CN107607724A - 一种用于补体c3测定试剂盒的复合稳定剂及其应用 - Google Patents
一种用于补体c3测定试剂盒的复合稳定剂及其应用 Download PDFInfo
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Abstract
本发明公开了一种用于补体C3测定试剂盒的复合稳定剂,包括以下按重量比计的原料:封闭剂1‑5%,蔗糖1‑2.5%,表面活性剂1‑2%,乳化剂1‑1.5%,液体生物防腐剂0.1‑0.2%,余量为纯化水;上述复合稳定剂应用于补体C3测定试剂盒中,使用量为试剂盒中试剂体积分数的1‑3%;本发明的复合稳定剂配制简单,操作方便,确保了试剂盒检测结果的准确性,并且使用于补体C3测定试剂盒更加稳定,可有效延长试剂盒的保存时间。
Description
技术领域
本发明属于体外诊断领域,特别是涉及用于补体C3测定试剂盒的复合稳定剂、制备方法及其应用。
背景技术
补体(complement,C)是存在于人和脊椎动物血清及组织液中一组具有酶原活性的蛋白质。C3是血清中含量最高的补体成分,分子量为195000,主要由巨噬细胞、单核细胞、淋巴组织、骨髓、腹膜和肝脏等合成的一种β球蛋白,在C3转化酶的作用下,裂解成C3a和C3b两个片段,在补体经典激活途径和旁路激活途径中均发挥重要作用。
补体动态变化在临床上越来越受到重视,血清中补体C3浓度的升高或降低往往与机体状况有关,比如,补体C3浓度的增高常见于某些急性炎症或者传染病早期,如风湿热急性期、心肌炎、心肌梗死、关节炎等;再比如,补体C3浓度的降低常见于:①补体合成能力下降,如慢性活动性肝炎、肝硬化、肝坏死等;②补体消耗或者丢失过多,如活动性红斑狼疮、急性肾小球肾炎早期及晚期、基底膜增生型肾小球肾炎、冷球蛋白血症、严重类风湿关节炎、大面积烧伤等;③补体合成原料不足,如儿童营养不良性疾病;④先天性补体缺乏。
人血清中补体C3与其相应抗体反应,形成抗原-抗体复合物,该复合物的浊度与样本中补体C3的含量成正比,从而测定补体C3的含量。与补体C3结合的抗体作为一种蛋白质容易失活、降解,直接影响C3测定的结果,致使C3测定试剂盒缺乏稳定性,保存时间短,直接影响临床使用效果。
目前关于补体C3测定试剂稳定性的报道非常有限。专利CN201610431532.X和CN201510226758.1提供了一种胶乳免疫比浊的补体C3试剂盒及其制备方法,但未加入任何稳定剂,未对试剂盒的稳定性进行说明;专利CN201510226757.7提供了一种胶乳增强免疫比浊的补体C3检测方法,同样未加入任何稳定剂,未对试剂盒的稳定性进行说明。因此,研究一种配制简单、成本低廉、针对补体C3测定试剂盒有稳定效果的复合稳定剂,具有相当的市场价值。
发明内容
针对现有技术存在的问题,本发明的一个目的是提供一种用于补体C3测定试剂盒的复合稳定剂及其制备方法;本发明的另一目的是提供用于补体C3测定试剂盒的复合稳定剂的应用。本发明的复合稳定剂配制简单、成本低廉且对补体C3测定试剂盒有良好的稳定效果。
一种用于补体C3测定试剂盒的复合稳定剂,包括以下按重量比计的原料:
余量为纯化水。
优选地,所述封闭剂为牛血清白蛋白。
优选地,所述表面活性剂为丙二醇。
优选地,所述乳化剂为Triton X-100。
优选地,所述生物防腐剂为Proclin 300。
进一步优选地,所述用于补体C3测定试剂盒的复合稳定剂,包括以下按重量比计的原料:
余量为纯化水。
上述用于补体C3测定试剂盒的复合稳定剂的制备方法,包括以下步骤:
(1)按重量比称取上述原料;
(2)在溶解桶中依次加入称取的封闭剂、表面活性剂、蔗糖,加适量水搅拌使其完全溶解;
(3)然后加入乳化剂使上述原料充分乳化;
(4)乳化完全后,加入生物防腐剂和足量的水,搅拌使其完全溶解后用盖子密封反应桶,过滤,即得。
上述复合稳定剂的应用,所述的复合稳定剂应用于补体C3测定试剂盒中。
优选地,所述用于补体C3测定的试剂盒包括第一试剂和第二试剂,其中,所述第一试剂的组分包括:Tris碱1-5g/L、盐酸0.2-2g/L、氯化钠1-10g/L、PEG-4000 0.5-2g/L、山梨酸钾0.5-2g/L;所述第二试剂的组分包括:Tris碱1-5g/L、盐酸0.2-2g/L、补体3抗体0.5-2g/L、山梨酸钾0.5-2g/L。
优选地,所述第一试剂与第二试剂的体积比为1:100-1:10。
优选地,所述复合稳定剂的使用量为试剂盒中试剂的总体积分数的1-3%;进一步优选地,在第一试剂中加入第一试剂体积分数的1-3%的复合稳定剂,在第二试剂中加入第二试剂体积分数的1-3%的复合稳定剂。更优选地,在第一试剂中加入第一试剂体积分数的2%的复合稳定剂,在第二试剂中加入第二试剂体积分数的2%的复合稳定剂。
抗原抗体主要是属于蛋白质,因此要保持抗原抗体的活性主要就是要保持抗原抗体蛋白的空间结构的稳定。影响抗原抗体活性的因素主要有溶液的PH值、盐分和糖分的浓度、微生物的作用及空气的氧化等。一方面,由于氨基酸是很好的抗氧化剂,本发明优选以牛血清白蛋白作为封闭剂,可以有效的避免抗原抗体被空气氧化;各种糖能起到保护抗原抗体活性的作用,本发明优选蔗糖作为保护剂,对抗原抗体起到保护作用;离子螯合剂有多重功效,如抗氧化、防腐,亦可防止一些离子沉积;表面活性剂用于降低所述复合稳定剂的表面张力,本发明优选丙二醇作为表面活性剂,其可以保持抗原抗体表面的滋润使其不至于因失水而失活。另外,本发明的复合稳定剂中还加入了一些水溶性杂蛋白或化学惰性的高分子物质的聚合物,如Triton X-100等,因其分子量大能够在抗原抗体表面形成一种保护膜,使蛋白结构免遭破坏。另一方面,随着保存时间的延长,抗原抗体及稳定剂中的氨基酸、糖类等有机物易受到空气、水中微生物的腐蚀,因此加入一定的生物防腐剂,优选Proclin300。
本发明的有益效果:
1.本发明的复合稳定剂用于补体C3测定试剂盒中,同时确保了试剂盒检测结果的准确性,并且使补体C3测定试剂盒更加稳定,可有效延长试剂盒的保存时间;
2.本发明的复合稳定剂成本低廉,配制简单,使用方便,有利于进一步地广泛推广使用;
3.本发明的复合稳定剂中各组分之间相互协同作用,从而显著提高了补体C3测定的试剂盒的稳定性,使其可长期存储,延长了有效期。
具体实施方式
下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述,显然,所描述的实施例仅是本发明的一部分实施例,而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例,本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其它实施例,都属于本发明保护的范围。
本发明以下实施例中涉及的仪器有:日立全自动生化仪1台(日立7020,或者其它品牌)。
实施例1
一种用于补体C3测定试剂盒的复合稳定剂,所述复合稳定剂组分的含量为:10g/L牛血清白蛋白、10g/L丙二醇、1g/L Triton X-100、15g/L蔗糖、2g/L液体生物防腐剂Proclin300。
上述复合稳定剂的制备方法,包括以下步骤:
(1)在溶解桶中依次加入称取的牛血清白蛋白、丙二醇、蔗糖,加适量水搅拌使其完全溶解;
(2)然后加入Triton X-100使上述原料充分乳化;
(3)乳化完全后,加入Proclin300和足量的水,搅拌使其完全溶解后用盖子密封反应桶,过滤,即得。
实施例2
一种用于补体C3测定试剂盒的复合稳定剂,所述复合稳定剂组分的含量为:1g/L牛血清白蛋白、2g/L丙二醇、1g/L Triton X-100、2g/L蔗糖、0.1g/L液体生物防腐剂Proclin300。
上述复合稳定剂的制备方法,包括以下步骤:
(1)在溶解桶中依次加入称取的牛血清白蛋白、丙二醇、蔗糖,加适量水搅拌使其完全溶解;
(2)然后加入Triton X-100使上述原料充分乳化;
(3)乳化完全后,加入Proclin300和足量的水,搅拌使其完全溶解后用盖子密封反应桶,过滤,即得。
实施例3
一种用于补体C3测定试剂盒的复合稳定剂,所述复合稳定剂组分的含量为:5g/L牛血清白蛋白、2.5g/L丙二醇、1g/LTriton X-100、1.5g/L蔗糖、0.2g/L液体生物防腐剂Proclin300。
上述复合稳定剂的制备方法,包括以下步骤:
(1)在溶解桶中依次加入称取的牛血清白蛋白、丙二醇、蔗糖,加适量水搅拌使其完全溶解;
(2)然后加入Triton X-100使上述原料充分乳化;
(3)乳化完全后,加入Proclin300和足量的水,搅拌使其完全溶解后用盖子密封反应桶,过滤,即得。
实施例4
将实施例1的复合稳定剂应用于补体C3测定试剂盒中,并从长期稳定性和使用量两方面进行评价。
(一)稳定性试验
1、试验用稳定剂:实施例1所述的复合稳定剂;
2、试验用补体C3测定试剂盒,由试剂1和试剂2组成:
试剂1:Tris碱2.20g/L、盐酸0.52g/L、氯化钠7.20g/L、PEG-4000 1g/L、山梨酸钾1g/L;
试剂2:Tris碱2.20g/L、盐酸0.52g/L、补体3抗体1.50g/L、山梨酸钾1g/L。
3、试验方法及结果:
按实施例1配制得到的复合稳定剂,按2%(v/v的量加入补体C3测定试剂盒中(试剂1和试剂2均按此量添加),与不添加复合稳定剂的补体C3测定试剂盒分别测定样本中C3含量。
本试验以英国朗道特种蛋白质控水平2(质控2)和特种蛋白质控水平3(质控3)为样本,标准品为英国朗道特种蛋白校准品,采用日立7020型全自动生化分析仪进行检测,设一个空白测试(空白测试以生理盐水代替样本)、两个样本测试。样本与试剂1和试剂2的添加量分别为:250μl、50μl和50μl,设定的主波长为340nm、副波长为700nm,样本与试剂1混匀后,37℃孵育5min,读取各管吸光度A1,加入试剂2混匀后反应5min,读取吸光度A2,每管的吸光度变化Λ,A=A2-A1,扣除试剂空白后计算出样本、标准品的吸光度变化值Λ,然后根据自动计算出样本中C3含量。质控2中C3靶值为150mg/dL,质控3中C3的靶值为227mg/dL,允许偏差范围在±10%。
根据以上测定方法,以同批次同瓶装的质控2、质控3作为检测样本,分别用添加2%(V/V)复合稳定剂的C3测定试剂盒和不添加复合稳定剂的C3测定试剂盒进行检测,每7天检测一次,检测周期64天,计算得到测定质控结果的相对偏差(CV)、标准偏差(SD)、相对标准偏差(CV)和有效期天数,相对偏差、相对标准偏差这两项可反映测定结果的稳定性。测定结果详见下表1。
表1补体C3测定试剂盒的稳定性结果
由上表数据可知,未加入复合稳定剂的补体C3测定试剂盒与加入2%的复合稳定剂的试剂盒相比,其检测结果相对偏差、相对标准偏差分别明显偏高。说明没有加入复合稳定剂的补体C3测定试剂盒很不稳定,有效期天数只能维持8天左右。加入2%的复合稳定剂的补体C3测定试剂盒在整个测试周期中,准确度均在允许偏差范围内,精密度CV小于4%,说明该测定试剂盒在64天内能保持良好的稳定性、准确性、精密度。由此可见,添加了2%的复合稳定剂的补体C3测定试剂盒在测试稳定性、准确度、精密度方面表现更为优异,复合稳定剂对其有明显的稳定效果,可有效延长补体C3测定试剂盒的保存期限。
(二)复合稳定剂使用量的考察
1、试验用稳定剂:配制实施例1所述复合稳定剂;
2、试验用补体C3测定试剂盒,由试剂1和试剂2组成:
试剂1:Tris碱2.20g/L、盐酸0.52g/L、氯化钠7.20g/L、PEG-4000 1g/L、山梨酸钾1g/L;
试剂2:Tris碱2.20g/L、盐酸0.52g/L、补体3抗体1.50g/L、山梨酸钾1g/L。
3、试验方法及结果:
将复合稳定剂按照1%(v/v)、2%(v/v)、3%(v/v)的比例分别加入补体C3测定试剂盒中(试剂1和试剂2均按同样量添加),进行样本中补体C3含量的测定。按本发明稳定性试验的测定方法测定,计算得到测定质控结果的相对偏差(CV)、标准偏差(SD)、相对标准偏差(CV)和有效期天数,相对偏差、相对标准偏差这两项可反映测定结果的稳定性。结果见下表2。
表2复合稳定剂的添加量对补体C3测定试剂盒稳定性的影响
由上表数据可知,复合稳定剂的三种不同加入量对补体C3测定试剂盒的稳定作用均有所增强,从不同程度地延长试剂盒的保存期限和提高试剂盒的测试稳定性、准确度、精密度。加入1%的复合稳定剂的试剂盒作用最弱,有效期天数约15天;加入3%的复合稳定剂的试剂盒相对偏差、相对标准偏差较加入2%复合稳定剂的试剂盒低,说明3%的复合稳定剂的加入量不是最优选;2%的复合稳定剂添加量的试剂盒的相对偏差、相对标准偏差最小,说明加入2%的复合稳定剂的补体C3测定试剂盒测试稳定性、准确性、精密度最好,在试剂盒开瓶后64天左右还能保持良好的测试性能。因此,可定为复合稳定剂在补体C3测定试剂盒中的最佳使用量为2%。
从以上数据和分析结果可以得到,补体C3测定试剂盒加入本发明所述复合稳定剂后,能延长试剂盒的保存时间,有效提高测试稳定性、准确性、精密度,且最适加入体积比大约为2%。该复合稳定剂成本低廉,配制简单,值得进一步推广使用。
Claims (10)
1.一种用于补体C3测定试剂盒的复合稳定剂,其特征在于,包括以下按重量比计的原料:
2.根据权利要求1所述的用于补体C3测定试剂盒的复合稳定剂,其特征在于,所述封闭剂为牛血清白蛋白。
3.根据权利要求1所述的用于补体C3测定试剂盒的复合稳定剂,其特征在于,所述表面活性剂为丙二醇。
4.根据权利要求1所述的用于补体C3测定试剂盒的复合稳定剂,其特征在于,所述乳化剂为Triton X-100。
5.根据权利要求1所述的用于补体C3测定试剂盒的复合稳定剂,其特征在于,所述生物防腐剂为Proclin 300。
6.根据权利要求1-5中任一项所述的用于补体C3测定试剂盒的复合稳定剂的制备方法,其特征在于,包括以下步骤:
(1)按重量比称取上述原料;
(2)在溶解桶中依次加入称取的封闭剂、表面活性剂、蔗糖,加适量水搅拌使其完全溶解;
(3)然后加入乳化剂使上述原料充分乳化;
(4)乳化完全后,加入生物防腐剂和足量的水,搅拌使其完全溶解后用盖子密封反应桶,过滤,分装。
7.根据权利要求1-5中任一项所述的复合稳定剂的应用,其特征在于,所述的复合稳定剂应用于补体C3测定试剂盒中。
8.根据权利要求7所述的复合稳定剂的应用,其特征在于,所述用于补体C3测定的试剂盒包括第一试剂和第二试剂,其中,所述第一试剂的组分包括:Tris碱1-5g/L、盐酸0.2-2g/L、氯化钠1-10g/L、PEG-4000 0.5-2g/L、山梨酸钾0.5-2g/L;所述第二试剂的组分包括:Tris碱1-5g/L、盐酸0.2-2g/L、补体3抗体0.5-2g/L、山梨酸钾0.5-2g/L。
9.根据权利要求8所述的复合稳定剂的应用,其特征在于,所述第一试剂与第二试剂的体积比为1:100-1:10。
10.根据权利要求7-9中任一项所述的复合稳定剂的应用,其特征在于,所述复合稳定剂的使用量为试剂盒中试剂的总体积分数的1-3%。
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