CN108061804A - 用于诊断子宫内膜异位症的生物标志物 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及用于诊断子宫内膜异位症的生物标志物、试剂盒和方法。具体地，本发明提供了与循环内膜细胞上的特异性抗原结合的单克隆抗体在制备用于诊断子宫内膜异位症的试剂盒中的用途。

Description

用于诊断子宫内膜异位症的生物标志物
技术领域
本申请涉及医学诊断的领域，具体涉及用于诊断子宫内膜异位症的生物标志物、试剂盒和方法。
背景技术
子宫内膜异位症（endometriosis，EM）是指有活性的子宫内膜腺体或间质出现在子宫腔以外的任何部位。目前，EM在育龄女性发病率超过10%。异位的内膜组织可以出现在腹膜及盆腔器官甚至肺、脑等远处器官，常引起不孕、盆腔疼痛和包块。在患者寻求诊断和治疗的漫长过程中，不孕、盆腔疼痛以及高额的医疗费用严重影响女性的生活质量。由此，在早期阶段检出子宫内膜异位症并对其进行处理是重要的。但由于部分患者临床症状不典型，EM须通过有创的腹腔镜检发现异位病灶才能确诊，导致诊断平均延迟达7-11年。因此，一般首先进行更简便的内诊、超声波检查、血液检查等以辅助诊断。
目前，血清CA125被广泛应用于临床子宫内膜异位症的辅助诊断，但其诊断价值有限：最初拟定的CA125正常上限（35 U/ml）适于卵巢癌筛查，对于EM诊断的敏感性和特异性均不佳，EM延迟诊断的现象仍广泛存在。虽然许多研究均表明子宫内膜异位症患者的血清CA125水平也增高，且升高程度与疾病的严重程度相关，但是子宫内膜异位症1、2期患者的水平升高不显著，轻度的子宫内膜异位症患者CA125水平常低于正常人，限制了单独使用CA125作为标志物对子宫内膜异位症进行诊断。1篇纳入了22项研究meta分析显示，CA125对1、2期EM的敏感性仅约24.8%，显著低于3、4期EM（约63.1%），因此，CA125正常不能排除EM(Hirsch M. et al., 2016)。此外，文献报道，血清CA125水平在月经周期中的月经期和增生期升高，不利于疾病的监测和随访(Kafali H et al., 2004)。
由于血液样本的获得简单便捷且几乎无创，EM血液学生物标志物的研究近年来呈指数式的增长，大约有200多个候选标志物在研究阶段，但不少报道之间相互矛盾。既往报道的EM生物标志物多为糖蛋白、细胞因子、非编码RNA等分子，只能反应疾病对机体某方面的影响。
另一方面，循环肿瘤细胞（circulating tumor cells，CTC）检测作为一种新的无创检测方法，在肿瘤研究领域引起了越来越多的关注，已经在多种癌症中被广泛用于转移机制、早期诊断、预测预后等研究。
EM虽然是一种良性疾病，却有着多种恶性特征，例如播散、种植、转移。术后五年累积复发率约为50%，恶变率约为1%。此外，EM中的子宫内膜细胞，包括原代细胞和永生化细胞系，具有类似于肿瘤细胞的侵袭性，使进入循环成为可能。循环内膜细胞（circulatingendometrial cells，CEC）作为完整的细胞，包涵了从基因、转录组到蛋白等各层面的综合信息，由外周血即可分离获得，可反映患者的病理状态，而不用通过手术获取病灶。Vladimir等人曾分离外周血细胞，进行体外培养，并通过免疫组化染色进行鉴定所分离细胞的原始来源，然而仅在17例EM患者中检出4例CECs阳性，检出率为23.5% (Vladimir etal., 2014)。
因此，迫切需要可以替代CA125等的新型子宫内膜异位症诊断用标志物，其不受疾病严重程度影响和月经周期干扰，使患者得到及时的治疗。
发明内容
为了建立更简便、更小创伤的检测方法，缩短诊断的延迟，用于EM的辅助诊断、监测和随访，本发明人对循环内膜细胞的分离及其在EM中的诊断价值进行了深入研究，首次发现并证实CEC对EM具有良好的敏感性与特异性，可更好的区别早期EM，而且不受月经周期的影响，可克服现有的检测的缺陷，从而完成本发明。
第一方面，本发明涉及用于辅助诊断有需要的对象的子宫内膜异位症的方法，所述方法包括以下步骤：从来自所述对象的外周血样品捕获循环内膜细胞；和对所捕获的细胞进行免疫荧光染色检测；其中循环内膜细胞的检出指示所述对象疑似患有子宫内膜异位症。
第二方面，本发明涉及循环内膜细胞特异性结合剂在制备用于诊断子宫内膜异位症的试剂盒中的用途，其中所述循环内膜细胞特异性结合剂是与循环内膜细胞上的特异性抗原结合的单克隆抗体。
在一些实施方式中，所述特异性抗原是选自广谱细胞角蛋白（pan-cytokeratin，pan-CK）、波形蛋白（vimentin）、雌激素受体（Estrogen receptor，ER）、孕酮受体（progesterone receptor，PR）中的一种或多种。在一些实施方式中，所述循环内膜细胞特异性结合剂为：抗-vimentin单克隆抗体、抗-pan-CK单克隆抗体、抗ER单克隆抗体和抗PR单克隆抗体。在一些实施方式中，所述单克隆抗体中的一种或多种是荧光标记的单克隆抗体，其用于通过免疫荧光染色法检测循环内膜细胞。
第三方面，本发明涉及用于诊断子宫内膜异位症的试剂盒，其包含循环内膜细胞特异性结合剂，其中所述循环内膜细胞特异性结合剂是与循环内膜细胞上的特异性抗原结合的单克隆抗体。
在一些实施方式中，所述特异性抗原是选自pan-CK、vimentin、ER、PR中的一种或多种。在一些实施方式中，所述试剂盒包含抗-vimentin单克隆抗体、抗-pan-CK单克隆抗体、抗ER单克隆抗体和抗PR单克隆抗体。在一些实施方式中，所述单克隆抗体中的一种或多种是荧光标记的单克隆抗体，其用于通过免疫荧光染色法检测循环内膜细胞。在一些实施方式中，所述试剂盒还包含抗CD45抗体。
在一些实施方式中，所述试剂盒还包含用以从待测样品捕获子宫内膜细胞的设备。在一些实施方式中，所述捕获子宫内膜细胞的设备是微流控芯片，优选具有空间梯度排布的微柱的微流控芯片。
子宫内膜异位症
子宫内膜是构成哺乳类子宫内壁的一层腺粘膜。正常的子宫内膜由单层柱状上皮和固有层组成，其中，上皮主要由具有分泌功能的腺上皮构成，而固有层的子宫内膜基质细胞与基质等成分则构成间质。
正常情况下，子宫内膜覆盖于子宫体腔面，如因某种因素，使子宫内膜在身体其他部位生长，即可成为子宫内膜异位症。异位的内膜在组织学上不但有内膜的腺体，而且还有内膜间质围绕；在功能上随雌激素水平而有明显变化，即随月经周期而重复增殖、出血、再生。子宫内膜异位症的病变形态多样，具有侵袭、远转移、复发等恶性生物学行为，治疗对策有限。
到目前为止，子宫内膜异位症的发病机制尚不清楚，主要包括Sampson的经血逆流学说、体腔上皮化生学说，以及淋巴、血行转移学说等。目前，较为公认的是Sampson的经血逆流学说，该学说认为盆腔子宫内膜异位症的发生，系子宫内膜碎片随经血逆流，通过输卵管进入盆腔而种植于卵巢或盆腔其他部位所致，临床上在月经期行剖腹探查时可在盆腔中发现经血，且经血中查见子宫内膜，剖宫手术后所形成的腹壁疤痕子宫内膜异位症，是该学说的好例证。
虽然血逆流现象在90%育龄期女性中均存在，但只有约10%的女性患有EM。血行转移理论提出了另一种途径：EM可能是由于子宫内膜组织碎片由循环转移至异位种植形成，但具体的转移过程仍然未明。循环内膜细胞作为该学说有力的证据，有助于阐释血行转移的过程，有着重要的临床价值。
循环内膜细胞
循环内膜细胞（circulating endometrial cells，CECs）是指存在于循环系统中的由子宫内膜起源的细胞，其包括内膜上皮、间质细胞等。循环内膜细胞保留子宫内膜细胞的特征，表达子宫内膜上皮细胞和间质细胞的特异性表面抗原分子，包括广谱细胞角蛋白（pan-cytokeratin，pan-CK）、波形蛋白（vimentin）、雌激素受体（Estrogen receptor，ER）、孕酮受体（progesterone receptor，PR）等。
广谱细胞角蛋白是重要的上皮细胞源性细胞标志物，它广泛分布于上皮细胞，具有极高的保守性和组织分化特异性，与上皮细胞的增殖分化密切相关。波形蛋白是间质细胞中最主要的中间纤维，其存在于内皮细胞和白细胞等中胚层起源的细胞，并与微管、微丝共同形成细胞支架网络而维持细胞完整性。广谱细胞角蛋白/波形蛋白是上皮及间质细胞表面分子。
雌激素受体是被雌激素激活的受体，常见于子宫内膜，乳腺癌细胞，卵巢基质细胞。孕酮受体是被类固醇激素孕酮激活的受体。ER/PR在子宫内膜上皮细胞和间质细胞均有表达，表达率在90%以上。
此外，已报道VEGF、MMP、CD44V6等分子在异位内膜组织中高表达。
循环内膜细胞的富集和分离
如前文所述，既往报道的EM生物标志物多为糖蛋白、细胞因子、非编码RNA等分子，只能反应疾病对机体某方面的影响。与之相比，循环内膜细胞作为完整的细胞，包涵了从基因、转录组到蛋白等各层面的综合信息，由外周血即可分离获得，可反映患者的病理状态，而不用通过手术获取病灶。因此，CEC检测可作为EM实时可重复的检测手段，用于疗效和复发的监测与随访。
然而，循环系统中CEC的含量极低，要实现CEC的检测，对其进行富集是一个必要的步骤。循环内膜细胞的富集可通过本领域中已知的多种方法进行，包括但不限于磁珠分选、流式细胞术、多孔滤膜分离、微流控分离等。
磁珠分选细胞是基于细胞表面抗原能与连接有磁珠的特异性单抗相结合，在外加磁场中，通过抗体与磁珠相连的细胞被吸附而滞留在磁场中；而没有特异性表面抗原的细胞由于不能与连接着磁珠的特异性单抗结合而没有磁性，不在磁场中停留，从而使细胞得以分离。
多孔滤膜分离是基于CEC细胞与血液中的血细胞在形态大小方面的差异进行分离的方法。该方法主要利用孔径为8um的多孔滤膜将CEC细胞与外周血中白细胞进行分离。所采用的滤膜包括多孔聚碳酸酯膜、聚对二甲苯膜等。
流式细胞术（Flow Cytometry）是一种对液流中排成单列的细胞逐个进行快速定量分析和分选的技术。在流式细胞术分选中，待测样品（源自外周血的细胞等）经荧光染料染色后制成样品悬液。样品悬液在一定压力下进入流动室，排成单列的细胞，由流动室的喷嘴喷出而成为细胞液滴流。根据细胞液滴的荧光性质，赋予其正电或负电荷，随后通过高压偏转带有电荷细胞液滴，从而达到了分类收集细胞的目的。
微流控技术是一种在微米尺度的流道内对液体进行动态操作，从而实现在分子和细胞水平实现快速、高回收、高纯度分选富集的技术。微流控芯片内的细胞分选富集主要分为生物化学方法和物理方法两大类，其中，生物化学方法通过特异性抗体对细胞表面表达的标志物进行特异性的抗原抗体吸附，从而分选富集目的细胞；而物理方法则基于细胞间的物理特性差异，例如大小等，利用外力场分离细胞。
此前的微流控芯片主要应用于循环肿瘤细胞（CTC）的分离，可以实现细胞的进样、培养、捕获和分离检测等过程。Nagrath等描述的微流控芯片捕获平台在层流条件下采用抗体修饰的微柱捕获CTC (Nagrath S. et al., Nature, 2007)。Hyun等人设计了具有不对称人字形结构的几何图案的表面交互芯片(Hyun K. A. et al., Analytical Chemistry,2013)。Sheng等描述了带有金纳米颗粒-核酸适配体的微流控装置(Sheng W. et al., ACSNano, 2013)。Lv等描述了带有阶梯状排列的微柱的微流控芯片（Lv P. et al., 2013）。
由于外周血成分较为复杂，除了对CEC的阳性富集之外，还需要对白细胞进行阴性选择分离以排除其他血液成分的干扰。根据本发明，可通过抗CD45抗体，或采用免疫磁珠、特殊的微结构功能单元等方式去除血液中的白细胞。根据本发明优选的实施方式，使用抗CD45抗体分离除去白细胞。
根据本发明优选的实施方式，使用微流控芯片进行循环内膜细胞的富集。根据本发明，微流控芯片不仅能够高效分离并回收高纯度的循环内膜细胞，包括较小的上皮细胞和较大的间质细胞，而且可方便地在芯片内进行染色，从而提高了敏感性，并且避免操作中的污染。
循环内膜细胞的检测
循环内膜细胞可以通过本领域中已知的方法进行检测，例如光学显微镜检查、免疫组织化学染色法、免疫荧光染色法等。
根据本发明优选的实施方式，通过免疫荧光染色法对循环内膜细胞进行检测。免疫荧光染色法是将不影响抗原抗体活性的荧光色素标记在抗体（或抗原）上，与其相应的抗原（或抗体）结合后，在荧光显微镜下呈现一种特异性荧光反应。根据循环内膜细胞所表达的特异性抗原，采用与循环内膜细胞特异性结合剂进行免疫荧光染色，其中所述循环内膜细胞特异性结合剂是与循环内膜细胞上的特异性抗原结合的单克隆抗体。
常用的免疫荧光染色法包括直接染色法、间接染色法、抗补体染色法，以及双层法、夹心法、混合法、三层法、抗体-抗补体法等。
本领域技术人员可以根据待检测的循环内膜细胞的特异性抗原选择适合的单克隆抗体进行免疫荧光染色检测。
在一个实施方式中，所述特异性抗原是选自广谱细胞角蛋白（pan-cytokeratin，pan-CK）、波形蛋白（vimentin）、雌激素受体（Estrogen receptor，ER）、孕酮受体（progesterone receptor，PR）中的一种或多种。此外，已报道VEGF、MMP、CD44V6等分子在异位内膜组织中高表达。本领域技术人员也可以选择其他特异性抗原进行循环内膜细胞的检测。
在一个实施方式中，所述循环内膜细胞特异性结合剂为：抗-vimentin单克隆抗体、抗-pan-CK单克隆抗体、抗ER单克隆抗体和抗PR单克隆抗体。可用于本发明的单克隆抗体可通过如杂交瘤法等常规方法制备，也可商购获得，例如由Abcam购得抗ER兔单抗（1:100）、抗PR兔单抗（1:200）。
在一些实施方式中，所述单克隆抗体中的任一种或多种与荧光标志物缀合。在一些实施方式中，在免疫荧光染色法中，使用与荧光标志物缀合的第二抗体（或简称为“二抗”）。所述第二抗体是特异性结合本发明的与循环内膜细胞上的特异性抗原结合的单克隆抗体的抗体。
所述荧光标志物包括但不限于异硫氰酸荧光素(fluorescein isothiocyanate，FITC)、藻红蛋白（PE）以及AlexaFluor系列染料等。本领域技术人员可以根据需要选择不同的荧光标志物。在一些实施方式中，对不同的单克隆抗体和/或第二抗体使用不同颜色的荧光标志物，从而对待检测的细胞进行区分和/或共定位。
将荧光标志物缀合至抗体的方法是本领域中已知的，例如经抗体赖氨酸侧链胺或经通过还原链内二硫键而活化的半胱氨酸巯基基团而进行缀合。荧光标志物缀合的抗体也是商购可得的，例如可由Abcam购得预染PE的抗Vimentin小鼠单抗(1:100, )、预染PE的抗Pan-CK小鼠单抗(1:100, Abcam)；可由Biolegend购得预染Alexa Fluor 647的抗CD45鼠单抗（1:20）；以及可由Thermo购得的偶联Alexa Fluor 488的羊抗兔抗体（1:1000）等。
试剂盒
本发明涉及用于诊断子宫内膜异位症的试剂盒，所述试剂盒包含用于从外周血样品富集循环内膜细胞以及特异性检测循环内膜细胞的工具和试剂，并且任选地包含介绍如何使用所述工具和试剂从外周血样品富集分离循环内膜细胞以及特异性检测循环内膜细胞的说明书。
在一个实施方式中，本发明的试剂盒包含循环内膜细胞特异性结合剂，其中所述循环内膜细胞特异性结合剂是与循环内膜细胞上的特异性抗原结合的单克隆抗体。
在一个实施方式中，所述特异性抗原是选自广谱细胞角蛋白（pan-cytokeratin，pan-CK）、波形蛋白（vimentin）、雌激素受体（Estrogen receptor，ER）、孕酮受体（progesterone receptor，PR）中的一种或多种。
在一个实施方式中，所述试剂盒包含抗-vimentin单克隆抗体、抗-pan-CK单克隆抗体、抗ER单克隆抗体和抗PR单克隆抗体。在一个实施方式中，所述试剂盒还包含抗CD45抗体。
在一个实施方式中，所述试剂盒还包含用以从待测样品捕获子宫内膜细胞的设备。在一个实施方式中，所述捕获子宫内膜细胞的设备是微流控芯片。优选地，所述微流控芯片为具有空间梯度排布的微柱的微流控芯片（Lv P. et al., 2013）。
诊断方法
本发明涉及用于辅助诊断有需要的对象的子宫内膜异位症的方法，所述方法包括以下步骤：从来自所述对象的外周血样品捕获循环内膜细胞；和对所捕获的细胞进行免疫荧光染色检测；其中循环内膜细胞的检出指示所述对象疑似患有子宫内膜异位症。
本发明的优点
使用CECs辅助诊断EM有诸多优势。首先，作为一种血液标志物，血样采集较为简便，是临床上医生和患者都较容易接受一种取样方式。第二，与CA125相比，CECs对EM的敏感性较高，不受疾病严重程度的影响。第三，检测结果不受月经周期的影响，患者就诊时可以即时进行检测，不用等待特定的月经周期。更重要的是，既往报道的EM生物标志物多为糖蛋白、细胞因子、非编码RNA等分子，只能反应疾病对机体某方面的影响。CECs作为完整的细胞，包涵了从基因、转录组到蛋白等各层面的综合信息，能够更全面的反应疾病的状态以及对机体的影响。CEC由外周血即可分离获得，可反映患者的病理状态，而不用通过手术获取病灶。因此，CECs检测可作为EM实时可重复的检测手段，用于疗效和复发的监测与随访。
本研究中我们建立的CECs检测方法不仅显著提升了敏感性，且特异性较高。采集外周静脉血，通过微流控芯片和免疫荧光染色鉴定血细胞中是否存在CEC，CEC的检出可用于包括1、2期在内EM的诊断，并适用于患者疗效和复发的监测和随访。我们选择广泛用于CTCs分离的微流控芯片，芯片内微柱成阶梯状排列，可高效(>90%)的分离并回收高纯度（约90%）的CTCs。因此，较小的上皮细胞和较大的间质细胞均可被捕获，不仅提高了敏感性，且可方便地直接在芯片内进行染色。
此外，我们选择的免疫荧光染色方案对内膜细胞有较好的特异性，其中pan-CK/vimentin是上皮及间质细胞表面分子，ER/PR在子宫内膜上皮细胞和间质细胞均有表达，表达率在90%以上，而CD45仅表达于白细胞表面，被广泛用于排除CTCs中的白细胞。我们的结果显示，EM患者中的CECs检出率达到89.5%，而卵巢癌中CECs均为阴性。考虑到卵巢癌病灶中也有ER/PR的表达，约30%-60%，因此我们对每例卵巢癌均行免疫组化验证，结果显示癌灶中ER及PR阴性或为<10%的弱阳，与检测结果基本相符。
附图说明
图1：荧光显微镜下观察到的微流控芯片中的CEC。明场中细胞周围为3个微柱，用于拦截细胞；从左向右依次为：经Dapi染色的细胞核（蓝色），CK/Vimentin阳性的细胞（橙色），ER/PR阳性的细胞（绿色）；CD45阴性排除白细胞。标尺为25um。
图2：CECs及血清CA125对EM的辅助诊断价值。CECs及血清CA125在卵巢良性肿物、健康对照组及EM各分期中的检出率。CECs检出率在I-II期和Ⅲ-Ⅳ期EM间无显著性差异（P=0.468），而与良性肿物组和健康对照组仍有显著性差异（P<0.001，卡方检验）。I-II期EM患者血清CA125阳性率显著低于Ⅲ-Ⅳ期患者（P=0.017），而与良性肿物组和健康对照组（P=0.609，方差分析）无显著性差异。
具体实施方式
实施例1：子宫内膜细胞样品采集
共招募59例入组者。44例患者因超声检出卵巢肿物于2015年10月-2016年7月在北京大学人民医院接受手术治疗。经腹腔镜和病理诊断，19例为EM，25例为非EM（包括16例其他卵巢良性肿物，4例为卵巢癌，5例其他卵巢良性肿物合并子宫腺肌症（表1）。其中EM组年龄为33.4±7.8岁（22-45岁），BMI为21.5±2.8（17.4-26.7），13例（68.4%）有痛经，13例（68.4%）处于增生期，6例（31.6%）处于分泌期，根据rAFS（revised Classification of theAmerican Society of Reproductive Medicine）判断EM分期。其中I-II 期5例（26.3%）、Ⅲ-Ⅳ期14例（73.7%）。此外，招募15例月经规律、盆腔超声正常、未接受手术的女性作为健康对照组。
所有入组者检测时未妊娠、未绝经，且未诊断有其他恶性肿瘤或有肿瘤病史，检测前3个月未使用甾体类激素。本研究经北京大学人民医院伦理委员会批准，所有入组者签署知情同意书。
患者在手术前一天用真空采血管（BD, 367983及367861）采集2管外周静脉血，第一管含促凝剂硅盐采集3.5ml用于分离血清，第二管含抗凝剂K2EDTA采集4ml用于分离CECs。健康志愿者主要在月经期经量最多的当天采血。血样采集后2小时内处理，第一管4°C2500g 离心10分钟收集血清并200ul分装，保存于-80°C待检测；第二管4°C 500g离心5分钟后弃上清，细胞加入冲洗缓冲液（1×PBS(Wisent)+1%牛血清(Wisent)+8mMEDTA (XilongChemical)）重悬，用于检测CECs。
实施例2：子宫内膜细胞的检测
将实施例1中采集的细胞悬液在注射泵的控制下以0.5ml/h的速度注入微流控芯片（LvP et al., 2013），通过空间梯度排布的微柱捕获子宫内膜细胞。应用免疫荧光染色的方法在芯片内对子宫内膜细胞进行鉴定。向芯片中注入4%多聚甲醛固定细胞20分钟，PBS冲洗后通入0.1% Triton X-100（Sigma）10分钟破膜，PBS冲洗后用10%牛血清（Wisent）封闭20分钟，然后注入一抗和DAPI (Life Technologies)，4°C孵育过夜，PBS冲洗后注入二抗室温孵育。使用荧光倒置显微镜（DM IL LED, Leica Microsystems）观察并采集图像。一抗使用如下：预染PE的抗Vimentin小鼠单抗(1:100, Abcam)、预染PE的抗Pan-CK小鼠单抗(1:100,Abcam)、抗ER兔单抗(1:100, Abcam)和抗PR兔单抗(1:200, Abcam)用于鉴定子宫内膜细胞，预染Alexa Fluor 647的抗CD45鼠单抗（1:20，Biolegend）用于排除白细胞。二抗为偶联Alexa Fluor 488的羊抗兔抗体（1:1000, Thermo）。
用SPSS22软件进行统计学分析。由Kolmogorov-Smirnov检验进行数据的正态性检验。年龄用均数±标准差表示；产次用中位数（范围）表示。各组间CECs检出率由卡方检验进行比较。当P<0.05时认为有统计学差异。试验结果如下：
1. CECs检出率
我们在59例入组者中检测了CECs（表2）。当细胞DAPI染色、Vimentin/Pan-CK、ER/PR均阳性，且CD45阴性时鉴定为CEC（图1）。在19例EM患者中，有17例检出CECs，检出率达89.5%，显著高于对照组(P<0.001)；在40例对照中，有6例检出CECs，检出率为15%。其中，3/15例健康对照、2/16例其他良性肿物、0/4例OC和1/5例腺肌症检出CECs。
2. CECs与月经周期
我们比较了对照组和EM组中不同月经周期CECs检出率的差异，以评估CECs与月经周期的关系（表3）。对照组中，3例月经期、1例增生期、2例分泌期女性检出CECs阳性，检出率分别为23.1%、6.3%、18.2%，无显著差异（P=0.425）。EM组中，12例增生期、5例分泌期女性检出CECs阳性，检出率分别为92.3%、83.3%，无显著差异（P=0.554）。
实施例3：CECs辅助诊断EM的价值
为了评估CECs是否可以作为辅助诊断的EM生物标志物，我们计算了在以其他良性肿物组和健康对照组为参照时，CECs的敏感性和特异性，并与血清CA125（>35U/mL时定义为检测阳性）进行了比较（图2）。
使用来自实施例1中相同对象的血清CA125检测作为对照。血清CA125由北京大学人民医院检验科应用电化学发光法，按照厂商给出的操作流程，使用糖类抗原125检测试剂盒（罗氏诊断）进行定量检测。检测系统为Cobase 411x型电化学发光全自动免疫分析系统（罗氏诊断）
用SPSS22软件进行统计学分析。由Kolmogorov-Smirnov检验进行数据的正态性检验。年龄用均数±标准差表示；产次用中位数（范围）表示。各组间CECs检出率和血清CA125的差异由卡方检验进行比较。当P<0.05时认为有统计学差异。
CECs可较好地区别EM患者与其他良性肿物患者和健康对照者，敏感性达89.5%(65.5-98.2%)，特异性分别为87.5% (60.4-97.8%)、80.0% (51.4-94.7%)；血清CA125敏感度仅68.4% (43.5-86.4%)，特异性分别为87.5% (60.4-97.8%)、73.3% (44.8-91.1%)。
我们进一步评估了CECs和血清CA125对不同严重程度EM的鉴别能力。CECs检出率在I-II期和Ⅲ-Ⅳ期EM患者中分别为80%（4/5）、92.9%（13/14），无显著性差异（P=0.468），与良性肿物组和健康对照组仍有显著性差异（P<0.001）（图2）。而血清CA125阳性率在I-II期和Ⅲ-Ⅳ期EM间有显著性差异（P=0.017），其中I-II期阳性率仅为20%，显著低于重度EM患者（85.7%），且与良性肿物组和健康对照组无显著性差异（P=0.609）（图2）。
由以上结果可知，CECs对EM有较好的敏感性与特异性，与CA125相比，CECs可更好的区别I-II EM，而且不受月经周期和疾病严重程度的影响，可用于EM的诊断、监测和随访。
参考文献
1. M Hirsch, JMN Duffy, CJ Davis, M Nieves Plana, KS Khan, "Diagnosticaccuracy of cancer antigen 125 for endometriosis: a systematic review andmeta-analysis", BJOG, Volume 123, Issue 11, October 2016, Pages 1761-1768.
2. Hyun KA, Lee TY, Jung HI, "Negative enrichment of circulating tumorcells using a geometrically activated surface interaction chip", Analytical Chemistry, 2013, 85(9): 4439-4445.
3. Kafali H, Artuc H, Demir N. "Use of CA125 fluctuation during themenstrual cycle as a tool in the clinical diagnosis of endometriosis; apreliminary report", Eur J Obstet Gynecol Reprod Biol. 2004 Sep 10; 116(1):85-8.
4. Nagrath S, Sequist LV, Maheswaran S, et al., "Isolation of rarecirculating tumor cells in cancer patients by microchip technology", Nature,2007, 450(7173): 1235-1239.
5. Peitao Lv, Zhewen Tang, Xingjie Liang, Mingzhou Guo, Ray P. S. Han, "Spatially gradated segregation and recovery of circulating tumor cells fromperipheral blood of cancer patients", Biomicrofluidics 2013; 2013, 7(3):530-533.
6. Sheng W, Chen T, Tan W, et al., "Multivalent DNA nanopheres forenhanced capture of cancer cells in microfluidic devices", ACS nano, 2013, 7(8): 7067-7076.
7. Vladimir B., Katarina K., Eduard K., "Circulating endometrial cells inperipheral blood", European Journal of Obstetrics & Gynecology and Reproductive Biology, 2014; 181:267-274。

Claims (10)

1.循环内膜细胞特异性结合剂在制备用于诊断子宫内膜异位症的试剂盒中的用途，其中所述循环内膜细胞特异性结合剂是与循环内膜细胞上的特异性抗原结合的单克隆抗体。
2.如权利要求1所述的用途，其中所述特异性抗原是选自pan-CK、波形蛋白、ER、PR中的一种或多种。
3.如权利要求1或2所述的用途，其中所述循环内膜细胞特异性结合剂为抗-波形蛋白单克隆抗体、抗-pan-CK单克隆抗体、抗ER单克隆抗体和抗PR单克隆抗体。
4.用于诊断子宫内膜异位症的试剂盒，其包含循环内膜细胞特异性结合剂，其中所述循环内膜细胞特异性结合剂是与循环内膜细胞上的特异性抗原结合的单克隆抗体。
5.如权利要求4所述的试剂盒，其中所述特异性抗原是选自pan-CK、波形蛋白、ER、PR中的一种或多种。
6.如权利要求4或5所述的试剂盒，其中所述试剂盒包含抗-波形蛋白单克隆抗体、抗-pan-CK单克隆抗体、抗ER单克隆抗体和抗PR单克隆抗体。
7.如权利要求4-6中任一项所述的试剂盒，其中所述单克隆抗体中的一种或多种是荧光标记的单克隆抗体，其用于通过免疫荧光染色法检测循环内膜细胞。
8.如权利要求4-7中任一项所述的试剂盒，其中所述试剂盒还包含抗CD45抗体。
9.如权利要求4-8中任一项所述的试剂盒，其中所述试剂盒还包含用以从待测样品捕获子宫内膜细胞的设备。
10.如权利要求9所述的试剂盒，其中所述样品是外周血样品。
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Cited By (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN108676874A (zh) * 2018-08-27 2018-10-19 复旦大学附属妇产科医院 循环外泌体长链非编码rna-tc0101441作为诊断子宫内膜异位症的标记物用途
CN109239030A (zh) * 2018-08-10 2019-01-18 北京莱尔生物医药科技有限公司 一种检测循环肿瘤细胞her2不同位点和er、pr的试剂盒及应用
RU2734840C1 (ru) * 2020-05-17 2020-10-23 Мекан Рахимбердыевич Оразов Способ оценки имплантационного потенциала эндометрия при эндометриоз-ассоциированном бесплодии
CN112946263A (zh) * 2021-01-28 2021-06-11 北京大学人民医院 用于鉴定外周血循环子宫内膜细胞的方法及应用
CN112946287A (zh) * 2021-01-28 2021-06-11 北京大学人民医院 用于诊断与外周血循环子宫内膜细胞异位定植相关疾病及其标志细胞的试剂盒
CN114002439A (zh) * 2021-12-21 2022-02-01 广州医科大学附属第三医院（广州重症孕产妇救治中心、广州柔济医院） 卵泡液中ks作为em诊断及妊娠结局评估标志物的应用

Citations (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN1331754A (zh) * 1998-10-30 2002-01-16 宝酒造株式会社 受内分泌扰乱子影响之基因的检测方法
CN1423692A (zh) * 2000-04-07 2003-06-11 雷文生物技术公司 人米勒管衍生上皮细胞及其分离和使用方法
US20030113746A1 (en) * 2001-12-18 2003-06-19 Gerhard Leyendecker Diagnosis of endometriosis from menstrual blood
CN101495156A (zh) * 2006-11-03 2009-07-29 伊佩尤斯生物技术公司 用于癌症和其他疾病的亲病灶性靶向基因递送系统
CN103237901A (zh) * 2010-03-01 2013-08-07 卡里斯生命科学卢森堡控股有限责任公司 用于治疗诊断的生物标志物
CN103298935A (zh) * 2007-08-15 2013-09-11 阿穆尼克斯公司 用于改善生物活性多肽性能的组合物和方法
CN105026934A (zh) * 2013-03-15 2015-11-04 詹森诊断器材有限责任公司 通过耗尽白血细胞富集循环肿瘤细胞

Patent Citations (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN1331754A (zh) * 1998-10-30 2002-01-16 宝酒造株式会社 受内分泌扰乱子影响之基因的检测方法
CN1423692A (zh) * 2000-04-07 2003-06-11 雷文生物技术公司 人米勒管衍生上皮细胞及其分离和使用方法
US20030113746A1 (en) * 2001-12-18 2003-06-19 Gerhard Leyendecker Diagnosis of endometriosis from menstrual blood
CN101495156A (zh) * 2006-11-03 2009-07-29 伊佩尤斯生物技术公司 用于癌症和其他疾病的亲病灶性靶向基因递送系统
CN103298935A (zh) * 2007-08-15 2013-09-11 阿穆尼克斯公司 用于改善生物活性多肽性能的组合物和方法
CN103237901A (zh) * 2010-03-01 2013-08-07 卡里斯生命科学卢森堡控股有限责任公司 用于治疗诊断的生物标志物
CN105026934A (zh) * 2013-03-15 2015-11-04 詹森诊断器材有限责任公司 通过耗尽白血细胞富集循环肿瘤细胞

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
VLADIMIR BOBEK, ET AL.: "Circulating endometrial cells in peripheral blood", 《EUROPEAN JOURNAL OF OBSTETRICS & GYNECOLOGY AND REPRODUCTIVE BIOLOGY》 *

Cited By (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN109239030A (zh) * 2018-08-10 2019-01-18 北京莱尔生物医药科技有限公司 一种检测循环肿瘤细胞her2不同位点和er、pr的试剂盒及应用
CN108676874A (zh) * 2018-08-27 2018-10-19 复旦大学附属妇产科医院 循环外泌体长链非编码rna-tc0101441作为诊断子宫内膜异位症的标记物用途
CN108676874B (zh) * 2018-08-27 2021-05-18 复旦大学附属妇产科医院 循环外泌体长链非编码rna-tc0101441作为诊断子宫内膜异位症的标记物用途
RU2734840C1 (ru) * 2020-05-17 2020-10-23 Мекан Рахимбердыевич Оразов Способ оценки имплантационного потенциала эндометрия при эндометриоз-ассоциированном бесплодии
CN112946263A (zh) * 2021-01-28 2021-06-11 北京大学人民医院 用于鉴定外周血循环子宫内膜细胞的方法及应用
CN112946287A (zh) * 2021-01-28 2021-06-11 北京大学人民医院 用于诊断与外周血循环子宫内膜细胞异位定植相关疾病及其标志细胞的试剂盒
CN114002439A (zh) * 2021-12-21 2022-02-01 广州医科大学附属第三医院（广州重症孕产妇救治中心、广州柔济医院） 卵泡液中ks作为em诊断及妊娠结局评估标志物的应用

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