JP5373610B2 - リガンド−レセプター結合阻害活性の測定方法 - Google Patents

Description

本発明は、被験物質のリガンドと該リガンドのレセプターの結合阻害活性の有無および／または強さを測定する方法に関する。本発明の方法は、高感度で、簡便な中和活性の検出方法として特に有用である。

生体内に繰り返し薬物を投与した場合、当該薬物に対する抗体が出現することがある。内因性の物質と同じアミノ酸配列を有するリコンビナント医薬品の場合であっても、自己抗体が出現する可能性があり、そのなかにはもとの内因性物質を中和する抗体もありうる。

例えば、リコンビナントヒトエリスロポエチン（rhEPO）の場合、極めて稀ではあるがEPOを投与されている腎不全患者の中に、rhEPOに対する中和抗体の出現が確認されており、当該抗体により、抗EPO抗体陽性の赤芽球ろう（pure red cell aplasia；PRCA）を合併する症例も報告されている（非特許文献１）。

薬物に対する中和抗体の出現は、当該薬物の効果を消失させるだけでなく、新たな疾患を惹起させる可能性もあるため、早期に発見することが重要であるが、従来の中和抗体の検出方法では不十分である。例えば、抗EPO抗体の測定のために、これまで、ELISA（Enzyme-Linked Immuno Sorbent Assay）法やRIP（放射免疫沈降）法、バイオアッセイ法等を用いて、中和抗体の測定が行われてきたが、測定感度や測定方法の煩雑さなどの点において従来の中和抗体の検出方法では不十分であることが指摘されている（非特許文献２，３，４）。更に、生体内で産生される薬物に対する抗体の濃度は極めて低いことから、当該抗体が中和抗体であるか否かを判定することは極めて困難であった。

そのため、薬物に対する抗体の産生が確認された時点で、当該抗体が中和活性を有するか否かにかかわらず、安全性の面から薬物の投与を中止しなければならない場合もあるため、より高感度で、簡便な中和活性の検出方法が求められていた。
N Engl J Med. 2002 Feb 14;346(7):469-75. Journal of Immunological Methods 283(2003)317-329 Journal of Immunological Methods 300(2005)179-191 Nephrol Dial Transplant (2005)20[Suppl 4]:iv 16-22

本発明はこのような状況に鑑みてなされたものであり、その目的は、高感度で、簡便な中和抗体の検出に用いることのできる、被験物質のリガンドと該リガンドのレセプターの結合阻害活性の有無および／または強さを測定する方法を提供することにある。

本発明者らは、上記目的を解決するために鋭意研究した結果、被験物質又はリガンドのいずれかを固相化しておき、リガンドに対するレセプターの存在下又は非存在下において、被験物質とリガンドの結合量を比較することで、リガンドとレセプターの結合阻害を高感度で検出可能であることを見出して本発明を完成した。

すなわち、本発明は、より具体的には以下の［１］〜［５］を提供するものである。
［１］被験物質のリガンドと該リガンドのレセプターの結合阻害活性の有無および／または強さを測定する方法であって、以下の（１）〜（３）の工程を有する方法：
（１）該被験物質又はリガンドのいずれかを固相化する工程
（２）該被験物質とリガンドを、該リガンドに対するレセプターの存在下又は非存在下で一定時間接触させる工程
（３）レセプターの存在下と非存在下における被験物質とリガンドの結合量を比較する工程。
［２］前記被験物質が抗体である［１］記載の測定方法。
［３］前記被験物質とリガンドの結合量の測定を分子間の物理的結合を検出する方法によって行う［１］または［２］に記載の測定方法。
［４］前記リガンドが患者に投与される薬剤であって、前記被験物質が該患者から採取された抗体である［１］〜［３］のいずれかに記載の測定方法。
［５］前記リガンドがエリスロポエチンであって、前記レセプターがエリスロポエチンレセプターであって、前記被験物質が抗エリスロポエチン抗体である［１］〜［４］のいずれかに記載の測定方法。
［６］［１］〜［５］のいずれかに記載の測定方法を含む、被験物質のリガンドに対する中和活性の有無および／または強さを検出する方法。

本発明は、被験対象が低濃度であっても、リガンドとレセプターの結合阻害を簡便に検出することが可能な新規な方法である。また、本方法は、被験対象が低濃度であってもリガンドとレセプターの結合阻害を確認することが可能であるため、繰り返し薬物が投与される患者の体内における、当該薬物に対する中和抗体の産生を高感度に検出することが可能である。従来のEPOの中和抗体を検出する方法（後述する比較例２に記載のバイオアッセイ法を利用した中和抗体の検出方法）で被験抗体が中和活性を有しているかどうかを確認するためには、血清中濃度に換算して最低でも650 ng/mLの抗体量が必要であるが、本発明の検出方法では、中和活性を有する抗体の濃度が40 ng/mLあれば十分検出可能である。本発明の方法によって、中和抗体の出現を早期に検出することができ、適切な薬物の投与を行うことが可能になる。

次に実施例を挙げて本発明をより具体的に説明するが、以下の実施例は本発明の単なる例示を示すものであり、本発明の範囲を何ら限定するものではない。

図１は、抗EPO抗体とEPOの結合に及ぼす種々の濃度のsEPOR（可溶性EPOレセプター）の効果を示すグラフである。 図２は、EPO抗体濃度がEPOとの結合に及ぼす効果を、AS-E2細胞を用いるレセプターアッセイで測定した結果を示すグラフである。 図３は、EPO抗体濃度がEPOとの結合に及ぼす効果を、AS-E2細胞を用いるバイオアッセイで測定した結果を示すグラフである。

発明を実施するための形態

用語の定義
本発明において、「被験物質」とは、特に限定されないが、好ましくは、薬物が投与された対象から採取された、血漿、血清、血液、涙液、体液等の中に含まれる物質、特に好ましくは抗体をいう。

本発明において、「リガンド」とは、生体内のレセプターに結合し、細胞内へのシグナル伝達を促進又は抑制する物質であれば特に限定されない。本発明のリガンドとしては、上記の作用を有する薬物が好ましく、例えば内因性タンパク質のリコンビナント医薬品や抗体が好ましい。例えば、EPO、G-CSF、インターフェロン等のサイトカイン、抗体医薬品等が挙げられる。

本発明において、「レセプター」とは、本発明の「リガンド」と結合し、細胞に応答を引き起こすための構造、若しくは当該構造の断片であって少なくとも「リガンド」との結合部位を有する構造を意味する。例えば、「リガンド」がEPO、G-CSF、インターフェロン等のサイトカインの場合、当該サイトカインのレセプター若しくは当該レセプターの断片(当該レセプターの細胞外領域等、少なくとも「リガンド」結合部位を有するレセプターの断片)、「リガンド」が抗体医薬品の場合、当該抗体が結合する抗原若しくは当該抗原の抗体結合部位を有する抗原の断片等が挙げられる。

本発明では、「固相化」には一般的な固相化方法を使用することができる。例えば、被験物質が抗体である場合には、ProteinGを利用して抗体を固相化することができる。その他、炭酸ナトリウム緩衝液を用いて固相化する方法、アミノカップリング等の化学的に架橋する方法、ビオチン-アビジン結合を用いて固相化する方法等が挙げられる。固相は特に限定されないが、担体粒子、ミクロタイタープレート、試験管などを使用できる。後述する実施例では、抗EPO抗体を市販のProtein G Sepharose 4FF（GEヘルスケアバイオサイエンス）に固相化した。

本発明において、「分子間の物理的結合を検出する方法」とは、分子間の物理的結合を検出することができる方法であればよく、例えば、RIP法、SPR（表面プラズモン共鳴）法、バイオアッセイ法、ELISA法等が挙げられる。それぞれの実験手法は当業者に公知である。

本発明の測定方法
本発明を実施する１態様において、被験物質を固相化する場合、リガンドとレセプターの結合阻害を例えばRIP法を用いて測定することができる。被験物質を固相化し、ラジオアイソトープや蛍光色素等で標識したリガンドを、当該リガンドに対するレセプターの存在下又は非存在下で接触させ、被験物質に結合しているリガンドを測定することにより、当該被験物質がリガンドとレセプターの結合を阻害するかどうかを判別することができる。レセプター存在下における被験物質とリガンドの結合がレセプター非存在下における結合と比較して低い場合には、当該被験物質はリガンドとレセプターの結合阻害活性を有すると判断することができる。具体的には以下の実施例に記載の手順で実施することができる。すなわち、¹²⁵Iで標識したEPOと種々の濃度の可溶性EPOレセプターをRIA用チューブ内で混合した試料（レセプターの存在群）と、可溶性EPOレセプターを含まない試料（レセプターの非存在群）を準備し、これらに抗EPO抗体を含むヒト血清の試験用試料として、ヒト血清と抗EPO抗体を添加した。次いでProtein G Sepharose 4FF懸濁液を添加、攪拌して抗EPO抗体を固相化し、遠心分離して，上清を除去し、得られる沈渣の放射能量（cpm）及びバックグラウンドをガンマーカウンターを用いて測定した。この方法により測定検体の放射能量を求めたところ、可溶性EPOレセプターの用量に依存して抗EPO抗体と¹²⁵I-EPOの結合が阻害されることが観察された。

また、本発明を実施する別の１態様において、リガンドを固相化する場合は、固相化されたリガンドに対し、当該リガンドに対するレセプターの存在下又は非存在下で被験物質を接触させ、固相化されたリガンドに結合している被験物質を測定することによりリガンドとレセプターの結合を阻害するかどうかを判別することができる。上記同様、レセプター存在下における被験物質とリガンドの結合がレセプター非存在下における結合と比較して低い場合には、当該被験物質はリガンドとレセプターの結合阻害活性を有すると判断することができる。

中和活性の有無の測定
上記の測定により、リガンドとレセプターの結合阻害活性を有する物質は、リガンドに対する中和活性を有すると判定できる。例えば、本測定方法を利用して、薬剤を投与している患者に当該薬剤に対する中和抗体が産生されているかどうかを判別することができる。

実施例１：抗EPO抗体と¹²⁵I-EPOの結合に及ぼす種々の濃度のsEPOR（可溶性EPOレセプター）の効果
それぞれ検体希釈液（150 mmol/L NaCl，0.02% NaN₃，0.1% BSA，0.1 vol% Tween 20含有10 mmol/L Tris-HCl buffer，pH7.4）で希釈した¹²⁵I-EPO溶液50 μL(190822cpm)と0、8、40、200 μg/mLに希釈したsEPOR（R&D Systems） 50μLをRIA用チューブ内で混合し、約4℃で一晩（約20時間）静置した。各条件につきtriplicateで検討した。

各々のチューブに、ヒトプール血清（Gemini Bio-Products）20 μLおよび検体希釈液で100ng/mLに希釈した抗EPO抗体80 μLを添加・撹拌（計200 μL）し，約4℃で6時間静置した。

Protein G Sepharose 4FF懸濁液50 μLを各々のチューブに添加し，振とう機を用いて室温で1時間攪拌した。なお、Protein G Sepharose 4FF懸濁液は、Protein G Sepharose 4FF（GEヘルスケアバイオサイエンス）を等容量の検体希釈液で懸濁して，遠心（1660×G，約4℃，1分）後，上清を除去する操作を2回繰り返し、ゲル湿重量1 gにつき検体希釈液1 mL（許容範囲±2%）を添加・懸濁することによって調製した。次に、冷却した検体希釈液2 mLを添加・攪拌し，遠心分離（1660×G，約4℃，5分間）し，上清を除去した。この沈渣に再度，冷却した検体希釈液2 mLを添加・攪拌し，遠心分離（1660×G，約4°C，5分間）し，上清を除去した。沈渣の放射能量（cpm）及びバックグラウンド（空の5チューブ）をガンマーカウンター（COBRA Quantum 5005 Gamma Counting system，PerkinElmer）を用いて，5分間測定した。以下の式を用いて測定検体の放射能量を求めた。

測定検体の放射能量（cpm）
＝測定検体の放射能量の実測値（cpm）−バックグラウンド（空の5チューブの平均cpm）
得られた結果を図1に示す。sEPORの用量に依存して抗EPO抗体と¹²⁵I-EPOの結合が阻害された。
実施例２：ヒト個体別血清での検討
それぞれ検体希釈液で希釈した¹²⁵I-EPO溶液50 μL(88869cpm)と、希釈液50 μL（コントロール）または40 μg/mLに希釈したsEPOR 50μLをRIA用チューブ内で混合し、約4℃で一晩（約20時間）静置した。各条件につきduplicateで検討した。

各々のチューブに、ヒト個体別血清（UNIGLOBE RESEARCH CORPORATION）20 μLおよび検体希釈液で10または100ng/mLに希釈した抗EPO抗体80 μLを添加・撹拌（計200 μL）し，約4℃で6時間静置した。

Protein G Sepharose 4FF懸濁液50 μLを各々のチューブに添加し，振とう機を用いて室温で1時間攪拌した。冷却した検体希釈液2 mLを添加・攪拌し，遠心分離（1660×G，約4℃，5分間）し，上清を除去した。この沈渣に再度，冷却した検体希釈液2 mLを添加・攪拌し，遠心分離（1660×G，約4℃，5分間）し，上清を除去した。沈渣の放射能量（cpm）及びバックグラウンド（空の5チューブ）をガンマーカウンター（COBRA Quantum 5005 Gamma Counting system，PerkinElmer）を用いて， 5分間測定し、実施例１と同様の方法で測定検体の放射能量を求めた。

得られた結果を表１に示す。なお、抗体濃度は血清中濃度に換算して表記した。

いずれの血清でもsEPOR添加による抗EPO抗体と¹²⁵I-EPOの結合阻害が観察された。

本結果により、本発明の方法を用いれば、40ng／mLの抗体量で被験抗体の阻害活性を十分検出することが可能であることが示された。
比較例：
１．レセプターアッセイ
ヒト赤白血病細胞株AS-E2を、20%FBS（Hyclone）を含むイスコフ改変ダルベッコ培地（IMDM）に10ng/mLのEPOを添加してCO₂培養器にて37℃、5%CO₂下6日間培養した。培養終了後、約4℃で1000rpm、5分間遠心し、上清を吸引して除去し、20%FBSを含むIMDMで３回洗浄した後、CO₂培養器にて一晩（約24時間）37℃、5%CO₂下培養した。

培養後、細胞を遠心により回収し、1%BSAを添加したダルベッコPBS（1%BSA/PBS）にて2回洗浄し、1x10⁷個/mLに希釈した。1%BSA/PBSにて0、0.46、2.78、16.7、100μg/mLに希釈した抗EPO抗体50μLに¹²⁵I-EPO 50μL(100025cpm)を添加し、さらに希釈した細胞200μLを混和し、約4℃で一晩（約20時間）静置した。

静置後の細胞を遠心し、1%BSA/PBSにて2回洗浄し、ガンマカウンターにて放射能量（cpm）を5分間測定した。

バックグラウンドは、¹²⁵I-EPO および抗体の代わりに2μgの非標識EPOを添加した細胞を用いて同様の操作を行って測定した。特異的結合は、各抗体濃度の放射活性からバックグラウンドの放射能量を減じて算出した。

得られた結果を図2に示す。細胞表面へのEPOの結合を阻害しているかどうかを確認するためには、少なくとも500ng/mLの抗体が必要であった。実際の評価には、血清を50%添加する系とした場合、血清中濃度で1μg/mLの抗体濃度が必要となる。
２．バイオアッセイ
20%FBS/IMDMに10ng/mL EPOを添加して培養したAS-E2細胞浮遊液を培養フラスコから遠心チューブに回収し，1000 rpm（約240×G）で10分間遠心した。上清を除去したのち，試験用培地（20%FBS/IMDM）に細胞を浮遊させ再度遠心した後，上清を除去し試験用培地に細胞を浮遊させた。この操作を3回行い，培地中のEPOを除去した。細胞浮遊液の一部を0.4%トリパンブルーにより染色して細胞数をカウントし，生細胞数及び生存率を求めた。生細胞数が2×10⁵cells/mLになるように試験用培地を用いて細胞浮遊液を希釈した。

試験用培地で希釈したEPO溶液を96ウェルマイクロプレートに40 μL/wellずつ添加した。さらに試料あるいは試験用培地を10 μL/wellずつ添加した。各試料につき3ウェルを用いた（triplicate assay）。プレートを炭酸ガスインキュベーターに入れ，30〜60分間静置した。プレートを炭酸ガスインキュベーターから取り出し，2×10⁵cells/mLの細胞浮遊液をすべてのウェルに1×10⁴ cells/50 μL/wellずつ添加した。また，これらとは別に細胞を播種していないウェル（ブランクウェル）を3ウェル設け，試験用培地を100 μL/wellずつ添加した。炭酸ガスインキュベーター内で96〜97時間培養した。プレート内のウェルの乾燥を極力防ぐため，何も添加していないウェル（空ウェル）にはPBSを300 μL/wellずつ添加した。

培養終了後，WST-1溶液10 mL/wellをすべてのウェルに加えて混和し，マイクロプレートリーダーを用いて，620 nmを対照波長として各ウェルの450 nmにおける吸光度（0時間後）を測定した。炭酸ガスインキュベーター内で2時間培養した後，620 nmを対照波長として各ウェルの450 nmにおける吸光度（2時間後）を測定した。

得られた結果を図３に示す。

本系では、被験抗体濃度が130ng/mL以上の場合に、増殖抑制を確認することができた。細胞系への血清添加濃度の上限が20％であることから、血清を20%添加する系を作成した場合、中和抗体の血清中濃度が650ng/mL以上であれば、当該抗体の存在を検出することができる。

一般に、細胞株を用いた評価系では、ヒト血清を多量に添加すると、非特異的な増殖阻害が起こることが知られていることから、本目的のように、特異的な増殖阻害を検出するためには、添加するヒト血清は、20%以内とすることが多い。よって、本系によって増殖抑制試験を行うには650ng/mLの抗体が必要となる。

Claims (6)

1. 被験物質のリガンドと該リガンドのレセプターの結合阻害活性の有無および／または強さを測定する方法であって、以下の（１）〜（３）の工程を有する方法：
   （１）該被験物質又はリガンドのいずれかを固相化する工程
   （２）該被験物質とリガンドを、該リガンドに対するレセプターの存在下又は非存在下で一定時間接触させる工程
   （３）レセプターの存在下と非存在下における被験物質とリガンドの結合量を比較する工程。
2. 前記被験物質が抗体である請求項１記載の測定方法。
3. 前記被験物質とリガンドの結合量の測定を分子間の物理的結合を検出する方法によって行う請求項１または２に記載の測定方法。
4. 前記リガンドが患者に投与される薬剤であって、前記被験物質が該患者から採取された抗体である請求項１〜３のいずれかに記載の測定方法。
5. 前記リガンドがエリスロポエチンであって、前記レセプターがエリスロポエチンレセプターであって、前記被験物質が抗エリスロポエチン抗体である請求項１〜４のいずれかに記載の測定方法。
6. 請求項１〜５のいずれかに記載の測定方法を含む、被験物質のリガンドに対する中和活性の有無および／または強さを検出する方法。

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