CN105431728A - 凝集免疫测定法 - Google Patents

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Abstract

本发明提供颗粒增强的凝集免疫测定法，其包括以下步骤：将含有分析物的样品溶液与含有携带分析物的一个结合配偶体或多个结合配偶体的不溶性载体颗粒的溶液混合以制备混合溶液；基于第一和第二时间点之间的散射光的强度差异测定，从混合溶液散射的光的强度的变化(i)；基于第三和第四时间点之间的吸光度的差异，测定混合溶液的吸光度的变化(ii)；并且使用基于散射光强度的变化绘制的校准曲线和基于吸光度的变化绘制的校准曲线，将测定的散射光强度的变化(i)和测定的吸光度的变化(ii)与存在于样品中的分析物的量关联。本发明联合使用散射光的强度和吸光度的测量值用于单次测定，并且因此提供实现比常规测定更高的灵敏度和更宽的动态范围的颗粒增强的凝集免疫测定法。

Description

凝集免疫测定法
技术领域
本发明涉及凝集免疫测定法，更特别涉及颗粒增强的凝集免疫测定法，其包括散射光强度的测量和吸光度的测量。
背景技术
在当前的临床试剂领域，很多试剂实际上用于在颗粒增强的凝集免疫测定法中使用。颗粒增强的凝集免疫测定法是利用携带用于分析物的一个结合配偶体或多个结合配偶体的载体颗粒测定分析物的方法。使用这样的试剂的免疫测定法利用自动化的分析仪进行，其可以通过简单操作在短的时间内获得结果。利用这样的自动化的分析仪进行的光学测量测定散射光的强度或吸光度，其任一个在单一免疫测定法中独立进行。
基于散射光强度的测量的免疫测定法提供高的灵敏度，但是具有非常窄的动态范围。由于其窄的动态范围，需要重复的样品稀释和重新测量，直到分析物的浓度在测定系统的测量范围内。因此，这样的免疫测定法耗费大量时间用于报告测定结果。
同时，本领域技术人员公知，与基于散射光强度的测量的免疫测定法相比，基于吸光度的测量的免疫测定法具有某种程度上的更宽动态范围，但在低浓度分析物的测量的准确性方面较低。
已知一些解决颗粒增强的凝集免疫测定法中的该问题的技术。例如，专利文件1旨在通过在不同波长进行测量提供更高灵敏度和更宽动态范围的测定方法。
专利文件2和3中公开的用于颗粒增强的凝集免疫测定法的试剂旨在通过使用两种不同尺寸的载体颗粒，结合与研究的分析物具有不同反应性的抗体提供更宽的动态范围。
相关技术
专利文件
专利文件1：日本专利申请公开号H08-043393
专利文件2：日本专利申请公开号H11-108929
专利文件3：日本专利申请公开号2001-289853
发明概述
专利文件1中公开的技术的本质是控制信号的绝对值。在低浓度的分析物，在短波长进行测量，其提供强的信号，并且在高的分析物浓度，在长波长进行测量，其防止信号超过分析仪的检测上线。遗憾地，如本领域技术人员已知的，微粒溶液的浊度取决于波长，并且在较长波长信号较弱。专利文件1中公开的技术仅通过选择波长控制某些光学变化的信号强度，从而可以通过分析仪检测信号，并且预期不对补偿颗粒增强的凝集免疫测定法中有限的准确性和动态范围的缺点具有显著的改善效果。
专利文件2和3中公开的用于测定的试剂中包含的较小颗粒经历了与凝集相关的小的光学改变并且可以大量配制，并且该试剂中包含的具有较低反应性的抗体具有低的凝集能力。因此预期两种技术都具有扩展动态范围的作用。遗憾的是，由于使用较小颗粒和使用具有较低反应性的抗体造成的光学改变和凝集能力的减少是实现预期的与测定的灵敏度相关的性质的障碍。
如上文所述，难以既实现增加的灵敏度也实现扩展的动态范围，并且实践中尚未使用实现这两种改善的颗粒增强的凝集免疫测定法。
本发明人考虑在颗粒增强的凝集免疫测定法中组合散射光强度和吸光度的测量用于单次测定，以实现具有增加的灵敏度和扩展的动态范围的测定，并且已经证明了这样的免疫测定法的潜能。
例如，如日本专利申请公开号2001-141654中公开的，一些常规分析仪可以基本上同时测量散射光的强度和吸光度。这样的分析仪仅旨在利用单个分析仪实践两种不同的分析方法：测量散射光强度用于凝集免疫测定法，并且测量吸光度用于分光光度测量以测定与酶或化学反应相关的光谱改变。常规文件既未描述也未提示，并且没有人想到，在单次测定中包括组合的两种测量的颗粒增强的凝集免疫测定法。
阻碍想到此方法的一种原因是颗粒增强的凝集免疫测定法的灵敏度和动态范围极大取决于用于测定的试剂的组成。如上文所述，分析物和携带用于分析物的一个结合配偶体或多个结合配偶体的载体颗粒之间在某段时间的反应导致的凝集程度通过选择用于测定的试剂的主要组分来控制，即，通过选择结合配偶体的类型或量，或载体颗粒的尺寸来控制。具体而言，使用较大颗粒和具有更高反应性的结合配偶体导致增加的灵敏度，并且使用较小颗粒和具有较低反应性的结合配偶体导致更宽的动态范围。基于此，为了颗粒增强的凝集免疫测定法中增加的灵敏度和扩展的动态范围，本领域技术人员将他们的努力集中于用于测定的试剂的设计。
遗憾的是，如上文所述，难以同时既实现增加的灵敏度的增加又实现扩展的动态范围，并且本领域技术人员常常必须设计用于测定的试剂，从而考虑这两种特征之间的平衡并且根据样品中分析物的目标值，以改善灵敏度或动态范围之一，同时牺牲另一个的性能。因此，其集中于对具有不同组成的用于测定的试剂的设计的努力对于改善两种性能二者以显著解决该问题是不足够的。
本发明的目标是通过在单次测定中组合为了实现高的灵敏度的散射光强度的测量和在特异于动态范围的扩展的分析条件下吸光度的测量，提供比常规技术具有更高灵敏度和更宽动态范围的更简单的颗粒增强的凝集免疫测定法。
问题的解决方案
发明人进行了大量的研究，实现了在利用设计以在散射光强度的测量中提供高的灵敏度但限制动态范围的试剂进行的单次测定中包括散射光强度的测量和吸光度测量二者的颗粒增强的凝集免疫测定法。该方法包括测定两个时间点之间吸光度的变化，其中所述两个时间点之间的时间期间比测定散射光强度的变化的时间期间短。因此，发明人成功绘制了在单次测定中基本上覆盖分析物的低和高浓度范围二者的校准曲线，并且实现颗粒增强的凝集免疫测定法，其包括组合的散射光强度的测量和吸光度的测量二者，并且其实现高的灵敏度和宽的动态范围。
本发明提供以下方面：
方面[1].一种颗粒增强的凝集免疫测定法，其包括以下步骤：将含有分析物的样品溶液与含有携带用于分析物的一个结合配偶体或多个结合配偶体的不溶性载体颗粒的溶液混合以制备混合溶液；基于第一和第二时间点之间的散射光强度的差异测定从混合溶液散射的光的强度的变化(i)；基于第三和第四时间点之间的吸光度的差异测定混合溶液的吸光度的变化(ii)；和使用基于散射光强度的变化绘制的校准曲线和基于吸光度的变化绘制的校准曲线将测定的散射光强度的变化(i)和测定的吸光度的变化(ii)与存在于样品中的分析物的量关联。
方面[2].根据方面[1]的免疫测定法，其中所述第一、第二、第三和第四时间点分别在开始制备混合溶液之后的0和1000秒之间选择。
方面[3].根据方面[1]或[2]的免疫测定法，其中由第三和第四时间点限定且测定变化(ii)的时间期间比由第一和第二时间点限定且测定变化(i)的时间期间更短。
方面[4].根据方面[1]至[3]中任一项的免疫测定法，其中在相同波长测定变化(i)和(ii)。
方面[5].根据方面[1]至[3]中任一项的免疫测定法，其中在测定散射光强度的变化(i)所在波长的±25％的范围内的波长测定吸光度的变化(ii)。
方面[6].根据方面[5]的免疫测定法，其中在由分别比测定散射光强度的变化(i)所在波长更短和更长的主波长和次波长组成的两个波长测定吸光度的变化(ii)。
方面[7].根据方面[1]至[6]中任一项的免疫测定法，其中在550至900nm的范围的波长测定变化(i)和(ii)。
发明效果
本发明提供颗粒增强的凝集免疫测定法，其比常规测定提供更高灵敏度和更宽动态范围，并且其减少设计用于颗粒增强的凝集免疫测定法的试剂所需的努力和成本。
附图简述
图1是本发明中的测量散射光强度，测量吸光度，并且在作为比较实施例的常规方法中测量吸光度的条件下观察到的光量随PSA浓度-依赖的变化的图表。
图2A是由于在本发明中含有超高PSA浓度的样品在不同测量吸光度的条件下的免疫测定法中观察到的前带效应导致的测量值(在测量吸光度1的条件下)的减小的水平的图表。
图2B是由于在本发明中含有超高PSA浓度的样品在不同测量吸光度的条件下的免疫测定法中观察到的前带效应导致的测量值(在测量吸光度2的条件下)的减小的水平的图表。
图3是根据本发明的颗粒增强的凝集免疫测定法的PSA-阳性的免疫测定法中观察到的相关性的图表。
实施方案描述
现在将参考实施方案描述本发明，其不应该理解为限制本发明。
在一个实施方案中，所述颗粒增强的凝集免疫测定法包括以下步骤：
将含有分析物的样品溶液与包含携带用于分析物的一个结合配偶体或多个结合配偶体的不溶载体颗粒的溶液混合以制备混合溶液；
基于第一和第二时间点之间散射光强度的差异测定从混合溶液散射的光的强度的变化(i)；
基于第三和第四时间点之间吸光度的差异测定混合溶液的吸光度的变化(ii)；和
使用基于散射光强度的变化绘制的校准曲线和基于吸光度的变化绘制的校准曲线，将测定的散射光强度的变化(i)和测定的吸光度的变化(ii)与存在于样品中的分析物的量关联。
包括根据本发明实施方案的这样的步骤的方法允许绘制基本上覆盖分析物的低和高的浓度范围二者，并且在颗粒增强的凝集免疫测定法中实现高的灵敏度和宽的动态范围的校准曲线。
在优选的实施方案中，所述第一、第二、第三和第四时间点分别在开始制备混合溶液后的0和1000秒之间选择。在该范围选择时间点为免疫测定法提供所需的灵敏度和动态范围二者，并且还允许用于测定的试剂的设计中的高的自由程度。
散射光强度的变化(i)和吸光度的变化(ii)优选在相同波长测定，并且优选在550至900nm的范围内测定。
现在将通过对实施方案中包括的组分的解释来详细描述根据本发明的实施方案的颗粒增强的凝集免疫测定法，所述组分包括不溶性载体颗粒和分析物。
如本文使用的，术语″单次测定″是指在单个反应试杯中进行的一系列反应和测量。例如，利用自动化的分析仪进行的免疫测定法进行的″单次测定″包括以下在单个反应试杯中进行的步骤：将第一试剂溶液与样品混合；随后加入并混合第二试剂溶液(即含有携带用于分析物的一个结合配偶体或多个结合配偶体的不溶性载体颗粒的溶液)；测定散射光强度的变化；和测定吸光度的变化。
如本文使用的，术语″含有分析物的样品溶液″包括用上述第一试剂溶液(缓冲液)混合或稀释的样品溶液。
如本文使用的，术语″散射光的强度″也可替换地被称为″散射光强度″。
(不溶性载体颗粒)
用于本发明的颗粒增强的凝集免疫测定法的不溶性载体可以是适于作为用于测定的试剂的组分的任何材料。不溶性载体的具体实例包括乳胶，胶体金属，二氧化硅，和碳。不溶性载体颗粒可以具有适当地选自0.05至1μm的范围内的任何平均粒径。在优选的实施方案中，用于本发明的颗粒增强的凝集免疫测定法中的试剂含有比在散射光强度的测量期间发出的光的波长小的平均粒径的载体颗粒，差异是250至450nm，尤其是300至450nm。例如，如果散射光的强度的测量期间发出的光具有700nm的波长，不溶性载体颗粒优选具有250nm至400nm的平均粒径。例如，不溶性载体颗粒的平均粒径可以通过利用颗粒分析仪或透射电子显微镜的一般方法测定。
(样品)
例如，本发明的颗粒增强的凝集免疫测定法适用于各种类型的生物样品的测定，包括但不限于，体液如血液、血清、血浆和尿。
(分析物)
在本发明的颗粒增强的凝集免疫测定法中测定的分析物可以是可以理论上通过颗粒增强的凝集免疫测定法测定的任何分子，如蛋白、肽、氨基酸、脂质、糖、核酸、和半抗原。分析物的实例包括CRP(C-反应蛋白)，Lp(a)(脂蛋白(a))，MMP3(基质金属蛋白酶3)，抗-CCP(抗环瓜氨酸肽)抗体，抗磷脂抗体，抗-梅毒抗原抗体，RPR，IV型胶原蛋白，PSA，AFP，CEA，BNP(脑钠肽)，NT-proBNP，胰岛素，微量白蛋白，半胱氨酸蛋白酶抑制剂C，RF(类风湿因子)，CA-RF，KL-6，PIVKA-II，FDP，D-二聚体，SF(可溶性纤维蛋白)，TAT(凝血酶-抗凝血酶III复合物)，PIC，PAI，因子XIII，胃蛋白酶原I，胃蛋白酶原II，苯妥英，苯巴比妥，卡马西平(carbamazepine)，丙戊酸，和茶碱。
(结合配偶体)
用于根据本发明的颗粒增强的凝集免疫测定法的结合配偶体可以结合分析物的任何材料。结合配偶体的实例包括蛋白，肽，氨基酸，脂质，糖，核酸和半抗原。由于其特异性和亲和力，抗体和抗原通常用作结合配偶体。结合配偶体可以具有任何分子量，并且可以是天然存在的或合成的。
(用于测定的试剂)
用于本发明的颗粒增强的凝集免疫测定法的试剂可以具有任何组成。如果试剂用于利用临床实验室测试领域中通常使用的自动化分析仪的使用，所述试剂通常由两种溶液组成：含有缓冲液的第一试剂溶液(R1)；和含有携带用于分析物的一个结合配偶体或多个结合配偶体的载体颗粒的第二试剂溶液(R2)。
(用于测定的试剂的组分)
除了是用于反应的主要组分的携带一个结合配偶体多个结合配偶体的不溶性载体颗粒，用于根据本发明的测定的试剂还可以含有缓冲例如，样品的离子强度或渗透压的组分。这样的组分的实例包括乙酸、柠檬酸、磷酸、Tris、甘氨酸、硼酸、碳酸和Good′s缓冲液，和其钠盐、钾盐和钙盐。根据本发明的用于测定的试剂还可以含有用于增强凝集的组分。这样的组分的实例包括聚合物如聚(乙二醇)，聚(乙烯吡咯烷酮)，和磷脂聚合物。用于根据本发明的测定的试剂还可以含有一种或多种通常用于控制凝集的组分。这样的组分的实例包括大分子物质，蛋白，氨基酸，糖，金属盐，表面活性剂，还原物质和离液物质。用于根据本发明的测定的试剂还可以含有消泡物质。
(分析仪)
本发明的颗粒增强的凝集免疫测定法适于利用自动化分析仪进行。自动化分析仪的使用将免疫测定法所需的总反应时间减少至10分钟或更少，并且允许快速和简单测定。自动化分析仪优选可以基本上同时测量散射光和吸光度的强度，如日本专利申请公开号2013-64705中所公开的。
(散射角)
本发明的散射光强度的测量中的前向散射角可以具有任何值，并且优选在15至35度的范围内，更优选20至30度的范围内。这样的范围内的散射角防止由用于检测散射光的光接收器上的透射光导致的过度影响，并且对于其接收散射光的能力有利。
(散射光强度的测量)
根据本发明的散射光强度可以利用任何光源测量，并且用于测量的光可以具有任何波长。所述光优选具有适于颗粒增强的凝集免疫测定法的可见光区域内的波长。尤其是，所述波长优选在650至750nm的范围内。可以在任意两个预定的时间点之间测定散射光强度的变化。通常，如果两个时间点之间的时间期间更长，则提供更高的灵敏度。
上述自动化分析仪可以单独测定对于由在将含有分析物的样品溶液与含有携带用于分析物的一个结合配偶体或多个结合配偶体的不溶性载体颗粒的溶液混合后的0和至多1000秒之间选择的任意两个时间点限定的时间期间的散射光强度的变化和吸光度的变化。如果对于在混合后0至300秒之间选择的两个时间点限定的时间期间测定散射光强度和吸光度的各自的变化，测定可以将第一和第二试剂溶液的单次测定(对于单个样品)的总时间减少至10分钟或更少，并且提供各种可商购的自动化分析仪的最高样品分析速度的益处。
(吸光度的测量)
本发明的吸光度可以在任意波长测量，并且适当的波长在测定散射光强度的变化所在波长的±25％的范围内，优选在550至900nm的范围内，更优选在570至800nm的范围内。用于测量吸光度和散射光强度的波长可以相同或不同。本发明中的吸光度可以在单个波长或在由比在散射光强度的测量中使用的波长更短和更长的主波长和次波长组成的两个波长测量，所述波长在前述的范围内。例如，如果在700nm的波长测量散射光的强度，用于测量吸光度的主波长和次波长可以分别设在550至699nm和701至900nm的范围内。
可以对于在任意两个时间点的测量之间的时间期间测定吸光度的变化，并且适当地在比测定散射光强度的变化的时间期间更短的时间期间，优选一半或更少的时间期间测定。在另一实施方案，可以优选对于测定散射光强度的变化的时间期间的三分之一或更少的时间期间测定吸光度的变化。例如，如果如果对于300秒的时间期间测定散射光强度的变化，优选对于150秒或更短的时间期间，在一些情况下更优选100秒或更短的时间期间测定吸光度的变化。优选在将含有分析物的样品溶液与含有携带用于分析物的一个结合配偶体或多个结合配偶体的不溶性载体颗粒的溶液混合后立即开始测量。
(变化)
可以通过适于颗粒增强的凝集免疫测定法的任意方法测定本发明中的光量值(散射光的强度和吸光度)的变化，包括对于两个时间点计算差异，比例，和每单位时间的值。
(与分析物的量关联的步骤)
根据本发明的颗粒增强的凝集免疫测定法，对于含有已知浓度的分析物的样品分析散射光强度和吸光度以基于测量绘制各自的校准曲线。在低的分析物浓度，根据基于散射光强度的测量绘制的校准曲线测定浓度，从而实现高的灵敏度，并且在高的分析物浓度，根据基于吸光度的测量绘制的校准曲线测定浓度，从而实现宽的动态范围。基于吸光度的测定提供宽的动态范围，并且允许绘制覆盖更宽浓度范围的校准曲线。
(灵敏度和动态范围)
术语″灵敏度″是指最小的可测量的分析物的量。通常，与光的量相关的较大的光量的变化意味着更高灵敏度。在本发明的颗粒增强的凝集免疫测定法中，高的灵敏度由在低浓度测量分析物的量的高的准确性和可重复性表示。
术语″动态范围″是指最低和最高的可测量的分析物的量之间的范围。在本发明的颗粒增强的凝集免疫测定法，动态范围表示可以检测与分析物浓度成比例的光量的变化的范围。
颗粒增强的凝集免疫测定法的灵敏度和动态范围取决于包含在用于测定的试剂中并且携带用于分析物的一个结合配偶体或多个结合配偶体的不溶性载体颗粒。如上文所述，这两种特征处于平衡(trade-off)关系。
实施例
现在将通过实施例的方式更详细描述本发明，其不应该被理解为限制本发明的构成。
实施例1.根据本发明的颗粒增强的凝集免疫测定法的效果确认
(制备实施例：用于PSA测定的试剂的制备)
1.第二试剂溶液(R2)(固定抗体的乳胶的溶液)的制备
(1)将抗-PSA单克隆抗体#79和#91，以及通过普通方法合成并且具有320nm的平均粒径的乳胶颗粒分开用20mM甘氨酸缓冲液(具有pH9)稀释以制备各个抗体(0.7mg/mL)的溶液和1％(w/w)乳胶溶液。将各个抗体的溶液与等体积的乳胶溶液混合，并且将混合物搅拌约一小时。
(2)以相同量将封闭溶液(10％BSA)加入至步骤(1)中的各个混合物中，并且将各个混合物搅拌约一小时。
(3)将步骤(2)中的各个混合溶液进行离心以分离上清，并且随后将上清悬浮在5mMMOPS缓冲液(具有pH7.0)。调节得到的溶液，从而在600nm波长的吸光度为1.5Abs/mL。随后将这两种溶液以等量混合，从而制备第二试剂溶液(R2)(固定抗体的乳胶的溶液)。
2.第一试剂溶液(R1)的制备
将第一试剂溶液制备为含有1M氯化钾和0.1％BSA的30mMTris-HCl缓冲液(具有pH8.5)。
(分析仪和测量条件)
利用日本专利申请公开号2013-64705中公开的自动化分析仪在单次测定中测量散射光强度和吸光度二者。建立测量散射光强度的条件，从而发出的光的波长是700nm并且散射角是30度。建立测量吸光度的条件，从而由570nm的主波长和800nm的次波长组成的两个波长进行测量。向8μL的含有PSA的样品中加入，100μL的R1，并且将混合物搅拌并且随后在37℃进行孵育约300秒。孵育后，加入100μLR2，并且将混合物搅拌并且随后在37℃进行孵育约300秒。测定在孵育期间选择的两个时间点之间观察到的光量的差异以测定散射光强度和吸光度的变化。
(样品的校准曲线和测定)
将测量的散射光强度和吸光度的值利用PSA校准器(可从SEKISUIMEDICALCO.，LTD.获得)由样条(spline)分别校准，以绘制各自的校准曲线。基于各自的校准曲线测定样品中的PSA浓度。对于各个测量，根据在各个测量条件下的动态范围，选择校准曲线的浓度范围
(结果1：灵敏度)
通过根据本发明的免疫测定法，基于散射光强度和吸光度测定光量的变化。测定从加入R2后约30秒开始的270秒的时间期间的变化，认为其在根据实施例的PSA的测定中具有最高灵敏度。将含有不同的两个浓度(分别是0.4ng/mL和1ng/mL)的PSA的样品连续分析十次，并且对于散射光强度的测量和吸光度的测量确认可重复性(参见表1)。在对于PSA的临床截取值(cut-offvalue)是4ng/mL时，甚至在1ng/mL的浓度或更低，散射光强度的测量提供高的灵敏度并且显示高的准确性和可重复性。
[表1]
(结果2：动态范围)
在以下条件下，以用于测定的不同时间期间进行测量：对于在加入R2后约30秒(第一时间点)至第一时间期间后270秒(第二时间期间)的时间期间测量散射光的强度；在加入R2后约30秒(第三时间点(a))至第三时间点(a)后约90秒(第四时间点(a))之间的时间期间(本发明的条件1)测量吸光度1；在加入R2后约15秒(第三时间点(b))至第三时间点(b)后约90秒(第四时间点(b))之间的时间期间(本发明的条件2)测量吸光度2；并且在加入R2后约30秒(比较实施例的第三时间点)至比较实施例的第三时间点后270秒(比较实施例的第四时间点)之间的时间期间(常规条件(比较实施例))测量吸光度3。随后比较基于各个测量的测定的动态范围(参见图1)。
基于散射光强度的测量(-●-)的测定显示窄的动态范围，PSA浓度的峰为25ng/mL。在高于25ng/mL的浓度，散射光强度的变化逐渐减少。基于在常规条件下吸光度3的测量的测定(比较实施例)(-×-)显示类似的动态范围，但在高的浓度范围具有更适中的光量的变化的减少。基于本发明的条件下吸光度1和2的测量的测定(分别是-□-和-Δ-)甚至在高的浓度范围显示浓度-依赖的光量的增加。因此结果表明，本发明提供宽的动态范围。(结果3.前带效应(prozoneeffect)的影响的观察)
在测量根据本发明的吸光度1和2的条件下分析含有超过100ng/mL至300ng/mL的范围的浓度的PSA的样品(共同称为含有超高浓度的PSA的样品)，以观察前带效应(参见图2A和图2B)。前带效应是指由于过量的抗原导致的在颗粒增强的凝集免疫测定法中观察到的表观测量值的减少，并且因为其可以导致假阴性结果和接着的误诊，因此是临床实验室测试中的严重问题。
作为分析含有超高浓度的PSA的样品的结果，由于前带效应，在条件2下的测定显示更宽动态范围，具有更适度的测量值的减少。该结果提示，在测量吸光度1和2的条件下的实际测量上限分别是约50ng/mL(参见图2A)和100ng/mL(参见图2B)，并且表明，测量吸光度2的条件允许在更高浓度范围内的测量范围。
(结果4.相关性)
通过根据本发明的颗粒增强的凝集免疫测定法分析含有已知浓度的PSA的PSA-阳性样品，从而确认分别基于在低浓度范围(多至10ng/mL)和高的浓度范围(超过10.1ng/mL)，在测量散射光强度的条件下的测量(●)和在测量吸光度2的条件下的测量(Δ)的相关性(参见图3)。
结果显示高的相关性并且表明，本发明提供具有高的灵敏度和宽的动态范围的颗粒增强的凝集免疫测定法。
工业适用性
本发明利用组合用于单次测定的散射光强度和吸光度的测量。因此，本发明提供颗粒增强的凝集免疫测定法，其比常规测定提供更高灵敏度和更宽的动态范围，并且其减少设计用于颗粒增强的凝集免疫测定法的试剂所需的努力和成本。
对保藏的生物材料的参考
(1)(杂交瘤#63279，产生#79-抗体)
i)保藏生物材料的保藏机构的名称和地址：
国际专利生物保藏中心，日本产业技术综合研究所
TsukubaCentral6，1-1-1Higashi，Tsukuba，Ibaraki305-8566，日本
ii)在i)中的保藏机构中生物材料保藏的日期：
2010年2月19日
iii)由i)中保藏机构分配的保藏登记号：
FERMBP-11454
(2)(杂交瘤#63291，产生#91-抗体)
i)保藏生物材料的保藏机构的名称和地址：
国际专利生物保藏中心，日本产业技术综合研究所
TsukubaCentral6，1-1-1Higashi，Tsukuba，Ibaraki305-8566，日本
ii)在i)中的保藏机构中生物材料保藏的日期：：
2010年2月19日
iii)由i)中保藏机构分配的保藏登记号：
FERMBP-11455

Claims (7)

1.一种颗粒增强的凝集免疫测定法，其包括以下步骤：
将含有分析物的样品溶液与含有不溶性载体颗粒的溶液混合以制备混合溶液，所述不溶性载体颗粒携带分析物的一个结合配偶体或多个结合配偶体；
基于第一和第二时间点之间的散射光强度的差异，测定从混合溶液散射的光的强度的变化(i)；
基于第三和第四时间点之间的吸光度的差异，测定混合溶液的吸光度的变化(ii)；和
使用基于散射光强度的变化绘制的校准曲线和基于吸光度的变化绘制的校准曲线，将测定的散射光强度的变化(i)和测定的吸光度的变化(ii)与存在于样品中的分析物的量关联。
2.根据权利要求1所述的免疫测定法，其中第一、第二、第三和第四时间点分别在开始制备混合溶液之后的0和1000秒之间选择。
3.根据权利要求1或2所述的免疫测定法，其中由第三和第四时间点限定的用于测定变化(ii)的时间期间比第一和第二时间点限定的用于测定变化(i)的时间期间更短。
4.根据权利要求1至3中任一项所述的免疫测定法，其中在相同波长测定变化(i)和(ii)。
5.根据权利要求1至3中任一项所述的免疫测定法，其中在测定散射光强度的变化(i)所在波长的±25％的范围内的波长测定吸光度的变化(ii)。
6.根据权利要求5所述的免疫测定法，其中在由主波长和次波长组成的两个波长测定吸光度的变化(ii)，所述主波长和次波长分别比测定散射光强度的变化(i)所在波长更短和更长。
7.根据权利要求1至6中任一项所述的免疫测定法，其中在550至900nm的范围的波长测定变化(i)和(ii)。
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