CN115516312A - 通过胶乳凝集法测定目标物质的方法及其试剂 - Google Patents

通过胶乳凝集法测定目标物质的方法及其试剂 Download PDF

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Abstract

本发明公开了在低浓度区域及高浓度区域的任一个中都可准确地进行测定的、通过胶乳凝集法测定目标物质的方法及其试剂。在包括使敏化胶乳粒子的悬浮液与目标物质反应，然后从光学变化量来测定敏化胶乳粒子的凝集的、通过胶乳凝集法测定目标物质的方法中，敏化胶乳粒子敏化前的体积平均粒径为80 nm~335 nm，反应体系中敏化胶乳粒子的终浓度为0.005~0.10 w/v%，敏化胶乳粒子的敏化前粒径为80 nm以下的粒子在反应体系中的终浓度为0.09 w/v%以下，光学变化量为吸光度变化量和散射光变化量。

Description

通过胶乳凝集法测定目标物质的方法及其试剂
技术领域
本发明涉及通过胶乳凝集法测定目标物质的方法及其试剂。更详细而言，涉及组合散射光强度测定和吸光度测定的胶乳粒子增强免疫凝集测定方法及其试剂。
背景技术
利用了胶乳粒子的免疫测定法作为血清、血浆、尿等体液中所含测定对象的目标物质的定量方法在临床检查中应用，因为通过使用自动分析装置可简便/迅速地进行测定而广泛普及。
近年来，提出了以进一步提高测定性能为目的的应用技术。例如，目标物质在低浓度区测定中用可得到强信号的短波长，在高浓度区测定中使用不超过分析装置的信号检测范围上限的长波长来抑制信号的绝对值(专利文献1)。然而，胶乳微粒子溶液的浊度存在波长依赖性，波长越长信号越低是公知的事实，对于某种光学变化，在仅通过波长的选择来调整信号大小而使其适合于分析装置的该方法中，无法期待足以弥补在粒子增强免疫凝集测定方法中有关精度与动态范围的缺点的显著改善效果。
另外，在粒子增强免疫凝集测定法中，也有通过在一个测定中并用散射光强度测定和吸光度测定而能够进行高灵敏度且动态范围广的测定的方法(专利文献2)。然而，文献内记述，尽管散射光强度测定可增大低浓度区的范围，但为了获得效果，必须选择正确的粒径(专利文献3)。据记述，如果粒径变为300 nm以下，则无法获得散射光强度测定的效果。即，如该方法一样选择有效利用可增大低浓度区范围的散射光强度测定的特征的粒径，将缩小可测定高浓度区的吸光度测定的设计范围，无法达成可称为增大动态范围的显著效果。
而且，根据用抗体对2种以上平均粒径不同的胶乳粒子进行敏化而使用的测定法(专利文献4)，可在广泛浓度范围内进行测定。根据在具有单一平均粒径的胶乳粒子上合并使用多克隆抗体和单克隆抗体的方法(专利文献5)，可得到同样的效果。另外，提出了使用包被低反应性抗体的小粒径粒子和包被高反应性抗体的大粒径粒子的测定法(专利文献6、专利文献7)等。然而，这些文献中所记载的方法仅以吸光度测定作为对象进行设计，无法成为适用于使低浓度区范围增大的散射光强度测定。即，并未明确表示可增大低浓度区范围的散射光强度测定的优点以及可测定高浓度区的吸光度测定的优点两者都可享受的、使动态范围增大的真正的试剂设计。
另外，为了在胶乳粒子增强免疫凝集法中达成所期望的低浓度区域的测定而增加检材量与试剂量之比(在本说明书及权利要求书中称为“检材量浓度”)的倾向作为问题点被指出。若增加检材量浓度，则表观上可增加反应试剂中的抗原浓度。由此，可获得提高低浓度检材的测定精度的效果。然而，若增加检材量浓度，则目标物质以外的成分也増加，因此产生测定目标物质以外物质的(非特异)反应的可能性增加，这可成为做出错误判定(假阳性)的原因。
现有技术文献
专利文献
专利文献1：日本特开平08-043393号公报；
专利文献2：WO2014-192963号公报；
专利文献3：日本特开2013-64705号公报；
专利文献4：日本专利第2588174号公报；
专利文献5：日本特开平10-90268号公报；
专利文献6：日本特开平11-108929号公报；
专利文献7：日本专利第3513075号登载公报。
发明内容
发明所要解決的课题
本发明的目的为提供通过胶乳凝集法测定目标物质的方法及其试剂，所述方法在低浓度区域及高浓度区域的任一个中都可准确地进行测定。
用于解决课题的手段
本发明人进行深入研究的结果，发现了通过在并用吸光度测定与散射光测定的同时，在特定浓度范围中使用具有特定范围的体积平均粒径并且小胶乳粒子的浓度在规定值以下的胶乳粒子，在低浓度区域及高浓度区域的任一个中都可准确地进行测定，从而完成了本发明。
换言之，本发明提供以下内容。
(1) 通过胶乳凝集法测定目标物质的方法，其包括使敏化胶乳粒子的悬浮液与前述目标物质反应，然后从光学变化量来测定前述敏化胶乳粒子的凝集，其中，前述敏化胶乳粒子敏化前的体积平均粒径为80 nm~335 nm，反应体系中前述敏化胶乳粒子的终浓度为0.005~0.10 w/v%，前述敏化胶乳粒子的敏化前粒径为80 nm以下的粒子在反应体系中的终浓度为0.09 w/v%以下，前述光学变化量为吸光度变化量和散射光变化量。
(2) (1)所述的方法，其中，使用前述敏化胶乳粒子敏化前的体积平均粒径的1~10倍范围的波长的光来进行前述吸光度变化量及前述散射光变化量的测定。
(3) (1)或者(2)所述的方法，其中，前述吸光度变化量的测定波长使用在500~900nm范围内选择的2个波长，进一步地所选的2个测定波长使用主波长和比该主波长更长的副波长，而且，前期散射光变化量使用在500~900 nm范围内选择的1个波长。
(4) (1)~(3)的任1项中所述的方法，所述方法对于前述目标物质，在应达成测定值的下限值和上限值根据规定而确定的情况下，以仅通过吸光度测定达成该下限值所需要的最低检材量浓度的0.7倍以下的检材浓度进行。
(5) (1)~(4)的任1项中所述的方法，其中，在前述散射光变化量的测定中，在散射角为10°~30°的范围内测定至少1种散射。
(6) 通过胶乳凝集法测定目标物质的试剂，其包括使敏化胶乳粒子的悬浮液与前述目标物质反应，然后从吸光度变化量和散射光变化量来测定前述敏化胶乳粒子的凝集，其中，前述敏化胶乳粒子敏化前的体积平均粒径为80 nm~335 nm，反应体系中前述敏化胶乳粒子的终浓度为0.005~0.10 w/v%，前述敏化胶乳粒子的敏化前粒径为80 nm以下的粒子在反应体系中的终浓度为0.09 w/v%以下。
(7) (6)中所述的试剂，其中，敏化前的前述敏化胶乳粒子的体积平均粒径为前述吸光度变化量及前述散射光变化量的测定波长的1~1/10的范围。
发明效果
根据本发明的胶乳凝集法，使用自动分析装置，在低浓度区域及高浓度区域的任一个中都可准确地进行测定。
附图说明
[图1] 显示可用于本发明方法的自动分析装置的概况图(示意图)。
具体实施方式
本发明的方法基本上为被称为胶乳凝集法的周知方法的一种，在本发明的方法中，通过测定吸光度变化量和散射光变化量来进行胶乳粒子的凝集程度的测定。例如，在本发明的一个实施方式中，其可以如下方式进行。
换言之，在一个实施方式的方法中，具有下述步骤：
将包含测定对象的目标物质的试样溶液和包含负载有目标物质结合配偶体(binding partner)的胶乳粒子的溶液混合来调制混合液的步骤；
从第1、第2时间点间的散射光强度差来测定混合液的(a)散射光强度变化量的步骤；
从第3、第4时间点间的吸光度差来测定混合液的(b)吸光度变化量的步骤；和
使用基于散射光强度变化量的校准曲线以及基于吸光度变化量的校准曲线，将所测定的(a)散射光强度变化量以及(b)吸光度变化量与试样中目标物质的存在量相关联的步骤。
根据本实施方式，由于具有这样的步骤，因此可获得实质上包含从低浓度到高浓度的校准曲线，可进行高灵敏度且动态范围广的粒子增强免疫凝集测定。
在此，优选第1、第2、第3、第4时间点分别选自从混合液调制开始到1000秒后的期间。这是由于通过设为从混合液调制开始的1000秒以内，使得可在确保测定试剂设计自由度的同时满足所期望的灵敏度和所期望的动态范围两者。另外，优选在500到900 nm的波长范围内进行(a)散射光强度变化量以及(b)吸光度变化量的测定。
以下，对在本实施方式中使用的胶乳粒子或目标物质等进行说明，同时对于实施方式所涉及的胶乳粒子增强免疫凝集测定法进行详细说明。需要说明的是，在以下说明中，“一个测定”是指在一个反应槽中进行的一系列反应和测定。以在自动分析装置的测定为例，其是指在一个反应槽中进行第一试液与试样的混合和随后的第二试液(包含负载有目标物质结合配偶体的胶乳粒子的溶液)的添加混合、散射光强度变化量的测定以及吸光度变化量的测定。另外，本发明中的“包含目标物质的试样溶液”还包含如上所述与第一试液(缓冲液)混合稀释的检材溶液。
(胶乳粒子)
在本发明方法中使用的胶乳粒子可使用以往广泛使用的例如聚苯乙烯、苯乙烯-丁二烯共聚物、苯乙烯-苯乙烯磺酸盐共聚物等。由于这样的胶乳粒子为市售的，因此可优选使用市售品。市售品的胶乳粒子粒径非常均匀一致，可近似地认为标明粒径的市售胶乳粒子的所有粒子均具有所标明的粒径，在使用2种以上粒径不同的胶乳粒子的情况下，下述体积平均粒径的计算也可基于此近似进行计算。
使用的胶乳粒子可由多种粒径构成，但将结合配偶体敏化前(在本说明书及权利要求书中有时简称为“敏化前”)的体积平均粒径a为80~335 nm的范围，优选为100~300 nm的范围。体积平均粒径a由下述的数学式1求出，从第1成分的粒径a1 (nm)与相同成分的粒子内比率n1 (%)、第2成分的粒径a2 (nm)和相同成分的粒子内比率n2 (%)、第n成分的粒径an(nm)和相同成分的粒子内比率nn(%)求出。若体积平均粒径a低于80 nm，则由抗原抗体反应产生的胶乳粒子凝集块的大小变小，无法在目标物质的低浓度区的测定中得到足够的精度。另外，若体积平均粒径超过335 nm，则凝集块变得过大，会产生粒子沈降等，高浓度区的测定变得困难。
[数学式1]
Figure 596304DEST_PATH_IMAGE001
另外，反应体系中的敏化胶乳粒子的终浓度为0.005~0.10 w/v%的范围，优选为0.010~0.090 w/v%的范围。若低于0.005 w/v%，则粒子数不足，高浓度区的测定变得困难。相反，若粒子浓度超过0.10 w/v%，则初始状态的光学量(吸光度)变大，难以取得与光学变化量的测定上限的差，因此高浓度区的测定变得困难。
而且，敏化前胶乳粒子的粒径为80 nm以下的胶乳粒子为0.09 w/v%以下，优选为0.05 w/v%以下。若80 nm以下的粒子超过0.09 w/v%，则发生多重散射，使得散射光变化量的测定精度会降低。
(检材)
本发明的方法可将各种生物体试样作为测定对象，例如但不特别限于为血液、血清、血浆、尿等体液。
目标物质的测定下限值与上限值不仅出于临床上的意义，有时还出于各测定方法(免疫比浊法、胶乳凝集法、化学发光免疫法、荧光免疫法等)的技术上的理由作为某种行业标准的测定范围而被确定。例如，在于下述实施例中测定的胶乳凝集法的CRP (C反应性蛋白质)中，下限值0.01 mg/dL、上限值32 mg/dL成为行业标准。在使用各公司售卖的各检查试剂盒进行测定的情况下，为使测定值在此下限值以上且满足上限值，需要设定检材量浓度。在通过本发明的方法测定目标物质的情况下，优选以仅通过吸光度测定达成该下限值所需要的最低检材量浓度(检材量浓度B)的0.7倍以下的检材量浓度(检材量浓度A)进行。达成下限值和达成上限值是相反的，下限值通过提高检材量浓度而变得易于达成，但若为了达成下限值而提高检材浓度，则根据检材，出现不满足上限值的可能性变高。根据本发明的方法，可在仅通过以往的吸光度测定达成下限值所需要的最低检材量浓度B的0.7倍以下的检材量浓度A下进行测定，若如此降低检材量浓度，则可提高上限值，因此是有利的。换言之，通过使检材量浓度为0.7倍以下，可享受通过高灵敏度的散射光检测提高最低检测灵敏度的效果，同时可达成大幅提高高浓度测定区上限的效果。若超过0.7倍，则最低检测灵敏度提高，但可能无法充分得到提高高浓度测定区上限的效果。
(测定对象的目标物质)
作为本发明方法的测定对象的目标物质为蛋白质、肽、氨基酸、脂质、糖、核酸、半抗原等理论上可通过胶乳粒子增强免疫凝集测定法测定的分子即可，没有特别限制。作为实例，可列举CRP (C反应性蛋白质)、Lp (a) (脂蛋白(a))、MMP3 (基质金属蛋白酶3)、抗CCP (环状瓜氨酸化肽)抗体、抗磷脂抗体、抗梅毒抗原抗体、RPR、IV型胶原蛋白、PSA、AFP、CEA、BNP (脑利尿钠肽)、NT-proBNP、胰岛素、微白蛋白、胱抑素C、RF (类风湿因子)、CA-RF、KL-6、PIVKA-II、FDP、D-二聚体、SF (可溶性血纤蛋白)、TAT (凝血酶-抗凝血酶III复合物)、PIC、PAI、XIII因子、胃蛋白酶原I/II或苯妥英、苯巴比妥、卡马西平、丙戊酸(valproicacid)、茶碱等。
(结合配偶体)
作为提供给本发明的粒子增强免疫凝集测定法的结合配偶体，可列举出作为与对象的目标物质结合的物质的蛋白质、肽、氨基酸、脂质、糖、核酸、半抗原等，但出于特异性以及亲和性，通常利用抗体、其抗原结合性片段或抗原。另外，对分子量的大小、天然或合成等来源没有特别限制。
(测定试剂)
对关于提供给本发明方法的测定试剂的构成没有特别限制，但在考虑到在临床检查领域通用的自动分析装置中使用的情况下，通常为由以下2种液体构成的测定试剂：由缓冲液组成的第一试液(R1)和包含负载有针对目标物质的结合配偶体的胶乳粒子的第二试液(R2)。
需要说明的是，本发明的测定试剂还可分别单独测定吸光度变化量和散射光变化量。
(测定试剂的成分)
在本发明的方法中使用的测定试剂的成分，除了敏化(负载)了作为反应主成分的结合配偶体的胶乳粒子之外，还可包含作为缓冲试样的离子强度或渗透压等的成分，例如乙酸、柠檬酸、磷酸、Tris、甘氨酸、硼酸、碳酸及Good's缓冲液、或它们的钠盐、钾盐、钙盐等。另外，还可包含作为增强凝集形成的成分的聚乙二醇、聚乙烯吡咯烷酮、磷脂聚合物等高分子。另外，还可包含作为控制凝集形成的成分的高分子物质、蛋白质、氨基酸、糖类、金属盐类、表面活性剂类、还原性物质或离液物质等通用成分的1种或者多种成分的组合。另外，还可包含消泡成分。
(分析装置)
在本发明的方法中，适合利用测定所需的总反应时间为10分钟以内并且迅速且简便的自动分析装置，特别是如日本特开2013-64705号公报中公开的那样可几乎同时测定散射光强度和吸光度的自动分析装置是适宜的。但是本发明的方法并不限定于使用自动分析装置的方法。
在图1中显示可用于本发明方法的自动分析装置的一个适宜实例的整体概况构成。图1中，自动分析装置1具备检材盘10、反应盘20、试剂盘30、检材分注机构41、试剂分注机构42、计算机100、接口电路101等。检材盘10中具备驱动部12。反应盘20中具备驱动部22。试剂盘30中具备驱动部32。另外，反应盘20中设置有吸光光度计44和散射光度计45两种光度计。另外，在反应盘20中具备恒温槽28。另外，在反应盘20中设置有搅拌部43或洗净部46等。
计算机100具备分析控制部50、存储部70、输出部71、输入部72等。分析控制部50通过包含信号线等的接口电路101与各驱动部或各机构连接。计算机100例如由PC构成，但不限于此，也可由LSI基板等电路基板构成，也可由它们的组合构成。存储部70由ROM、RAM、非易失性存储装置等存储装置构成。
在检材盘10中设置并保持多个检材杯15。检材杯15为容纳检材2的检材容器。各检材杯15在检材盘10的盘主体11上沿圆周方向相互间隔地并列设置并保持。
检材盘10的驱动部12按照来自分析控制部50的控制驱动控制检材盘10。此时，驱动部12使盘主体11转动，使多个检材杯15沿圆周方向移动。检材盘10通过驱动部12的驱动控制，将设置在盘主体11的多个检材杯15中的1个检材杯15配置在沿圆周方向的规定位置上。规定位置为例如检材分注机构41的检材吸入位置等。
需要说明的是，在图1的构成例中，检材盘10的多个检材杯15在盘主体11上沿圆周方向配置成一列的圆周。不限于此，也可为将检材杯15以多列配置成盘主体11的同心圆状的构成。另外，在图1的构成例中，具有盘式的检材盘15，但不限于此，也可为架式。在架式中，使用以一维或者二维排列并保持多个检材容器的检材架。
试剂盘30设置在反应盘20的旁边。在试剂盘30的盘主体31中，设置并保持多个试剂瓶35。试剂瓶35为容纳试剂4的试剂容器。各试剂瓶35沿盘主体31的圆周方向相互间隔地并列设置并保持。在试剂瓶35中，容纳有与自动分析装置1中的检查项目的目标成分物质对应的种类的试剂4。每种试剂4都容纳在单独的试剂瓶35中。
试剂盘30的驱动部32按照来自分析控制部50的控制，使盘主体31转动，使多个试剂瓶35沿圆周方向移动。试剂盘30根据驱动部32的驱动控制，将设置在盘主体31的多个试剂瓶35中使用的1个试剂瓶35配置在试剂盘30的规定位置。规定位置为例如试剂分注机构42的试剂吸入位置等。
在试剂盘30中设有具备冷却机构的试剂冷库38。即使盘主体31在转动，配置在盘主体31上的多个试剂瓶35也以始终保持在试剂冷库38的冷却环境中的状态被冷却。由此，可实现防止试剂4的劣化。作为试剂冷库38的冷却机构，可使用例如循环低温水的方式或者通过珀耳帖元件在气相中冷却的方式等。
反应盘20设置在检材盘10与试剂盘30之间。在反应盘20的盘主体21中设置并保持多个反应容器25。反应容器25为制作反应液3的容器。反应液3为检材2与试剂4的混合液。通过检材分注机构41在反应容器25内分注检材2，通过试剂分注机构42分注试剂4，通过该检材2与试剂4的混合液来制作反应液3。各反应容器25沿盘主体21的圆周方向相互间隔地并列设置并保持。反应容器25由于通过吸光光度计44以及散射光度计45进行测定，因此由透光性材料构成。反应盘20的驱动部22按照来自分析控制部50的控制，使盘主体21转动，使多个反应容器25沿圆周方向移动。反应盘20通过盘主体21的转动，将多个反应容器25中的1个反应容器25配置在沿圆周方向设置的规定位置上。规定位置为例如检材分注机构41的检材排出位置或试剂分注机构42的试剂排出位置等。
配置在反应盘20的盘主体21上的多个反应容器25分别始终浸泡在恒温槽28内的恒温槽水(也称为恒温流体)中。由此，反应容器25内的反应液3保持在一定的反应温度(例如37℃程度)下。恒温槽28内的恒温槽水通过分析控制部50控制温度以及流量，控制向反应容器25供给的热量。
在反应盘20的圆周上以及圆周附近，除了检材分注机构41以及试剂分注机构42，还彼此位置不同地配置了搅拌部43、吸光光度计44、散射光度计45、洗净部46等。
检材分注机构41设置在检材盘10与反应盘20之间。检材分注机构41进行检材分注动作，即从检材盘10检材吸入位置的检材杯15吸入检材2，向反应盘20的检材排出位置的反应容器25排出的动作。检材分注机构41具备可动臂或分注喷嘴。分注喷嘴由安装于可动臂的移液管喷嘴组成。检材分注机构41在检材分注动作时，将分注喷嘴移动至检材盘10上的检材吸入位置，从配置在检材吸入位置的检材杯15将规定量的检材2吸入并容纳在分注喷嘴内。之后，检材分注机构41将分注喷嘴移动至反应盘20上的检材排出位置，向配置于检材排出位置的反应容器25内排出分注喷嘴内的检材2。
试剂分注机构42设置在试剂盘30与反应盘20之间。试剂分注机构42进行试剂分注动作，即从试剂盘30的试剂吸入位置的试剂瓶35吸入试剂4，向反应盘20的试剂排出位置的反应容器25排出的动作。所分注的试剂4为用于定量目标成分物质的试剂，所述目标成分物质为针对对象的检材2而设定的分析项目(也被称为检查项目等)。同样地，试剂分注机构42具备可动臂或分注喷嘴。试剂分注机构42在试剂分注动作时，将分注喷嘴移动至试剂盘30上的试剂吸入位置，从配置在试剂吸入位置的试剂瓶35将规定量的试剂4吸入并容纳在分注喷嘴内。之后，试剂分注机构42将分注喷嘴移动至反应盘20上的试剂排出位置，向配置于试剂排出位置的反应容器25内排出分注喷嘴内的试剂4。
在检材分注机构41以及试剂分注机构42中分别设有洗净槽46，以备不同种类的检材2或者试剂4的分注。洗净槽46为用于洗净分注喷嘴的装置。各分注机构将各分注喷嘴在分注动作前后于洗净槽46中洗净。由此，防止检材2之间或者试剂4之间的污染。另外，在各分注机构的分注喷嘴中配备有检测检材2或者试剂4的液面的传感器。由此，可监视以及检测由检材2或者试剂4的不足引起的测定异常。此外，在检材分注机构41中配备有检测分注喷嘴堵塞的压力传感器。由此，可监视以及检测因检材2中所含的血纤蛋白等不溶性物质堵塞分注喷嘴而发生的分注异常。分析控制部50通过包含那些传感器的机构，可监视以及检测测定时的各种异常等。
搅拌部43搅拌配置在作为反应盘20上的规定位置的搅拌位置的反应容器25内的检材2与试剂4的混合液。由此，将反应容器25内的混合液均匀地搅拌，促进该反应，制作为反应液3。在搅拌部43中具备：例如具备搅拌叶片的搅拌机或者使用超声波的搅拌机构。
在2种光度计中，具有作为第1种光度计的1个吸光光度计44，具有作为第2种光度计的1个散射光度计45。吸光光度计44以及散射光度计45的各光度计具有光源以及受光部作为基本的构造。各光度计的光源配置在例如反应盘20内周侧，各光度计的受光部配置在反应盘20的外周侧。各光度计与分析控制部50连接。
吸光光度计44对于配置在作为反应盘20上的规定位置的测定位置(特别是第1测定位置)的反应容器25的反应液3进行测定。散射光度计45对于配置在作为反应盘20上的规定位置的测定位置(特别是第2测定位置)的反应容器25的反应液3进行测定。在图1的构成例中，吸光光度计44以及散射光度计45的2个光度计设置在规定位置，所述规定位置在反应盘20的圆周上，在通过反应盘20的转动中心的对角线上相对。相对于第1测定位置配置吸光光度计44，相对于第2测定位置配置散射光度计45。需要说明的是，搅拌部43或洗净部46配置在圆周上、第1测定位置与第2测定位置之间的规定位置上。
吸光光度计44从光源向第1测定位置的反应容器25的反应液3照射光线。此时，吸光光度计44通过受光部检测从反应液3得到的透过光，测定单一或者多个波长的透过光的光量或者光强度的至少一种(有时记载为光量/光强度)。另外，吸光光度计44可基于该测定值、通过规定的计算获得浓度等定量值。吸光光度计44输出包含测定值或者计算值的信号。
散射光度计45从光源向第2测定位置的反应容器25的反应液3照射光线。此时，散射光度计45通过受光部检测从反应液3得到的散射光，测定散射光的光量或者光强度的至少一种(光量/光强度)。另外，散射光度计45可基于该测定值、通过规定的计算获得浓度等定量值。散射光度计45输出包含测定值或者计算值的信号。
洗净部46对于配置在反应盘20上的洗净位置的反应容器25进行洗净。洗净部46将残留的反应液3从结束了测定和分析的反应容器25中排出，将该反应容器25洗净。已洗净的反应容器25变为可再使用。换言之，再次从检材分注机构41分注下一个检材2、从试剂分注机构42分注下一个试剂4到该反应容器25中。
(散射角度)
对在本发明中使用的散射光强度测定的散射角度没有特别限制，但希望为10°~35°，更优选为20°~30°。通过使散射角度在前述范围，在用于检测散射光的受光部中不受透过光的强烈影响，而且对于接收散射光的能力也是有利的。
(散射光强度测定)
对在本发明中使用的散射光强度测定的光源或照射光波长没有特别限制，但胶乳粒子的上述体积平均粒径a的1~10倍为适宜的。作为更适宜的范围为1.5~5倍。若低于1倍，则有时高浓度检材的测定精度大幅降低。另外，若变为大于10倍，则有时作为散射光强度测定优点的最低检测灵敏度能力会大幅降低。对测定散射光强度变化量的2个时间点的测光间隔没有特别限制，通常间隔越长灵敏度越高。在前述自动分析装置中，可分别测定从包含测定对象的目标物质的试样溶液与包含负载有目标物质结合配偶体的胶乳粒子的溶液混合后立刻到最大1000秒为止的任意2个时间点的散射光强度测定和吸光度测定的变化量，但通过分别测定从混合后立刻到300秒以内的2个时间点的散射光强度变化量和吸光度变化量两者，可使通过第一试液、第二试液的每一个测定(一种试样)的总测定时间在10分以内，可享受市售的各种自动分析装置的最大检材处理速度的利益。
(吸光度测定)
对在本发明中使用的吸光度测定的波长没有特别限制，但与散射光强度的测定相同，所使用的胶乳粒子的体积平均粒径a的1~10倍为适宜的。作为更适宜的范围为1.4~8倍。若低于1倍，则有时高浓度检材的测定精度大幅降低。另外，若变为大于10倍，则有时最低检测灵敏度能力会降低。另外，作为在本发明中使用的吸光度测定的波长，可利用在前述范围内的1种波长测定，或者利用将与散射光强度测定中使用的波长相比的短波长侧的主波长和长波长侧的副波长组合起来的2波长测定，后者更准确更优选。对测定吸光度变化量的2个时间点的测光间隔没有特别限制，通常间隔越长灵敏度越高。
(变化量)
在本发明中使用的光量(散射光强度以及吸光度)的变化量为2个时间点间的差或比、每单位时间的换算值等可适用于胶乳粒子增强免疫凝集测定法的计算方法即可，没有特别限制。
(与目标物质的存在量相关联的步骤)
在本发明的胶乳粒子增强免疫凝集测定法中，使用含有已知浓度的目标物质的试样，分别作出散射光强度测定、吸光度测定各自的校准曲线，目标物质的低浓度区、即最低检测灵敏度基于高灵敏度的散射光强度测定的校准曲线来计算浓度，目标物质的高浓度区测定上限基于动态范围广的吸光度测定的校准曲线来计算浓度。在动态范围广的吸光度测定中，可在更广泛的浓度范围内作出校准曲线。
(检测变动系数(coefficient of variation，变异系数)比)
检测变动系数比为通过吸光度测定值与散射光测定值之比导出的在低值标准物质的再现性测定中的偏差度(变动系数)。
(高浓度区测定上限)
高浓度区测定上限是指可测定的最大目标物质量。本发明的方法的高浓度区测定上限为可检测与目标物质浓度成比例的光量变化的范围。在必要的情况下，通过适当稀释检材可达到合适的浓度。
实施例
以下，基于实施例更具体地说明本发明。但是，本发明并非限定于下述实施例。
(实施例1~3以及比较例1~9)
(调制例：单一粒径的CRP测定试剂的调制)
1. 第2试液(R2)：抗体结合胶乳溶液的调制
用抗CRP兔多克隆抗体(相对于抗体液中的总蛋白量(mg/mL)含有17%特异抗体量(mg/mL)的抗体液)对聚苯乙烯胶乳粒子进行敏化，分散悬浮于甘氨酸缓冲液中，调制试剂。换言之，试剂为在缓冲液(170mM甘氨酸、pH 6.0)中混合规定量的抗体与聚苯乙烯胶乳粒子，通过在室温下在60分钟内充分搅拌来进行敏化，之后通过离心操作除去上清，通过包含牛血清白蛋白的甘氨酸缓冲液对聚苯乙烯胶乳粒子表面的抗体未敏化部分实施封闭，再次通过离心操作聚集抗体敏化的聚苯乙烯胶乳粒子，通过在甘氨酸缓冲液中将胶乳粒子进行超声处理充分地将其分散悬浮来调制，获得第2试剂(抗体结合胶乳溶液：R2)。
2. 第一试液(R1)的调制
调制包含200mM氯化钠、1.0%BSA的170mM甘氨酸缓冲液，作为第一试液。
3. 标准试样
作为测定用试样，使用将人CRP精制抗原用正常人血清稀释而调制的CRP标准品。CRP标准品遵照血浆蛋白国际标准品CRM470进行赋值，准备了0.25、0.5、1、2、4、8、16、32、48、67、100 mg/dL。使用生理盐水作为0 mg/dL。
(分析装置和测定条件)
使用日本特开2013-64705号公报记载的自动分析装置，对于一个测定进行散射光强度和吸光度两者的测定。散射光强度测定的各条件以照射波长700 nm、散射角度20°以及30°进行测定，吸光度测定的各条件以主波长570 nm、副波长800 nm的2个波长进行测定。向包含CRP的1.5μL试样中添加122μL的R1并搅拌，在37℃下孵育约300秒后，添加122μL的R2并搅拌，根据在37℃下孵育约300秒期间的任意2个时间点间的光量之差来计算散射光强度与吸光度的变化量。
(校准曲线与试样测定)
使用校准曲线分别计算试样中的CRP浓度，所述校准曲线分别基于使用CRP校准器(DENKA生研公司(Denka Seiken Co., Ltd.)制)进行样条计算的散射光强度、吸光度。需要说明的是，校准曲线的浓度范围每次都根据在各测定条件下的动态范围进行选择。
(测定中的胶乳粒子浓度和检材量浓度)
在本测定中使用表1中显示的各种粒径、粒子浓度的胶乳粒子。另外，检材量浓度为0.62 v%。
实施例1~3以及比较例1~9中使用的原料以及所得试剂用以下方法进行评价。结果在表2中显示。
[检测变动系数比]
用于测定精度管理的CRP的对照血清(DENKA生研(Denka Seiken)制)的低值侧试样用生理盐水稀释至1/20作为检材，分别测定吸光度以及散射光强度，各n = 20。从所得n= 20的标准偏差求出不同测定方法的变动系数(CV)，以吸光度的变动系数(CVabs)为基准，求出散射光强度的变动系数(CVsc)的比例，将该值作为检测变动系数比(式2)。若检测变动系数比为1以下，则表示散射光强度的变动系数比吸光度的变动系数小，这成为期待作为散射光强度优点的检测灵敏度提高的指标。
[数学式2]
检测变动系数比=CVsc/CVabs
该结果表明，在比较例1~8的使用胶乳粒径60 nm以及70 nm的试剂中，在经调整的任何粒子浓度(0.074~0.350 w/v%)下，检测变动系数比都为1以上，这是无法期待作为散射光检测体系优点的低值灵敏度提高的试剂组成。
在使用210 nm的胶乳粒子的试剂中，在粒子浓度为0.008~0.033 w/v% (实施例1~3)的范围下，检测变动系数比为1以下，表明了在该粒径以及浓度范围下为可期待作为散射光检测体系优点的低值灵敏度提高的试剂组成。然而，即使同样使用210 nm的胶乳直径，在粒子浓度为0.004 w/v % (比较例9)时，检测变动系数比也为1以上。
[表1]
Figure 863337DEST_PATH_IMAGE002
[表2]
Figure 999920DEST_PATH_IMAGE003
(实施例4~7)
以验证在实施例1~3以及比较例1~9中所得的结果是否为CRP测定试剂中特有的结果为目的，用不同的试剂项目进行同样的评价。
(实施例4)
将胶乳上负载的结合配偶体变更为抗胱抑素C (Cys-C)多克隆抗体，并且除了如表3中所示地进行变更以外，与实施例1同样地制作第2试剂(R2)，进行测定。所得结果在表4中显示。检测变动系数比为1以下，粒径以及粒子浓度都与在CRP测定试剂中的评价(实施例1~3以及比较例1~9)中所得范围相同，确认了没有矛盾。
(实施例5)
将胶乳上负载的结合配偶体变更为抗肌红蛋白(Mb)多克隆抗体，并且除了如表3中所示地进行变更以外，与实施例1同样地制作第2试剂(R2)，进行测定。所得结果在表4中显示。检测变动系数比为1以下，粒径以及粒子浓度都与在CRP测定试剂中的评价(实施例1~3以及比较例1~9)中所得范围相同，确认了没有矛盾。
(实施例6)
将胶乳上负载的结合配偶体变更为抗免疫球蛋白E (IgE)单克隆抗体，并且除了如表3中所示地进行变更以外，与实施例1同样地制作第2试剂(R2)，进行测定。所得结果在表4中显示。检测变动系数比为1以下，粒径以及粒子浓度都与在CRP测定试剂中的评价(实施例1~3以及比较例1~9)中所得范围相同，确认了没有矛盾。
(实施例7)
将胶乳上负载的结合配偶体变更为抗髓过氧化物酶(MPO)多克隆抗体，并且除了如表3中所示地进行变更以外，与实施例1同样地制作第2试剂(R2)，进行测定。所得结果在表4中显示。检测变动系数比为1以下，粒径以及粒子浓度都与在CRP测定试剂中的评价(实施例1~3以及比较例1~9)中所得范围相同，确认了没有矛盾。
[表3]
Figure 855750DEST_PATH_IMAGE004
[表4]
Figure 849114DEST_PATH_IMAGE005
(实施例8~12、比较例10~17)
使胶乳上负载的结合配偶体为抗CRP多克隆抗体，使用2种不同粒径的胶乳粒子，并且除了如表5中所示地变更各粒子浓度以外，与实施例1同样地制作第2试剂(R2)，进行测定。所得结果在表6中显示。
在所用的2种胶乳粒子的小粒径(60、70 nm)侧的浓度为0.35~0.15 w/v%的范围(比较例10~15)中，检测变动系数比为1以上，表明了这是与单一粒子体系的情况(比较例1~9)同样地无法发挥散射光测量的优点的试剂组成。
在胶乳粒子的小粒径为100 nm、且粒子浓度为0.35~0.15 w/v%的情况下(比较例16~17、实施例12)，短波长570 nm侧的吸光度测定值超过测定上限的吸光度3.0，变得无法测定(吸光度的变动系数记为“ERROR”)。因此，该范围的检测变动系数比变得无法进行计算。但是，该吸光度与测定波长的反比例关系是成立的，通过在使测定波长比570 nm更长的波长下进行测定，变为测定上限的3.0以下，存在可计算检测变动系数比的可能性。小粒径的粒子浓度为0.15 w/v%的实施例12的散射光测量的变动系数具有4.2%的足够低的值，通过吸光度的波长选择，可认为具有检测变动系数比变为1以下的充分的可能性。另外，小粒径(60、70、100 nm)的粒子浓度为0.074 w/v% (实施例8~11)时，检测变动系数比变为1以下，表明了这是可发挥散射光检测体系优点的试剂设计。
[表5]
Figure 603443DEST_PATH_IMAGE006
[表6]
Figure 278138DEST_PATH_IMAGE007
(实施例13、比较例18)
以验证在实施例8~12以及比较例10~17中所得的结果是否为CRP测定试剂中特有的结果为目的，用不同的试剂项目进行同样的评价。
(实施例13)
将胶乳上负载的结合配偶体变更为抗铁蛋白(FER)多克隆抗体，并且除了如表7中所示地进行变更以外，与实施例9同样地制作第2试剂(R2)，进行测定。所得结果在表8中显示。检测变动系数比为1以下，粒径以及粒子浓度都与在CRP测定试剂中的评价(实施例8~12以及比较例10~17)中所得范围相同，确认了没有矛盾。
(比较例18)
将胶乳上负载的结合配偶体变更为抗β2-微球蛋白(BMG)多克隆抗体，并且除了如表7中所示地进行变更以外，与实施例9同样地制作第2试剂(R2)，进行测定。所得结果在表8中显示。检测变动系数比为1以上，粒径以及粒子浓度都与在CRP测定试剂中的评价(实施例8~12以及比较例10~17)中所得范围相同，确认了没有矛盾。
[表7]
Figure 801523DEST_PATH_IMAGE008
[表8]
Figure 231367DEST_PATH_IMAGE009
(比较例19、实施例14)
以实施例9的试剂为基准，除了如表9中所示地变更检材浓度以外，同样地制作第2试剂(R2)，进行测定。但是，在比较例19中，不进行散射光测定，只进行吸光度测定。在本评价中，作为追加评价项目，追加了以下内容。所得结果在表10中显示。
[高浓度区测定上限]
高浓度区测定上限是为了获得校准曲线而测定的目标物质的最大浓度。
其结果，在实施例14中，即使将检材量从比较例19减量至0.68成(6.8%)，检测变动系数比也为1以下，且高浓度区测定上限与比较例19 (32 mg/dL)相比较，增大为相当于1.5倍的47 mg/dL，作为临床试剂获得良好的结果。
(比较例20、实施例15)
以验证在实施例14中所得的结果是否为CRP测定试剂中特有的结果为目的，作为不同的试剂项目用FER测定试剂进行同样的评价。以实施例13试剂为基准，除了如表9中所示地变更检材量以外，同样地制作第2试剂(R2)，进行测定。但是，在比较例20中，不进行散射光测定，只进行吸光度测定。所得结果在表10中显示。
其结果，即使将检材浓度从比较例20减量至0.29成(2.9%)，检测变动系数比也为1以下，且高浓度区测定上限与比较例20 (1000 ng/mL)相比较，增大为相当于3.5倍的3500ng/mL，作为临床试剂获得良好的结果。
[表9]
Figure 158479DEST_PATH_IMAGE010
[表10]
Figure 433602DEST_PATH_IMAGE011
从表1~表10的结果得知，本发明的胶乳粒子增强免疫凝集测定方法及其试剂的灵敏度(检测灵敏度比)以及动态范围(高浓度区测定上限)优良。
符号说明
2　 检材；
3　 反应液；
4　 试剂；
10　检材盘；
11　盘主体；
12　驱动部；
15　 检材杯；
20　 反应盘；
21　 盘主体；
22　 驱动部；
25　 反应容器；
28　 恒温槽；
30　 试剂盘；
31　 盘主体；
32　 驱动部；
35　 试剂瓶；
38　 试剂冷库；
41　 检材分注机构；
42　 试剂分注机构；
43　 搅拌部；
44　 吸光光度计；
45　 散射光度计；
46　 洗净部(槽)；
50　 分析控制部；
70　 存储部；
71　 输出部；
72　 输入部；
100　计算机；
101　接口电路。

Claims (7)

1. 通过胶乳凝集法测定目标物质的方法，其包括使敏化胶乳粒子的悬浮液与目标物质反应，然后从光学变化量来测定前述敏化胶乳粒子的凝集，其中，前述敏化胶乳粒子敏化前的体积平均粒径为80 nm~335 nm，反应体系中前述敏化胶乳粒子的终浓度为0.005~0.170 w/v%，前述敏化胶乳粒子的敏化前粒径为80 nm以下的粒子在反应体系中的终浓度为0.09 w/v%以下，前述光学变化量为吸光度变化量和散射光变化量。
2.权利要求1所述的方法，其中，使用前述敏化胶乳粒子敏化前的体积平均粒径的1~10倍范围的波长的光来进行前述吸光度变化量及前述散射光变化量的测定。
3. 权利要求1或者2所述的方法，其中，前述吸光度变化量的测定波长使用在500~900nm范围内选择的2个波长，进一步地所选的2个测定波长使用主波长和比该主波长更长的副波长，而且，前期散射光变化量使用在500~900 nm范围内选择的1个波长。
4.权利要求1~3的任1项中所述的方法，所述方法对于前述目标物质，在应达成测定值的下限值和上限值根据规定而确定的情况下，以仅通过吸光度测定达成该下限值所需要的最低检材量浓度的0.7倍以下的检材量浓度进行。
5.权利要求1~4的任1项中所述的方法，其中，在前述散射光变化量的测定中，在散射角为10°~30°的范围内测定至少1种散射。
6. 通过胶乳凝集法测定目标物质的试剂，其包括使敏化胶乳粒子的悬浮液与前述目标物质反应，然后从吸光度变化量和散射光变化量来测定前述敏化胶乳粒子的凝集，其中，前述敏化胶乳粒子敏化前的体积平均粒径为80 nm~335 nm，反应体系中前述敏化胶乳粒子的终浓度为0.005~0.10 w/v%，前述敏化胶乳粒子的敏化前粒径为80 nm以下的粒子在反应体系中的终浓度为0.09 w/v%以下。
7.权利要求6中所述的试剂，其中，敏化前的前述敏化胶乳粒子的体积平均粒径为前述吸光度变化量及前述散射光变化量的测定波长的1~1/10的范围。
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