CN113125723A - 一种检测男性恶性肿瘤标志物的检测芯片及其制备方法和应用 - Google Patents
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Abstract
本发明提供一种检测男性恶性肿瘤标志物的检测芯片及其制备方法和应用，检测男性恶性肿瘤标志物的检测芯片，包括固相载体和固定在固相载体表面的捕获抗体；捕获抗体包括：抗AFP‑捕获抗体、抗CA125‑捕获抗体、抗TG‑捕获抗体、抗CA199‑捕获抗体、抗CA724‑捕获抗体、抗CEA‑捕获抗体、抗fPSA‑捕获抗体、抗tPSA‑捕获抗体、抗NSE‑捕获抗体、抗PGI‑捕获抗体、抗PGII‑捕获抗体、抗SCCA1‑捕获抗体中的至少两种；固相载体选自氨基化玻片或者醛基化玻片。本发明能够实现将针对上述最多12种肿瘤标志物的特异性抗体稳定地固定在同一块固相载体表面，从而最多同时实现上述12种男性肿瘤标志物的高通量检测。
Description
技术领域
本发明属于体外免疫分析技术领域，具体地，涉及一种检测男性恶性肿瘤标志物的检测芯片及其制备方法和应用。
背景技术
癌症(cancer)，医学术语亦称恶性肿瘤(malignant neoplasm)，为由控制细胞生长增殖机制失常而引起的疾病。癌细胞除了生长失控外，还会局部侵入周边正常组织(浸润，invasion)甚至经由体内循环系统或淋巴系统转移到身体其他部分。癌症是一多因子疾病。其病因可能跟遗传、基因突变,老年化、或环境因子等有关。由于发病率及死亡率高，严重威胁大众的健康。
2018年全球男性新增9456418例癌症病例，发病率为245.6/10万，ASIRW为218.6/10万。男性病例里肺癌最常见(14.5％)，其次是前列腺癌(13.5％)、结直肠癌(10.9％)。男性癌症死亡病例5 385 640例，死亡率为139.9/10万，ASMRW为122.7/10万。肺癌也是男性死亡的首要原因(22.0％)，肝癌(10.2％)和胃癌(9.5％)分别居第2、3位。全性别癌症标化发病率为201.7/10万，男性发病率高于女性，分别为223.0/10万和182.6/10万。全性别标化死亡率为130.1/10万，男性死亡率(166.6/10万)明显高于女性(95.2/10万)。据统计，男性最常见的癌症是肺癌、胃癌、结直肠癌、肝癌及食管癌。与全球整体情况相比，男性前5位的癌种标化发病率均高于全球平均水平，我国男性前列腺癌发病率居第6位，食管癌居第5位，男性食管癌的预计发病例数占全球所有男性食管癌的53.6％。除此之外，约有近一半的男性胃癌和食管癌新发病例发生在中国。以死亡例数排序，男性死亡前5位的分别为肺癌、肝癌、胃癌、食管癌及结直肠癌，这5个癌种的标化死亡率均高于全球水平。近年来，由于受到环境污染、不良生活方式及人口老龄化的影响，恶性肿瘤的发病率呈逐年上升趋势，而早诊断、早治疗是提高肿瘤患者生存率和治愈率的关键。
肿瘤标志物一般是指在肿瘤患者体液或组织中存在的由肿瘤组织及细胞所产生的异常表达的活性物质,包括激素、酶、特异性和非特异性的糖蛋白或糖脂等一大类物质。肿瘤标志物的检测已成为肿瘤临床诊断的常规手段之一,作为早期发现无症状微灶肿瘤的有效途径，可先于超声、CT、MRI或PET-CT等物理检查发现肿瘤。针对男性，常见的恶性肿瘤标志物有AFP、CA125、CA199、CA724、CEA、NSE、PGI、PGII、SCCA1、fPSA、tPSA、TG。
AFP是一种糖蛋白，它属于白蛋白家族，主要由胎儿肝细胞及卵黄囊合成。AFP具有很多重要的生理功能，包括运输功能、作为生长调节因子的双向调节功能、免疫抑制、T淋巴细胞诱导凋亡等。甲胎蛋白与肝癌及多种肿瘤的发生发展密切相关，在多种肿瘤中均可表现出较高浓度，可作为多种肿瘤的阳性检测指标。目前临床上主要作为原发性肝癌的血清标志物，用于原发性肝癌的诊断及疗效监测。此外，睾丸癌，卵巢肿瘤，恶性畸胎瘤，胰腺癌，胃癌，肠癌，肺癌等患者AFP含量也增高。
CA125是1981年由Bast等从上皮性卵巢癌抗原检测出可被单克隆抗体OC125结合的一种糖蛋白，来源于胚胎发育期体腔上皮，在正常卵巢组织中不存在，因此最常见于上皮性卵巢肿瘤(浆液性肿瘤)患者的血清中，其诊断的敏感性较高，但特异性较差。CA125不仅是卵巢癌的特异性标志物，输卵管腺癌、子宫内膜癌、宫颈癌、胰腺癌、肠癌、乳腺癌和肺癌患者CA125的水平也会升高。对于其他非卵巢恶性肿瘤，CA125的阳性率判断标准如下：乳腺癌40％、胰腺癌50％、胃癌47％、肺癌44％、结肠直肠癌32％、其他妇科肿瘤43％。对于肺癌患者，CA125的阳性率随肺癌分期进展而明显升高，临床研究表明：肺癌I期阳性率为7.8％，II期阳性率为18.6％，III期为32.5％，IV期为53.9％，总体阳性率为26.9％。
CA199属低聚糖肿瘤相关抗原，为一种新的肿瘤标志物，为细胞膜上的糖脂质，分子量大于1000kD。是迄今报道的对胰腺癌敏感性最高的标志物。在血清中它以唾液粘蛋白形式存在，分布于正常胎儿胰腺、胆囊、肝、肠和正常成年人胰腺、胆管上皮等处。是存在于血液循环的胃肠道肿瘤相关抗原。胰腺癌、肝胆系癌、胃癌、结直肠癌的CA 199水平分别是正常均值的683、535、279、115倍，其中CA199阳性率以胰腺癌为最高，故CA199是胰腺癌较好的标志。CA724是一种由cc49和B72.3两株单抗识别的粘蛋白样的高分子量糖蛋白，分子量为220-400KD，正常人血清中含量<6U/mL，异常升高在各种消化道肿瘤、卵巢癌均可产生。CA724对于胃癌的检测特异性较高，以>6U/mL为临界值，是检测胃癌和各种消化道癌症的化验标志之一。CA724这也是一个非特异性肿瘤标志物，此指标升高不代表就是患了肿瘤，主要见于胃肠道，对胃癌、卵巢粘液性囊腺癌和非小细胞肺癌敏感度较高，对胆道系统肿瘤、结直肠癌、胰腺癌等亦有一定的敏感性。
CEA是1965年由Gold和Freedman首先从结肠癌和胚胎组织中提取的一种肿瘤相关抗原，是一种具有人类胚胎抗原特性的酸性糖蛋白，存在于内胚层细胞分化而来的癌症细胞表面，是细胞膜的结构蛋白。以往把CEA作为早期诊断结肠癌和直肠癌的特异性标志物，经大量的临床实践，发现不仅胃肠道的恶性肿瘤CEA值可以升高，在大肠癌、胰腺癌、胃癌、乳腺癌、甲状腺髓样癌、肝癌、肺癌、卵巢癌、泌尿系肿瘤等其他恶性肿瘤的血清中也有升高。因此，癌胚抗原是一种广谱肿瘤标志物。虽然不能作为诊断某种恶性肿瘤的特异性指标，但在恶性肿瘤的鉴别诊断、病情监测、疗效评价等方面，仍有重要临床价值。
NSE(神经元特异性烯醇化酶)是神经元和神经内分泌细胞所特有的一种酸性蛋白酶，神经内分泌肿瘤的特异性标志，如神经母细胞瘤、甲状腺髓质癌和小细胞肺癌(70％升高)，可用于鉴别诊断、病情监测、疗效评价和复发预报。NSE检测在肺癌诊断中、肺癌治疗监测中以及肺癌预后评估中都具有重要的意义。此外，NSE检测也可应用于其他肿瘤疾病的诊断、治疗中，如：22％非肺部恶性疾病患者(任何期别肿瘤)NSE浓度高于25ng/mL；脑部肿瘤如神经胶质瘤、脑脊膜瘤、纤维神经瘤和神经瘤仅偶尔有血清NSE值升高；在原发脑瘤或脑转移性瘤10和恶性黑色素瘤及肾上腺嗜铬细胞瘤(PC)患者中，可发现中枢神经系统CNS的NSE值升高；14％器官排斥和46％转移性肾癌患者NSE浓度升高。PG(pepsinogen，胃蛋白酶原)可分为PGI和PGII两种亚型，是由胃部分泌的参与消化的胃蛋白酶的前体，通常约1％的PG可通过胃黏膜进入血液循环。胃蛋白酶原在pH﹤5.0时活化为胃蛋白(pepsin)。PGⅠ是胃底腺的主细胞和颈粘液细胞分泌；PGⅡ除主细胞和颈粘液细胞分泌外，幽门腺和十二指肠腺亦可产生。利用慢性萎缩性胃炎和胃癌间，以及胃蛋白酶原值和慢性萎缩性胃炎间的相关关系，以PGⅠ、PGII值及PGⅠ/Ⅱ比为指标，监测进展期萎缩性胃炎这一胃癌高危人群，从而将其应用于对胃癌的检诊，该方法即胃蛋白酶原法(PG法)。胃蛋白酶原检测(PG法)的临床意义：1.胃癌早期筛查；2.胃溃疡、萎缩性胃炎、HP感染的筛查；3.幽门螺杆菌(HP)治疗效果的评价；4.消化性溃疡复发、治愈的判定指标；5.胃癌切除术后复发的判定指标；6.个人胃粘膜功能的动态监测。
SCCA(鳞状细胞癌抗原)是一种抑制型丝氨酸蛋白酶抑制剂，生理性表达于鳞状上皮组织。SCCA有两个亚型，分别是SCCA1和SCCA2，两者的基因核酸序列98％同源，蛋白氨基酸序列92％一致，但在功能上有较大差异。其中，SCCA1主要抑制木瓜蛋白酶样半胱氨酸蛋白激酶如组织蛋白酶S、K、L等，体外实验表明，其有促进细胞增殖、抑制细胞凋亡和通过诱导上皮间质转化促进肿瘤细胞侵袭转移的作用。SCCA1在肝癌组织、癌旁组织中均有表达，在肝癌组织中的表达水平高于癌旁组织。SSCA1的阳性率从正常肝、慢性肝病、癌旁组织、不典型增生到肝癌组织呈逐渐升高趋势。
PSA是前列腺特异抗原的简称，是一种含有237个氨基酸的单链多肽，属于具有组织特异性的有糜蛋白酶样作用的丝氨酸蛋白酶族，在正常和癌样上皮细胞中都可合成。PSA可以分解精液中的主要胶状蛋白，使胶状的精液液化，增强精子的活动性。PSA对前列腺组织呈免疫特异性反应。PSA不仅会出现在正常的、良性增生的或恶性前列腺组织中，还会出现在转移性前列腺癌、前列腺液和精液中。但是，在男性其他正常组织以及乳腺癌、肺癌、结肠癌、直肠癌、胃癌、胰腺癌和甲状腺癌中都不会出现PSA。在前列腺增生和前列腺癌的PSA水平在4–10ng/mL时较大部分重叠，在这个所谓灰色区域难以根据PSA水平来区分前列腺增生和前列腺癌。PSA在血清中可以游离态和结合态的形式存在，游离PSA是指游离在血浆中不被结合那部分PSA，表示为fPSA；血清总PSA以tPSA表示。fPSA浓度在癌症患者中低于良性增生患者。临床上就是应用这个差异，从良前列腺增生病人中，将早期前列癌筛检出来。应用fPSA/tPSA比值来辅助鉴别前列腺癌和良性增生获得广泛使用。
TG(甲状腺球蛋白)是甲状腺滤泡上皮细胞分泌的大分子糖蛋白，绝大多数由甲状腺细胞合成并释放进入甲状腺滤泡的残腔中。TG被认为是甲状腺体形完整性的特殊标志物，也是分化型甲状腺癌(DTC)的肿瘤标志物，可作为DTC患者治疗后随访的重要参考指标。TG对DTC预后判断和监测治疗效果有重要意义。临床对DTC患者的随访发现，测定TG含量诊断DTC复发或转移的灵敏度为88％～97％，特异性为100％。甲状腺癌术前TG水平高提示肿瘤能产生TG，术后TG可作为灵敏的随访肿瘤标志物。在治疗过程中，不同病理类型的分化型甲状腺癌TG水平也有明显差异。滤泡状癌的TG水平远远高于乳头状癌，这与两种细胞类型分泌TG的能力不同有关，这决定了其在治疗后TG下降的程度。在癌症的早期阶段，生物标志物的表达水平变化非常小，因此，开发出针对癌症生物标志物的高灵敏度检测芯片对早期癌症的筛查具有重要的现实意义。
发明内容
本发明的目的在于提供一种检测男性恶性肿瘤标志物的检测芯片及其制备方法和应用，以实现高通量、高灵敏度、高特异性和低成本的男性肿瘤标志物检测。
根据本发明的一个方面，提供一种检测男性恶性肿瘤标志物的检测芯片，包括固相载体和固定在固相载体表面的捕获抗体；捕获抗体包括：抗AFP-捕获抗体、抗CA125-捕获抗体、抗TG-捕获抗体、抗CA199-捕获抗体、抗CA724-捕获抗体、抗CEA-捕获抗体、抗fPSA-捕获抗体、抗tPSA-捕获抗体、抗NSE-捕获抗体、抗PGI-捕获抗体、抗PGII-捕获抗体、抗SCCA1-捕获抗体中的至少两种；固相载体选自氨基化玻片或者醛基化玻片。
优选地，固相载体为醛基化玻片。
优选地，捕获抗体包括：抗AFP-捕获抗体、抗CA125-捕获抗体、抗TG-捕获抗体、抗CA199-捕获抗体、抗CA724-捕获抗体、抗CEA-捕获抗体、抗fPSA-捕获抗体、抗tPSA-捕获抗体、抗NSE-捕获抗体、抗PGI-捕获抗体、抗PGII-捕获抗体和抗SCCA1-捕获抗体。
优选地，抗AFP-捕获抗体为购自广州瑞博奥生物科技有限公司的、货号为119-14002的抗体；抗CA125-捕获抗体为购自广州瑞博奥生物科技有限公司的、货号为119-16017的抗体；抗TG-捕获抗体为购自赛默飞世尔科技的、货号为MA1-21672的抗体；抗CEA-捕获抗体选为购自广州瑞博奥生物科技有限公司的、货号为MD-14-0828的抗体；抗CA199-捕获抗体为购自菲鹏生物股份有限公司的、货号为CA199-McAb2#的抗体；抗CA724-捕获抗体为购自菲鹏生物股份有限公司的、货号为CA724-McAb1#的抗体；抗fPSA-捕获抗体为购自上海鑫乐生物科技有限公司的、货号为XL02584的抗体；抗tPSA-捕获抗体选自购自上海一基实业有限公司的、货号为ER558665的抗体或购自广州瑞博奥生物科技有限公司的、货号为DS-MB-02167的抗体；抗NSE-捕获抗体为购自广州瑞博奥生物科技有限公司的、货号为DS-MB-02002的抗体；抗PGI-捕获抗体为购自OriGene Technologies的、货号为AP21370BT-N的抗体；抗PGII-捕获抗体为购自的南京欧凯生物科技有限公司、货号为K28c9的抗体；抗SCCA1-捕获抗体为购自广州瑞博奥生物科技有限公司的、货号为130-10461的抗体。
根据本发明的另一个方面，提供一种上述检测男性恶性肿瘤标志物的检测芯片的制备方法，包括如下步骤：S1.将捕获抗体与pH＝7.4±0.5磷酸盐缓冲液混合，形成捕获抗体混合物，磷酸盐缓冲液中含有0–10％的糖类物质；S2.将捕获抗体混合液点样固定于固相载体表面的点样孔。
优选地，磷酸盐缓冲液中含有0.5％的蔗糖。
优选地，磷酸盐缓冲液中含有5％的海藻糖。
根据本发明的另一个方面，提供一种检测男性恶性肿瘤的试剂盒，：包括上述检测男性恶性肿瘤标志物的检测芯片。
优选地，还包括被免疫标记物标记的检测抗体；若捕获抗体包括抗AFP-捕获抗体，则检测抗体包括抗AFP-检测抗体；若捕获抗体包括抗CA125-捕获抗体，则检测抗体包括抗CA125-检测抗体；若捕获抗体包括抗TG-捕获抗体，则检测抗体包括抗TG-检测抗体；若捕获抗体包括抗CA199-捕获抗体，则检测抗体包括抗CA199-检测抗体；若捕获抗体包括抗CA724-捕获抗体，则检测抗体包括抗CA724-检测抗体；若捕获抗体包括抗CEA-捕获抗体，则检测抗体包括抗CEA-检测抗体；若捕获抗体包括抗fPSA-捕获抗体，则检测抗体包括抗fPSA-检测抗体；若捕获抗体包括抗tPSA-捕获抗体，则检测抗体包括抗tPSA-检测抗体；若捕获抗体包括抗NSE-捕获抗体，则检测抗体包括抗NSE-检测抗体；若捕获抗体包括抗PGI-捕获抗体，则检测抗体包括抗PGI-检测抗体；若捕获抗体包括抗PGII-捕获抗体，则检测抗体包括抗PGII-检测抗体；若捕获抗体包括抗SCCA1-捕获抗体，则检测抗体包括抗SCCA1-检测抗体。
优选地，抗AFP-检测抗体为购自广州瑞博奥生物科技有限公司的、货号为DS-PB-00112的抗体；抗CA125-检测抗体为购自广州瑞博奥生物科技有限公司的、货号为MAB5609的抗体；抗TG-检测抗体为购自赛默飞世尔科技的、货号为MA5-33241的抗体；抗CEA-检测抗体为购自菲鹏生物股份有限公司的、货号为3CEA-9的抗体；抗CA199-检测抗体为购自菲鹏生物股份有限公司的、货号为CA199-McAb1#的抗体；抗CA724-检测抗体为购自菲鹏生物股份有限公司的、货号为CA724-McAb2#的抗体；抗fPSA-检测抗体为购自菲鹏生物股份有限公司的、货号为3PSA-17的抗体；抗tPSA-检测抗体选自购自上海一基实业有限公司的、货号为ER558665的抗体或购自广州瑞博奥生物科技有限公司的、货号为DS-MB-02167的抗体；抗NSE-检测抗体为购自广州瑞博奥生物科技有限公司的、货号为188-11440的抗体；抗PGI-检测抗体为购自赛默飞世尔科技的、货号为MA1-83390的抗体；PGII-检测抗体为购自OriGeneTechnologies的、货号为TA809596的抗体；抗SCCA1-检测抗体为购自广州瑞博奥生物科技有限公司的、货号为130-10459的抗体。
本发明可实现将分别针对AFP、CA125、TG、CA199、CA724、CEA、fPSA、tPSA、NSE、PGI、PGII、SCCA1的特异性抗体稳定地固定在同一块固相载体表面，能够最多同时实现12种肿瘤标志物的检测，检测结果能够可靠、灵敏地应用于男性恶性肿瘤的早期诊断、治疗监测以及术后观察。
本发明选取氨基化玻片或者醛基化玻片作为检测芯片的固相载体，所涉及的捕获抗体能够紧密、牢固地附着在氨基化玻片或者醛基化玻片的表面，由此制得的检测芯片具有较低的背景值较低和较高的灵敏度。
本发明用于配制捕获抗体混合物的磷酸盐缓冲液具有以下有益效果：向磷酸盐缓冲液中添加蔗糖，能够为上述12种肿瘤标志物的特异性抗体提供稳定共存的液体环境，能够避免和排除非特异性吸附，防止假阳性的出现，有效提高了检测芯片的准确性；向磷酸盐缓冲液中添加海藻糖，特异性抗体能够在磷酸盐缓冲液提供的液体反应环境中保持较高的活性，因此，特异性抗体与其各自对应的目标蛋白具有较高的结合能力，有效提高了检测芯片的灵敏度。
本发明进一步地对检测芯片表面的捕获抗体种类进行限定，限制了处于同一芯片环境中的捕获抗体之间发生交叉反应的可能，同时，保证了所选的捕获抗体针对其对应的目标蛋白具有特异、高效的结合能力。基于夹心ELISA法，采用本发明提供的检测芯片和对应的检测抗体组装检测男性恶性肿瘤的试剂盒，所涉及的抗原抗体反应能够互不干扰地在检测过程中高效进行，由此能够实现高通量、高灵敏度、高特异性和低成本的男性肿瘤标志物检测。使用上述试剂盒时，检测样品体积仅需50–100μL，且反应迅速，同时检测12个指标整个反应时间只需60分钟。
本发明制得的检测芯片能够同时实现男性肿瘤标志物的多通量检测，并且能够达到较高的准确度、重现性和灵敏度，能够被应用于癌症早期阶段的筛查。
附图说明
图1为实施例3和实施例4的芯片点阵示意图；
图2为实施例3制备的芯片Ⅰ的荧光检测结果示意图；
图3为实施例3制备的芯片Ⅱ的荧光检测结果示意图。
具体实施方式
为了使本技术领域的人员更好地理解本发明方案，下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分的实施例，而不是全部的实施例。
实施例1
1.实验设置方式
本实施例所采用的参试抗体如表1所示，其中所涉及的供应商如下：广州瑞博奥生物科技有限公司(瑞博奥)、圣克鲁斯生物技术(Santa cruz)、赛默飞世尔科技(invitrogen)、Novus Biologicals(Novusbio)、菲鹏生物股份有限公司(菲鹏)、RDBiosciences(RD)、上海一基实业有限公司(一基)、上海鑫乐生物科技有限公司(鑫乐)、南京欧凯生物科技有限公司(欧凯)、OriGene Technologies(Origene)、金斯瑞生物科技股份有限公司(金斯瑞)、派克生物(派克)。在37℃下，采用Thermo ScientificTM WellwashTM洗板机，使各参试抗体分别与AFP、CA125、TG、CA199、CA724、CEA、fPSA、tPSA、NSE、PGI、PGII、SCCA1发生免疫反应，以开展参试抗体与抗原的配对性检测。
配对性检测实验的实验参数为：载体，96微孔板；抗原稀释液，PBS；封闭液，5％脱脂奶粉+PBS；抗体稀释液，PBS；洗涤液，0.1％tween-20+Tris.Cl。
表1参试抗体信息
2.检测结果
本实施例部分参试抗体的配对性检测结果如表2–11所示。
表2抗AFP-特异性抗体的抗原配对性检测响应信号值
表3抗CA125-特异性抗体的抗原配对性检测响应信号值
表4抗TG-特异性抗体的抗原配对性检测响应信号值
表5抗CEA-特异性抗体的抗原配对性检测响应信号值
表6抗fPSA-特异性抗体的抗原配对性检测响应信号值
表7抗tPSA-特异性抗体的抗原配对性检测响应信号值
表8抗NSE-特异性抗体的抗原配对性检测响应信号值
表9抗PGI-特异性抗体的抗原配对性检测响应信号值
表10抗PGII-特异性抗体的抗原配对性检测响应信号值
表11抗SCCA1-特异性抗体的抗原配对性检测响应信号值
从抗AFP-特异性抗体的配对性检测中可以得出，第四AFP抗体的响应信号值偏低，第二AFP抗体会与其它抗原发生交叉反应。
从抗CA125-特异性抗体的配对性检测中可以得出，第一CA125抗体、第五CA125抗体和第七CA125抗体的响应信号值偏低，第四CA125抗体会与其它抗原发生交叉反应。
从抗TG-特异性抗体的配对性检测中可以得出，第三TG抗体的响应信号值偏低，第一TG抗体和第六TG抗体会与其它抗原发生交叉反应。
从抗CEA-特异性抗体的配对性检测中可以得出，第三CEA抗体的响应信号值偏低，第二CEA抗体和第五CEA抗体会与其它抗原发生交叉反应。
从抗fPSA-特异性抗体的配对性检测中可以得出，第六fPSA抗体的响应信号值偏低，第一fPSA抗体和第三fPSA抗体会与其它抗原发生交叉反应。
从抗tPSA-特异性抗体的配对性检测中可以得出，第一tPSA抗体、第三tPSA抗体和第四tPSA抗体会与其它抗原发生交叉反应。
从抗NSE-特异性抗体的配对性检测中可以得出，第一NSE抗体的响应信号值偏低，第三NSE抗体、第六NSE抗体和第七NSE抗体会与其它抗原发生交叉反应。
从抗PGI-特异性抗体的配对性检测中可以得出，第二PGI抗体会与其它抗原发生交叉反应。
从抗PGII-特异性抗体的配对性检测中可以得出，第四PGII抗体的响应信号值偏低。
从抗SCCA1-特异性抗体的配对性检测中可以得出，第三SCCA1抗体的响应信号值偏低。
综上，第二AFP抗体、第四AFP抗体、第一CA125抗体、，第四CA125抗体、第五CA125抗体、第七CA125抗体、第一TG抗体、第三TG抗体、第六TG抗体、第二CEA抗体、第三CEA抗体、第五CEA抗体、第一fPSA抗体、第三fPSA抗体、第六fPSA抗体、第一tPSA抗体、第三tPSA抗体、第四tPSA抗体、第一NSE抗体、第三NSE抗体、第六NSE抗体、第七NSE抗体、第二PGI抗体、第四PGII抗体、第三SCCA1抗体不适合用于制作同时实现AFP、CA125、TG、CA199、CA724、CEA、fPSA、tPSA、NSE、PGI、PGII、SCCA1多通量检测的检测芯片。
实施例2
1.参试抗体
选取实施例1中的以下抗体作为本实施例的参试抗体：
第一AFP抗体、第三AFP抗体、第六AFP抗体；
第二CA125抗体、第三CA125抗体、第六CA125抗体；
第二TG抗体、第四TG抗体、第五TG抗体；
第一CEA抗体、第四CEA抗体；
第二fPSA抗体、第四fPSA抗体、第五fPSA抗体、第七fPSA抗体；
第二tPSA抗体、第五tPSA抗体；
第二NSE抗体、第四NSE抗体、第五NSE抗体；
第一PGI抗体、第三PGI抗体；
第一PGII抗体、第二PGII抗体、第三PGII抗体、第五PGII抗体；
第一SCCA1抗体、第二SCCA1抗体、第四SCCA1抗体、第六SCCA1抗体。
2.实验设置方式
使以同一种男性肿瘤标志物作为特异性抗原的参试抗体分别作为捕获抗体(一抗)和检测抗体(二抗)，一一对应组合，开展抗体间的配对实验，抗体间的配对实验的实验参数为：载体，96微孔板；一抗稀释液，PBS；封闭液，5％脱脂奶粉+PBS；抗原稀释液，0.5％脱脂奶粉+PBS；二抗稀释液，PBS；洗涤液，0.1％tween-20+Tris.Cl。
3.检测结果
抗体间的配对实验结果如表12–21所示，可以选择具有高响应信号值的抗体对构建依据ELISA双抗体夹心法设计的检测男性恶性肿瘤的试剂盒。
表12抗AFP-特异性抗体的抗体间配对实验检测响应信号值
表13抗CA125-特异性抗体的抗体间配对实验检测响应信号值
表14抗TG-特异性抗体的抗体间配对实验检测响应信号值
表15抗CEA-特异性抗体的抗体间配对实验检测响应信号值
表16抗fPSA-特异性抗体的抗体间配对实验检测响应信号值
表17抗tPSA-特异性抗体的抗体间配对实验检测响应信号值
表18抗NSE-特异性抗体的抗体间配对实验检测响应信号值
表19抗PGI-特异性抗体的抗体间配对实验检测响应信号值
表20抗PGII-特异性抗体的抗体间配对实验检测响应信号值
表21抗SCCA1-特异性抗体的抗体间配对实验检测响应信号值
实施例3
1.实验设置方式
本实施例以配制捕获抗体混合物的芯片的固相载体作为变量设置两组处理组，处理组设置方式：处理a，以氨基化玻片作为芯片的固相载体；处理b，以醛基化玻片作为芯片的固相载体。
本实施例采用的一抗组合为实施例1中的：第三AFP抗体、第六CA125抗体、第五TG抗体、第一CEA抗体、第一CA199抗体、第一CA724抗体、第七fPSA抗体、第五tPSA抗体、第二tPSA抗体、第二NSE抗体、第三PGI抗体、第一PGII抗体和第二SCCA1抗体。
本实施例采用的二抗组合为实施例1中的：第一AFP抗体、第二CA125抗体、第四TG抗体、第四CEA抗体、第二CA199抗体、第二CA724抗体、第五fPSA抗体、第二tPSA抗体、第五tPSA抗体、第四NSE抗体、第一PGI抗体、第五PGII抗体和第一SCCA1抗体。
将一抗组合所包括的抗体溶于含有5％海藻糖的pH＝7.4磷酸盐缓冲液中形成抗体混合物；采用全自动点样仪(铂金艾尔默公司)，于抗体混合物中将每个抗体含量以0.01至0.5ng分别固定于氨基化玻片、醛基化玻片的点样孔中，具体的芯片点阵示意图如图1所示，生物素标记的牛IgG作为阳性对照。每种抗体还有两种不同浓度的阳性对照在每个芯片中都有四次的重复。然后加入二抗及底物进行检测。将分别采用处理a、处理b的参试缓冲液制备的芯片一一对应地编号为芯片a、芯片b。
2.测试结果
如图2和图3所示，芯片a和芯片b的背景都比较清晰，两者相比，芯片b具有更高的均一性及更低的检测限。由此可以得出，采用醛基化玻片作为固相载体制作得到的芯片具有更优异测试性能。
实施例4
1.实验设置方式
实施例以配制捕获抗体混合物的缓冲液的组成作为变量设置两组处理组，处理组设置方式：处理A，以pH＝7.4磷酸盐缓冲液作为参试缓冲液；处理B，以含有5％海藻糖的pH＝7.4磷酸盐缓冲液作为参试缓冲液。
本实施例采用的一抗组合为实施例1中的：第三AFP抗体、第六CA125抗体、第五TG抗体、第一CEA抗体、第一CA199抗体、第一CA724抗体、第七fPSA抗体、第五tPSA抗体、第二tPSA抗体、第二NSE抗体、第三PGI抗体、第一PGII抗体和第二SCCA1抗体。
本实施例采用的二抗组合为实施例1中的：第一AFP抗体、第二CA125抗体、第四TG抗体、第四CEA抗体、第二CA199抗体、第二CA724抗体、第五fPSA抗体、第二tPSA抗体、第五tPSA抗体、第四NSE抗体、第一PGI抗体、第五PGII抗体和第一SCCA1抗体。
将一抗组合所包括的抗体分别溶于处理A和处理B的参试缓冲液中形成抗体混合物；采用全自动点样仪(铂金艾尔默公司)，于抗体混合物中将每个抗体含量以0.01至0.5ng固定于醛基化玻片的点样孔中，具体的芯片点阵示意图如图1所示，生物素标记的牛IgG作为阳性对照。每种抗体还有两种不同浓度的阳性对照在每个芯片中都有四次的重复。然后加入二抗及底物进行检测。将分别采用处理A、处理B的固相载体制备的芯片一一对应地编号为芯片A、芯片B。
2.测试结果
芯片A和芯片B的测试结果分别如表22和表23所示，在抗体混合物提供的液体环境中，本实施例所选用的抗体均能够成功地进行针对同一目标抗原的一抗二抗抗体对配对，分别针对不同目标抗原的抗体间不会发生交叉反应。其中，芯片A中的抗CA199--特异性抗体间匹配响应信号值、抗PGII-特异性抗体间匹配响应信号值较低，与此相比，芯片B中的抗CA199--特异性抗体间匹配响应信号值、抗PGII-特异性抗体间匹配响应信号值明显更高，而芯片B中的其他特异性抗体间匹配响应信号值都能够达到与芯片A中的对应数值的同一水平。据此可以得出结论：制作检测芯片时，采用含有5％海藻糖的pH＝7.4磷酸盐缓冲液作为溶解一抗的缓冲液，能够有效提高特异性抗体间匹配的响应信号值，由此制得的检测芯片具有更高的灵敏度。
表22芯片A的响应信号值
表23芯片B的响应信号值
实施例5
1.检测男性恶性肿瘤的试剂盒的构建
本实施例提供的检测男性恶性肿瘤的试剂盒包括捕获抗体、生物素标记的检测抗体、试剂组、固相载体、软质硅胶垫、硬质框架和U形框夹。
试剂组包括如下试剂：
样品处理液---磷酸盐缓冲液(PBS)
1X封闭缓冲液(Blocking Buffer 8ml)---(5％海藻糖+5％脱脂奶粉+PBS)；
20X的洗液I(20X Wash Buffer I，30ml)：0.1％吐温20+PBS
20X的洗液II(20X Wash Buffer II,30ml)；0.02％吐温20+PBS
2X RIPA细胞裂解液(2X Cell Lysis Buffer，5ml)；
蛋白酶抑制剂(Proteinase Inhibitor，1管)；
磷酸酶抑制剂(Phosphatase Inhibitor Cocktail Set II，1管)；
荧光标记链霉亲和素(Cy3 equivalent，1张膜片配1管)。
本实施例采用的固相载体为经过亲水试剂的表面处理的醛基化玻片，固相载体上设有阳性对照孔和阴性对照孔。利用全自动点样仪(铂金艾尔默公司)，将本实施例所采用的捕获抗体固定在固相载体表面，具体的点样操作包括如下步骤：
1)将捕获抗体与含有5％海藻糖的pH＝7.4磷酸盐缓冲液混合形成捕获抗体混合物；
2)于捕获抗体混合物中将每种抗体含量以0.01–2ng固定于点样孔，每个抗体设置2至4个重复孔，抗体点阵排布于固相载体表面，固相载体表面每平方厘米点5种特异性抗体；
3)将点样好的芯片放于室温条件下静置过夜，然后在干燥器中抽气干燥2小时，制得检测芯片。
使用时，使U形框夹从两侧将由下至上放置的尺寸对应的硬质框架、软质硅胶垫和检测芯片夹紧，硬质框架表面被U形框夹划分为16或64孔每个小孔形成一个反应槽，检测芯片被U形框夹夹紧而贴紧反应槽的底部，由此，构建的试剂盒能实现多通量的检测。
2.检测男性恶性肿瘤的试剂盒的使用
S1.样本的预处理
利用RIPA细胞裂解液、蛋白酶抑制剂、磷酸酶抑制剂和抗原稀释液配制样本处理液，采用样本处理液对样本进行稀释，血浆、血清均适用于作为本实施例的心脏功能检测试剂盒的待测样本。
S2.固相载体的完全干燥
将固相载体从盒子中取出来，在室温平衡20–30分钟后，将包装袋打开，揭开密封条，然后将芯片放在真空干燥器或者室温干燥1-2小时。
S3.封闭和孵育
S3.1.
每个芯片孔中加入100μL的封闭缓冲液，室温摇床上孵育30分钟，避免产生气泡；抽去封闭缓冲液，每个孔中添加100μL稀释后的样本，一个阵列一个样品，4℃振荡过夜孵育。
S3.2.
使用Thermo Scientific Wellwash Versa芯片洗板机清洗玻片，分为两步，首先用1×洗液I进行清洗，每孔250μl的1×洗液I，清洗8次，每次震荡30s，震荡强度选择高，用去离子水稀释20×洗液I。然后换用1×洗液II通道进行清洗，每孔250μL的1×洗液II，清洗6次，每次震荡30秒，震荡强度选择高，用去离子水稀释20×洗液II。
S3.3.
抽去1×洗液II，配制生物素标记抗体，快速离心生物素标记抗体的小管，小管加入65μL的1×封闭液，混合均匀后，将生物素标记抗体小管中30μL的液体转移至含570μL封闭液的离心管中，混匀后分别每孔加入100μL，室温孵育2小时。
S3.4.
抽去1×洗液II，配制荧光标记链霉亲和素，快速离心荧光标记链霉亲和素的小管，小管加入50μL的1×封闭缓冲液，混合均匀后，将荧光标记链霉亲和素小管中10μL的液体转移至含1000μL封闭缓冲液的离心管中，混匀后分别每孔加入100μL，室温避光孵育2小时。
S4.荧光检测
采用GenePix 4000B Microarray Scanner激光扫描仪(Molecular Devices,LLC；1311Orleans Drive Sunnyvale,CA 94089-1136United States)扫描信号，利用GenepixPro 6.1软件获取芯片上所有点的信号强度，利用自行开发的电子表格版的分析软件计算每个蛋白的表达水平和标准曲线，利用阳性对照信号标准化，背景阈值设置对照组的平均强度加上2倍标准偏差(SD)进行统计，表达水平高于背景加上2xSD的蛋白用于校正的T检验分析。
3.测试例
本实施例分别以两种不同的抗体组合分别构建两个检测男性恶性肿瘤的试剂盒，分别标记为试剂盒Ⅰ和试剂盒Ⅱ：
3.1试剂盒Ⅰ
试剂盒Ⅰ采用的捕获抗体为实施例1中的：第三AFP抗体、第六CA125抗体、第五TG抗体、第一CEA抗体、第一CA199抗体、第一CA724抗体、第七fPSA抗体、第五tPSA抗体、第二NSE抗体、第三PGI抗体、第一PGII抗体和第二SCCA1抗体。
试剂盒Ⅰ采用的检测抗体为实施例1中的：第一AFP抗体、第二CA125抗体、第四TG抗体、第四CEA抗体、第二CA199抗体、第二CA724抗体、第五fPSA抗体、第二tPSA抗体、第四NSE抗体、第一PGI抗体、第五PGII抗体和第一SCCA1抗体。
3.2试剂盒Ⅱ
试剂盒Ⅱ采用的捕获抗体为实施例1中的：第三AFP抗体、第六CA125抗体、第五TG抗体、第一CEA抗体、第一CA199抗体、第一CA724抗体、第七fPSA抗体、第二tPSA抗体、第二NSE抗体、第三PGI抗体、第一PGII抗体和第二SCCA1抗体。
试剂盒Ⅱ采用的捕获抗体为实施例1中的：第一AFP抗体、第二CA125抗体、第四TG抗体、第四CEA抗体、第二CA199抗体、第二CA724抗体、第五fPSA抗体、第五tPSA抗体、第四NSE抗体、第一PGI抗体、第五PGII抗体和第一SCCA1抗体。
按照本实施例提供的方法分别使用试剂盒Ⅰ和试剂盒Ⅱ，并对试剂盒Ⅰ和试剂盒Ⅱ进行灵敏度、特异性以及稳定性的测试，相应的测试结果如表24所示。
表24试剂盒的性能参数
以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非对本发明保护范围的限制，尽管参照较佳实施例对本发明作了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的实质和范围。
Claims (10)
1.一种检测男性恶性肿瘤标志物的检测芯片，包括固相载体和固定在所述固相载体表面的捕获抗体，其特征在于：
所述捕获抗体包括：抗AFP-捕获抗体、抗CA125-捕获抗体、抗TG-捕获抗体、抗CA199-捕获抗体、抗CA724-捕获抗体、抗CEA-捕获抗体、抗fPSA-捕获抗体、抗tPSA-捕获抗体、抗NSE-捕获抗体、抗PGI-捕获抗体、抗PGII-捕获抗体、抗SCCA1-捕获抗体中的至少两种；
所述固相载体选自氨基化玻片或者醛基化玻片。
2.如权利要求1所述检测男性恶性肿瘤标志物的检测芯片，其特征在于：所述固相载体为醛基化玻片。
3.如权利要求1所述检测男性恶性肿瘤标志物的检测芯片，其特征在于，所述捕获抗体包括：所述抗AFP-捕获抗体、所述抗CA125-捕获抗体、所述抗TG-捕获抗体、所述抗CA199-捕获抗体、所述抗CA724-捕获抗体、所述抗CEA-捕获抗体、所述抗fPSA-捕获抗体、所述抗tPSA-捕获抗体、所述抗NSE-捕获抗体、所述抗PGI-捕获抗体、所述抗PGII-捕获抗体和所述抗SCCA1-捕获抗体。
4.如权利要求3所述检测男性恶性肿瘤标志物的检测芯片，其特征在于：
所述抗AFP-捕获抗体为购自广州瑞博奥生物科技有限公司的、货号为119-14002的抗体；
所述抗CA125-捕获抗体为购自广州瑞博奥生物科技有限公司的、货号为119-16017的抗体；
所述抗TG-捕获抗体为购自赛默飞世尔科技的、货号为MA1-21672的抗体；
所述抗CEA-捕获抗体选为购自广州瑞博奥生物科技有限公司的、货号为MD-14-0828的抗体；
所述抗CA199-捕获抗体为购自菲鹏生物股份有限公司的、货号为CA199-McAb2#的抗体；
所述抗CA724-捕获抗体为购自菲鹏生物股份有限公司的、货号为CA724-McAb1#的抗体；
所述抗fPSA-捕获抗体为购自上海鑫乐生物科技有限公司的、货号为XL02584的抗体；
所述抗tPSA-捕获抗体选自购自上海一基实业有限公司的、货号为ER558665的抗体或购自广州瑞博奥生物科技有限公司的、货号为DS-MB-02167的抗体；
所述抗NSE-捕获抗体为购自广州瑞博奥生物科技有限公司的、货号为DS-MB-02002的抗体；
所述抗PGI-捕获抗体为购自OriGene Technologies的、货号为AP21370BT-N的抗体；
所述抗PGII-捕获抗体为购自的南京欧凯生物科技有限公司、货号为K28c9的抗体；
所述抗SCCA1-捕获抗体为购自广州瑞博奥生物科技有限公司的、货号为130-10461的抗体。
5.如权利要求1–4任一项所述检测男性恶性肿瘤标志物的检测芯片的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：
S1.将所述捕获抗体与pH＝7.4±0.5磷酸盐缓冲液混合，形成捕获抗体混合物，所述磷酸盐缓冲液中含有0–10％的糖类物质；
S2.将所述捕获抗体混合液点样固定于所述固相载体表面的点样孔。
6.如权利要求5所述检测男性恶性肿瘤标志物的检测芯片的制备方法，其特征在于：所述磷酸盐缓冲液中含有0.5％的蔗糖。
7.如权利要求5所述检测男性恶性肿瘤标志物的检测芯片的制备方法，其特征在于：所述磷酸盐缓冲液中含有5％的海藻糖。
8.一种检测男性恶性肿瘤的试剂盒，其特征在于：包括如权利要求1–4任一项所述检测男性恶性肿瘤标志物的检测芯片。
9.如权利要求8所述检测男性恶性肿瘤的试剂盒，其特征在于：还包括被免疫标记物标记的检测抗体；
若所述捕获抗体包括所述抗AFP-捕获抗体，则所述检测抗体包括抗AFP-检测抗体；
若所述捕获抗体包括所述抗CA125-捕获抗体，则所述检测抗体包括抗CA125-检测抗体；
若所述捕获抗体包括所述抗TG-捕获抗体，则所述检测抗体包括抗TG-检测抗体；
若所述捕获抗体包括所述抗CA199-捕获抗体，则所述检测抗体包括抗CA199-检测抗体；
若所述捕获抗体包括所述抗CA724-捕获抗体，则所述检测抗体包括抗CA724-检测抗体；
若所述捕获抗体包括所述抗CEA-捕获抗体，则所述检测抗体包括抗CEA-检测抗体；
若所述捕获抗体包括所述抗fPSA-捕获抗体，则所述检测抗体包括抗fPSA-检测抗体；
若所述捕获抗体包括所述抗tPSA-捕获抗体，则所述检测抗体包括抗tPSA-检测抗体；
若所述捕获抗体包括所述抗NSE-捕获抗体，则所述检测抗体包括抗NSE-检测抗体；
若所述捕获抗体包括所述抗PGI-捕获抗体，则所述检测抗体包括抗PGI-检测抗体；
若所述捕获抗体包括所述抗PGII-捕获抗体，则所述检测抗体包括抗PGII-检测抗体；
若所述捕获抗体包括所述抗SCCA1-捕获抗体，则所述检测抗体包括抗SCCA1-检测抗体。
10.如权利要求9所述检测男性恶性肿瘤的试剂盒，其特征在于：
所述抗AFP-检测抗体为购自广州瑞博奥生物科技有限公司的、货号为DS-PB-00112的抗体；
所述抗CA125-检测抗体为购自广州瑞博奥生物科技有限公司的、货号为MAB5609的抗体；
所述抗TG-检测抗体为购自赛默飞世尔科技的、货号为MA5-33241的抗体；
所述抗CEA-检测抗体为购自菲鹏生物股份有限公司的、货号为3CEA-9的抗体；
所述抗CA199-检测抗体为购自菲鹏生物股份有限公司的、货号为CA199-McAb1#的抗体；
所述抗CA724-检测抗体为购自菲鹏生物股份有限公司的、货号为CA724-McAb2#的抗体；
所述抗fPSA-检测抗体为购自菲鹏生物股份有限公司的、货号为3PSA-17的抗体；
所述抗tPSA-检测抗体选自购自上海一基实业有限公司的、货号为ER558665的抗体或购自广州瑞博奥生物科技有限公司的、货号为DS-MB-02167的抗体；
所述抗NSE-检测抗体为购自广州瑞博奥生物科技有限公司的、货号为188-11440的抗体；
所述抗PGI-检测抗体为购自赛默飞世尔科技的、货号为MA1-83390的抗体；
所述PGII-检测抗体为购自OriGene Technologies的、货号为TA809596的抗体；
所述抗SCCA1-检测抗体为购自广州瑞博奥生物科技有限公司的、货号为130-10459的抗体。
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