CN105572354B - 一种检测早期胃癌的抗体芯片试剂盒 - Google Patents
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Abstract
本发明属于芯片检测技术领域，具体公开了一种检测早期胃癌的抗体芯片试剂盒。本发明所述试剂盒的固相载体上固定了多种胃癌标志物相关抗体，这些特异性抗体是从35种常规的胃癌标志物相关抗体中筛选得出的。本发明所述试剂盒能同时检测多个胃癌相关抗原蛋白。其中组合后的抗体芯片比采用单个肿瘤标志物的检测效果好。
Description
技术领域
本发明涉及芯片检测技术领域，具体涉及一种检测早期胃癌的抗体芯片试剂盒。
背景技术
我国是胃癌的高发区，发病率高达40/10万，仅次于肺癌，已经跃居中国癌症发病率的第二位。在中国，每年新增胃癌患者达40万人；占到全世界发病人数的42%；患病率和死亡率均是世界平均水平的两倍多；近5年来19岁至35岁青年人胃癌的发病率比30年前翻了一番。在世界范围内，胃癌也是最为常见的癌症之一，具有很高的死亡率。因此，对胃癌的诊断与治疗在医疗领域是一个重大的工程。目前在胃癌的综合治疗方案中，手术占据主导地位，早期胃癌手术5年后的生存率可达95%，可见胃癌的早前诊断对胃癌的治疗及其重要。然而，在中国对胃癌的早期诊断，并及时进行手术治疗所占的比例非常低，尽管中日胃癌人群发病率相当，但日本的早期胃癌发现率和手术率均已超过50％，中国该两项数据则均低于5％。由此可见，在中国对胃癌的早期诊断并及时进行手术治疗对胃癌的防治工程具有重大意义。大量的研究已经证实，在胃癌患者的早期，血清中有数种分子水平已经发生了明显的变化，比如：CEA、CA199， CA72-4，PGI/PGII明显上升。因此，通过对血清中这些分子水平的定量检查可以作为胃癌预测的一个有效手段。为了增加预测的敏感性和特异性，将多个指标联合起来诊断是一个很好的办法。比如联合采用CEA、CA242、CA72-4可以提高预测的敏感性和特异性。原来的芯片上的指标都是比较经典的指标，新近又有两个指标通过临床验证具有很好的诊断价值，比如：PGI、PGII。添加这两个指标更具有临床价值。蛋白芯片技术，可以在一个极小的微阵列内同时检测上百个指标，具有检测速度快、样本用量少、灵敏度高、稳定性好等优点，是用来开发这种多指标同时检测的最优技术选择。
胃癌的早期的发现率低，主要与早期胃癌的症状不明显以及目前市场上缺乏有效的检测手段有关。目前，临床上胃癌的确诊都要通过胃镜来验证。胃镜检查，不仅费用高，而且对患者来讲是及其痛苦的。因此，开发其它有效的检测手段是及其必要的。血清学检测已经成为临床诊断的一个常规手段。而且，大量的研究证实，在早期的胃癌患者体内相应的肿瘤标志物的水平明显上升。比如以下肿瘤标志物：
| 蛋白简称 | 中文译名 |
| HCG beta | 绒毛膜促性腺激素beta亚单位 |
| IL-1beta | 干扰素1beta亚单位 |
| MCP1 | 单核细胞趋化蛋白1 |
| RANTES | 受激活调节正常T细胞表达和分泌因子 |
| IGFBP2 | 胰岛素样生长因子结合蛋白2 |
| AEG-1 | 星形胶质细胞升高基因1蛋白 |
| ApoA1 | 载脂蛋白 A1 |
| PGII | 胃蛋白酶原2 |
| IL-6 | 干扰素6 |
| MCP3 | 单核细胞趋化蛋白3 |
| MMP1 | 基质金属蛋白酶1 |
| TNF-alpha | 肿瘤坏死因子alpha |
| ADAM10 | 整合素样金属蛋白酶10 |
| CEA | 癌胚抗原 |
| CK19 | 细胞角蛋白19 |
| IL-11 | 干扰素11 |
| MCP4 | 单核细胞趋化蛋白4 |
| MMP7 | 基质金属蛋白酶7 |
| GMCSF | 粒细胞集落刺激生物因子 |
| ADAM17 | 解聚素金属蛋白酶17 |
| CA199 | 糖类抗原199 |
| CA72-4 | 糖类抗原72-4 |
| IL-8 | 干扰素8 |
| VEGF | 血管内皮生长因子 |
| MMP9 | 基质金属蛋白酶9 |
| VDBP | 维生素D结合蛋白 |
| Nardilysin | N-精氨酸二元转化酶 |
| PGI | H3K4二甲基化识别蛋白 |
| CA242 | 糖类抗原242 |
| IL-18 | 干扰素18 |
| NGAL | 中性粒细胞明胶酶相关脂质运载蛋白 |
| TIMP-1 | 基质金属蛋白酶组织抑制剂1 |
| TTR | 转甲状腺素蛋白 |
| ProApoA1 | 前载脂蛋白A-1 |
| CA50 | 糖类抗原50 |
所有的这些指标已经成为临床检测项目。然而，大量的回顾性研究已经发现，单个指标的肿瘤标志物对肿瘤的敏感性和特异性都是很低的，比如：通过多个指标的联合检测可以大大提高肿瘤检测的敏感性和特异性。因此，开发一种可以同时检测多个指标的方法，避免传统单个指标检测方法样本使用量大，检测时间长的弊端是非常必要的。蛋白芯片可以在一个小的方阵内同时检测多个指标，因此为实现本目标提供了一个极佳的技术支持。
发明内容
本发明的目的在于提供一种高通量、高灵敏度、高特异性和低成本的早期胃癌检测试剂盒，具体为采用抗体芯片技术，能够同时检测5个胃癌肿瘤标志物，克服了现有技术操作繁琐、检测指标单一、灵敏度低等缺陷，具有廉价、便利、灵敏、准确、高通量、标本用量少、能在普通实验室推广和规模化等优点。
本发明的目的通过以下技术方案予以实现：
一种检测早期胃癌的抗体芯片试剂盒，所述试剂盒由固相载体、洗涤液、稀释液、检测抗体、荧光素-链霉亲和素溶液、样本处理液组成，其中，固相载体上固定多种胃癌标志物相关特异性抗体，所选特异性抗体是从35种肿瘤标志物相关抗体中筛选得到；所述35种胃癌肿瘤标志物为：CEA，CA242，IL-1beta，IL-6，CA72-4，IL-11，IL-8，IL-18，PGI，PGII，MCP1，MCP3，MCP4，CK19，VEGF，NGAL，RANTES，MMP1，MMP7，MMP9，TIMP-1，IGFBP2，TNF-alpha，GMCSF，VDBP，TTR，AEG-1，ADAM10，ADAM17，Nardilysin，ProApoA1，ApoA1，HCG beta，CA50，CA199。
作为优选实施方式，所述固相载体上固定的多种胃癌标志物相关特异性抗体选自以下32种胃癌标志物相关抗体中的多种或全部；CEA ，CA242，IL-1beta，IL-6，CA72-4， IL-8，IL-18，PGI，PGII，MCP1，MCP3，MCP4，CK19,VEGF，NGAL，RANTES，MMP1，MMP7，MMP9，TIMP-1，IGFBP2，TNF-alpha，GMCSF，VDBP，TTR， ADAM10，ADAM17，Nardilysin，ProApoA1，ApoA1，CA50，CA199。
更优选地，所述固相载体上固定5种胃癌标志物相关特异性抗体，5种胃癌标志物相关特异性抗体为CEA、CA199， CA72-4，PGI，PGII蛋白之抗体。
优选地，所述固相载体由玻片，软质硅胶垫，硬质框架，U形框夹形成反应槽，硬质框架划分为2X8或16X4个小孔，形成16或64孔框架。软质硅胶垫尺寸对应于所述硬质框架以及标准玻片，硬质框架的每个小格形成一个小的反应槽，各个小的反应槽里的标准玻片结合有相应浓度的特异性抗体。
优选地，所述胃癌标志物的特异性抗体通过全自动点样仪完成点样操作，将特异性抗体固定在载体上。
更优选地，所述全自动点样仪点样操作，包括以下步骤：
1）特异性抗体与含有1.4至2 %酪蛋白的pH7.4磷酸盐缓冲液混合形成抗体混合物。
2）于抗体混合物中将每个抗体含量以0.01至2ng固定于所述点样孔，每个抗体设置2至4个重复孔。
3）抗体芯片点阵排布于玻片，玻片每平方厘米点5至35种特异性抗体。各特异性抗体的排布可以按照实验设计需要进行调整，根据不同的抗体芯片排布阵列， 通过控制全自动点样仪，制备出所需要的中间产品。
所述样本处理液，用于裂解细胞沉淀物，包含蛋白酶抑制剂混合物的RIPA缓冲液。所用样本可为血浆，血清，尿液，细胞培养物，组织。
本发明所述检测早期胃癌的芯片试剂盒，通过改良的夹心酶联免疫吸附法测定胃癌肿瘤标志物，所述的特异性抗体与样品中的目标抗原结合，经过筛选的检测抗体与目标抗原的另一区域结合形成稳定的化合物。本发明试剂盒能同时检测5至35个胃癌相关抗原蛋白。其中组合后的抗体芯片比采用单个肿瘤标志物的检测效果好。
所述玻片还包括阳性对照孔和阴性对照孔；阳性对照孔为对应特异性抗体的具有相应浓度的生物素化IgG抗体，每个反应的生物素化的IgG抗体的浓度一致，以便于标准化检测；阴性对照孔为具有相应浓度的生物素化的无关抗体，每个反应的生物素化的无关抗体的浓度一致，以便于标准化检测。
本发明所述试剂盒，利用荧光素作为检测信号，通过比较未知样品和标准样本的信号来确定样品中的目标抗原的浓度。
本发明所述试剂盒，利用Genepix Pro 6.1软件获取芯片上所有点的信号强度，利用自行开发的电子表格版的分析软件计算每个蛋白的表达水平和标准曲线，利用阳性对照信号标准化，背景阈值设置对照组的平均强度加上2倍标准偏差（SD）进行统计，表达水平高于背景加上2xSD的蛋白用于校正的T检验分析。
与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：
本发明采用的抗体芯片是多个夹心ELISA法同时进行定量检测的系统，它结合了ELISA法高特异性和灵敏度及芯片高通量的优势。通过在玻片上固定多个特异性捕获抗体，一次实验可定量检测至少上千个蛋白，检测样品体积仅需50~100微升。利用荧光素作为检测信号，通过比较未知样品和参考值的信号来确定样品中的未知因子的含量，其结果具有一致性和可靠性且节省时间和样品量。
本发明同时采用了玻片式抗体芯片平台的优势。玻片式芯片是抗体预先固定在标准大小的玻片上，并用16或64孔的框架形成的多通量的芯片。玻片式芯片与膜芯片相比有以下优点：首先多个阵列在同一个标准大小玻璃片上，通量大大增加，其次，所需样品量更少，约是膜芯片的十分之一。最后，可应用于自动化操作，方便技术员一天完成几百个芯片的检测工作。玻片式芯片制作成本较低，价格比膜芯片便宜约20%，适合于膜芯片的样品都可以用于玻片式芯片。玻片式芯片激光扫描仪来检测荧光信号， 几乎相同原理的扫描仪都可以使用。玻片式芯片荧光信号可维持数月，适用于蛋白浓度的定量分析。
附图说明
图1固相载体结构图。
图2. 35种胃癌肿瘤标志物相应抗体点样示意图。
图3. 35种胃癌肿瘤标志物相应抗体包被芯片的检测结果。
图4.CEA, CA199, PGI, PGII, CA72-4相应抗体点样示意图。
图5.试剂盒CEA抗体与电化学发光法试剂盒检测结果的相关性比较。
图6.试剂盒CA72-4抗体与电化学发光法试剂盒检测结果的相关性比较。
图7.试剂盒CA199抗体与电化学发光法试剂盒检测结果的相关性比较。
图8.试剂盒PGI抗体与电化学发光法试剂盒检测结果的相关性比较。
图9.试剂盒PGII抗体与电化学发光法试剂盒检测结果的相关性比较。
图10.实施例2所述试剂盒各抗体的交叉反应。
图11.试剂盒检测胃癌血清样本和正常血清样本的结果，T1和 T1为胃癌血清样，N1和N2为正常血清样本。
图12. 32种胃癌标志物的抗体点样示意图。
具体实施方式
下面结合具体实施例进一步详细说明本发明。除非特别说明，本发明采用的试剂、设备为本技术领域常规试剂和设备。
实施例中所使用到的全自动点样仪为美国铂金艾尔默公司生产的产品；玻片为美国康宁公司产品。当然实施例中仪器和材料的采用并不局限于本实施例的列举，而是以能够解决本发明的技术问题，并实现相应的技术效果为依据。
实施例1
检测早期胃癌的抗体芯片试剂盒的制备。
一、试剂盒的组份
1、固相载体：由玻片，软质硅胶垫，硬质框架，U形框夹形成反应槽，硬质框架划分为2X8或者4X16个小孔，形成16或64孔框架（见图1）。其中软质硅胶垫尺寸对应于所述硬质框架以及标准玻片。硬质框架的每个小格形成一个小的反应槽，各个小的反应槽里的标准玻片结合有相应浓度的特异性抗体。
2、洗涤液：含吐温20的20X浓缩洗涤液。1X洗涤液为pH 7.2，含0.1%吐温20、0.1mol/L的磷酸盐缓冲液。
3、稀释液：2瓶用于稀释样本的15ml 5X浓缩稀释液D，1瓶用于稀释抗体和HRP-链亲和素的15ml 5X浓缩稀释液B。1X稀释液B为15mM， pH7.4的PBS缓冲液，溶质及其在所述稀释液B中的质量浓度或摩尔浓度或体积浓度如下：0.5%酪蛋白，2-4%蔗糖，150 mM NaCl。1X稀释液D为15mM, pH6.5的PBS缓冲液，溶质及其在所述标本稀释液中的质量浓度或摩尔浓度或体积浓度如下： 2-4%蔗糖，150 mM NaCl。
4、检测抗体：生物素化的检测抗体混合物。
5、200µl 300X浓缩荧光素-链亲和素溶液。
6、样本处理液：2X细胞裂解液10ml。
二、特异性抗体的筛选：
从以下35种胃癌肿瘤标志物中筛选可以将其对应抗体组合在一起，并通过全自动点样仪将特异性抗体固定在玻片上，从而实现在一个小的方阵内同时检测多个指标。35种胃癌肿瘤标志物为CEA，CA242，IL-1beta，IL-6，CA72-4，IL-11，IL-8，IL-18，PGI，PGII，MCP1，MCP3，MCP4，CK19，VEGF，NGAL，RANTES，MMP1，MMP7，MMP9，TIMP-1，IGFBP2，TNF-alpha，GMCSF，VDBP，TTR，AEG-1，ADAM10，ADAM17，Nardilysin，ProApoA1，ApoA1，HCG beta，CA50，CA199。
将35种胃癌肿瘤标志物相应抗体按照图2所示点样示意图进行点样。采用全自动点样仪进行点样，具体方法为：
1）特异性抗体与含有1.4~2 %酪蛋白的pH7.4磷酸盐缓冲液混合形成抗体混合物。
2）于抗体混合物中将每个抗体含量以0.01~2ng固定于所述点样孔，每个抗体设置2至4个重复孔。
3）抗体芯片点阵排布于玻片。
准备两个固定有35种胃癌肿瘤标志物相应抗体的芯片，左边的芯片中加入肿瘤组织样本裂解液，左边的芯片中加入正常组织样本裂解液。具体操作如下：
1、玻片芯片的完全干燥：将玻片芯片从盒子中取出来，在室温平衡20~30min后，将包装袋打开，揭开密封条，然后将芯片放在真空干燥器或者室温干燥1~2小时。
2、芯片操作流程：每个孔中加50~100µl的样品，组织裂解液经蛋白浓度测定后加入50~500ug/ml的量。
3、清洗：抽去每个孔中的样品，洗涤液清洗5次，每次5min室温摇床震荡，每孔150µl 的1×洗涤液，每次清洗要抽干净洗液，用去离子水稀释20×洗涤液。
4、 检测抗体混合物的孵育：离心检测抗体混合物小管，然后加入1.4ml的样品稀释液，混合均匀后再次快速离心。添加80µl的检测抗体到每个孔中，室温摇床上孵育2小时。
5、清洗：抽去每个孔中的检测抗体，洗涤液清洗5次，每次5min室温摇床震荡，每孔150µl 的洗涤液，每次清洗要抽干净洗液。
6、 Cy3-链霉亲和素的孵育：离心Cy3-链霉亲和素小管，然后加入1.4ml的样品稀释液，混合均匀后再次快速离心。添加80µl的Cy3-链霉亲和素到每个孔中，用铝箔纸包住玻片避光孵育，室温摇床上孵育1个小时。
7、清洗：抽去每个孔中的Cy3-链霉亲和素，洗涤液清洗5次，每次5min室温摇床震荡，每孔150µl 的洗涤液，每次清洗要抽干净洗液。
8、荧光检测
8.1将玻片框架拆掉，小心不要用手接触到玻片印制抗体的一面。
8.2将玻片放置在玻片清洗管中，添加约30ml的洗涤液，能整个覆盖住玻片，在室温摇床上震荡15min，弃去洗涤液。
8.3去除玻片的残留洗液。将玻片放置在玻片清洗管/干燥管中，不盖盖子，在1000rpm离心3min。
8.4采用激光扫描仪例如Axon GenePix扫描信号，采用Cy3或者绿色通道（激发频率=532nm）。
9芯片的数据提取以及用分析软件来进行数据分析。
检测结果见图3，由结果可知，CEA ,CA242，IL-1beta，IL-6，CA72-4， IL-8，IL-18，PGI，PGII，MCP1，MCP3，MCP4，CK19,VEGF，NGAL，RANTES，MMP1，MMP7，MMP9，TIMP-1，IGFBP2，TNF-alpha，GMCSF，VDBP，TTR， ADAM10，ADAM17，Nardilysin，ProApoA1，ApoA1，CA50,CA199相应抗体的检测浓度发生了变化，其中CEA, CA199, PGI, PGII, CA724变化较显著，而IL-11, HCG beta, AEG-1变化不显著。
因此，本发明所述芯片试剂盒上固定的特异性抗体可以选自CEA ,CA242，IL-1beta，IL-6，CA72-4， IL-8，IL-18，PGI，PGII，MCP1，MCP3，MCP4，CK19,VEGF，NGAL，RANTES，MMP1，MMP7，MMP9，TIMP-1，IGFBP2，TNF-alpha，GMCSF，VDBP，TTR， ADAM10，ADAM17，Nardilysin，ProApoA1，ApoA1，CA50,CA199蛋白之特异性抗体中的多种。
更优选地，本发明所述芯片试剂盒上固定的特异性抗体为CEA, CA199, PGI,PGII, CA724的5种蛋白之特异性抗体。
实施例2
以优选的CEA, CA199, PGI, PGII, CA724的5种蛋白之特异性抗体，按照实施例1的方式制备试剂盒。5种蛋白之特异性抗体按照图4所示进行点样。采用本试剂盒检测8份临床样本（临床样本的的检测值已知，采用电化学发光法测得），检测方法同实施例1所述。将临床样本检测值与本试剂盒的检测值对比画成散点图，其相关性如下：电化学发光检测结果与本试剂盒的检测结果基本相当。结果见表1和图5~9。
表1
图5为本试剂盒CEA抗体与电化学发光法试剂盒检测结果的相关性如下，其趋势方程为y=83.4x-125.1，相关系数为0.922。图6为本试剂盒CA724抗体与电化学发光法试剂盒检测结果的相关性如下，其趋势方程为y=44.86x+678.7，相关系数为0.992。图7为本试剂盒CA199抗体与电化学发光法试剂盒检测结果的相关性如下，其趋势方程为y=7.867x-76.07，相关系数为0.882。图8为本试剂盒PGI抗体与电化学发光法试剂盒检测结果的相关性如下，其趋势方程为y=5.094x+146，相关系数为0.946。图9为本试剂盒PGII抗体与电化学发光法试剂盒检测结果的相关性如下，其趋势方程为y=6.462x+86.87，相关系数为0.882。
实施例3 实施例2所述试剂盒的质量检测
一、实施例2所述试剂盒各抗体的检测灵敏度
具体操作参照实施例2，采用各抗原按梯度稀释求得试剂盒的最低检测限及线性范围。检测结果见表2。
表2
二、实施例2所述试剂盒各抗体的交叉反应实验
具体操作参照实施例1，检测抗体分别为抗CEA抗体，抗PGI抗体，抗PGII抗体，抗CA724抗体，抗CA199抗体以及这五个抗体的混合物。抗体对的交叉反应测试结果如下图10。由图10结果可知，每种抗体对可以特异地识别自己的检测抗原而与其他的抗原没有交叉反应。
实施例4 实施例2所述试剂盒的应用
将实施例2所述的试剂盒用来检测胃癌血清样本和正常血清样本，检测方法如下：
1玻片芯片的完全干燥
将玻片芯片从盒子中取出来，在室温平衡20~30min后，将包装袋打开，揭开密封条，然后将芯片放在真空干燥器或者室温干燥1~2小时。
2芯片操作流程
每个孔中加50~100µl的样品，不同样品的加样量不一样： 血浆，血清使用前用样品稀释液1：1稀释；细胞上清液可用原液；细胞或组织裂解液经蛋白浓度测定后加入50~500ug/ml的量。
3清洗
抽去每个孔中的样品，洗涤液清洗5次，每次5min室温摇床震荡，每孔150µl 的1×洗涤液，每次清洗要抽干净洗液，用去离子水稀释20×洗涤液。
4 检测抗体混合物的孵育
离心检测抗体混合物小管，然后加入1.4ml的样品稀释液，混合均匀后再次快速离心。添加80µl的检测抗体到每个孔中，室温摇床上孵育2小时。
5清洗
抽去每个孔中的检测抗体，洗涤液清洗5次，每次5min室温摇床震荡，每孔150µl的洗涤液，每次清洗要抽干净洗液。
6 Cy3-链霉亲和素的孵育
离心Cy3-链霉亲和素小管，然后加入1.4ml的样品稀释液，混合均匀后再次快速离心。添加80µl的Cy3-链霉亲和素到每个孔中，用铝箔纸包住玻片避光孵育，室温摇床上孵育1个小时。
7清洗
抽去每个孔中的Cy3-链霉亲和素，洗涤液清洗5次，每次5min室温摇床震荡，每孔150µl 的洗涤液，每次清洗要抽干净洗液。
8荧光检测
1）将玻片框架拆掉，小心不要用手接触到玻片印制抗体的一面。
2）将玻片放置在玻片清洗管中，添加约30ml的洗涤液，能整个覆盖住玻片，在室温摇床上震荡15min，弃去洗涤液。
3）去除玻片的残留洗液。将玻片放置在玻片清洗管/干燥管中，不盖盖子，在1000rpm离心3min。
4）采用激光扫描仪例如Axon GenePix扫描信号，采用Cy3或者绿色通道（激发频率=532nm）。
9芯片的数据提取以及用分析软件来进行数据分析。
检测结果如图11所示。
实施例5利用实施例2所述试剂盒检测临床样本
选用胃癌组114例，健康对照组110例对比各肿瘤标志物与芯片组合的数据, 所有病例均行外科病理及影像学检查证实为胃癌。
CEA的诊断界值为5ng／L、CA199的诊断界值为37U／ml、CA72-4的诊断界值为6.9U／ml、PGI的诊断界值为70ng/ml、PGI/PGII的诊断界值为3。敏感性=阳性数/(阳性数+假阴性数) X 100%，特异性=阴性数/(阴性数+假阳性数) X 100% 。敏感度与特异性应用SPSS11.0统计软件包处理所获数据，组间均数比较用t检验，计数资料采用χ2检验，计量数据采用方差分析，P＜0.05为差异有统计学意义。
各肿瘤标志物对胃癌检测的灵敏度与特异性见表3.
表3
| 组成 | 灵敏度(%) | 特异性(%) |
| CEA | 50.8 | 63 |
| CA199 | 55.6 | 65 |
| CA724 | 65.1 | 56 |
| PGI/PGII | 84.6 | 73.5 |
| CEA+CA199+CA724+PGI/PGII | 90.1 | 75 |
如上表所知，五项指标联合检测的敏感性和特异性均高于单检。
实施例6
一种检测早期胃癌的芯片试剂盒，所述试剂盒的固相载体上固定CEA ,CA242，IL-1beta，IL-6，CA72-4， IL-8，IL-18，PGI，PGII，MCP1，MCP3，MCP4，CK19,VEGF，NGAL，RANTES，MMP1，MMP7，MMP9，TIMP-1，IGFBP2，TNF-alpha，GMCSF，VDBP，TTR， ADAM10，ADAM17，Nardilysin，ProApoA1，ApoA1，CA50,CA199蛋白之特异性抗体。以上32种胃癌标志物的抗体按照图12的阵列示意图在玻片上进行点样。试剂盒的其他组成参照实施例1来制备。
以上列举的实施例只是用于解释本发明，并不能现在本发明保护的范围，按照本发明的研究思路，芯片载体上固定的抗体只要是从以下32种胃癌标志物对应的抗体（CEA ,CA242，IL-1beta，IL-6，CA72-4， IL-8，IL-18，PGI，PGII，MCP1，MCP3，MCP4，CK19,VEGF，NGAL，RANTES，MMP1，MMP7，MMP9，TIMP-1，IGFBP2，TNF-alpha，GMCSF，VDBP，TTR， ADAM10，ADAM17，Nardilysin，ProApoA1，ApoA1，CA50,CA199蛋白之特异性抗体）中选出来的，都落入本发明的保护范围。
Claims (6)
1.一种检测早期胃癌的抗体芯片试剂盒，其特征在于，固相载体上固定5种胃癌标志物相关特异性抗体，5种胃癌标志物相关特异性抗体为CEA、CA199，CA72-4，PGⅠ，PGⅡ蛋白之抗体；
所述特异性抗体是采用以下步骤固定于玻片：
1)特异性抗体与含有1.4～2％酪蛋白的pH7.4磷酸盐缓冲液混合形成抗体混合物；
2)于抗体混合物中将每个抗体含量以0.01～2ng固定于点样孔，每个抗体设置2～4个重复孔；
3)抗体芯片点阵排布于玻片。
2.根据权利要求1所述的检测早期胃癌的抗体芯片试剂盒，其特征在于，所述胃癌标志物的特异性抗体通过全自动点样仪完成点样操作，将特异性抗体固定在载体上。
3.根据权利要求1所述的检测早期胃癌的抗体芯片试剂盒，其特征在于，所述固相载体由玻片，软质硅胶垫，硬质框架，U形框夹形成反应槽，硬质框架划分为2×8或16×4个小孔，形成16或64孔框架，特异性抗体固定在玻片上。
4.根据权利要求3所述的检测早期胃癌的抗体芯片试剂盒，其特征在于，所述玻片还包括阳性对照孔和阴性对照孔；阳性对照孔为对应特异性抗体的具有相应浓度的生物素化IgG抗体，每个反应的生物素化的IgG抗体的浓度一致，以便于标准化检测；阴性对照孔为具有相应浓度的生物素化的无关抗体，每个反应的生物素化的无关抗体的浓度一致，以便于标准化检测。
5.根据权利要求1所述的检测早期胃癌的抗体芯片试剂盒，其特征在于，利用荧光素作为检测信号，通过比较未知样品和标准样本的信号来确定样品中的目标抗原的浓度。
6.根据权利要求1所述的检测早期胃癌的抗体芯片试剂盒，其特征在于，利用GenepixPro6.1软件获取芯片上所有点的信号强度，利用自行开发的电子表格版的分析软件计算每个蛋白的表达水平和标准曲线，利用阳性对照信号标准化，背景阈值设置对照组的平均强度加上2倍标准偏差(SD)进行统计，表达水平高于背景加上2×SD的蛋白用于校正的T检验分析。
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