CN107449918A - 一种蛋白芯片稳定剂及其制备方法和应用 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种蛋白芯片稳定剂及其制备方法和应用，所述蛋白芯片稳定剂为在PBS缓冲体系中包括蔗糖、牛血清白蛋白、Tween‑20、海藻糖和生物防腐剂Proclin 300。该方法制备的稳定剂可以延长蛋白免疫活性保存期，又能够节约成本，并且安全有效，不含其他化学制品。通过其中蔗糖与海藻糖突出地协同发挥效应，协调各自稳定性，更有效地提高整体蛋白芯片的稳定性。使试剂盒中在保存期内蛋白芯片的蛋白免疫活性不发生变化，并且本发明配方简单，价格低廉，适用范围广泛，不存在安全性隐患，具有良好的稳定效果与广阔的应用前景。
Description
技术领域
本发明属于生物制剂技术领域，涉及一种蛋白芯片稳定剂及其制备方法和应用。
背景技术
生物芯片技术是20世纪末期产生的高通量平行检测技术，它一经产生就显示了极大的优势。而蛋白质微阵列近年来也发展迅速，已经应用于TORCH感染病原体和过敏原的检测。目前有研究采用芯片的方法对15种自身抗体进行检测，发现蛋白芯片的检测灵敏度和特异度均和ELISA实验相当，也有研究用芯片对18种抗原的稀释血清检测到自身抗体，特异度和灵敏度也很高，而且可以达到40fg的检测下限。但是市场上的蛋白芯片稳定性差，保质期短，制作工艺繁琐并且成本高。
蛋白一般都是很高浓度在-80℃以液态形式保存一年甚至更长时间，但是商品化特别是用于医院的试剂盒一般都要求蛋白以固相形式在4℃或者室温25℃保存。并且为了减少误差，方便检测人员，一般都会以蛋白芯片的形式供应，但是这种蛋白芯片的蛋白是以固相形式附着于芯片上，而且蛋白浓度较低，稳定性差，保存期短。目前市场有通过甘油封闭蛋白芯片来延长蛋白芯片保存期，但结果并不理想。为了适应市场的需要，使试剂盒中在保存期内蛋白芯片的蛋白免疫活性不发生变化，故发明配方简单，价格低廉，适用范围广泛，不存在安全性隐患、具有良好的稳定效果的蛋白芯片稳定保存配方。
发明内容
针对现有技术的不足，本发明的目的在于提供一种蛋白芯片稳定剂及其制备方法和应用。
为达此目的，本发明采用以下技术方案：
一方面，本发明提供一种蛋白芯片稳定剂，所述蛋白芯片稳定剂为在PBS缓冲体系中包括蔗糖、牛血清白蛋白、Tween-20、海藻糖和生物防腐剂Proclin300。
在本发明中，利用蔗糖、牛血清白蛋白、Tween-20、海藻糖和生物防腐剂Proclin300组成PBS缓冲体系的生物制品稳定剂，该稳定剂可以提高蛋白芯片的稳定性，可以更好地延长蛋白芯片的保存期，又能够节约成本，并且安全有效，不含有其他化学类制品，不会对生物制品后续应用产生不利的影响。
优选地，在所述蛋白芯片稳定剂中，所述蔗糖的质量百分含量为1-6％，例如1％、1.3％、1.6％、2.1％、2.7％、3.4％、3.7％、4％、4.5％、5％、5.4％或6％，优选2-5％，进一步优选4％。
在本发明中，蔗糖属于非还原性二糖，自身的化学及生物性质非常稳定。目前，蔗糖在生物技术领域的主要应用集中于蛋白等生物活性物质的保护剂方面。糖类作为保护剂，其保护作用与它们的化学结构有密切关系。它们通常具有5个以上的羟基，可以与蛋白质形成氢键以取代水，保证了蛋白质的稳定性；在溶液中它们易结合水分子，发生水合作用，减少了游离水的含量并增加了溶液的粘性，从而减缓晶核的生长过程，使形成的冰晶较细小，以达到保护的目的。
优选地，在所述蛋白芯片稳定剂中，所述牛血清白蛋白(BSA)的质量百分含量为0.5-3％，例如0.5％、0.7％、0.9％、1％、1.2％、1.5％、1.8％、2％、2.2％、2.4％、2.6％、2.8％或3％，优选1-1.5％，进一步优选1％。牛血清白蛋白量过多(>5％)，会影响背景(空白)信号，使背景信号增高，影响测定准确性，如果牛血清白蛋白量过少，则起不到保护作用。
在本发明中，牛血清蛋白作为稳定剂的另一种配方，同样具有提高稳定性的作用。蛋白质在高浓度下保存时一般不易降解，理想的浓度为1mg/ml或更高。因此在抗体溶液中加入BSA作为稳定剂，以用来提高抗原抗体的稳定性，特别是低浓度的抗原抗体。
优选地，在所述蛋白芯片稳定剂中，所述Tween-20(吐温-20)的质量百分比含量为0.02-0.1％，例如0.02％、0.04％、0.05％、0.07％、0.08％、0.09％或0.1％，优选0.04-0.08％，进一步优选0.05％。
在本发明中，吐温-20作为一种非离子表面活性剂，具有乳化、扩散、增溶、稳定等作用。
优选地，在所述含蛋白芯片稳定剂中，所述海藻糖的质量百分比含量为2-8％，例如2％、2.7％、3％、3.8％、4.5％、5％、5.6％、6.3％、6.8％、7.4％、或8％，优选3-5％，进一步优选5％。
在本发明中，海藻糖是由两个葡萄糖分子以α,α,1,1-糖苷键构成的非还原性二糖，自身的化学及生物性质非常稳定。并且含有海藻糖的封闭液对预包被板条抗原、抗体以及酶标记抗体稳定性有非常好的保护作用。另外海藻糖在对抗高温影响蛋白活性方面具有明显的效果。
在本发明中，蔗糖和海藻糖在提高蛋白芯片稳定剂的稳定性上具有相互配合，相互协调的作用，具有非常显著的协同效果。
优选地，在所述蛋白芯片稳定剂中，所述生物防腐剂Proclin 300的质量百分比含量为0.01-0.05％，例如0.01％、0.02％、0.03％、0.04％或0.05％，优选0.02-0.05％，进一步优选0.05％。
在本发明中，生物防腐剂Proclin300是为了解决生物样本处理过程中保存期短的问题而诞生的新一代生物防腐剂，可以有效地控制体外诊断试剂中微生物的生长。当浓度达到0.02％-0.05％的条件下，他具有广谱抗菌活性，能在比较长的时间内抑制细菌、真菌、酵母菌等微生物的生长；同时，它又能保持体系中酶的活性。
优选地，在所述蛋白芯片稳定剂中，所述PBS缓冲体系为1×PBS缓冲液，其pH值为7.2-7.4，例如7.2、7.26、7.3、7.34或7.4。
在本发明中，应用PBS缓冲体系目的是为蛋白芯片提供合适的缓冲体系，使其在保存以及应用的过程中处于合适的缓冲环境下，为抗原抗体反应提供合适的环境，保证生物制品的活性以及稳定性。
优选地，所述蛋白芯片稳定剂为在PBS缓冲体系中包括以所述蛋白芯片稳定剂的总质量计质量百分含量如下的组分：1-6％的蔗糖、0.5-3％的牛血清白蛋白、0.02-0.1％的Tween-20、2-8％的海藻糖和0.01-0.05％的生物防腐剂Proclin300。
进一步优选地，所述蛋白芯片稳定剂为在PBS缓冲体系中包括以所述蛋白芯片稳定剂的总质量计质量百分含量如下的组分：4％的蔗糖、1％的牛血清白蛋白、0.05％的Tween-20、5％的海藻糖和0.05％的生物防腐剂Proclin 300。
另一方面，本发明提供了如上所述的蛋白芯片稳定剂的制备方法，所述制备方法为：将蔗糖、牛血清白蛋白、Tween-20、海藻糖和生物防腐剂Proclin300加入至PBS缓冲体系中，混合均匀，得到所述蛋白芯片稳定剂。
另一方面，本发明提供了所述蛋白芯片稳定剂在蛋白芯片保存中的应用。
相对于现有技术，本发明具有以下有益效果：
本发明利用蔗糖、牛血清白蛋白、Tween-20、海藻糖和生物防腐剂Proclin300组成PBS缓冲体系的蛋白芯片稳定剂，通过其中蔗糖与海藻糖突出地协同发挥效应，协调各自稳定性，更有效地提高整体蛋白芯片的稳定性。使试剂盒中在保存期内蛋白芯片的蛋白免疫活性不发生变化，并且本发明配方简单，价格低廉，适用范围广泛，不存在安全性隐患，具有良好的稳定效果与广阔的应用前景。
具体实施方式
下面通过具体实施方式来进一步说明本发明的技术方案。本领域技术人员应该明了，所述实施例仅仅是帮助理解本发明，不应视为对本发明的具体限制。
实施例1
在本实施例中，所述蛋白芯片稳定剂为在PBS缓冲体系中包括以所述蛋白芯片稳定剂的总质量计质量百分含量如下的组分：4％的蔗糖、1％的牛血清白蛋白、0.05％的Tween-20、5％的海藻糖和0.05％的生物防腐剂Proclin 300，其中PBS缓冲体系为1×PBS缓冲液，其pH值为7.2-7.4；
将蔗糖、牛血清白蛋白、Tween-20、海藻糖和生物防腐剂Proclin 300加入至PBS缓冲体系中，混合均匀，得到所述蛋白芯片稳定剂。
加速试验进行至第8天，在整个加速试验的过程中，每天的加速试验后和当天配制的效果一致，最低检测限均低于0.01ng/ml。线性R2﹥0.995，CV﹤10％。
实施例2
在本实施例中，所述蛋白芯片稳定剂为在PBS缓冲体系中包括以所述蛋白芯片稳定剂的总质量计质量百分含量如下的组分：3.5％的蔗糖、1.5％的牛血清白蛋白、0.06％的Tween-20、4.5％的海藻糖和0.03％的生物防腐剂Proclin300，其中PBS缓冲体系为1×PBS缓冲液，其pH值为7.2-7.4；
将蔗糖、牛血清白蛋白、Tween-20、海藻糖和生物防腐剂Proclin 300加入至PBS缓冲体系中，混合均匀，得到所述蛋白芯片稳定剂。
加速试验进行至第8天，前6天在整个加速试验的过程中，每天的加速试验后和当天配制的效果一致，最低检测限均低于0.01ng/mL。线性R2﹥0.995，CV﹤10％。从第7天，实验结果和当天配制的效果略有不同，电流信号值稍低，最低检测限升高至0.02ng/ml。线性R2＝0.993，CV﹤10％。
实施例3
在本实施例中，所述蛋白芯片稳定剂为在PBS缓冲体系中包括以所述蛋白芯片稳定剂的总质量计质量百分含量如下的组分：1％的蔗糖、3％的牛血清白蛋白、0.1％的Tween-20、8％的海藻糖和0.01％的生物防腐剂Proclin 300，其中PBS缓冲体系为1×PBS缓冲液，其pH值为7.2-7.4；
将蔗糖、牛血清白蛋白、Tween-20、海藻糖和生物防腐剂Proclin 300加入至PBS缓冲体系中，混合均匀，得到所述蛋白芯片稳定剂。
加速试验进行至第8天，前4天在整个加速试验的过程中，每天的加速试验后和当天配制的效果一致，最低检测限均低于0.015ng/mL(牛血清白蛋白增多，背景增高，检测限增高)。线性R2﹥0.995，CV﹤10％。从第5天，实验结果和当天配制的效果略有不同，电流信号值稍低，最低检测限升高至0.042ng/ml。线性R2＝0.991，CV﹤10％。
实施例4
在本实施例中，所述蛋白芯片稳定剂为在PBS缓冲体系中包括以所述蛋白芯片稳定剂的总质量计质量百分含量如下的组分：6％的蔗糖、0.5％的牛血清白蛋白、0.1％的Tween-20、2％的海藻糖和0.03％的生物防腐剂Proclin 300，其中PBS缓冲体系为1×PBS缓冲液，其pH值为7.2-7.4；
将蔗糖、牛血清白蛋白、Tween-20、海藻糖和生物防腐剂Proclin 300加入至PBS缓冲体系中，混合均匀，得到所述蛋白芯片稳定剂。
加速试验进行至第8天，加速试验第一天，CV较差，大于10％。到第三天，CV＞15％。当天配制的效果为：最低检测限均低于0.01ng/mL。线性R2﹥0.995，CV﹤10％。
实施例5
在本实施例中，所述蛋白芯片稳定剂为在PBS缓冲体系中包括以所述蛋白芯片稳定剂的总质量计质量百分含量如下的组分：1％的蔗糖、1.9％的牛血清白蛋白、0.02％的Tween-20、8％的海藻糖和0.01％的生物防腐剂Proclin 300，其中PBS缓冲体系为1×PBS缓冲液，其pH值为7.2-7.4；
将蔗糖、牛血清白蛋白、Tween-20、海藻糖和生物防腐剂Proclin 300加入至PBS缓冲体系中，混合均匀，得到所述蛋白芯片稳定剂。
加速试验进行至第8天，加速试验第一天，CV较差，大于10％。到第三天，CV＞15％。当天配制的效果为：最低检测限均低于0.01ng/mL。线性R2﹥0.995，CV﹤10％。
对比例1
与实施例1的区别仅在于，不加入蔗糖和海藻糖，其余成分用量均与实施例1相同。
加速试验第一天电流信号值降低，最低检测限增高至到0.05ng/ml。线性R2﹤0.99。加速试验第二天最低浓度电流信号值与背景电流值无显著性区别，线性R2﹤0.98。
对比例2
与实施例1的区别仅在于，不加入蔗糖，其余成分用量均与实施例1相同。
加速试验的结果：加速试验第一天，和当天配制的效果相差较大，电流信号值降低。最低检测限均大于0.02ng/mL。线性R2＝0.992，CV＝13％。
对比例3
与实施例1的区别仅在于，不加入蔗糖，海藻糖的用量为9％，其余成分用量均与实施例1相同。
加速试验的结果：加速试验第一天，和当天配制的效果相差较大，电流信号值降低。最低检测限均大于0.02ng/mL。线性R2＝0.994，CV＞15％。
对比例4
与实施例1的区别仅在于，不加入海藻糖，其余成分用量均与实施例1相同。
加速试验的结果：加速试验第一天，和当天配制的效果相差较大，电流信号值降低。最低检测限均大于0.02ng/mL。线性R2＝0.992，CV＞15％。
对比例5
与实施例1的区别仅在于，不加入海藻糖，蔗糖的用量为9％，其余成分用量均与实施例1相同。
加速试验的结果：加速试验第一天，最低检测限大于0.1ng/mL。线性R2＝0.993，CV＞15％。
对比例6
与实施例1的区别仅在于，不加入牛血清白蛋白，蔗糖的使用量为5％，其余成分的用量与实施例1相同。
加速试验的结果：加速试验第一天，最低检测限大于0.1ng/mL。线性R2＝0.992，CV＞15％。
对比例7
与实施例1的区别仅在于，不加入牛血清白蛋白，海藻糖的使用量为6％，其余成分的用量与实施例1相同。
加速试验的结果：加速试验第一天，最低检测限大于0.1ng/mL。线性R2＝0.992，CV＞15％。
对比例8
利用甘油作为蛋白芯片稳定剂，进行加速试验，测定其对蛋白芯片的稳定效果。
加速试验的结果：加速试验3天和当天配制的效果一致，最低检测限均低于0.01ng/ml。线性R2﹥0.995。加速试验第4天开始，电流信号值降低，最低检测限升高，线形差。
对比例9
与实施例1的区别仅在于，蔗糖的用量为0.5％，其余成分的用量与实施例1相同。
加速试验的结果：加速试验前3天，和当天配制的效果一致。第4天，最低检测限达到0.025ng/mL。线性R2＝0.991，CV＞10％。
对比例10
与实施例1的区别仅在于，蔗糖的用量为7％，其余成分的用量与实施例1相同。
加速试验的结果：加速试验进行8天。最低检测限均﹤0.03ng/ml，但CV＞10％。
对比例11
与实施例1的区别仅在于，牛血清白蛋白的用量为4％，其余成分的用量与实施例1相同。
加速试验的结果：加速试验进行8天。最低检测限均大于0.03ng/ml，且CV＞10％。
对比例12
与实施例1的区别仅在于，牛血清白蛋白的用量为0.3％，其余成分的用量与实施例1相同。
加速试验的结果：加速试验前2天，和当天配制的效果一致。第3天，最低检测限达0.042ng/mL。线性R2＝0.982，CV＞10％。
对比例13
与实施例1的区别仅在于，海藻糖的用量为1％，其余成分的用量与实施例1相同。
加速试验的结果：加速试验前2天，和当天配制的效果一致。第3天，最低检测限达0.042ng/mL。线性R2＝0.981，CV＞10％。
对比例14
与实施例1的区别仅在于，海藻糖的用量为9％，其余成分的用量与实施例1相同。
加速试验的结果：加速试验前2天，和当天配制的效果一致。第3天，最低检测限达0.045ng/mL。线性R2＝0.985，CV＞10％。
以上对实施例1-5制备得到的蛋白芯片稳定剂与对比例1-12制备得到的产品对蛋白芯片稳定性的影响进行了评估，其评估中，加速试验37℃4天相当于4℃半年。加速试验7天相当于4℃一年。考虑到须预留一定的安全系数，将加速试验进行到第八天，各项指标完好，认为用此稳定剂保存的酶标抗体工作液稳定性(有效期)4℃保存可达1年。
申请人声明，本发明通过上述实施例来说明本发明的蛋白芯片稳定剂及其制备方法和应用，但本发明并不局限于上述实施例，即不意味着本发明必须依赖上述实施例才能实施。所属技术领域的技术人员应该明了，对本发明的任何改进，对本发明产品各原料的等效替换及辅助成分的添加、具体方式的选择等，均落在本发明的保护范围和公开范围之内。
Claims (10)
1.一种蛋白芯片稳定剂，其特征在于，所述蛋白芯片稳定剂为在PBS缓冲体系中包括蔗糖、牛血清白蛋白、Tween-20、海藻糖和生物防腐剂Proclin300。
2.根据权利要求1所述的蛋白芯片稳定剂，其特征在于，所述蛋白芯片稳定剂中所述蔗糖的质量百分含量为1-6％，优选2-5％，进一步优选4％。
3.根据权利要求1或2所述的蛋白芯片稳定剂，其特征在于，所述牛血清白蛋白的质量百分含量为0.5-3％，优选1-1.5％，进一步优选1％。
4.根据权利要求1-3中任一项所述的蛋白芯片稳定剂，其特征在于，所述Tween-20的质量百分比含量为0.02-0.1％，优选0.04-0.08％，进一步优选0.05％。
5.根据权利要求1-4中任一项所述的蛋白芯片稳定剂，其特征在于，所述海藻糖的质量百分比含量为2-8％，优选3-5％，进一步优选5％；
优选地，所述生物防腐剂Proclin 300的质量百分比含量为0.01-0.05％，优选0.02-0.05％，进一步优选0.05％。
6.根据权利要求1-5中任一项所述的蛋白芯片稳定剂，其特征在于，所述PBS缓冲体系为1×PBS缓冲液，其pH值为7.2-7.4。
7.根据权利要求1-6中任一项所述的蛋白芯片稳定剂，其特征在于，所述蛋白芯片稳定剂为在PBS缓冲体系中包括以所述蛋白芯片稳定剂的总质量计质量百分含量如下的组分：1-6％的蔗糖、0.5-3％的牛血清白蛋白、0.02-0.1％的Tween-20、2-8％的海藻糖和0.01-0.05％的生物防腐剂Proclin 300。
8.根据权利要求1-7中任一项所述的蛋白芯片稳定剂，其特征在于，所述蛋白芯片稳定剂为在PBS缓冲体系中包括以所述蛋白芯片稳定剂的总质量计质量百分含量如下的组分：4％的蔗糖、1％的牛血清白蛋白、0.05％的Tween-20、5％的海藻糖和0.05％的生物防腐剂Proclin 300。
9.根据权利要求1-8中任一项所述的蛋白芯片稳定剂的制备方法，其特征在于，所述制备方法为：将蔗糖、牛血清白蛋白、Tween-20、海藻糖和生物防腐剂Proclin 300加入至PBS缓冲体系中，混合均匀，得到所述蛋白芯片稳定剂。
10.根据权利要求1-8中任一项所述的蛋白芯片稳定剂在蛋白芯片保存中的应用。
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