JP2008014752A - 簡易イムノアッセイ用検体浮遊液およびアッセイ方法 - Google Patents
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Abstract
【解決手段】1〜10(v/v)%の濃度の哺乳動物の正常血清を含有し、pHが4.5〜6.5の範囲である簡易イムノアッセイ用検体浮遊液により、体液等の検体に含まれる生体由来成分のアッセイへの影響を抑制することができる。
【選択図】なし
Description
即ち本発明は、1〜10(v/v)%の濃度の哺乳動物の正常血清を含有し、pHが4.5〜6.5の範囲である簡易イムノアッセイ用検体浮遊液である。更にpHは5.0〜6.0の範囲であることが好ましい。また、哺乳動物の正常血清を3〜5(v/v)%含有することが好ましい。更に本発明の検体浮遊液は、免疫学的特異反応による簡易メンブレンイムノアッセイ用の検体浮遊液やELISA用の検体浮遊液として好ましい。また本発明は、前記の検体浮遊液を用いる簡易メンブレンイムノアッセイ法である。
本発明の簡易イムノアッセイ用検体浮遊液はm1〜10(v/v)%の濃度の哺乳動物の正常血清を含有し、pHが4.5〜6.5の範囲であることを特徴とする。
本発明において、“哺乳動物の正常血清”はウイルスや細菌に感染していない哺乳動物より採取した血清のことを言う。例えば、“感染血清”は本発明の“哺乳動物の正常血清”には含まれない。哺乳動物の正常血清は特に限定されるものではないが、例えば、ヒツジ、ヤギ、馬、牛、マウス、ラット、ウサギ等の哺乳動物の正常血清を挙げることが出来る。中でも正常ウサギ血清が、容易に入手できる点で好ましい。哺乳動物の正常血清は市販されているものを適宜使用してもよく、また、従来知られている血清調製方法により哺乳動物から採取してもよい。市販物としては例えばフナコシ株式会社から入手可能である。
この哺乳動物の血清は、血清そのままでも脱脂処理したものでもどちらでも使用することができる。濃度は、その測定系を阻害しない濃度であることが必要で、その濃度範囲は1〜10(v/v)%であり、さらに3〜5(v/v)%含有することが好ましい。1(v/v)%未満では前記の効果が得られず、10(v/v)%を超えると固相化した捕捉物質と被検出物の抗原抗体反応および標識物質と被検出物の抗原抗体反応を阻害することがある。
本発明において検体浮遊液とは、簡易イムノアッセイ法で用いる液体媒体を指し、被検出物を含み得る検体を浮遊させて希釈及び/又は抽出するための溶液であると同時に、検体中の被測定物と捕捉物質との間で抗原抗体反応を行わせるための場となる溶液である。ここで示す簡易イムノアッセイ法とは、簡易メンブレンイムノアッセイ法、ELISA(エンザイム・リンクト・イムノ−ソルベント・アッセイ:Enzyme Linked Immuno-Sorbent Assay)法およびELISAに類する方法を指す。そして本発明の検体浮遊液は、好ましくは簡易メンブレンイムノアッセイに用いられる。
本発明者等は、前記の簡易イムノアッセイにおいて、検体試料に含まれる生体由来の成分に起因する偽陽性や偽陰性の発生を極力抑制するという課題を解決するために鋭意検討した結果、検体浮遊液のpHを特定の範囲に設定し、かつ特定濃度の哺乳動物の正常血清を含有させることにより、検査において生体由来の物質の影響で発生する偽陽性及び偽陰性の発生のいずれも著しく抑制できることを見出し、本発明に到達した。
本発明の簡易イムノアッセイ法で検出する被検出物としては、各種抗原および抗体を挙げることができる。好ましくは、病原微生物、バイオマーカー、ホルモン、環境ホルモンおよびそれらに対する抗体を挙げることができ、より好ましくは、呼吸器感染症、消化器感染症、循環器感染症を引き起こすウイルスおよび細菌、およびそれらに対する抗体、腫瘍マーカー、循環器系マーカー、糖尿病マーカー、骨代謝マーカーおよびこれらに対する抗体を挙げることができる。さらに好ましくは、インフルエンザウイルス抗原、アデノウイルス抗原、RSウイルス抗原、HA抗原、HBc抗原、HCV抗原、HIV抗原、EBV抗原、NLV抗原等のウイルス抗原およびこれらに対する抗体、病原性大腸菌抗原、クラミジア・トラコマティス抗原、溶連菌抗原、肺炎球菌抗原、百日咳菌抗原、ヘリコバクター・ピロリ抗原、レプトスピラ抗原、トレポネーマ・パリダム抗原、トキソプラズマ・ゴンディ抗原、ボレリア抗原、炭疽菌抗原、MRSA抗原等の細菌抗原およびこれらに対する抗体、マイコプラズマ脂質抗原、細菌等が産生する毒素抗原およびこれらに対する抗体を挙げることができ、さらに好ましくは、インフルエンザウイルス抗原、アデノウイルス抗原、RSウイルス抗原、ロタウイルス抗原、NV抗原、肺炎マイコプラズマ抗原、A群溶連菌抗原、肺炎球菌抗原、クラミジア抗原、病原性大腸菌抗原、カンピロバクター抗原等を挙げることができるが、これらに限定されない。
当然のことながら、前記の被検出物を実験的に培養したものを、生理食塩水等で希釈した試料では、本発明で課題としているような偽陰性や偽陽性は発生しない。本発明の簡易イムノアッセイに用いる検体としては、例えば全血、尿、便、鼻腔ぬぐい液、鼻腔吸引液、咽頭ぬぐい液、鼻腔洗浄液、肺胞洗浄液、喀痰、鼓膜切開・貯留液、スワブ検体として収集された分泌物などを挙げることができる。これらの検体に含まれる成分としては、例えば、全血の場合、赤血球、白血球などの血球成分であり、各種ぬぐい液などの場合、検体に混在する生体成分が剥離または分解して凝集した細胞成分などがある。また、これらの試料中には、プロテオグリカン、糖脂質等の粘性物質をはじめ、様々な生体成分が含まれる場合やウイルスや細菌などの微生物が混在する場合がある。本発明の検体浮遊液は、上記のような検体の検体浮遊液として用いるものである。これらの成分は検査に利用している原理によっては、偽陽性および偽陰性のような非特異的な反応を誘導する場合がある。上記の成分による非特異的な反応も本発明の検体浮遊液の組成で抑制する対象となる。
本発明の簡易イムノアッセイ法で、前記の被検出物を捕捉する捕捉物質としては、被検出物が抗原である場合は、それに対応した抗体、または実質的に同一の抗原抗体反応をする物質であればよく、被検出物が抗体である場合は、それに対応した抗原、または実質的に同一の抗原抗体反応をする物質であればよい。
(試料の作製)
1.モノクローナル抗体の作製
(1)抗A型インフルエンザウイルスNPモノクローナル抗体(マウス)の作製
精製A型インフルエンザウイルス抗原を免疫し、一定期間維持したBALB/cマウスから脾臓を摘出し、ケラーらの方法(Kohler et al., Nature, vol, 256, p495-497(1975))によりマウスミエローマ細胞(P3×63)と融合した。
得られた融合細胞(ハイブリドーマ)を、37℃インキュベーター中で維持し、A型インフルエンザウイルスNP抗原固相プレートを用いたELISAにより上清の抗体活性を確認しながら細胞の純化(単クローン化)を行った。
取得した該細胞2株をそれぞれプリスタン処理したBALB/cマウスに腹腔投与し、約2週間後、抗体含有腹水を採取した。得られた腹水をそれぞれProteinAカラムクロマトグラフィー(アマシャム社製)を用いたアフィニティ精製によってIgGを精製し、2種類の精製抗A型インフルエンザウイルスNPモノクローナル抗体を得た。
精製B型インフルエンザウイルス抗原を免疫し、一定期間維持したBALB/cマウスから脾臓を摘出し、ケラーらの方法(Kohler et al., Nature, vol.256, p495-497(1975))によりマウスミエローマ細胞(P3×63)と融合した。得られた融合細胞(ハイブリドーマ)は、37℃でインキュベーター中で維持し、B型インフルエンザウイルスNP抗原固相プレートを用いたELISAにより上清の抗体活性を確認しながら細胞の純化(単クローン化)を行った。取得した該細胞2株をそれぞれプリスタン処理したBALB/cマウスに腹腔投与し、約2週間後、抗体含有腹水を採取した。得られた腹水からProteinAカラムクロマトグラフィー(アマシャム社製)によってIgGを精製し、2種類の精製抗B型インフルエンザウイルスNPモノクローナル抗体を得た。
(1)ラテックス標識抗A型インフルエンザ抗体の調製
抗A型インフルエンザウイルスNPモノクローナル抗体のうち1種類を50mM MES(2-Morpholinoethanesulfonic acid,monohydrate;同仁化学社)緩衝液(pH6.0)溶液で透析後、赤色ポリスチレンラテックス粒子(粒径0.394μm, 表面修飾基はカルボキシル基;メルク社)と混合し、反応させた。次に、EDAC(N-(3-Dimethlaminopropyl)-N'-ethylcarbodiimide hydrochloride;Sigma社)を最終濃度0.1%になるように添加した後、2時間反応させた。洗浄後、最終浮遊液(5mMTris, 0.04(W/V)% BSA(ウシ血清アルブミン))中に浮遊し、超音波分散装置(オリンパス社)にかけ、ラテックス粒子を分散させてラテックス標識抗A型インフルエンザ抗体を調製した。
抗A型インフルエンザウイルスNPモノクローナル抗体のうち1種類を50mM MES緩衝液(pH6.0)溶液で透析後、青色ポリスチレンラテックス粒子(粒径0.394μm, 表面修飾基はカルボキシル基;メルク社)と混合し、反応させた。次に、EDACを最終濃度0.1%になるように添加した後、2時間反応させた。洗浄後、最終浮遊液(5mMTris, 0.04(W/V)% BSA(ウシ血清アルブミン))中に浮遊し、超音波分散装置(オリンパス社)にかけ、ラテックス粒子を分散させてラテックス標識抗B型インフルエンザ抗体を調製した。
(1)ラテックス標識抗体の混合
2.(1)、(2)で作製したラテックス標識抗A型インフルエンザ抗体とラテックス標識抗B型インフルエンザ抗体をラテックス濃度がそれぞれ等しくなるように希釈後、室温下で等量混合した。
(2)ラテックス標識抗体パッドの作製
3.(1)で作製したラテックス標識抗体を陽圧噴霧装置(BioJet;BioDot社)を用いてでリール状に巻いた幅15mmのセルロース不織布全面に噴霧した。噴霧後、50℃の温風を1分間吹きつけ乾燥させ、ラテックス標識抗体パッドを作製した。
(1)固相用抗A型インフルエンザ抗体の調製
1.(1)で作製した精製抗A型インフルエンザウイルスNPモノクローナル抗体のうち標識に用いなかった方を、0.22μmろ過を行い、M.Q水で希釈して固相用抗A型インフルエンザ抗体を調製した。
(2)固相用抗B型インフルエンザ抗体の調製
1.(2)で作製した精製抗B型インフルエンザウイルスNPモノクローナル抗体のうち標識に用いなかった方を、0.22μmろ過を行い、M.Q水で希釈して固相用抗B型インフルエンザ抗体を調製した。
インフルエンザウイルス検出用ラテラルフロー式メンブレンアッセイ装置は、図1及び図2に示すものと同様の構成のものを用いた。
メンブレンは、幅3cm x 長さ10cmのニトロセルロースメンブレン(ミリポア社製)シートを用いた。その長軸側の一端(この端を上流端、反対側を下流端とする)から8mm離れたdの位置に固相用抗A型インフルエンザ抗体を陽圧噴霧装置(BioJet;BioDot社)を用いて線状に塗布し、12mm離れたeの位置に固相用抗B型インフルエンザ抗体を陽圧噴霧装置(BioJet;BioDot社)を用いて線状に塗布した。塗布後、45℃の温風を10分間吹き付けて乾燥した。
次に、3.(2)で作製したラテックス標識抗体パッドを幅15mm x 長さ10cmに切断し、メンブレンの上面に、メンブレンの上流端が2mm重なる様に配置して貼り付け、サンプル滴下パッドとした。
次に、幅30mm x 長さ10cmのセルロースろ紙(ワットマン社)をメンブレンの上面に、メンブレンの下流端と5mm重なる様に配置して貼り付け、サンプル吸収パッドとした。
次にサンプル滴下パッドの上流端の幅7mmを除いて、上面全面を透明なプラスチックラミネート(Adhesive Research社)で被覆した。
最後に長軸方向に沿って、5mmずつ切断し、図1及び図2に示すメンブレンアッセイ装置を作製した。
図3に示した様なろ過用ノズルを用意し、ろ過用ガラスろ紙(アドバンテック東洋社)を円形(直径0.7cm)に打ち抜いてノズルの底面に装填し、標識抗体装填試料ろ過フィルターを作製した。
(1)培養ウイルスの調製と希釈
孵化鶏卵により培養したA型およびB型のインフルエンザウイルスを生理的食塩水で100倍希釈し、さらにそれを用いて、生理的食塩水で2倍段階希釈系列(100倍〜1600倍まで)を調製した。表2において、例えば“A×100”は、A型インフルエンザウイルスを添加した溶液を100倍に希釈した液を意味する
(2)メンブレンアッセイ法による検出
臨床的にインフルエンザウイルス感染が認められない患者より採取した鼻腔吸引液から滅菌綿棒を用いて検体を採取し、図4に示した様なチューブ内に分注した各検体浮遊液(組成を下表1に示す)0.4mL中に浮遊し、試験用試料を作製した。
この試験用試料に(1)で孵化鶏卵培養し、希釈した、A型またはB型インフルエンザウイルスウイルス希釈液30μLを添加し、チューブの先端に(試料の作製)6.で作製した標識抗体装填試料ろ過フィルターを装着した。
Tx-100:TritonX-100(ポリエチレングリコール モノ-p-イソオクチルフェニルエーテル)
PB-Na:ナトリウム燐酸バッファー
MES:2-モルホリノエタンスルホン酸
ADA:N-(2-アセトアミド)イミノジ酢酸
PIPES:ピペラジン-1,4-ビス(2-エタンスルホン酸)
MOPS:3-モルホリノプロパンスルホン酸
BSA:ウシ血清アルブミン(Bovine Serum Albumin)
(3)結果
表1に記載の各浮遊液を用いた検出結果を下記表2にまとめる。
(1)培養ウイルスの調製と希釈
孵化鶏卵により培養したA型およびB型のインフルエンザウイルスを生理的食塩水で100倍希釈し、さらにそれを用いて、生理的食塩水でA型ウイルス添加試料を800倍に、B型ウイルス添加試料を400倍にそれぞれ希釈した。
(2)メンブレンアッセイ法による検出
臨床的にインフルエンザウイルス感染が認められない患者より採取した鼻腔吸引液から滅菌綿棒を用いて検体を採取し、図4に示した様なチューブ内に分注した各検体浮遊液(表3)0.4mL中に浮遊し、試験用試料を作製した。この試験用試料に(1)で調製した孵化鶏卵培養ウイルス希釈液30μLを添加し、チューブの先端に(試料の作製)6.で作製した標識抗体装填試料ろ過フィルターを装着した。この状態で5分間、10分間、15分間、30分間静置した。
静置後ろ過を行い、ろ過液をそれぞれチューブに集めた後、(試料の作製)5.で作製したインフルエンザウイルス検出用ラテラルフロー式メンブレンアッセイ装置のサンプル滴下パッド側を試料液に浸して展開を行った。10分後、アッセイ装置を観察し、図1あるいは2のdの位置に赤色の発色が認められた場合にはA型インフルエンザウイルス陽性、eの位置に青色の発色が認められた場合にはB型インフルエンザウイルス陽性、両方の位置に発色が認められない場合は陰性と判定した。
臨床的にインフルエンザウイルス感染が認められない患者より採取した鼻腔吸引液から滅菌綿棒を用いて検体を採取し、図4に示した様なチューブ内に分注した検体浮遊液6及び14(表3参照)0.4mL中に浮遊し、試験用試料を作製した。このチューブの先端に6.で作製した標識抗体装填試料ろ過フィルターを装着した。
(1)培養ウイルスの調製と希釈
孵化鶏卵により培養したA型およびB型のインフルエンザウイルスを生理的食塩水で100倍希釈し、さらにそれを用いて、生理的食塩水で2倍段階希釈系列(100倍〜1600倍まで)を調製した。
(2)メンブレンアッセイ法による検出
臨床的にインフルエンザウイルス感染が認められない患者より採取した鼻腔吸引液から滅菌綿棒を用いて検体を採取し、図4に示した様なチューブ内に分注した各検体浮遊液(下表6に示す)0.4mL中に浮遊し、試験用試料を作製した。この試験用試料に(1)で調製した孵化鶏卵培養ウイルス希釈液30μLを添加し、チューブの先端に(試料の作製)6.で作製した標識抗体装填試料ろ過フィルターを装着した。この状態でそれぞれ0分、5分、10分、15分、30分間静置した(表8)。
上記各希釈率のウイルスを含む試料(静置0分)を用いて得られた各検体浮遊液による希釈検出限界を表7に示した。また、検出限界に近い希釈率により希釈されたウイルスを含む各試料を5分、10分、15分、30分間静置した後判定した結果を表8に示した。
また、実施例2で使用した臨床的にインフルエンザウイルス感染が認められない患者より採取した鼻腔吸引液を用いて、静置0分での偽陽性の発生を実施例2と同様の方法で検証した結果を表9に示した。
体液試料の浮遊後の安定性を、検出限界に近い希釈率で測定したところ、pH6.0、正常ウサギ血清5(v/v)%を添加した浮遊液を用いることで、完全にマトリックス効果(偽陰性)を抑制し、高感度、短時間で、高精度な検査が可能となることが明らかになった(表8、実験番号14)。
また、孵化鶏卵培養インフルエンザウイルスを添加せずに試験したところ、NRSを添加することで、マトリックス効果(偽陽性)を抑制できた(表9、実験番号16及び18)。
pHおよび哺乳動物の正常血清による効果は、どちらかでは不十分であり、両方を組み合わせることで、マトリックス効果(偽陰性及び偽陽性)を完全に抑制できることが明らかになった。
b:サンプル吸収パッド
c:ニトロセルロースメンブレン
d:抗A型インフルエンザウイルスNPモノクローナル抗体塗布ライン
e:抗B型インフルエンザウイルスNPモノクローナル抗体塗布ライン
f:バッキングシート
g:ラミネート
h:ろ過用ノズル
i:ろ過用ガラスろ紙
j:ラテックス標識パッド
k:チューブ
Claims (6)
- 1〜10(v/v)%の濃度の哺乳動物の正常血清を含有し、pHが4.5〜6.5の範囲である簡易イムノアッセイ用検体浮遊液。
- pHが5.0〜6.0の範囲である請求項1に記載の簡易イムノアッセイ用検体浮遊液。
- 哺乳動物の正常血清を3〜5(v/v)%含有する請求項1または請求項2に記載の簡易イムノアッセイ用検体浮遊液。
- 簡易メンブレンイムノアッセイ用の検体浮遊液である、請求項1〜3のいずれか1項に記載の簡易イムノアッセイ用検体浮遊液。
- ELISA、FIA、CLIAあるいはRIA用の検体浮遊液である、請求項1〜3のいずれか1項に記載の簡易イムノアッセイ用検体浮遊液。
- 請求項1〜5のいずれか1項に記載の検体浮遊液を用いる簡易イムノアッセイ法。
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