CN112533617A - 癌症新抗原和其在癌症疫苗和基于tcr的癌症免疫疗法中的效用 - Google Patents

癌症新抗原和其在癌症疫苗和基于tcr的癌症免疫疗法中的效用 Download PDF

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Abstract

公开了用于鉴定新抗原和使用新抗原用于治疗癌症以及自身免疫疾病的用途的组合物和方法，其中抗原引起组织破坏。

Description

癌症新抗原和其在癌症疫苗和基于TCR的癌症免疫疗法中的 效用
本申请要求于2018年4月25日提交的美国临时申请第62/662,495号的权益，所述美国临时申请通过引用整体并入本文。
背景技术
通过检查点阻断和基于T细胞的方法进行的癌症免疫疗法为癌症患者带来了令人印象深刻且持久的临床益处。越来越多的证据表明，通过检查点阻断疗法诱导的肿瘤消退依赖于癌细胞表达的突变衍生的新抗原的识别。癌症患者的突变情景是检查点阻断疗法的强烈预测生物标志物。尽管可以从每个癌症组织中鉴定出大量(数百个)体细胞突变来充当新抗原，但仅鉴定出少数(每个癌症患者1到3个免疫原性表位)用于T细胞识别。需要用于鉴定新抗原的新方法以及使用所述方法鉴定的新抗原的方法和组合物。
发明内容
公开了与鉴定新型新抗原有关的方法和组合物，以及在癌症的治疗中使用所述新抗原的方法。
在一方面，本文公开了从人类受试者的癌症中鉴定新抗原的方法，所述方法包括：a)对来自癌细胞的核酸样品进行全外显子组测序；b)将序列映射到参考基因组序列(如例如，人类基因组)；c)过滤序列变异以去除肿瘤和正常细胞中的常见变异；d)产生包括至少一种不常见的氨基酸变异和一或多种侧翼氨基酸的一或多种单突变肽构建体；e)合成对步骤d的一或多种单突变肽构建体进行编码的一或多种小基因；f)将一或多种小基因转染到一或多种表达MHC I类或MHC II类分子的细胞或细胞系中；g)将一或多种T细胞或T细胞系与步骤f)的经过转染的细胞共培养；h)测量经过共培养的T细胞或T细胞系的T细胞活性；i)在诱导T细胞活性的经过转染的细胞系中测定每个小基因的单突变肽单独诱导T细胞活性的能力。
在一方面，本文还公开了鉴定任何前述方面的新抗原的方法，所述方法进一步包括将所述突变映射到特定的肽表位和/或进一步包括测定所述肽表位的HLA限制。
本文还公开了鉴定任何前述方面的新抗原的方法，其中所述单突变构建体包括所述突变的任一侧上的至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24或25个氨基酸。
本文还公开了鉴定任何前述方面的新抗原的方法，其中所述小基因包括至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24或25个单突变构建体。
在一方面，本文还公开了鉴定任何前述方面的新抗原的方法，其中表达MHC I类或II类分子的所述一或多个细胞或细胞系(如例如HEK293细胞、HEK293T细胞、Cos-7、MA104细胞、CHO细胞、成纤维细胞、B细胞、VERO细胞、马丁达比狗肾(Madin-Darby Canine Kidney)(MDCK)细胞、HEp-2细胞、HeLa细胞、MRC-5细胞、WI-38细胞、EB66或PER C6细胞)被工程化为表达MHC分子。
本文还公开了鉴定任何前述方面的新抗原的方法，其中所述T细胞活性(如例如，细胞因子的释放，包含但不限于IFN-γ、TGF-β、淋巴毒素-α、IL-2、IL-4、IL-10、IL-17或IL-25)是通过ELISA、ELISpot、细胞内细胞因子染色或铬释放测量的。
在一方面，本文还公开了鉴定任何前述方面的新抗原的方法，其中所述癌症选自由以下组成的组：B细胞淋巴瘤、T细胞淋巴瘤、蕈样真菌病、霍奇金氏病(Hodgkin'sDisease)、髓细胞性白血病、膀胱癌、脑癌、神经系统癌症、头颈癌(head and neckcancer)、头颈部鳞状细胞癌、肺癌(lung cancer)、小细胞肺癌、非小细胞肺癌、神经母细胞瘤、胶质母细胞瘤、卵巢癌、胰腺癌、前列腺癌、皮肤癌、黑色素瘤、基底细胞癌、鳞状细胞癌、肝癌、口腔、咽喉、喉部和肺的鳞状细胞癌、宫颈癌(cervical cancer/cervicalcarcinoma)、乳腺癌、肾癌、泌尿生殖系统癌症、肺癌(pulmonary cancer)、食管癌、头颈癌(head and neck carcinoma)、大肠癌、造血系统癌症；睾丸癌；结直肠癌、前列腺癌、AIDS相关的淋巴瘤或AIDS相关的肉瘤。
在一方面，本文还公开了通过鉴定任何前述方面的新抗原的方法鉴定的新抗原(包含但不限于新抗原的肽、多肽和蛋白质)。例如，本文公开了包括氨基酸序列AEPKRKSSLFWHAFNRLTPFRK(SEQ ID NO:2)的肽、多肽或蛋白质或其包括至少9个氨基酸的片段，其中所述肽、多肽或蛋白质的任何片段至少包括序列LFWHAFNRL(SEQ ID NO:7)(例如，SSLFWHAFNRLTP(SEQ ID NO:4)、RKSSLFWHAFNRL(SEQ ID NO:3)、RKSSLFWHAFNRLTPFR(SEQID NO:6)和LFWHAFNRLTPFR(SEQ ID NO:5))；一种包括氨基酸序列FQLLLEKPFQIFCAELWVRDINDHA(SEQ ID NO:9)的多肽或其包括至少13个氨基酸的片段，其中所述多肽的任何片段至少包括序列LEKPFQIFCAELW(SEQ ID NO:12)；一种包括氨基酸序列ENSPLGTEFPLNYALDLDVGSNNVQ(SEQ ID NO:14)的多肽或其包括至少13个氨基酸的片段，其中所述多肽的任何片段至少包括序列LGTEFPLNYALDL(SEQ ID NO:17)；一种包括氨基酸序列MTDDKDVLRNVWFGRIPTCFT(SEQ ID NO:19)的多肽或其包括至少11个氨基酸的片段，其中所述多肽的任何片段至少包括序列KDVLRNVWFGR(SEQ ID NO:23)(例如，DDKDVLRNVWFGR(SEQ ID NO:22)、KDVLRNVWFGRIP(SEQ ID NO:21)和DDKDVLRNVWFGRIP(SEQ ID NO:24))；一种包括氨基酸序列RLKASLDRPFTNSESAFYSIVGLSS(SEQ ID NO:26)的多肽或其包括至少11个氨基酸的片段，其中所述多肽的任何片段至少包括序列RPFTNSESAFY(SEQ ID NO:30)(例如，DRPFTNSESAFYS(SEQ ID NO:28))；一种包括氨基酸序列GSGEKVAGRVIVKVCEVTRVKAVRI(SEQ ID NO:32)的多肽或其包括至少9个氨基酸的片段，其中所述多肽的任何片段至少包括序列RVIVKVCEV(SEQ ID NO:36)(例如，KVAGRVIVKVCEV(SEQ ID NO:33)、AGRVIVKVCEVTR(SEQ ID NO:34)、KVAGRVIVKVCEVTRVK(SEQ ID NO:32)和RVIVKVCEVTRVK(SEQ ID NO:35))；一种包括氨基酸序列YGMYFCMNISSQEDGACVLLRALEP(SEQ ID NO:39)的多肽或其包括至少10个氨基酸的片段，其中所述多肽的任何片段至少包括序列ISSQEDGACV(SEQ ID NO:43)(例如，MNISSQEDGACVL(SEQ ID NO:41)、ISSQEDGACVLLR(SEQ ID NO:42)、MNISSQEDGACVLLR(SEQ ID NO:44)、ISSQEDGACVL(SEQ ID NO:132)、ISSQEDGACVLL(SEQ ID NO:133)、NISSQEDGACV(SEQ ID NO:134)、NISSQEDGACVL(SEQ ID NO:135)、NISSQEDGACVLL(SEQ IDNO:136)、NISSQEDGACVLLR(SEQ ID NO:137)和MNISSQEDGACVLL(SEQ ID NO:138))；一种包括氨基酸序列MKLTSLMCNPVKSPFFGCVCGHVPISMCVSTCSSLPTASCALDLTVLAENSHQVGA(SEQ IDNO:46)的多肽或其包括至少26个氨基酸的片段，其中所述多肽的任何片段至少包括序列VSTCSSLPTASCALDLTVLAENSHQV(SEQ ID NO:60)(例如，MCNPVKSPFFGCVCGHVPISMCVSTCSSLPTASCALDLTVLAENSHQVGA(SEQ ID NO:49)、KSPFFGCVCGHVPISMCVSTCSSLPTASCALDLTVLAENSHQVGA(SEQ ID NO:50)、GCVCGHVPISMCVSTCSSLPTASCALDLTVLAENSHQVGA(SEQ ID NO:51)、GHVPISMCVSTCSSLPTASCALDLTVLAENSHQVGA(SEQ ID NO:52)、SMCVSTCSSLPTASCALDLTVLAENSHQVGA(SEQ ID NO:53)、VSTCSSLPTASCALDLTVLAENSHQVGA(SEQ ID NO:54)、MCNPVKSPFFGCVCGHVPISMCVSTCSSLPTASCALDLTVLAENSHQV(SEQ ID NO:57)、VSTCSSLPTASCALDLTVLAENSHQVG(SEQ ID NO:139)、CVSTCSSLPTASCALDLTVLAENSHQV(SEQ ID NO:140)、MCVSTCSSLPTASCALDLTVLAENSHQV(SEQ ID NO:141)、MCVSTCSSLPTASCALDLTVLAENSHQVG(SEQ ID NO:142)、SMCVSTCSSLPTASCALDLTVLAENSHQV(SEQ ID NO:143)和SMCVSTCSSLPTASCALDLTVLAENSHQVG(SEQ ID NO:144))；和/或一种包括氨基酸序列MLMAQEALAFLMAQGAMLAAQERRVPRAAEVPGAQGQQGPRGREEAPRGVRMAVPLLRRMEGAPAGPGGRTAACLSCTSRCLSRRPWKRSWSAGSCPGMPHRSPDQGRF(SEQ ID NO:67)的多肽或其包括至少61个氨基酸的片段，其中所述多肽的任何片段至少包括序列VPRAAEVPGAQGQQGPRGREEAPRGVRMAVPLLRRMEGAPAGPGGRTAACLSCTSRCLSRR(SEQ ID NO:73)(例如，QERRVPRAAEVPGAQGQQGPRGREEAPRGVRMAVPLLRRMEGAPAGPGGRTAACLSCTSRCLSRRPWKR(SEQ ID NO:74)、RVPRAAEVPGAQGQQGPRGREEAPRGVRMAVPLLRRMEGAPAGPGGRTAACLSCTSRCLSRR(SEQ ID NO:145)、RRVPRAAEVPGAQGQQGPRGREEAPRGVRMAVPLLRRMEGAPAGPGGRTAACLSCTSRCLSRR(SEQ ID NO:146)、ERRVPRAAEVPGAQGQQGPRGREEAPRGVRMAVPLLRRMEGAPAGPGGRTAACLSCTSRCLSRR(SEQ ID NO:147)、QERRVPRAAEVPGAQGQQGPRGREEAPRGVRMAVPLLRRMEGAPAGPGGRTAACLSCTSRCLSRR(SEQ ID NO:148)、RVPRAAEVPGAQGQQGPRGREEAPRGVRMAVPLLRRMEGAPAGPGGRTAACLSCTSRCLSRRP(SEQ ID NO:149)、RRVPRAAEVPGAQGQQGPRGREEAPRGVRMAVPLLRRMEGAPAGPGGRTAACLSCTSRCLSRRP(SEQ IDNO:150)、ERRVPRAAEVPGAQGQQGPRGREEAPRGVRMAVPLLRRMEGAPAGPGGRTAACLSCTSRCLSRRP(SEQID NO:151)、QERRVPRAAEVPGAQGQQGPRGREEAPRGVRMAVPLLRRMEGAPAGPGGRTAACLSCTSRCLSRRP(SEQ ID NO:152)、RVPRAAEVPGAQGQQGPRGREEAPRGVRMAVPLLRRMEGAPAGPGGRTAACLSCTSRCLSRRPW(SEQ ID NO:153)、RRVPRAAEVPGAQGQQGPRGREEAPRGVRMAVPLLRRMEGAPAGPGGRTAACLSCTSRCLSRRPW(SEQ ID NO:154)、ERRVPRAAEVPGAQGQQGPRGREEAPRGVRMAVPLLRRMEGAPAGPGGRTAACLSCTSRCLSRRPW(SEQ ID NO:155)、QERRVPRAAEVPGAQGQQGPRGREEAPRGVRMAVPLLRRMEGAPAGPGGRTAACLSCTSRCLSRRPW(SEQ ID NO:156)、RVPRAAEVPGAQGQQGPRGREEAPRGVRMAVPLLRRMEGAPAGPGGRTAACLSCTSRCLSRRPWK(SEQ ID NO:157)、RRVPRAAEVPGAQGQQGPRGREEAPRGVRMAVPLLRRMEGAPAGPGGRTAACLSCTSRCLSRRPWK(SEQ ID NO:158)、ERRVPRAAEVPGAQGQQGPRGREEAPRGVRMAVPLLRRMEGAPAGPGGRTAACLSCTSRCLSRRPWK(SEQ ID NO:159)、QERRVPRAAEVPGAQGQQGPRGREEAPRGVRMAVPLLRRMEGAPAGPGGRTAACLSCTSRCLSRRPWK(SEQ ID NO:160)、RVPRAAEVPGAQGQQGPRGREEAPRGVRMAVPLLRRMEGAPAGPGGRTAACLSCTSRCLSRRPWKR(SEQ ID NO:161)、RRVPRAAEVPGAQGQQGPRGREEAPRGVRMAVPLLRRMEGAPAGPGGRTAACLSCTSRCLSRRPWKR(SEQ ID NO:162)、ERRVPRAAEVPGAQGQQGPRGREEAPRGVRMAVPLLRRMEGAPAGPGGRTAACLSCTSRCLSRRPWKR(SEQ IDNO:163)、EALAFLMAQGAMLAAQERRVPRAAEVPGAQGQQGPRGREEAPRGVRMAVPLLRRMEGAPAGPGGRTAACLSCTSRCLSRRPWKRSWSAGSCPGMPHRSP(SEQ ID NO:61)、EALAFLMAQGAMLAAQERRVPRAAEVPGAQGQQGPRGREEAPRGVRMAVPLLRRMEGAPAGPGGRTAACLSCTSRCLSRRPWKRSWSAGSCPGM(SEQ ID NO:62)、EALAFLMAQGAMLAAQERRVPRAAEVPGAQGQQGPRGREEAPRGVRMAVPLLRRMEGAPAGPGGRTAACLSCTSRCLSRRPWKRSWSAG(SEQ ID NO:63)、EALAFLMAQGAMLAAQERRVPRAAEVPGAQGQQGPRGREEAPRGVRMAVPLLRRMEGAPAGPGGRTAACLSCTSRCLSRRPWKR(SEQ ID NO:64)、LMAQGAMLAAQERRVPRAAEVPGAQGQQGPRGREEAPRGVRMAVPLLRRMEGAPAGPGGRTAACLSCTSRCLSRRPWKRSWSAGSCPGMPHRSPDQGRF(SEQ ID NO:68)、AMLAAQERRVPRAAEVPGAQGQQGPRGREEAPRGVRMAVPLLRRMEGAPAGPGGRTAACLSCTSRCLSRRPWKRSWSAGSCPGMPHRSPDQGRF(SEQ ID NO:69)和QERRVPRAAEVPGAQGQQGPRGREEAPRGVRMAVPLLRRMEGAPAGPGGRTAACLSCTSRCLSRRPWKRSWSAGSCPGMPHRSPDQGRF(SEQ ID NO:70))。本文还公开了本文公开的任何多肽或多肽片段的变体，其中所述变体包括保守氨基酸取代。
在一方面，本文还公开了编码任何前述方面的多肽新抗原的核酸。
本文还公开了包括治疗有效量的任何前述方面的一或多种新抗原或编码任何前述方面的新抗原中的一或多种(包含但不限于新抗原的肽、多肽和蛋白质)的一或多种小基因mRNA的组合物。
本文还公开了组合物，所述组合物包括治疗有效量的一或多种嵌合抗原受体(CAR)T细胞、T细胞受体(TCR)T细胞和/或肿瘤浸润性淋巴细胞(TIL)；其中所述CAR T细胞、TCR T细胞和/或TIL已被工程化为表达识别任何前述方面的新抗原中的一或多种(包含但不限于新抗原的肽、多肽和蛋白质)的受体(如例如，T细胞受体或嵌合抗原受体)。在一方面，对任何前述方面的新抗原中的一或多种具有特异性的TCR T细胞、CAR T细胞或TIL进行了进一步工程化，以敲除或敲低含锌指和BTB结构域的蛋白7B(ThPOK)、赖氨酸特异性组蛋白脱甲基酶1(LSD1)、程序性细胞死亡蛋白(PD1)、蛋白磷酸酶2(PP2A)以在过继转移到癌症患者后增强其功能，如细胞毒性活性和体内持久性或存活率。在一方面，对任何前述方面的新抗原中的一或多种具有特异性的TCR T细胞、CAR T细胞或TIL用小分子抑制剂如2-PAPC处理以增强T细胞细胞毒性活性或在体内增殖和存活的能力。
在一方面，本文还公开了刺激针对癌症的免疫应答或治疗、抑制和/或预防癌症的方法，所述方法包括向受试者施用包括治疗有效量的任何前述方面的新抗原(包含但不限于新抗原的肽、多肽和蛋白质)和/或通过鉴定任何前述方面的新抗原的方法鉴定的新抗原的组合物。
附图说明
并入本说明书并构成本说明书一部分的附图示出了若干个实施例，并且与说明书一起说明了所公开的组合物和方法。
图1A、1B和1C示出了肿瘤反应性TIL和T细胞克隆的特异性。图1A示出了从患者#135和#136的癌症组织中扩增出的肿瘤浸润性淋巴细胞(TIL)以及用CD4或CD8抗体通过流式细胞术分析的所述肿瘤浸润性淋巴细胞的组成。从135TIL或136TIL系中分离了CD4+和CD8+T细胞群体，并且基于干扰素-γ(上，患者#135；下，患者#136)的表达确定了135mel或136mel对这些T细胞群体的活化。图1B示出了在与多种细胞系温育后确定135TIL和136TIL的特异性。图1C示出了在与135mel或EBV-B和其它黑色素瘤细胞系温育后通过释放IFN-γ确定患者#135的78个CD4+T细胞克隆中的14个和40个CD8+T细胞克隆中的14个的特异性和活化。(上，CD4+；下，CD8+)。数据呈现为表示三个独立实验。
图2示出了其它CD4+肿瘤反应性T细胞克隆的特异性。在与其它患者的135mel以及EBV-B和黑色素瘤细胞系温育后，通过释放IFN-γ来确定64个(共78个)CD4+T细胞克隆的活化。数据呈现为表示三个独立实验。
图3A、3B、3C、3D、3E、3F、3G和3H示出了通过T细胞使用全外显子组测序和串联小基因筛选鉴定患者#135的多种新抗原。图3A示出了通过全外显子组测序鉴定的以及通过一系列过滤标准分析的135mel细胞的体细胞突变，导致232个体细胞突变和24个TMG构建体。图3B示出了使用135TIL(CD4+群体)在人工APC中筛选由MHC-II分子呈递的TMG。IFN-γELISA示出，CD4+TIL分别强烈识别TMG6、TMG17、TMG18。图3C示出了基于四种HLA II类新抗原的IFN-γELISA鉴定阳性TMG中MHC-II新抗原：SPATA13(T>A)[TMG6-1](SEQ ID NO:1(WT)和SEQ ID NO:2(MT))；PCDHB7(R>C)[TMG17-6](SEQ ID NO:8(WT)和SEQ ID NO:9(MT))；PCDHB16(H>Y)[TMG17-7](SEQ ID NO:13(WT)和SEQ ID NO:14(MT))以及ATG5(D>N)[TMG18-10](SEQ ID NO:18(WT)和SEQ ID NO:19(MT))。每种新抗原的野生型未被识别。图3D示出了使用135TIL(CD8+群体)在人工APC中筛选由MHC-I分子呈递的TMG。IFN-γELISA示出，CD8+TIL分别强烈识别TMG1和TMG14。图3E示出了基于两种MHC-I新抗原的IFN-γELISA鉴定阳性TMG中MHC-I新抗原：RPN2(L>S)[TMG14-4](SEQ ID NO:25(WT)和SEQ ID NO:26(MT))和TXNIP(E>K)[TMG1-10](SEQ ID NO:31(WT)和SEQ ID NO:32(MT))。每种新抗原的野生型未被识别。图3F示出了使用135TIL筛选由135EBV-B细胞呈递的TMG。除了(D)中鉴定出的阳性TMG外，TMG7也被135TIL识别。图3G示出了在135TIL与自体EBV-B细胞呈递的的24种TMG共培养后，基于IFN-γELISA鉴定一种MHC-I新抗原：MPG(G>E)[TMG7-5](SEQ ID NO:38(WT)和SEQ ID NO:39(MT))。所述野生型未被识别。图3H示出了与135TIL温育的HLA II类和I类新抗原(突变型和野生型)的系列稀释肽的IFN-γELISA。B-H中的数据绘制为三个独立实验的平均值±SD。*P<0.05，**P<0.01，通过使用学生t检验与模拟对照或WT肽对照进行比较。
图4A和4B示出了鉴定来自TMG和其表位的135mel的亚克隆的MHC-II新抗原。图4A示出了被CD4+135TIL识别的每个阳性MHC-II TMG被亚克隆到10个分离的构建体中，每个构建体编码一个突变基因，然后用CD4+135TIL进行测定。IFN-γELISA示出每个TMG中的一个或两个亚克隆基因，当分别由293IMDR3/DP4和293IMDR4/DP4呈递时，所述一个或两个亚克隆基因被CD4+135TIL识别。每个阳性亚克隆被测序并且被鉴定为患者来源的新抗原。图4B示出了SPATA13(SPATA13 WT(SEQ ID NO:1)、SPATA13 MT(SEQ ID NO:2)、SPATA13 13mer-1(SEQ ID NO:3)、SPATA13 13mer-2(SEQ ID NO:4)、SPATA13 13mer-3(SEQ ID NO:5))、PCDHB16(PCDHB16 WT(SEQ ID NO:13)、PCDHB16 MT(SEQ ID NO:14)、PCDHB16 13mer-1(SEQID NO:15)、PCDHB16 13mer-2(SEQ ID NO:16)、PCDHB16 13mer-3(SEQ ID NO:17))、PCDHB7(PCDHB7 WT(SEQ ID NO:8)、PCDHB7 MT(SEQ ID NO:9)、PCDHB7 13mer-1(SEQ ID NO:10)、PCDHB7 13mer-2(SEQ ID NO:11)、PCDHB7 13mer-3(SEQ ID NO:12))和ATG5(ATG5 WT(SEQID NO:18)、ATG5 MT(SEQ ID NO:19)、ATG5 13mer-1(SEQ ID NO:20)、ATG5 13mer-2(SEQID NO:21)、ATG5 13mer-3(SEQ ID NO:22))新抗原被截短成三个构建体，每个构建体编码所述突变的13个aa。用135TIL测定截短的肽，并且通过释放IFN-γ来确定识别。将每种新抗原的表位完善到9-13个aa。数据绘制为三个独立实验的平均值±SD。*P<0.05，**P<0.01，通过使用学生t检验与模拟对照进行比较。NS，不显著。
图5A、5B和5C示出了鉴定来自TMG和其表位的135mel的亚克隆的HLA I类新抗原。图5A示出了阳性MHC-I TMG被亚克隆并且用CD8+135TIL进行测定。人工APC呈递的每个阳性亚克隆被测序并且被鉴定为新抗原。图5B示出了TMG7被亚克隆并且用135EBV-B细胞呈递的CD8+135TIL测定。阳性亚克隆被测序并且被鉴定为新抗原。图5C示出了RPN2(RPN2 WT(SEQID NO:25)、RPN2 MT(SEQ ID NO:26)、RPN2 13mer-1(SEQ ID NO:27)、RPN2 13mer-2(SEQID NO:28)、RPN2 13mer-3(SEQ ID NO:29))、TXNIP(TXNIP WT(SEQ ID NO:31)、TXNIP MT(SE QID NO:32)、TXNIP 13mer-1(SEQ ID NO:33)、TXNIP 13mer-2(SEQ ID NO:34)、TXNIP13mer-3(SEQ ID NO:35))和MPG(MPG WT(SEQ ID NO:38)、MPG MT(SE QID NO:39)、MPG13mer-1(SEQ ID NO:40)、MPG 13mer-2(SEQ ID NO:41)、MPG 13mer-3(SEQ ID NO:42))新抗原被截短成三个编码含有突变的13个aa的构建体并且用135TIL进行测定。RPN2的表位被截短成13个aa，MPG的表位被截短成11个aa并且TXNIP的表位被截短成9个aa。数据绘制为三个独立实验的平均值±SD。**P<0.01，通过使用学生t检验与模拟对照进行比较。NS，不显著。
图6A、6B、6C和6D示出了用T细胞克隆通过cDNA文库筛选来鉴定患者#135的两种非突变抗原。图6A示出了用EBV-B细胞呈递的135mel中鉴定的MHC-II新抗原对所有CD4+T细胞克隆进行测定后的代表性数据。两个CD4+肿瘤反应性T细胞克隆(1C1和1E1)不识别任何MHC-II新抗原。图6B示出了两个cDNA池(池#4和#26)分别被CD4+T-细胞克隆1C1和1E1识别。将cDNA池转染到293IMDR3/DP4或293IMDR4/DP4细胞中，然后与不同的T细胞克隆共培养。图6C示出了1C1的池#4和1E1的池#26中克隆的抗原的IFN-γELISA，示出当由293IMDR4或293IMDR3细胞呈递时，两者都分别被1C1和1E1识别。通过测序分析鉴定阳性抗原(示出的是ADIPOR2 3'UTR(省略号表示未在图中示出的核苷酸或氨基酸)的SEQ ID NO 45和46的3'和5'端和LAGE1b ORF2(省略号表示未在图中示出的核苷酸或氨基酸)的SEQ ID NO:47和48的3'和5'端)。图6D示出了分别在与135TIL和抗原特异性T细胞克隆温育的替代性ORF中ADIPOR2和LAGE1b的系列稀释肽的IFN-γELISA。C和D中的数据绘制为三个独立实验的平均值±SD。**P<0.01，使用学生t检验与对照进行比较。
图7A、7B、7C、7D和7E示出了鉴定135mel的两种非突变抗原。图7A示出了通过CD4+T细胞克隆鉴定的非突变抗原的序列。1C1识别的抗原是位于基因ADIPOR2(SEQ ID NO:45示出了ADIPOR2的核酸序列并且SEQ ID NO:46示出了3'UTR的氨基酸序列和T细胞识别的表位)的3'UTR序列中的56个aa阅读框。1E1识别的抗原是位于基因CTAG2(LAGE1b)(SEQ IDNO:47示出了LAGE1b的核酸序列并且SEQ ID NO:48示出了ORF2的氨基酸序列和T细胞识别的表位)的编码序列中的109个aa肽，但是位于框移阅读框中。图7B示出了用1C1测定ADIPOR2编码序列的IFN-γELISA和3'UTR中的抗原。1C1仅识别3'UTR中鉴定的抗原，但不识别ADIPOR2编码序列。图7C示出了用1E1测定的在正常阅读框(ORF1)和替代性阅读框(ORF2)中LAGE1b的IFN-γELISA。1E1仅识别ORF2，但不识别ORF1。数据呈现为三个独立实验的平均值±SD。*P<0.05，**P<0.01，通过使用学生t检验与模拟或指定对照进行比较。图7D和7E示出了对ADIPOR2和LAGE1b抗原进行了连续截短。用对应的T细胞克隆测定每个截短并且通过IFN-γELISA进行检验。1C1识别的ADIPOR2的最小线性截短为26个aa，而1E1识别的LAGE1b的最小线性截短为69个aa。数据绘制为三个独立实验的平均值±SD。*P<0.05，**P<0.01，通过使用学生t检验仅用T细胞进行比较。NS，不显著。
图8A、8B、8C、8D、8E、8F、8G、8H和8I示出了鉴定患者#136的多种新抗原。图8A示出了鉴定136mel细胞的体细胞突变，导致348个体细胞突变和35个TMG构建体。图8B示出了使用136TIL(CD4+群体)在人工APC中筛选由MHC-II分子呈递的TMG。IFN-γELISA示出，CD4+TIL分别强烈识别TMG19、TMG31、TMG32。图8C示出了基于四种HLA II类新抗原的IFN-γELISA鉴定阳性TMG中MHC-II新抗原：ZFYVE1(H>Y)[TMG19-1](SEQ ID NO:75(WT)和SEQ ID NO:76(MT))；LMAN2(L>R)[TMG31-2](SEQ ID NO:77(WT)和SEQ ID NO:78(MT))；MAPK9(W>C)[TMG31-3](SEQ ID NO:79(WT)和SEQ ID NO:80(MT))以及ANKIB1(P>L)[TMG32-8](SEQ IDNO:81(WT)和SEQ ID NO:82(MT))。每种新抗原的野生型未被识别。图8D示出了使用136TIL(CD8+群体)在人工APC中筛选由MHC-I分子呈递的TMG。IFN-γELISA示出，CD8+TIL仅分别强烈识别TMG2。图8E示出了基于仅一种MHC-I新抗原的IFN-γELISA鉴定阳性TMG中MHC-I新抗原：HHAT(G>E)[TMG2-3](SEQ ID NO:165(WT)和SEQ ID NO:166(MT))。此新抗原的野生型未被识别。图8F示出了筛选由IFN-γ预处理的患者#136的成纤维细胞呈递的TMG，用于表达HLA分子。未发现另外的阳性TMG。图8G示出了使用136TIL的CD4+T-细胞克隆(C13和C22)在人工APC中筛选由MHC-II分子呈递的TMG。IFN-γELISA示出，克隆C13和C22分别强烈识别TMG13和TMG8。图8H示出了基于两种MHC-II新抗原的IFN-γELISA鉴定仅由T细胞克隆识别的MHC-II新抗原：C1GALT1C1(L>F)[TMG13-1](SEQ ID NO:83(WT)和SEQ ID NO:84(MT))和HSPA13(P>L)[TMG8-1](SEQ ID NO:85(WT)和SEQ ID NO:86(MT))。每种新抗原的野生型未被识别。图8I示出了与136TIL或T细胞克隆温育的连续稀释的肽MHC-II和MHC-I新抗原(突变型和野生型)的IFN-γELISA。B-I中的数据绘制为三个独立实验的平均值±SD。*P<0.05，**P<0.01，通过使用学生t检验与模拟对照或WT肽对照进行比较。
图9A、9B、9C和9D示出了鉴定来自TMG的136mel的亚克隆HLA I类和II类新抗原。图9A示出了阳性MHC-II TMG被亚克隆并且用CD4+136TIL进行测定。293IMDR1/DP4或293IMDR11/DP4细胞呈递的每个阳性亚克隆被测序并且被鉴定为新抗原。图9B示出了仅被CD8+136TIL识别的阳性MHC-I TMG2被亚克隆到10个分离的构建体中，每个构建体编码一个突变基因，然后用CD8+136TIL进行测定。IFN-γELISA示出了每个TMG中的一个亚克隆基因，当被Cos7-A1细胞呈递时，其被CD8+136TIL识别并且然后被测序并鉴定为患者来源的新抗原。图9C示出了用IFN-γ处理了三天的136个成纤维细胞并且比较了治疗前后的MHC-II分子的表达。图9D示出了仅被136TIL的CD4+T细胞克隆识别的两个阳性MHC-II TMG被亚克隆并分别用CD4+T细胞克隆测定。293IMDR1/DP4细胞呈递的每个阳性亚克隆被测序并且被鉴定为新抗原。
图10A、10B、10C、10D、10E和10F示出了通过肿瘤反应性T细胞的优势群体识别患者#135和#136的给定新抗原。图10A示出了用MHC-II新抗原测定的135TIL的所有78个CD4+肿瘤反应性T细胞克隆的IFN-γELISA：分别为SPATA13、PCDHB7、PCDHB16、ATG5、ADIPOR226mer和LAGE1b ORF2。图10B示出了用MHC-I新抗原测定的135TIL的所有40个CD8+肿瘤反应性T细胞克隆的IFN-γELISA：分别为RPN2、MPG和TXNIP。图10C示出了CD4+(上)和CD8+(下)135TIL的肿瘤和新抗原肽反应性群体，所述群体在细胞内被IFN-γ抗体染色并通过FACS分选。图10D分别在所有肽反应性CD4+或CD8+T细胞群体的发明内容要中示出了135mel中每种鉴定出的新抗原的比例的统计结果。图10E示出了135TIL中结合PCDHB16和MPG肽的T细胞被分选。用经过分选的T细胞和135TIL进行TCRβCDR3分析。示出了经过分选的T细胞组中新抗原特异性TCR的最高序列频率。图10F示出了TCRβCDR3分析后，结合PCDHB16或MPG的TCR在135TIL中的百分比。
图11A、11B、11C和11D示出了135TIL和136TIL中优势新抗原反应性T细胞的TCRβCDR3库分析。图11A示出了CD4+(上)和CD8+(下)136TIL的肿瘤和新抗原肽反应性群体，所述群体在细胞内被IFN-γ抗体染色并通过FACS分选。图11B分别在所有肽反应性CD4+或CD8+T细胞群体的发明内容要中示出了136mel中每种鉴定出的新抗原的比例的统计结果。图11C示出了在135TIL中PCDHB16反应性T细胞(左)和MPG-反应性T细胞(右)的TCRβCDR3中组合的V-J序列的使用。图11D示出了135TIL中PCDHB16反应性T细胞(左，SEQ ID NO：87)和MPG特异性T细胞(右，SEQ ID NO:164)的TCRβCDR3中V-J接头的氨基酸使用。
图12A、12B、12C、12D、12E和12F示出了当靶向135mel的优势新抗原时的体外和体内抗肿瘤作用。图12A示出了通过有限稀释或单细胞克隆方法从135mel肿瘤细胞系产生的单细胞肿瘤克隆。优势PCDHB16新抗原特异性T细胞克隆1H1，以及亚优势/隐性新抗原2C10(PCDHB7特异性)和JF6(SPATA13特异性)用于检测其识别单肿瘤克隆和本体135mel肿瘤细胞系的能力。数据绘制为三个独立实验的平均值±SD。图12B示出了优势新抗原PCDHB16特异性T细胞克隆1H1示出比针对本体和选定的单肿瘤细胞克隆的135mel上的亚优势/隐性新抗原特异性T细胞克隆更高的肿瘤细胞杀死百分比。图12C示出了在PCDHB16、PCDHB7和SPATA13的突变位点处的135mel肿瘤克隆和135TIL的桑格测序(sanger sequencing)，揭示了每种新抗原的体细胞突变存在于每个克隆的基因组中。图12D示出了注射了135mel并且被135个T细胞克隆治疗的NSG小鼠的方案。图12E示出了在T细胞注射后第4天的体内IFN-γ的鼠血清水平。图12F示出了在注射靶向不同新抗原的T细胞克隆后，体内135mel肿瘤大小的变化。数据绘制为三个独立实验的平均值±SD。**P<0.01，使用学生t检验与对照进行比较。NS，不显著。
图13A、13B、13C和13D示出了单个TCR对多种新抗原的识别。图13A示出了通过连续稀释的肽的IFN-γELISA，T细胞克隆4B8同时识别从ADIPOR2 3'UTR mRNA和PCDHB16新抗原翻译的产物。用4B8 TCR转导的原初T细胞的相同测定证实了这种双重识别。图13B示出了用4B8 TCR转导的分离的CD4+和CD8+T细胞的IFN-γELISA。转导后，仅CD4+T细胞识别两种抗原。图13C示出了T细胞克隆C76的流式细胞术分析，示出了其CD4+/CD8+双重阳性。通过IFN-γ释放测定，经C76 TCR转导的原初T细胞识别HLA I类限制性RPN2新抗原和HLA II类限制性PCDHB16新抗原。图13D示出了用C76 TCR转导的CD8+T细胞识别HLA-A1呈递的RPN2新抗原，而转导的CD4+T细胞仅识别HLA-DR4限制性PCDHB16新抗原。数据呈现为三个独立实验的平均值±SD。**P<0.01，使用学生t检验与对照进行比较。NS，不显著。
图14A、14B和14C示出了一种T细胞受体可以识别双重新抗原。图14A示出了与两种新抗原PCDHB16和ADIPOR2 26mer反应的135TIL的CD4+T细胞克隆4B8的FACS分析。图14B示出了克隆到逆转录病毒载体pMSGV中的TCRα和β链的图。图14C示出了用HLA I类新抗原测定的所有78个CD4+T细胞克隆的IFN-γELISA。发现一个识别PCDHB16的CD4+T细胞克隆C76自发识别HLA-A1呈递的RPN2，从而进一步鉴定C76 TCR双重识别。数据呈现为表示三个独立实验。
图15A、15B、15C示出了ThPOK表达与135个TIL CD4+克隆的细胞毒性相关。图15A示出了通过LDH测定进行的135个TIL CD4+克隆的细胞毒性。效应子:靶标＝20:1。图15B示出了mRNA水平的定量实时PCR。图15C示出了在135个CD4+TIL克隆中ThPOK表达的蛋白质印迹分析。
图16A、16B、16C、16D和16E示出了在人135个CD4+135TIL中ThPOK的敲低增加了它们的细胞毒性。图16A示出了ThPOK敲低效率的蛋白质印迹分析。图16B示出了在ThPOKshRNA首次转导72小时后，在不同的E:T比率下进行了LDH测定。图16C示出了在CD4+135TIL克隆1D1中将有或没有ThPOK shRNA敲低的135mel肿瘤细胞共培养三天。图16D示出了ThPOK敲低72小时后，典型的CD8+CTL溶细胞分子的定量实时PCR分析。图16E示出了CD4+135TIL克隆1D1中的ThPOK敲低在体外保持CD4特性，IFN-γ、GM-CSF、IL-4、IL-10的细胞因子分泌的ELISA检测。
图17A、17B、17C和17D示出了hThPOK的敲低增强了体内肿瘤特异性T细胞的抗肿瘤功效。图17A示出了将2×106 135mel肿瘤细胞接种到SCID(米色)小鼠的腹侧(n＝5)。在第5天过继性转移了5×106个用hThPOK shRNA修饰的CD4+135TIL。用电子卡尺每2到3天监测肿瘤生长。图17B示出了当对照组长度达到10mm时处死小鼠。接种后第26天切除肿瘤并称重。图17C示出了在肿瘤细胞注射后第4天，将用A2ESO TCR或A2ESO TCR-ThPOK shRNA转导的人CD4+或CD8+T细胞注射入小鼠。每天测量肿瘤体积。图17D示出了在第9天处死小鼠并测量肿瘤形态。
图18A、18B、18C和18D示出了ThPOK通过与LSD1相互作用而抑制CD4+肿瘤特异性T细胞的细胞毒性。图18A示出了表观遗传抑制剂筛选鉴定的LSD1抑制增加了抗原特异性CD4+T细胞的细胞毒性。图18B示出了ThPOK相互作用表观遗传基因筛选鉴定的LSD1可以直接与ThPOK相互作用。图18C示出了CD4+T细胞验证的ThPOK中的内源性免疫沉淀可以与CD4+T细胞中的LSD1相互作用。图18D示出了ThPOK和LSD1在GZMB和PRF1基因启动子中的相对占有率。通过抗ThPOK和LSD1染色质免疫沉淀测定对回收的DNA进行Q-PCR分析。
图19A和19B示出了通过体外筛选鉴定2-PCPA为干细胞样记忆T细胞生成的正调节因子。图19A示出了在通过流式细胞术分析干细胞样记忆T细胞(Tscm)百分比之前，通过板结合的OKT3活化T细胞2天并且另外培养12天。在激活时添加代谢物或抑制剂。结果示出为处理的与未处理的T细胞之间的Tscm百分比的倍数变化。Tscm子集被标识为CCR7CD62L+CD45RO-。图19B示出了在2-PCPA处理的T细胞的对照上确定其它Tscm标志物CD95和CD45RA表达。同种型对照示出为蓝色峰。
图20A、20B、20C、20D和20E示出了2-PCPA处理促进了A2ESO TCR-T细胞的体外和体外功能。图20A示出了来自健康供体的T细胞被板结合的OKT3活化2天并且用PG13-A2ESOTCR病毒转导。将转导的T细胞另外培养8天。活化前添加2-PCPA或DMSO(对照)处理。在第10天通过流式细胞术检测CD4和CD8记忆表型。图20B示出了DMSO或2-PCPA处理的A2ESO TCR-T细胞被PMA和离子霉素刺激5小时、固定、透化并且检查了CD4+和CD8+T细胞中IFN-γ、IL-2和TNFα的表达。图20C示出了用CFSE标记DMSO或2-PCPA处理的A2ESO TCR-T细胞并且在IL-2下培养或用231-ESO细胞刺激3天。由FlowJo软件计算分区指数。图20D示出了2-PCPA处理使A2ESO TCR-T细胞具有增加的OXPHOS和备用呼吸能力(SRC)。通过海马(Seahorse)XFe96分析仪检测到OCR。图20E示出了在脂肪垫处NSG小鼠被注射了231-ESO乳腺癌细胞系。3天后，静脉内注射DMSO或2-PCPA处理的A2ESO TCR-T细胞。分离肿瘤并且在2周后称重。
图21A、21B、21C、21D和21E示出了2-PCPA处理促进了CAR-T细胞的体外和体外功能。图21A示出了来自健康供体的T细胞被板结合的OKT3活化2天并且用PG13-CD19 CAR病毒转导。将转导的T细胞另外培养10天。活化前添加2-PCPA或DMSO(对照)处理。在第12天通过流式细胞术检测CD4+和CD8+记忆表型。图21B示出了2-PCPA处理使CAR-T细胞具有增加的OXPHOS和备用呼吸能力(SRC)。通过海马XFe96分析仪检测到OCR。图21C示出了DMSO或2-PCPA处理的CAR-T细胞被广泛洗涤并且在不含IL-2的培养基中培养4天并且通过PI染色检测了存活的细胞。图21D示出了NSG小鼠被静脉内注射Raji淋巴瘤细胞。10天后，静脉内注射DMSO或2-PCPA处理的CD19 CAR和荧光素酶转导的T细胞。通过体内成像追踪CAR-T细胞的增殖。图21E示出了通过流式细胞术检测到的在第8天在脾内的人CD3+细胞百分比。
具体实施方式
在公开和描述本发明的化合物、组合物、制品、装置和/或方法之前，应当理解，除非另外指明，否则它们不限于特定的合成方法或特定的重组生物技术方法，或者除非另外指明，否则不限于特定的试剂，因为它们当然可以变化。还应理解，本文所使用的术语仅出于描述特定实施例的目的，而不旨在是限制性的。
A.定义
如在本说明书和所附权利要求书中所用的，单数形式的“一个”、“一种”和“所述”包含复数指示物，除非上下文清楚地另外指明。因此，例如，提及“药物载剂”包含两种或两种以上此类载剂的混合物等。
范围可以在本文中表示为从“约”一个特定值和/或到“约”另一个特定值。当表达这种范围时，另一个实施例包含从一个具体值和/或到其它具体值。类似地，当通过使用先行词“约”将值表达为近似值时，将理解特定值形成另一个实施例。还将理解，每个范围的端点相对于另一端点，以及独立于另一端点都是显著的。还将理解，本文公开了多个值，并且每个值在本文还被公开为除了值本身之外的“约”所述特定值。例如，如果公开所述值“10”，则还公开“约10”。还应理解，如本领域技术人员适当理解的，当公开的值“小于或等于”所述值时，还公开了“大于或等于所述值”以及值之间的可能范围。例如，如果公开了值“10”，则还公开了“小于或等于10”以及“大于或等于10”。还应当理解，在整个申请中，以多种不同格式提供数据，并且此数据表示端点和起点以及数据点的任何组合的范围。例如，如果公开了特定数据点“10”和特定数据点15，应当理解，认为大于、大于或等于、小于、小于或等于以及等于10和15以及在10与15之间。还应当理解，还公开了两个特定单元之间的每个单元。例如，如果公开了10和15，则还公开了11、12、13和14。
在本说明书和随后的权利要求中，将参考大量术语，这些术语应当被限定为具有以下含义：
“任选的(Optional)”或“任选地(optionally)”是指随后描述的事件或情况可能发生或不发生，并且该描述包括所述事件或情况发生的实例以及事件或情况不发生的实例。
术语“受试者”是指作为施用或治疗的靶标的任何个体。受试者可以是脊椎动物，例如，哺乳动物。在一方面，所述受试者可以是人、非人灵长类、牛、马、猪、犬或猫。受试者也可以是豚鼠、大鼠、仓鼠、兔子、小鼠或鼹鼠。因此，受试者可以是人或兽医患者。术语“患者”是指在临床医师，例如医师的治疗下的受试者。
在整个本申请中，引用了各种出版物。这些出版物的公开内容以其全文通过引用特此并入本申请中，以便更全面地描述本申请所属领域的现状。对于文献中所包含的在文献所依赖的句子中讨论的材料，所公开的参考文献还被单独地和具体地通过引用并入本文。
B.鉴定新抗原的方法
尽管用新抗原肽对正常健康供体的T细胞进行体外刺激可以增加能够活化T细胞的新抗原的数量，但在本公开之前，对于癌症患者中T细胞对新抗原的数量和识别方式尚不清楚。此外，在癌症患者中，单个T细胞受体(TCR)是否可以识别两个或多个新抗原在很大程度上还不清楚。尽管最近使用外显子组测序和计算机辅助预测程序鉴定出许多HLA I类限制性新抗原，但越来越多的证据表明，新抗原特异性CD4+T细胞比新抗原特异性CD8+T细胞更具优势，并且在肿瘤消退中起关键作用。然而，由于MHC II分子的开口袋，目前本领域用于MHC II限制性新抗原的现有预测程序不准确并且比MHC I限制性新抗原的预测程序差很多，从而限制了识别新抗原和开发基于新抗原的免疫疗法的能力。
通过检查点阻断疗法和基于T细胞的免疫疗法诱导的肿瘤消退依赖于T细胞对癌细胞表达的肿瘤抗原，特别是突变衍生的新抗原的识别。然而，尽管在癌症组织中鉴定出可能产生新抗原的大量体细胞突变，但仅报告了少数用于T细胞识别的免疫原性肽表位(每位癌症患者)。这些观察的潜在机制仍然知之甚少。本文报告了鉴定四种MHC II类限制性新抗原和两种MHC I类限制性新抗原。针对CD4+T细胞克隆识别新抗原的进一步分析揭示了一种新抗原的优势，这一优势被87％的T细胞克隆所识别，而若干个低频T细胞克隆识别另外的3种新抗原。总体而言，与仅34％的CD8+T细胞克隆相比，98％的CD4+T细胞识别新抗原。另外，2个T细胞克隆不识别突变衍生的新抗原，而是识别从ADIPOR2基因的3'非翻译区或LAGE1b的替代性开放阅读框翻译的基因产物衍生的新表位。最后，本文表明了单个TCR可以识别两种新抗原，但不识别正常细胞中的其它抗原。还证明了新抗原特异性T细胞在抑制肿瘤生长中的效用和功效。这些发现已经鉴定了免疫调节机制，所述免疫调节机制限制对有限数量的新抗原(其中一种为优势抗原)的T细胞应答，并且在靶向具有多种新抗原特异性的优势新抗原和TCR的个性化免疫疗法中，应该具有重要意义。
在一方面，本文公开了从人类受试者的癌症中鉴定新抗原的方法，所述方法包括a)对来自癌细胞的核酸样品进行外显子组测序(在一些实例中，所述方法可以进一步包括从癌细胞中分离DNA，捕获DNA片段以及构建外显子组文库)；b)将测序结果映射到参考基因组序列数据(例如人类基因组GRCh38/hg38)；c)过滤序列变异以去除肿瘤和正常细胞中的常见变异；d)产生包括至少一种不常见的氨基酸变异和一或多种侧翼氨基酸的一或多种单突变肽构建体；e)合成对步骤d的一或多种单突变肽构建体进行编码的一或多种小基因；f)将一或多种小基因转染到一或多种表达MHC I类或MHC II类分子的细胞或细胞系中；g)将一或多种T细胞或T细胞系与步骤f)的经过转染的细胞共培养；h)测量经过共培养的T细胞或T细胞系的T细胞活性；i)在诱导T细胞活性的经过转染的细胞系中测定每个小基因的单突变肽单独诱导T细胞活性的能力。
在一方面，本文还公开了鉴定本文所公开的任何新抗原的方法，所述方法进一步包括通过连续截短将所述突变映射到特定的肽表位和/或进一步包括通过HLA抗体阻断测定所述肽表位的HLA限制。
如本文所述，在公开的方法中产生的单突变构建体可以在突变的任一侧或两侧上具有一或多个氨基酸。因此，例如，本文公开了鉴定本文所公开的任何新抗原的方法，其中所述单突变构建体包括所述突变的任一侧上的至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24或25个氨基酸。
应当理解并且在本文中考虑，在所公开的方法中产生的小基因可以包括1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25或更多个单突变构建体。因此，在一方面，本文公开了鉴定本文所述公开的任何新抗原的方法，其中所述小基因包括至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24或25个单突变构建体。
在一方面，应当理解并且在本文中考虑，本文还公开的公开内容是鉴定本文所公开的任何新抗原的方法，其中表达MHC I类或II类分子的所述一或多个细胞或细胞系(如例如HEK293细胞、HEK293T细胞、Cos-7、MA104细胞、CHO细胞、成纤维细胞、B细胞、VERO细胞、马丁达比狗肾(MDCK)细胞、HEp-2细胞、HeLa细胞、MRC-5细胞、WI-38细胞、EB66或PER C6细胞)被工程化为表达MHC分子。
应当理解并且在本文中考虑，本领域中已知有许多用于测量T细胞活性的方法，这些方法可以用于所公开的鉴定新抗原的方法中，包含但不限于铬释放测定、ELISA、ELISpot、细胞内细胞因子染色、流式细胞术、MHC I类四聚体染色、MHC II类四聚体染色、放射免疫测定或其它免疫测定。免疫测定可以测量任何数量的效应细胞因子的释放(如例如，细胞因子的释放，包含但不限于IFN-γ、TGF-β、淋巴毒素-α、IL-2、IL-4、IL-10、IL-17或IL-25)或与T细胞活化相关的细胞表面标志物的表达(CD69、CD62L、CD44、CD45 RA、CD45RO和/或CCR7)。
1.免疫测定和荧光染料
各种有用的免疫检测方法的步骤已在科学文献中描述，如例如，马吉奥(Maggio)等人,《酶免疫测定(Enzyme-Immunoassay)》,(1987)和中村(Nakamura)等人,“酶免疫测定：非均相和/或均相系统(Enzyme Immunoassays:Heterogeneous and HomogeneousSystems)”,《实验免疫学手册(Handbook of Experimental Immunology)》,第1卷：免疫化学,27.1-27.20(1986)，所述文献中的每个通过引用整体并入本文并且特别是用于其关于免疫检测方法的教导。从其最简单和最直接的意义上讲，免疫测定是结合测定，涉及抗体与抗原之间的结合。免疫测定的许多类型和形式是已知的并且均适用于检测所公开的生物标志物。免疫测定的实例是酶联免疫吸附测定(ELISA)、放射免疫测定(RIA)、放射免疫沉淀测定(RIPA)、免疫珠捕获测定、蛋白质印迹、斑点印迹法、凝胶移位测定、流式细胞术、蛋白质测定、多重珠阵列、磁力捕获、体内成像、荧光共振能量转移(FRET)和光漂白后荧光恢复/定位(FRAP/FLAP)。
通常，免疫测定涉及在有效允许免疫复合物形成的条件下，使怀疑含有感兴趣的分子(如所公开的生物标志物)的样品与感兴趣的分子的抗体接触或使感兴趣的分子的抗体(如所公开的生物标志物的抗体)与可以被抗体结合的分子接触(视情况而定)。在有效并足以足以形成免疫复合物(一级免疫复合物)的条件下，使样品与感兴趣的分子的抗体或可以被抗体结合的分子接触通常是简单地使分子或抗体与样品接触，并且将混合物温育足够长的时间，以使抗体形成免疫复合物，即与抗体可以结合的任何分子(例如，抗原)结合。在许多形式的免疫测定中，然后可以洗涤样品-抗体组合物，如组织切片、ELISA板、斑点印迹或蛋白质印迹，以去除任何非特异性结合的抗体物种，从而仅检测特异性结合在一级免疫复合物内的抗体。
免疫测定可以包含用于检测或定量样品中感兴趣的分子(如所公开的生物标志物或其抗体)的量的方法，所述方法通常涉及在结合过程中检测或定量形成的任何免疫复合物。通常，免疫复合物形成的检测在本领域中是众所周知的并且可以通过应用多种方法来实现。这些方法通常基于标记或标志物的检测，如任何放射性、荧光、生物或酶标签或任何其它已知标记。
如本文所使用的，标记可以包含荧光染料、结合对的成员如生物素/链霉亲和素、金属(例如，金)或可以与可以检测到的分子特异性相互作用的表位标签，如通过产生有色底物或荧光。适于可检测地标记蛋白质的物质包含荧光染料(在本文中也被称为荧光色素和荧光团)和与比色底物反应的酶(例如，辣根过氧化物酶)。在本发明的实践中，通常优选使用荧光染料，因为可以以非常低的量检测到它们。此外，在多个抗原与单个阵列反应的情况下，可以用不同的荧光化合物标记每种抗原以进行同时检测。使用荧光计检测阵列上的标记斑点，信号的存在表明抗原与特定抗体结合。
荧光团是发光的化合物或分子。通常，荧光团吸收一个波长处的电磁能并且发射第二波长处的电磁能。代表性的荧光团包含但不限于1,5IAEDANS；1,8-ANS；4-甲基伞形酮；5-羧基-2,7-二氯荧光黄；5-羧基荧光素(5-FAM)；5-羧基萘荧光素；5-羧基四甲基罗丹明(5-TAMRA)；5-羟色胺(5-HAT)；5-ROX(羧基-X-罗丹明)；6-羧基罗丹明6G；6-CR6G；6-JOE；7-氨基-4-甲基香豆素；7-氨基放线菌素D(7-AAD)；7-羟基-4-I甲基香豆素；9-氨基-6-氯-2-甲氧基吖啶(ACMA)；ABQ；酸性品红；吖啶橙；吖啶红；吖啶黄(Acridine Yellow)；吖啶黄(Acriflavin)；吖啶黄福尔根(Feulgen)SITSA；水母素(光蛋白)；AFP-自发荧光蛋白-(昆腾生物技术有限公司(Quantum Biotechnologies))参见sgGFP、sgBFP；Alexa Fluor 350TM；Alexa Fluor 430TM；Alexa Fluor 488TM；Alexa Fluor 532TM；Alexa Fluor 546TM；AlexaFluor 568TM；Alexa Fluor 594TM；Alexa Fluor 633TM；Alexa Fluor 647TM；Alexa Fluor660TM；Alexa Fluor 680TM；茜素络合指示剂(Alizarin Complexon)；茜素红；别藻蓝蛋白(APC)；AMC、AMCA-S；氨基甲基香豆素(AMCA)；AMCA-X；氨基放线菌素D；氨基香豆素；苯胺蓝；硬脂酸蒽；APC-Cy7；APTRA-BTC；APTS；阳离子艳红4G；阳离子橙R；阳离子红6B；阳离子黄7GLL；阿的平(Atabrine)；ATTO-TAGTMCBQCA；ATTO-TAGTMFQ；金胺；磷化氢亚金G；磷化氢亚金；BAO 9(双氨基苯基噁二唑)；BCECF(高pH)；BCECF(低pH)；硫酸黄连素；β-内酰胺酶；BFP蓝移GFP(Y66H)；蓝色荧光蛋白；BFP/GFP FRET；比马内(Bimane)；双苯酰亚胺(Bisbenzemide)；双苯酰亚胺(赫斯特(Hoechst))；双-BTC；布兰科福尔荧光增白剂(Blancophor)FFG；布兰科福尔荧光增白剂SV；BOBOTM-1；BOBOTM-3；Bodipy492/515；Bodipy493/503；Bodipy500/510；Bodipy；505/515；Bodipy 530/550；Bodipy 542/563；Bodipy 558/568；Bodipy 564/570；Bodipy576/589；Bodipy 581/591；Bodipy 630/650-X；Bodipy 650/665-X；Bodipy 665/676；Bodipy Fl；Bodipy FL ATP；Bodipy Fl-神经酰胺；Bodipy R6G SE；Bodipy TMR；Bodipy TMR-X缀合物；Bodipy TMR-X,SE；Bodipy TR；BodipyTR ATP；Bodipy TR-X SE；BO-PROTM-1；BO-PROTM-3；亮磺基黄素FF；BTC；BTC-5N；钙黄绿素；钙黄绿素蓝；钙红-；钙绿；钙绿-1Ca2+染料；钙绿-2Ca2+；钙绿-5N Ca2+；钙绿-C18 Ca2+；钙橙；钙荧光白；羧基-X-罗丹明(5-ROX)；级联蓝TM；级联黄；儿茶酚胺；CCF2(GeneBlazer)；CFDA；CFP(青色荧光蛋白)；CFP/YFP FRET；叶绿素；色霉素A；色霉素A；CL-NERF；CMFDA；腔肠素；腔肠素cp；腔肠素f；腔肠素fcp；腔肠素h；腔肠素hcp；腔肠素ip；腔肠素n；腔肠素O；香豆素鬼笔环肽；C-藻青蛋白；CPM I甲基香豆素；CTC；CTC甲瓒；Cy2TM；Cy3.1 8；Cy3.5TM；Cy3TM；Cy5.18；Cy5.5TM；Cy5TM；Cy7TM；青色GFP；环状AMP荧光传感剂(FiCRhR)；Dabcyl；丹酰；丹酰胺；丹酰尸胺；丹磺酰氯；丹磺DHPE；丹磺酰氟；DAPI；Dapoxyl；Dapoxyl 2；Dapoxyl 3'DCFDA；DCFH(二氯二氢荧光素乙酰乙酸酯)；DDAO；DHR(二氢罗丹明123)；Di-4-ANEPPS；Di-8-ANEPPS(非比)；DiA(4-Di 16-ASP)；二氯二氢荧光素乙酰乙酸酯(DCFH)；DiD-亲脂性示踪剂；DiD(DilC18(5))；DIDS；二氢罗丹明123(DHR)；Dil(DilC18(3))；I二硝基酚；DiO(DiOC18(3))；DiR；DiR(DilC18(7))；DM-NERF(高pH)；DNP；多巴胺；DsRed；DTAF；DY-630-NHS；DY-635-NHS；EBFP；ECFP；EGFP；ELF 97；曙红；赤藓红；赤藓红ITC；溴化乙锭；溴乙啡锭二聚体-1(EthD-1)；Euchrysin；EukoLight；氯化铕(111)；EYFP；快蓝；FDA；福尔根(副蔷薇苯胺)；FIF(甲醛诱导荧光)；FITC；Flazo橙；Fluo-3；Fluo-4；荧光素(FITC)；二乙酸荧光素；荧光祖母绿；荧光金(羟芪巴脒)；荧光红；FluorX；FM 1-43TM；FM 4-46；Fura红TM(高pH)；Fura红TM/Fluo-3；Fura-2；Fura-2/BCECF；Genacryl亮红B；Genacryl亮黄10GF；Genacryl粉3G；Genacryl黄5GF；GeneBlazer；(CCF2)；GFP(S65T)；GFP红移(rsGFP)；GFP野生型非UV激发(wtGFP)；GFP野生型UV激发(wtGFP)；GFPuv；Gloxalic酸；粒蓝；血卟啉；赫斯特33258；赫斯特33342；赫斯特34580；HPTS；羟基香豆素；羟芪巴脒(荧光金)；羟色胺；Indo-1，高钙；Indo-1，低钙；吲哚二羰花青(DiD)；吲哚三羰花青(DiR)；Intrawhite Cf；JC-1；JO JO-1；JO-PRO-1；LaserPro；莱罗丹；LDS751(DNA)；LDS 751(RNA)；雷可福(Leucophor)PAF；雷可福(Leucophor)SF；雷可福(Leucophor)WS；丽丝胺罗丹明；丽丝胺罗丹明B；钙黄绿素/溴乙啡锭二聚体；LOLO-1；LO-PRO-1；；荧光黄；Lyso Tracker蓝；Lyso Tracker蓝白；Lyso Tracker绿；Lyso Tracker红；Lyso Tracker黄；LysoSensor蓝；LysoSensor绿；LysoSensor黄/蓝；Mag绿；麦哥达拉红(竹桃红B)；Mag-Fura红；Mag-Fura-2；Mag-Fura-5；Mag-lndo-1；镁绿；镁橙；孔雀石绿；船坞蓝；I美色纶亮黄素10GFF；美色纶亮黄素8GFF；部花青；甲氧基香豆素；Mitotracker绿FM；Mitotracker橙；Mitotracker红；光辉霉素；单溴二胺；单溴二胺(mBBr-GSH)；单氯二胺；MPS(甲基绿派洛宁二苯基乙烯)；NBD；NBD胺；尼罗红；硝基苯并二咪唑；去甲肾上腺素；核固红；i核黄；Nylosan Brilliant lavin E8G；俄勒冈绿TM；俄勒冈绿TM488；俄勒冈绿TM500；俄勒冈绿TM514；海水蓝；副蔷薇苯胺(福尔根)；PBFI；PE-Cy5；PE-Cy7；PerCP；PerCP-Cy5.5；PE-TexasRed(红613)；竹桃红B(麦哥达拉红)；Phorwite AR；Phorwite BKL；Phorwite Rev；Phorwite RPA；Phosphine 3R；光刻胶；藻红蛋白B[PE]；藻红蛋白R[PE]；PKH26(西格玛(Sigma))；PKH67；PMIA；Pontochrome蓝黑；POPO-1；POPO-3；PO-PRO-1；PO-I PRO-3；樱草黄；普施安黄；碘化丙啶(Pl)；PyMPO；芘；派若宁；派若宁B；Nylosan亮黄素7GF；QSY 7；芥子奎吖因；试卤灵；RH 414；Rhod-2；罗丹明；罗丹明110；罗丹明123；罗丹明5GLD；罗丹明6G；罗丹明B；罗丹明B 200；罗丹明B extra；罗丹明BB；罗丹明BG；罗丹明绿；罗丹明类鬼笔环肽；罗丹明：鬼笔环肽；罗丹明红；罗丹明WT；玫瑰红；R-藻蓝蛋白；R-藻红蛋白(PE)；rsGFP；S65A；S65C；S65L；S65T；天蓝色GFP；SBFI；血清素；塞夫隆(Sevron)亮红2B；塞夫隆亮红4G；塞夫隆I亮红B；塞夫隆橙；塞夫隆黄L；sgBFPTM(超级炫光BFP)；sgGFPTM(超级炫光GFP)；SITS(樱草黄；二苯基乙烯异硫磺酸)；SNAFL钙黄绿素；SNAFL-1；SNAFL-2；SNARF钙黄绿素；SNARF1；钠绿；光谱浅绿；光谱绿；光谱橙；光谱红；SPQ(6-甲氧基-N-(3磺丙基)喹啉鎓)；二苯基乙烯；磺酰罗丹明B和C；磺酰罗丹明Extra；SYTO 11；SYTO 12；SYTO 13；SYTO 14；SYTO 15；SYTO16；SYTO 17；SYTO 18；SYTO 20；SYTO 21；SYTO 22；SYTO 23；SYTO 24；SYTO 25；SYTO 40；SYTO 41；SYTO 42；SYTO 43；SYTO 44；SYTO 45；SYTO 59；SYTO 60；SYTO 61；SYTO 62；SYTO63；SYTO 64；SYTO 80；SYTO 81；SYTO 82；SYTO 83；SYTO 84；SYTO 85；SYTOX蓝；SYTOX绿；SYTOX橙；四环素；四甲基罗丹明(TRITC)；德克萨斯红TM；德克萨斯红-XTM缀合物；硫杂二羰花青(DiSC3)；噻嗪红R；噻唑橙；硫磺素5；硫磺素S；硫磺素TON；Thiolyte；Thiozole橙；Tinopol CBS(卡尔科弗卢尔(Calcofluor)白)；TIER；TO-PRO-1；TO-PRO-3；TO-PRO-5；TOTO-1；TOTO-3；三色(PE-Cy5)；TRITC四甲基若丹明异硫氰酸盐；纯蓝；纯红；Ultralite；荧光素钠B；尤辉得(Uvitex)SFC；wt GFP；WW 781；X-罗丹明；XRITC；二甲苯橙；Y66F；Y66H；Y66W；黄GFP；YFP；YO-PRO-1；YO-PRO 3；YOYO-1；YOYO-3；Sybr绿；噻唑橙(嵌入染料)；半导体纳米颗粒如量子点；或笼状荧光团(其可以用光或其它电磁能源活化)或其组合。
可以通过卤化将改性剂单元如放射性核素并入或直接连接到本文所描述的任何化合物。可用于本实施例的放射性核素的实例包含但不限于氚、碘125、碘131、碘123、碘-124、砹210、碳11、碳14、氮13、氟18。在另一个方面，放射性核素可以连接到连接基团或被螯合基团结合，然后将其直接或通过接头连接到化合物。可用于所述装置(apset)的放射性核素的实例包含但不限于Tc-99m、Re-186、Ga-68、Re-188、Y-90、Sm-153、Bi-212、Cu-67、Cu-64和Cu-62。如此类等放射性标记技术通常用于放射性药物工业中。
放射性标记的化合物可用作成像剂以诊断神经系统疾病(例如，神经退行性疾病)或精神疾病或追踪哺乳动物(例如，人)中此类疾病或病状的进展或治疗。本文所描述的放射性标记化合物可以方便地与成像技术结合使用，如正电子发射断层扫描(PET)或单光子发射计算机断层扫描(SPECT)。
标记可以是直接的或间接的。在直接标记中，检测抗体(感兴趣的分子的抗体)或检测分子(可以被抗体结合到感兴趣的分子的分子)包含标记。标记的检测表明检测抗体或检测分子的存在，这进而分别表明感兴趣的分子或感兴趣的分子的抗体的存在。在间接标记中，使另外的分子或部分与免疫复合物接触或在其位点处产生。例如，可以将信号产生分子或部分如酶与检测抗体或检测分子连接或检与其缔合。信号产生分子然后可以在免疫复合物的位点处产生可检测的信号。例如，当提供合适的底物时，酶可以在免疫复合物的位点处产生可见或可检测的产物。ELISA使用这种类型的间接标记。
作为间接标记的另一个实例，可以与感兴趣的分子或与感兴趣的分子的抗体(第一抗体)如第一抗体的第二抗体结合的另外的分子(其可以被称为结合剂)可以与免疫复合物接触。另外的分子可以具有标记或信号产生分子或部分。所述另外的分子可以是抗体，其因此可以被称为第二抗体。第二抗体与第一抗体的结合可以与第一(first/primary)抗体和感兴趣的分子形成所谓的夹心。免疫复合物可以在有效条件下与标记的第二抗体接触并且持续足以允许第二免疫复合物形成的时间段。然后通常可以洗涤第二免疫复合物以去除任何非特异性结合的标记的第二抗体，并且然后可以检测第二免疫复合物中的剩余标记。另外的分子也可以是或包含一对可以彼此结合的分子或部分中的一个，如生物素/抗生物素蛋白对。在这种模式下，检测抗体或检测分子应包含所述对中的另一个成员。
间接标记的其它模式包含通过两步法检测原发性免疫复合物。例如，如上文所描述的，对感兴趣的分子或对应抗体具有结合亲和力的分子(其可以被称为第一结合剂)如抗体可以用于形成第二免疫复合物。洗涤后，第二免疫复合物可以再次在有效条件下与对第一结合剂具有结合亲和力的另一个分子(其可以被称为第二结合剂)接触并且持续足以允许免疫复合物(从而形成三级免疫复合物)形成的时间段。第二结合剂可以与可检测的标记或信号产生分子或部分连接，从而允许检测由此形成的三级免疫复合物。此系统可以提供信号放大。
涉及检测如蛋白质或特定蛋白质的抗体等物质的免疫测定包含无标记测定、蛋白质分离方法(即，电泳)、固体载体捕获测定或体内检测。无标记测定通常是确定样品中存在或不存在特定蛋白质或特定蛋白质的抗体的诊断手段。蛋白质分离方法另外可用于评估蛋白质的物理性质，如大小或净电荷。捕获测定通常对定量评估样品中特定蛋白质或特定蛋白质的抗体的浓度更加有用。最后，体内检测可用于评估物质的空间表达模式，即，在受试者、组织或细胞中可以发现所述物质的情况下。
如果浓度足够，抗体-抗原相互作用产生的分子复合物([Ab–Ag]n)肉眼可见，但由于它们散射光束的能力，也还可以检测和测量更小的量。复合物的形成表明两种反应物均存在，并且在免疫沉淀测定中，恒定浓度的试剂抗体用于测量特定抗原([Ab–Ag]n)，并且试剂抗原用于检测特定抗体([Ab–Ag]n)。如果试剂物种事先被涂覆在细胞上(如在血凝测定中)或很小的颗粒(如在乳胶凝集测定中)，则涂覆的颗粒的“凝集”在低得多的浓度下可见。基于这些基本原理的各种测定是常用的，包含欧式免疫扩散测定(Ouchterlonyimmunodiffusion assay)、火箭免疫电泳和免疫比浊和浊度测定。与采用标记的测定相比，此类测定法的主要局限性是灵敏度受限(较低的检测限制)，并且在一些情况下，很高浓度的分析物实际上可以抑制复合物的形成，因此需要采取使所述程序更加复杂的保障措施。这些第1组测定中的一些测定追溯到抗体的发现并且它们中没有一个具有实际的“标记”(例如，Ag-enz)。无标记的其它种类的免疫测定依赖免疫传感器，并且可以直接检测抗体-抗原相互作用的各种仪器现在可商购获得。大多数依赖在具有固定化配体的传感器表面上产生消散波，这允许连续监控与配体的结合。免疫传感器允许轻松研究动力学相互作用，并且随着低成本专业仪器的出现，将来可能会在免疫分析中得到广泛应用。
免疫测定检测特定蛋白质的使用可能涉及通过电泳分离蛋白质。电泳是带电分子在溶液中响应电场的迁移。带电分子的迁移速率取决于所述领域的强度；分子的净电荷、大小和形状以及分子在其中移动的介质的离子强度、粘度和温度。作为分析工具，电泳简单、快速且灵敏度高。电泳被用于分析地研究单个带电物种的性质，并且用作分离技术。
通常，样品在支持基质如纸、醋酸纤维素、淀粉凝胶、琼脂糖或聚丙烯酰胺凝胶中运行。基质抑制了由加热引起的对流混合并且提供了电泳运行的记录：在运行结束时，可以对基质染色并且用于扫描、放射自显影或存储。另外，最常用的支持基质——琼脂糖和聚丙烯酰胺提供了按大小分离分子的方法，因为它们是多孔凝胶。多孔凝胶可以通过延迟或在一些情况下完全阻止大分子的移动，同时允许较小的分子自由迁移来充当筛子。由于稀释的琼脂糖凝胶通常比相同浓度的聚丙烯酰胺更坚硬且更易于处理，因此琼脂糖可用于分离较大的大分子，如核酸、大蛋白质和蛋白质复合物。易于处理并能以较高的浓度制备的聚丙烯酰胺可用于分离大多数蛋白质和小的寡核苷酸，所述寡核苷酸需要较小的凝胶孔径才能进行延迟。
蛋白质是两性化合物；因此，蛋白质的净电荷由介质(蛋白质悬浮在其中)的pH确定。在pH高于其等电点的溶液中，蛋白质具有净负电荷并且在电场中向阳极迁移。在其等电点以下，蛋白质带正电并且向阴极迁移。另外，蛋白质携带的净电荷与蛋白质的大小无关——即，分子的每单位质量(或长度、给定的蛋白质和核酸是线性大分子)携带的电荷因蛋白质而异。因此，在给定的pH下并且在非变性条件下，蛋白质的电泳分离由分子的大小和电荷确定。
十二烷基硫酸钠(SDS)是阴离子去污剂，其通过“缠绕”多肽主链使蛋白质变性——SDS以1.4:1的质量比相当特异性地与蛋白质结合。这样，SDS根据多肽的长度成比例地赋予多肽负电荷。此外，在它们采用按尺寸分离所需的随机线圈配置之前，通常需要减少蛋白质(变性)中的二硫键；这是通过2-巯基乙醇或二硫苏糖醇(DTT)完成的。因此，在变性SDS-PAGE分离中，迁移不是由多肽的固有电荷确定的，而是由分子量确定的。
分子量的确定是通过已知分子量的蛋白质与待表征的蛋白质的SDS-PAGE来完成的。SDS变性多肽或天然核酸的分子量的对数与其Rf之间存在线性关系。Rf计算为分子迁移的距离与标记染料前移的距离之比。通过电泳(Mr)确定相对分子量的简单方法是绘制已知样品的迁移距离与log10MW的标准曲线，并且在同一凝胶上测量迁移距离后读取样品的logMr。
在二维电泳中，首先基于一种物理性质对蛋白质进行分级分离，并且在第二步中基于另一种物理性质进行分级分离。例如，等电聚焦可以用于第一维，方便地在管凝胶中进行，并且平板凝胶中的SDS电泳可以用于第二维。程序的一个实例是奥法雷尔(O'Farrell)P.H.,“蛋白质的高分辨率二维电泳(High Resolution Two-dimensionalElectrophoresis of Proteins)”,《生物化学杂志(J.Biol.Chem.)》250:4007-4021(1975)，其通过引用整体并入本文用于关于二维电泳方法的教导。其它实例包含但不限于在以下中发现的那些：安德森(Anderson)L和安德森NG,“人血浆蛋白的高分辨率二维电泳(High resolution two-dimensional electrophoresis of human plasma proteins)”,《美国国家科学院院刊(Proc.Natl.Acad.Sci.)》74:5421-5425(1977)；奥恩斯坦(Ornstein)L.,“圆盘电泳(Disc electrophoresis)”,《纽约科学学术年报(L.Ann.N.Y.Acad.Sci.)》121:321349(1964)，这些文献中的每个通过引用整体并入本文用于关于电泳方法的教导。通过引用整体并入本文用于关于电泳方法的教导的勒姆利(Laemmli),英国,“噬菌体T4的头部的组装期间结构蛋白的切割(Cleavage of structuralproteins during the assembly of the head of bacteriophage T4)”,《自然(Nature)》227:680(1970)公开了不连续的系统，用于分离用SDS变性的蛋白质。勒姆利缓冲系统中的前导离子是氯离子，并且尾随离子是甘氨酸。因此，拆分凝胶和堆积凝胶由Tris-HCl缓冲液(具有不同的浓度和pH)组成，而箱缓冲液是Tris-甘氨酸。所有缓冲液含有0.1％SDS。
在当前方法中考虑的使用电泳的免疫测定的一个实例是蛋白质印迹分析。蛋白质印迹或免疫印迹允许确定蛋白质的分子量并且测量存在于不同样品中的蛋白质的相对量。检测方法包含化学发光和显色检测。蛋白质印迹分析的标准方法可以在以下中发现：例如，D.M.博拉格(Bollag)等人,《蛋白质方法(Protein Methods)》(第2版1996)和E.哈洛(Harlow)和D.莱恩(Lane),《抗体，实验室手册(Antibodies,a Laboratory Manual)》(1988)，美国专利第4,452,901号，这些文献中的每个通过引用整体并入本文用于关于蛋白质印迹方法的教导。通常，蛋白质通过凝胶电泳，通常是SDS-PAGE进行分离。尽管可以使用其它类型的纸或膜，但蛋白质会转移到一张特殊的吸墨纸，例如，硝酸纤维素。蛋白质保留了它们在凝胶上的相同的分离模式。将印迹与通用蛋白(如牛奶蛋白)一起温育，以与硝酸纤维素上任何剩余的粘性位置结合。然后将抗体添加到能够结合其特定蛋白质的溶液中。
通过间接酶免疫测定技术，通常使用显色底物(例如碱性磷酸酶或辣根过氧化物酶)或化学发光底物，可以很容易地可视化特异性抗体与特定固定抗原的连接。用于探测的其它可能性包含使用荧光或放射性同位素标记(例如，荧光素125I)。用于检测抗体结合的探针可以是缀合的抗免疫球蛋白、缀合的葡萄球菌蛋白A(结合IgG)或生物素化的第一抗体的探针(例如，缀合的抗生物素蛋白/链霉亲和素)。
所述技术的优势在于通过其抗原性和其分子量来同时检测特定蛋白质。首先在SDS-PAGE中按质量分离蛋白质，然后在免疫测定步骤中进行特异性检测。因此，可以同时运行蛋白标准品(梯)，以估算异质样品中感兴趣的蛋白质的分子量。
凝胶移位测定或电泳迁移率迁移测定(EMSA)可以用于以定性和定量方式检测DNA结合蛋白与其同源DNA识别序列之间的相互作用。示例性技术描述于以下：奥恩斯坦L.,“圆盘电泳——I：背景与理论(Disc electrophoresis-I:Background and theory)”,《纽约科学学术年报》121:321-349(1964)，以及Matsudiara,PT和伯吉斯博士(DR Burgess),“SDS微平板线性梯度聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS microslab linear gradient polyacrylamidegel electrophoresis)”,《分析生物化学(Anal.Biochem.)》87:386-396(1987)，这些文献中的每个通过引用整体并入本文用于关于凝胶移位测定的教导。
在一般的凝胶移位测定中，可以将纯化的蛋白质或粗制细胞提取物与标记的(例如，32P-放射性标记的)DNA或RNA探针一起温育，然后通过非变性聚丙烯酰胺凝胶将复合物与游离探针分离。与未结合的探针相比，复合物通过凝胶的迁移更缓慢。根据结合蛋白的活性，标记的探针可以是双链或单链的。为了检测DNA结合蛋白，如转录因子，可以使用纯化的或部分纯化的蛋白质或核细胞提取物。为了检测RNA结合蛋白，可以使用纯化或部分纯化的蛋白质或核或细胞质细胞提取物。DNA或RNA结合蛋白对推定的结合位点的特异性是通过竞争实验使用含有感兴趣的蛋白质或其它无关序列的结合位点的DNA或RNA片段或寡核苷酸建立的。在特定的和非特定的竞争者存在下形成的复合物的性质和强度的差异允许鉴定特定的相互作用。
凝胶移位方法可以包含使用例如，COOMASSIE(帝国化学工业有限公司(ImperialChemicals Industries,Ltd))蓝色染料的胶体形式来检测凝胶中的蛋白质，如聚丙烯酰胺电泳凝胶。此类方法描述于例如，诺伊霍夫(Neuhoff)等人,《电泳(Electrophoresis)》6:427-448(1985)，和诺伊霍夫等人,电泳》9:255-262(1988)，这些文献中的每个通过引用整体并入本文用于关于凝胶移位方法的教导。除了上文参考的常规蛋白质测定方法外，在美国专利第5,424,000号中还描述了组合清洁和蛋白质染色组合物，所述专利通过引用整体并入本文用于其关于凝胶移位方法的教导。所述溶液可以包含磷酸、硫酸和硝酸以及酸性紫色染料。
放射免疫沉淀测定(RIPA)是使用放射性标记的抗原的敏感的测定以检测血清中的特异性抗体。使抗原与血清反应，并且然后使用特殊试剂如蛋白A琼脂糖珠沉淀。然后通常通过凝胶电泳分析结合的放射性标记的免疫沉淀物。放射免疫沉淀测定(RIPA)通常被用作诊断测试，以诊断HIV抗体的存在。RIPA在本领域中还被称为法尔测定(Farr Assay)、沉淀素测定、放射免疫沉淀素测定；放射免疫沉淀分析；放射免疫沉淀分析；和放射免疫沉淀分析。
尽管利用电泳分离和检测特定感兴趣的蛋白质的上述免疫测定允许评估蛋白质大小，但它们对评估蛋白质浓度不是很敏感。然而，还考虑了免疫测定，其中将对蛋白质具有特异性的蛋白质或抗体与固体载体(例如，管、孔、珠或细胞)结合，以分别从样品中捕获感兴趣的抗体或蛋白质，与检测对载体上的蛋白质具有特异性的蛋白质或抗体的方法结合。此类免疫测定的实例包含放射免疫测定(RIA)、酶联免疫吸附测定(ELISA)、流式细胞术、蛋白质阵列、多重珠测定和磁捕获。
放射免疫测定(RIA)是经典的定量测定，用于直接或间接使用放射性标记的物质(放射性配体)来检测抗原-抗体反应，以测量未标记的物质与特定抗体或其它受体系统的结合。放射免疫测定用于例如检测血液中的激素水平，而无需使用生物测定。如果与能够诱导抗体形成的较大的载剂蛋白(例如，牛γ-球蛋白或人血清白蛋白)偶联，还可以测量非免疫原性物质(例如，半抗原)。RIA涉及将放射性抗原(由于碘原子可以很容易地引入蛋白质的酪氨酸残基中，因此通常使用放射性同位素125I或131I)与所述抗原的抗体混合。抗体通常与固体载体连接，如管或珠。然后以已知量添加未标记或“冷”抗原并且测量置换的标记抗原的量。最初，放射性抗原与抗体结合。当添加冷抗原时，两者竞争抗体结合位点并且在冷抗原的较高浓度下，更多地与抗体结合，从而置换了放射性变体。结合的抗原与未结合的抗原在溶液中分离并且每种抗原的放射性用于绘制结合曲线。所述技术非常敏感并且特定。
酶联免疫吸附测定(ELISA)，或更笼统地被称为EIA(酶免疫测定)是可以检测对蛋白质具有特异性的抗体的免疫测定。在此测定中，与抗体结合剂或抗原结合剂结合的可检测标记是酶。当暴露于其底物时，这种酶以此方式反应以产生可以通过例如分光光度法、荧光法或目测方法检测的化学部分。可以用于可检测地标记可用于检测的试剂的酶包含但不限于辣根过氧化物酶、碱性磷酸酶、葡糖氧化酶、β-半乳糖苷酶、核糖核酸酶、脲酶、过氧化氢酶、苹果酸酶、金葡菌核酸酶、天冬酰胺酶、酵母乙醇脱氢酶、α-磷酸甘油脱氢酶、磷酸丙糖异构酶、葡萄糖-6-磷酸脱氢酶、葡糖淀粉酶和乙酰胆碱酯酶。
ELISA技术的变型是本领域技术人员已知的。在一种变型中，可以与蛋白质结合的抗体可以固定在展现出蛋白质亲和力的所选表面上，如聚苯乙烯微量滴定板中的孔中。然后，可以将怀疑含有标志物抗原的测试组合物添加到孔中。结合并洗涤以除去非特异性结合的免疫复合物后，可以检测结合的抗原。可以通过添加对靶蛋白具有特异性的第二抗体来实现检测，其与可检测的标记连接。此类ELISA是简单的“夹心ELISA”。还可以通过添加第二抗体，然后添加对第二抗体具有结合亲和力的第三抗体来实现检测，其中第三抗体与可检测的标记连接。
另一种变型是竞争ELISA。在竞争ELISA中，测试样品与已知数量的标记抗原或抗体竞争结合。样品中反应性物种的量可以通过在与涂覆的孔温育之前或期间将样品与已知的标记物种混合来确定。样品中反应性物种的存在会减少可用于与孔结合的标记物种的数量，从而减少最终信号。
不管采用哪种格式，ELISA具有某些共同的特征，如涂覆、温育或结合、洗涤以去除非特异性结合的物种并且检测结合的免疫复合物。抗原或抗体可以与固体载体连接，如以板、珠、试纸、膜或柱基质的形式，并且将待分析的样品应用于固定的抗原或抗体。在用抗原或抗体涂覆板时，通常将用抗原或抗体的溶液温育板的孔过夜或指定的小时时段。然后可以洗涤所述板的孔以去除不完全吸附的材料。然后，可以用非特异性蛋白质“涂覆”孔的所有剩余可用表面，所述非特异性蛋白质对测试抗血清具有抗原中性。这些包含牛血清白蛋白(BSA)、酪蛋白和奶粉溶液。所述涂覆允许阻断固定表面上的非特异性吸附位点并且因此减少了由抗血清的非特异性结合到表面上引起的背景。
在ELISA中，还可以使用二级或三级检测手段，而不是直接程序。因此，在蛋白质或抗体与孔结合后，用非反应性材料涂覆以减少背景，并且洗涤以除去未结合的材料，使固定表面在有效允许免疫复合物(抗原/抗体)形成的条件下与待测试的对照临床或生物学样品接触。然后，检测免疫复合物需要标记的第二结合剂或与标记的第三结合剂结合的第二结合剂。
酶联免疫斑点测定(ELISpot)可以检测对蛋白质或抗原具有特异性的抗体的免疫测定法。在此测定中，与抗体结合剂或抗原结合剂结合的可检测标记是酶。当暴露于其底物时，这种酶以此方式反应以产生可以通过例如分光光度法、荧光法或目测方法检测的化学部分。可以用于可检测地标记可用于检测的试剂的酶包含但不限于辣根过氧化物酶、碱性磷酸酶、葡糖氧化酶、β-半乳糖苷酶、核糖核酸酶、脲酶、过氧化氢酶、苹果酸酶、金葡菌核酸酶、天冬酰胺酶、酵母乙醇脱氢酶、α-磷酸甘油脱氢酶、磷酸丙糖异构酶、葡萄糖-6-磷酸脱氢酶、葡糖淀粉酶和乙酰胆碱酯酶。在此测定中，用抗原涂覆硝酸纤维素微量滴定板。将测试样品暴露于抗原，并且然后与ELISA测定类似地反应。检测与传统ELISA的不同之处在于检测是通过硝酸纤维素板上斑点的计数来确定的。斑点的存在表明样品与抗原反应。可以对斑点进行计数并且确定样品中对抗原具有特异性的细胞数量。
“在有效允许免疫复合物(抗原/抗体)形成的条件下”意指所述条件包含用溶液如BSA、牛丙种球蛋白(BGG)和磷酸盐缓冲液(PBS)/Tween稀释抗原和抗体，以减少非特异性结合并且提高合理的信噪比。
合适的条件还意指温育处于足以允许有效结合的温度和时间段。温育步骤通常可以在约20°到30℃的温度下进行约1分钟到12小时，或者可以在约0℃到约10℃下温育过夜。
在ELISA中的所有温育步骤之后，可以洗涤接触的表面以去除非络合的材料。洗涤程序可以包含用如PBS/Tween或硼酸盐缓冲液等溶液洗涤。在测试样品与最初结合的材料之间形成特异性免疫复合物和随后洗涤后，可以确定甚至微量免疫复合物的出现。
为了提供检测手段，如上文所描述的，第二或第三抗体可以具有相关的标记以允许检测。这可以是酶，所述酶在与适当的显色底物温育时可以产生显色。因此，例如，可以将第一或第二免疫复合物与标记的抗体接触并温育一段时间，并且在有利于进一步的免疫复合物形成的发展的条件(例如，在含有PBS的溶液如PBS-Tween中在室温下温育2小时)下。
与标记的抗体温育，然后洗涤以去除未结合的材料后，在过氧化物酶作为酶标记的情况下，例如，可以通过与显色底物如尿素和溴甲酚紫或2,2'叠氮基-二-(3-乙基-苯并噻唑啉-6-磺酸[ABTS]和H2O2一起温育来定量标记的量。然后可以通过例如使用可见光谱分光光度计测量颜色产生的程度来实现定量。
蛋白质阵列是固相配体结合测定系统，其在包含玻璃、膜、微量滴定孔、质谱仪板和珠或其它颗粒的表面上使用固定化的蛋白质。测定是高度平行的(多重的)并且通常是小型化的(微阵列，蛋白质芯片)。它们的优势包含快速、可自动化、灵敏度高、试剂经济以及单个实验提供大量数据。生物信息学支持很重要；数据处理需要复杂的软件和数据比较分析。然而，所述软件可以改编自用于DNA阵列的软件，许多硬件和检测系统也可以。
主要形式之一是捕获阵列，其中配体结合试剂(其通常是抗体，但也可以是替代蛋白质支架、肽或核酸适体)用于检测混合物如血浆或组织提取物中的靶分子。在诊断中，捕获阵列可以用于并行执行多个免疫测定，例如测试单个血清中的若干种分析物并且同时测试许多血清样品。在蛋白质组学中，捕获阵列用于定量和比较健康和患病的不同样品中蛋白质的水平，即蛋白质表达谱。除特定配体结合剂外的蛋白质以阵列形式用于体外功能相互作用筛选，如蛋白质-蛋白质、蛋白质-DNA、蛋白质-药物、受体-配体、酶-底物等。选择捕获试剂本身并且针对许多蛋白质进行筛选，这也可以以针对多种蛋白质靶标的多重阵列形式进行。
对于阵列的构建，蛋白质来源包含重组蛋白质的基于细胞的表达系统，来自天然来源的纯化、通过无细胞翻译系统的体外产生以及肽的合成方法。这些方法中的许多方法都可以自动化进行高通量产生。对于捕获阵列和蛋白质功能分析，重要的是蛋白质应正确折叠并且起作用；这并非总是如此，例如在变性条件下从细菌中提取重组蛋白的情况。然而，变性蛋白质的阵列可用于筛选抗体的交叉反应性，鉴定自身抗体和选择配体结合蛋白。
蛋白质阵列已被设计为熟悉的免疫测定方法(如ELISA和斑点印迹)的小型化，通常利用荧光读数，并且通过机器人技术和高通量检测系统促进，以能够并行进行多种测定。常用的物理载体包含载玻片、硅、微孔、硝酸纤维素或PVDF膜以及磁性和其它微珠。虽然递送到平面表面上的蛋白质的微滴是最熟悉的形式，替代架构包含基于微流体(陀螺仪，新泽西州蒙默思章克申市(Monmouth Junction,NJ))的发展和专门芯片设计的CD离心装置，如板(例如，活芯片TM，Biotrove公司，马萨诸塞州沃本(Woburn,MA))中的经过工程化的微通道和硅表面(加利福尼亚州海沃德市的吉欧米克斯公司(Zyomyx,Hayward CA))上的微小3D柱。悬浮液中的颗粒还可以用作阵列的基础，只要对它们进行编码以进行识别；系统包含微珠(德克萨斯州奥斯汀的路明克斯公司(Luminex,Austin,TX)；伯乐实验室(Bio-RadLaboratories))和半导体纳米晶体(例如，QDotsTM，加利福尼亚州海沃德市的量子点公司(Quantum Dot))的颜色编码，以及微珠(UltraPlexTM，英国剑桥巴布拉汉的智能珠技术公司(SmartBead Technologies Ltd,Babraham,Cambridge,UK))和多金属微棒(例如，纳米条码TM颗粒，加利福尼亚州山景城的纳米复合物公司(Nanoplex Technologies,MountainView,CA))的条形码。珠还可以组装成半导体芯片上的平面阵列(LEAPS技术，新泽西州沃伦生物阵列溶液公司(BioArray Solutions,Warren,NJ))。
蛋白质的固定化涉及偶联剂和被偶联表面的性质。良好的蛋白质阵列载体表面在偶联程序之前和之后化学稳定，允许良好的斑点形态，显示出最小的非特异性结合，在检测系统中不提供背景，并且与不同的检测系统兼容。所使用的固定化方法具有可再现性，适用于不同性质(大小、亲水性、疏水性)的蛋白质，适合高通量和自动化，并且与全功能蛋白质活性的保留兼容。表面结合蛋白的朝向被认为是将其呈活性状态呈递给配体或底物的重要因素；对于捕获阵列，通过定向捕获试剂获得最有效的结合结果，着通常需要对蛋白质进行位点特异性标记。
使用蛋白质固定化的共价和非共价方法两者，并且具有各种利弊。被动吸附到表面在方法上是简单的，但允许很少的定量或朝向控制；它可能会或可能不会改变蛋白质的功能特性，并且可再现性和效率是可变的。共价偶联方法提供稳定的连接，可以应用于多种蛋白质并且具有良好的可再现性；然而，朝向可能是可变的，化学衍生化可能会改变蛋白质的功能并且需要稳定的相互作用表面。利用蛋白质上标签的生物捕获方法提供稳定的连接并且以可再现的朝向与蛋白质特异性结合，但必须首先将生物试剂充分固定并且阵列可能需要特殊处理并具有可变的稳定性。
已经描述了若干种固定化化学和标签用于蛋白质阵列的制造。用于共价连接的底物包含涂覆有含氨基或醛的硅烷试剂的载玻片。在VersalinxTM系统(华盛顿州博塞尔的普罗林克斯(Prolinx,Bothell,WA))中，可逆的共价偶联是通过苯基二硼酸衍生的蛋白质与固定在载体表面的水杨基异羟肟酸之间的相互作用实现的。这还具有低背景结合和低固有荧光并且使固定的蛋白质保留功能。基于3维聚丙烯酰胺凝胶，未修饰蛋白质的非共价结合发生在多孔结构如HydroGelTM(马塞诸塞州韦尔斯利的珀金埃尔默公司(PerkinElmer,Wellesley,MA))中；据报告，这种底物在玻璃微阵列上给出特别低的背景，具有高容量和蛋白质功能的保留。广泛使用的生物偶联方法是通过生物素/链霉亲和素或六组氨酸/Ni相互作用，适当地修饰蛋白质。生物素可以与固定在表面上的聚赖氨酸主链结合，如二氧化钛(吉欧米克斯公司)或五氧化二钽(Zeptosens，瑞士维特斯维尔的(Witterswil,Switzerland))。
阵列制造方法包含机器人接触印刷、喷墨、压电点样和光刻。可以获得许多商用点样仪[例如帕卡德生物科技(Packard Biosciences)]以及手动设备[V&P科技公司]。细菌菌落可以被自动网格化到PVDF膜上用于原位诱导蛋白质表达。
在斑点大小和密度的极限下是纳米阵列，其中斑点在纳米空间尺度上，使得在小于1平方毫米的单个芯片上可以进行数千个反应。在用于光学检测的极限下，生物力实验室(BioForce Laboratories)开发了纳米阵列，其具有85平方微米的1521个蛋白质斑点，相当于每平方厘米2500万个斑点；它们的读数方法是荧光和原子力显微镜(AFM)。
荧光标记和检测方法被广泛使用。与用于读取DNA微阵列的仪器相同的仪器适用于蛋白质阵列。对于差异显示，可以用来自两个不同细胞状态的荧光标记的蛋白质探测捕获(例如，抗体)阵列，其中细胞裂解物直接与不同的荧光团(例如Cy-3、Cy-5)缀合并混合，使得颜色充当靶标丰度变化的读数。通过酪酰胺信号放大(TSA)(珀金埃尔默生命科技公司(PerkinElmer Lifesciences))可以将荧光读数灵敏度放大10-100倍。平面波导技术(Zeptosens)能够进行超灵敏的荧光检测，具有无需干预清洗程序的另外的优势。使用藻红蛋白作为标记(路明克斯公司)或半导体纳米晶体的性质(量子点公司)，悬浮珠和颗粒也可以实现高灵敏度。已经开发出许多新型的替代读数，特别是在商业生物技术领域。这些包含表面等离子体共振(HTS生物系统，亚利桑那州坦佩的固有生物探针公司(IntrinsicBioprobes,Tempe,AZ))、滚环DNA放大(康涅狄格州纽黑文的分子分期公司(MolecularStaging,New Haven CT))、质谱(固有生物探针公司；加利福尼亚州弗里蒙特的赛弗吉公司(Ciphergen,Fremont,CA))、共振光散射(Genicon科学公司，加利福尼亚州圣地亚哥(SanDiego,CA))和原子力显微镜[生物力实验室]的改编。
捕获阵列形成了用于表达谱的诊断芯片和阵列的基础。他们采用高亲和力捕获试剂，如常规抗体、单结构域、经过工程化的支架、肽或核酸适体，以高通量方式结合和检测特定的靶配体。
抗体阵列具有所需的特异性和可接受的背景的特性，并且一些是可商购获得的(加利福尼亚州圣何塞的BD生物科学公司(BD Biosciences,San Jose,CA)；加利福尼亚州山景城的克罗泰克公司(Clontech,Mountain View,CA)；伯乐公司；西格玛，密苏里州圣路易斯)。从噬菌体或核糖体展示文库(英国剑桥的剑桥抗体技术公司(Cambridge AntibodyTechnology,Cambridge,UK)；BioInvent公司，瑞典隆德(Lund,Sweden)；Affitech公司，加利福尼亚州核桃溪市(Walnut Creek,CA)；加利福尼亚州圣地亚哥的博适公司(Biosite))中选择后，用于捕获阵列的抗体通过常规免疫(多克隆血清和杂交瘤)或重组片段制成，通常在大肠杆菌中表达。除了常规抗体、Fab和scFv片段之外，骆驼科或经过工程化的人类等效物(马萨诸塞州沃尔瑟姆的多曼蒂斯公司(Domantis,Waltham,MA))的单个V结构域在阵列中也可能有用。
术语“支架”是指蛋白质的配体结合结构域，其被工程化为能够结合具有特异性和亲和力的抗体样特性的多种靶分子的多个变体。可以以遗传文库形式产生变体并且通过噬菌体、细菌或核糖体展示针对单个靶标进行选择。此类配体结合的支架或框架包含基于金黄色葡萄球菌蛋白质A(亲合体，瑞典布罗马(Bromma,Sweden))的‘亲合体’、基于纤连蛋白(马萨诸塞州列克星敦市的费罗斯公司(Phylos,Lexington,MA))的‘Trinectin’和基于脂质运载蛋白结构(德国弗赖辛-魏恩施蒂芬的皮里斯蛋白实验公司(Pieris Proteolab,Freising-Weihenstephan,Germany))的‘抗体模拟物(Anticalin)’。这些可以以类似于抗体的方式用于捕获阵列并且可能具有稳健性和易于生产的优点。
非蛋白质捕获分子，尤其是结合具有高特异性和亲和力的蛋白质配体的单链核酸适体，也用于阵列(SomaLogic公司，科罗拉多州博尔德(Boulder,CO))中。通过SelexTM程序从寡核苷酸文库中选择适体并且可以通过并入溴化脱氧尿苷和UV活化的交联剂(光适体)，通过共价连接来增强它们与蛋白质的相互作用。由于特定的空间要求，与配体的光交联降低了适体的交叉反应性。适体具有通过自动寡核苷酸合成易于产生以及DNA的稳定性和稳健性的优点；在光适体阵列上，通用荧光蛋白染色剂可用于检测结合。
与抗体阵列结合的蛋白质分析物可以直接检测或通过夹心测定中的第二抗体。直接标记用于比较具有不同颜色的不同样品。在可获得针对同一蛋白质配体的成对抗体的情况下，夹心免疫测定提供高特异性和灵敏度并且因此是低丰度蛋白质(如细胞因子)的首选方法；它们还提供了检测蛋白质修饰的可能性。无标记的检测方法，包含质谱、表面等离振子共振和原子力显微镜检查，避免了配体的改变。任何一种方法需要的是最佳的灵敏度和特异性，具有低背景以产生高信噪比。由于分析物浓度的范围广泛，因此必须适当地调整灵敏度；样品的连续稀释或使用不同亲和力的抗体会解决这个问题。感兴趣的蛋白质通常是在体液和提取物中浓度低的蛋白质，需要检测在pg或更低的范围内，如细胞因子或细胞中的低表达产物。
捕获分子阵列的替代方案是通过‘分子印迹’技术制备的，其中将(例如，来自蛋白质的C端区)肽用作模板，以在可聚合基质中产生结构上互补的序列特异性的腔体；然后，腔体可以特异性捕获(变性的)具有适当初级氨基酸序列的蛋白质(ProteinPrintTM，加利福尼亚州伯林盖姆的阿斯皮拉生物系统公司(Aspira Biosystems,Burlingame,CA))。
可以用于诊断和表达谱的另一种方法是
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阵列(加利福尼亚州弗里蒙特的赛弗吉公司)，其中固相色谱表面结合具有混合物(如血浆或肿瘤提取物)的类似电荷或疏水性的特征的蛋白质，并且SELDI-TOF质谱用于检测保留的蛋白质。
通过固定大量纯化的蛋白质构建了大规模功能芯片并切将其用于测定多种生化功能，如与其它蛋白质的蛋白质相互作用、药物-靶标相互作用、酶-底物等。通常，它们需要表达文库，其克隆到大肠杆菌、酵母或类似物(表达的蛋白质然后在其中纯化)中的，例如，通过His标签，并且固定。无细胞蛋白质转录/翻译是可行替代方案，用于合成在细菌或其它体内系统中表达不好的蛋白质。
为了检测蛋白质-蛋白质相互作用，蛋白质阵列可以作为基于细胞的酵母双杂交系统的体外替代方案并且在后者不足的情况下有用，如涉及分泌的蛋白质或具有二硫键的蛋白质的相互作用。已针对酵母蛋白激酶和酵母蛋白质组的各种功能(蛋白质-蛋白质和蛋白质-脂质相互作用)描述了阵列上生化活性的高通量分析，其中所有酵母开放阅读框的大部分被表达并固定在微阵列上。大规模的‘蛋白质组芯片’有望在鉴定功能相互作用、药物筛选等中非常有用(康涅狄格州布兰福德的Proteometrix(Proteometrix,Branford,CT))。
作为个别元件的二维展示，蛋白质阵列可以用于筛选噬菌体或核糖体展示文库，以便选择特异性结合配偶体，包含抗体、合成支架、肽和适体。这样，可以进行‘文库对文库’筛选。针对从基因组计划中鉴定出的蛋白质靶标阵列，在组合化学文库中筛选候选药物是所述方法的另一个应用。
多重珠测定(如例如，BDTM的流式珠阵列)是一系列光谱离散的颗粒，其可以用于捕获和定量可溶性分析物。然后通过检测基于荧光的发射和流式细胞术分析来测量分析物。多重珠测定产生与基于ELISA的测定可比的数据，但是是以“多重”或同时方式进行。与任何夹心形式测定一样，针对流式珠阵列计算未知物的浓度，即通过使用已知的标准物并且针对标准曲线对未知物作图。进一步的，多重珠测定允许定量由于样品体积限制而先前从未考虑过的样品中的可溶性分析物。除了定量数据之外，还可以生成强大的可视图像，显示为用户提供一目了然的另外的信息的独特的配置文件或特征。
因此，在一方面，本文公开了鉴定本文所公开的任何新抗原的方法，其中所述T细胞活性(如例如，包含但不限于IFN-γ、TGF-β、淋巴毒素-α、IL-2、IL-4、IL-10、IL-17或IL-25的细胞因子的释放)是通过ELISA、ELISpot、细胞内细胞因子染色或铬释放测量的。
应当理解并且在本文中考虑，所公开的鉴定新抗原的方法可以用于鉴定任何癌症中的新抗原，包含但不限于：B细胞淋巴瘤、T细胞淋巴瘤、蕈样真菌病、霍奇金氏病、髓细胞性白血病、膀胱癌、脑癌、神经系统癌症、头颈癌(head and neck cancer)、头颈部鳞状细胞癌、肺癌(lung cancer)、小细胞肺癌、非小细胞肺癌、神经母细胞瘤、胶质母细胞瘤、卵巢癌、胰腺癌、前列腺癌(prostate cancer)、皮肤癌、黑色素瘤、基底细胞癌、鳞状细胞癌、肝癌、口腔、咽喉、喉部和肺的鳞状细胞癌、宫颈癌(cervical cancer/cervical carcinoma)、乳腺癌、肾癌、泌尿生殖系统癌症、肺癌(pulmonary cancer)、食管癌、头颈癌(head andneck carcinoma)、大肠癌、造血系统癌症；睾丸癌；结直肠癌、前列腺癌(prostaticcancer)、AIDS相关的淋巴瘤或AIDS相关的肉瘤。因此，在一方面，本文还公开了鉴定本文所公开的任何新抗原的方法，其中所述癌症选自由以下组成的组：B细胞淋巴瘤、T细胞淋巴瘤、蕈样真菌病、霍奇金氏病、髓细胞性白血病、膀胱癌、脑癌、神经系统癌症、头颈癌(headand neck cancer)、头颈部鳞状细胞癌、肺癌(lung cancer)、小细胞肺癌、非小细胞肺癌、神经母细胞瘤、胶质母细胞瘤、卵巢癌、胰腺癌、前列腺癌(prostate cancer)、皮肤癌、黑色素瘤、基底细胞癌、鳞状细胞癌、肝癌、口腔、咽喉、喉部和肺的鳞状细胞癌、宫颈癌(cervical cancer/cervical carcinoma)、乳腺癌、肾癌、泌尿生殖系统癌症、肺癌(pulmonary cancer)、食管癌、头颈癌(head and neck carcinoma)、大肠癌、造血系统癌症；睾丸癌；结直肠癌、前列腺癌(prostatic cancer)、AIDS相关的淋巴瘤或AIDS相关的肉瘤。
C.组合物
公开了用于制备所公开的组合物的组分以及在本文所公开的方法中使用的组合物本身。本文公开了这些和其它材料，并且应该理解，当公开了这些材料的组合、子集、相互作用、基团等时，虽然可能没有明确公开这些化合物的单独的和集体的组合和排列每个的具体参考，本文具体考虑和描述了每个。例如，如果公开并讨论了特定的新抗原并且讨论了可以对包含新抗原的许多分子进行的许多修饰，除非特别指出相反的情况，否则具体考虑的是新抗原的每一种组合和排列和可能的修饰。因此，如果公开了一类分子A、B和C以及一类分子D、E和F，以及组合分子的实例，则公开了A-D，因此，即使没有单独叙述每个，也单独和集体考虑了每个的含义组合，认为A-E、A-F、B-D、B-E、B-F、C-D、C-E以及C-F是公开的。同样，还公开了这些的任何子集或组合。因此，例如，将认为A-E、B-F和C-E的子组是公开的。此概念适用于本申请的所有方面，包含但不限于制备和使用所公开的组合物的方法中的步骤。因此，如果有可以执行多种另外的步骤，则应当理解，可以利用所公开方法的任何特定实施例或实施例的组合来执行这些另外的步骤中的每个。
本文所公开的方法鉴定了可以用于治疗癌症(作为治疗性治疗或预防性治疗)以及产生可以用于治疗癌症的CAR T细胞、TCR T细胞和/或TIL的组合物中的新抗原。因此，在一方面，本文还公开了通过鉴定本文所公开的任何新抗原的方法鉴定的新抗原。例如，本文还公开了包括氨基酸序列AEPKRKSSLFWHAFNRLTPFRK(SEQ ID NO:2)的多肽或其包括至少9个氨基酸的片段，其中所述序列的任何片段至少包括LFWHAFNRL(SEQ ID NO:7)，例如，SSLFWHAFNRLTP(SEQ ID NO:4)、RKSSLFWHAFNRL(SEQ ID NO:3)、RKSSLFWHAFNRLTPFR(SEQID NO:6)、LFWHAFNRLTPFR(SEQ ID NO:5)、SLFWHAFNRL(SEQ ID NO:88)、SSLFWHAFNRL(SEQID NO:89)、SSLFWHAFNRLT(SEQ ID NO:90)、LFWHAFNRLT(SEQ ID NO:91)、LFWHAFNRLTP(SEQID NO:92)、SLFWHAFNRLT(SEQ ID NO:93)、LFWHAFNRLTPF(SEQ ID NO:94)；一种包括氨基酸序列FQLLLEKPFQIFCAELWVRDINDHA(SEQ ID NO:9)的多肽或其包括至少13个氨基酸的片段，其中所述序列的任何片段至少包括LEKPFQIFCAELW(SEQ ID NO:12)，例如，LEKPFQIFCAELWV(SEQ ID NO:95)和LEKPFQIFCAELWVR(SEQ ID NO:96)；一种包括氨基酸序列ENSPLGTEFPLNYALDLDVGSNNVQ(SEQ ID NO:14)的多肽或其包括至少13个氨基酸的片段，其中所述序列的任何片段至少包括LGTEFPLNYALDL(SEQ ID NO:17)，例如，LGTEFPLNYALDLD(SEQ ID NO:97)、LGTEFPLNYALDLDV(SEQ ID NO:98)、LGTEFPLNYALDLDVG(SEQ ID NO:99)、LGTEFPLNYALDLDVGS(SEQ ID NO:100)、LGTEFPLNYALDLDVGSN(SEQ ID NO:101)、LGTEFPLNYALDLDVGSNN(SEQ ID NO:102)、LGTEFPLNYALDLDVGSNNV(SEQ ID NO:103)、LGTEFPLNYALDLDVGSNNVQ(SEQ ID NO:104)、ENSPLGTEFPLNYALDL(SEQ ID NO:105)、NSPLGTEFPLNYALDL(SEQ ID NO:106)、SPLGTEFPLNYALDL(SEQ ID NO:107)、PLGTEFPLNYALDL(SEQ ID NO:108)、PLGTEFPLNYALDLD(SEQ ID NO:109)、PLGTEFPLNYALDLDV(SEQ ID NO:110)、SPLGTEFPLNYALDLD(SEQ ID NO:111)、SPLGTEFPLNYALDLDV(SEQ ID NO:112)、NSPLGTEFPLNYALDLDV(SEQ ID NO:113)和ENSPLGTEFPLNYALDLDV(SEQ ID NO:114)；一种包括氨基酸序列MTDDKDVLRNVWFGRIPTCFT(SEQ ID NO:19)的多肽或其包括至少11个氨基酸的片段，其中所述序列的任何片段至少包括KDVLRNVWFGR(SEQ ID NO:23)，例如，DDKDVLRNVWFGR(SEQ ID NO:22)、KDVLRNVWFGRIP(SEQ ID NO:21)、DDKDVLRNVWFGRIP(SEQID NO:24)、DKDVLRNVWFGR(SEQ ID NO:115)、KDVLRNVWFGRI(SEQ ID NO:116)、DKDVLRNVWFGRI(SEQ ID NO:117)、DKDVLRNVWFGRIP(SEQ ID NO:118)、DDKDVLRNVWFGRI(SEQID NO:119)、DDKDVLRNVWFGRIPT(SEQ ID NO:120)、DDKDVLRNVWFGRIPTC(SEQ ID NO:121)和TDDKDVLRNVWFGRIPT(SEQ ID NO:122)；一种包括氨基酸序列RLKASLDRPFTNSESAFYSIVGLSS(SEQ ID NO:26)的多肽或其包括至少10个氨基酸的片段，其中所述序列的任何片段至少包括PFTNSESAFY(SEQ ID NO:30)，例如，DRPFTNSESAFYS(SEQ ID NO:28)、PFTNSESAFYS(SEQID NO:123)、PFTNSESAFYSI(SEQ ID NO:124)、PFTNSESAFYSIV(SEQ ID NO:29)、RPFTNSESAFY(SEQ ID NO:125)、RPFTNSESAFYS(SEQ ID NO:126)、RPFTNSESAFYSI(SEQ IDNO:127)、RPFTNSESAFYSIV(SEQ ID NO:128)、DRPFTNSESAFY(SEQ ID NO:129)、DRPFTNSESAFYSI(SEQ ID NO:130)和DRPFTNSESAFYSIV(SEQ ID NO:131)；一种包括氨基酸序列GSGEKVAGRVIVKVCEVTRVKAVRI(SEQ ID NO:32)的多肽或其包括至少9个氨基酸的片段，其中所述序列的任何片段至少包括RVIVKVCEV(SEQ ID NO:36)，例如，KVAGRVIVKVCEV(SEQID NO:33)、AGRVIVKVCEVTR(SEQ ID NO:34)、KVAGRVIVKVCEVTRVK(SEQ ID NO:32)、RVIVKVCEVTRVK(SEQ ID NO:35)和KVAGRVIVKVCEVTRVK(SEQ ID NO:37)；一种包括氨基酸序列YGMYFCMNISSQEDGACVLLRALEP(SEQ ID NO:39)的多肽或其包括至少10个氨基酸的片段，其中所述序列的任何片段至少包括ISSQEDGACV(SEQ ID NO:43)，例如，MNISSQEDGACVL(SEQID NO:41)、ISSQEDGACVLLR(SEQ ID NO:42)、MNISSQEDGACVLLR(SEQ ID NO:44)、ISSQEDGACVL(SEQ ID NO:132)、ISSQEDGACVLL(SEQ ID NO:133)、NISSQEDGACV(SEQ ID NO:134)、NISSQEDGACVL(SEQ ID NO:135)、NISSQEDGACVLL(SEQ ID NO:136)、NISSQEDGACVLLR(SEQ ID NO:137)和MNISSQEDGACVLL(SEQ ID NO:138)；一种包括氨基酸序列MKLTSLMCNPVKSPFFGCVCGHVPISMCVSTCSSLPTASCALDLTVLAENSHQVGA(SEQ ID NO:46)的多肽或其包括至少26个氨基酸的片段，其中所述序列的任何片段至少包括VSTCSSLPTASCALDLTVLAENSHQV(SEQID NO:60)例如，MCNPVKSPFFGCVCGHVPISMCVSTCSSLPTASCALDLTVLAENSHQVGA(SEQ ID NO:49)、KSPFFGCVCGHVPISMCVSTCSSLPTASCALDLTVLAENSHQVGA(SEQ ID NO:50)、GCVCGHVPISMCVSTCSSLPTASCALDLTVLAENSHQVGA(SEQ ID NO:51)、GHVPISMCVSTCSSLPTASCALDLTVLAENSHQVGA(SEQ ID NO:52)、SMCVSTCSSLPTASCALDLTVLAENSHQVGA(SEQ ID NO:53)、VSTCSSLPTASCALDLTVLAENSHQVGA(SEQ ID NO:54)、MCNPVKSPFFGCVCGHVPISMCVSTCSSLPTASCALDLTVLAENSHQV(SEQ ID NO:57)、VSTCSSLPTASCALDLTVLAENSHQVG(SEQ ID NO:139)、CVSTCSSLPTASCALDLTVLAENSHQV(SEQ ID NO:140)、MCVSTCSSLPTASCALDLTVLAENSHQV(SEQID NO:141)、MCVSTCSSLPTASCALDLTVLAENSHQVG(SEQ ID NO:142)、SMCVSTCSSLPTASCALDLTVLAENSHQV(SEQ ID NO:143)、SMCVSTCSSLPTASCALDLTVLAENSHQVG(SEQ ID NO:144)；一种包括氨基酸序列MLMAQEALAFLMAQGAMLAAQERRVPRAAEVPGAQGQQGPRGREEAPRGVRMAVPLLRRMEGAPAGPGGRTAACLSCTSRCLSRRPWKRSWSAGSCPGMPHRSPDQGRF(SEQ IDNO:67)的多肽或其包括至少61个氨基酸的片段，其中所述序列的任何片段至少包括VPRAAEVPGAQGQQGPRGREEAPRGVRMAVPLLRRMEGAPAGPGGRTAACLSCTSRCLSRR(SEQ ID NO:73)，例如，QERRVPRAAEVPGAQGQQGPRGREEAPRGVRMAVPLLRRMEGAPAGPGGRTAACLSCTSRCLSRRPWKR(SEQ IDNO:74)、RVPRAAEVPGAQGQQGPRGREEAPRGVRMAVPLLRRMEGAPAGPGGRTAACLSCTSRCLSRR(SEQ IDNO:145)、RRVPRAAEVPGAQGQQGPRGREEAPRGVRMAVPLLRRMEGAPAGPGGRTAACLSCTSRCLSRR(SEQID NO:146)、ERRVPRAAEVPGAQGQQGPRGREEAPRGVRMAVPLLRRMEGAPAGPGGRTAACLSCTSRCLSRR(SEQ ID NO:147)、QERRVPRAAEVPGAQGQQGPRGREEAPRGVRMAVPLLRRMEGAPAGPGGRTAACLSCTSRCLSRR(SEQ ID NO:148)、RVPRAAEVPGAQGQQGPRGREEAPRGVRMAVPLLRRMEGAPAGPGGRTAACLSCTSRCLSRRP(SEQ ID NO:149)、RRVPRAAEVPGAQGQQGPRGREEAPRGVRMAVPLLRRMEGAPAGPGGRTAACLSCTSRCLSRRP(SEQ ID NO:150)、ERRVPRAAEVPGAQGQQGPRGREEAPRGVRMAVPLLRRMEGAPAGPGGRTAACLSCTSRCLSRRP(SEQ ID NO:151)、QERRVPRAAEVPGAQGQQGPRGREEAPRGVRMAVPLLRRMEGAPAGPGGRTAACLSCTSRCLSRRP(SEQ ID NO:152)、RVPRAAEVPGAQGQQGPRGREEAPRGVRMAVPLLRRMEGAPAGPGGRTAACLSCTSRCLSRRPW(SEQ ID NO:153)、RRVPRAAEVPGAQGQQGPRGREEAPRGVRMAVPLLRRMEGAPAGPGGRTAACLSCTSRCLSRRPW(SEQ ID NO:154)、ERRVPRAAEVPGAQGQQGPRGREEAPRGVRMAVPLLRRMEGAPAGPGGRTAACLSCTSRCLSRRPW(SEQ ID NO:155)、QERRVPRAAEVPGAQGQQGPRGREEAPRGVRMAVPLLRRMEGAPAGPGGRTAACLSCTSRCLSRRPW(SEQ ID NO:156)、RVPRAAEVPGAQGQQGPRGREEAPRGVRMAVPLLRRMEGAPAGPGGRTAACLSCTSRCLSRRPWK(SEQ ID NO:157)、RRVPRAAEVPGAQGQQGPRGREEAPRGVRMAVPLLRRMEGAPAGPGGRTAACLSCTSRCLSRRPWK(SEQ ID NO:158)、ERRVPRAAEVPGAQGQQGPRGREEAPRGVRMAVPLLRRMEGAPAGPGGRTAACLSCTSRCLSRRPWK(SEQ ID NO:159)、QERRVPRAAEVPGAQGQQGPRGREEAPRGVRMAVPLLRRMEGAPAGPGGRTAACLSCTSRCLSRRPWK(SEQID NO:160)、RVPRAAEVPGAQGQQGPRGREEAPRGVRMAVPLLRRMEGAPAGPGGRTAACLSCTSRCLSRRPWKR(SEQ ID NO:161)、RRVPRAAEVPGAQGQQGPRGREEAPRGVRMAVPLLRRMEGAPAGPGGRTAACLSCTSRCLSRRPWKR(SEQ ID NO:162)、ERRVPRAAEVPGAQGQQGPRGREEAPRGVRMAVPLLRRMEGAPAGPGGRTAACLSCTSRCLSRRPWKR(SEQ ID NO:163)、EALAFLMAQGAMLAAQERRVPRAAEVPGAQGQQGPRGREEAPRGVRMAVPLLRRMEGAPAGPGGRTAACLSCTSRCLSRRPWKRSWSAGSCPGMPHRSP(SEQ ID NO:61)、EALAFLMAQGAMLAAQERRVPRAAEVPGAQGQQGPRGREEAPRGVRMAVPLLRRMEGAPAGPGGRTAACLSCTSRCLSRRPWKRSWSAGSCPGM(SEQ ID NO:62)、EALAFLMAQGAMLAAQERRVPRAAEVPGAQGQQGPRGREEAPRGVRMAVPLLRRMEGAPAGPGGRTAACLSCTSRCLSRRPWKRSWSAG(SEQ ID NO:63)、EALAFLMAQGAMLAAQERRVPRAAEVPGAQGQQGPRGREEAPRGVRMAVPLLRRMEGAPAGPGGRTAACLSCTSRCLSRRPWKR(SEQ ID NO:64)、LMAQGAMLAAQERRVPRAAEVPGAQGQQGPRGREEAPRGVRMAVPLLRRMEGAPAGPGGRTAACLSCTSRCLSRRPWKRSWSAGSCPGMPHRSPDQGRF(SEQ ID NO:68)、AMLAAQERRVPRAAEVPGAQGQQGPRGREEAPRGVRMAVPLLRRMEGAPAGPGGRTAACLSCTSRCLSRRPWKRSWSAGSCPGMPHRSPDQGRF(SEQ ID NO:69)和QERRVPRAAEVPGAQGQQGPRGREEAPRGVRMAVPLLRRMEGAPAGPGGRTAACLSCTSRCLSRRPWKRSWSAGSCPGMPHRSPDQGRF(SEQ ID NO:70)；一种包括SEQ ID NO:76(KDAARPAYWVPDYEILHCHNCRKEF)中所示的氨基酸序列的多肽；一种包括SEQ ID NO:78(SMPLWDFQGSTMRTSQYVRLTPDER)中所示的氨基酸序列的多肽；一种包括SEQ ID NO:80(YPGIKFEELFPDCIFPSESERDKIK)中所示的氨基酸序列的多肽；一种包括SEQ ID NO:82(LLKTRRILKCSYLYGFFLEPKSTKK)中所示的氨基酸序列的多肽；一种包括SEQ ID NO:84(PFYLGHTIKSGDFEYVGMEGGIVLS)中所示的氨基酸序列的多肽；一种包括SEQ ID NO:86(LLLAGYLAQQYLLLPTPKVIGIDLG)中所示的氨基酸序列的多肽；一种包括SEQ ID NO:166(TSMLILSNLVFLEGNEVGKTYWNRI)中所示的氨基酸序列的多肽；和/或包括保守氨基酸取代的任何前述多肽或多肽片段的变体。还公开了被工程化为表达可以识别本文所述公开的一或多种新抗原的受体(如例如，T细胞受体)的CAR T细胞。在一方面，可以对本文所公开的新抗原中的一或多种具有特异性的TCR T细胞、CAR T细胞或TIL进行进一步工程化，以敲除或敲低含锌指和BTB结构域的蛋白7B(ThPOK)、赖氨酸特异性组蛋白脱甲基酶1(LSD1)、程序性细胞死亡蛋白(PD1)、和/或蛋白磷酸酶2(PP2A)以在过继转移到癌症患者后增强其功能，如细胞毒性活性和体内持久性或存活率。在一方面，对本文所描述的新抗原中的一或多种具有特异性的TCR T细胞、CAR T细胞或TIL用小分子抑制剂如2-PAPC处理以增强T细胞细胞毒性活性或在体内增殖和存活的能力。
应当理解并且在本文中考虑，所公开的是，一旦新抗原的序列被鉴定，本领域技术人员将完全了解将编码所述氨基酸新抗原的核酸并且制备所述核酸构建体完全在本领域技术人员的技术范围内。因此，在一方面，本文还公开了编码本文所公开的任何新抗原的多肽的核酸。
1.同源性
应当理解，定义本文所公开的基因和蛋白质的任何已知的变体和衍生物或可能出现的那些的一种方法是根据特定的已知序列的同源性和/或同一性定义变体和衍生物。例如，SEQ ID NO:1示出了MHC II类表位肽的特定序列。具体公开了本文所公开的这些和其它基因和蛋白质的变体，其与所述序列具有至少70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％的同源性。本领域技术人员容易理解如何确定两种蛋白质或核酸，如基因的同源性。例如，可以在比对两个序列之后计算同源性，使得同源性处于其最高水平。
计算同源性的另一种方法可以由公开的算法执行。用于比较的序列的最佳比对可以通过以下进行：史密斯(Smith)和沃特曼(Waterman)的局部同源性算法,《高等应用数学(Adv.Appl.Math.)》2:482(1981)，尼德曼(Needleman)和乌士(Wunsch)的同源性比对算法,《分子生物学杂志(J.MoL Biol.)》48:443(1970)，皮尔森(Pearson)和李普曼(Lipman)的相似性搜索方法,《美国国家科学院院刊》85:2444(1988)，这些算法的计算机化实施方案(威斯康星州麦迪逊市575理学博士遗传学计算机组威斯康星州遗传学软件包(WisconsinGenetics Software Package,Genetics Computer Group,575Science Dr.,Madison,WI)中的GAP、BESTFIT、FASTA和TFASTA)，或者检查。
可以通过例如以下中所公开的算法获得核酸的相同类型的同源性：朱克曼(Zuker)M.《科学(Science)》244:48-52,1989，耶格尔(Jaeger)等人《美国国家科学院院刊》86:7706-7710,1989,耶格尔等人《酶学方法(Methods Enzymol.)》183:281-306,1989，这些文献通过引用并入本文用于至少与核酸比对有关的材料。
2.核酸
本文公开了多种基于核酸的分子，包含例如编码例如SEQ ID NO:1的核酸，或本文所公开的任何核酸或其片段以及各种功能核酸。所公开的核酸由例如核苷酸、核苷酸类似物或核苷酸替代物组成。本文讨论了这些和其它分子的非限制性实例。应当理解，例如，当载体在细胞中表达时，表达的mRNA将通常由A、C、G和U组成。同样地，应当理解，例如，通过例如外源性递送将反义分子引入细胞或细胞环境中，反义分子由减少细胞环境中反义分子降解的核苷酸类似物组成是有利的。
a)核苷酸及相关分子
核苷酸是包含碱基部分、糖部分和磷酸盐部分的分子。核苷酸可以通过其磷酸盐部分和糖部分连接在一起，产生核苷间键。核苷酸的碱基部分可以是腺嘌呤-9-基(A)、胞嘧啶-1-基(C)、鸟嘌呤-9-基(G)、尿嘧啶-1-基(U)和胸腺嘧啶-1-基(T)。核苷酸的糖部分是核糖或脱氧核糖。核苷酸的磷酸盐部分是五价磷酸盐。核苷酸的非限制性实例将是3'-AMP(3'-腺苷一磷酸)或5'-GMP(5'-鸟苷一磷酸)。在本领域和本文可获得的这些类型的分子有许多变种。
核苷酸类似物是含有对碱基、糖或磷酸盐部分进行某种类型的修饰的核苷酸。对核苷酸的修饰是本领域众所周知的并且将包含例如，5-甲基胞嘧啶(5-me-C)、5-羟甲基胞嘧啶、黄嘌呤、次黄嘌呤和2-氨基腺嘌呤以及在糖或磷酸盐部分处的修饰。在本领域和本文可获得的这些类型的分子有许多变种。
核苷酸替代物是具有与核苷酸类似的功能特性，但不含有磷酸盐部分的分子，如肽核酸(PNA)。核苷酸替代物是将以沃森-克里克(Watson-Crick)或霍氏(Hoogsteen)方式识别核酸，但通过除磷酸盐部分以外的部分连接在一起的分子。当与适当的靶核酸相互作用时，核苷酸替代物能够符合双螺旋型结构。在本领域和本文可获得的这些类型的分子有许多变种。
还可以将其它类型的分子(缀合物)与核苷酸或核苷酸类似物连接，以增强例如细胞摄取。缀合物可以与核苷酸或核苷酸类似物化学连接。此类缀合物包含但不限于脂质部分，如胆固醇部分。(勒辛格(Letsinger)等人,《美国国家科学院院刊》,1989,86,6553-6556)。在本领域和本文可获得的这些类型的分子有许多变种。
沃森-克里克相互作用是与核苷酸、核苷酸类似物或核苷酸替代物的沃森-克里克面的至少一种相互作用。核苷酸、核苷酸类似物或核苷酸替代物的沃森-克里克面包含基于嘌呤的核苷酸、核苷酸类似物或核苷酸替代物的C2、N1和C6位置以及基于嘧啶的核苷酸、核苷酸类似物或核苷酸替代物的C2、N3、C4位置。
霍氏相互作用是发生在核苷酸或核苷酸类似物的霍氏面上的相互作用，其暴露在双链体DNA的主要沟中。霍氏面包含N7位置和嘌呤核苷酸的C6位置处的反应基团(NH2或O)。
b)引物和探针
公开了包含引物和探针的组合物，所述组合物能够与所公开的核酸例如本文公开的新抗原相互作用。在某些实施例中，引物用于支持DNA扩增反应。通常，引物将能够以序列特异性方式延伸。以序列特异性方式延伸引物包含任何方法，其中与引物杂交或以其它方式缔合的核酸分子的序列和/或组成指导或影响通过引物延伸产生的产物的组成或序列。因此，以序列特异性方式延伸引物包含但不限于PCR、DNA测序、DNA延伸、DNA聚合、RNA转录或反转录。优选以序列特异性方式扩增引物的技术和条件。在某些实施例中，引物用于DNA扩增反应，如PCR或直接测序。应当理解，在某些实施例中，引物也可以使用非酶技术进行延伸，其中例如，修饰用于延伸引物的核苷酸或寡核苷酸，使得它们将以序列特异性方式发生化学反应以延伸引物。通常，所公开的引物与所公开的核酸或核酸的区域杂交，或者它们与核酸的互补物或核酸的区域的互补物杂交。
在某些实施例中，用于与核酸相互作用的引物或探针的大小可以是支持期望的引物的酶促操作，如DNA扩增或探针或引物的简单杂交的任何大小。典型的引物或探针的长度至少是6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100、125、150、175、200、225、250、275、300、325、350、375、400、425、450、475、500、550、600、650、700、750、800、850、900、950、1000、1250、1500、1750、2000、2250、2500、2750、3000、3500或4000个核甘酸。
在其它实施例中，引物或探针的长度可以小于或等于6、7、8、9、10、11、12 13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100、125、150、175、200、225、250、275、300、325、350、375、400、425、450、475、500、550、600、650、700、750、800、850、900、950、1000、1250、1500、1750、2000、2250、2500、2750、3000、3500或4000个核苷酸。
在某些实施例中，此产物的长度是至少20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100、125、150、175、200、225、250、275、300、325、350、375、400、425、450、475、500、550、600、650、700、750、800、850、900、950、1000、1250、1500、1750、2000、2250、2500、2750、3000、3500或4000个核苷酸。
在其它实施例中，所述产物的长度小于或等于20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100、125、150、175、200、225、250、275、300、325、350、375、400、425、450、475、500、550、600、650、700、750、800、850、900、950、1000、1250、1500、1750、2000、2250、2500、2750、3000、3500或4000个核苷酸。
3.肽
a)蛋白质变体
如本文所讨论的，有许多已知的新抗原并在本文中考虑的新抗原的变体。蛋白质变体和衍生物是本领域技术人员众所周知的并且可以涉及氨基酸序列修饰。例如，氨基酸序列修饰通常属于三类中的一或多种：取代变体、插入变体或缺失变体。插入包含氨基和/或羧基端融合物以及单个或多个氨基酸残基的序列内插入。插入通常是比氨基或羧基端融合物的插入更小的插入，例如，约1到4个残基的级别。通过在体外交联或通过用编码融合物的DNA转化的重组细胞培养物融合足够大以赋予靶序列免疫原性的多肽来制备免疫原性融合蛋白衍生物，如在实例中所描述的那些。缺失的特征在于从蛋白质序列中去除一或多个氨基酸残基。通常，在蛋白质分子内的任一位点处缺失不超过约2到6个残基。这些变体通常是通过对编码蛋白质的DNA中的核苷酸进行位点特异性诱变来制备的，从而产生编码所述变体的DNA，并且然后在重组细胞培养物中表达所述DNA。用于在具有已知序列的DNA中的预定位点处进行取代突变的技术是众所周知的，例如M13引物诱变和PCR诱变。氨基酸取代通常是单个残基，但是可以一次在多个不同位置处发生；插入通常将是约1到10个氨基酸残基的级别；并且缺失范围将是约1到30个残基。优选地在相邻对中进行缺失或插入，即缺失2个残基或插入2个残基。取代、缺失、插入或其任何组合可以组合以获得最终的构建体。突变不得将序列置于阅读框之外并且优选地将不产生可能产生二级mRNA结构的互补区。取代变体是其中至少一个残基已被去除并且在其位置插入了不同残基的那些变体。通常根据下表1和2进行此类取代并且被称为保守取代。
表1：氨基酸缩写
Figure BDA0002833673680000411
Figure BDA0002833673680000421
表2：氨基酸取代
原始残基示例性保守取代，其它是本领域已知的。
Figure BDA0002833673680000422
通过选择比表2中的取代保守程度低的取代来做出功能或免疫学同一性的基本改变，即选择残基在维持以下的作用上差异更显著的残基：(a)取代区域中多肽主链的结构，例如，折叠或螺旋构象，(b)分子在靶位点的电荷或疏水性，或(c)侧链的本体。通常预期在蛋白质特性上产生最大变化的取代将是以下取代，其中(a)亲水性残基，例如，丝氨酰或苏氨酰由(或被)疏水性残基，例如，亮氨酰、异亮氨酰、苯丙氨酰、缬氨酰或丙氨酰取代；(b)半胱氨酸或脯氨酸由(被)任何其它残基取代；(c)具有正电性侧链的残基，例如，赖氨酰、精氨酰或组氨酰基由(被)负电性残基，例如，谷酰基或门冬氨酰取代；或者(d)在这种情况下，具有大体积侧链的残基，例如，苯丙氨酸由(被)具有侧链的残基，例如，甘氨酸取代，(e)通过增加硫酸化和/或糖基化的位点数目。
例如，一个氨基酸残基被在生物学和/或化学上类似的另一个氨基酸残基取代是本领域技术人员已知的保守取代。例如，保守取代是将一个疏水性残基替换为另一个，或将一个极性残基替换为另一个。所述取代包含组合，如例如，Gly、Ala；Val、Ile、Leu；Asp、Glu；Asn、Gln；Ser、Thr；Lys、Arg；和Phe、Tyr。每个明确公开的序列的此类保守取代的变型包含在本文所提供的镶嵌多肽内。
可以采用取代或缺失诱变以插入用于N-糖基化(Asn-X-Thr/Ser)或O-糖基化(Ser或Thr)的位点。半胱氨酸或其它不稳定残基的缺失也可能是期望的。潜在的蛋白水解位点(例如，Arg)的缺失或取代例如通过缺失碱性残基之一或通过谷氨酰胺酰基或组氨酰基残基取代来实现。
某些翻译后衍生化是重组宿主细胞对表达的多肽起作用的结果。谷氨酰胺酰基和天冬酰胺酰残基经常在翻译后脱酰胺基化为对应的谷酰基和天门冬氨酰残基。可替代地，这些残基在弱酸性条件下脱酰胺。其它翻译后修饰包含脯氨酸和赖氨酸的羟基化，丝氨酰或苏氨酸残基的羟基的磷酸化，赖氨酸、精氨酸和组氨酸侧链的o-氨基的甲基化(T.E.克赖顿(Creighton),《蛋白质：结构和分子特性(Proteins:Structure and MolecularProperties)》,W.H.弗里曼公司(W.H.Freeman&Co.),旧金山(San Francisco)第79-86页[1983])，N端胺的乙酰化以及在一些实例中，C端羧基的酰胺化。
应当理解，定义本文所公开的蛋白质的变体和衍生物的一种方法是根据特定的已知序列的同源性/同一性定义变体和衍生物。具体公开了本文所公开的这些和其它蛋白质的变体，其与所述序列具有至少70％或75％或80％或85％或90％或95％的同源性。本领域技术人员容易理解如何确定两种蛋白质的同源性。例如，可以在比对两个序列之后计算同源性，使得同源性处于其最高水平。
计算同源性的另一种方法可以由公开的算法执行。用于比较的序列的最佳比对可以通过以下进行：史密斯和沃特曼的局部同源性算法,《高等应用数学》2:482(1981)，尼德曼和乌士的同源性比对算法,《分子生物学杂志》48:443(1970)，皮尔森和李普曼的相似性搜索方法,《美国国家科学院院刊》85:2444(1988)，这些算法的计算机化实施方案(威斯康星州麦迪逊市575理学博士遗传学计算机组威斯康星州遗传学软件包中的GAP、BESTFIT、FASTA和TFASTA)，或者检查。
可以通过例如以下中所公开的算法获得核酸的相同类型的同源性：朱克曼M.《科学》244:48-52,1989，耶格尔等人《美国国家科学院院刊》86:7706-7710,1989,耶格尔等人《酶学方法》183:281-306,1989。
应当理解，保守突变和同源性的描述可以以任何组合组合在一起，如与其中变体是保守突变的特定序列具有至少70％同源性的实施例。
当本说明书讨论各种蛋白质和蛋白质序列时，应当理解，还公开了可以编码那些蛋白质序列的核酸。这将包含与特定蛋白质序列有关的所有简并序列，即，具有编码一个特定蛋白质序列的序列的所有核酸以及编码蛋白质序列的所公开的变体和衍生物的所有核酸(包含简并核酸)。因此，尽管每个特定核酸序列在本文中可能未写出，但应当理解，实际上每一个序列是通过所公开的蛋白质序列在本文中公开和描述的。
应当理解，有大量的氨基酸和肽类似物，它们可以被并入所公开的组合物中。例如，存在许多D氨基酸或与表1和表2中所示的氨基酸相比具有不同功能取代基的氨基酸。公开了天然存在的肽的相反的立体异构体，以及肽类似物的立体异构体。通过用所选的氨基酸装入tRNA分子并工程化利用例如，琥珀密码子的遗传构建体，从而以位点特异性方式将类似氨基酸插入肽链可以很容易地将这些氨基酸并入多肽链中。
可以产生类似肽但不通过天然肽键连接的分子。例如，氨基酸或氨基酸类似物的连接可以包含CH2NH--、--CH2S--、--CH2--CH2--、--CH＝CH--(顺式和反式)、--COCH2--、--CH(OH)CH2--和--CHH2SO—(这些和其它可以在以下中发现：斯帕托拉(Spatola)A.F.《氨基酸、多肽和蛋白质的化学和生物化学(Chemistry and Biochemistry of Amino Acids,Peptides,and Proteins)》,B.温斯坦(Weinstein),编辑,纽约马塞尔·德克尔公司(Marcel Dekker,New York),第267页(1983)；斯帕托拉A.F.,《维加数据(Vega Data)》(1983年3月),第1卷,第3期,《肽主链修饰(综述)(Peptide Backbone Modifications(general review))》；莫利(Morley),《药理科学趋势(Trends Pharm Sci)》(1980)第463-468页；哈德森(Hudson)D.等人,《国际肽和蛋白质研究杂志(Int J Pept Prot Res)》14:177-185(1979)(--CH2NH--、CH2CH2--)；斯帕托拉等人《生命科学(Life Sci)》38:1243-1249(1986)(--CH H2--S)；汉恩(Hann)《化学学会杂志珀金会报(J.Chem.Soc Perkin Trans.)》I 307-314(1982)(--CH--CH--,顺式和反式)；阿姆奎斯特(Almquist)等人《药物化学杂志(J.Med.Chem.)》23:1392-1398(1980)(--COCH2--)；詹宁斯-怀特(Jennings-White)等人《四面体通讯(Tetrahedron Lett)》23:2533(1982)(--COCH2--)；塞尔凯(Szelke)等人《欧洲应用(European Appln)》,EP 45665 CA(1982):97:39405(1982)(--CH(OH)CH2--)；霍拉迪(Holladay)等人《四面体通讯》24:4401-4404(1983)(--C(OH)CH2--)；以及赫鲁比(Hruby)《生命科学》31:189-199(1982)(--CH2--S--)；所述文献中的每个通过引用并入本文。特别优选的非肽键是--CH2NH--。应当理解，肽类似物在键原子之间可以具有一个以上的原子，如b-丙氨酸、g-氨基丁酸等。
氨基酸类似物以及类似物和肽类似物通常具有增强的或期望的特性，如更经济的产生、更大的化学稳定性、增强的药理特性(半衰期、吸收、效力、功效等)、改变的特异性(例如，广谱的生物活动)、降低的抗原性等。
D-氨基酸可以用于产生更稳定的肽，因为D氨基酸不被肽酶等识别。共有序列的一或多个氨基酸被相同类型的D-氨基酸(例如，D-赖氨酸代替L-赖氨酸)的系统取代可以用于产生更稳定的肽。半胱氨酸残基可以用于环化或将两个或两个以上肽连接在一起。这对于将肽限制为特定构象可能是有益的。
4.药物载剂/药物产物的递送
在一方面，应当理解并且在本文中考虑，所公开的新抗原可以作为组合物施用于患有癌症或可能发展成癌症的受试者。因此，本文公开了包括治疗有效量的本文所公开的一或多种新抗原(包含但不限于新抗原的肽、多肽和蛋白质)的组合物。另外，本文公开了组合物，所述组合物包括治疗有效量的一或多种CAR T细胞、TCR T细胞和/或TIL；其中所述CAR T细胞、TCR T细胞和/或TIL已被工程化为表达本文所描述的新抗原中的一或多种的受体。在一方面，可以对本文所公开的新抗原中的一或多种具有特异性的TCR T细胞、CAR T细胞或TIL进行进一步工程化，以敲除或敲低含锌指和BTB结构域的蛋白7B(ThPOK)、赖氨酸特异性组蛋白脱甲基酶1(LSD1)、程序性细胞死亡蛋白(PD1)、和/或蛋白磷酸酶2(PP2A)以在过继转移到癌症患者后增强其功能，如细胞毒性活性和体内持久性或存活率。在一方面，对本文所描述的新抗原中的一或多种具有特异性的TCR T细胞、CAR T细胞或TIL用小分子抑制剂如2-PAPC处理以增强T细胞细胞毒性活性或在体内增殖和存活的能力。
如上文所描述的，组合物还可以在药学上可接受的载剂中体内施用。“药学上可接受的”意指不是生物学上或其它方面不期望的材料，即，该材料可以与核酸或载体一起施用于受试者，而不引起任何不期望的生物学效应或以有害的方式与包含它的药物组合物的任何其它组分相互作用。如本领域技术人员所熟知的，载体将被自然地选择来最小化活性成分的任何降解并且最小化受试者中的任何不良副作用。
所述组合物可以口服、肠胃外(例如，静脉内)、通过肌内注射、通过腹膜内注射、透皮、体外、局部等施用，包含局部鼻内施用或通过吸入剂施用。如本文所使用的，“局部鼻内施用”意指通过鼻孔中的一个或两个将组合物递送到鼻和鼻道中，并且可以包括通过雾化机制或液滴机制或通过核酸或载体的气雾化的递送。通过吸入剂施用组合物可以是经由喷雾或液滴机制的递送通过鼻或口。递送还可以通过插管直接到呼吸系统的任何区域(例如，肺)。根据受试者的物种、年龄、体重和一般状况，所治疗的过敏性病症的严重程度，使用的具体的核酸或载体，其施用方式等，所需组合物的确切量将随受试者而变化。因此，不可能为每种组合物指定确切的量。然而，在本文给出传授的前提下，本领域普通技术人员仅使用常规实验便可以确定适当的量。
组合物的肠胃外施用(如果使用的话)通常通过注射来表征。可以以常规形式(液体溶液或悬浮液、适于在注射前溶解于液体中悬浮液的固体形式或乳剂形式)制备注射剂。用于肠胃外施用的最近修订的方法涉及使用缓释或持续释放系统，从而维持恒定的剂量。参见，例如，美国专利第3,610,795号，所述美国专利通过引用并入本文。
这些材料可以在溶液、悬浮液(例如，并入微粒、脂质体或细胞中)中。这些可以通过抗体、受体或受体配体靶向特定细胞类型。以下参考资料是使用这种技术将特定蛋白质靶向肿瘤组织的实例(森特(Senter)等人,《生物共轭化学(Bioconjugate Chem.)》,2:447-451,(1991)；巴格肖(Bagshawe)K.D.,《英国癌症杂志(Br.J.Cancer)》,60:275-281,(1989)；巴格肖等人,《英国癌症杂志》,58:700-703,(1988)；森特等人,《生物共轭化学》,4:3-9,(1993)；巴泰利(Battelli)等人,《癌症免疫学免疫疗法(CancerImmunol.Immunother.)》,35:421-425,(1992)；彼得斯(Pietersz)和麦肯基(McKenzie),《免疫学综述(Immunolog.Reviews)》,129:57-80,(1992)；以及罗夫勒(Roffler)等人,《生化药理学(Biochem.Pharmacol)》,42:2062-2065,(1991))。媒剂如“隐形”和其它抗体缀合的脂质体(包含脂质介导的靶向结肠癌的药物)、受体介导的通过细胞特异性配体对DNA的靶向、针对淋巴细胞的肿瘤的靶向以及在体内对鼠神经胶质瘤细胞的高度特异性的治疗性逆转录病毒靶向。以下参考资料是使用这种技术将特定蛋白质靶向肿瘤组织的实例(休斯(Hughes)等人,《癌症研究(Cancer Research)》,49:6214-6220,(1989)；以及李兹恩格(Litzinger)和黄(Huang),《生物化学与生物物理学报(Biochimica et BiophysicaActa)》,1104:179-187,(1992))。通常，受体涉及组成或配体诱导的内吞途径。这些受体聚集在网格蛋白涂覆的凹坑中，通过网格蛋白涂覆的囊泡进入细胞，经过其中对受体进行分选的酸化的内体，并且然后循环到细胞表面，变成细胞内储存，或在溶酶体中降解。内化途径具有多种功能，如营养吸收、去除活化蛋白、清除大分子、病毒和毒素的机会性进入、配体的解离和降解以及受体水平调节。根据细胞类型、受体浓度、配体类型、配体价和配体浓度，许多受体遵循一种以上的细胞内途径。受体介导的内吞作用的分子和细胞机制已被综述(布朗(Brown)和格林(Greene),《DNA与细胞生物学(DNA and Cell Biology)》10:6,399-409(1991))。
a)药学上可接受的载剂
包含抗体的组合物可以与药学上可接受的载剂组合治疗性地使用。
合适的载剂和其调配物描述于以下：《雷明顿：药学的科学与实践(Remington:TheScience and Practice of Pharmacy)》(第19版)A.R.加图索(Gennaro)编辑,宾夕法尼亚州伊斯顿的马克出版公司(Mack Publishing Company,Easton,PA)1995。通常，在调配中使用适当量的药学上可接受的盐以使得制剂是等渗的。药学上可接受的载剂的实例包含但不限于盐水、林格氏溶液(Ringer's solution)和右旋糖溶液。溶液的pH优选地是从约5到约8，并且更优选地从约7到约7.5。另外的载剂包含持续释放制品，如含有抗体的固体疏水性聚合物的半透性基质，这些基质处于成形物品形式，例如，膜、脂质体或微粒。对于本领域技术人员将清楚的是，根据例如施用途径和施用的组合物的浓度，某些载剂可以是更优选的。
药物载剂是本领域的技术人员已知的。这些最典型地是用于向人类施用药物的标准载剂，包含溶液如无菌水、盐水和生理pH的缓冲溶液。这些组合物可以肌内地或皮下地施用。其它化合物将根据本领域技术人员使用的标准程序施用。
除了所选择的分子之外，药物组合物还可以包含载剂、增稠剂、稀释剂、缓冲剂、防腐剂、表面活性剂等。药物组合物还可以包含一或多种活性成分，如抗微生物剂、抗炎剂、麻醉剂等。
根据是否期望局部或全身治疗和待治疗的区域，可以以多种方式施用药物组合物。可以局部(包含眼、阴道、直肠、鼻内)、口服、吸入或胃肠外施用，例如通过静脉滴注、皮下、腹膜内或肌内注射。所公开的抗体可以静脉内、腹膜内、肌内、皮下、腔内或透皮施用。
肠胃外施用的制剂包含无菌的水性或非水性溶液、悬浮液和乳液。非水性溶剂的实例是丙二醇、聚乙二醇、植物油如橄榄油、以及可注射有机酯如油酸乙酯。水性载剂包含水、醇性/水性溶液、包含盐水和缓冲介质的乳液或悬浮液。肠胃外媒剂包含氯化钠溶液、林格氏右旋糖(Ringer's dextrose)、右旋糖和氯化钠、乳酸林格氏液或固定油。静脉媒剂包含流体和营养补充剂、电解质补充剂(如基于林格氏右旋糖的那些)等。也可以存在防腐剂和其它添加剂，如例如抗微生物剂、抗氧化剂、螯合剂和惰性气体等。
用于局部施用的调配物可以包含软膏、洗剂、乳膏、凝胶剂、滴剂、栓剂、喷雾剂、液体和粉末。常规的药物载剂、水性基质、粉末或油性基质、增稠剂等可以是必要的或希望的。
用于口服施用的组合物包含粉末或颗粒剂、在水或非水性介质中的悬浮液或溶液、胶囊、囊剂或片剂。增稠剂、调味剂、稀释剂、乳化剂、分散助剂或粘合剂可以是希望的。
组合物中的一些可以潜在地作为药学上可接受的酸加成盐或碱加成盐施用，其通过与无机酸(如盐酸、氢溴酸、高氯酸、硝酸、硫氰酸、硫酸和磷酸)和有机酸(如甲酸、乙酸、丙酸、乙醇酸、乳酸、丙酮酸、草酸、丙二酸、琥珀酸、马来酸和富马酸)，或通过与无机碱(如氢氧化钠、氢氧化铵、氢氧化钾)和有机碱(例如单、二、三烷基胺和芳基胺以及取代的乙醇胺)反应形成。
b)治疗用途
用于施用这些组合物的有效剂量和方案可以凭经验确定，并且进行这样的测定在本领域的技术范围内。用于施用这些组合物的剂量范围是足够大到以产生其中失调症状受影响的所需效果的那些。剂量不应大到引起不良副作用，如不需要的交叉反应、过敏反应等。通常，剂量将随着患者的年龄、病症、性别和疾病程度、施用途径或者其它药物是否被包括在方案中而变化，并且可以由本领域技术人员确定。在发生任何禁忌的情况下，可以由个别医生调整剂量。剂量可以变化，并且可以每天一或多次剂量施用，持续一天或几天。可以在文献中找到针对给定类别的药物产品的适当剂量的指导。例如，可以在有关抗体的治疗用途的文献中发现针对抗体选择适当剂量的指导，例如，《单克隆抗体手册(Handbook ofMonoclonal Antibodies)》,菲罗内(Ferrone)等人,编辑,Noges出版,新泽西州帕克里奇(Park Ridge,N.J.),(1985)第22章和第303-357页；史密斯等人,《人体诊断和疗法中的抗体(Antibodies in Human Diagnosis and Therapy)》,哈伯(Haber)等人,编辑,纽约雷文出版社(Raven Press,New York)(1977)第365-389页。根据上文所提及的因素，单独使用的抗体的通常每日剂量范围可能为每天约1μg/kg到最高100mg/kg体重或更多。
D.使用组合物的方法
1.治疗癌症的方法
所公开的组合物可以用于治疗发生不受控制的细胞增殖的任何疾病，如癌症。因此，在一方面，本文公开了刺激针对癌症的免疫应答或治疗、抑制和/或预防癌症的方法，所述方法包括向受试者施用包括治疗有效量的本文所公开的任何新抗原(例如SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:9、SEQID NO:12、SEQ ID NO:14、SEQ ID NO:17、SEQ ID NO:19、SEQ ID NO:21、SEQ ID NO:22、SEQID NO:23、SEQ ID NO:24、SEQ ID NO:26、SEQ ID NO:28、SEQ ID NO:29、SEQ ID NO:30、SEQID NO:32、SEQ ID NO:33、SEQ ID NO:34、SEQ ID NO:35、SEQ ID NO:36、SEQ ID NO:37、SEQID NO:39、SEQ ID NO:41、SEQ ID NO:42、SEQ ID NO:43、SEQ ID NO:44、SEQ ID NO:46、SEQID NO:49、SEQ ID NO:50、SEQ ID NO:51、SEQ ID NO:52、SEQ ID NO:53、SEQ ID NO:54、SEQID NO:57、SEQ ID NO:60、SEQ ID NO:61、SEQ ID NO:62、SEQ ID NO:63、SEQ ID NO:64、SEQID NO:67、SEQ ID NO:68、SEQ ID NO:69、SEQ ID NO:70、SEQ ID NO:73、SEQ ID NO:74、SEQID NO:76、SEQ ID NO:78、SEQ ID NO:80、SEQ ID NO:82、SEQ ID NO:84、SEQ ID NO:86、SEQID NO:88、SEQ ID NO:89、SEQ ID NO:90、SEQ ID NO:91、SEQ ID NO:92、SEQ ID NO:93、SEQID NO:94、SEQ ID NO:95、SEQ ID NO:96、SEQ ID NO:97、SEQ ID NO:98、SEQ ID NO:99、SEQID NO:100、SEQ ID NO:101、SEQ ID NO:102、SEQ ID NO:103、SEQ ID NO:104、SEQ ID NO:105、SEQ ID NO:106、SEQ ID NO:107、SEQ ID NO:108、SEQ ID NO:109、SEQ ID NO:110、SEQID NO:111、SEQ ID NO:112、SEQ ID NO:113、SEQ ID NO:114、SEQ ID NO:115、SEQ ID NO:116、SEQ ID NO:117、SEQ ID NO:118、SEQ ID NO:119、SEQ ID NO:120、SEQ ID NO:121、SEQID NO:122、SEQ ID NO:123、SEQ ID NO:124、SEQ ID NO:125、SEQ ID NO:126、SEQ ID NO:127、SEQ ID NO:128、SEQ ID NO:129、SEQ ID NO:130、SEQ ID NO:131、SEQ ID NO:132、SEQID NO:133、SEQ ID NO:134、SEQ ID NO:135、SEQ ID NO:136、SEQ ID NO:137、SEQ ID NO:138、SEQ ID NO:139、SEQ ID NO:140、SEQ ID NO:141、SEQ ID NO:142、SEQ ID NO:143、SEQID NO:144、SEQ ID NO:145、SEQ ID NO:146、SEQ ID NO:147、SEQ ID NO:148、SEQ ID NO:149、SEQ ID NO:150、SEQ ID NO:151、SEQ ID NO:152、SEQ ID NO:153、SEQ ID NO:154、SEQID NO:155、SEQ ID NO:156、SEQ ID NO:157、SEQ ID NO:158、SEQ ID NO:159、SEQ ID NO:160、SEQ ID NO:161、SEQ ID NO:162和/或SEQ ID NO:163)和/或通过鉴定本文所公开的新抗原的方法鉴定的任何新抗原的组合物。在一方面，应当理解并且在本文中考虑，所公开的新抗原包含任何所公开的新抗原的肽、多肽和/或蛋白质。
术语“治疗有效的”是指使用的组合物的量是足以改善疾病或病症的一或多种原因或症状的量。此类改善仅需要减少或改变，并不需要消除。
术语“治疗”是指患者的医疗管理，其中有意治愈、改善、稳定、或预防疾病、病理病状、或病症。此术语包括积极治疗，即特定地针对疾病、病理病状、或病症的改善的治疗，并且还包括病因治疗，即针对相关疾病、病理病状、或病症的病因的去除的治疗。此外，此术语包括姑息治疗，即经设计用于减轻症状而不是治愈疾病、病理病状、或病症的治疗；预防性治疗，即针对将相关疾病、病理病状、或病症的发展最小化或部分或完全抑制其发展的治疗；和支持性治疗，即用于补充针对相关疾病、病理病状、或病症的改善的另一种特定疗法的治疗。
可以通过所公开的方法治疗的不同类型的癌症的非限制性列表如下：淋巴瘤(霍奇金氏和非霍奇金氏)、白血病、癌、实体组织癌、鳞状细胞癌、腺癌、肉瘤、神经胶质瘤、高级别胶质瘤、胚细胞瘤、成神经细胞瘤、浆细胞瘤、组织细胞瘤、黑色素瘤、腺瘤、乏氧肿瘤、骨髓瘤、AIDS相关的淋巴瘤或肉瘤、转移癌或一般性癌症。
所公开的组合物可以用于治疗的代表性但非限制性癌症列表如下：淋巴瘤、B细胞淋巴瘤、T细胞淋巴瘤、蕈样真菌病、霍奇金氏病、髓细胞性白血病、膀胱癌、脑癌、神经系统癌症、头颈癌(head and neck cancer)、头颈部鳞状细胞癌、肺癌(lung cancer)如小细胞肺癌和非小细胞肺癌、神经母细胞瘤/胶质母细胞瘤、卵巢癌、胰腺癌、前列腺癌、皮肤癌、肝癌、黑色素瘤、口腔、咽喉、喉部和肺的鳞状细胞癌、大肠癌、宫颈癌(cervical cancer/cervical carcinoma)、乳腺癌和上皮癌、肾癌、泌尿生殖系统癌症、肺癌(pulmonarycancer)、食管癌、头颈癌(head and neck carcinoma)、大肠癌、造血系统癌症；睾丸癌；大肠癌和/或直肠癌。
2.治疗自身免疫疾病的方法
在一方面，应当理解并且在本文中考虑，所公开的新抗原可以用于治疗自身免疫疾病。如本文所使用的，“自身免疫疾病”是指由针对宿主生物的适应性免疫应答(T细胞和/或B细胞应答)导致的一组疾病、病症或病状。在此类条件下，通过突变或其它潜在原因，宿主T细胞和/或B细胞和/或抗体不再能够将宿主细胞与非自身抗原区分开来并且攻击露出其特异性针对的抗原的宿主细胞。可以引起炎性皮肤病症的自身免疫疾病的实例包含但不限于失弛症、急性播散性脑脊髓炎、急性运动性轴索神经病、艾迪生氏病(Addison'sdisease)、痛性肥胖症、成人斯提耳氏病(Adult Still's disease)、低丙种球蛋白血症、斑秃、阿尔茨海默氏病(Alzheimer's disease)、淀粉样变性病、强直性脊柱炎、抗GBM/抗-TBM肾炎、抗磷脂综合症、再生障碍性贫血、自身免疫性血管性水肿、自身免疫性神经异常、自身免疫性脑脊髓炎、自身免疫性肠病、自身免疫性溶血性贫血、自身免疫性肝炎、自身免疫性内耳病(AIED)、自身免疫性心肌炎、自身免疫性卵巢炎、自身免疫性睾丸炎、自身免疫性胰腺炎、自身免疫性多内分泌腺病综合症、自身免疫性视网膜病变、自身免疫性荨麻疹、轴索和神经元神经病(AMAN)、巴洛病(Baló disease)、白塞病(Behcet's disease)、良性粘膜类天疱疮、毕克斯达夫脑炎(Bickerstaff's encephalitis)、大疱性类天疱疮、卡斯尔曼病(Castleman disease)(CD)、乳糜泻、美洲锥虫病、慢性疲劳综合症、慢性炎性脱髓鞘性多发性神经病(CIDP)、慢性复发性多病灶性骨髓炎(CRMO)、查格-施特劳斯综合症(CSS)、嗜伊红细胞性肉芽肿病(EGPA)、疤痕性类天疱疮、科干综合症(Cogan's syndrome)、冷凝集素病、先天性心脏阻滞、柯赛基病毒性心肌炎(Coxsackie myocarditis)、CREST综合症、克罗恩氏病(Crohn's disease)、疱疹样皮炎、皮肌炎、德维克氏病(Devic's disease)(视神经脊髓炎)、1型糖尿病、盘状狼疮、德雷斯勒综合症(Dressler's syndrome)、子宫内膜异位、肌腱端炎、嗜酸细胞性食管炎(EoE)、嗜酸性筋膜炎、结节性红斑、原发性混合型冷球蛋白血症、伊文氏综合症(Evans syndrome)、费尔蒂综合症(Felty syndrome)、纤维肌痛症、纤维性肺泡炎、巨细胞动脉炎(颞动脉炎)、巨细胞性心肌炎、血管球性肾炎、古德帕斯彻氏综合症(Goodpasture's syndrome)、肉芽肿性多血管炎、格雷夫斯病(Graves'disease)、格林-巴利综合症(Guillain-Barre syndrome)、桥本脑病(Hashimoto's encephalopathy)、桥本甲状腺炎(Hashimoto's thyroiditis)、溶血性贫血、亨-舍二氏紫癜(Henoch-Schonleinpurpura)(HSP)、妊娠疱疹或妊娠性类天疱疮(PG)、化脓性汗腺炎(HS)(反常性痤疮)、低丙球蛋白血症、IgA肾病、IgG4有关的硬化症、免疫性血小板减少性紫癜(ITP)、包涵体肌炎(IBM)、间质性膀胱炎(IC)、炎性肠病(IBD)、幼年型关节炎、幼年型糖尿病(1型糖尿病)、幼年型肌炎(JM)、川崎氏病(Kawasaki disease)、兰伯特-伊顿综合症(Lambert-Eatonsyndrome)、白细胞破碎性血管炎、扁平苔藓、硬化性苔癣、木样结膜炎、线性IgA病(LAD)、狼疮性肾炎、狼疮性血管炎、慢性莱姆病(Lyme disease chronic)、美尼尔氏病(Meniere'sdisease)、显微镜下多血管炎(MPA)、混合性结蒂组织病(MCTD)、莫伦氏溃疡(Mooren'sulcer)、穆-哈二氏病(Mucha-Habermann disease)、多灶性运动神经病(MMN)或MMNCB、多发性硬化症、重症肌无力、肌炎、发作性嗜睡病、新生儿狼疮、视神经脊髓炎、嗜中性白血球减少症、眼部疤痕性类天疱疮、视神经炎、奥德甲状腺炎(Ord's thyroiditis)、复发性风湿病(PR)、PANDAS、副肿瘤性小脑变性(PCD)、阵发性睡眠性血红蛋白尿症(PNH)、帕-罗二氏综合症(Parry Romberg syndrome)、睫状体扁平部炎(周边葡萄膜炎)、帕森那-特纳症(Parsonnage-Turner syndrome)、天疱疮、周围神经病变、静脉周围性脑脊髓炎、恶性贫血(PA)、POEMS综合症、结节性多动脉炎、I、II、III型多腺性综合症、风湿性多肌痛、多肌炎、心肌梗死后综合症、心包切开术后综合症、原发性胆汁性肝硬化、原发性硬化性胆管炎、黄体酮皮炎、银屑病、银屑病关节炎、纯红细胞再生障碍(PRCA)、坏疽性脓皮病、雷诺氏现象(Raynaud's phenomenon)、反应性关节炎、反射交感性营养不良、复发性多软骨炎、多动腿综合症(RLS)、腹膜后纤维化、风湿热、类风湿性关节炎、类风湿性脉管炎、结节病、施密特综合症(Schmidt syndrome)、施尼茨勒综合症(Schnitzler syndrome)、巩膜炎、硬皮病、干燥综合症、精子和睾丸自身免疫、僵人综合症(SPS)、亚急性细菌性心内膜炎(SBE)、苏萨克综合症(Susac's syndrome)、西登哈姆舞蹈病(Sydenham chorea)、交感性眼炎(SO)、全身性红斑狼疮、系统性硬皮病、高安动脉炎(Takayasu's arteritis)、颞动脉炎/巨细胞动脉炎、血小板减少性紫癜(TTP)、托-享综合症(Tolosa-Hunt syndrome)(THS)、横贯性脊髓炎、1型糖尿病、溃疡性结肠炎(UC)、未分化结缔组织病(UCTD)、荨麻疹、荨麻疹性血管炎、葡萄膜炎、血管炎、白癜风、小柳原田病(Vogt-Koyanagi-Harada Disease)和韦格纳肉芽肿(Wegener's granulomatosis)(或肉芽肿性多血管炎(GPA))。因此，在一方面，本文公开了刺激针对自身免疫疾病的免疫应答或治疗、抑制和/或预防自身免疫疾病的方法，所述方法包括向受试者施用组合物，所述组合物包括治疗有效量的本文所公开的任何新抗原(例如SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:7、SEQID NO:9、SEQ ID NO:12、SEQ ID NO:14、SEQ ID NO:17、SEQ ID NO:19、SEQ ID NO:21、SEQID NO:22、SEQ ID NO:23、SEQ ID NO:24、SEQ ID NO:26、SEQ ID NO:28、SEQ ID NO:29、SEQID NO:30、SEQ ID NO:32、SEQ ID NO:33、SEQ ID NO:34、SEQ ID NO:35、SEQ ID NO:36、SEQID NO:37、SEQ ID NO:39、SEQ ID NO:41、SEQ ID NO:42、SEQ ID NO:43、SEQ ID NO:44、SEQID NO:46、SEQ ID NO:49、SEQ ID NO:50、SEQ ID NO:51、SEQ ID NO:52、SEQ ID NO:53、SEQID NO:54、SEQ ID NO:57、SEQ ID NO:60、SEQ ID NO:61、SEQ ID NO:62、SEQ ID NO:63、SEQID NO:64、SEQ ID NO:67、SEQ ID NO:68、SEQ ID NO:69、SEQ ID NO:70、SEQ ID NO:73、SEQID NO:74、SEQ ID NO:76、SEQ ID NO:78、SEQ ID NO:80、SEQ ID NO:82、SEQ ID NO:84、SEQID NO:86、SEQ ID NO:88、SEQ ID NO:89、SEQ ID NO:90、SEQ ID NO:91、SEQ ID NO:92、SEQID NO:93、SEQ ID NO:94、SEQ ID NO:95、SEQ ID NO:96、SEQ ID NO:97、SEQ ID NO:98、SEQID NO:99、SEQ ID NO:100、SEQ ID NO:101、SEQ ID NO:102、SEQ ID NO:103、SEQ ID NO:104、SEQ ID NO:105、SEQ ID NO:106、SEQ ID NO:107、SEQ ID NO:108、SEQ ID NO:109、SEQID NO:110、SEQ ID NO:111、SEQ ID NO:112、SEQ ID NO:113、SEQ ID NO:114、SEQ ID NO:115、SEQ ID NO:116、SEQ ID NO:117、SEQ ID NO:118、SEQ ID NO:119、SEQ ID NO:120、SEQID NO:121、SEQ ID NO:122、SEQ ID NO:123、SEQ ID NO:124、SEQ ID NO:125、SEQ ID NO:126、SEQ ID NO:127、SEQ ID NO:128、SEQ ID NO:129、SEQ ID NO:130、SEQ ID NO:131、SEQID NO:132、SEQ ID NO:133、SEQ ID NO:134、SEQ ID NO:135、SEQ ID NO:136、SEQ ID NO:137、SEQ ID NO:138、SEQ ID NO:139、SEQ ID NO:140、SEQ ID NO:141、SEQ ID NO:142、SEQID NO:143、SEQ ID NO:144、SEQ ID NO:145、SEQ ID NO:146、SEQ ID NO:147、SEQ ID NO:148、SEQ ID NO:149、SEQ ID NO:150、SEQ ID NO:151、SEQ ID NO:152、SEQ ID NO:153、SEQID NO:154、SEQ ID NO:155、SEQ ID NO:156、SEQ ID NO:157、SEQ ID NO:158、SEQ ID NO:159、SEQ ID NO:160、SEQ ID NO:161、SEQ ID NO:162和/或SEQ ID NO:163)和/或通过本文所公开的鉴定新抗原的方法鉴定的任何新抗原。在一方面，应当理解并且在本文中考虑，所公开的新抗原包含任何所公开的新抗原的肽、多肽和/或蛋白质。
E.实例
提出以下实例以向本领域普通技术人员提供关于如何制备和评估本文所要求的化合物、组合物、制品、装置和/或方法的完整公开和描述，并且仅旨在是示例性的并不旨在限制本公开。虽然已经尽力确保关于数字(例如，数量、温度等)的准确性，但是已经考虑了一些误差和偏差。除非另外指示，否则份数是重量份，温度以℃为单位或在环境温度下，并且压力是大气压或接近大气压。
1.实例1：优势新抗原特异性T细胞应答和单个T细胞受体的多种抗原特异性
通过检查点阻断疗法和基于T细胞的免疫疗法诱导的肿瘤消退取决于T细胞对肿瘤抗原，特别是突变衍生的新抗原的识别。越来越多的证据指示，肿瘤突变负荷与对检查点阻断疗法的临床应答呈正相关。然而，尽管癌症组织中体细胞突变的数量相对较多，但是使用肿瘤反应性T细胞从人类癌症患者中鉴定出的新抗原数量却出乎意料地低。用于T细胞识别的少量的新抗原的分子机制仍然知之甚少。
突变的蛋白质必须自然加工成具有特定MHC-I或-II结合基序的短肽[对于MHC I类分子，通常是9个氨基酸并且对于MHC-II分子是可变长度(13到15个氨基酸)]，并且然后呈递在细胞表面用于T细胞刺激。此外，新抗原与MHC-I或-II分子的结合亲和力是其免疫原性的关键决定因素并且取决于MHC-I(HLA-A、-B和-C)或MHC-II(HLA-DR、-DQ和DP)分子。更重要的是，有越来越多的支持新抗原肽的突变氨基酸增加了肽-MHC复合物的结合亲和力或触发T细胞受体(TCR)通过MHC/肽-TCR接触引发T细胞应答的证据。因此，抗原处理、HLA基因型和TCR可以影响引发针对癌细胞的T细胞应答的新抗原的数量和质量。最近的研究示出，肿瘤细胞可能通过调节抗原处理和HLA等位基因的特异性缺失来发展出多种入侵免疫破坏的策略，从而使它们对免疫疗法敏感或耐药。尽管最近鉴定了许多HLA I类限制性新抗原和其在癌症免疫疗法中的重要性，但越来越多的证据指示，新抗原特异性CD4+T细胞和其同源新抗原在肿瘤消退中起关键作用。然而，由于MHC II分子的开口袋，目前对新抗原的预测程序并不准确，尤其是对于MHC II限制性新抗原，因此限制了鉴定全光谱免疫原性新抗原的能力。
由于突变衍生的新抗原在检查点阻断疗法诱导的肿瘤消退中的重要性，可能需要系统性的方法来鉴定突变衍生的新抗原，以更好地了解T细胞识别库和控制用于T细胞识别的新抗原的数量和质量的潜在机制。此外，在癌症患者中，单个T细胞受体(TCR)是否可以识别两个或两个个新抗原在很大程度上还不清楚。在此研究中描述了系统性的方法以鉴定CD4+和CD8+T细胞识别的所有可能的突变衍生的新抗原，并且通过癌症患者的T细胞系和克隆发现新抗原识别的免疫优势。T细胞克隆分析、细胞内染色和原发性T细胞的TCR谱进一步支持了T细胞的免疫优势新抗原识别。有趣的是，一个单个TCR具有以MHC II限制性方式识别两个新抗原表位的能力，而另一个TCR在它在CD8+T细胞中表达时识别MHC-I限制性新抗原表位，但是在它在CD4+T细胞中表达时识别MHC II限制性新抗原表位。
a)结果
(1)135mel中体细胞突变衍生的新抗原的系统鉴定
为了系统地鉴定被T细胞识别的新抗原的最大数量，原发性肿瘤浸润淋巴细胞(TIL)系由新鲜的癌症组织产生，所述癌症组织已通过手术从两名黑色素瘤患者(#135和#136)中去除。所得的两个TIL细胞系分别由54.5％CD4+、41.9％CD8+T细胞(#135)和82.2％CD4+、17.2％CD8+T细胞(#136)组成并且分别引起针对135mel和136mel肿瘤细胞的肿瘤特异性应答(图1A)。同时，传代了两种衍生自原发性患者肿瘤组织的黑色素瘤细胞系(135mel和136mel)。测试了135TIL和136TIL识别自体肿瘤细胞系(分别为135mel和136mel)的能力以及其它对照细胞，包含同种异体肿瘤细胞系，艾普斯登-巴尔病毒(Epstein-Barr virus)转化的B(EBV-B)细胞和293细胞(图1B)，表明135TIL和136TIL两者是自体肿瘤特异性的。从早期TIL中纯化CD4+和CD8+T细胞群体后，通过有限稀释(0.3细胞/孔)建立肿瘤反应性T细胞克隆，以消除由于它们在本体T细胞中的不同生长特性而导致的肿瘤反应性T细胞的竞争和损失。T细胞克隆在96孔板上的分布是完全无偏置的，从中挑选出每个肿瘤反应性克隆并且进行扩增。测试了CD4+和CD8+T细胞克隆对自体EBV-B细胞、自体肿瘤细胞和其它同种异体肿瘤细胞系的肿瘤反应性，并且发现这些T细胞克隆对自体肿瘤细胞具有特异性，但是对自体EBV-B细胞和其它靶标没有反应。图1C和图2示出了一些代表性的T细胞克隆，指示与它们的亲本T细胞系一样，这些T细胞克隆保持了对自体肿瘤细胞的特异性识别。
对从135mel和135TIL细胞的基因组DNA生成的文库进行全外显子组测序。基于下一代测序结果，在与人类基因组版本19(hg19)进行比对后，分别在135mel和135TIL中区分了大约40,000个单核苷酸变异(SNV)。然后应用多步过滤管道确定SNV频率的下限，去除肿瘤和正常T细胞中的常见变异并且限制SNV型。最后，鉴定了135mel肿瘤细胞特有的232个体细胞错义突变(图3A)。由于目前可用的计算机辅助算法对新抗原的预测较差，因此设计并且构建了含有所有232个突变的24个串联小基因(TMG)文库。每个突变包含在25个氨基酸(aa)肽序列中，突变氨基酸的每侧具有12个氨基酸。将每个TMG具有10个突变的合成TMG克隆到Ii80融合靶向表达载体pTSX中，以有效处理T细胞表位并将其呈递到T细胞用于识别。
为了在肿瘤反应性T细胞识别的TMG中鉴定真正的新抗原，将被工程化为表达MHC-I(HLA-A1、HLA-B8或HLA-C7)和/或MHC-II分子(HLA-DR1、HLA-DR3、HLA-DR4、HLA-DR11和/或HLA-DP4)的HEK293细胞用作人工抗原呈递细胞(APC)。基于患者#135的HLA分型，产生用于MHC-I抗原呈递的293T-A1和293T-B8(其自然表达HLA-C7)和用于MHC-II抗原呈递的293IMDR3/DP4和293IMDR4/DP4(表达各种HLA-DR分子和HLA-DP4)。通过将24种TMG构建体分别转染到293IMDR3/DP4和293IMDR4/DP4细胞中，然后添加CD4+135TIL共培养过夜来针对T细胞识别筛选新抗原。从与293IMDR3/DP4或293IMDR4/DP4细胞(用TMG6、TMG17或TMG18转染)共培养的T细胞中发现了显著的IFN-γ释放(图3B)。为了鉴定单独的抗原，将来自TMG6、17和18的所有单突变(25个aa)亚克隆到同一载体中。在相同的MHC-II APC中，用CD4+肿瘤反应性T细胞测试每个含有单突变的构建体。这些实验导致对CD4+135TIL强烈识别的四种突变衍生的新抗原[TMG6中SPATA13(T>A)，TMG17中PCDHB7(R>C)并且PCDHB16(H>Y)，并且TMG18中ATG5(D>N)]的鉴定(图4A)。接下来，生成了每种突变衍生的新抗原的野生型(WT)对应物并且与突变的构建体一起进行了测试，并且发现135TIL强烈识别了四种新抗原，但不识别WT对应物(图3C)。为了进一步定义这些新抗原的T细胞表位，合成了编码位于突变位点周围的不同13-mer的肽并且测试了135TIL细胞识别。基于它们活化T细胞应答的能力，这些新表位通过一系列T细胞表位的缺失和截短缩小到9-13mer长(图4B)。
为了鉴定MHC-I限制性新抗原，用24个TMG共转染293T-A1或293T-B8细胞，然后与CD8+135TIL细胞共培养，并且发现CD8+135TIL细胞识别293T-B8细胞呈递的TMG1以及293T-A1细胞呈递的TMG14(图3D)。从阳性TMG(含有10个突变)中亚克隆每个突变的进一步实验，鉴定了两种新抗原[TMG1中TXNIP(E>K)以及TMG14中RPN2(L>S)](图3E和图5A)。然而，这些CD8+135TIL细胞对WT对应物没有反应(图3E)。
因为293工程化的APC不表达所有的HLA类型，所以使用永生化自体APC(135EBV-B)作为APC来鉴定不同MHC-I和II分子呈递的所有可能的新抗原。由于EBV-B细胞的转染效率低，产生了24个TMG的体外转录(IVT)RNA并且然后将其电穿孔到135EBV-B细胞中，然后通过添加135TIL细胞用于进行基于细胞因子释放测定的抗原识别。上文所鉴定的所有含有新抗原的TMG对T细胞识别呈阳性反应，但鉴定出EBV-B细胞呈递的一种新的构建体(TMG7)被135TIL强烈识别，指示由人工APC不覆盖的HLA分子呈递的更多新抗原(图3F)。通过TMG亚克隆和重新测试的进一步研究显示，TMG7中的MPG(G>E)是另一种MHC-I呈递的新抗原(图3G和图5B)，而其它阳性TMG与上文所鉴定的相同。使用相同的方法处理MHC-II新抗原，将所有三种MHC-I新抗原进一步定义为9-11mer肽用于进行T细胞识别(图5C)。进行了所有MHC-I和MHC-II新抗原的滴定实验并且示出，肿瘤反应性T细胞以剂量依赖性方式强烈识别这些新抗原肽，但很少识别或不识别WT肽序列(图3H)。
(2)鉴定衍生自135mel肿瘤细胞中替代性开放阅读框和3'UTR区的两种非突变抗原
本文示出肿瘤反应性T细胞能够识别衍生自替代性开放阅读框(ORF)和长非编码基因的T细胞表位。因此，可以从各种来源或机制[如替代性ORF、非编码区(3'和5'UTR、内含子、非编码RNA)]中产生免疫原性抗原。为了探索一些肿瘤反应性T细胞可以识别隐性T细胞表位的可能性，不仅在基于外显子组序列的编码区中，还测试了135mel中建立的CD4+T细胞克隆识别四种新鉴定的MHC-II新抗原的能力，以及CD8+T细胞克隆识别三种MHC-1新抗原的能力。在所有T细胞克隆中，鉴定出两个T细胞克隆识别135mel肿瘤细胞，但对鉴定出的任何新抗原没有反应。图6A示出了代表性数据。所有其它肿瘤反应性CD4+T细胞克隆和CD8+T细胞克隆识别突变衍生的新抗原。这两个T细胞克隆对用24个TMG RNA转染的EBV-B细胞没有反应，指示这些T细胞克隆识别通过其它来源但不是来自编码区的体细胞突变由135mel细胞呈递的抗原肽。为了鉴定被这两个CD4+T细胞克隆识别的这两种抗原，使用实验程序构建了从135mel肿瘤细胞衍生的Ii融合cDNA文库。将Ii融合cDNA文库池(每个池大约100个cDNA克隆)转染到293IMDR3/DP4或293IMDR4/DP4细胞中，然后与CD4+T细胞克隆(135-1C1或135-1E1)共培养。在2×105个cDNA克隆后，基于ELISA的IFN-γ释放，鉴定出分别刺激两个T细胞克隆的阳性cDNA文库池(图6B)。然后将阳性池转化到Stbl3TM大肠杆菌中，并且挑出单个细菌菌落进行质粒DNA分离。在用单个含有cDNA的质粒转染的同一APC中重复筛选测定，并且鉴定了三个能够刺激135-1C1 T细胞的克隆和两个与135-1E1 T细胞反应的克隆(图6C)。每个阳性cDNA克隆的测序和数据库搜索显示135-1C1 T细胞识别相同的抗原，所述抗原具有从ADIPOR2基因的3'UTR翻译的56个aa开放阅读框(ORF)(图6C和图7A)。135-1E1 T细胞反应性cDNA克隆编码从CTAG2(LAGE1b)的替代性阅读框翻译的产物(图6C和图7A)。为了进一步表明这两个T细胞应答的反应性和特异性，ADIPOR2和LAGE1b在Ii融合载体中用其正常阅读框构建，并且发现135-1C1 T细胞克隆仅对从ADIPOR2基因的3'UTR区翻译的肽有反应(图7B)。与之相反，135-1E1 T细胞识别从CTAG2基因的替代性ORF2翻译的基因产物，但对其正常ORF的基因产物没有反应(图7C)。LAGE1是癌症-睾丸抗原，与NY-ESO-1蛋白具有80％以上的氨基酸序列同一性，所述NY-ESO-1蛋白是迄今为止鉴定出的最具免疫原性的肿瘤抗原。为了定义T细胞表位，wee产生了ADIPOR2基因的3'UTR区的一系列缺失和截短，并且将T细胞表位缩小到26个aa肽编码序列，其刺激135-1C1 T细胞应答(图7D)。使用类似的方法，将T细胞表位缩小到LAGE1b替代性ORF2的69个aa肽编码序列用于135-1E1 T细胞识别(图7E)。肽滴定实验示出，135-1C1和135-1E1 T细胞克隆以剂量依赖性方式强烈识别抗原肽，但本体135TIL细胞系示出很少或没有活性(图6D)，指示135-1C1和135-1E1 T细胞克隆在初始T细胞群体中相对较少。综上所述，这些结果指示，这两个肿瘤反应性CD4+T细胞克隆识别从ADIPOR2基因的3'UTR序列或CTAG2基因的替代性ORF翻译的未突变但异常的新抗原肽。
(3)通过肿瘤反应性T细胞系统性鉴定第二患者肿瘤中的新抗原
使用若干种不同的方法(293工程化的APC和B细胞，以及不同的文库)和肿瘤反应性T细胞(TIL系和克隆)，鉴定出6种MHC-II抗(4种突变衍生的新抗原，并且2种来自替代性ORF和3'UTR区)，和135mel肿瘤细胞中的3种MHC-I新抗原。似乎即使有232种体细胞突变，T细胞识别的新抗原的数量也相当有限(表3)。为了扩大发现，对从第二患者肿瘤(136mel)和136TIL细胞(作为对照)中分离的基因组DNA进行了外显子组测序并且鉴定出136个肿瘤细胞特有的348个体细胞突变(图8A)(表4)。在基于体细胞突变的pTSX靶向表达载体中设计并且构建了文库，其含有35个TMG(每个TMG中10个突变)。为了鉴定HLA-DR1呈递的MHC-II新抗原，基于患者#136的HLA分型的DR11和DP4分子，用35个TMG分别转染293IMDR1/DP4和293IMDR11/DP4细胞，然后通过抗体涂覆的磁珠添加从136TIL细胞分离的肿瘤反应性CD4+T细胞。如图8B所示，鉴定出3个TMG(TMG19、TMG31和TMG 32)对293IMDR1/DP4细胞中T细胞识别呈阳性，并且发现能够刺激CD4+T细胞释放293IMDR11/DP4细胞中IFN-γ的一个TMG(TMG32)。将每个阳性TMG的10个小基因亚克隆到pTSX表达载体中后，测试了它们刺激293IMDR1/DP4细胞中T细胞活化的能力，并且在与T细胞共培养过夜后，发现四种新抗原，包含TMG19中ZFYVE1(H>Y)、TMG31中LMAN2(L>R)和MAPK9(W>C)以及TMG32中ANKIB1(P>L)，能够刺激CD4+T细胞以用于IFN-γ释放(图8C和图9A)。与之相反，没有观察到针对对应的WT对应物的明显的T细胞活性(图8C)。因为ANKIB1可以由293IMDR1/DP4和293IMDR11/DP4细胞两者呈递(图8B)，HLA-DP4分子可能呈递ANKIB1以用于T细胞识别。这些结果指示，处理并呈递四种MHC-II限制性新抗原以用于T细胞识别。
表3.在每个TMG中用于筛选的体细胞突变(患者#135)的氨基酸序列
Figure BDA0002833673680000581
Figure BDA0002833673680000591
Figure BDA0002833673680000601
Figure BDA0002833673680000611
Figure BDA0002833673680000621
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表4.在每个TMG中用于筛选的体细胞突变(患者#136)的氨基酸序列
Figure BDA0002833673680000682
Figure BDA0002833673680000691
Figure BDA0002833673680000701
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为了鉴定MHC-I新抗原，MHC-I表达性Cos7细胞是分别利用35个TMG的经过转染的(Cos7-A1、Cos7-B8和Cos7-C7)细胞，然后添加从136个TIL中分离的CD8+T细胞。ELISA分析显示，一个TMG(即TMG2)在活化Cos7-A1中的T细胞应答中呈阳性，但在Cos7-B8或Cos7-C7细胞中则不呈阳性(图8D)。使用单个小基因表达载体的进一步实验鉴定TMG2中的HHAT(G>E)为136mel中的HLA-A1限制性新抗原(图8E和图9B)。为了排除其它MHC-I和II分子也可能呈递新抗原用于T细胞识别的可能性，从患者#136肿瘤样本中生成了成纤维细胞并将其用作APC，以在IFN-γ预处理后表达所有MHC I和II分子(图9C)。将IFN-γ预处理的成纤维细胞通过136mel TMG的IVT mRNA电穿孔，并且然后与136TIL共培养。TMG2、TMG19、TMG31和TMG32在IFN-γ预处理的成纤维细胞中再次被鉴定针对T细胞识别呈阳性，但不使用136TIL鉴定新的TMG(图8F)。
如135mel所示，ADIPOR2和LAGE1b被鉴定为T细胞克隆识别的肿瘤抗原，所述T细胞克隆在本体TIL群体中丰度相对较低。因此，测试了从136TIL产生的T细胞克隆识别新近鉴定的以及未知的新抗原的能力。分别用35个TMG转染293IMDR1/DP4和293IMDR11/DP4细胞，然后与T细胞克隆共培养过夜。发现CD4+136-C13和136-C22T细胞克隆能够识别293IMDR1/DP4细胞呈递的TMG13和TMG8(图8G)。使用单个小基因的进一步实验将TMG13中的C1GALT1C1(L>F)和TMG8中的HSPA13(P>L)鉴定为两种MHC-II新抗原(图8H和图9D)。使用合成的新抗原和其对应的WT肽的滴定实验表明，CD4+136TIL和CD8+136TIL细胞可以分别识别4种MHC II新抗原和一种HLA-A1限制性新抗，而T细胞克隆(136-C13和136-C22)识别两种MHC-II限制性新抗原(图8I)。与之相反，这些T细胞系或克隆示出对它们对应的WT肽(图8I)没有反应性或很少的反应性，指示这些是被肿瘤反应性T细胞识别的真正的新抗原。
(4)通过肿瘤反应性T细胞发现新抗原识别模式的免疫优势
使用系统性和多种方法，在135mel中鉴定出8种癌症新抗原并且在136mel中鉴定出7种新抗原。为了理解抑制可能诱导T细胞应答的新抗原数量的潜在机制，询问这些新抗原是否被T细胞同样识别。为了测试这种可能性，测试了从135TIL建立的78个CD4+肿瘤反应性T细胞克隆的识别新抗原的能力，并且出乎意料地发现78个T细胞克隆中的69个(88％)能够识别293IMDR4/DP4细胞中的PCDHB16新抗原，而3个(3.8％)识别SPATA13，3个(3.8％)识别PCDHB7，并且1个(1.3％)识别ATG5(图10A)，指示PCDHB16新抗原是刺激CD4+T细胞应答的免疫优势新抗原。类似地，测试了40个CD8+肿瘤反应性T细胞克隆的识别MHC-I限制性新抗原(RPN2、MPG和TXNIP)的能力，并且分别发现40个CD8+T-细胞克隆中的27个(67.5％)识别MPG，而40个中的5个(12.5％)识别RPN2并且40个中的8个(20％)识别TXNIP(图10B)，指示MPG是负责CD8+T细胞识别的免疫优势新抗原。
为了排除在T细胞克隆期间中T细胞生长选择可能有助于观察到的免疫优势的可能性，新鲜地产生原发性新抗原特异性T细胞群体(无需长时间培养和扩增)并且在特异性新抗原肽刺激后进行细胞内细胞因子染色，并且发现当用135mel肿瘤细胞刺激时，肿瘤反应性CD4+T细胞群体占总T细胞群体的32.7％。重要的是，PCDHB16新抗原特异性CD4+T细胞群体占总T细胞群体的30.2％(图10C)，这指示92％的肿瘤反应性CD4+T细胞是PCDHB16新抗原特异性T细胞(图10D)。与之相反，其它新抗原(SPATA13、PCDHB7和ATG5)特异性T细胞在肿瘤反应性T细胞中占非常小的的百分比(图10C和10D)。使用类似方法，示出当用135mel肿瘤细胞刺激时，18.8％的肿瘤反应性CD8+T细胞呈递在总T细胞群体中，但12.3％的肿瘤反应性CD8+T细胞会识别MPG新抗原，而2.95和1.54％会分别识别TXNIP和RPN2(图10C)，指示MPG新抗原用作CD8+T细胞应答的免疫优势抗原，其占肿瘤反应性CD8+T细胞的65％(图10D)。这些结果指示，PCDHB16和MPG新抗原分别是大多数CD4+或CD8+肿瘤反应性T细胞识别的免疫优势新抗原。
有趣的是，在第二患者衍生的T细胞(136TIL)中观察到了类似的识别模式用于识别其新抗原。用载有新抗原肽池的成纤维细胞或单个成纤维细胞刺激后，新鲜产生的136TIL群体的细胞内染色示出，CD4+或CD8+肿瘤反应性T细胞分别占总T细胞群体的24.8％和14.6％(图11A)。其中，MAPK9和ANKIB1新抗原特异性CD4+T细胞分别占总T细胞群体的14.3％和5.2％，其分别占总肿瘤反应性CD4+T细胞群体的58％和21％(图11B)。与之相反，其它新抗原特异性CD4+T细胞仅占总T细胞群体中T细胞的小的百分比(图11A)。由于HHAT只是一种MHC-I新抗原，示出当用HHAT肽刺激时，HHAT新抗原特异性CD8+T细胞占总T细胞群体的10.6％(图11A)，其占总肿瘤反应性CD8+T细胞群体的73％(图11B)。综上所述，这些结果指示，突变的MAPK9和ANKIB1抗原是MHC-II限制性免疫优势新抗原，而HHAT是唯一的MHC-I限制性免疫新抗原。
尽管T细胞克隆和细胞内染色分析表明T细胞的免疫优势新抗原识别模式，尚不清楚具有相同或不同TCRα和β链的T细胞是否识别免疫优势新抗原。为了解决这个问题，在刺激的PCDHB16新表位肽脉冲的135EBV-B细胞后，通过FACS分选来自新鲜产生的本体T细胞中的PCDHB16新抗原T细胞，分离出PCDHB16新抗原特异性CD4+T细胞。使用类似的方法，在刺激的MPG新表位肽脉冲的135EBV-B细胞后，还从新鲜产生的本体T细胞中纯化MPG特异性CD8+T细胞。从两个纯化的新抗原特异性T细胞群体以及亲本本体T细胞中分离出基因组DNA，并且将其用作TCRβ链CDR3库扩增的模板。由于单个T细胞中只有一个基因组DNA拷贝，因此特定TCRβ链序列丰度可以表示总T细胞群体中新抗原特异性T细胞的频率。然后用靶向成熟V-D-J重排的T细胞的一组引物扩增TCRβCDR3。将扩增子(来自PCDHB16-、MPG特异性T细胞和本体135TIL)通过下一代测序经受深度测序(每个样品读数>100,000)，然后进行生物信息学分析和TCR谱库比对。去除了所有三个组中功能异常的TCR序列和冗余序列。在测序结果中鉴定具有最高频率(>0.001％)的PCDHB16和MPG新抗原特异性TCR序列(CDR3βVDJ)，并且用于确定总T细胞群中新抗原特异性TCR的相对频率(图10E)。在总135TIL细胞群体中确定了与PCDHB16特异性T细胞和MPG特异性T细胞中的相对TCR序列频率相同的相对TCR序列频率(图10F)。PCDHB16特异性TCR占总135TIL TCR的36％，其接近通过细胞内染色和FACS分析鉴定的32％(图10B和图10F)。MPG特异性TCR占135TIL中总TCR序列的25.5％，其高于通过细胞内染色鉴定的12.3％(图10B和图10F)。应当注意的是，细胞内染色方法鉴定功能性T细胞，而TCR序列分析可能含有功能性TCR和非功能性TCR两者。这些结果指示，即使具有类似序列的一些TCR在T细胞识别测定中可能不起作用，PCDHB16和MPG特异性TCR在总TCR序列中占优势。重要的是，示出相同的新抗原特异性TCR在TCR VβCDR3区(V-J段)展现出强的多样性(图10F、图11C和11D)。这些结果指示，结合PCDHB16和MPG的T细胞以相同的新抗原特异性维持其TCR多样性。综上所述，不同的方法(T细胞克隆分析、细胞内染色以及TCR谱分析)指示癌症患者中T细胞应答和识别中的免疫优势新抗原。
(5)新抗原特异性T细胞在体内和体外对肿瘤细胞的差异识别
为了进一步理解免疫优势新抗原对免疫疗法的原因和影响，推测免疫优势新抗原可能由所有肿瘤细胞高度表达并且呈递，而隐性(亚优势)新抗原由一些但不是全部肿瘤细胞表达并且呈递。为了测试这种可能性，通过在96孔板中进行有限稀释(0.3个细胞/孔)来产生135mel的单个肿瘤细胞克隆。每个克隆从一个单个135mel细胞扩增而来并且然后通过不同的新抗原特异性T细胞克隆测试其识别。如所预期的，PCDHB16特异性T细胞克隆1H1识别生成的每个单个肿瘤细胞克隆，但其它亚优势新抗原特异性T细胞克隆(如对PCDHB7具有特异性的2C10和对SPATA13具有特异性的JF6)仅识别少数单个肿瘤细胞克隆(图12A)。类似地，PCDHB16特异性T细胞克隆示出对135mel本体和克隆的显著CD4+T细胞杀伤活性(图12B)。与之相反，亚优势PCDHB7特异性T细胞克隆示出其对其识别的肿瘤克隆的杀伤活性，但对本体肿瘤细胞的杀伤活性却弱得多或者对其未能识别的肿瘤细胞克隆没有活性(图12B)。令人惊讶的是，从每个肿瘤克隆中分离出基因组DNA并且送去进行桑格测序后，所有的肿瘤克隆在全部三种新抗原中示出基因组突变，这与全外显子组测序的结果相同[PCDHB16(C>T)，PCDHB7(C>T)，SPATA13(A>G)]，而135TIL中的相同位点示出了野生型序列(图12C)。此结果指示，在不同的肿瘤克隆中T细胞识别的丧失不是源自野生型基因的存在，而是功能障碍的抗原处理和突变抗原的呈递。
为了进一步表明不同的新抗原特异性T细胞对单个肿瘤细胞克隆的体内识别，在第0天将135mel细胞注射入NSG小鼠中，然后在第15天用不同的新抗原特异性T细胞克隆(对PCDHB16具有特异性的1H1和对PCDHB7具有特异性的2C10)的过继转移处理。在第15天连续三天给予外源性白介素-2，以维持T细胞增殖和体内存活(图12D)。在第19天(T细胞注射后4天)，检查血清IFN-γ的水平并且发现，与PCDHB7特异性T细胞相比，用优势新抗原PCDHB16特异性T细胞治疗的荷瘤小鼠产生的IFN-γ量更高(图12E)，指示PCDHB16特异性T细胞对135mel肿瘤细胞的强烈体内识别，而PCDHB7特异性T细胞的弱识别。与这些观察一致，发现PCDHB16特异性T细胞显著抑制135mel肿瘤生长，但是PCDHB7特异性T细胞示出弱的抗肿瘤活性(图12F)。这些结果指示，与那些亚优势新抗原特异性T细胞相比，优势新抗原特异性T细胞展现出更强烈的体外和体内肿瘤识别和抗肿瘤免疫性，从而为新抗原特异性免疫疗法提供了合理的设计。
(6)单个TCR对两种新抗原的双重识别
由于相同新抗原的TCR序列多样性大，应当注意优势新抗原PCGHB16的少数肿瘤反应性T细胞克隆具有针对其它新抗原(ADIPOR2)的交叉反应性(图10A)。进一步的实验示出135-4B8 T细胞克隆以剂量依赖性方式识别PCDHB16和ADIPOR2新抗原肽两者(图13A和图14A)。为了排除135-4B8 T细胞克隆含有含一个以上T细胞受体(TCR)或与两个抗原特异性T细胞混合的可能性，从135-4B8 T细胞克隆了TCR(α和β)基因。测序分析显示，这些T细胞表达TRAV8-6和TRBV5-1，指示135-4B8是表达单个TCR的纯T细胞克隆。然后将此TCR的全长α和β链克隆到逆转录病毒载体pMSGV中(图14B)并且转导从健康供体分离出的本体T细胞。在将TCR工程化的T细胞与PCDHB16和ADIPOR2新抗原肽共培养后，示出4B8-TCR转导的T细胞能够识别PCDHB16和ADIPOR2新抗原两者(图13B)。为了确定4B8-TCR是否通过CD4+或CD8+T细胞介导抗原识别，CD4+和CD8+原初T细胞用4B8-TCR转导，并且然后测试其识别靶标新抗原的能力。发现4B8 TCR转导的CD4+T细胞识别PCDHB16和ADIPOR2抗原两者，而4B8-TCR转导的CD8+T细胞则不能这么做(图13C)。
分析了CD4+T细胞克隆135-C76对HLA-DP4分子呈递的PCDHB16新抗原和HLA-A1分子呈递的RPN2新抗原的双重识别(图14C)。流式细胞术分析显示135-C76 T细胞是CD4和CD8双阳性(图13D)。克隆135-C76 TCR(TRAV29、TRBV15)后，将其插入pMSGV逆转录病毒载体以测试其活性。发现含有CD8+和CD4+T细胞群体的135-C76 TCR转导的T细胞能够识别突变的PCDHB16和RPN2新抗原(图13D)。然而，进一步的实验显示，135-C76 TCR转导的CD8+T细胞识别HLA-A1限制性RPN2新抗原，但不识别PCDHB16新抗原(图13E)。与之相反，135-C76 TCR转导的CD4+T细胞识别PCDHB16新抗原，但不识别RPN2新抗原(图13E)。这些结果指示，135-C76TCR可以通过CD8+T细胞识别MHC-I限制性抗原，并且通过CD4+T细胞识别MHC-II限制性新抗原。
(7)敲低CD4+135TIL和其它CD4+T细胞中的ThPOK增加其体外和体内溶细胞活性
CD8+和CD4+T细胞是基于T细胞的抗肿瘤免疫性的主要组分。CD8+T细胞，也被称为细胞毒性T淋巴细胞(CTL)，能够进行MHC-I分子呈递的特异性抗原进行识别并且具有杀死靶细胞的高细胞毒性。CD4+T细胞也示出由MHC-II分子呈递的特异性抗原识别，但杀伤能力比CD8+T细胞低得多。尽管当靶向PCDHB16新抗原时，135TIL的T细胞克隆数据示出相当高的溶细胞活性，但在大多数情况下，CD4+抗原特异性T细胞在识别靶细胞时具有罕见的杀伤能力。因此，重新编程CD4+T细胞并且改善其溶细胞活性将是新的挑战。转录因子T辅助诱导POZ/Krueppel样因子(ThPOK)是CD4+T细胞发育的主要调节因子并且负向调节CD4+T细胞的溶细胞能力。从胸腺迁移后，原初CD4+T细胞维持ThPOK的表达，指示ThPOK仍可以在CD4+T细胞表型和功能的维持中发挥重要作用。
为了解决这个问题，通过有限稀释从135mel癌细胞反应性CD4+TIL产生单个T细胞克隆。用扩增的T细胞克隆进行了那些T细胞克隆的细胞毒性分析，示出每个T细胞克隆中不同的细胞毒性能力(图15A)。接下来，通过定量PCR和蛋白质印迹检查了那些CD4+T细胞克隆中ThPOK在mRNA和蛋白水平两者中的表达(图15B和图15C)。结果示出，mRNA和蛋白质两者的ThPOK表达水平与CD4+T细胞的杀伤能力呈负相关。ThPOK在弱细胞毒性CD4+T细胞克隆(2F8)中高度表达并且反之亦然(1H1)，指示ThPOK负向调节CD4+T细胞的溶细胞活性。
为了消除ThPOK在抗原特异性CD4+人T细胞中的表达，来自人shRNA文库的慢病毒shRNA质粒被应用于降解ThPOK mRNA产生。蛋白质印迹分析证实ThPOK在CD4+135TIL的慢病毒转导后72小时被有效敲低(图16A)。然后在LDH测定(E/T比为5:1到20:1)中比较具有或不具有ThPOK敲低的CD4+135TIL。ThPOK敲低的CD4+TIL在每个E/T点显著具有较高的针对135mel的细胞毒性(高达55％，这超过大多数正常的CD4+T细胞，图16B)。在另一个实验中，三天的培养后，与ThPOK敲低的CD4+TIL一起温育的活135mel细胞的数量比正常CD4+135TIL减少了约20％(图16C)。两项结果表明，体外ThPOK敲低的CD4+135TIL中溶细胞活性的显著改善。还检查了ThPOK敲低的CD4+135TIL中的基因GZMB、PRF1、EOMES、RUNX3和IFN-γ的mRNA水平，这些是T细胞细胞毒性的正调节因子。GzmB、Prf1的显著上调表示T细胞细胞毒性的显著增强(图16D)。尽管IFN-γ的mRNA水平也被上调(图16D)，但通过ELISA未发现蛋白水平的显著变化(图16E)。此外，ThPOK敲低不影响其它CD4+T细胞细胞因子，如IL-4、IL-10和GM-CSF(图16E)。这些结果指示，敲低ThPOK可以增加CD4+T细胞细胞毒性，但在体外维持其CD4+特性。
基于体外结果，将135mel小鼠模型应用于测试体内ThPOK的敲低。将135mel肿瘤细胞接种到NSG小鼠中。在肿瘤接种后第5天，将ThPOK shRNA慢病毒修饰的CD4+135TIL与未修饰的CD4+135TIL和非特异性CD4+T细胞过继转移。从第5天到第25天，观察每组的135mel生长。与未修饰的CD4+135TIL和非特异性CD4+T细胞相比，通过ThPOK敲低的CD4+135TIL处理的肿瘤生长被显著抑制，使得肿瘤大小最小(图17A和图17B)。为了进一步验证ThPOK敲低的CD4+T细胞的体内功能，除135TIL以外还应用了CD4+TCR-T模型。分别在正常人CD4+和CD8+T细胞中逆转录转导靶向MHC-A2呈递的NY-ESO-1的TCR。在NSG小鼠中皮下接种表达NY-ESO-1和MHC-A2(A2ESO)的人前列腺癌细胞系PC3，然后以如上文的类似时间方式注射TCR转导或未转导的CD4+和CD8+T细胞(具有或不具有ThPOK敲低)。有趣的是，发现ThPOK敲低的TCR转导的CD4+T细胞的肿瘤抑制作用与TCR转导的CD8+T细胞的肿瘤抑制作用非常类似，这显著抑制了肿瘤生长，而无特异性的CD4+T细胞和ThPOK表达CD4+TCR-T细胞示出较小的肿瘤抑制作用(图17C和图17D)。所有体内实验证实在肿瘤反应性CD4+T细胞中敲低ThPOK改善T细胞抗肿瘤活性并且减慢NSG小鼠中的肿瘤生长。综上所述，ThPOK在CD4+T细胞中选择性表达，而ThPOK的低水平对应于CD4+T细胞的改善的溶细胞活性，这已在体外和体内实验中得到证实。
(8)ThPOK通过与LSD1相互作用抑制CD4+肿瘤特异性T细胞溶细胞活性
推测由于ThPOK敲低CD4+T细胞杀伤能力的改善是通过表观遗传调节对T细胞重新编程的程序。为了区分ThPOK如何将CD4+T细胞重新编程为溶细胞CD4+T细胞，对通过各种表观遗传抑制剂处理的A2ESO TCR转导的CD4+T细胞进行了筛选。在测量了CD4+TCR-T细胞针对肿瘤的细胞毒性变化后，发现2-PCPA，即赖氨酸特异性组蛋白去甲基化酶1A(LSD1)的抑制剂是唯一一种显著增强CD4+TCR-T细胞的溶细胞活性的抑制剂，其与ThPOK的耗尽类似(图18A)。为了进一步研究ThPOK与LSD1之间的相关性，通过在具有各种表观遗传调节因子和ThPOK的HEK293T宿主细胞中过表达标记的蛋白质来进行免疫沉淀筛选。令人惊讶的是，在所有表观遗传调节因子中，LSD1示出与ThPOK的最强结合(图18B)。LSD1与ThPOK之间的直接相互作用通过原发性人CD4+T细胞中的内源性免疫沉淀进一步证实(图18C)。由于LSD1用作通过修饰其启动子组蛋白甲基化状态来调节靶基因表达，因此通过分别用CD4+和CD8+T细胞中的ThPOK和LSD1抗体拉低结合的DNA来进行CHIP-PCR。检测CD4+T细胞中基因GZMB和PRF1的高水平启动子区显示，ThPOK和LSD1两者仅与CD4+T细胞中的这两个基因的启动子强结合(图18D)。ThPOK和LSD1在GZMB和PRF1的启动子处的共同占用可以阻断这两个关键细胞毒性基因的转录并且剥夺CD4+细胞的溶细胞活性。
(9)2-PCPA对LSD1的抑制正向调节干细胞样记忆T细胞的生成
为了鉴定干细胞样记忆T细胞(Tscm)的产生和维持的关键调节因子，建立了直接在离体原发性人T细胞上工作的体外小分子筛选平台。简而言之，用板结合的OKT3活化T细胞并且用包含不同代谢物和抑制剂的小分子对其进行处理。改变培养基的一半体积，并且每2或3天添加代谢物或抑制剂。在第12天，通过用关键记忆标记物CD45RO、CCR7和CD62L染色来检测CD4+和CD8+T细胞群体的记忆表型。通过流式细胞术将此平台中的Tscm子集鉴定为CD45RO-、CCR7+和CD62L+群体。在不含有原初T细胞的活化T细胞中，这三个标记物能够鉴定三个记忆T细胞子集：Tscm、Tcm和Tem(卢利(Lugli)等人，2013)。此平台不包含毒性极强且显著抑制T细胞生长的小分子。通过这种T细胞培养方法，T细胞显著分化并且可以获得CD4+和CD8+T细胞两者中非常有限的Tscm细胞百分比。2-PCPA，即LSD1的抑制剂，被鉴定为Tscm产生的唯一一种正调节因子，其增加CD4+和CD8+T细胞两者中Tscm的数量(图19A)。为了进一步证实CD45RO-CCR7+CD62L+群体是真正的Tscm细胞，在CD45RO-CCR7+CD62L+群体中分析了其它2个Tscm标记物CD45RA和CD95并且发现在这2个标记物中细胞呈几乎100％阳性(图19B)，验证了Tscm群体的纯度。总之，示出2-PCPA有效促进在CD4+和CD8+T细胞两者中的Tscm产生。
(10)2-PCPA在TCR-T和CAR-T细胞中对LSD1的抑制增加体内和体外T细胞抗肿瘤活性
为了测试2-PCPA处理对LSD1的抑制如何影响TCR-T细胞，在TCR-T细胞生成开始时直接施用了2-PCPA(8uM)。在第2天和第3天用被PG13-A2ESO TCR克隆包装的A2ESO TCR病毒转导活化的人T细胞。结果示出，2-PCPA处理增加A2ESO TCR-T细胞的Tscm和Tcm两者百分比，指示较低分化的表型(图20A)。为了研究2-PCPA处理后A2ESO TCR-T细胞的功能变化，进行了细胞内染色(ICS)以检查靶向IL-2、IFN-γ和TNF-α的效应细胞因子的表达。有趣的是，尽管2-PCPA处理维持较低分化的表型中的A2ESO TCR-T细胞，没有减少但稍微增加了具有多功能细胞因子分泌的A2ESO TCR-T细胞的频率(图20B)。由于高增殖潜能是Tscm细胞的关键特征，通过使用CFSE染色和用IL-2或231-ESO细胞刺激A2ESO TCR-T细胞进行的体外增殖测定证实了2-PCPA处理的A2ESO TCR-T细胞的此特征(图20C)。较低分化的T细胞的另一个关键特征是增强的氧化代谢和线粒体呼吸能力。还报告了LSD1抑制上调肌生细胞中的氧化代谢基因(安安(Anan)等人，2018)。结果还示出，2-PCPA处理使A2ESO TCR-T细胞具有增加的氧化代谢和提高的备用呼吸能力(SRC)(图20D)。
2-PCPA处理的A2ESO TCR-T细胞的体外结果示出较低分化的记忆表型和增加的功能和增殖，试图测试2-PCPA处理的A2ESO TCR-T细胞的体内作用。使用表达HLA-A2和NY-ESO-1抗原的MDA-MB-231细胞在8周龄的NOD-scid IL2Rγnull(NSG)小鼠中建立乳腺癌模型。通过2-PCPA处理显著增强A2ESO TCR-T细胞的体内抗肿瘤功能(图20E)。通过确定过继转移后T细胞的记忆表型，发现在对照A2ESO TCR-T细胞中Tscm群体几乎检测不到，而2-PCPA处理的A2ESO TCR-T细胞在Tscm和Tcm细胞两者中维持较高的频率(图14F)。这些结果指示2-PCPA处理促进具有更高增殖潜能和自我更新能力的A2ESO TCR-T细胞中的Tscm产生。
为了确定2-PCPA处理对CAR-T细胞以及TCR-T细胞是否也有效，当产生CAR-T细胞时，应用2-PCPA处理。用CD19特异性嵌合抗原受体(CAR)转导活化T细胞，所述受体拥有由PG13克隆包装的CD28共刺激结构域病毒。记忆表型分析示出2-PCPA处理类似地增加了较低分化的记忆T细胞子集的频率(图21A)。代谢重新编程作用与其对A2ESO TCR-T细胞的作用一致(图21B)。体外存活测定示出，2-PCPA处理的CAR-T细胞在无IL-2的条件下比对照CAR-T细胞存活得更好(图21C)。然而，这种作用在2-PCPA处理的A2ESO TCR-T细胞上未见到。接下来，在有或没有2-PCPA处理的情况下观察到CAR-T细胞的体内增殖。CAR和萤光素酶两者被转导到活化T细胞中并且转移到已注射Raji淋巴瘤细胞的NSG小鼠中。体内成像示出，2-PCPA处理的CAR-T细胞生长得快于对照CAR-T细胞(图21D)。为了进一步证实体内成像的结果，处死小鼠并且检查脾脏中是否存在人T细胞(图21E)。这些结果表明2-PCPA处理促进CAR-T细胞的体外和体内抗肿瘤功能。
b)讨论
此处提出的发现鉴定了针对突变衍生的新抗原的T细胞反应性的独特模式；也就是说，大多数肿瘤反应性CD4+或CD8+T细胞识别优势新抗原，而T细胞很少识别若干种其它新抗原。有趣的是，在患者#135的情况下，示出大多数肿瘤反应性CD4+或CD8+TIL群体/T细胞克隆分别识别衍生自体细胞错义突变的新抗原，这通过FACS和TCR测序分析来表明。重要的是，与亚优势/隐性新抗原特异性T细胞克隆相比，优势新抗原特异性T细胞示出对单个肿瘤细胞克隆更好的识别和杀伤能力，暗示优势新抗原特异性T细胞可以在检查点免疫疗法中在肿瘤消退中发挥关键作用。尽管两个肿瘤反应性CD4+T细胞克隆不识别突变衍生的新抗原，所述肿瘤反应性CD4+T细胞克隆对衍生自ADIPOR2 mRNA的3'UTR区的基因产物的新表位或从LAGE1b基因的替代性ORF翻译的新表位没有反应。因此，衍生自mRNA的异常翻译的基因产物可以用作癌细胞中的新抗原。与之相反，发现所有的肿瘤反应性CD8+T细胞克隆识别衍生自体细胞错义突变的新抗原。对另一个黑色素瘤患者(患者#136)中的新抗原的进一步的研究显示与黑色素瘤患者#135中所见的新抗原识别模式类似的新抗原识别模式，指示尽管能够引发特定T细胞应答的新抗原在癌症患者中可能有所不同，但在同一类型癌症内，新抗原特异性应答和识别模式的调节和控制似乎是一致的。
在自身免疫性疾病和传染性疾病中已经报告了免疫优势抗原和隐性抗原，所述研究指示类似的机制可以对癌症新抗原产生应答。在这项研究中，生成了从单细胞生长的肿瘤克隆并且通过识别T细胞克隆检查了在肿瘤克隆上的特异性新抗原呈递。数据证实，新抗原的呈递水平在一个肿瘤组织中会变化并且通常会有大多数肿瘤细胞呈递的少量新抗原，从而诱导其特异性T细胞向原发性肿瘤反应性T细胞中的最大群体扩增。这些优势新抗原是用于基于T细胞的免疫疗法的理想靶标并且比那些亚优势新抗原在肿瘤抑制和消除中贡献更大，这已在体外和体内研究中得到证实。
已报告单个TCR识别传染性疾病和自身免疫性疾病中的多种抗原，但是尚未表明单个TCR可以识别双重癌症新抗原。通过利用具有肿瘤反应性单个T细胞克隆，本文提供了明确的证据：单个TCR可以识别由相同MHC II分子呈递的两种新抗原，而没有氨基酸序列类似性。令人惊讶的是，135-C76 T细胞的单个TCR在转导到CD4+T细胞中时识别HLA-DR4分子呈递的PCDHB16新抗原，而当在CD8+T细胞上表达时，相同的TCR仅对HLA-A1分子呈递的RPN2新抗原有反应。因此，具有双重新抗原特异性的TCR的使用可以增强用于基于TCR的癌症免疫疗法中的T细胞的效力。
c)方法
(1)人类样品
根据批准的休斯顿卫理公会(Houston Methodist)的机构审查委员会(IRB)协议，从黑色素瘤患者(#135和#136)获得新鲜的肿瘤组织。两名患者均为HLA型(#135：HLA-A1、B8、C7、DR3、DR4、DP4；#136：HLA-A1、B8、C7、DR1、DR11、DP4)。
(2)原发性和细胞系
除非另有说明，否则所有细胞在37℃下通过5％CO2生长。生成患者的黑色素瘤细胞系(135mel和136mel)并且在具有10％(v/v)胎牛血清(Valley生物医学公司(ValleyBiomedical Inc.))的RPMI 1640培养基(飞世尔科技公司(Fisher scientific))中扩增，所述胎牛血清补充有1％(v/v)青霉素-链霉素(赛默飞世尔科技公司(Thermo FisherScientific))。
建立了所有类型的含有人T细胞的细胞，包含外周血单核细胞(PBMC)、肿瘤浸润淋巴细胞(135TIL和136TIL)、T细胞克隆等并且维持在含有具有10％(v/v)人AB血清(康宁公司(Corning))的RPMI 1640培养基的T细胞培养基(TCM)中，补充有1％(v/v)HEPES(赛默飞世尔科技公司)、1％(v/v)GlutaMAX(赛默飞世尔科技公司)和0.1％(v/v)2-巯基乙醇(赛默飞世尔科技公司)，补充有重组人白介素-2(IL-2，300IU/ml)(派普泰克公司(Peprotech))。
将衍生自患者#135的艾普斯登-巴尔病毒转化的B(EBV-B)细胞培养在具有10％(v/v)胎牛血清的RPMI 1640培养基中，补充有1％(v/v)青霉素-链霉素。
将衍生自患者#136的成纤维细胞在具有10％(v/v)胎牛血清(FBS)且含有1％青霉素-链霉素的杜氏改性伊格尔培养基(Dulbecco's Modified Eagle Medium)(DMEM)(飞世尔科技公司)中进行培养。
生成了基于HEK293的抗原呈递细胞(APC)，包含293IMDR3/DP4、293IMDR4/DP4、293IMDR1/DP4、293IMDR11/DP4，并且将其维持在具有10％(v/v)FBS且含有1％(v/v)青霉素-链霉素的杜氏DMEM中。将HEK293T细胞、239T-HLA-A1和293T-HLA-B8细胞维持在具有10％(v/v)胎牛血清且含有1％(v/v)青霉素-链霉素的DMEM中。
将Cos-7细胞在具有10％(v/v)胎牛血清且含有1％(v/v)青霉素-链霉素的DMEM中培养。
将Phoenix-AMPHO细胞在具有10％(v/v)胎牛血清且含有1％(v/v)青霉素-链霉素的DMEM中培养。
(3)T细胞克隆和T细胞扩增
进行T细胞克隆和扩增。简而言之，通过在96孔板中进行有限稀释(0.3个细胞/孔)来产生135TIL的T细胞克隆。辐照(60Gy)来自正常供体的同种异体PBMC并且然后将其作为饲养细胞(7×104/孔)接种在含有35ng/ml OKT3(抗hCD3抗体)(R&D系统公司(R&DSystems))和35ng/ml抗hCD28抗体(R&D系统公司)的TCM中。在第1天，将重组IL-2添加到300IU/ml的最终浓度。在第5天，将一半培养基替换为含有重组IL-2的新鲜TCM，并且然后每隔一天或当培养基颜色变为黄色时更换培养基。在第14天，对T细胞克隆进行采集、计数、测试肿瘤反应性。进一步扩增肿瘤反应性T细胞克隆。
针对T细胞扩增，将2.5×105个T细胞转移到具有20ml TCM的25ml烧瓶中。添加2×107个经辐照的PBMC(60Gy)和5×106个经辐照的EBV-B细胞(210Gy)作为饲养细胞。将OKT3和抗hCD28抗体添加到35ng/ml的最终浓度。在第1天，将重组白介素-2添加到300IU/ml的最终浓度。从第5天开始，如上文所描述的更换培养基。在第14天，对扩增的T细胞进行采集、计数并在液氮中恢复直到使用。
(4)T细胞反应性测定
在37℃下用含有50μg/ml聚L-赖氨酸(密理博西格玛公司(Millipore Sigma))的磷酸盐缓冲盐水(PBS,GenDEPOT)涂覆96孔组织培养板。10分钟后，将板用PBS冲洗两次。将肿瘤细胞或293-APC以5×104/孔接种在96孔板中并且在37℃、5％CO2下培养至少4小时。对于质粒转染，根据制造商的说明，用0.5μl脂质体2000(赛默飞世尔科技公司)将250ng质粒DNA转染到每孔293-APC中，并且37℃下在5％CO2中温育过夜。为了肽呈递，将合成的肽(GeneScript)在102到10-4μM的不同最终浓度下添加到每个孔中，并且在37℃、5％CO2下温育。用TCM洗涤质粒转染或用肽脉冲的细胞两次，并且然后与T细胞(1×105/孔)共培养。培养过夜后，收集50μl上清液用于通过ELISA测定测量细胞因子释放。
将96孔微孔板(葛莱娜第一生化公司(Greiner Bio-one))用每孔50μl含有抗人IFN-γ(赛默飞世尔科技公司，第一抗体，1μg/ml)的PBS涂覆并且在4℃下温育过夜。用PBS洗涤三次后，将每个孔用200μl PBS中1％(w/v)牛血清白蛋白(BSA)封闭并且在室温下温育至少1小时。用PBS洗涤三次后，将50μl培养上清液或人IFN-γ标准品(派普泰克公司)在PBS中的不同浓度下添加到每个孔中并且在室温下温育1小时。洗涤三次后，将2％(v/v)含有FBS的PBS缓冲液中的50μl生物素标记的抗人IFN-γ抗体(赛默飞世尔科技公司，第二抗体，1:1000稀释)添加到每个孔，并且然后在室温下温育1小时。将96孔板用含有1％(v/v)Tween-20的PBS洗涤六次。然后每孔添加50μl含有1％(w/v)BSA的PBS中1:5000稀释的多HRP链霉亲和素(赛默飞世尔科技公司)，并且在黑暗中在室温下温育30分钟。用含有1％(v/v)Tween-20的PBS洗涤六次后，每孔添加100μl3,3',5,5'-四甲基联苯胺底物溶液(TMB，密理博西格玛公司)，并且在室温下温育10分钟。通过添加50μl 2.5M H2SO4终止显色反应。在OD450 nm处读取所述板。通过标准读数计算IFN-γ的浓度。
(5)肿瘤和对照细胞的全外显子组测序
通过标准方案进行全外显子组测序。简而言之，使用Quick-DNATM小量制备试剂盒(齐莫研究公司(Zymo Research))提取135mel和135TIL的基因组DNA。通过Illumina HiSeq3000的标准程序进行DNA文库构建、外显子组捕获和测序。平均读数约为每个碱基覆盖范围的150倍。从每个测序样品中获得超过80亿个序列数据的碱基。处理来自Illumina的输出以产生BAM文件，其含有对NCBI人类参考基因组Build hg19(具有经过良好校准的质量评分)的对齐读取。参考先前的报告检测到体细胞突变并且在通过以下参数过滤后确定：过滤出TIL测序中的变体；读取深度>10；1000个人基因组频率<0.01；错义突变。最后，鉴定了串联小基因构建的体细胞突变。
(6)通过T细胞进行串联小基因(TMG)的构建和筛选
串联小基因构建体被设计成编码10个含有突变的肽(两侧带有12个氨基酸)。优化了用于双应变核苷酸合成的密码子，以避免用于克隆的EcoRI和XhoI位点。然后将合成的串联小基因(集成DNA技术公司(Integrated DNA Technologies))克隆到pTSX表达载体中，与Ii80开放阅读框进行框内融合。
如上文T细胞反应性测定中所描述的进行针对TMG的抗原特异性T细胞的筛选。简而言之，分别根据患者的HLA分型在人工APC中用脂质体2000转染TMG。将经过转染的细胞与肿瘤反应性T细胞共培养过夜并且在第二天通过ELISA确定每个孔中上清液中的IFN-γ释放。
(7)TMG的体外转录
使用HiScribeTMT7 ARCA mRNA试剂盒(新英格兰生物公司(New EnglandBiolabs))的标准方案进行TMG的体外转录(IVT)。简而言之，通过切割XhoI(新英格兰生物公司)将每个TMG构建体线性化并且用DNA回收试剂盒(齐莫研究公司)凝胶纯化。线性化DNA(1μg)分别用作RNA合成的模板并且按照试剂盒说明与T7 RNA聚合酶和反应缓冲液在20μl的混合物混合。将反应在37℃下温育至少30分钟。然后通过添加2μl DNase I去除DNA模板并且在37℃下温育15分钟。接下来，按照试剂盒说明，通过将IVT反应与Poly(A)聚合酶和反应缓冲液混合并且在37℃下温育30分钟来完成poly(A)加尾反应(50μl)。
按照试剂盒说明，通过向反应中添加1/2体积的LiCl来纯化每个5'封端和3'加尾的IVT-RNA。在-20℃下温育30分钟后，将RNA在4℃下高速旋转沉降15分钟，并且然后将沉淀物用500μl冷的70％乙醇洗涤并风干。最后将沉淀物重悬并且溶解于合适的RNA储存溶液中。
(8)通过T细胞进行EBV-B细胞的电穿孔和筛选
按照
Figure BDA0002833673680000961
细胞系
Figure BDA0002833673680000962
试剂盒V(龙沙集团(Lonza))的修改方案进行电穿孔。简而言之，将1×105个EBV-B细胞旋转沉降并重悬于50μl电穿孔溶液(
Figure BDA0002833673680000963
溶血:补充物＝9:2)中并且立即转移到试剂盒附带的100μl比色皿中。将500ng TMG的IVT-RNA分别添加到比色皿中。通过将比色皿放入NucleofectorTM2b装置并且运行预设程序(T-020)来完成电穿孔。
将电穿孔的EBV-B细胞在37℃下在生长培养基中培养过夜并且然后如上文所描述的与肿瘤反应性T细胞共培养。在第二天通过ELISA确定每个孔的上清液中的IFN-γ释放。
(9)通过T细胞进行Ii80-cDNA文库构建和筛选
针对cDNA文库构建和筛选，根据制造商的说明，用TRIzol试剂(赛默飞世尔科技公司)提取了135mel肿瘤细胞的总RNA。从总RNA中进一步纯化mRNA，并且使用带有低聚核苷酸-dT引物的cDNA构建试剂盒(赛默飞世尔科技公司)转化为cDNA。与衔接子连接后，将cDNA克隆到在克隆位点的上游含有Ii80片段的pTSX载体中，并且然后转化到Stbl3TM大肠杆菌(赛默飞世尔科技公司)中。将cDNA细菌文库分为多个池，每个池由大约100个cDNA克隆组成。从细菌中分离每个质粒池并且用0.5μl脂质体2000转染到每孔基于293的APC中，并且在37℃下，5％CO2下温育过夜。温和洗涤后，将经过转染的细胞与T细胞克隆(1×105/孔)共培养过夜。通过ELISA基于来自T细胞的细胞因子释放来鉴定阳性池。挑选用阳性池质粒DNA转化的细菌菌落并且准备用于DNA分离。重复数百个单个菌落用于通过T细胞进行筛选。对阳性克隆进行测序以鉴定被T细胞识别的靶抗原。
(10)IFN-γ的细胞内染色
用各种体外方法刺激T细胞，如肿瘤细胞、编码新抗原的肽或DNA等，并且诱导释放细胞因子。对于微孔板(或对于试管，250μl)，将刺激的T细胞重悬于每孔100μl Cytofix/Cytoperm溶液(BD生物科学公司)中，并在4℃下温育20分钟以进行细胞固定。通过在1×Perm/Wash缓冲液(BD生物科学公司)中洗涤两次来透化固定的细胞。然后将固定/透化的细胞彻底重悬于50μl含有1μl藻红蛋白(PE)缀合的IFN-γ抗体(赛默飞世尔科技公司)的1×Perm/Wash缓冲液中，并且在黑暗中在4℃下温育30分钟。之后，将细胞用1×Perm/Wash缓冲液洗涤两次并且准备用于流式细胞术分析。
(11)活细胞IFN-γ染色
细胞因子分泌测定-检测试剂盒(MACS美天旎生物科技公司(Miltenyi Biotec))基于商业方案用于细胞表面IFN-γ染色。简而言之，用生长培养基洗涤1×106个T细胞并且以300×g旋转沉降10分钟，并且然后重悬于100μl含有5％人血清的生长培养基中。将经洗涤的细胞转移到96孔板的一个孔中并且添加抗原肽到1-10μg/ml的浓度，并且在37℃下在5％CO2中温育3到6小时。在体外刺激T细胞后，将T细胞转移到15ml可封闭试管中并且用1ml冷缓冲液(含有2％FBS(v/v)和5mM EDTA的冷PBS)洗涤并旋转沉降。将细胞沉淀物重悬于90μl的冷生长培养基中并且添加10μl的IFN-γ捕获试剂，并在冰上温育5分钟。之后，在试管中添加1ml的温暖培养基(37℃)并且将细胞在密闭试管中在37℃下在缓慢连续旋转下温育45分钟。温育后将试管转移到冰上并且用冷缓冲液洗涤细胞并旋转沉降。将细胞沉淀物重悬于90μl的冷缓冲液中并且然后添加10μl的IFN-γ检测抗体，并在冰上温育10分钟。最后，将细胞用冷缓冲液洗涤并且准备用于流式细胞术分析。
(12)肿瘤细胞克隆
在胰蛋白酶消化后，以1.5个细胞/ml的密度，将135mel肿瘤细胞悬浮于1XKeratinocyte-SFM和补充剂(赛默飞世尔科技公司)中，其具有另外的10％(v/v)胎牛血清和1％(v/v)青霉素-链霉素，然后将200μl的混合物每孔添加到96孔板中，并且在37℃，5％CO2下温育。在第5天，在显微镜下观察后标记含有单个菌落的孔。在第10天，用新鲜培养基更换所述培养基。将所述板温育直到第20天。胰蛋白酶消化标记孔中的肿瘤克隆，并且然后分别在更大的烧瓶中扩增。
(13)细胞毒性测定
CytoTox
Figure BDA0002833673680000981
非放射性细胞毒性测定试剂盒(普洛麦格(Promega))应用于测量T细胞-肿瘤细胞毒性。简而言之，T细胞(效应子)和肿瘤细胞(靶标)在TCM中以2:1到20:1的E/T比混合，然后在96孔板中在37℃，5％CO2下以100μl/孔共培养至少4小时。温育后，使用试剂盒按照制造商的说明测量每个孔的上清液中的乳酸脱氢酶(LDH)浓度，并且计算细胞毒性百分比。
(14)体内基于T细胞的过继性抗肿瘤测定
从杰克逊实验室(Jackson Laboratories)获得的NSG小鼠(雌性)是6到8周龄。所有NSG小鼠相关的实验是在休斯顿卫理公会在特定无病原体条件下在动物收容所进行的。所有动物研究按照NIH指南所指导的进行，并且得到休斯顿卫理公会动物护理和使用委员会(Animal Care and Use Committee of Houston Methodist)的批准。
在NSG小鼠中进行135mel肿瘤系的皮下注射，以构建用于基于T细胞的过继性疗法的动物模型(每组4只小鼠)。简而言之，每只小鼠在第0天注射3×106个135mel细胞。在第15天，以每只小鼠107个T细胞静脉内注射不同的新抗原特异性T细胞克隆，然后在第15、16和17天每只小鼠腹膜内注射5×104单位白介素-2。在第19天收集每只荷瘤小鼠的IFN-γ血清水平并且通过ELISA测量。跟踪每只小鼠中135mel的生长直到第40天。
(15)TCRβCDR3库分析
TCRβCDR3分析参考先前的描述(罗宾斯(Robins)等人，2009)。通过活细胞IFN-γ染色对肽刺激的TIL本体进行流式细胞术分选后，分离出新抗原特异性T细胞。根据商业方案，使用Quick-DNATM小量制备试剂盒(齐莫研究公司)从经过分选的T细胞中分离出基因组DNA。分离的基因组DNA用作模板，用于成熟T细胞中重排的TCRβCDR3的PCR扩增。用16ng/μl基因组DNA模板、1μM正向BV引物组和1μM反向BJ引物组(表5)、10×反应缓冲液和0.2μlAccuPrime Taq DNA聚合酶HF(赛默飞世尔科技公司)建立50μl PCR混合物。PCR进行了35个循环(95℃下30秒、59℃下30秒以及68℃下1分钟)。PCR扩增子通过DNA回收试剂盒(齐莫研究公司)凝胶纯化并且发送用于扩增子下一代测序(金唯智公司(Genewiz))。测序结果通过实验室管道进行分析，以用于进行数据过滤和TCR库比对。
表5：TCRβCDR3扩增的引物
Figure BDA0002833673680000991
Figure BDA0002833673680001001
表6：135TIL中优势新抗原特异性T细胞TCRβCDR3中V-J接头的氨基酸序列
Figure BDA0002833673680001002
潜在功能的MPG反应性TCR的氨基酸序列(CDR3β)
Figure BDA0002833673680001003
Figure BDA0002833673680001011
V片段、接头(-NDN-)和J片段是单个连续序列的部分。此处描绘了每个序列以强调不同的片段。
(16)TCRα/β链可变区和全长TCRα/β链克隆
通过三轮嵌套PCR从单个T细胞扩增TCRα/β链可变区(CDR3)。使用OneStep RT-PCR试剂盒(凯杰公司(Qiagen))在25μl反应和以下引物中进行第一单步RT-PCR(表7)：mixα1(混合的38种引物，各自10μM)和pCα1(TCRα)、mixβ1(混合的36种引物，各自10μM)和pCβ1(TCRβ)。添加含有至少一个T细胞的2μl PBS作为DNA模板。根据制造商的说明，通过逆转录(50℃，30分钟)进行单步RT-PCR，然后进行PCR 25循环(94℃下30秒，62℃下1分钟以及72℃下1分钟)。按照制造商的说明，使用KOD热启动DNA聚合酶(密理博西格玛公司)进行第二和第三PCR反应。在25μl反应中，添加1μl第一轮PCR产物作为第二轮PCR的模板。使用以下引物进行第二轮PCR(表7)：mixα2(混合的36种引物，各自10μM)和pCα2(TCRα)、mixβ2(混合的36种引物，各自10μM)和pCβ2(TCRβ)25个循环(94℃下30秒，64℃下1分钟以及70℃下1分钟)。在25μl反应中，添加1μl第二轮PCR产物作为第三轮PCR的模板。使用以下引物进行第三轮PCR(表7)：pF3和pCα3(TCRα)、pF3和pCβ3(TCRβ)35个循环(94℃下30秒，64℃下1分钟以及70℃下1分钟)。最终的PCR扩增子被凝胶纯化(齐莫研究公司)并测序(金唯智公司)。通过使用在线工具V-QUEST(IMGT)和Igblast(NCBI)进行搜索来确定TCR的基因型。
表7.用于TCRα/β链可变区(CDR3)扩增的引物
Figure BDA0002833673680001012
Figure BDA0002833673680001021
Figure BDA0002833673680001031
Figure BDA0002833673680001041
Figure BDA0002833673680001051
Figure BDA0002833673680001061
一旦确定了TCRα/β链可变区，就使用对前导序列和恒定区具有特异性的引物扩增全长TCRα/β链。根据制造商的说明，使用KOD热启动DNA聚合酶(密理博西格玛公司)进行扩增完整TCRα-或β链的PCR和随后的重叠PCR。在25μl反应中，与引物一起添加1μl cDNA作为模板：pLα-P2A(基于TCR基因型)、用于扩增全长α链或pLβ的pRCα(基于TCR基因型)和用于扩增全长β链的pRCβ-P2A。PCR进行了20个循环(94℃下30秒、64℃下1分钟并且70℃下1分钟)。在25μl重叠PCR反应中混合2μl TCRα和2μl TCRβ链PCR产物。还添加了引物pLβ和pRCα。重叠PCR进行了30个循环(94℃下30秒、60℃下1分钟以及70℃下90秒)。重叠PCR产物(～1.5kb)用DNA回收试剂盒(齐莫研究公司)凝胶纯化并且用
Figure BDA0002833673680001062
HiFi DNA组合主混合物(新英格兰生物公司)克隆到pMSGV载体。
(17)原初T细胞中TCR的逆转录病毒转导
将编码全长TCR的pMSGV DNA转染到Phoenix-Ampho细胞(ATCC)中以产生逆转录病毒。简而言之，将6孔组织培养板在37℃下用聚L-赖氨酸(PBS中50μg/ml)涂覆10分钟并且用PBS冲洗一次。将Phoenix-Ampho细胞以每孔1.5×106接种到涂覆的板上并且用含有1％青霉素-链霉素的10％(v/v)胎牛血清在37℃，5％CO2下在DMEM中培养。四小时后，将4μgpMSGV质粒用10μl脂质体2000转染到每个孔中。转染后6小时更换培养基并且在转染后48或60小时收集逆转录病毒上清液。
为了制备活化的原初T细胞，将24孔组织培养板用每孔含有0.5μg/ml OKT3的1mlPBS涂覆，并且在4℃下温育过夜。用PBS冲洗所述板一次后，添加正常供体的PBMC或珠纯化的T细胞(1.0×106/孔)并且在37℃，5％CO2下在含有300IU/ml IL-2的TCM中培养48小时。用TCM洗涤两次后，将OKT3刺激的T细胞准备用于转导。
为了活化T细胞的逆转录病毒转导，在转导前1天，每孔用0.5ml人重组RetroNectin(宝生物公司(Takara)，PBS中10μg/ml)涂覆24孔非组织培养板(康宁公司)，并且在4℃下温育过夜。去除RetroNectin后，在室温下用PBS中的2％(w/v)BSA封闭板30分钟。然后将板用含有2.5％(v/v)HEPES的PBS洗涤两次。将Phoenix-Ampho细胞的逆转录病毒上清液添加到RetroNectin涂覆的板中(每孔2.5ml)。将板在2000×g，32℃下离心2小时。丢弃病毒上清液后，将OKT3刺激的T细胞添加到板中(5×105/孔)并且在37℃，5％CO2下在含有150IU/ml IL-2的TCM中培养过夜。如上文所描述的，用新鲜的逆转录病毒上清液和RetroNectin涂覆的板进行第二轮转导。在转导后72小时将转导的T细胞准备用肿瘤细胞或293APC进行测定。
(18)统计
使用GraphPad Prism(GraphPad软件)通过学生t检验计算组之间的比较。P<0.05被认为是统计学上显著的。
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Claims (45)

1.一种从人类受试者的癌症中鉴定新抗原的方法，所述方法包括
a.对来自癌细胞的核酸样品进行全外显子组测序；
b.将序列映射到参考基因组序列；
c.过滤序列变异以去除肿瘤和正常细胞中的常见变异；
d.产生包括至少一种不常见的氨基酸变异和一或多种侧翼氨基酸的一或多种单突变肽构建体；
e.合成编码步骤d的一或多种单突变肽构建体的一或多种小基因；
f.将一或多种小基因转染到一或多种表达MHCI类或MHCII类分子的细胞或细胞系中；
g.将一或多种T细胞或T细胞系与步骤f)的所述经转染细胞共培养；
h.测量所述经共培养的T细胞或T细胞系的T细胞活性；以及
i.在诱导T细胞活性的经转染细胞系中测定来自每个小基因的单突变肽单独诱导T细胞活性的能力。
2.根据权利要求1所述的方法，其进一步包括将所述突变映射到特定的肽表位。
3.根据权利要求1或2所述的方法，其进一步包括测定所述肽表位的HLA限制。
4.根据权利要求1所述的方法，其中所述参考基因组是人类基因组。
5.根据权利要求1所述的方法，其中所述单突变构建体包括所述突变的任一侧上的至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24或25个氨基酸。
6.根据权利要求1所述的方法，其中所述小基因包括至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24或25个单突变构建体。
7.根据权利要求1所述的方法，其中表达MHC I类或II类分子的所述一或多种细胞或细胞系被工程化以表达MHC分子。
8.根据权利要求7所述的方法，其中所述经工程化的细胞是工程化HK293细胞、293T细胞、MA104细胞、CHO细胞、成纤维细胞、B细胞、VERO细胞、马丁-达比狗肾MDCK细胞、HEp-2细胞、HeLa细胞、MRC-5细胞、WI-38细胞、EB66或PER C6细胞。
9.根据权利要求1所述的方法，其中所述T细胞活性是通过ELISA、ELISpot、细胞内细胞因子染色、MHC I类四聚体染色、MHC II类四聚体染色、流式细胞术或铬释放测量的。
10.根据权利要求1所述的方法，其中所测量的所述T细胞活性是细胞因子释放。
11.根据权利要求10所述的方法，其中所测量的细胞因子释放是IFN-γ、TGF-β、淋巴毒素-α、IL-2、IL-4、IL-10、IL-17或IL-25。
12.根据权利要求1所述的方法，其中所述癌症选自由以下组成的群组：B细胞淋巴瘤、T细胞淋巴瘤、蕈样真菌病、霍奇金氏病、髓细胞性白血病、膀胱癌、脑癌、神经系统癌症、头颈癌(head and neck cancer)、头颈部鳞状细胞癌、肺癌(lung cancer)、小细胞肺癌、非小细胞肺癌、神经母细胞瘤、胶质母细胞瘤、卵巢癌、胰腺癌、前列腺癌(prostate cancer)、皮肤癌、黑色素瘤、基底细胞癌、鳞状细胞癌、肝癌、口腔、咽喉、喉部和肺的鳞状细胞癌、宫颈癌(cervicalcancer/cervical carcinoma)、乳腺癌、肾癌、泌尿生殖系统癌症、肺癌(pulmonary cancer)、食管癌、头颈癌(head and neck carcinoma)、大肠癌、造血系统癌症；睾丸癌；结直肠癌、前列腺癌(prostatic cancer)、AIDS相关的淋巴瘤或AIDS相关的肉瘤。
13.一种刺激针对癌症的免疫应答的方法，所述方法包括向受试者施用包括治疗有效量的通过根据权利要求1所述的方法鉴定的新抗原的组合物。
14.一种用于治疗癌症的组合物，所述组合物包括治疗有效量的一或多种新抗原。
15.根据权利要求14所述的组合物，其中所述新抗原包括肽、多肽或蛋白质。
16.一种用于治疗癌症的组合物，所述组合物包括治疗有效量的一或多种编码一或多种新抗原的小基因mRNA。
17.一种用于治疗癌症的组合物，所述组合物包括治疗有效量的一或多种嵌合抗原受体CAR T细胞、T细胞受体TCR T细胞和/或肿瘤浸润性淋巴细胞TIL；其中所述CAR T细胞、TCR T细胞和/或TIL已被工程化以表达新抗原的受体。
18.根据权利要求14到17所述的组合物，其中所述新抗原选自由以下中所示的氨基酸组成的新抗原的群组：SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:12、SEQ ID NO:14、SEQ ID NO:17、SEQ ID NO:19、SEQ ID NO:21、SEQ ID NO:22、SEQ ID NO:23、SEQ ID NO:24、SEQ ID NO:26、SEQ IDNO:28、SEQ ID NO:29、SEQ ID NO:30、SEQ ID NO:32、SEQ ID NO:33、SEQ ID NO:34、SEQ IDNO:35、SEQ ID NO:36、SEQ ID NO:37、、SEQ ID NO:39、SEQ ID NO:41、SEQ ID NO:42、SEQID NO:43、SEQ ID NO:44、SEQ ID NO:46、SEQ ID NO:49、SEQ ID NO:50、SEQ ID NO:51、SEQID NO:52、SEQ ID NO:53、SEQ ID NO:54、SEQ ID NO:57、SEQ ID NO:60、SEQ ID NO:61、SEQID NO:62、SEQ ID NO:63、SEQ ID NO:64、SEQ ID NO:67、SEQ ID NO:68、SEQ ID NO:69、SEQID NO:70、SEQ ID NO:73、SEQ ID NO:74、SEQ ID NO:76、SEQ ID NO:78、SEQ ID NO:80、SEQID NO:82、SEQ ID NO:84、SEQ ID NO:86、SEQ ID NO:88、SEQ ID NO:89、SEQ ID NO:90、SEQID NO:91、SEQ ID NO:92、SEQ ID NO:93、SEQ ID NO:94、SEQ ID NO:95、SEQ ID NO:96、SEQID NO:97、SEQ ID NO:98、SEQ ID NO:99、SEQ ID NO:100、SEQ ID NO:101、SEQ ID NO:102、SEQ ID NO:103、SEQ ID NO:104、SEQ ID NO:105、SEQ ID NO:106、SEQ ID NO:107、SEQ IDNO:108、SEQ ID NO:109、SEQ ID NO:110、SEQ ID NO:111、SEQ ID NO:112、SEQ ID NO:113、SEQ ID NO:114、SEQ ID NO:115、SEQ ID NO:116、SEQ ID NO:117、SEQ ID NO:118、SEQ IDNO:119、SEQ ID NO:120、SEQ ID NO:121、SEQ ID NO:122、SEQ ID NO:123、SEQ ID NO:124、SEQ ID NO:125、SEQ ID NO:126、SEQ ID NO:127、SEQ ID NO:128、SEQ ID NO:129、SEQ IDNO:130、SEQ ID NO:131、SEQ ID NO:132、SEQ ID NO:133、SEQ ID NO:134、SEQ ID NO:135、SEQ ID NO:136、SEQ ID NO:137、SEQ ID NO:138、SEQ ID NO:139、SEQ ID NO:140、SEQ IDNO:141、SEQ ID NO:142、SEQ ID NO:143、SEQ ID NO:144、SEQ ID NO:145、SEQ ID NO:146、SEQ ID NO:147、SEQ ID NO:148、SEQ ID NO:149、SEQ ID NO:150、SEQ ID NO:151、SEQ IDNO:152、SEQ ID NO:153、SEQ ID NO:154、SEQ ID NO:155、SEQ ID NO:156、SEQ ID NO:157、SEQ ID NO:158、SEQ ID NO:159、SEQ ID NO:160、SEQ ID NO:161、SEQ ID NO:162和/或SEQID NO:163。
19.一种治疗受试者的癌症的方法，所述方法包括向所述受试者施用根据权利要求14到18中任一权利要求所述的组合物。
20.一种包括氨基酸序列AEPKRKSSLFWHAFNRLTPFRK(SEQ ID NO:2)的多肽或其包括至少9个氨基酸的片段，其中所述多肽的任何片段至少包括序列LFWHAFNRL(SEQ ID NO:7)。
21.根据权利要求20所述的多肽，其中所述多肽包括选自由以下组成的群组的氨基酸序列：LFWHAFNRL(SEQ ID NO:7)、SSLFWHAFNRLTP(SEQ ID NO:4)、RKSSLFWHAFNRL(SEQ IDNO:3)、RKSSLFWHAFNRLTPFR(SEQ ID NO:6)和LFWHAFNRLTPFR(SEQ ID NO:5)。
22.一种包括氨基酸序列FQLLLEKPFQIFCAELWVRDINDHA(SEQ ID NO:9)的多肽或其包括至少13个氨基酸的片段，其中所述多肽的任何片段至少包括序列LEKPFQIFCAELW(SEQ IDNO:12)。
23.根据权利要求22所述的多肽，其中所述多肽包括所述氨基酸序列LEKPFQIFCAELW(SEQ ID NO:12)。
24.一种包括氨基酸序列ENSPLGTEFPLNYALDLDVGSNNVQ(SEQ ID NO:14)的多肽或其包括至少13个氨基酸的片段，其中所述多肽的任何片段至少包括序列LGTEFPLNYALDL(SEQ IDNO:17)。
25.根据权利要求24所述的多肽，其中所述多肽包括所述氨基酸序列LGTEFPLNYALDL(SEQ ID NO:17)。
26.一种包括氨基酸序列MTDDKDVLRNVWFGRIPTCFT(SEQ ID NO:19)的多肽或其包括至少11个氨基酸的片段，其中所述多肽的任何片段至少包括序列KDVLRNVWFGR(SEQ ID NO:23)。
27.根据权利要求26所述的多肽，其中所述多肽包括选自由以下组成的群组的氨基酸序列：KDVLRNVWFGR(SEQ ID NO:23)、DDKDVLRNVWFGR(SEQ ID NO:22)、KDVLRDVWFGRIP(SEQID NO:21)和DDKDVLRNVWFGRIP(SEQ ID NO:24)。
28.一种包括氨基酸序列RLKASLDRPFTNSESAFYSIVGLSS(SEQ ID NO:26)的多肽或其包括至少11个氨基酸的片段，其中所述多肽的任何片段至少包括序列PFTNSESAFYS(SEQ IDNO:27)。
29.根据权利要求28所述的多肽，其中所述多肽包括氨基酸序列DRPFTNSESAFYS(SEQID NO:28)。
30.一种包括氨基酸序列GSGEKVAGRVIVKVCEVTRVKAVRI(SEQ ID NO:32)的多肽或其包括至少9个氨基酸的片段，其中所述多肽的任何片段至少包括序列RVIVKVCEV(SEQ ID NO:36)。
31.根据权利要求30所述的多肽，其中所述多肽包括选自由以下组成的群组的氨基酸序列：KVAGRVIVKVCEV(SEQ ID NO:33)、AGRVIVKVCEVTR(SEQ ID NO:34)、KVAGRVIVKVCEVTRVK(SEQ ID NO:37)和RVIVKVCEVTRVK(SEQ ID NO:35)。
32.一种包括氨基酸序列YGMYFCMNISSQEDGACVLLRALEP(SEQ ID NO:39)的多肽或其包括至少10个氨基酸的片段，其中所述多肽的任何片段至少包括序列ISSQEDGACV(SEQ IDNO:43)。
33.根据权利要求32所述的多肽，其中所述多肽包括选自由以下组成的群组的氨基酸序列：MNISSQEDGACVL(SEQ ID NO:41)、ISSQEDGACVLLR(SEQ ID NO:42)、MNISSQEDGACVLLR(SEQ ID NO:44)、ISSQEDGACVL(SEQ ID NO:132)、ISSQEDGACVLL(SEQ ID NO:133)、NISSQEDGACV(SEQ ID NO:134)、NISSQEDGACVL(SEQ ID NO:135)、NISSQEDGACVLL(SEQ IDNO:136)、NISSQEDGACVLLR(SEQ ID NO:137)和MNISSQEDGACVLL(SEQ ID NO:138)。
34.一种包括氨基酸序列MKLTSLMCNPVKSPFFGCVCGHVPISMCVSTCSSLPTASCALDLTVLAENSHQVGA(SEQ ID NO:46)的多肽或其包括至少26个氨基酸的片段，其中所述多肽的任何片段至少包括序列VSTCSSLPTASCALDLTVLAENSHQV(SEQ ID NO:60)。
35.根据权利要求34所述的多肽，其中所述多肽包括选自由以下组成的群组的氨基酸序列：MCNPVKSPFFGCVCGHVPISMCVSTCSSLPTASCALDLTVLAENSHQVGA(SEQ ID NO:49)、KSPFFGCVCGHVPISMCVSTCSSLPTASCALDLTVLAENSHQVGA(SEQ ID NO:50)、GCVCGHVPISMCVSTCSSLPTASCALDLTVLAENSHQVGA(SEQ ID NO:51)、GHVPISMCVSTCSSLPTASCALDLTVLAENSHQVGA(SEQ IDNO:52)、SMCVSTCSSLPTASCALDLTVLAENSHQVGA(SEQ ID NO:53)、VSTCSSLPTASCALDLTVLAENSHQVGA (SEQ ID NO:54)、MCNPVKSPFFGCVCGHVPISMCVSTCSSLPTASCALDLTVLAENSHQV(SEQ ID NO:57)、VSTCSSLPTASCALDLTVLAENS HQVG(SEQ ID NO:139)、CVSTCSSLPTASCALDLTVLAENSHQV(SEQ ID NO:140)、MCVSTCSSLPTASCALDLTVLAENSHQV(SEQ ID NO:141)、MCVSTCSSLPTASCALDLTVLAENSHQVG(SEQ ID NO:142)、SMCVSTCSSLPTASCALDLTVLAENSHQV(SEQ ID NO:143)和SMCVSTCSSLPTASCALDLTVLAENSHQVG(SEQ ID NO:144)。
36.一种包括氨基酸序列MLMAQEALAFLMAQGAMLAAQERRVPRAAEVPGAQGQQGPRGREEAPRGVRMAVPLLRRMEGAPAGPGGRTAACLSCTSRCLSRRPWKRSWSAGSCPGMPHRSPDQGRF(SEQ ID NO:67)的多肽或其包括至少61个氨基酸的片段，其中所述多肽的任何片段至少包括序列VPRAAEVPGAQGQQGPRGREEAPRGVRMAVPLLRRMEGAPAGPGGRTAACLSCTSRCLSRR(SEQ ID NO:73)。
37.根据权利要求36所述的多肽，其中所述多肽包括选自由以下组成的群组的氨基酸序列：QERRVPRAAEVPGAQGQQGPRGREEAPRGVRMAVPLLRRMEGAPAGPGGRTAACLSCTSRCLSRRPWKR(SEQ ID NO:74)，
RVPRAAEVPGAQGQQGPRGREEAPRGVRMAVPLLRRMEGAPAGPGGRTAACLSCTSRCLSRR(SEQ ID NO:145)，
RRVPRAAEVPGAQGQQGPRGREEAPRGVRMAVPLLRRMEGAPAGPGGRTAACLSCTSRCLSRR(SEQ IDNO:146)，
ERRVPRAAEVPGAQGQQGPRGREEAPRGVRMAVPLLRRMEGAPAGPGGRTAACLSCTSRCLSRR(SEQ IDNO:147)，
QERRVPRAAEVPGAQGQQGPRGREEAPRGVRMAVPLLRRMEGAPAGPGGRTAACLSCTSRCLSRR(SEQ IDNO:148)，
RVPRAAEVPGAQGQQGPRGREEAPRGVRMAVPLLRRMEGAPAGPGGRTAACLSCTSRCLSRRP(SEQ IDNO:149)，
RRVPRAAEVPGAQGQQGPRGREEAPRGVRMAVPLLRRMEGAPAGPGGRTAACLSCTSRCLSRRP(SEQ IDNO:150)，
ERRVPRAAEVPGAQGQQGPRGREEAPRGVRMAVPLLRRMEGAPAGPGGRTAACLSCTSRCLSRRP(SEQ IDNO:151)，
QERRVPRAAEVPGAQGQQGPRGREEAPRGVRMAVPLLRRMEGAPAGPGGRTAACLSCTSRCLSRRP(SEQ IDNO:152)，
RVPRAAEVPGAQGQQGPRGREEAPRGVRMAVPLLRRMEGAPAGPGGRTAACLSCTSRCLSRRPW(SEQ IDNO:153)，
RRVPRAAEVPGAQGQQGPRGREEAPRGVRMAVPLLRRMEGAPAGPGGRTAACLSCTSRCLSRRPW(SEQ IDNO:154)，
ERRVPRAAEVPGAQGQQGPRGREEAPRGVRMAVPLLRRMEGAPAGPGGRTAACLSCTSRCLSRRPW(SEQ IDNO:155)，
QERRVPRAAEVPGAQGQQGPRGREEAPRGVRMAVPLLRRMEGAPAGPGGRTAACLSCTSRCLSRRPW(SEQID NO:156)，
RVPRAAEVPGAQGQQGPRGREEAPRGVRMAVPLLRRMEGAPAGPGGRTAACLSCTSRCLSRRPWK(SEQ IDNO:157)，
RRVPRAAEVPGAQGQQGPRGREEAPRGVRMAVPLLRRMEGAPAGPGGRTAACLSCTSRCLSRRPWK(SEQ IDNO:158)，
ERRVPRAAEVPGAQGQQGPRGREEAPRGVRMAVPLLRRMEGAPAGPGGRTAACLSCTSRCLSRRPWK(SEQID NO:159)，
QERRVPRAAEVPGAQGQQGPRGREEAPRGVRMAVPLLRRMEGAPAGPGGRTAACLSCTSRCLSRRPWK(SEQID NO:160)，
RVPRAAEVPGAQGQQGPRGREEAPRGVRMAVPLLRRMEGAPAGPGGRTAACLSCTSRCLSRRPWKR(SEQ IDNO:161)，
RRVPRAAEVPGAQGQQGPRGREEAPRGVRMAVPLLRRMEGAPAGPGGRTAACLSCTSRCLSRRPWKR(SEQID NO:162)，
ERRVPRAAEVPGAQGQQGPRGREEAPRGVRMAVPLLRRMEGAPAGPGGRTAACLSCTSRCLSRRPWKR(SEQID NO:163)，
EALAFLMAQGAMLAAQERRVPRAAEVPGAQGQQGPRGREEAPRGVRMAVPLLRRMEGAPAGPGGRTAACLSCTSRCLSRRPWKRSWSAGSCPGMPHRSP(SEQ ID NO:61)，
EALAFLMAQGAMLAAQERRVPRAAEVPGAQGQQGPRGREEAPRGVRMAVPLLRRMEGAPAGPGGRTAACLSCTSRCLSRRPWKRSWSAGSCPGM(SEQ ID NO:62)，
EALAFLMAQGAMLAAQERRVPRAAEVPGAQGQQGPRGREEAPRGVRMAVPLLRRMEGAPAGPGGRTAACLSCTSRCLSRRPWKRSWSAG(SEQ ID NO:63)，
EALAFLMAQGAMLAAQERRVPRAAEVPGAQGQQGPRGREEAPRGVRMAVPLLRRMEGAPAGPGGRTAACLSCTSRCLSRRPWKR(SEQ ID NO:64)，
LMAQGAMLAAQERRVPRAAEVPGAQGQQGPRGREEAPRGVRMAVPLLRRMEGAPAGPGGRTAACLSCTSRCLSRRPWKRSWSAGSCPGMPHRSPDQGRF(SEQ ID NO:68)，
AMLAAQERRVPRAAEVPGAQGQQGPRGREEAPRGVRMAVPLLRRMEGAPAGPGGRTAACLSCTSRCLSRRPWKRSWSAGSCPGMPHRSPDQGRF(SEQ ID NO:69)，以及
QERRVPRAAEVPGAQGQQGPRGREEAPRGVRMAVPLLRRMEGAPAGPGGRTAACLSCTSRCLSRRPWKRSWSAGSCPGMPHRSPDQGRF(SEQ ID NO:70)。
38.一种包括SEQ ID NO:76中所示的氨基酸序列的多肽。
39.一种包括SEQ ID NO:78中所示的氨基酸序列的多肽。
40.一种包括SEQ ID NO:80中所示的氨基酸序列的多肽。
41.一种包括SEQ ID NO:82中所示的氨基酸序列的多肽。
42.一种包括SEQ ID NO:84中所示的氨基酸序列的多肽。
43.一种包括SEQ ID NO:86中所示的氨基酸序列的多肽。
44.一种包括SEQ ID NO:166中所示的氨基酸序列的多肽。
45.一种分离的核酸，其编码根据权利要求19到44中任一权利要求所述的多肽。
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