg agaatatcac tgtcccagac accaaagtta atttctatgc ctggaagagg 240

atggaggtcg ggcagcaggc cgtagaagtc tggcagggcc tggccctgct gtcggaagct 300

gtcctgcggg gccaggccct gttggtcaac tcttcccagc cgtgggagcc cctgcagctg 360

catgtggata aagccgtcag tggccttcgc agcctcacca ctctgcttcg ggctctggga 420

gcccagaagg aagccatctc ccctccagat gcggcctcag ctgctccact ccgaacaatc 480

actgctgaca ctttccgcaa actcttccga gtctactcca atttcctccg gggaaagctg 540

aagctgtaca caggggaggc ctgcaggaca ggggacaga 579

<210> 2

<211> 654

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 2

atggctacag gctcccggac gtccctgctc ctggcttttg gcctgctctg cctgccctgg 60

cttcaagagg gcagtgcctt cccaaccatt cccttatcca ggctttttga caacgctatg 120

ctccgcgccc atcgtctgca ccagctggcc tttgacacct accaggagtt tgaagaagcc 180

tatatcccaa aggaacagaa gtattcattc ctgcagaacc cccagacctc cctctgtttc 240

tcagagtcta ttccgacacc ctccaacagg gaggaaacac aacagaaatc caacctagag 300

ctgctccgca tctccctgct gctcatccag tcgtggctgg agcccgtgca gttcctcagg 360

agtgtcttcg ccaacagcct ggtgtacggc gcctctgaca gcaacgtcta tgacctccta 420

aaggacctag aggaaggcat ccaaacgctg atggggaggc tggaagatgg cagcccccgg 480

actgggcaga tcttcaagca gacctacagc aagttcgaca caaactcaca caacgatgac 540

gcactactca agaactacgg gctgctctac tgcttcagga aggacatgga caaggtcgag 600

acattcctgc gcatcgtgca gtgccgctct gtggagggca gctgtggctt ctag 654

<210> 3

<211> 477

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 3

atgggaaaaa tcagcagtct tccaacccaa ttatttaagt gctgcttttg tgatttcttg 60

aaggtgaaga tgcacaccat gtcctcctcg catctcttct acctggcgct gtgcctgctc 120

accttcacca gctctgccac ggctggaccg gagacgctct gcggggctga gctggtggat 180

gctcttcagt tcgtgtgtgg agacaggggc ttttatttca acaagcccac agggtatggc 240

tccagcagtc ggagggcgcc tcagacaggc atcgtggatg agtgctgctt ccggagctgt 300

gatctaagga ggctggagat gtattgcgca cccctcaagc ctgccaagtc agctcgctct 360

gtccgtgccc agcgccacac cgacatgccc aagacccaga agtatcagcc cccatctacc 420

aacaagaaca cgaagtctca gagaaggaaa ggaagtacat ttgaagaacg caagtag 477

<210> 4

<211> 41

<212> RNA

<213> Artificial Sequence

<400> 4

uaauuucuac uaaguguaga uagcacagcc cgucgugaua u 41

<210> 5

<211> 41

<212> RNA

<213> Artificial Sequence

<400> 5

uaauuucuac uaaguguaga ucuucugggc ucccagagcc c 41

<210> 6

<211> 41

<212> RNA

<213> Artificial Sequence

<400> 6

uaauuucuac uaaguguaga uacaccuacc aggaguuuga a 41

<210> 7

<211> 41

<212> RNA

<213> Artificial Sequence

<400> 7

uaauuucuac uaaguguaga uuuucaacaa gcccacaggg u 41

<210> 8

<211> 30

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 8

cctgcctggc tgtggcttct cctgtccctg 30

<210> 9

<211> 30

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 9

gcctgctgcc cgacctccat cctcttccag 30

<210> 10

<211> 30

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 10

agtgccttcc caaccattcc cttatccagg 30

<210> 11

<211> 30

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 11

ccacgactgg atgagcagca gggagatgcg 30

<210> 12

<211> 30

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 12

tggtggatgc tcttcagttc gtgtgtggag 30

<210> 13

<211> 30

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 13

ctgagacttc gtgttcttgt tggtagatgg 30

Claims (10)

1.一种基因兴奋剂的CRISPR/Cas12a检测体系，其特征在于：所述CRISPR/Cas12a检测体系包括：针对基因兴奋剂靶标的特异性crRNA、CRISPR/Cas12a蛋白和报告分子；

其中，所述特异性crRNA的由如下方法制备：筛选能特异性反映基因兴奋剂靶标的多个外显子区域；对外显子连接区域设计RPA扩增引物并对基因兴奋剂靶标进行扩增，得到扩增产物；在扩增产物区域内，根据CRISPR-Cas12a体系中crRNA的设计原则，设计出能够特异性识别基因兴奋剂靶标的crRNA，然后合成crRNA；

所述报告分子包括单链ssDNA、可形成发夹结构的DNA、DNA G-三链体和DNA G-四链体中的任意一种；标记在所述报告分子上的基团包括能发生荧光共振能量转移的一对荧光基团、一个荧光基团和一个淬灭基团、一对基于试纸条方式检测的基团、可发生电化学反应的基团和可发生等离子体共振的基团中的任意一种。

2.如权利要求1所述的一种基因兴奋剂的CRISPR/Cas12a检测体系，其特征在于：所述基因兴奋剂靶标包括EPO，IGF-1和GH-1中的任意一种。

3.如权利要求2所述的一种基因兴奋剂的CRISPR/Cas12a检测体系，其特征在于：所述特异性crRNA包括crRNA1、crRNA2、crRNA3和crRNA4中的任意一种，所述crRNA1的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示，所述crRNA2的核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示；所述crRNA3的核苷酸序列如SEQ ID NO.6所示；所述crRNA4的核苷酸序列如SEQ ID NO.7所示。

4.如权利要求2所述的一种基因兴奋剂的CRISPR/Cas12a检测体系，其特征在于：所述RPA扩增引物包括EPO-2，GH1-1和IGF1-4中任意一种，所述EPO-2引物对核苷酸序列如SEQID NO.8-NO.9所示，所述GH1-1引物对核苷酸序列如SEQ ID NO.10-NO.11所示，所述IGF1-4引物对核苷酸序列如SEQ ID NO.12-NO.13所示。

5.如权利要求2所述的一种基因兴奋剂的CRISPR/Cas12a检测体系，其特征在于：所述报告分子为TBA11-FRET、TBA11-FQ和Lateral flow TBA11中的任意一种，标记产物分别为5’-FAM-GGTTGGTGTGG-TAMRA-3’，5’-FAM-GGTTGGTGTGG-BHQ1-3’和5’-FAM-GGTTGGTGTGG-Biotin-3’。

6.如权利要求2所述的一种基因兴奋剂的CRISPR/Cas12a检测体系，其特征在于：所述EPO的外显子区域的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示；所述IGF-1的外显子区域的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示；所述GH-1的外显子区域的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示。

7.如权利要求2所述的一种基因兴奋剂的CRISPR/Cas12a检测体系，其特征在于：所述Cas12a为LbCas12a蛋白。

8.一种用于基因兴奋剂检测的试剂盒，其特征在于：包括如权利要求1-7任一项所述的基因兴奋剂的CRISPR/Cas12a检测体系。

9.一种基因兴奋剂的检测方法，其特征在于：采用如权利要求8所述的用于基因兴奋剂检测的试剂盒。

10.如权利要求9所述的一种基因兴奋剂的检测方法，其特征在于，所述基因兴奋剂检测方法包括以下步骤：

S1、从待测样本中提取核酸；

S2、利用等温扩增引物扩增待测样品中核酸：将步骤S1获得产物，分别利用EPO-2，GH1-1和IGF1-4的特异性引物，加入RPA等温扩增试剂，在37～42℃反应10～30min扩增获得特异性产物；

S3、将步骤S2中产物加入到所述试剂盒的CRISPR/Cas12a检测体系中，于37～42℃反应10～30min；

S4、利用荧光检测法或侧向流动试纸条检测样品中基因兴奋剂核酸。

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