CN105572353B - 一种用于检测肝癌标志物的抗体芯片试剂盒 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种用于检测肝癌标志物的抗体芯片试剂盒。该抗体芯片试剂盒包括：由玻片、软质硅胶垫、硬质框架、U形框夹形成反应槽，硬质框架划分为2×8或4×16个小格，形成16或64孔框架；其中，软质硅胶垫尺寸对应于所述硬质框架以及标准玻片；硬质框架的每个小格形成一个小的反应槽，各个小的反应槽里的标准玻片结合有相应浓度的特异性抗体；所述特异性抗体为针对选自如下8种肿瘤标志物的抗体：AFP、AFP‑L3、DCP、AFU、GP73、SCCA、CK19、VEGF。该试剂盒采用抗体芯片技术，能够同时检测8种肝癌标志物，避免传统单个指标检测方法样本使用量大、检测时间长的弊端，具有检测速度快、样本用量少、灵敏度高、稳定性好等优点。

Description

一种用于检测肝癌标志物的抗体芯片试剂盒

技术领域

本发明属于生物技术领域，涉及一种用于检测肝癌标志物的抗体芯片试剂盒。

背景技术

肝癌是临床上最常见的恶性肿瘤之一，全球发病率逐年增长，已超过62.6万/年，居于恶性肿瘤的第5位；死亡接近60万/年，位居肿瘤相关死亡的第3位。PLC在我国高发，目前，我国发病人数约占全球的55％；在肿瘤相关死亡中仅次于肺癌，位居第二。因此，肝癌严重威胁我国人民健康和生命。肝脏是人体最大的实质性器官，承担人体的各类重要代谢功能，因此，肝脏一旦出现恶性肿瘤将导致未及生命的严重后果。又由于肝脏具有丰富的血流供应，与人体的重要结构如下腔静脉、门静脉、胆道系统等关系密切；肝脏恶性肿瘤发病隐匿，侵袭性生长快速，其治疗甚为困难。因此，早期发现、早期诊断对肝癌的治疗及其重要。大量的研究已经证实，在肝癌患者的早期，血清中有数种分子水平已经发生了明显的变化，比如：AFP、AFP-L3、CK19、SCCA、DCP、GP73等明显上升。因此，通过对血清中这些分子水平的定量检查可以作为肝癌预测的一个有效手段。

AFP是目前诊断原发性肝癌最重要的肿瘤标记物,已被广泛用于肝癌的普查、诊断、判断治疗效果和预测复发中,但AFP的敏感性和特异性较差,据文献报道，阳性率仅为60-70％，并存在假阳性。

AFP-L3为AFP的异质体。有研究认为，AFP-L3比AFP具有更高的特异性，其敏感性和特异性分别为36至96％和89至94％。研究表明，AFP-L3与肝功能不佳，肿瘤低分化程度及生物学恶性行为相关。

细胞角蛋白19(CK19)表达于胆管上皮，肝脏干细胞，是胆管上皮标志物。CK19在恶性上皮细胞中，激活的蛋白酶加速了细胞角蛋白的降解，使得大量细胞角蛋白片段释放入血，可作为肿瘤鉴别诊断的参考指标，并能提未肿瘤的分化程度。

鳞状细胞癌抗原(SCCA)鳞状细胞癌抗原(SCCA)是从宫颈鳞状上皮细胞癌组织提取的肿瘤相关抗原TA-4，正常人血清含量极微＜2.5μg/L。SCCA是鳞癌的肿瘤标志物，适用于宫颈癌、肺鳞癌、食管癌、头颈部癌，膀胱癌的辅助诊断，治疗观察和复发监测。

异常凝血酶原(DCP)是产生于肿瘤细胞的不正常的凝血酶原，与正常凝血酶原相比,DCP的分子结构特点是其Gla domain结构域中的一个或多个Glu残基(Glu residus)没有被完全羧化(γ-carboxylated)成为Gla,从而失去凝血功能。大约50至60％的HCC患者DCP水平升高。由于肝病本身可以引起AFP水平的增高，但不能导致DCP水平的增高，所以DCP诊断HCC比AFP更特异。

高尔基蛋白73(GP73)是存在于高尔基体的一种跨膜蛋白。研究表明，在正常的人体肝组织中，GP73主要由胆管上皮细胞表达，而肝细胞表达很少甚至不表达。肝细胞受到病毒感染后可引起GP73的表达上调，在肝癌患者血清中GP73水平显著升高。GP73诊断肝癌的敏感性为69％，特异性为75％。

血管内皮生长因子(VEGF)，可在体内诱导血管新生(induce angiogenesis invivo)。VEGF对单核细胞和造骨细胞也是化学趋化因子。在体内，VEGF能诱导血管生成和增加血管渗透性。基于这些体外与体内的活性，VEGF被认为在伤口愈合、胚胎发育、固体瘤的生长与转移等过程有重要作用。

α-L岩藻糖苷酶(AFU)是一种溶酶体酸性水解酶，在HCC患者中其血清活性较肝硬化，慢性肝炎等良性肝病及健康对照组均有明显升高，诊断HCC的敏感性为75-90％，且与肿瘤大小无关，对直径小于2cm HCC的敏感性高于AFP，特异性为79-90％。

肝癌的早期的发现率低，主要与早期肝癌的症状不明显以及目前市场上缺乏有效的检测手段有关。目前，临床上肝癌的确诊主要通过影像学方法如PET-CT、病理活检来验证。PET-CT检查费用昂贵，而侵入性活检对患者来讲是极其痛苦的。因此，开发其它有效的检测手段是极其必要的。血清学检测已经成为临床诊断的一个常规手段。而且，大量的研究证实，在早期的肝癌患者体内相应的肿瘤标志物的水平明显上升。比如：AFP、DCP、AFP-L3、SCCA。所有的这些指标已经成为临床检测项目。然而，大量的回顾性研究已经发现，单个指标的肿瘤标志物对肿瘤的敏感性和特异性都是很低的，因此，通过多个指标的联合检测有可能提高肿瘤检测的敏感性和特异性。

发明内容

针对现有技术的不足，本发明的目的在于提供一种用于检测肝癌标志物的抗体芯片试剂盒，该试剂盒采用抗体芯片技术，能够同时检测8种肝癌标志物，避免传统单个指标检测方法样本使用量大、检测时间长的弊端，具有检测速度快、样本用量少、灵敏度高、稳定性好等优点，能在普通实验室推广和应用。

本发明一种检测肝癌标志物的抗体芯片试剂盒，包括：由用于点样的标准载玻片、用于防止漏液的软质硅胶垫、划分为若干个小格的硬质框架、U形框夹形成的反应槽，所述U形框夹从两侧将由下至上放置的尺寸对应的所述硬质框架、所述软质硅胶垫和所述标准载玻片夹紧在一起，以致所述标准载玻片贴紧封闭所述硬质框架的底部，使所述硬质框架上的每个小格形成一个小的反应槽，各个小的反应槽里的标准玻片结合有相应浓度的特异性抗体；所述硬质框架划分为2×8或4×16个小格，形成16或64孔框架；所述特异性抗体为针对选自如下8种肿瘤标志物的抗体：AFP、AFP-L3、DCP、AFU、GP73、SCCA、CK19、VEGF。

根据本发明所述的用于检测肝癌标志物的抗体芯片试剂盒的进一步特征，所述特异性抗体是采用以下步骤固定于玻片：

1)特异性抗体与含有1.4至2％酪蛋白的pH7.4磷酸盐缓冲液混合形成抗体混合物；

2)于抗体混合物中将每个抗体含量以0.01至2ng固定于所述点样孔，每个抗体设置2至4个重复孔；

3)抗体芯片点阵排布于玻片，玻片每平方厘米点10至100个特异性抗体。

根据本发明所述的用于检测肝癌标志物的抗体芯片试剂盒的进一步特征，所述玻片包括阳性对照孔和阴性对照孔；阳性对照孔为对应特异性抗体的具有相应浓度的生物素化IgG抗体，每个反应的生物素化的IgG抗体的浓度一致，以便于标准化检测；阴性对照孔为具有相应浓度的生物素化的无关抗体，每个反应的生物素化的无关抗体的浓度一致，以便于标准化检测。

根据本发明所述的用于检测肝癌标志物的抗体芯片试剂盒的进一步特征，所述样本处理液为包含蛋白酶抑制剂混合物的RIPA缓冲液，用于裂解细胞沉淀物，可处理血浆、血清、尿液、咽拭子、细胞培养物、组织等样本。

根据本发明所述的用于检测肝癌标志物的抗体芯片试剂盒的进一步特征，利用荧光素作为检测信号，通过比较未知样品和标准样本的信号来确定样品中的目标抗原的浓度。

根据本发明所述的用于检测肝癌标志物的抗体芯片试剂盒的进一步特征，利用Genepix Pro 6.1软件获取芯片上所有点的信号强度，利用电子表格版的分析软件计算每个蛋白的表达水平和标准曲线，利用阳性对照信号标准化，背景阈值设置对照组的平均强度加上2倍标准偏差(SD)进行统计，表达水平高于背景加上2×SD的蛋白用于校正的T检验分析。

根据本发明所述的用于检测肝癌标志物的抗体芯片试剂盒的进一步特征，采用全自动点样仪器，各特异性抗体蛋白质的排布可以按照实验设计需要进行调整，根据不同的蛋白质芯片排布阵列，控制全自动点样仪，制备出所需要的中间产品。

本发明采用了玻片式抗体芯片平台与定量抗体芯片平台。通过在标准大小的玻片上固定多个特异性捕获抗体，并用16或64孔的框架形成的多通量的芯片。所需样品量仅需50-100微升，约是膜芯片的十分之一。可应用于自动化操作，方便技术员一天完成几百个芯片的检测工作。采用激光扫描仪来检测荧光信号，荧光信号可维持数月，适用于蛋白浓度的定量分析。利用荧光素作为检测信号，通过比较未知样品和参考值的信号来确定样品中的未知因子的含量，其结果具有一致性和可靠性且节省时间和样品量。

本发明所述的用于检测肝癌标志物的抗体芯片试剂盒具有以下优点：采用本发明的早期肝癌的抗体芯片试剂盒，能够同时检测出8种肝癌相关蛋白，并且能够实现多样本多指标的并行检测，克服了现有技术操作繁琐、检测指标单一、需有费仪器、灵敏度低等缺陷，具有廉价、便利、灵敏、准确、高通量、标本用量少、能在普通实验室推广和规模化应用。

另外本发明的抗体芯片试剂盒所用到的将特异性抗体固定于玻片的方法，由于其采用了全自动点样仪，为实现检测早期肝癌的抗体芯片试剂盒的高通量、多位点提供了一种可能；另外，通过对在点样和包被过程中用到的玻片进行优选，也优化了抗体芯片试剂盒在灵敏度、准确性、高通量等方面的性能。

本发明采用的抗体芯片是多个夹心ELISA法同时进行定量检测的系统，它结合了ELISA法高特异性和灵敏度及芯片高通量的优势。通过在玻片上固定多个特异性捕获抗体，一次实验可定量检测至少上千个蛋白，检测样品体积仅需50～100微升。利用荧光素作为检测信号，通过比较未知样品和参考值的信号来确定样品中的未知因子的含量，其结果具有一致性和可靠性且节省时间和样品量。本发明同时采用了玻片式抗体芯片平台的优势。玻片式芯片是抗体预先固定在标准大小的玻片上，并用16或64孔的框架形成的多通量的芯片。玻片式芯片与膜芯片相比有以下优点：首先多个阵列在同一个标准大小玻璃片上，通量大大增加，其次，所需样品量更少，约是膜芯片的十分之一。最后，可应用于自动化操作，方便技术员一天完成几百个芯片的检测工作。玻片式芯片制作成本较低，价格比膜芯片便宜约20％，适合于膜芯片的样品都可以用于玻片式芯片。玻片式芯片激光扫描仪来检测荧光信号，几乎相同原理的扫描仪都可以使用。玻片式芯片荧光信号可维持数月，适用于蛋白浓度的定量分析。采用多种标志物组合方式，对于早期肝癌的辅助诊断及术后的疾病进展观察有积极的作用。

附图说明

图1是本发明所述试剂盒与电化学发光法试剂盒对于AFP抗体的检测结果的相关性比较图，其趋势方程为y＝4.494x-30.55，相关系数为0.965。

图2是本发明所述试剂盒与电化学发光法试剂盒对于AFP-L3抗体的检测结果的相关性比较图，其趋势方程为y＝4642x+92.42，相关系数为0.991。

图3是本发明所述试剂盒与电化学发光法试剂盒对于DCP抗体的检测结果的相关性比较图，其趋势方程为y＝119.8x-588.9，相关系数为0.980。

图4是本发明所述试剂盒与电化学发光法试剂盒对于AFU抗体的检测结果的相关性比较图，其趋势方程为y＝5.364x+104，相关系数为0.98。

图5是本发明所述试剂盒与电化学发光法试剂盒对于GP73抗体的检测结果的相关性比较图，其趋势方程为y＝6.925x+45.09，相关系数为0.943。

图6是本发明所述试剂盒与电化学发光法试剂盒对于SCCA抗体的检测结果的相关性比较图，其趋势方程为y＝7.172x+44.52，相关系数为0.962。

图7是本发明所述试剂盒与电化学发光法试剂盒对于CK19抗体的检测结果的相关性比较图，其趋势方程为y＝3.908x+124.7，相关系数为0.942。

图8是本发明所述试剂盒与电化学发光法试剂盒对于VEGF抗体的检测结果的相关性比较图，其趋势方程为y＝8.177x+54.54，相关系数为0.932。

图9显示本发明的试剂盒所用抗体的交叉反应结果。

图10是本发明所述抗体芯片试剂盒检测肝癌血清样本的结果示意图。

图11显示16孔固相载体硬质芯片框架结构图。

图12显示64孔固相载体硬质芯片框架结构图。

具体实施方式

为使本发明更加容易理解，下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。

实施例1：试剂盒的制备。

一、抗体的筛选和来源

以AFP抗体筛选举例，采用本抗体检测6份临床样本(临床样本的检测值已知，采用电化学发光法测得)，将临床样本检测值与本试剂盒的检测值对比画成散点图，其相关性如下：电化学发光检测结果与本试剂盒的检测结果基本相当。

以AFP抗体为例，采用本抗体检测6份临床样本(临床样本的检测值已知，采用电化学发光法测得，为光吸收峰值通过软件转化为数值)，将临床样本检测值与本试剂盒的检测值对比画成散点图(见图1)，其相关性如下：电化学发光检测结果与本试剂盒的检测结果基本相当。

对于其他抗体，方法同AFP。将临床样本检测值与本试剂盒的检测值对比画成散点图，见图2至图8。

AFP临界值为20ng/ml，AFP-L3临界值为10％，DCP临界值为40m AU/ml，GP73临界值为150ug/ml，SCCA临界值为2ug/ml，VEGF临界值为200pg/ml，AFU临界值为38U/L，CK19临界值为2.2ug/ml。

二、特异性抗体的筛选：

从以下8种肝癌肿瘤标志物中筛选可以将其对应抗体组合在一起，并通过全自动点样仪将特异性抗体固定在玻片上，从而实现在一个小的方阵内同时检测多个指标。

各特异性抗体采用美国伯乐公司或铂金艾尔默公司生产的全自动点样仪器固定于玻片。而在具体的操作过程中，各特异性抗体蛋白质的排布可以按照实验设计需要进行调整，根据不同的蛋白质芯片排布阵列，控制全自动点样仪，制备出所需要的中间产品。

将8种肝癌肿瘤标志物相应抗体按照图2所示点样示意图进行点样。采用全自动点样仪进行点样，具体方法为：

1)特异性抗体与含有1.4～2％酪蛋白的pH7.4磷酸盐缓冲液混合形成抗体混合物。

2)于抗体混合物中将每个抗体含量以0.01～2ng固定于所述点样孔，每个抗体设置2至4个重复孔。

3)抗体芯片点阵排布于玻片。

准备两个固定有8种肝癌肿瘤标志物相应抗体的芯片，左边的芯片中加入肿瘤组织样本裂解液，左边的芯片中加入正常组织样本裂解液。具体操作如下：

1、玻片芯片的完全干燥：将玻片芯片从盒子中取出来，在室温平衡20～30min后，将包装袋打开，揭开密封条，然后将芯片放在真空干燥器或者室温干燥1～2小时。

2、芯片操作流程：每个孔中加50～100μl的样品，组织裂解液经蛋白浓度测定后加入50～500ug/ml的量。

3、清洗：抽去每个孔中的样品，洗涤液清洗5次，每次5min室温摇床震荡，每孔150μl的1×洗涤液，每次清洗要抽干净洗液，用去离子水稀释20×洗涤液。

4、检测抗体混合物的孵育：离心检测抗体混合物小管，然后加入1.4ml的样品稀释液，混合均匀后再次快速离心。添加80μl的检测抗体到每个孔中，室温摇床上孵育2小时。

5、清洗：抽去每个孔中的检测抗体，洗涤液清洗5次，每次5min室温摇床震荡，每孔150μl的洗涤液，每次清洗要抽干净洗液。

6、Cy3-链霉亲和素的孵育：离心Cy3-链霉亲和素小管，然后加入1.4ml的样品稀释液，混合均匀后再次快速离心。添加80μl的Cy3-链霉亲和素到每个孔中，用铝箔纸包住玻片避光孵育，室温摇床上孵育1个小时。

7、清洗：抽去每个孔中的Cy3-链霉亲和素，洗涤液清洗5次，每次5min室温摇床震荡，每孔150μl的洗涤液，每次清洗要抽干净洗液。

8、荧光检测

8.1将玻片框架拆掉，小心不要用手接触到玻片印制抗体的一面。

8.2将玻片放置在玻片清洗管中，添加约30ml的洗涤液，能整个覆盖住玻片，在室温摇床上震荡15min，弃去洗涤液。

8.3去除玻片的残留洗液。将玻片放置在玻片清洗管/干燥管中，不盖盖子，在1000rpm离心3min。

8.4采用激光扫描仪例如Axon GenePix扫描信号，采用Cy3或者绿色通道(激发频率＝532nm)。

9、芯片的数据提取以及用分析软件来进行数据分析。

检测结果见图片，由结果可知，AFP、AFP-L3、DCP、AFU、GP73、SCCA、CK19、VEGF。相应抗体的检测浓度发生了变化，其中AFP、GP73、SCCA、CK19、VEGF变化较显著，而FER变化不显著。

因此，本发明所述芯片试剂盒上固定的特异性抗体可以选自AFP、AFP-L3、DCP、AFU、GP73、SCCA、CK19、VEGF蛋白之特异性抗体中的多种。

三、试剂盒的化学组份

固相载体：已包被抗体的标准玻片，玻片为美国康宁公司产品。

洗涤液：含吐温20的20X浓缩洗涤液。1×洗涤液为pH 7.2的0.1mol/L的磷酸盐缓冲液，含0.1％吐温20。

稀释液：2瓶用于稀释样本的15ml 5×浓缩稀释液D，1瓶用于稀释抗体和HRP-链亲和素的15ml 5×浓缩稀释液B。

1×稀释液B为15mM,pH7.4的PBS缓冲液，溶质及其在所述稀释液B中的质量浓度或摩尔浓度或体积浓度如下：0.5％酪蛋白，2-4％蔗糖，150mM NaCl。

1×稀释液D为15mM,pH6.5的PBS缓冲液，溶质及其在所述标本稀释液中的质量浓度或摩尔浓度或体积浓度如下：2-4％蔗糖，150mM NaCl。

检测抗体：生物素化的检测抗体混合物，为上述8种抗体的混合物。

200μl 300×浓缩荧光素-链亲和素溶液。

样本处理液：2X细胞裂解液10ml，包含10mM pH 7.5，Tris.HCl，25mM NaCl，1％脱氧胆酸钠，1％Triton X-100，包含磷酸酶及蛋白酶抑制剂。

实施例2：本发明所述的试剂盒用于检测肝癌肿瘤标志物的实验。

1、玻片芯片的完全干燥

从本发明所述的肝癌标志物检测抗体芯片试剂盒中取出抗体芯片。

该抗体芯片的框架可以有两种，如果一个抗体点4个孔(即4个重复)，可采用2×8芯片框架；如果一个抗体点2个孔，可采用4×16芯片框架。

将玻片芯片在室温平衡20-30min后，将包装袋打开，揭开密封条，然后将芯片放在真空干燥器或者室温干燥1-2小时。

2、芯片操作流程

每个孔中加50-100μl的样品，不同样品的加样量不一样：血浆、血清使用前用样品稀释液1：1稀释；细胞上清液可用原液；细胞或组织裂解液经蛋白浓度测定后加入50-500ug/ml的量。

3、清洗

抽去每个孔中的样品，洗涤液清洗5次，每次5min室温摇床震荡，每孔150μl的1×洗涤液，每次清洗要抽干净洗液，用去离子水稀释20×洗涤液。

4、检测抗体混合物的孵育

离心检测抗体混合物小管，然后加入1.4ml的样品稀释液，混合均匀后再次快速离心。添加80μl的检测抗体到每个孔中，室温摇床上孵育2小时。

5、清洗

抽去每个孔中的检测抗体，洗涤液清洗5次，每次5min室温摇床震荡，每孔150μl的洗涤液，每次清洗要抽干净洗液。

6、Cy3-链霉亲和素的孵育

离心Cy3-链霉亲和素小管，然后加入1.4ml的样品稀释液，混合均匀后再次快速离心。添加80μl的Cy3-链霉亲和素到每个孔中，用铝箔纸包住玻片避光孵育，室温摇床上孵育1个小时。

7、清洗

抽去每个孔中的Cy3-链霉亲和素，洗涤液清洗5次，每次5min室温摇床震荡，每孔150μl的洗涤液，每次清洗要抽干净洗液。

8、荧光检测

1)将玻片框架拆掉，小心不要用手接触到玻片印制抗体的一面。

2)将玻片放置在玻片清洗管中，添加约30ml的洗涤液，能整个覆盖住玻片，在室温摇床上震荡15min，弃去洗涤液。

3)去除玻片的残留洗液。将玻片放置在玻片清洗管/干燥管中，不盖盖子，在1000rpm离心3min。

4)采用激光扫描仪例如Axon GenePix扫描信号，采用Cy3或者绿色通道(激发频率＝532nm)。

9、芯片的数据提取以及用分析软件来进行数据分析。

利用Genepix Pro 6.1软件获取芯片上所有点的信号强度。利用开发的电子表格版的分析软件计算每个蛋白的表达水平和标准曲线。芯片数据均利用阳性对照信号标准化。背景阈值设置对照组的平均强度加上2倍标准偏差(SD)，所用的对照组是由无血清样本或标准蛋白芯片实验得到的。如果样本中某一特异标志5物的信号强度低于背景阈值，则不再对此标志物做进一步分析。

为了检测癌症及对照样本中的蛋白质表达差异，使用SSPS统计软件做校正后的T检验分析。为了进一步的分类研究，每个标志物的统计显著性阈值被设为P<0.05。正态分布用柯尔莫哥洛夫-斯米尔诺夫检验和夏皮罗-威尔克检验(SSPS统计软件)分析。正态分布被定为P>0.05。抗体芯片上的高度相关的标志物被筛选用于层序聚类分析。回归分析被用于检验抗体芯片和其它方法(Western blot和ELISA)所得的数据的相关性和显著性。表达水平高于背景加上2xSD的蛋白用于校正的T检验分析。为了分析样品是否符合正态分布，柯尔莫哥洛夫-斯米尔诺夫(Kolmogorov-Smirnova)检验和夏皮罗-威尔克(Shapiro-Wilk)检验均用于分析癌症组及对照组。

实施例3：本发明的试剂盒所用抗体的检测灵敏度与抗体的交叉反应结果

一本发明的试剂盒所用抗体的检测灵敏度

具体操作参照实施例2，采用各抗原按梯度稀释求得试剂盒的最低检测限及线性范围。

表2：本发明的试剂盒中8种抗体的检测灵敏度

二、本发明的试剂盒所用抗体的交叉反应结果

具体操作参照实施例2，检测抗体分别为抗AFP抗体,抗CK19抗体,抗VEGF抗体,抗DCP抗体，抗SCCA抗体以及这五个抗体的混合物。抗体对的交叉反应测试结果如图9所示。

由结果可知，每种抗体对可以特异地识别自己的检测抗原，而与其他的抗原没有交叉反应。

实施例4：本发明所述试剂盒的应用

a)本发明选用8种抗体点阵的试剂盒检测肝癌血清样品

具体操作步骤如下：

玻片芯片的完全干燥，将玻片芯片从盒子中取出来，在室温平衡20-30min后，将包装袋打开，揭开密封条，然后将芯片放在真空干燥器或者室温干燥1-2小时。

每个芯片孔中加入100μL样品，一个阵列一个样品，4℃振荡过夜孵育。(样品离心14000rpm 4min，样品0.5mg/ml上样)

使用Thermo Scientific Wellwash Versa芯片洗板机清洗玻片，首先用1×洗液进行清洗，每孔250μl洗液I，清洗6次，每次震荡10s，震荡强度选择高。

配制生物素标记抗体，快速离心生物素标记抗体的小管，每个小管加入300μL的1×抗体稀释液，混合均匀。每孔加入70ul生物素标记抗体；室温震荡孵育2个小时。

清洗，清洗步骤同上。

每孔加入70μl的1500倍稀释的荧光剂-链霉亲和素(快速离心后加入1.5ml的封闭液到荧光剂-链霉亲和素的小管)，用密封条贴住玻片，然后用铝箔纸包住玻片避光室温震荡孵育1-2个小时。(此步也可在4℃过夜孵育)

清洗，清洗步骤同上。

采用激光扫描仪例如Axon GenePix扫描信号，采用Cy3或者绿色通道(激发频率＝532nm)，扫描仪器为GenePix 4000B Microarray Scanner，扫描参数：PMT：700，Wavelengh(波长)：532nm；Resolution(分辨率)：42um。

采用芯片分析软件提取数据进行分析。

检测了三个肝癌血清样本，标示为T1、T2和T3；同时采用健康人血清样本作为正对照，标示为N1，采用不加血清样本为负对照，标示为Cont。检测结果见图10。

该抗体芯片的点样示意图如下表3：

表3：

POS	GP73
		AFP	SCCA
APF-L3	CK19
		FER	DCP
AFU	VEGF
		POS	NEG

抗体的位置和点样的数量可根据要求进行调整。

由图10可见，在检测T1肝癌血清样品后，其GP73、AFP、AFP-L3、CK19，AFU抗体点样孔的亮度明显高于对照组及正常人组。同样，检测T2肝癌血清样品后，其AFP、CK19、DCP、VEGF抗体点样孔的亮度明显高于对照组及正常人组；检测T3肝癌血清样品后，其AFP、DCP、VEGF抗体点样孔的亮度明显高于对照组及正常人组。而FER抗体点样孔无论是癌症组还是正常人组的亮度相似。由此可知，不选用FER作为试剂盒的抗体。

铁蛋白(FER)是一种铁结合蛋白，存在于各组织，病理状态下释放入血液中，在多种癌症患者血液中，均有不同程度的阳性率，肝癌患者的阳性率在70％以上，所以可辅助诊断肝癌。但并不是所有抗铁蛋白抗体都能应用于辅助诊断。b)本实施例选用8种抗体点阵的组合检测临床样本以测试本发明所述抗体芯片试剂盒的灵敏度与特异性：

选用肝癌组200例(所有病例均行外科病理及影像学检查证实为肝癌)、健康对照组100例，采用本发明所述的试剂盒对比各肿瘤标志物与芯片组合的数据，计算各肿瘤标志物对肝癌检测的灵敏度与特异性。

操作步骤严格按照实施例2进行。

表4：本发明所述抗体芯片试剂盒的灵敏度与特异性

结果判断：AFP临界值为20ng/ml，AFP-L3临界值为10％，DCP临界值为40m AU/ml，GP73临界值为150ug/L，SCCA临界值为2ug/L，VEGF临界值为200pg/ml，AFU临界值为38U/L，CK19临界值为2.2ug/L。

检测值以＞阳性临界值上限为判断标准。

敏感性＝阳性数/(阳性数+假阴性数)×100％。

特异性＝阴性数/(阴性数+假阳性数)×100％。

敏感度与特异性应用SPSS11.0统计软件包处理所获数据，组间均数比较用t检验，计数资料采用χ2检验，计量数据采用方差分析，P＜0.05为差异有统计学意义。

Claims (5)

1.一种检测肝癌标志物的抗体芯片试剂盒，其特征在于，包括：由用于点样的标准载玻片、用于防止漏液的软质硅胶垫、划分为若干个小格的硬质框架、U形框夹形成的反应槽，所述U形框夹从两侧将由上至下放置的尺寸对应的所述硬质框架、所述软质硅胶垫和所述标准载玻片夹紧在一起，以致所述标准载玻片贴紧封闭所述硬质框架的底部，使所述硬质框架上的每个小格形成一个小的反应槽，各个小的反应槽里的标准载玻片结合有相应浓度的特异性抗体；

所述硬质框架划分为2×8或4×16个小格，形成16或64孔框架；

所述特异性抗体为如下8种肿瘤标志物的抗体组合：AFP、AFP-L3、DCP、AFU、GP73、SCCA、CK19、VEGF；

所述特异性抗体是采用以下步骤固定于载玻片：

1)特异性抗体与含有1.4至2％酪蛋白的pH7.4磷酸盐缓冲液混合形成抗体混合物；

2)于抗体混合物中将每个抗体含量以0.01至2ng固定于点样孔，每个抗体设置2至4个重复孔；

3)抗体芯片点阵排布于载玻片，载玻片每平方厘米点10至100个特异性抗体；

所述载玻片包括阳性对照孔和阴性对照孔；阳性对照孔为对应特异性抗体的具有相应浓度的生物素化IgG抗体，每个反应的生物素化的IgG抗体的浓度一致，以便于标准化检测；阴性对照孔为具有相应浓度的生物素化的无关抗体，每个反应的生物素化的无关抗体的浓度一致，以便于标准化检测。

2.根据权利要求1所述的检测肝癌标志物的抗体芯片试剂盒，其特征在于：所述试剂盒还包括样本处理液，所述样本处理液为包含蛋白酶抑制剂混合物的RIPA缓冲液，用于裂解细胞沉淀物，可处理血浆、血清、尿液、咽拭子、细胞培养物或组织样本。

3.根据权利要求1所述的检测肝癌标志物的抗体芯片试剂盒，其特征在于，利用荧光素作为检测信号，通过比较未知样品和标准样本的信号来确定样品中的目标抗原的浓度。

4.根据权利要求1所述的检测肝癌标志物的抗体芯片试剂盒，其特征在于，利用GenepixPro6.1软件获取芯片上所有点的信号强度，利用电子表格版的分析软件计算每个蛋白的表达水平和标准曲线，利用阳性对照信号标准化，背景阈值设置对照组的平均强度加上2倍标准偏差(SD)进行统计，表达水平高于背景加上2×SD的蛋白用于校正的T检验分析。

5.根据权利要求1所述的检测肝癌标志物的抗体芯片试剂盒，其特征在于，采用全自动点样仪器，各特异性抗体蛋白质的排布可以按照实验设计需要进行调整，根据不同的蛋白质芯片排布阵列，控制全自动点样仪，制备出所需要的中间产品。