CN108676874A

CN108676874A - 循环外泌体长链非编码rna-tc0101441作为诊断子宫内膜异位症的标记物用途

Info

Publication number: CN108676874A
Application number: CN201810978582.9A
Authority: CN
Inventors: 邱君君; 华克勤; 唐晓燕; 林晓静; 郑婷婷
Original assignee: Obstetrics and Gynecology Hospital of Fudan University
Current assignee: Obstetrics and Gynecology Hospital of Fudan University
Priority date: 2018-08-27
Filing date: 2018-08-27
Publication date: 2018-10-19
Anticipated expiration: 2038-08-27
Also published as: CN108676874B

Abstract

一种循环外泌体长链非编码RNA‑TC0101441作为诊断子宫内膜异位症的标记物用途，所述的循环外泌体长链非编码RNA‑TC0101441的基因序列如SEQ ID NO.1所示。提供了一种用于诊断子宫内膜异位症的试剂盒，含有检测循环外泌体长链非编码RNA‑TC0101441的试剂，试剂包括上游引物序列和下游引物序列，上游引物序列如SEQ ID NO.2所示，下游引物序列如SEQ ID NO.3所示。本发明发现内异症患者血清中可检测到外泌体TC0101441，并且其表达水平明显高于非内异症女性，因此，循环外泌体TC0101441可成为内异症早期诊断及病情监测的新型非侵入性生物标志物。

Description

循环外泌体长链非编码RNA-TC0101441作为诊断子宫内膜异位症的标记物用途

技术领域

本发明属于医学检测领域，涉及一种血清及细胞上清外泌体lncRNA-TC0101441，具体来说是循环外泌体长链非编码RNA-TC0101441在作为诊断子宫内膜异位症的生物标记物和在诊断试剂中的用途。

背景技术

子宫内膜异位症(endometriosis，EMs，简称“内异症”)是一种具有侵袭性，雌激素依赖性的疾病，以子宫内膜的腺体和基质存在子宫体以外的其他部位为特点。子宫内膜异位症的主要临床表现为疼痛和不孕，严重影响女性生活质量。在全球范围内10％-15％的生育年龄女性约有超过7000万人受到内异症的影响。子宫内膜异位症轻度病变可有器官表面的微小病灶，重度病变可导致盆腔脏器肠管、膀胱、输尿管的广泛性粘连。

对于早期病变疼痛明显的内异症患者或者晚期病变但症状不明显的患者，腹腔镜检查作为一种有创的诊断方式并不实用。临床上子宫内膜异位症的早期诊断存在延迟现象，有报道称在患有疼痛和不孕症状的妇女中内异症诊断的延迟时间分别为6年和3年。因此，积极探索一种无创性鉴别内异症的生物标志物会降低手术风险，有助于监测内异症的病情进展，促进早期内异症的诊断、干预和治疗。

目前在生物标志物中，组织标志物存在标本采集、无法连续监测和随访等诸多限制，不利于临床开展和推广应用。现有的外周血标志物如CA125等特异性差，不足以早期诊断内异症。最近，基于液态活检的循环生物标志物受到重视。液态活检三大来源主要是：循环肿瘤 DNA、循环肿瘤细胞和外泌体。外泌体，是细胞外环境的重要成分之一，是30-150nm膜结合分泌囊泡，容易从各种生物体液中分离。外泌体存在于血液、尿液、腹水等人体大多数体液中。外泌体可携带多种生物活性物质，包括蛋白质、脂质、及遗传物质如信使RNA（messenger RNA，mRNA），微小RNA（microRNA，miRNA）及长链非编码RNA（long non-codingRNA，lncRNA）等。外泌体的稳定性极高，在各种冷冻冷藏和解冻条件下都可保存长达数年，含量也极为丰富，每毫升血浆中就含有10^^8-13个外泌体。这些优点赋予了外泌体成为新型标志物的可能性。目前认为，循环血液中的各种RNA是由相关外泌体释放而来，同时也正是由于外泌体的保护，使循环血液中的各种RNA免遭降解。因此，基于液态活检技术探寻外泌体来源的特异性RNA分子，或能为内异症的早期诊断及病情监测带来新的契机。

在外泌体的运载成分中，lncRNA受到广泛关注。已有研究表明外泌体可作为功能性lncRNA的运输载体，诱导受体细胞内的表型改变，参与肿瘤的发生发展；并能成为肿瘤诊断，预后预测的潜在标志物。然而在内异症中，国内外均未见外泌体lncRNA的研究报道。

发明内容

本发明的目的在于提供循环外泌体长链非编码RNA-TC0101441作为诊断子宫内膜异位症的生物标记物用途，所述的这种循环外泌体长链非编码RNA-TC0101441的用途要解决现有技术中对早期诊断子宫内膜异位症困难的技术问题。

本发明提供了一种循环外泌体长链非编码RNA-TC0101441作为诊断子宫内膜异位症的生物标记物用途，所述的循环外泌体长链非编码RNA-TC0101441的基因序列如SEQ IDNO.1所示。

本发明还提供了一种用于诊断子宫内膜异位症的试剂盒，含有检测循环外泌体长链非编码RNA-TC0101441的试剂，所述的试剂包括上游引物序列和下游引物序列，所述的上游引物序列如SEQ ID NO.2所示，所述的下游引物序列如SEQ ID NO.3所示，所述的循环外泌体长链非编码RNA-TC0101441的基因序列如SEQ ID NO.1所示。

本发明和已有技术相比，其技术效果是积极和明显的。本发明发现外泌体TC0101441介导异位内膜间质细胞间的交互对话，促进内异症的侵袭转移，具有监测内异症病情进展的潜能。另一方面，内异症患者血清中可检测到外泌体TC0101441，并且其表达水平明显高于非内异症女性，具有诊断内异症的潜能。因此，液体活检循环外泌体TC0101441可以成为内异症早期诊断及病情监测的新型非侵入性生物标志物。

附图说明

图1显示了促转移相关lncRNA-TC0101441高表达于内异症患者异位内膜间质组织中。

图2显示了鉴定来源于TC0101441敲低及对照异位内膜间质细胞（ECSCs）上清液中的外泌体。

图3显示了TC0101441敲低及对照ECSCs上清液所释放的外泌体能被受体细胞内吞。

图4显示了外泌体递送TC0101441至受体细胞，诱导受体ECSCs发生类似恶性的侵袭转移表型改变。

图5 显示了循环血清外泌体TC0101441在内异症患者中的表达显著高于非内异症女性。

具体实施方式

实施例1 内异症患者中异位、在位及正常内膜组织促转移相关lncRNA-TC0101441的表达情况

荧光原位杂交技术（Fluorescence in situ hybridization, FISH）：

1）将内异症中异位、在位及正常内膜组织样本固定、脱水；

2）在杂交buffer上加入lncRNA-TC0101441探针，用原位杂交试剂盒(Biochain,Hayward, CA, USA)进行原位杂交。

3）细胞核用DAPI染色后，用荧光显微镜观察。

实时荧光定量PCR法（qRT-PCR）检测内异症患者异位、在位及正常内膜组织促转移相关lncRNA-TC0101441的表达情况

检测过程：

实时荧光定量PCR法：

引物序列如下：lncRNA-TC0101441：

上游引物 5’- caaggcaggtgagaacgagt -3’；

下游引物：5’- ctcgacttagggagctgcac -3’；

GAPDH：

上游引物：5’- tgacttcaacagcgacaccca -3’；

下游引物：5’- caccctgttgctgtagccaaa -3’；

反应体系如下：SYBR○R Premix Ex Taq 10ul；上游引物0.8ul；下游引物0.8ul；cDNA模板2ul；ROX Reference Dye II 0.4ul；RNase free water 6ul。

于ABI 7900实时荧光定量PCR仪内进行如下反应：

第一步：95℃30秒预变性；

第二步：PCR反应，共40个循环，每个循环由95℃5秒变性，60℃34秒延伸。

我们发现： TC0101441主要位于异位内膜细胞质中，其在异位内膜中的表达明显高于在位内膜及正常对照内膜。 FISH结果（图1A）显示：相比于在位内膜及正常内膜，TC0101441主要表达于异位内膜间质细胞的细胞质中。qRT-PCR结果（图1B）显示：TC0101441在异位内膜中的表达显著高于在位内膜及正常内膜组织。*P<0.05。

实施例2 异位子宫内膜间质细胞（ECSCs）上清液外泌体的提取及鉴定

细胞上清液外泌体提取和鉴定过程：

1）原代培养高表达TC0101441的异位子宫内膜间质细胞（3#和5# ECSCs），将ECSCs培养于无血清培养液中3天；

2）用siRNA及慢病毒敲低（knockdown， KD）技术敲低3#和5# ECSCs中TC0101441的表达，获得TC0101441敲低及对照ECSCs。

3）用外泌体抽提试剂盒#44578259 (Thermo Fisher Scientific, CA, USA)提取上述细胞上清液中外泌体。

4）外泌体的透射电子显微镜（Transmission electron microscope，TEM）鉴定：取上述所得的外泌体溶液20ul，加入20ulPBS稀释后滴加到显微镜专用的载样铜网上，室温放置3分钟，晾干，吸取3%磷钨酸钠溶液20ul滴加至铜网进行负染1分钟，吸纸吸去多余液体。铜网放置到电镜中进行抽真空后，观察并拍照如图2。

5） Western blot鉴定外泌体表面标志性蛋白：利用外泌体表面标志性蛋白CD63，TSG101的抗体，通过Western blot试剂盒进行鉴定。

我们发现：如图2A所示，原代培养高表达TC0101441的异位子宫内膜间质细胞（3#和5# ECSCs），敲低TC0101441后，显著降低3#和5# ECSCs中的TC010144表达。如图2B所示，用透射显微电镜对所分离的TC0101441敲低及对照ECSCs上清液中外泌体进行鉴定，可见电镜下所分离到的外泌体表现为圆形形态，大小较一致的颗粒，直径在30-150nm。然后进行Western blot，如图2C所示，可检测到外泌体表面标志性蛋白CD63，TSG101的表达。以上结果表明本发明成功提取了ECSCs上清液中的外泌体。此外，图2D显示了TC0101441敲低ECSCs上清液释放的外泌体中TC0101441的含量显著降低。*P<0.05。

实施例3 供体异位子宫内膜间质细胞（ECSCs）上清液分泌的外泌体被受体细胞内吞

外泌体的标记及内吞实验：

1）将外泌体用绿色染料PKH67 (green dye, Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA)标记，

2）将供体异位子宫内膜间质细胞（ECSCs）上清液分泌的外泌体与受体ECSCs共培养，4小时后利用荧光显微镜观察外泌体的内吞现象。

我们发现：如图3所示，TC0101441敲低及对照ECSCs上清液所释放的外泌体能被受体细胞内吞，提示外泌体及外泌体TC0101441能从供体异位子宫内膜间质细胞（ECSCs）转运至受体细胞。

实施例4 供体ECSCs上清液分泌的外泌体TC0101441能促进受体ECSCs的转移

体外细胞迁移实验（细胞划痕法）

当ECSCs生长汇合 90%以上，以无菌的 200μl 枪头沿着直尺在孔中央所形成的单层细胞上呈“一”字划痕，用 PBS 清洗掉被划出的细胞，更换新的无血清培养基，继续细胞培养。分别拍照记录0小时、24小时的划痕区域，并用公式计算出迁移能力（1-[current woundsize/initial wound size]）×100。

体外细胞侵袭实验（Transwell assay）

1)包被基底膜：用50mg/L Matrigel胶1：8稀释后，吸取20μl均匀涂在Transwell小室底部膜的上室面，37°C孵育30分钟使胶凝固。

2)制备细胞悬液：制备细胞悬液前可先让细胞饥饿24h，进一步去除血清的影响；消化细胞，终止消化后离心弃去培养液，PBS洗涤2遍后用无血清培养基混匀细胞，细胞技术仪计数细胞密度。

3)接种细胞：小室（8µm孔径）中每孔加入细胞悬液200ul，细胞数目1×10⁵个，24孔板小室外加入600ul含10% FBS培养基。

4)37°C孵育24小时后，取出小室去除上清液。

5)用棉签擦去基质胶和上室内的细胞，将小室放入4%的多聚甲醛中固定 30min后用 PBS清洗。

6)结晶紫染色：将小室浸没在含0.1%结晶紫溶液中15-30分钟。取出小室，放入PBS 浸洗三遍，用棉签擦去内侧未迁移过去的细胞。

7)计数：在显微镜下取5个高倍镜视野计数被结晶紫染色的细胞个数，并拍照。

我们发现：供体异位子宫内膜间质细胞（ECSCs）能通过外泌体运输TC0101441至受体细胞，诱导受体ECSCs发生类似恶性的侵袭转移表型改变。如图4A所示，划痕实验表明：来源于TC0101441敲低ECSCs上清液中的外泌体显著抑制受体细胞的迁移能力。如图4B所示，侵袭实验表明：来源于TC0101441敲低ECSCs上清液中的外泌体显著抑制受体细胞的侵袭能力。*P<0.05.

实施例5 内异症患者和对照组血清外泌体lncRNA-TC0101441的表达情况

血清外泌体提取过程：

1）将血清标本（约200ul/份）自-80℃冰箱取出化冻后，3000g离心15分钟；

2）将上清转移至另一干净灭菌管中，加入ExoQuick exosome precipitationsolution 50ul，上下颠倒混匀。

3）孵育30分钟，室温1500g离心30分钟，管底可见沉淀。

4）去除上清，1500g继续离心5分钟，小心去除上层的液体组分，加入20ul无菌水重悬沉淀。

内异症患者和对照组血清外泌体lncRNA-TC0101441的表达情况

检测过程：

实时荧光定量PCR法：

引物序列如下：lncRNA-TC0101441：

上游引物 5’- caaggcaggtgagaacgagt -3’；

下游引物：5’- ctcgacttagggagctgcac -3’；

GAPDH：

上游引物：5’- tgacttcaacagcgacaccca -3’；

下游引物：5’- caccctgttgctgtagccaaa -3’；

于ABI 7900实时荧光定量PCR仪内进行如下反应：

第一步：95℃30秒预变性；

我们发现：提取血清外泌体后，如图5所示，通过qRT-PCR的方法对29例内异症患者及16例对照组的血清外泌体TC0101441进行了检测，结果显示内异症患者血清外泌体TC0101441的含量明显高于对照组（P<0.05）。提示在循环外泌体TC0101441高表达于内异症患者。*P<0.05。

序列表

<110> 复旦大学附属妇产科医院

<120> 循环外泌体长链非编码RNA-TC0101441作为诊断子宫内膜异位症的标记物用途

<160> 5

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 765

<212> DNA

<213> 长链非编码RNA(long non-coding RNA)

<400> 1

aggccagctc ccgttccaac acctctacct tagggacatc tgcagaaagg ctgggcagtg 60

gcaaaaaagg gggccttgga aaaatggcca atctcttaga ccctcacttt tatcatctgt 120

aaaatggcac tgaggcgtcc tgtccttctg actcctctgg ttatgctagg aagctgataa 180

agacatgggc gtcaaagcat gaggcagagc ataaaagtca ctgactgagg gcatccctgc 240

tactttgtga aaggaacagg agggtaagga aggagacaca gggaaaggac aaggcaggtg 300

agaacgagtg tccagacctg gggattccag actaagaaca agggcaacag gagcagtggg 360

gagagatgca aaacagacct gatcttagga tgctgggaaa actccccagg aggcggtgca 420

gctccctaag tcgagctgac tcccacaaag atcctcccca ggaggaagag tagtgccctg 480

gcagggagct ggagcaatgg agctctcttg aggaggcaga ggtatgtcct ggtatgcacc 540

cccctctcac cccagcagct gaccatgtca caggtagaag ggatcagaga gacggtctgg 600

tctaacctct catctcacaa acagaccatc ggctcacatg agaaagcaaa ctaagagctt 660

ctttagctca ctcctacact gtcaaaggaa cattaaagcc ttcaatgaag agcatgcttg 720

ctttgtggct ccccattgac tcatcccttc taccttgagt tatga 765

<210> 2

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

caaggcaggt gagaacgagt 20

<210> 3

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

ctcgacttag ggagctgcac 20

<210> 4

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

tgacttcaac agcgacaccc a 21

<210> 5

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

caccctgttg ctgtagccaa a 21

Claims

1.一种循环外泌体长链非编码RNA-TC0101441作为诊断子宫内膜异位症的生物标记物用途，所述的循环外泌体长链非编码RNA-TC0101441的基因序列如SEQ ID NO.1所示。

2.一种用于诊断子宫内膜异位症的试剂盒，其特征在于：含有检测循环外泌体长链非编码RNA-TC0101441的试剂，所述的试剂包括上游引物序列和下游引物序列，所述的上游引物序列如SEQ ID NO.2所示，所述的下游引物序列如SEQ ID NO.3所示，所述的循环外泌体长链非编码RNA-TC0101441的基因序列如SEQ ID NO.1所示。