BR112019021094A2 - Peptídeos e combinações dos mesmos para uso na imunoterapia contra leucemias e outros cânceres - Google Patents

Abstract

a presente invenção refere-se a peptídeos, proteínas, ácidos nucleicos e células para utilização em métodos de imunoterapia. mais especificamente, a presente invenção refere-se à imunoterapia do câncer. a presente invenção refere-se também a epítopos de peptídeos obtidos de células t associadas a tumores, isoladamente ou combinados com outros peptídeos associados a tumores, que podem, por exemplo, atuar como ingredientes farmacêuticos ativos de composições vacinais que estimulam respostas imunes antitumorais ou que estimulam células t ex vivo e transferência a pacientes. peptídeos, quer ligados a moléculas do complexo principal de histocompatibilidade (mhc) ou peptídeos como tal, também podem ser alvos de anticorpos, de receptores de células t solúveis e de outras moléculas ligantes.

Description

Relatório Descritivo da Patente de Invenção para PEPTÍDEOS E COMBINAÇÕES DOS MESMOS PARA USO NA IMUNOTERAPIA CONTRA LEUCEMIAS E OUTROS CÂNCERES.

[001] A presente invenção refere-se a peptídeos, proteínas, ácidos nucleicos e células para utilização em métodos de imunoterapia. Mais especificamente, a presente invenção refere-se à imunoterapia do câncer. A presente invenção refere-se também a epítopos de peptídeos obtidos de células T associadas a tumores, isoladamente ou combinados com outros peptídeos associados a tumores, que podem, por exemplo, atuar como ingredientes farmacêuticos ativos de composições vacinais que estimulam respostas imunes antitumorais ou que estimulam células T ex vivo e transferência a pacientes. Peptídeos, quer ligados a moléculas do complexo principal de histocompatibilidade (MHC) ou peptídeos como tal, também podem ser alvos de anticorpos, de receptores de células T solúveis e de outras moléculas ligantes.

[002] A presente invenção refere-se a diversas novas sequências peptídicas e a variantes das mesmas, ambas derivadas de moléculas de HLA classe I de células tumorais humanas, que podem ser utilizadas em composições vacinais para produzir respostas imunes antitumorais ou como alvos para o desenvolvimento de compostos e células com atividade imunofarmacêutica.

ASPECTOS GERAIS DA INVENÇÃO

[003] Segundo a Organização Mundial de Saúde (OMS), o câncer foi uma das doenças não transmissíveis mais letais no mundo em 2012. Naquele ano, os cânceres colorretal, de mama e do trato respiratório estiveram entre as dez principais causas de morte em países de renda elevada (http://www.who.int/mediacentre/factsheets /fs310/en/).

Epidemioloqia

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[004] Estima-se que, em 2012, houve 14,1 milhões de casos novos, 32,6 milhões de pacientes com câncer (diagnosticado havia menos de 5 anos) e 8,2 milhões de óbitos por câncer no mundo inteiro (Ferlay et al., 2013; Bray et al., 2013).

[005] Dentre as leucemias, a presente invenção tem como foco especificamente a leucemia linfocítica crônica (LLC), a leucemia mieloide crônica (LMC) e a leucemia mieloide aguda (LMA).

[006] A LLC é a leucemia mais comum no Ocidente, correspondendo a cerca de um terço de todas as leucemias. As taxas de incidência são semelhantes nos EUA e na Europa, estimadas em cerca de 16.000 casos por ano. A LLC é mais comum em brancos que em negros, mais rara em hispânicos e descendentes de índios americanos e mais rara ainda em asiáticos. Em indivíduos de origem asiática, a incidência de LLC é três vezes menor que em brancos (Gunawardana et al., 2008). A sobrevida geral em cinco anos de pacientes com LLC é de cerca de 79%.

[007] A LMA é a segunda leucemia mais diagnosticada em adultos e crianças. Nos Estados Unidos, estima-se que haja cerca de 21.000 casos por ano. A sobrevida em cinco anos de pacientes com LMA é de cerca de 25%.

[008] A LMC corresponde a 15% a 25% das leucemias em adultos, com incidência de 1,2/100.000 na Europa e 1,75/100.000 nos EUA (Hoglund et al., 2015). Estima-se que houve 8.220 casos novos e 1.070 mortes por LMC nos EUA em 2016 (National Cancer Institute, 2015). Desde a introdução do imatinibe no ano 2000, a mortalidade anual por LMC diminuiu de 10% a 20% para 1% a 2%. Devido a essa diminuição, a prevalência estimada de LMC nos EUA aumentou de 25.000 a 30.000 casos em 2000 para 80.000 a 100.000 casos em 2015 (Huang et al., 2012).

Tratamento

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[009] Leucemia linfocítica crônica - Embora a LLC ainda seja incurável, em muitos pacientes a progressão da doença e a piora dos sintomas são lentos. Como o tratamento precoce não é benéfico, a abordagem inicial consiste em observar e esperar (Richards et al., 1999). Para pacientes com doença sintomática ou rapidamente progressiva, existem várias opções de tratamento, como quimioterapia, terapias direcionadas, tratamentos imunológicos (por exemplo anticorpos monoclonais), receptores antigênicos quiméricos (CAR), imunoterapia ativa e transplante de células tronco.

[0010] A quimioterapia da LLC usa sobretudo agentes alquilantes como a clorambucila ou a ciclofosfamida ou análogos de purina como a fludarabina. O Grupo Alemão de Estudo da LLC (GCLLSG, The German LLC Study Group) demonstrou que a associação de fludarabina e ciclofosfamida é superior à fludarabina isolada (remissão completa (RC) de 24% em vez de 7%) (Eichhorst et al., 2006).

[0011] O ibrutinibe e o idelalisibe são inibidores de quinase que atuam sobre moléculas na cascata de sinalização do receptor de células B. O ibrutinibe inibe a tirosina quinase de Bruton (BTK), uma enzima relacionada ao src que é importante para o amadurecimento das células B, e é usada no tratamento inicial ou de segunda linha (Byrd et al., 2013; O'Brien et al., 2014). O idelalisibe é um inibidor de PI3K-delta usado em associação com rituximabe na LLC refratária (Furman et al., 2014).

[0012] O transplante de células-tronco hematopoiéticas (TCTH) pode ser indicado em pacientes com mau prognóstico (por exemplo deleções cromossômicas do tipo 17p (dei 17p) ou mutações de p53. Os TCTHs podem ser alogênicos, em que são transplantadas células de um doador com HLA compatível, ou autólogos, em que célulastronco do paciente são reinfundidas após quimioterapia (Schetelig et al., 2008).

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[0013] Os anticorpos monoclonais são amplamente usados no tratamento de doenças malignas hematológicas, pois as superfícies das células imunes já foram bem caracterizadas — e portanto são conhecidos antígenos apropriados — e as células tumorais são fáceis de obter a partir do sangue e da medula óssea dos pacientes. Os anticorpos monoclonais comumente usados contra LLC atuam sobre CD20 ou CD52. O rituximabe foi o primeiro anticorpo monoclonal antiCD20 aprovado pelo FDA para tratamento de LNH e hoje é usado no tratamento da LLC. A associação de rituximabe, fludarabina e ciclofosfamida produz taxas de RC e sobrevida geral (SG) melhores que a combinação com fludarabina e ciclofosfamida e se tornou a opção terapêutica preferida (Hallek et al., 2008). O ofatumomabe atua contra CD20 e é usado no tratamento de pacientes com LLC refratária (Wierda et al., 2011). O obinutuzumabe é outro anticorpo monoclonal anti-CD20 usado no tratamento de primeira linha em associação com clorambucila (Goede et al., 2014).

[0014] O alemtuzumabe é um anticorpo anti-CD52 usado no tratamento de doenças refratárias à quimioterapia ou com fatores de mau prognóstico como dei 17p ou mutações de p53 (Parikh et al., 2011).

[0015] Outros anticorpos monoclonais que atuam sobre CD37 (otlertuzumabe, BI 836826, IMGN529 e ¹⁷⁷Lu-tetulomabe) ou CD40 (dacetuzumabe e lucatumumabe) vêm sendo submetidos a ensaios pré-clínicos (Robake Robak, 2014).

[0016] Vários ensaios clínicos, alguns já concluídos e outros ainda em andamento, vêm testando células T modificadas com receptores antigênicos quiméricos (CAR) específicas para CD19 (Maus et al.,

2014). Até agora, poucos pacientes apresentaram CARs detectáveis ou persistentes. Nos ensaios clínicos conduzidos por Porter et al. e

Kalos et al., foram obtidas uma resposta parcial (RP) e duas respostas

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5/196 completas (RC) (Kalos et al., 2011; Porter et al., 2011).

[0017] A imunoterapia ativa inclui as seguintes estratégias: terapia gênica, vacinas com células tumorais integrais modificadas, vacinas à base de células dendríticas (CD) e vacinas derivadas de antígenos associados a tumores (AAT).

[0018] As abordagens de terapia gênica usam células tumorais autólogas geneticamente modificadas. Células de LLC de origem B são transfectadas com genes imunoestimulatórios como IL-2, IL-12, TNFoc, GM-CSF, CD80, CD40L, LFA-3 e ICAM-1 para melhorar a apresentação de antígenos e a ativação de células T (Carballido et ai., 2012). Embora as respostas de células T específicas e a redução da carga de células tumorais ocorram rapidamente, as respostas imunes são apenas transitórias.

[0019] Vários estudos usaram CDs autólogas como células apresentadoras de antígenos para promover respostas antitumorais. As CDs são carregadas ex vivo com peptídeos associados ao tumor, lisado de células tumorais inteiras e RNA ou DNA derivado do tumor. Outra estratégia funde células tumorais inteiras com CDs para gerar híbridos de CD e LLC do tipo B. As CDs transfectadas iniciam respostas de células T CD4+ e CD8+ (Muller et ai., 2004). Os híbridos de fusão e CDs carregadas com lisado de células tumorais ou corpos apoptóticos aumentaram as respostas de células T CD8+ específicas contra tumores. Alguns pacientes obtiveram resposta clínica, que se manifestou com aumento dos níveis séricos de IL-12 e diminuição do número de células T reguladoras (Palma et ai., 2008).

[0020] Várias abordagens usam células tumorais modificadas para iniciar ou promover respostas imunes específicas para LLC. Uma dessas estratégias é a geração de células de trioma, em que células de LLC de origem B são fundidas com células de hibridoma que expressam antagonistas do receptor Fc específicas contra células

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6/196 apresentadoras de antígenos. As células de trioma induzem respostas de células T específicas para LLC in vitro (Kronenberger et al., 2008).

[0021] Outra estratégia consiste em usar células de LLC autólogas irradiadas associadas ao bacilo de Calmette-Guérin (usado como coadjuvante) em uma vacina. Vários pacientes tratados por essa abordagem obtiveram redução dos níveis de leucócitos ou estabilização da doença (Hus et al., 2008).

[0022] Além de células de LLC isoladas, também foram preparadas vacinas com sangue total de pacientes com LLC em unidades de hemoterapia. As respostas de células T específicas para LLC induzidas por vacinas produziram respostas clínicas parciais ou estabilização da doença em vários pacientes (Spaner et al., 2005).

[0023] A LLC sobrexpressa diversos AATs apropriados para vacinação, como fibromodulina (Mayr et al., 2005), RHAMM/CD168 (Giannopoulos et al., 2006), MDM2 (Mayr et al., 2006), hTERT (Counter et al., 1995), OFAiLRP (receptor de laminina imaturo, que é um antígeno oncofetal) (Siegel et al., 2003), adipofilina (Schmidt et al., 2004), survivina (Granziero et al., 2001), KW1 a KW14 (Krackhardt et al., 2002) e região lgVHCDR3 derivada de tumor (Harig et al., 2001; Carballido et al., 2012). Um ensaio clínico de fase I foi realizado usando o peptídeo R3 derivado de RHAMM como vacina. Dos 6 pacientes, 5 apresentaram respostas de células T CD8+ detectáveis e específicas para R3 (Giannopoulos et al., 2010).

[0024] Leucemia mieloide crônica - A LMC é uma neoplasia mieloproliferativa caracterizada pela translocação cromossômica (9;22)(q34;q11.2), que produz o gene de fusão BCR-ABL1. A proteína de fusão BCR-ABL1 possui atividade de tirosina quinase desregulada e é essencial para a patogênese e manutenção da LMC (Lugo et al., 1990). A descoberta do mecanismo leucemogênico da LLC em nível molecular levou ao desenvolvimento e uso clínico bem-sucedido de

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7/196 inibidores de tirosina quinase (TKI) específicos para a BCR-ABL1, que culminou com a aprovação do imatinibe para tratamento de primeira linha de LMC recém-diagnosticada em 2002 (Johnson et al., 2003). A introdução dos TKIs modificou enormemente o tratamento e a evolução clínica dos pacientes com LMC, melhorando muito a expectativa de vida (Schmidt, 2016). Contudo, o tratamento com TKI precisa ser mantido durante toda a vida, o que aumenta o risco de resistência secundária (Khorashad et al., 2013) e eleva os custos (Kantarjian et al., 2013). Embora sejam geralmente bem tolerados, os TKIs podem apresentar perfis de toxicidade que impedem o uso de drogas específicas em alguns pacientes com comorbidades, o que pode causar efeitos colaterais raros, porém graves (Jabbour e Kantarjian, 2016). O único tratamento capaz de curar a LMC é o transplante de células-tronco alogênicas, que possui morbimortalidade elevada e pode ser usada apenas em casos avançados ou como terapia de resgate em pacientes nos quais vários TKI se mostraram ineficazes (Horowitz et al., 1996; Radich, 2010).

[0025] A LMC é subdividida de acordo com a concentração de blastos no sangue e na medula óssea em três fases clínicas distintas: crônica, acelerada e crise blástica. Cerca de 90% dos pacientes são diagnosticados na fase crônica inicial, sendo que em torno de 50% dos casos novos são assintomáticos (Jabbour e Kantarjian, 2016). Antes da introdução dos TKI, o tratamento da LMC consistia em agentes inespecíficos como poliquimioterapia com o agente alquilante bussulfano, o inibidor de ribonucleotídeo redutase hidroxiureia e o interferon alfa (IFNoc). Nesses casos, a fase crônica possui duração mediana de 3 a 5 anos e a fase acelerada, que normalmente tem evolução letal, de 3 a 6 meses (Silver et al., 1999). Embora o IFNoc reduza a progressão da doença e melhore a sobrevida de um subgrupo de pacientes, seu uso é limitado porque a droga possui

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8/196 toxicidade significativa e é relativamente ineficaz (Kujawski e Talpaz, 2007), o que a levou a ser substituída pelos TKI. O surgimento de terapias direcionadas contra LMC baseadas em TKI mudou significativamente a evolução da doença, aumentando a sobrevida em 10 anos de cerca de 20% para 80% a 90% (Jabbour e Kantarjian, 2016).

[0026] Atualmente existem cinco TKIs aprovados nos EUA para tratamento de LMC. O tratamento-padrão de primeira linha para LMC normalmente consiste em imatinibe, um TKI de primeira geração, (O'Brien et al., 2003) ou um dos TKIs de segunda geração: nilotinibe (Saglio et al., 2010) ou dasatinibe (Kantarjian et al., 2010). O bosutinibe (Cortes et al., 2012) e o ponatinibe são indicados em pacientes com histórico de resistência ou intolerância a outros TKI.

[0027] Embora as taxas de resposta sejam elevadas e as respostas sejam substanciais, casos de resistência primária e secundária a TKI foram observados em pacientes com LMC. Os mecanismos de resistência mais bem caracterizados são a amplificação genômica do BCR-ABL1 e mutações do domínio de quinase do BCR-ABL1 (Khorashad et al., 2013). A análise de mutações normalmente é realizada após progressão na vigência de tratamento com LKI e pode ajudar a orientar a escolha dos TKIs subsequentes (Soverini et al., 2011). O inibidor inespecífico de tradução de proteínas omacetaxina foi aprovado nos EUA para pacientes com resistência ou intolerância a dois ou mais TKIs (Gandhi et al., 2014), mas os TKI continuam sendo a opção preferida (Soverini et al., 2011). A omacetaxina é uma droga cuja ação independe de BCR-ABL1 e que é capaz de induzir a apoptose de células-tronco primárias de LMC ao subregular a proteína antiapoptótica Mcl1-1 (Allan et al., 2011).

[0028] A descontinuação do imatinibe foi investigada no estudo

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STIM (Stop Imatinib), que recrutou pacientes com respostas moleculares completas (RMC) à droga por mais de dois anos (Mahon et ai., 2010). Em uma publicação recente, 61% dos pacientes tiveram recorrência molecular, sendo que 95% desses eventos ocorreram até sete meses após a interrupção do imatinibe. Cabe notar que quase todos os pacientes continuaram sensíveis ao imatinibe e a RMC foi restaurada quando o imatinibe foi reiniciado. O estudo TWISTER fez observações semelhantes (Ross et ai., 2013). Embora esses estudos tenham demonstrado que é possível interromper o tratamento com TKI e que alguns pacientes podem ser curados, a interrupção de TKI deve ser realizada apenas em ensaios clínicos e com o paciente sob rigoroso monitoramento (Jabbour e Kantarjian, 2016). O principal motivo da recorrência molecular após interrupção do tratamento com TKI é a doença residual mínima (DRM), que é a persistência na medula óssea de células de LMC residuais (Bhatia et ai., 2003). Essas células-tronco de LMC independem da atividade de BCR-ABL1 para sobreviver e, portanto, a terapia com TKI é incapaz de eliminá-las (Corbin et ai., 2011).

[0029] Esses fatores indicam a necessidade de desenvolver novas estratégias terapêuticas que atuem contra as células-tronco de LMC independentes de BCR-ABL1 para erradicar a DRM. O fato de que o transplante de células-tronco alogênicas e a imunoterapia inespecífica com IFNoc podem induzir remissões prolongadas em alguns pacientes indica que a ação imunológica contra LMC é uma opção terapêutica viável. A imunoterapia contra antígenos específicos (peptídeos associados à junção BCR-ABL) se mostrou capaz de induzir respostas de células T específicas para peptídeos e efeitos antitumorais em boa parte dos pacientes em dois estudos separados de vacinação de fase 2 (Bocchia et ai., 2005; Cathcart et ai., 2004). Entretanto, a ação contra esses alvos específicos para LMC só ocorre em um

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10/196 subconjunto de pacientes que expressam os alotipos de HLA apropriados. Outros possíveis alvos usados na imunoterapia da LMC são antígenos sobrexpressos (por exemplo fator de transcrição do dedo de zinco WT1), que se mostrou capaz de induzir células T CD8 citotóxicas capazes de matar células WT1⁺ em estudos clínicos do uso da vacinação contra neoplasias malignas mieloides (Rezvani et al., 2008; Keilholz et al., 2009). Outrossim, um receptor semelhante ao receptor de célula T específico para o peptídeo RMFPNAPYL derivado de WT1 em associação com HLA-A*02 se mostrou capaz de medir a citotoxicidade dependente de anticorpos em xenoenxertos de leucemia humana (Dao et al., 2013). Outros antígenos associados à leucemia encontrados na LMC são o receptor de mobilidade associado ao ácido hialurônico (RHAMM) (Greiner et al., 2002), PPP2R5C (Zheng et al.,

2011) , PR1, PR3, PPP2R5C, ELA2, PRAME (Smahel, 2011) e um epítopo derivado da fosfoproteína de fase M do tipo 11 (MPP11) (Al et al., 2010). A maioria dos antígenos descritos nesses estudos foi identificada por imunologia reversa e previsões, sem evidências diretas de apresentação associada à LMC por moléculas de HLA.

[0030] Devido à disponibilidade de TKI, o tratamento imunoestimulatório contra LMC vem sendo reavaliado. Um exemplo é o estudo da associação de IFNoc com TKI em pacientes com a mutação T315I, que confere resistência a vários TKI (Itonaga et al.,

2012) . Um relato de caso constatou indução de resposta molecular acentuada em um paciente, que pôde interromper o tratamento (Hander et al., 2014). Outros estudos estão investigando a eficácia de inibidores de checkpoint imune como o a-CTLA4 (ipilimumabe) e aPD1 (nivolumabe). A combinação de tratamentos contra antígenos específicos é uma abordagem promissora para erradicação da DRM em pacientes com LMC e para tratamento de clones multirresistentes a TKI.

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[0031] Leucemia mieloide aguda - O tratamento da LMA é dividido em duas fases: indução e pós-remissão, esta última também denominada terapia de consolidação. A indução visa a induzir a remissão da doença e consiste em poliquimioterapia. A consolidação consiste em mais quimioterapia ou em transplante de células hematopoiéticas (TCH) (Showel e Levis, 2014).

[0032] Os quimioterápicos mais usados para tratar a LMA são a citarabina, daunorrubicina, idarrubicina e mitoxantrona, seguidas da cladribina, fludarabina e vários outros. A azacitidina e a decitabina, dois agentes hipometiladores de DNA, são usados atualmente para tratar SDM e LMA. O tratamento da LMA do subtipo M3 da LPA usa o ácido transretinoico (ATRA) e o trióxido de arsênio (ATO) (National Cancer Institute, 2015).

[0033] O tratamento padrão da LMA é denominado 3+7: 3 dias de idarrubicina ou daunorrubicina seguidos de 7 dias de citarabina e vários ciclos semelhantes para obter remissão completa (RC) (Estey, 2014). A escolha entre o tratamento padrão e o ingresso em ensaios clínicos depende da estratificação de risco.

[0034] Na LMA com cariótipo de risco intermediário, não existem anomalias cariotípicas ou são observadas apenas uma ou duas anomalias que não são classificadas como de alto ou de baixo risco.

[0035] As mutações de FLT3 estão associadas com uma forma de LMA agressiva e com mau prognóstico e frequentemente ocorrem ao mesmo tempo que mutações de NPM1 e DNMT3a (DNA metiltransferase 3A). As mutações de NPM1 (nucleofosmina) são um indicador de prognóstico favorável em casos sem mutações concomitantes de FLT3. As mutações de CEPBA (proteína alfa ligante do promotor CCAAT ou do C/EBPoc) conferem aumento de sobrevida em casos com mutações de CEBPA duplas ou homozigotas sem expressão do tipo selvagem. Alguns genes apresentam padrões de

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12/196 metilação anormais causados por mutações da isocitrato desidrogenase (IDH1 e IDH2) e da DNMT3A. Essas mutações estão associadas com sobrevida reduzida.

[0036] São casos de LMA com cariótipo indicativo de risco favorável a LPA (leucemia promielocítica aguda) e a leucemia com o fator ligante nuclear CBF (core-binding factor). A LPA está associada com fusão do fator PML de transcrição mieloide com a subunidade alfa do receptor de ácido retinoico (RARA). A translocação PML/RARA é uma mutação indicativa de prognóstico favorável. As leucemias com CBF apresentam translocações que envolvem uma subunidade do CBF: na translocação t(8;21), o CBF alfa se funde com o gene ETO; na translocação inv(16), o CBF se funde com a cadeia pesada da miosina de músculo liso. As translocações de CBF beta são mutações que acarretam prognóstico muito favorável.

[0037] Na LMA, os cariótipos que indicam risco desfavorável são complexos e incluem aberrações cromossômicas como translocações, rearranjos desequilibrados e ganho ou perda de cromossomos inteiros. Tais achados estão associados com mau prognóstico.

[0038] Os casos de SMD e LMA secundários a síndromes mielodisplásicas têm prognóstico pior que outros subgrupos de LMA (Showel e Levis, 2014).

[0039] Além dos fatores prognósticos listados acima, outros marcadores moleculares ou combinações de marcadores também permitem avaliar o prognóstico de subconjuntos citogenéticos específicos:

[0040] As anomalias genéticas mais desfavoráveis na LMA são as mutações de TP53. A associação de mutações de NPM1 e FLT3 WT com uma mutação em IDH1 ou IDH2 é considerada favorável. Por outro lado, são consideradas desfavoráveis duplicação parcial em tandem do gene MLL, mutação do gene TET2, FLT3 ITD+ junto com

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13/196 mutação de DNMT3a e CEBPA, e FLT3 ITD- com mutação de ASXL1 ou PHF6 e expressão de CD25 (assinatura semelhante à de célulatronco, que é associada com evolução menos favorável). Em pacientes com translocações favoráveis como inv(16) ou t(8;21), mutações de CKIT afetam o prognóstico, levando-o a um nível mais intermediário. O SPARC é sobrerregulado em pacientes NK (cariótipo normal) com assinatura de expressão gênica desfavorável e subregulado em associação com a mutação de NPM1, que é favorável. A sobrexpressão de miR-155 piora o prognóstico da LMA NK. As regiões com metilação diferencial (DMRs) servem como indicadoras prognosticas quando encontradas em associação com vários genes (mutação de FLT3 e mutação de NPM1). Nesse caso, níveis mais baixos de expressão estão associados com um prognóstico melhor (Estey, 2014).

[0041] As decisões sobre o tratamento subsequente devem levar em consideração informações obtidas após o tratamento e a presença de doença residual mínima (DRM), incluindo a resposta ao tratamento de indução, detecção de DRM por PCR de produtos de transcrição de fusão, genes com mutações ou sobrexpressão gênica e citometria de fluxo multiparamétrica para observação de expressão de antígenos aberrantes na superfície celular.

[0042] Recomenda-se que pacientes em grupos de prognóstico desfavorável ou intermediário devem participar de ensaios clínicos. São opções de tratamento os agentes hipometilantes (AHM) como a azacitidina e a decitabina; o CPX-351, que é uma formulação lipossômica de daunorrubicina e citarabina na proporção molar ideal de 1:5; e volasertibe, um inibidor das pólo quinases. O volasertibe é usado em associação com citarabina em baixas doses (CBD). Em casos com FLT3 mutante, podem ser administrados vários inibidores de FLT3, tais como sorafenibe (usado em combinação com 3+7),

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14/196 quizartinibe (inibidor mais seletivo de FLT3 ITD que também inibe a CKIT), crenolanibe e midostaurina (inibidor não seletivo de FLT3 ITD). Outra opção de tratamento são os conjugados de droga e anticorpo anti-CD33 (anti-CD33 e calequiamicina, SGN-CD33a, anti-CD33 e actínio-225), anticorpos biespecíficos (que reconhecem CD33 e CD3 (AMG 330) ou CD33 e CD16) e receptores antigênicos quiméricos (CARS) (Estey, 2014).

[0043] Como o tratamento do câncer é dispendioso e produz graves efeitos colaterais, existe uma necessidade de identificação de fatores que possam ser usados no tratamento do câncer em geral e das leucemias linfocítica crônica, mieloide crônica e mieloide aguda em particular. Também é necessário identificar fatores que representem biomarcadores de câncer em geral e das leucemia linfocítica crônica, mieloide crônica e mieloide aguda em particular. Isso permitiría melhorar o diagnóstico, a avaliação do prognóstico e a previsão da eficácia do tratamento do câncer.

[0044] A imunoterapia age sobre antígenos associados a tumores existentes e serve como opção que age especificamente sobre as células tumorais e, ao mesmo tempo, minimiza os efeitos colaterais.

[0045] A classificação atual de antígenos associados a tumores (AATs) compreende os seguintes grupos principais:

[0046] a. Antígenos de câncer e testículo: Os primeiros AATs reconhecíveis por células T a serem identificados pertencem a essa classe, que foi denominada inicialmente antígenos de câncer e testículo (CT) porque seus membros são expressos em tumores humanos de diversas histologias mas, em tecidos normais, ocorrem apenas em espermatócitos e espermatogônias nos testículos e, ocasionalmente, na placenta. Como as células testiculares não expressam moléculas de HLA classe I e II, esses antígenos não podem ser reconhecidos pelas células T em tecidos normais e podem,

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15/196 portanto, ser considerados imunologicamente específicos para o tumor. Alguns exemplos mais bem conhecidos de antígenos de CT são os membros da família MAGE e o NY-ESO-1.

[0047] b. Antígenos de diferenciação: Estes AATs são compartilhados por tumores e pelos tecidos normais dos quais o tumor se originou, e a maioria dos antígenos de diferenciação conhecidos se concentram em melanomas e em melanócitos normais. Muitas dessas proteínas relacionadas à linhagem melanocitária participam da biossíntese da melanina e, portanto, não são específicas para tumores, embora sejam amplamente utilizadas para imunoterapia do câncer. Alguns exemplos são, entre outros, a tirosinase e MelanA/MART-1 em melanoma e PSA em câncer de próstata.

[0048] c. AATs sobrexpressos: Os genes que codificam AATs amplamente expressos foram detectados tanto em tumores de diversos tipos histológicos como em muitos tecidos normais, geralmente com níveis de expressão mais baixos. É possível que muitos dos epítopos processados e que podem ser apresentados por tecidos normais estejam abaixo do limiar para reconhecimento pelas células T, ao passo que sua sobrexpressão em células tumorais pode desencadear uma resposta anticâncer ao quebrar a tolerância estabelecida anteriormente. Alguns exemplos conhecidos desta classe de AAT são o Her-2/neu, a survivina e a telomerase ou WT1.

[0049] d. Antígenos específicos para tumores: Estes AATs únicos se originam de mutações de genes normais (por exemplo β-catenina, CDK4, etc.). Algumas dessas alterações moleculares estão associadas a transformação e/ou progressão neoplásica. Os antígenos específicos para tumores são geralmente capazes de induzir fortes respostas imunológicas sem criar risco de reações imunes contra tecidos normais. Por outro lado, estes AATs são, na maioria dos casos, relevantes apenas ao tumor específico em que foram

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16/196 identificados e geralmente não são compartilhados por vários tumores individuais. Um peptídeo também pode ser específico para tumores (ou associado a tumores) se for originário de um éxon presente em (ou associado a) um tumor no caso de proteínas com isoformas específicas para (ou associadas a) tumores.

[0050] e. AATs originários de modificações anormais após a tradução: Estes AATs podem se originar de proteínas que não são nem específicas nem sobrexpressas em tumores, mas mesmo assim tornam-se associadas a tumores por processos pós-tradução que ocorrem preponderantemente em tumores. Alguns exemplos dessa classe surgem de alterações de padrões de glicosilação, que produzem novos epítopos em tumores como no MUC1 ou eventos como splicing de proteínas durante a degradação, que podem ou não ser específicos para tumores.

[0051] f. Proteínas oncovirais: Estes AATs são proteínas virais que podem desempenhar um importante papel no processo oncogênico e, por serem de origem estranha (não humana), podem produzir respostas de células T. São exemplos destas proteínas as proteínas do papilomavírus humano tipo 16, E6 e E7, que são expressas no carcinoma de colo do útero.

[0052] A imunoterapia baseada em células T age contra epítopos peptídicos derivados de proteínas associadas a ou específicas para tumores, que são apresentadas por moléculas do complexo principal de histocompatibilidade (MHC). Os antígenos reconhecidos por linfócitos T específicos para tumores, ou seja, epítopos dos mesmos, podem ser moléculas derivadas de todas as classes de proteínas, como enzimas, receptores, fatores de transcrição, etc., que são expressas e normalmente apresentam regulação positiva em células do tumor em comparação com células inalteradas da mesma origem.

[0053] As moléculas de MHC podem ser de duas classes: MHC

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17/196 classe I e MHC classe II. As moléculas de MHC classe I consistem em uma cadeia pesada alfa e em uma beta-2 microglobulina, As moléculas de MHC classe II consistem em uma cadeia alfa e outra beta. Sua conformação tridimensional produz um sulco de ligação, que é usado na interação não covalente com peptídeos.

[0054] As moléculas de MHC classe I são encontradas na maioria das células nucleadas. Elas apresentam peptídeos derivados da divagem proteolítica de proteínas predominantemente endógenas, produtos ribossômicos defeituosos (DRIPs) e peptídeos maiores. Entretanto, os peptídeos derivados de compartimentos endossômicos ou de fontes exógenas também são frequentemente encontrados em moléculas de MHC classe I. Na literatura, essa apresentação não clássica de MHC classe I é denominada apresentação cruzada (Brossart e Bevan, 1997; Rock et al., 1990). As moléculas de MHC classe II são encontradas predominantemente em células apresentadores de antígenos (CAA) profissionais e apresentam sobretudo peptídeos de proteínas exógenas ou de proteínas transmembrana, que são captadas pelas CAA, por exemplo, durante a endocitose e depois processadas.

[0055] Os complexos formados por peptídeos e MHC classe I são reconhecidos por células T CD8-positivas que apresentam o receptor de célula (TCR) apropriado, ao passo que complexos de peptídeos com moléculas de MHC classe II são reconhecidos por células T auxiliares CD4-positivas que apresentam o TCR apropriado. É bem sabido que, em razão dessa modalidade o TCR, o peptídeo e o MHC estão presentes em proporções estequiométricas de 1:1:1.

[0056] As células T auxiliares CD4-positivas desempenham um importante papel em induzir e manter respostas eficazes de células T citotóxicas CD8-positivas. A identificação de epítopos CD4-positivos de células T derivados de antígenos associados a tumores (AAT) é de

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18/196 enorme importância para o desenvolvimento de produtos farmacêuticos para desencadear respostas imunes antitumorais (Gnjatic et ai., 2003). No sítio do tumor, as células T auxiliares suportam um meio com células T citotóxicas propício para LTC (Mortara et ai., 2006) e atraem células efetoras como, por exemplo, LTCs, células natural killer (NK), macrófagos e granulócitos (Hwang etal., 2007).

[0057] Na ausência de inflamação, a expressão de moléculas de MHC classe II restringe-se basicamente a células do sistema imunológico, especialmente células apresentadoras de antígenos (CAA) profissionais, como monócitos, células derivadas de monócitos, macrófagos e células dendríticas. Em pacientes com câncer, constatou-se que as células tumorais expressam moléculas de MHC classe II (Dengjel et ai., 2006).

[0058] Os peptídeos longos (prolongados) da invenção podem atuar como epítopos ativos de MHC classe II.

[0059] As células T auxiliares ativadas por epítopos do MHC classe II desempenham um importante papel em orquestrar a função efetora de LTC na imunidade antitumoral. Os epítopos de células T auxiliares que desencadeiam a resposta de células T auxiliares do tipo TH1 auxiliam as funções efetoras de células T killer CD8-positivas, incluindo funções citotóxicas dirigidas contra células tumorais cujas superfícies apresentam complexos de peptídeos associados a tumor e MHC. Desse modo, os epítopos peptídicos em células T auxiliares associadas a tumores podem, isoladamente ou em associação com outros peptídeos associados a tumores, atuar como ingredientes farmacêuticos ativos de composições vacinais que estimulam respostas imunes antitumorais.

[0060] Mostrou-se em modelos animais mamíferos (por exemplo camundongos) que, mesmo na ausência de linfócitos T CD8-positivos,

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19/196 as células T CD4-positivas são suficientes para inibir a manifestação de tumores por meio da inibição da angiogênese mediada pela secreção de interferon gama (IFNy) (Beatty e Paterson, 2001; Mumberg et al., 1999). Algumas evidências indicam que as células T CD4 exercem efeitos antitumorais diretos (Braumuller et al., 2013; Tran et al., 2014).

[0061] Como a expressão constitutiva de moléculas de HLA classe II é geralmente limitada a células imunológicas, a possibilidade de isolar peptídeos de classe II diretamente de tumores primários era considerada implausível. Entretanto, Dengjel et al. conseguiram identificar uma série de epítopos de MHC classe II diretamente em tumores (WO 2007/028574, EP 1 760 088 B1).

[0062] Como ambos os tipos de resposta (a dependente de CD4 e a dependente de CD8) contribuem conjunta e sinergisticamente para o efeito antitumoral, a identificação e caracterização de antígenos associados a tumores reconhecidos tanto por células T CD8+ (cujo ligante é a molécula de MHC classe I e seu epítopo peptídico) como por células T auxiliares CD4-positivas (cujo ligante é a molécula de MHC classe II e seu epítopo peptídico) são importantes para o desenvolvimento de vacinas antitumorais.

[0063] Para que um peptídeo de MHC classe I possa desencadear (provocar) uma resposta imune celular, ele precisa ligar-se a uma molécula de MHC. O processo depende do alelo da molécula de MHC e de polimorfismos específicos da sequência de aminoácidos do peptídeo. Os peptídeos ligantes de MHC classe I geralmente possuem 8 a 12 resíduos de aminoácidos de comprimento e geralmente contêm dois resíduos conservados (âncoras) em suas sequências que interagem com o sulco de ligação correspondente da molécula de MHC. Dessa forma, cada alelo de MHC possui um motivo de ligação que determina quais peptídeos podem se ligar especificamente ao

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20/196 sulco de ligação.

[0064] Nas reações imunes dependentes do MHC classe I, os peptídeos precisam tanto ser capazes de se ligarem a certas moléculas de MHC classe I expressas em células tumorais como serem posteriormente reconhecidos por células T que apresentam receptores de células T (TCR) específicos.

[0065] Para as proteínas serem reconhecidas pelos linfócitos T como antígenos específicos para ou associados a tumores e serem usadas como tratamentos, alguns pré-requisitos precisam ser atendidos. O antígeno deve ser expresso sobretudo em células tumorais e ser expresso relativamente pouco ou nada em tecidos normais saudáveis. Em uma modalidade preferida, o peptídeo deve ser apresentado de maneira exacerbada pelas células tumorais em comparação com os tecidos normais. Outrossim, é desejável também que o respectivo antígeno esteja presente em concentrações elevadas (isto é, números de cópias do respectivo peptídeo por célula) em apenas um determinado tipo de tumor. Os antígenos específicos para ou associados a tumores são frequentemente derivados de proteínas que participam diretamente da transformação de uma célula normal em uma célula tumoral devido à sua função (por exemplo controle do ciclo celular ou supressão da apoptose). Além disso, alvos distais da proteína que causa diretamente a transformação podem apresentar regulação positiva e, portanto, associarem-se indiretamente ao tumor. Tais antígenos associados indiretamente a tumores também podem ser alvos de abordagens vacinais (Singh-Jasuja et al., 2004). É essencial que os epitopes estejam presentes na sequência de aminoácidos do antígeno para garantir que o peptídeo (peptídeo imunogênico) derivado de um antígeno associado a tumor produza uma resposta de células T in vivo ou in vitro.

[0066] Basicamente, qualquer peptídeo capaz de se ligar a uma

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21/196 molécula de MHC pode funcionar como epítopo de célula T. Um prérequisito para indução de resposta de células T in vitro ou in vivo é a presença de uma célula T com um TCR correspondente e ausência de tolerância imunológica para o epítopo em questão.

[0067] Portanto, os AATs servem como ponto de partida para o desenvolvimento de tratamentos à base de células T, incluindo, entre outros, vacinas antitumorais. Os métodos utilizados para identificar e caracterizar os AATs normalmente se baseiam na utilização de células T, que podem ser isoladas de pacientes ou de indivíduos saudáveis ou baseadas na geração de perfis diferentes de transcrição ou de expressão peptídica em tumores e em tecidos normais. Entretanto, a identificação de genes sobrexpressos em tecidos tumorais ou em linhagens de tumores humanos ou expressos seletivamente em tais tecidos ou linhagens celulares não proporciona informações precisas sobre a utilização dos antígenos que são transcritos a partir desses genes em imunoterapia. Isso ocorre porque apenas uma determinada subpopulação de epítopos desses antígenos é apropriada para tal aplicação, pois uma célula T com um TCR correspondente precisa estar presente e é preciso que haja pouca ou nenhuma tolerância imunológica ao epítopo em questão. Portanto, é importante, em uma modalidade bastante preferida da invenção, selecionar apenas peptídeos sobrexpressos ou apresentados seletivamente contra os quais se possa encontrar células T funcionais e/ou em proliferação. Tais células T funcionais são definidas como células T que, quando estimuladas por um antígeno específico, podem se expandir de forma clonal e são capazes de executar funções efetoras (célula T efetora).

[0068] No caso de TCRs específicos contra complexos de peptideo com MHC (por exemplo TCRs solúveis) e anticorpos ou outras moléculas ligantes (suportes) de acordo com a invenção, a imunogenicidade dos peptídeos subjacentes é secundária. Nesses

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22/196 casos, o fator determinante é a apresentação.

SUMÁRIO DA INVENÇÃO

[0069] Em um primeiro aspecto da presente invenção, a mesma refere-se a um peptídeo que compreende uma sequência de aminoácidos selecionada do grupo formado por SEQ ID N^Q 1 a SEQ ID N^Q 279 ou a uma sequência variante dos mesmos com pelo menos 77% de homologia, e preferivelmente pelo menos 88% de homologia (preferivelmente pelo menos 77% ou pelo menos 88% idêntica) com SEQ ID N- 1 a SEQ ID N^Q 279, caracterizado pelo fato de que a referida variante se liga ao MHC e/ou induz reação cruzada de células T com o referido peptídeo, ou um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo no qual o referido peptídeo não corresponde ao polipeptideo completo original.

[0070] A presente invenção refere-se a um peptídeo da presente invenção que compreende uma sequência selecionada do grupo formado por SEQ ID N- 1 a SEQ ID N^Q 279 ou uma variante das mesmas que seja pelo menos 77%, e preferivelmente pelo menos 88%, homóloga (preferivelmente pelo menos 77% ou pelo menos 88% idêntica) à SEQ ID N- 1 a SEQ ID N^Q 279, sendo que cada um dos peptídeos referidos ou variantes dos mesmos possui comprimento total de 8 a 100, preferivelmente de 8 a 30 e, mais preferivelmente, de 8 a 14 aminoácidos.

[0071] As tabelas a seguir mostram os peptídeos de acordo com a presente invenção, seus respectivos números de SEQ e os genes que podem originá-los (subjacentes). Na Tabela 1, os peptídeos com SEQ ID N^Q 1 a SEQ ID N^Q 16 se ligam ao HLA-A*01, peptídeos com SEQ ID N^Q 17 a SEQ ID N^Q 27 se ligam ao HLA-A*02, peptídeos com SEQ ID

N^Q 28 a SEQ ID N^Q 52 se ligam ao HLA-A*03, peptídeos com SEQ ID

N^Q 53 a SEQ ID N^Q 76 se ligam ao HLA-A*24, peptídeos com SEQ ID

N^Q 77 a SEQ ID N^Q 106 se ligam ao HLA-B*07, peptídeos com SEQ ID

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N^Q 107 a SEQ ID N^Q 121 se ligam ao HLA-B*08, peptídeos com SEQ ID N^Q 122 a SEQ ID N^Q 187 se ligam ao HLA-B*44. Os peptídeos da Tabela 2 foram revelados anteriormente em grandes listas geradas por triagens de alto rendimento, mas com altas taxas de erro, ou calculados por algoritmos, mas nenhum deles havia sido associado com câncer até agora. Na Tabela 2, os peptídeos com SEQ ID N^Q 188 a SEQ ID N^Q 196 se ligam ao HLA-A*01, peptídeos com SEQ ID N^Q 197 a SEQ ID N^Q 207 se ligam ao HLA-A*02, peptídeos com SEQ ID N^Q 208 a SEQ ID N^Q 221 se ligam ao HLA-A*03, peptídeos com SEQ ID N^Q 222 a SEQ ID N^Q 224 se ligam ao HLA-A*24, peptídeos com SEQ ID N^Q 225 a SEQ ID N^Q 255 se ligam ao HLA-B*07, peptídeos com SEQ ID N^Q 256 se ligam ao HLA-B*08, peptídeos com SEQ ID N^Q 257 a SEQ ID N^Q 277 se ligam ao HLA-B*44. Os peptídeos na Tabela 3 são peptídeos adicionais que podem ser especialmente úteis em associação com outros peptídeos da invenção. Na Tabela 3, os peptídeos com SEQ ID N^Q 278 se ligam ao HLA-A*02, peptídeos com SEQ ID N^Q 279 se ligam ao HLA-A*24.

Tabela 1: Peptídeos de acordo com a presente invenção.

SEQ ID Ne	Sequência	Símbolo(s) oficial(is) do gene	Alótipo de HLA
1	LTEGHSGNYY	FCRL5	A*01
2	TMIRIFHRY	S100Z	A*01/B*15
3	YINPAKLTPY	CARD11	A*01/A*03
4	ALDQNKMHY	CPA3	A*01
5	GTDVLSTRY	CPA3	A*01
6	VTEGVAQTSFY	HLA-DOA	A*01
7	FMDSESFYY	INPP5F	A*01
8	STDSAGSSY	PAX5	A*01
9	YSHPQYSSY	PAX5	A*01/B*15
10	YSDIGHLL	SESN3	A*01
11	AAADHHSLY	SOX4	A*01/A*32
12	ATDIVDSQY	T	A*01
13	ITDIHIKY	VPS13C	A*01

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SEQ ID Ne	Sequência	Símbolo(s) oficial(is) do gene	Alótipo de HLA
14	TFDLTVVSY	VPS13C	A*01
15	SVADIRNAY	WDFY4	A*01/A*32
16	WIGDKSFEY	ZNF121	A*01/A*29
17	KAYNRVIFV	MARCH1	A*02
18	YLLPSVVLL	AGPAT5	A*02
19	SLFEGIYTI	FLT3	A*02
20	FSLEDLVRI	KIAA0226L	A*02
21	FLFDKLLLI	PLEKHG1	A*02
22	ILHAQTLKI	RALGPS2	A*02/B*13
23	FAFSGVLRA	RREB1	A*02
24	KLGPVAVSI	SIPA1L3	A*02/B*13
25	YLNEKSLQL	ST8SIA6	A*02
26	SLYVQQLKI	SYNE2	A*02/B*13
27	RLIAKEMNI	WDFY4	A*02/B*13
28	VILESIFLK	BTK	A*03/A*11
29	RIYDEILQSK	CD84	A*03
30	RTYGFVLTF	DENND5B	A*03/A*32
31	ATFNKLVSY	DNMT3B	A*03/A*32
32	KTSNIVKIK	FCRL2	A*03
33	SVFEGDSIVLK	FCRL2	A*03/A*11
34	SVYSETSNMDK	GSAP	A*03/A*11
35	ATKSPAKPK	HIST1H1B	A*03
36	KAKAAAKPK	HIST1H1B	A*03
37	KAKKPAGAAK	HIST1H1E	A*03
38	KARKSAGAAK	HIST1H1E	A*03
39	IVIQLRAQK	HLA-DOB	A*03
40	RSKEYIRKK	KBTBD8	A*03
41	SVAHLLSKY	MAP3K1	A*03/B*15
42	SVSSSTHFTR	MAP3K1	A*03/A*11
43	KLMETSMGF	MGA	A*03/A*32
44	KVYDPVSEY	MTMR1	A*03/B*15
45	VVFPFPVNK	MYCN	A*03
46	RVFPSPMRI	PLCL2	A*03
47	SVLDLSVHK	PRDM2	A*03/A*11

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SEQ ID Ne	Sequência	Símbolo(s) oficial(is) do gene	Alótipo de HLA
48	RIKPPGPTAVPK	SCML2	A*03
49	GLLEEALFY	SMYD3	A*03/A*29
50	GVFNTLISY	TARBP1	A*03
51	ASTTVLALK	WDFY4	A*03/A*11
52	KAFNQSSTLTK	ZNF431, ZNF714, ZNF92, ZNF93	A*03
53	KYIEYYLVL	ADAM28	A*24
54	QQALNFTRF	AKAP13	A*24/B*15
55	IFVARLYYF	APOBEC3G	A*24
56	KYSSGFRNI	ATM	A*24
57	RFPPTPPLF	BCL11A	A*24
58	KYLADLPTL	CEP85L	A*24
59	GLYEGTGRLF	DNMT3A, DNMT3B	A*24
60	TQDPHVNAFF	DOCK10	A*24/B*38
61	IFKEHNFSF	FLT3	A*24
62	YYLSHLERI	GNA15	A*24
63	IYFSNTHFF	GPR114	A*24
64	SFQSKATVF	HOXA9	A*24
65	AYLKQVLLF	INPP5F	A*24
66	SQPAVATSF	MYB	A*24/B*15
67	VFLPSEGFNF	N4BP2	A*24
68	LYQDRFDYL	NLRP3	A*24
69	EYNTIKDKF	PARP15	A*24
70	LYSDIGHLL	SESN3	A*24
71	RYLGKNWSF	SPNS3	A*24
72	TYVENLRLL	SYNE2	A*24
73	TYPQLEGFKF	WDFY4	A*24
74	SYADNILSF	WDR11	A*24
75	RFYLLTEHF	ZNF121	A*24
76	KAFSWSSAF	ZNF92	A*24/A*32
77	RPNGNSLFTSA	AFF3	B*07
78	RPRGLALVL	CASP2	B*07
79	SPVPSHWMVA	CD79B	B*07
80	KPLFKVSTF	DOCK10	B*07

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SEQ ID Ne	Sequência	Símbolo(s) oficial(is) do gene	Alótipo de HLA
81	SESPWLHAPSL	FAIM3	B*07/B*40
82	APFGFLGMQSL	FAM129C	B*07
83	IPVSRPIL	FCRL1	B*07
84	SPKLQIAAM	FCRL1	B*07
85	IPVSHPVL	FCRL3	B*07
86	IPASHPVL	FCRL5	B*07
87	FPAPILRAV	FCRLA	B*07
88	MPDPHLYHQM	FCRLA	B*07
89	FPETVNNLL	HEATR5B	B*07
90	KPKAAKPKA	HIST1H1B	B*07
91	KPKAAKPKAA	HIST1H1B	B*07
92	KAKKPAGAA	HIST1H1E	B*07
93	KARKSAGAA	HIST1H1E	B*07
94	KPKAAKPKKAAA	HIST1H1E	B*07
95	KPKAAKPKTA	HIST1H1E	B*07
96	KPKKAPKSPA	HIST1H1E	B*07
97	LPFGKIPIL	HPGDS	B*07/B*51
98	YPIALTRAEM	IKZF3	B*07/B*35
99	SPRAINNLVL	KLHL14	B*07
100	YPYQERVFL	PIK3R6	B*07/B*35
101	NPRYPNYMF	ROR1	B*07
102	LPLSMEAKI	RREB1	B*07/B*35
103	IPANTEKASF	SCIMP	B*07/B*50
104	RPMTPTQIGPSL	TCL1A	B*07
105	NPLTKLLAI	TFEC	B*07/B*08
106	KAFKWFSAL	ZNF736	B*07
107	QAAQRTAL	AFF3	B*08
108	ILAIRQNAL	AGPAT5	B*08
109	LGHVRYVL	AGPAT5	B*08
110	FGLARIYSF	CDK6	B*08
111	VTLIKYQEL	CLEC17A	B*08/A*02
112	APLLRHWEL	HLA-DOA	B*08/B*07
113	DANSRTSQL	MAP3K1	B*08
114	HNALRILTF	NUP210	B*08

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SEQ ID Ne	Sequência	Símbolo(s) oficial(is) do gene	Alótipo de HLA
115	ELYQRIYAF	PIK3R6	B*08
116	TLKIRAEVL	RALGPS2	B*08
117	YIKTAKKL	RALGPS2	B*08
118	FEKEKKESL	SESN3	B*08
119	DLRTKEVVF	SIPA1L3	B*08
120	VPPKKHLL	TRRAP	B*08
121	RPKKVNTL	ZBTB24	B*08
122	KELPGVKKY	ADAM28	B*44
123	EENPGKFLF	ARHGAP24	B*44
124	SESLPKEAF	ATF7IP	B*44
125	SESTFDRTF	ATF7IP	B*44
126	EENKPGIVY	BTLA	B*44
127	TEYPVFVY	CACNA2D4	B*44
128	GENDRLNHTY	CCDC88A	B*44
129	GEGAYGKVF	CDK6	B*44
130	EEEHGKGREY	CHD1	B*44
131	EEFETIERF	CHD1	B*44
132	GELPAVRDL	CIITA	B*44/B*40
133	AEHNFVAKA	CLEC17A	B*44/B*50
134	SEYADTHYF	CLNK	B*44
135	NEIKVYITF	CPA3	B*44
136	AEYKGRVTL	FAIM3	B*44/B*40/B*49
137	GELGGSVTI	FAIM3	B*44/B*49
138	SQAPAARAF	FAM129C	B*44/B*15
139	RENQVLGSGW	FCRL2	B*44
140	EYDLKWEF	FLT3	B*44/A*23
141	REYEYDLKWEF	FLT3	B*44
142	TEIFKEHNF	FLT3	B*44
143	YEYDLKWEF	FLT3	B*44
144	TEGKRYFTW	GANC	B*44
145	AEPLVGQRW	GDF7	B*44
146	SESKTVVTY	ICOSLG	B*44
147	KEVPRSYEL	IKZF3	B*44/B*40
148	REYNEYENI	IKZF3	B*44/B*49

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SEQ ID Ne	Sequência	Símbolo(s) oficial(is) do gene	Alótipo de HLA
149	SEKETVAYF	INPP5F	B*44
150	EEVTDRSQL	IRF8	B*44/B*40
151	EVDASIFKAW	IRF8	B*44
152	AELLAKELY	KIAA0226L	B*44
153	KEFEQVPGHL	KIAA0226L	B*44/B*40
154	AEPGPVITW	LILRA4	B*44
155	NEFPVIVRL	LRRK1	B*44
156	FEVESLFQKY	MAP3K1	B*44
157	VEIAEAIQL	MAP3K1	B*44/B*40
158	GENEDNRIGL	MCOLN2	B*44/B*40
159	GELLGRQSF	MDM4	B*44
160	EEETILHFF	NEK8	B*44
161	EEGDTLLHLF	NFKBID	B*44
162	DEAQARAAF	NLRP3	B*44
163	EEWMGLLEY	NLRP3	B*44
164	SEYSHLTRV	NPR3	B*44/B*49
165	VELDLQRSV	PIK3R6	B*44
166	NEVLASKY	PLCL2	B*44/B*18
167	KEIGAAVQAL	PLEKHA2	B*44/B*40
168	QEIQSLLTNW	PLEKHG1	B*44
169	EENGEVKEL	PRDM2	B*44
170	SENEQRRMF	PYHIN1	B*44
171	SEDLAVHLY	RALGPS2	B*44
172	VEDGLFHEF	RBM15	B*44
173	KEYDFGTQL	RNF220	B*44/B*49
174	TDKSFPNAY	RNGTT	B*44/B*47
175	HEIDGKALFL	SCML2	B*44
176	AENAVSNLSF	SLAMF6	B*44
177	QENMQIQSF	SPG11	B*44
178	REYEHYWTEL	STAP1	B*44/B*50
179	AEIKQTEEKY	VAV3	B*44
180	EEPAFNVSY	VOPP1	B*44
181	GEIKEPLEI	VPS13C	B*44/B*40/B*49
182	AQNLSIIQY	WDFY4	B*44/B*15

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SEQ ID Ne	Sequência	Símbolo(s) oficial(is) do gene	Alótipo de HLA
183	GESQDSTTAL	WDFY4	B*44/B*40
184	RMPPFTQAF	WDFY4	B*44/B*15
185	SEGDNVESW	ZCCHC7	B*44
186	NEQKIVRF	ZNF699	B*44/B*18
187	SDAQRPSSF	ZNF831	B*44/B*37

Tabela 2: Outros peptídeos de acordo com a presente invenção que nunca haviam sido associados com câncer.

SEQ ID Ne	Sequência	Símbolo(s) oficial(is) do gene	Alótipo de HLA
188	YVDAGTPMY	AGPAT5	A*01
189	VTEEPQRLFY	BMF	A*01
190	HVDQDLTTY	CDK6	A*01
191	ISEAGKDLLY	CNTRL	A*01
192	RSDPGGGGLAY	MEX3B	A*01
193	LTDSEKGNSY	RALGPS2	A*01
194	YTDKKSIIY	STAP1	A*01
195	YSDKEFAGSY	TBC1D9	A*01
196	FTDIDGQVY	WDR11	A*01
197	SLADVHIEV	BTAF1	A*02
198	KLLGYDVHV	CASP2	A*02
199	AMPDSPAEV	CBFA2T3	A*02
200	VMLQINPKL	CCDC88A	A*02
201	ILAAVETRL	FBXO28	A*02
202	MVALPMVLV	ITGB7	A*02
203	FLLPKVQSI	KIAA0922	A*02
204	FLLPKVQSIQL	KIAA0922	A*02
205	FLINTNSEL	PDE4A, PDE4B, PDE4C, PDE4D	A*02
206	SLMDLQERL	STIM2	A*02
207	KLSDNILKL	SYNE2	A*02/B*13
208	KLNPQQAPLY	AKAP13	A*03
209	KTLPAMLGTGK	BTLA	A*03/A*11

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SEQ ID Ne	Sequência	Símbolo(s) oficial(is) do gene	Alótipo de HLA
210	RMYSQLKTLQK	DNMBP	A*03
211	ATYNKQPMYR	DNMT3A	A*03
212	LLWHWDTTQSLK	FCER2	A*03
213	RVYNIYIRR	GPR114	A*03/A*32
214	ATGAATPKK	HIST1H1E	A*03/A*11
215	KATGAATPK	HIST1H1E	A*03
216	RIKAPSRNTIQK	MAP3K1	A*03
217	TTVPHVFSK	MAP3K1	A*03/A*11
218	RVLTGVFTK	PARP15	A*03
219	HSYSSPSTK	RBM15	A*03
220	SISNLVFTY	SOX4	A*03/A*29
221	LLNRHILAH	ZNF669	A*03
222	RYLDEINLL	GNA15	A*24
223	RRMYPPPLI	VOPP1	A*24/B*27
224	VYEYVVERF	ZCCHC11	A*24
225	LPARFYQAL	AGPAT5	B*07
226	YLNRHLHTW	BCL2	B*07/A*32
227	APINKAGSFL	BLK	B*07
228	SPRITFPSL	BLK	B*07
229	SPLGSLARSSL	CARD11	B*07
230	KPMKSVLVV	CCR7	B*07
231	MPLSTIREV	CDK6	B*07/B*51
232	APRPAGSYL	CIITA	B*07
233	SPRVYWLGL	CLEC17A	B*07
234	SPKESENAL	DEPDC5	B*07
235	SPSLPSRTL	DEPDC5	B*07
236	RPSNKAPLL	EHMT1	B*07
237	SPWLHAPSL	FAIM3	B*07
238	SPRSWIQVQI	FCRL5	B*07
239	APSKTSLIM	FOXP1	B*07
240	SPSLPNITL	HDAC4, HDAC9	B*07
241	APAPAEKTPV	HIST1H1E	B*07
242	SPFSFHHVL	ITGB7	B*07/B*35

Petição 870190100586, de 08/10/2019, pág. 50/391

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SEQ ID Ne	Sequência	Símbolo(s) oficial(is) do gene	Alótipo de HLA
243	LPKVQSIQL	KIAA0922	B*07
244	MPSSDTTVTF	MAP3K1	B*07/B*35
245	SPLSHHSQL	MAP3K1	B*07
246	YPGWHSTTI	MYB	B*07/B*51
247	QPSPARAPAEL	PMAIP1	B*07
248	LPYDSKHQI	PTPN22	B*07/B*51
249	SPADHRGYASL	SOX4	B*07
250	VPNLQTVSV	SP4	B*07/B*51
251	QPRLFTMDL	TRRAP	B*07
252	RPHIPISKL	UBASH3B	B*07
253	RPFADLLGTAF	WDFY4	B*07
254	SPRNLQPQRAAL	WDFY4	B*07
255	YPGSDRIML	WDFY4	B*07
256	SPYKKLKEAL	TRAPPC10	B*08
257	KEFFFVKVF	AIM2	B*44
258	EELFRDGVNW	BCL2	B*44
259	EENTLVQNY	BTAF1	B*44
260	AEIGEGAYGKVF	CDK6	B*44
261	NEIEHIPVW	CNTRL	B*44
262	QENQAETHAW	CXCR5	B*44
263	REAGFQVKAY	FCRLA	B*44
264	SEDHSGSYW	FCRLA	B*44
265	QEVDASIFKAW	IRF8	B*44
266	VDASIFKAW	IRF8	B*44
267	KEKFPINGW	MTMR1	B*44
268	NEDKGTKAW	MYSM1	B*44
269	KELEDLNKW	PDE4B	B*44
270	AESEDLAVHL	RALGPS2	B*44/B*40
271	AESEDLAVHLY	RALGPS2	B*44
272	KEFELRSSW	STIM2	B*44
273	AEIEIVKEEF	SYNE2	B*44
274	GEAVTDHPDRLW	TCL1A	B*44
275	TENPLTKLL	TFEC	B*44

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SEQ ID Ne	Sequência	Símbolo(s) oficial(is) do gene	Alótipo de HLA
276	EEEGNLLRSW	WDFY4	B*44
277	EEGNLLRSW	WDFY4	B*44

Tabela 3: Peptídeos úteis para, por exemplo, tratamentos anticâncer personalizados.

SEQ ID NQ	Sequência	Símbolo(s) oficial(is) do gene	Alótipo de HLA
278	YLDRKLLTL	SYK	A*02
279	LYIDRPLPYL	FAM21A, FAM21B, FAM21C	A*24

[0072] A presente invenção geral mente se refere também aos peptídeos de acordo com a presente invenção para uso no tratamento de doenças proliferai ivas, tais como, por exemplo, neoplasias linfoides (por exemplo linfoma não Hodgkin, distúrbios linfoproliferativos póstransplante (DLPT), neoplasias mieloides (por exemplo mielofibrose primária, trombocitopenia essencial, policitemia vera) e outras neoplasias como carcinoma hepatocelular, carcinoma colorretal, glioblastoma, câncer gástrico, câncer de esôfago, câncer de pulmão de células não pequenas, câncer de pulmão de pequenas células, câncer de pâncreas, carcinoma de células renais, câncer de próstata, melanoma, câncer de mama, câncer da vesícula e das vias biliares, câncer de bexiga, câncer de útero, carcinoma de células escamosas de cabeça e pescoço e mesotelioma.

[0073] São particularmente preferidos, isoladamente ou em associações, os peptídeos de acordo com a presente invenção selecionados do grupo formado por SEQ ID N^Q 1 a SEQ ID N^Q 279.

São particularmente preferidos, isoladamente ou em associações, os peptídeos selecionados do grupo formado por SEQ ID N- 1 a SEQ ID

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N^Q 187 (ver Tabela 1) e seu uso na imunoterapia da leucemia linfocítica crônica (LLC), leucemia mieloide aguda (LMA), leucemia mieloide crônica (LMC) e outras neoplasias linfoides (por exemplo linfoma não Hodgkin), distúrbios linfoproliferativos pós-transplante (DLPT), assim como outras neoplasias linfoides (por exemplo mielofibrose primária, trombocitopenia essencial, policitemia vera) e outras neoplasias como carcinoma hepatocelular, carcinoma colorretal, glioblastoma, câncer gástrico, câncer de esôfago, câncer pulmão de células não pequenas, câncer de pulmão de pequenas células, câncer de pâncreas, câncer carcinoma de células renais, câncer de próstata, melanoma, câncer de mama, câncer da vesícula biliar e colangiocarcinoma, câncer de bexiga, câncer do útero, carcinoma de células escamosas de cabeça e pescoço, mesotelioma e, preferivelmente, leucemia linfocítica crônica, leucemia mieloide crônica e leucemia mieloide aguda.

[0074] Uma combinação especialmente preferida dos peptídeos de acordo com a presente invenção inclui peptídeos apresentados pelos sete alotipos mais comuns de HLA-A e B (ver Tabelas anteriores), que permitem criar medicamentos que proporcionam cobertura genética para mais de 92% dos pacientes na Europa.

[0075] Portanto, outro aspecto da presente invenção refere-se ao uso dos peptídeos de acordo com a presente invenção, preferivelmente em associações, para tratamento de uma das doenças proliferativas do grupo formado por leucemia linfocítica crônica, leucemia mieloide crônica e leucemia mieloide aguda; outras neoplasias linfoides (por exemplo linfoma não Hodgkin, distúrbios linfoproliferativos pós-transplante (DLPT)) e outras neoplasias mieloides (por exemplo mielofibrose primária, trombocitopenia essencial, policitemia vera); e outras neoplasias como carcinoma hepatocelular, carcinoma colorretal, glioblastoma, câncer gástrico,

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34/196 câncer de esôfago, câncer de pulmão de células não pequenas, câncer de pulmão de pequenas células, câncer de pâncreas, carcinoma de células renais, câncer de próstata, melanoma, câncer de mama, câncer da vesícula biliar e colangiocarcinoma, câncer de bexiga, câncer do útero, carcinoma de células escamosas de cabeça e pescoço e mesotelioma.

[0076] A presente invenção refere-se também aos peptídeos de acordo com a presente invenção que possuem a capacidade de se ligarem a uma molécula do complexo principal de histocompatibilidade (MHC) humano classe I ou, em uma forma alongada, a uma variante de comprimento diferente do MHC classe II.

[0077] A presente invenção refere-se também aos peptídeos de acordo com a presente invenção, onde cada um de tais peptídeos consiste ou consiste principalmente em uma sequência de aminoácidos de acordo com SEQ ID N^Q1 a SEQ ID N^Q 279.

[0078] A presente invenção refere-se também aos peptídeos de acordo com a presente invenção nos quais os referidos peptídeos são modificados e/ou incluem ligações não peptídicas.

[0079] A presente invenção refere-se também aos peptídeos de acordo com a presente invenção, nos quais os referidos peptídeos constituem parte de uma proteína de fusão, em particular fusão com aminoácidos N-terminais da cadeia invariante associada ao antigeno do HLA-DR (li) ou fundido a (ou incorporado à sequência de) um anticorpo, tal como, por exemplo, um anticorpo específico para células dendríticas.

[0080] A presente invenção refere-se também a um ácido nucleico que codifica os peptídeos de acordo com a presente invenção. A presente invenção refere-se também ao ácido nucleico de acordo com a presente invenção que consista em DNA, cDNA, PNA, RNA ou combinações destes.

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[0081] A presente invenção refere-se também a um vetor de expressão capaz de expressar e/ou que expresse um ácido nucleico de acordo com a presente invenção.

[0082] A presente invenção refere-se também a um peptídeo de acordo com a presente invenção, um ácido nucleico de acordo com a presente invenção ou um vetor de expressão de acordo com a presente invenção para uso no tratamento de doenças e em medicina, em especial para o tratamento de câncer.

[0083] A presente invenção refere-se também aos anticorpos específicos contra os peptídeos de acordo com a presente invenção ou complexos de tais peptídeos de acordo com a presente invenção com MHC e métodos para produzi-los.

[0084] A presente invenção refere-se ainda a receptores de células T (TCR, T-cell receptors) e em particular a TCRs solúveis (sTCR) e a TCRs clonados introduzidos por engenharia genética em células T autólogas ou alogênicas, assim como a métodos de produzilas, além de células NK ou outras células que apresentam o referido TCR ou que participem de reações cruzadas com os referidos TCRs.

[0085] Os anticorpos e os TCRs são configurações adicionais do uso imunoterapêutico dos peptídeos de acordo com a presente invenção.

[0086] A presente invenção refere-se também a células hospedeiras que compreendem um ácido nucleico de acordo com a presente invenção ou um vetor de expressão conforme descrito anteriormente. A presente invenção refere-se também as células hospedeiras de acordo com a presente invenção, que são células apresentadoras de antígenos e, preferivelmente, células dendríticas.

[0087] A presente invenção refere-se também a um método de produção de um peptídeo de acordo com a presente invenção, sendo que o referido método compreende o cultivo da célula hospedeira de

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36/196 acordo com a presente invenção e o isolamento do peptídeo da referida célula hospedeira ou do respectivo meio de cultura.

[0088] A presente invenção refere-se também ao referido método de acordo com a presente invenção, sendo que o antígeno é carregado em moléculas de MHC classe I ou II expressas na superfície de uma célula apresentadora de antígenos apropriada ou de uma célula apresentadora de antígenos artificial colocando-se uma quantidade suficiente do antígeno em contato com uma célula apresentadora de antígenos.

[0089] A presente invenção refere-se também a um método de acordo com a presente invenção, no qual a célula apresentadora de antígenos compreende um vetor de expressão que expressa ou é capaz de expressar o referido peptídeo contendo as sequências SEQ ID N^Q 1 a SEQ ID N^Q 279, preferivelmente contendo SEQ ID N^Q 1 a SEQ ID N^Q 187, ou uma sequência de aminoácidos variante das mesmas.

[0090] A presente invenção relaciona-se também com células T ativadas produzidas de acordo com o método da presente invenção, sendo que as referidas células T reconhecem seletivamente células que expressam um polipeptídeo que compreende uma sequência de aminoácidos de acordo com a presente invenção.

[0091] A presente invenção refere-se também a um método para destruir células-alvo em um paciente no qual as células-alvo expressam de forma aberrante um polipeptídeo que compreende qualquer sequência de aminoácidos de acordo com a presente invenção, sendo que o método compreende a administração ao paciente de um número eficaz de células T produzidas de acordo com a presente invenção.

[0092] A presente invenção refere-se também ao uso de qualquer peptídeo conforme aqui descrito, do ácido nucleico de acordo com a

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37/196 presente invenção, do vetor de expressão de acordo com a presente invenção, da célula de acordo com a presente invenção, do linfócito T ativado, do receptor de célula T ou do anticorpo ou de outro peptídeo e/ou a moléculas ligantes de peptídeo e MHC de acordo com a presente invenção como medicamento ou para fabricação de um medicamento. Preferivelmente, o medicamento possui atividade anticâncer.

[0093] Preferivelmente, o referido medicamento consiste em uma terapia celular, em uma vacina ou em uma proteína à base de um TCR solúvel ou anticorpo.

[0094] A presente invenção se refere também a um uso de acordo com a presente invenção, no qual as referidas células cancerosas são de leucemia linfocítica crônica, leucemia mieloide crônica e leucemia mieloide aguda; outras neoplasias linfoides (por exemplo linfoma não Hodgkin, distúrbios linfoproliferativos pós-transplante (DLPT)) e outras neoplasias mieloides (por exemplo mielofibrose primária, trombocitopenia essencial, policitemia vera); e outras neoplasias como carcinoma hepatocelular, carcinoma colorretal, glioblastoma, câncer gástrico, câncer de esôfago, câncer de pulmão de células não pequenas, câncer de pulmão de pequenas células, câncer de pâncreas, carcinoma de células renais, câncer de próstata, melanoma, câncer de mama, câncer da vesícula biliar e colangiocarcinoma, câncer de bexiga, câncer do útero, carcinoma de células escamosas de cabeça e pescoço, mesotelioma e, preferivelmente, células de leucemia linfocítica crônica, leucemia mieloide crônica e leucemia mieloide aguda.

[0095] A presente invenção refere-se também a biomarcadores baseados nos peptídeos de acordo com a presente invenção, doravante denominados alvos, que podem ser utilizados para diagnóstico de câncer, preferivelmente da leucemia linfocítica crônica,

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38/196 leucemia mieloide crônica e leucemia mieloide aguda. O marcador pode ser a sobreapresentação do(s) peptideo(s) em si ou a sobrexpressão do(s) gene(s) correspondente(s). Os marcadores também podem ser usados para prever a possibilidade de sucesso de um determinado tratamento, preferivelmente uma imunoterapia, sendo mais preferida uma imunoterapia que atue sobre os alvos identificados pelo biomarcador. Pode-se, por exemplo, usar um anticorpo ou TCR solúvel para corar cortes de um tumor para detectar um peptídeo relevante em complexo com MHC.

[0096] Opcionalmente, o anticorpo exerce outra função efetora, como um domínio de estimulação imunológica ou uma toxina.

[0097] A presente invenção refere-se também ao uso desses novos alvos no âmbito do tratamento do câncer.

DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO

[0098] A estimulação de uma resposta imune depende da presença de antígenos reconhecidos como estranhos pelo sistema imune do hospedeiro. A descoberta da existência de antígenos associados a tumores levantou a possibilidade de usar o sistema imune do hospedeiro para intervir no crescimento tumoral. Vários mecanismos para acionar tanto a imunidade humoral como a celular vêm sendo explorados para imunoterapia do câncer.

[0099] Alguns elementos específicos da resposta imune celular são capazes de reconhecer e destruir especificamente células tumorais. O isolamento de células T de populações de células infiltrantes de tumor ou do sangue periférico sugere que tais células podem desempenhar um importante papel nas defesas imunes naturais contra o câncer. Em particular, as células T CD8-positivas que reconhecem moléculas de classe I do complexo principal de histocompatibilidade (MHC), que normalmente possuem 8 a 10 resíduos de aminoácidos derivados de proteínas ou proteínas produtos

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39/196 de defeitos ribossômicos (DRIPS, defect ribosomal products) localizadas no citossol, desempenham um importante papel nessa resposta. As moléculas de MHC humanas também são designadas antígenos leucocitários humanos (HLA, human leucocyte antigen). [00100] O termo resposta de célula T significa a proliferação específica e a ativação das funções efetoras induzidas por peptídeos in vitro ou in vivo. No caso de células T citotóxicas restritas por MHC classe I, as funções efetoras podem consistir em lise de células-alvo que foram pulsadas com peptídeos ou com precursores de peptídeos ou que apresentam os peptídeos naturalmente; em secreção de citoquinas induzida por peptídeos, preferivelmente interferon gama, TNFa ou IL-2; em secreção induzida por peptídeos de moléculas efetoras, preferivelmente granzimas ou perforinas; ou em degranulação.

[00101] O termo peptídeo é aqui utilizado para designar uma série de resíduos de aminoácidos conectados uns aos outros, tipicamente por ligações peptídicas entre os grupamentos alfa-amino e carbonila de aminoácidos adjacentes. Preferivelmente, os peptídeos possuem 9 aminoácidos de comprimento, mas podem ter apenas 8 aminoácidos de comprimento ou até 10, 11, 12 ou mais aminoácidos; os peptídeos de MHC classe II (variantes alongadas dos peptídeos da invenção) podem ter comprimento de até 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20 ou mais aminoácidos de comprimento.

[00102] O termo peptídeo designa também sais de uma série de resíduos de aminoácidos conectados uns aos outros, tipicamente por ligações peptídicas entre os grupamentos alfa-amino e carbonila de aminoácidos adjacentes. Preferivelmente, tais sais são sais farmaceuticamente aceitáveis de peptídeos como, por exemplo, sais de cloreto ou acetato (trifluoracetato). Cabe notar que os sais dos peptídeos de acordo com a presente invenção diferem

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40/196 substancial mente dos peptídeos em seu estado in vivo, pois esses peptídeos não se apresentam como sais in vivo.

[00103] O termo peptídeo abrange também oligopeptídeo. O termo oligopeptídeo é aqui utilizado para designar uma série de resíduos de aminoácidos conectados uns aos outros, tipicamente por ligações peptídicas entre os grupamentos alfa-amino e carbonila de aminoácidos adjacentes. O comprimento do oligopeptídeo não é essencial para a invenção, conquanto o epítopo ou epítopos corretos sejam nele mantidos. Os oligopeptídeos tipicamente possuem mais de cerca de 15 e menos de cerca de 30 resíduos de aminoácidos de comprimento.

[00104] O termo polipeptideo designa uma série de resíduos de aminoácidos conectados uns aos outros, tipicamente por ligações peptídicas entre os grupamentos alfa-amino e carbonila de aminoácidos adjacentes. O comprimento do polipeptideo não é essencial para a invenção, conquanto os epítopos corretos sejam nele mantidos. Ao contrário dos termos peptídeo e oligopeptídeo, o termo polipeptideo designa apenas moléculas com mais de cerca de 30 resíduos de aminoácidos.

[00105] Um peptídeo, oligopeptídeo, proteína ou polinucleotídeo que codifica tal molécula é imunogênico (e, portanto, imunogênico no escopo da presente invenção) se for capaz de induzir uma resposta imune. No caso da presente invenção, a imunogenicidade é definida mais especificamente como a capacidade de induzir uma resposta de células T. Portanto, um imunogênio seria uma molécula capaz de induzir uma resposta imune e, no caso da presente invenção, uma molécula capaz de induzir uma resposta de células T. Em outro aspecto, o imunogênio pode ser o peptídeo, o complexo formado pelo peptídeo com MHC, o oligopeptídeo e/ou proteína usada para produzir anticorpos específicos ou TCRs contra ele.

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[00106] Um epítopo de células T classe I requer um peptídeo curto ligado a um receptor de MHC classe I formando um complexo ternário (cadeia alfa de MHC classe I, beta-2 microglobulina e peptídeo), que pode ser reconhecido por receptores de células T que se ligam com afinidade apropriada ao complexo de MHC com peptídeo. Os peptídeos que se ligam a moléculas de MHC classe I geralmente possuem 8 a 14 aminoácidos de comprimento, e mais tipicamente 9 aminoácidos de comprimento.

[00107] Em seres humanos, três lócus genéticos diferentes codificam as moléculas de MHC classe I. (As moléculas de MHC de seres humanos também são designadas antígenos leucocitários humanos (HLA, human leukocyte antigens)): o HLA-A, ο HLA-B e ο HLA-C. São exemplos de alelos de MHC classe I diferentes que podem ser expressos nesses lócus o HLA-A*01, o HLA-A*02 e o HLAB*07 .

[00108] Tabela 4: Frequências de expressão (F) dos sorotipos de HLA-A*02, HLA-A*01, HLA-A*03, HLA-A*24, HLA-B*07, HLA-B*08 e HLA-B*44. As frequências dos haplótipos (Gf) são derivadas de um estudo que usou dados de tipagem de HLA de um registro com mais de 6,5 milhões de doadores voluntários nos EUA (Gragert et al., 2013). A frequência de haplótipos é a frequência de um alelo distinto em um cromossomo individual. Como as células mamíferas possuem um conjunto diploide de cromossomos, a frequência de ocorrência genotípica deste alelo será maior e pode ser calculada usando-se o princípio de Hardy-Weinberg (F = 1 - (1 - Gf)²).

Alelo	População	Fenótipo calculado a partir da frequência de alelos (F)
A*02	Africano (N=28557)	32,3%
Caucasiano europeu (N=1242890)	49,3%

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Alelo	População	Fenótipo calculado a partir da frequência de alelos (F)
	Japonês(N=24582)	42,7%
Hispânico (América do Sul e Central) (N=146714)	46,1%
Sudeste Asiático (N=27978)	30,4%
A*01	Africano (N=28557)	10,2%
Caucasiano europeu (N=1242890)	30,2%
Japonês(N=24582)	1,8%
Hispânico (América do Sul e Central) (N=146714)	14,0%
Sudeste Asiático (N=27978)	21,0%
A*03	Africano (N=28557)	14,8%
Caucasiano europeu (N=1242890)	26,4%
Japonês(N=24582)	1,8%
Hispânico (América do Sul e Central) (N=146714)	14,4%
Sudeste Asiático (N=27978)	10,6%
A*24	Africano (N=28557)	2,0%
Caucasiano europeu (N=1242890)	8,6%
Japonês(N=24582)	35,5%
Hispânico (América do Sul e Central) (N=146714)	13,6%
Sudeste Asiático (N=27978)	16,9%
B*07	Africano (N=28557)	14,7%
Caucasiano europeu	25,0%

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Alelo	População	Fenótipo calculado a partir da frequência de alelos (F)
	(N=1242890)
Japonês(N=24582)	11,4%
Hispânico (América do Sul e Central) (N=146714)	12,2%
Sudeste Asiático (N=27978)	10,4%
B*08	Africano (N=28557)	6,0%
Caucasiano europeu (N=1242890)	21,6%
Japonês(N=24582)	1,0%
Hispânico (América do Sul e Central) (N=146714)	7,6%
Sudeste Asiático (N=27978)	6,2%
B*44	Africano (N=28557)	10,6%
Caucasiano europeu (N=1242890)	26,9%
Japonês(N=24582)	13,0%
Hispânico (América do Sul e Central) (N=146714)	18,2%
Sudeste Asiático (N=27978)	13,1%

[00109] Os peptídeos da invenção, preferivelmente quando incluídos em uma vacina da invenção conforme aqui descrita, liga-se a A*02, A*01, A*03, A*24, B*07, B*08 ou B*44. Uma vacina também pode apresentar ligação a todos os peptídeos de MHC classe II. Portanto, a vacina da invenção pode ser usada para tratar o câncer em pacientes positivos para A*02, A*01, A*03, A*24, B*07, B*08 ou B*44, ao passo que nenhuma seleção de alótipos de MHC classe II é necessária porque esses peptídeos se ligam a todos os MHC classe II.

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[00110] Se os peptídeos A*02 da invenção forem combinados com peptídeos que se ligam a outro alelo (por exemplo A*24), uma porcentagem maior de qualquer população de pacientes poderá ser tratada que com a abordagem de apenas um dos alelos de MHC classe I. Enquanto na maioria das populações menos de 50% dos pacientes podería ser tratada com qualquer desses alelos isoladamente, uma vacina compreendendo epítopos de HLA-A*02 e HLA-A*24 pode tratar pelo menos 60% dos pacientes em qualquer população relevante. Mais especificamente, os seguintes porcentuais de pacientes serão positivos para pelo menos um desses alelos em várias regiões: EUA 61%, Europa Ocidental 62%, China 75%, Coréia do Sul 77%, Japão 86% (porcentagens calculadas a partir de www.allelefreguencies.net)·

Tabela 5: Cobertura de alelos de HLA em uma população caucasiana europeia (calculada segundo Gragert et al. (2013)).

	Cobertura (pelo menos um alelo A)	Combinado com B*07	Ccombinado com B*44	Combinado com B*07 e B*44
A*02 / A*01	70%	78%	78%	84%
A*02 / A*03	68%	76%	76%	83%
A*02 / A*24	61%	71%	71%	80%
A*'O1 / A*03	52%	64%	65%	75%
A*01 / A*24	44%	58%	59%	71%
A*03 / A*24	40%	55%	56%	69%
A*02 / A*01 / A*03	84%	88%	88%	91%
A*02 / A*01 / A*24	79%	84%	84%	89%
A*02 / A*03 / A*24	77%	82%	83%	88%
A*01 / A*03 / A*24	63%	72%	73%	81%
A*02 / A*01 / A*03 / A*24	90%	92%	93%	95%

[00111] Em uma modalidade preferida, o termo sequência de nucleotídeos refere-se a um heteropolímero de desoxirribonucleotídeos.

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[00112] A sequência de nucleotídeos que codifica um determinado peptídeo, oligopeptídeo ou polipeptideo pode ocorrer naturalmente ou ser construída por meios sintéticos. Em geral, os segmentos de DNA que codificam peptídeos, polipeptídeos e proteínas desta invenção são construídos a partir de fragmentos de cDNA e ligantes oligonucleotídeos curtos ou de uma série de oligonucleotídeos de modo a fornecer um gene sintético capaz de ser expresso em uma unidade de transcrição recombinante que compreende elementos regulatórios derivados de um operon microbiano ou viral.

[00113] Conforme aqui utilizado, o termo nucleotídeo codificador (ou que codifica) um peptídeo refere-se a uma sequência de nucleotídeos que codifica o peptídeo, incluindo códons de início e parada artificiais (produzidos pelo homem) compatíveis com o sistema biológico que será expresso, por exemplo, por uma célula dendrítica ou por outro sistema celular útil para a produção de TCRs.

[00114] Conforme aqui utilizadas, referências a uma sequência de ácido nucleico abrangem tanto ácidos nucleicos de fita única como de dupla fita. Portanto, por exemplo, para DNA, a sequência específica refere-se, salvo indicação em contrário no contexto, ao DNA de fita única de tal sequência, à forma dúplex de tal sequência com o respectivo complemento (DNA de dupla fita) e ao complemento de tal sequência.

[00115] O termo região codificadora refere-se à porção do gene que, natural ou normalmente, codifica o produto expresso pelo gene em questão em seu ambiente genômico natural, isto é, a região codificadora in vivo do produto de expressão nativo do gene em questão.

[00116] A região codificadora pode ser derivada de um gene não mutante (normal), mutante ou alterado e pode até mesmo ser derivada de uma sequência de DNA ou gene sintetizado inteiramente

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46/196 em laboratório usando métodos bem conhecidos dos versados na técnica de síntese de DNA.

[00117] O termo produto de expressão significa o polipeptídeo ou proteína que é o produto de tradução natural do gene e de quaisquer sequências de ácidos nucleicos que produzam codificação equivalente resultantes da natureza degenerada do código genético produzindo o(s) mesmo(s) aminoácido(s).

[00118] O termo fragmento significa, quando se refere a uma sequência codificante, uma porção do DNA que compreende menos que a região codificadora completa, cujo produto de expressão retém basicamente a mesma função ou atividade biológica que o produto de expressão da região codificante completa.

[00119] O termo segmento de DNA refere-se a um polímero de DNA, seja como fragmento separado ou como componente de uma estrutura de DNA maior, derivado do DNA isolado pelo menos uma vez de forma basicamente pura, isto é, livre de materiais contaminantes endógenos e em quantidade ou concentração suficientes para permitir identificação, manipulação e recuperação do segmento e das sequências de nucleotídeos componentes usando-se métodos bioquímicos padrão como, por exemplo, um vetor de clonagem. Tais segmentos são fornecidos como um frame (matriz) de leitura aberto sem interrupções de sequências internas não traduzidas, denominadas introns, que geralmente estão presentes em genes eucarióticos. As sequências de DNA não traduzido podem estar presentes em posição distai à matriz de leitura aberta, onde a mesma não interfere na manipulação nem na expressão das regiões codificantes.

[00120] O termo primer significa uma sequência curta de ácidos nucleicos que pode ser pareada com uma fita de DNA e fornece uma terminação 3ΌΗ livre na qual a DNA polimerase inicia a síntese de

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47/196 uma cadeia de desoxirribonucleotídeos.

[00121] O termo promotor significa uma região do DNA envolvida em ligar a RNA polimerase para iniciar a transcrição.

[00122] O termo isolado significa que o material foi retirado de seu ambiente original (por exemplo o ambiente original em que ocorria naturalmente). Por exemplo, polinucleotídeos que ocorrem na natureza ou que estão presentes em um animal vivo não são considerados isolados, mas o mesmo polinucleotídeo ou polipeptideo é considerado isolado quando é separado de alguns ou de todos os materiais que com ele coexistem em um sistema natural. Tais polinucleotídeos podem formar parte de um vetor e/ou tais polinucleotídeos ou polipeptídeos podem ser parte de uma composição e mesmo assim ser isolados, mesmo que tal vetor ou composição não seja parte de seu ambiente natural.

[00123] Os polinucleotídeos e os polipeptídeos recombinantes ou imunogênicos revelados de acordo com a presente invenção também podem estar em forma purificada. O termo purificado não requer pureza absoluta; é uma definição relativa e abrange tanto preparações altamente purificadas como preparações apenas parcialmente purificadas, conforme tais termos são compreendidos pelos versados na técnica relevante. Por exemplo, clones individuais isolados de uma biblioteca de cDNA foram purificados usando-se técnicas convencionais para se obter homogeneidade eletroforética. A purificação de um material inicial ou de material natural em pelo menos uma ordem de grandeza, e preferivelmente em duas ou três ordens, e mais preferivelmente em quatro a cinco ordens de magnitude é expressamente contemplada. Outrossim, o polipeptideo reivindicado que possui pureza de, preferivelmente 99,999% ou pelo menos 99,99% ou 99,9% e, ainda desejável mente, 99% por peso ou mais, fica expressamente incluído.

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[00124] Os ácidos nucleicos e produtos da expressão de polipeptídeos revelados de acordo com a presente invenção, assim com os vetores de expressão que contêm tais ácidos nucleicos e/ou tais polipeptídeos, podem estar presentes em forma enriquecida. Conforme aqui utilizado, o termo enriquecido significa que a concentração do material é de pelo menos 2, 5, 10, 100 ou 1000 vezes sua concentração natural (por exemplo), vantajosamente 0,01% por peso e preferivelmente pelo menos 0,1% por peso. Preparações enriquecidas contendo cerca de 0,5%, 1%, 5%, 10% e 20% por peso também são contempladas. As sequências, produtos de construção, vetores, clones e outros materiais que compreendem a presente invenção podem, vantajosamente, estar em forma enriquecida ou isolada. O termo fragmento ativo significa um fragmento, normalmente de um peptídeo, polipeptídeo ou sequência de ácido nucleico, que gera uma resposta imune (i.é, possui atividade imunogênica) quando administrado — isolado ou, opcionalmente, com um adjuvante apropriado ou em um vetor — a um animal como um mamífero (por exemplo coelho, camundongo) ou a um ser humano. A resposta imune assume a forma de estimulação da resposta de células T em um animal receptor como, por exemplo, um ser humano. Alternativamente, o fragmento ativo também pode ser usado para induzir uma resposta de células T in vitro.

[00125] Conforme aqui utilizados, os termos porção, segmento e fragmento referem-se, quando usados em relação a peptídeos, a uma sequência contínua de resíduos, como resíduos de aminoácidos, que forma um subconjunto de uma sequência maior. Por exemplo, se um polipeptídeo for sujeito a tratamento com qualquer uma das endopeptidases comuns como a tripsina ou a quimotripsina, os oligopeptídeos resultantes de tal tratamento representariam porções, segmentos ou fragmentos do polipeptídeo inicial. Quando utilizados

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49/196 em relação a polinucleotideos, esses termos referem-se a produtos produzidos pelo tratamento dos referidos nucleotídeos com qualquer uma das endonucleases.

[00126] De acordo com a presente invenção, os termos porcentual de identidade e porcentagem de idênticos significam, quando usados em referência a uma sequência, que uma sequência é comparada com uma sequência reivindicada ou descrita após alinhamento da sequência a ser comparada (Sequência de Comparação) com a sequência descrita ou reivindicada (Sequência de Referência). O porcentual de identidade é então determinado de acordo com a seguinte fórmula:

Porcentual de identidade = 100 [1 - (C/R)]

[00127] Onde C é o número de diferenças entre a Sequência de Referência e a Sequência de Comparação ao longo do alinhamento entre a Sequência de Referência e a Sequência de Comparação, onde constituem diferenças:

[00128] i. Cada base ou aminoácido da Sequência de Referência que não possui uma base ou aminoácido alinhado correspondente na Sequência de Comparação; e

[00129] ii. Cada lacuna na sequência; e

[00130] iii. Cada base ou aminoácido da Sequência de Referência diferente da base ou aminoácido alinhado correspondente na Sequência de Comparação; sendo que:

[00131] iv. O alinhamento deve começar na posição 1 das sequências alinhadas;

[00132] e R é o número de bases ou aminoácidos na Sequência de Referência ao longo do comprimento do alinhamento com a Sequência de Comparação, sendo que quaisquer lacunas criadas na Sequência de Referência também são consideradas como uma base ou aminoácido.

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[00133] Se existir um alinhamento entre a Sequência de Comparação e a Sequência de Referência para o qual o porcentual de identidade calculado acima for igual ou superior a um porcentual de identidade mínimo especificado, a Sequência de Comparação possui o porcentual de identidade mínimo especificado em relação à Sequência de Referência, mesmo que possa haver alinhamentos em que o porcentual de identidade calculado acima seja inferior à identidade porcentual especificada.

[00134] Conforme mencionado anteriormente, a presente invenção refere-se, portanto, a um peptideo que compreende uma sequência de aminoácidos selecionada do grupo formado por SEQ ID N^Q 1 a SEQ ID N^Q 279 ou a uma variante dos mesmos com 88% de homologia com SEQ ID N- 1 a SEQ ID N^Q 279 ou uma variante da mesma que induz reação cruzada de células T com o referido peptideo. Os peptídeos da presente invenção possuem capacidade de ligação com uma das moléculas do complexo principal de histocompatibilidade humano (MHC) de classe I ou com versões alongadas dos referidos peptídeos a moléculas de classe II.

[00135] Na presente invenção, o termo homólogo refere-se ao grau de identidade (ver o conceito de porcentual de identidade descrito anteriormente) entre duas sequências de aminoácidos, isto é, sequências de peptídeos ou de polipeptídeos. A homologia mencionada anteriormente é determinada comparando-se duas sequências alinhadas sob condições ideais com as sequências a serem comparadas. Tal homologia entre sequências pode ser calculada criando-se um alinhamento utilizando-se, por exemplo, o algoritmo ClustaIW. Alguns softwares de análise de sequências comumente disponíveis, mais especificamente o Vector NTI, o GENETYX e outras ferramentas de análise, são disponibilizados por bancos de dados abertos ao público.

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[00136] Os versados na técnica poderão avaliar se as células T induzidas por um peptídeo variante de um peptídeo específico podem apresentar reação cruzada com o peptídeo original (Appay et al., 2006; Colombetti et al., 2006; Fong et al., 2001; Zaremba et al., 1997).

[00137] Por variante de uma determinada sequência de aminoácidos, os inventores entendem que as cadeias laterais de, por exemplo, um ou dois resíduos de aminoácidos são alterados (por exemplo, substituindo-os pela cadeia lateral de outro resíduo de aminoácido encontrado na natureza ou alguma outra cadeia lateral) de modo que o peptídeo continue sendo capaz de se ligar a uma molécula de HLA basicamente da mesma maneira que um peptídeo com a mesma sequência de aminoácidos que as SEQ ID N- 1 a SEQ ID N^Q 279. Por exemplo, um peptídeo pode ser modificado de modo a pelo menos manter, ou até melhorar, sua capacidade de interagir com e se ligar ao sulco de ligação de uma molécula de MHC apropriada, tal como HLA-A*02 ou -DR, e dessa forma pelo menos manter, ou até melhorar, a capacidade de ligar-se ao TCR de células T ativadas.

[00138] Em seguida, essas células T ativadas podem participar de reação cruzada com outras células e destruir células que expressam um polipeptideo que contém a sequência natural de aminoácidos do peptídeo cognato, conforme definido nos aspectos da invenção. Como se pode depreender da literatura e de bancos de dados científicos (Rammensee et al., 1999; Godkin et al., 1997), determinadas posições em peptídeos ligantes de HLA são geralmente resíduos de ancoragem que formam uma sequência central que se fixa ao motivo ligante do receptor de HLA, que é definido por propriedades de polaridade, eletrofísicas, hidrofóbicas e espaciais das cadeias polipeptídicas que constituem o sulco de ligação. Assim, os versados na técnica saberão modificar as sequências de aminoácidos apresentadas em SEQ ID N^Q 1 a SEQ ID N^Q 279 mantendo os resíduos de ancoragem conhecidos e

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52/196 serão capazes de determinar se tais variantes preservam sua capacidade de ligação com moléculas de MHC classe I ou classe II. As variantes da presente invenção preservam a capacidade de ligação ao TCR de células T ativadas, que podem participar posteriormente de reações cruzadas e destruir células que expressam um polipeptídeo contendo a sequência natural de aminoácidos do peptídeo cognato, conforme definido nos aspectos da invenção.

[00139] Os peptídeos originais (não modificados) aqui revelados podem ser modificados por substituição de um ou mais resíduos em sítios diferentes, e possivelmente seletivos, dentro da cadeia peptídica, salvo indicação em contrário. Preferivelmente, essas substituições se encontram no final da cadeia de aminoácidos. Tais substituições podem ser de natureza conservadora, substituindo-se, por exemplo, um aminoácido por outro de estrutura e características semelhantes, como, por exemplo, substituir um aminoácido hidrofóbico por outro aminoácido hidrofóbico. Ainda mais conservador seria substituir aminoácidos de tamanho e natureza química semelhantes ou idênticos, como substituir leucina por isoleucina. Em estudos de variações de sequências em famílias de proteínas homólogas que ocorrem naturalmente, determinadas substituições de aminoácidos são toleradas com muito mais frequência que outras, e estas frequentemente mostram correlação com semelhanças de tamanho, carga, polaridade e hidrofobicidade entre o aminoácido original e seu substituto, sendo esta a base para definição de substituições conservadoras.

[00140] As substituições conservadoras são aqui definidas como trocas dentro de um dos seguintes grupos: grupo 1: resíduos pequenos alifáticos, apoiares ou ligeiramente polares (Ala, Ser, Tre,

Pro, Gli); grupo 2: resíduos polares com carga negativa e as respectivas amidas (Asp, Asn, Glu, Gin); grupo 3: resíduos polares

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53/196 com carga positiva (His, Arg, Lis); grupo 4: resíduos alifáticos grandes e apoiares (Met, Leu, lie, Vai, Cis); e grupo 5: resíduos aromáticos grandes (Fen, Tir, Trp).

[00141] Algumas substituições menos conservadoras podem consistir em substituição de um aminoácido por outro com características semelhantes mas algo diferente em tamanho, como substituição de uma alanina por um resíduo de isoleucina. Substituições pouquíssimo conservadoras podem consistir em substituir um aminoácido ácido por outro polar ou até mesmo por outro básico. Entretanto, nem todas as substituições radicais podem ser descartadas como ineficazes, pois seus efeitos químicos não são totalmente previsíveis e elas podem produzir efeitos fortuitos, que não podem ser previstos a partir de princípios químicos simples.

[00142] Evidentemente, tais substituições podem envolver outras estruturas que não os L-aminoácidos comuns. Portanto, os Daminoácidos podem ser substituídos pelos L-aminoácidos comumente encontrados em peptídeos antigênicos da invenção, não deixando de ser contemplados pela presente revelação. Além disso, aminoácidos não padrão (isto é, outros aminoácidos que não os 20 aminoácidos proteinogênicos) também podem ser usados para finalidades de substituição de modo a produzir imunogênios e polipeptídeos imunogênicos de acordo com a presente invenção.

[00143] Se for constatado que substituições em mais de uma posição produzem peptídeos com atividade antigênica substancialmente equivalente ou maior conforme definido a seguir, combinações dessas substituições serão testadas para determinar se as substituições combinadas produzem efeitos aditivos ou sinergísticos sobre a antigenicidade do peptídeo. No máximo, não mais de quatro posições no peptídeo devem ser substituídas simultaneamente.

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[00144] Um peptídeo que consiste essencialmente na sequência de aminoácidos aqui indicada pode possuir um ou dois aminoácidos não âncoras (o motivo âncora é descrito mais detalhadamente a seguir), que são trocados sem que a capacidade de ligação a uma molécula do complexo principal de histocompatibilidade (MHC) humano classe I ou II seja modificada significativamente ou prejudicada em comparação com o peptídeo não modificado. Em outra modalidade, que consiste essencialmente na sequência de aminoácidos aqui indicada, um ou dois aminoácidos podem ser trocados por elementos de troca conservadores (ver adiante) sem que a capacidade de ligação a uma molécula do complexo principal de histocompatibilidade (MHC) humano classe I ou II seja modificada significativamente ou prejudicada em comparação com o peptídeo não modificado.

[00145] Os resíduos de aminoácidos que não contribuem significativamente para as interações com o receptor de células T podem ser modificados substituindo-os com outros aminoácidos, cuja incorporação não afeta significativamente a reatividade de células T nem elimina a ligação ao MHC relevante. Assim, considerando-se a condição acima, o peptídeo da invenção pode ser qualquer peptídeo (termo sob o qual os inventores incluem oligopeptídeo e polipeptideo), incluindo sequência de aminoácidos ou uma porção ou variante das mesmas conforme apresentadas.

Tabela 6: Variantes e motivos dos peptídeos de acordo com as SEQs

N^Q 1, 193, 17, 27, 33, 210, 64, 73, 99, 238, 116, 118, 134 e 148.

Posição	1	2	3	4	5	6	7	8	9	10
SEQ ID Ne 1	L	T	E	G	H	S	G	N	Y	Y
Variante		s	D
		s	D							A
		s
		s								A
			D

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Posição	1	2	3	4	5	6	7	8	9	10
			D							A
										A
Posição	1	2	3	4	5	6	7	8	9	10
SEQ ID Ne 193	L	T	D	S	E	K	G	N	S	Y
Variante		s
		s								A
		s	E
		s	E							A
										A
			E
			E							A
Posição	1	2	3	4	5	6	7	8	9
SEQ ID Ne 17	K	A	Y	N	R	V	I	F	V
Variante		L
		L							I
		L							L
		L							A
		M
		M							I
		M							L
		M							A
									I
									L
									A
		V
		V							I
		V							L
		V							A
		T
		T							I
		T							L
		T							A

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Posição	1	2	3	4	5	6	7	8	9	10
		Q
		Q							I
		Q							L
		Q							A
Posição	1	2	3	4	5	6	7	8	9
SEQ ID Ne 27	R	L	I	A	K	E	M	N	I
Variante									V
									L
									A
		M							V
		M
		M							L
		M							A
		A							V
		A
		A							L
		A							A
		V							V
		V
		V							L
		V							A
		T							V
		T
		T							L
		T							A
		Q							V
		Q
		Q							L
		Q							A
Posição	1	2	3	4	5	6	7	8	9	10	11
SEQ ID Ne 33	s	V	F	E	G	D	S	I	V	L	K
Variante		L

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Posição	1	2	3	4	5	6	7	8	9	10
		L									Y
		L									R
		L									F
		I
		I									Y
		I									R
		I									F
		M
		M									Y
		M									R
		M									F
											Y
											R
											F
		T
		T									Y
		T									R
		T									F
Posição	1	2	3	4	5	6	7	8	9	10	11
SEQ ID Ne 210	R	M	Y	S	Q	L	K	T	L	Q	K
Variante		L
		L									Y
		L									R
		L									F
		I
		I									Y
		I									R
		I									F
											Y
											R
											F
		V
		V									Y

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Posição	1	2	3	4	5	6	7	8	9	10
		V									R
		V									F
		T
		T									Y
		T									R
		T									F
Posição	1	2	3	4	5	6	7	8	9
SEQ ID Ne 64	S	F	Q	S	K	A	T	V	F
Variante		Y							I
		Y							L
		Y
									I
									L
Posição	1	2	3	4	5	6	7	8	9	10
SEQ ID Ne 73	T	Y	P	Q	L	E	G	F	K	F
Variante										I
										L
		F								I
		F								L
		F
Posição	1	2	3	4	5	6	7	8	9	10
SEQ ID Ne 99	s	P	R	A	I	N	N	L	V	L
Variante										F
										V
										M
										A
										I
Posição	1	2	3	4	5	6	7	8	9	10
SEQ ID Ne 238	s	P	R	S	W	I	Q	V	Q	I
Variante										L

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Posição	1	2	3	4	5	6	7	8	9	10
										F
										V
										M
										A
Posição	1	2	3	4	5	6	7	8	9
SEQ ID Ne 116	T	L	K	I	R	A	E	V	L
Variante					K
					K				V
					K				I
					K				M
					K				F
									V
									I
									M
									F
					H
					H				V
					H				I
					H				M
					H				F
			R		K
			R		K				V
			R		K				I
			R		K				M
			R		K				F
			R
			R						V
			R						I
			R						M
			R						F
			R		H
			R		H				V
			R		H				I

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60/196

Posição	1	2	3	4	5	6	7	8	9	10
			R		H				M
			R		H				F
			L		K
			L		K				V
			L		K				I
			L		K				M
			L		K				F
			L
			L						V
			L						I
			L						M
			L						F
			L		H
			L		H				V
			L		H				I
			L		H				M
			L		H				F
Posição	1	2	3	4	5	6	7	8	9
SEQ ID Ne 118	F	E	K	E	K	K	E	S	L
Variante									V
									I
									M
									F
					R
					R				V
					R				I
					R				M
					R				F
					H
					H				V
					H				I
					H				M
					H				F

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Posição	1	2	3	4	5	6	7	8	9	10
			R
			R						V
			R						I
			R						M
			R						F
			R		R
			R		R				V
			R		R				I
			R		R				M
			R		R				F
			R		H
			R		H				V
			R		H				I
			R		H				M
			R		H				F
			L
			L						V
			L						I
			L						M
			L						F
			L		R
			L		R				V
			L		R				I
			L		R				M
			L		R				F
			L		H
			L		H				V
			L		H				I
			L		H				M
			L		H				F
Posição	1	2	3	4	5	6	7	8	9
SEQ ID Ne 134	S	E	Y	A	D	T	H	Y	F
Variante									W

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Posição	1	2	3	4	5	6	7	8	9	10
									Y
									L
		D
		D							W
		D							Y
		D							L
Posição	1	2	3	4	5	6	7	8	9
SEQ ID Ne 148	R	E	Y	N	E	Y	E	N	I
Variante									F
									W
									Y
									L
		D							F
		D							W
		D							Y
		D							L

[00146] Peptídeos mais longos (prolongados) também podem ser apropriados. Também é possível que epítopos de MHC classe I, embora normalmente tenham de 8 a 11 aminoácidos de comprimento, sejam gerados pelo processamento de peptídeos mais longos ou por proteínas que incluam o epítopo real. É preferível que os resíduos que flanqueiam o epítopo sejam resíduos que não afetem significativamente a divagem proteolítica necessária para expor o epítopo durante o processamento.

[00147] Os peptídeos da invenção podem ser prolongados em até quatro aminoácidos, ou seja, podem-se adicionar 1, 2, 3 ou 4 aminoácidos a qualquer extremidade em qualquer combinação entre

4:0 e 0:4. A Tabela 7 apresenta combinações de alongamentos de acordo com a invenção.

Tabela 7: Algumas combinações de peptídeos alongados da presente

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63/196 invenção

C terminal	N terminal
4	0
3	0 ou 1
2	0, 1 ou 2
1	0, 1,2 ou 3
0	0, 1,2, 3 ou 4
N terminal	C terminal
4	0
3	0 ou 1
2	0, 1 ou 2
1	0, 1,2 ou 3
0	0, 1,2, 3 ou 4

[00148] Os aminoácidos do prolongamento/extensão podem ser os peptídeos da sequência original da proteína ou quaisquer outros aminoácidos. O prolongamento pode ser utilizado para tornar os peptídeos mais estáveis ou mais solúveis.

[00149] Portanto, os epítopos da presente invenção podem ser idênticos a epítopos que ocorrem naturalmente e que são associados a ou específicos para tumores, ou podem incluir epítopos que diferem em no máximo quatro resíduos do peptídeo de referência, conquanto apresentem atividade antigênica substancialmente idêntica.

[00150] Em uma modalidade alternativa, o peptídeo é alongado em mais de quatro aminoácidos em um ou ambos os lados, preferivelmente até atingir um comprimento total de até 30 aminoácidos. Assim, podem-se criar peptídeos ligantes de MHC classe

II. A ligação ao MHC classe II pode ser testada por métodos conhecidos na técnica.

[00151] Dessa forma, a presente invenção fornece peptídeos e

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64/196 variantes de epitopes de MHC classe I nas quais o peptideo ou variante tem comprimento total entre 8 e 100, preferivelmente entre 8 e 30, mais preferivelmente entre 8 e 14, especificamente, 8, 9, 10, 11, 12, 13 ou 14 aminoácidos; no caso de peptídeos ligantes de classe II prolongados o comprimento também pode ser de 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21 ou 22 aminoácidos.

[00152] Evidentemente, o peptideo ou variante de acordo com a presente invenção terá a capacidade de se ligar a uma molécula do complexo principal de histocompatibilidade (MHC) classe I ou II. A ligação de um peptideo ou variante a um complexo de MHC pode ser testada por métodos conhecidos na técnica.

[00153] Preferivelmente, quando células T específicas para um peptideo de acordo com a presente invenção são testadas contra os peptídeos substituídos, a concentração de peptídeos em que os peptídeos substituídos produzem metade do aumento máximo de lise em relação aos níveis basais é de não mais que cerca de 1 mM, preferivelmente não mais que cerca de 1 μΜ, mais preferivelmente não mais que cerca de 1 nM e ainda mais preferivelmente não mais que cerca de 100 pM e, mais preferivelmente, não mais que 10 pM. É preferível também que o peptideo substituído possa ser reconhecido por células T citotóxicas de mais de um indivíduo, de pelo menos dois e, mais preferivelmente, de três indivíduos.

[00154] Em uma modalidade especialmente preferida da invenção, o(s) peptídeo(s) consiste(m) basicamente em uma sequência de aminoácidos de acordo com SEQ ID N^Q1 a SEQ ID N^Q 279.

[00155] Consiste essencialmente em significa que um peptideo de acordo com a presente invenção contém, além da sequência de acordo com qualquer sequência de SEQ ID N- 1 a SEQ ID N^Q 279 ou variante das mesmas, outros prolongamentos formados por segmentos aminoácidos N e/ou C-terminais, que não necessariamente

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65/196 formam parte do peptídeo que funciona como epítopo para epítopos que possuem moléculas de MHC.

[00156] Contudo, esses segmentos podem ser importantes para tornar eficiente a introdução do peptídeo de acordo com a presente invenção em células. Em uma modalidade da presente invenção, o peptídeo é parte de uma proteína de fusão que compreende, por exemplo, os 80 aminoácidos N-terminais da cadeia invariante associada ao antigeno HLA-DR (p33, no seguinte li) conforme derivado do NCBI, GenBank número de acesso X00497. Em outras fusões, os peptídeos da presente invenção podem ser fundidos com um anticorpo conforme aqui descrito ou com uma parte funcional do mesmo, e em particular com uma sequência de um anticorpo, de modo a se tornar um alvo específico do referido anticorpo ou, por exemplo, em ou no interior de um anticorpo específico para células dendríticas, conforme aqui descrito.

[00157] O peptídeo ou variante também pode ser modificado ainda mais para melhorar a estabilidade e/ou a ligação a moléculas de MHC a fim de produzir uma resposta imune mais forte. Os métodos de otimização de tais sequências peptídicas são bem conhecidos na técnica e incluem, por exemplo, a introdução de ligações peptídicas reversas ou de ligações não peptídicas.

[00158] Em uma ligação peptídica reversa, os aminoácidos não se ligam por meio de ligações peptídicas (-CO-NH-), mas por uma ligação peptídica invertida. Tal peptideomimetismo retroinvertido pode ser produzido usando-se métodos conhecidos na técnica, como, por exemplo, os descritos por Mezière et ai (1997) (1997), que fica aqui incorporado por referência. Esta abordagem inclui criar pseudopeptídeos contendo alterações na cadeia básica e não na orientação das cadeias laterais. Mezière et ai. (1997) demonstraram que esses pseudopeptídeos podem ser úteis para respostas de

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66/196 ligação de MHC e de células T auxiliares. Os peptídeos retroinvertidos, que contêm ligações NH-CO em vez de CO-NH, são muito mais resistentes à proteólise.

[00159] São exemplos de ligações não peptídicas, -CH2 -NH, CH₂S-, -CH2CH2-, -CH=CH-, -COCH2-, -CH(OH)CH₂- e -CH2SO-. US 4.897.445 fornece um método para síntese em fase sólida de ligações não peptídicas (-CH2-NH-) em cadeias polipeptídicas envolvendo polipeptídeos sintetizados por procedimentos padrão, onde a ligação não peptídica é sintetizada pela reação de um aminoaldeído com um aminoácido na presença de NaCNBHs.

[00160] Os peptídeos que compreendem as sequências descritas acima podem ser sintetizados com outros grupamentos químicos presentes em suas terminações amina ou carboxila para torná-los mais estáveis ou melhorar sua biodisponibilidade e/ou afinidade. Por exemplo, grupamentos hidrofóbicos como a carbobenzoxila, dansila ou t-butiloxicarbonila podem ser adicionados à amina terminal dos peptídeos. Da mesma forma, um grupamento acetila ou um grupamento 9-fluorenilmetóxi-carbonila pode ser adicionado à amina terminal dos peptídeos. Além disso, 0 grupamento hidrofóbico tbutiloxicarbonila ou um grupamento amida podem ser adicionados às carboxilas terminais dos peptídeos.

[00161] Outrossim, os peptídeos descritos podem ser sintetizados de forma a alterar suas configurações estéricas. Por exemplo, 0 Disômero de um ou mais resíduos de aminoácidos do peptídeo pode ser utilizado em vez do L-isômero. Pode-se também substituir um ou mais resíduos de aminoácidos dos peptídeos da invenção por resíduos de aminoácidos bem conhecidos que não ocorrem naturalmente. Alterações como essas podem contribuir para aumentar a estabilidade, a biodisponibilidade ou a ação ligante dos peptídeos da invenção.

[00162] Da mesma forma, um peptídeo da invenção ou variante do

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67/196 mesmo pode ser modificado quimicamente por meio de reações com aminoácidos específicos antes ou depois da síntese do peptídeo. Alguns exemplos de tais modificações são bem conhecidos na técnica e resumidos em, por exemplo, R. Lundblad, Chemical Reagents for Protein Modification, 3rd ed. CRC Press, 2004 (Lundblad, 2004), que fica aqui incorporado por referência. A modificação química de aminoácidos inclui, entre outras, modificação por acilação, amidinação, piridoxilação de lisina, alquilação redutora, trinitrobenzilação de grupamentos amina com ácido 2,4,6-trinitrobenzeno sulfônico (TNBS), modificação amídica de grupamentos carboxila e modificações sulfidrila mediante oxidação por ácido perfórmico de cisteína formando ácido cisteico, formação de derivados mercuriais, formação de dissulfetos mistos com outros compostos de tiol, reação com maleimida, carboximetilação com ácido iodoacético ou iodoacetamida e carbamoilação com cianato em pH alcalino, sem limitar-se a estes. Em relação a isso, os versados na técnica podem referir-se ao Capítulo 15 de Current Protocols In Protein Science, Eds. Coligan et al. (John Wiley & Sons NY 1995-2000) (Coligan et al., 1995) para obter mais detalhes sobre as metodologias de modificação química de proteínas.

[00163] Resumidamente, a modificação de, por exemplo, resíduos de arginila em proteínas baseia-se muitas vezes na reação de compostos com dicarbonilas vicinais como o fenilglioxal, o 2,3butanediona e o 1,2-ciclohexanediona para formar um adutor. Outro exemplo é a reação de metilglioxal com resíduos de arginina. A cisteína pode ser modificada sem alteração concomitante de outros sítios nucleofílicos como a lisina e a histidina. Com isso, muitos reagentes estão disponíveis para modificar a cisteína. Os websites de empresas como a Sigma-Aldrich (httD://www.siqma-aldrich.com) apresentam informações sobre reagentes específicos.

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[00164] A redução seletiva de ligações dissulfeto em proteínas também é comum. As ligações dissulfeto podem ser encontradas e oxidadas durante o tratamento térmico de produtos biofarmacêuticos. O Reagente K de Woodward pode ser usado para modificar resíduos específicos de ácido glutâmico. A N-(3-(dimetilamino)propil)-N’etilcarbodiimida pode ser usada para formar ligações cruzadas intramoleculares entre resíduos de lisina e um resíduo de ácido glutâmico. Por exemplo, o dietilpirocarbonato é um reagente para modificação de resíduos histidil em proteínas. A histidina também pode ser modificada usando-se 4-hidroxi-2-nonenal. A reação de resíduos de lisina e outros grupamentos a-amino é útil, por exemplo, para ligar peptídeos a superfícies ou para ligação cruzada de proteínas ou peptídeos. A lisina é o local de fixação do poli(etileno)glicol e é o principal sítio de modificação na glicosilação de proteínas. Os resíduos de metionina das proteínas podem ser modificados por, por exemplo, iodoacetamida, bromoetilamina e cloramina T.

[00165] O tetranitrometano e o N-acetilimidazol podem ser usados para modificar os resíduos de tirosila. A ligação cruzada por meio da formação de ditirosina pode ser efetuada com peróxido de hidrogênio e íons de cobre.

[00166] Estudos recentes sobre a modificação do triptofano vem usando a N-bromosuccinimida, 2-hidróxi-5-nitrobenzil brometo ou 3bromo-3-metil-2-(2-nitrofenilmercapto)-2H-indol (BPNS-escatol).

[00167] A modificação bem-sucedida de proteínas e peptídeos terapêuticos com PEG frequentemente prolonga a meia-vida na circulação, e a ligação cruzada de proteínas com glutaraldeído, polietilenoglicol diacrilato e formaldeído é usada para preparar hidrogéis. Muitos alergênios são modificados para imunoterapia por carbamilação com cianato de potássio.

[00168] Um peptideo ou variante onde o peptideo é modificado ou

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69/196 inclui ligações não peptídicas é uma modalidade preferida da invenção.

[00169] Outra modalidade da presente invenção se refere a um peptídeo que não é encontrado naturalmente, sendo que o referido peptídeo consiste ou consiste essencialmente em uma sequência de aminoácidos de acordo com SEQ ID N- 1 a SEQ ID N^Q 279 e foi produzido sinteticamente (por exemplo sintetizado) na forma de um sal farmaceuticamente aceitável. Os métodos de produção sintética de peptídeos são bem conhecidos na técnica. Os sais dos peptídeos de acordo com a presente invenção diferem substancialmente dos peptídeos em seu estado in vivo, pois esses peptídeos não se apresentam como sais in vivo. O peptídeo em forma de sal não natural medeia a solubilidade do peptídeo, sobretudo no âmbito de composições farmacêuticas que compreendem os peptídeos (por exemplo as vacinas peptídicas aqui reveladas). Para fornecer eficientemente os peptídeos ao indivíduo a ser tratado, requer-se uma solubilidade suficiente e pelo menos substancial do(s) peptídeos(s). Preferivelmente, os sais são sais farmaceuticamente aceitáveis dos peptídeos. Os referidos sais de acordo com a invenção incluem sais alcalinos e alcalino-terrosos, tais como os sais da série de Hofmeister, que compreendem os ânions PO4³·, SO4²·, CHaCOO', Cl’, Br, NO3·, CIO4·, I’, SCN’ e os cátions NhÍ4⁺, Rb⁺, K⁺, Na⁺, Cs⁺, Li⁺, Zn²⁺, Mg²⁺, Ca²⁺, Mn²⁺, Cu²⁺ e Ba²⁺. Sais específicos são selecionados entre (NH₄)₃PO4, (ΝΗ₄)₂ΗΡΟ₄, (NH₄)H₂PO₄, (NH₄)2SQ₄, NH4CH3COO, NH4CI, NH₄Br, NH4NO3, NH4CIO4, NH₄I, NH₄SCN, Rb₃PO₄, Rb₂HPO₄, RbH₂PO₄, Rb₂SO₄, Rb4CH₃COO, Rb₄CI, Rb₄Br, Rb₄NO₃, Rb₄CIO₄, Rb₄l, Rb₄SCN, K3PO4, K₂HPO₄, KH₂PO₄, K₂SO₄, KCH3COO, KCI, KBr, KNO3, KCIO4, Kl, KSCN, Na₃PO₄, Na₂HPO₄, NaH₂PO₄, Na₂SO₄, NaCH₃COO, NaCI, NaBr, NaNO₃, NaCIO₄, Nal, NaSCN, ZnCI₂ CS3PO4, Cs₂HPO4, CsH₂PO4, Cs₂SO4, CsCHsCOO, CsCI, CsBr,

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CsNO₃, CsCIO₄, Csl, CsSCN, Li₃PO₄, Li₂HPO₄, LiH₂PO₄, l_i₂SO₄, LiCH₃COO, LiCI, LiBr, LiNO₃, l_iCIO₄, Lil, LiSCN, Cu₂SO₄, Mg₃(PO₄)₂, Mg₂HPO₄, Mg(H₂PO₄)₂, Mg₂SO₄, Mg(CH₃COO)₂, MgCI₂, MgBr₂, Mg(NO₃)₂, Mg(CIO₄)₂, Mgl₂, Mg(SCN)₂, MnCI₂, Ca₃(PO₄)„ Ca₂HPO₄, Ca(H₂PO₄)₂, CaSO₄, Ca(CH₃COO)₂, CaCI₂, CaBr₂, Ca(NO₃)₂, Ca(CIO₄)₂, Cal₂, Ca(SCN)₂, Ba₃(PO₄)₂, Ba₂HPO₄, Ba(H₂PO₄)₂, BaSO₄, Ba(CH₃COO)₂, BaCI₂, BaBr₂, Ba(NO₃)₂, Ba(CIO₄)₂, Bal₂ e Ba(SCN)₂. São particularmente preferidos o acetato de NH, MgCI₂, KH₂PO₄, Na₂SO₄, KCI, NaCI e CaCI₂, tais como, por exemplo, sais cloreto ou acetato (trifl uoroacetato).

[00170] Geralmente, os peptídeos e variantes (pelo menos aquelas que contêm ligações peptídicas entre resíduos de aminoácidos) podem ser sintetizadas pelo método Fmoc-poliamida ou por síntese de peptídeos em fase sólida, conforme revelado por Lukas et al. (Lukas et al., 1981) e nas respectivas referências. O grupamento 9fluorenilmetiloxicarbonil (Fmoc) protege temporariamente o grupamento N-amino. A divagem repetitiva do grupo protetor altamente base-lábil é efetuada usando-se 20% piperidina em N, Ndimetilformamida. Os grupamentos em cadeias laterais podem ser protegidos mediante formação dos respectivos éteres butílicos (para treonina e tirosina), ésteres butílicos (para ácido glutâmico e ácido aspártico), derivados butiloxicarbonila (para lisina e histidina), derivados tritila (para cisteína) e derivados 4-metoxi-2,3,6trimetilbenzenossulfonil (para arginina). Se houver resíduos Cterminais de glutamina ou asparagina, o grupamento 4,4'dimetoxibenzidrila é usado para proteger os grupamentos amido das cadeias laterais. O suporte de fase sólida é baseado em um polímero de polidimetil-acrilamida constituído a partir de três monômeros: dimetilacrilamida (monômero da cadeia básica), bisacriloiletileno diamina (ligante cruzado) e acriloilsarcosina metil éster (agente

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71/196 funcionalizante). O agente clivável da ligação peptídeo-resina usado é um derivado ácido-lábil do ácido 4-hidroximetil-fenoxiacético. Todos os derivados de aminoácidos são adicionados na forma de anidridos simétricos pré-formados, com exceção de asparagina e glutamina, que são adicionadas usando-se um procedimento de acoplamento reverso mediado por N, N-dicicloexilcarbodiimida/1-hidroxibenzotriazol. Todas as reações de acoplamento e desproteção são monitoradas por procedimentos de teste com ninhidrina, ácido trinitrobenzenossulfônico ou isotina. Ao final da síntese, os peptídeos são clivados da resina de suporte e, ao mesmo tempo, os grupamentos protetores das cadeias laterais são removidos por tratamento com ácido trifluoracético a 95% contendo uma mistura de 50% de captantes. Alguns captantes comumente utilizados são etanoditiol, fenol, anisol e água, e a escolha exata depende dos aminoácidos constituintes do peptídeo que está sendo sintetizado. Também é possível combinar metodologias de fase sólida e fase em solução para sintetizar peptídeos (ver, por exemplo, Bruckdorfer et ai. (2004) e referências nele citadas).

[00171] O ácido trifluoracético é removido por evaporação a vácuo seguida de trituração com éter dietílico para produzir o peptídeo bruto. Quaisquer captantes que ainda estiverem presentes serão retirados por um procedimento de extração simples, no qual a liofilização da fase aquosa produz o peptídeo bruto livre de captantes. Os reagentes para síntese de peptídeos são geralmente fornecidos por, por exemplo, Calbiochem-Novabiochem (Nottingham, Reino Unido).

[00172] A purificação pode ser realizada por qualquer uma ou por uma combinação de técnicas como recristalização, cromatografia de exclusão por tamanho molecular, cromatografia de troca iônica, cromatografia de interação hidrofóbica e (geralmente) cromatografia líquida de alto desempenho de fase reversa usando, por exemplo, um gradiente de separação de acetonitrilo/água.

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[00173] A análise dos peptídeos pode ser realizada usando-se cromatografia em camada fina, eletroforese — sobretudo a eletroforese capilar com extração em fase sólida (CSPE, capillary solid phase extraction) —, cromatografia líquida de alto desempenho de fase reversa, análise de aminoácidos após hidrólise ácida e por espectrometria de massa com bombardeio por átomos rápidos (FAB, fast atom bombardment), assim como análise espectrométrica de massa por MALDI e ESI-Q-TOF.

[00174] Para identificação e quantificação relativa de ligantes de HLA por espectrometria de massa, moléculas de HLA de amostras de tecido congeladas criogenicamente foram purificadas e peptídeos associados ao HLA foram isolados. Os peptídeos isolados foram separados e suas sequências foram identificadas por ensaios de cromatografia líquida com espectrometria de massa (LC-MS) com ionização por nanoeletrospray (nanoESI). As sequências peptídicas resultantes foram verificadas comparando-se o padrão de fragmentação dos peptídeos associados a tumores (TUMAPs) naturais registrado em amostras de leucemia linfocítica crônica (N = 35 amostras), leucemia mieloide crônica (N = 16 amostras) e leucemia mieloide aguda (N = 32 amostras) com os padrões de fragmentação de peptídeos de referência sintéticos correspondentes cujas sequências eram idênticas. Como os peptídeos foram identificados diretamente como ligantes de moléculas de HLA de tumores primários, esses resultados constituem uma evidência direta de que os peptídeos identificados são processados e apresentados natural mente nos tecidos cancerosos primários obtidos de 83 pacientes com leucemia linfocítica crônica, leucemia linfocítica, leucemia mieloide crônica e leucemia mieloide aguda (ver Exemplo 1).

[00175] O pipeline de descoberta /PRESIDENT® v2.1 (ver, por exemplo, US 2013-0096016, que fica aqui integralmente incorporada

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73/196 por referência) permite identificar e selecionar peptídeos sobreapresentados relevantes candidatos a uso vacinai com base na quantificação relativa direta dos níveis de peptídeo restrito por HLA em tecidos cancerosos em comparação com diversos outros tecidos e órgãos não cancerosos. Isso foi obtido mediante desenvolvimento de quantificação diferencial sem marcadores com uso dos dados adquiridos por cromatografia líquida com espectrometria de massa (LC-MS), que foram processados por um pipeline de dados exclusivo. O pipeline combina algoritmos de identificação de sequências, agregação espectral, contagem de íons, alinhamento de tempos de retenção e desconvolução e normalização de estados de carga.

[00176] Os complexos HLA-peptídeo em amostras de leucemia linfocítica crônica, leucemia mieloide crônica e leucemia mieloide aguda foram purificados e os peptídeos associados ao HLA foram isolados e analisados por LC-MS (ver Exemplo 1). Todos os TUMAPs contidos na presente solicitação foram identificados mediante essa abordagem a partir de amostras de leucemia linfocítica crônica, leucemia mieloide crônica e leucemia mieloide aguda primárias. O procedimento confirmou a apresentação dos TUMAPs em leucemia linfocítica crônica, leucemia mieloide crônica e leucemia mieloide aguda primárias.

[00177] Além da apresentação do peptídeo, a expressão do mRNA do gene subjacente também foi testada. Os dados de mRNA foram obtidos por meio de análises de sequenciamento de RNA de tecidos normais e de tecidos cancerosos (cf. Exemplo 2 na Figura 1). Preferivelmente, foram incluídos na presente invenção peptídeos derivados de proteínas codificadas por mRNAs expressos de forma acentuada em tecidos cancerosos e pouco ou nada expressos em tecidos normais.

[00178] A presente invenção fornece peptídeos úteis para o

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74/196 tratamento de cânceres e tumores, preferivelmente leucemia linfocítica crônica, leucemia mieloide crônica e leucemia mieloide aguda com apresentação exacerbada ou exclusiva dos peptídeos da invenção. A espectrometria de massa mostrou que esses peptídeos são apresentados naturalmente por moléculas de HLA em amostras de leucemia linfocítica crônica, leucemia mieloide crônica e leucemia mieloide aguda primárias em humanos.

[00179] Muitas das proteínas e/ou genes fonte (também designada proteínas completas ou proteínas subjacentes) dos quais os peptídeos são derivados apresentaram altos níveis de sobrexpressão no câncer em comparação com tecidos normais. Para fins desta invenção, tecidos normais são células mononucleares de sangue periférico (CMSP) saudáveis ou outras células de tecidos normais, que demonstram a existência de níveis elevados de associação com os genes originais (ver Exemplo 2). Os peptídeos também estão presentes em tecido tumoral. Para fins desta invenção, tecido tumoral são amostras de pacientes que sofrem de leucemia linfocítica crônica, leucemia mieloide crônica ou leucemia mieloide aguda.

[00180] Os peptídeos ligados ao HLA podem ser reconhecidos pelo sistema imunológico, especificamente pelos linfócitos T. As células T podem destruir as células que apresentam o complexo HLA/peptídeo reconhecido, por exemplo leucemia linfocítica crônica, leucemia mieloide crônica ou leucemia mieloide aguda que apresentam os peptídeos derivados.

[00181] Os peptídeos da presente invenção mostraram-se capazes de estimular respostas de células T e/ou são sobreapresentados;

portanto, pode-se usá-los para produzir anticorpos e/ou TCRs, tais como os sTCRs solúveis de acordo com a presente invenção (ver

Exemplo 3 e Exemplo 4). Além disso, os peptídeos da presente invenção também podem ser usados, quando formam complexos com

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75/196 os respectivos MHCs, para produzir anticorpos e/ou sTCRs, sobretudo sTCRs, de acordo com a presente invenção. Os respectivos métodos são bem conhecidos de indivíduos versados na técnica e também podem ser encontrados na respectiva literatura (ver também adiante). Assim, os peptídeos da presente invenção são úteis para gerar uma resposta imune em um paciente, por meio da qual as células tumorais podem ser destruídas. Pode-se induzir uma resposta imune em um paciente administrando-se os peptídeos descritos ou substâncias precursoras apropriadas (por exemplo peptídeos prolongados, proteínas ou ácidos nucleicos que codificam tais peptídeos) diretamente ao paciente, idealmente em combinação com agentes que promovem a imunogenicidade (isto é, um adjuvante). Pode-se esperar que a resposta imune originária de tal vacinação terapêutica seja altamente específica contra células tumorais porque os peptídeos-alvo da presente invenção não são apresentados em tecidos normais em números de cópias semelhantes, evitando o risco de reações autoimunes indesejadas contra células normais do paciente.

[00182] A presente descrição refere-se também a receptores de células T (TCRs) que compreendem uma cadeia alfa e uma cadeia beta (TCRs alfa/beta). Também são fornecidos peptídeos de acordo com a invenção capazes de se ligar a TCR e anticorpos quando apresentados por uma molécula de MHC.

[00183] A presente descrição se refere também a fragmentos dos TCRs de acordo com a presente invenção que são capazes de se ligarem a um antigeno peptídico de acordo com a presente invenção quando estes são apresentados por uma molécula de HLA. O termo se refere em particular a fragmentos de TCR solúveis (por exemplo TCRs sem as porções transmembrana e/ou sem as regiões constantes, TCRs de cadeia única e fusões dos mesmos, por exemplo, com imunoglobulinas).

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[00184] A presente descrição refere-se também a ácidos nucleicos, vetores e células hospedeiras para expressão de TCRs e peptídeos da presente descrição, assim como a métodos de usá-los.

[00185] O termo receptor de células T (abreviatura TCR) refere-se a uma molécula heterodimérica que compreende uma cadeia polipeptídica alfa (cadeia alfa) e uma cadeia polipeptídica beta (cadeia beta), na qual o receptor heterodimérico é capaz de se ligar a um antígeno peptídico apresentado por uma molécula de HLA. O termo também inclui os chamados TCRs gama/delta.

[00186] Em uma modalidade, a descrição fornece um método de produção de um TCR conforme aqui descrito, sendo que o método compreende cultivar células hospedeiras capazes de expressar o TCR em condições apropriadas para promover a expressão do TCR.

[00187] Em outro aspecto, a descrição refere-se a métodos de acordo com a descrição, sendo que o antígeno é carregado em moléculas de MHC classe I ou II expressas na superfície de uma célula apresentadora de antígenos apropriada ou de uma célula apresentadora de antígenos artificial colocando-se uma quantidade suficiente do antígeno em contato com uma célula apresentadora de antígenos ou o antígeno é carregado em tetrâmetros de MHC classe I ou II por meio da tetramerização de monômeros de complexos de MHC classe I ou II com antígenos.

[00188] As cadeias alfa e beta dos TCRs alfa/beta e as cadeias gama e delta dos TCRs gama/delta são geralmente consideradas como possuindo dois domínios cada: o domínio variável e o domínio constante. O domínio variável consiste na concatenação de uma região variável (V) com uma região juncional (J). O domínio variável também pode incluir uma região líder (L), e as cadeias beta e delta também podem apresentar uma região de diversidade (D). Os domínios constantes das cadeias alfa e beta também podem incluir

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77/196 domínios transmembrana (TM) C-terminais que ancoram as cadeias alfa e beta à membrana celular.

[00189] Em relação aos TCRs gama/delta, o termo domínio variável do TCR gama conforme aqui utilizado refere-se à concatenação da região gama V do TCR (TRGV) sem região líder (L) com a região TCR gama J (TRGJ), e o termo TCR gama de domínio constante refere-se à região extracelular do TRGC ou a uma sequência de TRGC com truncamento C-terminal. Da mesma forma, o termo domínio variável de TCR delta refere-se à concatenação da região TCR delta V (TRDV) sem região líder (L) com a região TCR delta D/J (TRDD/TRDJ), e o termo domínio constante do TCR delta refere-se à região extracelular do TRDC ou a uma sequência de TRDC com truncamento C-terminal.

[00190] Os TCRs da presente invenção se ligam preferivelmente a um complexo de peptídeo com HLA com afinidade de ligação (Kd) de cerca de 100 μΜ ou menos, cerca de 50 μΜ ou menos, cerca de 25 μΜ ou menos ou cerca de 10 μΜ ou menos. São mais preferíveis os TCRs de alta afinidade cujas afinidades de ligação sejam de aproximadamente 1 μΜ ou menos, cerca de 100 nM ou menos, cerca de 50 nM ou menos ou cerca de 25 nM ou menos. São exemplos não limitantes dos intervalos de afinidade de ligação preferidos de TCRs da presente invenção cerca de 1 nM a cerca de 10 nM; cerca de 10 nM a cerca de 20 nM; cerca de 20 nM a cerca de 30 nM; cerca de 30 nM a cerca de 40 nM; cerca de 40 nM a cerca de 50 nM; cerca de 50 nM a cerca de 60 nM; cerca de 60 nM a cerca de 70 nM; cerca de 70 nM a cerca de 80 nM; cerca de 80 nM a cerca de 90 nM; e cerca de 90 nM a cerca de 100 nM.

[00191] Conforme aqui utilizado em relação aos TCRs da presente descrição, ligação específica e variações gramaticais do termo são usados para designar um TCR com afinidade de ligação (Kd) de 100

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78/196 μΜ ou menos para um complexo de HLA com peptídeo.

[00192] As TCRs alfa/beta heterodiméricas da presente descrição podem ter uma ligação dissulfeto introduzida entre seus domínios constantes. Os TCRs preferidos deste tipo incluem aqueles com uma sequência de domínio TRAC constante e uma sequência de TRBC1 ou TRBC2 constante, exceto que a Tre 48 do TRAC e a Ser 57 do TRBC1 ou TRBC2 são substituídas por resíduos de cisteína, e essas cisteínas formam uma ponte dissulfeto entre a sequência de domínio constante do TRAC e a sequência de domínio constante do TRBC1 ou TRBC2 do TCR.

[00193] Com ou sem a introdução da ligação entre cadeias mencionada anteriormente, os TCRs alfa/beta heterodiméricos da presente descrição podem apresentar um domínio com sequência constante codificado pelo gene TRAC e um domínio TRBC1 ou TRBC2 com sequência constante, e as sequências do domínio constante TRAC e dos domínios constantes TRBC1 ou TRBC2 do TCR podem ser ligadas uma à outra pela ligação dissulfeto nativa entre a Cis4 do éxon 2 da TRAC e a Cis2 do éxon 2 da TRBC1 ou da TRBC2.

[00194] Os TCRs da presente descrição podem compreender um marcador detectável, selecionado do grupo formado por um radionuclídeo, um fluoróforo e biotina. Os TCRs da presente descrição podem ser conjugados com um agente terapeuticamente ativo, como um radionuclídeo, um agente quimioterápico ou uma toxina.

[00195] Em uma modalidade, um TCR da presente descrição que apresenta pelo menos uma mutação na cadeia alfa e/ou apresenta pelo menos uma mutação na cadeia beta exibe glicosilação modificada em comparação com o TCR sem mutação.

[00196] Em uma modalidade, um TCR que compreende pelo menos uma mutação na cadeia alfa do TCR e/ou a cadeia beta do TCR

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79/196 possui afinidade de ligação por e/ou meia-vida de ligação para um complexo de peptídeo com molécula de HLA que corresponde a pelo menos o dobro do de um TCR que compreende a cadeia alfa não mutante do TCR e/ou a cadeia beta não mutante do TCR. A melhora da afinidade de TCRs específicas para tumores e sua exploração depende da existência de uma janela na qual o TCR apresenta máxima afinidade. A existência dessa janela baseia-se em observações de que TCRs específicos para patógenos restritos por HLA-A2 geralmente possuem valores de Kd 10 vezes menores que os de TCRs específicos para autoantígenos associados a tumor restritos por HLA-A2. Sabe-se atualmente que, embora os antígenos tumorais tenham potencial imunogênico, apenas proteínas mutantes ou cujo processamento pós-tradução foi alterado serão consideradas estranhas pelo sistema imune; afinal, os tumores se originam das células do próprio indivíduo. Os antígenos sobrerregulados ou sobrexpressos (os chamados autoantígenos) nem sempre induzem uma resposta imune funcional contra o tumor. As células T que expressam TCRs reativos a esses antígenos são selecionadas negativamente no time por um processo conhecido como tolerância central, no qual apenas células T com TCRs de baixa afinidade para autoantígenos permanecem. Portanto, a afinidade por peptídeos dos TCRs da presente descrição ou de variantes dos mesmos pode ser melhorada por métodos bem conhecidos na técnica.

[00197] A presente descrição se refere também a um método de identificação de isolamento de um TCR de acordo com a presente invenção, sendo que o referido método compreende a incubação de células mononucleares do sangue periférico (CMSP) de doadores negativos para HLA-A*02 com monômeros de peptídeo-A2, incubação das CMSPs com ficoeritrina tetramérica (PE) e isolamento das células T que apresentam avidez elevada por separação celular ativada por

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80/196 fluorescência (FACS)-Calibur.

[00198] A presente descrição refere-se também a um método de identificação e isolamento de TCR de acordo com a presente descrição, sendo que o referido método compreende a obtenção de um camundongo transgênico com a totalidade dos lócus do gene TCRap humano (1,1 e 0,7 Mb), no qual as células T expressam um repertório diversificado de TCR humano que compensa a deficiência de TCR de camundongo e imuniza o animal com o peptídeo de interesse; refere-se ainda à incubação de CMSP obtidas de camundongos transgênicos com ficoeritrina tetramérica (PE) e isolamento de células T de alta avidez por separação de células ativadas por fluorescência segundo FACS-Calibur.

[00199] Em um aspecto, para obter células T que expressem TCRs da presente descrição, realiza-se a clonagem de ácidos nucleicos que codificam as cadeias TCRoc e/ou TCRD da presente descrição em vetores de expressão, como retrovirus gama ou lentivírus. Uma vez gerados, os vírus recombinantes têm sua funcionalidade testada, incluindo especificidade para antígenos e avidez funcional. Em seguida, uma alíquota do produto final é utilizada para transdução da população de células T alvo (geralmente purificada de CMSP do paciente), que é então expandida antes de ser infundida no paciente.

[00200] Em outro aspecto, para se obter TCRs que expressam células T da presente descrição, RNAs de TCR são sintetizados por meio de procedimentos conhecidos na técnica, por exemplo sistemas de transcrição in vitro. Os RNAs de TCRs sintetizados in vitro são então introduzidos em células T CD8+ primárias obtidas de doadores saudáveis por eletroporação para que reexpressem as cadeias TCRoc e/ou TCRD específicas para tumores.

[00201] Para aumentar a expressão, os ácidos nucleicos que codificam os TCRs da presente descrição podem ser ligados

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81/196 operacionalmente a promotores fortes, tais como repetição terminal longa (LTRs) em retrovirus, citomegalovírus (CMV), vírus de células tronco murinas (MSCV) U3, fosfoglicerato quinase (PGK), β-actina, ubiquitina e um promotor composto de vírus símio 40 (SV40)/CD43, fator de alongamento (EF)-1a e o promotor do vírus formador de foco esplênico (SFFV). Em uma modalidade preferida, o promotor é heterólogo em relação ao ácido nucleico expresso.

[00202] Além dos promotores fortes, os cassetes de expressão de TCR da presente descrição podem conter outros elementos capazes de incentivar a expressão de transgenes, tais como um trato central de polipurina (cPPT), que promove a translocação central de estruturas lentivirais (Follenzi et al., 2000), e o elemento regulatório póstranscricional do vírus da hepatite da marmota (wPRE), que aumenta os níveis da expressão do transgene ao melhorar a estabilidade do RNA (Zufferey etal., 1999).

[00203] As cadeias alfa e beta de um TCR da presente invenção podem ser codificadas por ácidos nucleicos localizados em vetores separados ou por polinucleotídeos localizados no mesmo vetor.

[00204] Para obter níveis elevados de expressão superficial de TCR, tanto a cadeia TCRoc como a TCRp do TCR introduzido precisam ser transcritas em volumes elevados. Isso requer que as cadeias TCRoc e TCRp da presente descrição sejam clonadas com formação de estruturas bicistrônicas em um único vetor, o que se mostrou suficiente para sobrar esse obstáculo. O uso de um sítio de entrada intra-ribossômico viral (IRES) entre as cadeias TCRoc e TCRp induz a expressão coordenada das duas cadeias, pois as cadeias TCRoc e TCRp são ambas geradas a partir de um único produto de transcrição, que é clivado em duas proteínas durante a tradução, garantindo que as cadeias TCRoc e TCRp sejam produzidas em proporção equimolar (Schmitt et al., 2009).

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[00205] Os ácidos nucleicos que codificam os TCRs da presente descrição podem ser otimizados ao nível de seus códons para aumentar a expressão em uma célula hospedeira. O código genético é redundante e permite que alguns aminoácidos sejam codificados por mais de um códon, mas alguns códons são menos adequados que outros devido a fatores como, por exemplo, a disponibilidade relativa de tRNAs correspondentes (Gustafsson et al., 2004). Demonstrou-se que a modificação das sequências dos genes TCRoc e TCRD de modo que cada aminoácido seja codificado pelo códon ideal para expressão de genes de mamíferos e de modo que a instabilidade de motivos ou de sítios de splicing crípticos seja eliminada aumenta significativamente a expressão de genes de TCRoc e TCRp (Scholten etal., 2006).

[00206] Além disso, erros de pareamento entre a cadeia de TCR endógena e a introduzida podem criar especificidades que acarretam risco significativo de autoimunidade. Por exemplo, a formação de dímeros mistos de TCR pode reduzir o número de moléculas CD3 disponíveis para formar complexos TCR devidamente pareados, o que diminui significativamente a avidez funcional das células que expressam o TCR introduzido (Kuball et al., 2007).

[00207] Para reduzir erros de pareamento, o domínio C-terminal das cadeias do TCR introduzidas na presente descrição pode ser modificado para promover a afinidade entre cadeias e, ao mesmo tempo, tornar as cadeias introduzidas menos capazes de emparelhar com o TCR endógeno. Essas estratégias podem consistir em substituição dos domínios C-terminais de TCRoc e TCRp humanos por seus correspondentes murinos (domínio C-terminal murinizado), geração de uma segunda ponte dissulfeto entre as cadeias no domínio C-terminal introduzindo-se um segundo resíduo de cisteína tanto na cadeia TCRoc como na cadeia TCRD do TCR introduzido (modificação

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83/196 por cisteína), troca de resíduos que interagem nos domínios Cterminais das cadeias TCRoc e TCRp (knob in hole) e fusão dos domínios variáveis das cadeias TCRoc e TCRp diretamente no CD3< (fusão de CD3<) (Schmitt et al., 2009).

[00208] Em uma modalidade, uma célula hospedeira é modificada para expressar um TCR da presente descrição. Em algumas configurações preferidas, a célula hospedeira é uma célula T humana ou um progenitor de célula T. Em algumas configurações, a célula T ou a célula progenitora de célula T é obtida de um paciente com câncer. Em outras configurações, a célula T ou a célula progenitora de célula T é obtida de um doador saudável. As células hospedeiras da presente descrição podem ser alogênicas ou autólogas em relação ao paciente a ser tratado. Em uma modalidade a célula hospedeira é uma célula T gama/delta transformada para expressar um TCR alfa/beta.

[00209] Uma composição farmacêutica significa uma composição apropriada para administração a um ser humano em um ambiente clínico. Preferivelmente, a composição farmacêutica é estéril e produzida de acordo com as diretrizes de Boas Práticas de Fabricação.

[00210] As composições farmacêuticas compreendem os peptídeos tanto em forma livre como na forma de um sal farmaceuticamente aceitável (ver também o texto anterior). Conforme aqui utilizado, sal farmaceuticamente aceitável refere-se a um derivado dos peptídeos revelados onde o peptideo é modificado elaborando-se sais ácidos ou básicos do agente. Por exemplo, os sais ácidos são preparados a partir da base livre (geralmente onde a forma neutra da droga possui um grupamento NH2 neutro) envolvendo reação com um ácido apropriado. Entre os ácidos apropriados para preparar sais ácidos estão tanto ácidos orgânicos (por exemplo ácido acético, ácido propiônico, ácido glicólico, ácido pirúvico, ácido oxálico, ácido málico,

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84/196 ácido malônico, ácido succínico, ácido maleico, ácido fumárico, ácido tartárico, ácido cítrico, ácido benzoico, ácido cinâmico, ácido mandélico, ácido metanossulfônico, ácido etanossulfônico, ácido ptoluenossulfônico, ácido salicílico e assemelhados) como ácidos inorgânicos (por exemplo ácido clorídrico, ácido bromídrico, ácido sulfúrico, ácido nítrico, ácido fosfórico e assemelhados). Por outro lado, a preparação de sais básicos de grupamentos ácidos que podem estar presentes em um peptídeo são preparados usando-se uma base farmaceuticamente aceitável como hidróxido de sódio, hidróxido de potássio, hidróxido de amônia, hidróxido de cálcio, trimetilamina ou assemelhados.

[00211] Em uma modalidade especialmente preferida, as composições farmacêuticas compreendem os peptídeos na forma de sais do ácido acético (acetatos), de trifluoracetatos ou do ácido clorídrico (cloretos).

[00212] Preferivelmente, o medicamento da presente invenção é um imunoterápico como uma vacina. Ela pode ser administrada ao paciente, seja no órgão afetado ou por via sistêmica i.d., i.m., s.c., i.p. e i.v. ou aplicada ex vivo em células derivadas do paciente ou de linhagens celulares humanas que são posteriormente administradas ao paciente ou usadas in vitro para selecionar uma subpopulação de células imunes derivadas do paciente, que são então readministradas ao paciente. Se o ácido nucleico for administrado a células in vitro, pode ser útil que as células sejam transfectadas para que coexpressem citoquinas imunoestimulatórias como a interleucina 2. O peptídeo pode ser basicamente puro ou associado a um adjuvante imunoestimulatório (ver adiante) ou usado em associação com citoquinas imunoestimulatórias ou ser administrado por um sistema de administração apropriado como, por exemplo, lipossomos. O peptídeo também pode ser conjugado com um transportador apropriado, como

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85/196 a hemocianina de lapa (KLH, keyhole limpet hemocyanin) ou manana (ver WO 95/18145 e Longenecker et al. (1993)). O peptídeo também pode ser marcado por uma proteína de fusão ou ser uma molécula híbrida. Espera-se que os peptídeos cujas sequências são mostradas na presente invenção sejam capazes de estimular células T CD4 ou CD8. Entretanto, a estimulação de células T CD8 é mais eficiente na presença do auxílio proporcionado por células T auxiliares CD4. Portanto, para epítopos de MHC classe I que estimulam células T CD8, o elemento de fusão ou seções de uma molécula híbrida proporcionam epítopos de maneira apropriada, que estimulam células T CD4-positivas. Os epítopos estimulantes de CD4 e CD8 são bem conhecidos na técnica e incluem aqueles identificados na presente invenção.

[00213] Em um aspecto, a vacina compreende pelo menos um peptídeo cuja sequência de aminoácidos é apresentada em SEQ ID N^Q 1 a SEQ ID N^Q 279 e pelo menos um outro peptídeo, preferivelmente de 2 a 50, mais preferivelmente de 2 a 25, ainda mais preferivelmente de 2 a 20 e, o mais preferido, de 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17 ou 18 peptídeos. Os peptídeos podem ser derivados de um ou mais AATs específicos e podem se ligar a moléculas de MHC classe I.

[00214] Outro aspecto da invenção proporciona um ácido nucleico (por exemplo, um polinucleotídeo) que codifica um peptídeo ou variante de um peptídeo da invenção. O polinucleotídeo pode ser, por exemplo, DNA, cDNA, PNA, RNA ou combinações dos mesmos, tanto de fita única como de dupla fita, ou formas nativas ou estabilizadas de polinucleotídeos como, por exemplo, polinucleotídeos com uma cadeia básica de fosforotioato, e pode ou não conter introns, contanto que codifique o peptídeo. Evidentemente, apenas peptídeos que contenham os resíduos de aminoácidos que ocorrem naturalmente e

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86/196 unidos por ligações peptídicas que ocorrem naturalmente podem ser codificados por um polinucleotídeo. Outro aspecto da invenção fornece um vetor de expressão capaz de expressar um polipeptideo de acordo com a invenção.

[00215] Diversos métodos foram desenvolvidos para ligar polinucleotídeos, sobretudo de DNA, a vetores usando, por exemplo, terminações coesivas complementares. Por exemplo, trechos de homopolímeros complementares podem ser adicionados ao segmento de DNA a ser inserido no DNA do vetor. Em seguida, o vetor e o segmento de DNA são unidos pela ponte de hidrogênio entre as caudas homopoliméricas complementares para formar moléculas de DNA recombinante.

[00216] Ligantes sintéticos que contêm um ou mais sítios de restrição constituem um método alternativo de unir o segmento de DNA aos vetores. Existem também diversas fontes comerciais de ligantes sintéticos contendo diversos sítios de endonucleases de restrição, tais como a International Biotechnologies Inc. (New Haven, CN, EUA).

[00217] Um método desejável de modificar o DNA que codifica ο polipeptideo da invenção usa a reação em cadeia de polimerase, conforme descrita por Saiki RK, et ai (1988). Esse método pode ser usado introduzindo-se DNA em um vetor apropriado, por exemplo, mediante engenharia de sítios de restrição apropriados, ou pode-se usá-lo para modificar o DNA de outras formas úteis, como é conhecido na técnica. Se forem usados vetores virais, são preferidos os vetores de varíola ou adenovirus.

[00218] O DNA (ou RNA, no caso de vetores retrovirais) pode então ser expresso em um hospedeiro apropriado para produzir um polipeptideo que compreende um peptídeo da invenção ou variante do mesmo. Portanto, o DNA que codifica o peptídeo da invenção ou

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87/196 variante do mesmo pode ser usado de acordo com técnicas conhecidas e modificado apropriadamente conforme os ensinamentos aqui apresentados para construir um vetor de expressão, que é então utilizado para transformar uma célula hospedeira apropriada e produzir o polipeptídeo da invenção. Tais técnicas incluem as reveladas em, por exemplo, US 4.440.859, 4.530.901, 4.582.800, 4.677.063, 4.678.751,4.704.362, 4.710.463, 4.757.006, 4.766.075 e 4.810.648. [00219] O DNA (ou RNA no caso de vetores retrovirais) que codifica o polipeptídeo que constitui o composto da invenção pode ser unido a várias outras sequências de DNA para introdução em um hospedeiro apropriado. O DNA acompanhante dependerá da natureza do hospedeiro, do modo como o DNA é introduzido no hospedeiro e em se o desejado é a manutenção epissômica ou a integração.

[00220] Em geral, o DNA é inserido em um vetor de expressão como um plasmídio na orientação correta e no frame de leitura correto para expressão. Se necessário, o DNA pode ser ligado às sequências de nucleotídeos reguladoras da transcrição e tradução reconhecidas pelo hospedeiro desejado, embora tais reguladores geralmente estejam disponíveis no vetor de expressão. Em seguida, o vetor é introduzido no hospedeiro por meio de técnicas padrão. Como nem todos os hospedeiros são transformadas ao serem expostos ao vetor, é necessário selecionar as células do hospedeiro que sofreram transformação. Uma técnica de seleção consiste em incorporar ao vetor de expressão uma sequência de DNA, junto com os elementos de controle necessários, que codifique uma característica selecionada na célula transformada, como resistência a um antibiótico.

[00221] Como alternativa, o gene para tal característica selecionável pode estar em outro vetor, que é usado conjuntamente para transformar a célula hospedeira desejada.

[00222] As células hospedeiras transformadas pelo DNA

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88/196 recombinante da invenção são então cultivadas por um período de tempo suficiente e sob condições apropriadas, bem conhecidas dos versados na técnica em vista dos ensinamentos aqui revelados, para permitir a expressão do polipeptideo, que poderá então ser recuperado.

[00223] Muitos vetores de expressão são conhecidos, incluindo bactérias (por exemplo E. coli e Bacillus subtilis), leveduras (por exemplo Saccharomyces cerevisiae), fungos filamentosos (por exemplo Aspergillus sp.), células vegetais, células animais e células de insetos. Preferivelmente, o sistema pode consistir em células mamíferas como células CHO disponibilizadas pela ATCC Cell Biology Collection.

[00224] Um vetor plasmídio típico para expressão constitutiva em célula mamífera compreende o promotor de CMV ou SV40 com uma cauda poli-A apropriada e um marcador de resistência como a neomicina. Um exemplo é o pSVL, disponibilizado pela Pharmacia, Piscataway, NJ, EUA. Um exemplo de vetor de expressão induzível para células mamíferas é o pMSG, também fornecido pela Pharmacia. O pRS403-406 e o pRS413-416 são vetores plasmídicos úteis, que são geralmente disponibilizados pela Stratagene Cloning Systems (La Jolla, CA 92037, EUA). Os plasmídios pRS403, pRS404, pRS405 e pRS406 são plasmídios de integração a leveduras (Yips, Yeast Integrating plasmids) e incluem os marcadores selecionáveis de leveduras HIS3, TRP1, LEU2 e URA3. Os plasmídios pRS413-416 são plasmídios de centromeres de leveduras (Ycps, yeast centromere plasmids). Os vetores à base de promotor de CMV (por exemplo os fornecidos pela Sigma-Aldrich) proporcionam expressão transitória ou estável, expressão citoplasmática ou secreção, e a marcação Nterminal ou C-terminal em várias combinações de FLAG, 3xFLAG, cmyc ou MAT. Essas proteínas de fusão permitem detectar, purificar e

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89/196 analisar a proteína recombinante, e as proteínas de fusão com marcação dupla aumentam a flexibilidade de detecção.

[00225] A região regulatória promotora forte do citomegalovírus humano (CMV) promove a expressão de níveis constitutivos de proteína de até 1 mg/L em células COS. Em linhagens celulares menos potentes, os níveis proteicos são geralmente cerca de 0,1 mg/L. A presença da origem de replicação do SV40 proporciona níveis elevados de replicação de DNA em células COS que permitem a replicação de SV40. Os vetores de CMV podem conter, por exemplo, a origem pMB1 (derivada de pBR322) para permitir a replicação em células bacterianas, o gene de β-lactamase para seleção de resistência à ampicilina em bactérias, poli-A de hGH e a origem f1. Os vetores que contêm a sequência líder de preprotripsina (PPT) podem direcionar a secreção de proteínas de fusão FLAG no meio de cultura para purificação mediante o uso de anticorpos anti-FLAG, resinas e placas. Outros vetores e sistemas de expressão são bem conhecidos na técnica para uso com diversas células hospedeiras.

[00226] Em outra modalidade, dois ou mais peptídeos ou variantes de peptídeos da invenção são codificados e, portanto, expressos em ordem sucessiva, numa estrutura semelhante a contas em um colar. Ao fazê-lo, os peptídeos ou variantes de peptídeos podem ser ligados ou fundidos por trechos de aminoácidos ligantes, como, por exemplo, LLLLLL, ou podem ser ligados um ao outro sem nenhum outro peptídeo entre eles. Essas estruturas podem ser usadas para tratamento do câncer e podem induzir respostas imunes que envolvem tanto MHC I como MHC II.

[00227] A presente invenção refere-se também a uma célula hospedeira transformada por uma estrutura de vetor polinucleotídeo da presente invenção. A célula hospedeira pode ser procariota ou eucariota. As células bacterianas, que podem ser, preferivelmente,

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90/196 procariotas em algumas situações e normalmente são uma cepa de E. coli como, por exemplo, as cepas de E. coli DH5 fornecidas por Bethesda Research Laboratories Inc., (Bethesda, MD, EUA) e RR1, fornecidas pela American Type Culture Collection (ATCC) (Rockville, MD, EUA) (ATCC N^Q 31343). As células eucariotas preferidas são as de levedura, inseto e mamífero, preferivelmente células de vertebrados como camundongo, rato, macaco ou linhagens celulares de fibroblastos ou cólon humano. São células hospedeiras de levedura YPH499, YPH500 e YPH501, que são geralmente disponibilizadas por Stratagene Cloning Systems (La Jolla, CA 92037, EUA). São células preferidas de hospedeiros mamíferos as de ovário de hamster chinês (CHO) fornecidas pela ATCC sob o número CCL61, células embrionárias NIH/3T3 de camundongo suíço do NIH fornecidas pela ATCC sob o número CRL 1658, células COS-1 derivadas de rim de macaco fornecidas pela ATCC sob o número CRL 1650 e células HEK-293 derivadas de rim embrionário humano. As células de inseto preferidas são as células Sf9, que podem ser transfectadas por vetores de expressão baseados em baculovírus. Uma visão geral da escolha de células hospedeiras apropriadas para expressão é apresentada, por exemplo, no livro-texto de Paulina Balbás e Argélia Lorence Methods in Molecular Biology Recombinant Gene Expression, Reviews and Protocols, Part One, Second Edition, ISBN 978-1-58829-262-9 e em outras publicações conhecidas dos versados na técnica.

[00228] A transformação de células hospedeiras apropriadas por uma estrutura de DNA da presente invenção é realizada por métodos bem conhecidos na técnica, que normalmente dependem do tipo de vetor utilizado. Em relação à transformação de células hospedeiras procariotas, ver, for exemplo, Cohen et al. (1972) e (Green e

Sambrook, 2012). A transformação de células de levedura foi descrita

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91/196 por Sherman et al. (1986) - O método de Beggs (1978) também é útil. A Stratagene Cloning Systems e a Life Technologies Inc. (Gaithersburg, MD 20877, EUA) fornecem reagentes úteis para transfectar células de vertebrados (por exemplo fosfato de cálcio, DEAE-dextrana e formulações de lipossomos). A eletroporação também pode ser usada para transformar e/ou transfectar células e é bem conhecida na técnica como processo para transformação de células de leveduras, células de bactérias, células de insetos e células de vertebrados.

[00229] As células cuja transformação foi bem-sucedida, isto é, células contendo uma estrutura de DNA da presente invenção, podem ser identificadas por técnicas bem conhecidas, como PCR. Uma técnica alternativa para detectar proteínas no sobrenadante é o uso de anticorpos.

[00230] Perceber-se-á que algumas células hospedeiras da invenção (por exemplo células bacterianas, de levedura ou de inseto) são úteis na preparação dos peptídeos da invenção. Entretanto, outras células hospedeiras podem ser úteis em determinados métodos terapêuticos. Por exemplo, células apresentadoras de antígenos, como as células dendríticas, podem ser utilizadas com proveito para expressar os peptídeos da invenção de forma que possam ser carregados em moléculas de MHC apropriadas. Portanto, a presente invenção fornece uma célula hospedeira que compreende um ácido nucleico ou um vetor de expressão de acordo com a invenção.

[00231] Em uma modalidade preferida, a célula hospedeira é uma célula apresentadora de antígenos, podendo ser uma célula dendrítica ou outra célula apresentadora de antígenos. Em 29 de abril de 2010, a

Food and Drug Administration (FDA) aprovou o sipuleucel-T, que consiste em CAAs carregadas com uma proteína de fusão recombinante que contém fosfatase ácida prostática (PAP), para

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92/196 tratamento de CPRC assintomático ou minimamente sintomático (Rini et al., 2006; Small et al., 2006).

[00232] Outro aspecto da invenção fornece um método de produção de um peptídeo ou de uma variante do mesmo, sendo que o método compreende o cultivo de uma célula hospedeira descrita e isolamento do peptídeo da célula hospedeira ou do meio de cultura da mesma.

[00233] Em outra modalidade, o peptídeo, o ácido nucleico ou o vetor de expressão da invenção são usados em medicina. Por exemplo, o peptídeo ou uma variante do mesmo podem ser preparados para injeção intravenosa (i.v.), injeção subcutânea (s.c.), injeção intradérmica (i.d.), injeção intraperitoneal (i.p.) ou injeção intramuscular (i.m.). Os métodos preferidos de injeção de peptídeos são s.c., i.d., i.p., i.m. e i.v. Os métodos preferidos de injeção de DNA são i.d., i.m., s.c., i.p. e i.v. Doses de, por exemplo, 50 pg a 1,5 mg e, preferivelmente 125 pg a 500 pg de peptídeo ou DNA, podem ser administradas, dependendo do peptídeo ou do DNA em questão. O uso de doses nesse intervalo já foi bem-sucedido em ensaios clínicos (Walter etal., 2012).

[00234] O polinucleotídeo usado para vacinação ativa pode ser basicamente puro ou contido em um sistema apropriado de vetor ou de transporte. Os ácidos nucleicos podem ser DNA, cDNA, PNA, RNA ou uma combinação dos mesmos. Os métodos usados para projetar e introduzir tais ácidos nucleicos são bem conhecidos na técnica. Uma visão geral é apresentada em, por exemplo, Teufel et al. (2005) Vacinas de polinucleotídeos são fáceis de preparar, mas o modo de ação pelo qual esses vetores induzem uma resposta imune não é totalmente compreendido. Os vetores e sistemas de administração apropriados utilizam DNA e/ou RNA viral, tais como sistemas baseados em adenovirus, vírus da vacínia, retrovirus, herpesvirus, vírus associados ao adenovirus ou híbridos contendo elementos de

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93/196 mais de um vírus. Alguns sistemas não virais consistem em lipídios catiônicos e polímeros catiônicos, que são bem conhecidos na técnica de administração de DNA. A administração física por dispositivos como o gene gun (canhão gênico) também pode ser usada. O(s) peptídeo(s) codificado(s) pelos ácidos nucleicos pode(m) ser uma proteína de fusão, por exemplo, com um epítopo que estimula as células T do respectivo CDR oposto, conforme descrito anteriormente. [00235] O medicamento da invenção também pode incluir um ou mais adjuvantes. Os adjuvantes são substâncias que promovem ou potencializam de maneira inespecífica a resposta imune (por exemplo a resposta imune mediada por células T CD8-positivas e células T auxiliares (TH)) contra um antigeno e que, portanto, seriam consideras úteis no medicamento da presente invenção. Alguns adjuvantes apropriados são, entre outros, 1018 ISS, sais de alumínio, AMPLIVAX®, AS15, BCG, CP-870.893, CpG7909, CyaA, dSLIM, flagelina ou ligantes TLR5 derivados da flagelina, ligante FLT3, GMCSF, IC30, IC31, imiquimode (ALDARA®), resiquimode, ImuFact IMP321, interleucinas como IL-2, IL-13, IL-21, interferon alfa ou beta ou derivados peguilados dos mesmos, IS Patch, ISS, ISCOMATRIX, ISCOMs, Juvlmmune®, LipoVac, MALP2, MF59, monofosforil lipídio A, Montanide IMS 1312, Montanide ISA 206, Montanide ISA 50V, Montanide ISA-51, emulsões de água-em-óleo ou óleo-em-água, OK432, OM-174, OM-197-MP-EC, ONTAK, OspA, sistema de vetor PepTel®, micropartículas à base de poli(lactídeo coglicolídeo) [PLG] e dextrana, talactoferrina, SRL172, virossomas e outras partículas semelhantes a vírus, YF-17D, armadilha de VEGF, R848, betaglucana, Pam3Cys, estimulon QS21 de Áquila (derivado da saponina), extratos micobacterianos e simuladores da parede celular bacteriana e outros adjuvantes exclusivos como Ribi's Detox, Quil ou Superfos. São preferidos adjuvantes como o de Freund ou GM-CSF. Vários

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94/196 adjuvantes imunológicos (por exemplo MF59) específicos para células dendríticas e suas preparações já foram descritos anteriormente (Allison e Krummel, 1995). Citoquinas também podem ser usadas. Várias citoquinas (por exemplo TNF) foram associadas diretamente à influência sobre a migração de células dendríticas para tecidos linfoides, acelerando a maturação de células dendríticas de modo a formar células apresentadoras de antígenos que interagem de forma eficiente com linfócitos T (por exemplo GM-CSF, IL-1 e IL-4) (Pat. EUA N^Q 5.849.589, que fica específica e integralmente incorporada por referência) e que possuam atividade imunoadjuvante (por exemplo IL12, IL-15, IL-23, IL-7 e IFNa). IFN□) (Gabrilovich et ai., 1996).

[00236] Descreveu-se também que os oligonucleotídeos CpG imunoestimulatórios podem potencializar os efeitos dos adjuvantes em situações vacinais. Sem restringir-se a nenhuma teoria, os oligonucleotídeos CpG agem ativando o sistema imune inato (não adaptativo) por meio de receptores do tipo Toll (TLR, Toll-like receptors), especial mente o TLR9. A ativação de TLR9 desencadeada pelo CpG promove respostas humorais e celulares específicas contra diversos antígenos, incluindo antígenos peptídicos ou proteicos, vírus vivos ou mortos, vacinas de células dendríticas, vacinas celulares autólogas e conjugados de polissacarídeos, em vacinas tanto profiláticas como terapêuticas. Ainda mais importante, o CpG promove a maturação e diferenciação de células dendríticas, produzindo ativação de células TH1 e forte geração de linfócitos T citotóxicos (LTC), mesmo na ausência de auxílio de células T CD4. O viés para TH1 induzido pela estimulação por TLR9 se mantém mesmo na presença de adjuvantes vacinais, tais como o alúmen ou o adjuvante incompleto de Freund (IFA), que normalmente promovem um viés para TH2. Os oligonucleotídeos CpG apresentam atividade adjuvante ainda mais acentuada quando formulados ou coadministrados com outros

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95/196 adjuvantes ou em formulações como micropartículas, nanopartículas, emulsões lipídicas ou formulações semelhantes, que são especialmente necessárias para induzir uma resposta acentuada a antígenos relativamente fracos. Eles também aceleram a resposta imune, permitindo reduzir as doses de antígenos em cerca de duas ordens de grandeza e obter uma resposta de anticorpos comparável à obtida com a dose plena da vacina sem CpG em alguns experimentos (Krieg, 2006). US 6.406.705 B1 descreve a utilização combinada dos oligonucleotídeos CpG, adjuvantes que não consistem em ácidos nucleicos e um antigeno para induzir uma resposta imune antígenoespecífica. Um antagonista de CpG TLR9 é o dSLIM (double Stem Loop Immunomodulator), produzido pela Mologen (Berlim, Alemanha), que é o componente preferido para a composição farmacêutica da presente invenção. Outras moléculas ligantes de TLR como o TLR 7, TLR 8 e/ou TLR 9 ligantes de RNA também podem ser utilizadas. [00237] Outros exemplos de adjuvantes úteis são, entre outros, CpGs modificados quimicamente (por exemplo CpR, Idera), análogos de RNA de dupla fita como o Poli(LC) e derivados do mesmo (por exemplo AmpliGen®, Hiltonol®, poli-(ICLC), poli(IC-R), poli(l:C12U), DNA ou RNA bacteriano sem CpG e moléculas pequenas ou anticorpos com atividade imunológica como a ciclofosfamida, sunitinibe, bevacizumabe®, Celebrex, NCX-4016, sildenafila, tadalafila, vardenafila, sorafenibe, temozolomida, tensirolimo, XL-999, CP-547632, pazopanibe, armadilha de VEGF, ZD2171, AZD2171 e anti-CTLA4, outros anticorpos contra estruturas-chave do sistema imune (por exemplo anti-CD40, anti-TGFD e antirreceptor de TNFa) e SC58175, que podem exercer ação terapêutica ou como adjuvantes. As quantidades e concentrações de adjuvantes e aditivos úteis no contexto da presente invenção podem ser determinadas facilmente e sem experimentação excessiva por indivíduos praticantes da técnica.

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[00238] São adjuvantes preferidos o anti-CD40, imiquimode, resiquimode, GM-CSF, ciclofosfamida, sunitinibe, bevacizumabe, interferon-α, oligonucleotídeos CpG e derivados, poli-(l:C) e derivados, RNA, sildenafila e formações particuladas com PLG ou virossomos.

[00239] Em uma modalidade preferida da composição farmacêutica de acordo com a invenção, o adjuvante é selecionado de um grupo formado por fatores estimuladores de colônias como o fator estimulador de colônias de granulócitos e macrófagos (GM-CSF, sargramostim), ciclofosfamida, imiquimod, resiquimode e interferon-a.

[00240] Em uma modalidade preferida da composição farmacêutica de acordo com a invenção, o adjuvante é selecionado de um grupo formado por fatores estimuladores de colônias como o fator estimulador de colônias de granulócitos e macrófagos (GM-CSF, sargramostim), ciclofosfamida, imiquimode e resiquimode. Em uma modalidade preferida da composição farmacêutica de acordo com a invenção, o adjuvante é a ciclofosfamida, o imiquimode ou o resiquimode. São adjuvantes ainda mais preferidos o Montanide IMS 1312, Montanide ISA 206, Montanide ISA 50V, Montanide ISA-51, poliICLC (Hiltonol®) e anticorpos monoclonais anti-CD40 ou combinações dos mesmos.

[00241] Esta composição é usada para administração parenteral, como por via subcutânea, intradérmica, intramuscular ou oral. Para esse fim, os peptídeos e, opcionalmente, outras moléculas, são dissolvidos ou suspensos em um veículo farmaceuticamente aceitável, preferivelmente um veículo aquoso. A composição também pode conter excipientes como tampões, agentes de ligação, agentes abrasivos, diluentes, flavorizantes, lubrificantes, etc. Os peptídeos também podem ser administrados conjuntamente com substâncias estimuladoras do sistema imune, como as citoquinas. Uma ampla lista de excipientes que podem ser usados em tais composições pode ser

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97/196 encontrada em, por exemplo, A. Kibbe, Handbook of Pharmaceutical Excipients (Kibbe, 2000). A composição pode ser usada para prevenção, profilaxia e/ou tratamento de doenças adenomatosas ou cancerosas. Podem-se encontrar formulações exemplares em, por exemplo, EP2112253.

[00242] Cabe ressaltar que a resposta imune produzida pela vacina de acordo com a invenção ataca o câncer em diferentes estágios celulares e em vários estágios de desenvolvimento. Além disso, outras vias de sinalização associadas com o câncer também são atacadas. Isso constitui uma vantagem em relação às vacinas que agem apenas sobre um ou poucos alvos, pois o tumor pode se adaptar facilmente a esse tipo de ataque (escape tumoral) e nem todos os tumores expressam o mesmo padrão de antígenos. Por isso, uma combinação de vários peptídeos associados a tumores garante que todos os tumores apresentarão pelo menos alguns dos alvos. A composição foi projetada para tumores que expressem vários dos antígenos e age sobre diversas vias independentes necessárias para o crescimento e a manutenção do tumor. Portanto, a vacina pode ser usada sem individualização em uma população maior de pacientes. Isso significa que os pacientes a serem tratados com a vacina podem ser selecionados apenas por tipagem de HLA e não requerem análise de outros biomarcadores de expressão antigênica. Mesmo assim, a resposta imune induzida ataca vários alvos ao mesmo tempo, o que é importante para a eficácia (Banchereau et al., 2001; Walter et al., 2012).

[00243] Conforme aqui utilizado, o termo scaffold (arcabouço) designa uma molécula que se liga especificamente a um determinante (por exemplo antigênico). Em uma modalidade, o arcabouço é capaz de direcionar a entidade à qual está vinculado (por exemplo um (segundo) grupamento ligante de antigeno) a um sítio alvo como, por

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98/196 exemplo, um tipo específico de célula tumoral ou estroma tumoral que apresenta um determinante antigênico (por exemplo um complexo de peptídeo com MHC de acordo com a aplicação ora contemplada). Em outra modalidade, o arcabouço é capaz de ativar a sinalização por meio de seu antígeno alvo, que pode ser, por exemplo, um antígeno de um complexo receptor de células T. Os arcabouços incluem, entre outros, anticorpos e fragmentos dos mesmos, domínios ligantes de antígenos em um anticorpo, que compreendem uma região de cadeia pesada do anticorpo e uma região de cadeia leve do anticorpo, proteínas ligantes que compreendem pelo menos um motivo repetitivo de anquirina e molécula ligantes de antígenos de domínio único (SDAB), aptâmeros, TCRs (solúveis) e células (modificadas) como, por exemplo, células T alogênicas ou autólogas. Para avaliar se uma molécula funciona como arcabouço e se liga a um alvo, podem ser realizados ensaios de ligação.

[00244] Por ligação específica, entende-se uma ligação na qual o arcabouço se liga ao complexo de peptídeo com MHC relevante melhor que a outros complexos de peptídeo com MHC, de modo que um arcabouço dotado de uma molécula ativa capaz de destruir uma célula portadora de um alvo específico não seja capaz de destruir outra célula que não possui o alvo específico mas apresenta outros complexos de peptídeo com MHC. A ligação a outros complexos de peptídeo com MHC é irrelevante quando o peptídeo do complexo de peptídeo com MHC que produz reação cruzada não ocorre naturalmente, isto é, não é derivado do peptidoma do HLA humano. Os ensaios de avaliação da morte de células-alvo são bem conhecidos na técnica e devem ser realizados usando células-alvo (células primárias ou linhagens celulares) nas quais o complexo de peptídeo com MHC seja apresentado inalterado ou células carregadas com peptídeos de modo que se atinjam os níveis observados naturalmente

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99/196 de complexos de peptideo com MHC.

[00245] Um arcabouço pode incluir uma marcação que permite detectá-lo por meio da determinação da presença ou ausência do sinal emitido pelo marcador. Por exemplo, o arcabouço pode ser marcado por um corante fluorescente ou qualquer outra molécula marcadora celular pertinente. Tais moléculas marcadoras são bem conhecidas na técnica. Por exemplo, a marcação fluorescente proporcionada, por exemplo, por um corante fluorescente, pode permitir a visualização do aptâmero ligado por meio de microscopia de fluorescência ou de varredura a laser ou detecção por citometria de fluxo.

[00246] Os arcabouços podem ser conjugados com uma segunda molécula ativa como, por exemplo, IL-21, anti-CD3 e anti-CD28.

[00247] Para mais informações sobre arcabouços polipeptídicos, ver, por exemplo, a seção geral de WO 2014/071978A1 e as referências nela citadas.

[00248] A presente invenção refere-se também a aptâmeros. Os aptâmeros (ver, por exemplo, WO 2014/191359 e a literatura nela citada) são moléculas curtas de ácido nucleico de fita única, que podem se dobrar formando estruturas tridimensionais e reconhecer estruturas-alvo específicas. Eles parecem ser opções apropriadas para o desenvolvimento de terapias direcionadas. Os aptâmeros se mostraram capazes de se ligar seletivamente e com alta afinidade e especificidade a diversos alvos complexos.

[00249] Na última década, foram identificados aptâmeros que reconhecem moléculas da superfície celular e proporcionam meios para o desenvolvimento de abordagens diagnosticas e terapêuticas. Como são praticamente atóxicos e não imunogênicos, os aptâmeros são candidatos promissores para aplicações biomédicas. Com efeito, aptâmeros como aqueles que reconhecem o antígeno prostático específico na membrana celular foram usados com sucesso como

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100/196 terapias direcionadas e demonstraram sua funcionalidade em modelos de xenoenxerto in vivo. Também foram identificados aptâmeros que reconhecem linhagens específicas de células tumorais.

[00250] Podem-se selecionar aptâmeros de DNA que revelem propriedades de reconhecimento de amplo espectro para várias células oncológicas, sobretudo aquelas derivadas de tumores sólidos, e que não reconheçam células não tumorigênicas nem células saudáveis primárias. Se os aptâmeros identificados, em vez de reconhecer um subtipo tumoral específico, interagissem com diversos tumores, isso os tornaria úteis para o diagnóstico e tratamento dito de amplo espectro.

[00251] Além disso, pesquisas sobre o comportamento de ligação celular, realizadas por citometria de fluxo, também mostraram que os aptâmeros apresentaram excelentes afinidades aparentes na faixa de nanomoles.

[00252] Os aptâmeros podem ter aplicações diagnosticas e terapêuticas. Também foi demonstrado que alguns aptâmeros são captados por células tumorais e, portanto, podem funcionar como veículos moleculares para administração dirigida de agentes anticâncer (por exemplo siRNA) a células tumorais.

[00253] Podem-se selecionar aptâmeros contra alvos complexos como células e tecidos e complexos de peptídeos que compreendem ou, preferivelmente, que consistem em uma sequência de acordo com SEQ ID N- 1 a SEQ ID N^Q 279 da invenção ora em pauta com a molécula de MHC usando a técnica de seleção cell-SELEX (Systematic Evolution of Ligands by Exponential Enrichment).

[00254] Os peptídeos da presente invenção podem ser usados para gerar e desenvolver anticorpos específicos contra complexos de MHC com peptídeo, que podem ser usados para tratamentos nos quais toxinas ou substâncias radioativas são guiadas até o tecido patológico.

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Outra aplicação desses anticorpos é guiar radionuclídeos ao tecido patológico para exames de imagem como o PET. Esta aplicação pode ajudar a detectar metástases pequenas ou determinar o tamanho e a localização exata dos tecidos patológicos.

[00255] Portanto, constitui outro aspecto da invenção o fornecimento de um método de produção de um anticorpo recombinante que se ligue especificamente a um complexo principal de histocompatibilidade (MHC) humano classe I ou II que forme um complexo com um antígeno restrito por HLA (preferivelmente um peptídeo de acordo com a presente invenção), sendo que o método compreende imunizar um mamífero não humano submetido à engenharia genética com células que expressam o referido complexo principal de histocompatibilidade (MHC) humano classe I ou II com uma forma solúvel de uma molécula de MHC classe I ou II que forme complexo com o referido antígeno restrito por HLA; isolar moléculas de mRNA de células produtoras de anticorpo do referido mamífero não humano; produzir uma biblioteca de exposição em fagos que exiba as moléculas de proteína codificadas pelas referidas moléculas de mRNA; e isolar ao menos um fago da referida biblioteca de exposição em fagos, sendo que o pelo menos um fago referido expõe o referido anticorpo e se liga especificamente ao referido complexo principal de histocompatibilidade (MHC) humano classe I ou II em complexo com o referido antígeno restrito por HLA.

[00256] Constitui, portanto, outro aspecto da presente invenção o fornecimento de um anticorpo que se ligue especificamente a um complexo principal de histocompatibilidade (MHC) humano classe I ou II em complexo com um antígeno restrito por HLA, no qual o anticorpo é preferivelmente um anticorpo policlonal, um anticorpo monoclonal, um anticorpo biespecífico ou um anticorpo quimérico.

[00257] Os respectivos métodos usados para produzir tais

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102/196 anticorpos e complexos principais de histocompatibilidade classe I de cadeia única, assim como outras ferramentas usadas para produzir tais anticorpos, são revelados em WO 03/068201, WO 2004/084798, WO 01/72768, WO 03/070752 e em publicações (Cohen et al., 2003a; Cohen et al., 2003b; Denkberg et al., 2003) que, para as finalidades da presente invenção, ficam aqui integralmente incorporadas por referência.

[00258] Preferivelmente, o anticorpo se liga ao complexo com afinidade inferior a 20 nanomolares, e preferivelmente inferior a 10 nanomolares, o que é também considerado específico no contexto da presente invenção.

[00259] A presente invenção refere-se a um peptídeo que compreende uma sequência de aminoácidos selecionada do grupo formado por SEQ ID N- 1 a SEQ ID N^Q 279 ou a uma variante dos mesmos com pelo menos 88% de homologia (preferivelmente idêntico) com SEQ ID N- 1 a SEQ ID N^Q 279 ou uma variante da mesma que induz reação cruzada de células T com o referido peptídeo, sendo que o referido peptídeo não é o peptídeo completo subjacente.

[00260] A presente invenção refere-se ainda a um peptídeo que compreende uma sequência selecionada do grupo formado por SEQ ID N- 1 a SEQ ID N^Q 279 ou uma variante das mesmas que seja pelo menos 88% homóloga (preferivelmente idêntico) à SEQ ID N^Q 1 a SEQ ID N^Q 279, sendo que cada um dos peptídeos referidos ou variantes possui comprimento total de 8 a 100, preferivelmente de 8 a 30 e, mais preferivelmente que todos, de 8 a 14 aminoácidos.

[00261] A presente invenção refere-se também aos peptídeos de acordo com a invenção que possuem a capacidade de se ligarem a uma molécula do complexo principal de histocompatibilidade (MHC) humano classe I ou II.

[00262] A presente invenção refere-se também aos peptídeos de

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103/196 acordo com a presente invenção, nos quais o referido peptídeo consiste ou consiste essencialmente em uma sequência de aminoácidos de acordo com SEQ ID N^Q1 a SEQ ID N^Q 279.

[00263] A presente invenção refere-se também aos peptídeos de acordo com a invenção, sendo que o peptídeo é modificado quimicamente e/ou inclui ligações não peptídicas.

[00264] A presente invenção refere-se também aos peptídeos de acordo com a invenção, nos quais o peptídeo constitui parte de uma proteína de fusão, compreendendo em particular aminoácidos Nterminais da cadeia invariante associada ao antigeno do HLA-DR (li), ou nos quais o peptídeo é fundido a (ou incorporado à sequência de) um anticorpo, tal como, por exemplo, um anticorpo específico para células dendríticas.

[00265] A presente invenção refere-se também a um ácido nucleico que codifica os peptídeos de acordo com a invenção, conquanto tal peptídeo não seja uma proteína humana completa (total).

[00266] A presente invenção refere-se também ao ácido nucleico de acordo com a invenção que consista em DNA, cDNA, PNA, RNA ou combinações dos mesmos.

[00267] A presente invenção refere-se também a um vetor de expressão capaz de expressar um ácido nucleico de acordo com a presente invenção.

[00268] A presente invenção refere-se também a um peptídeo de acordo com a presente invenção, um ácido nucleico de acordo com a presente invenção ou um vetor de expressão de acordo com a presente invenção para uso em medicina, em especial para o tratamento da leucemia linfocítica crônica, leucemia mieloide crônica e leucemia mieloide aguda.

[00269] A presente invenção refere-se também a uma célula hospedeira que compreende um ácido nucleico de acordo com a

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104/196 invenção ou um vetor de expressão de acordo com a invenção.

[00270] A presente invenção refere-se também a células hospedeiras de acordo com a presente invenção, que sejam células apresentadoras de antígenos e, preferivelmente, células dendríticas.

[00271] A presente invenção refere-se também a um método de produção de um peptídeo de acordo com a presente invenção, sendo que o referido método compreende o cultivo da célula hospedeira de acordo com a presente invenção e o isolamento do peptídeo da referida célula hospedeira ou do meio de cultura da mesma.

[00272] A presente invenção refere-se também ao método de acordo com a presente invenção, sendo que o referido antigeno é carregado em moléculas de MHC classe I ou II expressas na superfície de uma célula apresentadora de antígenos apropriada colocando-se uma quantidade suficiente do antigeno em contato com uma célula apresentadora de antígenos.

[00273] A presente invenção refere-se também ao método de acordo com a presente invenção, sendo que a célula apresentadora de antígenos compreende um vetor de expressão capaz de expressar o referido peptídeo contendo SEQ ID N^Q1 a SEQ ID N^Q 279 ou a referida sequência variante de aminoácidos.

[00274] A presente invenção relaciona-se também com células T ativadas produzidas de acordo com o método da presente invenção, sendo que as referidas células T reconhecem seletivamente células com expressão aberrante de um polipeptideo que compreende uma sequência de aminoácidos de acordo com a presente invenção.

[00275] A presente invenção refere-se também a um método para destruir células-alvo em um paciente no qual as células-alvo expressam aberrantemente um polipeptideo que compreende qualquer sequência de aminoácidos de acordo com a presente invenção, sendo que o método compreende a administração ao paciente de um número

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105/196 eficaz de células T ativadas de acordo com a presente invenção. [00276] A presente invenção refere-se também à utilização de qualquer um dos peptídeos descritos, de um ácido nucleico de acordo com a presente invenção, de um vetor de expressão de acordo com a presente invenção, de uma célula de acordo com a presente invenção ou de um linfócito T citotóxico ativado de acordo com a presente invenção como medicamento ou para fabricação de um medicamento. A presente invenção refere-se também a uma utilização de acordo com a presente invenção, onde o medicamento possui atividade anticâncer.

[00277] A presente invenção refere-se também a uma utilização de acordo com a invenção, na qual o medicamento é uma vacina. A presente invenção refere-se também a uma utilização de acordo com a invenção, onde o medicamento possui atividade anticâncer.

[00278] A presente invenção se refere também a um uso de acordo com a invenção, no qual as referidas células cancerosas são de leucemia linfocítica crônica, leucemia mieloide crônica e leucemia mieloide aguda ou de outras neoplasias sólidas ou hematológicas, tais como outras neoplasias linfoides (por exemplo linfoma não Hodgkin, distúrbios linfoproliferativos pós-transplante (DLPT)) e outras neoplasias mieloides (por exemplo mielofibrose primária, trombocitopenia essencial, policitemia vera); e outras neoplasias como carcinoma hepatocelular, carcinoma colorretal, glioblastoma, câncer gástrico, câncer de esôfago, câncer de pulmão de células não pequenas, câncer de pulmão de pequenas células, câncer de pâncreas, carcinoma de células renais, câncer de próstata, melanoma, câncer de mama, câncer da vesícula biliar e colangiocarcinoma, câncer de bexiga, câncer do útero, carcinoma de células escamosas de cabeça e pescoço e mesotelioma.

[00279] A presente invenção refere-se também a proteínas

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106/196 marcadoras específicas e a biomarcadores baseados nos peptídeos de acordo com a presente invenção, doravante denominados alvos, que podem ser utilizados para diagnóstico e/ou determinação do prognóstico da leucemia linfocítica crônica leucemia mieoide crônica e leucemia mieloide aguda. A presente invenção refere-se também ao uso desses novos agentes para tratamento do câncer.

[00280] O termo anticorpo ou anticorpos é aqui utilizado em sentido amplo e inclui tanto anticorpos policlonais como monoclonais. Além de moléculas de imunoglobulina intactas ou completas, o termo anticorpos abrange também fragmentos (por exemplo fragmentos CDRs, Fv, Fab e Fc) ou polímeros dessas moléculas de imunoglobulina e versões humanizadas de moléculas de imunoglobulina, conquanto apresente qualquer uma das propriedades desejadas (por exemplo ligação específica a (poli)peptídeos marcadores de leucemia linfocítica crônica, leucemia mieloide crônica ou leucemia mieloide aguda, transporte de uma toxina a uma célula de linfocítica crônica, leucemia mieloide crônica ou leucemia mieloide aguda que expresse um gene marcador tumoral em níveis mais elevados e/ou inibição da atividade de um peptídeo marcador de linfocítica crônica, leucemia mieloide crônica ou leucemia mieloide aguda) de acordo com a invenção.

[00281] Sempre que possível, os anticorpos da invenção podem ser adquiridos de fontes comerciais. Os anticorpos da invenção também podem ser gerados usando-se métodos bem conhecidos. Os versados na técnica compreenderão que os polipeptídeos marcadores de leucemia linfocítica crônica, leucemia mieloide crônica ou leucemia mieloide aguda (completos ou em fragmentos) podem ser usados para gerar os anticorpos da invenção. Um polipeptídeo para uso na geração de um anticorpo da invenção pode ser total ou parcialmente purificado a partir de uma fonte natural ou pode ser produzido usando-se

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107/196 técnicas de DNA recombinante.

[00282] Por exemplo, um peptídeo que codifica cDNA de acordo com a presente invenção, tal como o peptídeo de acordo com os polipeptídeos SEQ ID N- 1 a SEQ ID N^Q 279 ou uma variante ou fragmento do mesmo pode ser expresso em células procariotas (por exemplo bactérias) ou eucariotas (por exemplo células de leveduras, insetos ou mamíferos). Em seguida, a proteína recombinante pode ser purificada e usada para gerar uma preparação de anticorpos monoclonais ou policlonais que se liga especificamente ao peptídeo marcador de leucemia linfocítica crônica, leucemia mieloide crônica ou leucemia mieloide aguda usado para gerar o anticorpo de acordo com a invenção.

[00283] Os versados na técnica perceberão que a geração de dois ou mais conjuntos diferentes de anticorpos monoclonais ou policlonais maximiza a possibilidade de obter um anticorpo com a especificidade e a afinidade necessárias para o uso pretendido (por exemplo ELISA, imunohistoquímica, imagem in vivo, imunoterapia com toxinas). Os anticorpos foram testados para avaliar se possuíam a atividade desejada usando-se métodos conhecidos de acordo com o propósito para o qual os anticorpos serão usados (por exemplo ELISA, imunohistoquímica, imunoterapia, etc.; para mais informações sobre a geração e teste de anticorpos, consulte, por exemplo, Greenfield (2014)). Por exemplo, os anticorpos podem ser testados em ensaios ELISA, western blot ou coloração imunohistoquímica de cânceres fixados em formalina ou cortes de tecido congelado. Após serem caracterizados inicial mente in vitro, os anticorpos destinados a uso terapêutico ou diagnóstico in vivo são testados de acordo com métodos de ensaio clínico bem conhecidos.

[00284] Conforme aqui utilizado, o termo anticorpo monoclonal refere-se a um anticorpo obtido de uma população substancialmente

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108/196 homogênea de anticorpos, isto é, os anticorpos individuais que compreendem a população são idênticos, exceto por mutações que podem ocorrer naturalmente e estar presentes em pequenas quantidades. Os anticorpos monoclonais aqui descritos incluem especificamente anticorpos quiméricos nos quais uma parte das cadeias leves e/ou pesadas é idêntica ou homóloga às sequências correspondentes de anticorpos derivados de uma espécie específica ou pertencentes a uma classe ou subclasse de anticorpos específicos, ao passo que o restante da(s) cadeia(s) é idêntico ou homólogo às sequências correspondentes de anticorpos derivados de outra espécie ou pertencentes a outra classe ou subclasse de anticorpos, assim como fragmentos de tais anticorpos, conquanto apresentem a atividade antagonista desejada (Pat. US 4.816.567, que fica aqui integralmente incorporada).

[00285] Os anticorpos monoclonais da invenção podem ser preparados usando métodos com hibridomas. Em um método com hibridoma, um camundongo ou outro animal hospedeiro apropriado é tipicamente imunizado com um agente imunizante para produzir linfócitos que produzam ou sejam capazes de produzir anticorpos que se ligam especificamente ao agente imunizante. Como alternativa, os linfócitos podem ser imunizados in vitro.

[00286] Os anticorpos monoclonais também podem ser produzidos por métodos de DNA recombinante, tais como os descritos em US 4.816.567. O DNA que codifica os anticorpos monoclonais da invenção pode ser prontamente isolado e sequenciado mediante procedimentos convencionais (por exemplo usando sondas de oligonucleotídeos capazes de se ligar especificamente aos genes que codificam as cadeias leves e pesadas de anticorpos murinos).

[00287] Os métodos in vitro também são apropriados para preparar anticorpos monovalentes. A digestão de anticorpos para produzir

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109/196 fragmentos dos mesmos, sobretudo fragmentos Fab, pode ser realizada usando-se técnicas rotineiras conhecidas na técnica. Por exemplo, a digestão pode ser realizada usando-se papaína. Alguns exemplos de digestão por papaína são descritos em WO 94/29348 e Pat. US 4.342.566. A digestão de anticorpos por papaína geralmente produz dois fragmentos idênticos ligantes de antígenos denominados fragmentos Fab, cada um dos quais com um único sítio de ligação de antígenos e um fragmento Fc residual. O tratamento com pepsina produz um fragmento F(ab')2 e um fragmento pFc'.

[00288] Sejam ou não conectados a outras sequências, os fragmentos de anticorpos podem incluir inserções, deleções, substituições ou outras modificações selecionadas de regiões específicas ou de resíduos de aminoácidos específicos, com a condição de que a atividade do fragmento não seja significativamente alterada ou prejudicada em comparação com o anticorpo ou fragmento de anticorpo não modificado. Essas modificações podem proporcionar novas propriedades, como a retirada ou inclusão de aminoácidos capazes de formar pontes dissulfeto para aumentar a biolongevidade, alterar as caraterísticas secretórias, etc. Em qualquer caso, o fragmento de anticorpos deve possuir uma propriedade bioativa, como atividade de ligação, regulação da ligação no domínio de ligação, etc. As regiões funcionais ou ativas do anticorpo podem ser identificadas por mutagênese de uma região específica da proteína, seguida de expressão e teste do polipeptideo expresso. Tais métodos, que serão prontamente evidentes para os versados na técnica, podem incluir mutagênese em sítios específicos do ácido nucleico codificador do fragmento de anticorpo.

[00289] Os anticorpos da invenção também podem compreender anticorpos humanizados ou anticorpos humanos. As formas humanizadas de anticorpos não humanos (por exemplo murinos) são

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110/196 imunoglobulinas quiméricas, cadeias de imunoglobulina ou fragmentos das mesmas (como Fv, Fab, Fab' ou outra subsequência ligante de antigeno de um anticorpo) que contêm a sequência mínima derivada de uma imunoglobulina não humana. Os anticorpos humanizados incluem imunoglobulinas humanas (anticorpo receptor) nas quais os resíduos de uma região determinante complementar (CDR, complementary determining region) do receptor são substituídos por resíduos do CDR de uma espécie não humana (anticorpo doador) como camundongo, rato ou coelho, que tenha especificidade, afinidade e capacidade desejadas. Em alguns casos, resíduos da estrutura Fv (FR) da imunoglobulina humana são substituídos por resíduos não humanos correspondentes. Os anticorpos humanizados também podem compreender resíduos que não são encontrados nem no anticorpo recipiente nem no CDR importado ou nas sequências da estrutura. Em geral, os anticorpos humanizados compreendem basicamente ao menos um, e tipicamente dois, domínios variáveis nos quais todas ou substancialmente todas as regiões do CDR correspondem às de uma imunoglobulina não humana e todas ou substancialmente todas as regiões FR são de uma sequência de consenso de imunoglobulina humana. Idealmente, o anticorpo humanizado compreende também ao menos parte de uma região constante de imunoglobulina (Fc), tipicamente uma região de imunoglobulina humana.

[00290] Os métodos de humanização de anticorpos não humanos são bem conhecidos na técnica. De forma geral, um anticorpo humanizado recebe um ou mais resíduos de aminoácidos obtidos de uma fonte não humana. Esses resíduos de aminoácidos não humanos são frequentemente denominados resíduos importados, pois são obtidos de um domínio variável importado. Essencialmente, a humanização pode ser realizada usando-se CDRs ou sequências de

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CDR de roedores para substituir sequências correspondentes de um anticorpo humano. Portanto, tais anticorpos humanizados são anticorpos quiméricos (Pat. US 4.816.567) nos quais uma porção substancialmente menor que um domínio variável humano intacto foi substituída pela sequência correspondente de uma espécie não humana. Na prática, os anticorpos humanizados são tipicamente anticorpos humanos nos quais alguns resíduos de CDR e talvez alguns resíduos de FR foram substituídos por resíduos de sítios análogos de anticorpos de roedores.

[00291] Podem ser usados animais transgênicos (por exemplo camundongos) capazes de, quando imunizados, produzir um repertório completo de anticorpos humanos na ausência de produção de imunoglobulina endógena. Por exemplo, foi descrito que a deleção homozigota do gene na região juncional da cadeia pesada dos anticorpos em camundongos quiméricos com mutação germinativa inibe completamente a produção endógena de anticorpos. Nesses camundongos com mutação germinativa, a transferência do conjunto de genes de imunoglobulina de linhagem germinativa humana leva à produção de anticorpos humanos após exposição antigênica. Também é possível produzir anticorpos humanos usando bibliotecas de exposição de fagos.

[00292] Preferivelmente, os anticorpos da invenção devem ser administrados a indivíduos em um veículo farmaceuticamente aceitável. Em geral, usa-se uma formulação contendo uma quantidade apropriada de um sal farmaceuticamente aceitável para tornar a formulação isotônica. Alguns exemplos de veículos farmaceuticamente aceitáveis são solução salina, solução de Ringer e solução de dextrose. O pH da solução é preferivelmente de cerca de 5 a cerca de 8, e mais preferivelmente de cerca de 7 a cerca de 7,5. Outros veículos possíveis são preparações de liberação prolongada como

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112/196 matrizes semipermeáveis de polímeros hidrofóbicos sólidos contendo o anticorpo, sendo que as matrizes possuem o formato de artigos moldados (por exemplo filmes, lipossomos ou micropartículas). Os versados na técnica perceberão que alguns veículos podem ser mais preferíveis, dependendo, por exemplo, da via de administração e da concentração do anticorpo a ser administrado.

[00293] Os anticorpos podem ser administrados ao indivíduo, paciente ou célula por injeção (por exemplo intravenosa, intraperitoneal, subcutânea ou intramuscular) ou por outros métodos, como a infusão, para garantir a introdução na circulação de forma eficaz. Os anticorpos também podem ser administrados pelas vias intra ou peritumoral para que produzam efeitos terapêuticos locais e sistêmicos. A injeção local ou intravenosa é preferida.

[00294] As doses efetivas e cronogramas de administração dos anticorpos podem ser determinados empiricamente, e a realização dessas determinações é contemplada pelas habilidades conhecidas na técnica. Os versados na técnica perceberão que a dose de anticorpos que precisa ser administrada variará dependendo, por exemplo, do indivíduo que receberá o anticorpo, da via de administração, do tipo específico de anticorpo utilizado e de outras drogas administradas. Uma dose diária típica do anticorpo usado isoladamente pode variar de cerca de 1 pg/kg até 100 mg/kg de peso corporal por dia, dependendo dos fatores mencionados anteriormente. Após administração de um anticorpo, preferivelmente para tratamento de leucemia linfocítica crônica, leucemia mieloide crônica ou leucemia mieloide aguda, pode-se avaliar a eficácia do anticorpo terapêutico de várias maneiras bem conhecidas pelos versados na técnica. Por exemplo, o tamanho, o número e/ou a distribuição do câncer em um indivíduo em tratamento podem ser monitorados por técnicas padrão de imagem tumoral. Um anticorpo administrado com finalidade

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113/196 terapêutica que detenha o crescimento tumoral, faça o tumor encolher e/ou impeça que surjam novos tumores (em relação a como a doença evoluiría se não se administrasse o anticorpo) constitui um anticorpo eficaz para tratamento de câncer.

[00295] Outro aspecto da invenção é o fornecimento de um método de produção de um receptor de células T solúvel (sTCR) que reconheça um complexo peptídeo-MHC específico. Esses receptores de células T solúveis podem ser gerados a partir de clones específicos de células T, e sua afinidade pode ser aumentada por mutagênese nas regiões determinantes de complementaridade. Para selecionar receptores de células T, pode-se usar a exibição em fagos (US 2010/0113300 e Liddy et ai. (2012)). Para estabilizar os receptores de células T durante a exibição em fagos e em aplicações práticas envolvendo sua utilização como droga, podem-se ligar as cadeias alfa e beta uma à outra por, por exemplo, ligações dissulfeto não nativas, outras ligações covalentes (receptor de células T de cadeia única) ou domínios de dimerização (Boulter et ai., 2003; Card et ai., 2004; Willcox et ai., 1999). O receptor de célula T pode ser ligado a toxinas, drogas, citoquinas (ver, por exemplo, US 2013/0115191), domínios de recrutamento de células efetoras (por exemplo domínio anti-CD3), etc., para executar funções específicas em células-alvo. O receptor também pode ser expresso em células T usadas para transferência adotiva. Para mais informações, consulte WO 2004/033685A1 e WO 2004/074322A1. Uma combinação de sTCRs é descrita em WO 2012/056407A1. Outros métodos de produção dos mesmos são revelados em WO 2013/057586A1.

[00296] Os peptídeos e/ou TCRs ou anticorpos ou outras moléculas ligantes da presente invenção podem ser usadas também para verificar o diagnóstico de câncer de um patologista a partir de uma amostra de biópsia.

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[00297] Os anticorpos ou TCRs também podem ser usados para ensaios diagnósticos in vivo. Geralmente, o anticorpo é marcado por um radionuclídeo (como ¹¹¹1n, Tc, ¹⁴C, ¹³¹1, ³H, ³²P ou ³⁵S) para que se possa localizar o tumor por imunocintigrafia. Em uma modalidade, anticorpos ou fragmentos dos mesmos se ligam aos domínios extracelulares de dois ou mais alvos de uma proteína selecionada do grupo formado pelas proteínas supramencionadas, e o coeficiente de afinidade (Kd) é menor que 1x10 μΜ.

[00298] Os anticorpos para uso diagnóstico podem ser marcados com sondas apropriadas para detecção por vários métodos de imagem. São métodos para detecção de sondas, entre outros, fluorescência, microscopia óptica, confocal ou eletrônica; imagem e espectroscopia de ressonância magnética; fluoroscopia; tomografia computadorizada; e tomografia por emissão de positrons. São sondas apropriadas, entre outras, fluoresceína, rodamina, eosina e outros fluoróforos, radioisótopos, ouro, gadolínio e outros lantanídeos, ferro paramagnético, flúor-18 e outros radionuclídeos emissores de positrons. As sondas também podem ser bi ou multifuncionais e os métodos de detecção podem incluir mais de um dos métodos listados anteriormente. Esses anticorpos podem ser marcados direta ou indiretamente pelas referidas sondas. A conexão das sondas aos anticorpos requer ligação covalente da sonda, incorporação da sonda ao anticorpo e ligação covalente de um composto quelante para ligação da sonda, entre outros procedimentos bem conhecidos na técnica. Para imunohistoquímica, a amostra de tecido patológico pode ser fresca, congelada ou emblocada em parafina e fixada com um conservante como a formalina. O corte fixado ou emblocado contendo a amostra é colocado em contato com um anticorpo primário marcado e com um anticorpo secundário, sendo que o anticorpo é usado para detectar a expressão de proteínas in situ.

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[00299] Outro aspecto da presente invenção inclui um método in vitro de produção de células T ativadas, sendo que o método compreende colocar células T em contato in vitro com moléculas de MHC humano expressas na superfície de uma célula apresentadora de antígenos por um período suficientemente longo para ativar a célula T de forma específica para o antigeno, sendo que o antigeno é um peptídeo de acordo com a invenção. Preferivelmente, usa-se uma quantidade de antigeno apropriada junto com uma célula apresentadora de antigeno.

[00300] Preferivelmente, as células de mamíferos não possuem ou apresentam níveis reduzidos de função do transportador de peptídeos TAP. Algumas células apropriadas, que não possuem o transportador de peptídeos TAP, são as células T2, RMA-S e células de drosófila. O TAP é o transportador associado ao processamento de antígenos.

[00301] A linhagem celular T2, que é deficiente em carregamento de peptídeos humanos, está disponível na American Type Culture Collection (12301 Parklawn Drive, Rockville, Maryland 20852, EUA) sob o n² de catálogo CRL 1992; a linhagem celular de drosófila Schneider 2 está disponível na ATCC sob o n^Q de catálogo CRL 19863; e a linhagem celular de camundongo RMA-S foi descrita por Ljunggren et al (Ljunggren e Karre, 1985).

[00302] Preferivelmente, antes da transfecção a célula hospedeira praticamente não expressa moléculas de MHC classe I. Também é preferível que a célula estimulatória expresse uma molécula importante para o fornecimento de um sinal coestimulatório para células T, tais como qualquer um entre B7.1, B7.2, ICAM-1 e LFA 3. As sequências de ácidos nucleicos de várias moléculas de MHC classe I e de moléculas coestimulatórias estão disponíveis publicamente nos bancos de dados GenBank e EMBL.

[00303] No caso de epítopos de MHC classe I usados como

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116/196 antigeno, as células T são células T CD8-positivas.

[00304] Se uma célula apresentadora de antigeno for transfectada para expressar um desses epítopos, a célula deve compreender, preferivelmente, um vetor de expressão capaz de expressar um peptídeo contendo SEQ ID N^Q 1 a SEQ ID N^Q 279 ou uma sequência de aminoácidos variante dos mesmos.

[00305] Diversos outros métodos podem ser usados para gerar células T in vitro. Por exemplo, linfócitos autólogos infiltrantes de tumores podem ser usados para geração de LTC. Plebanski et al. (1995) utilizaram linfócitos autólogos de sangue periférico (PLBs) para preparar células T. Pode-se produzir células T citotóxicas autólogas pulsando células dendríticas com peptídeos ou polipeptídeos ou mediante infecção por um vírus recombinante. As células B também podem ser usadas para produzir células T autólogas. Macrófagos pulsados com peptídeos ou polipeptídeos ou infectados com vírus recombinantes também podem ser usados para preparar células T autólogas. S. Walter et al. (2003) descreveram a preparação (priming) in vitro de células T por meio de células apresentadoras de antígenos (aCAAs) artificiais, que também são uma maneira apropriada de gerar células T contra o peptídeo escolhido. Na presente invenção, as aCAAs foram geradas acoplando-se complexos MHC-peptídeo pré-formados à superfície de partículas de poliestireno (microesférulas) por bioquímica de biotina-estreptavidina. Esse sistema permite controlar exatamente a densidade de MHC sobre as aCAAs, permitindo induzir, de forma seletiva e altamente eficiente, respostas de células T específicas para antígenos de avidez baixa ou elevada em amostras de sangue. Além dos complexos de MHC com peptídeo, as aCAAs devem transportar outras proteínas com atividade coestimulatória como anticorpos anti-CD28 acoplados à sua superfície. Além disso, tais sistemas à base de aCAA frequentemente requerem

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117/196 adição de fatores solúveis apropriados, como, por exemplo, citoquinas como a interleucina 12.

[00306] Células alogênicas também podem ser usadas para preparar células T, e um método é descrito detalhadamente em WO 97/26328, que fica aqui incorporada por referência. Por exemplo, além de células de drosófila e células T2, podem-se usar outras células para apresentar antígenos, tais como células CHO, células de inseto infectadas por baculovírus, bactérias, leveduras e células-alvo infectadas por vacínia. Também podem ser usados vírus de plantas (ver, por exemplo, Porta et al. (1994), que descreve o desenvolvimento do vírus do mosaico de caupi como um sistema de alto rendimento para apresentação de peptídeos exógenos).

[00307] As células T ativadas direcionadas contra os peptídeos da invenção possuem utilidade terapêutica. Portanto, outro aspecto da invenção fornece células T ativadas que podem ser obtidas pelos métodos da invenção apresentados anteriormente.

[00308] As células T ativadas produzidas pelo método descrito anteriormente reconhecem seletivamente células com expressão aberrante de um polipeptídeo que compreende qualquer sequência de aminoácidos do grupo SEQ ID N^Q1 a SEQ ID N^Q 279.

[00309] Preferivelmente, a célula T reconhecerá a célula ao interagir através de seu TCR com o complexo HLA-peptídeo (por exemplo, ligação). As células T são úteis em um método de destruição células-alvo em um paciente cujas células-alvo apresentem expressão aberrante de um polipeptídeo que compreenda uma sequência de aminoácidos da invenção, sendo que o paciente recebe um número eficaz de células T ativadas. As células T administradas ao paciente podem ser derivadas do próprio paciente e ativadas conforme descrito anteriormente (isto é, são células T autólogas). Alternativamente, as células T não são do paciente, mas de outro indivíduo. Evidentemente,

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118/196 prefere-se que o indivíduo seja um indivíduo saudável. Por indivíduo saudável, os inventores designam um indivíduo com boa saúde geral, preferivelmente com um sistema imune competente e, mais preferivelmente, que não apresente nenhuma doença que possa ser facilmente detectada por exames.

[00310] In vivo, as células-alvo das células T CD8-positivas de acordo com a presente invenção podem ser células tumorais (que às vezes expressam MHC classe II) e/ou células estromais que circundam o tumor (células tumorais) (que às vezes também expressam MHC classe II (Dengjel et al., 2006)).

[00311] As células T da presente invenção podem ser utilizadas como ingredientes ativos de uma composição terapêutica. Portanto, a invenção fornece também um método de destruição de células-alvo em um paciente cujas células-alvo apresentam expressão aberrante de um polipeptideo que compreende uma sequência de aminoácidos da invenção, sendo que o método compreende administrar ao paciente um número eficaz de células T, conforme definido anteriormente.

[00312] Com o termo expressão aberrante, os inventores também querem dizer que o polipeptideo é sobrexpresso em comparação com os níveis de expressão em tecidos normais ou que o gene é expresso no tumor apesar de permanecer silencioso no tecido do qual o tumor é derivado. Com o termo sobrexpresso, os autores querem dizer que o peptídeo está presente em níveis pelo menos 1,2 vez o nível encontrado no tecido normal, preferivelmente pelo menos 2 vezes e, mais preferivelmente pelo menos 5 ou 10 vezes o nível encontrado no tecido normal.

[00313] As células T podem ser obtidas por métodos conhecidos na técnica, por exemplo os métodos descritos anteriormente.

[00314] Os protocolos para a chamada transferência adotiva de células T são bem conhecidos na técnica. Gattioni et al. e Morgan et

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119/196 al. elaboraram revisões sobre o tema (Gattinoni et al., 2006; Morgan et al., 2006)

[00315] Outro aspecto da presente invenção inclui o uso de peptídeos em complexo com MHC para gerar um receptor de células T cujo ácido nucleico seja clonado e introduzido na célula hospedeira, preferivelmente uma célula T. Essa célula T modificada pode então ser introduzida em um paciente para tratamento do câncer.

[00316] Qualquer molécula da invenção, isto é, o peptídeo, ácido nucleico, anticorpo, vetor de expressão, célula, célula T ativada, receptor de célula T ou ácido nucleico que o codifique, é útil no tratamento de distúrbios caracterizados por células que escapam de uma resposta imune. Portanto, qualquer molécula da presente invenção pode ser usada como medicamento ou na fabricação de um medicamento. A molécula pode ser usada isoladamente ou combinada com outras moléculas da invenção ou com moléculas conhecidas.

[00317] A presente invenção refere-se também a um kit que compreende: (a) um recipiente que contém uma composição farmacêutica conforme descrito anteriormente, em solução ou em forma liofilizada; (b) opcionalmente, um segundo recipiente contendo um diluente ou solução de reconstituição para a formulação liofilizada; e (c) opcionalmente, instruções de (i) uso da solução ou (ii) reconstituição e/ou uso da formulação liofilizada.

[00318] O kit pode compreender também um ou mais dentre (iii) um tampão, (iv) um diluente, (v) um filtro, (vi) uma agulha ou (v) uma seringa. O recipiente é preferivelmente um frasco, uma ampola, uma seringa ou um tubo de ensaio e pode ser um recipiente multiuso. A composição farmacêutica é preferivelmente liofilizada.

[00319] Kits da presente invenção, compreendendo preferivelmente uma formulação liofilizada da presente invenção em um recipiente apropriado e instruções para sua reconstituição e uso. São recipientes

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120/196 adequados, por exemplo, frascos, ampolas (por exemplo ampolas de câmara dupla), seringas (como seringas de câmara dupla) e tubos de ensaio. O recipiente pode ser constituído de diversos materiais como vidro ou plástico. Preferivelmente, o kit e/ou o recipiente contêm instruções no ou associadas ao recipiente que apresentam instruções para reconstituição e/ou utilização. Por exemplo, o rótulo pode indicar que a formulação liofilizada pode ser reconstituída até atingir as concentrações peptídicas descritas anteriormente. O rótulo também pode indicar que a formulação é útil ou destina-se a administração subcutânea.

[00320] O recipiente contendo a formulação pode ser um frasco multiuso, que permite administrações repetidas (por exemplo de 2 a 6 administrações) da formulação reconstituída. O kit pode compreender também um segundo recipiente que contém um diluente apropriado (por exemplo solução de bicarbonate de sódio).

[00321] Ao misturar o diluente e a formulação liofilizada, a concentração final do peptideo na formulação reconstituída é preferivelmente pelo menos 0,15 g/mL/peptídeo (75 pg) e preferivelmente não mais que 3 mg/mL/peptídeo (1500 pg). O kit pode incluir também outros materiais desejáveis do ponto de vista comercial e do usuário, como outros tampões, diluentes, filtros, agulhas, seringas e bulas com instruções de uso.

[00322] Os kits da presente invenção podem conter um único recipiente que contém a formulação das composições farmacêuticas de acordo com a presente invenção, com ou sem outros componentes (por exemplo outros compostos ou composições farmacêuticas desses outros compostos) ou pode possuir recipientes distintos para cada componente.

[00323] Preferivelmente, os kits da presente invenção contêm uma formulação farmacêutica embalada para uso em associação com a

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121/196 coadministração de um segundo composto (como os adjuvantes (por exemplo GM-CSF), um agente quimioterápico, um produto natural, um hormônio ou antagonista, um agente antiangiogênese ou inibidor, um agente indutor de apoptose ou um quelante) ou uma composição farmacêutica dos mesmos. Os componentes do kit podem ser précomplexados ou cada componente pode ser fornecido em um recipiente diferente e separado antes da administração a um paciente. Os componentes do kit podem ser fornecidos em uma ou mais soluções líquidas, preferivelmente soluções aquosas e, mais preferivelmente, soluções aquosas estéreis. Os componentes do kit também podem ser fornecidos no estado sólido e serem convertidos em líquido adicionando-se solventes apropriados, que são preferivelmente fornecidos em outro recipiente separado.

[00324] O recipiente de um kit terapêutico pode ser uma ampola, tubo de ensaio, frasco, garrafa, seringa ou qualquer outro meio de envasar um sólido ou líquido. Usualmente, quando existe mais de um componente, o kit conterá um segundo frasco ou outro recipiente, que permitirá administração separada. O kit também pode conter outro recipiente para um líquido farmaceuticamente aceitável. Preferivelmente, um kit terapêutico contém um aparato (por exemplo uma ou mais agulhas, seringas, conta-gotas, pipetas, etc.), que permite administrar os agentes da invenção que são componentes do presente kit.

[00325] A presente formulação é de um tipo apropriado para administração de peptídeos por qualquer via aceitável, como a oral (entérica), nasal, oftálmica, subcutânea, intradérmica, intramuscular, intravenosa ou transdérmica. A administração deve ser preferivelmente s.c. e, o mais preferido, i.d., podendo também ser realizada por uma bomba de infusão.

[00326] Como os peptídeos da invenção foram isolados de

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122/196 leucemia linfocítica crônica, leucemia mieloide crônica e leucemia mieloide aguda, o medicamento da invenção deve ser preferivelmente usado no tratamento de leucemia linfocítica crônica, leucemia mieloide crônica e leucemia mieloide aguda.

[00327] A presente invenção refere-se também a método de produção de um medicamento personalizado para um paciente individual, que compreende a fabricação de uma composição farmacêutica que compreende pelo menos um peptídeo selecionado de um depósito de TUMAPs pré-selecionados, no qual pelo menos um peptídeo usado na composição farmacêutica é selecionado conforme seja mais apropriado para o paciente individual. Em uma modalidade, a composição farmacêutica é uma vacina. O método também pode ser adaptado para produzir clones de células T para aplicações subsequentes, tais como isolamento de TCR, ou anticorpos solúveis e outras opções terapêuticas.

[00328] Medicamento personalizado significa tratamentos adaptados especificamente a um paciente e que serão usados apenas para tratamento desse paciente, incluindo vacinas anticâncer personalizadas ativamente e terapias adotivas com células usando tecido autólogo do paciente.

[00329] Conforme aqui utilizado, o termo depósito refere-se a um grupo ou conjunto de peptídeos pré-selecionados por sua imunogenicidade e apresentação aumentada em um determinado tipo de tumor. O termo depósito não pretende sugerir que os peptídeos específicos incluídos na vacina foram pré-fabricados e armazenados em uma instalação física, embora se contemple essa possibilidade. Contempla-se expressamente que os peptídeos podem ser fabricados de novo para cada vacina individualizada fabricada ou podem ser préfabricados e armazenados. O depósito (por exemplo na forma de um banco de dados) é formado por peptídeos associados a tumores com

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123/196 níveis elevados de sobrexpressão no tecido tumoral de pacientes com leucemia linfocítica crônica, leucemia mieloide crônica e leucemia mieloide aguda e diversos alelos de HLA-A, HLA-B e HLA-C. O depósito pode conter peptídeos de MHC classe I ou MHC classe II ou peptídeos alongados de MHC classe I. Além dos peptídeos associados a tumores obtidos de diversos tecidos de leucemia linfocítica crônica, leucemia mieloide crônica e leucemia mieloide aguda, o depósito pode conter peptídeos marcadores de HLA-A*02, HLA-A*01, HLA-A*03, HLA-A*24, HLA-B*07, HLA-B*08 e HLA-B*44. Esses peptídeos permitem comparar quantitativamente a magnitude da imunidade mediada por células T induzida por TUMAPs, permitindo assim tirar importantes conclusões sobre a capacidade da vacina de produzir respostas antitumorais. Segundo, os peptídeos funcionam como importantes controles positivos derivados de um antígeno não próprio (não self) nos casos em que não se observam respostas de células T induzidas pela vacina a TUMAPs derivados de antígenos próprios (self) em um paciente. Terceiro, eles podem permitir tirar conclusões sobre o nível de imunocompetência do paciente.

[00330] Os TUMAPs usados para constituir o depósito foram identificados por meio de uma abordagem de genômica funcional integrada que combina análise de expressão gênica, espectrometria de massa e imunologia de células T (/PRESIDENT®). Essa abordagem garante que apenas TUMAPs que estejam realmente presentes em uma porcentagem elevada de tumores e sejam minimamente ou nada expressos em tecidos normais sejam selecionados para análises posteriores. Para seleção inicial de peptídeos, amostras de leucemia linfocítica crônica, leucemia mieloide crônica e leucemia mieloide aguda saudáveis foram analisadas em etapas:

[00331] 1. Ligantes de HLA do material maligno foram identificados

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124/196 por espectrometria de massa.

[00332] 2. A análise da expressão de ácido ribonucleico mensageiro (mRNA) em todo o genoma foi usada para identificar genes sobrexpressos em tecidos malignos (leucemia linfocítica crônica, leucemia mieloide crônica e leucemia mieloide aguda) em comparação com uma série de órgãos e tecidos normais.

[00333] 3. Os ligantes de HLA identificados foram comparados com os dados de expressão gênica. Os peptídeos apresentados de forma exacerbada ou seletivamente em tecidos tumorais, preferivelmente codificados por genes expressos seletivamente ou expressos de forma excessiva conforme detectados na etapa 2, foram considerados candidatos a TUMAPs apropriados para uma vacina multipeptídica.

[00334] 4. Uma busca na literatura foi realizada para identificar mais evidências indicativas da relevância dos peptídeos identificados como TUMAPs.

[00335] 5. A relevância da sobrexpressão ao nível de mRNA foi confirmada pela detecção dos TUMAPs selecionados na etapa 3 em tecido tumoral e pela detecção baixa ou ausente em tecidos saudáveis.

[00336] 6. Para avaliar a viabilidade da indução de respostas de células T in vivo pelos peptídeos selecionados, foram realizados ensaios de imunogenicidade in vitro usando células T humanas de doadores saudáveis e de pacientes com leucemia linfocítica crônica, leucemia mieloide crônica ou leucemia mieloide aguda.

[00337] Em um aspecto, os peptídeos são pré-selecionados por sua imunogenicidade antes de serem incluídos no depósito. A título exemplificativo e não limitante, a imunogenicidade dos peptídeos incluídos no depósito é determinada por um método que compreende a preparação (priming) in vitro de células T mediante estimulações repetidas de células T CD8+ de doadores saudáveis com células

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125/196 apresentadoras de antígenos artificiais carregadas com complexos de peptídeo com MHC e anticorpo anti-CD28.

[00338] Esse método é preferido para cânceres raros e pacientes com perfis de expressão raros. Ao contrário dos coquetéis multipeptídicos com composição fixa desenvolvidos atualmente, o depósito permite obter correspondências significativamente melhores entre a vacina e a expressão efetiva de antígenos do tumor. Peptídeos selecionados disponíveis comercialmente ou combinações dos mesmos serão usados para cada paciente em uma abordagem multialvo. Teoricamente, uma abordagem baseada na seleção de, por exemplo, 5 peptídeos antigênicos diferentes de uma biblioteca de 50 proporcionaria cerca de 17 milhões de possíveis composições de produtos medicamentosos (PM).

[00339] Em um aspecto, os peptídeos são selecionados para inclusão na vacina com base em sua adequação ao paciente individual baseado no método de acordo com a presente invenção conforme aqui descrito ou conforme apresentado a seguir.

[00340] Os dados de fenótipo de HLA, transcriptoma e peptidoma são coligidos do material obtido do tumor do paciente e de amostras de sangue para identificar os peptídeos mais apropriados para cada paciente contendo TUMAPs do depósito específicos para o paciente (isto é, mutantes). Serão selecionados peptídeos expressos de forma excessiva ou seletiva nos tumores dos pacientes e que, sempre que possível, mostrem forte imunogenicidade in vitro quando testados com células mononucleares do sangue periférico (CMSPs) do paciente.

[00341] Preferivelmente, os peptídeos incluídos na vacina são identificados por um método que compreende: (a) identificação de peptídeos associados ao tumor (TUMAPs) apresentados por uma amostra tumoral de um paciente individual; (b) comparação dos peptídeos identificados em (a) com um depósito (banco de dados) de

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126/196 peptídeos conforme descrito anteriormente; e (c) seleção de pelo menos um peptídeo do depósito (banco de dados) que se correlacione com um peptídeo associado ao tumor identificado no paciente. Por exemplo, os TUMAPs apresentados em amostras tumorais são identificados da seguinte maneira: (a1) comparação dos dados de expressão da amostra tumoral com os dados de expressão de uma amostra de tecido normal correspondente ao tipo de tecido da amostra tumoral para identificar proteínas que são sobrexpressas ou apresentam expressão aberrante na amostra tumoral; e (a2) correlação dos dados de expressão com sequências de ligantes de MHC ligados a moléculas de MHC classe I e/ou classe II na amostra tumoral para identificar ligantes de MHC derivados de proteínas sobrexpressas ou expressas de forma aberrante pelo tumor. Preferivelmente, as sequências dos ligantes de MHC são identificadas eluindo-se os peptídeos ligados das moléculas de MHC isoladas da amostra tumoral e sequenciando-se os ligantes eluídos. Preferivelmente, a amostra de tumor e a amostra de tecido normal devem ser obtidas do mesmo paciente.

[00342] Além de, ou como alternativa a, selecionar peptídeos usando um modelo de depósito (banco de dados), os TUMAPs podem ser identificados em pacientes de novo e incluídos na vacina. Como exemplo, os TUMAPs candidatos podem ser identificados no paciente da seguinte maneira: (a1) comparação dos dados de expressão da amostra tumoral com os dados de expressão de uma amostra de tecido normal correspondente ao tipo de tecido da amostra tumoral para identificar proteínas que são sobrexpressas ou apresentam expressão aberrante na amostra tumoral; e (a2) correlação dos dados de expressão com sequências de ligantes de MHC ligados a moléculas de MHC classe I e/ou classe II na amostra tumoral para identificar ligantes de MHC derivados de proteínas sobrexpressas ou

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127/196 expressas de forma aberrante pelo tumor. Como outro exemplo, podem-se identificar proteínas que contêm mutações específicas para a amostra tumoral em relação ao tecido normal correspondente de um paciente individual, e podem-se identificar TUMAPs que atuam especificamente sobre a mutação. Por exemplo, os genomas do tumor e do tecido normal correspondente podem ser sequenciados por sequenciamento de genoma inteiro. Para descobrir mutações não sinônimas nas regiões codificadoras de proteínas dos genes, o DNA e o RNA genômicos são extraídos de tecidos tumorais e o DNA germinativo não mutante do genoma normal é extraído de células mononucleares do sangue periférico (CMSPs). A abordagem NGS aplicada restringe-se ao ressequenciamento de regiões codificadoras de proteínas (ressequenciamento do exoma). Para essa finalidade, o DNA exônico de amostras humanas é capturado usando kits de enriquecimento fornecidos comercialmente seguido por sequenciamento usando, por exemplo, um instrumento HiSeq2000 (Illumina). O mRNA tumoral também é sequenciado para quantificação direta da expressão gênica e validação do fato de que os tumores dos pacientes expressam os genes mutantes. As milhões de leituras de sequências assim produzidas são processadas por algoritmos em software. A lista produzida contém mutações e expressão gênica. As mutações somáticas específicas para tumores são determinadas comparando-se as variações germinativas derivadas de CMSP, e essas derivações recebem prioridade. Os peptídeos identificados de novo podem então ter sua imunogenicidade testada conforme descrito anteriormente em relação ao depósito, e os TUMAPs candidatos que possuírem imunogenicidade apropriada são selecionados para inclusão na vacina.

[00343] Em uma modalidade exemplar, os peptídeos incluídos na vacina são identificados pelo seguinte procedimento: (a) identificação

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128/196 de peptídeos associados a tumor (TUMAPs) apresentados por uma amostra tumoral de um paciente individual usando o método descrito anteriormente; (b) comparação dos peptídeos identificados na etapa a) com um depósito de peptídeos pré-selecionados de acordo com a imunogenicidade e apresentação aumentada em tumores em comparação com os tecidos normais correspondentes; (c) seleção de pelo menos um peptídeo do depósito que se correlaciona com um peptídeo associado a tumores identificado no paciente; e (d) opcionalmente, seleção de pelo menos um peptídeo identificado de novo em (a) para confirmar sua imunogenicidade.

[00344] Em uma modalidade exemplar, os peptídeos incluídos na vacina são identificados pelo seguinte procedimento: (a) identificação de peptídeos associados a tumor (TUMAPs) apresentados por uma amostra tumoral de um paciente individual; e (b) seleção de pelo menos um peptídeo identificado de novo em (a) para confirmar sua imunogenicidade.

[00345] Uma vez selecionados os peptídeos para uma vacina peptídica personalizada, a vacina é produzida. Preferivelmente, a vacina é uma formulação líquida que consiste em peptídeos individuais dissolvidos em 20% a 40% de DMSO, preferivelmente de 30% a 35% de DMSO, como cerca de 33% de DMSO.

[00346] Todos os peptídeos a serem incluídos em um produto são dissolvidos em DMSO. A concentração das soluções de peptídeo único deve ser escolhida em função do número de peptídeos a serem incluídos no produto. Soluções de um peptídeo em DMSO são misturadas em partes iguais para criar uma solução contendo todos os peptídeos a serem incluídos no produto a uma concentração de cerca de 2,5 mg/ml por peptídeo. A solução misturada é então diluída 1:3 em água para injeção de modo a atingir uma concentração de 0,826 mg/ml por peptídeo em DMSO a 33%. A solução diluída é filtrada por

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129/196 um filtro estéril de 0,22 μιτι. A solução bruta final é obtida.

[00347] A solução bruta final é acondicionada em ampolas e armazenada a -200 até o momento do uso. Cada ampol a contém 700 μΙ_ de uma solução que contém 0,578 mg de cada peptídeo. Destes, 500 μΙ_ (cerca de 400 pg por peptídeo) serão administrados por injeção intradérmica.

[00348] Além de ser usados no tratamento do câncer, os peptídeos da presente invenção também têm aplicações diagnosticas. Como os peptídeos foram gerados a partir de células de leucemia linfocítica crônica, leucemia mieloide crônica e leucemia mieloide aguda e como se determinou que esses peptídeos estão pouco ou nada presentes em tecidos normais, esses peptídeos podem ser utilizados para diagnosticar a presença de um câncer.

[00349] A presença dos peptídeos reivindicados em biópsias de tecidos ou em amostras de sangue pode ajudar um patologista a diagnosticar câncer. A detecção de determinados peptídeos por meio de anticorpos, espectrometria de massa ou outros métodos conhecidos na técnica pode dizer ao patologista que a amostra de tecido é maligno, está inflamado ou apresenta patologia em geral ou pode ser usada como biomarcador de leucemia linfocítica crônica, leucemia mieloide crônica ou leucemia mieloide aguda. A presença de grupos de peptídeos pode permitir a classificação ou subclassificação de tecidos patológicos.

[00350] A detecção de peptídeos em amostras de tecido doente pode permitir a decisão sobre o benefício de tratamentos que envolvem o sistema imune, sobretudo se os linfócitos T participarem ou se esperar que participem do mecanismo de ação. A perda da expressão de MHC é um mecanismo bem descrito pelo qual células malignas infectadas escapam da imunovigilância. Portanto, a presença de peptídeo mostra que esse mecanismo não é explorado pelas

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130/196 células analisadas.

[00351] Os peptídeos da presente invenção podem ser usados para analisar respostas linfocitárias contra esses peptídeos, tais como respostas de células T ou de anticorpos contra o peptideo ou contra o peptideo em complexo com moléculas de MHC. Essas respostas podem ser usadas como marcadores prognósticos para tomar decisões sobre as próximas etapas do tratamento. Essas respostas também podem ser usadas como indicadores de resposta em abordagens imunoterápicas que visam a induzir respostas linfocitárias por outros meios (por exemplo vacinação com proteínas, ácidos nucleicos, materiais autólogos e transferência adotiva de linfócitos). No âmbito de terapias gênicas, as respostas linfocitárias contra peptídeos podem ser consideradas na avaliação dos efeitos colaterais. O monitoramento das respostas linfocitárias também pode ser um valioso recurso para exames de acompanhamento de tratamentos envolvendo transplantes; por exemplo para detectar doença enxerto-versushospedeiro ou hospedeiro-versus-enxerto.

[00352] A presente invenção será agora descrita nos seguintes exemplos, que descrevem configurações preferidas da mesma, com referência às figuras apresentadas a seguir, mas sem limitar-se aos exemplos. Para os fins da presente invenção, todas as referências aqui citadas ficam integralmente incorporadas por referência.

FIGURAS

[00353] As Figuras 1A a 1W mostram perfis de expressão exemplares de genes fonte da presente invenção que são sobrexpressos em várias amostras de câncer. Os tumores (pontos pretos) e amostras normais (pontos cinzas) são agrupados de acordo com o órgão de origem. Os gráficos de caixa de bigodes representam a mediana, 25^Q e 75^Q percentis (caixa), mínima e máxima (bigodes) de RPKM. Os órgãos normais aparecem ordenados por categoria de

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131/196 risco. RPKM = leituras por quilobase por milhão de leituras mapeadas. Amostras normais: células sanguíneas, vasos sanguíneos, cérebro, coração, fígado, pulmão, tecido adiposo, gl. suprarr (glândula suprarrenal), dueto biliar; bexiga, MO (medula óssea), cartilagem, esôf. (esôfago), olho, vesb (vesícula biliar), cabeça-e-pescoço, rim; int.grosso (intestino grosso), LN (linfonodo), nervo, pâncreas, paratir (glândula paratireoide), perit (peritônio) hipóf (hipófise), mus.esquel (músculo esquelético); pele, int.delgado (intestino delgado), baço, estômago, tireoide, traqueia, ureter, mama, ovário, placenta, próstata, testículo; timo e útero. Amostras tumorais: LMA: leucemia mieloide aguda; LLC: leucemia linfocítica crônica; LNH: linfoma não Hodgkin. Figura 1A) Símbolo do gene: S100Z; peptídeo TMIRIFHRY (SEQ ID N^Q

2). Figura 1B) Símbolo do gene: PAX5, peptídeo YSHPQYSSY (SEQ ID N^Q 9), 1C) Símbolo do gene: FLT3; peptídeo SLFEGIYTI (SEQ ID N^Q 19), 1D) Símbolo do gene: RALGPS2; peptídeo ILHAQTLKI (SEQ ID N^Q 22), 1E) Símbolo do gene: FCRL2; peptídeo KTSNIVKIK (SEQ ID N^Q 32), 1F) Símbolo do gene: KBTBD8; peptídeo RSKEYIRKK (SEQ ID N^Q 40). 1G) Símbolo do gene: ZNF92; peptídeo KAFNQSSTLTK (SEQ ID N^Q 52), 1H) Símbolo do gene: ADAM28; peptídeo KYIEYYLVL (SEQ ID N^Q 53), 11) Símbolo do gene: FLT3; peptídeo IFKEHNFSF (SEQ ID N 61), 1J) Símbolo do gene: ZNF92; peptídeo KAFSWSSAF (SEQ ID N^Q 76), 1K) Símbolo do gene: FCRL3; peptídeo IPVSHPVL (SEQ ID N^Q 85), 1L) Símbolo do gene: CDK6; peptídeo FGLARIYSF (SEQ ID N^Q 110), 1M) Símbolo do gene: CLEC17A; peptídeo VTLIKYQEL (SEQ ID N^Q 111), 1N) Símbolo do gene: RALGPS2; peptídeo YIKTAKKL (SEQ ID N^Q 117), 10) Símbolo do gene: CDK6; peptídeo GEGAYGKVF (SEQ ID N^Q 129), 1P) Símbolo do gene: FCRL2; peptídeo RENQVLGSGW (SEQ ID N^Q 139), 1Q) Símbolo do gene: FLT3; peptídeo REYEYDLKWEF (SEQ ID N^Q 141), 1R) Símbolo do gene: BMF; peptídeo VTEEPQRLFY (SEQ ID N^Q 189), 1S) Símbolo

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132/196 do gene: FCER2; peptídeo LLWHWDTTQSLK (SEQ ID N^Q 212), 1T) Símbolo do gene: CDK6; peptídeo MPLSTIREV (SEQ ID N^Q 231), 1U) Símbolo do gene: CLEC17A; peptídeo SPRVYWLGL (SEQ ID N^Q 233), 1V) Símbolo do gene: PMAIP1; peptídeo QPSPARAPAEL (SEQ ID N^Q 247), 1W) Símbolo do gene: CDK6; peptídeo AEIGEGAYGKVF (SEQ ID N^Q 260).

[00354] A Figura 2 mostra exemplos de resultados de respostas de células T CD8+ in vitro em doadores saudáveis HLA-A*02+. As células T CD8+ foram preparadas usando-se CAAs artificiais revestidas por anticorpos monoclonais anti-CD28 e HLA-A*02 em complexo com o peptídeo YLDRKLLTL de SEQ ID N^Q 278 (A, painel esquerdo). Depois de três ciclos de estimulação, as células que reagiam a peptídeos foram detectadas por coloração 2D para multímeros com A*02/SEQ ID N^Q 278 (A). O painel à direita (B) mostra a coloração de células de controle estimuladas por complexos irrelevantes de A*02 com peptídeos. As células singlete viáveis foram tríadas para detecção de linfócitos CD8+. Portas booleanas ajudaram a descartar falsos positivos detectados por multímeros específicos para peptídeos diferentes. As frequências de células específicas positivas para multímeros em linfócitos CD8+ estão indicadas.

[00355] A Figura 3 mostra exemplos de resultados de respostas de células T CD8+ in vitro em doadores saudáveis HLA-A*24+. As células T CD8+ foram preparadas usando-se CAAs artificiais revestidas por anticorpos monoclonais anti-CD28 e HLA-A*24 em complexo com o peptídeo SEQ ID N^Q 279 (A, painel esquerdo). Depois de três ciclos de estimulação, as células que reagiam a peptídeos foram detectadas por coloração com A*24/SEQ ID N^Q 279 (LYIDRPLPYL, SEQ ID N^Q 279 (A). O painel direito (B) mostra a coloração de células de controle estimuladas por complexos irrelevantes de A*24 com peptídeos. As células singlete viáveis foram tríadas para detecção de linfócitos CD8+.

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Portas booleanas ajudaram a descartar falsos positivos detectados por multímeros específicos para peptídeos diferentes. As frequências de células específicas positivas para multímeros em linfócitos CD8+ estão indicadas.

[00356] A Figura 4 mostra exemplos de resultados de respostas de células T CD8+ in vitro em doadores saudáveis HLA-A*01+. As células T CD8+ foram preparadas usando-se aCAAs artificiais revestidas por anticorpos monoclonais anti-CD28 e HLA- A*01 em complexo com os peptídeos SEQ ID N^Q 12 (ATDIVDSQY, SEQ ID N^Q 12; A, painel esquerdo) e SEQ ID N^Q 192 (RSDPGGGGLAY, SEQ ID N^Q 192; B, painel esquerdo), respectivamente. Depois de três ciclos de estimulação, as células que reagiam a peptídeos foram detectadas por coloração com multímeros 2D e A*01/SEQ ID N^Q 12 (A) ou A*01/SEQ ID N^Q 192 (B). Os painéis à direita (A e B) mostram a coloração de células de controle estimuladas por complexos irrelevantes de A*01 com peptídeos. As células singlete viáveis foram tríadas para detecção de linfócitos CD8+. Portas booleanas ajudaram a descartar falsos positivos detectados por multímeros específicos para peptídeos diferentes. As frequências de células específicas positivas para multímeros em linfócitos CD8+ estão indicadas.

[00357] A Figura 5 mostra exemplos de resultados de respostas de células T CD8+ in vitro em doadores saudáveis HLA-A*02+. As células T CD8+ foram preparadas usando-se CAAs artificiais revestidas por anticorpos monoclonais anti-CD28 e HLA-A*02 em complexo com os peptídeos SEQ ID N^Q 19 (SLFEGIYTIA, SEQ ID N^Q 19; A, painel esquerdo) e com o peptídeo SEQ ID N^Q 26 (SLYVQQLKI, SEQ ID N^Q 26; B, painel esquerdo), respectivamente. Depois de três ciclos de estimulação, as células que reagiam a peptídeos foram detectadas por coloração com multímeros 2D e A*02/SEQ ID N^Q 19 (A) ou A*02/SEQ ID N^Q 26 (B). Os painéis à direita (A e B) mostram a coloração de

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134/196 células de controle estimuladas por complexos irrelevantes de A*02 com peptídeos. As células singlete viáveis foram tríadas para detecção de linfócitos CD8+. Portas booleanas ajudaram a descartar falsos positivos detectados por multímeros específicos para peptídeos diferentes. As frequências de células específicas positivas para multímeros em linfócitos CD8+ estão indicadas.

[00358] A Figura 6 mostra exemplos de resultados de respostas de células T CD8+ in vitro em doadores saudáveis HLA-A*03+. As células T CD8+ foram preparadas usando-se CAAs artificiais revestidas por anticorpos monoclonais anti-CD28 e HLA-A*03 em complexo com os peptídeos SEQ ID N^Q 45 (VVFPFPVNK; SEQ ID N^Q 45; A, painel esquerdo) e SEQ ID N^Q 215 (KVAGERYVYK; SEQ ID N^Q 215; B, painel esquerdo), respectivamente. Depois de três ciclos de estimulação, as células que reagiam a peptídeos foram detectadas por coloração com multímeros 2D e A*03/SEQ ID N^Q 45 (A) ou A*03/SEQ ID N^Q 215 (B). Os painéis à direita (A e B) mostram a coloração de células de controle estimuladas por complexos irrelevantes de A*03 com peptídeos. As células singlete viáveis foram tríadas para detecção de linfócitos CD8+. Portas booleanas ajudaram a descartar falsos positivos detectados por multímeros específicos para peptídeos diferentes. As frequências de células específicas positivas para multímeros em linfócitos CD8+ estão indicadas.

[00359] A Figura 7 mostra exemplos de resultados de respostas de células T CD8+ in vitro em doadores saudáveis HLA-A*24+. As células T CD8+ foram preparadas usando-se CAAs artificiais revestidas por anticorpos monoclonais anti-CD28 e HLA A*24 em complexo com os peptídeos SEQ ID N^Q 53 (KYIEYYLVL, SEQ ID N^Q 53; A, painel esquerdo) e SEQ ID N^Q 68 (LYQDRFDYL, SEQ ID N^Q 68; B, painel esquerdo), respectivamente. Depois de três ciclos de estimulação, as células que reagiam a peptídeos foram detectadas por coloração com

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135/196 multímeros 2D e A*02/SEQ ID N^Q 53 (A) ou A*24/SEQ ID N^Q 68 (B). Os painéis à direita (A e B) mostram a coloração de células de controle estimuladas por complexos irrelevantes de A*24 com peptídeos. As células singlete viáveis foram tríadas para detecção de linfócitos CD8+. Portas booleanas ajudaram a descartar falsos positivos detectados por multímeros específicos para peptídeos diferentes. As frequências de células específicas positivas para multímeros em linfócitos CD8+ estão indicadas.

[00360] A Figura 8 mostra exemplos de resultados de respostas de células T CD8+ in vitro em doadores saudáveis HLA-B*07+. As células T CD8+ foram preparadas usando-se CAAs artificiais revestidas por anticorpos monoclonais anti-CD28 e HLA-B*07 em complexo com os peptídeos SEQ ID N^Q 233 (SPRVYWLGL, SEQ ID N^Q 233; A, painel esquerdo) e SEQ ID N^Q 84 (SPKLQIAAM, SEQ ID N^Q 84; B, painel esquerdo), respectivamente. Depois de três ciclos de estimulação, as células que reagiam a peptídeos foram detectadas por coloração com multímeros 2D e B*07/SEQ ID N^Q 233 (A) ou B*07/SEQ ID N^Q 84 (B). Os painéis à direita (A e B) mostram a coloração de células de controle estimuladas por complexos irrelevantes de B*07 com peptídeos. As células singlete viáveis foram tríadas para detecção de linfócitos CD8+. Portas booleanas ajudaram a descartar falsos positivos detectados por multímeros específicos para peptídeos diferentes. As frequências de células específicas positivas para multímeros em linfócitos CD8+ estão indicadas.

[00361] A Figura 9 mostra exemplos de resultados de respostas de células T CD8+ in vitro em doadores saudáveis HLA-B*44+. As células

T CD8+ foram preparadas usando-se CAAs artificiais revestidas por anticorpos monoclonais anti-CD28 e HLA-B*44 em complexo com os peptídeos SEQ ID N^Q 145 (AEPLVGQRW, SEQ ID N^Q 145; A, painel esquerdo) e SEQ ID N^Q 171 (SEDLAVHLY, SEQ ID N^Q 171; B, painel

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136/196 esquerdo), respectivamente. Depois de três ciclos de estimulação, as células que reagiam a peptídeos foram detectadas por coloração 2D com o multímero relevante (por exemplo B*44/SEQ ID N^Q 145 (A) ou B*44/SEQ ID N^QSEQ ID N^Q 171 (B)). Os painéis à direita (A e B) mostram a coloração de células de controle estimuladas por complexos irrelevantes de B*44 com peptídeos. As células singlete viáveis foram tríadas para detecção de linfócitos CD8+. Portas booleanas ajudaram a descartar falsos positivos detectados por multímeros específicos para peptídeos diferentes. As frequências de células específicas positivas para multímeros em linfócitos CD8+ estão indicadas.

EXEMPLOS

EXEMPLO 1

Identificação de peptídeos associados ao tumor apresentados na superfície celular

Amostras de tecido

[00362] As amostras tumorais e tecidos normais de pacientes foram obtidos do Hospital Universitário de Tübingen (Tübingen, Alemanha). Todos os pacientes deram consentimento livre e esclarecido antes de colher sangue. As CMSP foram isoladas de amostras de sangue por centrifugação em gradiente de densidade de Ficoll-Hypaque imediatamente após a coleta do sangue. Imediatamente após a purificação, grumos de CMSP foram criocongelados a -70^QC ou menos até o isolamento dos TUMAPs.

Isolamento de peptídeos de HLA de amostras de tecido

[00363] Misturas de peptídeos HLA de amostras congeladas criogenicamente foram obtidas por imunoprecipitação de acordo com um protocolo ligeiramente modificado (Falk et al., 1991; Seeger et al.,

1999) usando o anticorpo BB7.2 específico para HLA-A*02, o anticorpo W6/32 específico para HLA-A, B ou C, sefarose ativada por

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CNBr, tratamento com ácido e ultrafiltração.

Análises por espectrometria de massa

[00364] Os agregados de peptídeos de HLA foram obtidos e separados de acordo com sua hidrofobicidade por cromatografia de fase reversa (sistema Ultimate 3000 RSLC de Nano UHPLC, Dionex) e os peptídeos eluídos foram analisados por espectrômetros de massa híbridos LTQ Orbitrap e Fusion Lumos (ThermoElectron) equipados com fontes ESI. Amostras de peptídeos foram carregadas com 3% de solvente B (20% H2O, 80% acetonitrilo e 0,04% ácido fórmico) em uma coluna PepMap 100 C18 Nanotrap de 2 cm (Dionex) com taxa de fluxo de 4 μΙ/min por 10 minutos. A separação foi realizada em colunas PepMap C18 de 25 cm ou 50 cm com partículas de 2 μιτι (Dionex) montadas em um forno de colunas aquecido a 50Ό. O gradiente aplicado variou de 3% a 40% de solvente B durante 90 minutos com taxa de fluxo de 300 nl/min (colunas de 25 cm) ou 140 min com taxa de fluxo de 175 nl/min (colunas de 50 cm), (solvente A: H2O 99%, ACN 1% e ácido fórmico 0,1%; solvente B: H2O 20%, ACN 80% e ácido fórmico 0,1%).

[00365] As análises de espectrometria de massa foram realizadas em um modo de aquisição dependente de dados usando um método de atuação sobre os cinco maiores peptídeos, ou seja, um método no qual em cada varredura os cinco íons precursores mais abundantes são selecionados para fragmentação. Alternativamente, a análise usou um método TopSpeed usando instrumentos Fusion Lumos.

[00366] As varreduras foram realizadas no Orbitrap a uma resolução de 60.000 (Orbitrap XL) ou 120.000 (Orbitrap Fusion

Lumos). A análise MS/MS foi realizada com dissociação induzida por colisão (CID, collision induced dissociation) com energia de colisão normalizada de 35%, tempo de ativação de 30 ms, largura de isolamento de 1,3 m/z) e análise subsequente em trap iônico linear

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138/196 quadripolar (LTQ). O intervalo de massas para ligantes de HLA classe I foi limitado em 400 a 650 m/z e os estados de carga 2+ e 3+ selecionados para fragmentação. Para HLA classe II, o intervale de massas foi ajustado para 300 a 1500 m/z, permitindo fragmentação com todos os estados de carga positivos iguais ou maiores que 2. [00367] Espectros de massa em tândem foram interpretados por meio de buscas nos bancos de dados MASCOT e SEQUEST com uma taxa fixa de falsas descobertas em percolador (q<0,05) mais controles manuais. Em casos onde a sequência de peptídeos identificada era incerta, ela foi submetida a mais uma etapa de validação, na qual se comparou o padrão de fragmentação do peptídeo gerado naturalmente com o padrão de fragmentação de um peptídeo de referência sintético com a mesma sequência.

[00368] As Tabelas 8a e 8b mostram a apresentação de vários peptídeos em diversas entidades oncológicas, o que demonstra a relevância dos mesmos para o diagnóstico e/ou tratamento dos cânceres indicados (por exemplo peptídeo SEQ ID N^Q 3 para LMA e LMC (Tabela 8a) e para CVB, MEL, LNH, CPCNP e CB (Tabela 8b), peptídeo SEQ ID N^Q 4 para LLC (Tabela 8a) e para CAM, CCC, CaCR, CVB, CG, CJEG, CHC, CCECP, MEL, CPCNPadeno, CPCNPoutro, CPCNPescam, CE, CP, CPr, CPPC, CB e CAU (Tabela 8b)).

Tabela 8a: Apresentação de alguns peptídeos associados a tumores da presente invenção entidades (doenças).

[00369] LLC: leucemia linfocítica crônica; LMA: leucemia mieloide aguda; LMC: leucemia mieloide crônica

SEQ ID NQ	Sequência	Apresentação de peptídeos em entidades oncológicas
1	LTEGHSGNYY	LLC
2	TMIRIFHRY	LMA
3	YINPAKLTPY	LLC

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139/196

SEQ ID NQ	Sequência	Apresentação de peptídeos em entidades oncológicas
4	ALDQNKMHY	LMA
5	GTDVLSTRY	LMA, LMC
6	VTEGVAQTSFY	LLC
7	FMDSESFYY	LLC
8	STDSAGSSY	LLC
9	YSHPQYSSY	LLC
10	YSDIGHLL	LLC
11	AAADHHSLY	LMA
12	ATDIVDSQY	LLC
13	ITDIHIKY	LLC
14	TFDLTVVSY	LLC
15	SVADIRNAY	LLC
16	WIGDKSFEY	LMA
17	KAYNRVIFV	LLC
18	YLLPSVVLL	LLC
19	SLFEGIYTI	LMA
20	FSLEDLVRI	LLC
21	FLFDKLLLI	LLC
22	ILHAQTLKI	LLC
23	FAFSGVLRA	LMA
24	KLGPVAVSI	LLC
25	YLNEKSLQL	LMA, LMC
26	SLYVQQLKI	LLC
27	RLIAKEMNI	LLC
28	VILESIFLK	LLC
29	RIYDEILQSK	LMA
30	RTYGFVLTF	LLC

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140/196

SEQ ID NQ	Sequência	Apresentação de peptídeos em entidades oncológicas
31	ATFNKLVSY	LMA
32	KTSNIVKIK	LLC
33	SVFEGDSIVLK	LLC
34	SVYSETSNMDK	LLC
35	ATKSPAKPK	LLC
36	KAKAAAKPK	LLC
37	KAKKPAGAAK	LLC
38	KARKSAGAAK	LLC
39	IVIQLRAQK	LLC
40	RSKEYIRKK	LLC
41	SVAHLLSKY	LLC
42	SVSSSTHFTR	LLC
43	KLMETSMGF	LLC
44	KVYDPVSEY	LLC
45	VVFPFPVNK	LMA, LMC
46	RVFPSPMRI	LLC
47	SVLDLSVHK	LLC
48	RIKPPGPTAVPK	LMA
49	GLLEEALFY	LMA
50	GVFNTLISY	LMA
51	ASTTVLALK	LLC
52	KAFNQSSTLTK	LLC
53	KYIEYYLVL	LLC
54	QQALNFTRF	LLC
55	IFVARLYYF	LLC
56	KYSSGFRNI	LLC
57	RFPPTPPLF	LLC

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141/196

SEQ ID NQ	Sequência	Apresentação de peptídeos em entidades oncológicas
58	KYLADLPTL	LLC
59	GLYEGTGRLF	LMA
60	TQDPHVNAFF	LLC
61	IFKEHNFSF	LMA
62	YYLSHLERI	LMA
63	IYFSNTHFF	LMA
64	SFQSKATVF	LMA
65	AYLKQVLLF	LLC
66	SQPAVATSF	LMA
67	VFLPSEGFNF	LMA
68	LYQDRFDYL	LMA
69	EYNTIKDKF	LLC
70	LYSDIGHLL	LLC
71	RYLGKNWSF	LMA
72	TYVENLRLL	LLC
73	TYPQLEGFKF	LLC
74	SYADNILSF	LLC
75	RFYLLTEHF	LMA
76	KAFSWSSAF	LLC
77	RPNGNSLFTSA	LLC
78	RPRGLALVL	LMA, LMC
79	SPVPSHWMVA	LLC
80	KPLFKVSTF	LLC
81	SESPWLHAPSL	LLC
82	APFGFLGMQSL	LLC
83	IPVSRPIL	LLC
84	SPKLQIAAM	LLC

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142/196

SEQ ID NQ	Sequência	Apresentação de peptídeos em entidades oncológicas
85	IPVSHPVL	LLC
86	IPASHPVL	LLC
87	FPAPILRAV	LLC
88	MPDPHLYHQM	LLC
89	FPETVNNLL	LLC
90	KPKAAKPKA	LLC
91	KPKAAKPKAA	LLC
92	KAKKPAGAA	LLC
93	KARKSAGAA	LLC
94	KPKAAKPKKAAA	LLC
95	KPKAAKPKTA	LLC
96	KPKKAPKSPA	LLC
97	LPFGKIPIL	LMA, LMC
98	YPIALTRAEM	LLC
99	SPRAINNLVL	LLC
100	YPYQERVFL	LMC
101	NPRYPNYMF	LLC
102	LPLSMEAKI	LMC
103	IPANTEKASF	LLC
104	RPMTPTQIGPSL	LLC
105	NPLTKLLAI	LMA
106	KAFKWFSAL	LLC
107	QAAQRTAL	LLC
108	ILAIRQNAL	LLC
109	LGHVRYVL	LLC
110	FGLARIYSF	LMA, LMC
111	VTLIKYQEL	LLC

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SEQ ID NQ	Sequência	Apresentação de peptídeos em entidades oncológicas
112	APLLRHWEL	LLC
113	DANSRTSQL	LLC
114	HNALRILTF	LMA
115	ELYQRIYAF	LMA
116	TLKIRAEVL	LLC
117	YIKTAKKL	LLC
118	FEKEKKESL	LLC
119	DLRTKEVVF	LLC
120	VPPKKHLL	LLC
121	RPKKVNTL	LLC
122	KELPGVKKY	LLC
123	EENPGKFLF	LLC
124	SESLPKEAF	LLC
125	SESTFDRTF	LLC
126	EENKPGIVY	LLC
127	TEYPVFVY	LMA
128	GENDRLNHTY	LLC
129	GEGAYGKVF	LMA
130	EEEHGKGREY	LLC
131	EEFETIERF	LLC
132	GELPAVRDL	LLC
133	AEHNFVAKA	LLC
134	SEYADTHYF	LLC
135	NEIKVYITF	LMA, LMC
136	AEYKGRVTL	LLC
137	GELGGSVTI	LLC
138	SQAPAARAF	LLC

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144/196

SEQ ID NQ	Sequência	Apresentação de peptídeos em entidades oncológicas
139	RENQVLGSGW	LLC
140	EYDLKWEF	LMA
141	REYEYDLKWEF	LMA
142	TEIFKEHNF	LMA
143	YEYDLKWEF	LMA
144	TEGKRYFTW	LLC
145	AEPLVGQRW	LLC
146	SESKTVVTY	LLC
147	KEVPRSYEL	LLC
148	REYNEYENI	LLC
149	SEKETVAYF	LLC
150	EEVTDRSQL	LLC
151	EVDASIFKAW	LLC
152	AELLAKELY	LLC
153	KEFEQVPGHL	LLC
154	AEPGPVITW	LLC
155	NEFPVIVRL	LLC
156	FEVESLFQKY	LLC
157	VEIAEAIQL	LLC
158	GENEDNRIGL	LLC
159	GELLGRQSF	LLC
160	EEETILHFF	LLC
161	EEGDTLLHLF	LLC
162	DEAQARAAF	LMA
163	EEWMGLLEY	LMA
164	SEYSHLTRV	LMA
165	VELDLQRSV	LMA

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145/196

SEQ ID NQ	Sequência	Apresentação de peptídeos em entidades oncológicas
166	NEVLASKY	LLC
167	KEIGAAVQAL	LLC
168	QEIQSLLTNW	LLC
169	EENGEVKEL	LLC
170	SENEQRRMF	LLC
171	SEDLAVHLY	LLC
172	VEDGLFHEF	LLC
173	KEYDFGTQL	LMA
174	TDKSFPNAY	LLC
175	HEIDGKALFL	LMA
176	AENAVSNLSF	LLC
177	QENMQIQSF	LLC
178	REYEHYWTEL	LLC
179	AEIKQTEEKY	LMA
180	EEPAFNVSY	LLC
181	GEIKEPLEI	LLC
182	AQNLSIIQY	LLC
183	GESQDSTTAL	LLC
184	RMPPFTQAF	LLC
185	SEGDNVESW	LLC
186	NEQKIVRF	LLC
187	SDAQRPSSF	LLC
188	YVDAGTPMY	LLC
189	VTEEPQRLFY	LLC
190	HVDQDLTTY	LMA
191	ISEAGKDLLY	LMA, LMC, LLC
192	RSDPGGGGLAY	LMA

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146/196

SEQ ID NQ	Sequência	Apresentação de peptídeos em entidades oncológicas
193	LTDSEKGNSY	LLC
194	YTDKKSIIY	LLC
195	YSDKEFAGSY	LLC
196	FTDIDGQVY	LLC
197	SLADVHIEV	LLC
198	KLLGYDVHV	LMA
199	AMPDSPAEV	LMA
200	VMLQINPKL	LLC
201	ILAAVETRL	LLC
202	MVALPMVLV	LLC
203	FLLPKVQSI	LLC
204	FLLPKVQSIQL	LLC
205	FLINTNSEL	LLC
206	SLMDLQERL	LLC
207	KLSDNILKL	LLC
208	KLNPQQAPLY	LLC
209	KTLPAMLGTGK	LLC
210	RMYSQLKTLQK	LLC
211	ATYNKQPMYR	LMC
212	LLWHWDTTQSLK	LLC
213	RVYNIYIRR	LMA
214	ATGAATPKK	LLC
215	KATGAATPK	LLC
216	RIKAPSRNTIQK	LLC
217	TTVPHVFSK	LLC
218	RVLTGVFTK	LLC
219	HSYSSPSTK	LLC

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147/196

SEQ ID NQ	Sequência	Apresentação de peptídeos em entidades oncológicas
220	SISNLVFTY	LMA
221	LLNRHILAH	LLC
222	RYLDEINLL	LMA
223	RRMYPPPLI	LLC
224	VYEYVVERF	LLC
225	LPARFYQAL	LLC
226	YLNRHLHTW	LLC
227	APINKAGSFL	LLC
228	SPRITFPSL	LLC
229	SPLGSLARSSL	LLC
230	KPMKSVLVV	LLC
231	MPLSTIREV	LMA, LMC
232	APRPAGSYL	LLC
233	SPRVYWLGL	LLC
234	SPKESENAL	LLC
235	SPSLPSRTL	LLC
236	RPSNKAPLL	LLC
237	SPWLHAPSL	LLC
238	SPRSWIQVQI	LLC
239	APSKTSLIM	LLC
240	SPSLPNITL	LLC
241	APAPAEKTPV	LLC
242	SPFSFHHVL	LLC
243	LPKVQSIQL	LLC
244	MPSSDTTVTF	LLC
245	SPLSHHSQL	LLC
246	YPGWHSTTI	LMA

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SEQ ID NQ	Sequência	Apresentação de peptídeos em entidades oncológicas
247	QPSPARAPAEL	LLC
248	LPYDSKHQI	LLC
249	SPADHRGYASL	LMA
250	VPNLQTVSV	LLC
251	QPRLFTMDL	LLC
252	RPHIPISKL	LLC
253	RPFADLLGTAF	LLC
254	SPRNLQPQRAAL	LLC
255	YPGSDRIML	LLC
256	SPYKKLKEAL	LLC
257	KEFFFVKVF	LLC
258	EELFRDGVNW	LLC
259	EENTLVQNY	LLC
260	AEIGEGAYGKVF	LMA
261	NEIEHIPVW	LLC
262	QENQAETHAW	LLC
263	REAGFQVKAY	LLC
264	SEDHSGSYW	LLC
265	QEVDASIFKAW	LLC
266	VDASIFKAW	LLC
267	KEKFPINGW	LLC
268	NEDKGTKAW	LLC
269	KELEDLNKW	LLC
270	AESEDLAVHL	LLC
271	AESEDLAVHLY	LLC
272	KEFELRSSW	LLC
273	AEIEIVKEEF	LLC

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SEQ ID NQ	Sequência	Apresentação de peptídeos em entidades oncológicas
274	GEAVTDHPDRLW	LLC
275	TENPLTKLL	LMA
276	EEEGNLLRSW	LLC
277	EEGNLLRSW	LLC

[00370] Tabela 8b: Apresentação de alguns peptídeos associados a tumores da presente invenção entidades (doenças).

[00371] CaCR: carcinoma colorretal; CAM: câncer de mama; CAU: câncer de útero.; CB: câncer de bexiga; CCC: câncer do dueto biliar; CCECP: carcinoma de células escamosas de cabeça e pescoço; CCR: carcinoma de células renais; CE câncer de esôfago; CG: câncer gástrico; CHC: carcinoma hepatocelular; CO: câncer de ovário; CP: câncer de pâncreas; CPCNPadeno: câncer de pulmão de células não pequenas do tipo adenocarcinoma; CPCNPescam: câncer de pulmão de células não pequenas do tipo escamoso; CPCNPoutro: câncer de pulmão de células não pequenas que não pôde ser definitivamente caracterizado como CPCNPadeno ou CPCNPescam; CPPC: câncer de pulmão de pequenas células; CPr: câncer de próstata e hiperplasia prostática benigna; CVB: adenocarcinoma da vesícula biliar; GBM: câncer cerebral; LNH: linfoma não Hodgkin; MEL: melanoma

SEQ ID Ns	Sequência	Tipos tumorais em que o peptídeo foi apresentado
1	LTEGHSGNYY	LNH
3	YINPAKLTPY	CB, CPCNPoutro, CVB, LNH, MEL
4	ALDQNKMHY	CaCR, CAM, CAU, CB, CCC, CCECP, CE, CG, CHC, CJEG, CP, CPCNPadeno, CPCNPescam, CPCNPoutro, CPPC, CPr, CVB, MEL
5	GTDVLSTRY	CaCR, CAM, CAU, CB, CCR, CE, CG, CJEG, CP, CPCNPadeno, CPCNPescam, CPCNPoutro, CPPC, CPr, CVB, LNH, LNH, MEL, MEL

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SEQ ID Ns	Sequência	Tipos tumorais em que o peptídeo foi apresentado
6	VTEGVAQTSFY	CAM, CAU, CCC, CCECP, CCR, CE, CG, CHC, CJEG, CO, CP, CPCNPadeno, CPCNPescam, CPCNPoutro, CPPC, CPr, CVB, GBM, LNH, MEL
7	FMDSESFYY	CAM, CCECP, CG, CPCNPadeno, CPCNPescam, CVB, LNH, MEL
8	STDSAGSSY	LNH
10	YSDIGHLL	CAM, CAU, CCC, CCR, CG, CO, CP, CPCNPadeno, CPCNPescam, CPCNPoutro, LNH
11	AAADHHSLY	CG, CPPC
13	ITDIHIKY	CaCR, CAM, CB, CCECP, CCR, CE, CG, CJEG, CP, CPCNPadeno, CPCNPescam, CPCNPoutro, CPPC, CPr, CVB, GBM, LNH, MEL
14	TFDLTVVSY	CaCR, CAM, CAU, CB, CCC, CCECP, CCR, CE, CG, CHC, CO, CP, CPCNPadeno, CPCNPescam, CPCNPoutro, CPPC, CPr, CVB, GBM, LNH, MEL
15	SVADIRNAY	CaCR, CAM, CAU, CB, CCC, CCECP, CCR, CE, CG, CHC, CO, CP, CPCNPadeno, CPCNPescam, CPCNPoutro, CPPC, CPr, CVB, GBM, LNH, MEL
16	WIGDKSFEY	CaCR, CAM, CCR, CE, CG, CHC, CP, CPCNPadeno, CPCNPescam, CPr, CVB, GBM, MEL
17	KAYNRVIFV	CaCR, CAM, CAU, CB, CCC, CCECP, CE, CHC, CJEG, CO, CP, CPCNPadeno, CPCNPescam, CPCNPoutro, CPPC, CVB, GBM, LNH
18	YLLPSVVLL	CaCR, CAM, CAU, CB, CCC, CCECP, CCR, CE, CG, CHC, CJEG, CO, CP, CPCNPadeno, CPCNPescam, CPCNPoutro, CPPC, CPr, CVB, GBM, LNH, MEL
20	FSLEDLVRI	LNH
21	FLFDKLLLI	CaCR, CAM, CAU, CB, CCC, CCECP, CCR, CE, CG, CHC, CJEG, CO, CP, CPCNPadeno, CPCNPescam, CPCNPoutro, CPPC, CPr, CVB, GBM, LNH, MEL
22	ILHAQTLKI	CHC, CPCNPescam, CPr, LNH
23	FAFSGVLRA	CaCR, CAM, CAU, CB, CCECP, CE, CHC, CJEG, CO, CPCNPadeno, CPCNPescam, CPCNPoutro, CPPC, CPr, CVB, LNH
24	KLGPVAVSI	CCECP, CE, CE, CHC, CPCNPescam, CPr, LNH
25	YLNEKSLQL	CaCR, CAM, CAU, CB, CCC, CCR, CHC, CJEG, CO, CPCNPadeno, CPCNPescam, CPCNPoutro, CPPC, CPr, LNH,

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SEQ ID Ns	Sequência	Tipos tumorais em que o peptideo foi apresentado
		MEL
26	SLYVQQLKI	CCECP, CO, CPr, LNH
27	RLIAKEMNI	CHC, LNH
28	VILESIFLK	CAU, CE, CO, CPCNPadeno, CPCNPescam, CPCNPoutro, CPr, CVB, LNH
29	RIYDEILQSK	CCR
31	ATFNKLVSY	CaCR, CB, CPPC
33	SVFEGDSIVLK	CO, CPCNPadeno, CPCNPoutro, LNH
34	SVYSETSNMDK	CAM, CAU, CCR, CE, CO, CPCNPescam, LNH, MEL
41	SVAHLLSKY	CAU
42	SVSSSTHFTR	CAU, CCECP, CG, CPCNPadeno, CPCNPescam, LNH
43	KLMETSMGF	CaCR, CAM, CAU, CB, CCECP, CCR, CE, CG, CHC, CO, CP, CPCNPescam, CPCNPoutro, CPPC, CPr, CVB, GBM, LNH, MEL
44	KVYDPVSEY	CAM, CAU, CB, CCC, CCR, CE, CHC, CO, CP, CPCNPadeno, CPCNPescam, CPCNPoutro, CPPC, CVB, GBM, LNH, MEL
45	VVFPFPVNK	CAU, CO, CPCNPoutro, CPPC, GBM, LNH
46	RVFPSPMRI	CE, CPCNPescam, CPPC, LNH, MEL
47	SVLDLSVHK	CAU, CCC, CE, CHC, CPPC, CPr, LNH
48	RIKPPGPTAVPK	CAM, MEL
49	GLLEEALFY	CaCR, CAM, CCR, CE, CG, CHC, CP, CPCNPadeno, CPCNPescam, CPr, CVB, MEL
50	GVFNTLISY	CPr, MEL
51	ASTTVLALK	LNH
53	KYIEYYLVL	CAU, CG, CPCNPadeno, CPCNPescam
54	QQALNFTRF	CCR, CO, CPCNPadeno, CPCNPescam, CPPC, CVB, LNH, MEL
55	IFVARLYYF	CaCR, CAM, CAU, CB, CCR, CE, CG, CHC, CO, CP, CPCNPadeno, CPCNPescam, CPCNPoutro, CPPC, CPr, CVB, LNH, MEL
56	KYSSGFRNI	CaCR, CAM, CAU, CCC, CCR, CE, CG, CHC, CO, CP, CPCNPadeno, CPCNPescam, CPCNPoutro, CPPC, CPr, CVB, GBM, LNH, MEL
57	RFPPTPPLF	CAU, CCECP, CE, CPCNPescam, LNH
58	KYLADLPTL	CaCR, CAM, CAU, CCC, CCECP, CCR, CE, CG, CHC, CO, CPCNPadeno, CPCNPescam, CPCNPoutro, CPPC, CPr, CVB,

Petição 870190100586, de 08/10/2019, pág. 171/391

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SEQ ID Ns	Sequência	Tipos tumorais em que o peptídeo foi apresentado
		GBM, LNH, MEL
60	TQDPHVNAFF	CaCR, CAM, CAU, CB, CCECP, CE, CHC, CJEG, CO, CP, CPCNPadeno, CPCNPescam, CPCNPoutro, CPPC, CPr, CVB, LNH
62	YYLSHLERI	CB, CCECP, CPCNPadeno, CPCNPescam, CPCNPoutro, CVB
65	AYLKQVLLF	CaCR, CAM, CAU, CB, CCC, CCR, CE, CG, CHC, CO, CP, CPCNPadeno, CPCNPescam, CPCNPoutro, CPPC, CPr, CVB, GBM, LNH, MEL
66	SQPAVATSF	CaCR, CPPC
67	VFLPSEGFNF	CPCNPadeno, CPPC, MEL
68	LYQDRFDYL	CAU, CG, CPCNPadeno, CPCNPescam, CPCNPoutro, CPPC, CPr, LNH, MEL
69	EYNTIKDKF	CAU, CE, CG, CHC, CP, CPCNPadeno, CPCNPescam, CPCNPoutro, CPPC, CVB, LNH, MEL
70	LYSDIGHLL	CaCR, CAU, CB, CCECP, CCR, CE, CG, CHC, CPCNPadeno, CPCNPescam, CPCNPoutro, CPr, CVB, GBM, LNH, MEL
71	RYLGKNWSF	CCR, CO, CVB
72	TYVENLRLL	CaCR, CAM, CAU, CB, CCC, CCECP, CCR, CE, CG, CHC, CO, CP, CPCNPadeno, CPCNPescam, CPCNPoutro, CPPC, CPr, CVB, GBM, LNH, MEL
73	TYPQLEGFKF	CaCR, CAM, CAU, CB, CE, CG, CHC, CJEG, CO, CP, CPCNPadeno, CPCNPescam, CPCNPoutro, CPPC, CPr, CVB, LNH, MEL
74	SYADNILSF	CaCR, CAM, CAU, CB, CCECP, CCR, CE, CG, CHC, CO, CP, CPCNPadeno, CPCNPescam, CPCNPoutro, CPPC, CPr, CVB, GBM, LNH, MEL
75	RFYLLTEHF	CaCR, CE, CHC, CPCNPadeno, CPCNPescam, CPPC, CVB, LNH
76	KAFSWSSAF	CAM, CB, CPCNPescam, CPPC, CPr, GBM, LNH
77	RPNGNSLFTSA	CAU, CHC, CPPC, CPr, LNH, MEL
78	RPRGLALVL	CaCR, CAM, CAU, CB, CCC, CCECP, CCR, CE, CG, CHC, CO, CP, CPCNPadeno, CPCNPescam, CPCNPoutro, CPPC, CPr, CVB, GBM, LNH, MEL
79	SPVPSHWMVA	CB, CCC, CPPC, CPr, LNH, MEL
80	KPLFKVSTF	CAU, CCR, CE, CO, CPCNPadeno, CPCNPescam, CPCNPoutro, LNH
84	SPKLQIAAM	Câncer de ovário, LNH

Petição 870190100586, de 08/10/2019, pág. 172/391

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SEQ ID Ns	Sequência	Tipos tumorais em que o peptídeo foi apresentado
85	IPVSHPVL	LNH
86	IPASHPVL	CE, CP, CPCNPescam, CPPC, CVB, LNH, MEL
87	FPAPILRAV	CB, CG, CPCNPoutro, CVB, LNH, MEL
88	MPDPHLYHQM	CPCNPescam, LNH, MEL
89	FPETVNNLL	CP, CPCNPadeno, CPCNPescam, CPCNPoutro
97	LPFGKIPIL	CaCR, CAM, CAU, CB, CCECP, CCR, CE, CG, CHC, CO, CP, CPCNPadeno, CPCNPescam, CPCNPoutro, CPPC, CPr, CVB, GBM, LNH, MEL
98	YPIALTRAEM	CAM, CAU, CCC, CCECP, CCR, CE, CG, CO, CP, CPCNPadeno, CPCNPescam, CPCNPoutro, CPPC, CPr, CVB, LNH, MEL
99	SPRAINNLVL	LNH
100	YPYQERVFL	CPCNPadeno, CPCNPescam, LNH
101	NPRYPNYMF	LNH
104	RPMTPTQIGPSL	LNH
105	NPLTKLLAI	CCC, CO, CPCNPadeno, CPCNPescam, CPCNPoutro, LNH, MEL
106	KAFKWFSAL	LNH
108	ILAIRQNAL	CCC LNH, CO
109	LGHVRYVL	CB, CCC, GBM, LNH
110	FGLARIYSF	CAM, CAU, CB, CCC, CCECP, CCR, CE, CG, CHC, CP, CPCNPadeno, CPCNPescam, CPCNPoutro, CPPC, CPr, CVB, LNH, MEL
112	APLLRHWEL	CaCR, CAM, CCC, CCECP, CE, CHC, CO, CP, CPCNPadeno, CPCNPescam, CPCNPoutro, CPPC, CVB, LNH
113	DANSRTSQL	CAU, CPCNPadeno, CPCNPoutro, LNH, MEL
114	HNALRILTF	CAM, CPCNPescam, CPCNPoutro, LNH
115	ELYQRIYAF	CCECP, CPCNPadeno, CPCNPescam, CPCNPoutro, CPPC, CPr, LNH
116	TLKIRAEVL	CCC, CCECP, CE, CO, CPCNPadeno, CPCNPescam, CPCNPoutro, CPPC, CPr, LNH, MEL
118	FEKEKKESL	CO
119	DLRTKEVVF	CG, LNH
122	KELPGVKKY	CaCR, CAU, CCC, CCR, CE, CG, CHC, CP, CPCNPadeno, CPCNPescam, LNH
123	EENPGKFLF	CCECP, CE, CPCNPadeno, CPCNPescam, CPr, LNH, MEL

Petição 870190100586, de 08/10/2019, pág. 173/391

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SEQ ID Ns	Sequência	Tipos tumorais em que o peptídeo foi apresentado
124	SESLPKEAF	CaCR, CAM, CAU, CB, CCC, CCECP, CCR, CE, CG, CHC, CJEG, CO, CP, CPCNPadeno, CPCNPescam, CPCNPoutro, CPPC, CPr, CVB, GBM, LNH, MEL
126	EENKPGIVY	CaCR, CHC, LNH
128	GENDRLNHTY	LNH
129	GEGAYGKVF	CCECP, CCR, CE, CHC, CO, CPCNPadeno
131	EEFETIERF	CaCR, CAM, CAU, CB, CCC, CCECP, CCR, CE, CG, CHC, CJEG, CO, CP, CPCNPadeno, CPCNPescam, CPCNPoutro, CPPC, CPr, CVB, GBM, LNH, MEL
132	GELPAVRDL	CaCR, CCECP, CE, CG, CHC, CO, CP, CPCNPadeno, CPCNPescam, CPCNPoutro, CVB, GBM, LNH
133	AEHNFVAKA	CAM, CCECP, CE, CO, CPCNPadeno, GBM, LNH, MEL
134	SEYADTHYF	LNH
135	NEIKVYITF	CaCR, CAM, CCECP, CCR, CPCNPadeno, CPCNPescam, CPr
136	AEYKGRVTL	CE, LNH
138	SQAPAARAF	CPCNPadeno, LNH
139	RENQVLGSGW	LNH
143	YEYDLKWEF	LNH
144	TEGKRYFTW	LNH, MEL
145	AEPLVGQRW	CB, CPr, LNH
146	SESKTVVTY	CaCR, CAU, CB, CCECP, CCR, CE, CG, CHC, CO, CP, CPCNPadeno, CPCNPescam, CPPC, CPr, LNH, MEL
147	KEVPRSYEL	CCECP, CCR, CE, CO, CPCNPadeno, CPCNPescam, LNH
148	REYNEYENI	CE, CPCNPadeno, LNH
149	SEKETVAYF	LNH, MEL
150	EEVTDRSQL	CO, CPCNPadeno, CPCNPescam, CPCNPoutro, CVB, GC, LNH
151	EVDASIFKAW	CAM, CAU, CB, CCC, CCECP, CE, CHC, CO, CP, CPCNPescam, CPPC, CPr, CVB, GBM, LNH
152	AELLAKELY	CaCR, CAU, CCC, CPCNPescam, LNH
154	AEPGPVITW	LNH
155	NEFPVIVRL	CaCR, CAM, CAU, CB, CCECP, CCR, CE, CG, CO, CP, CPCNPadeno, CPCNPescam, CPCNPoutro, CPPC, CPr, CVB, GBM, LNH, MEL
156	FEVESLFQKY	CaCR, CAM, CAU, CCECP, CCR, CE, CG, CHC, CJEG, CO,

Petição 870190100586, de 08/10/2019, pág. 174/391

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SEQ ID Ns	Sequência	Tipos tumorais em que o peptideo foi apresentado
		CP, CPCNPadeno, CPCNPescam, CPPC, CPr, CVB, LNH, MEL
157	VEIAEAIQL	CaCR, CCC, CCECP, CO, CPCNPadeno, CPCNPescam, CPCNPoutro
159	GELLGRQSF	CaCR, CAM, CAU, CCC, CCR, CO, CP, CPCNPadeno, LNH, MEL
160	EEETILHFF	LNH
161	EEGDTLLHLF	CaCR, CAU, CB, CCECP, CE, CP, CPCNPescam, LNH
164	SEYSHLTRV	CCR
166	NEVLASKY	CaCR, CAM, CAU, CB, CCC, CE, CG, CHC LNH, CO, CPCNPadeno, CPCNPescam, CPPC, CPr, CVB
167	KEIGAAVQAL	CO, CPCNPadeno, CPCNPoutro
168	QEIQSLLTNW	CaCR, CAU, CCC, CCECP, CCR, CE, CHC, CP, CPCNPadeno, CPCNPescam, CPPC, GBM, LNH, MEL
169	EENGEVKEL	LNH
171	SEDLAVHLY	CaCR, CAM, CB, CCECP, CE, CG, CHC, CP, CPr, LNH
172	VEDGLFHEF	CaCR, CAM, CAU, CB, CCECP, CCR, CE, CG, CHC, CO, CP, CPCNPadeno, CPCNPescam, CPr, LNH, MEL
174	TDKSFPNAY	CPPC, CPr
176	AENAVSNLSF	LNH
177	QENMQIQSF	CaCR, CAM, CAU, CB, CCC, CCECP, CE, CG, CHC, CO, CP, CPCNPadeno, CPCNPescam, CPPC, LNH, MEL
178	REYEHYWTEL	CE, CPCNPadeno, CPCNPoutro, LNH, MEL
179	AEIKQTEEKY	CHC
180	EEPAFNVSY	CAM, CCC, CE, CO, CPCNPadeno, CVB, LNH
181	GEIKEPLEI	CaCR, CAM, CAU, CCC, CCECP, CCR, CE, CG, CHC, CO, CP, CPCNPadeno, CPCNPescam, CPCNPoutro, CVB, LNH, MEL
182	AQNLSIIQY	CAM, CE, CG, CHC, CPCNPadeno, CPCNPescam, CPCNPoutro, CPr, CVB, LNH, MEL
183	GESQDSTTAL	CCC, CCECP, CO, CPCNPadeno, CPCNPescam, CPCNPoutro, LNH
184	RMPPFTQAF	CAM, CCR, CG, CO, CP, CPCNPadeno, CPCNPescam, CPCNPoutro, CPPC, CPr, CVB, LNH, MEL
185	SEGDNVESW	LNH
187	SDAQRPSSF	CCR, CPCNPoutro

Petição 870190100586, de 08/10/2019, pág. 175/391

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SEQ ID Ns	Sequência	Tipos tumorais em que o peptídeo foi apresentado
188	YVDAGTPMY	CG, CPCNPadeno, CPCNPescam, CVB, GBM
189	VTEEPQRLFY	CAM, CAU, CB, CCC, CCECP, CE, CG, CHC, CO, CP CPr, CPCNPadeno, CPCNPescam, CPCNPoutro, CPPC, CVB, LNH, MEL
190	HVDQDLTTY	CG, CO, CP, CPCNPadeno, CPCNPescam, CPCNPoutro, CPr, GBM
191	ISEAGKDLLY	CAM, CAU, CCC, CCECP, CE, CJEG, CP, CPCNPadeno, CPCNPescam, CPPC, CPr, LNH, MEL
192	RSDPGGGGLAY	CaCR, CAM, CAU, CB, CCECP, CE, CG, CHC, CJEG, CO, CP, CPCNPadeno, CPCNPescam, CPCNPoutro, CPPC, CPr, CVB, GBM, LNH, MEL
193	LTDSEKGNSY	CCECP, CHC, CJEG, CO, CPCNPadeno, CPCNPescam, CPr, CVB, LNH, MEL
195	YSDKEFAGSY	CaCR, CAM, CAU, CB, CCECP, CCR, CE, CG, CHC, CJEG, CP, CPCNPadeno, CPCNPescam, CPCNPoutro, CPPC, CPr, CVB, GBM, MEL LNH
196	FTDIDGQVY	CaCR, CAM, CAU, CB, CCC, CCECP, CCR, CE, CG, CHC, CP, CPCNPadeno, CPCNPescam, CPCNPoutro, CPPC, CPr, CVB, GBM, LNH, MEL
197	SLADVHIEV	CaCR, CAM, CAU, CB, CCC, CCECP, CCR, CE, CG, CHC, CJEG, CO, CP, CPCNPadeno, CPCNPescam, CPCNPoutro, CPPC, CPr, CVB, GBM, LNH, MEL
198	KLLGYDVHV	CaCR, CAM, CAU, CCR, CO, CPCNPoutro, LNH
199	AMPDSPAEV	CCECP, CPCNPadeno, LNH
200	VMLQINPKL	CAM, CAU, CCECP, CCR, CE, CHC, CO, CPCNPadeno, CPCNPescam, CPCNPoutro, CPPC, CVB, GBM, LNH, MEL
201	ILAAVETRL	CaCR, CAM, CAU, CB, CCC, CCECP, CCR, CE, CG, CHC, CJEG, CO, CP, CPCNPadeno, CPCNPescam, CPCNPoutro, CPPC, CPr, CVB, GBM, LNH, MEL
203	FLLPKVQSI	CAM, CE, CHC, CO, CPCNPadeno, CPCNPescam, CPCNPoutro, LNH, MEL
204	FLLPKVQSIQL	CPCNPadeno, CPCNPescam, CPCNPoutro, MEL
205	FLINTNSEL	CaCR, CAM, CAU, CB, CCC, CCECP, CCR, CE, CG, CHC, CJEG, CO, CP, CPCNPadeno, CPCNPescam, CPCNPoutro, CPPC, CPr, CVB, GBM, LNH, MEL
206	SLMDLQERL	CaCR, CAM, CAU, CCC, CCECP, CCR, CE, CHC, CJEG, CO, CP, CPCNPadeno, CPCNPescam, CPCNPoutro, CPPC, CPr,

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SEQ ID Ns	Sequência	Tipos tumorais em que o peptídeo foi apresentado
		CVB, GBM, LNH, MEL
207	KLSDNILKL	CaCR, CPr, CVB, LNH, MEL
208	KLNPQQAPLY	CAU, CE, LNH, MEL
209	KTLPAMLGTGK	Câncer de ovário, LNH
210	RMYSQLKTLQK	LNH, MEL
211	ATYNKQPMYR	CaCR, CAU, CCC, CCR, CE, CG, CO, CPCNPadeno, CPCNPescam, CPPC, CVB, LNH, MEL
213	RVYNIYIRR	CO, CPCNPadeno, LNH
215	KATGAATPK	CPCNPescam
216	RIKAPSRNTIQK	LNH
217	TTVPHVFSK	CaCR, CAM, CAU, CCC, CCR, CE, CG, CHC, CO, CP, CPCNPadeno, CPCNPescam, CPCNPoutro, CPPC, CPr, CVB, LNH, MEL
218	RVLTGVFTK	LNH
220	SISNLVFTY	CaCR, CAM, CAU, CB, CCECP, CCR, CE, CHC, CO, CP, CPCNPadeno, CPCNPescam, CPPC, CPr, CVB, GBM, MEL
221	LLNRHILAH	CAU, MEL
222	RYLDEINLL	CaCR, CAM, CAU, CB, CCC, CCECP, CCR, CE, CG, CHC, CO, CP, CPCNPadeno, CPCNPescam, CPCNPoutro, CPPC, CPr, CVB, GBM, LNH, MEL
223	RRMYPPPLI	CAU, CHC, CO, CPCNPadeno, CPCNPescam, CPCNPoutro, CPPC, LNH, MEL
224	VYEYVVERF	CaCR, CAM, CAU, CB, CCC, CCECP, CCR, CE, CG, CHC, CJEG, CO, CP, CPCNPadeno, CPCNPescam, CPCNPoutro, CPPC, CPr, CVB, GBM, LNH, MEL
225	LPARFYQAL	CAM, CE
226	YLNRHLHTW	CPCNPescam, LNH
227	APINKAGSFL	CO, MEL LNH
229	SPLGSLARSSL	CE, CO, CVB, LNH
230	KPMKSVLVV	CAM, CB, CE, CG, CO, CPCNPadeno, LNH
231	MPLSTIREV	CaCR, CAM, CAU, CB, CCECP, CCR, CE, CG, CHC, CO, CP, CPCNPadeno, CPCNPescam, CPPC, CPr, CVB, GBM, LNH, MEL
232	APRPAGSYL	CaCR, CAM, CAU, CB, CCC, CCECP, CCR, CE, CG, CHC, CO, CP, CPCNPadeno, CPCNPescam, CPCNPoutro, CPPC, CPr, CVB, GBM, LNH, MEL
233	SPRVYWLGL	LNH

Petição 870190100586, de 08/10/2019, pág. 177/391

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SEQ ID Ns	Sequência	Tipos tumorais em que o peptídeo foi apresentado
234	SPKESENAL	CPCNPescam, LNH
237	SPWLHAPSL	CO, CPCNPadeno, CVB, LNH
238	SPRSWIQVQI	CaCR, CAM, CAU, CCECP, CCR, CE, CO, CP, CPCNPadeno, CPCNPescam, CPCNPoutro, CPPC, CVB, LNH, MEL
239	APSKTSLIM	CaCR, CAM, CAU, CB, CCC, CCECP, CCR, CE, CG, CHC, CO, CP, CPCNPadeno, CPCNPescam, CPCNPoutro, CPPC, CPr, CVB, GBM, LNH, MEL
240	SPSLPNITL	CaCR, CAM, CAU, CB, CCC, CCECP, CCR, CE, CG, CHC, CO, CP, CPCNPadeno, CPCNPescam, CPCNPoutro, CPPC, CPr, CVB, GBM, LNH, MEL
241	APAPAEKTPV	CaCR, CAM, CAU, CB, CCECP, CE, CG, CO, CP, CPCNPadeno, CPCNPescam, CPPC, CPr, CVB, GBM, LNH, MEL
242	SPFSFHHVL	CaCR, CAM, CAU, CB, CCC, CCECP, CCR, CE, CG, CHC, CO, CP, CPCNPadeno, CPCNPescam, CPCNPoutro, CPPC, CPr, CVB, GBM, LNH, MEL
243	LPKVQSIQL	CCC, CCR, CE, CHC, CO, CPCNPadeno, CPCNPescam
244	MPSSDTTVTF	CaCR, CAM, CAU, CB, CCC, CCECP, CCR, CE, CG, CHC, CO, CP, CPCNPadeno, CPCNPescam, CPCNPoutro, CPPC, CPr, CVB, GBM, LNH, MEL
245	SPLSHHSQL	CE, CG, CO, CPCNPadeno, CPCNPescam, CPCNPoutro, LNH
246	YPGWHSTTI	CaCR, CCECP, LNH
247	QPSPARAPAEL	CE, CPCNPadeno, CPCNPescam, CPPC, CVB, LNH
248	LPYDSKHQI	CaCR, CAM, CAU, CB, CCECP, CCR, CE, CG, CO, CP, CPCNPadeno, CPCNPescam, CPCNPoutro, CPPC, CPr, CVB, GBM, LNH, MEL
249	SPADHRGYASL	CaCR, CAM, CAU, CB, CCECP, CCR, CE, CHC, CO, CPCNPadeno, CPCNPescam, CPCNPoutro, CPPC, CVB, MEL
250	VPNLQTVSV	CaCR, CAM, CAU, CB, CCC, CCECP, CCR, CE, CG, CHC, CO, CP, CPCNPadeno, CPCNPescam, CPPC, CPr, CVB, LNH, MEL
251	QPRLFTMDL	CaCR, CAM, CAU, CCECP, CCR, CE, CG, CHC, CO, CP, CPCNPadeno, CPCNPescam, CPCNPoutro, CPPC, CVB, LNH, MEL
252	RPHIPISKL	CaCR, CAM, CAU, CB, CCECP, CCR, CE, CHC, CO, CP, CPCNPadeno, CPCNPescam, CPCNPoutro, CPPC, CVB, GBM, LNH, MEL

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159/196

SEQ ID Ns	Sequência	Tipos tumorais em que o peptídeo foi apresentado
253	RPFADLLGTAF	CAM, CAU, CB, CCECP, CE, CG, CHC, CO, CP, CPCNPadeno, CPCNPescam, CPPC, CVB, LNH, MEL
254	SPRNLQPQRAAL	CaCR, CB, CCECP, CCR, CE, CHC, CP, CPCNPadeno, CPCNPescam, CPPC, CVB, LNH, MEL
255	YPGSDRIML	CPCNPadeno, LNH, MEL
256	SPYKKLKEAL	CAM, CB, CCR, CE, CPCNPadeno, CPCNPescam, CPCNPoutro, CPPC, CPr, LNH, MEL
257	KEFFFVKVF	CaCR, CAM, CAU, CB, CCECP, CCR, CE, CG, CHC, CP, CPCNPadeno, CPCNPescam, CPPC, LNH, MEL
258	EELFRDGVNW	CaCR, CAU, CCC, CHC, CP, CPCNPadeno, CPCNPescam, CPr, LNH, MEL
259	EENTLVQNY	CaCR, CAM, CAU, CB, CCECP, CE, CHC, CO, CP, CPCNPadeno, CPCNPescam, CPCNPoutro, CPPC, CPr, LNH, MEL
260	AEIGEGAYGKVF	CaCR, CAM, CAU, CB, CCC, CCECP, CE, CHC, CO, CP, CPCNPadeno, CPCNPescam, CPCNPoutro, CPr, GBM, LNH, MEL
261	NEIEHIPVW	CE, LNH
262	QENQAETHAW	LNH
263	REAGFQVKAY	LNH, MEL
264	SEDHSGSYW	CaCR, CG, CPCNPadeno, CPCNPescam, LNH, MEL
265	QEVDASIFKAW	CaCR, CAM, CAU, CB, CCC, CCECP, CCR, CE, CG, CHC, CP, CPCNPadeno, CPCNPescam, CPCNPoutro, CPPC, CPr, CVB, LNH, MEL
266	VDASIFKAW	CaCR, CAM, CAU, CB, CCECP, CCR, CE, CHC, CO, CP, CPCNPadeno, CPCNPescam, CPPC, CVB, LNH, MEL
267	KEKFPINGW	CaCR, CCECP, CP, LNH
269	KELEDLNKW	CaCR, CAM, CAU, CCECP, CCR, CE, CHC, CO, CP, CPCNPadeno, CPCNPescam, CPr, CVB, GBM, LNH, MEL
270	AESEDLAVHL	CPCNPescam, MEL
271	AESEDLAVHLY	CaCR, CCECP, CE, CHC, CP, CPCNPadeno, CPCNPescam, LNH, MEL
272	KEFELRSSW	CaCR, CAM, CAU, CCECP, CCR, CE, CG, CHC, CP, CPCNPadeno, CPCNPescam, CPr, LNH, MEL
273	AEIEIVKEEF	CaCR, CAM, CAU, CB, CCC, CCECP, CCR, CE, CG, CHC, CO, CP, CPCNPadeno, CPCNPescam, CPPC, CPr, CVB, GBM, LNH, MEL

Petição 870190100586, de 08/10/2019, pág. 179/391

160/196

SEQ ID Ns	Sequência	Tipos tumorais em que o peptídeo foi apresentado
274	GEAVTDHPDRL W	LNH
275	TENPLTKLL	CaCR, CAM, CHC, LNH
276	EEEGNLLRSW	CaCR, CAM, CAU, CB, CCC, CCECP, CCR, CE, CG, CHC, CO, CP, CPCNPadeno, CPCNPescam, CPCNPoutro, CPPC, CPr, CVB, LNH, MEL
277	EEGNLLRSW	CaCR, CAM, CAU, CB, CCECP, CCR, CE, CG, CHC, CP, CPCNPadeno, CPCNPescam, CPCNPoutro, LNH, MEL

EXEMPLO 2

Perfil da expressão de genes que codificam peptídeos da invenção [00372] A apresentação exacerbada ou apresentação específica de um peptídeo em células tumorais em comparação com células normais é suficiente para demonstrar a utilidade dos peptídeos para imunoterapia, e alguns peptídeos são específicos para tumores, mesmo que a proteína da qual se originaram também esteja presente em tecidos normais. Contudo, o perfil de expressão de mRNA cria um nível adicional de segurança para selecionar peptídeos para uso em imunoterapia. Sobretudo para opções de tratamento mais arriscadas, como TCRs maturados por afinidade, o peptídeo-alvo ideal é derivado de uma proteína específica para o tumor e que não é encontrada em tecidos normais.

Fontes de RNA e preparação

[00373] Amostras de tecido retiradas cirurgicamente foram fornecidas conforme descrito anteriormente (ver Exemplo 1) após obtenção de consentimento livre e esclarecido de cada paciente. As amostras de tecido congeladas foram criocongeladas imediatamente após a cirurgia e depois homogeneizadas em cadinho com pistilo sob nitrogênio líquido. O RNA total foi preparado a partir dessas amostras usando-se o reagente TRI (Ambion, Darmstadt, Alemanha) seguido de limpeza com RNeasy (QIAGEN, Hilden, Alemanha). Ambos os

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161/196 métodos foram realizados de acordo com o protocolo do fabricante. [00374] O RNA total de tecidos humanos saudáveis de experimentos de sequenciamento de RNA foi obtido de Asterand (Detroit, Ml, EUA e Royston, Herts, Reino Unido), Bio-Options Inc. (Brea, CA, EUA); Geneticist Inc. (Glendale, CA, EUA), ProteoGenex Inc. (Culver City, CA, EUA) e Tissue Solutions Ltd (Glasgow, Reino Unido). O RNA total de tecidos tumorais para experimentos de sequenciamento de RNA foi obtido de Asterand (Detroit, Ml, EUA e Royston, Herts, Reino Unido), BioCat GmbH (Heidelberg, Alemanha, BioServe (Beltsville, MD, EUA), Geneticist Inc. (Glendale, CA, EUA), Istituto Nazionale Tumori Pascale (Nápoles, Itália), ProteoGenex Inc. (Culver City, CA, EUA) e Hospital Universitário de Heidelberg (Heidelberg, Alemanha). A qualidade e a quantidade de todas as amostras de RNA foram analisadas em um bioanalisador Agilent 2100 (Agilent, Waldbronn, Alemanha) usando um kit RNA 6000 Pico LabChip (Agilent).

Experimentos de sequenciamento de RNA

[00375] A análise de expressão gênica em amostras de RNA de tumores e tecidos normais foi realizada por sequenciamento de próxima geração (RNAseq) da CeGaT (Tübingen, Alemanha). Resumidamente, bibliotecas de sequenciamento foram preparadas usando o kit de reagentes Illumina HiSeq v4 de acordo com o protocolo do fornecedor (Illumina Inc., San Diego, CA, Estados Unidos), que inclui fragmentação de RNA, conversão em cDNA e adição de adaptadores de sequenciamento. Bibliotecas derivadas de várias amostras são misturadas em proporção equimolar e sequenciadas em um sequenciador Illumina HiSeq 2500 de acordo com as instruções do fabricante, gerando leituras de extremidade única com 50 bp cada. As leituras processadas foram mapeadas em relação ao genoma humano (GRCh38) usando-se o software STAR.

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162/196

Os dados de expressão ao nível de transcrição são fornecidos em RPKM (leituras por quilobase por milhões de leituras mapeadas, geradas pelo software Cufflinks) e ao nível de éxon (leituras totais, geradas pelo software Bedtools), baseado nas anotações do banco de dados Ensembl77. As leituras de éxons foram normalizadas para o comprimento e alinhamento dos éxons para gerar valores de RKPM.

[00376] A Figura 1 mostra alguns perfis de expressão exemplares da presente invenção que apresentam sobrexpressão acentuada ou exclusiva leucemia linfocítica crônica, leucemia mieloide crônica ou leucemia mieloide aguda. Os escores de expressão para outros genes exemplificativos são mostrados na Tabela 9.

[00377] Tabela 9: Escores de expressão. A tabela apresenta uma lista de peptídeos derivados de genes cuja expressão é, quando comparada com um painel de tecidos normais, fortemente acentuada (+++), acentuada (++) ou sobrexpressa (+).0 nível basal para essa pontuação foi calculado a partir de mensurações realizadas nos seguintes tecidos normais relevantes: células sanguíneas, vasos sanguíneos, cérebro, coração, fígado, pulmão, tecido adiposo, glândula suprarrenal, dueto biliar, bexiga, medula óssea, cartilagem, esôfago, olho, vesícula biliar, cabeça e pescoço, rim, intestino grosso, linfonodo, nervo, pâncreas, paratireoide, peritônio, hipófise, pleura, músculo esquelético, pele, intestino delgado, baço, estômago, tireoide, traqueia e ureter. Em casos para os quais existiam dados para várias amostras de um mesmo tipo de tecido, a média aritmética de todas as respectivas amostras foi usada para o cálculo.

SEQ ID NQ	Sequência	Expressão gênica
LMA	LLC
1	LTEGHSGNYY		+++
2	TMIRIFHRY	+++
3	YINPAKLTPY		+

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163/196

SEQ ID NQ	Sequência	Expressão gênica
LMA	LLC
4	ALDQNKMHY	+
5	GTDVLSTRY	+
6	VTEGVAQTSFY		+
7	FMDSESFYY		++
8	STDSAGSSY		++
9	YSHPQYSSY		+++
10	YSDIGHLL		+
11	AAADHHSLY	+
12	ATDIVDSQY		++
13	ITDIHIKY		+
14	TFDLTVVSY		+
15	SVADIRNAY		+
16	WIGDKSFEY	+
17	KAYNRVIFV		+
18	YLLPSVVLL		+
19	SLFEGIYTI	+++
20	FSLEDLVRI		+
21	FLFDKLLLI		+
22	ILHAQTLKI		++
23	FAFSGVLRA	+
24	KLGPVAVSI		+
25	YLNEKSLQL	+
26	SLYVQQLKI		+
27	RLIAKEMNI		+
28	VILESIFLK		+
29	RIYDEILQSK	+	+
30	RTYGFVLTF		+

Petição 870190100586, de 08/10/2019, pág. 183/391

164/196

SEQ ID NQ	Sequência	Expressão gênica
LMA	LLC
31	ATFNKLVSY	+
32	KTSNIVKIK		++
33	SVFEGDSIVLK		++
34	SVYSETSNMDK		+
35	ATKSPAKPK		++
36	KAKAAAKPK		++
37	KAKKPAGAAK		+
38	KARKSAGAAK		+
39	IVIQLRAQK		+
40	RSKEYIRKK		++
41	SVAHLLSKY		+
42	SVSSSTHFTR		+
43	KLMETSMGF		+
44	KVYDPVSEY		+
45	VVFPFPVNK	++
46	RVFPSPMRI		+
47	SVLDLSVHK		+
48	RIKPPGPTAVPK	+
49	GLLEEALFY	+
50	GVFNTLISY	+
51	ASTTVLALK		+
52	KAFNQSSTLTK		+++
53	KYIEYYLVL		++
54	QQALNFTRF		+
55	IFVARLYYF		+
56	KYSSGFRNI		+
57	RFPPTPPLF		+

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165/196

SEQ ID NQ	Sequência	Expressão gênica
LMA	LLC
58	KYLADLPTL		+
59	GLYEGTGRLF	+
60	TQDPHVNAFF		+
61	IFKEHNFSF	+++
62	YYLSHLERI	+
63	IYFSNTHFF	+
64	SFQSKATVF	+++
65	AYLKQVLLF		++
66	SQPAVATSF	+
67	VFLPSEGFNF	+	+
68	LYQDRFDYL	++
69	EYNTIKDKF		+
70	LYSDIGHLL		+
71	RYLGKNWSF	++
72	TYVENLRLL		+
73	TYPQLEGFKF		++
74	SYADNILSF		+
75	RFYLLTEHF	+
76	KAFSWSSAF		+++
77	RPNGNSLFTSA		+
78	RPRGLALVL	+
79	SPVPSHWMVA		+
80	KPLFKVSTF		+
81	SESPWLHAPSL		+
82	APFGFLGMQSL		+
83	IPVSRPIL		++
84	SPKLQIAAM		++

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166/196

SEQ ID NQ	Sequência	Expressão gênica
LMA	LLC
85	IPVSHPVL		+++
86	IPASHPVL		+++
87	FPAPILRAV		+
88	MPDPHLYHQM		+
89	FPETVNNLL	+	+
90	KPKAAKPKA		++
91	KPKAAKPKAA		++
92	KAKKPAGAA		+
93	KARKSAGAA		+
94	KPKAAKPKKAAA		+
95	KPKAAKPKTA		+
96	KPKKAPKSPA		+
97	LPFGKIPIL	+
98	YPIALTRAEM		+
99	SPRAINNLVL		++
100	YPYQERVFL	+
101	NPRYPNYMF		+
102	LPLSMEAKI	+
103	IPANTEKASF		+
104	RPMTPTQIGPSL		++
105	NPLTKLLAI	++	+
106	KAFKWFSAL		+
107	QAAQRTAL		+
108	ILAIRQNAL		+
109	LGHVRYVL		+
110	FGLARIYSF	++
111	VTLIKYQEL		++

Petição 870190100586, de 08/10/2019, pág. 186/391

167/196

SEQ ID NQ	Sequência	Expressão gênica
LMA	LLC
112	APLLRHWEL		+
113	DANSRTSQL		+
114	HNALRILTF	+
115	ELYQRIYAF	+
116	TLKIRAEVL		++
117	YIKTAKKL		++
118	FEKEKKESL		+
119	DLRTKEVVF		+
120	VPPKKHLL		+
121	RPKKVNTL		+
122	KELPGVKKY		++
123	EENPGKFLF		++
124	SESLPKEAF		+
125	SESTFDRTF		+
126	EENKPGIVY		+
127	TEYPVFVY	+
128	GENDRLNHTY		+
129	GEGAYGKVF	+++
130	EEEHGKGREY		+
131	EEFETIERF		+
132	GELPAVRDL		+
133	AEHNFVAKA		++
134	SEYADTHYF		+++
135	NEIKVYITF	+
136	AEYKGRVTL		++
137	GELGGSVTI		++
138	SQAPAARAF		+

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168/196

SEQ ID NQ	Sequência	Expressão gênica
LMA	LLC
139	RENQVLGSGW		++
140	EYDLKWEF	+++
141	REYEYDLKWEF	+++
142	TEIFKEHNF	+++
143	YEYDLKWEF	+++
144	TEGKRYFTW		+
145	AEPLVGQRW		++
146	SESKTVVTY		++
147	KEVPRSYEL		+
148	REYNEYENI		+++
149	SEKETVAYF		++
150	EEVTDRSQL		+
151	EVDASIFKAW		+
152	AELLAKELY		++
153	KEFEQVPGHL		+
154	AEPGPVITW		++
155	NEFPVIVRL		+
156	FEVESLFQKY		+
157	VEIAEAIQL		+
158	GENEDNRIGL		++
159	GELLGRQSF		+
160	EEETILHFF		+
161	EEGDTLLHLF	+	+
162	DEAQARAAF	++
163	EEWMGLLEY	++
164	SEYSHLTRV	+
165	VELDLQRSV	+

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169/196

SEQ ID NQ	Sequência	Expressão gênica
LMA	LLC
166	NEVLASKY		+
167	KEIGAAVQAL		+
168	QEIQSLLTNW		+
169	EENGEVKEL		+
170	SENEQRRMF		+
171	SEDLAVHLY		++
172	VEDGLFHEF		+
173	KEYDFGTQL	+
174	TDKSFPNAY		+
175	HEIDGKALFL	+
176	AENAVSNLSF		++
177	QENMQIQSF		+
178	REYEHYWTEL		+
179	AEIKQTEEKY	+
180	EEPAFNVSY		+
181	GEIKEPLEI		+
182	AQNLSIIQY		++
183	GESQDSTTAL		++
184	RMPPFTQAF		+
185	SEGDNVESW		+
186	NEQKIVRF		+
187	SDAQRPSSF		+
188	YVDAGTPMY		+
189	VTEEPQRLFY		+++
190	HVDQDLTTY	++
191	ISEAGKDLLY	+	+
192	RSDPGGGGLAY	++

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170/196

SEQ ID NQ	Sequência	Expressão gênica
LMA	LLC
193	LTDSEKGNSY		++
194	YTDKKSIIY		+
195	YSDKEFAGSY		+
196	FTDIDGQVY		+
197	SLADVHIEV		+
198	KLLGYDVHV	+
199	AMPDSPAEV	+	+
200	VMLQINPKL		+
201	ILAAVETRL		+
202	MVALPMVLV		+
203	FLLPKVQSI		+
204	FLLPKVQSIQL		+
205	FLINTNSEL		+
206	SLMDLQERL		+
207	KLSDNILKL		+
208	KLNPQQAPLY		+
209	KTLPAMLGTGK		++
210	RMYSQLKTLQK		++
211	ATYNKQPMYR	+
212	LLWHWDTTQSLK		++
213	RVYNIYIRR	+
214	ATGAATPKK		+
215	KATGAATPK		+
216	RIKAPSRNTIQK		+
217	TTVPHVFSK		+
218	RVLTGVFTK		+
219	HSYSSPSTK		+

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171/196

SEQ ID NQ	Sequência	Expressão gênica
LMA	LLC
220	SISNLVFTY	+
221	LLNRHILAH		+
222	RYLDEINLL	+
223	RRMYPPPLI		+
224	VYEYVVERF		+
225	LPARFYQAL		+
226	YLNRHLHTW		++
227	APINKAGSFL		+
228	SPRITFPSL		+
229	SPLGSLARSSL		+
230	KPMKSVLVV		+
231	MPLSTIREV	+++
232	APRPAGSYL		+
233	SPRVYWLGL		++
234	SPKESENAL		+
235	SPSLPSRTL		+
236	RPSNKAPLL		+
237	SPWLHAPSL		+
238	SPRSWIQVQI		+++
239	APSKTSLIM		+
240	SPSLPNITL		+
241	APAPAEKTPV		+
242	SPFSFHHVL		+
243	LPKVQSIQL		+
244	MPSSDTTVTF		+
245	SPLSHHSQL		+
246	YPGWHSTTI	+

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172/196

SEQ ID NQ	Sequência	Expressão gênica
LMA	LLC
247	QPSPARAPAEL	+	+++
248	LPYDSKHQI		+
249	SPADHRGYASL	+
250	VPNLQTVSV		+
251	QPRLFTMDL		+
252	RPHIPISKL	+	+
253	RPFADLLGTAF		++
254	SPRNLQPQRAAL		++
255	YPGSDRIML		+
256	SPYKKLKEAL		+
257	KEFFFVKVF		+
258	EELFRDGVNW		++
259	EENTLVQNY		+
260	AEIGEGAYGKVF	+++
261	NEIEHIPVW		+
262	QENQAETHAW		+
263	REAGFQVKAY		+
264	SEDHSGSYW		+
265	QEVDASIFKAW		+
266	VDASIFKAW		+
267	KEKFPINGW		+
268	NEDKGTKAW		+
269	KELEDLNKW		+
270	AESEDLAVHL		++
271	AESEDLAVHLY		++
272	KEFELRSSW		+
273	AEIEIVKEEF		+

Petição 870190100586, de 08/10/2019, pág. 192/391

173/196

SEQ ID NQ	Sequência	Expressão gênica
LMA	LLC
274	GEAVTDHPDRLW		++
275	TENPLTKLL	++	+
276	EEEGNLLRSW		++
277	EEGNLLRSW		++

EXEMPLO 3

Imunogenicidade in vitro de peptídeos apresentados por MHC classe I [00378] Para obter informações sobre a imunogenicidade dos TUMAPs da presente invenção, os investigadores realizaram investigações usando um ensaio de priming in vitro de células T baseado em estimulações repetidas de células T CD8+ com células apresentadoras de antígenos artificiais (aCAAs) carregadas com complexos peptídeo/MHC e anticorpo anti-CD28. Assim, os inventores puderam demonstrar a imunogenicidade dos TUMAPs restritos por HLA- A*02:01, HLA-A*24:02, HLA-A*01:01, HLA-A*03:01, HLAB*07:02 ou HLA-B*44:02 da invenção, demonstrando que esses peptídeos são epítopos de células T contra os quais existem células T CD8+ precursoras em humanos (Tabela 10a e Tabela 10b).

Preparação in vitro de células T CD8+

[00379] Para realizar estimulações in vitro por células apresentadoras de antígenos artificiais carregadas com complexo peptídeo-MHC (pMHC) e anticorpo anti-CD28, os inventores primeiramente isolaram células T CD8+ de produtos frescos de leucaférese de HLA-A*02, HLA-A*24, HLA-A*01, HLA-A*03, HLA-B*07 ou HLA-B*44 usando seleção positiva com microesférulas de CD8 (Miltenyi Biotec, Bergisch Gladbach, Alemanha) de doadores saudáveis, obtidas da Clínica Universitária de Mannheim, Alemanha, após consentimento livre e esclarecido.

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[00380] As CMSPs e os linfócitos CD8+ isolados foram incubados por uma noite em um meio para células T (TCM, T-cell medium) que consistia em RPMI-Glutamax (Invitrogen, Karlsruhe, Alemanha) suplementado com 10% de soro humano AB termoinativado (PANBiotech, Aidenbach, Alemanha), penicilina 100 U/ml, estreptomicina 100 pg/ml (Cambrex, Colônia, Alemanha), piruvato de sódio 1 mM (CC Pro, Oberdorla, Alemanha) e gentamicina 20 pg/ml (Cambrex). Nesta etapa, também foram adicionados ao TCM 2,5 ng/ml de IL-7 (PromoCell, Heidelberg, Alemanha) e 10 U/ml de IL-2 (Novartis Pharma, Nuremberg, Alemanha).

[00381] A geração de esférulas revestidas por pMHC/anti-CD28, a estimulação de células Tea leitura foram realizadas em um sistema in vitro muito bem definido, no qual foram usadas 4 moléculas de pMHC diferentes por condição de estimulação e 8 moléculas de pMHC diferentes por condição de leitura.

[00382] A lgG2a de camundongo anti-CD28 humano purificada e co-estimulatória de Ab 9.3 (Jung et al., 1987)foi biotinilada quimicamente por sulfo-N-hidroxisuccinimidobiotina conforme recomendado pelo fabricante (Perbio, Bonn, Alemanha). Foram usadas esférulas que consistiam em partículas de poliestireno de 5,6 pm de diâmetro revestidas por estreptavidina (Bangs Laboratories, Illinois, EUA).

[00383] Os pMHCs usados para estimulações de controle positivo e controle negativo foram A*0201/MLA-001 (peptídeo ELAGIGILTV, SEQ ID N^Q 280 de Melan-A/MART-1 modificado) e A*0201/DDX5-001 (YLLPAIVHI de DDX5, SEQ ID N^Q 281), respectivamente.

[00384] Um total de 800.000 esférulas / 200 μΙ foram revestidas em placas de 96 cavidades na presença de 4 x 12,5 ng de complexos biotina-pMHC diferentes e lavados. Em seguida, 600 ng de anti-CD28 biotinilado foram adicionados até atingir o volume de 200 μΙ. As

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175/196 estimulações foram iniciadas em placas de 96 cavidades por incubação conjunta de 1 χ 10⁶ células T CD8+ com 2 χ 10⁵ esférulas revestidas lavadas em 200 μΙ TCM suplementado com IL-12 5 ng/ml (PromoCell) por 3 dias a 37Ό. Em seguida, metade do meio foi suplementado por TCM fresco suplementado com IL-2 80 U/ml. A incubação foi mantida por 4 dias a 37Ό, e o ciclo estimulatório foi realizado um total de três vezes. Para leitura do multímero pMHC com 8 moléculas diferentes de pMHC por condição, uma abordagem de codificação combinatória bidimensional foi usada conforme descrito anteriormente (Andersen et al., 2012) com pequenas modificações relacionadas ao acoplamento com 5 fluorocromos diferentes. Finalmente, foram realizadas análises multiméricas por coloração das células com um corante quase-infravermelho indicativo de vida ou morte (Invitrogen, Karlsruhe, Alemanha), clone SK1 de anticorpo contra CD8-FITC (BD, Heidelberg, Alemanha) e multímeros fluorescentes de pMHC. Para análise, foi usado um citômetro BD LSRII SORP equipado com lasers e filtros apropriados. As células específicas para peptídeos foram calculadas como porcentagem das células CD8+ totais. A avaliação da análise multimérica foi realizada pelo software FlowJo (Tree Star, Oregon, EUA). A ativação in vitro de linfócitos CD8+ específicos e positivos nos multímeros foi detectada por comparação com as estimulações de controles negativos. A imunogenicidade para um determinado antígeno foi detectada quando pelo menos uma cavidade estimulada in vitro avaliável de um doador saudável apresentava uma linhagem específica de células T CD8+ após estimulação in vitro (isto é a cavidade continha no mínimo 1% do multímero+ específico entre as células T CD8+, e a porcentagem de células multímero+ positivas era pelo menos 10x a mediana das simulações em controles negativos).

Imunogenicidade In vitro de peptídeos de leucemia linfocítica crônica,

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176/196 leucemia mieloide crônica e leucemia mieloide aquda

[00385] Para peptídeos de HLA classe I testados, a imunogenicidade in vitro pôde ser demonstrada pela geração de linhagens de células T específicas para os peptídeos. A Figura 9 mostra resultados exemplares de citometria de fluxo após coloração específica para multímeros TUMAP de 14 peptídeos da invenção mostrados na Figuras 2 a 9, junto com os controles negativos correspondentes. As Tabelas 10a e 11b resumem os resultados obtidos com os 63 peptídeos da invenção.

Tabela 10A: Imunogenicidade in vitro de peptídeos de HLA classe I da invenção

Exemplos de resultados de experimentos de imunogenicidade in vitro realizados pelo depositante com os peptídeos da invenção. <20%: +; 20% a 49%: ++; 50% a 69%= +++; > 70%: ++++

SEQ ID NQ	Sequência	Cavidades positivas [%]
278	YLDRKLLTL	++++
279	LYIDRPLPYL	++++

Tabela 10b: Imunogenicidade in vitro de peptídeos de HLA classe I da invenção

Exemplos de resultados de experimentos de imunogenicidade in vitro realizados pelo depositante com os peptídeos da invenção. <20%: +; 20% a 49%: ++; 50% a 69%= +++; > 70%: ++++

SEQ ID NQ	Sequência	Cavidades positivas [%]	HLA
1	LTEGHSGNYY		A*01
12	ATDIVDSQY	++	A*01
19	SLFEGIYTI	++++	A*02
22	ILHAQTLKI		A*02
24	KLGPVAVSI	+++	A*02
25	YLNEKSLQL		A*02

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177/196

SEQ ID NQ	Sequência	Cavidades positivas [%]	HLA
26	SLYVQQLKI	++	A*02
27	RLIAKEMNI		A*02
29	RIYDEILQSK		A*03
45	VVFPFPVNK		A*03
47	SVLDLSVHK		A*03
51	ASTTVLALK		A*03
53	KYIEYYLVL	+++	A*24
55	IFVARLYYF		A*24
57	RFPPTPPLF		A*24
68	LYQDRFDYL		A*24
73	TYPQLEGFKF		A*24
83	IPVSRPIL		B*07
84	SPKLQIAAM	++	B*07
87	FPAPILRAV		B*07
89	FPETVNNLL		B*07
96	KPKKAPKSPA		B*07
99	SPRAINNLVL		B*07
104	RPMTPTQIGPSL		B*07
122	KELPGVKKY	++++	B*44
123	EENPGKFLF	++	B*44
129	GEGAYGKVF	+++	B*44
133	AEHNFVAKA		B*44
134	SEYADTHYF	+++	B*44
136	AEYKGRVTL		B*44
137	GELGGSVTI	++++	B*44
139	RENQVLGSGW	+++	B*44
140	EYDLKWEF	++++	B*44
142	TEIFKEHNF	++	B*44

Petição 870190100586, de 08/10/2019, pág. 197/391

178/196

SEQ ID NQ	Sequência	Cavidades positivas [%]	HLA
143	YEYDLKWEF		B*44
145	AEPLVGQRW	++++	B*44
146	SESKTVVTY	+++	B*44
149	SEKETVAYF		B*44
154	AEPGPVITW	+++	B*44
158	GENEDNRIGL	++	B*44
162	DEAQARAAF		B*44
171	SEDLAVHLY	++++	B*44
176	AENAVSNLSF	++	B*44
182	AQNLSIIQY	++++	B*44
192	RSDPGGGGLAY		A*01
197	SLADVHIEV	++	A*02
207	KLSDNILKL	++	A*02
210	RMYSQLKTLQK		A*03
215	KATGAATPK	++	A*03
233	SPRVYWLGL	++++	B*07
238	SPRSWIQVQI		B*07
247	QPSPARAPAEL	++	B*07
253	RPFADLLGTAF	++++	B*07
254	SPRNLQPQRAAL		B*07
258	EELFRDGVNW		B*44
260	AEIGEGAYGKVF	++	B*44
270	AESEDLAVHL		B*44
271	AESEDLAVHLY		B*44
275	TENPLTKLL		B*44
276	EEEGNLLRSW	++	B*44
277	EEGNLLRSW	++	B*44

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179/196

EXEMPLO 4

Síntese de peptídeos

[00386] Todos os peptídeos foram sintetizados por técnicas padronizadas e bem estabelecidas de síntese de peptídeos em fase sólida usando a estratégia Fmoc. A identidade e a pureza de cada peptídeo foram determinadas por espectrometria de massa e RP-HPLC analítica. Os peptídeos foram obtidos na forma de liofilizados brancos a esbranquiçados com pureza superior a 50%. Preferivelmente, todos os TUMAPs são administrados como sais de trifluoracetato ou sais acetato, mas outras formas em sal também são possíveis.

EXEMPLO 5

Ensaios de ligação a MHC

[00387] Os peptídeos candidatos para terapias à base de células T de acordo com a presente invenção foram testados também para sua capacidade (afinidade) de ligação ao MHC. Os complexos individuais de peptídeo com MHC foram produzidos por troca de ligantes induzida por UV, na qual um peptídeo sensível a UV é clivado por irradiação UV e trocado pelo peptídeo de interesse a ser analisado. Entre os peptídeos candidatos, apenas aqueles capazes de se ligar eficazmente e estabilizar as moléculas de MHC receptivas a peptídeos podem impedir a dissociação dos complexos de MHC. Para determinar o rendimento da reação de troca, foi realizado um ELISA baseado na detecção da cadeia leve (p2m) de complexos de MHC estabilizados. De forma geral, o ensaio foi realizado conforme descrito por Rodenko et ai (Rodenko et ai., 2006).

[00388] Placas MAXISorp de 96 cavidades (NUNC) foram revestidas de um dia para outro com estreptavidina 2 pg/ml em PBS em temperatura ambiente, lavadas 4 vezes e bloqueadas por 1 ha

370 em BSA 2% contendo tampão bloqueador. Monômero s de HLAPetição 870190100586, de 08/10/2019, pág. 199/391

180/196

A*02:01/MLA-001 foram usados como padrões, cobrindo o intervalo de 15 a 500 ng/ml. Os monômeros peptídeo-MHC da reação de troca induzida por UV foram diluídos 100 vezes em um tampão bloqueador. As amostras foram incubadas por 1 ha 37^QC, lavadas 4 vezes, incubadas com HRP 2 pg/ml conjugado com anti-p2m por 1 ha 37^QC, lavadas novamente e detectadas com solução de TMB, que foi interrompida com NH2SO4. A absorbância foi medida a 450 nm. Os peptídeos candidatos que mostram altas taxas de trocas (preferivelmente maior que 50% e, mais preferivelmente, maior que 75%) são geralmente preferidos para geração e produção de anticorpos ou fragmentos de anticorpos e/ou de receptores de células T ou fragmentos dos mesmos, pois apresentam avidez suficiente pelas moléculas de MHC e impedem a dissociação dos complexos de MHC. Tabela 11: Escores de ligação de MHC classe I. A ligação de peptídeos restritos por HLA classe I a HLA-A*01:01 foi determinada em função do rendimento de troca de peptídeos. >10%: +; >20%: ++; >50%: +++; >75%: ++++

SEQ ID NQ	Sequência	Troca de peptídeo
1	LTEGHSGNYY	+++
3	YINPAKLTPY	++
4	ALDQNKMHY	+++
5	GTDVLSTRY	+++
6	VTEGVAQTSFY	++++
7	FMDSESFYY
8	STDSAGSSY	++++
9	YSHPQYSSY	++
10	YSDIGHLL	++
11	AAADHHSLY	+++
12	ATDIVDSQY	+++
13	ITDIHIKY	++++

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181/196

SEQ ID NQ	Sequência	Troca de peptídeo
14	TFDLTVVSY	++
15	SVADIRNAY	++
16	WIGDKSFEY	++
188	YVDAGTPMY	+++
189	VTEEPQRLFY	++++
190	HVDQDLTTY	++
191	ISEAGKDLLY	+++
192	RSDPGGGGLAY	+++
193	LTDSEKGNSY	+++
194	YTDKKSIIY	+++
195	YSDKEFAGSY	++++
196	FTDIDGQVY	+++

Tabela 12: Escores de ligação de MHC classe I. A ligação de peptídeos restritos por HLA classe I a HLA-A*02:01 foi determinada em função do rendimento de troca de peptídeos. >10%: +; >20%: ++; >50%: +++; >75%: ++++

SEQ ID NQ	Sequência	Troca de peptídeo
17	KAYNRVIFV	+++
18	YLLPSVVLL	++++
19	SLFEGIYTI	++++
20	FSLEDLVRI	++
21	FLFDKLLLI	++++
22	ILHAQTLKI	+++
23	FAFSGVLRA	++
24	KLGPVAVSI	++++
25	YLNEKSLQL	++++
26	SLYVQQLKI	++++

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182/196

SEQ ID NQ	Sequência	Troca de peptideo
27	RLIAKEMNI	++++
197	SLADVHIEV	++++
198	KLLGYDVHV	+++
199	AMPDSPAEV	++++
200	VMLQINPKL	+++
201	ILAAVETRL	+++
203	FLLPKVQSI	++++
204	FLLPKVQSIQL	+++
205	FLINTNSEL	++++
206	SLMDLQERL	+++
207	KLSDNILKL	++++

Tabela 13: Escores de ligação de MHC classe I. A ligação de peptídeos restritos por HLA classe I a HLA-A*03:01 foi determinada em função do rendimento de troca de peptídeos. >10%: +; >20%: ++; >50%: +++; >75%: ++++

Seq ID No	Sequência	Troca de peptideo
28	VILESIFLK	++
29	RIYDEILQSK	++
30	RTYGFVLTF	++
32	KTSNIVKIK	++
33	SVFEGDSIVLK	++
34	SVYSETSNMDK	+++
35	ATKSPAKPK	+++
36	KAKAAAKPK	++
37	KAKKPAGAAK	+++
38	KARKSAGAAK	+++
40	RSKEYIRKK

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183/196

Seq ID No	Sequência	Troca de peptídeo
41	SVAHLLSKY	++
42	SVSSSTHFTR	++
43	KLMETSMGF	++
44	KVYDPVSEY	++
45	VVFPFPVNK	+++
46	RVFPSPMRI	++
47	SVLDLSVHK	++
48	RIKPPGPTAVPK	+++
49	GLLEEALFY	++
51	ASTTVLALK	++
52	KAFNQSSTLTK	+++
208	KLNPQQAPLY	++
209	KTLPAMLGTGK	++
210	RMYSQLKTLQK	+++
211	ATYNKQPMYR	+++
212	LLWHWDTTQSLK
213	RVYNIYIRR	++
214	ATGAATPKK	+++
215	KATGAATPK	++
216	RIKAPSRNTIQK	++
217	TTVPHVFSK	++
218	RVLTGVFTK	++
219	HSYSSPSTK	+++
220	SISNLVFTY	++
221	LLNRHILAH	+++

Tabela 14: Escores de ligação de MHC classe I. A ligação de peptídeos restritos por HLA classe I a HLA-A*24:02 foi determinada em função do rendimento de troca de peptídeos. >10%: +; >20%: ++;

Petição 870190100586, de 08/10/2019, pág. 203/391

184/196 >50%: +++; >75%: ++++

Seq ID No	Sequência	Troca de peptídeo
53	KYIEYYLVL	++++
55	IFVARLYYF	++++
56	KYSSGFRNI	+++
57	RFPPTPPLF	++++
58	KYLADLPTL	++++
61	IFKEHNFSF	++++
62	YYLSHLERI	++++
63	IYFSNTHFF	+++
64	SFQSKATVF	++
67	VFLPSEGFNF	+++
68	LYQDRFDYL	++++
69	EYNTIKDKF	+++
70	LYSDIGHLL	+++
71	RYLGKNWSF	++++
72	TYVENLRLL	+++
73	TYPQLEGFKF	++++
74	SYADNILSF	++++
75	RFYLLTEHF	+++
222	RYLDEINLL	+++

Tabela 15: Escores de ligação de MHC classe I. A ligação de peptídeos restritos por HLA classe I a HLA-B*07:02 foi determinada em função do rendimento de troca de peptídeos. >10%: +; >20%: ++; >50%: +++; >75%: ++++

Seq ID No	Sequência	Troca de peptídeo
77	RPNGNSLFTSA	+++
78	RPRGLALVL	+++
79	SPVPSHWMVA	+++

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185/196

Seq ID No	Sequência	Troca de peptídeo
80	KPLFKVSTF	++
81	SESPWLHAPSL	+++
82	APFGFLGMQSL	+++
83	IPVSRPIL	+++
84	SPKLQIAAM	+++
85	IPVSHPVL	++
86	IPASHPVL	++
87	FPAPILRAV	+++
88	MPDPHLYHQM	++
89	FPETVNNLL	++
90	KPKAAKPKA	++
91	KPKAAKPKAA	++
92	KAKKPAGAA	++
93	KARKSAGAA	+++
94	KPKAAKPKKAAA	++
95	KPKAAKPKTA	++
96	KPKKAPKSPA	+++
97	LPFGKIPIL	++
98	YPIALTRAEM	+++
99	SPRAINNLVL	++++
100	YPYQERVFL	++
101	NPRYPNYMF	+++
102	LPLSMEAKI	++
103	IPANTEKASF	++
104	RPMTPTQIGPSL	+++
105	NPLTKLLAI	+++
106	KAFKWFSAL	++
225	LPARFYQAL	++++

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186/196

Seq ID No	Sequência	Troca de peptídeo
226	YLNRHLHTW	++
227	APINKAGSFL	++++
228	SPRITFPSL	++++
229	SPLGSLARSSL	++++
230	KPMKSVLVV	+++
231	MPLSTIREV	++
232	APRPAGSYL	+++
233	SPRVYWLGL	+++
234	SPKESENAL	++
235	SPSLPSRTL	++
236	RPSNKAPLL	+++
237	SPWLHAPSL	++
238	SPRSWIQVQI	+++
239	APSKTSLIM	++
240	SPSLPNITL	+++
241	APAPAEKTPV	+++
242	SPFSFHHVL	++
243	LPKVQSIQL	++
244	MPSSDTTVTF	+++
245	SPLSHHSQL	++
246	YPGWHSTTI	++
247	QPSPARAPAEL	++
248	LPYDSKHQI	++
249	SPADHRGYASL	++
250	VPNLQTVSV	++
251	QPRLFTMDL	+++
252	RPHIPISKL	++
253	RPFADLLGTAF	+++

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187/196

Seq ID No	Sequência	Troca de peptídeo
254	SPRNLQPQRAAL	+++
255	YPGSDRIML	++

Tabela 16: Escores de ligação de MHC classe I. A ligação de peptídeos restritos por HLA classe I a HLA-B*44:02 foi medida em função do rendimento de troca de peptídeos. >10%: +; >20%: ++; >50%: +++; >75%: ++++

Seq ID No	Sequência	Troca de peptídeo
122	KELPGVKKY	++
123	EENPGKFLF	+++
124	SESLPKEAF	++
125	SESTFDRTF	+++
126	EENKPGIVY	++
127	TEYPVFVY
128	GENDRLNHTY	++
129	GEGAYGKVF	++++
130	EEEHGKGREY	++
131	EEFETIERF	++
132	GELPAVRDL	++
133	AEHNFVAKA	+++
134	SEYADTHYF	+++
135	NEIKVYITF	+++
136	AEYKGRVTL	++++
137	GELGGSVTI	+++
138	SQAPAARAF	++
139	RENQVLGSGW	+++
140	EYDLKWEF	++
141	REYEYDLKWEF	+++

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188/196

Seq ID No	Sequência	Troca de peptídeo
142	TEIFKEHNF	++
143	YEYDLKWEF	+++
144	TEGKRYFTW	+++
145	AEPLVGQRW	+++
146	SESKTVVTY	+++
147	KEVPRSYEL	++
148	REYNEYENI	++
149	SEKETVAYF	+++
150	EEVTDRSQL	++
151	EVDASIFKAW	++
152	AELLAKELY	++
153	KEFEQVPGHL	++
154	AEPGPVITW	+++
155	NEFPVIVRL	+++
156	FEVESLFQKY	+++
157	VEIAEAIQL	+++
158	GENEDNRIGL	++
159	GELLGRQSF	+++
160	EEETILHFF	++
161	EEGDTLLHLF	+++
162	DEAQARAAF	++
163	EEWMGLLEY	++++
164	SEYSHLTRV	++
165	VELDLQRSV	++
166	NEVLASKY
167	KEIGAAVQAL	+++
168	QEIQSLLTNW	+++
169	EENGEVKEL	++

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189/196

Seq ID No	Sequência	Troca de peptídeo
170	SENEQRRMF	+++
171	SEDLAVHLY	++
172	VEDGLFHEF	+++
173	KEYDFGTQL	++
174	TDKSFPNAY
175	HEIDGKALFL	++
176	AENAVSNLSF	++
177	QENMQIQSF	+++
178	REYEHYWTEL	+++
179	AEIKQTEEKY	++
180	EEPAFNVSY	++
181	GEIKEPLEI	++
182	AQNLSIIQY	++
183	GESQDSTTAL	++
184	RMPPFTQAF	++
185	SEGDNVESW	+++
186	NEQKIVRF
187	SDAQRPSSF
257	KEFFFVKVF	+++
258	EELFRDGVNW	+++
259	EENTLVQNY	++
260	AEIGEGAYGKVF	+++
261	NEIEHIPVW	+++
262	QENQAETHAW	+++
263	REAGFQVKAY	+++
264	SEDHSGSYW	+++
265	QEVDASIFKAW	+++
266	VDASIFKAW	++

Petição 870190100586, de 08/10/2019, pág. 209/391

190/196

Seq ID No	Sequência	Troca de peptideo
267	KEKFPINGW	+++
268	NEDKGTKAW	++
269	KELEDLNKW	+++
270	AESEDLAVHL	++
271	AESEDLAVHLY	++
272	KEFELRSSW	+++
273	AEIEIVKEEF	++
274	GEAVTDHPDRLW	+++
275	TENPLTKLL	++++
276	EEEGNLLRSW	+++
277	EEGNLLRSW	+++

EXEMPLO 6

Estabilidade dos peptídeos ligados ao MHC classe I

[00389] A estabilidade da ligação de peptídeos a MHC de HLAB*08:01 foi ensaiada pela técnica ImmunAware (Copenhagen, Dinamarca). Os dados foram obtidos a partir de um ensaio baseado em proximidade, que foi forma homogênea e em tempo real para medir a dissociação de peptídeos de moléculas de HLA classe I. Primeiramente HLA-B*08:01 e b2m humanos recombinantes foram expressos em E. coli e purificados em uma série de etapas baseadas em cromatografia líquida (Ferre et al., 2003; Ostergaard et al., 2001). Em seguida, determinou-se a estabilidade de um complexo de peptideo com MHC (pMHC) medindo-se a quantidade de b2m associada a cadeias pesadas de MHC por um intervalo de tempo a 370 (Harndahl et al., 2012). A estabilidade dos pM HC (expressa como meia-vida do b2m associado à respectiva cadeia pesada) foi calculada ajustando-se os dados a uma equação de dissociação monofásica.

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[00390] A estabilidade do pMHC foi medida em três experimentos independentes com os peptídeos em questão. Constatou-se que o HLA-B*08:01 a ligação pode ser de fraca (+) a muito intensa (++++). A meia-vida média (ti/₂) é mostrada na Tabela 17.

Tabela 17: Meia-vida média (ti/₂) baseada em três medições individuais. ti/₂ > 2 h: +; ti/₂ > 4 h: ++; ti/₂ > 6 h: +++; ti/₂ > 10 h: ++++

SEQ ID NQ	Sequência	Meia-vida média (ti/2)
107	QAAQRTAL	++
108	ILAIRQNAL	++
109	LGHVRYVL	+
110	FGLARIYSF	+
112	APLLRHWEL	+
113	DANSRTSQL	+++
114	HNALRILTF	++
115	ELYQRIYAF	++
116	TLKIRAEVL	+++
117	YIKTAKKL	++
118	FEKEKKESL	+++
119	DLRTKEVVF	++
120	VPPKKHLL	+
121	RPKKVNTL	+

Lista de referências

Al, Qudaihi G. et al., Hematol.Oncol Stem Cell Ther. 3 (2010): 24-33

Allan, E. K. et al., Leukemia 25 (2011): 985-994

Allison, J. P. et al., Science 270 (1995): 932-933

Andersen, R. S. et al., Nat.Protoc. 7 (2012): 891-902

Appay, V. et al., Eur.J Immunol. 36 (2006): 1805-1814

Banchereau, J. et al., Cell 106 (2001): 271-274

Beatty, G. et al., J Immunol 166 (2001): 2276-2282

Petição 870190100586, de 08/10/2019, pág. 211/391

192/196

Beggs, J. D., Nature 275 (1978): 104-109

Bhatia, R. et al., Blood 101 (2003): 4701-4707

Bocchia, M. et al., Lancet 365 (2005): 657-662

Boulter, J. M. et al., Protein Eng 16 (2003): 707-711

Braumuller, H. et al., Nature (2013)

Bray, F. et al., Int J Cancer 132 (2013): 1133-1145

Brossart, P. et al., Blood 90 (1997): 1594-1599

Bruckdorfer, T. et al., Curr.Pharm.Biotechnol. 5 (2004): 29-43

Byrd, J. C. et al., N.Engl.J Med. 369 (2013): 32-42

Carballido, E. et al., Cancer Control 19 (2012): 54-67

Card, K. F. et al., Cancer Immunol Immunother. 53 (2004): 345-357

Cathcart, K. et al., Blood 103 (2004): 1037-1042

Cohen, C. J. et al., J Mol Recognit. 16 (2003a): 324-332

Cohen, C. J. et al., J Immunol 170 (2003b): 4349-4361

Cohen, S. N. et al., Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A 69 (1972): 2110-2114

Coligan, J. E. et al., Current Protocols in Protein Science (1995)

Colombetti, S. et al., J Immunol. 176 (2006): 2730-2738

Corbin, A. S. et al., J Clin Invest 121 (2011): 396-409

Cortes, J. E. et al., J Clin Oncol 30 (2012): 3486-3492

Counter, C. M. et al., Blood 85 (1995): 2315-2320

Dao, T. et al., Sci.Transi.Med 5 (2013): 176ra33

Dengjel, J. et al., Clin Cancer Res 12 (2006): 4163-4170

Denkberg, G. et al., J Immunol 171 (2003): 2197-2207

Eichhorst, B. F. et al., Blood 107 (2006): 885-891

Estey, E. H., Am.J Hematol. 89 (2014): 1063-1081

Falk, K. et al., Nature 351 (1991): 290-296

Ferlay et al., GLOBOCAN 2012 v1.0, Cancer Incidence and Mortality Worldwide: IARC CancerBase No.11 [Internet], (2013), http://qlobocan.iarc.fr

Ferre, H. et al., Protein Sci. 12 (2003): 551-559

Petição 870190100586, de 08/10/2019, pág. 212/391

193/196

Follenzi, A. et al., Nat Genet. 25 (2000): 217-222

Fong, L. et al., Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A 98 (2001): 8809-8814

Furman, R. R. et al., N.Engl.J Med. 370 (2014): 997-1007

Gabrilovich, D. I. et al., Nat Med. 2 (1996): 1096-1103

Gandhi, V. et al., Clin Cancer Res 20 (2014): 1735-1740

Gattinoni, L. et al., Nat Rev.Immunol 6 (2006): 383-393

Giannopoulos, K. et al., Leukemia 24 (2010): 798-805

Giannopoulos, K. et al., Int.J Oncol 29 (2006): 95-103

Gnjatic, S. et al., Proc Natl.Acad.Sci.U.S.A 100 (2003): 8862-8867

Godkin, A. et al., Int.Immunol 9 (1997): 905-911

Goede, V. et al., N.Engl.J Med. 370 (2014): 1101-1110

Gragert, L. et al., Hum.Immunol. 74 (2013): 1313-1320

Granziero, L. et al., Blood 97 (2001): 2777-2783

Green, M. R. et al., Molecular Cloning, A Laboratory Manual 4th (2012)

Greenfield, E. A., Antibodies: A Laboratory Manual 2nd (2014)

Greiner, J. et al., Exp.Hematol. 30 (2002): 1029-1035

Gunawardana, C. et al., Br.J Haematol. 142 (2008): 606-609

Gustafsson, C. et al., Trends Biotechnol. 22 (2004): 346-353

Hallek, Michael et al., ASH Annual Meeting Abstracts 112 (2008): 325

Harig, S. et al., Blood 98 (2001): 2999-3005

Harndahl, M. et al., Eur.J Immunol. 42 (2012): 1405-1416

Hoglund, M. et al., Ann.Hematol. 94 Suppl 2 (2015): S241-S247

Horowitz, Μ. M. et al., Bone Marrow Transplant. 17 Suppl 3 (1996): S5-S6

Huang, X. et al., Cancer 118 (2012): 3123-3127

Hus, I. et al., Oncol Rep. 20 (2008): 443-451

Hwang, M. L. et al., J Immunol. 179 (2007): 5829-5838

Hander, M. et al., Leuk.Lymphoma 55 (2014): 934-937

Itonaga, H. et al., Int.J Hematol. 95 (2012): 209-213

Jabbour, E. et al., Am.J Hematol. 91 (2016): 252-265

Petição 870190100586, de 08/10/2019, pág. 213/391

194/196

Johnson, J. R. et al., Clin Cancer Res 9 (2003): 1972-1979

Jung, G. et al., Proc Natl Acad Sci U S A 84 (1987): 4611-4615

Kalos, M. et al., Sci.Transi.Med. 3 (2011): 95ra73

Kantarjian, H. et al., N.Engl.J Med 362 (2010): 2260-2270

Kantarjian, Η. M. et al., J Clin Oncol 31 (2013): 3600-3604

Keilholz, U. et al., Blood 113 (2009): 6541-6548

Khorashad, J. S. et al., Blood 121 (2013): 489-498

Kibbe, A. H., Handbook of Pharmaceutical Excipients rd (2000)

Krackhardt, A. M. et al., Blood 100 (2002): 2123-2131

Krieg, A. M., Nat Rev.Drug Discov. 5 (2006): 471-484

Kronenberger, K. et al., J Immunother. 31 (2008): 723-730

Kuball, J. et al., Blood 109 (2007): 2331-2338

Kujawski, L. A. et al., Cytokine Growth Factor Rev 18 (2007): 459-471

Liddy, N. et al., Nat Med. 18 (2012): 980-987

Ljunggren, H. G. et al., J Exp.Med. 162 (1985): 1745-1759 Longenecker, B. M. et al., Ann N.Y.Acad.Sci. 690 (1993): 276-291

Lugo, T. G. et al., Science 247 (1990): 1079-1082

Lukas, T. J. et al., Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A 78 (1981): 2791-2795 Lundblad, R. L., Chemical Reagents for Protein Modification 3rd (2004) Mahon, F. X. etal., Lancet Oncol 11 (2010): 1029-1035

Maus, Μ. V. et al., Blood 123 (2014): 2625-2635

Mayr, C. et al., Exp.Hematol. 34 (2006): 44-53

Mayr, C. et al., Blood 105 (2005): 1566-1573

Meziere, C. et al., J Immunol 159 (1997): 3230-3237

Morgan, R. A. et al., Science 314 (2006): 126-129

Mortara, L. et al., Clin Cancer Res. 12 (2006): 3435-3443

Muller, M. R. et al., Blood 103 (2004): 1763-1769

Mumberg, D. et al., Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A 96 (1999): 8633-8638

National Cancer Institute, (5-6-2015), www.cancer.gov

O'Brien, S. et al., Lancet Oncol 15 (2014): 48-58

Petição 870190100586, de 08/10/2019, pág. 214/391

195/196

O'Brien, S. G. et al., N.Engl.J Med 348 (2003): 994-1004

Ostergaard, Pedersen L. et al., Eur.J Immunol. 31 (2001): 2986-2996

Palma, M. et al., Cancer Immunol Immunother. 57 (2008): 1705-1710

Parikh, S. A. et al., Blood 118 (2011): 2062-2068

Piebanski, M. et al., Eur.J Immunol 25 (1995): 1783-1787

Porta, C. et al., Virology 202 (1994): 949-955

Porter, D. L. et al., N.Engl.J Med. 365 (2011): 725-733

Radich, J., Semin.Hematol. 47 (2010): 354-361

Rammensee, H. et al., Immunogenetics 50 (1999): 213-219

Rezvani, K. et al., Blood 111 (2008): 236-242

Richards, S. et al., J Natl.Cancer Inst. 91 (1999): 861-868

Rini, B. I. et al., Cancer 107 (2006): 67-74

Robak, T. et al., Expert.Opin.Biol.Ther 14 (2014): 651-661

Rock, K. L. et al., Science 249 (1990): 918-921

Rodenko, B. et al., Nat Protoc. 1 (2006): 1120-1132

Ross, D. M. et al., Blood 122 (2013): 515-522

Saglio, G. et al., N.Engl.J Med 362 (2010): 2251-2259

Saiki, R. K. et al., Science 239 (1988): 487-491

Schetelig, J. et al., J Clin Oncol 26 (2008): 5094-5100

Schmidt, S., Memo. 9 (2016): 157-162

Schmidt, S. M. et al., Cancer Res 64 (2004): 1164-1170

Schmitt, T. M. et al., Hum.Gene Ther. 20 (2009): 1240-1248

Scholten, K. B. et al., Clin Immunol. 119 (2006): 135-145

Seeger, F. H. et al., Immunogenetics 49 (1999): 571-576

Sherman, F. et al., Laboratory Course Manual for Methods in Yeast Genetics (1986)

Showel, Μ. M. et al., FIOOOPrime.Rep. 6 (2014): 96

Siegel, S. et al., Blood 102 (2003): 4416-4423

Silver, R. T. et al., Blood 94 (1999): 1517-1536

Singh-Jasuja, H. etal., Cancer Immunol.Immunother. 53 (2004): 187-195

Petição 870190100586, de 08/10/2019, pág. 215/391

196/196

Smahel, M., Cancer Immunol.Immunother. 60 (2011): 1655-1668

Small, E. J. et al., J Clin Oncol. 24 (2006): 3089-3094

Soverini, S. et al., Blood 118 (2011): 1208-1215

Spaner, D. E. et al., Cancer Immunol Immunother. 54 (2005): 635-646

Teufel, R. et al., Cell Mol Life Sci. 62 (2005): 1755-1762

Tran, E. et al., Science 344 (2014): 641-645

Walter, S. et al., J Immunol 171 (2003): 4974-4978

Walter, S. et al., Nat Med. 18 (2012): 1254-1261

Wierda, W. G. et al., Blood 118 (2011): 5126-5129

Willcox, B. E. et al., Protein Sci. 8 (1999): 2418-2423

Zaremba, S. et al., Cancer Res. 57 (1997): 4570-4577

Zheng, Y. et al., Clin Biochem. 44 (2011): 1405-1411

Zufferey, R. et al., J Virol. 73 (1999): 2886-2892

Claims (32)

1. REIVINDICAÇÕES

   1. Peptideo, caracterizado pelo fato de que compreende uma sequência de aminoácidos selecionada do grupo formado por SEQ ID N^Q1 a SEQ ID N^Q 279 e sequências variantes da mesma com pelo menos 88% de homologia com SEQ ID N^Q1 a SEQ ID N^Q 279, em que as referidas variantes se ligam a moléculas do complexo principal de histocompatibilidade (MHC) e/ou induzem reação cruzada de células T com o referido peptideo variante, e um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo, sendo que o referido peptideo não é um polipeptídeo completo.
2. 2. Peptideo, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o referido peptideo possui capacidade de se ligar a uma molécula de MHC classe I ou II, sendo que tal peptideo pode, quando ligado ao referido MHC, ser reconhecido por células T CD4 e/ou CD8.
3. 3. Peptideo ou variante do mesmo, de acordo com a reivindicação 1 ou 2, caracterizado pelo fato de que a sequência de aminoácidos do mesmo compreende um segmento contínuo de aminoácidos de acordo com qualquer elemento de SEQ ID N^Q1 a SEQ ID N^Q 279.
4. 4. Peptideo ou variante do mesmo, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 3, caracterizado pelo fato de que o referido peptideo ou variante do mesmo possui comprimento total de 8 a 100, preferivelmente de 8 a 30, mais preferivelmente de 8 a 16 aminoácidos e, mais preferido de todos, onde o peptideo consiste ou consiste essencialmente em uma sequência de aminoácidos de acordo com qualquer uma das SEQ ID N^Q1 a SEQ ID N^Q 279 e, preferivelmente, uma sequência de aminoácidos de acordo com qualquer uma das SEQ ID N^Q1 a SEQ ID N^Q187.
5. 5. Peptideo ou variante do mesmo, de acordo com

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   2/9 qualquer uma das reivindicações 1 a 4, caracterizado pelo fato de que o peptídeo é modificado e/ou inclui ligações não peptídicas.
6. 6. Peptídeo ou variante do mesmo, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 5, caracterizado pelo fato de que o referido peptídeo é parte de uma proteína de fusão, em especial uma proteína que contém aminoácidos N-terminais da cadeia invariante (li) associada ao antígeno HLA-DR.
7. 7. Anticorpo, em particular um anticorpo solúvel ou ligado a membrana, preferivelmente um anticorpo monoclonal ou fragmento do mesmo, caracterizado pelo fato de que reconhece especificamente o peptídeo ou variante do mesmo, como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 5, preferivelmente o peptídeo ou variante do mesmo, como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 5 quando ligado a uma molécula de MHC.
8. 8. Receptor de célula T, preferivelmente solúvel ou ligado à membrana, ou um fragmento do mesmo que reaja com um ligante de HLA, caracterizado pelo fato de que o referido ligante é o peptídeo ou variante do mesmo, como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 5, preferivelmente o peptídeo ou variante do mesmo, como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 5 quando ligado a uma molécula de MHC.
9. 9. Receptor de célula T, de acordo com a reivindicação 8, caracterizado pelo fato de que a referida sequência ligante de aminoácidos é pelo menos 88% idêntica a qualquer uma das sequências SEQ ID N^Q1 a SEQ ID N^Q 279 ou onde a referida sequência ligante de aminoácidos consiste em qualquer uma das sequências SEQ ID N^Q 1 a SEQ ID N^Q 279.
10. 10. Receptor de célula T, de acordo com a reivindicação 8 ou 9, caracterizado pelo fato de que o referido receptor de células T é fornecido como molécula solúvel e, opcionalmente, realiza outra

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    3/9 função efetora como um domínio de imunoestimulação ou uma toxina.
11. 11. Aptâmero, caracterizado pelo fato de que reconhece especificamente o peptídeo ou variante do mesmo, como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 5, preferivelmente o peptídeo ou variante do mesmo, como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 5 ligado a uma molécula de MHC.
12. 12. Ácido nucleico, caracterizado pelo fato de que codifica um peptídeo ou uma variante do mesmo, como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 5, um anticorpo ou fragmento do mesmo, como definido na reivindicação 7 ou um receptor de célula T ou fragmento do mesmo, como definido na reivindicação 8 ou 9, ligado opcionalmente a uma sequência promotora heteróloga ou a um vetor de expressão que expressa o referido ácido nucleico.
13. 13. Célula hospedeira recombinante, caracterizada pelo fato de que compreende o peptídeo, como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 6, o anticorpo ou fragmento do mesmo, como definido na reivindicação 7, o receptor de célula T ou fragmento do mesmo, como definido na reivindicação 8 ou 9 ou o ácido nucleico ou o vetor de expressão, como definido na reivindicação 12, em que a referida célula hospedeira é selecionada preferivelmente entre uma célula apresentadora de antígeno, tal como uma célula dendrítica, uma célula T ou uma célula NK.
14. 14. Método in vitro de produção de linfócitos T ativados, caracterizado pelo fato de que compreende colocar células T em contato in vitro com moléculas de MHC classe I ou II humanas expressas na superfície de células apresentadoras de antígeno adequadas ou uma estrutura que mimetiza uma célula apresentadora de antígeno por um período suficientemente longo para ativar as referidas células T de forma específica para o antígeno, sendo que tal antígeno é o peptídeo, como definido em qualquer uma das

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    4/9 reivindicações 1 a 4.
15. 15. LinfócitoT ativado produzido pelo método, como definido na reivindicação 14, caracterizado pelo fato de que reconhece seletivamente uma célula que apresenta um polipeptídeo, que compreende uma das sequências de aminoácidos, como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 4.
16. 16. Composição farmacêutica, caracterizada pelo fato de que compreende pelo menos um ingrediente ativo selecionado do grupo que consiste no peptídeo, como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 6, no anticorpo ou fragmento do mesmo, como definido na reivindicação 7, no receptor de célula T ou fragmento do mesmo, como definido na reivindicação 8 ou 9, no aptâmero, como definido na reivindicação 11, no ácido nucleico ou vetor de expressão, como definido na reivindicação 12, na célula hospedeira, como definida na reivindicação 13 ou no linfócito T ativado, como definido na reivindicação 15 ou um ingrediente ativo conjugado ou marcado e um veículo farmaceuticamente aceitável e, opcionalmente, excipientes e/ou estabilizantes farmaceuticamente aceitáveis.
17. 17. Método de produção de um peptídeo ou variante do mesmo, como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 6, do anticorpo ou fragmento do mesmo, como definido na reivindicação 7 ou do receptor de célula T ou fragmento do mesmo, como definido na reivindicação 8 ou 9, caracterizado pelo fato de que compreende a cultura da célula hospedeira, como definida na reivindicação 13 e o isolamento do peptídeo ou variante do mesmo, do anticorpo ou fragmento do mesmo ou do receptor de célula T ou fragmento do mesmo da referida célula hospedeira e/ou de seu meio de cultura.
18. 18. Peptídeo, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 6, anticorpo ou fragmento do mesmo, de acordo com a reivindicação 7, receptor de célula T ou fragmento do mesmo,

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    5/9 de acordo com a reivindicação 8 ou 9, aptâmero, de acordo com a reivindicação 11, ácido nucleico ou vetor de expressão, de acordo com a reivindicação 12, célula hospedeira, de acordo com a reivindicação 13 ou linfócitoT ativado, de acordo com a reivindicação 15, caracterizados pelo fato de que são para uso em medicina.
19. 19. Método para matar células-alvo em um paciente, no qual as células-alvo apresentam um polipeptídeo, caracterizado pelo fato de que compreende uma das sequências de aminoácidos apresentadas em qualquer uma das reivindicações 1 a 4, sendo que o método compreende administração ao paciente de um número eficaz de células T ativadas, como definido na reivindicação 15.
20. 20. Peptídeo, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 6, anticorpo ou fragmento do mesmo, de acordo com a reivindicação 7, receptor de célula T ou fragmento do mesmo, de acordo com a reivindicação 8 ou 9, aptâmero, de acordo com a reivindicação 11, ácido nucleico ou vetor de expressão, de acordo com a reivindicação 12, célula hospedeira, de acordo com a reivindicação 13 ou linfócitoT ativado, de acordo com a reivindicação 15, caracterizados pelo fato de que são para uso no diagnóstico e/ou tratamento do câncer ou para uso na fabricação de um medicamento anticâncer.
21. 21. Uso, de acordo com a reivindicação 20, caracterizado pelo fato de que o referido câncer é selecionado do grupo formado por leucemia linfocítica crônica (LLC), leucemia mieloide aguda (LMA), leucemia mieloide crônica (LMC) e outras neoplasias linfoides (por exemplo linfoma não Hodgkin, distúrbios linfoproliferativos póstransplante (DLPT); outras neoplasias mieloides (por exemplo mielofibrose primária, trombocitopenia essencial, policitemia vera); e outras neoplasias como carcinoma hepatocelular, carcinoma colorretal, glioblastoma, câncer gástrico, câncer de esôfago, câncer de pulmão

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    6/9 de células não pequenas, câncer de pulmão de pequenas células, câncer de pâncreas, carcinoma de células renais, câncer de próstata, melanoma, câncer de mama, câncer da vesícula e das vias biliares, câncer de bexiga, câncer do útero, carcinoma de células escamosas de cabeça e pescoço, mesotelioma e outros tumores que apresentam sobrexpressão de uma proteína da qual um peptídeo SEQ ID N^Q1 a SEQ ID N^Q 279 é derivado.
22. 22. Kit, caracterizado pelo fato de que compreende:

    (a) um recipiente que compreende uma composição farmacêutica que contém o(s) peptídeo(s), como definido(s) em qualquer uma das reivindicações 1 a 6, o anticorpo ou fragmento do mesmo, como definido na reivindicação 7, o receptor de célula T ou fragmento do mesmo, como definido na reivindicação 8 ou 9, o aptâmero, como definido na reivindicação 11, o ácido nucleico ou vetor de expressão, como definido na reivindicação 12, a célula hospedeira, como definida na reivindicação 13 ou o linfócitoT ativado, como definido na reivindicação 15 em solução ou em forma liofilizada.

    (b) opcionalmente, um segundo recipiente contendo um diluente ou solução para reconstituição de uma formulação liofilizada;

    (c) opcionalmente, pelo menos mais um peptídeo selecionado do grupo formado por SEQ ID N^Q1 a SEQ ID N^Q 279; e (d) opcionalmente, instruções de (i) uso da solução ou (ii) reconstituição e/ou uso da formulação liofilizada.
23. 23. Kit, de acordo com a reivindicação 22, caracterizado pelo fato de que compreende também um ou mais dentre (iii) uma solução tampão, (iv) um diluente, (v) um filtro, (vi) uma agulha ou (v) uma seringa.
24. 24. Método de produção de uma vacina anticâncer personalizada para tratamento a base de compostos ou células para pacientes individuais, caracterizado pelo fato de que o referido método

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    7/9 compreende:

    a) identificar os peptídeos associados a tumores (TUMAPs) apresentados por uma amostra tumoral obtida do referido paciente;

    b) comparar os peptídeos identificados em a) com um depósito de peptídeos pré-selecionados de acordo com sua imunogenicidade e/ou apresentação aumentada em tumores em comparação com tecidos normais;

    c) selecionar pelo menos um peptídeo do depósito que corresponda a um TUMAP identificado no paciente; e

    d) fabricar e/ou formular a vacina personalizada ou produto para terapia a base de compostos ou de células de acordo com a etapa c).
25. 25. Método, de acordo com a reivindicação 24, caracterizado pelo fato de que os TUMAPs são identificados por:

    a1) comparar os dados de expressão da amostra tumoral com os dados de expressão de uma amostra de tecido normal correspondente ao tipo de tecido do tumor para identificar proteínas sobrexpressas ou com expressão aberrante na amostra tumoral; e a2) correlacionar os dados de expressão com as sequências de ligantes de MHC ligados a moléculas de MHC classe I e/ou MHC classe II na amostra tumoral para identificar ligantes de MHC derivados de proteínas sobrexpressas ou expressas de maneira aberrante pelo tumor.
26. 26. Método, de acordo com a reivindicação 24 ou 25, caracterizado pelo fato de que as sequências dos ligantes de MHC são identificadas eluindo-se os peptídeos ligados das moléculas de MHC isoladas da amostra tumoral e sequenciando-se os ligantes eluídos.
27. 27. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 24 a 26, caracterizado pelo fato de que o tecido normal

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    8/9 correspondente ao tipo de tecido do tumor é obtido do mesmo paciente.
28. 28. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 24 a 27, caracterizado pelo fato de que os peptídeos incluídos no depósito são identificados conforme as seguintes etapas:

    aa. realizar a análise de expressão de ácido ribonucleico mensageiro (mRNA) em todo o genoma, usando microarrays ou perfis de expressão baseados em sequenciamento, compreendendo a identificação de genes sobrexpressos em tecidos malignos em comparação com um ou mais tecidos normais;

    ab. selecionar os peptídeos codificados pelos genes sobrexpressos ou expressos seletivamente detectados na etapa aa; e ac. determinar as respostas de células T induzidas in vivo pelos peptídeos selecionados a partir de ensaios de imunogenicidade in vitro usando células T humanas de doadores saudáveis ou do referido paciente; ou ba. Identificação de ligantes de HLA da amostra tumoral por espectrometria de massa;

    bb. realizar a análise de expressão de ácido ribonucleico mensageiro (mRNA) em todo o genoma, usando microarrays ou perfis de expressão baseados em sequenciamento, compreendendo a identificação de genes sobrexpressos em tecidos malignos em comparação com um ou mais tecidos normais;

    bc. comparar os ligantes de HLA identificados com os referidos dados de expressão gênica;

    bd. selecionar os peptídeos codificados por genes sobrexpressos ou expressos seletivamente detectados na etapa bc;

    be. detectar os TUMAPs selecionados na etapa bd em tecidos tumorais e pouca ou nenhuma detecção em tecidos saudáveis e confirmação da relevância da sobrexpressão ao nível de mRNA; e

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    9/9 bf. determinar a indução de respostas de células T in vivo pelos peptídeos selecionados a partir de ensaios de imunogenicidade in vitro em células T humanas de doadores saudáveis ou do referido paciente.
29. 29. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 24 a 28, caracterizado pelo fato de que a imunogenicidade dos peptídeos incluídos no depósito é determinada por um método que compreende ensaios de imunogenicidade in vitro, monitoramento da imunidade do paciente para detecção de ligação a HLAs individuais, coloração para multímeros de MHC, ensaios ELISPOT e/ou coloração para citoquinas intracelulares.
30. 30. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 24 a 29, caracterizado pelo fato de que o referido depósito compreende uma pluralidade de peptídeos selecionados do grupo formado por SEQ ID N^Q1 a SEQ ID N^Q 279.
31. 31. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 24 a 30, caracterizado pelo fato de que compreende a identificação de pelo menos uma mutação exclusiva para a amostra tumoral em relação ao tecido normal correspondente de um paciente individual e seleção de um peptídeo que se correlaciona com a mutação para inclusão na vacina ou na criação de terapias celulares.
32. 32. Método, de acordo com a reivindicação 31, caracterizado pelo fato de que pelo menos uma mutação é identificada por sequenciamento de genoma inteiro.