CN115998341B - 一种非疾病治疗和诊断的hpv快速检测系统 - Google Patents

Abstract

本发明涉及HPV采样和检测技术领域，具体公开了一种用于月经血样本采集的便携装置及HPV快速检测系统。便携装置包括使用聚酯纤维网吸水棉作为便携装置的主体部分和背面的粘连胶布，粘连胶布的表面覆盖有PU膜胶布，PU膜胶布的表面贴有防粘连覆盖膜。本发明的便携装置是一种完全非侵入式的取样方式，只需要在月经第2～3天，在卫生巾适合区域贴上MiniPad，即可获得HPV筛查样本。本发明的HPV快速检测系统具有即时检测、准确、高灵敏度等优点，检测过程中基于CRISPR‑Cas12a进行基因编辑，不仅可以特异性识别切割靶标核酸链，而且可以无差别切割邻近靶标的ssDNA，实现HPV即时筛查。

Description

一种非疾病治疗和诊断的HPV快速检测系统

技术领域

本发明涉及HPV采样和检测技术领域，尤其是涉及一种用于月经血样本采集的便携装置及HPV快速检测系统。

背景技术

宫颈癌是最常见的妇科恶性肿瘤之一。近年来，我国加强了宫颈癌的防治工作，推进实施三级预防策略：疫苗接种-宫颈癌筛查-宫颈癌治疗。由于宫颈的生理解剖位置较深，病人往往不能通过自我检查发现，致使许多宫颈癌病人早中期不易察觉，耽误了疾病的治疗，因此实施有效的宫颈癌筛查项目是宫颈癌防控中的重要一环。

传统的宫颈癌筛查取样技术包括细胞学检测取样方法、形态学观察取样、HPV-DNA检测取样，其中，细胞学检测取样方法包括巴氏涂片法、醋酸染色肉眼观察(VIA)和薄层液基细胞学检查(TCT)，其中，巴氏涂片法：用小刮板从子宫颈部取少量的脱落细胞，涂在玻璃片上，经过染色处理后，在显微镜下观察是否有异常。在传统的巴氏涂片法中，巴氏染色可发现由HPV感染导致的特征性“挖空细胞”，通过简单的宫颈涂片，医生可以侦测到子宫颈细胞微小的极早期变化，其优点包括：诊断特异性高，便宜，便于普查。醋酸染色肉眼观察(VIA)：醋酸溶液染色后肉眼观察(VIA)和细胞学筛查一样，都是基于对细胞形态学的主观诊断，比较依赖医师的专业水平。薄层液基细胞学检查(TCT)：液基细胞学是针对传统巴氏涂片缺点改进后的检查方法，用于宫颈癌筛查，其基本原理是采集宫颈的脱落细胞进行检查。与传统的巴氏涂片检查相比，液基细胞学在技术上有了很大的改进，更加方便和准确。此方法是将宫颈管及宫颈表层细胞刷取至液基细胞保存液中，通过形态学观察而做出诊断，是筛查早期宫颈癌的重要方法。形态学观察取样包括宫颈碘试验、阴道镜检查，宫颈碘试验：将碘溶液涂在宫颈和阴道壁上，观察其着色情况。正常宫颈和阴道鳞状上皮可被碘液染为棕色，即为阴性；而瘢痕、囊肿、宫颈糜烂、异常鳞状上皮区(包括不典型增生、原位癌及浸润癌)不会被染色，即为阳性。这种取样检测试验对癌无特异性，但是碘试验用于检测CIN主要是识别宫颈病变的危险区，以便确定活检取材部位，提高诊断率。阴道镜检查：阴道镜可以将宫颈阴道部放大至10～40倍，从而能够观察到肉眼无法看到的子宫颈表面微小病变；可发现宫颈部与癌相关的异型血管、异型上皮以及早期的癌变，以便准确选择用来做活体组织检查的部位，可以用于宫颈癌前病变及宫颈癌的早期诊断和治疗，也可用于治疗过程中定期观察，了解治疗效果，并评估预后。但是阴道镜不能直接确诊是否患有癌症，但可通过病理活检协助诊断。

但是，目前的宫颈癌筛查取样技术存在耗时性、有创性和安全性欠缺等短板。虽然宫颈癌筛查技术已成熟，然而，很多女性在医院进行HPV筛查的体验感较差，主要在于取样过程以及样本检测过程两个方面。首先整个检查的过程比较耗费时间，例如阴道镜检查不仅是观察宫颈，像阴道穹窿，各个阴道壁，外阴等都要仔细检查，因此医生需要将所有区域都要暴露充分才能发现那些容易漏诊的病灶。在医取样本过程中，某些敏感性患者容易存在不适感，有时甚至无法配合医生的要求，这势必会影响检查的进程。对于细胞液基检查的取样到制片过程，都需要专业的医生和检测人员进行结果的判断，若进行HPV DNA的检测，则需要等待更长的时间。巴氏涂片取样需要受检妇女充分暴露宫颈，医护人员用无菌棉球轻拭宫颈表面过多的分泌物及血迹，使用消毒灭菌的一次性刮板在宫颈外口与颈管交界处轻轻刮转一周，将刮取物均匀涂在载玻片上，立即固定于95％的乙醇内，然后再进行巴氏法染色、检查。HPV检测医用取样与液基细胞学类似，用宫颈刷插入宫颈口1.0～1.5cm，至最外侧刷毛接触到宫颈外口，朝同一方向旋转5周，然后将宫颈刷插入样本保存管，折断留存于保存管中封盖。这些取样的过程对于不同受检妇女的有创性程度不同，某些受检妇女因其子宫颈口较小，使宫颈取样难度增加。子宫颈口较小，取样刷深入宫颈口较困难，取材的到细胞数较少，取样不足，容易引起假阴性结果。而对于某些剖宫产女性而言，其宫颈上移，致使暴露困难，取样也同样受到限制，且取样的有创性对于受检人员身心存在一定的影响，也是影响宫颈癌筛查普及率的一大原因。目前市面上的许多自取样本试剂盒由取样器和保存液构成，取样前受检人员需要仔细阅读取样操作指引，阴道自取样工具使用者必须要具备一定的文化教育水平，能够阅读理解取样指示图谱或步骤。不按照取样流程随意操作或错误操作不仅无法取得满意样本，还会带来一些医疗风险，轻者或可能穿破阴道黏膜导致出血引起心理压力，重者可能感染(中毒)性休克。此外，还需考虑到一些肥胖的妇女、解剖学异常的妇女和阴道萎缩的中老年妇女，并不能适用任意自取样工具，需根据情况个体化选择和研发新的采集工具，具有一定的局限性。

HPV(人乳头瘤状病毒)检测和宫颈液基薄层细胞学检查(TCT)是目前较为常见的筛查方法。然而传统细胞学检查对实验室及病理医生水平要求高，准确性受人为因素影响大，结果可重复性欠佳。随着检测技术的进步，高危型HPV检测(以下简称“HPV检测”)以其高敏感性等优势在宫颈癌筛查中发挥着日益重要的作用，越来越多的研究结果证实了HPV检测作为宫颈癌初筛方法的有效性，成为宫颈癌防治工作的一大突破口。目前宫颈癌HPV筛查主要依赖于DNA的下游检测技术，这些技术对实验室配置要求高，对操作人员技术和专业知识要求也较高，影响着HPV筛查的普及性及规模性发展。因此，开发出一种快速、灵敏、便捷的HPV采样技术及快速检测系统，对于宫颈癌筛查的普及、早期发现及干预具有重要意义。

发明内容

目前进行月经血的收集一般直接依赖卫生巾样本，该过程无法控制卫生巾的材质(不同品牌)，可能对后续的月经血DNA提取工作带来困难，并可能降低提取产物质量。此外，从卫生巾上直接剪取血斑进行下游实验这一过程较为繁琐并耗时长，容易引入污染。本发明的目的在于克服上述现有技术的不足之处而提供一种用于月经血样本采集的便携装置及HPV快速检测系统。本发明开发了一种用于月经血样本采集的便捷装置——MiniPad，该MiniPad改变了卫生巾上采样的传统方式，使用标准化MinPad实现在不同品牌卫生巾上实现相同采样，使得收集的月经血DNA不受到卫生巾材质的影响，同时MiniPad小巧便于剪取，为下游的月经血HPV检测提供了更好的前提基础。本发明并利用Minipad提取的DNA进行下游的HPV快速检测，准确性、可重复性高，有望成为未来普及宫颈癌筛查和即时检测的一大利器。

为实现上述目的，本发明采取的技术方案为：

第一目的，本发明提供了一种用于月经血样本采集的便携装置，包括使用聚酯纤维网吸水棉作为便携装置的主体部分和固定在所述主体部分两端的粘连胶布，所述粘连胶布的表面覆盖有PU膜胶布，所述PU膜胶布的表面贴有防粘连覆盖膜。在PU膜胶布的表面贴有防粘连覆盖膜，以保持两侧PU膜胶布不互相粘连，便于采集月经血样本的顺利进行。

HPV自取样是一种很有前景的策略，可以克服资源匮乏地区宫颈癌筛查的多重障碍，并在筛查计划完善的国家提高筛查的覆盖率。HPV自采样方法可能是提高宫颈癌筛查的可及性和采用率的重要途径，尤其是在疾病负担最重的地区，并且现在被认为是实现WHO消除宫颈癌这一目标的关键因素。

本发明对月经血-DNA采集装置进行了优化，即得到用于月经血样本采集的便携装置—MiniPad，该便携装置无需依赖特殊医疗设施、无需医务人员参与采样过程，这样把以往由医务人员承担的宫颈癌筛查任务得以分离出来，交由社区或筛查者个人完成。MiniPad自取样方式对于生活节奏快无暇顾及自身体检，以及没有时间到医院挂号排队的女性大大地节约了时间，并避免了大部分女性进行妇科检查的不适；对于经济不发达地区与医疗资源匮乏的地区的妇女也解决了筛查困难、低筛查率等问题。在这一新模式下，受检妇女只需要在月经期间，直接把MiniPad贴至卫生巾中央区域，待血液收集完毕即可撕下，保存于密封袋中，通过邮寄或者自行送样到检测机构的方式，节省了筛查的医疗成本以及其他相关费用。

其次，目前市面上很多HPV自采样装置是筛查人员把取样刷采集的脱落细胞置于细胞保存液中，通过邮寄的方式寄送到检测机构中。而细胞保存液内含有高比例甲醇或乙醇，属于易燃介质，标本外溢易造成污染，且受物流的限制不便跨区域转运，不利于在大范围人群筛查中使用，更不便用于医疗资源匮乏的偏远地区。目前以月经血作为HPV检测的样本来源，旧方法是通过收集受检人的卫生巾棉片，但卫生巾棉片面积大、潮湿不易保存，运输的过程中容易发生污染。而MiniPad是收集月经血装置的更新迭代，作为月经血DNA标本的固态载体，面积小，且容易干燥，可进行长期储存和转运。使用时，受检妇女只需要在月经第2～3天，把MiniPad贴到卫生巾中部，MiniPad由血液浸透即可提示标本收集成功及标本所在区域正确，此时受检妇女只需要把MiniPad撕下装入密封袋即可。送至检测机构后，检测人员对MiniPad的DNA进行简单的裂解和提取即可。因此，MiniPad体积小、转运方便、不易污染、简化了检测人员对样本的预处理，适用于大量自取样本的储存、运输、检测。

作为本发明所述便携装置的优选实施方式，所述粘连胶布远离主体部分的一端呈弧形；所述主体部分呈长条形状。

本发明设计上述性状的主体部分和粘连胶布，便于后续操作人员的检测，形象也更为美观。

作为本发明所述便携装置的优选实施方式，所述主体部分和粘连胶布的表面左右覆盖两张PU膜胶布，两张PU膜胶布在位于主体部分的垂直中心线呈宽度对齐，保持在同一水平线上。

作为本发明所述便携装置的优选实施方式，所述主体部分的长度为9-10cm，宽度为2-3cm。

本发明的便携装置面积小，且容易干燥，可进行长期储存和转运。

第二目的，本发明提供了上述便携装置在采集月经血样本中的应用。

目前基于月经血DNA检测HPV的样品采集一般通过受检人直接将一整片卫生巾棉片送至检测机构，而检测人员对于卫生巾棉片还需要进行十分耗时的预处理。首先检测人员需要将卫生巾棉片用消毒过的剪刀剪切成3*3cm左右的小片置于1.5mL离心管中。每换一个样品，剪刀和镊子都需要浸泡数秒后置于酒精灯处烤干，继续处理下一个样本。同时卫生巾棉片比较潮湿，血迹容易对台面造成污染，每处理一个卫生棉片都需要对台面进行一定的消毒处理，该过程耗时耗力，样本之间容易交叉污染。而MiniPad作为一个迭代的采集装置，在采集与运输的过程中，血迹容易干燥，面积小，检测人员只需要将收集到MiniPad从密封袋中取出，浸泡于细胞裂解液中即可得到样本DNA提取液，无须进行反复的消毒处理，样本之间也不容易污染。

作为本发明所述应用的优选实施方式，将便携装置中的主体部分贴在卫生巾带有月经血的一面。

作为本发明所述应用的优选实施方式，所述月经血的采集时间为月经周期的第2到3天。

第三目的，本发明提供了一种用于检测HPV的引物，所述引物包括扩增HPV DNA的特异性引物，扩增HPV DNA的特异性引物为HPV16-引物F、HPV16-引物R、HPV18-引物F和HPV18-引物R；所述HPV16-引物F的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示；所述HPV16-引物R的核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示；所述HPV18-引物F的核苷酸序列如SEQ ID NO:3所示；所述HPV18-引物R的核苷酸序列如SEQ ID NO:4所示。

HPV16-引物F：ttgttggggtaaccaactatttgttactgtt；

HPV16-引物R：cctccccatgtcgtaggtActccttaaag；

HPV18-引物F：gggtcataacaatggtgtttgctggcataatc；

HPV18-引物R：catctgcagttaaagtaatagtacacaactg。

采用上述的HPV16-引物F、HPV16-引物R、HPV18-引物F和HPV18-引物R，可以较好地特异性扩增HPV DNA，有利于HPV的快速检测。

第四目的，本发明提供了一种快速检测HPV的试剂盒，包含如上述引物。

作为本发明所述试剂盒的优选实施方式，所述试剂盒还包括LtCas12a、crRNA和两端带有荧光素和生物素标记的ssDNA；

所述crRNA包括HPV16-crRNA和HPV18-crRNA，所述HPV16-crRNA和HPV18-crRNA的序列分别如SEQ ID NO:5-6所示；

SEQ ID NO:5：

AUUUCUACUGAAAGUGUAGAUAUaUgUagUUUcUgaagUagaUaU；

SEQ ID NO:6：AUUUCUACUGAAAGUGUAGAUAagcagUaUag cagacaUgUUgag。

所述LtCas12a的氨基酸序列如SEQ ID NO:7所示。

本发明新设计出Cas12a(LtCas12a)蛋白，该LtCas12a蛋白具有特异性切割靶标序列的顺式裂解活性及非特异性切割其余核酸序列的反式裂解活性的特点，可以无差别切割单链DNA(ssDNA)，实现对HPV的高灵敏度和特异性检测。

作为本发明所述试剂盒的优选实施方式，所述荧光素包括FAM荧光素，所述FAM荧光素连接于ssDNA的3’端。

作为本发明所述试剂盒的优选实施方式，所述生物素包括Biotin生物素，所述Biotin生物素连接于ssDNA的5’端。

第五目的，本发明提供了一种非疾病治疗和诊断的HPV快速检测系统，包括恒温扩增装置、Cas12a切割装置和显色装置；

使用所述的便携装置采集月经血样本，所述恒温扩增装置对月经血样本进行月经血DNA的提取，然后将月经血DNA进行恒温扩增；恒温扩增过程中含有上述引物(引物F和引物R)；

所述Cas12a切割装置包括无酶水、缓冲液、LtCas12a、crRNA和两端带有荧光素和生物素标记的ssDNA；

所述显色装置对由Cas12a切割装置切割获得产物进行检测，定性判断月经血样本中有无靶标。优选地，所述显色装置为检测试纸条，通过检测试纸条的条带来定性判断月经血样本中有无靶标，如T线有红线则为阳性，如果T线无红线则为阴性。

传统镜检采用主观诊断方法，且因医院大小及医生经验不同所致导致细胞诊断结果不同。以传统的宫颈癌TCT细胞学检测为例，其流程涉及多个专业人工操作流程，如采样、漂洗、过滤等，需要专业的医生来操作与把控，一旦中间某一环节发生疏忽或差错，检测样本极易受到破坏，导致检测结果错误。

本发明基于利用Cas12a系统独特的侧支反式切割核酸酶活性，可以无差别切割单链DNA(ssDNA)，实现对核酸的高灵敏度和特异性检测，开发出一种不依赖实验室设备即可即时检测的系统，更是从检测技术方面突破高效性、准确性及安全性等问题。

更为准确地，本发明开发了基于Minipad采集的月经血DNA可进行下游的快速检测系统，通过利用自主研发的Cas12a(LtCas12a)蛋白具有特异性切割靶标序列的顺式裂解活性及非特异性切割其余核酸序列的反式裂解活性的特点，开发出HPV试纸条检测方法，检测只需要实现4步：即将样品中DNA快速提取、恒温扩增、Cas12a-crRNA复合物对探针的切割，最后反应产物在试纸条检测，即可通过检测条带来定性判断样本中有无靶标，这是一种高灵敏度、特异性和快速可视化的检测系统，从获取样品到出结果只需要数小时。

作为本发明所述HPV快速检测方法的优选实施方式，所述恒温扩增装置中还加入RAA酶、缓冲液V和无酶水。

作为本发明所述HPV快速检测系统的优选实施方式，所述LtCas12a、crRNA和ssDNA的浓度为(1-4μM):(1-4μM):(1-4μM)。

作为本发明所述HPV快速检测系统的优选实施方式，所述缓冲液包括NEB缓冲液。

作为本发明所述HPV快速检测系统的优选实施方式，所述荧光素包括FAM荧光素，所述FAM荧光素连接于ssDNA的3’端。本发明的荧光素不仅限定于FAM，还包括本领域中常用的荧光素，能实现本发明的技术效果即可。

作为本发明所述HPV快速检测系统的优选实施方式，所述生物素包括Biotin生物素，所述Biotin生物素连接于ssDNA的5’端。本发明的生物素不仅限定于Biotin，还包括本领域中常用的生物素，能实现本发明的技术效果即可。

作为本发明所述HPV快速检测系统的优选实施方式，所述步骤S3中，所述试纸条的对比线带有能够与生物素结合的链霉亲和素，所述试纸条的检测线带有与FAM结合的抗荧光素抗体。

为了实现即时检测可视化，在反应体系中使用两端带有荧光素和生物素标记的DNA(FAM-ssDNA-Biotin)。在试纸条的对比线(control line)带有能够与生物素结合的链霉亲和素，在检测线(test line)带有与FAM结合的抗荧光素抗体。当LtCas12a蛋白和crRNA识别目标基因完成靶标切割后，会无差别切割报告基因，被切割后的ssDNA会与检测线中的抗FAM抗体结合，可呈现出红色条带，可肉眼直接判读检测样本是否为阳性。基于这种的CRISPR-HPV快检技术，不容易出现人为判断的误差，真正实现快速、精准、可重复。

与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：

本发明提供了一种用于月经血样本采集的便携装置(MiniPad)及HPV快速检测系统，本发明设计的便携装置是一种完全非侵入式的取样方式，样本来源于妇女自然规律下的周期性子宫排血现象，只需要在月经第2～3天，在卫生巾适合区域贴上MiniPad，即可获得筛查样本，避免了操作不当带来的安全隐患，大大降低了污染的风险，在运输过程中，固体介质的MiniPad采集月经血易干燥，易保存，不容易发生邮寄运输过程的安全隐患。检测人员收到样品后，只需要核对受检人信息即可把MiniPad浸没于细胞裂解液中进行DNA提取，从而获得DNA。并且，本发明设计的HPV快速检测系统具有即时检测、准确等优点，检测过程中基于CRISPR-Cas12a进行基因编辑，不仅可以特异性识别切割靶标核酸链，而且可以无差别切割邻近靶标的ssDNA，基于该技术原理，CRISPR-Cas平台应用于HPV筛查具有高灵敏度的特点，为女性患者进行HPV即时筛查提供了重要的技术支持。

附图说明

图1为实施例1提供的用于月经血样本采集的便携装置(MiniPad)的正面图；

图2为实施例1提供的用于月经血样本采集的便携装置(MiniPad)的反面图；

图3为用于月经血样本采集的便携装置(MiniPad)的使用示意图I；

图4为用于月经血样本采集的便携装置(MiniPad)的使用示意图II；

图5为使用便携装置(MiniPad)进行月经血DNA提取步骤流程示意图；

图6为实施例3采用的HPV快速检测系统原理图。

具体实施方式

为更好的说明本发明的目的、技术方案和优点，下面将结合附图和具体实施例对本发明作进一步说明。

在以下实施例中，所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法，所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

实施例1、一种用于月经血样本采集的便携装置

参考图1-2，本实施例提供了一种用于月经血样本采集的便携装置(简称MiniPad)，包括：使用聚酯纤维网吸水棉作为便携装置的主体部分和背面的粘连胶布，所述粘连胶布远离主体部分的一端呈弧形；所述主体部分呈长条形状；所述主体部分的长度为9-10cm，宽度为2-3m。所述粘连胶布的表面左右覆盖两张PU膜胶布(为MiniPad的背面)，两张PU膜胶布在位于主体部分的垂直中心线呈宽度对齐，保持在同一水平线上，PU膜胶布的形状与粘连胶布构成的形状是相同的，两张PU膜胶布完全贴合于主体部分和粘连胶布。在所述PU膜胶布(两张)的表面贴有防粘连覆盖膜，所述防粘连覆盖膜的形状与两张PU膜胶布在位于主体部分的垂直中心线呈宽度对齐拼接构成的形状是保持一致的，以保持两侧PU膜胶布不互相粘连，便于采集月经血样本的顺利进行。其中，PU膜胶布可以使得聚酯纤维网吸水棉固定在带有月经血一面的卫生巾上。

上述用于月经血样本采集的便携装置的具体使用方法：

(1)建议患者于月经量较多的经期使用，例如月经血的采集时间为月经周期的第2到3天。

(2)打开一片新启用的卫生巾，撕开MiniPad背面的防粘连覆盖膜，如图3所示，将其粘贴于卫生巾的中间部分。

(3)待MiniPad的吸水棉红染80％以上，如图4所示，将其从卫生巾中撕下来，放置于标本袋中风干，并将其快递寄送至相关的月经血DNA检测机构。

本实施例的用于月经血样本采集的便携装置(简称MiniPad)比目前市面上的自取样方法相比更加简单便捷，无需就医检查，自采集试剂盒价格成本低，更加容易受到广大受检妇女的青睐。

在当前自取样本的装置中，除了考虑无创取样外，样本的保存、邮寄以及到检测人员对于样本预处理过程中，都需要考虑样本污染的问题。一般市面上的自取样试剂盒，尽管有诸多优势，但阴道自采样的实施仍面临挑战，包括培训医护人员向参与的妇女充分解释自取样程序、收集标本的运输、实验室对宫颈和阴道样本处理之间的技术差异。目前的自取样本需使用一次性无菌宫颈采样器(属II类医疗器械)，细胞须在细胞保存液(属I类医疗器械)保存。由于意外因素，比如运输的过程中瓶盖脱落、瓶身受到挤压等等，样本容易受到污染，并且细胞的存活状态也因试剂盒中的保存液成分不同而不同，因此，液体保存介质不如固体介质稳定。但之前的月经血取样方式对于检测人员的预处理存在很大的挑战。目前基于月经血DNA检测HPV的样品采集多通过受检人送一整片卫生巾棉片到检测机构，而检测人员对于卫生巾棉片还需要进行十分耗时的预处理，例如超净台紫外灭菌、消毒后的剪刀、镊子、EP管、酒精灯等等。而MiniPad的发明，大大降低了污染的风险。从运输过程中，固体介质的MiniPad采集月经血易干燥，易保存，不容易发生邮寄运输过程的安全隐患。检测人员收到样品后，只需要核对受检人信息即可把MiniPad浸没于细胞裂解液中进行DNA提取，从而获得DNA。

自取样本对于宫颈癌筛查工作的推进毋庸置疑，虽然自取样的方式省去了阴道镜检查医生操作步骤，受检人在家中收集样本后邮寄至检测中心即可完成筛查，但是具体实施中还涉及妇女对筛查的认知，个人信息的登记核实，申请参与和获得取样器的流程，以及对自取样操作步骤的了解。阴道自取样工具使用者必须要具备基本的文化教育水平，能够阅读理解取样指示图谱或步骤。不按照取样流程随意操作或错误操作不仅无法取得满意样本，还会带来一些医疗风险。虽然目前市面上许多自取样试剂盒已实现快速取样、检测的功能，但本实施例的用于月经血样本采集的便携装置——MiniPad，样本来源于妇女自然规律下的周期性子宫排血现象，只需要在月经第2～3天，在卫生巾适合区域贴上MiniPad装置，即可获得筛查样本，不存在操作不当带来的安全隐患。除了省时省力，这还是一种完全非侵入式的取样方式，更能被广大受检妇女所接受。

实施例2、使用便携装置(MiniPad)进行月经血DNA提取的方法

(1)从MiniPad中剪一块1cm×1cm样品(不要剪碎)，放到1.5ml的离心管中。

(2)加入1ml的缓冲液GA，常温浸泡1h后吸取浸泡液到新的1.5ml的离心管。

(3)加入20μl蛋白酶K，涡旋震荡10sec混匀后，放入预热至56℃的恒温震荡器中，900rpm恒温震荡1h。

(4)短暂离心，加入200μl的缓冲液GB，震荡10sec充分混匀。将离心管放入预热至70℃的恒温震荡器中，900rpm恒温震荡10min。孵育结束后短暂离心以去除管盖内壁的液滴。

(5)加入100μl的无水乙醇。如果室温超过25℃，请将乙醇置冰上预冷。轻轻颠倒混匀样品，室温放置5min，短暂离心以去除管盖内壁的液滴。

(6)将上一步所得溶液都加到一个吸附柱CR2中(吸附柱放入收集管中)，12000rpm(～13400×g)离心30sec，弃收集管废液，将吸附柱CR2放回收集管中。

(7)向吸附柱CR2中加入500μl缓冲液GD(使用前请先检查是否已加入无水乙醇)，等待3min(给漂洗液反应时间)，12000rpm(～13400×g)离心30sec，弃收集管废液，将吸附柱CR2放回收集管中(此步骤做2遍，即GD漂洗2遍)。(8)向吸附柱CR2中加入700μl漂洗液PW(使用前请先检查是否已加入无水乙醇)，等待3min(给漂洗液反应时间)，12000rpm(～13400×g)离心1min，弃收集管废液，将吸附柱CR2放回收集管中。

(9)向吸附柱CR2中加入500μl漂洗液PW，等待3min(给漂洗液反应时间)，12000rpm(～13400×g)离心1min(此步骤做2遍，即PW漂洗2遍)，弃收集管废液。

(10)将吸附柱CR2放回废液收集管中，12000rpm(～13400×g)离心2min，倒掉废液。将吸附柱CR2开盖置于室温放置5min，以彻底晾干吸附材料中残余的漂洗液。

(11)将吸附柱CR2转入一个干净的离心管中，向吸附膜中间位置悬空滴加30μl已预热至72℃的无酶水，室温放置5min(给无酶水溶解时间)，12000rpm(～13400×g)离心2min，将溶液收集到离心管中(此步骤做3遍，即洗柱子3遍，第2、3遍室温放置2min)。DNA产物保存在-20℃，以防DNA降解。

使用便携装置(MiniPad)进行月经血DNA提取步骤如图5所示。

实施例3、一种HPV快速检测系统

本实施例提供了一种HPV快速检测系统(LtCas12a-HPV即时检测)，包括恒温扩增装置、Cas12a切割装置和显色装置；

使用实施例1的便携装置采集月经血样本，所述恒温扩增装置对月经血样本进行月经血DNA的提取(实施例2)，然后将月经血DNA进行恒温扩增；

恒温扩增过程：

(1)使用重组酶聚合酶扩增(recombinase polymerase amplification，RAA)恒温试剂盒进行相关流程操作；

(2)取出冻干粉管1支(内有RAA酶)，分别加入缓冲液V 25μl和无酶水17.5μl；

(3)在上一反应液中加入引物F和引物R各2μl；具体地，针对HPV16所采用的引物为HPV16-引物F(如SEQ ID NO:1所示)、HPV16-引物R(如SEQ ID NO:2所示)，针对HPV18采用的引物为HPV18-引物F(如SEQ ID NO:3所示)和HPV18-引物R(如SEQ ID NO:4所示)；

HPV16-引物F：ttgttggggtaaccaactatttgttactgtt；

HPV16-引物R：cctccccatgtcgtaggtActccttaaag；

HPV18-引物F：gggtcataacaatggtgtttgctggcataatc；

HPV18-引物R：catctgcagttaaagtaatagtacacaactg。

(4)在管盖加入2.5μl醋酸镁；

(5)在反应液面下加入实施例2提取出的DNA模板1μl；

(6)瞬间离心后，手轻弹管壁10下，再次离心后放入37℃，孵育25min。

所述Cas12a切割装置包括无酶水、缓冲液、LtCas12a、crRNA和两端带有荧光素和生物素标记的ssDNA；

LtCas12a切割过程：

(1)取7.3ul无酶水加入200μl EP管；

(2)加入缓冲液2.1(NEB)2μl；

(3)在上一反应体系中加入10uM的LtCas12a(氨基酸序列如SEQ ID NO:7所示)2μl，10uM的crRNA(crRNA包括HPV16-crRNA和HPV18-crRNA，所述HPV16-crRNA和HPV18-crRNA的序列分别如SEQ ID NO:5-6所示)4μl，吹打混匀后室温孵育10min；

(4)加入10μM试纸条探针(3’FAM-ssDNA-5’Biotin)0.7μl；取RAA反应产物⁽恒温扩增步骤1-6)4μl加入其中，轻轻吹打混匀，37度孵育50min。

所述显色装置对由Cas12a切割装置切割获得产物进行检测，定性判断月经血样本中有无靶标。

试纸条显色过程：

(1)提前取出试纸条试剂盒(TwistDX)，室温放置30min；

(2)将上一步切割产物加入80μl的试纸条缓冲液，避光孵育10-15min；

(3)放置试纸条，2分钟后读取结果；

(4)如T线有红线则为阳性，如果T线无红线则为阴性。上述方法原理如图6所示。

针对女性宫颈癌的高发生率，早期进行HPV诊断与预防非常重要。随着现代分子生物学不断发展，聚合酶链式反应(polymerase chain reaction，PCR)技术在病原体鉴定与检疫检测中发挥了关键作用。然而，该技术需要大型精密的实验仪器，以及专用实验场地和专业实验人员，限制了其HPV即时检测的开展。本实施例基于基因编辑的CRISPR-Cas12a，不仅可以特异性识别切割靶标核酸链，而且可以无差别切割邻近靶标的ssDNA，基于该技术原理，CRISPR-Cas平台应用于HPV筛查具有高灵敏度的特点，以其快速、便利优势脱颖而出，成为未来普及宫颈癌早筛的一大利器。

最后所应当说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非对本发明保护范围的限制，尽管参照较佳实施例对本发明作了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的实质和范围。

Claims (5)

1.一种非疾病治疗和诊断的HPV快速检测系统，其特征在于，包括恒温扩增装置、Cas12a切割装置和显色装置；

使用便携装置采集月经血样本，所述恒温扩增装置对月经血样本进行月经血DNA的提取，然后将月经血DNA进行恒温扩增，恒温扩增过程中含有快速检测HPV的试剂盒中的扩增HPV DNA的特异性引物；

所述Cas12a切割装置包括无酶水、缓冲液、快速检测HPV的试剂盒中的LtCas12a、crRNA和两端带有荧光素和生物素标记的ssDNA；

所述显色装置对由Cas12a切割装置切割获得产物进行检测，定性判断月经血样本中有无靶标；

其中，所述便携装置由使用聚酯纤维网吸水棉作为便携装置的主体部分和背面的粘连胶布组成，所述粘连胶布的表面覆盖有PU膜胶布，所述PU膜胶布的表面贴有防粘连覆盖膜；

所述粘连胶布远离主体部分的一端呈弧形；所述主体部分呈长条形状；

所述主体部分和粘连胶布的表面左右覆盖两张PU膜胶布，两张PU膜胶布在位于主体部分的垂直中心线呈宽度对齐，保持在同一水平线上；

所述主体部分的长度为9-10cm，宽度为2-3cm；

将便携装置中的主体部分贴在卫生巾带有月经血的一面，所述月经血的采集时间为月经周期的第2到3天；

所述扩增HPV DNA的特异性引物为HPV16-引物F、HPV16-引物R、HPV18-引物F和HPV18-引物R；所述HPV16-引物F的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示；所述HPV16-引物R的核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示；所述HPV18-引物F的核苷酸序列如SEQ ID NO:3所示；所述HPV18-引物R的核苷酸序列如SEQ ID NO:4所示；

所述crRNA包括HPV16-crRNA和HPV18-crRNA，所述HPV16-crRNA和HPV18-crRNA的序列分别如SEQ ID NO:5-6所示；

所述LtCas12a的氨基酸序列如SEQ ID NO:7所示。

2.如权利要求1所述的HPV快速检测系统，其特征在于，所述荧光素包括FAM荧光素，所述FAM荧光素连接于ssDNA的3’端。

3.如权利要求1所述的HPV快速检测系统，其特征在于，所述生物素包括Biotin生物素，所述Biotin生物素连接于ssDNA的5’端。

4.如权利要求1所述的HPV快速检测系统，其特征在于，所述恒温扩增装置中还加入RAA酶、缓冲液V和无酶水。

5.如权利要求1所述的HPV快速检测系统，其特征在于，所述LtCas12a、crRNA和ssDNA的浓度为(1-4μM):(1-4μM):(1-4μM)。