CN104628843B - 一种促甲状腺激素受体蛋白质、基因序列及其试剂盒 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及疾病诊断领域，本发明之一涉及促甲状腺激素受体蛋白质，所述蛋白质的序列为SEQ ID NO:1；本发明之二提供了一种用于检测甲状腺疾病的试剂盒，所述试剂盒包括上述的蛋白质；本发明之三提供了一种促甲状腺激素受体蛋白质的基因序列，所述基因序列为通过表达获得上述的蛋白质的基因序列中的一种。
Description
技术领域
本发明涉及疾病诊断领域，特别涉及促甲状腺激素受体蛋白质。
背景技术
促甲状腺激素受体(TSHR)是存在于甲状腺滤泡细胞膜上的一种G蛋白偶联受体。在正常的生理情况下，TSHR通过与促甲状腺激素(TSH)的结合来调节甲状腺滤泡细胞的功能和生长。促甲状腺激素受体抗体(TRAb)是自身免疫甲状腺疾病、格雷氏(Graves)病甲状腺机能亢进和部分原发性粘液性水肿患者检测的重要指标。其中Graves病是一种以甲亢、弥漫性甲状腺肿和突眼为特征的自身免疫性疾病。而TRAb是引起Graves病甲亢和甲亢复发的重要原因之一。因此对于TRAb的检测至关重要，我们通过TSHR来检测患者体内的TRAb的含量，从而对其患甲状腺疾病的风险进行评估。TSHR不仅介导TSH的生理作用，而且是一种重要的自身抗原，其相应的自身抗体在自身免疫性甲状腺疾病的发生过程中起着重要作用。
由于TSHR基因突变和免疫系统的作用，体内出现抗TSHR抗体(TSHR Ab，TRAb)。依抗体与TSHR结合后引起的变化不同，TSHR Ab可以分为TSHR刺激抗体(TSHR SAb)和TSHR抑制抗体(TSHR IAb)。前者促甲状腺滤泡细胞增生和功能亢进，后者抑制TSHR作用导致甲状腺滤泡细胞萎缩和功能低下。
目前临床上检测体外TRAb都基于放射免疫或酶联免疫技术，随着灵敏度和精确度更高的化学发光技术在体外诊断中的应用，生产出能适用于化学发光封闭系统的抗原原料变得尤其重要。
发明内容
本发明提供了一种促甲状腺激素受体蛋白质，所述蛋白质的序列为SEQ ID NO:1。所述蛋白质能与TRAb特异性的结合，特别是应用于化学发光系统中，其与化学发光系统的配合使用显著的提高了检测的灵敏度和精确度。
在一个具体的实施方式中，所述蛋白质为在真核表达系统中表达而获得的蛋白质。由于真核表达系统获得的蛋白质的被修饰水平和/或构象能够更接近产生于人体的促甲状腺激素受体，因此，使用在真核表达系统表达获得的蛋白质来与TRAb结合，进行临床检测的灵敏度和精确度高于原核表达系统获得的蛋白质。
在一个具体的实施方式中，所述蛋白质为在哺乳动物表达系统中表达而获得的蛋白质。
在一个具体的实施方式中，所述蛋白质为结合标记物的蛋白质；优选自纳米磁珠包被的蛋白质、生物素及生物素衍生物化的蛋白质和荧光素标记的蛋白质。其中包被可分直接包被和间接包被，间接包被方式包括但不限于通过FITC+抗FITC抗体体系、链霉亲和生物素体系。
在一个具体的实施方式中，生物素衍生物可以选自Sulfo-NHS-Biotin、Sulfo-NHS-LC-Biotin、Sulfo-NHS-LC-LC-Biotin、NHS-PEG4-Biotin、NHS-PEG12-Biotin、NHS-Biotin、NHS-LC-Biotin、NHS-LC-LC-Biotin、Sulfo-NHS-SS-Biotin、NHS-SS-Biotin、NHS-SS-PEG4-Biotin、NHS-Chromogenic Biotin、NHS-Iminobiotin、PEP-Biotin、TFP-PEG3-Biotin、Maleimide-PEG2-Biotin、以及Maleimide-PEG11-Biotin；
荧光素可以选自异硫氰酸荧光素、6-羧基荧光素、四乙基罗丹明、四甲基异硫氰酸罗丹明、藻红蛋白、多甲藻叶绿素蛋白、以及碘化丙啶。
本发明还提供了一种促甲状腺激素受体蛋白质的基因序列，所述基因序列为通过表达获得如上所述的任意一种蛋白质的基因序列中的至少一种。
本发明最后提供了一种用于检测促甲状腺激素受体抗体的试剂盒，所述试剂盒包括如上所述任意一种蛋白质。例如，所述蛋白质可以为浓度0.1-5％的包被磁球的重组蛋白质，或10-200μg/L的生物素(Biotin)化的重组蛋白质，或10-200μg/L的标记的FITC的重组蛋白质。
在一个具体的实施方式中，所述试剂盒中还包括携带有标记示踪物的蛋白A。例如，携带有标记示踪物的蛋白A为ABEI标记的蛋白A，其浓度可以为0.1-1mg/L。利用化学发光法可以显著地提高产品的灵敏度和特异性。其中，蛋白A是一种金黄色葡萄球菌细胞壁蛋白质，能特异性地与人和哺乳动物抗体(主要是IgG)的Fc区结合。
在一个具体的实施方式中，所述试剂盒中还包括携带有标记示踪物的抗人IgG和抗人IgM。例如，抗人IgG和抗人IgM可以为抗人IgG标记的ABEI(0.1-1mg/L)和抗人IgM标记的ABEI(0.1-1mg/L)。抗IgG抗体的Fab片段(抗原结合片段)能与IgG抗体的Fc片段(结晶片段)结合。抗IgM抗体的Fab片段(抗原结合片段)能与IgM抗体的Fc片段(结晶片段)结合。
在一个具体的实施方式中，所述标记示踪物可以选自吖啶酯、吖啶酯酸-NHS酯、吖啶酸丙磺酸钠盐、9-吖啶羧酸、鲁米诺、鲁米诺钠盐、N-(4-氨丁基)-N-乙基异鲁米诺、光泽精、3,3',5,5'-四甲基联苯胺丙磺酸钠、3,3',5,5'-四甲基联苯胺、异鲁米洛、多聚异鲁米诺、多聚吖啶酯、氧化葡聚糖、氨化葡聚糖、以及羧基化葡聚糖。
在一个具体的实施方式中，所述试剂盒中还包括BSA缓冲液。
在一个具体实施例中，所述试剂盒可以包含链霉亲和素(SA)包被的磁球，其浓度可以为0.1-5mg/mL。
在一个具体实施例中，所述试剂盒可以包含羊抗FITC多克隆抗体包被的磁球，其浓度为0.1-5mg/mL。
在一个具体实施例中，所述试剂盒可以包含低点校准品(TRAb 30-100ng/mL)和高点校准品(TRAb 500-1500ng/mL)。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明做以下详细说明。
本发明提供了一种促甲状腺激素受体蛋白质，所述蛋白质的序列为SEQ ID NO:1。所述蛋白质通过真核系统表达得到，所述真核系统优选哺乳动物表达系统，以下给出本发明得到促甲状腺激素受体蛋白的获取过程。
1.主要试剂与设备
PCR所用试剂(包括Taq酶，buffer，dNTP)，T4连接酶、DNA Marker、蛋白Marker购自全式金生物技术有限公司；EcoR I、Xba I和Kpn I等限制性内切酶、小牛肠碱性磷酸酶(CIAP)购自Takara(宝生物工程(大连)有限公司)；胶回收试剂盒及质粒提取试剂盒购自life technology公司；氨苄青霉素等购自BBI公司；PCR引物及重组质粒测序由华大基因公司或Invitrogen公司完成；所用一抗、二抗及ECL显色剂均购自Snata Cruzs公司；G418的配制：G418溶于10mL蒸馏水，搅拌使其完全溶解，过滤除菌后，以l mL分装至1.5mL的离心管中，然后于-20℃保存。细胞冻存液：以DMEM培养基:胎牛血清:二甲基亚砜(DMSO)＝7:2:1的比例配制细胞冻存液，4℃保存。Ni柱蛋白纯化试剂盒购自康为世纪，其余试剂由深圳市新产业生物医学工程股份有限公司提供。
ABI Veriti PCR仪购自ABI，水平电泳仪RDY-SP1Z购自上海山富，恒温摇床COS-2102C购自上海比朗，超净工作台BSC-1000II A2购自上海博迅实业有限公司，离心机购自Sigma，倒置显微镜购自奥林巴斯，垂直电泳仪购自BioRad，转膜仪购自BioRad，凝胶成像仪805购自上海山富，CO2培养箱购自Thermo scientific；其余设备由深圳市新产业生物医学工程股份有限公司提供。
2.细胞株、菌株和质粒
Human TSHR(hTSHR，人促甲状腺激素受体，也就是来源于人的促甲状腺激素受体)cDNA购自OriGene公司，质粒pcDNATM3.1/His A及GripTiteTM293MSR细胞、相应的培养基购自life technology公司；感受态细胞Trans5α购自北京全式金公司。
3.通过分子克隆技术构建表达hTSHR重组蛋白的动物细胞表达载体
由哺乳动物细胞翻译后再加工修饰产生的来源于哺乳动物的外源蛋白质，在活性方面远胜于原核表达系统，及酵母、昆虫细胞等真核表达系统中表达的蛋白。其能够指导蛋白质的正确折叠，提供复杂的N型糖基化和准确的O型糖基化等多种翻译后加工功能，因而表达产物在分子结构、理化性质和生物学功能方面最接近于天然蛋白质。
哺乳动物细胞表达载体包含原核序列、启动子、增强子、选择标记基因、终止子和多聚核苷酸信号等。
3.1引物的设计与合成
利用primer5.0根据hTSHR的cDNA序列(如SEQ ID NO:2)设计扩增hTSHR第61-537位的引物序列，并以Kpn I和EcoR I作为酶切位点，上游引物序列PF1如SEQ ID NO:3，下游引物序列PR1如SEQ ID NO:4；和第1417-1700位的引物序列，并以EcoR I和Xba I作为酶切位点，上游引物序列PF2如SEQ ID NO:5，下游引物序列PR2如SEQ ID NO:6。引物序列的合成由生工生物工程(上海)股份有限公司完成。
3.2目的基因的克隆
以购买的hTSHR cDNA质粒为模板，PF1和PR1为引物扩增hTSHR第61-537位的DNA序列；以PF2和PR2为引物扩增hTSHR第1417-1500位的DNA序列。并通过酶切、连接等步骤将此两个片段构建到pcDNATM3.1/His A质粒载体上，具体如下：
用Kpn I和Xba I双酶切pcDNATM3.1/His A载体，用Kpn I和EcoR I双酶切PF1和PR1扩增后纯化的hTSHR第61-537位的DNA片段，以及用EcoR I和Xba I双酶切PF2和PR2扩增后纯化的hTSHR第1417-1500位的DNA片段，并用胶回收试剂盒对上述酶切后的载体和目的片段进行纯化回收。分别取2μL回收的线性载体和目的片段进行1％琼脂糖凝胶电泳，用Nanodrop分光光度计计算出线性载体和目的片段的浓度。
用T4连接酶连接上述回收纯化后的片段和载体，其中目标片段和载体的摩尔比为2:1-10:1，体系如下：载体片段：1μL；hTSHR第61-537位的DNA片段：3μL；hTSHR第1417-1500位的DNA片段：3μL；5×T4DNA Ligase Buffer：2μL；T4DNA Ligase：1μL；补水至10μL，16℃连接过夜。然后将连接体系转化大肠杆菌Trans5α。在转化时设置阳性和阴性对照，阳性对照为没有经过酶切的质粒，用以检测转化效率；阴性对照为空的大肠杆菌感受态，用以检测感受态细胞是否有污染。将转化产物涂布于含氨苄(100μL/mL)的LB固体培养基中，37℃过夜培养。在含有重组质粒的LB平板上随机挑取多个单菌落，以其为模板，采用通用引物分别作PCR扩增反应，l％琼脂糖凝胶电泳检测是否有目的条带。同时将挑取的多个单菌落分别摇菌，按质粒提取试剂盒的说明提取质粒，并用相应的限制性内切酶双酶切质粒，电泳检测酶切产物。
将菌液PCR和双酶切两种验证均为阳性的样品送至测序公司进行测序，以分析克隆基因的序列组成及其阅读框的正确性。
4.高纯度质粒的制备
采用life technology的HiPure Plasmid DNA Purification Kits进行操作：
1)对高拷贝的质粒采用5mL过夜LB培养菌液，收集菌体，4000g离心7min，弃上清；
2)加入0.4mL的R3(已加入RnaseA)重悬菌体，并混合均匀；
3)加入0.4mL的L7，温和混匀(切勿涡旋)，室温孵育5min(不超过5min)；
4)加入0.4mL的N3，立即混匀(切勿涡旋)；
5)13000g室温离心10min；
6)将上清转移至柱子中，使溶液依靠重力滴下；
7)采用2.5mL的W8清洗柱子，洗两次；
8)将柱子转移至新的离心管中，加入0.9mL的E4于柱子中进行洗脱DNA，使溶液依靠重力滴下；
9)于洗脱液中加入0.63mL的异丙醇，混匀；
10)13000g离心30min于4℃，小心去掉上清；
11)1mL 70％的酒精清洗沉淀，13000g离心5min，4℃；
12)小心去掉上清，沉淀吹干10min；
13)将DNA沉淀重悬于50μL的TE buffer中，即可使用。
5.GripTiteTM293MSR细胞的培养及复苏
5.1细胞培养
采用DMEM培养基，并在培养基中加入10％胎牛血清(FBS)、10U/mL青霉素和10μg/mL链霉素，在37℃、5％CO2的加湿培养箱中培养细胞GripTiteTM293MSR，待细胞于细胞培养皿中贴壁长满后用0.2％胰酶消化数分钟，镜检下细胞处于圆球状的非贴壁状态，加入胰酶两倍体积的DMEM培养基终止消化，制备成单细胞悬液，以每瓶l×105cells/mL接种传代。
5.2细胞复苏
细胞复苏时，从液氮中取出所要复苏细胞的冻存管，立即投入37℃水浴。在细胞刚好完全解冻前，采用70％的乙醇擦拭小瓶外部，并打开细胞冻存管，将里面所有的细胞悬液移入15mL提前预热的不含相应抗生素的完全培养基置于75cm2培养瓶中，在37℃、5％CO2的加湿培养箱中培养，第二天将培养基更换为含有抗生素的完全培养基，继续进行培养，每天进行检查，直至细胞的覆盖率达到80-90％。
6.hTSHR/pcDNATM3.1/His A在GripTiteTM293MSR细胞中瞬时转染
脂质体转染试剂采用LipofectamineTM 2000。
(1)转染前l天，将处于对数生长期的细胞制备成单细胞悬液，以2×105个/mL细胞接种24孔培养板，加含20％胎牛血清的DMEM培养基2.5mL，在37℃、5％CO2的加湿度培养箱中，培养细胞至80％的汇合度时进行转染。
(2)脂质体/DNA复合物制备
Solution 1：纯化的hTSHR/pcDNATM3.1/His A质粒1μg稀释于Medium250μL。
Solution 2：Reagent 3μL稀释于Medium 250μL。
将上述Solution1和Solution2，混合均匀，即为脂质体/DNA复合物，室温放置孵育10min。
(3)转染：将制备好的脂质体/DNA复合物缓缓加入24孔培养板中，摇匀，37℃、5％CO2细胞培养箱中放置5h，加入20％胎牛血清的DMEM培养基，继续置入培养箱中培养。
(4)转染72h后，分析转染细胞并进行各种相关检测。用同样的方法转染空质粒pcDNATM3.1/His A作为阴性对照。
7.hTSHR/pcDNATM3.1/His A在GripTiteTM293MSR细胞中稳定筛选
7.1确定最佳的G418筛选浓度
(1)在12孔板的每孔中加入100μL细胞悬浮液(4000个/m1)，每孔中再加入900μL的完全培养基。
(2)12孔依次加入0到11μL，100mg/mL浓度的G418溶液，在5％CO2、37℃培养箱培养。
(3)以14d后确定杀死所有GripTiteTM293MSR细胞的G418最低药物浓度，将比此浓度稍高的值作为筛选的最佳浓度。
7.2hTSHR基因稳定表达的GripTiteTM293MSR细胞克隆
转染GripTiteTM293MSR细胞后3d，1:10传代于90mm培养皿中，加入含G418的DMEM培养基进行持续稳定筛选，每7d更换培养基。稳定筛选3周，稳定细胞系形成。
8.Westerm blot检测
转染GripTiteTM293MSR细胞培养一定时间后，0.2％胰酶消化离心，PBS洗涤2次，加入相应体积的细胞裂解液，冰上30min，与2×SDS凝胶上样缓冲液混合，沸水中煮10min，l0000g离心10min，将上清蛋白上样，进行SDS-PAGE，转印至硝酸纤维素膜上，5％脱脂奶粉封闭液中缓慢摇动1-2h，然后将hTSHR特异性抗体与膜一起孵育4℃过夜。之后，用1×PBST洗涤5次，每次5分钟。随后将二抗一起室温孵育2h，在1×PBST洗涤5次后，利用增强性化学发光试剂(ECL)检测特异性蛋白条带。
9.收获并纯化重组蛋白
用灭菌的PBS Buffer洗涤细胞，洗去残留在细胞表面的培养基，用PBS重悬，采用超声破碎(即超声3s，停ls，总时长12min)细胞的方法破碎细胞。然后12,000rpm，离心20min；收集上清。采用Ni柱进行蛋白纯化，之后将从Ni柱中洗脱出来的蛋白质用EK酶对纯化的蛋白质进行酶切，以切除融合蛋白的N端的组氨酸标签序列和冗余序列，然后再次使用Ni柱进行蛋白纯化，将切下的含有组氨酸标签序列和冗余序列的多肽挂柱，收集不挂柱的蛋白质，即为本发明的重组蛋白(如SEQ ID NO:1)，使其纯度≥95％。
以下为利用优化表达得到的hTSHR重组抗原进行化学发光检测，本发明所提供的用于检测甲状腺疾病的试剂盒的组成可以包含多种方式。
实施例1
在本具体实施中，检测试剂盒的制备包括：
1、ABEI标记的蛋白A
其制备方法为：利用ABEI通过直接或间接标记的方式，与蛋白A抗原振摇反应后，得到标记有ABEI的蛋白A抗原。其中，间接标记包括但不限于利用FITC-抗FITC抗体体系、链霉亲和素系统进行间接连接。
1)透析液(碳酸缓冲液，F溶液)的配置，在5000mL烧杯中加入Na2CO314.31g，NaHCO326.46g，加水，调节pH值到9.5，定容至4500mL配制好的F溶液置于磁力搅拌器上备用。
2)选用合适截留量(一般为截留分子量10000-20000的透析袋，常用截留分子量14000的透析袋)的透析袋，用纯化水试漏3次(使用时不能漏液)。
3)取100μg蛋白A抗原用0.1mol/L pH9.5的碳酸缓冲液(F溶液)调整到1mL，装入透析袋中后，放入透析液中，室温搅拌透析2小时，将透析好的溶液加入300μg ABEI活化酯，37℃反应2小时。
4)利用G-25凝胶柱纯化ABEI标记后的蛋白A。
5)D2溶液的配制
加入200mL磷酸缓冲液溶液(pH 5.8)、20g BSA、8g NaN3、2g MgCl2·6H2O、600mL甘油定容到2000mL(过滤)。
6)纯化好的ABEI标记后的蛋白A用D2溶液对倍稀释，即可。
2、hTSHR重组抗原包被的磁球
1)称取2.55g三水合乙酸钠用4500mL纯化水溶解后再加如14mL乙酸混匀后，定容至5000mL(pH值为3.6)。
2)向小白瓶中加入5倍于包被体积的磷酸盐缓冲液，放入超声波仪器中一边超声一边搅拌清洗2-3分钟，然后置于磁铁上，待上清液清亮后，倒出上清液。该步骤重复三次。
3)加入包被体积等量的pH3.6醋酸缓冲液悬浮磁珠浓度20mg/mL，再加入碳二亚胺(CDC)(浓度为10mg/mL)，按抗原:抗体＝1:2的量加入纯化的hTSHR重组抗原。
4)将磁珠放入恒温震荡水浴箱中37℃反应24小时(震荡水浴锅振摇速度为260rpm/min)。
5)以磷酸盐缓冲液(pH 5.8):纯化水＝1:9比率配置pH 7.4的PBS缓冲液，混匀后，称量0.5％的BSA自溶，即为磁珠清洗液。
6)将温浴好的磁珠倒入烧杯中，然后置于磁铁上沉淀后，倒掉上清，加入5倍体积的磁珠清洗液搅拌清洗，然后放置在磁铁上，待上清液清亮后倒掉上清液，重复该清洗步骤四次。
7)清洗完毕后，加入包被体积的磁珠悬浮液或Tris-HCl缓冲液，悬浮浓度为20mg/mL，即得到hTSHR重组抗原包被的磁球。
3、TRAb(促甲状腺激素受体抗受体抗体)低点校准品、高点校准品制备
将TRAb校准品用校准品稀释液(50％牛血清制品)按不同比例稀释成低浓度：20IU/mL；高浓度：200IU/mL的两个高、低校准品定标点，用来校准标准曲线。
实施例2
在本具体实施中，检测试剂盒的制备包括：
hTSHR重组抗原的FITC标记：1)透析液(碳酸缓冲液，F溶液)的配置，在5000mL烧杯中加入Na2CO314.31g，NaHCO326.46g，加纯水，调节pH值到9.5，定容至4500mL配制好的F溶液置于磁力搅拌器上备用。
2)选用合适截留量(一般为截留分子量10000-20000的透析袋，常用截留分子量14000的透析袋)的透析袋，量取合适的尺寸，润湿后扎紧一端，纯化水试漏3次(使用时不能漏液)。
3)取100μg真核表达的hTSHR重组抗原用0.1mol/L pH 9.5的碳酸缓冲液(F溶液)调整到1mL，装入透析袋中后，放入透析液中，室温搅拌透析2小时，将透析好的溶液加入300μg FITC活化酯，37℃反应2小时。
4)利用G-25凝胶柱纯化FITC标记后的蛋白hTSHR重组抗原。
5)D2溶液的配制
加入200mL磷酸盐缓冲液溶液(pH 5.8)、20g BSA、8g NaN3、2g MgCl2·6H2O、600mL甘油定容到2000mL(过滤)。
6)纯化好的FITC标记后的蛋白hTSHR重组抗原用D2溶液对倍稀释，即可。
ABEI标记的蛋白A和TRAb(促甲状腺激素受体抗受体抗体)低点校准品、高点校准品制备同实施1，抗FITC抗体包被磁球同实施例1中的hTSHR重组抗原的包被磁球。
实施例3
在本具体实施中，检测试剂盒的制备包括：
(1)蛋白A的生物素化，具体步骤如下：
透析液(碳酸缓冲液，F溶液)的配制：在5000mL烧杯中加入Na2CO314.31g，NaHCO326.46g，加纯水，调节pH值到9.5，定容至4500mL。配制好的F溶液置于磁力搅拌器上备用。
取100μg生物素及1mg蛋白A用0.1mol/L pH9.5的碳酸缓冲液(F溶液)调整到1mL，装入透析袋中后，放入透析液中，室温搅拌透析2小时，37℃反应2小时。
通过G-25凝胶柱纯化。
按照实施例1的方法配制D2溶液，将纯化好的连接产物用D2溶液稀释，使其浓度为0.025μg/mL。
(2)SA的标记
取100μg SA用0.1mol/L pH9.5的碳酸缓冲液(F溶液)调整到1mL，装入透析袋中后，放入透析液中，室温搅拌透析2小时，将透析好的溶液加入300μg ABEI活化酯，37℃反应2小时。
使用G-25凝胶柱纯化SA与ABEI的连接产物。
纯化好的连接产物用D2溶液稀释，使其浓度以SA计为10μg/mL，备用。
hTSHR重组抗原的包被磁珠和TRAb(促甲状腺激素受体抗受体抗体)低点校准品、高点校准品制备同实施例1。
实施例4
在本具体实施中，检测试剂盒的制备包括：
(1)抗人IgG的标记
透析液(碳酸缓冲液，F溶液)的配制：在5000mL烧杯中加入Na2CO314.31g，NaHCO326.46g，加纯水，调节pH值到9.5，定容至4500mL。配制好的F溶液置于磁力搅拌器上备用。
选用合适截留量(常用14000)的透析袋，量取合适的尺寸，润湿后扎紧一端，纯化水试漏3次(需无漏液)。
取100μg抗人IgG用0.1mol/L pH9.5的碳酸缓冲液(F溶液)调整到1mL，装入透析袋中后，放入透析液中，室温搅拌透析2小时，将透析好的溶液加入300μg ABEI活化酯，37℃反应2小时。
通过G-25凝胶柱纯化抗人IgG与ABEI的连接产物。
D2溶液的配制：加入200mL的0.5M磷酸盐缓冲液(P001溶液)、20g BSA、8g NaN3、2gMgCl2·6H2O、600mL甘油，加纯水定容到2000mL，过滤。
将纯化好的抗人IgG与ABEI的连接产物用D2溶液稀释，使其浓度以抗人IgG计为0.025μg/mL。
(2)抗人IgM的标记
透析液(碳酸缓冲液，F溶液)的配制：在5000mL烧杯中加入Na2CO314.31g，NaHCO326.46g，加纯水，调节pH值到9.5，定容至4500mL。配制好的F溶液置于磁力搅拌器上备用。
选用合适截留量(常用14000)的透析袋，量取合适的尺寸，润湿后扎紧一端，纯化水试漏3次(需无漏液)。
取100μg抗人IgM用0.1mol/L pH9.5的碳酸缓冲液(F溶液)调整到1mL，装入透析袋中后，放入透析液中，室温搅拌透析2小时，将透析好的溶液加入300μg ABEI活化酯，37℃反应2小时。
通过G-25凝胶柱纯化抗人IgM与ABEI的连接产物。
D2溶液的配制：加入200mL的0.5M磷酸盐缓冲液(P001溶液)、20g BSA、8g NaN3、2gMgCl2·6H2O、600mL甘油，加纯化水定容到2000mL，过滤。
将纯化好的抗人IgM与ABEI连接产物用D2溶液稀释，使其浓度以抗人IgM计为0.025μg/mL。
hTSHR重组抗原的包被磁珠和TRAb(促甲状腺激素受体抗受体抗体)低点校准品、高点校准品制备同实施例1。
实施例5
化学发光免疫双抗原夹心法原理为：蛋白A用ABEI标记或抗人IgG和抗人IgM分别用ABEI标记，hTSHR重组抗原包被磁性微球、生物素化或用FITC标记，在37℃下，样本、校准品和ABEI标记的SPA或抗人IgG和抗人IgM与包被在磁性微球上的hTSHR重组抗原或FITC上标记的hTSHR重组抗原发生免疫反应，形成“夹心三明治”免疫复合物。仪器自动将各个标本的光强度信号，通过十点曲线及两点定标自动拟合出待测样本的TRAb浓度值。
1)利用上述4个实施例制备的检测试剂盒测定待测样本的TRAb浓度值，具体操作如下：
(1)仪器开机，背景BGW和光检查LC，确保仪器状态正常。
(2)十点标准曲线的配置，标准品(TSHR抗体，北京博奥森公司)，原始浓度为5600IU/mL，于-20℃保存；用夹心法稀释液按一定比例稀释A至J点，其中，各点的浓度梯度为：
A、0.00IU/mL，B、10.0IU/mL，C、15.298IU/mL，D、23.403IU/mL，E、35.803IU/mL，F、54.772IU/mL，G、83.792IU/mL，H、182.186IU/mL，I、192.102IU/mL，J、300.0IU/mL。
(3)样本准备：确诊的格雷氏(Graves)病人标本150例，WHO标准品浓度为100IU/mL。
(4)加样步骤：25μL标准品/样本、40μL缓冲液和20μL包被hTSHR重组抗原的纳米磁珠，37℃反应30分钟，循环清洗一次，加入200μL ABEI标记的蛋白A，37℃反应10分钟，循环清洗一次，测量得出相应的相对光强度RLU。
(5)十点曲线和样本及WHO标准品的计算。
a)使用深圳市新产业生物医学工程股份有限公司研发生产的全自动化学发光免疫分析仪Maglumi 2000Plus确定标准品浓度的光强度(RLU)函数关系式，计算出十点标准曲线。
b)依据标准曲线，计算深圳北大医院临床确认的150例Graves病人及酶联免疫的结果的样本。
c)验证WHO标准品实际浓度和标定浓度是否相符合。
2)正常人判断阀值的确定
通过大量临床试验及根据统计学分析，判断阀值为正常人<30IU/mL，阳性≥30IU/mL。
3)结果
实施例1中表达的hTSHR重组抗原在化学发光免疫检测和酶免检测上的结果的对比如表1所示：
表1
表2
对表1的数据分析可知，第5、8、9、19、21、49、57、75、87、90、93、99、104、106、140、149号样本的酶免检测hTSHR抗体显示为阴性，而实际结果中，第5、8、9、19、21、49、57、75、87、90、93、99、104、106、140、149样本为Graves病阳性患者，即本方案经优化表达的hTSHR抗原在化学发光免疫平台上的检测结果与临床实际诊断结果相符，也就是说，本方案可减少酶免平台的漏检现象，由此可知本方案检测结果更符合临床检测。
另外，如上表2显示，通过优化表达的hTSHR抗原在化学发光免疫平台上的检测结果可知：
阳性检出率＝137/150*100％＝91.33％
而酶免阳性检出率＝121/150*100％＝80.67％
由上述数据可得出以下结论：
(1)经优化表达的hTSHR抗原在Graves病中的检出率高于酶联免疫试剂盒；
(2)经优化表达的hTSHR蛋白抗原在化学发光平台上应用，可有效避免酶联免疫平台的灵敏度和精确度差，容易造成漏检或者出现假阳性的现象。
需要说明的是，虽然本发明已作了详细描述，但对本领域技术人员来说，在本发明精神和范围内的修改将是显而易见的。此外，应当理解的是，本发明记载的各方面、不同具体实施方式的各部分、和列举的各种特征可被组合或全部或部分互换。在上述的各个具体实施方式中，那些参考另一个具体实施方式的实施方式可适当地与其它实施方式组合，这是将由本领域技术人员所能理解的。此外，本领域技术人员将会理解，前面的描述仅是示例的方式，并不旨在限制本发明。
Claims (11)
1.一种促甲状腺激素受体蛋白质，所述蛋白质的序列为SEQ ID NO:1；
所述蛋白质为在真核表达系统中表达而获得的蛋白质。
2.根据权利要求1所述的蛋白质，其特征在于，所述蛋白质为在哺乳动物表达系统中表达而获得的蛋白质。
3.根据权利要求1或2所述的蛋白质，其特征在于，所述蛋白质为结合标记物的蛋白质。
4.根据权利要求3所述的蛋白质，其特征在于，所述蛋白质选自纳米磁珠包被的蛋白质、生物素及生物素衍生物化的蛋白质和荧光素标记的蛋白质。
5.根据权利要求4所述的蛋白质，其特征在于，所述生物素衍生物选自Sulfo-NHS-Biotin、Sulfo-NHS-LC-Biotin、Sulfo-NHS-LC-LC-Biotin、NHS-PEG4-Biotin、NHS-PEG12-Biotin、NHS-Biotin、NHS-LC-Biotin、NHS-LC-LC-Biotin、Sulfo-NHS-SS-Biotin、NHS-SS-Biotin、NHS-SS-PEG4-Biotin、NHS-Chromogenic Biotin、NHS-Iminobiotin、PEP-Biotin、TFP-PEG3-Biotin、Maleimide-PEG2-Biotin、以及Maleimide-PEG11-Biotin；
所述荧光素选自异硫氰酸荧光素、6-羧基荧光素、四乙基罗丹明、四甲基异硫氰酸罗丹明、藻红蛋白、多甲藻叶绿素蛋白、以及碘化丙啶。
6.一种编码促甲状腺激素受体蛋白质的基因，其特征在于，所述基因为通过表达能够获得如权利要求1或2所述的蛋白质的基因中的至少一种。
7.一种用于检测促甲状腺激素受体抗体的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括如权利要求1至5任意一项所述的蛋白质。
8.根据权利要求7所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒中还包括携带有标记示踪物的蛋白A。
9.根据权利要求7所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒中还包括携带有标记示踪物的抗人IgG和抗人IgM。
10.根据权利要求8或9所述的试剂盒，其特征在于，所述标记示踪物选自吖啶酯、吖啶酯酸-NHS酯、吖啶酸丙磺酸钠盐、9-吖啶羧酸、鲁米诺、鲁米诺钠盐、N-(4-氨丁基)-N-乙基异鲁米诺、光泽精、3,3',5,5'-四甲基联苯胺丙磺酸钠、3,3',5,5'-四甲基联苯胺、异鲁米洛、多聚异鲁米诺、多聚吖啶酯、氧化葡聚糖、氨化葡聚糖、以及羧基化葡聚糖。
11.根据权利要求8或9所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒中还包括BSA缓冲液。
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