CN105717292A - 脂蛋白磷脂酶a2检测试剂盒 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种脂蛋白磷脂酶A2检测试剂盒，该试剂盒包括试剂R1和试剂R2，试剂R1包括缓冲液、稳定剂、电解质、表面活性剂和防腐剂；试剂R2包括偶联抗脂蛋白磷脂酶A2抗体的聚苯乙烯胶乳颗粒、缓冲液、稳定剂、表面活性剂和防腐剂。抗脂蛋白磷脂酶A2抗体致敏的聚苯乙烯胶乳颗粒采用定向偶联的方法，制备步骤包括：聚苯乙烯胶乳颗粒的激活；抗脂蛋白磷脂酶A2抗体的氧化；抗脂蛋白磷脂酶A2抗体与聚苯乙烯胶乳颗粒的偶联。该试剂盒检测灵敏度高，检测范围宽，准确性好，抗干扰能力强。

Description

脂蛋白磷脂酶A2检测试剂盒

技术领域

本发明属于医学检测领域，涉及一种脂蛋白磷脂酶A2检测试盒。

背景技术

脂蛋白磷脂酶A2(1ipoprotein-associatedphospholipaseA2，Lp-PLA2)是近年来引起广泛关注的一种与动脉硬化和缺血性心脑血管疾病密切相关的磷脂酶A2超家族、一种新的炎症标记物和一种独立危险因子。它的分子量为45KD，由成熟的巨噬细胞和淋巴细胞合成和分泌，并受炎性介质的调节。脂蛋白磷脂酶A2具有促炎症的作用，因此Lp-PLA2从炎症细胞中产生和释放也可以被解读成为一个极佳的前炎症反应指标。Lp-PLA2在血管壁内产生氧化分子，它更易于导致动脉粥样硬化和产生不稳定性斑块。Lp－PLA2水平的升高预示着有斑块形成和破裂的很大危险性，并且不依赖其他脂类和CRP水平。通过检测循环系统中的Lp-PLA2水平，可以独立的预测心脑血管的病发。

目前常用的测定脂蛋白磷脂酶A2蛋白的方法有荧光免疫层析法、酶联免疫吸附法、上转发光法、胶乳增强免疫比浊法。其中大多数方法都无法准确进行定量测定，只有胶乳增强免疫比浊法可以用于准确定量测定，它的基本原理是：将抗体包被在胶乳颗粒上，在与相应抗原发生免疫反应后，能够形成聚集颗粒，在一定波长条件下，聚集颗粒形成的浊度与相应抗原有比例关系，因此通过测定聚集物所产生的浊度，即可测出样本中待检抗原的含量。目前将抗脂蛋白磷脂酶A2抗体包被到胶乳颗粒上的常用方法是物理吸附法或者随机方向偶联法，这些方法稳定性较差，抗体使用量大导致试剂成本高，而且容易受类风湿因子(RF)和嗜异性抗体的干扰，IgM、IgG型RF或者嗜异性抗体可以与包被在胶乳上的抗体的Fc段相结合，导致检测测值假性升高。

发明内容

本发明的目的是提供一种脂蛋白磷脂酶A2检测试剂盒，该试剂盒包括试剂R1、试剂R2，试剂R1包括缓冲液、稳定剂、电解质、表面活性剂和防腐剂；试剂R2包括偶联抗脂蛋白磷脂酶A2抗体的聚苯乙烯胶乳颗粒、缓冲液、稳定剂、表面活性剂和防腐剂。

在本发明的一个实施方案中，所述缓冲液包括但不限于PBS缓冲液、Tris缓冲液、甘氨酸缓冲液、硼酸盐缓冲液、醋酸盐缓冲液、柠檬酸-磷酸盐缓冲液、2-吗啉乙磺酸缓冲液、氯化铵缓冲液以及其他具有相似性质的缓冲液中的一种或者几种。

在本发明另一个实施方案中，所述防腐剂包括但不限于苯甲酸钠、亚硝酸钠、Proclin300、山梨酸钾、叠氮钠以及其他具有类似性质的防腐剂中的一种或几种。所述稳定剂包括但不限于聚乙二醇、丙二醇、蔗糖、丙三醇、山梨醇、BSA、海藻糖以及其他具有类似性质的稳定剂中的一种或者几种。

在本发明又一个实施方案中，所述电解质包括但不限于氯化钠、氯化钾、氯化钙以及其他具有类似性质的电解质中的一种或者几种。所述表面活性剂包括但不限于SPAN系列表面活性剂、TRITON系列表面活性剂、TWEEN系列表面活性剂以及其他具有类似性质的表面活性剂中的一种或者几种。

在本发明优选的实施方案中，所述R1试剂为含5g/LPEG8000（聚乙二醇8000），10g/L氯化钠，8g/L的蔗糖，5g/L的吐温20，1g/L叠氮钠的0.25M氯化铵缓冲液，pH值为9.0。

所述R2试剂为中含有1g/L的偶联抗脂蛋白磷脂酶A2抗体的聚苯乙烯胶乳颗粒，15g/L的蔗糖，2g/L的叠氮钠的0.1M氯化铵缓冲液；pH值为9.0。

在本发明中，所述偶联抗脂蛋白磷脂酶A2抗体的聚苯乙烯胶乳颗粒的制备步骤如下：

（1）聚苯乙烯胶乳颗粒的激活：在带有羧基的聚苯乙烯胶乳颗粒中加入乙基二甲基胺丙基碳化二亚胺，混合均匀，反应结束后加入己二酸二酰肼，继续反应，得到激活的聚苯乙烯胶乳颗粒；

（2）抗脂蛋白磷脂酶A2抗体的氧化：用高碘酸钠将抗脂蛋白磷脂酶A2抗体Fc端糖链上的羟基氧化成醛基；

（3）抗脂蛋白磷脂酶A2抗体与聚苯乙烯胶乳颗粒的偶联：将步骤（1）激活的聚苯乙烯胶乳颗粒和步骤（2）氧化的抗脂蛋白磷脂酶A2抗体混合进行反应，反应结束后，加入葡萄糖封闭聚苯乙烯胶乳颗粒上没有发生反应的集团，获得偶联抗脂蛋白磷脂酶A2抗体的聚苯乙烯胶乳颗粒。

本发明上述制备方法各个步骤中物料配比为：

步骤（1）中乙基二甲基胺丙基碳化二亚胺：聚苯乙烯胶乳颗粒=0.1-1:100（重量）；己二酸二酰肼：聚苯乙烯胶乳颗粒=10-50:100（重量）；所述聚苯乙烯胶乳颗粒粒径介于100nm-300nm之间。

步骤（2）中高碘酸钠:抗脂蛋白磷脂酶A2抗体=1:2（重量）；

步骤（3）中抗脂蛋白磷脂酶A2抗体：激活的聚苯乙烯胶乳颗粒=5-20:100（重量），葡萄糖：激活的聚苯乙烯胶乳颗粒=20-50：100（重量）。

本发明通过改进胶乳颗粒包被方法，使得该试剂盒灵敏度高，准确性好，线性范围宽，并且生产成本低。

本发明试剂盒中的试剂R2制备是一种抗原抗体反应试验方法，特别之处在于采用定向偶联法将抗脂蛋白磷脂酶A2抗体包被到聚苯乙烯胶乳颗粒上；本发明将抗脂蛋白磷脂酶A2抗体的非结合活性区域的Fc端定向偶联到聚苯乙烯胶乳颗粒上，不会发生类风湿因子(RF)和嗜异性抗体的干扰所导致的检测结果的假性升高；该方法定向偶联的抗脂蛋白磷脂酶A2抗体偶联到聚苯乙烯胶乳颗粒上后，其抗原结合位点指向流动相，抗体偶联部位为Fc片段，因此不会发生抗体结合力降低的情况，保持了抗体活力，从而大大减少抗体用量，降低了生产成本。

具体实施方式

下面将进一步的详细说明本发明。需要指出的是，以下说明仅仅是对本发明要求保护的技术方案的举例说明，并非对这些技术方案的任何限制。本发明的保护范围以所附权利要求书记载的内容为准。

实施例1脂蛋白磷脂酶A2检测试剂盒的制备

A、试剂R1的制备：

精密称取5gPEG8000，10g氯化钠，8g蔗糖，5g吐温20和1g叠氮钠；溶于1L的0.25M氯化铵缓冲液中，用1mol/L盐酸和1mol/L氢氧化钠溶液调节溶液pH值为9.0即得。

B、试剂R2的制备：

抗脂蛋白磷脂酶A2抗体：鼠单克隆抗体，ELISA法测定效价为1:50000。

胶乳颗粒：采用带羧基基团的粒径150-200nm的聚苯乙烯胶乳颗粒。

1、取1ml（50mg/ml）胶乳颗粒，用0.2M，pH5.0的MES溶液（2-吗啉乙磺酸缓冲液）洗涤三次，分散；

2、加入0.05ml用0.2M，pH5.0的MES溶液新鲜配制的10mg/mlEDAC溶液，室温反应1小时；

3、加入0.5ml用0.2M，pH5.0的MES溶液新鲜配制的100mg/ml已二酸二酰肼溶液，4度反应过夜；

4、用0.2M，pH5.0的MES溶液洗涤两次，0.1M，pH7.5的磷酸盐缓冲液洗涤一次，分散备用；

5、取1.5ml抗体（10mg/ml）溶液，加入0.5ml用0.1M，pH7.5的磷酸盐缓冲液配制的10mg/ml的高碘酸钠溶液，室温混合15分钟；

6、将步骤5中氧化好的抗体加入到步骤4中激活的胶乳颗粒溶液中，4度反应过夜；

7、加入0.5ml10%牛血清白蛋白溶液，4度反应2小时；

8、加入0.5ml10%葡萄糖溶液，4度反应过夜；

9、用0.1M，pH7.5的氯化铵缓冲液洗涤三次，加入含15g/L蔗糖，2g/L叠氮钠的0.1M，pH9.0的氯化铵缓冲液至胶乳颗粒终浓度为1g/L。

C、脂蛋白磷脂酶A2蛋白校准品溶液制备：

在0.9%生理盐水中加入不同含量的脂蛋白磷脂酶A2蛋白，除菌过滤。所述的脂蛋白磷脂酶A2蛋白校准品中脂蛋白磷脂酶A2的蛋白含量控制在0-800ng/ml之间。

实施例2试剂盒性能考察

采用实施例1制备的试剂盒进行如下测试：

1、精密度试验

使用2个不同脂蛋白磷脂酶A2含量的人血清样品，测定本发明检测试剂盒的批内精密度。使用3个批号检测试剂盒分别测定同一个人血清样品各20次，计算本发明检测试剂盒的批间相对极差。结果表明，本发明检测试剂盒的批内精密度为4.26%和1.78%（见表1），而批间相对极差为4.38%（见表2）。

表1

表2

2、线性测定试验

测定不同脂蛋白磷脂酶A2蛋白含量的标准品，脂蛋白磷脂酶A2蛋白标准品的浓度分别为10、20、40、80、100、200、400、600、800ng/ml，每个样本测试3次，求取平均值并进行回归分析的线性方程，结果表明线性方程的r²>=0.999，说明试剂盒在0-800ng/ml之间线性良好。

3、准确度试验

在去除脂蛋白磷脂酶A2的人血清样品中加入一定体积的标准溶液，获得5个不同含量的脂蛋白磷脂酶A2样本。每个样本测定三次，得到平均值，计算回收率。结果显示本发明检测试剂盒在各个浓度点的回收率摆动均小于3%（见表3）。

表3

4、灵敏度试验

用实施例1所制备的试剂盒对空白样本(含有5％牛血清的生理盐水)重复测定20次，最低检测限度为空白的均值浓度加上二个标准差，得到最低检测限度为1ng/ml。

实施例3试剂盒稳定性考察

在2-8℃储存条件下，分别在0个月、12个月和24个月对同一血清样本进行测定，每个样本测定20次，取均值（试验结果见表4）。结果表明，测值差异非常小，说明实施例1制备的检测试剂盒在2-8度储存条件下至少可以稳定24个月以上。

表4

测值差=（测定值-0月时测定值）/0月时测定值×100%

对比例1：除试剂R2中去除蔗糖外，其他均同实施例1

对比例2：试剂R1和R2中的缓冲液系统替换为甘氨酸缓冲液系统，其他均同实施例1

还需要说明的是本发明对试剂中缓冲液系统还进行过详细考察，采用PBS缓冲液系统，Tris缓冲液系统，HEPES缓冲液系统或者TAPS缓冲液系统的试剂盒的稳定性均会出现大幅下降，在保存12个月后，批内CV均>5%，测值差均>5%或<-5%。

pH对试剂盒稳定性的影响

按上述方法对实施例1制备试剂盒进行稳定性考察，区别仅在于各试剂盒中试剂R1和R2的缓冲液pH值存在不同，具体结果如下：

表5

实施例4试剂盒特异性考察

在同一份人血清样本中分别加入不同含量的干扰物质，然后进行测定。加入干扰物质后的测定值和加入干扰物质之前的测定值的差值与加入干扰物质之前的测定值的比值作为干扰率。试验结果表明游离胆红素，结合胆红素，血红蛋白以及乳糜微粒的浓度分别在200mg/dl，200mg/dl，4000mg/dl以及20000以下时，它们对测定结果的干扰均在5%以下（见表6）。

表6

对比试验：

采用实施例1的制备方法制备偶联抗脂蛋白磷脂酶A2抗体的聚苯乙烯胶乳颗粒，区别仅在于在所述步骤5中不添加高碘酸钠溶液，然后按照实施例1的方法制备试剂盒。除上述胶乳颗粒制备方法不同外，其他均同实施例1。

然后按照上述方法进行特异性实验，试验结果如下：

本发明内容仅仅举例说明了要求保护的一些具体实施方案，其中一个或更多个技术方案中所记载的技术特征可以与任意的一个或多个技术方案相组合，这些经组合而得到的技术方案也在本申请保护范围内，就像这些经组合而得到的技术方案已经在本发明公开内容中具体记载一样。

Claims (9)

1.一种脂蛋白磷脂酶A2检测试剂盒，该试剂盒包括试剂R1、试剂R2，试剂R1包括缓冲液、稳定剂、电解质、表面活性剂和防腐剂；试剂R2包括偶联抗脂蛋白磷脂酶A2抗体的聚苯乙烯胶乳颗粒、缓冲液、稳定剂、表面活性剂和防腐剂。

2.根据权利要求1所述检测试剂盒，其特征在于，所述缓冲液包括但不限于PBS缓冲液、Tris缓冲液、甘氨酸缓冲液、硼酸盐缓冲液、醋酸盐缓冲液、柠檬酸-磷酸盐缓冲液、2-吗啉乙磺酸缓冲液、氯化铵缓冲液以及其他具有相似性质的缓冲液中的一种或者几种。

3.根据权利要求2所述检测试剂盒，其特征在于，所述缓冲液为氯化铵缓冲液。

4.根据权利要求1所述检测试剂盒，其特征在于，所述电解质包括但不限于氯化钠、氯化钾、氯化钙以及其他具有类似性质的电解质中的一种或者几种；所述表面活性剂包括但不限于SPAN系列表面活性剂、TRITON系列表面活性剂、TWEEN系列表面活性剂以及其他具有类似性质的表面活性剂中的一种或者几种。

5.根据权利要求1所述检测试剂盒，其特征在于，所述R1试剂为含5g/LPEG8000（聚乙二醇8000），10g/L氯化钠，8g/L的蔗糖，5g/L的吐温20，1g/L叠氮钠的0.25M氯化铵缓冲液，pH值为9.0；所述R2试剂为中含有1g/L的偶联抗脂蛋白磷脂酶A2抗体的聚苯乙烯胶乳颗粒，15g/L的蔗糖，2g/L的叠氮钠的0.1M氯化铵缓冲液；pH值为9.0。

6.根据权利要求1所述检测试剂盒，其特征在于，所述偶联抗脂蛋白磷脂酶A2抗体的聚苯乙烯胶乳颗粒的制备步骤如下：

（1）聚苯乙烯胶乳颗粒的激活：在带有羧基的聚苯乙烯胶乳颗粒中加入乙基二甲基胺丙基碳化二亚胺，混合均匀，反应结束后加入己二酸二酰肼，继续反应，得到激活的聚苯乙烯胶乳颗粒；

（2）抗脂蛋白磷脂酶A2抗体的氧化：用高碘酸钠将抗脂蛋白磷脂酶A2抗体Fc端糖链上的羟基氧化成醛基；

（3）抗脂蛋白磷脂酶A2抗体与聚苯乙烯胶乳颗粒的偶联：将步骤（1）激活的聚苯乙烯胶乳颗粒和步骤（2）氧化的抗脂蛋白磷脂酶A2抗体混合进行反应，反应结束后，加入葡萄糖封闭聚苯乙烯胶乳颗粒上没有发生反应的集团，获得偶联抗脂蛋白磷脂酶A2抗体的聚苯乙烯胶乳颗粒。

7.根据权利要求6所述检测试剂盒，其特征在于，步骤（1）中乙基二甲基胺丙基碳化二亚胺：聚苯乙烯胶乳颗粒=0.1-1:100（重量）；己二酸二酰肼：聚苯乙烯胶乳颗粒=10-50:100（重量）；所述聚苯乙烯胶乳颗粒粒径介于100nm-300nm之间。

8.根据权利要求6所述检测试剂盒，其特征在于，步骤（2）中高碘酸钠:抗脂蛋白磷脂酶A2抗体=1:2（重量）。

9.根据权利要求6所述检测试剂盒，其特征在于，步骤（3）中抗脂蛋白磷脂酶A2抗体：激活的聚苯乙烯胶乳颗粒=5-20:100（重量），葡萄糖：激活的聚苯乙烯胶乳颗粒=20-50：100（重量）。