CN106996978A

CN106996978A - α2巨球蛋白检测试剂盒及其制备方法

Info

Publication number: CN106996978A
Application number: CN201710117035.7A
Authority: CN
Inventors: 刘永晖; 张小锐; 刘希
Original assignee: Beijing Strong Biotechnologies Inc
Current assignee: Beijing Strong Biotechnologies Inc
Priority date: 2017-03-01
Filing date: 2017-03-01
Publication date: 2017-08-01

Abstract

本发明涉及α2巨球蛋白检测试剂盒及其制备方法。该试剂包括第一试剂、第二试剂和校准品。第一试剂包含缓冲液、表面活性剂、电解质、高分子促进剂、稳定剂、防腐剂等；第二试剂包含缓冲液、抗人α2巨球蛋白抗体、电解质、防腐剂等。校准品包含缓冲液、α2巨球蛋白、防腐剂、抗氧化剂等。该试剂盒利用样本中的α2巨球蛋白与在试剂中的α2巨球蛋白抗体相结合反应形成浊度，通过该浊度的程度推算样本中α2巨球蛋白的含量。

Description

α2巨球蛋白检测试剂盒及其制备方法

技术领域

本公开涉及医学免疫体外诊断领域，具体涉及一种用免疫透射比浊法检测α2巨球蛋白的试剂盒。

背景技术

α2巨球蛋白(α2-macroglobulin，α2MG或AMG)是血浆中分子量最大的蛋白质。α2巨球蛋白的分子量约为65.2万-80万，含糖量约8％，由4个亚单位组成。它与淋巴网状系统细胞的发育和功能有密切联系。

α2MG最突出的特性是能与多种分子和离子结合。特别是它能与不少蛋白水解酶结合而影响这些酶的活性，如与肽链内切酶(包括丝氨酸、巯基、羧基蛋白水解酶和金属蛋白水解酶)的结合。这些蛋白水解酶包括纤维蛋白溶酶、胃蛋白酶、糜蛋白酶、胰蛋白酶及组织蛋白酶D等。

研究表明，α2MG与蛋白水解酶相互作用可使α2MG的分子构象发生变化，当酶处于复合物状态时，酶的活性部位没有失活，但不容易作用于大分子底物，若底物为分子量小的蛋白质，即使有其它抗蛋白酶的存在，也能被α2MG-蛋白酶复合物所催化而水解。这样，α2MG起到有选择地保护某些蛋白酶活性的作用，这在免疫反应中可能具有重要意义。

α2MG是由肝细胞与单核吞噬细胞系统中合成的，半寿期约5天，但当与蛋白水解酶结合成为复合物后其清除率加速。

α2MG的正常成人参考值为：男：1.50-3.50mg/ml，女：1.50-4.70mg/ml。α2MG升高见于肝病如急慢性肝炎、肝硬化等、肾病综合征、糖尿病以及恶性肿瘤等。α2MG降低见于急性肾小球肾炎、急性胰腺炎、胃溃疡、肺气肿、慢性肝炎、类风湿性肝炎、糖尿病、甲状腺功能亢进症、弥散性血管内凝血(DIC)、抗纤维蛋白溶解治疗、心脏手术、营养不良等。

目前的α2MG检测方法主要采用酶联免疫分析法。然而，此种检测方法的缺陷在于不能够用于全自动分析、耗时长、需要专门的技术人员和仪器。因此，本领域中仍然需要一种检测α2巨球蛋白的试剂盒，以克服酶联免疫分析法的缺点。

发明内容

本公开提供了一种α2巨球蛋白检测试剂盒，其包含：第一试剂、第二试剂和任选地校准品。

在一些实施方式中，第一试剂包含缓冲液、表面活性剂、电解质、高分子促进剂、稳定剂、防腐剂；第二试剂包含缓冲液、抗人α2巨球蛋白抗体、电解质、防腐剂；校准品包含缓冲液、人α2巨球蛋白、抗氧化剂、防腐剂。

在一些实施方式中，第一试剂、第二试剂和校准品中的缓冲液各自独立地选自：磷酸盐缓冲液、甘氨酸缓冲液、Tris缓冲液、CAPSO、MOPS、硼酸盐缓冲液、Hepes缓冲液及其组合。在一些实施方式中，第一试剂、第二试剂和校准品中的缓冲液浓度为10至600mM。

在一些实施方式中，第一试剂、第二试剂和校准品中的缓冲液的类型可以相同也可以不同；优选是相同的。第一试剂、第二试剂和校准品中的缓冲液浓度可以相同也可以不同。

在一些优选实施方式中，第一试剂和第二试剂中的缓冲液类型相同；第一试剂和第二试剂中的缓冲液浓度不同。

在一个具体实施方式中，第一试剂的缓冲液是200mM磷酸盐缓冲液；第二试剂的缓冲液是50mM磷酸盐缓冲液。本领域技术人员可以理解，随着缓冲液类型、浓度的改变，缓冲液的pH值也有所不同。

在一些实施方式中，α2巨球蛋白抗体为多克隆抗体或单克隆抗体，其中多克隆抗体选自：鼠抗人、兔抗人、羊抗人、鸡抗人、鸭抗人α2巨球蛋白抗体及其组合。在一些实施方式中，所述抗人α2巨球蛋白抗体浓度为10至500mg/ml，例如10、20、30、40、50、60、70、80、90、100、110、120、130、140、150、200、250、300、350、400、450、500mg/ml以及前述任意两个数值之间的范围。在一些具体的实施方式中，所述的抗体的浓度是20mg/ml。

在一些实施方式中，校准品中的所述α2巨球蛋白为自然抗原或人工合成抗原。

在一些实施方式中，所述的表面活性剂选自：Triton、Tween、月桂醚、聚氧乙烯烷基苯基醚中的一种或更多种。其中，所述聚氧乙烯烷基苯基醚是聚氧乙烯壬基苯基醚或聚氧乙烯辛基苯基醚。在一些实施方式中，所述的表面活性剂浓度为0.5至50g/L，优选0.5、1.0、2.0、3.0、4.0、5.0、10.0、15.0、20.0、30.0、40.0、50.0g/L以及前述任意两个数值之间的范围。在一些具体的实施方式中，所述的表面活性剂是吐温20，优选2.0至10.0g/L。

在一些实施方式中，所述电解质选自氯化钠、氯化钾、氯化镁、硫酸镁及其组合；所述电解质的浓度为5至100g/L，优选5至10g/L。在一些具体的实施方式中，所述电解质是氯化钠。在一些实施方式中，第一试剂和第二试剂中的电解质的类型可以相同也可以不同；优选是相同的。第一试剂和第二试剂中的电解质浓度可以相同也可以不同。

在一些实施方式中，所述高分子促进剂选自：脂肪醇聚氧乙烯醚、聚乙烯吡咯烷酮、乙二醇聚氧乙烯醚、羟丙基甲基纤维素、羟甲基纤维素钠、聚丙烯酸纳及其组合。所述高分子促进剂的浓度为2至100g/L，包括但不限于2.0、3.0、4.0、5.0、10.0、15.0、20.0、30.0、40.0、50.0、60、70、80、90、100g/L以及前述任意两个数值之间的范围。在一些实施方式中，所述高分子促进剂是脂肪醇聚氧乙烯醚；浓度优选2.0至10.0g/L。

在一些实施方式中，所述的稳定剂选自：甘露糖、葡萄糖、壳聚糖、山梨醇、牛血清白蛋白、乙二胺四乙酸二钠、果糖、海藻糖及其组合。在一些实施方式中，所述稳定剂的浓度为5至50g/L。优选，5.0、10.0、15.0、20.0、30.0、40.0、50.0g/L以及前述任意两个数值之间的范围。在一些具体的实施方式中，所述的稳定剂是BSA，优选2.0至10.0g/L。在一些具体的实施方式中，所述的稳定剂是海藻糖，优选2.0至10.0g/L；4至6g/L；更优选4.5至5.5g/L。

在一些实施方式中，所述的防腐剂选自：叠氮钠、苯酚、对羟基苯甲酸、对羟基苯甲酸乙酯、乙基汞硫代硫酸钠及其组合。所述防腐剂的浓度为1至10g/L。优选1.0、2.0、3.0、4.0、5.0、10.0g/L以及前述任意两个数值之间的范围。在一些实施方式中，所述防腐剂是NaN₃；浓度优选1g/L。在一些实施方式中，第一试剂、第二试剂、和校准品中的防腐剂的类型可以相同也可以不同。第一试剂、第二试剂、和校准品中的防腐剂浓度可以相同也可以不同。

根据需要，根据本公开的α2巨球蛋白检测试剂盒还包括校准品，校准品主要用于校准测量系统、评价测量程序或为待测样本赋值。因此，所述校准品包含已知浓度的α2巨球蛋白。本领域技术人员可以根据待测物质的浓度范围，采用本领域常用的方法自行制备适当浓度的校准品。

在一些具体实施方式中，根据本公开的α2巨球蛋白检测试剂盒还包括若干不同浓度的校准品，例如2个、3个、4个、5个甚至更多浓度的校准品。

在一个实施方式中，本公开的α2巨球蛋白检测试剂盒包括5个不同浓度的校准品。校准品含有α2巨球蛋白(分别为，但不限于，4.80mg/ml、2.40mg/ml、1.20mg/ml、0.60mg/ml和0.30mg/ml)、缓冲液，适当时还含有稳定剂、或防腐剂、抗氧化剂。校准品可制备成液体形式、干粉或冻干粉形式。

在一些实施方式中，所述的抗氧化剂选自：丁基羟基茴香醚、二丁基羟基甲苯、苯多酚、甘草抗氧化物、硫代二丙酸二月桂醚、没食子酸丙脂、特丁基对苯二酚、维生素及其组合。所述抗氧化剂的浓度为0.01至10g/L，优选0.01、0.02、0.03、0.04、0.05、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、1.0、2.0、3.0、4.0、5.0、10.0g/L以及前述任意两个数值之间的范围。在一些具体的实施方式中，所述的抗氧化剂是丁基羟基茴香醚，优选0.05至2.0g/L，更优选0.1至0.5g/L。

本公开提供了一种α2巨球蛋白检测试剂盒，其包含第一试剂、第二试剂、和任选地校准品，

其中，所述第一试剂包含：

其中，所述第二试剂包含：

所述第二试剂的pH为8.0；

其中，所述校准品包含：

所述校准品的pH为8.0。

本公开的试剂盒的检测原理是基于抗原抗体结合的动态测定。具体而言，样本中α2巨球蛋白和第二试剂中的α2巨球蛋白抗体发生抗原抗体结合，形成不溶性的抗原-抗体复合物，使反应产生一定的浊度。形成的免疫复合物的量随着样本中的α2巨球蛋白量的增加而增加，反应液的浊度液相应增加。在特定波长下测定该复合物的吸光值，与校准品标定的校准曲线比较，即可以计算出样本中α2巨球蛋白的含量。

附图说明

图1：本公开的α2巨球蛋白试剂盒的标准曲线。

图2：本发明实施例1和实施例2中试剂盒的定标曲线对比。◆实施例1；■实施例2。

图3：本发明实施例1和实施例2的试剂在37℃加速7天之后的定标稳定性实验对比。●实施例1；■实施例2。

图4：本公开的试剂盒与酶联免疫分析法的血清测值的相关性。

具体实施方式

为了使本公开易于理解，下面结合具体实施例进一步阐述本公开。以下提供了本公开实施方式中所使用的具体材料及其来源。但是，应当理解的是，这些仅仅是示例性的，并不意图限制本公开，与如下试剂和仪器的类型、型号、品质、性质或功能相同或相似的材料均可以用于实施本公开。

实施例1：

1.第一试剂制备过程如下：

第一试剂组成:

室温(22至28℃)条件下，按照上述配方表的浓度进行第一试剂的配制。

2.第二试剂制备过程如下：

第二试剂的组成：

将羊抗人α2巨球蛋白抗体的纯品(购自上海远慕生物科技有限公司)加入含有8.5g/L NaCl、1g/L NaN3、0.5M磷酸盐缓冲液溶液中，制得20mg/ml浓度的α2巨球蛋白抗体的第二试剂。

3.校准品的制备过程：

校准品组成：

按参考校准品所需要浓度，将α2巨球蛋白纯品加入含有5g/L的BSA、1g/L NaN3的50mM磷酸盐缓冲液溶液中，获得4.80mg/ml、2.40mg/ml、1.20mg/ml、0.60mg/ml和0.30mg/ml浓度的α2巨球蛋白参考校准品。

实施例2：

1.第一试剂制备过程如下：

第一试剂组成:

室温条件下，按照上述配方表的浓度进行第一试剂的配制。

2.第二试剂制备过程如下：

第二试剂的组成：

将α2巨球蛋白抗体纯品加入含有8.5g/L NaCl、1g/L NaN3、0.5M Tris缓冲液溶液中，制得20mg/ml浓度的α2巨球蛋白抗体的第二试剂。

3.校准品的制备过程同实施例1的章节3。

测试例1：α2巨球蛋白校准曲线的绘制

本公开试剂盒的测定步骤如下表1：

表1

以校准品浓度为横轴，相应的△OD340为纵轴，采用非线性拟合，如spline绘制出标准曲线，如图1。

测试例2：本公开的制备方法(实施例1与实施例2中试剂盒的重复性比较

采用实施例1、实施例2各自的试剂盒，选取高值和低值样本血清，使用OlympusAU400全自动生化分析仪对样本进行重复检测10次，考察各个实施例的重复性，检测结果如表2所示：

表2：重复性

结果显示，实施例1的试剂盒测定低值血清样本时，CV为0.61％，高值血清样本CV为0.17％，与实施例2的试剂盒相比实施例1的试剂盒具有很好的重复性。

测试例3：实施例1与实施例2试剂盒的热稳定性比较

实施例1试剂盒和实施例2试剂盒的差别之一在于实施例2中不添加海藻糖作为保护剂。

将实施例1和实施例2的试剂盒使用相同校准品定标，并绘制标准曲线(图2)。然后将两种试剂放置于37℃进行加速破坏试验，7天后在生化分析仪上对两种试剂进行定标，并绘制标准曲线(图3)。

通过对比可以看出实施例2经过37℃放置后，吸光度明显下降。而实施例1经过37℃放置后，定标吸光度没有明显改变。说明海藻糖可以提高试剂的稳定性。

测试例4：α2巨球蛋白试剂的线性

采用实施例1的试剂盒，将某一α2巨球蛋白浓度样本(血清)做倍比稀释，测定稀释后的浓度，测定三次求平均值，与理论浓度相比较，计算其线性偏差。

表3：线性结果

从表3可以看出本公开试剂盒的线性范围可达0.37-4.86mg/ml。

测试例5：本公开的α2巨球蛋白试剂与酶联免疫分析法(Elisa)测值相关性

相关性考察所用样本：肝素钠抗凝血清样本。

本公开的α2巨球蛋白检测试剂盒(实施例1制备的试剂盒)与现有技术(酶联免疫分析法)所得的测定值进行比较(如图4)，并进行回归分析。

获知相关性r²＝0.9943，y＝0.9944x+0.0387；显示出本方法与酶联免疫分析法在肝素钠抗凝血清α2巨球蛋白测定方面具有良好的相关性。

测试例6：实施例1与实施例2试剂盒的运输稳定性比较

将实施例1和实施例2的试剂盒，在常温条件下由北京运往上海，再由上海运回北京。使用Olympus AU400全自动生化分析仪定标后并检测国际参考物质ERM-DA470K(靶值1.43±0.06g/L)，检测重复3次，求平均值(见表4)。

表4

测试例7：实施例1与实施例2试剂盒的冻融稳定性比较

将实施例1和实施例2的试剂盒，冻融3次后。使用Olympus AU400全自动生化分析仪定标后并检测国际参考物质ERM-DA470K(靶值1.43±0.06g/L)，检测重复3次，求平均值(表5)。

表5

通过对比可以看出实施例2经过冻融实验后，检测国际标准物质测值下降。而实施例1经过运输后，检测国际标准物质测值没有明显改变。说明海藻糖可以提高试剂的冻融稳定性。

本公开的试剂盒建立了一种利用全自动生化分析仪检测α2巨球蛋白的方法，其中第一试剂包含缓冲液、表面活性剂、电解质、高分子促进剂、稳定剂、防腐剂，为样本中的抗原与第二试剂中的抗体发生反应创造了液体环境；第二试剂包含缓冲液、抗人α2巨球蛋白抗体、电解质、防腐剂。利用免疫透射比浊的方法原理，检测α2巨球蛋白抗体与样本中α2巨球蛋白反应产生的吸光度，通过与校准品的比对，可以推算出样本中α2巨球蛋白的含量。

参考文献

姜志宏,王建承,张臣烈,张圣道；α2巨球蛋白测定在急性胰腺炎中的意义[J]；上海医学检验杂志1998(04)。

张薇,朱光华,何威逊,罗运九,任志德,方明俊；尿α2-巨球蛋白检测在鉴别肾小球性与非肾小球性血尿中的意义[J]；中国当代儿科杂志.2004(05)。

陈文杰；α2巨球蛋白及其在免疫系统中的可能重要性[J]；国外医学.临床生物化学与检验学分册1981(03)。

Claims

1.一种α2巨球蛋白检测试剂盒，其包含：

第一试剂、第二试剂、和任选地校准品，

其中，

所述第一试剂包含缓冲液、表面活性剂、电解质、高分子促进剂、稳定剂、防腐剂，

所述第二试剂包含缓冲液、抗人α2巨球蛋白抗体、电解质、防腐剂，

所述校准品包含缓冲液、α2巨球蛋白、防腐剂、抗氧化剂。

2.根据权利要求1所述的α2巨球蛋白检测试剂盒，其中

所述第一试剂中的缓冲液选自：Tris缓冲液、磷酸盐缓冲液、甘氨酸缓冲液、CAPSO、MOPS、硼酸盐缓冲液、Hepes缓冲液中的一种或更多种；

所述第二试剂中的缓冲液选自：Tris缓冲液、磷酸盐缓冲液、甘氨酸缓冲液、CAPSO、MOPS、硼酸盐缓冲液、Hepes缓冲液中的一种或更多种；

所述校准品中的缓冲液选自：Tris缓冲液、磷酸盐缓冲液、甘氨酸缓冲液、CAPSO、MOPS、硼酸盐缓冲液、Hepes缓冲液中的一种或更多种；

优选，第一试剂中的缓冲液、第二试剂中的缓冲液和校准品中的缓冲液是相同的；

所述缓冲液的浓度为10mM至600mM。

3.根据权利要求1所述的α2巨球蛋白检测试剂盒，其中

所述的表面活性剂选自：Triton、Tween、月桂醚、聚氧乙烯烷基苯基醚中的一种或更多种，优选所述聚氧乙烯烷基苯基醚是聚氧乙烯壬基苯基醚或聚氧乙烯辛基苯基醚；

所述表面活性剂浓度为0.5至50g/L。

4.根据权利要求1所述的α2巨球蛋白检测试剂盒，其中

所述电解质选自氯化钠、氯化钾、氯化镁、硫酸镁中的一种或更多种；

所述电解质的浓度为5至100g/L。

5.根据权利要求1所述的α2巨球蛋白检测试剂盒，其中

所述高分子促进剂选自脂肪醇聚氧乙烯醚、聚乙烯吡咯烷酮、乙二醇聚氧乙烯醚、羟丙基甲基纤维素、羟甲基纤维素钠、聚丙烯酸纳中的一种或更多种；

所述高分子促进剂的浓度为2至100g/L。

6.根据权利要求1所述的α2巨球蛋白检测试剂盒，其中

所述的稳定剂选自甘露糖、葡萄糖、壳聚糖、山梨醇、牛血清白蛋白、乙二胺四乙酸二钠、果糖、海藻糖中的一种或更多种；

所述稳定剂的浓度为5至50g/L。

7.根据权利要求1所述的α2巨球蛋白检测试剂盒，其中

所述的防腐剂选自叠氮钠、苯酚、对羟基苯甲酸、对羟基苯甲酸乙酯、乙基汞硫代硫酸钠中的一种或更多种；

所述防腐剂的浓度为1至10g/L。

8.根据权利要求1所述的α2巨球蛋白检测试剂盒，其中

所述的抗人α2巨球蛋白抗体选自鼠抗人、兔抗人、羊抗人、鸡抗人、鸭抗人α2巨球蛋白抗体中的一种；

所述抗人α2巨球蛋白抗体浓度为10至500g/L。

9.根据权利要求1所述的α2巨球蛋白检测试剂盒，其中

所述的校准品中α2巨球蛋白的浓度为0.30至4.80mg/mL；优选4.80mg/ml、2.40mg/ml、1.20mg/ml、0.60mg/ml和0.30mg/ml。

10.根据权利要求1所述的α2巨球蛋白检测试剂盒，其中

所述的抗氧化剂选自：丁基羟基茴香醚、二丁基羟基甲苯、苯多酚、甘草抗氧化物、硫代二丙酸二月桂醚、没食子酸丙脂、特丁基对苯二酚、维生素中的一种或更多种；

所述抗氧化剂的浓度为0.01至10g/L。