IT202000006973A1 - Antigeni herv tumore-specifici e loro uso nella immunoterapia del cancro - Google Patents
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Description
Descrizione di Brevetto per Invenzione Industriale avente per titolo:
?ANTIGENI HERV TUMORE-SPECIFICI E LORO USO NELLA IMMUNOTERAPIA DEL CANCRO?.
DESCRIZIONE
La presente invenzione concerne antigeni HERV (human endogenous retroviruses) tumore-specifici e loro uso nella immunoterapia del cancro. In particolare, la presente invenzione concerne epitopi HERV espressi solo da cellule tumorali e che, in combinazione con farmaci epigenetici, possono essere utilizzati in terapie vaccinali contro il tumore.
L'immunoterapia del cancro pu? essere classificata in strategie passive e attive, queste ultime essendo specifiche o non specifiche [1]. L'immunoterapia passiva o "adottiva" si basa sulla somministrazione di anticorpi antitumorali o sul trasferimento di linfociti reattivi tumorali. L'immunoterapia attiva ? mirata sia a stimolare nell?ospite una risposta immunitaria de novo specifica contro antigeni tumorali selezionati, impiegando vaccini terapeutici anti-cancro, sia ad amplificare la risposta immunitaria anti-tumorale esistente, somministrando molecole o adiuvanti pro-infiammatori non specifici. In questo contesto, considerando i risultati deludenti ottenuti fino ad ora con tali strategie, la ricerca di antigeni tumorali specifici e selettivi per lo sviluppo di vaccini tumorali ? l'obiettivo principale per diversi gruppi di ricerca e aziende leader nel settore sanitario.
In questa prospettiva, la ricerca di antigeni tumorali umani come potenziali bersagli per l'immunoterapia del cancro ha portato alla scoperta di diverse molecole principalmente o selettivamente espresse su cellule tumorali. Infatti, solo in questo modo gli antigeni tumorali usati nei vaccini possono essere in grado di rompere la tolleranza immunitaria, senza indurre reazioni collaterali patologiche di tipo autoimmunitario [2,3].
Gli antigeni tumorali si distinguono in antigeni associati a tumori (Tumor associated antigens ? TAAs) e in antigeni specifici tumorali (Tumor specific antigens ? TSAs). Uno dei limiti possibili dei TAAs ? che possono essere presenti anche su cellule normali, sebbene con bassi livelli di espressione e, di conseguenza, possono essere soggetti a meccanismi di tolleranza immunitaria sia centrali sia periferici [4]. Pertanto, dovrebbero essere disegnati analoghi peptidici sostituendo uno o due residui amminoacidici nella sequenza dell'epitopo per migliorarne l'antigenicit? e l'immunogenicit? [5].
D?altro canto, i TSAs sono antigeni presenti solo sulle cellule tumorali perch? derivanti da processi biologici specifici del processo neoplastico. Un particolare gruppo di TSAs sono neoantigeni derivanti da mutazioni non sinonime correlate al cancro o da altre alterazioni genetiche che danno luogo a peptidi mutati presentati dall'HLA (human leukocyte antigen) sulla superficie cellulare al sistema immunitario. I neoantigeni sono teoricamente i bersagli terapeutici pi? interessanti perch? sono diversi dalla linea germinale e visti come ?non self? dal sistema immunitario. Di conseguenza, le reazioni immunitarie dirette verso i neoantigeni non sono soggette a tolleranza centrale e periferica [6]. Tuttavia, tali neoantigeni mutati sono strettamente individuali (privati) e la loro identificazione richiede una combinazione di procedure di screening genomica, proteomica e immunomica che attualmente non pu? essere applicata su larga scala [7-9]. Inoltre, l'efficacia di un approccio cos? altamente personalizzato ? ridotta probabilmente dall'elevato tasso mutazionale di tumori che determina la costante generazione di nuovi neoantigeni mutati bersaglio e una conseguente evasione immunitaria del cancro.
Una differente categoria di TSAs include gli antigeni derivanti dalla trascrizione dei geni dei retrovirus endogeni (HERV). Infatti, gli HERV, sebbene rappresentino circa l?8% dell?intero genoma cellulare, sono normalmente trascrizionalmente inattivi. Quindi, i loro antigeni sono considerati non self dal nostro sistema immunitario e non sono soggetti al fenomeno della tolleranza immunitaria [10]. Di conseguenza, i TSAs derivati dagli HERV, rispetto a quelli derivati da mutazioni, avrebbero il vantaggio essenziale di non essere personalizzati perch? condivisi tra tutti i pazienti affetti dalla stessa patologia oncologica o da patologie oncologiche differenti in cui sono espressi gli stessi HERV [11].
I retrovirus sono virus ad RNA che si replicano attraverso un intermedio del DNA e si integrano permanentemente nel genoma di un ospite. Dopo l'integrazione iniziale, il provirus ? anche capace di retrotrasposizione, che ha l'effetto di amplificare il numero di copie (100-1000) del provirus nel genoma ospite. Tali provirus possono diventare incompetenti per la replicazione per l?accumulo di delezioni e mutazioni non-senso all'interno del genoma virale. In tal modo, il provirus si fissa nel genoma umano e i retrovirus "endogenizzati" non sono pi? in grado di causare l?infezione orizzontale di un altro ospite e sono riclassificati come HERV. Oltre ad acquisire ampie delezioni e mutazioni all'interno del genoma provirale, gli HERV subiscono il silenziamento trascrizionale attraverso la metilazione del DNA e il rimodellamento della cromatina [12].
Esistono circa 40 gruppi di HERV indipendenti e filogeneticamente distinti categorizzati nel genoma umano [13]. Sono ancora in corso studi per comprendere se gli HERV hanno un ruolo attivo nell'inizio o progressione del cancro o se invece sono il risultato di un effetto secondario del cambiamento epigenetico all?interno della cellula tumorale [14]. In generale, ? probabile che la regolazione differenziale degli HERV nelle cellule tumorali sia un risultato dell?instabilit? genomica globale dei tumori che porta all'ipometilazione del DNA e al rimodellamento della cromatina. Tali cambiamenti epigenetici possono esporre e rendere disponibili le Long Terminal Repeats (LTRs) degli HERV, che sono normalmente trascrizionalmente silenti, con il risultato di una maggiore trascrizione e traduzione dei geni retrovirali [15].
Sebbene gli HERV non siano pi? competenti per la replicazione, possono avere effetti significativi sui livelli di trascrizione di geni cellulari e pathways oncogenici mediante inserimento degli LTR vicino a protooncogeni [16]. Infatti, ? stato dimostrato che le proteine HERV interagiscono con altre proteine citosoliche inclusi i zinc fingers motifs su geni onco-soppressori [17] e sono coinvolte nell'evasione immunitaria del tumore [18]. Inoltre, le proteine HERV sono anche immunogeniche, come dimostrato da una significativa attivazione della risposta immunitaria adattativa nei confronti delle proteine HERVs nel tessuto tumorale e nel siero di pazienti oncologici.
? riportato in letteratura che il trattamento di cellule tumorali con farmaci epigenetici, come ad esempio gli inibitori della DNA metiltransferasi o inibitori della istone deacetilasi, deregola il pattern trascrizionale cellulare, con l?attivazione di differenti geni, tra cui quelli degli HERV, che sono normalmente inattivi. Tale effetto non ? evidente nelle cellule normali perch? non sono in attiva fase di replicazione.
Di conseguenza, l?attivazione trascrizionale indotta dal trattamento con farmaci epigenetici induce nelle cellule tumorali l?espressione di un ampio spettro di ?neo-antigeni? (antigeni normalmente non espressi dalle cellule) derivanti sia dalle sequenze dei geni HERV (gag, pol, env) sia dalle sequenze di geni cellulari regolati dalle LTRs degli HERV. La seconda categoria di geni non ? predittibile a causa della inserzione random delle LTR nel genoma, e quindi sarebbero neo-antigeni pazienti specifici. Di contro, i neoantigeni derivanti dalle sequenze dei geni HERV possono rappresentare un target ottimale condiviso tra tutti i pazienti affetti da una stessa patologia oncologica o tra tutti i pazienti affetti da differenti patologie oncologiche in cui sono espressi gli stessi HERV [11].
Differenti classi di HERV sono state associate a diverse patologie oncologiche per le quali possono svolgere un ruolo sia come potenziali marcatori tumorali sia come target immunologici. Il tumore al seno e il melanoma sono le neoplasie per cui vi sono evidenze sperimentali pi? solide, ma sono disponibili prove documentate anche sul ruolo dell'attivit? degli HERV nel cancro del colon-retto, cancro del pancreas, cancro epatocellulare, cancro della prostata e cancro ovarico [19]. Per quanto riguarda il tumore del fegato, l?unico lavoro presente in letteratura descrive l?espressione dell?HERV-K (HML-2) che sembra essere correlato con la prognosi della malattia [20].
Fra i tumori sopra elencati, il carcinoma epatocellulare (HCC) ? la terza principale causa di morte per cancro a livello globale. Il tasso di incidenza standardizzato per et? (ASR) dell'HCC negli uomini in Europa, adeguato alla popolazione standard europea, ? di circa 8 su 100.000 (http://globocan.iarc.fr/). L'infezione cronica da virus dell'epatite B e C (HBV e HCV) ? il principale fattore di rischio per lo sviluppo di HCC [21]. Le terapie per HCC dipendono dallo stadio della malattia con un tasso di sopravvivenza a 5 anni estremamente variabile [22]. La chirurgia rappresenta il trattamento standard per HCC nelle prime fasi con un tasso di sopravvivenza a 5 anni del 70% tra i pazienti trattati [23,24]. Terapie loco-regionali non chirurgiche sono implementate per i pazienti HCC che mostrano una malattia pi? avanzata, con tassi di sopravvivenza variabili da 3 a 5 anni [25] e recidiva del tumore in pi? del 50% dei pazienti a 5 anni dopo il trattamento [26]. Il Sorafenib ed il Lenvatinib rappresentano l'unica terapia sistemica approvata nell'HCC non resecabile avanzato, che fornisce un beneficio di sopravvivenza molto limitato [27]. Recentemente, lo studio RESORCE (Regorafenib dopo Sorafenib in pazienti con carcinoma epatocellulare) ha dimostrato che Regorafenib pu? essere usato come trattamento di seconda linea in pazienti con stadio avanzato di carcinoma epatico che non hanno risposto al trattamento con Sorafenib. Sebbene lo studio abbia mostrato solo un modesto miglioramento di 2,8 mesi nella sopravvivenza globale, con una riduzione del 38% del rischio di morte, questo ? stato il primo studio a mostrare i benefici di un trattamento di seconda linea in HCC [28]. In tale scenario, le strategie di immunoterapia per HCC possono rappresentare uno strumento terapeutico chiave per migliorare l'esito clinico nei pazienti con carcinoma epatocellulare. In particolare, i vaccini terapeutici contro il cancro potrebbero essere molto promettenti. Questo ? un campo di ricerca ancora aperto, dato che solo pochissimi studi sul vaccino contro il cancro per HCC sono stati condotti finora con risultati ancora modesti [29].
Alla luce di quanto esposto sopra, appare evidente la necessit? di disporre di nuove terapie e composti antitumorali in grado di superare gli svantaggi delle terapie e composti noti.
Secondo la presente invenzione, sono stati ora individuati nuovi antigeni tumore-specifici, ossia espressi soltanto in cellule tumorali e che non sono soggetti a fenomeni di tolleranza immunitaria centrale e periferica. Gli antigeni della presente invenzione mostrano il vantaggio di non essere strettamente specifici per un singolo paziente, ma di essere condivisi tra tutti i pazienti affetti dalla stessa patologia oncologica.
Gli antigeni, e in particolare gli epitopi, secondo la presente invenzione, sono in grado di legare le molecole di MHC (major histocompatibility complex), in particolare HLA. Nello specifico, secondo la presente invenzione, sono stati individuati peptidi HERV tumore-specifici, in particolare della superfamiglia HERV-K, che rappresentano epitopi in grado di legare MHC, pi? specificatamente HLA e, pi? in particolare, diversi tipi di HLA di classe I.
Come descritto nella parte sperimentale, gli epitopi specifici per proteine HERV associati a differenti HLA di classe I secondo la presente invenzione sono stati individuati mediante un?analisi di predizione antigenica per gli HLA di classe I pi? frequenti nella popolazione mondiale (effettuata con l?algoritmo NetMHCPan http://www.cbs.dtu.dk/services/NetMHCpan/). Vantaggiosamente, tali epitopi risultano essere condivisi tra il 70 e il 75% dei campioni analizzati.
Secondo la presente invenzione, i peptidi tumore-specifici individuati possono essere vantaggiosamente utilizzati in terapie vaccinali antitumorali, in combinazione con farmaci epigenetici. In breve, la somministrazione di un vaccino comprendente uno o pi? peptidi secondo la presente invenzione avrebbe l?effetto di stimolare il sistema immunitario contro tali peptidi. Successivamente, la somministrazione di un farmaco epigenetico indurrebbe una riprogrammazione del profilo trascrizionale e traduzionale della cellula tumorale, inducendo l?espressione di tali epitopi da parte della cellula tumorale, che verrebbero quindi prontamente riconosciuti dal sistema immunitario con conseguente effettiva eliminazione da parte della immunit? antitumorale indotta dal vaccino. Vantaggiosamente, secondo la presente invenzione, possono essere somministrati come vaccino i peptidi tal quali, oppure i peptidi in forme ottimizzate, come ad esempio fusi ad anticorpi in grado di riconoscere cellule presentanti l?antigene (APC), come le cellule dendritiche, oppure i peptidi possono essere somministrati in forme alternative, come ad esempio acidi nucleici codificanti per detti peptidi, o vettori comprendenti detti acidi nucleici o direttamente cellule, ad esempio APC, che esprimono i peptidi. Inoltre, secondo la presente invenzione, detti epitopi o peptidi possono vantaggiosamente essere utilizzati per stimolare cellule T ex vivo e poi reinfondere dette cellule T nel paziente dopo la somministrazione del farmaco epigenetico.
Infine, secondo la presente invenzione ? possibile somministrare una cellula T ingegnerizzata per esprimere un recettore (CAR-T cell) in grado di riconoscere gli antigeni tumore specifici espressi a seguito della somministrazione di un farmaco epigentico.
La presente invenzione verr? ora descritta, a titolo illustrativo, ma non limitativo, secondo sue forme preferite di realizzazione, con particolare riferimento alle figure dei disegni allegati, in cui:
la figura 1 mostra il Saggio di binding ad HLA-A*02:01. Peptidi HERV predetti per legare agli HLA indicati sono stati messi a reagire con cellule T2, positive per HLA*02:01, in cui non ? funzionante il pathway per la presentazione degli antigeni intracellulari. L?HLA ?, quindi, in grado di legare solo epitopi forniti dall?esterno. I risultati mostrano che solo gli epitopi HERV predetti specifici per l?HLA*02:01 si legano all?HLA espresso dalle cellule T2, che risulta evidenziabile da anticorpi specifici. La figura 2 mostra il Saggio di stabilit? ad HLA-A*02:01. La stabilit? del legame dei peptidi HERV predetti all?HLA*02:01 delle cellule T2 ? stata verificata valutando nel tempo i livelli di espressione dell?HLA sulla superficie cellulare. Per tutti i peptidi HERV predetti per legare l?HLA*02:01 si nota un tempo di dimezzamento pari a circa 6 ore.
La figura 3 mostra il Saggio di IFN? ELISpot con cellule da pazienti HCC HLA-A*02:01. PBMCs da pazienti HCC positivi per HLA-A*02:01 e per HLA-A*24:02 sono stati purificati e messi a reagire con peptidi predetti per essere specifici per i due alleli. Il risultato del saggio di IFN? ELISpot dimostra che i pazienti con HCC presentano una quota di linfociti T circolanti in grado di riconoscere solo i peptidi HERVs predetti per l?HLA*02:01 e per HLA-A*24:02
ESEMPIO 1. Analisi bioinformatica dell?espressione dei geni HERV in campioni di pazienti affetti da carcinoma epatocellulare (HCC) ed individuazione di epitopi associati a differenti classi di HLA di classe I. Materiali e metodi
Raccolta dei campioni di tessuto e dei pazienti
14 pazienti HCC cronici infetti da HCV sottoposti a resezione epatica sono stati arruolati presso l?Istituto Nazionale Tumori ?Pascale? a seguito di lettura e firma del consenso informato. Da ciascun paziente con HCC confermato istologicamente sono state ottenute una biopsia epatica del tumore e del tessuto epatico adiacente non tumorale al momento dell'intervento e conservate a -80?C fino al momento dell?utilizzo in agente stabilizzante l'RNA (RNAlater, Qiagen) per il sequenziamento dell'RNA. Cellule mononucleate di sangue periferico umano fresco (PBMC) sono state isolate mediante centrifugazione del gradiente di densit? Ficoll-Hypaque e coltivate in terreno appropriato costituito da RPMI 1640 (Capricorn Scientific GmbH) contenente 2 mM L-Glutammina, integrato con il 10% di siero umano inattivato al calore (Capricorn Scientific GmbH), soluzione tampone HEPES da 25 mM (Capricorn Scientific GmbH), 50 UI/ml di penicillina e 50 ?g/ml di streptomicina (Gibco Life Technologies), 20 ?g/ml di gentamicina (Capricorn Scientific GmbH). I PBMC sono stati mantenuti in azoto liquido in 10% DMSO fino al momento dell?utilizzo.
Estrazione dell'RNA, preparazione della libreria e sequenziamento. I campioni di fegato sono stati omogeneizzati nel reagente TRIzol utilizzando il sistema Tissue Lyser Disruption (Qiagen), congelati immediatamente in ghiaccio secco e l'RNA totale ? stato purificato secondo il protocollo del produttore (Invitrogen). I campioni di RNA sono stati quantificati mediante spettrofotometro NanoDrop1000 (Thermo Fisher Scientific) e hanno mostrato un rapporto di assorbanza 260/280 di circa 1,8-2. La qualit? dell'RNA ? stata valutata mediante elettroforesi digitale su Experion System mediante RNA StdSens Kit e chip RNA (Bio-Rad). La preparazione del sequenziamento delle librerie di cDNA ? stata effettuata su 4 ?g di RNA totale per campione utilizzando il kit di preparazione del campione a trefoli di RNA TruSeq (Illumina). Le librerie di cDNA sono state quantificate mediante Qubit Fluorometer (Q32866; LifeTechnologies) e Qubit dsDNA High Sensay Kit. La qualit? complessiva delle librerie ? stata valutata su Experion System da DNA 1K Analysis Kit e DNA chips (Bio-Rad). Le librerie accoppiate (100 x 2 bp) sono state sequenziate ad alta copertura su Illumina HiSeq2000 NGS.
Analisi dei dati RNA-seq
Il controllo qualit? ? stato eseguito sul numero totale di letture grezze utilizzando lo strumento FastQC (http://www.bioinformatics.babraham.ac.uk/projects/fastqc/). Le letture di alta qualit? sono state mappate al trascrittoma di riferimento umano e al genoma di riferimento umano utilizzando TopHat2 v2.0.10 [30]. Sono state utilizzate solo letture mappate in modo univoco per quantificare l'espressione genica in ciascun campione e per calcolare l'espressione differenziale tra campioni non tumorali e tumorali [31]. L?identificazione delle sequenze HERV nei campioni ? stata effettuata sulla base delle sequenze depositate nel database https://herv.img.cas.cz/. Le sequenze che sono state selezionate per le successive analisi di predizione di epitopi antigenici sono state quelle che mostravano un rapporto ?2 tra il tessuto tumorale e quello non tumorale adiacente.
Selezione delle sequenze proteiche dei geni HERVs
Le sequenze identificate e selezionate nel database https://herv.img.cas.cz/ sono state tradotte mediante il tool ExPASy https://web.expasy.org/translate/ e allineate con Blast https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi per verificarne l?identit? specifica delle proteine HERV.
Analisi della predizione degli epitopi HERVs
La predizione degli epitopi ? stata eseguita sulle sequenze proteiche HERV utilizzando gli strumenti di previsione disponibili su http://www.cbs.dtu.dk/services/.
La versione 4.0 di NetMHCpan http://www.cbs.dtu.dk/services/NetMHCpan/ ? stata utilizzata per prevedere gli epitopi ristretti agli alleli MHC di classe I HLA-A01:01, HLA-A02:01, HLA-A03:01, HLA-A24:02, HLA-A26:01, HLA-B07:02, HLA-B08:01, HLA-B27:05, HLA-B39:01, HLA-B40:01, HLA-B58:01, HLA-B15:01. L?intera sequenza pol dell?HERV-K ? stata utilizzata per predire antigeni della lunghezza di 9 aminoacidi effettuando la scansione di peptidi sovrapposti dell'intera sequenza proteica. Gli antigeni sono stati selezionati per ogni HLA di classe I se con affinit? predetta <100 nM.
Analisi di omologia degli epitopi HERVs
L'Immune Epitope Database (IEDB; http://www.iedb.org/) ? stato utilizzato per l'analisi dell'omologia di sequenza degli epitopi HERV predetti con antigeni noti derivati dall'uomo e da patogeni validati sperimentalmente. L?analisi di omologia si ? concentrata sui residui aminoacidici nelle posizioni di legame dei peptidi al Tcell receptor (posizioni 1, 4, 5 e 8).
Sintesi peptidica
I peptidi sono stati sintetizzati con una purezza >95%. La polvere liofilizzata ? stata disciolta in dimetilsulfossido (DMSO; Sigma-Aldrich), diluita in soluzione salina tamponata con fosfato (PBS 1X, Gibco Life Technologies) e conservata a -80 ?C fino al momento dell'uso.
Linea cellulare T2 carente di TAP
La linea cellulare T2 carente di TAP umana (174xCEM.T2; ATCC CRL 1992 ?) ? stata acquistata dalla American Type Culture Collection (ATCC; https://www.atcc.org/).
La linea cellulare T2 ? stata mantenuta nel mezzo di Dulbecco modificato di Iscove (IMDM; Gibco Life Technologies) contenente 25 mM di HEPES e 2 mM L-Glutammina, integrato con 20% di siero bovino fetale (FBS, Capricorn Scientific GmbH), 100 UI / ml di penicillina e 100 ?g / ml di streptomicina (Gibco Life Technologies). Le cellule sono state mantenute a 37 ? C in un incubatore umidificato con 5% di CO2.
Saggi di affinit? per legame peptidico e decadimento del BFA
I test di affinit? del legame dei peptidi all?HLA-A*02:01 ed il test di decadimento Brefeldina A (BFA) sono stati eseguiti per ciascun peptide sintetizzato. In breve, le cellule T2 sono state seminate ad una concentrazione di 3,5 x 10<5 >cellule per pozzetto in piastre da 24 pozzetti ed incubate per tutta la notte in un incubatore umidificato a 37?C con 5% di CO2 con i peptidi (concentrazioni finali: 10 ?M, 20 ?M, 50 ?M, 100 ?M) in terreno IMDM privo di siero contenente 3 ?g/ml di microglobulina ?2 (Sigma -Aldrich). Dopo l'incubazione, le cellule sono state raccolte e centrifugate a 200 x g per 5 minuti. Successivamente, le cellule sono state lavate due volte con soluzione salina tamponata con fosfato (PBS 1X, Gibco Life Technologies) e colorate con anticorpi monoclonali anti-HLA A2 coniugati con R-PE (Cat. 343306; BioLegend), per 30 minuti a 4?C ed analizzate con il citometro a flusso Attune? NxT (Thermo Fisher Scientific). Il peptide OVA ? stato usato come controllo negativo e le cellule T2 senza alcun peptide aggiunto sono state utilizzate come controllo di fondo. L?indice di fluorescenza (FI) ? stato calcolato utilizzando la seguente formula:
FI = [campione medio di intensit? di fluorescenza (MFI) - sfondo MFI] / sfondo MFI, in cui lo sfondo MFI rappresenta il valore senza peptide. Un FI> 0,5 ? stato impostato come soglia per indicare i peptidi con affinit? per la molecola HLA A*02: 01. Per il test di decadimento di Brefeldina A, le cellule T2 sono state seminate alla concentrazione di 5 x 10<5 >cellule per pozzetto in piastre da 24 pozzetti e sottoposto a coltura durante la notte come descritto in precedenza con i peptidi candidati o il peptide di controllo (CAP 1 ? stato usato come controllo) ad una concentrazione finale di 50 ?M. Dopo l'incubazione, le cellule sono state lavate e incubate con 1X BFA (soluzione di brefeldina A, 420601, BioLegend) in terreno IMDM privo di siero, per 1 ora a 37 ?C. Le cellule sono state raccolte ogni due ore (T0, T2, T4, T6, T8), lavate con tampone fosfato salino (PBS 1X, Gibco Life Technologies), colorate con anticorpi monoclonali fluorescenti anti HLA A*02:01 (Cat. 343306; BioLegend) ed analizzate mediante citometria a flusso. La stabilit? di ciascun peptide legato a HLA A2 ? stata misurata come il valore DC50, che ? stato definito come una stima del tempo richiesto per una riduzione del 50% del valore MFI registrato al tempo 0. Il valore DC50 ? stato calcolato secondo la formula: MFI ai punti temporali indicati/MFI al tempo 0 x 100. Tutti gli esperimenti sono stati eseguiti in triplice copia.
IFN ? ELISpot
Il saggio IFN? ELISpot (BD<TM >human IFN? ELISPOT Set) ? stato eseguito con PBMCs di pazienti affetti da HCC, stimolando 4 x 10<6 >PBMC/ml/pozzetto con peptidi alla concentrazione finale di 10 ?g/ml. Il terzo giorno, 10U/ml di IL 2 sono stati aggiunti a ciascun pozzetto. Il quinto giorno, met? del volume di terreno ? stato sostituito con terreno fresco contenente IL 2 ad una concentrazione finale di 10U/ml. Il settimo giorno, i PBMC sono stati stimolati nuovamente con ciascun peptide. Il giorno 10, le cellule sono state raccolte per il saggio ELISpot IFN?. Ciascun peptide ? stato aggiunto ad una concentrazione finale di 10 ?g/ml a 2 x 10<5 >PBMC per pozzetto in 100 ?l di RPMI 1640 (Capricorn Scientific GmbH). I PBMC sono stati coltivati a 37 ?C in un incubatore umidificato con 5% di CO2 per 20 ore. La stimolazione con 10 ?g/ml PHA (PHA-K; Capricorn Scientific GmbH) ? stata utilizzata come controllo positivo, i PBMC senza aggiunta di peptidi sono stati utilizzati come controllo negativo, il terreno RPMI 1640 (Capricorn Scientific GmbH) ? stato utilizzato come controllo di base.
I pozzetti sono stati letti con un sistema ELISpot Reader AID (AID GmbH, Strassberg, Germania) e la media ? stata ottenuta da letture dei pozzetti in triplicato. I dati sono stati analizzati sottraendo il numero medio di spot nei pozzetti con le cellule non trattate. Le unit? di formazione di spot (SFU) sono state calcolate come la frequenza per 1x10<6 >PBMC.
Analisi statistica
Il confronto tra i singoli punti dati ? stato eseguito con il t-test di Student a due lati non appaiati e l'ANOVA, a seconda dei casi. Tutti i valori di P erano a due code e considerati significativi se inferiori a 0,05.
Risultati
Identificazione sequenze ERV over-espresse in HCC
L?analisi di espressione delle sequenze HERV in campioni tumorali (T) verso la controparte non-tumorale (NT) ha evidenziato la over-espressione in ogni campione analizzato di sequenze HERV identificate nello Human Endogenous Retrovirus Database (HERVd) https://herv.img.cas.cz/ con un rapporto T/NT ? 2. Tali sequenze includono sia regioni LTR (L) che interne (I). Le sequenze HERV identificate nel database HERVd con un rapporto T/NT maggiore o uguale a 2 (almeno 2-fold expression nel tessuto tumorale comparato al tessuto non tumorale) sono di seguito riportate in Tabella 1. In particolare, nella colonna ID si trovano riferimenti alfanumerici che, se inseriti nel database HERVd (nella sezione "Entities", nel campo "Name equals") permettono di ottenere informazioni e dettagli delle sequenze, nonch? le sequenze stesse.
Tabella 1
Le sequenze over-espresse in pi? del 50% dei campioni analizzati sono riportate in Tabella 2 e sono state selezionate per identificare sequenze geniche interne specifiche di HERVs.
Tabella 2
Sequenze proteiche dei geni HERVs
Le sequenze nucleotidiche del database HERVd di Tabella 2 sono state tradotte ed allineate con Blast per identificare open-reading frames (ORF) specifiche retrovirali, ossia per verificarne l?identit? specifica delle proteine HERV. Nella grande maggioranza dei casi tali ORF non sono state identificate. Solo per tre sequenze (ID: ERV_0312447, ERV_0312445, aventi SEQ ID NO:1 e ERV_0308616, avente SEQ ID NO:2) sono state identificate ORFs corrispondenti a proteine retrovirali, in particolare tali sequenze sono risultate essere corrispondenti a geni del HERV-K. In particolare, le sequenze ERV_0312447, ERV_0312445 sono risultate essere identiche tra di loro ed identiche (omologia 100%) con la sequenza Pol del membro 7 dell?HERV-K (aa 85-1459) e hanno sequenza MLTDLRAVNAVIQPMGPLQPGLPSPAMIPKDWPLIIIDLKDCFFTIPL AEQDCEKFAFTIPAINNKEPATRFQWKVLPQGMLNSPTICQTFVGR ALQPVREKFSDCYIIHYIDDILCAAETRDKLIDCYTFLQAEVANAGL AIASDKIQTSTPFHYLGMQIENRKIKQQKIEIRKDTLKTLNDFQKLLG DINWIRPTLGIPTYAMSNLFSILRGDSDLNSKRILTPEATKEIKLVEE KIQSAQINRIDPLAPLQLLIFATAHSPTGIIIQNTDLVEWSFLPHSTVK TFTLYLDQIATLIGQTRLRIIKLCGNDPDKIVVPLTKEQVRQAFINSG AWQIGLANFVGIIDNHYPKTKIFQFLKLTTWILPKITRREPLENALTV FTDGSSNGKAAYTGPKERVIKTPYQSAQRAELVAVITVLQDFDQPI NIISDSAYVVQATRDVETALIKYSMDDQLNQLFNLLQQTVRKRNFP FYITHIRAHTNLPGPLTKANEQADLLVSSALIKAQELHALTHVNAA GLKNKFDVTWKQAKDIVQHCTQCQILHLPTQEAGVNPRGLCPNAL WQMDVTHVPSFGRLSYVHVTVDTYSHFIWATCQTGESTSHVKKHL LSCFAVMGVPEKIKTDNGPGYCSKAFQKFLSQWKISHTTGIPYNSQ GQAIVERTNRTLKTQLVKQKEGGDSKECTTPQMQLNLALYTLNFL NIYRNQTTTSAEQHLTGKKNSPHEGKLIWWKDNKNKTWEIGKVIT WGRGFACVSPGENQLPVWIPTRHLKFYNEPIGDAKKRASTEMVTP VTWMDNPIEIYVNDSVWVPGPIDDRCPAKPEEEGMMINISIGYRYPP ICLGRAPGCLMPAVQNWLVEVPTVSPISRFTYHMVSGMSLRPRVN YLQDFSYQRSLKFRPKGKPCPKEIPKESKNTEVLVWEECVANSAVI LQNNEFGTIIDWAPRGQFYHNCSGQTQSCPSAQVSPAVDSDLTESL DKHKHKKLQSFYPWEWGEKGISTPRPKIVSPVSGPEHPELWRLTVA SHHIRIWSGNQTLETRDCKPFYTIDLNSSLTVPLQSCVKPPYMLVVG NIVIKPDSQTITCENCRLLTCIDSTFNWQHRILLVRAREGVWIPVSM DRPWEASPSVHILTEVLKGVLNRSKRFIFTLIAVIMGLIAVTATAAV AGVALHSSVQSVNFVNDWQKNSTRLWNSQSSIDQKLANQINDLRQ TVIWMGDRLMSLEHRFQLQCDWNTSDFCITPQIYNESEHHWDMVR RHLQGREDNLTLDISKLKEQIFEASKAHLNLVPGTEAIAGVADGLA NLNPVTWVKTIGSTTIINLILILVCLFCLLLVCRCTQQLRRDSDHRER AMMTMAVLSKRKGGNVGKSKRDQIVTVSV (SEQ ID NO:1).
La sequenza ERV_0308616, avente sequenza MDDQLNQLFNLLQQTVRKRNFPFYITHIRAHTNLPGPLTKANEPAD LLVSSAFIKAQKFHALTHVNAAGLKNKFDVTWKQAKDIVRHCTQC QVLHLPTQEAGVNPRGLCPNALRQMDVTHSKAFQKFLSQWKISHT TGIPYNSQGQAIVERTNRTLKTQLVKVPSFGRLLYVHVTVDTYSHFI WATCQTGESTSHVKKHLLPCFAVMRVPEKIKTDNGAGYC (SEQ ID NO:2), ? risultata avere un?omologia del 96% con la sequenza Pol del membro 6 dell?HERV-K (aa 537-758), quest?ultima avente sequenza MDDQLNQLFNLLQQTVRKRNFPFYITHIRAHTNLPGPLTKANEQAD LLVSSALIKAQELHALTHVNAAGLKNKFDVTWKQAKDIVQHCTQC QVLHLPTQEAGVNPRGLCPNALWQMDVTHSKAFQKFLSQWKISHT TGIPYNSQGQAIVERTNRTLKTQLVKVPSFGRLSYVHVTVDTYSHFI WATCQTGESTSHVKKHLLSCFAVMGVPEKIKTDNGPGYC (SEQ ID NO:3).
Predizione degli epitopi HERVs
Le sequenze Pol identificate nei campioni di HCC (SEQ ID NO:1 e SEQ ID NO:2) sono state utilizzate per la predizione di epitopi di 9 aminoacidi mediante la versione 4.0 di NetMHCpan. Gli antigeni sono stati selezionati per ogni HLA di classe I con affinit? predetta <100 nM, corrispondenti a strong binders (SB).
Di seguito, nella Tabella 3, sono riportate le sequenze degli epitopi o peptidi HERV predetti, assieme ai riferimenti SEQ ID NO:. In carattere grassetto sono evidenziati i peptidi comuni a tutte le tre le sequenze analizzate.
Tabella 3
Ulteriormente, sono state predette sequenze di epitopi o peptidi HERV a partire da sequenze Env identificate nei campioni di differenti tumori (es. HCC, melanoma, tumore al seno, tumore al colon, tumore al polmone). Tali sequenze Env identificate sono state utilizzate per la predizione di epitopi di 9 amino acidi mediante la versione 4.0 di NetMHCpan.
Gli antigeni sono stati selezionati per ogni HLA di classe I con affinit? predetta <100 nM, corrispondenti a strong binders (SB).
Di seguito, nella Tabella 4, sono riportate le sequenze degli epitopi o peptidi HERV predetti, assieme ai riferimenti SEQ ID NO:.
In carattere grassetto sono evidenziati i peptidi con elevata affinit? inferiore a 50 nM che rappresentano i peptidi con maggiore potenzialit? di efficacia immunogenica.
Tabella 4
Saggi di affinit? e stabilit? dei peptidi all?HLA*02:01
? stato possibile verificare sperimentalmente il legame e la stabilit? degli epitopi predetti per l?allele HLA-A*0201. E? stata utilizzata la linea cellulare T2 positiva per HLA A*02 che, avendo un deficit nel processamento intracellulare dei peptidi, non presenta epitopi sulla superficie cellulare associati all?HLA. Di conseguenza, questa linea cellulare pu? essere utilizzata per confermare il legame e la stabilit? del legame di epitopi specifici per tale HLA. Gli esperimenti hanno dimostrato che tutti i peptidi predetti per essere specifici per l?HLA*02:01 legano l?allele e sono presentati sulla superficie delle cellule T2 (Figura 1). Inoltre, la cinetica di dissociazione del peptide dall?HLA ha mostrato che tutti i complessi peptidi-HLA hanno un valore di dissociazione del 50% tra le 6 e le 8 ore (T6 e T8), che indica una forte stabilit? di legame. Questo era osservato per i peptidi predetti specifici per l?HLA-A*02:01 e non per quelli specifici per altri HLA-A (Figura 2).
Saggi di IFN? ELiSpot con PBMCs di pazienti HCC positivi per HLA-A*02:01 e per HLA-A*24:02
PBMCs da pazienti HCC positivi per HLA-A*02:01 e per HLA-A*24:02 sono stati purificati e messi a reagire con peptidi predetti per essere specifici per i due alleli. Il risultato del saggio di IFN? ELiSpot dimostra che i pazienti con HCC presentano una quota di linfociti T circolanti in grado di riconoscere solo i peptidi HERVs predetti per l?HLA*02:01 e per HLA-A*24:02 (Figura 3).
Il presente trovato riguarda uno o pi? peptidi, e/o loro varianti aventi una omologia di sequenza di almeno l?80%, preferibilmente di almeno il 90%, rispetto alla sequenza di uno o pi? peptidi, e/o sali farmaceuticamente accettabili di uno o pi? peptidi e/o loro varianti, in cui ciascun peptide comprende o consiste in una sequenza amminoacidica scelta tra le sequenze da SEQ ID NO:4 a SEQ ID NO:107 (Tabella 3) o da SEQ ID NO:108 a SEQ ID NO:521 (Tabella 4), in cui uno o pi? peptidi, e/o varianti sono in grado di legare MHC di classe I e/o MHC di classe II.
In particolare, quando il peptide in accordo con l?invenzione ? legato a MHC di classe I, il peptide ? in grado di essere riconosciuto da cellule T, in particolare da cellule T CD8.
Oppure, quando il peptide in accordo con la presente invenzione lega MHC di classe II ? legato a MHC di classe II, il peptide ? in grado di essere riconosciuto da cellule TCD4+ (cellule T helper).
Inoltre, il peptide in accordo con la presente invenzione o una relativa variante pu? essere impiegato/a da solo/a, oppure in forma di combinazione di alcuni o di tutti i peptidi, le varianti, oppure in forma di miscela di almeno due tra peptidi e varianti menzionati sopra.
Preferibilmente, il peptide secondo la presente invenzione o relative varianti, hanno una lunghezza da 9 amminoacidi a 30 amminoacidi, preferibilmente da 9 amminoacidi a 20 amminoacidi, pi? preferibilmente di 9 amminoacidi.
Nel dettaglio, i peptidi di 9 aminoacidi sono ottimali per legare l?MHC di classe I, mentre per legare l?MHC di classe II i peptidi devono essere di almeno 15 aminoacidi, preferibilmente di 20-30 amminoacidi.
Vantaggiosamente, quando il peptide in accordo con la presente invenzione o i peptidi in accordo con la presente invenzione sono in grado di legare MHC di classe II, questi ultimi hanno una lunghezza di almeno 15 amminoacidi, preferibilmente da 20 amminoacidi a 30 amminoacidi.
Si specifica che il peptide in accordo con la presente invenzione, relative varianti e/o sali in cui quando legano MHC di classe II ? HLA di classe II, preferibilmente HLA-DR, pi? preferibilmente HLA-DR1, HLA-DR3, HLA-DR4 e/o HLA-DR11.
Analogamente, il peptide o i peptidi in accordo con la presente invenzione, loro varianti e/o sali quando legano MHC di classe I ? HLA di classe I, preferibilmente HLA-A e/o HLA-B, pi? preferibilmente HLA-A.
Nel dettaglio HLA-A ? scelto nel gruppo che consiste in HLA-A*02:01, HLA-A*01:01, HLA-A*26:01, HLA-A*03:01 e/o HLA-A*24:02, preferibilmente HLA-A*02:01 e/o HLA-A*24:02.
Inoltre, HLA-B ? scelto nel gruppo che consiste in HLA-B*40:01, HLA-B*15:01, HLA-B*27:05, HLA-B*07:02, HLA-B*58:01, HLA-B*08:01 e/o HLA-B*39:01, preferibilmente HLA-B*40:01, HLA-B*15:01 e/o HLA-B*08:01.
Preferibilmente, il peptide comprende o consiste in una sequenza amminoacidica scelta nel gruppo consistente in SEQ ID NO:5, SEQ ID NO:11, SEQ ID NO:13, SEQ ID NO:17, SEQ ID NO:19, SEQ ID NO:20, SEQ ID NO:24, SEQ ID NO:33, SEQ ID NO:39, SEQ ID NO:41, SEQ ID NO:42, SEQ ID NO:55, SEQ ID NO:73, SEQ ID NO:74, SEQ ID NO:76, SEQ ID NO:77, SEQ ID NO:83, SEQ ID NO:87, SEQ ID NO:95, SEQ ID NO:96, SEQ ID NO:98, SEQ ID NO:100 e/o SEQ ID NO:101, SEQ ID NO:115-120, SEQ ID NO:127-129, SEQ ID NO:133, SEQ ID NO:148, SEQ ID NO:150-154, SEQ ID NO:156-158, SEQ ID NO:161, SEQ ID NO:172, SEQ ID NO:181, SEQ ID NO:182, SEQ ID NO:185, SEQ ID NO:204, SEQ ID NO:206-208, SEQ ID NO:212, SEQ ID NO:224, SEQ ID NO:231, SEQ ID NO:232, SEQ ID NO:234, SEQ ID NO:235, SEQ ID NO:249, SEQ ID NO:250, SEQ ID NO:261, SEQ ID NO:262, SEQ ID NO:264, SEQ ID NO:266, SEQ ID NO:269, SEQ ID NO:270, SEQ ID NO:272-274, SEQ ID NO:299-301, SEQ ID NO:319, SED ID NO:320, SEQ ID NO:323, SEQ ID NO:331, SEQ ID NO:386, SEQ ID NO:389, SEQ ID NO:392, SEQ ID NO:394, SEQ ID NO:396, SEQ ID NO:397, SEQ ID NO:401, SEQ ID NO:404, SEQ ID NO:405, SEQ ID NO:414, SEQ ID NO:431-434, SEQ ID NO:460, SEQ ID NO:466, SEQ ID NO:481, SEQ ID NO:483, SEQ ID NO:487-489, SEQ ID NO:503, SEQ ID NO:505-510, preferibilmente SEQ ID NO:5, SEQ ID NO:17, SEQ ID NO:83 e/o SEQ ID NO:96, SEQ ID NO:115-120, SEQ ID NO:127-129, SEQ ID NO:133, SEQ ID NO:148, SEQ ID NO:150-154, SEQ ID NO:156-158, SEQ ID NO:161, SEQ ID NO:172, SEQ ID NO:181, SEQ ID NO:182, SEQ ID NO:185, SEQ ID NO:204, SEQ ID NO:206, SEQ ID NO:208, SEQ ID NO:212, SEQ ID NO:224, SEQ ID NO:231, SEQ ID NO:232, SEQ ID NO:234, SEQ ID NO:235, SEQ ID NO:249, SEQ ID NO:250, SEQ ID NO:261, SEQ ID NO:262, SEQ ID NO:264, SEQ ID NO:266, SEQ ID NO:269, SEQ ID NO:270, SEQ ID NO:272, SEQ ID NO:273, SEQ ID NO:274, SEQ ID NO:299, SEQ ID NO:300, SEQ ID NO:319, SEQ ID NO:320, SEQ ID NO:323, SEQ ID NO:, SEQ ID NO:331, SEQ ID NO:386, SEQ ID NO:389, SEQ ID NO:392, SEQ ID NO:394, SEQ ID NO:396, SEQ ID NO:397, SEQ ID NO:401, SEQ ID NO:404, SEQ ID NO:405, SEQ ID NO:414, SEQ ID NO:431, SEQ ID NO:432, SEQ ID NO:434, SEQ ID NO:460, SEQ ID NO:466, SEQ ID NO:481, SEQ ID NO:483, SEQ ID NO:487-489, SEQ ID NO:503, SEQ ID NO:505-510, in cui il peptide in accordo con la presente invenzione o i peptidi sono in grado di legare HLA-A*02:01.
Vantaggiosamente, il peptide comprende o consiste in una sequenza amminoacidica scelta nel gruppo consistente in SEQ ID NO:60, SEQ ID NO:61 e/o SEQ ID NO:65, SEQ ID NO:121, SEQ ID NO:130, SEQ ID NO:136, SEQ ID NO:174, SEQ ID NO:175, SEQ ID NO:201, SEQ ID NO:252, SEQ ID NO:317, SEQ ID NO:325-327, SEQ ID NO:339-341, SEQ ID NO:349, SEQ ID NO:378, SEQ ID NO:379, SEQ ID NO:424, SEQ ID NO:425, SEQ ID NO:449, SEQ ID NO:473, SEQ ID NO:474, SEQ ID NO:498, SEQ ID NO:499, in cui il peptide o pi? peptidi sono in grado di legare HLA-A*24:02.
Parallelamente, ciascun peptide comprende o consiste in una sequenza amminoacidica scelta nel gruppo consistente in SEQ ID NO:40, SEQ ID NO:43, SEQ ID NO:47, SEQ ID NO:50, SEQ ID NO:54, SEQ ID NO:62, SEQ ID NO:63, SEQ ID NO:72, SEQ ID NO:81 e/o SEQ ID NO:97, SEQ ID NO:40, SEQ ID NO:43, SEQ ID NO:47, SEQ ID NO:50, SEQ ID NO:54, SEQ ID NO:62, SEQ ID NO:63, SEQ ID NO:72, SEQ ID NO:81 e/o SEQ ID NO:97, SEQ ID NO:123, SEQ ID NO:125, SEQ ID NO:126, SEQ ID NO:155, SEQ ID NO:160, SEQ ID NO:192, SEQ ID NO:193, SEQ ID NO:202, SEQ ID NO:211, SEQ ID NO:230, SEQ ID NO:233, SEQ ID NO:246, SEQ ID NO:251, SEQ ID NO:265, SEQ ID NO:302-305, SEQ ID NO:332, SEQ ID NO:350, SEQ ID NO:375, SEQ ID NO:387, SEQ ID NO:390, SEQ ID NO:391, SEQ ID NO:402, SEQ ID NO:403, SEQ ID NO:420, SEQ ID NO:446, SEQ ID NO: 447, SEQ ID NO:457, SEQ ID NO:470 preferibilmente SEQ ID NO:43, SEQ ID NO:50, SEQ ID NO:81, SEQ ID NO:246, SEQ ID NO:265, SEQ ID NO:304, SEQ ID NO:305, SEQ ID NO:311, in cui uno o pi? peptidi in accordo con la presente invenzione sono in grado di legare HLA-A*03:01.
Analogamente, ciascun peptide comprende o consiste in una sequenza amminoacidica scelta nel gruppo consistente in SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:25, SEQ ID NO:31, SEQ ID NO:38, SEQ ID NO:70, SEQ ID NO:90, SEQ ID NO:92 e/o SEQ ID NO:93, SEQ ID NO:113, SEQ ID NO:114, SEQ ID NO:139, SEQ ID NO:177, SEQ ID NO:199, SEQ ID NO:200, SEQ ID NO:227-229, SEQ ID NO:257, SEQ ID NO:258, SEQ ID NO:318, SEQ ID NO:347, SEQ ID NO:382-384, SEQ ID NO:428, SEQ ID NO:454-456, SEQ ID NO:475-478, preferibilmente SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:348, SEQ ID NO:229, SEQ ID NO:454 in cui uno o pi? peptidi sono in grado di legare HLA-B*40:01.
Ulteriormente, ciascun peptide comprende o consiste in una sequenza amminoacidica scelta nel gruppo consistente in SEQ ID NO:6, SEQ ID NO:7, SEQ ID NO:8, SEQ ID NO:12, SEQ ID NO:22, SEQ ID NO:27, SEQ ID NO:35, SEQ ID NO:36, SEQ ID NO:45, SEQ ID NO:51, SEQ ID NO:53, SEQ ID NO:58, SEQ ID NO:62, SEQ ID NO:75, SEQ ID NO:84, SEQ ID NO:91 e/o SEQ ID NO:107, SEQ ID NO: 135, SEQ ID NO:158-159, SEQ ID NO:161, SEQ ID NO: 167-169, SEQ ID NO:183, SEQ ID NO: 184, SEQ ID NO: 203, SEQ ID NO:209, SEQ ID NO:216, SEQ ID NO: 236, SEQ ID NO:240, SEQ ID NO:259, SEQ ID NO:260, SEQ ID NO:263, SEQ ID NO:267-268, SEQ ID NO:271, SEQ ID NO:274-275, SEQ ID NO:286, SEQ ID NO:287, SEQ ID NO:295, SEQ ID NO:302, SEQ ID NO:303, SEQ ID NO:311, SEQ ID NO:316, SEQ ID NO:330, SEQ ID NO:333, SEQ ID NO:346, SEQ ID NO:350-352, SEQ ID NO:367, SEQ ID NO:376, SEQ ID NO:393, SEQ ID NO:395, SEQ ID NO:400, SEQ ID NO:413, SEQ ID NO:423, SEQ ID NO:426, SEQ ID NO:430, SEQ ID NO:435, SEQ ID NO:437, SEQ ID NO:442, SEQ ID NO:453, SEQ ID NO:458, SEQ ID NO:459, SEQ ID NO:464, SEQ ID NO:467, SEQ ID NO:514-516, SEQ ID NO:520, SEQ ID NO:521, preferibilmente SEQ ID NO:36, SEQ ID NO:91 e/o SEQ ID NO:107, SEQ ID NO:203, SEQ ID NO:267, SEQ ID NO:268, SEQ ID NO:302, SEQ ID NO:303, SEQ ID NO:333, SEQ ID NO:367, SEQ ID NO:376, SEQ ID NO:435, SEQ ID NO:437, in cui uno o pi? peptidi sono in grado di legare HLA-B*15:01.
Inoltre, ciascun peptide comprende o consiste in una sequenza amminoacidica scelta nel gruppo consistente in SEQ ID NO:15, SEQ ID NO:18, SEQ ID NO:26, SEQ ID NO:32, SEQ ID NO:57, SEQ ID NO:82, SEQ ID NO:88, SEQ ID NO:95, SEQ ID NO:102 e/o SEQ ID NO:104, SEQ ID NO:131, SEQ ID NO:149, SEQ ID NO:153, SEQ ID NO:173, SEQ ID NO:238, SEQ ID NO:306, SEQ ID NO:334, SEQ ID NO:374, SEQ ID NO:398, SEQ ID NO:399, SEQ ID NO:407, SEQ ID NO:436, SEQ ID NO:480, SEQ ID NO:481, SEQ ID NO:482, SEQ ID NO:487, SEQ ID NO:488, SEQ ID NO:503, SEQ ID NO:504, SEQ ID NO:510, preferibilmente SEQ ID NO:88, SEQ ID NO:102, SEQ ID NO: 149, SEQ ID NO:153, SEQ ID NO:480, in cui uno o pi? peptidi in accordo con la presente invenzione sono in grado di legare HLA-B*08:01.
Ulteriormente, ciascun peptide comprende o consiste in una sequenza amminoacidica scelta nel gruppo consistente in SEQ ID NO:108-112, SEQ ID NO:124, SEQ ID NO:132, SEQ ID NO: 134, SEQ ID NO:138, SEQ ID NO:146, SEQ ID NO:167, SEQ ID NO:168, SEQ ID NO:176, SEQ ID NO:178, SEQ ID NO:179, SEQ ID NO:198, SEQ ID NO:205, SEQ ID NO:210, SEQ ID NO:217, SEQ ID NO:219-223, SEQ ID NO:226, SEQ ID NO:243-245, SEQ ID NO:247, SEQ ID NO:248, SEQ ID NO:249, SEQ ID NO:253-256, SEQ ID NO:276, SEQ ID NO:277, SEQ ID NO:285, SEQ ID NO:288-294, SEQ ID NO:294, SEQ ID NO:297, SEQ ID NO:298, SEQ ID NO:307, SEQ ID NO:311, SEQ ID NO:312, SEQ ID NO:314, SEQ ID NO:315, SEQ ID NO:324, SEQ ID NO:328, SEQ ID NO:335-338, SEQ ID NO: 342-345, SEQ ID NO:370-373, SEQ ID NO:377, SEQ ID NO:381, SEQ ID NO:417-419, SEQ ID NO:422, SEQ ID NO:427, SEQ ID NO:443-445, SEQ ID NO:451-453, SEQ ID NO:465, SEQ ID NO:467-469, SEQ ID NO:492, SEQ ID NO:497, preferibilmente SEQ ID NO:88 e/o SEQ ID NO:102, in cui uno o pi? peptidi in accordo con la presente invenzione sono in grado di legare HLA-B*58:01.
Inoltre, ciascun peptide comprende o consiste in una sequenza amminoacidica scelta nel gruppo consistente in SEQ ID NO: 137, SEQ ID NO:140, SEQ ID NO:142, SEQ ID NO:147, SEQ ID NO:163, SEQ ID NO:165, SEQ ID NO:180, SEQ ID NO:195, SEQ ID NO:296, SEQ ID NO:321, SEQ ID NO:322, SEQ ID NO:329, SEQ ID NO:385, SEQ ID NO:388, SEQ ID NO: 412, SEQ ID NO:429, SEQ ID NO:440, SEQ ID NO:479, SEQ ID NO:493, SEQ ID NO:500-502, SEQ ID NO:509, SEQ ID NO:511, SEQ ID NO:513, SEQ ID NO:517, in cui uno o pi? peptidi in accordo con la presente invenzione sono in grado di legare HLA-B*39:01.
Inoltre, ciascun peptide comprende o consiste in una sequenza amminoacidica scelta nel gruppo consistente in SEQ ID NO: 166, SEQ ID NO:191, SEQ ID NO:196, SEQ ID NO:197, SEQ ID NO:241, SEQ ID NO:242, SEQ ID NO:322, SEQ ID NO:368, SEQ ID NO:369, SEQ ID NO:415, SEQ ID NO:416, SEQ ID NO:493-496, SEQ ID NO:517, SEQ ID NO:518, in cui uno o pi? peptidi in accordo con la presente invenzione sono in grado di legare HLA-B*27:05.
Inoltre, ciascun peptide comprende o consiste in una sequenza amminoacidica scelta nel gruppo consistente in SEQ ID NO:141, SEQ ID NO:143, SEQ ID NO:144, SEQ ID NO:145, SEQ ID NO:169-171, SEQ ID NO:423, preferibilmente SEQ ID NO:170, in cui uno o pi? peptidi in accordo con la presente invenzione HLA-A*26:01.
Analogamente, ciascun peptide comprende o consiste in SEQ ID NO: 122, SEQ ID NO:162, SEQ ID NO:163, SEQ ID NO:164, SEQ ID NO:186, SEQ ID NO: 187, SEQ ID NO:188, SEQ ID NO:189, SEQ ID NO:190, SEQ ID NO:194, SEQ ID NO: 213, SEQ ID NO:214, SEQ ID NO:215, SEQ ID NO:237, SEQ ID NO:238, SEQ ID NO:239, SEQ ID NO:278, SEQ ID NO:279, SEQ ID NO:280, SEQ ID NO:281, SEQ ID NO:282, SEQ ID NO:283, SEQ ID NO:284, SEQ ID NO:308, SEQ ID NO:309, SEQ ID NO:310, SEQ ID NO:343, SEQ ID NO:353-366, SEQ ID NO:380, SEQ ID NO:406-411, SEQ ID NO:438, SEQ ID NO:439, SEQ ID NO:450, SEQ ID NO:461-463, SEQ ID NO:471, SEQ ID NO:472, SEQ ID NO:490, SEQ ID NO:491, SEQ ID NO:512, preferibilmente SEQ ID NO: 194 e/o SEQ ID NO:281, in cui uno o pi? peptidi in accordo con la presente invenzione sono in grado di legare HLA-B*07:02.
Ulteriormente, ciascun peptide comprende o consiste in SEQ ID NO: 169, SEQ ID NO: 223, SEQ ID NO: 313, SEQ ID NO: 421, SEQ ID NO: 441, SEQ ID NO: 448, SEQ ID NO: 484-486, SEQ ID NO: 519, in cui uno o pi? peptidi in accordo con la presente invenzione sono in grado di legare HLA-A*01:01.
Nel dettaglio, uno o pi? peptidi comprendono legami non peptidici e/o in cui uno o pi? peptidi sono parte di una proteina di fusione, ad esempio, comprendente amminoacidi N-terminali della catena invariabile associata all?antigene HLA-DR.
Il peptide secondo la presente invenzione, o la variante del peptide come definita sopra, pu? comprendere parti addizionali di amminoacidi all?estremit? N-terminale o C-terminale, che non fanno necessariamente parte della porzione di peptide che funge da epitopo per le molecole MHC. Tuttavia, queste parti addizionali possono essere importanti per fornire un'introduzione efficiente del peptide secondo la presente invenzione all?interno delle cellule. In una forma di realizzazione della presente invenzione, il peptide ? parte di una proteina di fusione che comprende, ad esempio, gli 80 amminoacidi N-terminali della catena invariabile associata all'antigene HLA-DR (p33) come derivato dalla banca dati NCBI, GenBank_Accession number X00497.
In altri tipi di fusione, i peptidi della presente invenzione possono essere fusi con un anticorpo come di seguito descritto, o una parte funzionale dell?anticorpo stesso, in particolare tali peptidi possono essere inseriti in una sequenza di un anticorpo, in modo da essere specificatamente veicolati dall?anticorpo o, ad esempio, possono essere fusi a un anticorpo, o inseriti in un anticorpo, che ? specifico per le cellule dendritiche come descritto di seguito.
Inoltre, il peptide o la variante secondo la presente invenzione pu? essere ulteriormente modificato o modificata per migliorare la stabilit? e/o il legame con le molecole MHC, al fine di ottenere una risposta immunitaria pi? forte. Metodi per l?ottimizzazione di una sequenza peptidica sono ben noti nella tecnica e comprendono, ad esempio, l'introduzione di legami peptidici inversi o legami non peptidici.
In un legame peptidico inverso i residui amminoacidici non sono uniti da legami peptidici (-CO-NH-), ma il legame peptidico ? invertito. Tali peptidi peptidomimetici retro-inversi possono essere realizzati usando metodi noti nell'arte, come ad esempio quelli descritti in Meziere et al (1997) J. Immunol. 159, 3230-3237, qui incorporato come riferimento. Questo approccio comporta la creazione di pseudopeptidi contenenti cambiamenti che coinvolgono lo scheletro e non l'orientamento delle catene laterali. Meziere et al (1997) mostrano che questi pseudopeptidi sono utili per il legame MHC e le risposte delle cellule T helper.
I peptidi retro-inversi, che contengono legami NH-CO invece dei legami peptidici CO-NH, sono molto pi? resistenti alla proteolisi.
Un legame non peptidico pu? essere, ad esempio, uno dei seguenti: -CH2-NH, -CH2S-, -CH2CH2-, -CH?CH-, -COCH2-, -CH (OH) CH2- e -CH2SO-. Il brevetto statunitense n. 4,897,445 fornisce un metodo per la sintesi in fase solida di legami non peptidici (-CH2-NH) in catene polipeptidiche che comporta l?uso di polipeptidi sintetizzati mediante procedure standard e il legame non peptidico sintetizzato mediante reazione di una amminoaldeide e un amminoacido in presenza di NaCNBH3.
I peptidi comprendenti le sequenze sopra descritte possono essere sintetizzati con ulteriori gruppi chimici presenti ai loro terminali amminici e/o carbossilici, per migliorare la stabilit?, la biodisponibilit? e/o l'affinit? dei peptidi. Ad esempio, gruppi idrofobi come i gruppi carbobenzilossi, dansile o t-butilossicarbonile possono essere aggiunti agli amminoterminali dei peptidi.
Allo stesso modo, un gruppo acetile o un gruppo 9-fluorenilmetossicarbonile possono essere posti agli ammino-terminali dei peptidi. Inoltre, il gruppo idrofobico, il t-butilossicarbonile o un gruppo ammidico possono essere aggiunti ai carbossi-terminali dei peptidi.
Inoltre, i peptidi secondo la presente invenzione possono essere sintetizzati in modo tale da alterare la loro configurazione sterica. Ad esempio, pu? essere usato l'isomero D di uno o pi? dei residui amminoacidici del peptide, piuttosto che l?usuale isomero L. Ulteriormente, almeno uno dei residui amminoacidici dei peptidi dell'invenzione pu? essere sostituito da uno dei ben noti residui amminoacidici non presenti in natura. Alterazioni come queste possono servire ad aumentare la stabilit?, la biodisponibilit? e/o l'azione legante dei peptidi dell'invenzione.
Analogamente, un peptide o una variante del peptide secondo la presente invenzione, pu? essere modificato o modificata chimicamente facendo reagire amminoacidi specifici prima o dopo la sintesi del peptide. Esempi per tali modifiche sono ben noti nella tecnica e sono riassunti ad esempio in R. Lundblad, Chemical Reagents for Protein Modification, 3rd ed. CRC Press, 2005, che ? qui incorporato come riferimento.
La modificazione chimica degli amminoacidi include, ma non ? limitata a: modificazione mediante acilazione, ammidazione, piridossilazione di lisina, alchilazione riduttiva, trinitrobenzilazione di gruppi amminici con acido 2,4,6-trinitrobenzensolfonico (TNBS), modificazione ammidica di gruppi carbossilici e modificazione sulfidrilica mediante ossidazione con acido performico della cisteina in acido cisteico, formazione di derivati mercuriali, formazione di disolfuri misti con altri composti tiolici, reazione con maleimmide, carbossimetilazione con acido iodoacetico o iodoacetammide e carbamilazione con cianato a pH alcalino. A questo proposito, le metodologie per la modificazione chimica delle proteine sono ben note a un esperto del ramo.
In breve, la modificazione dei residui arginilici nelle proteine sono spesso basati sulla reazione di composti dicarbonilici vicinali come ad esempio il fenilgliossale, il 2,3-butanedione e l'1,2-cicloesandione per formare un addotto. Un altro esempio ? la reazione del metilgliossale con residui di arginina. La cisteina pu? essere modificata senza la modifica concomitante di altri siti nucleofili come la lisina e l'istidina.
Di conseguenza, ? disponibile un gran numero di reagenti per la modificazione della cisteina. I siti Web di aziende come Sigma-Aldrich (http://www.sigma-aldrich.com) forniscono informazioni su reagenti specifici.
Anche la riduzione selettiva dei legami disolfuro nelle proteine ? ben nota. I legami disolfuro possono essere formati e ossidati durante il trattamento termico dei prodotti biofarmaceutici. Il reagente K di Woodward pu? essere utilizzato per modificare specifici residui di acido glutammico. N-(3-(dimetilammino)propil)-N'-etilcarbodiimmide pu? essere usato per formare connessioni intra-molecolari tra un residuo di lisina e un residuo di acido glutammico. Ad esempio, il dietilpirocarbonato ? un reagente per la modificazione dei residui istidilici nelle proteine. L'istidina pu? anche essere modificata usando 4-idrossi-2-nonenale. La reazione dei residui di lisina e di altri gruppi ?-amminici ?, ad esempio, utile nel legame di peptidi alle superfici o nel cross-linking di proteine/peptidi. La lisina ? il sito di attacco del poli(etilene)glicole e il principale sito di modificazione nella glicosilazione delle proteine. I residui di metionina nelle proteine possono essere modificati ad esempio con iodoacetamide, bromoetilammina e clorammina T.
Il tetranitrometano e l?N-acetilimidazolo possono essere utilizzati per la modificazione dei residui tirosilici. Il cross-linking attraverso la formazione di di-tirosina pu? essere realizzato con perossido di idrogeno/ioni di rame. In alcuni studi sulla modificazione del triptofano ? stato usato N-bromosuccinimmide, 2-idrossi-5-nitrobenzil bromuro o 3-bromo-3-metil-2-(2-nitrofenilmercapto)-3H-indolo(BPNS-skatole).
Una modifica ben riuscita delle proteine e dei peptidi terapeutici con PEG ? spesso associata a un prolungamento dell'emivita circolatoria, mentre il cross-linking delle proteine con glutaraldeide, polietilenglicole diacrilato e formaldeide ? usato per la preparazione di idrogel.
La modifica chimica degli allergeni per l'immunoterapia ? spesso ottenuta mediante carbamilazione con cianato di potassio.
In generale, peptidi e varianti (almeno quelli contenenti legami peptidici tra i residui di amminoacidi) possono essere sintetizzati mediante modalit? Fmoc-poliammide della sintesi peptidica in fase solida, come divulgato da Lukas et al. (Sintesi del peptide in fase solida in condizioni di flusso continuo Proc. Natl Acad Sci USA, maggio 1981; 78 (5): 2791-2795). La protezione temporanea del gruppo N-ammino ? fornita dal gruppo 9-fluorenilmetilossicarbonile (Fmoc).
In un?ulteriore forma di realizzazione, la presente invenzione riguarda un anticorpo comprendente uno o pi? peptidi, e/o varianti e/o sali e in cui l?anticorpo ? in grado di riconoscere cellule presentanti l?antigene (APC), preferibilmente cellule dendritiche.
L?anticorpo secondo la presente invenzione ? in grado di riconoscere recettori di lectina tipo C come il DC-SIGN (CD209) sulle cellule dendritiche. In questo modo la quota di peptide catturato dalle cellule dendritiche ? aumentata significativamente e il peptide ? presentato pi? efficacemente alle cellule T.
In un?altra forma di realizzazione, la presente invenzione riguarda un recettore dei linfociti T in grado di legare uno o pi? peptidi come precedentemente definiti in cui il recettore comprende opzionalmente uno o pi? domini co-stimolatori. Il recettore ? ad esempio un recettore chimerico per l?antigene (CAR).
In un?altra forma di realizzazione, la presente invenzione riguarda una sequenza nucleotidica (DNA o RNA) che codifica per un peptide come precedente descritto o per un anticorpo come sopra descritto.
In un?ulteriore forma di realizzazione, la presente invenzione riguarda una sequenza nucleotidica che codifica per un recettore come precedentemente definito.
In un?ulteriore forma di realizzazione, la presente invenzione riguarda un vettore di espressione comprendente una sequenza nucleotidica come precedentemente definita.
Ancora, in un?ulteriore forma di realizzazione, la presente invenzione riguarda una cellula comprendente:
- uno o pi? peptidi in accordo con la presente invenzione;
- un anticorpo in accordo con la presente invenzione;
- un recettore in accordo con la presente invenzione;
- una sequenza nucleotidica in accordo con la presente invenzione o un vettore come definito nella rivendicazione.
Ulteriormente, in un?altra forma di realizzazione, la presente invenzione riguarda una cellula T espansa in vitro in presenza di uno o pi? peptidi in accordo con la presente invenzione o un anticorpo in accordo con la presente invenzione.
Si specifica che nell?ambito della presente trattazione con l?espressione ?composizione farmaceutica? si fa riferimento indistintamente anche ad una composizione vaccinale.
Preferibilmente, tale composizione farmaceutica o vaccinale comprende uno o pi? peptidi scelti dal gruppo comprendente o consistente in: SEQ ID NO:17, SEQ ID NO:83, SEQ ID NO:96, SEQ ID NO:119, SEQ ID NO:120, SEQ ID NO:133, SEQ ID NO:158, SEQ ID NO:182, SEQ ID NO:185, SEQ ID NO:206, SEQ ID NO:249, SEQ ID NO:250, SEQ ID NO:300, SEQ ID NO:340, SEQ ID NO:378, SEQ ID NO:394, SEQ ID NO:396, SEQ ID NO:405, SEQ ID NO:460, SEQ ID NO:466, SEQ ID NO:506, SEQ ID NO:507, SEQ ID NO:508, SEQ ID NO:509, SEQ ID NO:510.
Ancora, in un?ulteriore forma di realizzazione la presente invenzione riguarda una composizione farmaceutica o vaccinale comprendente o consistente in uno o pi? dei seguenti principi attivi:
- uno o pi? peptidi in accordo con la presente invenzione;
- un anticorpo in accordo con la presente invenzione;
- una sequenza nucleotidica in accordo con la presente invenzione;
- un vettore in accordo con la presente invenzione o una cellula che comprende il peptide, l?anticorpo o il vettore comprendente la sequenza nucleotidica in accordo con la presente invenzione, e opzionalmente uno o pi? farmaci inibitori di checkpoint immunitari, assieme a uno o pi? eccipienti e/o adiuvanti farmaceuticamente accettabili.
Tale composizione farmaceutica pu? essere vantaggiosamente impiegata prima di somministrare un farmaco epigenetico. La composizione farmaceutica ha la funzione di attivare la risposta immunitaria, mentre il farmaco epigenetico ha la funzione di far esprimere le proteine HERV, e quindi gli epitopi, da parte delle cellule tumorali. Tali epitopi saranno quindi riconosciuti dal sistema immunitario precedentemente attivato mediante la composizione farmaceutica secondo la presente invenzione. Ulteriormente, in un?altra forma di realizzazione, la presente invenzione riguarda una composizione farmaceutica comprendente o consistente in uno o pi? tra i seguenti principi attivi:
- un recettore in accordo con la presente invenzione;
- una sequenza nucleotidica in accordo con la presente invenzione;
- un vettore in accordo con la presente invenzione o una cellula che comprende un vettore comprendente la sequenza nucleotidica in accordo con la presente invenzione, e opzionalmente uno o pi? farmaci inibitori di checkpoint immunitari, assieme a uno o pi? eccipienti e/o adiuvanti farmaceuticamente accettabili.
Tale composizione pu? essere vantaggiosamente somministrata dopo aver somministrato un farmaco epigenetico.
Come detto sopra, il farmaco epigenetico ha la funzione di far esprimere le proteine HERV, e quindi gli epitopi, da parte delle cellule tumorali. Tali epitopi saranno quindi riconosciuti dai principi attivi della composizione farmaceutica secondo la presente invenzione appena menzionata.
Allo stesso modo, ossia dopo la somministrazione di un farmaco epigenetico, pu? essere somministrata una composizione farmaceutica in accordo con la presente invenzione.
In accordo con un?ulteriore forma di realizzazione, la presente invenzione riguarda una composizione farmaceutica comprendente o consistente in cellule T in accordo con la presente invenzione, e opzionalmente uno o pi? farmaci inibitori di checkpoint immunitari, assieme a uno o pi? eccipienti e/o adiuvanti farmaceuticamente accettabili.
Ancora, la presente invenzione riguarda uno o pi? peptidi in accordo con la presente invenzione, un anticorpo in accordo con la presente invenzione, un recettore in accordo con la presente invenzione, una sequenza nucleotidica in accordo con la presente invenzione, un vettore in accordo con la presente invenzione, una cellula in accordo con la presente invenzione, una cellula T in accordo con la presente invenzione, una composizione farmaceutica in accordo con la presente invenzione, per l?uso come medicamento.
In un?ulteriore forma di realizzione, la presente invenzione riguarda:
- uno o pi? peptidi in accordo con la presente invenzione;
- un anticorpo in accordo con la presente invenzione;
- un recettore in accordo con la presente invenzione;
- una sequenza nucleotidica in accordo con la presente invenzione;
- un vettore in accordo con la presente invenzione;
- una cellula in accordo con la presente invenzione;
- una cellula T in accordo con la presente invenzione;
- una composizione farmaceutica in accordo con la presente invenzione; per l?uso nel trattamento dei tumori, come ad esempio tumore epatocellulare, tumore al seno, melanoma, tumore del colon, tumore del pancreas, tumore renale, tumore prostatico, tumore polmonare.
Nello specifico, per l?uso nel trattamento dei tumori, come ad esempio tumore epatocellulare, tumore al seno, melanoma, carcinoma del colon, carcinoma del pancreas, carcinoma renale, carcinoma prostatico, tumore polmonare.
Ulteriormente, la presente invenzione riguarda:
- uno o pi? peptidi in accordo con la presente invenzione;
- un anticorpo in accordo con la presente invenzione;
- un recettore in accordo con la presente invenzione;
- una sequenza nucleotidica in accordo con la presente invenzione;
- un vettore in accordo con la presente invenzione;
- una cellula in accordo con la presente invenzione;
- una cellula T in accordo con la presente invenzione;
- una composizione farmaceutica in accordo con la presente invenzione; per l?uso nel trattamento dei tumori, come ad esempio tumore epatocellulare, tumore al seno, melanoma, tumore del colon, tumore del pancreas, tumore renale, tumore prostatico, tumore polmonare in cui:
- uno o pi? peptidi in accordo con la presente invenzione;
- l?anticorpo in accordo con la presente invenzione;
- la sequenza nucleotidica in accordo con la presente invenzione;
- il vettore in accordo con la presente invenzione che comprende la sequenza nucleotidica in accordo con la presente invenzione;
- la cellula che comprende il peptide o vettore comprendente la sequenza nucleotidica in accordo con la presente invenzione o la composizione farmaceutica in accordo con la presente invenzione;
sono somministrati/e prima di un farmaco epigenetico in grado di indurre l?espressione di sequenze HERV (Human endogenous retroviruses) in cellule tumorali; mentre il recettore in accordo con la presente invenzione, la cellula T in accordo con la presente invenzione, la sequenza nucleotidica in accordo con la presente invenzione, il vettore che comprende la sequenza nucleotidica in accordo con la presente invenzione, la cellula che comprende il recettore o vettore in accordo con la presente invenzione o la composizione farmaceutica in accordo con la presente invenzione;
? somministrato/a dopo un farmaco epigenetico in grado di indurre l?espressione di sequenze HERV in cellule tumorali, in cui detto farmaco epigenetico ? preferibilmente un inibitore delle DNA metiltransferasi.
Infine, la presente invenzione riguarda una combinazione comprendente o consistente in uno o pi? peptidi in accordo con la presente invenzione, un anticorpo in accordo con la presente invenzione, un recettore in accordo con la presente invenzione, una sequenza nucleotidica in accordo con la presente invenzione, un vettore in accordo con la presente invenzione, una cellula in accordo con la presente invenzione, una cellula T in accordo con la presente invenzione e/o una composizione farmaceutica in accordo con la presente invenzione, con un farmaco epigenetico in grado di indurre l?espressione di sequenze HERV in cellule tumorali, per l?uso sequenziale nel trattamento dei tumori, come ad esempio carcinoma epatocellulare, tumore al seno, melanoma, tumore del colon, tumore del pancreas, tumore renale, tumore prostatico, tumore polmonare, in cui il farmaco epigenetico ? preferibilmente un inibitore delle DNA metiltrasferasi.
Preferibilmente, per l?uso sequenziale nel trattamento del carcinoma epatocellulare, tumore al seno, melanoma, tumore del colon, tumore del pancreas, tumore renale, tumore prostatico, tumore polmonare.
Si specifica che nell?ambito della presente trattazione con l?espressione ?uso sequenziale? si intende la somministrazione successiva degli elementi della combinazione, cio? dei peptidi, dell?anticorpo, del recettore, della sequenza nucleotidica, del vettore, della cellula, della cellula T, del farmaco epigenetico, in forme farmaceutiche distinte e, eventualmente, differenti tra loro.
La presente invenzione ? stata descritta a titolo illustrativo, ma non limitativo, secondo sue forme preferite di realizzazione, ma ? da intendersi che variazioni e/o modifiche potranno essere apportate dagli esperti nel ramo senza per questo uscire dal relativo ambito di protezione, come definito dalle rivendicazioni allegate.
Claims (35)
- RIVENDICAZIONI 1) Uno o pi? peptidi, e/o loro varianti aventi una omologia di sequenza di almeno l?80%, preferibilmente di almeno il 90%, rispetto alla sequenza di detti uno o pi? peptidi, e/o sali farmaceuticamente accettabili di detti uno o pi? peptidi e/o loro varianti, in cui ciascun peptide comprende o consiste in una sequenza amminoacidica scelta tra le sequenze da SEQ ID NO:5 a SEQ ID NO:107 o da SEQ ID NO:108 a SEQ ID NO:521, detti uno o pi? peptidi, e/o varianti essendo in grado di legare MHC di classe I e/o MHC di classe II.
- 2) Uno o pi? peptidi, varianti secondo la rivendicazione 1, in cui detti uno o pi? peptidi hanno una lunghezza da 9 amminoacidi a 30 amminoacidi, preferibilmente da 9 amminoacidi a 20 amminoacidi, pi? preferibilmente di 9 amminoacidi.
- 3) Uno o pi? peptidi, varianti secondo una qualsiasi delle rivendicazioni 1-2, in cui quando detti uno o pi? peptidi sono in grado di legare MHC di classe I hanno una lunghezza di 9 aminoacidi.
- 4) Uno o pi? peptidi, varianti e/o sali secondo una qualsiasi delle rivendicazioni 1-3, in cui quando detti uno o pi? peptidi sono in grado di legare MHC di classe II, detti uno o pi? peptidi hanno una lunghezza di almeno 15 amminoacidi, preferibilmente da 20 amminoacidi a 30 amminoacidi.
- 5) Uno o pi? peptidi, varianti e/o sali secondo una qualsiasi delle rivendicazioni 1-4, in cui MHC di classe II ? HLA di classe II, preferibilmente HLA-DR, pi? preferibilmente HLA-DR1, HLA-DR3, HLA-DR4 e/o HLA-DR11.
- 6) Uno o pi? peptidi, varianti e/o sali secondo una qualsiasi delle rivendicazioni 1-5, in cui MHC di classe I ? HLA di classe I, preferibilmente HLA-A e/o HLA-B, pi? preferibilmente HLA-A.
- 7) Uno o pi? peptidi, varianti e/o sali secondo la rivendicazione 5, in cui HLA-A ? scelto nel gruppo che consiste in HLA-A*02:01, HLA-A*01:01, HLA-A*26:01, HLA-A*03:01 e/o HLA-A*24:02, preferibilmente HLA-A*02:01 e/o HLA-A*24:02.
- 8) Uno o pi? peptidi, varianti e/o sali secondo una qualsiasi delle rivendicazioni 6-7, in cui HLA-B ? scelto nel gruppo che consiste in HLA-B*40:01, HLA-B*15:01, HLA-B*27:05, HLA-B*07:02, HLA-B*58:01, HLA-B*08:01 e/o HLA-B*39:01, preferibilmente HLA-B*40:01, HLA-B*15:01 e/o HLA-B*08:01.
- 9) Uno o pi? peptidi, varianti e/o sali secondo una qualsiasi delle rivendicazioni 1-8, in cui ciascun peptide comprende o consiste in una sequenza amminoacidica scelta nel gruppo consistente in SEQ ID NO:5, SEQ ID NO:11, SEQ ID NO:13, SEQ ID NO:17, SEQ ID NO:19, SEQ ID NO:20, SEQ ID NO:24, SEQ ID NO:33, SEQ ID NO:39, SEQ ID NO:41, SEQ ID NO:42, SEQ ID NO:55, SEQ ID NO:73, SEQ ID NO:74, SEQ ID NO:76, SEQ ID NO:77, SEQ ID NO:83, SEQ ID NO:87, SEQ ID NO:95, SEQ ID NO:96, SEQ ID NO:98, SEQ ID NO:100 e/o SEQ ID NO:101, SEQ ID NO:115-120, SEQ ID NO:127-129, SEQ ID NO:133, SEQ ID NO:148, SEQ ID NO:150-154, SEQ ID NO:156-158, SEQ ID NO:161, SEQ ID NO:172, SEQ ID NO:181, SEQ ID NO:182, SEQ ID NO:185, SEQ ID NO:204, SEQ ID NO:206-208, SEQ ID NO:212, SEQ ID NO:224, SEQ ID NO:231, SEQ ID NO:232, SEQ ID NO:234, SEQ ID NO:235, SEQ ID NO:249, SEQ ID NO:250, SEQ ID NO:261, SEQ ID NO:262, SEQ ID NO:264, SEQ ID NO:266, SEQ ID NO:269, SEQ ID NO:270, SEQ ID NO:272-274, SEQ ID NO:299-301, SEQ ID NO:319, SED ID NO:320, SEQ ID NO:323, SEQ ID NO:331, SEQ ID NO:386, SEQ ID NO:389, SEQ ID NO:392, SEQ ID NO:394, SEQ ID NO:396, SEQ ID NO:397, SEQ ID NO:401, SEQ ID NO:404, SEQ ID NO:405, SEQ ID NO:414, SEQ ID NO:431-434, SEQ ID NO:460, SEQ ID NO:466, SEQ ID NO:481, SEQ ID NO:483, SEQ ID NO:487-489, SEQ ID NO:503, SEQ ID NO:505-510, preferibilmente SEQ ID NO:5, SEQ ID NO:17, SEQ ID NO:83 e/o SEQ ID NO:96, SEQ ID NO:115-120, SEQ ID NO:127-129, SEQ ID NO:133, SEQ ID NO:148, SEQ ID NO:150-154, SEQ ID NO:156-158, SEQ ID NO:161, SEQ ID NO:172, SEQ ID NO:181, SEQ ID NO:182, SEQ ID NO:185, SEQ ID NO:204, SEQ ID NO:206, SEQ ID NO:208, SEQ ID NO:212, SEQ ID NO:224, SEQ ID NO:231, SEQ ID NO:232, SEQ ID NO:234, SEQ ID NO:235, SEQ ID NO:249, SEQ ID NO:250, SEQ ID NO:261, SEQ ID NO:262, SEQ ID NO:264, SEQ ID NO:266, SEQ ID NO:269, SEQ ID NO:270, SEQ ID NO:272, SEQ ID NO:273, SEQ ID NO:274, SEQ ID NO:299, SEQ ID NO:300, SEQ ID NO:319, SEQ ID NO:320, SEQ ID NO:323, SEQ ID NO:, SEQ ID NO:331, SEQ ID NO:386, SEQ ID NO:389, SEQ ID NO:392, SEQ ID NO:394, SEQ ID NO:396, SEQ ID NO:397, SEQ ID NO:401, SEQ ID NO:404, SEQ ID NO:405, SEQ ID NO:414, SEQ ID NO:431, SEQ ID NO:432, SEQ ID NO:434, SEQ ID NO:460, SEQ ID NO:466, SEQ ID NO:481, SEQ ID NO:483, SEQ ID NO:487-489, SEQ ID NO:503, SEQ ID NO:505-510,in cui detti uno o pi? peptidi sono in grado di legare HLA-A*02:01.
- 10) Uno o pi? peptidi, varianti e/o sali secondo una qualsiasi delle rivendicazioni 1-9, in cui ciascun peptide comprende o consiste in una sequenza amminoacidica scelta nel gruppo consistente in SEQ ID NO:60, SEQ ID NO:61, SEQ ID NO:65, SEQ ID NO:121, SEQ ID NO:130, SEQ ID NO:136, SEQ ID NO:174, SEQ ID NO:175, SEQ ID NO:201, SEQ ID NO:252, SEQ ID NO:317, SEQ ID NO:325-327, SEQ ID NO:339-341, SEQ ID NO:349, SEQ ID NO:378, SEQ ID NO:379, SEQ ID NO:424, SEQ ID NO:425, SEQ ID NO:449, SEQ ID NO:473, SEQ ID NO:474, SEQ ID NO:498, SEQ ID NO:499, in cui detti uno o pi? peptidi sono in grado di legare HLA-A*24:02.
- 11) Uno o pi? peptidi, varianti e/o sali secondo una qualsiasi delle rivendicazioni 1-10, in cui ciascun peptide comprende o consiste in una sequenza amminoacidica scelta nel gruppo consistente in SEQ ID NO:40, SEQ ID NO:43, SEQ ID NO:47, SEQ ID NO:50, SEQ ID NO:54, SEQ ID NO:62, SEQ ID NO:63, SEQ ID NO:72, SEQ ID NO:81 e/o SEQ ID NO:97, SEQ ID NO:123, SEQ ID NO:125, SEQ ID NO:126, SEQ ID NO:155, SEQ ID NO:160, SEQ ID NO:192, SEQ ID NO:193, SEQ ID NO:202, SEQ ID NO:211, SEQ ID NO:230, SEQ ID NO:233, SEQ ID NO:246, SEQ ID NO:251, SEQ ID NO:265, SEQ ID NO:302-305, SEQ ID NO:332, SEQ ID NO:350, SEQ ID NO:375, SEQ ID NO:387, SEQ ID NO:390, SEQ ID NO:391, SEQ ID NO:402, SEQ ID NO:403, SEQ ID NO:420, SEQ ID NO:446, SEQ ID NO: 447, SEQ ID NO:457, SEQ ID NO:470 preferibilmente SEQ ID NO:43, SEQ ID NO:50, SEQ ID NO:81, SEQ ID NO:246, SEQ ID NO:265, SEQ ID NO:304, SEQ ID NO:305, SEQ ID NO:311, in cui detti uno o pi? peptidi sono in grado di legare HLA-A*03:01.
- 12) Uno o pi? peptidi, varianti e/o sali secondo una qualsiasi delle rivendicazioni 1-11, in cui ciascun peptide comprende o consiste in una sequenza amminoacidica scelta nel gruppo consistente in SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:25, SEQ ID NO:31, SEQ ID NO:38, SEQ ID NO:70, SEQ ID NO:90, SEQ ID NO:92 e/o SEQ ID NO:93, SEQ ID NO:113, SEQ ID NO:114, SEQ ID NO:139, SEQ ID NO:177, SEQ ID NO:199, SEQ ID NO:200, SEQ ID NO:227-229, SEQ ID NO:257, SEQ ID NO:258, SEQ ID NO:318, SEQ ID NO:347, SEQ ID NO:382-384, SEQ ID NO:428, SEQ ID NO:454-456, SEQ ID NO:475-478, preferibilmente SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:348, SEQ ID NO:229, SEQ ID NO:454 in cui detti uno o pi? peptidi sono in grado di legare HLA-B*40:01.
- 13) Uno o pi? peptidi, varianti e/o sali secondo una qualsiasi delle rivendicazioni 1-12, in cui ciascun peptide comprende o consiste in una sequenza amminoacidica scelta nel gruppo consistente in SEQ ID NO:6, SEQ ID NO:7, SEQ ID NO:8, SEQ ID NO:12, SEQ ID NO:22, SEQ ID NO:27, SEQ ID NO:35, SEQ ID NO:36, SEQ ID NO:45, SEQ ID NO:51, SEQ ID NO:53, SEQ ID NO:58, SEQ ID NO:62, SEQ ID NO:75, SEQ ID NO:84, SEQ ID NO:91 e/o SEQ ID NO:107, SEQ ID NO: 135, SEQ ID NO:158-159, SEQ ID NO:161, SEQ ID NO: 167-169, SEQ ID NO:183, SEQ ID NO: 184, SEQ ID NO: 203, SEQ ID NO:209, SEQ ID NO:216, SEQ ID NO: 236, SEQ ID NO:240, SEQ ID NO:259, SEQ ID NO:260, SEQ ID NO:263, SEQ ID NO:267-268, SEQ ID NO:271, SEQ ID NO:274-275, SEQ ID NO:286, SEQ ID NO:287, SEQ ID NO:295, SEQ ID NO:302, SEQ ID NO:303, SEQ ID NO:311, SEQ ID NO:316, SEQ ID NO:330, SEQ ID NO:333, SEQ ID NO:346, SEQ ID NO:350-352, SEQ ID NO:367, SEQ ID NO:376, SEQ ID NO:393, SEQ ID NO:395, SEQ ID NO:400, SEQ ID NO:413, SEQ ID NO:423, SEQ ID NO:426, SEQ ID NO:430, SEQ ID NO:435, SEQ ID NO:437, SEQ ID NO:442, SEQ ID NO:453, SEQ ID NO:458, SEQ ID NO:459, SEQ ID NO:464, SEQ ID NO:467, SEQ ID NO:514-516, SEQ ID NO:520, SEQ ID NO:521, preferibilmente SEQ ID NO:36, SEQ ID NO:91 e/o SEQ ID NO:107, SEQ ID NO:203, SEQ ID NO:267, SEQ ID NO:268, SEQ ID NO:302, SEQ ID NO:303, SEQ ID NO:333, SEQ ID NO:367, SEQ ID NO:376, SEQ ID NO:435, SEQ ID NO:437 in cui detti uno o pi? peptidi sono in grado di legare HLA-B*15:01.
- 14) Uno o pi? peptidi, varianti e/o sali secondo una qualsiasi delle rivendicazioni 1-13, in cui ciascun peptide comprende o consiste in una sequenza amminoacidica scelta nel gruppo consistente in SEQ ID NO:15, SEQ ID NO:18, SEQ ID NO:26, SEQ ID NO:32, SEQ ID NO:57, SEQ ID NO:82, SEQ ID NO:88, SEQ ID NO:95, SEQ ID NO:102 e/o SEQ ID NO:104, SEQ ID NO:131, SEQ ID NO:149, SEQ ID NO:153, SEQ ID NO:173, SEQ ID NO:238, SEQ ID NO:306, SEQ ID NO:334, SEQ ID NO:374, SEQ ID NO:398, SEQ ID NO:399, SEQ ID NO:407, SEQ ID NO:436, SEQ ID NO:480, SEQ ID NO:481, SEQ ID NO:482, SEQ ID NO:487, SEQ ID NO:488, SEQ ID NO:503, SEQ ID NO:504, SEQ ID NO:510, preferibilmente SEQ ID NO:88, SEQ ID NO:102, SEQ ID NO: 149, SEQ ID NO:153, SEQ ID NO:480, in cui detti uno o pi? peptidi sono in grado di legare HLA-B*08:01.
- 15) Uno o pi? peptidi, varianti e/o sali secondo una qualsiasi delle rivendicazioni 1-14, in cui ciascun peptide comprende o consiste in una sequenza amminoacidica scelta nel gruppo consistente in SEQ ID NO:108-112, SEQ ID NO:124, SEQ ID NO:132, SEQ ID NO: 134, SEQ ID NO:138, SEQ ID NO:146, SEQ ID NO:167, SEQ ID NO:168, SEQ ID NO:176, SEQ ID NO:178, SEQ ID NO:179, SEQ ID NO:198, SEQ ID NO:205, SEQ ID NO:210, SEQ ID NO:217, SEQ ID NO:219-223, SEQ ID NO:226, SEQ ID NO:243-245, SEQ ID NO:247, SEQ ID NO:248, SEQ ID NO:249, SEQ ID NO:253-256, SEQ ID NO:276, SEQ ID NO:277, SEQ ID NO:285, SEQ ID NO:288-294, SEQ ID NO:294, SEQ ID NO:297, SEQ ID NO:298, SEQ ID NO:307, SEQ ID NO:311, SEQ ID NO:312, SEQ ID NO:314, SEQ ID NO:315, SEQ ID NO:324, SEQ ID NO:328, SEQ ID NO:335-338, SEQ ID NO: 342-345, SEQ ID NO:370-373, SEQ ID NO:377, SEQ ID NO:381, SEQ ID NO:417-419, SEQ ID NO:422, SEQ ID NO:427, SEQ ID NO:443-445, SEQ ID NO:451-453, SEQ ID NO:465, SEQ ID NO:467-469, SEQ ID NO:492, SEQ ID NO:497, preferibilmente SEQ ID NO:88 e/o SEQ ID NO:102, in cui detti uno o pi? peptidi sono in grado di legare HLA-B*58:01.
- 16) Uno o pi? peptidi, varianti e/o sali secondo una qualsiasi delle rivendicazioni 1-15, in cui ciascun peptide comprende o consiste in una sequenza amminoacidica scelta nel gruppo consistente in SEQ ID NO: 137, SEQ ID NO:140, SEQ ID NO:142, SEQ ID NO:147, SEQ ID NO:163, SEQ ID NO:165, SEQ ID NO:180, SEQ ID NO:195, SEQ ID NO:296, SEQ ID NO:321, SEQ ID NO:322, SEQ ID NO:329, SEQ ID NO:385, SEQ ID NO:388, SEQ ID NO: 412, SEQ ID NO:429, SEQ ID NO:440, SEQ ID NO:479, SEQ ID NO:493, SEQ ID NO:500-502, SEQ ID NO:509, SEQ ID NO:511, SEQ ID NO:513, SEQ ID NO:517, in cui detti uno o pi? peptidi sono in grado di legare HLA-B*39:01.
- 17) Uno o pi? peptidi, varianti e/o sali secondo una qualsiasi delle rivendicazioni 1-16, in cui ciascun peptide comprende o consiste in una sequenza amminoacidica scelta nel gruppo consistente in SEQ ID NO: 166, SEQ ID NO:191, SEQ ID NO:196, SEQ ID NO:197, SEQ ID NO:241, SEQ ID NO:242, SEQ ID NO:322, SEQ ID NO:368, SEQ ID NO:369, SEQ ID NO:415, SEQ ID NO:416, SEQ ID NO:493-496, SEQ ID NO:517, SEQ ID NO:518, in cui detti uno o pi? peptidi sono in grado di legare HLA-B*27:05.
- 18) Uno o pi? peptidi, varianti e/o sali secondo una qualsiasi delle rivendicazioni 1-17, in cui ciascun peptide comprende o consiste in una sequenza amminoacidica scelta nel gruppo consistente in SEQ ID NO:141, SEQ ID NO:143, SEQ ID NO:144, SEQ ID NO:145, SEQ ID NO:169-171, SEQ ID NO:423, preferibilmente SEQ ID NO:170 in cui detti uno o pi? peptidi sono in grado di legare HLA-A*26:01.
- 19) Uno o pi? peptidi, varianti e/o sali secondo una qualsiasi delle rivendicazioni 1-17, in cui ciascun peptide comprende o consiste in una sequenza amminoacidica scelta nel gruppo consistente in SEQ ID NO: 122, SEQ ID NO:162, SEQ ID NO:163, SEQ ID NO:164, SEQ ID NO:186, SEQ ID NO: 187, SEQ ID NO:188, SEQ ID NO:189, SEQ ID NO:190, SEQ ID NO:194, SEQ ID NO: 213, SEQ ID NO:214, SEQ ID NO:215, SEQ ID NO:237, SEQ ID NO:238, SEQ ID NO:239, SEQ ID NO:278, SEQ ID NO:279, SEQ ID NO:280, SEQ ID NO:281, SEQ ID NO:282, SEQ ID NO:283, SEQ ID NO:284, SEQ ID NO:308, SEQ ID NO:309, SEQ ID NO:310, SEQ ID NO:343, SEQ ID NO:353-366, SEQ ID NO:380, SEQ ID NO:406-411, SEQ ID NO:438, SEQ ID NO:439, SEQ ID NO:450, SEQ ID NO:461-463, SEQ ID NO:471, SEQ ID NO:472, SEQ ID NO:490, SEQ ID NO:491, SEQ ID NO:512, preferibilmente SEQ ID NO: 194 e/o SEQ ID NO:281 in cui detti uno o pi? peptidi sono in grado di legare HLA-B*07:02.
- 20) Uno o pi? peptidi, varianti e/o sali secondo una qualsiasi delle rivendicazioni 1-19, in cui ciascun peptide comprende o consiste in una sequenza amminoacidica scelta nel gruppo consistente in SEQ ID NO: 169, SEQ ID NO: 223, SEQ ID NO: 313, SEQ ID NO: 421, SEQ ID NO: 441, SEQ ID NO: 448, SEQ ID NO: 484-486, SEQ ID NO: 519, in cui detti uno o pi? peptidi sono in grado di legare HLA-A*01:01.
- 21) Uno o pi? peptidi, varianti e/o sali secondo una qualsiasi delle rivendicazioni 1-20, in cui detti uno o pi? peptidi comprendono legami non peptidici e/o in cui detti uno o pi? peptidi sono parte di una proteina di fusione ad esempio comprendente amminoacidi N-terminali della catena invariabile associata all?antigene HLA-DR.
- 22) Anticorpo comprendente uno o pi? peptidi, e/o varianti e/o sali come definiti in una qualsiasi delle rivendicazioni 1-21, detto anticorpo essendo in grado di riconoscere cellule presentanti l?antigene (APC), preferibilmente cellule dendritiche.
- 23) Recettore dei linfociti T in grado di legare uno o pi? peptidi come definiti in una qualsiasi delle rivendicazioni 1-21, detto recettore comprendendo opzionalmente uno o pi? domini co-stimolatori, detto recettore essendo ad esempio un recettore chimerico per l?antigene (CAR).
- 24) Sequenza nucleotidica DNA o RNA che codifica per un peptide come definito in una qualsiasi delle rivendicazioni 1-21, o per un anticorpo come definito nella rivendicazione 22.
- 25) Sequenza nucleotidica che codifica per un recettore come definito nella rivendicazione 23.
- 26) Vettore di espressione comprendente una sequenza nucleotidica come definita nella rivendicazione 24 o nella rivendicazione 25.
- 27) Cellula comprendente uno o pi? peptidi come definiti in una qualsiasi delle rivendicazioni 1-21, un anticorpo come definito nella rivendicazione 22, un recettore come definito nella rivendicazione 24, una sequenza nucleotidica come definita nella rivendicazione 24 o 25 o un vettore come definito nella rivendicazione 26.
- 28) Cellula T espansa in vitro in presenza di uno o pi? peptidi come definiti in una qualsiasi delle rivendicazioni 1-21 o un anticorpo come definito nella rivendicazione 22.
- 29) Composizione farmaceutica comprendente o consistente in uno o pi? dei seguenti principi attivi: uno o pi? peptidi come definiti in una qualsiasi delle rivendicazioni 1-21, un anticorpo come definito nella rivendicazione 22, una sequenza nucleotidica come definita nella rivendicazione 24, un vettore che comprende la sequenza nucleotidica come definita nella rivendicazione 24 o una cellula che comprende detto peptide, detto anticorpo o detto vettore comprendente la sequenza nucleotidica come definita nella rivendicazione 25, e opzionalmente uno o pi? farmaci inibitori di checkpoint immunitari, assieme a uno o pi? eccipienti e/o adiuvanti farmaceuticamente accettabili.
- 30) Composizione farmaceutica comprendente o consistente in uno o pi? tra i seguenti principi attivi: un recettore come definito nella rivendicazione 23, una sequenza nucleotidica come definita nella rivendicazione 25, un vettore che comprende la sequenza nucleotidica come definita nella rivendicazione 25 o una cellula che comprende un vettore comprendente la sequenza nucleotidica come definita nella rivendicazione 25, e opzionalmente uno o pi? farmaci inibitori di checkpoint immunitari, assieme a uno o pi? eccipienti e/o adiuvanti farmaceuticamente accettabili.
- 31) Composizione farmaceutica comprendente o consistente in cellule T come definite nella rivendicazione 28, e opzionalmente uno o pi? farmaci inibitori di checkpoint immunitari, assieme a uno o pi? eccipienti e/o adiuvanti farmaceuticamente accettabili.
- 32) Uno o pi? peptidi come definiti in una qualsiasi delle rivendicazioni 1-21, un anticorpo come definito nella rivendicazione 22, un recettore come definito nella rivendicazione 23, una sequenza nucleotidica come definita nella rivendicazione 24 o 25, un vettore come definito nella rivendicazione 25, una cellula come definita nella rivendicazione 27, una cellula T come definita nella rivendicazione 28, una composizione farmaceutica come definita nelle rivendicazioni 29, 30 o 31, per l?uso come medicamento.
- 33) Uno o pi? peptidi come definiti in una qualsiasi delle rivendicazioni 1-21, un anticorpo come definito nella rivendicazione 22, un recettore come definito nella rivendicazione 23, una sequenza nucleotidica come definita nella rivendicazione 24 o 25, un vettore come definito nella rivendicazione 26, una cellula come definita nella rivendicazione 27, una cellula T come definita nella rivendicazione 28, una composizione farmaceutica come definita nelle rivendicazioni 29, 30 o 31, per l?uso nel trattamento dei tumori, come ad esempio carcinoma epatocellulare, tumore al seno, melanoma, carcinoma del colon, del pancreas, renale, prostatico, polmonare.
- 34) Uno o pi? peptidi come definiti in una qualsiasi delle rivendicazioni 1-21, un anticorpo come definito nella rivendicazione 22, un recettore come definito nella rivendicazione 23, una sequenza nucleotidica come definita nella rivendicazione 24 o 25, un vettore come definito nella rivendicazione 26, una cellula come definita nella rivendicazione 27, una cellula T come definita nella rivendicazione 28, una composizione farmaceutica come definita nelle rivendicazioni 29, 30 o 31, per l?uso secondo la rivendicazione 33, in cui uno o pi? peptidi come definiti in una qualsiasi delle rivendicazioni 1-21, l?anticorpo come definito nella rivendicazione 22, la sequenza nucleotidica come definita nella rivendicazione 24, il vettore che comprende la sequenza nucleotidica come definita nella rivendicazione 24, la cellula che comprende detto peptide o vettore comprendente la sequenza nucleotidica come definita nella rivendicazione 23 o la composizione farmaceutica come definita nella rivendicazione 29, sono somministrati/e prima di un farmaco epigenetico in grado di indurre l?espressione di sequenze HERV (Human endogenous retroviruses) in cellule tumorali, mentre il recettore come definito nella rivendicazione 23, la cellula T come definita nella rivendicazione 28, la sequenza nucleotidica come definita nella rivendicazione 25, il vettore che comprende la sequenza nucleotidica come definita nella rivendicazione 25, la cellula che comprende detto recettore o vettore che comprende la sequenza nucleotidica come definita nella rivendicazione 25 o la composizione farmaceutica come definita nella rivendicazione 29 o 30, ? somministrato/a dopo un farmaco epigenetico in grado di indurre l?espressione di sequenze HERV in cellule tumorali, in cui detto farmaco epigenetico ? preferibilmente un inibitore delle DNA metiltransferasi.
- 35) Combinazione comprendente o consistente in uno o pi? peptidi come definiti in una qualsiasi delle rivendicazioni 1-21, un anticorpo come definito nella rivendicazione 22, un recettore come definito nella rivendicazione 23, una sequenza nucleotidica come definita nella rivendicazione 24 o 25, un vettore come definito nella rivendicazione 25, una cellula come definita nella rivendicazione 27, una cellula T come definita nella rivendicazione 28 e/o una composizione farmaceutica come definita nelle rivendicazioni 29, 30 o 31, con un farmaco epigenetico in grado di indurre l?espressione di sequenze HERV in cellule tumorali, per l?uso sequenziale nel trattamento dei tumori, come ad esempio carcinoma epatocellulare, tumore al seno, melanoma, tumore del colon, tumore del pancreas, tumore renale, tumore prostatico, tumore polmonare in cui detto farmaco epigenetico ? preferibilmente un inibitore delle DNA metiltransferasi.
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