CN107741492A - 一种包被有n‑端脑利钠肽前体抗体的胶乳微球的制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种包被有N‑端脑利钠肽前体抗体的胶乳微球的制备方法，包括如下步骤：(1)乳胶微球预处理；(2)乳胶微球与抗体反应；(3)乳胶微球与抗体反应物处理，制得包被有N‑端脑利钠肽前体抗体的胶乳微球。本发明的优点在于：胶乳微球抗包被N‑端脑利钠肽前体抗体的方法采用化学偶联法，稳定性好，在2‑8度至少可以保存12个月。
Description
技术领域
本发明涉及医学检验技术领域，更具体涉及一种包被有N-端脑利钠肽前体抗体的胶乳微球的制备方法。
背景技术
心血管疾病是目前危害人类健康的重要疾病之一，中国每年因该疾病入院病人在三千多万，死于该疾病的有三百多万人，而且每年呈上升趋势。所以，利用合适的医疗设备对心血管疾病的诊断、治疗和康复已成为一个引起全球性重视的话题。N-端脑利钠肽前体(NT-ProBNP)是B型利钠肽激素原分裂后无活性的N端碎片，是典型的心脏标志物，主要在心肌细胞所受容量负荷增高时由左心室分泌。N-端脑利钠肽前体的应用在于协助诊断充血性心力衰竭，判断病情的严重程度和预后，以及指导治疗已经取得了医学界的广泛关注。
迄今，已有多篇相关的研究论文发表于新英格兰医学杂志、循环医学、美国心脏病学院杂志等权威杂志上。这些论文探讨了诸如NT-ProBNP在心衰急诊诊断中的作用、快速NT-ProBNP检测用于区别充血性心衰或肺部疾患导致的呼吸困难的病人等问题，为心衰的诊断和评估开辟了一个崭新的领域。
目前市面上检测NT-ProBNP的试剂盒主要是以荧光免疫分析法、酶联免疫分析法的方式进行检测，这些方法成本高、准确度低。还需要配备特定的仪器进行配合检测，操作比较繁琐。用胶乳增强免疫比浊法制备试剂盒的方法可解决上述问题，但是抗体的标记工艺是制约这种技术发展的关键。
发明内容
本发明所要解决的技术问题在于提供了一种采用的化学偶联法、稳定性好的包被有N-端脑利钠肽前体抗体的胶乳微球的制备方法。
本发明是通过以下技术方案解决上述技术问题的：
一种包被有N-端脑利钠肽前体抗体的胶乳微球的制备方法，包括如下步骤：
(1)乳胶微球预处理：将乳胶微球用PBS缓冲液清洗并离心2遍，去上清液，将沉淀物用PBS缓冲液稀释至总体积的4.0％-6.0％，添加表面活性剂，混匀后于室温下摇晃反应0.3-1小时，离心去上清液，将沉淀物悬浮于缓冲液中，超声分散；
(2)乳胶微球与抗体反应：离心去上清液，将沉淀物悬浮于缓冲液中至总体积的4.0％-6.0％，超声分散，边搅拌边加入1/3体积的N-端脑利钠肽前体抗体，混匀后于室温下反应1-3小时；
(3)乳胶微球与抗体反应物处理：离心去上清液，向沉淀物中加入1倍体积的缓冲液，超声分散，然后向其中加入牛血清蛋白，4℃封闭20-40分钟，离心去上清液，向沉淀物中加入1倍体积的缓冲液，超声分散，2-8℃过夜保存，制得包被有N-端脑利钠肽前体抗体的胶乳微球。
优选地，步骤(1)中，
离心的转速为9000-12000rpm，更有选10000rpm，时间为8-12分钟，更有选10分钟；
PBS缓冲液的浓度为04-0.6mmol/L，更有选0.5mmol/L；
表面活性剂的添加量为0.4-0.6mg/mL溶液，更有选0.5mg/mL溶液；
缓冲液的浓度为40-60mmol/L，更有选50mmol/L。
优选地，步骤(2)中，
离心的转速为18000-22000rpm，更有选20000rpm，时间为0.5-2分钟，更有选1分钟；
缓冲液的浓度为80-120mmol/L，更有选100mmol/L。
优选地，步骤(3)中，
离心的转速为18000-22000rpm，更有选20000rpm，时间为20-40分钟，更有选30分钟；
缓冲液的浓度为80-120mmol/L，更有选100mmol/L。
优选地，缓冲液选自HEPES缓冲液或硼酸缓冲液。
优选地，表面活性剂选自S9或曲拉通-100。
优选地，胶乳微球的粒径为80nm。
本发明相比现有技术具有以下优点：胶乳微球抗包被N-端脑利钠肽前体抗体的方法采用化学偶联法，稳定性好，在2-8度至少可以保存12个月。
具体实施方式
下面对本发明的实施例作详细说明，本实施例在以本发明技术方案为前提下进行实施，给出了详细的实施方式和具体的操作过程，但本发明的保护范围不限于下述的实施例。
实施例1
一种包被有N-端脑利钠肽前体抗体的胶乳微球的制备方法，包括如下步骤：
(1)乳胶微球预处理：将粒径为80nm乳胶微球用0.5mmol/L的PBS缓冲液清洗并离心2遍，每次10000rpm转速下离心10分钟，去上清液，将沉淀物用PBS缓冲液稀释至总体积的5.0％，添加0.5mg表面活性剂S9，混匀后于室温下摇晃反应0.5小时，10000rpm转速下离心10分钟，去上清液，将沉淀物悬浮于50mmol/L硼酸缓冲液中，超声分散；
(2)乳胶微球与抗体反应：20000rpm转速下离心1分钟，去上清液，将沉淀物悬浮于100mmol/L硼酸缓冲液中至总体积的5.0％，超声分散，边搅拌边加入1/3体积的N-端脑利钠肽前体抗体，混匀后于室温下反应2小时；
(3)乳胶微球与抗体反应物处理：20000rpm转速离心30分钟，去上清液，向沉淀物中加入1倍体积的100mmol/L硼酸缓冲液，超声分散，然后向其中加入牛血清蛋白，4℃封闭30分钟，离心去上清液，向沉淀物中加入1倍体积的硼酸缓冲液，超声分散，2-8℃过夜保存，制得包被有N-端脑利钠肽前体抗体的胶乳微球。
实施例2
一种包被有N-端脑利钠肽前体抗体的胶乳微球的制备方法，包括如下步骤：
(1)乳胶微球预处理：将粒径为80nm乳胶微球用0.5mmol/L的PBS缓冲液清洗并离心2遍，每次10000rpm转速下离心10分钟，去上清液，将沉淀物用PBS缓冲液稀释至总体积的5.0％，添加0.5mg表面活性剂曲拉通-100，混匀后于室温下摇晃反应0.5小时，10000rpm转速下离心10分钟，去上清液，将沉淀物悬浮于50mmol/LHEPES缓冲液中，超声分散；
(2)乳胶微球与抗体反应：20000rpm转速下离心1分钟，去上清液，将沉淀物悬浮于100mmol/LHEPES缓冲液中至总体积的5.0％，超声分散，边搅拌边加入1/3体积的N-端脑利钠肽前体抗体，混匀后于室温下反应2小时；
(3)乳胶微球与抗体反应物处理：20000rpm转速离心30分钟，去上清液，向沉淀物中加入1倍体积的100mmol/LHEPES缓冲液，超声分散，然后向其中加入牛血清蛋白，4℃封闭30分钟，离心去上清液，向沉淀物中加入1倍体积的HEPES缓冲液，超声分散，2-8℃过夜保存，制得包被有N-端脑利钠肽前体抗体的胶乳微球。
实施例3
一种包被有N-端脑利钠肽前体抗体的胶乳微球的制备方法，包括如下步骤：
(1)乳胶微球预处理：将粒径为80nm乳胶微球用0.4mmol/L的PBS缓冲液清洗并离心2遍，每次12000rpm转速下离心8分钟，去上清液，将沉淀物用PBS缓冲液稀释至总体积的4.0％，添加0.4mg表面活性剂曲拉通-100，混匀后于室温下摇晃反应0.5小时，12000rpm转速下离心8分钟，去上清液，将沉淀物悬浮于40mmol/LHEPES缓冲液中，超声分散；
(2)乳胶微球与抗体反应：18000rpm转速下离心2分钟，去上清液，将沉淀物悬浮于80mmol/LHEPES缓冲液中至总体积的5.0％，超声分散，边搅拌边加入1/3体积的N-端脑利钠肽前体抗体，混匀后于室温下反应2小时；
(3)乳胶微球与抗体反应物处理：18000rpm转速离心40分钟，去上清液，向沉淀物中加入1倍体积的80mmol/LHEPES缓冲液，超声分散，然后向其中加入牛血清蛋白，4℃封闭30分钟，离心去上清液，向沉淀物中加入1倍体积的HEPES缓冲液，超声分散，2-8℃过夜保存，制得包被有N-端脑利钠肽前体抗体的胶乳微球。
实施例4
一种包被有N-端脑利钠肽前体抗体的胶乳微球的制备方法，包括如下步骤：
(1)乳胶微球预处理：将粒径为80nm乳胶微球用0.6mmol/L的PBS缓冲液清洗并离心2遍，每次8000rpm转速下离心12分钟，去上清液，将沉淀物用PBS缓冲液稀释至总体积的6.0％，添加0.6mg表面活性剂S9，混匀后于室温下摇晃反应0.5小时，8000rpm转速下离心12分钟，去上清液，将沉淀物悬浮于60mmol/L硼酸缓冲液中，超声分散；
(2)乳胶微球与抗体反应：22000rpm转速下离心0.5分钟，去上清液，将沉淀物悬浮于120mmol/L硼酸缓冲液中至总体积的5.0％，超声分散，边搅拌边加入1/3体积的N-端脑利钠肽前体抗体，混匀后于室温下反应2小时；
(3)乳胶微球与抗体反应物处理：22000rpm转速离心20分钟，去上清液，向沉淀物中加入1倍体积的120mmol/L硼酸缓冲液，超声分散，然后向其中加入牛血清蛋白，4℃封闭30分钟，离心去上清液，向沉淀物中加入1倍体积的硼酸缓冲液，超声分散，2-8℃过夜保存，制得包被有N-端脑利钠肽前体抗体的胶乳微球。
上述实施例采用化学偶联法制备包被N-端脑利钠肽前体抗体的胶乳微球，所得微球抗体的稳定性好，在2-8度至少可以保存12个月。
以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
Claims (7)
1.一种包被有N-端脑利钠肽前体抗体的胶乳微球的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：
(1)乳胶微球预处理：将乳胶微球用PBS缓冲液清洗并离心2遍，去上清液，将沉淀物用PBS缓冲液稀释至总体积的4.0％-6.0％，添加表面活性剂，混匀后于室温下摇晃反应0.3-1小时，离心去上清液，将沉淀物悬浮于缓冲液中，超声分散；
(2)乳胶微球与抗体反应：离心去上清液，将沉淀物悬浮于缓冲液中至总体积的4.0％-6.0％，超声分散，边搅拌边加入1/3体积的N-端脑利钠肽前体抗体，混匀后于室温下反应1-3小时；
(3)乳胶微球与抗体反应物处理：离心去上清液，向沉淀物中加入1倍体积的缓冲液，超声分散，然后向其中加入牛血清蛋白，4℃封闭20-40分钟，离心去上清液，向沉淀物中加入1倍体积的缓冲液，超声分散，2-8℃过夜保存，制得包被有N-端脑利钠肽前体抗体的胶乳微球。
2.根据权利要求1所述的包被有N-端脑利钠肽前体抗体的胶乳微球的制备方法，其特征在于，步骤(1)中，
所述离心的转速为9000-12000rpm，时间为8-12分钟；
所述PBS缓冲液的浓度为04-0.6mmol/L；
所述表面活性剂的添加量为0.4-0.6mg/mL溶液；
所述缓冲液的浓度为40-60mmol/L。
3.根据权利要求1所述的包被有N-端脑利钠肽前体抗体的胶乳微球的制备方法，其特征在于，步骤(2)中，
所述离心的转速为18000-22000rpm，时间为0.5-2分钟；
所述缓冲液的浓度为80-120mmol/L。
4.根据权利要求1所述的包被有N-端脑利钠肽前体抗体的胶乳微球的制备方法，其特征在于，步骤(3)中，
所述离心的转速为18000-22000rpm，时间为20-40分钟；
所述缓冲液的浓度为80-120mmol/L。
5.根据权利要求1所述的包被有N-端脑利钠肽前体抗体的胶乳微球的制备方法，其特征在于，所述缓冲液选自HEPES缓冲液或硼酸缓冲液。
6.根据权利要求1所述的包被有N-端脑利钠肽前体抗体的胶乳微球的制备方法，其特征在于，所述表面活性剂选自S9或曲拉通-100。
7.根据权利要求1所述的包被有N-端脑利钠肽前体抗体的胶乳微球的制备方法，其特征在于，所述胶乳微球的粒径为80nm。
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