BR112021010432A2

BR112021010432A2 - Peptídeo, anticorpo, receptor de célula t, aptâmero, ácido nucleico, célula hospedeira, método in vitro de produção de linfócitos t ativados, llinfócito t, composição farmacêutica, método de produção de um peptídeo e de produção de uma vacina anticâncer, método para matar células alvo em um paciente, utilização e kit

Info

Publication number: BR112021010432A2
Application number: BR112021010432-1A
Authority: BR
Inventors: Gisela SCHIMMACK; Heiko Schuster; Daniel Kowalewski; Oliver Schoor; Jens FRITSCHE; Toni Weinschenk; Harpreet Singh; Annika Sonntag; Michael Römer
Original assignee: Immatics Biotechnologies Gmbh
Priority date: 2018-12-18
Filing date: 2019-12-18
Publication date: 2021-08-24
Also published as: US11779605B2; US20220008472A1; MX2021007313A; KR20210104674A; US11433099B2; IL284160A; AU2019400780A1; IL310379A; EP3897698A2; CO2021003997A2; CA3108747A1; MA54519A; TW202039535A; CL2021001336A1; AU2019400780A2; CN113260376A; US20220008471A1; WO2020127546A2; SG11202103498YA; US20200188438A1

Abstract

PEPTÍDEO,ANTICORPO, RECEPTOR DE CÉLULA T,APTÂMERO,ÁCIDO NUCLEICO, CÉLULA HOSPEDEIRA, MÉTODO IN VITRO DE PRODUÇÃO DE LINFÓCITOS T ATIVADOS, LLINFÓCITO T, COMPOSIÇÃO FARMACÊUTICA, MÉTODO DE PRODUÇÃO DE UM PEPTÍDEOE DE PRODUÇÃO DE UMA VACINA ANTICÂNCER, MÉTODO PARA MATAR CÉLULAS ALVO EM UM PACIENTE, UTILIZAÇÃO E KIT. A presente invenção refere-se a peptídeos, proteínas, ácidos nucleicos e células para utilização em métodos de imunoterapia. Mais especificamente, a presente invenção refere-se à imunoterapia do câncer. A presente invenção refere-se também a epítopos de peptídeos obtidos de células T associadas a tumores, isoladamente ou combinados com outros peptídeos associados a tumores, que podem, por exemplo, atuar como ingredientes farmacêuticos ativos de composições vacinais que estimulam respostas imunes antitumorais ou que estimulam células T ex vivo, que são depois transferidas a pacientes. Peptídeos, quer ligados a moléculas do complexo principal de histocompatibilidade (MHC), quer peptídeos como tal, também podem ser alvos de anticorpos, de receptores de células T solúveis e de outras moléculas ligantes.

Description

“PEPTÍDEO, ANTICORPO, RECEPTOR DE CÉLULA T, APTÂMERO, ÁCIDO NUCLEICO, CÉLULA HOSPEDEIRA, MÉTODO IN VITRO DE PRODUÇÃO DE LINFÓCITOS T ATIVADOS, LLINFÓCITO T, COMPOSIÇÃO FARMACÊUTICA, MÉTODO DE PRODUÇÃO DE UM PEPTÍDEO E DE PRODUÇÃO DE UMA VACINA ANTICÂNCER, MÉTODO PARA MATAR CÉLULAS ALVO EM UM PACIENTE, UTILIZAÇÃO E KIT”

[001] A presente invenção refere-se a peptídeos, proteínas, ácidos nucleicos e células para utilização em métodos de imunoterapia. Mais especificamente, a presente invenção refere-se à imunoterapia do câncer. A presente invenção refere-se também a epítopos de peptídeos obtidos de células T associadas a tumores, isoladamente ou combinados com outros peptídeos associados a tumores, que podem, por exemplo, atuar como ingredientes farmacêuticos ativos de composições vacinais que estimulam respostas imunes antitumorais ou que estimulam células T ex vivo, que são depois transferidas a pacientes. Peptídeos, quer ligados a moléculas do complexo principal de histocompatibilidade (MHC), quer peptídeos como tal, também podem ser alvos de anticorpos, de receptores de células T solúveis e de outras moléculas ligantes.

[002] A presente invenção refere-se a diversas novas sequências peptídicas e a variantes das mesmas, ambas derivadas de moléculas de HLA classe I de células tumorais humanas, que podem ser utilizadas em composições vacinais para produzir respostas imunes antitumorais ou como alvos para o desenvolvimento de compostos e células com atividade imunofarmacêutica.

ASPECTOS GERAIS DA INVENÇÃO

[003] Segundo a Organização Mundial de Saúde (OMS), o câncer foi uma das doenças não transmissíveis mais letais do mundo em 2012. Naquele ano, os cânceres colorretal, de mama e do trato respiratório estiveram entre as dez principais causas de morte em países de renda elevada.

Epidemiologia

[004] Estima-se que, em 2012, houve 14,1 milhões de casos novos, 32,6 milhões de pacientes com câncer (diagnosticado havia menos de 5 anos) e 8,2 milhões de óbitos por câncer no mundo inteiro (Bray et al., 2013; Ferlay et al., 2013).

[005] Nos grupos formados por câncer cerebral, leucemia e câncer de pulmão, a presente invenção é focada especificamente em glioblastoma (GBM), leucemia linfocítica crônica (LLC), leucemia mieloide aguda (LMA), câncer de pulmão de células não-pequenas ou de pequenas células (CPCNP e CPPC), respectivamente.

[006] O GBM é o tumor maligno mais comum do sistema nervoso central. Nos Estados Unidos, sua incidência ajustada para a idade é de 3,19 por

100.000 habitantes. O prognóstico do GBM é péssimo, com sobrevida de 35% em 1 ano e menos de 5% em 5 anos. Parecem ser fatores de risco para GBM o sexo masculino, idade avançada e etnia(Thakkar et al., 2014).

[007] A LLC é a leucemia mais comum no Ocidente, onde compreende cerca de um terço de todas as leucemias. As taxas de incidência são semelhantes nos EUA e na Europa, e estima-se que haja cerca de 16.000 casos novos por ano. A LLC é mais comum em brancos que em negros, mais rara em hispânicos e descendentes de índios americanos e ainda mais rara em asiáticos. Em indivíduos de origem asiática, a incidência de LLC é três vezes menor que em brancos(Gunawardana et al., 2008). A sobrevida geral em cinco anos de pacientes com LLC é de cerca de 79%.

[008] A LMA é a segunda leucemia mais comum, tanto em adultos como em crianças. Nos Estados Unidos, estima-se que haja cerca de 21.000 novos casos por ano. A sobrevida geral em cinco anos de pacientes com LMA é de aproximadamente 25%.

[009] O câncer de pulmão é o tipo de câncer mais comum do mundo e a principal causa de óbito em vários países. A doença é subdividida em câncer de pulmão de pequenas células e de células não-pequenas. O CPCNP pode ser de um dos seguintes tipos histológicos: adenocarcinoma, carcinoma de células escamosas e carcinoma de grandes células. Esses tumores correspondem a cerca de 85% do câncer de pulmão nos Estados Unidos. A incidência de CPCNP se correlaciona com a prevalência de tabagismo (pregresso ou ativo), e a sobrevida em cinco anos da doença foi descrita como 15%(Molina et al., 2008; World Cancer Report, 2014).

[010] Como o tratamento do câncer é dispendioso e produz graves efeitos colaterais, existe uma necessidade de identificação de fatores que possam ser empregados no tratamento do câncer em geral e em particular de carcinoma colangiocelular, carcinoma de bexiga, carcinoma de células escamosas de cabeça e pescoço, carcinoma de células renais, carcinoma hepatocelular, câncer colorretal, câncer da vesícula biliar, câncer de esôfago, câncer de mama, câncer de ovário, câncer de próstata, câncer de pulmão (incluindo adenocarcinoma de pulmão de células não pequenas, câncer de células escamosas de células não pequenas e câncer de pulmão de pequenas células), câncer de pâncreas, câncer do endométrio uterino, câncer gástrico, glioblastoma, leucemia linfocítica crônica, leucemia mieloide aguda, linfoma não- Hodgkin e melanoma. Outra necessidade é a de identificar fatores que sirvam como biomarcadores de câncer em geral, e em particular de carcinoma colangiocelular, carcinoma de bexiga, carcinoma de células escamosas de cabeça e pescoço, carcinoma de células renais, carcinoma hepatocelular, câncer colorretal, câncer da vesícula biliar, câncer de esôfago, câncer de mama, câncer de ovário, câncer de próstata, câncer de pulmão (incluindo adenocarcinoma de pulmão de células não pequenas, câncer de células escamosas de células não pequenas e câncer de pulmão de pequenas células), câncer de pâncreas, câncer do endométrio uterino, câncer gástrico, glioblastoma, leucemia linfocítica crônica, leucemia mieloide aguda, linfoma não-Hodgkin e melanoma.

[011] A imunoterapia é uma modalidade que age sobre antígenos associados a tumores existentes e serve como opção que age especificamente sobre as células tumorais e, ao mesmo tempo, minimiza os efeitos colaterais.

[012] A classificação atual de antígenos associados a tumores (AATs) compreende os seguintes grupos principais: a) Antígenos câncer/testículo: Os primeiros AATs reconhecíveis por células T a serem identificados pertencem a essa classe, que foi denominada inicialmente antígenos câncer/testículo (CT) porque seus membros são expressos em tumores humanos histologicamente diferentes ao passo que, em tecidos normais, ocorrem apenas em espermatócitos e espermatogônias nos testículos e, ocasionalmente, na placenta. Como as células testiculares não expressam moléculas de HLA classe I e II, esses antígenos não podem ser reconhecidos pelas células T em tecidos normais e podem, portanto, ser considerados imunologicamente específicos para o tumor. Alguns exemplos bem conhecidos de antígenos CT são os membros da família MAGE e o NY-ESO-1; b) Antígenos de diferenciação: Estes AATs são compartilhados por tumores e pelos tecidos normais dos quais o tumor se originou, e a maioria dos antígenos de diferenciação conhecidos se concentram em melanomas e em melanócitos normais. Muitas dessas proteínas relacionadas à linhagem melanocitária participam da biossíntese da melanina e, portanto, não são específicas para tumores, embora sejam amplamente utilizadas para imunoterapia do câncer. Alguns exemplos são, sem limitação, tirosinase e Melan-A/MART-1 em melanoma e PSA em câncer de próstata; c) AATs sobrexpressos: Os genes que codificam AATs amplamente expressos foram detectados tanto em tumores de diversos tipos histológicos como em muitos tecidos normais, geralmente com níveis de expressão mais baixos.

É possível que muitos dos epítopos processados e que podem ser apresentados por tecidos normais estejam abaixo do limiar para reconhecimento por células T, ao passo que sua sobrexpressão em células tumorais pode desencadear uma resposta anticâncer ao quebrar a tolerância estabelecida anteriormente.

Alguns exemplos conhecidos dessa classe de AAT são o Her-2/neu, a survivina e a telomerase ou WT1;

d) Antígenos específicos para tumores: Estes AATs únicos se originam de mutações de genes normais (p.ex. β-catenina, CDK4, etc.). Algumas dessas alterações moleculares estão associadas a transformação e/ou progressão neoplásica.

Os antígenos específicos para tumores são geralmente capazes de induzir fortes respostas imunológicas sem criar risco de reações imunes contra tecidos normais.

Por outro lado, esses AATs são, na maioria dos casos, relevantes apenas ao tumor específico em que foram identificados e geralmente não são compartilhados por vários tumores individuais.

Um peptídeo também pode ser específico para tumores (ou associado a tumores) se for originário de um éxon presente em (ou associado a) um tumor no caso de proteínas com isoformas específicas para (ou associadas a) tumores;

e) AATs originários de modificações pós-traducionais anormais:

Esses AATs podem se originar de proteínas que não são nem específicas nem sobrexpressas em tumores, mas mesmo assim tornam-se associadas a tumores por processos pós-traducionais que atuam primariamente em tumores.

Alguns exemplos dessa classe surgem de alterações de padrões de glicosilação, que produzem novos epítopos em tumores como no MUC1 ou eventos como splicing de proteínas durante a degradação, que podem ou não ser específicos para tumores; e f) Proteínas oncovirais: Esses AATs são proteínas virais que podem desempenhar um importante papel no processo oncogênico e, por serem exógenas (não humanas), podem induzir respostas de células T.

São exemplos destas proteínas as proteínas E6 e E7 do papilomavírus humano tipo 16, que são expressas no carcinoma de colo do útero.

[013] A imunoterapia baseada em células T age contra epítopos peptídicos derivados de proteínas associadas a ou específicas para tumores, que são apresentadas por moléculas do complexo principal de histocompatibilidade (MHC). Os antígenos reconhecidos por linfócitos T específicos para tumores, ou seja, epítopos dos mesmos, podem ser moléculas derivadas de todas as classes de proteínas, como enzimas, receptores, fatores de transcrição, etc., que são expressas e normalmente apresentam regulação positiva em células do tumor em comparação com células inalteradas da mesma origem.

[014] As moléculas de MHC podem ser de duas classes: MHC classe I e MHC classe II. As moléculas de MHC classe I consistem em uma cadeia pesada alfa e em uma beta-2 microglobulina, As moléculas de MHC classe II consistem em uma cadeia alfa e outra beta. Sua conformação tridimensional produz um sulco de ligação, que é empregado para interação não- covalente com peptídeos.

[015] As moléculas de MHC classe I são encontradas na maioria das células nucleadas. Elas apresentam peptídeos derivados da clivagem proteolítica de proteínas predominantemente endógenas, produtos ribossômicos defeituosos (DRIPs, “defective ribosomal products”) e peptídeos maiores.

Entretanto, os peptídeos derivados de compartimentos endossômicos ou de fontes exógenas também são frequentemente encontrados em moléculas de MHC classe I. Na literatura, essa apresentação não-clássica de MHC classe I é denominada apresentação cruzada(Brossart and Bevan, 1997; Rock et al., 1990). As moléculas de MHC classe II são encontradas predominantemente em células apresentadoras de antígenos (CAA) “profissionais” e apresentam sobretudo peptídeos de proteínas exógenas ou de proteínas transmembrana,

que são captadas pelas CAA, p.ex., durante a endocitose e depois processadas.

[016] Os complexos formados por peptídeos e MHC classe I são reconhecidos por células T CD8-positivas que apresentam o receptor de célula (TCR) apropriado, ao passo que complexos de peptídeos com moléculas de MHC classe II são reconhecidos por células T auxiliares CD4-positivas que apresentam o TCR apropriado. É bem-sabido que, em razão dessa configuração o TCR, o peptídeo e o MHC estão presentes em proporções estequiométricas 1:1:1.

[017] As células T auxiliares CD4-positivas desempenham um importante papel em induzir e manter respostas eficazes de células T citotóxicas CD8-positivas. A identificação de epítopos CD4-positivos de células T derivados de antígenos associados a tumores (AAT) é de grande importância para o desenvolvimento de produtos farmacêuticos que visam a desencadear respostas imunes antitumorais (Gnjatic et al., 2003). No sítio do tumor, as células T auxiliares suportam um meio com células T citotóxicas propício para LTC(Mortara et al., 2006) e atraem células efetoras como, p.ex., LTCs, células “natural killer” (NK), macrófagos e granulócitos(Hwang et al., 2007).

[018] Na ausência de inflamação, a expressão de moléculas de MHC classe II restringe-se basicamente a células do sistema imune, especialmente células apresentadoras de antígenos (APC) profissionais, como monócitos, células derivadas de monócitos, macrófagos e células dendríticas.

Em pacientes com câncer, constatou-se que as células tumorais expressam moléculas de MHC classe II(Dengjel et al., 2006).

[019] Os peptídeos longos (prolongados) da invenção podem atuar como epítopos ativos de MHC classe II.

[020] As células T auxiliares ativadas por epítopos do MHC classe II desempenham um importante papel em orquestrar a função efetora de LTC na imunidade antitumoral. Os epítopos de células T auxiliares que desencadeiam a resposta de células T auxiliares do tipo TH1 auxiliam as funções efetoras de células T killer CD8-positivas, incluindo funções citotóxicas dirigidas contra células tumorais cujas superfícies apresentam complexos de peptídeos associados a tumor com MHC. Desse modo, os epítopos peptídicos em células T auxiliares associadas a tumores podem, isoladamente ou em associação com outros peptídeos associados a tumores, atuar como ingredientes farmacêuticos ativos de composições vacinais que estimulam respostas imunes antitumorais.

[021] Mostrou-se em modelos animais mamíferos (p.ex.

camundongos) que, mesmo na ausência de linfócitos T CD8-positivos, as células T CD4-positivas são suficientes para inibir a manifestação de tumores por meio da inibição da angiogênese mediada pela secreção de interferon gama (IFNγ) (Beatty and Paterson, 2001; Mumberg et al., 1999). Algumas evidências indicam que as células T CD4 exercem efeitos antitumorais diretos (Braumuller et al., 2013; Tran et al., 2014).

[022] Como a expressão constitutiva de moléculas de HLA classe II é geralmente limitada a células imunológicas, a possibilidade de isolar peptídeos de classe II diretamente de tumores primários era considerada implausível. Entretanto, Dengjel et al. conseguiram identificar uma série de epítopos de MHC classe II diretamente em tumores (WO 2007/028574, EP 1 760 088 B1).

[023] Como ambos os tipos de resposta (a dependente de CD4 e a dependente de CD8) contribuem conjunta e sinergisticamente para o efeito antitumoral, a identificação e caracterização de antígenos associados a tumores reconhecidos tanto por células T CD8+ (cujo ligante é a molécula de MHC classe I e seu epítopo peptídico) como por células T auxiliares CD4-positivas (cujo ligante é a molécula de MHC classe II e seu epítopo peptídico) são importantes para o desenvolvimento de vacinas antitumorais.

[024] Para que um peptídeo de MHC classe I possa desencadear

(provocar) uma resposta imune celular, ele precisa ligar-se a uma molécula de MHC. O processo depende do alelo da molécula de MHC e de polimorfismos específicos da sequência de aminoácidos do peptídeo. Os peptídeos ligantes de MHC classe I geralmente possuem 8 a 12 resíduos de aminoácidos de comprimento e geralmente contêm dois resíduos conservados (“âncoras”) em suas sequências que interagem com o sulco de ligação correspondente da molécula de MHC. Dessa forma, cada alelo de MHC possui um “motivo de ligação” que determina quais peptídeos podem se ligar especificamente ao sulco de ligação.

[025] Nas reações imunes dependentes do MHC classe I, os peptídeos precisam tanto ser capazes de se ligarem a certas moléculas de MHC classe I expressas em células tumorais como serem posteriormente reconhecidos por células T que apresentam receptores de células T (TCR) específicos.

[026] Para as proteínas serem reconhecidas pelos linfócitos T como antígenos específicos para ou associados a tumores, e serem usadas como tratamentos, alguns pré-requisitos precisam ser atendidos. O antígeno deve ser expresso sobretudo por células tumorais e ser expresso relativamente pouco ou nada por tecidos normais saudáveis. Em uma configuração preferida, o peptídeo deve ser apresentado de maneira exacerbada pelas células tumorais em comparação com os tecidos normais. Ademais, é desejável também que o respectivo antígeno esteja presente apenas em um determinado tipo de tumor, mas também em concentrações elevadas (i.é., números de cópias do respectivo peptídeo por célula). Os antígenos específicos para ou associados a tumores são frequentemente derivados de proteínas que participam diretamente da transformação de uma célula normal em uma célula tumoral devido à sua função; p.ex. controle do ciclo celular ou supressão da apoptose. Além disso, alvos distais da proteína que causa diretamente a transformação podem apresentar regulação positiva e, portanto, associarem-se indiretamente ao tumor. Tais antígenos associados indiretamente a tumores também podem ser alvos de abordagens vacinais (Singh-Jasuja et al., 2004). É essencial que os epítopos estejam presentes na sequência de aminoácidos do antígeno para garantir que o peptídeo (“peptídeo imunogênico”), que é derivado de um antígeno associado a tumor, produza uma resposta de células T in vivo ou in vitro.

[027] Basicamente, qualquer peptídeo capaz de se ligar a uma molécula de MHC pode funcionar como epítopo de célula T. Um pré-requisito para indução de resposta de células T in vitro ou in vivo é a presença de uma célula T com um TCR correspondente e ausência de tolerância imunológica para o epítopo em questão.

[028] Portanto, os AATs servem como ponto de partida para desenvolver tratamentos à base de células T, incluindo, entre outros, vacinas antitumorais. Os métodos utilizados para identificar e caracterizar os AATs normalmente se baseiam na utilização de células T, que podem ser isoladas de pacientes ou de indivíduos saudáveis ou baseadas na geração de perfis diferentes de transcrição ou de expressão peptídica em tumores e em tecidos normais. Entretanto, a identificação de genes sobrexpressos em tecidos tumorais ou em linhagens de tumores humanos ou expressos seletivamente em tais tecidos ou linhagens celulares não proporciona informações precisas sobre a utilização dos antígenos que são transcritos a partir desses genes em imunoterapia. Isso ocorre porque apenas uma determinada subpopulação de epítopos desses antígenos é apropriada para tal aplicação, pois uma célula T com um TCR correspondente precisa estar presente e é preciso que haja pouca ou nenhuma tolerância imunológica ao epítopo em questão. Portanto, é importante, em uma configuração bastante preferida da invenção, selecionar apenas peptídeos sobrexpressos ou apresentados seletivamente contra os quais se possa encontrar células T funcionais e/ou em proliferação. Tais células T funcionais são definidas como células T que, quando estimuladas por um antígeno específico, podem se expandir de forma clonal e são capazes de executar funções efetoras (“célula T efetora”).

[029] No caso de TCRs específicos contra complexos peptídeo- MHC (p.ex. TCRs solúveis) e anticorpos ou outras moléculas ligantes (suportes) de acordo com a invenção, a imunogenicidade dos peptídeos subjacentes é secundária. Nesses casos, o fator determinante é a apresentação.

SUMÁRIO DA INVENÇÃO

[030] Em um primeiro aspecto da presente invenção, a mesma refere-se a um peptídeo que compreende uma sequência de aminoácidos selecionada do grupo formado por SEQ Nº 1 a SEQ Nº 251 e SEQ Nº 289 a SEQ Nº 291 e SEQ Nº 292 a SEQ Nº 299 ou uma sequência variante da smesmas que é pelo menos 77%, preferencialmente pelo menos 88% homóloga (preferencialmente pelo menos77% ou pelo menos 88% idêntica) à SEQ Nº 1 a SEQ Nº 251 e SEQ Nº 289 a SEQ Nº 291 e SEQ Nº 292 a SEQ Nº 299, em que a dita variante se liga ao MHC e/ou induz células T que reagem cruzado com o dito peptídeo, ou um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo, em que o dito peptídeo não é o polipeptídeo de comprimento total salientado.

[031] A presente invenção refere-se também a um peptídeo compreendendo uma sequência de aminoácidos selecionada do grupo que consiste em SEQ Nº 1 a SEQ Nº 251 e SEQ Nº 289 a SEQ Nº 291 e SEQ Nº 292 a SEQ Nº 299 ou uma variante das mesmas que seja pelo menos 77%, e preferivelmente pelo menos 88%, homóloga (preferivelmente pelo menos 77% ou pelo menos 88% idêntica) a SEQ Nº 1 a SEQ Nº 251 e SEQ Nº 289 a SEQ Nº 291 e SEQ Nº 292 a SEQ Nº 299, sendo que cada um dos peptídeos referidos ou variantes dos mesmos possui comprimento total de 8 a 100, preferivelmente de 8 a 30 e, o mais preferido, de 8 a 14 aminoácidos.

[032] As tabelas a seguir mostram os peptídeos de acordo com a presente invenção, seus respectivos números de SEQ e os genes que podem originá-los (genes subjacentes). Na Tabela 1A, os peptídeos com SEQ Nº 1 a SEQ Nº 245 se ligam ao HLA-B*08. Na Tabela 1B, os peptídeos com SEQ Nº 289 e SEQ Nº 291 se ligam a HLA-A*02 e o peptídeo com SEQ Nº 290 se liga a B*44. Na tabela 1C, os peptídeos se ligam a outros alelos, conforme divulgado na tabela. Os peptídeos da Tabela foram revelados anteriormente em grandes listagens como resultados de seleções de alto rendimento com altas taxas de erro ou calculados usando algoritmos, mas nenhum deles havia sido associado com câncer até agora. Na Tabela 2, os peptídeos com SEQ Nº 246 a SEQ Nº 251 se ligam ao HLA-B*08. Os peptídeos na Tabela são peptídeos adicionais que podem ser úteis em associação com outros peptídeos da invenção. Na Tabela 3, os peptídeos com SEQ Nº 252 a SEQ Nº 286 se ligam ao HLA-B*08.

Tabela 1A: Peptídeos de acordo com a presente invenção. SEQ Nº Sequência Símbolos genéticos oficiais 1 ALKLKVAEL MAGEA9, MAGEA9B 2 QIMPKAGL MAGEA3 3 SIQSRYISM PRAME 4 QVMPKTGL MAGEA2, MAGEA2B, MAGEA6 5 STMPKILAL OR51E2 6 NRQKRFVL MMP11 7 AARLRPAL ZBTB32 8 FVRPKLVTI DCX 9 LLKGKPRAL PGR 10 MGKFKQCF SCGB2A1 11 MAPLKMLAL CCL17 12 DFYLRSSAF TTC6 13 EPFTRPVL FCRL5 14 ELILKRCL MYCN 15 LLKKIEHA MYCN 16 NRKPRTPF MSX1, MSX2 17 LLILKTVL OR51E1 18 LSLVRKAL LAMC2 19 FTLLRRLSL ITIH6 20 ILKRFLAC PTPRZ1 21 RILKRFLAC PTPRZ1

SEQ Nº Sequência Símbolos genéticos oficiais 22 EVRLKPIL LOXL4 23 DIKKTNESL FAM111B 24 DLVLKRCL PMEL 25 HLHPKGREL NFE2L3 26 DARCKLAEL KRT121P, KRT81, KRT83, KRT85, KRT86 27 WVLTNIVAL OR1N1 28 DPKSRLKSL LOXL4 29 ELFLHPVL FCRL3 30 DLQKKAQAL NEFH 31 SPRVKWTF BCAN 32 NPYLKLVL KBTBD8 33 WIGLRNLDL FCER2 34 IYRKKYIL SYCP2 35 ELFQRPVL FCRL2 36 IVKIKVQEL FCRL2 37 EAFSRASL NKX3-1 38 EVYQKIIL PASD1 39 DAKSKIEQI LAMB3 40 ESMLKTTL APOB 41 RGALRTLSL NLRP2, NLRP7 42 VLRRKTLL RALGPS2 43 DLKKLVDSL TRIM31 44 HLTNRVLSL HAS2, HAS3 45 RLKVALSTL ABCC12 46 DLRNKIIAA KRT16 47 HSRVKLAQL PTPRZ1 48 ELALRQTV KRT16, KRT16P2 49 FLRVFTDSL BEND4 50 TLRLLVAAL COL7A1 51 ERRVKVSSL MSX2 52 ELILKHSL PCDHGB2 53 DLRKLKRQL FMN1 54 DLSRRDVSL HAVCR1 55 VLLSRRTAL CXCR3 56 ILCGSRKMPL MRGPRX3, MRGPRX4 57 MPLKHYLL LRRC15 58 LPKKMKLL CHST4 59 FDFRGKTKVF L1TD1 60 MLHIKKAEV HMCN1 61 SIKKELVVL MKRN3 62 FMLAKEASL IL22 63 YVKRKTNVL LPAR3 64 FILGREAGAL KLHL35 65 NLLMRNVL SLC44A5

SEQ Nº Sequência Símbolos genéticos oficiais 66 DLKKTRVL MET 67 DMNTKRAIHTL KLHL14 68 DLKIPRYPV CCDC83 69 ELARQRLL PRAMEF24, PRAMEF7, PRAMEF8 70 RPKGTPPL KIF26B 71 HIRIKHTF ZFP64 72 LPLAHHIQL MED12L 73 MFPARGVPL OTOG 74 RLKLRYEGL SFMBT1 75 YARLKNVLL FSTL4 76 HPRLKVNLL GPR31 77 LPKLPVPPL CHAT 78 DGHMKVFSL PARD3 79 GLARIYSF CDK6 80 EVYLRMYQL TBC1D7 81 MYRKEQYL TBC1D7 82 SIRKRPML KIAA1211 83 FVLLRSVDL DMXL1 84 YITRQFVQF DCSTAMP 85 QKPRKKKL LOC388553 86 RPIHHPLVL C12orf50 87 QILQHHVL STON2 88 MLLCLSLEL PCDHGA1 89 VPYTKVQL HOXA13, HOXC13 90 TIGLGLHSL KLK4 91 MPMQDIKMIL PRAME 92 TLKAMVQAW PRAME 93 LMKEKIQEM MMP12 94 DQLLRHVM PRAME 95 SRNPRGFFL ALPP, ALPPL2 96 RPAGVFEL DLL3 MAGEA1, MAGEA2, MAGEA2B, MAGEA3, MAGEA6, 97 EPVTKAEM MAGEA8, MAGEA9, MAGEA9B, MAGEC2, MAGEC3 98 EPVNTNVVL CHRNA9 99 NVKIRFLE CLNK 100 VLLMGPLHL PRDM7 101 FAFEKLIQF ABCC11 102 IMKKIRESY IGF2BP3 103 IANLRVKNI SMC1B 104 FAFGEPREL MAGEC1 105 APLKMLALV CCL17 106 HLHLLETSI LAMC2 107 LPKGLKDWQA DNAH8 108 RSYYHPTNL MMP13

SEQ Nº Sequência Símbolos genéticos oficiais 109 IPASHPVLTL FCRL5 110 DAMTKHTL EML6 111 GAGLRITAPL LAMC2 112 NALDPLSAL SALL3 113 MEKGLASL LAMC2 114 PVKPKFYL ITIH6 115 MRILKRFLAC PTPRZ1 116 FTQNPRVQL ROPN1, ROPN1B 117 VGPNGFKSL LAMC2 118 MAFVKHLL DSCR8 119 FQRVSSVSF HMCN1 120 AQRSEMVTL FCRL5 121 YSQLSISL SLC24A5 122 ESSAQPTAL GREB1 123 SLLPFTLSF HMCN1 124 HSWTRTSV NEFH 125 FPLVTPLL PTPRZ1 126 TAAEARLSL BSX 127 EPVIRTVSI FMN1, LOC101059984 128 HFHNRHVF KIAA1407 129 HRILRLPAL FMN1, LOC101059984 130 LPAPYQHQL ETV4 131 MSTKTTSI SLITRK6 132 IPIQAHQI GFAP 133 QATPRVRIL HMCN1 134 DQRSRATL APOB 135 EYLETKRLAF DNAH17 136 KMFYRKDVM PRDM15 137 VQWKPPAL ROS1 138 TQHLTVATL GRIN2D 139 YGRIGISLF NPFFR2 140 IAVDKPITL HMCN1 141 AQLKLVAL KLHDC7B 142 YNLIYSMCL SUCNR1 143 DADLREQAL LAMB3 144 IEQIRAVL LAMB3 145 MIYRKALRL ABCC4 146 FQTAHFYL PTPRZ1 147 HAMDGASHL GREB1 148 DVNPVSLQL LAMB3 149 TQKSVQVL PTPRZ1 150 MRSSYIREL PGR 151 DRHLTNRVL HAS2, HAS3 152 FNKLVTEL APOB

SEQ Nº Sequência Símbolos genéticos oficiais 153 HAIPHYVTM GPR143 154 VLKTLQEL APOB, FAM179A 155 LPASFPAVL BMF 156 ILKEQSSSSF KRT13, KRT16 157 QPYRFPQA MCOLN2 158 DVIIKGNGL LAMA1 159 DLRNKIIA KRT16 160 LPINNTHI ADAMTS6 161 DIVPPFSAF FOLH1 162 LFKQTKINL PCDHGB2 163 EVMAQFKEI NLRP2 164 LPAPIPTLL FOXB1 165 QNSLRHNL FOXB1, FOXB2 166 VLSGGRILAL HMCN1 167 DMKITVSL HAVCR1 168 HVQDFTAF ABCC4 169 YELNNLHAL RALGPS2 170 SPANVRGQSL LRRC15 171 FPSQVPKQVL PLEKHG4B 172 PYEKVSRL CHST4 173 YPLLKDPSL CHST4 174 HAMPSPRIL SULT1C4 175 MRFQQFLFA APELA 176 YVIQRQSVL ROS1 177 SVPVRSSPL TCHH 178 IPRLAVISI ADCY8 179 LPLTEHEL KLHL6 180 LAVPIFVAL SLC7A11 181 SIRSSYSRF KRT9 182 ILHLSAIAL HTR1F 183 YVSKPGAQL MET 184 DRLKPLKM LAMA1 185 MELKTVKPI NDST4 186 DLISPRQPRL E2F7 187 VPYNSVLF LPAR4 188 EIMEKTTL LAMA1 189 APDNVLLTL LOC644717, SAGE1 190 ELLNRIYF C8orf48 191 RPLKPGEVL TMEM132E 192 EEKHFTTL SLC9C2 193 LGGLRLTAL HPDL 194 RAIEHVLQV SERHL, SERHL2 195 EGNQKSVI KCNMB2 196 LDLRQKVL ZFP92

SEQ Nº Sequência Símbolos genéticos oficiais 197 YKAYPSQL BRIP1 198 FPLTSIIAI SLC16A14 199 IPFIHLPEI SLC16A14 200 VAAARAVPV TRIT1 201 TASAMQHVL ITGAE 202 RIPEKASFL SLC10A5 203 DVYTQVSAF PRSS57 204 MSPLLRSI HRNR, TCHH 205 YMQYGFLSM TDRD5 206 MEFPNKFNTL ABCB5 207 LRKRKSPE CCDC150 208 LPPPQPLSL SPATA31D1 209 SRFGKFVQL MYO10 210 QPNTHQLL NAALADL2 211 DVISKGVSL FREM2 212 EEYKFPSL CDKAL1 213 FPSLFINQF CDKAL1 214 DAPRHRLL PCDHA12, PCDHA3, PCDHA4, PCDHA7 215 NPLIEIISI CDKAL1 216 EARPPSPAV TMEM132E 217 ETIKGHSVRL CDKAL1 218 DNHPRLVTL HPGDS 219 VRNPKILIL ABCB5 220 LAVRHLSL PKHD1 221 SLKEELLSL KRT33B, KRT35 222 AQKAELIAL UBXN8 223 DVSARKLRV PCDHGB6 224 LPYPPQKVV KIAA1211 225 MPKRAHWGA MXRA5 226 DIYEVAVSL TDRD9 227 SRFPGMSVL FAM124B 228 TLRAYVLAL LRRK1 229 DTHTNTYYL SLC12A2 230 DVYFHHVL TDRD5 231 GEKLLRPSL SLC12A2 232 KLYIHRVTL PAPL 233 DVKLVFVM GEN1 234 VFRVGISF TXNDC16 235 SPNSLVTIL GLI3 236 STLKKSLEI CCDC88A 237 LPLDSRYVTL TMEM169 238 IPLAIARL KIAA1211 239 SEPVMRVTL STON2 240 KVIDRKVEL TRIT1

SEQ Nº Sequência Símbolos genéticos oficiais 241 NAYEAPSI BICD1 242 KPQSLQLVL CEP250 243 EGVPPGTVL CDH4 244 HALPPYITVL FSIP2 245 GPRGPSSGHPL ZNF469

Tabela 1B: Peptídeos de acordo com a presente invenção.

SEQ Nº Sequência Símbolos genéticos oficiais 289 SLAESEASL LAMC2 290 EEFLTPKKL KLK3 291 YVYANHFTEA COL6A3

Tabela 1C: Peptídeos adicionais de acordo com a presente invenção.

SEQ Nº Sequência Alelo 292 IRNKSVILL A*02:01 293 HPEDTGQVF C*06:02 294 ATFYEVESILK C*04:01 295 SLYTKVVHY A*11:01 296 SHDLMLLRL C*12:03 297 DSLSSLVTR B*38:01 298 HPQWVLTAA A*33:01 299 QVFQVSHSF B*54:01

Tabela 2: Outros peptídeos de acordo com a presente invenção.

Nº SEQ Sequência Símbolo(s) oficial(is) do gene 246 RLLQKSKEL ADAMTS12 247 TPEPSVHAL DLL3 248 SEVNKHETAL FAM111B 249 QQIDRVVEV CDKAL1 250 AARAPPQAL CABLES2 251 DAAAFFKSV SLC9A7

Tabela 3: Peptídeos úteis para, p.ex., tratamentos anticâncer personalizados.

SEQ Nº Sequência Símbolos genéticos oficiais 252 IFPKTGLLII MAGEA4 253 FPSLREAAL MAGEA1 254 YTIGLGLHSL KLK4 255 MPMQDIKM PRAME 256 QEMQHFLGL MMP12 257 RYLEKFYGL MMP12 258 YLEKFYGL MMP12 259 HAIEKAFQL MMP1

260 SPASRSISL CD70 261 RILRFPWQL MMP11 262 YTFRYPLSL MMP11 263 YPKDIYSSF MMP1 264 YGQSKPWTF PAX3 265 HPSAHDVIL LAMC2 266 RSYQHSLRL LAMC2 267 HLMDQPLSV LAMC2 268 EAMKRLSYI LAMC2 269 VPRPIFSQL GREB1, GREB1L 270 SPRWLPVSL BTBD17 271 LEMPHYSTF PTPRZ1 272 SLLAELHVL FCRL3 273 APQVHIFSL OXTR 274 NPASRLTAL BMPR1A, BMPR1B 275 VPSSRILQL THEG 276 TLKIRAEVL RALGPS2 277 LPIARVLTV LRP1B 278 RAQLKLVAL KLHDC7B 279 TPRIGPKVSL VCAN 280 FPYPYAERL GRIN2D 281 YTIERYFTL GABRP 282 MPVDSFNSM NFE2L3 283 MAQFKEISL NLRP2 284 ELKKKEYEEL CENPF 285 EAMLRNKEL CENPF 286 ILLPRTVSL MXRA5 SEQ ID 291 é derivada de COL6A3

[033] Os colágenos são uma superfamília de proteínas que exercem um papel importante na manutenção da integridade de vários tecidos.

Os colágenos são proteínas de matriz extracelular e têm um domínio de tríplice hélice como seu elemento estrutural comum. O colágeno VI é um componente de estrutura principal das microfibrilas. A unidade estrutural básica do colágeno VI é um heterotrímero de cadeias de colágeno alfa l(VI), alfa 2(VI), e alfa 3(VI).

As cadeias alfa l(VI) e alfa 2(VI) são codificadas pelos genes COL6A1 e COL6A2, respectivamente. A proteína codificada pelo gene COL6A3 é a subunidade alfa 3 do colágeno tipo VI (cadeia de colágeno alfa 3(VI)) (Bertini et al., 2002 Eur. J.

Paediatr. Neurol 6:193-8). Mostrou-se previamente que a expressão do gene de

COL6A3 está associada à progressão de câncer de mama e doi elevada em câncer de cólon (Smith MJ, et al. “Analysis of differential gene expression in colorectal cancer and stroma using fluorescence-activated cell sorting purification” British journal of cancer. 2009;100:1452–1464; Tilman G et al “Human periostin gene expression in normal tissues, tumors and melanoma: evidences for periostin production by both stromal and melanoma cells” Mol Cancer. 2007;6:80) e como um marcador de prognóstico de carcinoma colorretal (Qiao J et al. “Stroma derived COL6A3 is a potential progno-sis marker of colorectal carcinoma revealed by quantitative proteomics” Oncotarget. 2015 Oct 6; 6(30): 29929–29946). O gene COL6A3 se localiza 2q37 no genoma humano e contém 44 éxons. A proteína COL6A3 tem 3177 aminoácidos e contém 12 domínios do tipo A do fator de Von Willebrand (vWA), um domínio tipo 3 de fibronectina e uma família BPTI/Kunitz do domínio de inibidores de protease de serina (KU).

[034] A SEQ ID 291 pode ser usada para o tratamento ou diagnóstico por meio da obtenção de uma resposta imunológica através da geração de construtos de reconhecimento e outros materiais derivados deles ou, se marcada com um marcador, por ligação a uma célula cancerosa, tornando a célula cancerosa visível. O câncer a ser tratado e/ou diagnosticado pode ser qualquer câncer, cânceres preferidos incluindo qualquer de câncer linfocítico agudo, leucemia mieloide aguda, rabdomiossarcoma alveolar, câncer ósseo, câncer do cérebro, câncer de mama, câncer do ânus, canal anal, ou anorreto, câncer dos olhos, câncer do duto biliar intra-hepático, câncer das juntas, câncer do pescoço, vesícula biliar ou pleura, câncer do nariz, cavidade nasal ou ouvido médio, câncer da cavidade oral, câncer da vagina, câncer da vulva, leucemia linfocítica crônica, câncer mieloide crônico, câncer de cólon, câncer esofageal, câncer cervical, tumor cardinoide gastrointestinal, glioma, linfoma de Hodgkin, câncer da hipofaringe, câncer renal, câncer da laringe, câncer de fígado, câncer de pulmão, mesotelioma maligno, melanoma, mieloma múltiplo, câncer da nasofaringe, linfoma não Hodgkin, câncer da orofaringe, câncer de ovário, câncer do pênis, câncer pancreático, peritônio, omento e câncer mesentérico, câncer da faringe, câncer de próstata, câncer retal, câncer renal, câncer de pele, câncer de intestino delgado, câncer de tecido mole, câncer de estômago, câncer testicular, câncer da tireoide, câncer do útero, câncer do ureter e câncer da bexiga urinária.

[035] Um câncer mais preferido é câncer do cérvice uterino, orofaringe, ânus, canal anal, anorreto, vagina, vulva ou pênis. Um câncer particularmente preferido é um câncer positivo para COL6A3, incluindo câncer gastrointestinal e gástrico.

[036] Os construtos, proteínas, anticorpos de TCRs, polipeptídeos e ácidos nucleicos da invenção são, em particular, para uso em terapia imunológica, preferencialmente na terapia de célula T adotiva. A administração dos compostos da invenção pode, por exemplo, envolver a infusão de células T da invenção no dito paciente. Preferencialmente, tais células T são células T autólogas do paciente e transduzidas in vitro com um construto que reconhece ácido nucleico ou antígeno da presente invenção.

[037] O documento WO 2016/011210 divulga células modificadas geneticamente para terapia adotiva, incluindo células NK e células T e composições contendo as células, e métodos para sua administração aos sujeitos. As células podem conter receptores de antígeno geneticamente modificado que se ligam especificamente a antígenos, como receptores de antígeno quimérico (CARs) e receptores coestimulatórios.

[038] O objetivo da invenção é também resolvido por um método de fabricação de uma linha celular que expressa o construto que reconhece COL6A3 específico, compreendendo: a. Prover uma célula hospedeira adequada,

b. Prover um construto genético compreendendo uma sequência de codificação que codifica para um construto de reconhecimento de antígeno de acordo com a invenção aqui divulgada, c. Introduzir no dito hospedeiro adequado o dito construto genético, e d. Expressar o dito construto genético pela dita célula hospedeira adequada.

[039] O método pode compreender ainda uma etapa de apresentação da superfície celular do dito construto de reconhecimento de antígeno na dita célula hospedeira adequada.

[040] Em outras modalidades preferidas, o construto genético é um construto de expressão que compreende uma sequência promotora operativamente ligada à dita sequência de codificação.

[041] Preferencialmente, o dito construto de reconhecimento de antígeno é de origem de mamífero, preferencialmente de origem humana. A célula hospedeira adequada preferida para uso no método da invenção é uma célula de mamífero, como uma célula humana, em particular um linfócito T humano. As células T para uso na invenção são descritas em detalhes neste documento anteriormente.

Tabela 8: Visão geral da apresentação de peptídeos associados ao tumor selecionados da presente invenção através das entidades. CAM: câncer de mama; CCC: carcinoma colangiocelular; LLC: leucemia linfocítica; CaCR: câncer colorretal; CVB: câncer da vesícula biliar; GBM: glioblastoma; CG: câncer gástrico; CHC: carcinoma hepatocelular; CCECP: carcinoma de célula escamosa de cabeça e pescoço; MEL: melanoma; LNH: linfoma não Hodgkin; CPCNPadeno: adenocarcinoma de câncer de pulmão de célula não pequena; CPCNPoutro: amostras de CPCNP que não seriam designadas inequivocadamente como CPCNPadeno ou CPCNPescam; CPCNPescam:

câncer de pulmão de célula não pequena escamosa; CO: câncer de ovário; CE: câncer esofageal; CP: câncer pancreático; CPr: câncer de próstata; CCR: carcinoma de célula renal; CPPC: câncer de pulmão de célula pequena; CB: carcinoma de bexiga; CAU: câncer uterino e do endométrio. No. de ID Sequência Apresentação de peptídeo nas entidades de câncer de SEQ

SLAESEAS 289 CCC, CVB, CHC, CCECP, CPCNPadeno, CPCNPescam, CPCNPoutro, CO, CE, CP, CAU

L

EEFLTPKK 290 CPr

L YVYANHFT CAM, CCC, CaCR, CVB, CG, CJGE, CHC, CCECP, MEL, LNH, CPCNPadeno, 291 EA CPCNPoutro, CPCNPescam, CO, CE, CP, CPPC, CB, CAU

[042] A presente invenção refere-se também aos peptídeos de acordo com a presente invenção para uso no tratamento de doenças proliferativas como o câncer, incluindo, por exemplo, carcinoma colangiocelular, carcinoma de bexiga, carcinoma de células escamosas de cabeça e pescoço, carcinoma de células renais, carcinoma hepatocelular, câncer colorretal, câncer da vesícula biliar, câncer de esôfago, câncer de mama, câncer de ovário, câncer de próstata, câncer de pulmão (incluindo adenocarcinoma de pulmão de células não pequenas, câncer de células escamosas de células não pequenas e câncer de pulmão de pequenas células), câncer de pâncreas, câncer do endométrio uterino, câncer gástrico, glioblastoma, leucemia linfocítica crônica, leucemia mieloide aguda, linfoma não-Hodgkin e melanoma.

[043] São particularmente preferidos, isoladamente ou em combinações, os peptídeos de acordo com a presente invenção selecionados do grupo formado por SEQ Nº 1 a SEQ Nº 251 e SEQ Nº 289 a SEQ Nº 291 e SEQ Nº 292 a SEQ Nº 299. Os peptídeos mais preferidos são aqueles, isoladamente ou em associações, selecionados do grupo formado por SEQ Nº 1 a SEQ Nº 89 (ver Tabela 1A) e SEQ Nº 289 a SEQ Nº 291 e SEQ Nº 292 a SEQ Nº 299 e seus usos na imunoterapia de câncer e, preferencialmente, leucemia mieloide aguda, câncer de mama, carcinoma colangiocelular, leucemia linfocítica crônica, câncer colorretal, câncer de bexiga, glioblastoma, câncer gástrico, carcinoma hepatocelular, carcinoma de célula escamosa de cabeça e pescolo, melanoma, linfoma não Hodking, câncer de pulmão (incluindo adenocarcinoma de câncer de pulmão de célula não pequena, câncer de pulmão de célula não pequena escamosa e câncer de pulmão de célula pequena), câncer de ovário, câncer esofageal, câncer pancreático, câncer de próstata, carcinoma de célula renal, carcinoma da bexiga uriária, câncer uterino e do endométrio.

[044] Portanto, outro aspecto da presente invenção se refere ao uso dos peptídeos de acordo com a presente invenção, preferivelmente combinados, para tratamento de doenças proliferativas selecionadas do grupo formado por carcinoma colangiocelular, carcinoma de bexiga, carcinoma de células escamosas de cabeça e pescoço, carcinoma de células renais, carcinoma hepatocelular, câncer colorretal, câncer da vesícula biliar, câncer de esôfago, câncer de mama, câncer de ovário, câncer de próstata, câncer de pulmão (incluindo adenocarcinoma de pulmão de células não pequenas, câncer de células escamosas de células não pequenas e câncer de pulmão de pequenas células), câncer de pâncreas, câncer do endométrio uterino, câncer gástrico, glioblastoma, leucemia linfocítica crônica, leucemia mieloide aguda, linfoma não-Hodgkin e melanoma.

[045] A presente invenção refere-se também aos peptídeos de acordo com a presente invenção que possuem a capacidade de se ligarem a uma molécula do complexo principal de histocompatibilidade (MHC) humano classe I ou, em uma forma alongada, a uma variante de comprimento diferente do MHC classe II.

[046] A presente invenção refere-se também aos peptídeos de acordo com a presente invenção, onde preferencialmente cada um de tais peptídeos consiste ou consiste principalmente em uma sequência de aminoácidos de acordo com SEQ Nº 1 a SEQ Nº 251 e SEQ Nº 289 a SEQ Nº

291 e SEQ Nº 292 a SEQ Nº 299.

[047] A presente invenção refere-se também aos peptídeos de acordo com a presente invenção nos quais os referidos peptídeos são modificados e/ou incluem ligações não-peptídicas.

[048] A presente invenção refere-se também aos peptídeos de acordo com a presente invenção, nos quais os referidos peptídeos constituem parte de uma proteína de fusão, em particular fusão com aminoácidos N- terminais da cadeia invariante associada ao antígeno do HLA-DR (Ii) ou fundido a (ou incorporado à sequência de) um anticorpo, tal como, por exemplo, um anticorpo específico para células dendríticas.

[049] A presente invenção refere-se também a um ácido nucleico que codifica os peptídeos de acordo com a presente invenção. A presente invenção refere-se também ao ácido nucleico de acordo com a presente invenção que consista em DNA, cDNA, PNA, RNA ou combinações destes.

[050] A presente invenção refere-se também a um vetor de expressão capaz de expressar e/ou que expresse um ácido nucleico de acordo com a presente invenção.

[051] A presente invenção refere-se também a um peptídeo de acordo com a presente invenção, um ácido nucleico de acordo com a presente invenção ou um vetor de expressão de acordo com a presente invenção para emprego no tratamento de doenças e em medicina, em especial para o tratamento de câncer.

[052] A presente invenção refere-se também aos anticorpos específicos contra os peptídeos de acordo com a presente invenção ou complexos de tais peptídeos de acordo com a presente invenção com MHC e métodos para produzi-los.

[053] A presente invenção refere-se ainda a receptores de células T (TCR, “T-cell receptors”) e em particular a TCRs solúveis (sTCR) e a

TCRs clonados introduzidos por engenharia genética em células T autólogas ou alogênicas, assim como a métodos de produzi-las, além de células NK ou outras células que apresentam o referido TCR ou que participem de reações cruzadas com os referidos TCRs.

[054] Os anticorpos e os TCRs são configurações adicionais do uso imunoterapêutico dos peptídeos de acordo com a invenção ora em pauta.

[055] A presente invenção refere-se também a células hospedeiras que compreendem um ácido nucleico de acordo com a presente invenção ou um vetor de expressão conforme descrito anteriormente. A presente invenção refere-se também as células hospedeiras de acordo com a presente invenção, que são células apresentadoras de antígenos e, preferivelmente, células dendríticas.

[056] A presente invenção refere-se também a um método de produção de um peptídeo de acordo com a presente invenção, sendo que o referido método compreende o cultivo da célula hospedeira de acordo com a presente invenção e o isolamento do peptídeo da referida célula hospedeira ou do respectivo meio de cultura.

[057] A presente invenção refere-se também ao referido método de acordo com a presente invenção, sendo que o antígeno é carregado em moléculas de MHC classe I ou II expressas na superfície de uma célula apresentadora de antígenos apropriada ou de uma célula apresentadora de antígenos artificial colocando-se uma quantidade suficiente do antígeno em contato com uma célula apresentadora de antígenos.

[058] A presente invenção refere-se também a um método de acordo com a presente invenção, no qual a célula apresentadora de antígenos compreende um vetor de expressão capaz de expressão ou expressar o referido peptídeo contendo SEQ Nº 1 a SEQ Nº 251 e SEQ Nº 289 a SEQ Nº 291 e SEQ Nº 292 a SEQ Nº 299, preferivelmente contendo SEQ Nº 1 a SEQ Nº 89 ou uma sequência de aminoácidos variante e SEQ Nº 289 a SEQ Nº 291 e SEQ Nº 292 a SEQ Nº 299.

[059] A presente invenção refere-se também a células T ativadas produzidas de acordo com o método da presente invenção, sendo que as referidas células T reconhecem seletivamente células que expressam um polipeptídeo que compreende uma sequência de aminoácidos de acordo com a presente invenção.

[060] A presente invenção refere-se ainda a um método de matar as células alvo em um paciente, cujas células alvo expressam de forma aberrante um polipeptídeo compreendendo qualquer sequência de aminoácidos de acordo com a presente invenção, o método compreendendo administrar ao paciente um número eficaz de células T produzidas de acordo com a presente invenção.

[061] A presente invenção refere-se também ao uso de qualquer peptídeo conforme descrito, ao ácido nucleico de acordo com a presente invenção, ao vetor de expressão de acordo com a presente invenção, à célula de acordo com a presente invenção, ao linfócito T ativado, ao receptor de célula T ou ao anticorpo ou a outro peptídeo e/ou a moléculas ligantes de peptídeo e MHC de acordo com a presente invenção como medicamento ou para fabricação de um medicamento. Preferivelmente, o medicamento possui atividade anticâncer.

[062] Preferivelmente, o referido medicamento destina-se a terapia celular, uma vacina ou proteína à base de um TCR solúvel ou anticorpo.

[063] A presente invenção se refere também a uma aplicação de acordo com a presente invenção, na qual as referidas células de câncer são de carcinoma colangiocelular, carcinoma de bexiga, carcinoma de células escamosas de cabeça e pescoço, carcinoma de células renais, carcinoma hepatocelular, câncer colorretal, câncer da vesícula biliar, câncer de esôfago,

câncer de mama, câncer de ovário, câncer de próstata, câncer de pulmão (incluindo adenocarcinoma de pulmão de células não pequenas, câncer de células escamosas de células não pequenas e câncer de pulmão de pequenas células), câncer de pâncreas, câncer do endométrio uterino, câncer gástrico, glioblastoma, leucemia linfocítica crônica, leucemia mieloide aguda, linfoma não- Hodgkin e melanoma e, preferivelmente, células de carcinoma colangiocelular, carcinoma de bexiga, carcinoma de células escamosas de cabeça e pescoço, carcinoma de células renais, carcinoma hepatocelular, câncer colorretal, câncer da vesícula biliar, câncer de esôfago, câncer de mama, câncer de ovário, câncer de próstata, câncer de pulmão (incluindo adenocarcinoma de pulmão de células não pequenas, câncer de células escamosas de células não pequenas e câncer de pulmão de pequenas células), câncer de pâncreas, câncer do endométrio uterino, câncer gástrico, glioblastoma, leucemia linfocítica crônica, leucemia mieloide aguda, linfoma não-Hodgkin e melanoma.

[064] A presente invenção refere-se também aos biomarcadores baseados nos peptídeos de acordo com a presente invenção, doravante denominados “alvos”, para uso no diagnóstico de câncer, preferivelmente carcinoma colangiocelular, carcinoma de bexiga, carcinoma de células escamosas de cabeça e pescoço, carcinoma de células renais, carcinoma hepatocelular, câncer colorretal, câncer da vesícula biliar, câncer de esôfago, câncer de mama, câncer de ovário, câncer de próstata, câncer de pulmão (incluindo adenocarcinoma de pulmão de células não pequenas, câncer de células escamosas de células não pequenas e câncer de pulmão de pequenas células), câncer de pâncreas, câncer do endométrio uterino, câncer gástrico, glioblastoma, leucemia linfocítica crônica, leucemia mieloide aguda, linfoma não- Hodgkin e melanoma. O marcador pode ser a sobreapresentação do(s) peptídeo(s) em si ou a sobrexpressão do(s) gene(s) correspondente(s). Os marcadores também podem ser empregados para prever a possibilidade de sucesso de um determinado tratamento, preferivelmente uma imunoterapia, sendo mais preferida uma imunoterapia que atue sobre os alvos identificados pelo biomarcador. Pode-se, por exemplo, usar um anticorpo ou TCR solúvel para corar cortes de um tumor para detectar um peptídeo relevante em complexo com MHC.

[065] Opcionalmente, o anticorpo exerce outra função efetora, como um domínio de estimulação imunológica ou uma toxina.

[066] A presente invenção refere-se também ao uso desses novos alvos no âmbito do tratamento do câncer.

DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO

[067] A estimulação de uma resposta imune depende da presença de antígenos reconhecidos como estranhos pelo sistema imune do hospedeiro.

A descoberta da existência de antígenos associados a tumores levantou a possibilidade de usar o sistema imune do hospedeiro para intervir no crescimento tumoral. Vários mecanismos para acionar tanto a imunidade humoral como a celular vêm sendo explorados para imunoterapia do câncer.

[068] Alguns elementos específicos da resposta imune celular são capazes de reconhecer e destruir especificamente células tumorais. O isolamento de células T de populações de células infiltrantes de tumor ou do sangue periférico sugere que tais células podem desempenhar um papel importante nas defesas imunes naturais contra o câncer. As células T CD8- positivas, em particular, capazes de reconhecer moléculas de classe I do complexo principal de histocompatibilidade (MHC), que normalmente possuem 8 a 10 resíduos de aminoácidos derivados de proteínas ou proteínas produtos de defeitos ribossômicos (DRIPS, “defect ribosomal products”) localizadas no citossol, desempenham um papel importante nessa resposta. As moléculas de MHC humanas também são designadas antígenos leucocitários humanos (HLA, “human leucocyte antigen”).

[069] Conforme aqui utilizados, e exceto onde indicado o contrário, todos os termos são definidos conforme segue.

[070] O termo “resposta de célula T” significa a proliferação específica e a ativação das funções efetoras induzidas por peptídeos in vitro ou in vivo. No caso de células T citotóxicas restritas por MHC classe I, as funções efetoras podem consistir em lise de células alvo que foram pulsadas com peptídeos ou com precursores de peptídeos ou que apresentam os peptídeos naturalmente; em secreção de citoquinas induzida por peptídeos, preferivelmente interferon-gama, TNF-α ou IL-2; em secreção induzida por peptídeos de moléculas efetoras, preferivelmente granzimas ou perforinas; ou em desgranulação.

[071] O termo “peptídeo” é aqui utilizado para designar uma série de resíduos de aminoácidos conectados uns aos outros, tipicamente por ligações peptídicas entre os grupamentos alfa-amino e carbonila de aminoácidos adjacentes. Preferivelmente, os peptídeos possuem 9 aminoácidos de comprimento mas podem ter apenas 8 aminoácidos de comprimento ou até 10, 11 ou mais; os peptídeos de MHC classe II (variantes alongadas dos peptídeos da invenção) podem ter comprimento de até 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20 ou mais aminoácidos de comprimento.

[072] O termo “peptídeo” designa também sais de uma série de resíduos de aminoácidos conectados uns aos outros, tipicamente por ligações peptídicas entre os grupamentos alfa-amino e carbonila de aminoácidos adjacentes. Preferivelmente, tais sais são sais farmaceuticamente aceitáveis de peptídeos como, por exemplo, sais de cloreto ou acetato (trifluoracetato). Cabe notar que os sais dos peptídeos de acordo com a presente invenção diferem substancialmente dos peptídeos em seu estado in vivo, pois esses peptídeos não se apresentam como sal in vivo.

[073] O termo “peptídeo” abrange também “oligopeptídeo”. O termo “oligopeptídeo” é aqui utilizado para designar uma série de resíduos de aminoácidos conectados uns aos outros, tipicamente por ligações peptídicas entre os grupamentos alfa-amino e carbonila de aminoácidos adjacentes. O comprimento do oligopeptídeo não é essencial para a invenção, conquanto o epítopo ou epítopos corretos sejam nele mantidos. Os oligopeptídeos tipicamente possuem mais de cerca de 15 e menos de cerca de 30 resíduos de aminoácidos de comprimento.

[074] O termo “polipeptídeo” designa uma série de resíduos de aminoácidos conectados uns aos outros, tipicamente por ligações peptídicas entre os grupamentos alfa-amino e carbonila de aminoácidos adjacentes. O comprimento do polipeptídeo não é essencial para a invenção, conquanto os epítopos corretos sejam nele mantidos. Ao contrário do termo peptídeo e oligopeptídeo, o termo polipeptídeo designa apenas moléculas com mais de cerca de 30 resíduos de aminoácidos.

[075] Um peptídeo, oligopeptídeo, proteína ou polinucleotídeo que codifica tal molécula é “imunogênico” (e, portanto, “imunogênico” no escopo da presente invenção) se for capaz de induzir uma resposta imune. No caso da presente invenção, a imunogenicidade é definida mais especificamente como a capacidade de induzir uma resposta de células T. Portanto, um “imunogênio” seria uma molécula capaz de induzir uma resposta imune e, no caso da presente invenção, uma molécula capaz de induzir uma resposta de células T. Em outro aspecto, o imunogênio pode ser o peptídeo, o complexo formado pelo peptídeo com MHC, o oligopeptídeo e/ou proteína empregada para produzir anticorpos específicos ou TCRs contra ele.

[076] Um “epítopo” de células T classe I requer um peptídeo curto ligado a um receptor de MHC classe I formando um complexo ternário (cadeia alfa de MHC classe I, beta-2 microglobulina e peptídeo), que pode ser reconhecido por receptores de células T que se ligam com afinidade apropriada ao complexo de MHC com peptídeo. Os peptídeos que se ligam a moléculas de MHC classe I geralmente possuem 8-14 aminoácidos de comprimento, e mais tipicamente 9 aminoácidos de comprimento.

[077] Em seres humanos, três lócus genéticos diferentes codificam as moléculas de MHC classe I. (As moléculas de MHC de seres humanos também são designadas antígenos leucocitários humanos (HLA, “human leukocyte antigens”)). O HLA-A, HLA-B e HLA-C. HLA-A*01, HLA-A*02 e HLA-B*08 são exemplos de alelos de MHC classe I diferentes que podem ser expressos a partir desses lócus.

Tabela 4: Frequências de expressão (F) dos sorotipos de HLA-A*02, HLA-A*01, HLA-A*03, HLA-A*24, HLA-B*07, HLA-B*08 e HLA-B*44. As frequências dos haplótipos (Gf) são derivadas de um estudo que usou dados de tipagem de HLA de um registro com mais de 6,5 milhões de doadores voluntários nos EUA (Gragert et al., 2013). A frequência de haplótipos é a frequência de um alelo distinto em um cromossomo individual. Como as células mamíferas possuem um conjunto diploide de cromossomos, a frequência de ocorrência genotípica deste alelo será maior e pode ser calculada empregando-se o princípio de Hardy- Weinberg (F = 1 – (1 – Gf)²).

Fenótipo calculado a partir da Alelo População frequência de alelos (F) Africano (N=28557) 32,3% Caucasiana europeia (N=1242890) 49,3% A*02 Japonesa (N=24582) 42,7% Hispânica (América do Sul e Central) (N=146714) 46,1% Sudeste Asiático (N=27978) 30,4% Africano (N=28557) 10,2% Caucasiana europeia (N=1242890) 30,2% A*01 Japonesa (N=24582) 1,8% Hispânica (América do Sul e Central) (N=146714) 14,0% Sudeste Asiático (N=27978) 21,0%

Africano (N=28557) 14,8% Caucasiana europeia (N=1242890) 26,4% A*03 Japonesa (N=24582) 1,8% Hispânica (América do Sul e Central) (N=146714) 14,4% Sudeste Asiático (N=27978) 10,6% Africano (N=28557) 2,0% Caucasiana europeia (N=1242890) 8,6% A*24 Japonesa (N=24582) 35,5% Hispânica (América do Sul e Central) (N=146714) 13,6% Sudeste Asiático (N=27978) 16,9% Africano (N=28557) 14,7% Caucasiana europeia (N=1242890) 25,0% B*07 Japonesa (N=24582) 11,4% Hispânica (América do Sul e Central) (N=146714) 12,2% Sudeste Asiático (N=27978) 10,4% Africano (N=28557) 6,0% Caucasiana europeia (N=1242890) 21,6% B*08 Japonesa (N=24582) 1,0% Hispânica (América do Sul e Central) (N=146714) 7,6% Sudeste Asiático (N=27978) 6,2% Africano (N=28557) 10,6% Caucasiana europeia (N=1242890) 26,9% B*44 Japonesa (N=24582) 13,0% Hispânica (América do Sul e Central) (N=146714) 18,2% Sudeste Asiático (N=27978) 13,1%

[078] Os peptídeos da invenção, preferivelmente quando incluídos em uma vacina da invenção conforme aqui descrita, ligam-se a B*08.

Uma vacina também pode apresentar ligação a todos os peptídeos de MHC classe II. Portanto, a vacina da invenção pode ser empregada para tratar o câncer em pacientes positivos para B*08, ao passo que nenhuma seleção de alótipos de MHC classe II é necessária porque esses peptídeos se ligam a todos os MHC classe II.

[079] Se os peptídeos B*08 da invenção forem combinados com peptídeos que se ligam a outro alelo (p.ex. A*24), uma porcentagem maior de qualquer população de pacientes poderá ser tratada que com a abordagem de apenas um dos alelos de MHC classe I. Enquanto na maioria das populações menos de 50% dos pacientes poderia ser tratada com qualquer desses alelos isoladamente, uma vacina compreendendo epítopos de HLA-A*02 e HLA-A*24 pode tratar pelo menos 60% dos pacientes em qualquer população relevante.

Mais especificamente, os seguintes porcentuais de pacientes serão positivos para pelo menos um desses alelos em várias regiões: EUA 61%, Europa Ocidental 62%, China 75%, Coreia do Sul 77%, Japão 86% (porcentagens calculadas a partir de www.allelefrequencies.net).

Tabela 5: Cobertura de alelos de HLA em uma população caucasiana europeia (calculada segundo (Gragert et al., 2013)). cobertura combinado (pelo menos combinado combinado com B*08 e um alelo A) com B*08 com B*44 B*44 A*02 / A*01 70% 77% 78% 84% A*02 / A*03 68% 75% 76% 82% A*02 / A*24 61% 69% 71% 79% A*'01 / A*03 52% 62% 65% 74% A*01 / A*24 44% 56% 59% 69% A*03 / A*24 40% 53% 56% 67% A*02 / A*01 / A*03 84% 87% 88% 91% A*02 / A*01 / A*24 79% 83% 84% 88% A*02 / A*03 / A*24 77% 82% 83% 87% A*01 / A*03 / A*24 63% 71% 73% 80% A*02 / A*01 / A*03 / A*24 90% 92% 93% 94%

[080] Em uma configuração preferida, o termo “sequência de nucleotídeos” refere-se a um heteropolímero de desoxirribonucleotídeos.

[081] A sequência de nucleotídeos que codifica um determinado peptídeo, oligopeptídeo ou polipeptídeo pode ocorrer naturalmente ou ser construída por meios sintéticos. Em geral, os segmentos de DNA que codificam peptídeos, polipeptídeos e proteínas desta invenção são construídos a partir de fragmentos de cDNA e ligantes oligonucleotídeos curtos ou de uma série de oligonucleotídeos de modo a fornecer um gene sintético capaz de ser expresso em uma unidade de transcrição recombinante que compreende elementos regulatórios derivados de um operon microbiano ou viral.

[082] Conforme aqui utilizado, o termo “nucleotídeo codificador [ou que codifica] um peptídeo” refere-se a uma sequência de nucleotídeos que codifica o peptídeo, incluindo códons de início e parada artificiais (produzidos pelo homem) compatíveis com o sistema biológico que será expresso, por exemplo, por uma célula dendrítica ou por outro sistema celular útil para a produção de TCRs.

[083] Conforme aqui utilizadas, referências a uma sequência de ácido nucleico abrangem tanto ácidos nucleicos de fita única como de fita dupla.

Portanto, por exemplo, para DNA, a sequência específica refere-se, salvo indicação em contrário no contexto, ao DNA de fita única de tal sequência, à forma dúplex de tal sequência com o respectivo complemento (DNA de fita dupla) e ao complemento de tal sequência.

[084] O termo “região codificadora” refere-se à porção do gene que, natural ou normalmente, codifica o produto expresso pelo gene em questão em seu ambiente genômico natural, i.é., a região codificadora in vivo do produto de expressão nativo do gene em questão.

[085] A região codificadora pode ser derivada de um gene não- mutante (“normal”), mutante ou alterado e pode até mesmo ser derivada de uma sequência de DNA ou gene sintetizado inteiramente em laboratório empregando métodos bem conhecidos dos versados na técnica de síntese de DNA.

[086] O termo “produto de expressão” significa o polipeptídeo ou proteína que é o produto de tradução natural do gene e de quaisquer sequências de ácidos nucleicos que produzam codificação equivalente resultantes da natureza degenerada do código genético produzindo o(s) mesmo(s) aminoácido(s).

[087] O termo “fragmento” significa, quando se refere a uma sequência codificante, uma porção do DNA que compreende menos que a região codificadora completa, cujo produto de expressão retém basicamente a mesma função ou atividade biológica que o produto de expressão da região codificante completa.

[088] O termo “segmento de DNA” refere-se a um polímero de DNA, seja como fragmento separado ou como componente de uma estrutura de DNA maior, derivado do DNA isolado pelo menos uma vez de forma basicamente pura, i.é., livre de materiais contaminantes endógenos e em quantidade ou concentração suficientes para permitir identificação, manipulação e recuperação do segmento e das sequências de nucleotídeos componentes empregando-se métodos bioquímicos padrão como, por exemplo, um vetor de clonagem. Tais segmentos são fornecidos como um “frame” (matriz) de leitura aberto sem interrupções de sequências internas não traduzidas, denominadas íntrons, que geralmente estão presentes em genes eucarióticos. As sequências de DNA não traduzido podem estar presentes em posição distal à matriz de leitura aberta, onde a mesma não interfere na manipulação nem na expressão das regiões codificantes.

[089] O termo “primer” significa uma sequência curta de ácidos nucleicos que pode ser pareada com uma fita de DNA e fornece uma terminação 3'OH livre na qual a DNA polimerase inicia a síntese de uma cadeia de desoxirribonucleotídeos.

[090] O termo “promotor” significa uma região do DNA envolvida em ligar a RNA polimerase para iniciar a transcrição.

[091] O termo “isolado” significa que o material foi retirado de seu ambiente original (p.ex. o ambiente original em que ocorria naturalmente). Por exemplo, polinucleotídeos que ocorrem na natureza ou que estão presentes em um animal vivo não são considerados isolados, mas o mesmo polinucleotídeo ou polipeptídeo é considerado isolado quando é separado de alguns ou de todos os materiais que com ele coexistem em um sistema natural. Tais polinucleotídeos podem formar parte de um vetor e/ou tais polinucleotídeos ou polipeptídeos podem ser parte de uma composição e mesmo assim ser isolados, mesmo que tal vetor ou composição não seja parte de seu ambiente natural.

[092] Os polinucleotídeos e os polipeptídeos recombinantes ou imunogênicos revelados de acordo com a presente invenção também podem estar em forma “purificada”. O termo “purificado” não requer pureza absoluta; é uma definição relativa e abrange tanto preparações altamente purificadas como preparações apenas parcialmente purificadas, conforme tais termos são compreendidos pelos versados na técnica relevante. Por exemplo, clones individuais isolados de uma biblioteca de cDNA foram purificados empregando-se técnicas convencionais para se obter homogeneidade eletroforética. A purificação de um material inicial ou de material natural em pelo menos uma ordem de grandeza, e preferivelmente em duas ou três ordens, e mais preferivelmente em quatro a cinco ordens de magnitude é expressamente contemplada. Ademais, o polipeptídeo reivindicado que possui pureza de, preferivelmente 99,999% ou pelo menos 99,99% ou 99,9% e, ainda desejavelmente, 99% por peso ou mais, fica expressamente incluído.

[093] Os ácidos nucleicos e produtos da expressão de polipeptídeos revelados de acordo com a presente invenção, assim com os vetores de expressão que contêm tais ácidos nucleicos e/ou tais polipeptídeos, podem estar presentes em “forma enriquecida”. Conforme aqui utilizado, o termo “enriquecido” significa que a concentração do material é de pelo menos 2, 5, 10, 100 ou 1000 vezes sua concentração natural (por exemplo), vantajosamente 0,01% por peso e preferivelmente pelo menos 0,1% por peso. Preparações enriquecidas de cerca de 0,5%, 1%, 5%, 10% e 20% por peso também são contempladas. As sequências, produtos de construção, vetores, clones e outros materiais que compreendem a presente invenção podem, vantajosamente, estar em forma enriquecida ou isolada.

O termo “fragmento ativo” significa um fragmento, normalmente de um peptídeo, polipeptídeo ou sequência de ácido nucleico, que gera uma resposta imune (i.é, possui atividade imunogênica) quando administrado — isolado ou, opcionalmente, com um adjuvante apropriado ou em um vetor — a um animal como um mamífero (p.ex. coelho, camundongo) ou a um ser humano. A resposta imune assume a forma de estimulação da resposta de células T em um animal receptor como, por exemplo, um ser humano. Alternativamente, o “fragmento ativo” também pode ser empregado para induzir uma resposta de células T in vitro.

[094] Conforme aqui utilizados, os termos “porção”, “segmento” e “fragmento” referem-se, quando usados em relação a peptídeos, a uma sequência contínua de resíduos, como resíduos de aminoácidos, que forma um subconjunto de uma sequência maior. Por exemplo, se um polipeptídeo for sujeito a tratamento com qualquer uma das endopeptidases comuns como a tripsina ou a quimotripsina, os oligopeptídeos resultantes de tal tratamento representariam porções, segmentos ou fragmentos do polipeptídeo inicial. Quando utilizados em relação a polinucleotídeos, esses termos referem-se a produtos produzidos pelo tratamento dos referidos nucleotídeos com qualquer uma das endonucleases.

[095] De acordo com a presente invenção, os termos “porcentual de identidade” e “porcentagem de idênticos” significam, quando usados em referência a uma sequência, que uma sequência é comparada com uma sequência reivindicada ou descrita após alinhamento da sequência a ser comparada (“Sequência de Comparação”) com a sequência descrita ou reivindicada (“Sequência de Referência”). O porcentual de identidade é então determinado de acordo com a seguinte fórmula: Porcentual de identidade = 100 [1 - (C/R)]

[096] Onde C é o número de diferenças entre a Sequência de Referência e a Sequência de Comparação ao longo do alinhamento entre a Sequência de Referência e a Sequência de Comparação, onde:

(i) Cada base ou aminoácido da Sequência de Referência que não possui uma base ou aminoácido alinhado correspondente na Sequência de Comparação; e (ii) Cada lacuna na sequência; e (iii) Cada base ou aminoácido da Sequência de Referência diferente da base ou aminoácido alinhado correspondente na Sequência de Comparação constitui uma diferença; e (iv) O alinhamento deve começar na posição 1 das sequências alinhadas; e R é o número de bases ou aminoácidos na Sequência de Referência ao longo do comprimento do alinhamento com a Sequência de Comparação, sendo que quaisquer lacunas criadas na Sequência de Referência também são consideradas como uma base ou aminoácido.

[097] Se existir um alinhamento entre a Sequência de Comparação e a Sequência de Referência para o qual o porcentual de identidade calculado acima for igual ou superior a um porcentual de identidade mínimo especificado, a Sequência de Comparação possui o porcentual de identidade mínimo especificado em relação à Sequência de Referência, mesmo que possa haver alinhamentos em que o porcentual de identidade calculado acima seja inferior à identidade porcentual especificada.

[098] Conforme mencionado anteriormente, a presente invenção refere-se, portanto, a um peptídeo que compreende uma sequência de aminoácidos selecionada do grupo formado por SEQ Nº 1 a SEQ Nº 251 e SEQ Nº 289 a SEQ Nº 291 e SEQ Nº 292 a SEQ Nº 299 ou a uma variante dos mesmos com 88% de homologia com SEQ Nº 1 a SEQ Nº 251 e SEQ Nº 289 a SEQ Nº 291 e SEQ Nº 292 a SEQ Nº 299 ou uma variante da mesma que induz reação cruzada de células T com o referido peptídeo. Os peptídeos da presente invenção possuem capacidade de ligação com uma das moléculas do complexo principal de histocompatibilidade humano (MHC) de classe I ou com versões alongadas dos referidos peptídeos a moléculas de classe II.

[099] Na presente invenção, o termo “homólogo” refere-se ao grau de identidade (ver o conceito de percentual de identidade descrito anteriormente) entre duas sequências de aminoácidos, i.é., sequências de peptídeos ou de polipeptídeos. A “homologia” mencionada anteriormente é determinada comparando-se duas sequências alinhadas sob condições ideais com as sequências a serem comparadas. Tal homologia entre sequências pode ser calculada criando-se um alinhamento utilizando-se, por exemplo, o algoritmo ClustalW. Alguns softwares de análise de sequências comumente disponíveis, mais especificamente o Vector NTI, o GENETYX e outras ferramentas de análise, são disponibilizados por bancos de dados abertos ao público.

[100] Os versados na técnica poderão avaliar se as células T induzidas por um peptídeo variante de um peptídeo específico podem apresentar reação cruzada com o peptídeo original(Appay et al., 2006; Colombetti et al., 2006; Fong et al., 2001; Zaremba et al., 1997).

[101] Por “variante” de uma determinada sequência de aminoácidos, os inventores entendem que as cadeias laterais de, por exemplo, um ou dois resíduos de aminoácidos são alterados (por exemplo, substituindo-os pela cadeia lateral de outro resíduo de aminoácido encontrado na natureza ou alguma outra cadeia lateral) de modo que o peptídeo continue sendo capaz de se ligar a uma molécula de HLA basicamente da mesma maneira que um peptídeo com a mesma sequência de aminoácidos que as SEQ Nº 1 a SEQ Nº 251 e SEQ Nº 289 a SEQ Nº 291 e SEQ Nº 292 a SEQ Nº 299. Pode-se, por exemplo, modificar um peptídeo de modo a melhorar ou pelo menos manter sua capacidade de interagir com e se ligar a um sulco de ligação em uma molécula de MHC apropriada, tal como HLA-B*08 ou -DR, e dessa forma pelo menos manter, ou até melhorar, a capacidade de ligar-se ao TCR de células T ativadas.

[102] Em seguida, essas células T ativadas podem participar de reação cruzada com outras células e destruir células que expressam um polipeptídeo que contém a sequência natural de aminoácidos do peptídeo cognato, conforme definido nos aspectos da invenção. Como se pode depreender da literatura e de bancos de dados científicos(Godkin et al., 1997; Rammensee et al., 1999), determinadas posições em peptídeos ligantes de HLA são geralmente resíduos de ancoragem que formam uma sequência central que se fixa ao motivo ligante do receptor de HLA, que é definido por propriedades de polaridade, eletrofísicas, hidrofóbicas e espaciais das cadeias polipeptídicas que constituem o sulco de ligação. Assim, os versados na técnica saberão modificar as sequências de aminoácidos apresentadas em SEQ Nº 1 a SEQ Nº 251 e SEQ Nº 289 a SEQ Nº 291 e SEQ Nº 292 a SEQ Nº 299 mantendo os resíduos de ancoragem conhecidos e serão capazes de determinar se tais variantes preservam sua capacidade de ligação com moléculas de MHC classe I ou classe II. As variantes da presente invenção preservam a capacidade de ligação ao TCR de células T ativadas, que podem participar posteriormente de reações cruzadas e destruir células que expressam um polipeptídeo contendo a sequência natural de aminoácidos do peptídeo cognato, conforme definido nos aspectos da invenção.

[103] Os peptídeos originais (não modificados) aqui revelados podem ser modificados por substituição de um ou mais resíduos em sítios diferentes, e possivelmente seletivos, dentro da cadeia peptídica, salvo indicação em contrário. Preferivelmente, essas substituições se encontram no final da cadeia de aminoácidos. Tais substituições podem ser de natureza conservadora, substituindo-se, por exemplo, um aminoácido por outro de estrutura e características semelhantes, como, por exemplo, substituir um aminoácido hidrofóbico por outro aminoácido hidrofóbico. Ainda mais conservador seria substituir aminoácidos de tamanho e natureza química semelhantes ou idênticos, como substituir leucina por isoleucina. Em estudos de variações de sequências em famílias de proteínas homólogas que ocorrem naturalmente, determinadas substituições de aminoácidos são toleradas com muito mais frequência que outras, e estas frequentemente mostram correlação com semelhanças de tamanho, carga, polaridade e hidrofobicidade entre o aminoácido original e seu substituto, sendo esta a base para definição de “substituições conservadoras”.

[104] As substituições conservadoras são aqui definidas como trocas dentro de um dos seguintes grupos: Grupo 1: Resíduos pequenos alifáticos, apolares ou ligeiramente polares (Ala, Ser, Tre, Pro, Gli); Grupo 2: Resíduos polares com carga negativa e as respectivas amidas (Asp, Asn, Glu, Gln); Grupo 3: Resíduos polares com carga positiva (His, Arg, Lis); Grupo 4: Resíduos alifáticos grandes e apolares (Met, Leu, Ile, Val, Cis); e Grupo 5: resíduos aromáticos grandes (Fen, Tir, Trp).

[105] Em um aspecto, as substituições conservadoras podem incluir aquelas descritas por Dayhoff em “The Atlas of Protein Sequence and Structure.

Vol. 5”, Natl. Biomedical Research, cujo conteúdo fica integralmente incorporado ao presente pedido mediante esta referência. Por exemplo, em um aspecto pode-se substituir um aminoácido pertencente a um dos seguintes grupos por outro do mesmo grupo, o que caracteriza uma troca conservadora: Grupo 1: alanina (A), prolina (P), glicina (G), asparagina (N), serina (S) e treonina (T); Grupo 2: cisteína (C), serina (S), tirosina (Y) e treonina (T); Grupo 3: valina (V), isoleucina (I), leucina (L), metionina (M), alanina (A) e fenilalanina (F); Grupo 4: lisina (K), arginina (R) e histidina (H); Grupo 5: fenilalanina (F), tirosina (Y), triptofano (W) e histidina (H); e Grupo 6: ácido aspártico (D) e ácido glutâmico (E). Em um aspecto, pode-se selecionar uma substituição de aminoácidos conservadora do grupo formado por T→A, G→A, A→I, T→V, A→M, T→I, A→V, T→G e T→S.

[106] Em um aspecto, uma substituição conservadora de aminoácido pode incluir a substituição de um aminoácido por outro da mesma classe, sendo a classe, p.ex., (1) apolar (ala, val, leu, ile, pro, met, fen, trp), (2) polar neutro (gli, ser, tre, cis, tir, asn, gln), (3) ácido (asp, glu) ou (4) básico (lis, arg, his).

Outras substituições conservadoras de aminoácidos também podem ser efetuadas da seguinte maneira: (1) aromático (fen, tir, his), (2) doador de próton (asn, gln, lis, arg, his, trp) e (3) aceitador de próton (glu, asp, tre, ser, tir, asn, gln). Vide, p.ex., a patente dos EUA no 10.106.805, cujo conteúdo fica integralmente incorporado ao presente pedido mediante esta referência.

[107] Em outro aspecto, podem-se realizar substituições conservadoras de acordo com a Tabela A. Métodos preditivos da tolerância a modificação proteica são descritos em, p.ex., Guo et al., Proc Natl Acad Sci USA, 101(25):9205-9210 (2004), cujo conteúdo fica integralmente incorporado ao presente pedido mediante esta referência.

Tabela A Substituições conservadoras de aminoácidos Aminoácido Substituições (entre outras conhecidas na técnica)

[108] Em outro aspecto, as substituições conservadoras podem ser aquelas mostradas na Tabela B sob o título “substituições conservadoras”.

Quando tais substituições acarretam modificação da atividade biológica, podem- se introduzir modificações mais significativas, denominadas “substituições exemplares” na Tabela B, e os produtos podem ser avaliados se necessário.

Tabela B Substituições de aminoácidos Resíduo original (aminoácido encontrado na Substituições natureza) conservadoras Substituições exemplares Norleucina Norleucina; Norleucina

[109] Algumas substituições menos conservadoras podem consistir em substituição de um aminoácido por outro com características semelhantes mas algo diferente em tamanho, como substituição de uma alanina por um resíduo de isoleucina. Substituições pouquíssimo conservadoras podem consistir em substituir um aminoácido ácido por outro polar ou até mesmo por outro básico. Entretanto, tais substituições “radicais” não podem ser descartadas como possivelmente ineficazes, pois seus efeitos químicos não são totalmente previsíveis e as substituições radicais podem produzir efeitos fortuitos que não podem ser previstos de outra forma a partir de princípios químicos simples.

[110] Evidentemente, tais substituições podem envolver outras estruturas que não os L-aminoácidos comuns. Portanto, os D-aminoácidos podem ser substituídos pelos L-aminoácidos comumente encontrados em peptídeos antigênicos da invenção, não deixando de ser contemplados pela presente revelação. Além disso, aminoácidos não-padrão (i.é., outros aminoácidos que não os aminoácidos proteinogênicos encontrados na natureza) também podem ser empregados para finalidades de substituição de modo a produzir imunogênios e polipeptídeos imunogênicos de acordo com a presente invenção.

[111] Se for constatado que substituições em mais de uma posição produzem peptídeos com atividade antigênica substancialmente equivalente ou maior conforme definido a seguir, combinações dessas substituições serão testadas para determinar se as substituições combinadas produzem efeitos aditivos ou sinergísticos sobre a antigenicidade do peptídeo.

No máximo, não mais de quatro posições no peptídeo devem ser substituídas simultaneamente.

[112] Um peptídeo que consiste essencialmente na sequência de aminoácidos aqui indicada pode possuir um ou dois aminoácidos não-âncoras (o motivo âncora é descrito mais detalhadamente a seguir), que são trocados sem que a capacidade de ligação a uma molécula do complexo principal de histocompatibilidade (MHC) humano classe I ou II seja modificada significativamente ou prejudicada em comparação com o peptídeo não modificado. Em outra configuração, que consiste essencialmente na sequência de aminoácidos aqui indicada, um ou dois aminoácidos podem ser trocados por elementos de troca conservadores (ver adiante) sem que a capacidade de ligação a uma molécula do complexo principal de histocompatibilidade (MHC) humano classe I ou II seja modificada significativamente ou prejudicada em comparação com o peptídeo não modificado.

[113] Os resíduos de aminoácidos que não contribuem significativamente para as interações com o receptor de células T podem ser modificados substituindo-se com outro aminoácido, cuja incorporação não afeta significativamente a reatividade de células T nem elimina a ligação ao MHC relevante. Assim, considerando-se a condição acima, o peptídeo da invenção pode ser qualquer peptídeo (termo sob o qual os inventores incluem oligopeptídeo e polipeptídeo), incluindo sequência de aminoácidos ou uma porção ou variante das mesmas conforme apresentadas, desde que eles mantenham a capacidade de incuzir células T que se ligam especificamente aos peptídeos da invenção.

Tabela 6: Variantes e motivos dos peptídeos de acordo com as SEQs Nº 9, 10, 16, 19 e 28. Posição 1 2 3 4 5 6 7 8 9 SEQ Nº: 9 L L K G K P R A L Variante V

I M F R R V R I R M R F H H V H I H M H F R R V R I R M R F R R R R V R R I R R M R R F R H R H V R H I R H M R H F L L V L I L M L F L R L R V L R I L R M L R F L H L H V L H I L H M

L H F Posição 1 2 3 4 5 6 7 8 SEQ Nº: 10 M G K F K Q C F Variante L

V I M R L R V R I R M R H L H V H I H M H R L R V R I R M R R R L R R V R R I R R M R R R H L R H V R H I R H M R H L L L V L I L M L L R L L R V L R I L R M L R L H L L H V L H I L H M

L H Posição 1 2 3 4 5 6 7 8 SEQ Nº: 16 N R K P R T P F Variante K L

K V K I K M K L V I M H L H V H I H M H R K L R K V R K I R K M R K R L R V R I R M R R H L R H V R H I R H M R H L K L L K V L K I L K M L K L L L V L I L M L L H L L H V L H I L H M

L H Posição 1 2 3 4 5 6 7 8 9 SEQ Nº: 19 F T L L R R L S L Variante K K

K K V K K I K K M K K F K K V K I K M K F K H K H V K H I K H M K H F R K R K V R K I R K M R K F R R V R I R M R F R H R H V R H I R H M R H F K K V K I K M K F V I M F H H V H I H M

H F Posição 1 2 3 4 5 6 7 8 9 SEQ Nº: 28 D P K S R L K S L Variante K

K V K I K M K F V I M F H H V H I H M H F R K R K V R K I R K M R K F R R V R I R M R F R H R H V R H I R H M R H F L K L K V L K I L K M L K F L L V L I L M L F L H L H V L H I L H M L H F

[114] Peptídeos mais longos (alongados) também podem ser apropriados. Também é possível que epítopos de MHC classe I, embora normalmente tenham de 8 a 11 aminoácidos de comprimento, sejam gerados pelo processamento de peptídeos mais longos ou por proteínas que incluam o epítopo real. É preferível que os resíduos que flanqueiam o epítopo sejam resíduos que não afetem significativamente a clivagem proteolítica necessária para expor o epítopo durante o processamento.

[115] Os peptídeos da invenção podem ser alongados em até quatro aminoácidos, ou seja, podem-se adicionar 1, 2, 3 ou 4 aminoácidos a qualquer extremidade em qualquer combinação entre 4:0 e 0:4. A Tabela 7 apresenta combinações de alongamentos de acordo com a invenção.

Tabela 7: Algumas combinações de peptídeos alongados da presente invenção C terminal N terminal 4 0 3 0 ou 1 2 0, 1 ou 2 1 0, 1, 2 ou 3 0 0, 1, 2, 3 ou 4 N terminal C terminal 4 0 3 0 ou 1 2 0, 1 ou 2 1 0, 1, 2 ou 3 0 0, 1, 2, 3 ou 4

[116] Os aminoácidos do alongamento/extensão podem ser os peptídeos da sequência original da proteína ou quaisquer outros aminoácidos. O alongamento pode ser utilizado para tornar os peptídeos mais estáveis ou mais solúveis.

[117] Portanto, os epítopos da presente invenção podem ser idênticos a epítopos que ocorrem naturalmente e que são associados a ou específicos para tumores, ou podem incluir epítopos que diferem em no máximo quatro resíduos do peptídeo de referência, conquanto apresentem atividade antigênica substancialmente idêntica.

[118] Em uma configuração alternativa, o peptídeo é alongado em mais de quatro aminoácidos em um ou ambos os lados, preferivelmente até atingir um comprimento total de até 30 aminoácidos. Assim, podem-se criar peptídeos ligantes de MHC classe II. A ligação ao MHC classe II pode ser testada por métodos conhecidos na técnica.

[119] Dessa forma, a presente invenção fornece peptídeos e variantes de epítopos de MHC classe I nas quais o peptídeo ou variante tem comprimento total entre 8 e 100, preferivelmente entre 8 e 30 ou, o mais preferido, entre 8 e 14, especificamente, 8, 9, 10, 11, 12, 13 ou 14 aminoácidos; no caso de peptídeos ligantes de classe II prolongados o comprimento também pode ser de 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21 ou 22 aminoácidos.

[120] Evidentemente, o peptídeo ou variante de acordo com a presente invenção terá a capacidade de se ligar a uma molécula do complexo principal de histocompatibilidade (MHC) classe I ou II. A ligação de um peptídeo ou variante a um complexo de MHC pode ser testada por métodos conhecidos na técnica.

[121] Preferivelmente, quando células T específicas para um peptídeo de acordo com a presente invenção são testadas contra os peptídeos substituídos, a concentração de peptídeos em que os peptídeos substituídos produzem metade do aumento máximo de lise em relação aos níveis basais é de não mais que cerca de 1 mM, preferivelmente não mais que cerca de 1 µM, mais preferivelmente não mais que cerca de 1 nM e ainda mais preferivelmente não mais que cerca de 100 pM e, o mais preferido, não mais que 10 pM. É preferível também que o peptídeo substituído possa ser reconhecido por células T citotóxicas de mais de um indivíduo, de pelo menos dois e, mais preferivelmente, de três indivíduos.

[122] Em uma configuração especialmente preferida da invenção, o(s) peptídeo(s) consiste(m) basicamente em uma sequência de aminoácidos de acordo com SEQ Nº 1 a SEQ Nº 251 e SEQ Nº 289 a SEQ Nº 291 e SEQ Nº 292 a SEQ Nº 299.

[123] “Consiste essencialmente em” significa que um peptídeo de acordo com a presente invenção contém, além da sequência de acordo com qualquer sequência de SEQ Nº 1 a SEQ Nº 251 e SEQ Nº 289 a SEQ Nº 291 e SEQ Nº 292 a SEQ Nº 299 ou variante das mesmas, outros prolongamentos formados por segmentos aminoácidos N- e/ou C-terminais, que não necessariamente formam parte do peptídeo que funciona como epítopo para epítopos que possuem moléculas de MHC.

[124] Contudo, esses segmentos podem ser importantes para tornar eficiente a introdução do peptídeo de acordo com a presente invenção em células. Em uma configuração da presente invenção, o peptídeo é parte de uma proteína de fusão que compreende, por exemplo, os aminoácidos N-terminais da cadeia invariante associada ao antígeno HLA-DR (p33, no seguinte “Ii”) conforme derivado do NCBI, GenBank número de acesso X00497. Em outras fusões, os peptídeos da presente invenção podem, conforme aqui descrito, ser fundidos com um anticorpo ou com uma parte funcional do mesmo, e em particular com uma sequência de um anticorpo, de modo a criar um alvo específico para o referido anticorpo ou, por exemplo, contra um anticorpo ou parte de um anticorpo específico para células dendríticas, conforme aqui descrito.

[125] Além disso, o peptídeo ou variante pode ser modificado ainda mais para melhorar a estabilidade e/ou a ligação a moléculas de MHC a fim de produzir uma resposta imune mais forte. Os métodos de otimização de tais sequências peptídicas são bem conhecidos na técnica e incluem, por exemplo, a introdução de ligações peptídicas reversas ou de ligações não peptídicas.

[126] Em uma ligação peptídica reversa, os aminoácidos não se ligam por meio de ligações peptídicas (–CO–NH–), mas por uma ligação peptídica invertida. Tal peptideomimetismo retroinvertido pode ser produzido usando-se métodos conhecidos na técnica, como, por exemplo, os descritos por Mezière et al (1997)(Mezière et al., 1997), que fica aqui incorporado por referência. Esta abordagem inclui criar pseudopeptídeos contendo alterações na cadeia básica e não na orientação das cadeias laterais. Mezière et al. (Mezière et al., 1997) demonstraram que esses pseudopeptídeos podem ser úteis para respostas de ligação de MHC e de células T auxiliares. Os peptídeos retroinvertidos, que contêm ligações NH–CO em vez de CO–NH, são muito mais resistentes à proteólise.

[127] São exemplos de ligações não peptídicas –CH2 –NH, – CH2S–, –CH2CH2–, –CH=CH–, –COCH2–, –CH(OH)CH2– e –CH2SO–.

US 4.897.445 fornece um método para síntese em fase sólida de ligações não- peptídicas (–CH2–NH–) em cadeias polipeptídicas envolvendo polipeptídeos sintetizados por procedimentos padrão, onde a ligação não peptídica é sintetizada pela reação de um aminoaldeído com um aminoácido na presença de NaCNBH3.

[128] Os peptídeos que compreendem as sequências descritas acima podem ser sintetizados com outros grupamentos químicos presentes em suas terminações amina ou carboxila para melhorar a estabilidade, biodisponibilidade e/ou afinidade dos peptídeos. Por exemplo, grupamentos hidrofóbicos como a carbobenzoxila, dansila ou t-butiloxicarbonila podem ser adicionados à amina terminal dos peptídeos. Da mesma forma, um grupamento acetila ou um grupamento 9-fluorenilmetóxi-carbonila pode ser adicionado à amina terminal dos peptídeos. Além disso, o grupamento hidrofóbico t- butiloxicarbonila ou um grupamento amida podem ser adicionados às carboxilas terminais dos peptídeos.

[129] Ademais, os peptídeos descritos podem ser sintetizados de forma a alterar suas configurações estéricas. Por exemplo, o D-isômero de um ou mais resíduos de aminoácidos do peptídeo pode ser utilizado em vez do L- isômero. Ainda mais, um ou mais resíduos de aminoácidos dos peptídeos da invenção podem ser substituídos por um dos resíduos de aminoácidos bem conhecidos e que não ocorrem naturalmente. Alterações como essas podem contribuir para aumentar a estabilidade, a biodisponibilidade ou a ação ligante dos peptídeos da invenção.

[130] Da mesma forma, um peptídeo da invenção ou variante do mesmo pode ser modificado quimicamente por meio de reações com aminoácidos específicos antes ou depois da síntese do peptídeo. Alguns exemplos de tais modificações são bem conhecidos na técnica e resumidos em, p.ex., R. Lundblad, Chemical Reagents for Protein Modification, 3rd ed. CRC Press, 2004(Lundblad, 2004), que fica aqui incorporado por referência. A modificação química de aminoácidos inclui, entre outras, modificação por acilação, amidinação, piridoxilação de lisina, alquilação redutora, trinitrobenzilação de grupamentos amina com ácido 2,4,6-trinitrobenzeno sulfônico (TNBS), modificação amídica de grupamentos carboxila e modificações sulfidrila mediante oxidação por ácido perfórmico de cisteína formando ácido cisteico, formação de derivados mercuriais, formação de dissulfetos mistos com outros compostos de tiol, reação com maleimida, carboximetilação com ácido iodoacético ou iodoacetamida e carbamoilação com cianato em pH alcalino, sem limitar-se a estes. Em relação a isso, os versados na técnica podem referir-se ao Capítulo 15 de Current Protocols In Protein Science, Eds. Coligan et al. (John Wiley & Sons NY 1995-2000) (Coligan et al., 1995) para obter mais detalhes sobre as metodologias de modificação química de proteínas.

[131] Resumidamente, a modificação de, p.ex., resíduos de arginila em proteínas baseia-se muitas vezes na reação de compostos com dicarbonilas vicinais como o fenilglioxal, o 2,3-butanediona e o 1,2-

ciclohexanediona para formar um adutor. Outro exemplo é a reação de metilglioxal com resíduos de arginina. A cisteína pode ser modificada sem alteração concomitante de outros sítios nucleofílicos como a lisina e a histidina.

Com isso, muitos reagentes estão disponíveis para modificar a cisteína. Os websites de empresas como a Sigma-Aldrich (http://www.sigma-aldrich.com) apresentam informações sobre reagentes específicos.

[132] A redução seletiva de ligações dissulfeto em proteínas também é comum. As ligações dissulfeto podem ser encontradas e oxidadas durante o tratamento térmico de produtos biofarmacêuticos. O Reagente K de Woodward pode ser empregado para modificar resíduos específicos de ácido glutâmico. A N-(3-(dimetilamino)propil)-N’-etil carbodiimida pode ser empregada para formar ligações cruzadas intramoleculares entre resíduos de lisina e um resíduo de ácido glutâmico. Por exemplo, o dietilpirocarbonato é um reagente para modificação de resíduos histidil em proteínas. A histidina também pode ser modificada usando-se 4-hidroxi-2-nonenal. A reação de resíduos de lisina e outros grupamentos α-amino é útil, por exemplo, para ligar peptídeos a superfícies ou para ligação cruzada de proteínas ou peptídeos. A lisina é o local de fixação do poli(etileno)glicol e é o principal sítio de modificação na glicosilação de proteínas. Os resíduos de metionina das proteínas podem ser modificados por, p.ex., iodoacetamida, bromoetilamina e cloramina T.

[133] O tetranitrometano e o N-acetilimidazol podem ser usados para modificar os resíduos de tirosila. A ligação cruzada por meio da formação de ditirosina pode ser efetuada com peróxido de hidrogênio e íons de cobre.

[134] Estudos recentes sobre a modificação do triptofano vem empregando a N-bromosuccinimida, 2-hidróxi-5-nitrobenzil brometo ou 3-bromo- 3-metil-2-(2-nitrofenilmercapto)-2H-indol (BPNS-escatol).

[135] A modificação bem-sucedida de proteínas e peptídeos terapêuticos com PEG frequentemente prolonga a meia-vida na circulação, e a ligação cruzada de proteínas com glutaraldeído, polietilenoglicol diacrilato e formaldeído é empregada para preparar hidrogéis. Muitos alergênios são modificados para imunoterapia por carbamilação com cianato de potássio.

[136] Um peptídeo ou variante onde o peptídeo é modificado ou inclui ligações não peptídicas é uma configuração preferida da invenção.

[137] Outra configuração da presente invenção se refere a um peptídeo que não é encontrado naturalmente, sendo que o referido peptídeo consiste ou consiste essencialmente em uma sequência de aminoácidos de acordo com SEQ Nº 1 a SEQ Nº 251 e SEQ Nº 289 a SEQ Nº 291 e SEQ Nº 292 a SEQ Nº 299 e foi produzido sinteticamente (p.ex. sintetizado) na forma de um sal farmaceuticamente aceitável. Os métodos de produção sintética de peptídeos são bem conhecidos na técnica. Os sais dos peptídeos de acordo com a presente invenção diferem substancialmente dos peptídeos em seu estado in vivo, pois esses peptídeos não se apresentam como sais in vivo. O peptídeo em forma de sal não-natural medeia a solubilidade do peptídeo, sobretudo no âmbito de composições farmacêuticas que compreendem os peptídeos (p.ex. as vacinas peptídicas aqui reveladas). Para fornecer eficientemente os peptídeos ao indivíduo a ser tratado, requer-se uma solubilidade suficiente e pelo menos substancial do(s) peptídeos(s) Preferivelmente, os sais são sais farmaceuticamente aceitáveis dos peptídeos. Os referidos sais de acordo com a invenção incluem sais alcalinos e alcalino-terrosos, tais como os sais da série de Hofmeister, que compreendem os ânions PO43-, SO42-, CH3COO-, Cl-, Br-, NO3-, ClO4-, I-, SCN- e os cátions NH4+, Rb+, K+, Na+, Cs+, Li+, Zn2+, Mg2+, Ca2+, Mn2+, Cu2+ e Ba2+. Sais específicos são selecionados entre (NH4)3PO4, (NH4)2HPO4, (NH4)H2PO4, (NH4)2SO4, NH4CH3COO, NH4Cl, NH4Br, NH4NO3, NH4CIO4, NH4I, NH4SCN, Rb3PO4, Rb2HPO4, RbH2PO4, Rb2SO4, Rb4CH3COO, Rb4Cl, Rb4Br, Rb4NO3, Rb4CIO4, Rb4I, Rb4SCN, K3PO4, K2HPO4, KH2PO4, K2SO4, KCH3COO, KCl, KBr, KNO3, KClO4, KI, KSCN,

Na3PO4, Na2HPO4, NaH2PO4, Na2SO4, NaCH3COO, NaCl, NaBr, NaNO3, NaCIO4, NaI, NaSCN, ZnCI2 Cs3PO4, Cs2HPO4, CsH2PO4, Cs2SO4, CsCH3COO, CsCl, CsBr, CsNO3, CsCIO4, CsI, CsSCN, Li3PO4, Li2HPO4, LiH2PO4, Li2SO4, LiCH3COO, LiCl, LiBr, LiNO3, LiClO4, LiI, LiSCN, Cu2SO4, Mg3(PO4)2, Mg2HPO4, Mg(H2PO4)2, Mg2SO4, Mg(CH3COO)2, MgCl2, MgBr2, Mg(NO3)2, Mg(ClO4)2, MgI2, Mg(SCN)2, MnCl2, Ca3(PO4),, Ca2HPO4, Ca(H2PO4)2, CaSO4, Ca(CH3COO)2, CaCl2, CaBr2, Ca(NO3)2, Ca(ClO4)2, CaI2, Ca(SCN)2, Ba3(PO4)2, Ba2HPO4, Ba(H2PO4)2, BaSO4, Ba(CH3COO)2, BaCl2, BaBr2, Ba(NO3)2, Ba(ClO4)2, BaI2 e Ba(SCN)2. São particularmente preferidos o acetato de NH, MgCl2, KH2PO4, Na2SO4, KCl, NaCl e CaCl2, tais como, por exemplo, sais cloreto ou acetato (trifluoroacetato).

[138] Geralmente, os peptídeos e variantes (pelo menos aquelas que contêm ligações peptídicas entre resíduos de aminoácidos) podem ser sintetizadas pelo método Fmoc-poliamida ou por síntese de peptídeos em fase sólida, conforme revelado por Lukas et al.(Lukas et al., 1981) e nas respectivas referências. O grupamento 9-fluorenilmetiloxicarbonil (Fmoc) protege temporariamente o grupamento N-amino. A clivagem repetitiva do grupo protetor altamente base-lábil é efetuada usando-se 20% piperidina em N, N- dimetilformamida. Os grupamentos em cadeias laterais podem ser protegidos mediante formação dos respectivos éteres butílicos (para treonina e tirosina), ésteres butílicos (para ácido glutâmico e ácido aspártico), derivados butiloxicarbonila (para lisina e histidina), derivados tritila (para cisteína) e derivados 4-metoxi-2,3,6-trimetilbenzenossulfonil (para arginina). Se houver resíduos C-terminais de glutamina ou asparagina, o grupamento 4,4'- dimetoxibenzidrila é usado para proteger os grupamentos amido das cadeias laterais. O suporte de fase sólida é baseado em um polímero de polidimetil- acrilamida constituído a partir de três monômeros: dimetilacrilamida (monômero da cadeia básica), bisacriloiletileno diamina (ligante cruzado) e acriloilsarcosina metil éster (agente funcionalizante). O agente clivável da ligação peptídeo-resina empregado é um derivado ácido-lábil do ácido 4-hidroximetil-fenoxiacético.

Todos os derivados de aminoácidos são adicionados na forma de anidridos simétricos pré-formados, com exceção de asparagina e glutamina, que são adicionadas usando-se um procedimento de acoplamento reverso mediado por N, N-dicicloexilcarbodiimida/1-hidroxibenzotriazol. Todas as reações de acoplamento e desproteção são monitoradas por procedimentos de teste com ninhidrina, ácido trinitrobenzenossulfônico ou isotina. Ao final da síntese, os peptídeos são clivados da resina de suporte e, ao mesmo tempo, os grupamentos protetores das cadeias laterais são removidos por tratamento com ácido trifluoracético a 95% contendo uma mistura de 50% de captantes. Alguns captantes comumente utilizados são etanoditiol, fenol, anisol e água, e a escolha exata depende dos aminoácidos constituintes do peptídeo que está sendo sintetizado. Também é possível combinar metodologias de fase sólida e fase em solução para sintetizar peptídeos (ver, por exemplo,(Bruckdorfer et al., 2004), e referências nele citadas).

[139] O ácido trifluoracético é removido por evaporação a vácuo seguida de trituração com éter dietílico para produzir o peptídeo bruto. Quaisquer captantes que ainda estiverem presentes serão retirados por um procedimento de extração simples, no qual a liofilização da fase aquosa produz o peptídeo bruto livre de captantes. Os reagentes para síntese de peptídeos são geralmente fornecidos por, p.ex., Calbiochem-Novabiochem (Nottingham, Reino Unido).

[140] A purificação pode ser realizada por qualquer uma ou por uma combinação de técnicas como recristalização, cromatografia de exclusão por tamanho, cromatografia de troca iônica, cromatografia de interação hidrofóbica e (geralmente) cromatografia líquida de alto desempenho de fase reversa empregando, p.ex., um gradiente de separação de acetonitrilo e água.

[141] A análise dos peptídeos pode ser realizada empregando-se cromatografia em camada fina, eletroforese — sobretudo a eletroforese capilar com extração em fase sólida (CSPE, “capillary solid phase extraction”) —, cromatografia líquida de alto desempenho de fase reversa, análise de aminoácidos após hidrólise ácida e por espectrometria de massa com bombardeio por átomos rápidos (FAB, “fast atom bombardment”), assim como análise espectrométrica de massa usando as técnicas MALDI e ESI-Q-TOF.

[142] Para selecionar peptídeos apresentados de forma exacerbada, um perfil de apresentação é calculado para mostrar a apresentação mediana da amostra e a variação entre réplicas. O perfil justapõe amostras da entidade tumoral relevante a uma base de tecidos tumorais normais. Em seguida, cada um desses perfis pode ser consolidado em um escore de sobreapresentação calculando-se o p-valor de um modelo misto de efeitos lineares(Pinheiro et al., 2015) com ajuste para testes múltiplos pelo método da taxa de falsas descobertas(Benjamini and Hochberg, 1995) (cf. Exemplo 1 na Figura 1).

[143] Para identificação e quantificação relativa de ligantes de HLA por espectrometria de massa, moléculas de HLA de amostras de tecido congeladas criogenicamente foram purificadas e peptídeos associados ao HLA foram isolados. Os peptídeos isolados foram separados e suas sequências foram identificadas por ensaios de cromatografia líquida com espectrometria de massa (LC-MS) com ionização por nanoeletrospray (nanoESI). As sequências peptídicas resultantes foram verificadas comparando-se o padrão de fragmentação dos peptídeos associados a tumores (TUMAPs) identificados em amostras (N =91 amostras) de carcinoma colangiocelular, carcinoma de bexiga, carcinoma de células escamosas de cabeça e pescoço, carcinoma de células renais, carcinoma hepatocelular, câncer colorretal, câncer da vesícula biliar, câncer de esôfago, câncer de mama, câncer de ovário, câncer de próstata, câncer de pulmão (incluindo adenocarcinoma de pulmão de células não pequenas, câncer de células escamosas de células não pequenas e câncer de pulmão de pequenas células), câncer de pâncreas, câncer do endométrio uterino, câncer gástrico, glioblastoma, leucemia linfocítica crônica, leucemia mieloide aguda, linfoma não-Hodgkin e melanoma, onde os padrões de fragmentação eram idênticos aos dos peptídeos sintéticos de referência. Como os peptídeos foram identificados diretamente como ligantes de moléculas de HLA de tumores primários, esses resultados constituem uma evidência direta de que os peptídeos identificados são processados naturalmente e apresentados em tecidos cancerosos primários obtidos de 91 pacientes com carcinoma colangiocelular, carcinoma de bexiga, carcinoma de células escamosas de cabeça e pescoço, carcinoma de células renais, carcinoma hepatocelular, câncer colorretal, câncer da vesícula biliar, câncer de esôfago, câncer de mama, câncer de ovário, câncer de próstata, câncer de pulmão (incluindo adenocarcinoma de pulmão de células não pequenas, câncer de células escamosas de células não pequenas e câncer de pulmão de pequenas células), câncer de pâncreas, câncer do endométrio uterino, câncer gástrico, glioblastoma, leucemia linfocítica crônica, leucemia mieloide aguda, linfoma não-Hodgkin e melanoma.

[144] O pipeline de descoberta XPRESIDENT® v2.1 (ver, por exemplo, US 2013-0096016, que fica aqui integralmente incorporada por referência) permite identificar e selecionar peptídeos sobrapresentados relevantes candidatos a uso vacinal com base na quantificação relativa direta dos níveis de peptídeo restrito por HLA em tecidos cancerosos em comparação com diversos outros tecidos e órgãos não-cancerosos. Isso foi obtido mediante desenvolvimento de quantificação diferencial sem marcadores com emprego dos dados adquiridos por cromatografia líquida com espectrometria de massa (LC- MS), que foram processados por um pipeline de dados exclusivo. O pipeline combina algoritmos de identificação de sequências, agregação espectral, contagem de íons, alinhamento de tempos de retenção e desconvolução e normalização de estados de carga.

[145] Os níveis de apresentação, que incluem estimativas de erro para cada peptídeo, foram estabelecidos. Foram identificados peptídeos apresentados exclusivamente em tecidos tumorais e peptídeos apresentados de forma aumentada em tumores em comparação com tecidos e órgãos não- cancerosos.

[146] Complexos de peptídeos com HLA derivados de carcinoma colangiocelular, carcinoma de bexiga, carcinoma de células escamosas de cabeça e pescoço, carcinoma de células renais, carcinoma hepatocelular, câncer colorretal, câncer da vesícula biliar, câncer de esôfago, câncer de mama, câncer de ovário, câncer de próstata, câncer de pulmão (incluindo adenocarcinoma de pulmão de células não pequenas, câncer de células escamosas de células não pequenas e câncer de pulmão de pequenas células), câncer de pâncreas, câncer do endométrio uterino, câncer gástrico, glioblastoma, leucemia linfocítica crônica, leucemia mieloide aguda, linfoma não-Hodgkin e melanoma foram purificados e os peptídeos associados a HLA foram isolados e analisados por LC-MS (ver Exemplo 1). Todos os TUMAPs constantes do presente pedido de patente foram identificados por meio dessa abordagem em amostras de carcinoma colangiocelular, carcinoma de bexiga, carcinoma de células escamosas de cabeça e pescoço, carcinoma de células renais, carcinoma hepatocelular, câncer colorretal, câncer da vesícula biliar, câncer de esôfago, câncer de mama, câncer de ovário, câncer de próstata, câncer de pulmão (incluindo adenocarcinoma de pulmão de células não pequenas, câncer de células escamosas de células não pequenas e câncer de pulmão de pequenas células), câncer de pâncreas, câncer do endométrio uterino, câncer gástrico, glioblastoma, leucemia linfocítica crônica, carcinoma colangiocelular, carcinoma de bexiga, carcinoma de células escamosas de cabeça e pescoço, carcinoma de células renais, carcinoma hepatocelular, câncer colorretal, câncer da vesícula biliar, câncer de esôfago, câncer de mama, câncer de ovário, câncer de próstata, câncer de pulmão (incluindo adenocarcinoma de pulmão de células não pequenas, câncer de células escamosas de células não pequenas e câncer de pulmão de pequenas células), câncer de pâncreas, câncer do endométrio uterino, câncer gástrico, glioblastoma, leucemia linfocítica crônica, leucemia mieloide aguda, linfoma não-Hodgkin e melanoma.

[147] Os TUMAPs identificados em tecidos normais e em várias amostras de carcinoma colangiocelular, carcinoma de bexiga, carcinoma de células escamosas de cabeça e pescoço, carcinoma de células renais, carcinoma hepatocelular, câncer colorretal, câncer da vesícula biliar, câncer de esôfago, câncer de mama, câncer de ovário, câncer de próstata, câncer de pulmão (incluindo adenocarcinoma de pulmão de células não pequenas, câncer de células escamosas de células não pequenas e câncer de pulmão de pequenas células), câncer de pâncreas, câncer do endométrio uterino, câncer gástrico, glioblastoma, leucemia linfocítica crônica, leucemia mieloide aguda, linfoma não-Hodgkin e melanoma foram quantificados a partir de dados de ensaios de contagem de íons sem marcação em LC-MS. O método pressupõe que as áreas de sinal de LC-MS de um peptídeo se correlacionam com sua abundância na amostra. Todos os sinais quantitativos de um peptídeo em vários experimentos de LC-MS foram normalizados com base na tendência central, e as médias por amostra foram calculadas e consolidadas em um gráfico de barras para criar o perfil de apresentação. O perfil de apresentação consolida vários métodos de análise diferentes, como buscas em bancos de dados de proteínas, agregação espectral, desconvolução do estado de carga (eliminação da carga) e alinhamento e normalização do tempo de retenção.

[148] Além da sobreapresentação do peptídeo, a expressão do mRNA do gene subjacente também foi testada. Os dados de mRNA foram obtidas por meio de análises de sequenciamento de RNA de tecidos normais e de tecidos cancerosos (cf. Exemplo 2 na Figura 2). Uma fonte adicional de dados de tecido normal foi uma base de dados de dados de expressão de RNA publicamente disponível de cerca de 3.000 amostras de tecido normal (Linsdale, 2013). Preferivelmente, foram incluídos na presente invenção peptídeos derivados de proteínas codificadas por mRNAs com expressão acentuada em tecidos cancerosos e pouca ou nenhuma expressão em tecidos normais.

[149] A presente invenção fornece peptídeos úteis no tratamento de cânceres e tumores que apresentem os peptídeos da invenção de forma exacerbada ou exclusiva, preferivelmente carcinoma colangiocelular, carcinoma de bexiga, carcinoma de células escamosas de cabeça e pescoço, carcinoma de células renais, carcinoma hepatocelular, câncer colorretal, câncer da vesícula biliar, câncer de esôfago, câncer de mama, câncer de ovário, câncer de próstata, câncer de pulmão (incluindo adenocarcinoma de pulmão de células não pequenas, câncer de células escamosas de células não pequenas e câncer de pulmão de pequenas células), câncer de pâncreas, câncer do endométrio uterino, câncer gástrico, glioblastoma, leucemia linfocítica crônica, leucemia mieloide aguda, linfoma não-Hodgkin e melanoma. Demonstrou-se por meio de espectrometria de massa que esses peptídeos são apresentados naturalmente por moléculas de HLA em amostras de carcinoma colangiocelular, carcinoma de bexiga, carcinoma de células escamosas de cabeça e pescoço, carcinoma de células renais, carcinoma hepatocelular, câncer colorretal, câncer da vesícula biliar, câncer de esôfago, câncer de mama, câncer de ovário, câncer de próstata, câncer de pulmão (incluindo adenocarcinoma de pulmão de células não pequenas, câncer de células escamosas de células não pequenas e câncer de pulmão de pequenas células), câncer de pâncreas, câncer do endométrio uterino, câncer gástrico, glioblastoma, leucemia linfocítica crônica, leucemia mieloide aguda, linfoma não-Hodgkin e melanoma.

[150] Demonstrou-se que muitos dos genes e proteínas dos quais os peptídeos se originam (também denominadas “proteínas completas” ou “proteínas subjacentes”) são acentuadamente sobrexpressos em câncer em comparação com tecidos normais. Para fins da presente invenção, “tecidos normais” significa células saudáveis originárias de sangue, vasos sanguíneos, cérebro, coração, fígado, pulmão, tecido adipose, glândula adrenal, duto biliar, bexiga, medulla óssea, esôfago, olhos, vesícula biliar, cabeça e pescoço, intestino grosso, intestine delgado, rim, linfonodo, nervo periférico, pâncreas, glândula paratireoide, peritôneo, pituitária, pleura, músculo esquelético, pele, medulla espinhal, baço, estômago, tireoide, traqueia, ureter ou outros tecidos normais que apresentem graus acentuados de associação com os genes fonte (ver Exemplo 2). Ademais, os peptídeos são fortemente sobrexpressos em tecidos tumorais. Para fins desta invenção, “tecido tumoral” significa uma amostra oriunda de um paciente que apresenta carcinoma colangiocelular, carcinoma de bexiga, carcinoma de células escamosas de cabeça e pescoço, carcinoma de células renais, câncer da junção gastroesofageal, carcinoma hepatocelular, câncer colorretal, câncer da vesícula biliar, câncer de esôfago, câncer de mama, câncer de ovário, câncer de próstata, câncer de pulmão (incluindo adenocarcinoma de pulmão de células não pequenas, câncer de células escamosas de células não pequenas e câncer de pulmão de pequenas células), câncer de pâncreas, câncer do endométrio uterino, câncer gástrico, glioblastoma, leucemia linfocítica crônica, leucemia mieloide aguda, linfoma não- Hodgkin e melanoma, mas não de tecidos normais (ver Exemplo 1).

[151] Os peptídeos ligados ao HLA podem ser reconhecidos pelo sistema imunológico, especificamente pelos linfócitos T. As células T podem destruir células que apresentem o complexo HLA/peptídeo reconhecido em células que apresentem tais peptídeos, tais como células de, p.ex., carcinoma colangiocelular, carcinoma de bexiga, carcinoma de células escamosas de cabeça e pescoço, carcinoma de células renais, carcinoma hepatocelular, câncer colorretal, câncer da vesícula biliar, câncer de esôfago, câncer de mama, câncer de ovário, câncer de próstata, câncer de pulmão (incluindo adenocarcinoma de pulmão de células não pequenas, câncer de células escamosas de células não pequenas e câncer de pulmão de pequenas células), câncer de pâncreas, câncer do endométrio uterino, câncer gástrico, glioblastoma, leucemia linfocítica crônica, leucemia mieloide aguda, linfoma não-Hodgkin e melanoma.

[152] Os peptídeos da presente invenção mostraram-se capazes de estimular respostas de células T e/ou são sobreapresentados; portanto, pode- se usá-los para produzir anticorpos e/ou TCRs, tais como os sTCRs solúveis de acordo com a presente invenção (ver Exemplo 3 e Exemplo 4). Além disso, os peptídeos da presente invenção também podem ser usados, quando formam complexos com os respectivos MHCs, para produzir anticorpos e/ou sTCRs, sobretudo sTCRs, de acordo com a presente invenção. Os respectivos métodos são bem conhecidos de indivíduos versados na técnica e também podem ser encontrados na respectiva literatura (ver também adiante). Assim, os peptídeos da presente invenção são úteis para gerar uma resposta imune em um paciente, por meio da qual as células tumorais podem ser destruídas. Pode-se induzir uma resposta imune em um paciente administrando-se os peptídeos descritos ou substâncias precursoras apropriadas (p.ex. peptídeos alongados, proteínas ou ácidos nucleicos que codificam tais peptídeos) diretamente ao paciente, idealmente em combinação com agentes que promovem a imunogenicidade (i.é., um adjuvante). Pode-se esperar que a resposta imune originária de tal vacinação terapêutica seja altamente específica contra células tumorais porque os peptídeos-alvo da presente invenção não são apresentados em tecidos normais em números de cópias semelhantes, evitando o risco de reações autoimunes indesejadas contra células normais do paciente.

[153] A presente descrição refere-se também a receptores de células T (TCRs) que compreendem uma cadeia alfa e uma cadeia beta (TCRs alfa/beta). Também são fornecidos peptídeos de acordo com a invenção capazes de se ligar a TCR e anticorpos quando apresentados por uma molécula de MHC.

[154] A presente descrição se refere também a fragmentos dos TCRs de acordo com a presente invenção que são capazes de se ligarem a um antígeno peptídico de acordo com a presente invenção quando estes são apresentados por uma molécula de HLA. O termo se refere em particular a fragmentos de TCR solúveis (p.ex. TCRs sem as porções transmembrana e/ou sem as regiões constantes, TCRs de cadeia única e fusões dos mesmos, p.ex., com imunoglobulinas).

[155] A presente descrição refere-se também a ácidos nucleicos, vetores e células hospedeiras para expressão de TCRs e peptídeos da presente descrição, assim como a métodos de usar os mesmos.

[156] O termo “receptor de células T” (abreviatura TCR) refere-se a uma molécula heterodimérica que compreende uma cadeia polipeptídica alfa (cadeia alfa) e uma cadeia polipeptídica beta (cadeia beta), na qual o receptor heterodimérico é capaz de se ligar a um antígeno peptídico apresentado por uma molécula de HLA. O termo também inclui os chamados TCRs gama/delta.

[157] Em uma configuração, a descrição fornece um método de produção de um TCR conforme aqui descrito, sendo que o método compreende cultivar células hospedeiras capazes de expressar o TCR em condições apropriadas para promover a expressão do TCR.

[158] Em outro aspecto, a descrição refere-se a métodos de acordo com a descrição, sendo que o antígeno é carregado em moléculas de MHC classe I ou II expressas na superfície de uma célula apresentadora de antígenos apropriada ou de uma célula apresentadora de antígenos artificial colocando-se uma quantidade suficiente do antígeno em contato com uma célula apresentadora de antígenos ou o antígeno é carregado em tetrâmetros de MHC classe I ou II por meio da tetramerização de monômeros de complexos de MHC classe I ou II com antígenos.

[159] As cadeias alta e beta dos TCRs alfa/beta e as cadeias gama e delta dos TCRs gama/delta são geralmente consideradas como possuindo dois “domínios” cada: o domínio variável e o domínio constante. O domínio variável consiste na concatenação de uma região variável (V) com uma região juncional (J). O domínio variável também pode incluir uma região líder (L), e as cadeias beta e delta também podem apresentar uma região de diversidade (D). Os domínios constantes das cadeias alfa e beta também podem incluir domínios transmembrana (TM) C-terminais que ancoram as cadeias alfa e beta à membrana celular.

[160] Em relação aos TCRs gama/delta, o termo “domínio variável do TCR gama” conforme aqui utilizado refere-se à concatenação da região gama V do TCR (TRGV) sem região líder (L) com a região TCR gama J (TRGJ), e o termo TCR gama de domínio constante refere-se à região extracelular do TRGC ou a uma sequência de TRGC com truncamento C-terminal. Da mesma forma, o termo “domínio variável de TCR delta” refere-se à concatenação da região TCR delta V (TRDV) sem região líder (L) com a região TCR delta D/J (TRDD/TRDJ), e o termo “domínio constante do TCR delta” refere-se à região extracelular do TRDC ou a uma sequência de TRDC com truncamento C-terminal.

[161] Os TCRs da presente invenção se ligam preferivelmente a um complexo de peptídeo com HLA com afinidade de ligação (KD) de cerca de 100 µM ou menos, cerca de 50 µM ou menos, cerca de 25 µM ou menos ou cerca de 10 µM ou menos. São mais preferíveis os TCRs de alta afinidade cujas afinidades de ligação sejam de aproximadamente 1 µM ou menos, cerca de 100 nM ou menos, cerca de 50 nM ou menos ou cerca de 25 nM ou menos. São exemplos não limitantes dos intervalos de afinidade de ligação preferidos de TCRs da presente invenção cerca de 1 nM a cerca de 10 nM; cerca de 10 nM a cerca de 20 nM; cerca de 20 nM a cerca de 30 nM; cerca de 30 nM a cerca de 40 nM; cerca de 40 nM a cerca de 50 nM; cerca de 50 nM a cerca de 60 nM; cerca de 60 nM a cerca de 70 nM; cerca de 70 nM a cerca de 80 nM; cerca de 80 nM a cerca de 90 nM; e cerca de 90 nM a cerca de 100 nM.

[162] Conforme aqui utilizado em relação aos TCRs da presente descrição, “ligação específica” e variações gramaticais do termo são usados para designar um TCR com afinidade de ligação (KD) de 100 µM ou menos para um complexo de HLA com peptídeo.

[163] As TCRs alfa/beta heterodiméricas da presente descrição podem ter uma ligação dissulfeto introduzida entre seus domínios constantes.

Os TCRs preferidos deste tipo incluem aqueles com uma sequência de domínio TRAC constante e uma sequência de TRBC1 ou TRBC2 constante, exceto que a Tre 48 do TRAC e a Ser 57 do TRBC1 ou TRBC2 são substituídas por resíduos de cisteína, e essas cisteínas formam uma ponte dissulfeto entre a sequência de domínio constante do TRAC e a sequência de domínio constante do TRBC1 ou TRBC2 do TCR.

[164] Com ou sem a introdução da ligação entre cadeias mencionada anteriormente, os TCRs alfa/beta heterodiméricos da presente descrição podem apresentar um domínio com sequência constante codificado pelo gene TRAC e um domínio TRBC1 ou TRBC2 com sequência constante, e as sequências do domínio constante TRAC e dos domínios constantes TRBC1 ou TRBC2 do TCR podem ser ligadas uma à outra pela ligação dissulfeto nativa entre a Cis4 do éxon 2 da TRAC e a Cis2 do éxon 2 da TRBC1 ou da TRBC2.

[165] Os TCRs da presente descrição podem compreender um marcador detectável, selecionado do grupo formado por um radionuclídeo, um fluoróforo e biotina. Os TCRs da presente descrição podem ser conjugados com um agente terapeuticamente ativo, como um radionuclídeo, um agente quimioterápico ou uma toxina.

[166] Em uma configuração, um TCR da presente descrição que apresenta pelo menos uma mutação na cadeia alfa e/ou apresenta pelo menos uma mutação na cadeia beta exibe glicosilação modificada em comparação com o TCR sem mutação.

[167] Em uma configuração, um TCR que compreende pelo menos uma mutação na cadeia alfa do TCR e/ou a cadeia beta do TCR possui afinidade de ligação por e/ou meia-vida de ligação para um complexo de peptídeo com molécula de HLA que corresponde a pelo menos o dobro do de um TCR que compreende a cadeia alfa não-mutante do TCR e/ou a cadeia beta não-mutante do TCR. A melhora da afinidade de TCRs específicas para tumores e sua exploração depende da existência de uma janela na qual o TCR apresenta máxima afinidade. A existência dessa janela baseia-se em observações de que TCRs específicos para patógenos restritos por HLA-B*B08 geralmente possuem valores de KD 10 vezes menores que os de TCRs específicos para autoantígenos associados a tumor restritos por HLA-B*08. Sabe-se atualmente que, embora os antígenos tumorais tenham potencial imunogênico, apenas proteínas mutantes ou cujo processamento pós-tradução foi alterado serão consideradas estranhas pelo sistema imune; afinal, os tumores se originam das células do próprio indivíduo. Os antígenos sobrerregulados ou sobrexpressos (os chamados autoantígenos) nem sempre induzem uma resposta imune funcional contra o tumor. As células T que expressam TCRs reativos a esses antígenos são selecionadas negativamente no timo por um processo conhecido como tolerância central, no qual apenas células T com TCRs de baixa afinidade para autoantígenos permanecem. Portanto, a afinidade dos TCRs ou de variantes da presente descrição para os peptídeos pode ser melhorada por métodos bem conhecidos na técnica.

[168] A presente descrição se refere também a um método de identificação de isolamento de um TCR de acordo com a presente invenção,

sendo que o referido método compreende a incubação de células mononucleares do sangue periférico (CMSP) de doadores negativos para HLA- B*08 com monômeros de peptídeo B*08, incubação das CMSPs com ficoeritrina tetramérica (PE) e isolamento das células T que apresentam avidez elevada por separação celular ativada por fluorescência (FACS)-Calibur.

[169] A presente descrição refere-se também a um método de identificação e isolamento de TCR de acordo com a presente descrição, sendo que o referido método compreende a obtenção de um camundongo transgênico com a totalidade dos lócus do gene TCRαβ humano (1,1 e 0,7 Mb), no qual as células T expressam um repertório diversificado de TCR humano que compensa a deficiência de TCR de camundongo e imuniza o animal com o peptídeo de interesse; refere-se ainda à incubação de CMSP obtidas de camundongos transgênicos com ficoeritrina tetramérica (PE) e isolamento de células T de alta avidez por separação de células ativadas por fluorescência segundo FACS- Calibur.

[170] Em um aspecto, para obter células T que expressem TCRs da presente descrição, realiza-se a clonagem de ácidos nucleicos que codificam as cadeias TCR-alfa e/ou TCR-beta da presente descrição em vetores de expressão, como retrovírus gama ou lentivírus. Uma vez gerados, os vírus recombinantes têm sua funcionalidade testada, incluindo especificidade para antígenos e avidez funcional. Em seguida, uma alíquota do produto final é utilizada para transdução da população de células T alvo (geralmente purificada de CMSP do paciente), que é então expandida antes de ser infundida no paciente.

[171] Em outro aspecto, para se obter TCRs que expressam células T da presente descrição, RNAs de TCR são sintetizados por meio de procedimentos conhecidos na técnica, p.ex. sistemas de transcrição in vitro. Os RNAs de TCRs sintetizados in vitro são então introduzidos em células T CD8+ primárias obtidas de doadores saudáveis por eletroporação para que reexpressem as cadeias TCR-alfa e/ou TCR-beta específicas para tumores.

[172] Para aumentar a expressão, os ácidos nucleicos que codificam os TCRs da presente descrição podem ser ligados operacionalmente a promotores fortes, tais como repetição terminal longa (LTRs) em retrovírus, citomegalovírus (CMV), vírus de células tronco murinas (MSCV) U3, fosfoglicerato quinase (PGK), β-actina, ubiquitina e um promotor composto de vírus símio 40 (SV40)/CD43, fator de alongamento (EF)-1a e o promotor do vírus formador de foco esplênico (SFFV). Em uma configuração preferida, o promotor é heterólogo em relação ao ácido nucleico expresso.

[173] Além dos promotores fortes, os cassetes de expressão de TCR da presente descrição podem conter outros elementos que podem incentivar a expressão de transgenes, tais como um trato central de polipurina (cPPT), que promove a translocação central de estruturas lentivirais(Follenzi et al., 2000), e o elemento regulatório pós-transcricional do vírus da hepatite da marmota (wPRE), que aumenta os níveis da expressão do transgene ao melhorar a estabilidade do RNA (Zufferey et al., 1999).

[174] As cadeias alfa e beta de um TCR da presente invenção podem ser codificadas por ácidos nucleicos localizados em vetores separados ou por polinucleotídeos localizados no mesmo vetor.

[175] Para obter níveis elevados de expressão superficial de TCR, tanto a cadeia TCR-alfa como a TCR-beta do TCR introduzido precisam ser transcritas em volumes elevados. Isso requer que as cadeias TCR-alfa e TCR- beta da presente descrição sejam clonadas com formação de estruturas bicistrônicas em um único vetor, o que se mostrou suficiente para superar esse obstáculo. O uso de um sítio de entrada intra-ribossômico viral (IRES) entre as cadeias TCR-alfa e TCR-beta induz a expressão coordenada das duas cadeias, pois as cadeias TCR-alfa e TCR-beta são ambas geradas a partir de um único produto de transcrição, que é clivado em duas proteínas durante a tradução, garantindo que as cadeias TCR-alfa e TCR-beta sejam produzidas em proporção equimolar (Schmitt et al., 2009).

[176] Os ácidos nucleicos que codificam os TCRs da presente descrição podem ser otimizados ao nível de seus códons para aumentar a expressão em uma célula hospedeira. O código genético é redundante e permite que alguns aminoácidos sejam codificados por mais de um códon, mas alguns códons são menos adequados que outros devido a fatores como, por exemplo, a disponibilidade relativa de tRNAs correspondentes (Gustafsson et al., 2004).

Demonstrou-se que a modificação das sequências dos genes TCR-alfa e TCR- beta de modo que cada aminoácido seja codificado pelo códon ideal para expressão de genes de mamíferos e de modo que a instabilidade de motivos ou de sítios de splicing crípticos seja eliminada aumenta significativamente a expressão de genes de TCR-alfa e TCR-beta (Scholten et al., 2006).

[177] Além disso, erros de pareamento entre a cadeia de TCR endógena e a introduzida podem criar especificidades que acarretam risco significativo de autoimunidade. Por exemplo, a formação de dímeros mistos de TCR pode reduzir o número de moléculas CD3 disponíveis para formar complexos TCR devidamente pareados, o que diminui significativamente a avidez funcional das células que expressam o TCR introduzido (Kuball et al., 2007).

[178] Para reduzir erros de pareamento, o domínio C-terminal das cadeias do TCR introduzidas na presente descrição pode ser modificado para promover afinidade entre cadeias e, ao mesmo tempo, tornar as cadeias introduzidas menos capazes de emparelhar com o TCR endógeno. Essas estratégias podem consistir em substituição dos domínios C-terminais de TCR- alfa e TCR-beta humanos por seus correspondentes murinos (domínio C- terminal murinizado), geração de uma segunda ponte dissulfeto entre as cadeias no domínio C-terminal introduzindo-se um segundo resíduo de cisteína tanto na cadeia TCR-alfa como na cadeia TCR-beta do TCR introduzido (modificação por cisteína), troca de resíduos que interagem nos domínios C-terminais das cadeias TCR-alfa TCR-beta (“knob in hole”) e fusão dos domínios variáveis das cadeias TCR-alfa e TCR-beta diretamente no CD3ζ (fusão de CD3ζ) (Schmitt et al., 2009).

[179] Em uma configuração, uma célula hospedeira é modificada para expressar um TCR da presente descrição. Em algumas configurações preferidas, a célula hospedeira é uma célula T humana ou um progenitor de célula T. Em algumas configurações, a célula T ou a célula progenitora de célula T é obtida de um paciente com câncer. Em outras configurações, a célula T ou a célula progenitora de célula T é obtida de um doador saudável. As células hospedeiras da presente descrição podem ser alogênicas ou autólogas em relação ao paciente a ser tratado. Em uma configuração a célula hospedeira é uma célula T gama/delta transformada para expressar um TCR alfa/beta.

[180] Uma “composição farmacêutica” significa uma composição apropriada para administração a um ser humano em um ambiente clínico.

Preferivelmente, a composição farmacêutica é estéril e produzida de acordo com as diretrizes de Boas Práticas de Fabricação.

[181] As composições farmacêuticas compreendem os peptídeos tanto em forma livre como na forma de um sal farmaceuticamente aceitável (ver também o texto anterior). Conforme aqui utilizado, “sal farmaceuticamente aceitável” refere-se a um derivado dos peptídeos revelados onde o peptídeo é modificado elaborando-se sais ácidos ou básicos do agente. Por exemplo, os sais ácidos são preparados a partir da base livre (geralmente onde a forma neutra da droga possui um grupamento –NH2 neutro) envolvendo reação com um ácido apropriado. Entre os ácidos apropriados para preparar sais ácidos estão tanto ácidos orgânicos (p.ex. ácido acético, ácido propiônico, ácido glicólico, ácido pirúvico, ácido oxálico, ácido málico, ácido malônico, ácido succínico, ácido maleico, ácido fumárico, ácido tartárico, ácido cítrico, ácido benzoico, ácido cinâmico, ácido mandélico, ácido metanossulfônico, ácido etanossulfônico, ácido p-toluenossulfônico, ácido salicílico e assemelhados) como ácidos inorgânicos (p.ex. ácido clorídrico, ácido bromídrico, ácido sulfúrico, ácido nítrico, ácido fosfórico e assemelhados). Por outro lado, a preparação de sais básicos de grupamentos ácidos que podem estar presentes em um peptídeo são preparados usando-se uma base farmaceuticamente aceitável como hidróxido de sódio, hidróxido de potássio, hidróxido de amônia, hidróxido de cálcio, trimetilamina ou assemelhados.

[182] Em uma configuração especialmente preferida, as composições farmacêuticas compreendem os peptídeos na forma de sais do ácido acético (acetatos), de trifluoracetatos ou do ácido clorídrico (cloretos).

[183] Preferivelmente, o medicamento da presente invenção é um imunoterápico como uma vacina. Ela pode ser administrada ao paciente, seja no órgão afetado ou por via sistêmica i.d., i.m., s.c., i.p. e i.v. ou aplicada ex vivo em células derivadas do paciente ou de linhagens celulares humanas que são posteriormente administradas ao paciente ou usadas in vitro para selecionar uma subpopulação de células imunes derivadas do paciente, que são então readministradas ao paciente. Se o ácido nucleico for administrado a células in vitro, pode ser útil que as células sejam transfectadas para que coexpressem citoquinas imunoestimulatórias como a interleucina 2. O peptídeo pode ser basicamente puro ou associado a um adjuvante imunoestimulatório (ver adiante) ou usado em associação com citoquinas imunoestimulatórias ou ser administrado por um sistema de administração apropriado como, por exemplo, lipossomos. O peptídeo também pode ser conjugado com um transportador apropriado, como a hemocianina de lapa (KLH, “keyhole limpet hemocyanin”) ou manana (ver WO 95/18145 e(Longenecker et al., 1993)). O peptídeo também pode ser marcado por uma proteína de fusão ou ser uma molécula híbrida.

Espera-se que os peptídeos cujas sequências são mostradas na presente invenção sejam capazes de estimular células T CD4 ou CD8. Entretanto, a estimulação de células T CD8 é mais eficiente na presença do auxílio proporcionado por células T auxiliares CD4. Portanto, para epítopos de MHC classe I que estimulam células T CD8, o elemento de fusão ou seções de uma molécula híbrida proporcionam epítopos de maneira apropriada, que estimulam células T CD4-positivas. Os epítopos estimulantes de CD4 e CD8 são bem conhecidos na técnica e incluem aqueles identificados na presente invenção.

[184] Em um aspecto, a vacina compreende pelo menos um peptídeo cuja sequência de aminoácidos é apresentada em SEQ Nº 1 a SEQ Nº 251 e SEQ Nº 289 a SEQ Nº 291 e pelo menos um outro peptídeo, preferivelmente de 2 a 50, mais preferivelmente de 2 a 25, ainda mais preferivelmente de 2 a 20 e, o mais preferido, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17 ou 18 peptídeos. Os peptídeos podem ser derivados de um ou mais AATs específicos e podem se ligar a moléculas de MHC classe I.

[185] Outro aspecto da invenção proporciona um ácido nucleico (por exemplo, um polinucleotídeo) que codifica um peptídeo ou variante de um peptídeo da invenção. O polinucleotídeo pode ser, por exemplo, DNA, cDNA, PNA, RNA ou combinações dos mesmos, tanto de fita única como de fita dupla, ou formas nativas ou estabilizadas de polinucleotídeos como, por exemplo, polinucleotídeos com uma cadeia básica de fosforotioato, e pode ou não conter íntrons, contanto que codifique o peptídeo. Evidentemente, apenas peptídeos que contenham os resíduos de aminoácidos que ocorrem naturalmente e unidos por ligações peptídicas que ocorrem naturalmente podem ser codificados por um polinucleotídio. Outro aspecto da invenção fornece um vetor de expressão capaz de expressar um polipeptídeo de acordo com a invenção.

[186] Diversos métodos foram desenvolvidos para ligar polinucleotídeos, sobretudo de DNA, a vetores empregando, por exemplo, terminações coesivas complementares. Por exemplo, trechos de homopolímeros complementares podem ser adicionados ao segmento de DNA a ser inserido no DNA do vetor. Em seguida, o vetor e o segmento de DNA são unidos pela ponte de hidrogênio entre as caudas homopoliméricas complementares para formar moléculas de DNA recombinante.

[187] Ligantes sintéticos que contêm um ou mais sítios de restrição constituem um método alternativo de unir o segmento de DNA aos vetores. Ligantes sintéticos contendo diversos sítios de endonucleases de restrição estão disponíveis comercialmente de diversas fontes, tais como a International Biotechnologies Inc. New Haven, CN, EUA.

[188] Um método desejável de modificação do DNA que codifica o peptídeo da invenção emprega a reação em cadeia de polimerase conforme revelada por Saiki RK, et al. (Saiki et al., 1988). Esse método pode ser usado introduzindo-se DNA em um vetor apropriado, por exemplo, mediante engenharia de sítios de restrição apropriados, ou pode-se usá-lo para modificar o DNA de outras formas úteis, como é conhecido na técnica. Se forem usados vetores virais, são preferidos os vetores de varíola ou adenovírus.

[189] O DNA (ou RNA, no caso de vetores retrovirais) pode então ser expresso em um hospedeiro apropriado para produzir um polipeptídeo que compreende um peptídeo da invenção ou variante do mesmo. Portanto, o DNA que codifica o peptídeo da invenção ou variante do mesmo pode ser usado de acordo com técnicas conhecidas e modificado apropriadamente conforme os ensinamentos aqui apresentados para construir um vetor de expressão, que é então utilizado para transformar uma célula hospedeira apropriada e produzir o polipeptídeo da invenção. Tais técnicas incluem as reveladas nas, por exemplo, em US 4.440.859, 4.530.901, 4.582.800, 4.677.063, 4.678.751, 4.704.362,

4.710.463, 4.757.006, 4.766.075 e 4.810.648.

[190] O DNA (ou, no caso de vetores retrovirais, RNA) que codifica o polipeptídeo que constitui o composto da invenção pode ser unido a várias outras sequências de DNA para introdução em um hospedeiro apropriado.

O DNA acompanhante dependerá da natureza do hospedeiro, do modo como o DNA é introduzido no hospedeiro e em se o desejado é a manutenção epissômica ou a integração.

[191] Em geral, o DNA é inserido em um vetor de expressão como um plasmídio na orientação correta e no “frame” de leitura correto para expressão. Se necessário, o DNA pode ser ligado às sequências de nucleotídeos de controle regulatória da transcrição e tradução reconhecidas pelo hospedeiro desejado, embora tais controles geralmente estejam disponíveis no vetor de expressão. Em seguida, o vetor é introduzido no hospedeiro por meio de técnicas padrão. Em geral, nem todos os hospedeiros serão transformados pelo vetor.

Portanto, é necessário selecionar as células transformadas do hospedeiro. Uma técnica de seleção consiste em incorporar ao vetor de expressão uma sequência de DNA, junto com os elementos de controle necessários, que codifique uma característica selecionada na célula transformada, como resistência a um antibiótico.

[192] Como alternativa, o gene para tal característica selecionável pode estar em outro vetor, que é usado conjuntamente para transformar a célula hospedeira desejada.

[193] As células hospedeiras transformadas pelo DNA recombinante da invenção são então cultivadas por um período de tempo suficiente e sob condições apropriadas, bem conhecidas dos versados na técnica em vista dos ensinamentos aqui revelados, para permitir a expressão do polipeptídeo, que poderá então ser recuperado.

[194] Muitos vetores de expressão são conhecidos, incluindo bactérias (p.ex. E. coli e Bacillus subtilis), leveduras (p.ex. Saccharomyces cerevisiae), fungos filamentosos (p.ex. Aspergillus sp.), células vegetais, células animais e células de insetos. Preferivelmente, o sistema pode consistir em células mamíferas como células CHO disponibilizadas pela ATCC Cell Biology Collection.

[195] Um vetor plasmídio típico para expressão constitutiva em célula mamífera compreende o promotor de CMV ou SV40 com uma cauda poli- A apropriada e um marcador de resistência como a neomicina. Um exemplo é o pSVL, disponibilizado pela Pharmacia, Piscataway, NJ, EUA. Um exemplo de vetor de expressão induzível para células mamíferas é o pMSG, também fornecido pela Pharmacia. O pRS403-406 e o pRS413-416 são vetores plasmídicos úteis, que são geralmente disponibilizados pela Stratagene Cloning Systems, La Jolla, CA 92037, EUA. Os plasmídios pRS403, pRS404, pRS405 e pRS406 são plasmídios de integração a leveduras (YIps, “Yeast Integrating plasmids”) e incluem os marcadores selecionáveis de leveduras HIS3, TRP1, LEU2 e URA3. Os plasmídios pRS413-416 são plasmídios de centrômeros de leveduras (Ycps, “yeast centromere plasmids”). Os vetores à base de promotor de CMV (p.ex. os fornecidos pela Sigma-Aldrich) proporcionam expressão transitória ou estável, expressão citoplasmática ou secreção, e a marcação N- terminal ou C-terminal em várias combinações de FLAG, 3xFLAG, c-myc ou MAT. Essas proteínas de fusão permitem detectar, purificar e analisar a proteína recombinante, e as proteínas de fusão com marcação dupla aumentam a flexibilidade de detecção.

[196] A região regulatória promotora forte do citomegalovírus humano (CMV) promove a expressão de níveis constitutivos de proteína de até 1 mg/L em células COS. Em linhagens celulares menos potentes, os níveis proteicos são geralmente ~0,1 mg/L. A presença da origem de replicação do SV40 proporciona níveis elevados de replicação de DNA em células COS que permitem a replicação de SV40. Os vetores de CMV podem conter, por exemplo,

a origem pMB1 (derivada de pBR322) para permitir a replicação em células bacterianas, o gene de β-lactamase para seleção de resistência à ampicilina em bactérias, poli-A de hGH e a origem f1. Os vetores que contêm a sequência líder de preprotripsina (PPT) podem direcionar a secreção de proteínas de fusão FLAG no meio de cultura para purificação mediante o uso de anticorpos anti- FLAG, resinas e placas. Outros vetores e sistemas de expressão são bem conhecidos na técnica para emprego com diversas células hospedeiras.

[197] Em outra configuração, dois ou mais peptídeos ou variantes de peptídeos da invenção são codificados e, portanto, expressos em ordem sucessiva, numa estrutura semelhante a “contas em um colar”. Ao fazê-lo, os peptídeos ou variantes de peptídeos podem ser ligados ou fundidos por trechos de aminoácidos ligantes, como, por exemplo, LLLLLL, ou podem ser ligados um ao outro sem nenhum outro peptídeo entre eles. Essas estruturas podem ser usadas para tratamento do câncer e podem induzir respostas imunes que envolvem tanto MHC I como MHC II.

[198] A presente invenção refere-se também a uma célula hospedeira transformada por uma estrutura de vetor polinucleotídeo da presente invenção. A célula hospedeira pode ser procariota ou eucariota. As células bacterianas, que podem ser, preferivelmente, procariotas em algumas situações e normalmente são uma cepa de E. coli como, por exemplo, as cepas de E. coli DH5 fornecidas por Bethesda Research Laboratories Inc., Bethesda, MD, EUA e RR1, fornecidas pela American Type Culture Collection (ATCC) de Rockville, MD, EUA (ATCC Nº 31343). As células eucariotas preferidas são as de levedura, inseto e mamífero, preferivelmente células de vertebrados como camundongo, rato, macaco ou linhagens celulares de fibroblastos ou cólon humano. São células hospedeiras de levedura YPH499, YPH500 e YPH501, que são geralmente disponibilizadas por Stratagene Cloning Systems, La Jolla, CA 92037, EUA. São células preferidas de hospedeiros mamíferos as de ovário de hamster chinês (CHO) fornecidas pela ATCC sob o número CCL61, células embrionárias NIH/3T3 de camundongo suíço do NIH fornecidas pela ATCC sob o número CRL 1658, células COS-1 derivadas de rim de macaco fornecidas pela ATCC sob o número CRL 1650 e células HEK-293 derivadas de rim embrionário humano. As células de inseto preferidas são as células Sf9, que podem ser transfectadas por vetores de expressão baseados em baculovírus. Uma visão geral da escolha de células hospedeiras apropriadas para expressão é apresentada, por exemplo, no livro-texto de Paulina Balbás e Argelia Lorence “Methods in Molecular Biology Recombinant Gene Expression, Reviews and Protocols, Part One, Second Edition,” ISBN 978-1-58829-262-9 e em outras publicações conhecidas dos versados na técnica.

[199] A transformação de células hospedeiras apropriadas por uma estrutura de DNA da presente invenção é realizada por métodos bem conhecidos na técnica, que normalmente dependem do tipo de vetor utilizado.

Em relação à transformação de células hospedeiras procariotas, ver, for exemplo, Cohen et al.(Cohen et al., 1972) e(Green and Sambrook, 2012). A transformação de células de levedura foi descrita por Sherman et al. (Sherman et al., 1986). O método de Beggs(Beggs, 1978) também é útil. A Stratagene Cloning Systems e a Life Technologies Inc., Gaithersburg, MD 20877, EUA fornecem reagentes úteis para transfectar células de vertebrados (p.ex. fosfato de cálcio, DEAE-dextrana e formulações de lipossomos). A eletroporação também pode ser empregada para transformar e/ou transfectar células e é bem conhecida na técnica como processo para transformação de células de leveduras, células de bactérias, células de insetos e células de vertebrados.

[200] As células cuja transformação foi bem-sucedida, i.é., células contendo uma estrutura de DNA da presente invenção, podem ser identificadas por técnicas bem conhecidas, como PCR. Alternativamente, a presença de proteínas no sobrenadante pode ser detectada usando-se anticorpos.

[201] Perceber-se-á que algumas células hospedeiras da invenção são úteis na preparação dos peptídeos da invenção, como, por exemplo, células bacterianas, de levedura e de inseto. Entretanto, outras células hospedeiras podem ser úteis em determinados métodos terapêuticos. Por exemplo, células apresentadoras de antígenos, como as células dendríticas, podem ser utilizadas com proveito para expressar os peptídeos da invenção de forma que possam ser carregados em moléculas de MHC apropriadas. Portanto, a presente invenção fornece uma célula hospedeira que compreende um ácido nucleico ou um vetor de expressão de acordo com a invenção.

[202] Em uma configuração preferida, a célula hospedeira é uma célula apresentadora de antígenos, podendo ser uma célula dendrítica ou outra célula apresentadora de antígenos. Em 29 de abril de 2010, a Food and Drug Administration (FDA) aprovou o sipuleucel-T, que consiste em CAAs carregadas com uma proteína de fusão recombinante que contém fosfatase ácida prostática (PAP), para tratamento de CPRC assintomático ou minimamente sintomático(Rini et al., 2006; Small et al., 2006).

[203] Outro aspecto da invenção fornece um método de produção de um peptídeo ou de uma variante do mesmo, sendo que o método compreende o cultivo de uma célula hospedeira descrita e isolamento do peptídeo da célula hospedeira ou do meio de cultura da mesma.

[204] Em outra configuração, o peptídeo, o ácido nucleico ou o vetor de expressão da invenção são usados em medicina. Por exemplo, o peptídeo ou uma variante do mesmo podem ser preparados para injeção intravenosa (i.v.), injeção subcutânea (s.c.), injeção intradérmica (i.d.), injeção intraperitoneal (i.p.) ou injeção intramuscular (i.m.). Os métodos preferidos de injeção de peptídeos são s.c., i.d., i.p., i.m. e i.v. Os métodos preferidos de injeção de DNA são i.d., i.m., s.c., i.p. e i.v. Doses de, p.ex., 50 µg a 1,5 mg e, preferivelmente 125 µg a 500 µg de peptídeo ou DNA, podem ser administradas,

dependendo do peptídeo ou do DNA em questão. O uso de doses nesse intervalo já foi bem-sucedido em ensaios clínicos(Walter et al., 2012).

[205] O polinucleotídeo usado para vacinação ativa pode ser basicamente puro ou contido em um sistema apropriado de vetor ou de transporte. Os ácidos nucleicos podem ser DNA, cDNA, PNA, RNA ou uma combinação dos mesmos. Os métodos usados para projetar e introduzir tais ácidos nucleicos são bem conhecidos na técnica. Uma visão geral é apresentada em, p.ex., Teufel et al. (Teufel et al., 2005). Vacinas de polinucleotídeos são fáceis de preparar, mas o modo de ação pelo qual esses vetores induzem uma resposta imune não é totalmente compreendido. Os vetores e sistemas de administração apropriados utilizam DNA e/ou RNA viral, tais como sistemas baseados em adenovírus, vírus da vacínia, retrovírus, herpesvírus, vírus associados ao adenovírus ou híbridos contendo elementos de mais de um vírus.

Alguns sistemas não virais consistem em lipídios catiônicos e polímeros catiônicos, que são bem conhecidos na técnica de administração de DNA. A administração física por dispositivos como o “gene gun” (canhão gênico) também pode ser empregada. O(s) peptídeo(s) codificados pelos ácidos nucleicos pode(m) ser uma proteína de fusão, por exemplo, com um epítopo que estimula as células T do respectivo CDR oposto, conforme descrito anteriormente.

[206] O medicamento da invenção também pode incluir um ou mais adjuvantes. Os adjuvantes são substâncias que promovem ou potencializam de maneira inespecífica a resposta imune (p.ex. a resposta imune mediada por células T CD8-positivas e células T auxiliares (TH)) contra um antígeno e que, portanto, seriam consideras úteis no medicamento da presente invenção. Alguns adjuvantes apropriados são, entre outros, 1018 ISS, sais de alumínio, AMPLIVAX®, AS15, BCG, CP-870.893, CpG7909, CyaA, dSLIM, flagelina ou ligantes TLR5 derivados da flagelina, ligante FLT3, GM-CSF, IC30, IC31, Imiquimod (ALDARA®), resiquimod, ImuFact IMP321, interleucinas como

IL-2, IL-13, IL-21, interferon alfa ou beta ou derivados peguilados dos mesmos, IS Patch, ISS, ISCOMATRIX, ISCOMs, JuvImmune®, LipoVac, MALP2, MF59, monofosforil lipídio A, Montanide IMS 1312, Montanide ISA 206, Montanide ISA 50V, Montanide ISA-51, emulsões de água-em-óleo ou óleo-em-água, OK- 432, OM-174, OM-197-MP-EC, ONTAK, OspA, sistema de vetor PepTel®, micropartículas à base de poli(lactídeo coglicolídeo) [PLG] e dextrana, talactoferrina, SRL172, virossomas e outras partículas semelhantes a vírus, YF- 17D, armadilha de VEGF, R848, beta-glucana, Pam3Cys, estimulon QS21 de Áquila (derivado da saponina), extratos micobacterianos e simuladores da parede celular bacteriana e outros adjuvantes exclusivos como Ribi's Detox, Quil ou Superfos. São preferidos adjuvantes como o de Freund ou GM-CSF. Vários adjuvantes imunológicos (p.ex. MF59) específicos para células dendríticas e suas preparações já foram descritos anteriormente(Allison and Krummel, 1995).

Citoquinas também podem ser usadas. Várias citoquinas (p.ex. TNF) foram associadas diretamente à influência sobre a migração de células dendríticas para tecidos linfoides, acelerando a maturação de células dendríticas de modo a formar células apresentadoras de antígenos que interagem de forma eficiente com linfócitos T (p.ex. GM-CSF, IL-1 e IL-4) (Pat. EUA Nº 5.849.589, que fica específica e integralmente incorporada por referência) e que possuam atividade imunoadjuvante (p.ex. IL-12, IL-15, IL-23, IL-7, IFN-alfa e IFN-beta) (Gabrilovich et al., 1996).

[207] Descreveu-se também que os oligonucleotídeos CpG imunoestimulatórios podem potencializar os efeitos dos adjuvantes em situações vacinais. Sem restringir-se a nenhuma teoria, os oligonucleotídeos CpG agem ativando o sistema imune inato (não adaptativo) por meio de receptores do tipo Toll (TLR, “Toll-like receptors”), especialmente o TLR9. A ativação de TLR9 desencadeada pelo CpG promove respostas humorais e celulares específicas contra diversos antígenos, incluindo antígenos peptídicos ou proteicos, vírus vivos ou mortos, vacinas de células dendríticas, vacinas celulares autólogas e conjugados de polissacarídeos, em vacinas tanto profiláticas como terapêuticas.

Ainda mais importante, o CpG promove a maturação e diferenciação de células dendríticas, produzindo ativação de células TH1 e forte geração de linfócitos T citotóxicos (LTC), mesmo na ausência de auxílio de células T CD4. O viés para TH1 induzido pela estimulação por TLR9 se mantém mesmo na presença de adjuvantes vacinais, tais como o alúmen ou o adjuvante incompleto de Freund (IFA), que normalmente promovem um viés para TH2. Os oligonucleotídeos CpG apresentam atividade adjuvante ainda mais acentuada quando formulados ou coadministrados com outros adjuvantes ou em formulações como micropartículas, nanopartículas, emulsões lipídicas ou formulações semelhantes, que são especialmente necessárias para induzir uma resposta acentuada a antígenos relativamente fracos. Eles também aceleram a resposta imune, permitindo reduzir as doses de antígenos em cerca de duas ordens de grandeza e obter uma resposta de anticorpos comparável à obtida com a dose plena da vacina sem CpG em alguns experimentos (Krieg, 2006).

US 6.406.705 B1 descreve a utilização combinada dos oligonucleotídeos CpG, adjuvantes que não consistem em ácidos nucleicos e um antígeno para induzir uma resposta imune antígeno-específica. Um antagonista de CpG TLR9 é o dSLIM (“double Stem Loop Immunomodulator”), produzido pela Mologen (Berlim, Alemanha), que é o componente preferido para a composição farmacêutica da presente invenção. Outras moléculas ligantes de TLR como o TLR 7, TLR 8 e/ou TLR 9 ligantes de RNA também podem ser utilizadas.

[208] Outros exemplos de adjuvantes úteis são, entre outros, CpGs modificados quimicamente (p.ex. CpR, Idera), análogos de dsRNA como o Poli(I:C) e derivados do mesmo (p.ex. AmpliGen®, Hiltonol®, poli-(ICLC), poli(IC-R), poli(I:C12U), DNA ou RNA bacteriano sem CpG e moléculas pequenas ou anticorpos com atividade imunológica como a ciclofosfamida,

sunitinibe, inibidores de ‘checkpoint’ imune como ipilimumabe, nivolumabe, pembrolizumabem atezolizumabe, avelumabe, durvalumabe e cemiplimabe, Bevacizumabe®, Celebrex, NCX-4016, sildenafila, tadalafila, vardenafila, sorafenibe, temozolomida, temsirolimus, XL-999, CP-547632, pazopanibe, armadilha de VEGF, ZD2171, AZD2171 e anti-CTLA4, outros anticorpos contra estruturas-chave do sistema imune (p.ex. anti-CD40, anti-TGF-beta e antirreceptor de TNF-α) e SC58175, que podem exercer ação terapêutica ou como adjuvantes. As quantidades e concentrações de adjuvantes e aditivos úteis no contexto da presente invenção podem ser determinadas facilmente e sem experimentação excessiva por indivíduos praticantes da técnica.

[209] São adjuvantes preferidos o anti-CD40, imiquimod, resiquimod, GM-CSF, ciclofosfamida, sunitinibe, becacizumabe, interferon-alfa, oligonucleotídeos CpG e derivados, poli-(I:C) e derivados, RNA, sildenafila e formações particuladas com PLG ou virossomas.

[210] Em uma configuração preferida da composição farmacêutica de acordo com a invenção, o adjuvante é selecionado de um grupo formado por fatores estimuladores de colônias como o fator estimulador de colônias de granulócitos e macrófagos (GM-CSF, sargramostim), ciclofosfamida, imiquimod, resiquimod e interferon-α.

[211] Em uma configuração preferida da composição farmacêutica de acordo com a invenção, o adjuvante é selecionado de um grupo formado por fatores estimuladores de colônias como o fator estimulador de colônias de granulócitos e macrófagos (GM-CSF, sargramostim), ciclofosfamida, imiquimod e resiquimod. Em uma configuração preferida da composição farmacêutica de acordo com a invenção, o adjuvante é a ciclofosfamida, o imiquimod ou o resiquimod. São adjuvantes ainda mais preferidos o Montanide IMS 1312, Montanide ISA 206, Montanide ISA 50V, Montanide ISA-51, poli-ICLC (Hiltonol®) e anticorpos monoclonais anti-CD40 ou combinações dos mesmos.

[212] Esta composição é usada para administração parenteral, como por via subcutânea, intradérmica, intramuscular ou oral. Para esse fim, os peptídeos e, opcionalmente, outras moléculas, são dissolvidos ou suspensos em um veículo farmaceuticamente aceitável, preferivelmente um veículo aquoso. A composição também pode conter excipientes como tampões, agentes de ligação, agentes abrasivos, diluentes, flavorizantes, lubrificantes, etc. Os peptídeos também podem ser administrados conjuntamente com substâncias estimuladoras do sistema imune, como as citoquinas. Uma ampla lista de excipientes que podem ser empregados em tais composições pode ser encontrada em, por exemplo, A. Kibbe, Handbook of Pharmaceutical Excipients (Kibbe, 2000). A composição pode ser usada para prevenção, profilaxia e/ou tratamento de doenças adenomatosas ou cancerosas. Podem-se encontrar formulações exemplares em, por exemplo, EP2112253.

[213] Cabe ressaltar que a resposta imune produzida pela vacina de acordo com a invenção ataca o câncer em diferentes estágios celulares e em vários estágios de desenvolvimento. Além disso, outras vias de sinalização associadas com o câncer também são atacadas. Isso constitui uma vantagem em relação às vacinas que agem apenas sobre um ou poucos alvos, pois o tumor pode se adaptar a esse tipo de ataque (escape tumoral) e nem todos os tumores expressam o mesmo padrão de antígenos. Por isso, uma combinação de vários peptídeos associados a tumores garante que todos os tumores apresentarão pelo menos alguns dos alvos. A composição foi projetada para tumores que expressem vários dos antígenos e age sobre diversas vias independentes necessárias para o crescimento e a manutenção do tumor. Portanto, a vacina pode ser usada sem individualização em uma população maior de pacientes.

Isso significa que os pacientes a serem tratados com a vacina podem ser selecionados apenas por tipagem de HLA e não requerem análise de outros biomarcadores de expressão antigênica. Mesmo assim, a resposta imune induzida ataca vários alvos ao mesmo tempo, o que é importante para a eficácia (Banchereau et al., 2001; Walter et al., 2012).

[214] Conforme aqui utilizado, o termo “scaffold” (arcabouço) designa uma molécula que se liga especificamente a um determinante (p.ex.

antigênico). Em uma configuração, o arcabouço é capaz de direcionar a entidade à qual está vinculado (p.ex. um (segundo) grupamento ligante de antígeno) a um sítio alvo como, por exemplo, um tipo específico de célula tumoral ou estroma tumoral que apresenta um determinante antigênico (p.ex. um complexo de peptídeo com MHC de acordo com a aplicação ora contemplada). Em outra configuração, o arcabouço é capaz de ativar a sinalização por meio de seu antígeno alvo, que pode ser, por exemplo, um antígeno de um complexo receptor de células T. Os arcabouços incluem, entre outros, anticorpos e fragmentos dos mesmos, domínios ligantes de antígenos em um anticorpo, que compreendem uma região de cadeia pesada do anticorpo e uma região de cadeia leve do anticorpo, proteínas ligantes que compreendem pelo menos um motivo repetitivo de anquirina e molécula ligantes de antígenos de domínio único (SDAB), aptâmeros, TCRs (solúveis) e células (modificadas) como, por exemplo, células T alogênicas ou autólogas. Para avaliar se uma molécula funciona como arcabouço e se liga a um alvo, podem ser realizados ensaios de ligação.

[215] Por ligação “específica”, entende-se uma ligação na qual o arcabouço se liga ao complexo de peptídeo com MHC relevante melhor que a outros complexos de peptídeo com MHC, de modo que um arcabouço dotado de uma molécula ativa capaz de destruir uma célula portadora de um alvo específico não seja capaz de destruir outra célula que não possui o alvo específico mas apresenta outros complexos de peptídeo com MHC. A ligação a outros complexos de peptídeo com MHC é irrelevante quando o peptídeo do complexo de peptídeo com MHC que produz reação cruzada não ocorre naturalmente, i.é., não é derivado do peptidoma do HLA humano. Os ensaios de avaliação da morte de células-alvo são bem conhecidos na técnica e devem ser realizados usando células-alvo (células primárias ou linhagens celulares) nas quais o complexo de peptídeo com MHC seja apresentado inalterado ou células carregadas com peptídeos de modo que se atinjam os níveis observados naturalmente de complexos de peptídeo com MHC.

[216] Um arcabouço pode incluir uma marcação que permite detectá-lo por meio da determinação da presença ou não do sinal fornecido pelo marcador. Por exemplo, o arcabouço pode ser marcado por um corante fluorescente ou qualquer outra molécula marcadora celular pertinente. Tais moléculas marcadoras são bem conhecidas na técnica. Por exemplo, a marcação fluorescente proporcionada, por exemplo, por um corante fluorescente, pode permitir a visualização do aptâmero ligado por meio de microscopia de fluorescência ou de varredura a laser ou detecção por citometria de fluxo.

[217] Os arcabouços podem ser conjugados com uma segunda molécula ativa como, por exemplo, IL-21, anti-CD3 e anti-CD28.

[218] Para mais informações sobre arcabouços polipeptídicos, ver, por exemplo, a seção geral de WO 2014/071978A1 e as referências nela citadas.

[219] A presente invenção refere-se também a aptâmeros. Os aptâmeros (ver, por exemplo, WO 2014/191359 e a literatura nela citada) são moléculas curtas de ácido nucleico de fita única, que podem se dobrar formando estruturas tridimensionais e reconhecer estruturas-alvo específicas. Eles parecem ser opções apropriadas para o desenvolvimento de terapias direcionadas. Os aptâmeros se mostraram capazes de se ligar seletivamente e com alta afinidade e especificidade a diversos alvos complexos.

[220] Na última década, foram identificados aptâmeros que reconhecem moléculas da superfície celular e proporcionam meios para o desenvolvimento de abordagens diagnósticas e terapêuticas. Como são praticamente atóxicos e não imunogênicos, os aptâmeros são candidatos promissores para aplicações biomédicas. Com efeito, aptâmeros como aqueles que reconhecem o antígeno prostático específico na membrana celular foram empregados com sucesso como terapias direcionadas e demonstraram sua funcionalidade em modelos de xenoenxerto in vivo. Também foram identificados aptâmeros que reconhecem linhagens específicas de células tumorais.

[221] Podem-se selecionar aptâmeros de DNA que revelem propriedades de reconhecimento de amplo espectro para várias células oncológicas, sobretudo aquelas derivadas de tumores sólidos, e que não reconheçam células não-tumorigênicas nem células saudáveis primárias. Se os aptâmeros identificados, em vez de reconhecer um subtipo tumoral específico, interagissem com diversos tumores, isso os tornaria úteis para o diagnóstico e tratamento dito de amplo espectro.

[222] Além disso, pesquisas sobre o comportamento de ligação celular, realizadas por citometria de fluxo, também mostraram que os aptâmeros apresentaram excelentes afinidades aparentes na faixa de nanomoles.

[223] Os aptâmeros podem ter aplicações diagnósticas e terapêuticas. Também foi demonstrado que alguns aptâmeros são captados por células tumorais e, portanto, podem funcionar como veículos moleculares para administração dirigida de agentes anticâncer (p.ex. siRNA) a células tumorais.

[224] Podem-se selecionar aptâmeros contra alvos complexos como células e tecidos e complexos de peptídeos que compreendem ou, preferivelmente, que consistem em uma sequência de acordo com SEQ Nº 1 a SEQ Nº 251 e SEQ Nº 289 a SEQ Nº 291 e SEQ Nº 292 a SEQ Nº 299 da invenção ora em pauta com a molécula de MHC empregando a técnica de seleção cell-SELEX (“Systematic Evolution of Ligands by Exponential Enrichment”).

[225] Os peptídeos da presente invenção podem ser empregados para gerar e desenvolver anticorpos específicos contra complexos de MHC com peptídeo, que podem ser usados para tratamentos nos quais toxinas ou substâncias radioativas são guiadas até o tecido patológico. Outra aplicação desses anticorpos é guiar radionuclídeos ao tecido patológico para exames de imagem como o PET. Esta aplicação pode ajudar a detectar metástases pequenas ou determinar o tamanho e a localização exata dos tecidos patológicos.

[226] Portanto, constitui outro aspecto da invenção o fornecimento de um método de produção de um anticorpo recombinante que se ligue especificamente a um complexo principal de histocompatibilidade (MHC) humano classe I ou II que forme um complexo com um antígeno restrito por HLA (preferivelmente um peptídeo de acordo com a presente invenção), sendo que o método compreende imunizar um mamífero não-humano submetido à engenharia genética com células que expressam o referido complexo principal de histocompatibilidade (MHC) humano classe I ou II com uma forma solúvel de uma molécula de MHC classe I ou II que forme complexo com o referido antígeno restrito por HLA; isolar moléculas de mRNA de células produtoras de anticorpo do referido mamífero não-humano; produzir uma biblioteca de exposição em fagos que exiba as moléculas de proteína codificadas pelas referidas moléculas de mRNA; e isolar ao menos um fago da referida biblioteca de exposição em fagos, sendo que o pelo menos um fago referido expõe o referido anticorpo e se liga especificamente ao referido complexo principal de histocompatibilidade (MHC) humano classe I ou II em complexo com o referido antígeno restrito por HLA.

[227] Constitui portanto outro aspecto da presente invenção o fornecimento de um anticorpo que se ligue especificamente a um complexo principal de histocompatibilidade (MHC) humano classe I ou II em complexo com um antígeno restrito por HLA, no qual o anticorpo é preferivelmente um anticorpo policlonal, um anticorpo monoclonal, um anticorpo biespecífico ou um anticorpo quimérico.

[228] Os respectivos métodos usados para produzir tais anticorpos e complexos principais de histocompatibilidade classe I de cadeia única, assim como outras ferramentas empregadas para produzir tais anticorpos, são revelados em WO 03/068201, WO 2004/084798, WO 01/72768, WO 03/070752 e em publicações (Cohen et al., 2003a; Cohen et al., 2003b; Denkberg et al., 2003) que, para as finalidades da presente invenção, ficam aqui integralmente incorporadas por referência.

[229] Preferivelmente, o anticorpo se liga ao complexo com afinidade inferior a 20 nanomolares, e preferivelmente inferior a 10 nanomolares, o que é também considerado “específico” no contexto da presente invenção.

[230] A presente invenção refere-se a um peptídeo que compreende uma sequência de aminoácidos selecionada do grupo formado por SEQ Nº 1 a SEQ Nº 251 e SEQ Nº 289 a SEQ Nº 291 e SEQ Nº 292 a SEQ Nº 299 ou a uma variante dos mesmos com pelo menos 88% de homologia (preferivelmente idêntico) com SEQ Nº 1 a SEQ Nº 251 e SEQ Nº 289 a SEQ Nº 291 e SEQ Nº 292 a SEQ Nº 299 ou uma variante da mesma que induz reação cruzada de células T com o referido peptídeo, sendo que o referido peptídeo não é o peptídeo completo subjacente.

[231] A presente invenção refere-se também a um peptídeo que compreende uma sequência selecionada do grupo formado por SEQ Nº 1 a SEQ Nº 251 e SEQ Nº 289 a SEQ Nº 291 e SEQ Nº 292 a SEQ Nº 299 ou uma variante das mesmas, que seja pelo menos 88% homóloga (preferivelmente idêntica) a SEQ Nº 1 a SEQ Nº 251 e SEQ Nº 289 a SEQ Nº 291 e SEQ Nº 292 a SEQ Nº 299, sendo que cada um dos peptídeos referidos ou variantes dos mesmos possui comprimento total de 8 a 100, preferivelmente de 8 a 30 e, o mais preferido, de 8 a 14 aminoácidos.

[232] A presente invenção refere-se também aos peptídeos de acordo com a invenção que possuem a capacidade de se ligarem a uma molécula do complexo principal de histocompatibilidade (MHC) humano classe I ou II.

[233] A presente invenção refere-se também aos peptídeos de acordo com a presente invenção, nos quais o referido peptídeo consiste ou consiste essencialmente em uma sequência de aminoácidos de acordo com SEQ Nº 1 a SEQ Nº 251 e SEQ Nº 289 a SEQ Nº 291 e SEQ Nº 292 a SEQ Nº 299.

[234] A presente invenção refere-se também aos peptídeos de acordo com a invenção, sendo que o peptídeo é modificado quimicamente e/ou inclui ligações não-peptídicas.

[235] A presente invenção refere-se também aos peptídeos de acordo com a invenção, nos quais o peptídeo constitui parte de uma proteína de fusão, compreendendo em particular aminoácidos N-terminais da cadeia invariante associada ao antígeno do HLA-DR (Ii), ou nos quais o peptídeo é fundido a (ou incorporado à sequência de) um anticorpo, tal como, por exemplo, um anticorpo específico para células dendríticas.

[236] A presente invenção refere-se também a um ácido nucleico que codifica os peptídeos de acordo com a invenção, conquanto tal peptídeo não seja uma proteína humana completa (total).

[237] A presente invenção refere-se também ao ácido nucleico de acordo com a invenção que consista em DNA, cDNA, PNA, RNA ou combinações dos mesmos.

[238] A presente invenção refere-se também a um vetor de expressão capaz de expressar um ácido nucleico de acordo com a presente invenção.

[239] A presente invenção se refere também a um peptídeo de acordo com a presente invenção, um ácido nucleico de acordo com a presente invenção ou um vetor de expressão de acordo com a presente invenção para uso em medicina, em particular para o tratamento de carcinoma colangiocelular, carcinoma de bexiga, carcinoma de células escamosas de cabeça e pescoço, carcinoma de células renais, carcinoma hepatocelular, câncer colorretal, câncer da vesícula biliar, câncer de esôfago, câncer de mama, câncer de ovário, câncer de próstata, câncer de pulmão (incluindo adenocarcinoma de pulmão de células não pequenas, câncer de células escamosas de células não pequenas e câncer de pulmão de pequenas células), câncer de pâncreas, câncer do endométrio uterino, câncer gástrico, glioblastoma, leucemia linfocítica crônica, leucemia mieloide aguda, linfoma não-Hodgkin e melanoma.

[240] A presente invenção refere-se também a uma célula hospedeira que compreende um ácido nucleico de acordo com a invenção ou um vetor de expressão de acordo com a invenção.

[241] A presente invenção refere-se também a células hospedeiras de acordo com a presente invenção, que sejam células apresentadoras de antígenos e, preferivelmente, células dendríticas.

[242] A presente invenção refere-se também a um método de produção de um peptídeo de acordo com a presente invenção, sendo que o referido método compreende o cultivo da célula hospedeira de acordo com a presente invenção e o isolamento do peptídeo da referida célula hospedeira ou do meio de cultura da mesma.

[243] A presente invenção refere-se também ao método de acordo com a presente invenção, sendo que o referido antígeno é carregado em moléculas de MHC classe I ou II expressas na superfície de uma célula apresentadora de antígenos apropriada colocando-se uma quantidade suficiente do antígeno em contato com uma célula apresentadora de antígenos.

[244] A presente invenção refere-se também a um método de acordo com a invenção, no qual a célula apresentadora de antígenos compreende um vetor de expressão capaz de expressar o referido peptídeo contendo SEQ Nº 1 a SEQ Nº 251 e SEQ Nº 289 a SEQ Nº 291 e SEQ Nº 292 a SEQ Nº 299 da referida sequência variante de aminoácidos.

[245] A presente invenção relaciona-se também com células T ativadas produzidas de acordo com o método da presente invenção, sendo que as referidas células T reconhecem seletivamente células com expressão aberrante de um polipeptídeo que compreende uma sequência de aminoácidos de acordo com a presente invenção.

[246] A presente invenção relaciona-se também a método de matar células alvo em um paciente cujas células alvo expressam de forma aberrante um polipeptídeo compreendendo qualquer sequência de aminoácidos de acordo com a presente invenção, o método compreendendo administrar ao paciente um número eficaz de células T de acordo com a presente invenção.

[247] A presente invenção refere-se também à utilização de qualquer um dos peptídeos descritos, de um ácido nucleico de acordo com a presente invenção, de um vetor de expressão de acordo com a presente invenção, de uma célula de acordo com a presente invenção ou de um linfócito T citotóxico ativado de acordo com a presente invenção como medicamento ou para fabricação de um medicamento. A presente invenção refere-se também a uma utilização de acordo com a presente invenção, onde o medicamento possui atividade anticâncer.

[248] A presente invenção refere-se também a uma utilização de acordo com a invenção, na qual o medicamento é uma vacina. A presente invenção refere-se também a uma utilização de acordo com a invenção, onde o medicamento possui atividade anticâncer.

[249] A presente invenção se refere também a um uso de acordo com a invenção, no qual as referidas células de câncer são de carcinoma colangiocelular, carcinoma de bexiga, carcinoma de células escamosas de cabeça e pescoço, carcinoma de células renais, carcinoma hepatocelular, câncer colorretal, câncer da vesícula biliar, câncer de esôfago, câncer de mama, câncer de ovário, câncer de próstata, câncer de pulmão (incluindo adenocarcinoma de pulmão de células não pequenas, câncer de células escamosas de células não pequenas e câncer de pulmão de pequenas células), câncer de pâncreas, câncer do endométrio uterino, câncer gástrico, glioblastoma, leucemia linfocítica crônica, carcinoma colangiocelular, carcinoma de bexiga, carcinoma de células escamosas de cabeça e pescoço, carcinoma de células renais, carcinoma hepatocelular, câncer colorretal, câncer da vesícula biliar, câncer de esôfago, câncer de mama, câncer de ovário, câncer de próstata, câncer de pulmão (incluindo adenocarcinoma de pulmão de células não pequenas, câncer de células escamosas de células não pequenas e câncer de pulmão de pequenas células), câncer de pâncreas, câncer do endométrio uterino, câncer gástrico, glioblastoma, leucemia linfocítica crônica, leucemia mieloide aguda, linfoma não- Hodgkin e melanoma.

[250] A presente invenção se refere também a proteínas marcadoras e biomarcadores específicos, baseados nos peptídeos de acordo com a presente invenção e doravante denominados “alvos”, que podem ser usados para diagnóstico ou determinação do prognóstico de carcinoma colangiocelular, carcinoma de bexiga, carcinoma de células escamosas de cabeça e pescoço, carcinoma de células renais, carcinoma hepatocelular, câncer colorretal, câncer da vesícula biliar, câncer de esôfago, câncer de mama, câncer de ovário, câncer de próstata, câncer de pulmão (incluindo adenocarcinoma de pulmão de células não pequenas, câncer de células escamosas de células não pequenas e câncer de pulmão de pequenas células), câncer de pâncreas, câncer do endométrio uterino, câncer gástrico, glioblastoma, leucemia linfocítica crônica, leucemia mieloide aguda, linfoma não-Hodgkin e melanoma. A presente invenção refere-se também ao uso desses novos agentes para tratamento do câncer.

[251] O termo “anticorpo” ou ”anticorpos“ é aqui utilizado em sentido amplo e inclui tanto anticorpos policlonais como monoclonais. O termo anticorpo abrange tanto moléculas de imunoglobulina integrais (completas) como fragmentos (p.ex. CDRs, Fv, Fab e Fc) ou polímeros de tais moléculas de imunoglobulinas e versões humanizadas de moléculas de imunoglobulina, conquanto apresentem quaisquer das propriedades desejadas (p.ex. ligação específica a um peptídeo ou polipeptídeo marcador de carcinoma colangiocelular, carcinoma de bexiga, carcinoma de células escamosas de cabeça e pescoço, carcinoma de células renais, carcinoma hepatocelular, câncer colorretal, câncer da vesícula biliar, câncer de esôfago, câncer de mama, câncer de ovário, câncer de próstata, câncer de pulmão (incluindo adenocarcinoma de pulmão de células não pequenas, câncer de células escamosas de células não pequenas e câncer de pulmão de pequenas células), câncer de pâncreas, câncer do endométrio uterino, câncer gástrico, glioblastoma, leucemia linfocítica crônica, leucemia mieloide aguda, linfoma não-Hodgkin ou melanoma, carreamento de uma toxina a uma célula de carcinoma colangiocelular, carcinoma de bexiga, carcinoma de células escamosas de cabeça e pescoço, carcinoma de células renais, carcinoma hepatocelular, câncer colorretal, câncer da vesícula biliar, câncer de esôfago, câncer de mama, câncer de ovário, câncer de próstata, câncer de pulmão (incluindo adenocarcinoma de pulmão de células não pequenas, câncer de células escamosas de células não pequenas e câncer de pulmão de pequenas células), câncer de pâncreas, câncer do endométrio uterino, câncer gástrico, glioblastoma, leucemia linfocítica crônica, leucemia mieloide aguda, linfoma não-Hodgkin ou melanoma que sobrexpresse um gene marcador de câncer e/ou apresente atividade inibidora, conforme definida pela invenção, sobre um peptídeo de carcinoma colangiocelular, carcinoma de bexiga, carcinoma de células escamosas de cabeça e pescoço, carcinoma de células renais, carcinoma hepatocelular, câncer colorretal, câncer da vesícula biliar, câncer de esôfago, câncer de mama, câncer de ovário, câncer de próstata, câncer de pulmão (incluindo adenocarcinoma de pulmão de células não pequenas, câncer de células escamosas de células não pequenas e câncer de pulmão de pequenas células), câncer de pâncreas, câncer do endométrio uterino, câncer gástrico, glioblastoma, leucemia linfocítica crônica, leucemia mieloide aguda, linfoma não-Hodgkin e melanoma de acordo com a invenção.

[252] Sempre que possível, os anticorpos da invenção podem ser adquiridos de fontes comerciais. Os anticorpos da invenção também podem ser gerados usando-se métodos bem conhecidos. Os versados na técnica perceberão que os anticorpos da invenção podem ser gerados a tanto a partir de peptídeos marcadores de carcinoma colangiocelular, carcinoma de bexiga, carcinoma de células escamosas de cabeça e pescoço, carcinoma de células renais, carcinoma hepatocelular, câncer colorretal, câncer da vesícula biliar, câncer de esôfago, câncer de mama, câncer de ovário, câncer de próstata, câncer de pulmão (incluindo adenocarcinoma de pulmão de células não pequenas, câncer de células escamosas de células não pequenas e câncer de pulmão de pequenas células), câncer de pâncreas, câncer do endométrio uterino, câncer gástrico, glioblastoma, leucemia linfocítica crônica, leucemia mieloide aguda, linfoma não-Hodgkin e melanoma como de fragmentos dos mesmos. Um polipeptídeo para uso na geração de um anticorpo da invenção pode ser total ou parcialmente purificado a partir de uma fonte natural ou pode ser produzido usando-se técnicas de DNA recombinante.

[253] Pode-se, por exemplo, expressar um cDNA que codifica um peptídeo de acordo com a presente invenção (p.ex. um polipeptídeo de acordo com SEQ Nº 1 a SEQ Nº 251 e SEQ Nº 289 a SEQ Nº 291 e SEQ Nº 292 a

SEQ Nº 299 ou uma variante ou fragmento do mesmo) em células procariotas (p.ex. bactérias) ou eucariotas (p.ex. células de leveduras, insetos ou mamíferos). Em seguida, pode-se purificar a proteína recombinante e usá-la para gerar um preparado de anticorpos monoclonais ou policlonais que se ligam especificamente aos polipeptídeos marcadores de carcinoma colangiocelular, carcinoma de bexiga, carcinoma de células escamosas de cabeça e pescoço, carcinoma de células renais, carcinoma hepatocelular, câncer colorretal, câncer da vesícula biliar, câncer de esôfago, câncer de mama, câncer de ovário, câncer de próstata, câncer de pulmão (incluindo adenocarcinoma de pulmão de células não pequenas, câncer de células escamosas de células não pequenas e câncer de pulmão de pequenas células), câncer de pâncreas, câncer do endométrio uterino, câncer gástrico, glioblastoma, leucemia linfocítica crônica, leucemia mieloide aguda, linfoma não-Hodgkin ou melanoma usados para gerar o anticorpo de acordo com a invenção.

[254] Os versados na técnica perceberão que a geração de dois ou mais conjuntos diferentes de anticorpos monoclonais ou policlonais maximiza a possibilidade de obter um anticorpo com a especificidade e a afinidade necessárias para o uso pretendido (p.ex. ELISA, imunohistoquímica, imagem in vivo, imunoterapia com toxinas). Os anticorpos foram testados para avaliar se possuíam a atividade desejada usando-se métodos conhecidos de acordo com o propósito para o qual os anticorpos serão empregados (p.ex. ELISA, imunohistoquímica, imunoterapia, etc.; para mais informações sobre a geração e teste de anticorpos, consulte, p.ex., Greenfield, 2014(Greenfield, 2014)). Por exemplo, os anticorpos podem ser testados em ensaios ELISA, western blot ou coloração imunohistoquímica de cânceres fixados em formalina ou cortes de tecido congelado. Após serem caracterizados inicialmente in vitro, os anticorpos destinados a emprego terapêutico ou diagnóstico in vivo são testados de acordo com métodos de ensaio clínico bem conhecidos.

[255] Conforme aqui utilizado, o termo “anticorpo monoclonal” refere-se a um anticorpo obtido de uma população substancialmente homogênea de anticorpos, i.é., os anticorpos individuais que compreendem a população são idênticos, exceto por mutações que podem ocorrer naturalmente e estar presentes em pequenas quantidades. Os anticorpos monoclonais aqui descritos incluem especificamente anticorpos “quiméricos” nos quais uma parte das cadeias leves e/ou pesadas é idêntica ou homóloga às sequências correspondentes de anticorpos derivados de uma espécie específica ou pertencentes a uma classe ou subclasse de anticorpos específicos, ao passo que o restante da(s) cadeia(s) é idêntico ou homólogo às sequências correspondentes de anticorpos derivados de outra espécie ou pertencentes a outra classe ou subclasse de anticorpos, assim como fragmentos de tais anticorpos, conquanto apresentem a atividade antagonista desejada (Pat. US

4.816.567, que fica aqui integralmente incorporada).

[256] Os anticorpos monoclonais da invenção podem ser preparados usando métodos com hibridomas. Em um método com hibridoma, um camundongo ou outro animal hospedeiro apropriado é tipicamente imunizado com um agente imunizante para produzir linfócitos que produzam ou sejam capazes de produzir anticorpos que se ligam especificamente ao agente imunizante. Como alternativa, os linfócitos podem ser imunizados in vitro.

[257] Os anticorpos monoclonais também podem ser produzidos por métodos de DNA recombinante, tais como os descritos em US 4.816.567. O DNA que codifica os anticorpos monoclonais da invenção pode ser prontamente isolado e sequenciado mediante procedimentos convencionais (p.ex. usando sondas de oligonucleotídeos capazes de se ligar especificamente aos genes que codificam as cadeias leves e pesadas de anticorpos murinos).

[258] Os métodos in vitro também são apropriados para preparar anticorpos monovalentes. A digestão de anticorpos para produzir fragmentos dos mesmos, sobretudo fragmentos Fab, pode ser realizada usando-se técnicas rotineiras conhecidas na técnica. Por exemplo, a digestão pode ser realizada usando-se papaína. Alguns exemplos de digestão por papaína são descritos em WO 94/29348 e Pat. US 4.342.566. A digestão de anticorpos por papaína geralmente produz dois fragmentos idênticos ligantes de antígenos denominados fragmentos Fab, cada um dos quais com um único sítio de ligação de antígenos e um fragmento Fc residual. O tratamento com pepsina produz um fragmento F(ab')2 e um fragmento pFc'.

[259] Sejam ou não conectados a outras sequências, os fragmentos de anticorpos podem incluir inserções, deleções, substituições ou outras modificações selecionadas de regiões específicas ou de resíduos de aminoácidos específicos, com a condição de que a atividade do fragmento não seja significativamente alterada ou prejudicada em comparação com o anticorpo ou fragmento de anticorpo não modificado. Essas modificações podem proporcionar novas propriedades, como a retirada ou inclusão de aminoácidos capazes de formar pontes dissulfeto para aumentar a biolongevidade, alterar as caraterísticas secretórias, etc. Em qualquer caso, o fragmento de anticorpos deve possuir uma propriedade bioativa, como atividade de ligação, regulação da ligação no domínio de ligação, etc. As regiões funcionais ou ativas do anticorpo podem ser identificadas por mutagênese de uma região específica da proteína, seguida de expressão e teste do polipeptídeo expresso. Tais métodos, que serão prontamente evidentes para os versados na técnica, podem incluir mutagênese em sítios específicos do ácido nucleico codificador do fragmento de anticorpo.

[260] Os anticorpos da invenção também podem compreender anticorpos humanizados ou anticorpos humanos. As formas humanizadas de anticorpos não-humanos (p.ex. murinos) são imunoglobulinas quiméricas, cadeias de imunoglobulina ou fragmentos das mesmas (como Fv, Fab, Fab' ou outra subsequência ligante de antígeno de um anticorpo) que contêm a sequência mínima derivada de uma imunoglobulina não-humana. Os anticorpos humanizados incluem imunoglobulinas humanas (anticorpo receptor) nas quais os resíduos de uma região determinante complementar (CDR, “complementary determining region”) do receptor são substituídos por resíduos do CDR de uma espécie não-humana (anticorpo doador) como camundongo, rato ou coelho, que tenha especificidade, afinidade e capacidade desejadas. Em alguns casos, resíduos da estrutura Fv (FR) da imunoglobulina humana são substituídos por resíduos não-humanos correspondentes. Os anticorpos humanizados também podem compreender resíduos que não são encontrados nem no anticorpo recipiente nem no CDR importado ou nas sequências da estrutura. Em geral, os anticorpos humanizados compreendem basicamente ao menos um, e tipicamente dois, domínios variáveis nos quais todas ou substancialmente todas as regiões do CDR correspondem às de uma imunoglobulina não-humana e todas ou substancialmente todas as regiões FR são de uma sequência de consenso de imunoglobulina humana. Idealmente, o anticorpo humanizado compreende também ao menos parte de uma região constante de imunoglobulina (Fc), tipicamente uma região de imunoglobulina humana.

[261] Os métodos de humanização de anticorpos não-humanos são bem conhecidos na técnica. De forma geral, um anticorpo humanizado recebe um ou mais resíduos de aminoácidos obtidos de uma fonte não-humana.

Esses resíduos de aminoácidos não-humanos são frequentemente denominados resíduos “importados”, pois são obtidos de um domínio variável “importado”. Essencialmente, a humanização pode ser realizada usando-se CDRs ou sequências de CDR de roedores para substituir sequências correspondentes de um anticorpo humano. Portanto, tais anticorpos “humanizados” são anticorpos quiméricos (Pat. US 4.816.567) nos quais uma porção substancialmente menor que um domínio variável humano intacto foi substituída pela sequência correspondente de uma espécie não-humana. Na prática, os anticorpos humanizados são tipicamente anticorpos humanos nos quais alguns resíduos de CDR e talvez alguns resíduos de FR foram substituídos por resíduos de sítios análogos de anticorpos de roedores.

[262] Podem ser empregados animais transgênicos (p.ex.

camundongos) capazes de, quando imunizados, produzir um repertório completo de anticorpos humanos na ausência de produção de imunoglobulina endógena.

Por exemplo, foi descrito que a deleção homozigota do gene na região juncional da cadeia pesada dos anticorpos em camundongos quiméricos com mutação germinativa inibe completamente a produção endógena de anticorpos. Nesses camundongos com mutação germinativa, a transferência do conjunto de genes de imunoglobulina de linhagem germinativa humana leva à produção de anticorpos humanos após exposição antigênica. Também é possível produzir anticorpos humanos usando bibliotecas de exposição de fagos.

[263] Preferivelmente, os anticorpos da invenção devem ser administrados a indivíduos em um veículo farmaceuticamente aceitável. Em geral, usa-se uma formulação contendo uma quantidade apropriada de um sal farmaceuticamente aceitável para tornar a formulação isotônica. Alguns exemplos de veículos farmaceuticamente aceitáveis são solução salina, solução de Ringer e solução de dextrose. O pH da solução é preferivelmente de cerca de 5 a cerca de 8, e mais preferivelmente de cerca de 7 a cerca de 7,5. Outros veículos possíveis são preparações de liberação prolongada como matrizes semipermeáveis de polímeros hidrofóbicos sólidos contendo o anticorpo, sendo que as matrizes possuem o formato de artigos moldados (p.ex. filmes, lipossomos ou micropartículas). Os versados na técnica perceberão que alguns veículos podem ser mais preferíveis, dependendo, por exemplo, da via de administração e da concentração do anticorpo a ser administrado.

[264] Os anticorpos podem ser administrados ao indivíduo, paciente ou célula por injeção (p.ex. intravenosa, intraperitoneal, subcutânea ou intramuscular) ou por outros métodos, como a infusão, para garantir a introdução na circulação de forma eficaz. Os anticorpos também podem ser administrados pelas vias intra ou peritumoral para que produzam efeitos terapêuticos locais e sistêmicos. A injeção local ou intravenosa é preferida.

[265] As doses efetivas e cronogramas de administração dos anticorpos podem ser determinados empiricamente, e a realização dessas determinações é contemplada pelas habilidades conhecidas na técnica. Os versados na técnica compreenderão que a dose de anticorpos que precisa ser administrada variará dependendo, por exemplo, do indivíduo que receberá o anticorpo, da via de administração, do tipo específico de anticorpo utilizado e de outras drogas administradas. Uma dose diária típica do anticorpo usado isoladamente pode variar de cerca de 1 µg/kg até 100 mg/kg de peso corporal por dia, dependendo dos fatores mencionados anteriormente. Após administração de um anticorpo, preferivelmente para tratamento de carcinoma colangiocelular, carcinoma de bexiga, carcinoma de células escamosas de cabeça e pescoço, carcinoma de células renais, carcinoma hepatocelular, câncer colorretal, câncer da vesícula biliar, câncer de esôfago, câncer de mama, câncer de ovário, câncer de próstata, câncer de pulmão (incluindo adenocarcinoma de pulmão de células não pequenas, câncer de células escamosas de células não pequenas e câncer de pulmão de pequenas células), câncer de pâncreas, câncer do endométrio uterino, câncer gástrico, glioblastoma, leucemia linfocítica crônica, leucemia mieloide aguda, linfoma não-Hodgkin ou melanoma, pode-se avaliar a eficácia terapêutica do mesmo de diversas maneiras conhecidas dos versados na técnica. Por exemplo, o tamanho, o número e/ou a distribuição do câncer em um indivíduo em tratamento podem ser monitorados por técnicas padrão de imagem tumoral. Um anticorpo administrado com finalidade terapêutica que detenha o crescimento tumoral, faça o tumor encolher e/ou impeça que surjam novos tumores (em relação a como a doença evoluiria se não se administrasse o anticorpo) constitui um anticorpo eficaz para tratamento de câncer.

[266] Outro aspecto da invenção é o fornecimento de um método de produção de um receptor de células T solúvel (sTCR) que reconheça um complexo peptídeo-MHC específico. Esses receptores de células T solúveis podem ser gerados a partir de clones específicos de células T, e sua afinidade pode ser aumentada por mutagênese nas regiões determinantes de complementaridade. Para selecionar receptores de células T, pode-se empregar a exibição em fagos (US 2010/0113300, (Liddy et al., 2012)). Para estabilizar os receptores de células T durante a exibição em fagos e em aplicações práticas envolvendo sua utilização como droga, podem-se ligar as cadeias alfa e beta uma à outra por, p.ex., ligações dissulfeto não-nativas, outras ligações covalentes (receptor de células T de cadeia única) ou domínios de dimerização (Boulter et al., 2003; Card et al., 2004; Willcox et al., 1999). O receptor de célula T pode ser ligado a toxinas, drogas, citoquinas (ver, p.ex., US 2013/0115191), domínios de recrutamento de células efetoras (p.ex. domínio anti-CD3), etc., para executar funções específicas em células-alvo. O receptor também pode ser expresso em células T usadas para transferência adotiva. Para mais informações, consulte WO 2004/033685A1 e WO 2004/074322A1. Uma combinação de sTCRs é descrita em WO 2012/056407A1. Outros métodos para sua produção são revelados em WO 2013/057586A1, cujos conteúdos estão incorporados neste documento por referência na sua íntegra.

[267] Os peptídeos e/ou TCRs ou anticorpos ou outras moléculas ligantes da presente invenção podem ser usadas também para verificar o diagnóstico de câncer de um patologista a partir de uma amostra de biópsia.

[268] Os anticorpos ou TCRs também podem ser usados para ensaios diagnósticos in vivo. Geralmente, o anticorpo é marcado por um radionuclídeo (como 111In, 99Tc, 14C, 131I, 3H, 32P ou 35S) para que se possa localizar o tumor por imunocintigrafia. Em uma configuração, anticorpos ou fragmentos dos mesmos se ligam aos domínios extracelulares de dois ou mais alvos de uma proteína selecionada do grupo formado pelas proteínas supramencionadas, e o coeficiente de afinidade (KD) é menor que 1 × 10 µM.

[269] Os anticorpos para uso diagnóstico podem ser marcados com sondas apropriadas para detecção por vários métodos de imagem. São métodos para detecção de sondas, entre outros, fluorescência, microscopia óptica, confocal ou eletrônica; imagem e espectroscopia de ressonância magnética; fluoroscopia; tomografia computadorizada; e tomografia por emissão de pósitrons. São sondas apropriadas, entre outras, fluoresceína, rodamina, eosina e outros fluoróforos, radioisótopos, ouro, gadolínio e outros lantanídeos, ferro paramagnético, flúor-18 e outros radionuclídeos emissores de pósitrons. As sondas também podem ser bi ou multifuncionais e os métodos de detecção podem incluir mais de um dos métodos listados anteriormente. Esses anticorpos podem ser marcados direta ou indiretamente pelas referidas sondas. A conexão das sondas aos anticorpos requer ligação covalente da sonda, incorporação da sonda ao anticorpo e ligação covalente de um composto quelante para ligação da sonda, entre outros procedimentos bem conhecidos na técnica. Para imunohistoquímica, a amostra de tecido patológico pode ser fresca, congelada ou emblocada em parafina e fixada com um conservante como a formalina. O corte fixado ou emblocado contendo a amostra é colocado em contato com um anticorpo primário marcado e com um anticorpo secundário, sendo que o anticorpo é usado para detectar a expressão de proteínas in situ.

[270] Outro aspecto da presente invenção inclui um método in vitro de produção de células T ativadas, sendo que o método compreende colocar células T em contato in vitro com moléculas de MHC humano expressas na superfície de uma célula apresentadora de antígenos por um período suficientemente longo para ativar a célula T de forma específica para o antígeno,

sendo que o antígeno é um peptídeo de acordo com a invenção. Preferivelmente, emprega-se uma quantidade de antígeno apropriada junto com uma célula apresentadora de antígeno.

[271] Preferivelmente, as células de mamíferos não possuem ou apresentam níveis reduzidos de função do transportador de peptídeos TAP.

Algumas células apropriadas, que não possuem o transportador de peptídeos TAP, são as células T2, RMA-S e células de drosófila. O TAP é o transportador associado ao processamento de antígenos.

[272] A linhagem celular T2, que é deficiente em carregamento de peptídeos humanos, está disponível na American Type Culture Collection, 12301 Parklawn Drive, Rockville, Maryland 20852, EUA, sob o nº de catálogo CRL 1992; a linhagem celular de drosófila Schneider 2 está disponível na ATCC sob o nº de catálogo CRL 19863; e a linhagem celular de camundongo RMA-S é descrita em Ljunggren et al. (Ljunggren and Karre, 1985).

[273] Preferivelmente, antes da transfecção a célula hospedeira praticamente não expressa moléculas de MHC classe I. Também é preferível que a célula estimulatória expresse uma molécula importante para o fornecimento de um sinal coestimulatório para células T, tais como qualquer um entre B7.1, B7.2, ICAM-1 e LFA 3. As sequências de ácidos nucleicos de várias moléculas de MHC classe I e de moléculas coestimulatórias estão disponíveis publicamente nos bancos de dados GenBank e EMBL.

[274] No caso de epítopos de MHC classe I usados como antígeno, as células T são células T CD8-positivas.

[275] Se uma célula apresentadora de antígeno for transfectada para expressar um desses epítopos, a célula deve compreender, preferivelmente, um vetor de expressão capaz de expressar um peptídeo contendo SEQ Nº 1 a SEQ Nº 251 e SEQ Nº 289 a SEQ Nº 291 e SEQ Nº 292 a SEQ Nº 299 ou uma sequência de aminoácidos variante dos mesmos.

[276] Diversos outros métodos podem ser usados para gerar células T in vitro. Por exemplo, linfócitos autólogos infiltrantes de tumores podem ser usados para geração de LTC. Plebanski et al.(Plebanski et al., 1995) utilizaram linfócitos autólogos de sangue periférico (PLBs) para preparar células T. Pode-se produzir células T citotóxicas autólogas pulsando células dendríticas com peptídeos ou polipeptídeos ou mediante infecção por um vírus recombinante. As células B também podem ser usadas para produzir células T autólogas. Macrófagos pulsados com peptídeos ou polipeptídeos ou infectados com vírus recombinantes também podem ser usados para preparar células T autólogas. S. Walter et al.(Walter et al., 2003) descreveram a preparação (“priming”) in vitro de células T por meio de células apresentadoras de antígenos (aCAAs) artificiais, que também são uma maneira apropriada de gerar células T contra o peptídeo escolhido. Na presente invenção, as aCAAs foram geradas acoplando-se complexos MHC-peptídeo pré-formados à superfície de partículas de poliestireno (microesférulas) por bioquímica de biotina:estreptavidina. Esse sistema permite controlar exatamente a densidade de MHC sobre as aCAAs, permitindo induzir, de forma seletiva e altamente eficiente, respostas de células T específicas para antígenos de avidez baixa ou elevada em amostras de sangue. Além dos complexos de MHC com peptídeo, as aCAAs devem transportar outras proteínas com atividade coestimulatória como anticorpos anti- CD28 acoplados à sua superfície. Além disso, tais sistemas à base de aCAA frequentemente requerem adição de fatores solúveis apropriados, como, p.ex., citoquinas como a interleucina 12.

[277] Células alogênicas também podem ser usadas para preparar células T, e um método é descrito detalhadamente em WO 97/26328, que fica aqui incorporada por referência. Por exemplo, além de células de drosófila e células T2, podem-se usar outras células para apresentar antígenos, tais como células CHO, células de inseto infectadas por baculovírus, bactérias,

leveduras e células-alvo infectadas por vacínia. Também podem ser usados vírus de plantas (ver, por exemplo, Porta et al.(Porta et al., 1994), que descreve o desenvolvimento do vírus do mosaico de caupi como um sistema de alto rendimento para apresentação de peptídeos exógenos).

[278] As células T ativadas direcionadas contra os peptídeos da invenção possuem utilidade terapêutica. Portanto, outro aspecto da invenção fornece células T ativadas que podem ser obtidas pelos métodos da invenção apresentados anteriormente.

[279] As células T ativadas produzidas pelo método descrito anteriormente reconhecem seletivamente células com expressão aberrante de um polipeptídeo que compreende qualquer sequência de aminoácidos do grupo SEQ Nº 1 a SEQ Nº 251 e SEQ Nº 289 a SEQ Nº 291 e SEQ Nº 292 a SEQ Nº 299.

[280] Um aspecto da invenção fornece métodos para induzir uma resposta imune em um paciente que tem câncer, incluindo a administração ao paciente de uma população de células T ativadas que matam células cancerosas que apresentam um peptídeo que consiste na sequência de aminoácidos de SEQ Nº: 1 a SEQ Nº: 251 ou SEQ Nº: 289 a SEQ Nº: 291.

[281] Um outro aspecto da invenção fornece métodos para tratar um paciente que tem câncer, incluindo a administração ao paciente de uma população de células T ativadas que matam células cancerosas que apresentam um peptídeo que consiste na sequência de aminoácidos de SEQ Nº: 1 a SEQ Nº 251 ou SEQ Nº: 289 a SEQ Nº: 291

[282] Preferivelmente, a célula T reconhecerá a célula ao interagir através de seu TCR com o complexo HLA-peptídeo (p.ex., ligação). As células T são úteis em um método de destruição células-alvo em um paciente cujas células-alvo apresentem expressão aberrante de um polipeptídeo que compreenda uma sequência de aminoácidos da invenção, sendo que o paciente recebe um número eficaz de células T ativadas. As células T administradas ao paciente podem ser derivadas do próprio paciente e ativadas conforme descrito anteriormente (i.é., são células T autólogas). Alternativamente, as células T não são do paciente, mas de outro indivíduo. Evidentemente, prefere-se que o indivíduo seja um indivíduo saudável. Por “indivíduo saudável”, os inventores designam um indivíduo com boa saúde geral, preferivelmente com um sistema imune competente e, mais preferivelmente, que não apresente nenhuma doença que possa ser facilmente detectada por exames.

[283] In vivo, as células-alvo das células T CD8-positivas de acordo com a presente invenção podem ser células tumorais (que às vezes expressam MHC classe II) e/ou células estromais que circundam o tumor (células tumorais) (que às vezes também expressam MHC classe II (Dengjel et al., 2006)).

[284] As células T da presente invenção podem ser utilizadas como ingredientes ativos de uma composição terapêutica. Portanto, a invenção fornece também um método de destruição de células-alvo em um paciente cujas células-alvo apresentam expressão aberrante de um polipeptídeo que compreende uma sequência de aminoácidos da invenção, sendo que o método compreende administrar ao paciente um número eficaz de células T, conforme definido anteriormente.

[285] Com o termo “expressão aberrante”, os inventores também querem dizer que o polipeptídeo é sobrexpresso em comparação com os níveis de expressão em tecidos normais ou que o gene é expresso no tumor apesar de permanecer silencioso no tecido do qual o tumor é derivado. Com o termo “sobrexpresso”, os autores querem dizer que o peptídeo está presente em níveis pelo menos 1,2 vez o nível encontrado no tecido normal, preferivelmente pelo menos 2 vezes e, mais preferivelmente pelo menos 5 ou 10 vezes o nível encontrado no tecido normal.

[286] As células T podem ser obtidas por métodos conhecidos na técnica, p.ex. os métodos descritos anteriormente.

[287] Os protocolos para a chamada transferência adotiva de células T são bem conhecidos na técnica. São apresentadas revisões em Gattioni et al. e Morgan et al.(Gattinoni et al., 2006; Morgan et al., 2006).

[288] Outro aspecto da presente invenção inclui o uso de peptídeos em complexo com MHC para gerar um receptor de células T cujo ácido nucleico seja clonado e introduzido na célula hospedeira, preferivelmente uma célula T. Essa célula T modificada pode então ser introduzida em um paciente para tratamento do câncer.

[289] Qualquer molécula da invenção, i.é., o peptídeo, ácido nucleico, anticorpo, vetor de expressão, célula, célula T ativada, receptor de célula T ou ácido nucleico que o codifique, é útil no tratamento de distúrbios caracterizados por células que escapam de uma resposta imune. Portanto, qualquer molécula da presente invenção pode ser empregada como medicamento ou na fabricação de um medicamento. A molécula pode ser empregada isoladamente ou combinada com outras moléculas da invenção ou com moléculas conhecidas.

[290] A presente invenção refere-se também a um kit que compreende: (a) um recipiente que contém uma composição farmacêutica conforme descrito anteriormente, em solução ou em forma liofilizada; (b) opcionalmente, um segundo recipiente contendo um diluente ou solução para reconstituição de uma formulação liofilizada; e (c) opcionalmente, instruções de (i) uso da solução ou (ii) reconstituição e/ou uso da formulação liofilizada.

[291] O kit pode compreender também um ou mais dentre (iii) um tampão, (iv) um diluente, (v) um filtro, (vi) uma agulha ou (v) uma seringa. O recipiente é preferivelmente um frasco, uma ampola, uma seringa ou um tubo de ensaio e pode ser um recipiente multiuso. A composição farmacêutica é preferivelmente liofilizada.

[292] Kits da presente invenção, compreendendo preferivelmente uma formulação liofilizada da presente invenção em um recipiente apropriado e instruções para sua reconstituição e uso. São recipientes adequados, por exemplo, frascos, ampolas (p.ex. ampolas de câmara dupla), seringas (como seringas de câmara dupla) e tubos de ensaio. O recipiente pode ser constituído de diversos materiais como vidro ou plástico. Preferivelmente, o kit e/ou o recipiente contêm instruções no ou associadas ao recipiente que apresentam instruções para reconstituição e/ou utilização. Por exemplo, o rótulo pode indicar que a formulação liofilizada pode ser reconstituída até atingir as concentrações peptídicas descritas anteriormente. O rótulo também pode indicar que a formulação é útil ou destina-se a administração subcutânea.

[293] O recipiente contendo a formulação pode ser um frasco multiuso, que permite administrações repetidas (p.ex. de 2 a 6 administrações) da formulação reconstituída. O kit pode compreender também um segundo recipiente que contém um diluente apropriado (p.ex. solução de bicarbonato de sódio).

[294] Ao misturar o diluente e a formulação liofilizada, a concentração final do peptídeo na formulação reconstituída é preferivelmente pelo menos 0,15 mg/mL/peptídeo (75 µg) e preferivelmente não mais que 3 mg/mL/peptídeo (1500 µg). O kit pode incluir também outros materiais desejáveis do ponto de vista comercial e do usuário, como outros tampões, diluentes, filtros, agulhas, seringas e bulas com instruções de uso.

[295] Os kits da presente invenção podem conter um único recipiente que contém a formulação das composições farmacêuticas de acordo com a presente invenção, com ou sem outros componentes (p.ex. outros compostos ou composições farmacêuticas desses outros compostos) ou pode possuir recipientes distintos para cada componente.

[296] Preferivelmente, os kits da presente invenção contêm uma formulação farmacêutica embalada para uso em associação com a coadministração de um segundo composto (como os adjuvantes (p.ex. GM- CSF), um agente quimioterápico, um produto natural, um hormônio ou antagonista, um agente antiangiogênese ou inibidor, um agente indutor de apoptose ou um quelante) ou uma composição farmacêutica dos mesmos. Os componentes do kit podem ser pré-complexados ou cada componente pode ser fornecido em um recipiente diferente e separado antes da administração a um paciente. Os componentes do kit podem ser fornecidos em uma ou mais soluções líquidas, preferivelmente soluções aquosas e, mais preferivelmente, soluções aquosas estéreis. Os componentes do kit também podem ser fornecidos no estado sólido e serem convertidos em líquido adicionando-se solventes apropriados, que são preferivelmente fornecidos em outro recipiente separado.

[297] O recipiente de um kit terapêutico pode ser uma ampola, tubo de ensaio, frasco, garrafa, seringa ou qualquer outro meio de envasar um sólido ou líquido. Usualmente, quando existe mais de um componente, o kit conterá um segundo frasco ou outro recipiente, que permitirá administração separada. O kit também pode conter outro recipiente para um líquido farmaceuticamente aceitável. Preferivelmente, um kit terapêutico contém um aparato (p.ex. uma ou mais agulhas, seringas, conta-gotas, pipetas, etc.), que permite administrar os agentes da invenção que são componentes do presente kit.

[298] A presente formulação é de um tipo apropriado para administração de peptídeos por qualquer via aceitável, como a oral (entérica), nasal, oftálmica, subcutânea, intradérmica, intramuscular, intravenosa ou transdérmica. A administração deve ser preferivelmente s.c. e, o mais preferido, i.d., podendo também ser realizada por uma bomba de infusão.

[299] Como os peptídeos da invenção foram isolados de carcinoma colangiocelular, carcinoma de bexiga, carcinoma de células escamosas de cabeça e pescoço, carcinoma de células renais, carcinoma hepatocelular, câncer colorretal, câncer da vesícula biliar, câncer de esôfago, câncer de mama, câncer de ovário, câncer de próstata, câncer de pulmão (incluindo adenocarcinoma de pulmão de células não pequenas, câncer de células escamosas de células não pequenas e câncer de pulmão de pequenas células), câncer de pâncreas, câncer do endométrio uterino, câncer gástrico, glioblastoma, leucemia linfocítica crônica, leucemia mieloide aguda, linfoma não- Hodgkin e melanoma, o medicamento da invenção é preferivelmente usado no tratamento de carcinoma colangiocelular, carcinoma de bexiga, carcinoma de células escamosas de cabeça e pescoço, carcinoma de células renais, carcinoma hepatocelular, câncer colorretal, câncer da vesícula biliar, câncer de esôfago, câncer de mama, câncer de ovário, câncer de próstata, câncer de pulmão (incluindo adenocarcinoma de pulmão de células não pequenas, câncer de células escamosas de células não pequenas e câncer de pulmão de pequenas células), câncer de pâncreas, câncer do endométrio uterino, câncer gástrico, glioblastoma, leucemia linfocítica crônica, leucemia mieloide aguda, linfoma não-Hodgkin ou melanoma.

[300] A presente invenção refere-se também a método de produção de um medicamento personalizado para um paciente individual, que compreende a fabricação de uma composição farmacêutica que compreende pelo menos um peptídeo selecionado de um depósito de TUMAPs pré- selecionados, no qual pelo menos um peptídeo empregado na composição farmacêutica é selecionado conforme seja mais apropriado para o paciente individual. Em uma configuração, a composição farmacêutica é uma vacina. O método também pode ser adaptado para produzir clones de células T para aplicações subsequentes, tais como isolamento de TCR, ou anticorpos solúveis e outras opções terapêuticas.

[301] “Medicamento personalizado” significa tratamentos adaptados especificamente a um paciente e que serão usados apenas para tratamento desse paciente, incluindo vacinas anticâncer personalizadas ativamente e terapias adotivas com células usando tecido autólogo do paciente.

[302] Conforme aqui utilizado, o termo “depósito” refere-se a um grupo ou conjunto de peptídeos pré-selecionados por sua imunogenicidade e apresentação aumentada em um determinado tipo de tumor. O termo “depósito” não pretende sugerir que os peptídeos específicos incluídos na vacina foram pré- fabricados e armazenados em uma instalação física, embora se contemple essa possibilidade. Contempla-se expressamente que os peptídeos podem ser fabricados de novo para cada vacina individualizada fabricada ou podem ser pré- fabricados e armazenados. O depósito (p.ex. na forma de um banco de dados) consiste em peptídeos associados a tumores e sobrexpressos em tecidos tumorais de pacientes com carcinoma colangiocelular, carcinoma de bexiga, carcinoma de células escamosas de cabeça e pescoço, carcinoma de células renais, carcinoma hepatocelular, câncer colorretal, câncer da vesícula biliar, câncer de esôfago, câncer de mama, câncer de ovário, câncer de próstata, câncer de pulmão (incluindo adenocarcinoma de pulmão de células não pequenas, câncer de células escamosas de células não pequenas e câncer de pulmão de pequenas células), câncer de pâncreas, câncer do endométrio uterino, câncer gástrico, glioblastoma, leucemia linfocítica crônica, leucemia mieloide aguda, linfoma não-Hodgkin e melanoma, associados a diversos alelos de HLA-A HLA-B e HLA-C. O depósito pode conter peptídeos de MHC classe I ou MHC classe II ou peptídeos alongados de MHC classe I. Além dos peptídeos associados a tumores colhidos de diversos tecidos de carcinoma colangiocelular,

carcinoma de bexiga, carcinoma de células escamosas de cabeça e pescoço, carcinoma de células renais, carcinoma hepatocelular, câncer colorretal, câncer da vesícula biliar, câncer de esôfago, câncer de mama, câncer de ovário, câncer de próstata, câncer de pulmão (incluindo adenocarcinoma de pulmão de células não pequenas, câncer de células escamosas de células não pequenas e câncer de pulmão de pequenas células), câncer de pâncreas, câncer do endométrio uterino, câncer gástrico, glioblastoma, leucemia linfocítica crônica, leucemia mieloide aguda, linfoma não-Hodgkin e melanoma, o depósito pode conter também peptídeos marcadores de HLA-A*02, HLA-A*01, HLA-A*03, HLA-A*24, HLA-B*07, HLA-B*08 e HLA-B*44. Esses peptídeos permitem comparar quantitativamente a magnitude da imunidade mediada por células T induzida por TUMAPs, permitindo assim tirar importantes conclusões sobre a capacidade da vacina de produzir respostas antitumorais. Segundo, os peptídeos funcionam como importantes controles positivos derivados de um antígeno “não-próprio” (“não-self”) nos casos em que não se observam respostas de células T induzidas pela vacina a TUMAPs derivados de antígenos “próprios” (“self”) em um paciente. Terceiro, eles podem permitir tirar conclusões sobre o nível de imunocompetência do paciente.

[303] Os TUMAPs usados para constituir o depósito foram identificados por meio de uma abordagem de genômica funcional integrada que combina análise de expressão gênica, espectrometria de massa e imunologia de células T (XPRESIDENT®). Essa abordagem garante que apenas TUMAPs que estejam realmente presentes em uma porcentagem elevada de tumores e sejam minimamente ou nada expressos em tecidos normais sejam selecionados para análises posteriores. Para seleção inicial de peptídeos, amostras de pacientes com carcinoma colangiocelular, carcinoma de bexiga, carcinoma de células escamosas de cabeça e pescoço, carcinoma de células renais, carcinoma hepatocelular, câncer colorretal, câncer da vesícula biliar, câncer de esôfago,

câncer de mama, câncer de ovário, câncer de próstata, câncer de pulmão (incluindo adenocarcinoma de pulmão de células não pequenas, câncer de células escamosas de células não pequenas e câncer de pulmão de pequenas células), câncer de pâncreas, câncer do endométrio uterino, câncer gástrico, glioblastoma, leucemia linfocítica crônica, leucemia mieloide aguda, linfoma não- Hodgkin ou melanoma e sangue de doadores saudáveis foram analisados de acordo com a sequência detalhada a seguir.

[304] 1. Ligantes de HLA do material maligno foram identificados por espectrometria de massa.

[305] 2. A análise de expressão de ácido ribonucleico mensageiro (mRNA) em genoma inteiro foi utilizada para identificar genes sobrexpressos em tecidos malignos como carcinoma colangiocelular, carcinoma de bexiga, carcinoma de células escamosas de cabeça e pescoço, carcinoma de células renais, carcinoma hepatocelular, câncer colorretal, câncer da vesícula biliar, câncer de esôfago, câncer de mama, câncer de ovário, câncer de próstata, câncer de pulmão (incluindo adenocarcinoma de pulmão de células não pequenas, câncer de células escamosas de células não pequenas e câncer de pulmão de pequenas células), câncer de pâncreas, câncer do endométrio uterino, câncer gástrico, glioblastoma, leucemia linfocítica crônica, leucemia mieloide aguda, linfoma não-Hodgkin ou melanoma em relação a uma série de órgãos e tecidos normais.

[306] 3. Os ligantes de HLA identificados foram comparados com os dados de expressão gênica. Os peptídeos apresentados de forma exacerbada ou seletivamente em tecidos tumorais, preferivelmente codificados por genes expressos seletivamente ou expressos de forma excessiva conforme detectados na etapa 2, foram considerados candidatos a TUMAPs apropriados para uma vacina multipeptídica.

[307] 4. Uma busca na literatura foi realizada para identificar mais evidências indicativas da relevância dos peptídeos identificados como TUMAPs.

[308] 5. A relevância da sobrexpressão ao nível de mRNA foi confirmada pela detecção dos TUMAPs selecionados na etapa 3 em tecido tumoral e pela detecção baixa ou ausente em tecidos saudáveis.

[309] 6. A fim de avaliar se a indução de respostas de células T in vivo pelos peptídeos selecionados é factível, foram realizados ensaios de imunogenicidade in vitro com células T humanas de doadores saudáveis e com células de pacientes portadores de carcinoma colangiocelular, carcinoma de bexiga, carcinoma de células escamosas de cabeça e pescoço, carcinoma de células renais, carcinoma hepatocelular, câncer colorretal, câncer da vesícula biliar, câncer de esôfago, câncer de mama, câncer de ovário, câncer de próstata, câncer de pulmão (incluindo adenocarcinoma de pulmão de células não pequenas, câncer de células escamosas de células não pequenas e câncer de pulmão de pequenas células), câncer de pâncreas, câncer do endométrio uterino, câncer gástrico, glioblastoma, leucemia linfocítica crônica, leucemia mieloide aguda, linfoma não-Hodgkin e melanoma.

[310] Em um aspecto, os peptídeos são pré-selecionados por sua imunogenicidade antes de serem incluídos no depósito. A título exemplificativo e não limitante, a imunogenicidade dos peptídeos incluídos no depósito é determinada por um método que compreende a preparação (“priming”) in vitro de células T mediante estimulações repetidas de células T CD8+ de doadores saudáveis com células apresentadoras de antígenos artificiais carregadas com complexos de peptídeo com MHC e anticorpo anti-CD28.

[311] Esse método é preferido para cânceres raros e pacientes com perfis de expressão raros. Ao contrário dos coquetéis multipeptídicos com composição fixa desenvolvidos atualmente, o depósito permite obter correspondências significativamente melhores entre a vacina e a expressão efetiva de antígenos do tumor. Peptídeos selecionados disponíveis comercialmente ou combinações dos mesmos serão usados para cada paciente em uma abordagem multialvo. Teoricamente, uma abordagem baseada na seleção de, p.ex., 5 peptídeos antigênicos diferentes de uma biblioteca de 50 proporcionaria cerca de 17 milhões de possíveis composições de produtos medicamentosos (PM).

[312] Em um aspecto, os peptídeos são selecionados para inclusão na vacina com base em sua adequação ao paciente individual baseado no método de acordo com a presente invenção conforme aqui descrito ou conforme apresentado a seguir.

[313] Os dados de fenótipo de HLA, transcriptoma e peptidoma são coligidos do material obtido do tumor do paciente e de amostras de sangue para identificar os peptídeos mais apropriados para cada paciente contendo TUMAPs do depósito específicos para o paciente (i.é., mutantes). Serão selecionados peptídeos expressos de forma excessiva ou seletiva nos tumores dos pacientes e que, sempre que possível, mostrem forte imunogenicidade in vitro quando testados com células mononucleares do sangue periférico (CMSPs) do paciente.

[314] Preferivelmente, os peptídeos incluídos na vacina são identificados por um método que compreende: (a) identificação de peptídeos associados ao tumor (TUMAPs) apresentados por uma amostra tumoral de um paciente individual; (b) comparação dos peptídeos identificados em (a) com um depósito (banco de dados) de peptídeos conforme descrito anteriormente; e (c) seleção de pelo menos um peptídeo do depósito (banco de dados) que se correlacione com um peptídeo associado ao tumor identificado no paciente. Por exemplo, os TUMAPs apresentados em amostras tumorais são identificados da seguinte maneira: (a1) comparação dos dados de expressão da amostra tumoral com os dados de expressão de uma amostra de tecido normal correspondente ao tipo de tecido da amostra tumoral para identificar proteínas que são sobrexpressas ou apresentam expressão aberrante na amostra tumoral; e (a2) correlação dos dados de expressão com sequências de ligantes de MHC ligados a moléculas de MHC classe I e/ou classe II na amostra tumoral para identificar ligantes de MHC derivados de proteínas sobrexpressas ou expressas de forma aberrante pelo tumor. Preferivelmente, as sequências dos ligantes de MHC são identificadas eluindo-se os peptídeos ligados das moléculas de MHC isoladas da amostra tumoral e sequenciando-se os ligantes eluídos. Preferivelmente, a amostra de tumor e a amostra de tecido normal devem ser obtidas do mesmo paciente.

[315] Além de, ou como alternativa a, selecionar peptídeos usando um modelo de depósito (banco de dados), os TUMAPs podem ser identificados em pacientes de novo e incluídos na vacina. Como exemplo, os TUMAPs candidatos podem ser identificados no paciente da seguinte maneira: (a1) comparação dos dados de expressão da amostra tumoral com os dados de expressão de uma amostra de tecido normal correspondente ao tipo de tecido da amostra tumoral para identificar proteínas que são sobrexpressas ou apresentam expressão aberrante na amostra tumoral; e (a2) correlação dos dados de expressão com sequências de ligantes de MHC ligados a moléculas de MHC classe I e/ou classe II na amostra tumoral para identificar ligantes de MHC derivados de proteínas sobrexpressas ou expressas de forma aberrante pelo tumor. Como outro exemplo, podem-se identificar proteínas que contêm mutações específicas para a amostra tumoral em relação ao tecido normal correspondente de um paciente individual, e podem-se identificar TUMAPs que atuam especificamente sobre a mutação. Por exemplo, os genomas do tumor e do tecido normal correspondente podem ser sequenciados por sequenciamento de genoma inteiro. Para descobrir mutações não-sinônimas nas regiões codificadoras de proteínas dos genes, o DNA e o RNA genômicos são extraídos de tecidos tumorais e o DNA germinativo não-mutante do genoma normal é extraído de células mononucleares do sangue periférico (CMSPs). A abordagem NGS aplicada restringe-se ao ressequenciamento de regiões codificadoras de proteínas (ressequenciamento do exoma). Para essa finalidade, o DNA exônico de amostras humanas é capturado usando kits de enriquecimento fornecidos comercialmente seguido por sequenciamento usando, por exemplo, um instrumento HiSeq2000 (Illumina). O mRNA tumoral também é sequenciado para quantificação direta da expressão gênica e validação do fato de que os tumores dos pacientes expressam os genes mutantes. As milhões de leituras de sequências assim produzidas são processadas por algoritmos em software. A lista produzida contém mutações e expressão gênica. As mutações somáticas específicas para tumores são determinadas comparando-se as variações germinativas derivadas de CMSP, e essas derivações recebem prioridade. Os peptídeos identificados de novo podem então ter sua imunogenicidade testada conforme descrito anteriormente em relação ao depósito, e os TUMAPs candidatos que possuírem imunogenicidade apropriada são selecionados para inclusão na vacina.

[316] Em uma configuração exemplar, os peptídeos incluídos na vacina são identificados pelo seguinte procedimento: (a) identificação de peptídeos associados a tumor (TUMAPs) apresentados por uma amostra tumoral de um paciente individual usando o método descrito anteriormente; (b) comparação dos peptídeos identificados na etapa a) com um depósito de peptídeos pré-selecionados de acordo com a imunogenicidade e apresentação aumentada em tumores em comparação com os tecidos normais correspondentes; (c) seleção de pelo menos um peptídeo do depósito que se correlaciona com um peptídeo associado a tumores identificado no paciente; e (d) opcionalmente, seleção de pelo menos um peptídeo identificado de novo em (a) para confirmar sua imunogenicidade.

[317] Em uma configuração exemplar, os peptídeos incluídos na vacina são identificados pelo seguinte procedimento: (a) identificação de peptídeos associados a tumor (TUMAPs) apresentados por uma amostra tumoral de um paciente individual; e (b) seleção de pelo menos um peptídeo identificado de novo em (a) para confirmar sua imunogenicidade.

[318] Uma vez selecionados os peptídeos para uma vacina peptídica personalizada, a vacina é produzida. Preferivelmente, a vacina é uma formulação líquida que consiste em peptídeos individuais dissolvidos em 20% a 40% de DMSO, preferivelmente de 30% a 35% de DMSO, como cerca de 33% de DMSO.

[319] Todos os peptídeos a serem incluídos em um produto são dissolvidos em DMSO. A concentração das soluções de peptídeo único deve ser escolhida em função do número de peptídeos a serem incluídos no produto.

Soluções de um peptídeo em DMSO são misturadas em partes iguais para criar uma solução contendo todos os peptídeos a serem incluídos no produto a uma concentração de ~2,5 mg/ml por peptídeo. A solução misturada é então diluída 1:3 em água para injeção de modo a atingir uma concentração de 0,826 mg/ml por peptídeo em DMSO a 33%. A solução diluída é filtrada por um filtro estéril de 0,22 µm. A solução bruta final é obtida.

[320] A solução bruta final é acondicionada em ampolas e armazenada a -20°C até o momento do uso. Cada ampola contém 700 µL de uma solução que contém 0,578 mg de cada peptídeo. Destes, 500 μL (cerca de 400 μg por peptídeo) serão administrados por injeção intradérmica.

[321] Além de serem úteis para o tratamento do câncer, os peptídeos da presente invenção também têm aplicações diagnósticas. Como os peptídeos foram gerados a partir de células de carcinoma colangiocelular, carcinoma de bexiga, carcinoma de células escamosas de cabeça e pescoço, carcinoma de células renais, carcinoma hepatocelular, câncer colorretal, câncer da vesícula biliar, câncer de esôfago, câncer de mama, câncer de ovário, câncer de próstata, câncer de pulmão (incluindo adenocarcinoma de pulmão de células não pequenas, câncer de células escamosas de células não pequenas e câncer de pulmão de pequenas células), câncer de pâncreas, câncer do endométrio uterino, câncer gástrico, glioblastoma, leucemia linfocítica crônica, leucemia mieloide aguda, linfoma não-Hodgkin e melanoma.

[322] A presença dos peptídeos reivindicados em biópsias de tecidos ou em amostras de sangue pode ajudar um patologista a diagnosticar câncer. A detecção de determinados peptídeos por anticorpos, espectrometria de massa ou outros métodos conhecidos na técnica pode indicar para o patologista que a amostra de tecido é maligna, inflamatória ou geralmente patológica ou pode ser usada como biomarcador de carcinoma colangiocelular, carcinoma de bexiga, carcinoma de células escamosas de cabeça e pescoço, carcinoma de células renais, carcinoma hepatocelular, câncer colorretal, câncer da vesícula biliar, câncer de esôfago, câncer de mama, câncer de ovário, câncer de próstata, câncer de pulmão (incluindo adenocarcinoma de pulmão de células não pequenas, câncer de células escamosas de células não pequenas e câncer de pulmão de pequenas células), câncer de pâncreas, câncer do endométrio uterino, câncer gástrico, glioblastoma, leucemia linfocítica crônica, leucemia mieloide aguda, linfoma não-Hodgkin e melanoma. A presença de grupos de peptídeos pode permitir a classificação ou subclassificação de tecidos patológicos.

[323] A detecção de peptídeos em amostras de tecido doente pode permitir a decisão sobre o benefício de tratamentos que envolvem o sistema imune, sobretudo se os linfócitos T participarem ou se esperar que participem do mecanismo de ação. A perda da expressão de MHC é um mecanismo bem descrito pelo qual células malignas infectadas escapam da imunovigilância. Portanto, a presença de peptídeo mostra que esse mecanismo não é explorado pelas células analisadas.

[324] Os peptídeos da presente invenção podem ser empregados para analisar respostas linfocitárias contra esses peptídeos, tais como respostas de células T ou de anticorpos contra o peptídeo ou contra o peptídeo em complexo com moléculas de MHC. Essas respostas podem ser usadas como marcadores prognósticos para tomar decisões sobre as próximas etapas do tratamento. Essas respostas também podem ser empregadas como marcadores de resposta sucedâneos em abordagens imunoterápicas que visam a induzir respostas linfocitárias por outros meios (p.ex. vacinação com proteínas, ácidos nucleicos, materiais autólogos e transferência adotiva de linfócitos). No âmbito de terapias gênicas, as respostas linfocitárias contra peptídeos podem ser consideradas na avaliação dos efeitos colaterais. O monitoramento das respostas linfocitárias também pode ser um valioso recurso para exames de acompanhamento de tratamentos envolvendo transplantes; p.ex. para detectar doença enxerto-versus-hospedeiro ou hospedeiro-versus-enxerto.

[325] A presente invenção será agora descrita nos seguintes exemplos, que descrevem configurações preferidas da mesma, com referência às figuras apresentadas a seguir, mas sem limitar-se aos exemplos. Para os fins da presente invenção, todas as referências aqui citadas ficam integralmente incorporadas por referência.

FIGURAS

[326] As Figuras 1A a 1O mostram a sobreapresentação de vários peptídeos em diferentes tecidos de câncer (pontos pretos). Parte superior: As intensidades medianas dos sinais de espectrometria de massa (MS) obtidos a partir de mensurações de réplicas técnicas aparecem como pontos para amostras positivas normais (pontos cinza, lado esquerdo da figura) e de tumor (pontos pretos, lado direito da figura) nas quais o peptídeo foi detectado. As caixas representam a mediana e o 25º e o 75º percentis da intensidade normalizada do sinal, o ponto mais baixo dos bigodes indica o valor mais baixo que ainda está dentro de 1,5 do intervalo interquartis (IIQ) do quartil inferior e o ponto mais alto dentro de 1,5 do IIQ do quartil superior. Os órgãos normais são ordenados segundo categorias de risco. Células sanguíneas, vasos sanguíneos, cérebro, coração, fígado e pulmão são marcados com pontos cinza (risco alto); órgãos reprodutores, mama, próstata com pontos cinza (risco baixo); e todos os outros órgãos com pontos cinza (risco médio). Parte inferior: A frequência relativa de detecção de peptídeos em cada órgão é mostrada em um gráfico de espinha de peixe. Os números embaixo do painel indicam o número de amostras nas quais o peptídeo foi detectado em relação ao total de amostras analisadas para cada órgão. Se o peptídeo for encontrado na amostra mas não puder ser quantificado por motivos técnicos, a amostra será incluída nesta representação de frequência de detecção, mas não será mostrado um ponto na parte superior da figura. As Figuras 1A a 1L mostram a sobreapresentação de vários peptídeos em tecidos de câncer HLA-B*08 em comparação com um painel de amostras normais de HLA-B*08 (N = 38 para amostras normais, N = 91 para amostras de tumor). Tecidos (da esquerda para a direita): Amostras normais: células sang. (células sanguíneas); vsang (vasos sanguíneos); cérebro; coração; fígado; pulmão; glsuprarr (glândula suprarrenal); ducto biliar; esôf. (esôfago); ves.

biliar (vesícula biliar); rim; periferia do nervo (nervo periférico); pâncreas; pele; med.

espin. (medula espinhal); baço; estômago; tireoide; traqueia; Amostras de tumor: LMA (leucemia mieloide aguda); CAM (câncer de mama); CCC (carcinoma colangiocelular); LLC (leucemia linfocítica crônica); CaCR (câncer colorretal); CVB (câncer da vesícula biliar); GBM (glioblastoma); CG (câncer gástrico); CHC (carcinoma hepatocelular); CCECP (carcinoma de células escamosas de cabeça e pescoço); MEL (melanoma); LNH (linfoma não-Hodgkin); adenoCPCNP (adenocarcinoma de pulmão de células não-pequenas); outroCPCNP (amostras de CPCNP que não podem ser caracterizadas com certeza como adenoCPCNP ou CPCNP escamoso); NSCLCescam (câncer de pulmão de células não-pequenas do tipo escamoso); CO (câncer de ovário); CE (câncer de esôfago); CP (câncer de pâncreas); CPr (câncer de próstata); CCR (carcinoma de células renais); CPPC (câncer de pulmão de pequenas células); CB (carcinoma de bexiga); CAU (câncer de útero e endométrio). Figura 1A) Peptídeo: MAPLKMLAL (SEQ Nº: 11).

Figura 1B) Peptídeo: EPFTRPVL (SEQ Nº: 13), Figura 1C) Peptídeo: RILKRFLAC (SEQ Nº: 21), Figura 1D) Peptídeo: DLRNKIIAA (SEQ Nº: 46), Figura 1E) Peptídeo: RPKGTPPL (SEQ Nº: 70), Figura 1F) Peptídeo: EVYLRMYQL (SEQ Nº: 80), Figura 1G) Peptídeo: VPYTKVQL (SEQ Nº: 89), Figura 1H) Peptídeo: DIKKTNESL (SEQ Nº: 23), Figura 1I) Peptídeo: DLVLKRCL (SEQ Nº: 24). Figura 1J) Peptídeo: ELFLHPVL (SEQ Nº: 29). Figura 1K) Peptídeo: DLQKKAQAL (SEQ Nº: 30), Figura 1L) Peptídeo: DLRKLKRQL (SEQ Nº: 53). As Figuras 1M e 1O mostram a sobreapresentação de vários peptídeos em tecidos de câncer HLA-A*02 em comparação com um painel de amostras normais de HLA-A*02 (N = 592 para amostras normais, N = 711 para amostras de tumor). Tecidos (da esquerda para a direita): Amostras normais: células sanguíneas (células sang.); vassang (vasos sanguíneos); cérebro; coração; fígado; pulmão; med. espin. (medula espinhal); adiposo; glsuprarr (glândula suprarrenal); ducto biliar; bexiga; medula óssea; esôf.

(esôfago); olho; ves. biliar (vesícula biliar); cabeça e pescoço; int. grosso (intestino grosso); intest. delgado (intestino delgado); rim; linfonodo; centro do nervo (nervo central); periferia do nervo (nervo periférico); pâncreas; paratir (glândula paratireoide); perit (peritônio); pituit (glândula pituitária); pleura; músculo esq.

(músculo esquelético); pele; baço; estômago; tireoide; traqueia; ureter; mama; ovário, placenta; próstata; testículo; timo; útero; Amostras de tumor: LMA (leucemia mieloide aguda); CAM (câncer de mama); CCC (carcinoma colangiocelular); LLC (leucemia linfocítica crônica); CaCR (câncer colorretal); GVB (câncer da vesícula biliar); GBM (glioblastoma); CG (câncer gástrico); GJGE (câncer da junção gastroesofágica); CHC (carcinoma hepatocelular); CCECP (carcinoma de células escamosas de cabeça e pescoço); MEL (melanoma); LNH (linfoma não Hodking); adeno CPCNP (adenocarcinoma de câncer de pulmão de célula não pequena);

outro CPCNP (amostras de CPCNP que não poderiam ser ambiguamente designadas como adeno CPCNP ou CPCNP escam); CPCNPescam (câncer de pulmão de célula escamosa não pequena); CO (câncer de ovário); CE (câncer esofageal); CP (câncer pancreático); CPr(câncer de próstata); CCR (câncer de célula renal); CPPC (câncer de pulmão de célula pequena); CB (carcinoma de bexiga); CAU (câncer de endométrio e uterino. Figura 1M) Peptídeo: SLAESEASL (SEQ Nº: 289), Figura 1O) Peptídeo: YVYANHFTEA (SEQ Nº: 291). A Figura 1N mostra a sobreapresentação de EEFLTPKKL (SEQ Nº: 290) em tecidos de câncer HLA-B*44 em comparação com um painel de amostras normais de HLA-B*44 (N = 204 para amostras normais, N = 206 para amostras de tumor). Tecidos (da esquerda para a direita): Amostras normais: células sang. (células sanguíneas); vassang (vasos sanguíneos); cérebro; coração; fígado; pulmão; med. espin.

(medula espinhal); adiposo; glsuprarr (glândula suprarrenal); ducto biliar; bexiga; medula óssea; esôf. (esôfago); olho; ves. biliar (vesícula biliar); cabeça e pescoço; int. grosso (intestino grosso); intest. delgado (intestino delgado); rim; linfonodo; centro do nervo (nervo central); periferia do nervo (nervo periférico); pâncreas; paratir (glândula paratireoide); perit (peritônio); pituit (glândula pituitária); músculo esq. (músculo esquelético); pele; baço; estômago; tireoide; traqueia; ureter; mama; ovário; placenta; próstata; testículo; útero; Amostras de tumor: LMA (leucemia mieloide aguda); CAM (câncer de mama); CCC (carcinoma colangiocelular); LLC (leucemia linfocítica crônica); CaCR (câncer colorretal); CVB (câncer da vesícula biliar); GBM (glioblastoma); CG (câncer gástrico); CHC (carcinoma hepatocelular); CCECP (carcinoma de células escamosas de cabeça e pescoço); MEL (melanoma); LNH (linfoma não-Hodgkin); adenoCPCNP (adenocarcinoma de pulmão de células não-pequenas); outroCPCNP (amostras de CPCNP que não podem ser caracterizadas com certeza como adenoCPCNP ou CPCNP escamoso); NSCLCescam (câncer de pulmão de células não-pequenas do tipo escamoso); CO (câncer de ovário); CE (câncer de esôfago); CP (câncer de pâncreas); CPr (câncer de próstata); CCR (carcinoma de células renais); CPPC (câncer de pulmão de pequenas células); CB (carcinoma de bexiga); CAU (câncer de útero e endométrio).

[327] As Figuras 2A a 2Y mostram perfis de expressão exemplares de genes fonte da presente invenção, que são sobrexpressos em várias amostras de câncer. As amostras tumorais (pontos pretos) e normais (pontos cinza) são agrupadas de acordo com o órgão de origem. As caixas de bigodes representam o valor mediano de FPKM, o 25º e o 75º percentis (caixa), o ponto mais baixo dentro de 1,5 do intervalo interquartis (IIQ) do quartil inferior e o ponto mais alto dentro de 1,5 do IIQ do quartil superior. Os órgãos normais aparecem ordenados por categoria de risco. FPKM: Fragmentos por quilobase por milhão de leituras mapeadas.

Amostras normais: células sang. (células sanguíneas); vsang (vasos sanguíneos); cérebro; coração; fígado; pulmão; adiposo (tecido adiposo); glsuprarr (glândula suprarrenal); ducto biliar; bexiga; medula óssea; esôf (esôfago); olho; ves bil (vesícula biliar); cabeça e pescoço; intest. gr (intestino grosso); intest. del (intestino delgado); rim; linfonodo; nervo perif (nervo periférico); pâncreas; paratir (glândula paratireoide); perit (peritônio); hipóf (hipófise); pleura; mus esquel. (Músculo esquelético); pele; medula espinhal; baço; estômago; tireoide; traqueia; ureter; mama; ovário; placenta; próstata; testículo; timo; útero. Amostras tumorais: adenoCPCNP (adenocarcinoma de pulmão de células não-pequenas); CaCR (câncer colorretal); CAM (câncer de mama); CAU (câncer de útero e endométrio); CB (carcinoma de bexiga); CCC (carcinoma colangiocelular); CCECP (carcinoma de células escamosas de cabeça e pescoço); CCR (carcinoma de células renais); CE (câncer de esôfago); CG (câncer gástrico); CHC (carcinoma hepatocelular); CO (câncer de ovário); CP (câncer de pâncreas); CPCNPescam (câncer de pulmão de células não-pequenas do tipo escamoso); CPPC (câncer de pulmão de pequenas células); CPr (câncer de próstata); CVB (câncer da vesícula biliar); GBM (glioblastoma); LLC (leucemia linfocítica crônica); LMA (leucemia mieloide aguda); LNH (linfoma não-Hodgkin); MEL (melanoma); outroCPCNP (amostras de CPCNP que não podem ser caracterizadas com certeza como adenoCPCNP ou CPCNP escamoso).

[328] Figura 2A) Símbolo do gene: MAGEA9, MAGEA9B, Peptídeo ALKLKVAEL (SEQ Nº: 1), Figura 2B) Símbolo do gene: MAGEA3, Peptídeo: QIMPKAGL (SEQ Nº: 2), Figura 2C) Símbolo do gene: PRAME; Peptídeo: SIQSRYISM (SEQ Nº: 3), Figura 2D) Símbolo do gene: MAGEA2, MAGEA2B, MAGEA6, Peptídeo: QVMPKTGL (SEQ Nº: 4), Figura 2E) Símbolo do gene: OR51E2, peptídeo STMPKILAL (SEQ Nº: 5), Figura 2F) Símbolo do gene: MMP11, Peptídeo: NRQKRFVL (SEQ Nº: 6), Figura 2G) Símbolo do gene: ZBTB32, Peptídeo: AARLRPAL (SEQ Nº: 7), Figura 2H) Símbolo do gene: DCX; Peptídeo: FVRPKLVTI (SEQ Nº: 8), Figura 2I) Símbolo do gene: LAMC2, Peptídeo: LSLVRKAL (SEQ Nº: 18), Figura 2J) Símbolo do gene: MYCN; Peptídeo: LLKKIEHA (SEQ Nº: 15), Figura 2K) Símbolo do gene: HAVCR1, Peptídeo: DLSRRDVSL (SEQ Nº: 54), Figura 2L) Símbolo do gene: LRRC15, Peptídeo: MPLKHYLL (SEQ Nº: 57), Figura 2M) Símbolo do gene: MET; Peptídeo: DLKKTRVL (SEQ Nº: 66), Figura 2N) Símbolo do gene: KLHL14, Peptídeo: DMNTKRAIHTL (SEQ Nº: 67), Figura 2O) Símbolo do gene: MMP12, peptídeo LMKEKIQEM (SEQ Nº: 93), Figura 2P) Símbolo do gene: ABCC11, Peptídeo: FAFEKLIQF (SEQ Nº: 101), Figura 2Q) Símbolo do gene: IGF2BP3; Peptídeo: IMKKIRESY (SEQ Nº: 102), Figura 2R) Símbolo do gene: CCL17, Peptídeo: APLKMLALV (SEQ Nº: 105), Figura 2S) Símbolo do gene: MMP13, Peptídeo: RSYYHPTNL (SEQ Nº: 108), Figura 2T) Símbolo do gene: GREB13, Peptídeo: ESSAQPTAL (SEQ Nº: 122), Figura 2U) Símbolo do gene: DNAH17, Peptídeo: EYLETKRLAF (SEQ Nº: 135). Figura 2V) Símbolo do gene: MXRA5, Peptídeo: MPKRAHWGA (SEQ Nº: 225), Figura 2W) Símbolo do gene: LAMC2, Peptídeo: SLAESEASL (SEQ Nº: 289), Figura 2X) Símbolo do gene: KLK3, Peptídeo: EEFLTPKKL (SEQ Nº: 290) e Figura 1Y) Símbolo do gene: COL6A3, Peptídeo: YVYANHFTEA (SEQ Nº: 291.

[329] As Figuras 3A a 3G mostram resultados exemplificativos de respostas de células T CD8+ in vitro específicas para peptídeo de um doador saudável de HLA-B*08+. As células T CD8+ foram preparadas usando-se CAAs artificiais revestidas de mAb anti-CD28 e HLA- B*08 em complexo com o peptídeo da ID de SEQ Nº 283) (MAQFKEISL) (A, painel esquerdo), peptídeo de ID de SEQ Nº: 278) (RAQLKLVAL) (B, painel esquerdo), peptídeo de ID de SEQ Nº: 9) (LLKGKPRAL) (C, painel esquerdo), peptídeo de ID de SEQ Nº: 10) (MGKFKQCF) (D, painel esquerdo), peptídeo de ID de SEQ Nº: 19) (FTLLRRLSL) (E, painel esquerdo), peptídeo de ID de SEQ Nº: 20) (ILKRFLAC) (F, painel esquerdo), peptídeo de ID de SEQ Nº: 31 (SPRVKWTF) (G, painel esquerdo). Depois de três ciclos de estimulação, a detecção das células reativas a peptídeo foi realizada por coloração 2D para multímeros B*08/ID de SEQ Nº: 283 (A), B*08/ID de SEQ Nº: 278 /B), B*08/ID de SEQ Nº: 9 (C), B*08/ID de SEQ Nº: 10 (D), B*08/ID de SEQ Nº: 19 (E), B*08/ID de SEQ Nº: 20 (F), B*08/ID de SEQ Nº: 31 (G). Os painéis na Figura 3A a 3F mostram a coloração de células de controle estimuladas por complexos irrelevantes de B*08/peptídeo. As células singlete viáveis foram triadas para detecção de linfócitos CD8+. Portas booleanas ajudaram a descartar falsos positivos detectados por multímeros específicos para peptídeos diferentes. As frequências de células específicas positivas para multímeros em linfócitos CD8+ estão indicadas.

EXEMPLOS EXEMPLO 1 Identificação e quantificação de peptídeos associados a tumores apresentados na superfície celular Amostras de tecido

[330] Os tecidos tumorais de pacientes foram obtidos de Asterand (Detroit, MI, USA & Royston, Herts, UK), Bio-Options Inc. (Brea, CA, USA), Geneticist Inc. (Glendale, CA, USA), ProteoGenex Inc. (Culver City, CA, USA),

Tissue Solutions Ltd (Glasgow, UK), Hospital Universitário de Bonn (Bonn, Alemanha), Hospital Universitário de Geneva (Geneva, Suíça), Hospital Universitário de Tübingen (Tübingen, Alemanha). Tecidos normais foram obtidos daAsterand (Detroit, MI, USA & Royston, Herts, UK), BioServe (Beltsville, MD, USA), Capital BioScience Inc. (Rockville, MD, USA), Centro de Medicina Clínica Transfusional Tübingen (Tübingen, Alemanha), Geneticist Inc. (Glendale, CA, USA), Hospital Universitário de Heidelberg (Heidelberg, Alemanha), Universidade Municipal de Medicina de Kyoto (KPUM) (Kyoto, Japão), ProteoGenex Inc. (Culver City, CA, USA), Tissue Solutions Ltd (Glasgow, UK), Hospital Universitário de Heidelberg (Heidelberg, Alemanha) e Hospital Universitário de Tübingen (Tübingen, Alemanha).

[331] Os tecidos normais foram obtidos de Asterand (Detroit, MI, EUA & Royston, Herts, Reino Unido), BioServe (Beltsville, MD, EUA), Capital BioScience Inc. (Rockville, MD, EUA), Centro de Medicina Clínica Transfusional Tübingen (Tübingen, Alemanha), Geneticist Inc. (Glendale, CA, EUA), ProteoGenex Inc. (Culver City, CA, EUA), Hospital Universitário de Heidelberg (Heidelberg, Alemanha) e Hospital Universitário de Tübingen (Tübingen, Alemanha).

[332] Todos os pacientes deram consentimento livre e esclarecido antes da cirurgia ou autópsia. Os tecidos foram criocongelados logo após a excisão e armazenados a -70ºC ou menos até o isolamento dos TUMAPs.

Isolamento de peptídeos de HLA de amostras de tecido

[333] Misturas de peptídeos HLA de amostras de tecido sujeitas a congelamento criogênico foram obtidas por imunoprecipitação de tecidos sólidos de acordo com um protocolo ligeiramente modificado (Falk et al., 1991; Seeger et al., 1999) empregando o anticorpo BB7.2, que é específico para HLA-A*02; o anticorpo W6/32, que é específico para HLA-A, B ou C; o anticorpo L243, que é específico para HLA-DR; e o anticorpo B7/21, que é específico para HLA DP em geral. Foram usadas sefarose ativada por CNBr, tratamento com ácido e ultrafiltração.

Análises por espectrometria de massa

[334] As misturas de peptídeos de HLA foram obtidas e separados de acordo com sua hidrofobicidade por cromatografia de fase reversa (sistema de UPLC nanoAcquity, Waters) e os peptídeos eluídos forma analisados por um espectrômetro de massa híbrido LTQ Velos (ThermoElectron) equipado com uma fonte ESI. Os agregados de peptídeos foram carregados diretamente na coluna analítica microcapilar de sílica fundida (75 µm d.i. x 250 mm) preenchida com material de fase reversa C18 de 1,7 µm (Waters) a uma taxa de fluxo de 400 nL por minuto. Em seguida, os peptídeos foram separados usando-se um gradiente binário com duas etapas de 180 minutos de 10% a 33% B a taxas de fluxo de 300 nL por minuto. O gradiente era composto do Solvente A (ácido fórmico a 0,1% em água) e do solvente B (ácido fórmico a 0,1% em acetonitrilo).

Um capilar de vidro revestido de ouro (PicoTip, New Objective) foi empregado para introdução na fonte nano-ESI. Os espectrômetros de massa LTQ Orbitrap foram operados no modo dependente de dados usando-se uma estratégia TOP5. Resumidamente, um ciclo de varredura foi iniciado com uma varredura completa com alta precisão para massa no Orbitrap (R = 30.000), seguida de varreduras MS/MS realizadas também no Orbitrap (R = 7.500) para os cinco íons precursores mais abundantes com exclusão dinâmica de íons pré-selecionados.

Os espectros de massa em tandem foram interpretados por SEQUEST com uma taxa fixa de descobertas falsas (q≤0,05) e suplementadas com controle manual.

Em casos onde a sequência de peptídeos identificada era incerta, ela foi submetida a mais uma etapa de validação, na qual se comparou o padrão de fragmentação do peptídeo gerado naturalmente com o padrão de fragmentação de um peptídeo de referência sintético com a mesma sequência.

[335] A quantificação relativa por LC-MS sem marcadores foi realizada por contagem de íons, i.é., extração e análise de características de LC-MS(Mueller et al., 2007). O método pressupõe que as áreas de sinal de LC-MS do peptídeo se correlacionam com sua abundância na amostra.

As características extraídas foram também processadas por desconvolução por estado de carga e alinhamento dos tempos de retenção(Mueller et al., 2008; Sturm et al., 2008). Finalmente, todas as características do LC-MS foram submetidas a referência cruzada com os resultados da identificação das sequências para combinar dados quantitativos de várias amostras e tecidos com os perfis de apresentação de peptídeos. Os dados quantitativos foram normalizados em duas sequências de acordo com a tendência central para compensar as variações entre os produtos de replicação técnicos e biológicos. Portanto, pode-se associar cada peptídeo identificado com dados quantitativos, que permitem uma quantificação relativa entre amostras e tecidos. Todos os dados quantitativos adquiridos para peptídeos candidatos também foram inspecionados manualmente para garantir a consistência dos dados e verificar a precisão da análise automatizada. Para cada peptídeo, um perfil de apresentação foi calculado para mostrar a apresentação média da amostra e a variação entre réplicas. Os perfis justapõem amostras de tecidos normais com amostras de leucemia mieloide aguda, câncer de mama, carcinoma colangiocelular, leucemia linfocítica crônica, câncer colorretal, câncer de vesícula biliar, glioblastoma, câncer gástrico, câncer da junção gastroesopfageal, carvinoma hepatocelular, carcinoma de célula escamosa de cabeça e pescoço, melanoma, linfoma não Hodking, câncer de pulmão (incluindo adenocarvinoma de câncer de pulmão ed célula não pequena, câncer de pulmão de célula escamosa não pequena e câncer de pulmão de célula pequena), câncer de ovário, câncer esofageal, câncer pancreático, câncer de próstata, carcinoma de célula renal, carcinoma de bexiga, câncer do endométrio e uterino.

[336] Os perfis de apresentação dos peptídeos com apresentação exacerbada exemplares são mostrados na Figura 1.

[337] A Tabela 8A e a Tabela 8B mostram a apresentação em várias entidades de câncer para os peptídeos selecionados e, portanto, a relevância particular dos peptídeos como mencionado para o diagnóstico e / ou tratamento dos cânceres como indicado (por exemplo, peptídeo de ID de SEQ Nº: 4 para carcinoma hepatocelular, melanoma e câncer de esôfago e peptídeo de ID de SEQ Nº: 11 para carcinoma colangiocelular, carcinoma de células escamosas de cabeça e pescoço, linfoma não Hodgkin, adenocarcinoma de câncer de pulmão de células não pequenas, câncer de pulmão de células não pequenas não escamosas e não adenocarcinoma, câncer de pulmão de células não pequenas escamosas, câncer de esôfago, câncer de pâncreas, câncer do pulmão de células pequenas e câncer endometrial do útero).

Tabela 8A: Apresentação de alguns peptídeos associados a tumores da presente invenção em diversas entidades.

[338] AdenoCPCNP (adenocarcinoma de pulmão de células não-pequenas); CaCR (câncer colorretal); CAM (câncer de mama); CAU (câncer de útero e endométrio); CB (carcinoma de bexiga); CCC (carcinoma colangiocelular); CCECP (carcinoma de células escamosas de cabeça e pescoço); CCR (carcinoma de células renais); CE (câncer de esôfago); CG (câncer gástrico); CHC (carcinoma hepatocelular); CO (câncer de ovário); CP (câncer de pâncreas); CPCNPescam (câncer de pulmão de células não- pequenas do tipo escamoso); CPPC (câncer de pulmão de pequenas células); CPr (câncer de próstata); CVB (câncer da vesícula biliar); GBM (glioblastoma); LLC (leucemia linfocítica crônica); LMA (leucemia mieloide aguda); LNH (linfoma não-Hodgkin); MEL (melanoma); outroCPCNP (amostras de CPCNP que não podem ser caracterizadas inequivocamente como adenoCPCNP ou CPCNP escamoso).

SEQ Nº Sequência Tipos tumorais em que o peptídeo foi apresentado 1 ALKLKVAEL adenoCPCNP, CPCNPescam 2 QIMPKAGL CHC, CE 3 SIQSRYISM MEL 4 QVMPKTGL CHC, MEL, CE 5 STMPKILAL CPr 6 NRQKRFVL adenoCPCNP, CP, CB, CAU 7 AARLRPAL LLC 8 FVRPKLVTI GBM 9 LLKGKPRAL CAU 10 MGKFKQCF CAU CCC, CCECP, LNH, adenoCPCNP, CPCNPoutro, CPCNPescam, CE, 11 MAPLKMLAL CP, CPPC, CAU 12 DFYLRSSAF CPCNPescam LLC, LNH, adenoCPCNP, CPCNPoutro, CPCNPescam, CE, CP, CCR, 13 EPFTRPVL CPPC, CB 14 ELILKRCL adenoCPCNP, CPCNPescam 15 LLKKIEHA CCC, GBM 16 NRKPRTPF CAU 17 LLILKTVL CAM 18 LSLVRKAL CCECP 19 FTLLRRLSL MEL 20 ILKRFLAC GBM, CG 21 RILKRFLAC GBM, CCECP, MEL 22 EVRLKPIL CCC, MEL 23 DIKKTNESL CAM, LLC, CCECP, LNH, adenoCPCNP 24 DLVLKRCL MEL 25 HLHPKGREL adenoCPCNP, CCECP 26 DARCKLAEL adenoCPCNP 27 WVLTNIVAL adenoCPCNP, CPCNPescam 28 DPKSRLKSL MEL 29 ELFLHPVL LLC, MEL, LNH, CPCNPoutro 30 DLQKKAQAL CAM, MEL, CPCNPescam, CE, CP, CPr 31 SPRVKWTF GBM, CG 32 NPYLKLVL LLC, LNH, CPCNPoutro, CPCNPescam, CPPC 33 WIGLRNLDL LLC 34 IYRKKYIL LLC, LNH, CB

35 ELFQRPVL LLC, LNH, CPCNPoutro, CPCNPescam 36 IVKIKVQEL LLC, LNH, CPCNPoutro, CPCNPescam 37 EAFSRASL CPr 38 EVYQKIIL CCC, CCECP, LNH, adenoCPCNP, CPCNPoutro 39 DAKSKIEQI CCECP, CPCNPescam, CP 40 ESMLKTTL CCC, CHC 41 RGALRTLSL adenoCPCNP, CAU 42 VLRRKTLL LLC, CG, LNH, CPCNPescam, CAU 43 DLKKLVDSL CaCR, CPCNP outro, CB 44 HLTNRVLSL CCECP, CPCNPescam 45 RLKVALSTL CCC, LLC, MEL, CPCNPadeno, CE, CPPC, CAU CCC, CVB, CCECP, MEL, LNH, CPCNPadeno, CPCNPoutro, 46 DLRNKIIAA CPCNPescam, CE, CP, CB 47 HSRVKLAQL GBM, CG 48 ELALRQTV CCECP 49 FLRVFTDSL LLC, LNH, CPCNPoutro, CPPC 50 TLRLLVAAL CCC, CCECP, CE, CB 51 ERRVKVSSL CAU 52 ELILKHSL CCECP, LNH, CPCNPadeno, CPCNPoutro 53 DLRKLKRQL LLC, MEL, CPCNPadeno 54 DLSRRDVSL CCC, CP, CCR 55 VLLSRRTAL LLC, MEL, CPCNPadeno, CB, CAU

ILCGSRKMP 56 L LNH 57 MPLKHYLL CCECP 58 LPKKMKLL CP

FDFRGKTKV 59 F outroCPCNP 60 MLHIKKAEV MEL CG, CCECP, MEL, CPCNPadeno, CPCNPoutro, CPCNPescam, CP, 61 SIKKELVVL CAU 62 FMLAKEASL LNH 63 YVKRKTNVL CCECP 64 FILGREAGAL CAM, CCC, CCECP 65 NLLMRNVL CPCNPescam 66 DLKKTRVL CCECP, CPCNPadeno, CPCNPescam, CP

DMNTKRAIH 67 TL LLC 68 DLKIPRYPV adenoCPCNP, CCECP 69 ELARQRLL CCECP, CPCNPadeno, CPCNPescam

CAM, CCC, CaCR, GBM, CG, CCECP, MEL, LNH, CPCNPadeno, 70 RPKGTPPL CPCNPescam, CCR, CB, CAU 71 HIRIKHTF CCECP, LNH, CPCNPadeno, CPCNPescam 72 LPLAHHIQL CCECP 73 MFPARGVPL CPCNPescam 74 RLKLRYEGL LLC 75 YARLKNVLL adenoCPCNP 76 HPRLKVNLL CCC, CPCNPoutro, CE, CPPC, CB, CAU 77 LPKLPVPPL adenoCPCNP, CPCNPescam 78 DGHMKVFSL CCECP, CPCNPadeno, CPCNPescam, CPr 79 GLARIYSF CCC CAM, CCC, LLC, CCECP, MEL, LNH, CPCNPadeno, CPCNPoutro, 80 EVYLRMYQL CPCNPescam, CO, CPPC, CAU 81 MYRKEQYL CPCNPoutro, CAU 82 SIRKRPML CPCNPoutro 83 FVLLRSVDL CAM, CCC, LLC, LNH, CPCNPoutro 84 YITRQFVQF CPCNPoutro 85 QKPRKKKL LLC 86 RPIHHPLVL CAM, CHC 87 QILQHHVL CVB, CCECP 88 MLLCLSLEL CVB, CCECP, MEL, CPCNPadeno, CPCNPescam, CPPC CAM, CCC, CaCR, CVB, CG, CCECP, MEL, LNH, CPCNPadeno, CPCNPescam, 89 VPYTKVQL CP, CPr, CB, CAU 90 TIGLGLHSL CB

MPMQDIKMI 91 L MEL, CPPC

TLKAMVQA 92 W MEL 93 LMKEKIQEM CPCNPoutro 94 DQLLRHVM MEL, CPCNPescam 95 SRNPRGFFL CP, CAU 96 RPAGVFEL adenoCPCNP 97 EPVTKAEM CCECP 98 EPVNTNVVL outroCPCNP 99 NVKIRFLE CCECP 100 VLLMGPLHL CPCNPescam 101 FAFEKLIQF MEL, CPr 102 IMKKIRESY MEL, CPCNPadeno, CPCNPescam 103 IANLRVKNI CAU

104 FAFGEPREL MEL, CE CAM, CCC, CaCR, GBM, CCECP, MEL, LNH, CPCNPadeno, 105 APLKMLALV CPCNPescam, CE, CCR 106 HLHLLETSI CCECP

LPKGLKDWQ 107 A CPPC 108 RSYYHPTNL CCECP, CPCNPescam 109 IPASHPVLTL CPCNPoutro 110 DAMTKHTL LNH 111 GAGLRITAPL CPCNPescam, CO 112 NALDPLSAL GBM, CPCNPadeno, CE 113 MEKGLASL CCECP 114 PVKPKFYL MEL 115 MRILKRFLAC MEL 116 FTQNPRVQL MEL 117 VGPNGFKSL CP, CAU 118 MAFVKHLL MEL 119 FQRVSSVSF CO 120 AQRSEMVTL CPCNPescam 121 YSQLSISL MEL 122 ESSAQPTAL GBM, CCECP 123 SLLPFTLSF MEL 124 HSWTRTSV CPr 125 FPLVTPLL GBM, CG 126 TAAEARLSL LMA, CPPC 127 EPVIRTVSI CCECP 128 HFHNRHVF CAU, CCECP, CE 129 HRILRLPAL MEL 130 LPAPYQHQL outroCPCNP 131 MSTKTTSI GBM, CP, CCR 132 IPIQAHQI GBM, CG 133 QATPRVRIL MEL, CPCNPescam, CAU 134 DQRSRATL CHC

EYLETKRLA 135 F CCECP

KMFYRKDV 136 M CVB 137 VQWKPPAL adenoCPCNP 138 TQHLTVATL CPCNPescam, CO 139 YGRIGISLF adenoCPCNP, CCECP

140 IAVDKPITL MEL, CPCNPescam 141 AQLKLVAL adenoCPCNP 142 YNLIYSMCL adenoCPCNP 143 DADLREQAL CCECP, CPCNPescam, CP 144 IEQIRAVL CCECP 145 MIYRKALRL LNH 146 FQTAHFYL MEL 147 HAMDGASHL MEL 148 DVNPVSLQL CCECP, CPCNPoutro 149 TQKSVQVL GBM, CG 150 MRSSYIREL CAU 151 DRHLTNRVL MEL 152 FNKLVTEL CCC, CHC 153 HAIPHYVTM MEL 154 VLKTLQEL CCC, CHC 155 LPASFPAVL CPCNPoutro 156 ILKEQSSSSF CCECP, CPCNPescam 157 QPYRFPQA CCECP 158 DVIIKGNGL CCECP, CPCNPadeno, CPCNPoutro, CPCNPescam, CE, CCR 159 DLRNKIIA CCECP, CPCNPescam 160 LPINNTHI CAM, CCC, LLC, GBM, CHC, MEL, CPCNPoutro, CPCNPescam, CB 161 DIVPPFSAF CCC, MEL, CE, CB 162 LFKQTKINL CPCNPescam 163 EVMAQFKEI CE, CB 164 LPAPIPTLL CPCNPoutro 165 QNSLRHNL CCC 166 VLSGGRILAL CHC 167 DMKITVSL CCC 168 HVQDFTAF CPCNPescam 169 YELNNLHAL MEL

SPANVRGQS 170 L CVB

FPSQVPKQV 171 L outroCPCNP 172 PYEKVSRL CCC 173 YPLLKDPSL CCC, CP, CPPC 174 HAMPSPRIL CPCNPoutro 175 MRFQQFLFA CCECP

176 YVIQRQSVL outroCPCNP 177 SVPVRSSPL LNH 178 IPRLAVISI GBM, CG 179 LPLTEHEL CCECP, CPCNPoutro, CPPC 180 LAVPIFVAL CO 181 SIRSSYSRF CAU 182 ILHLSAIAL CAM 183 YVSKPGAQL CVB 184 DRLKPLKM MEL 185 MELKTVKPI CCC, GBM, CPCNPoutro, CPCNPescam 186 DLISPRQPRL CCECP 187 VPYNSVLF MEL 188 EIMEKTTL MEL, CPCNPescam 189 APDNVLLTL CAM, GBM, CHC, CPCNPescam, CE, CPPC 190 ELLNRIYF MEL 191 RPLKPGEVL CAM 192 EEKHFTTL adenoCPCNP 193 LGGLRLTAL adenoCPCNP 194 RAIEHVLQV CPCNPoutro 195 EGNQKSVI LNH, CPCNPadeno, CPCNPescam, CP, CAU CAM, CCC, LLC, CaCR, CVB, GBM, CG, CHC, CCECP, MEL, LNH, CPCNPadeno, 196 LDLRQKVL CPCNPoutro, CPCNPescam, CE, CP, CPr, CCR, CPPC, CB, CAU 197 YKAYPSQL adenoCPCNP 198 FPLTSIIAI CPCNPoutro 199 IPFIHLPEI GBM, CHC 200 VAAARAVPV MEL 201 TASAMQHVL CPCNPoutro 202 RIPEKASFL CHC 203 DVYTQVSAF LMA CAM, CCC, CaCR, CVB, CG, CHC, CCECP, MEL, CPCNPoutro, 204 MSPLLRSI CPCNPescam, CP, CAU

YMQYGFLS 205 M CPCNPescam, CO

MEFPNKFNT 206 L MEL 207 LRKRKSPE CCECP 208 LPPPQPLSL CAM, LLC, LNH, CPCNPoutro 209 SRFGKFVQL CG, CCECP, CPCNPoutro, CPCNPescam, CP, CPr, CAU 210 QPNTHQLL CCECP

211 DVISKGVSL MEL 212 EEYKFPSL CPCNPescam, CAU 213 FPSLFINQF CPCNPescam, CAU 214 DAPRHRLL adenoCPCNP 215 NPLIEIISI CPPC 216 EARPPSPAV GBM, CG 217 ETIKGHSVRL CCECP 218 DNHPRLVTL MEL CCC, LLC, GBM, CHC, MEL, LNH, CPCNPadeno, CPCNPescam, 219 VRNPKILIL CP, CPr, CCR, CAU 220 LAVRHLSL CCC 221 SLKEELLSL CCC 222 AQKAELIAL CO 223 DVSARKLRV CPPC 224 LPYPPQKVV GBM, CG

MPKRAHWG 225 A CCECP 226 DIYEVAVSL CCC 227 SRFPGMSVL MEL 228 TLRAYVLAL CPCNPoutro 229 DTHTNTYYL CCECP 230 DVYFHHVL CCECP, CPCNPadeno, CPCNPescam 231 GEKLLRPSL CCECP 232 KLYIHRVTL MEL 233 DVKLVFVM LNH, CPCNPoutro 234 VFRVGISF CVB 235 SPNSLVTIL CCECP 236 STLKKSLEI CPCNPescam

LPLDSRYVT 237 L CPCNPoutro 238 IPLAIARL CPCNPescam 239 SEPVMRVTL CCECP 240 KVIDRKVEL adenoCPCNP, CPCNPescam 241 NAYEAPSI GBM, CG 242 KPQSLQLVL CPCNPoutro 243 EGVPPGTVL CPCNPescam 244 HALPPYITVL MEL, LNH

GPRGPSSG 245 HPL MEL 246 RLLQKSKEL CAM, CCC, CCECP, CPCNPadeno, CPCNPescam, CPPC, CB

247 TPEPSVHAL CPCNPoutro

SEVNKHETA 248 L CCECP 249 QQIDRVVEV CCC, GBM, LNH 250 AARAPPQAL CAM, CVB 251 DAAAFFKSV GBM, CG Tabela 8B: Apresentação de alguns peptídeos associados a tumores da presente invenção em diversas entidades.

[339] CAM: câncer de mama; CCC: carcinoma colangiocelular; CaCR: câncer colorretal; CVB: câncer da vesícula biliar; GBM: glioblastoma; CG: câncer gástrico; CHC: carcinoma hepatocelular; CCECP: carcinoma de células escamosas de cabeça e pescoço; MEL: melanoma; LNH: linfoma não-Hodgkin; CPCNPadeno: adenocarcinoma de pulmão de células não-pequenas; CPCNPoutro: amostras de CPCNP que não puderam ser classificadas definitivamente como adenoCPCNP ou CPCNPescam; CPCNPescam: câncer de pulmão de células não-pequenas do tipo escamoso; CO: câncer de ovário; CE: câncer de esôfago; CP: câncer de pâncreas; CPr: câncer de próstata; CPPC: câncer de pulmão de pequenas células; CB: carcinoma de bexiga; CAU: câncer do endométrio uterino.

SEQ Nº Sequência Tipos tumorais em que o peptídeo foi apresentado

SLAESEA 289 SL CCC, CVB, CCECP, adenoCPCNP, CPCNPescam, CO, CE, CAU

EEFLTPK 290 KL CPr YVYANHF CAM, CCC, CaCR, CVB, CG, CHC, CCECP, MEL, LNH, adenoCPCNP, CPCNPoutro, 291 TEA CPCNPescam, CO, CP, CCR, CPPC, CB, CAU EXEMPLO 2 Perfil da expressão de genes que codificam peptídeos da invenção

[340] A apresentação exacerbada ou apresentação específica de um peptídeo em células tumorais em comparação com células normais é suficiente para demonstrar a utilidade dos peptídeos para imunoterapia, e alguns peptídeos são específicos para tumores, mesmo que a proteína da qual se originaram também esteja presente em tecidos normais. Contudo, o perfil de expressão de mRNA cria um nível adicional de segurança para selecionar peptídeos para uso em imunoterapia. Sobretudo para opções de tratamento mais arriscadas, como TCRs maturados por afinidade, o peptídeo-alvo ideal é derivado de uma proteína específica para o tumor e que não é encontrada em tecidos normais.

Fontes de RNA e preparação

[341] Amostras de tecido retiradas cirurgicamente foram fornecidas conforme descrito anteriormente (ver Exemplo 1) após obtenção de consentimento livre e esclarecido de cada paciente. As amostras de tecido congeladas foram criocongeladas imediatamente após a cirurgia e depois homogeneizadas em cadinho com pistilo sob nitrogênio líquido. O RNA total foi preparado a partir dessas amostras usando-se o reagente TRI (Ambion, Darmstadt, Alemanha) seguido de limpeza com RNeasy (QIAGEN, Hilden, Alemanha). Ambos os métodos foram realizados de acordo com o protocolo do fabricante.

[342] O RNA total de tecidos humanos saudáveis de experimentos de sequenciamento de RNA foi obtido de Asterand (Detroit, MI, EUA e Royston, Herts, Reino Unido), Bio-Options Inc. (Brea, CA, EUA); Geneticist Inc. (Glendale, CA, EUA), ProteoGenex Inc. (Culver City, CA, EUA) e Tissue Solutions Ltd (Glasgow, Reino Unido).

[343] O RNA total de tecidos tumorais para experimentos de sequenciamento de RNA foi obtido de Asterand (Detroit, MI, EUA e Royston, Herts, Reino Unido), BioCat GmbH (Heidelberg, Alemanha, BioServe (Beltsville, MD, EUA), Geneticist Inc. (Glendale, CA, EUA), Istituto Nazionale Tumori “Pascale” (Nápoles, Itália), ProteoGenex Inc. (Culver City, CA, EUA) e Hospital Universitário de Heidelberg (Heidelberg, Alemanha).

[344] A qualidade e a quantidade de todas as amostras de RNA foram analisadas em um bioanalisador Agilent 2100 (Agilent, Waldbronn,

Alemanha) usando um kit RNA 6000 Pico LabChip (Agilent).

Experimentos de sequenciamento de DNA

[345] A análise de expressão gênica em amostras de RNA de tumores e tecidos normais foi realizada por sequenciamento de próxima geração (RNASeq) da CeGaT (Tübingen, Alemanha). Resumidamente, bibliotecas de sequenciamento foram preparadas usando o kit de reagentes Illumina HiSeq v4 de acordo com o protocolo do fornecedor (Illumina Inc., San Diego, CA, Estados Unidos), que inclui fragmentação de RNA, conversão em cDNA e adição de adaptadores de sequenciamento. Bibliotecas derivadas de várias amostras são misturadas em proporção equimolar e sequenciadas em um sequenciador Illumina HiSeq 2500 de acordo com as instruções do fabricante, gerando leituras de extremidade única com 50 bp cada. As leituras processadas foram mapeadas em relação ao genoma humano (GRCh38) usando-se o software STAR. Os dados de expressão ao nível de transcrição são fornecidos em RPKM (leituras por quilobase por milhões de leituras mapeadas, geradas pelo software Cufflinks) e ao nível de éxon (leituras totais, geradas pelo software Bedtools), baseado nas anotações do banco de dados Ensembl77. As leituras de éxons foram normalizadas para o comprimento e alinhamento dos éxons para gerar valores de RKPM.

[346] A Figura 2 mostra alguns perfis de expressão exemplares de genes-fonte da presente invenção, cuja expressão é acentuada ou exclusiva em carcinoma colangiocelular, carcinoma de bexiga, carcinoma de células escamosas de cabeça e pescoço, carcinoma de células renais, carcinoma hepatocelular, câncer colorretal, câncer da vesícula biliar, câncer de esôfago, câncer de mama, câncer de ovário, câncer de próstata, câncer de pulmão (incluindo adenocarcinoma de pulmão de células não pequenas, câncer de células escamosas de células não pequenas e câncer de pulmão de pequenas células), câncer de pâncreas, câncer do endométrio uterino,

câncer gástrico, glioblastoma, leucemia linfocítica crônica, leucemia mieloide aguda, linfoma não-Hodgkin e melanoma. Os escores de expressão para outros genes exemplificativos são mostrados na Tabela 9A e Tabela 9B.

Tabela 9A: Escores de expressão. A tabela apresenta uma lista de peptídeos derivados de genes cuja expressão é, quando comparada com um painel de tecidos normais, fortemente acentuada (+++), acentuada (++) ou sobrexpressa (+). O nível basal para essa pontuação foi calculado a partir de mensurações realizadas nos seguintes tecidos normais: tecido adiposo, glândula suprarrenal, ducto biliar, células sanguíneas, vasos sanguíneos, medula óssea, cérebro, esôfago, olho, vesícula biliar, coração, cabeça e pescoço, rim, intestino grosso, fígado, pulmão, linfonodo, nervo, paratireoide, pâncreas, peritônio, ptuitária, pleura músculo esquelético, pele, intestino delgado, medula espinhal, baço, estômago, tireoide, traqueia, ureter e bexiga.

Em casos para os quais existiam dados para várias amostras de um mesmo tipo de tecido, a média aritmética de todas as respectivas amostras foi usada para o cálculo.

[347] LMA: leucemia mieloide aguda; CAM: câncer de mama; CCC: carcinoma colangiocelular; LLC: leucemia linfocítica crônica; CaCR: câncer colorretal; CVB: câncer da vesícula biliar; GBM: glioblastoma; CG: câncer gástrico; CHC: carcinoma hepatocelular; CCECP: carcinoma de células escamosas de cabeça e pescoço; MEL: melanoma; LNH: linfoma não- Hodgkin; adenoCPCNP: adenocarcinoma de pulmão de células não- pequenas; outroCPCNP: amostras de CPCNP que não puderam ser classificadas definitivamente como adenoCPCNP ou CPCNPescam; CPCNPescam: câncer de pulmão de células não-pequenas do tipo escamoso; CO: câncer de ovário; CE: câncer de esôfago; CP: câncer de pâncreas; CPr: câncer de próstata; CCR: carcinoma de células renais; CPPC: câncer de pulmão de pequenas células; CB: carcinoma de bexiga; CAU: câncer do endométrio e útero.

Expressão gênica em amostras tumorais

SE Sobrexpressão Q Sequência muito Nº acentuada Sobrexpressão (+) Sobrexpressão acentuada (++) (+++) CCECP, MEL, ALKLKVAE CAM, CVB, CG, LNH, CPCNPescam, 1 L CaCR, CHC, CP CPCNPadeno, CO, CAU CE, CPPC, CB CG, CHC, CCECP, MEL, CPCNPescam, 2 QIMPKAGL CaCR, LNH, CP CVB, CPCNPadeno, CAU CE, CPPC, CB SIQSRYIS LMA, CAM, CG, CHC, CVB, CCECP, adenoCPCNP, MEL, CO, 3 M LNH, CE, CB CPCNPescam, CCR CPPC, CAU CVB, CHC, CCECP, QVMPKTG CPCNPadeno, CPCNPescam, CG, MEL, 4 L CaCR, CP, CAU CE CPPC, CB

STMPKILA 5 L CPr CaCR, CVB, CG, CCECP, NRQKRFV CHC, MEL, CPCNPoutro, CPCNPadeno, CPCNPescam, CAM, CCC, 6 L CCR, CPPC CO, CE, CB, CAU CP 7 AARLRPAL LNH LLC

FVRPKLVT 8 I GBM, CPPC

LLKGKPRA 9 L CAM CAU

MGKFKQC 10 F CO, CAU

MAPLKML 11 AL LNH

DFYLRSSA 12 F CAM, CPPC, CB CPr 13 EPFTRPVL LNH LLC 14 ELILKRCL GBM, MEL, CO, CPPC, CB LMA, CAU 15 LLKKIEHA GBM, MEL, CO, CPPC, CB LMA, CAU 16 NRKPRTPF CAU 17 LLILKTVL CCR CPr CCC, CG, CPCNPadeno, 18 LSLVRKAL CPCNPoutro, CP, CAU CCECP, CPCNPescam, CE, CB

FTLLRRLS 19 L MEL 20 ILKRFLAC GBM, CG

RILKRFLA 21 C GBM, CG 22 EVRLKPIL CCC MEL

LMA, CAM, CCC, CaCR, CVB, GBM, CG, CHC, CCECP, MEL, LNH, CPCNPadeno, CPCNPoutro, DIKKTNES CPCNPescam, CO, CE, 23 L CP, CB, CAU LLC, CPPC 24 DLVLKRCL MEL CAM, CG, CCECP, MEL, LNH, CPCNPadeno, CPCNPoutro, HLHPKGR CPCNPescam, CO, CE, 25 EL CP, CCR, CB, CAU CCC, CaCR, CVB DARCKLAE CAM, CVB, MEL, 26 L CPCNPescam, CO, CPPC adenoCPCNP, CB

WVLTNIVA 27 L GBM, CG CO

DPKSRLKS 28 L MEL 29 ELFLHPVL LLC, LNH

DLQKKAQ 30 AL CPr

SPRVKWT 31 F GBM, CG 32 NPYLKLVL LNH LLC

WIGLRNLD 33 L LLC, LNH 34 IYRKKYIL LLC, CG, CO, CPPC CAM 35 ELFQRPVL LNH LLC 36 IVKIKVQEL LNH LLC 37 EAFSRASL CPr 38 EVYQKIIL CO, CPPC CVB, MEL CCC, CVB, CG, CCECP, CPCNPadeno, 39 DAKSKIEQI CPCNPescam, CP, CB CE 40 ESMLKTTL CHC CAM, CCC, LNH, RGALRTLS CPCNPescam, CO, CE, 41 L CPPC, CB, CAU CVB 42 VLRRKTLL LNH LLC

DLKKLVDS 43 L CVB, CG CaCR HLTNRVLS CCECP, CPCNPescam, 44 L CE CB

RLKVALST 45 L MEL, CPr, CAU CAM 46 DLRNKIIAA CE CCECP

HSRVKLA 47 QL GBM, CG

48 ELALRQTV CCECP

FLRVFTDS 49 L LMA, LNH, CPr LLC TLRLLVAA CCC, CVB, CCECP, 50 L CPCNPescam, CPr, CB CE

ERRVKVS 51 SL CB CAU 52 ELILKHSL GBM, CG

DLRKLKRQ 53 L MEL

DLSRRDV 54 SL CCR

VLLSRRTA 55 L LLC

ILCGSRKM 56 PL MEL CAM, CCECP, MEL, LNH, 57 MPLKHYLL CPCNPadeno, CE 58 LPKKMKLL CCC

FDFRGKTK 59 VF LLC, CaCR

MLHIKKAE 60 V MEL 61 SIKKELVVL LMA, GBM, CE, CPPC

FMLAKEAS 62 L LNH

YVKRKTNV 63 L CCECP, CO, CE, CPr

FILGREAG 64 AL CAM, CCC, MEL, CO 65 NLLMRNVL CHC, CCECP, CE, CPPC 66 DLKKTRVL CCC, CVB, CCR

DMNTKRAI 67 HTL LLC, CO

DLKIPRYP 68 V CAM, CPr, CB, CAU CCC, CaCR, CVB, CHC, 69 ELARQRLL MEL CAM, CCC, CaCR, CVB, GBM, CG, CCECP, MEL, LNH, adenoCPCNP, CPCNPescam, CE, CP, 70 RPKGTPPL CPPC, CB, CAU CCECP, CPCNPescam, 71 HIRIKHTF CE

LPLAHHIQ 72 L LMA

MFPARGV 73 PL CPPC

RLKLRYEG 74 L LLC

YARLKNVL 75 L CB CAM, CCC, CG, MEL, HPRLKVNL LNH, CPCNPoutro, 76 L CPCNPescam, CO, CCR

LPKLPVPP 77 L GBM, CO, CCR

DGHMKVF 78 SL CCC 79 GLARIYSF LMA

EVYLRMY 80 QL MEL

MYRKEQY 81 L MEL 82 SIRKRPML CCC, GBM, CP

FVLLRSVD 83 L CPr

YITRQFVQ 84 F MEL, CPCNPadeno CAM, CCECP, MEL, LNH, CPCNPadeno, CPCNPoutro, CO, CE, 85 QKPRKKKL CAU

RPIHHPLV 86 L GBM, CPPC 87 QILQHHVL CCECP, CO, CE, CB

MLLCLSLE 88 L GBM, CG 89 VPYTKVQL CaCR, CPr

TIGLGLHS 90 L CPr MPMQDIK LMA, CAM, CG, LNH, CE, CVB, CCECP, adenoCPCNP, MEL, CO, 91 MIL CB CPCNPescam, CCR CPPC, CAU TLKAMVQ LMA, CAM, CG, CHC, CVB, CCECP, adenoCPCNP, MEL, CO, 92 AW LNH, CE, CB CPCNPescam, CCR CPPC, CAU CaCR, CCECP, CCC, CVB, CG, MEL, LNH, CPCNPoutro, LMKEKIQE CPCNPadeno, CO, CE, CP, CB, CPCNPescam, 93 M CHC, CCR CAU CPPC DQLLRHV CVB, CCECP, CPCNPadeno, 94 M LMA, CAM, LNH, CE, CB CPCNPescam, CO, CCR, CPPC CAU, MEL

SRNPRGF 95 FL CO CAU 96 RPAGVFEL MEL, CPPC GBM, CG EPVTKAE CG, adenoCPCNP, CHC, CCECP, 97 M CVB, LNH, CAU CPCNPescam, CE, CB MEL, CPPC

EPVNTNVV 98 L CCECP GBM, CPPC CPCNPoutro

99 NVKIRFLE LNH LLC

VLLMGPLH 100 L MEL

FAFEKLIQ 101 F CAU CAM, CPr CCC, LLC, CaCR, CVB, GBM, CG, CHC, CCECP, MEL, LNH, IMKKIRES CPCNPadeno, CPCNPescam, 102 Y LMA, CPCNPoutro, CAU CO, CE, CP, CCR, CPPC, CB CAM, CCC, CCECP, MEL, LNH, CPCNPadeno, CPCNPescam, CE, CP, 103 IANLRVKNI CCR, CB, CAU CVB, CHC, CO, CPPC

FAFGEPRE 104 L CPPC CHC, MEL

APLKMLAL 105 V LNH CaCR, CVB, CG, CPCNPadeno, CCC, CCECP, CPCNPescam, 106 HLHLLETSI CPCNPoutro, CO, CAU CE, CP, CB

LPKGLKD 107 WQA CPr

RSYYHPT 108 NL adenoCPCNP, CB CCECP, CPCNPescam, CE

IPASHPVL 109 TL LNH LLC 110 DAMTKHTL LLC LNH GAGLRITA CVB, CG, CPCNPadeno, CCC, CCECP, CPCNPescam, 111 PL CPCNPoutro, CP, CAU CE, CB

NALDPLSA 112 L CPr, CPPC GBM, CG CCC, CG, CPCNPadeno, 113 MEKGLASL CPCNPoutro, CP, CAU CCECP, CPCNPescam, CE, CB 114 PVKPKFYL MEL

MRILKRFL 115 AC GBM, CG

FTQNPRV 116 QL MEL CCC, CVB, CG, VGPNGFK CPCNPadeno, 117 SL CPCNPoutro, CP CCECP, CPCNPescam, CE, CB 118 MAFVKHLL CO, CB CVB, CHC, MEL, CAU

FQRVSSV 119 SF MEL

AQRSEMV 120 TL LNH LLC 121 YSQLSISL MEL ESSAQPTA CAM, CHC, MEL, CO, 122 L CPPC, CAU CPr

SLLPFTLS 123 F MEL

HSWTRTS 124 V CPr 125 FPLVTPLL GBM, CG

TAAEARLS 126 L CPPC 127 EPVIRTVSI MEL

HFHNRHV 128 F LLC

HRILRLPA 129 L MEL CCC, CVB, CG, CHC, CCECP, CPCNPadeno, LPAPYQH CPCNPescam, CO, CE, 130 QL CP, CB CaCR, MEL 131 MSTKTTSI CAM CB 132 IPIQAHQI GBM, CG

QATPRVRI 133 L MEL

DQRSRAT 134 L CHC

EYLETKRL 135 AF CCECP, CPCNPescam CE

KMFYRKD 136 VM LNH

VQWKPPA 137 L CPCNPescam adenoCPCNP, CPCNPoutro CVB, GBM, CCECP, MEL, CPCNPadeno, TQHLTVAT CPCNPescam, CE, CP, 138 L CPPC, CAU CaCR, CG, CB 139 YGRIGISLF CVB CHC 140 IAVDKPITL MEL CAM, CPCNPescam, CE, 141 AQLKLVAL CB CCECP

YNLIYSMC 142 L LMA CCC CCC, CVB, CG, CCECP, DADLREQ CPCNPadeno, 143 AL CPCNPescam, CP, CB CE CCC, CVB, CG, CCECP, CPCNPadeno, 144 IEQIRAVL CPCNPescam, CP, CB CE

MIYRKALR 145 L CPr 146 FQTAHFYL GBM, CG

HAMDGAS 147 HL CAM, MEL, CO CPr CCC, CVB, CG, CCECP, DVNPVSL CPCNPadeno, 148 QL CPCNPoutro, CE

CPCNPescam, CP, CB 149 TQKSVQVL GBM, CG

MRSSYIRE 150 L CAM CAU DRHLTNR CCECP, CPCNPescam, 151 VL CE CB 152 FNKLVTEL CHC

HAIPHYVT 153 M MEL 154 VLKTLQEL CHC

LPASFPAV 155 L LMA, LNH LLC

ILKEQSSS 156 SF CCECP

QPYRFPQ 157 A LLC, LNH DVIIKGNG GBM, MEL, CPCNPescam, 158 L CO, CCR, CPPC CAU 159 DLRNKIIA CE CCECP 160 LPINNTHI LMA, GBM, LNH LLC

DIVPPFSA 161 F CPr

LFKQTKIN 162 L GBM, CG CAM, CCC, CVB, EVMAQFK CPCNPescam, CO, CE, 163 EI CB, CAU LNH, CPCNPadeno, CO, 164 LPAPIPTLL CPPC, CAU QNSLRHN LNH, CPCNPadeno, CO, 165 L CPr, CPPC, CAU

VLSGGRIL 166 AL MEL 167 DMKITVSL CCR 168 HVQDFTAF CPr

YELNNLHA 169 L LLC SPANVRG CAM, CCECP, MEL, LNH, 170 QSL CPCNPadeno, CE

FPSQVPK 171 QVL CPCNPescam, CO, CPPC 172 PYEKVSRL CCC

YPLLKDPS 173 L CCC

HAMPSPRI 174 L CCC, CCR

MRFQQFL 175 FA CCECP, MEL, CP, CPr adenoCPCNP, YVIQRQSV outroCPCNP, 176 L CPCNPescam SVPVRSSP CCECP, MEL, 177 L CPCNPescam, CE, CCR 178 IPRLAVISI GBM, CG 179 LPLTEHEL LNH GBM, CCECP, CPCNPadeno, 180 LAVPIFVAL CPCNPescam, CE

SIRSSYSR 181 F CCECP, MEL, CE 182 ILHLSAIAL LMA

YVSKPGA 183 QL CCC, CVB, CPCNPadeno MEL, CPCNPescam, CO, 184 DRLKPLKM CPPC, CAU

MELKTVKP 185 I LMA, CPPC

DLISPRQP 186 RL CPCNPescam, CPPC 187 VPYNSVLF LMA, GBM MEL, CPCNPescam, CO, 188 EIMEKTTL CPPC, CAU APDNVLLT LMA, CVB, MEL, 189 L CPCNPescam, CO 190 ELLNRIYF MEL

RPLKPGEV 191 L GBM, CG 192 EEKHFTTL CO

LGGLRLTA 193 L CaCR, CG, CPPC

RAIEHVLQ 194 V CAM, CPr 195 EGNQKSVI CPPC 196 LDLRQKVL CO CaCR, LNH, CPCNPoutro, 197 YKAYPSQL CPCNPescam, CE, CPPC 198 FPLTSIIAI CPCNPoutro 199 IPFIHLPEI CPCNPoutro

VAAARAVP 200 V CPPC

TASAMQH 201 VL LMA, CG, CPCNPoutro

RIPEKASF 202 L CHC

DVYTQVS 203 AF LMA

CCECP, MEL, 204 MSPLLRSI CPCNPescam, CE, CCR

YMQYGFL 205 SM CAM, CO, CB

MEFPNKF 206 NTL MEL 207 LRKRKSPE CHC, LNH, CCR, CPPC

LPPPQPLS 208 L CHC

SRFGKFV 209 QL MEL 210 QPNTHQLL CAM, CPr

DVISKGVS 211 L GBM, CPPC 212 EEYKFPSL CPPC

FPSLFINQ 213 F CPPC CVB, GBM, CO, CCR, 214 DAPRHRLL CPPC, CB, CAU 215 NPLIEIISI CPPC

EARPPSPA 216 V GBM, CG

ETIKGHSV 217 RL CPPC

DNHPRLVT 218 L LMA 219 VRNPKILIL MEL 220 LAVRHLSL CCC

SLKEELLS 221 L MEL

AQKAELIA 222 L CO, CCR

DVSARKLR 223 V GBM, CG

LPYPPQKV 224 V CCC, GBM, CP CAM, CaCR, CVB, CG, CCECP, CPCNPadeno, MPKRAHW CPCNPescam, CO, CE, 225 GA CP

DIYEVAVS 226 L MEL

SRFPGMS 227 VL LMA

TLRAYVLA 228 L LNH

DTHTNTYY 229 L CaCR CAM, CCECP, 230 DVYFHHVL CPCNPescam, CO, CE,

CB

GEKLLRPS 231 L CaCR

KLYIHRVT 232 L CCECP, CPCNPescam 233 DVKLVFVM LLC 234 VFRVGISF CPr, CPPC 235 SPNSLVTIL CAM, MEL 236 STLKKSLEI LLC

LPLDSRYV 237 TL GBM, CG 238 IPLAIARL GBM, CP

SEPVMRV 239 TL CCECP, CO, CE, CB

KVIDRKVE 240 L CPPC 241 NAYEAPSI LLC, CO

KPQSLQLV 242 L CPPC

EGVPPGT 243 VL GBM, CG

HALPPYIT 244 VL CG, CP, CB, CAU

GPRGPSS 245 GHPL GBM, CE CAM, CCC, CaCR, CVB, CG, CCECP, CPCNPadeno, CPCNPoutro, RLLQKSKE CPCNPescam, CE, CP, 246 L CB

TPEPSVHA 247 L GBM, MEL, CPPC LMA, CAM, CCC, CaCR, CVB, GBM, CG, CHC, CCECP, MEL, CPCNPadeno, CPCNPoutro, SEVNKHET CPCNPescam, CO, CE, 248 AL CP, CB, CAU LLC, LNH, CPPC

QQIDRVVE 249 V CPPC

AARAPPQ 250 AL CCC, CVB, MEL, CO

DAAAFFKS 251 V LLC Tabela 9B: Pontuações de expressão. A tabela lista os peptídeos de genes que são altamente superexpressos em tumores em comparação com um painel de tecidos normais (+++), altamente superexpressos em tumores em comparação com um painel de tecidos normais (++) ou superexpressos em tumores em comparação com um painel de tecidos normais (+). A linha de base para esta pontuação foi calculada a partir de medições dos seguintes tecidos normais relevantes: tecido adiposo, glândula adrenal, ducto biliar, células sanguíneas, vasos sanguíneos, medula óssea, cérebro, esôfago, olho, vesícula biliar, coração, cabeça e pescoço, rim, intestino grosso, fígado, pulmão, linfonodo, nervo, paratireoide, pâncreas, peritônio, pituitária, pleura, músculo esquelético, pele, intestino delgado, medula espinhal, baço, estômago, glândula tireóide, traqueia, ureter, bexiga urinária. Em casos para os quais existiam dados para várias amostras de um mesmo tipo de tecido, a média aritmética de todas as respectivas amostras foi usada para o cálculo.

[348] CAM: câncer de mama; CCC: carcinoma colangiocelular; CaCR: câncer colorretal; CVB: câncer da vesícula biliar; CG: câncer gástrico; CCECP: carcinoma de células escamosas de cabeça e pescoço; MEL: melanoma; CPCNPadeno: adenocarcinoma de pulmão de células não- pequenas; CPCNPoutro: amostras de CPCNP que não puderam ser classificadas definitivamente como adenoCPCNP ou CPCNPescam; CPCNPescam: câncer de pulmão de células não-pequenas do tipo escamoso; CO: câncer de ovário; CE: câncer de esôfago; CP: câncer de pâncreas; CPr: câncer de próstata; CB: carcinoma de bexiga; CAU: câncer do endométrio e uterino. Expressão gênica em amostras tumorais sobrexpre SEQ Sequênci ssão Nº a muito Sobrexpressão acentuada acentuad Sobrexpressão (+) (++) a (+++) SLAESEA CCC, CCECP, 289 SL CaCR, CVB, CG, CPCNPadeno, CPCNPoutro, CO, CAU CPCNPescam, CE, CP, CB

EEFLTPK 290 KL CPr YVYANH CAM, CCC, CaCR, CVB, CG, CCECP, MEL, CPCNPadeno, 291 FTEA CPCNPescam, CE, CP, CB

EXEMPLO 3 Imunogenicidade in vitro de peptídeos apresentados por MHC classe I

[349] Para obter informações sobre a imunogenicidade dos TUMAPs da presente invenção, os investigadores realizaram investigações usando um ensaio de priming in vitro de células T baseado em estimulações repetidas de células T CD8+ com células apresentadoras de antígenos artificiais (aCAAs) carregadas com complexos peptídeo/MHC e anticorpo anti-CD28.

Assim, os inventores puderam demonstrar a imunogenicidade dos TUMAPs restritos por HLA-B*08 da invenção, demonstrando que esses peptídeos são epítopos de células T contra os quais existem células T CD8+ precursoras em humanos (Tabela 10A e Tabela 10B).

Preparação in vitro de células T CD8+

[350] Para realizar estimulações in vitro por células apresentadoras de antígenos artificiais carregadas com complexo peptídeo- MHC (pMHC) e anticorpo anti-CD28, os inventores primeiramente isolaram células T CD8+ de produtos frescos de leucaférese de HLA-B*08 usando seleção positiva com microesférulas de CD8 (Miltenyi Biotec, Bergisch Gladbach, Alemanha) de doadores saudáveis, obtidas da Clínica Universitária de Mannheim, Alemanha, após consentimento livre e esclarecido.

[351] As CMSPs e os linfócitos CD8+ isolados foram incubados por uma noite em um meio para células T (TCM, “T-cell medium”) que consistia em RPMI-Glutamax (Invitrogen, Karlsruhe, Alemanha) suplementado com 10% de soro humano AB termoinativado (PAN-Biotech, Aidenbach, Alemanha), penicilina 100 U/ml, estreptomicina 100 µg/ml (Cambrex, Colônia, Alemanha), piruvato de sódio 1 mM (CC Pro, Oberdorla, Alemanha) e gentamicina 20 µg/ml (Cambrex). Nesta etapa, também foram adicionados ao TCM 2,5 ng/ml de IL-7 (PromoCell, Heidelberg, Alemanha) e 10 U/ml de IL-2 (Novartis Pharma,

Nuremberg, Alemanha).

[352] A geração de esférulas revestidas por pMHC/anti-CD28, a estimulação de células T e a leitura foram realizadas em um sistema in vitro muito bem definido, no qual foram usadas 4 moléculas de pMHC diferentes por condição de estimulação e 8 moléculas de pMHC diferentes por condição de leitura.

[353] A IgG2a de camundongo anti-CD28 humano purificada e co- estimulatória de Ab 9.3(Jung et al., 1987)foi biotinilada quimicamente por sulfo- N-hidroxisuccinimidobiotina conforme recomendado pelo fabricante (Perbio, Bonn, Alemanha). Foram usadas esférulas que consistiam em partículas de poliestireno de 5,6 µm de diâmetro revestidas por estreptavidina (Bangs Laboratories, Illinois, EUA).

[354] Os pMHCs usados para estimulações de controle positivo e controle negativo foram A*0201/MLA-001 (peptídeo ELAGIGILTV, SEQ Nº 287) de Melan-A/MART-1 modificado) e A*0201/DDX5-001 (YLLPAIVHI de DDX5, SEQ Nº 288), respectivamente.

[355] Um total de 800.000 esférulas / 200 µl foram revestidas em placas de 96 cavidades na presença de 4 × 12,5 ng de complexos biotina-pMHC diferentes e lavados. Em seguida, 600 ng de anti-CD28 biotinilado foram adicionados até atingir o volume de 200 µl. As estimulações foram iniciadas em placas de 96 cavidades por incubação conjunta de 1 × 106 células T CD8+ com 2 × 105 esférulas revestidas lavadas em 200 µl TCM suplementado com IL-12 5 ng/ml (PromoCell) por 3 dias a 37°C. Em seguida, metade do meio foi suplementado por TCM fresco suplementado com IL-2 80 U/ml. A incubação foi mantida por 4 dias a 37°C, e o ciclo estimulatório foi realizado um total de três vezes. Para leitura do multímero pMHC com 8 moléculas diferentes de pMHC por condição, uma abordagem de codificação combinatória bidimensional foi empregada conforme descrito anteriormente(Andersen et al., 2012)com pequenas modificações relacionadas ao acoplamento com 5 fluorocromos diferentes. Finalmente, foram realizadas análises multiméricas por coloração das células com um corante quase-infravermelho indicativo de vida ou morte (Invitrogen, Karlsruhe, Alemanha), clone SK1 de anticorpo contra CD8-FITC (BD, Heidelberg, Alemanha) e multímeros fluorescentes de pMHC. Para análise, foi usado um citômetro BD LSRII SORP equipado com lasers e filtros apropriados.

As células específicas para peptídeos foram calculadas como porcentagem das células CD8+ totais. A avaliação da análise multimérica foi realizada pelo software FlowJo (Tree Star, Oregon, EUA). A ativação in vitro de linfócitos CD8+ específicos e positivos nos multímeros foi detectada por comparação com as estimulações de controles negativos. A imunogenicidade para um determinado antígeno foi detectada quando pelo menos uma cavidade estimulada in vitro avaliável de um doador saudável apresentava uma linhagem específica de células T CD8+ após estimulação in vitro (i.é. a cavidade continha no mínimo 1% do multímero+ específico entre as células T CD8+, e a porcentagem de células multímero+ positivas era pelo menos 10x a mediana das simulações em controles negativos).

[356] A imunogenicidade in vitro contra carcinoma colangiocelular, carcinoma de bexiga, carcinoma de células escamosas de cabeça e pescoço, carcinoma de células renais, carcinoma hepatocelular, câncer colorretal, câncer da vesícula biliar, câncer de esôfago, câncer de mama, câncer de ovário, câncer de próstata, câncer de pulmão (incluindo adenocarcinoma de pulmão de células não pequenas, câncer de células escamosas de células não pequenas e câncer de pulmão de pequenas células), câncer de pâncreas, câncer do endométrio uterino, câncer gástrico, glioblastoma, leucemia linfocítica crônica, leucemia mieloide aguda, linfoma não-Hodgkin e melanoma foi avaliada.

[357] Para peptídeos de HLA classe I testados, a imunogenicidade in vitro pôde ser demonstrada pela geração de linhagens de células T específicas para os peptídeos. A Figura 3 mostra resultados exemplares de citometria de fluxo após coloração específica para multímeros TUMAP de 7 peptídeos da invenção, junto com os controles negativos correspondentes. Os resultado para 51 peptídeos da invenção estão sumarizados na Tabela 10A e 10B.

Tabela 10A: Imunogenicidade in vitro de peptídeos de HLA classe I da invenção Exemplos de resultados de experimentos de imunogenicidade in vitro realizados pelo depositante com os peptídeos da invenção. <20% = +; 20% a 49% = ++; 50% a 69%= +++; ≥ 70% = ++++ SEQ Nº Sequência Cavidades positivas [%] 278 RAQLKLVAL + 283 MAQFKEISL ++++ 284 ELKKKEYEEL + 285 EAMLRNKEL + 286 ILLPRTVSL + Tabela 10B: Imunogenicidade in vitro de peptídeos de HLA classe I da invenção Exemplos de resultados de experimentos de imunogenicidade in vitro realizados pelo depositante com os peptídeos da invenção. <20% = +; 20% a 49% = ++; 50% a 69%= +++; ≥ 70% = ++++ SEQ Nº Sequência Cavidades positivas [%] 1 ALKLKVAEL ++ 3 SIQSRYISM ++ 5 STMPKILAL + 8 FVRPKLVTI + 9 LLKGKPRAL + 10 MGKFKQCF ++++ 11 MAPLKMLAL +++ 13 EPFTRPVL + 18 LSLVRKAL ++ 19 FTLLRRLSL ++++ 20 ILKRFLAC + 21 RILKRFLAC +

SEQ Nº Sequência Cavidades positivas [%] 22 EVRLKPIL + 25 HLHPKGREL ++ 29 ELFLHPVL ++ 31 SPRVKWTF ++++ 33 WIGLRNLDL + 34 IYRKKYIL + 35 ELFQRPVL + 36 IVKIKVQEL ++ 37 EAFSRASL ++ 38 EVYQKIIL ++++ 40 ESMLKTTL + 41 RGALRTLSL + 42 VLRRKTLL + 45 RLKVALSTL + 47 HSRVKLAQL ++ 48 ELALRQTV + 49 FLRVFTDSL + 57 MPLKHYLL +++ 58 LPKKMKLL ++ 60 MLHIKKAEV + 62 FMLAKEASL + 63 YVKRKTNVL + 66 DLKKTRVL + 68 DLKIPRYPV +++ 71 HIRIKHTF ++ 74 RLKLRYEGL ++ 75 YARLKNVLL +++ 76 HPRLKVNLL + 78 DGHMKVFSL ++ 80 EVYLRMYQL +++ 82 SIRKRPML + 83 FVLLRSVDL +++

86 RPIHHPLVL +

89 VPYTKVQL +

EXEMPLO 4 Síntese de peptídeos

[358] Todos os peptídeos foram sintetizados por técnicas padronizadas e bem estabelecidas de síntese de peptídeos em fase sólida empregando a estratégia Fmoc. A identidade e a pureza de cada peptídeo foram determinadas por espectrometria de massa e RP-HPLC analítica. Os peptídeos foram obtidos na forma de liofilizados brancos a esbranquiçados com pureza >50%. Preferivelmente, todos os TUMAPs são administrados como sais de trifluoracetato ou sais acetato, mas outras formas em sal também são possíveis.

EXEMPLO 5 Ensaios de ligação a MHC

[359] Os peptídeos candidatos para terapias à base de células T de acordo com a presente invenção foram testados também para sua capacidade (afinidade) de ligação ao MHC. Os complexos individuais de peptídeo com MHC foram produzidos por troca de ligantes induzida por UV, na qual um peptídeo sensível a UV é clivado por irradiação UV e trocado pelo peptídeo de interesse a ser analisado. Entre os peptídeos candidatos, apenas aqueles capazes de se ligar eficazmente e estabilizar as moléculas de MHC receptivas a peptídeos podem impedir a dissociação dos complexos de MHC.

Para determinar o rendimento da reação de troca, foi realizado um ELISA baseado na detecção da cadeia leve (β2m) de complexos de MHC estabilizados.

De forma geral, o ensaio foi realizado conforme descrito por Rodenko et al (Rodenko et al., 2006).

[360] Placas MAXISorp de 96 cavidades (NUNC) foram revestidas de um dia para outro com estreptavidina 2 g/ml em PBS em temperatura ambiente, lavadas 4 vezes e bloqueadas por 1 h a 37°C em BSA 2% contendo tampão bloqueador. Monômeros de HLA-A*02:01/MLA-001 foram usados como padrões, cobrindo o intervalo de 15 a 500 ng/ml. Os monômeros peptídeo-MHC da reação de troca induzida por UV foram diluídos 100 vezes em um tampão bloqueador. As amostras foram incubadas por 1 h a 37ºC, lavadas 4 vezes, incubadas com HRP 2 µg/ml conjugado com anti-β2m por 1 h a 37ºC, lavadas novamente e detectadas com solução de TMB, que foi interrompida com NH2SO4. A absorbância foi medida a 450 nm. Os peptídeos candidatos que mostram altas taxas de trocas (preferivelmente maior que 50% e, o mais preferido, maior que 75%) são geralmente preferidos para geração e produção de anticorpos ou fragmentos de anticorpos e/ou de receptores de células T ou fragmentos dos mesmos, pois apresentam avidez suficiente pelas moléculas de MHC e impedem a dissociação dos complexos de MHC.

[361] A Tabela 11A, Tabela 11B e Tabela 11C resumem os resultados de ensaios de ligação de MHC a peptídeo para 252 peptídeos da invenção.

Tabela 11A: Pontuações de ligação ao MHC de classe I. A ligação de peptídeos restritos por HLA de classe I a HLA-B*08:01 variou em função do rendimento de troca de peptídeos: ≥10% = +; ≥20% = ++; ≥50% = +++; ≥75% = ++++ SEQ Nº Sequência Troca de peptídeo 1 ALKLKVAEL ++ 2 QIMPKAGL +++ 3 SIQSRYISM +++ 4 QVMPKTGL ++ 5 STMPKILAL +++ 6 NRQKRFVL ++ 7 AARLRPAL ++ 8 FVRPKLVTI +++ 9 LLKGKPRAL ++ 10 MGKFKQCF +++ 11 MAPLKMLAL +++ 12 DFYLRSSAF +++ 13 EPFTRPVL ++ 14 ELILKRCL +++ 15 LLKKIEHA ++ 16 NRKPRTPF ++ 17 LLILKTVL +++ 18 LSLVRKAL +++

SEQ Nº Sequência Troca de peptídeo 19 FTLLRRLSL +++ 20 ILKRFLAC +++ 21 RILKRFLAC +++ 22 EVRLKPIL ++ 23 DIKKTNESL ++ 24 DLVLKRCL ++++ 25 HLHPKGREL ++ 26 DARCKLAEL ++ 28 DPKSRLKSL ++ 29 ELFLHPVL ++ 30 DLQKKAQAL ++ 31 SPRVKWTF ++ 32 NPYLKLVL ++ 33 WIGLRNLDL +++ 34 IYRKKYIL ++ 35 ELFQRPVL ++ 36 IVKIKVQEL ++ 37 EAFSRASL ++ 38 EVYQKIIL +++ 39 DAKSKIEQI ++ 40 ESMLKTTL ++ 41 RGALRTLSL ++ 42 VLRRKTLL ++ 43 DLKKLVDSL +++ 44 HLTNRVLSL +++ 45 RLKVALSTL +++ 46 DLRNKIIAA +++ 47 HSRVKLAQL ++ 48 ELALRQTV ++ 49 FLRVFTDSL +++ 50 TLRLLVAAL +++ 51 ERRVKVSSL +++ 52 ELILKHSL +++ 53 DLRKLKRQL ++ 54 DLSRRDVSL ++ 55 VLLSRRTAL ++ 56 ILCGSRKMPL ++ 57 MPLKHYLL ++ 58 LPKKMKLL ++ 59 FDFRGKTKVF ++ 60 MLHIKKAEV +++ 61 SIKKELVVL ++ 62 FMLAKEASL ++ 63 YVKRKTNVL ++

SEQ Nº Sequência Troca de peptídeo 64 FILGREAGAL ++ 65 NLLMRNVL ++ 66 DLKKTRVL ++ 67 DMNTKRAIHTL ++ 68 DLKIPRYPV +++ 69 ELARQRLL ++ 70 RPKGTPPL ++ 71 HIRIKHTF +++ 72 LPLAHHIQL +++ 73 MFPARGVPL ++ 74 RLKLRYEGL +++ 75 YARLKNVLL +++ 76 HPRLKVNLL +++ 77 LPKLPVPPL +++ 78 DGHMKVFSL ++ 79 GLARIYSF ++ 80 EVYLRMYQL +++ 81 MYRKEQYL ++ 82 SIRKRPML ++ 83 FVLLRSVDL +++ 84 YITRQFVQF ++ 85 QKPRKKKL ++ 86 RPIHHPLVL ++ 87 QILQHHVL +++ 88 MLLCLSLEL ++ 89 VPYTKVQL +++ 90 TIGLGLHSL ++ 91 MPMQDIKMIL ++ 92 TLKAMVQAW +++ 93 LMKEKIQEM +++ 94 DQLLRHVM +++ 95 SRNPRGFFL ++ 96 RPAGVFEL ++ 97 EPVTKAEM +++ 98 EPVNTNVVL ++ 99 NVKIRFLE ++ 100 VLLMGPLHL ++ 101 FAFEKLIQF +++ 102 IMKKIRESY +++ 103 IANLRVKNI +++ 104 FAFGEPREL ++ 105 APLKMLALV ++ 106 HLHLLETSI ++ 107 LPKGLKDWQA ++

SEQ Nº Sequência Troca de peptídeo 108 RSYYHPTNL ++ 109 IPASHPVLTL ++ 110 DAMTKHTL +++ 111 GAGLRITAPL ++ 112 NALDPLSAL ++ 113 MEKGLASL ++ 114 PVKPKFYL ++ 115 MRILKRFLAC ++ 116 FTQNPRVQL ++ 117 VGPNGFKSL ++ 118 MAFVKHLL +++ 119 FQRVSSVSF +++ 120 AQRSEMVTL ++ 121 YSQLSISL ++ 122 ESSAQPTAL ++ 123 SLLPFTLSF ++ 124 HSWTRTSV +++ 125 FPLVTPLL +++ 126 TAAEARLSL ++ 127 EPVIRTVSI +++ 128 HFHNRHVF +++ 129 HRILRLPAL +++ 130 LPAPYQHQL ++ 131 MSTKTTSI ++ 132 IPIQAHQI +++ 133 QATPRVRIL ++ 134 DQRSRATL ++ 135 EYLETKRLAF + 136 KMFYRKDVM +++ 137 VQWKPPAL ++ 138 TQHLTVATL +++ 139 YGRIGISLF ++ 140 IAVDKPITL ++ 141 AQLKLVAL ++ 142 YNLIYSMCL +++ 143 DADLREQAL ++ 144 IEQIRAVL ++ 145 MIYRKALRL ++ 146 FQTAHFYL +++ 147 HAMDGASHL ++ 148 DVNPVSLQL ++ 149 TQKSVQVL ++ 150 MRSSYIREL ++ 151 DRHLTNRVL ++

SEQ Nº Sequência Troca de peptídeo 152 FNKLVTEL ++ 153 HAIPHYVTM ++ 154 VLKTLQEL ++ 155 LPASFPAVL ++ 156 ILKEQSSSSF ++ 157 QPYRFPQA ++ 158 DVIIKGNGL ++ 159 DLRNKIIA ++ 160 LPINNTHI ++ 161 DIVPPFSAF ++ 162 LFKQTKINL ++ 163 EVMAQFKEI ++ 164 LPAPIPTLL ++ 165 QNSLRHNL ++ 166 VLSGGRILAL ++ 167 DMKITVSL +++ 168 HVQDFTAF ++ 169 YELNNLHAL ++ 170 SPANVRGQSL ++ 171 FPSQVPKQVL ++ 172 PYEKVSRL ++ 173 YPLLKDPSL +++ 174 HAMPSPRIL ++ 175 MRFQQFLFA + 176 YVIQRQSVL ++ 177 SVPVRSSPL ++ 178 IPRLAVISI ++ 179 LPLTEHEL +++ 180 LAVPIFVAL ++ 181 SIRSSYSRF ++ 182 ILHLSAIAL ++++ 183 YVSKPGAQL ++ 184 DRLKPLKM ++ 185 MELKTVKPI ++ 186 DLISPRQPRL ++ 187 VPYNSVLF ++ 188 EIMEKTTL ++ 189 APDNVLLTL ++ 190 ELLNRIYF ++ 191 RPLKPGEVL ++ 192 EEKHFTTL ++ 193 LGGLRLTAL ++ 194 RAIEHVLQV +++ 195 EGNQKSVI ++

SEQ Nº Sequência Troca de peptídeo 196 LDLRQKVL ++ 197 YKAYPSQL ++ 198 FPLTSIIAI +++ 199 IPFIHLPEI ++ 200 VAAARAVPV ++ 201 TASAMQHVL +++ 202 RIPEKASFL ++ 203 DVYTQVSAF ++ 204 MSPLLRSI ++ 205 YMQYGFLSM ++ 206 MEFPNKFNTL ++ 207 LRKRKSPE ++ 208 LPPPQPLSL ++ 209 SRFGKFVQL ++ 210 QPNTHQLL ++ 211 DVISKGVSL ++ 212 EEYKFPSL ++ 213 FPSLFINQF ++ 214 DAPRHRLL ++ 215 NPLIEIISI ++ 216 EARPPSPAV ++ 217 ETIKGHSVRL ++ 218 DNHPRLVTL +++ 219 VRNPKILIL ++ 220 LAVRHLSL ++ 221 SLKEELLSL +++ 222 AQKAELIAL ++ 223 DVSARKLRV ++ 224 LPYPPQKVV ++ 225 MPKRAHWGA +++ 226 DIYEVAVSL +++ 227 SRFPGMSVL ++ 228 TLRAYVLAL +++ 229 DTHTNTYYL ++ 230 DVYFHHVL ++ 231 GEKLLRPSL ++ 232 KLYIHRVTL ++ 233 DVKLVFVM ++ 234 VFRVGISF ++ 235 SPNSLVTIL +++ 236 STLKKSLEI ++ 237 LPLDSRYVTL +++ 238 IPLAIARL +++ 239 SEPVMRVTL ++

SEQ Nº Sequência Troca de peptídeo 240 KVIDRKVEL ++ 241 NAYEAPSI ++ 242 KPQSLQLVL ++ 243 EGVPPGTVL +++ 244 HALPPYITVL ++ 245 GPRGPSSGHPL ++ 246 RLLQKSKEL ++ 247 TPEPSVHAL ++ 248 SEVNKHETAL ++ 249 QQIDRVVEV ++ 250 AARAPPQAL ++ 251 DAAAFFKSV ++ Tabela 11B: Pontuações de ligação ao MHC de classe I. A ligação de peptídeos restritos por HLA de classe I a HLA-B*44:05 variou em função do rendimento de troca de peptídeos: ≥50% = +++. SEQ Nº Sequência Troca de peptídeo 290 EEFLTPKKL +++ Tabela 11C: Pontuações de ligação ao MHC de classe I. A ligação de peptídeos restritos por HLA classe I a HLA-A*02:01 foi determinada em função do rendimento de troca de peptídeos. ≥75% = ++++. SEQ Nº Sequência Troca de peptídeo 291 YVYANHFTEA ++++ EXEMPLO 6 Quantificação absoluta de peptídeos associados a tumores apresentados na superfície celular

[362] A geração de ligantes como anticorpos e/ou TCRs é um processo laborioso, que pode ser realizado apenas para alguns alvos selecionados. No caso de peptídeos específicos para ou associados a tumores, os critérios de seleção incluíram, entre outros, exclusividade de apresentação e densidade de apresentação do peptídeo na superfície celular. Além do isolamento e quantificação relativa dos peptídeos conforme descrito no EXEMPLO 1, os inventores analisaram as cópias de peptídeo absoluto por célula, conforme descrito em US20160187351, cujo conteúdo está incorporado por referência na íntegra. A quantificação de cópias de TUMAP por célula em amostras de tumores sólidos requer a quantificação absoluta dos TUMAPs isolados, a eficiência do processo de isolamento de TUMAPs e conhecimento da contagem celular da amostra de tecido sob análise. Uma visão geral da nossa abordagem experimental está descrita a seguir.

Quantificação de peptídeos por nano-LC-MS/MS

[363] Para uma quantificação precisa dos peptídeos por espectrometria de massa, uma curva de calibragem foi gerada para cada peptídeo usando-se duas variantes marcadas por isótopos (um ou dois aminoácidos marcados por isótopos introduzidos durante a síntese dos TUMAPs). Essas variantes marcadas por isótopos diferem do peptídeo associado ao tumor apenas em relação à massa; todas as outras propriedades físico-químicas são idênticas (Anderson et al., 2012). Para gerar a curva de calibração do peptídeo, foi realizada uma série de mensurações de nano-LC- MS/MS a fim de determinar a razão de sinais de MS/MS dos peptídeos titulados (peptídeo marcado com um único isótopo) em relação aos peptídeos constantes (peptídeo marcado com dois isótopos).

[364] O peptídeo marcado com dois isótopos, também denominado padrão interno, foi subsequentemente repicado em todas as amostras de MS, e todos os sinais de MS foram normalizados em relação ao sinal de MS do padrão interno para nivelar possíveis variações técnicas entre experimentos de MS.

[365] As curvas de calibragem foram preparadas em pelo menos três matrizes diferentes, i.é., eluatos do peptídeo de HLA de amostras naturais semelhantes a amostras de MS de rotina, e cada preparação foi mensurada em ensaios duplicados de MS. Para avaliação, os sinais de MS foram normalizados em relação ao sinal do padrão interno e uma curva de calibragem foi calculada por regressão logística.

[366] Para quantificar os peptídeos associados ao tumor nas amostras de tecido, as respectivas amostras também foram repicadas com o padrão interno, os sinais de MS foram normalizados em relação ao padrão interno e quantificados usando-se a curva de calibragem do peptídeo.

Eficiência do isolamento de complexos peptídeo-MHC

[367] Assim como em qualquer processo de purificação de proteínas, a proteína procurada é parcialmente perdida durante o isolamento de proteínas de amostras tumorais. Para determinar a eficiência do isolamento de TUMAP, foram gerados complexos peptídeo-MHC para todos os TUMAPs selecionados para quantificação absoluta. Para permitir a distinção entre os complexos de MHC com peptídeos repicados e os complexos naturais, usaram- se TUMAPs marcados com um único isótopo, i.é., um aminoácido marcado por isótopo foi incluído na síntese do TUMAP em questão. Esses complexos foram repicados em preparados frescos de tecido lisado – i.é., o mais precocemente possível no processo de isolamento de TUMAPs – e depois capturados na purificação por afinidade realizada a seguir junto com os complexos de peptídeo com MHC encontrados naturalmente. Assim, a mensuração de recuperação de TUMAPs com marcação única permite obter conclusões sobre a eficiência do isolamento de TUMAPs naturais individuais.

[368] A eficiência do isolamento foi analisada em um pequeno conjunto de amostras e foi semelhante em todas as amostras testadas. Por outro lado, a eficiência variou em função do peptídeo a ser isolado. Isso sugere que a eficiência do isolamento, embora tenha sido determinada em um número limitado de amostras, pode ser extrapolada para qualquer outro preparado de tecido.

Entretanto, cada TUMAP precisa ser analisado individualmente, pois a eficiência de isolamento não pode ser extrapolada de um peptídeo para outro. Determinação da contagem celular em tecidos sólidos congelados

[369] Para determinar a contagem celular de amostras de tecidos sujeitas a quantificação absoluta de peptídeos, os inventores recorreram à análise de conteúdo de DNA. Esse método se aplica a diversos tipos de amostras de origens diferentes, incluindo, especialmente, amostras congeladas (Alcoser et al., 2011; Forsey and Chaudhuri, 2009; Silva et al., 2013). Durante o protocolo de isolamento do peptídeo, uma amostra de tecido é processada formando um lisado homogêneo, a partir do qual uma pequena alíquota de lisado é colhida. A alíquota é dividida em três partes, das quais o DNA é isolado (QiaAmp DNA Mini Kit, Qiagen, Hilden, Alemanha). O conteúdo de DNA total de cada isolamento de DNA foi quantificado por um ensaio de quantificação à base de DNA fluorescente (Qubit dsDNA HS Assay Kit, Life Technologies, Darmstadt, Alemanha) pelo menos em duplicata.

[370] Para calcular o número de células, foi gerada uma curva padrão de DNA a partir de alíquotas de células sanguíneas isoladas de doadores de sangue saudáveis com um intervalo definido de número de células. Essa curva padrão foi usada para calcular o conteúdo celular total a partir do conteúdo de DNA total de cada isolamento de DNA. A média da contagem celular total da amostra tecidual usada para isolamento de peptídeo foi extrapolada considerando-se o volume conhecido das alíquotas do lisado e o volume total do lisado.

Cópias de peptídeo por célula

[371] A partir de dados dos experimentos supramencionados, os inventores calcularam o número de cópias de TUMAPs por célula dividindo a quantidade total de peptídeos pela contagem celular total da amostra e depois dividindo pela eficiência de isolamento. Os números de cópias de células para os peptídeos selecionados são mostrados na Tabela 12.

[372] Tabela 12: Número absoluto de cópias A tabela lista os resultados da quantificação absoluta de peptídeo em amostras tumorais. O número mediano de cópias por células é indicado para cada peptídeo. <25 = +.

O número de amostras para as quais existem dados de MS avaliáveis e de alta qualidade é mostrado. SEQ Nº Código do peptídeo Cópias por célula Número de amostras (mediana) 291 COL6A3-039 + 9

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Claims

REIVINDICAÇÕES

1. PEPTÍDEO, caracterizado por compreender uma sequência de aminoácidos selecionada a partir do grupo que consiste em SEQ No 1 a SEQ No. 251 e SEQ No.289 a SEQ No 291, e uma variante de comprimento da sequência do dito peptídeo compreendendo aminoácidos adicionais no C- e N terminal da mesma e uma sequência variante do dito peptídeo que é modificada por pelo menos uma substituição conservativa de aminoácido, definido pelo fato de que a dita variante se liga à(s) molécula(s) do complexo principal de histocompatibilidade e/ou induz a reação cruzada de células T com o dito peptídeovariante; e um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo, e em que o dito peptídeo ou variante do mesmo tem um comprimento máximo de 16 aminoácidos.

2. PEPTÍDEO de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo referido peptídeo ou variante do mesmo possuir capacidade de se ligar a uma molécula de MHC de classe I ou II, sendo que tal peptídeo pode, quando ligado ao referido MHC, ser reconhecido por células T CD4 e/ou CD8.

3. PEPTÍDEO ou variante do mesmo de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 2, caracterizado pelo referido peptídeo ou variante do mesmo ter um comprimento geral de 8 a 16 aminoácidos, e mais preferido em que o peptídeo consiste ou consiste essencialmente emu ma sequência de aminoácidos de acordo com qualquer uma de SEQ No 1 a SEQ No. 251 e SEQ No 289 a SEQ No 291.

4. PEPTÍDEO ou variante do mesmo de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 3, caracterizado pelo peptídeo ser modificado e/ou incluir ligações não-peptídicas.

5. PEPTÍDEO ou variante do mesmo de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 4, caracterizado pelo referido peptídeo ser parte de uma proteína de fusão, em especial uma proteína que contém aminoácidos N- terminais da cadeia invariante (Ii) associada ao antígeno HLA-DR.

6. ANTICORPO, em particular um anticorpo solúvel ou ligado a membrana, preferivelmente um anticorpo monoclonal ou fragmento do mesmo, caracterizado por reconhecer especificamente o peptídeo ou variante do mesmo de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 4, preferivelmente o peptídeo ou variante do mesmo de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 4 quando ligado a uma molécula de MHC.

7. RECEPTOR DE CÉLULA T, preferivelmente solúvel ou ligado à membrana, ou um fragmento do mesmo que reaja com um ligante de HLA, caracterizado pelo referido ligante ser o peptídeo ou variante do mesmo de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 4, preferivelmente o peptídeo ou variante do mesmo de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 4 quando ligado a uma molécula de MHC.

8. RECEPTOR DE CÉLULA T de acordo com a reivindicação 7, caracterizado pela referida sequência ligante de aminoácidos ser pelo menos 88% idéntica à qualquer da SEQ No 1 a SEQ No 251 e SEQ No 289 a SEQ No 291 ou onde a referida sequência ligante de aminoácidos consiste em qualquer uma das sequências SEQ No 1 a SEQ No 251 e SEQ No 289 a SEQ No 291.

9. RECEPTOR DE CÉLULAS T de acordo com as reivindicações 7 ou 8, caracterizado pelo referido receptor de células T ser fornecido como molécula solúvel e, opcionalmente, realiza outra função efetora como um domínio de imunoestimulação ou uma toxina.

10. APTÂMERO que reconhece especificamente o peptídeo ou variante do mesmo de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 4, preferivelmente o peptídeo ou variante do mesmo de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 4, caracterizado por ser ligado a uma molécula de MHC.

11. ÁCIDO NUCLEICO que codifica um peptídeo ou uma variante do mesmo de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 4, um anticorpo ou fragmento do mesmo de acordo com a reivindicação 6 ou um receptor de célula T ou fragmento do mesmo de acordo com as reivindicações 7 ou 8, caracterizado por ser ligado opcionalmente a uma sequência promotora heteróloga ou a um vetor de expressão que expressa o referido ácido nucleico.

12. CÉLULA HOSPEDEIRA recombinante que compreende o peptídeo de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 6, o anticorpo ou fragmento do mesmo de acordo com a reivindicação 6, o receptor de célula T ou fragmento do mesmo de acordo com as reivindicações 7 ou 8 ou o ácido nucleico ou o vetor de expressão de acordo com a reivindicação 11, caracterizada pela referida célula hospedeira ser selecionada preferivelmente entre uma célula apresentadora de antígeno, tal como uma célula dendrítica, uma célula T ou uma célula NK.

13. MÉTODO IN VITRO DE PRODUÇÃO DE LINFÓCITOS T ATIVADOS, caracterizado pelo método compreender colocar células T em contato in vitro com moléculas de MHC classe I ou II humanas expressas na superfície de células apresentadoras de antígeno adequadas ou uma estrutura que mimetiza uma célula apresentadora de antígeno por um período suficientemente longo para ativar as referidas células T de forma específica para o antígeno, sendo que tal antígeno é o peptídeo de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 3.

14. LLINFÓCITO T ativado produzido pelo método de acordo com a reivindicação 13 que reconhece seletivamente uma célula que apresenta um polipeptídeo, caracterizado por compreender uma das sequências de aminoácidos apresentadas em qualquer uma das reivindicações 1 a 3.

15. COMPOSIÇÃO FARMACÊUTICA, caracterizada por compreender pelo menos um ingrediente ativo selecionado do grupo que consiste do peptídeo de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 5, o anticorpo ou fragmento do mesmo de acordo com a reivindicação 6, o receptor de célula T ou fragmento do mesmo de acordo com as reivindicações 7 ou 8, o aptâmero de acordo com a reivindicação 10, o ácido nucleico ou vetor de expressão de acordo com a reivindicação 11, a célula hospedeira de acordo com a reivindicação 12 ou o linfócito T ativado de acordo com a reivindicação 14 ou um ingrediente ativo conjugado ou marcado e um veículo farmaceuticamente aceitável e, opcionalmente, excipientes e/ou estabilizantes farmaceuticamente aceitáveis.

16. MÉTODO DE PRODUÇÃO DE UM PEPTÍDEO ou variante do mesmo de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 6, o anticorpo ou fragmento do mesmo de acordo com a reivindicação 6 ou o receptor de célula T ou fragmento do mesmo de acordo com as reivindicações 7 ou 8, caracterizado pelo método compreender a cultura da célula hospedeira de acordo com a reivindicação 12 e o isolamento do peptídeo ou variante do mesmo, do anticorpo ou fragmento do mesmo u do receptor de célula T ou fragmento do mesmo da referida célula hospedeira e/ou de seu meio de cultura.

17. PEPTÍDEO de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 5, o anticorpo ou fragmento do mesmo de acordo com a reivindicação 6, o receptor de célula T ou fragmento do mesmo de acordo com as reivindicações 7 ou 8, o aptâmero de acordo com a reivindicação 10, o ácido nucleico ou vetor de expressão de acordo com a reivindicação 11, a célula hospedeira de acordo com a reivindicação 12 ou o linfócito T ativado de acordo com a reivindicação 14, caracterizado por ser para uso em medicina.

18. MÉTODO PARA MATAR CÉLULAS ALVO EM UM PACIENTE no qual as células-alvo apresentam um polipeptídeo que compreende uma das sequências de aminoácidos apresentadas em qualquer uma das reivindicações 1 a 3, caracterizado pelo método compreender administração ao paciente de um número eficaz de células T ativadas, conforme definido na reivindicação 14.

19. PEPTÍDEO de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 5, o anticorpo ou fragmento do mesmo de acordo com a reivindicação 6, o receptor de célula T ou fragmento do mesmo de acordo com as reivindicações 7 ou 8, o aptâmero de acordo com a reivindicação 10, o ácido nucleico ou vetor de expressão de acordo com a reivindicação 11, a célula hospedeira de acordo com a reivindicação 12 ou o linfócito T ativado de acordo com a reivindicação 14, caracterizado por ser para uso no diagnóstico e/ou tratamento do câncer ou para uso na fabricação de um medicamento anticâncer.

20. UTILIZAÇÃO de acordo com a reivindicação 19, caracterizada pelo referido câncer ser selecionado do grupo formado por leucemia mieloide aguda, câncer de mama, carcinoma colangiocelular, leucemia linfocítica crônica, câncer colorretal, câncer da vesícula biliar, glioblastoma, câncer gástrico, carcinoma hepatocelular, carcinoma de células escamosas de cabeça e pescoço, melanoma, linfoma não-Hodgkin, câncer de pulmão (incluindo adenocarcinoma de pulmão de células não pequenas, câncer de células escamosas de células não pequenas e câncer de pulmão de pequenas células), câncer de ovário, câncer de esôfago, câncer de pâncreas, câncer de próstata, carcinoma de células renais, carcinoma de bexiga e câncer do endométrio uterino e outros tumores que apresentam sobrexpressão de uma proteína da qual são derivados um dos peptídeos de SEQ No 1 a SEQ No 251 e SEQ No 289 a SEQ No 291.

21. KIT, caracterizado por compreender: a) um recipiente que compreende uma composição farmacêutica que contém o(s) peptídeo(s) de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 5, o anticorpo ou fragmento do mesmo de acordo com a reivindicação 6, o receptor de célula T ou fragmento do mesmo de acordo com as reivindicações 7 ou 8, o aptâmero de acordo com a reivindicação 10, o ácido nucleico ou vetor de expressão de acordo com a reivindicação 11, a célula hospedeira de acordo com a reivindicação 12 ou o linfócito T ativado de acordo com a reivindicação 14 em solução ou em forma liofilizada; b) opcionalmente, um segundo recipiente contendo um diluente ou solução para reconstituição de uma formulação liofilizada; c) opcionalmente, pelo menos mais um peptídeo selecionado do grupo formado por SEQ No 1 a SEQ No 286 e SEQ No 289 a SEQ No 291; e d) opcionalmente, instruções de (i) uso da solução ou (ii) reconstituição e/ou uso da formulação liofilizada.

22. KIT de acordo com a reivindicação 21, caracterizado por compreender também um ou mais dentre (iii) uma solução tampão, (iv) um diluente, (v) um filtro, (vi) uma agulha ou (v) uma seringa.

23. MÉTODO DE PRODUÇÃO DE UMA VACINA ANTICÂNCER personalizada para tratamento a base de compostos ou células para pacientes individuais, caracterizado pelo referido método compreender: a) identificar os peptídeos associados a tumores (TUMAPs) apresentados por uma amostra tumoral obtida do referido paciente; b) comparar os peptídeos identificados em a) com um depósito de peptídeos pré-selecionados de acordo com sua imunogenicidade e/ou apresentação aumentada em tumores em comparação com tecidos normais; c) selecionar pelo menos um peptídeo do depósito que corresponda a um TUMAP identificado no paciente; e d) fabricar e/ou formular a vacina personalizada ou produto para terapia a base de compostos ou de células de acordo com a etapa c).

24. MÉTODO de acordo com a reivindicação 23, caracterizado pelo fato de que os TUMAPs são identificados por: a1) comparações dos dados de expressão da amostra tumoral com os dados de expressão de uma amostra de tecido normal correspondente ao tipo de tecido do tumor para identificar proteínas sobrexpressas ou com expressão aberrante na amostra tumoral; e a2) correlações dos dados de expressão com as sequências de ligantes de MHC ligados a moléculas de MHC de classe I e/ou de classe II na amostra tumoral para identificar ligantes de MHC derivados de proteínas sobrexpressas ou expressas de maneira aberrante pelo tumor.

25. MÉTODO de acordo com as reivindicações 23 ou 24, caracterizado pelas sequências dos ligantes de MHC serem identificadas eluindo-se os peptídeos ligados das moléculas de MHC isoladas da amostra tumoral e sequenciando-se os ligantes eluídos.

26. MÉTODO de acordo com qualquer uma das reivindicações 23 a 25, caracterizado pelo tecido normal correspondente ao tipo de tecido do tumor ser obtido do mesmo paciente.

27. MÉTODO de acordo com qualquer uma das reivindicações 23 a 26, caracterizado pelos peptídeos incluídos no depósito serem identificados conforme as seguintes etapas: aa. Realização de análise de expressão de ácido ribonucleico mensageiro (mRNA) em todo o genoma, empregando microarrays ou perfis de expressão baseados em sequenciamento, compreendendo a identificação de genes sobrexpressos em tecidos malignos em comparação com um ou mais tecidos normais; ab. Seleção dos peptídeos codificados pelos genes sobrexpressos ou expressos seletivamente detectados na etapa aa; e ac. Determinação das respostas de células T induzidas in vivo pelos peptídeos selecionados a partir de ensaios de imunogenicidade in vitro usando células T humanas de doadores saudáveis ou do referido paciente; ou ba. Identificação de ligantes de HLA da amostra tumoral por espectrometria de massa;

bb. Realização de análise de expressão de ácido ribonucleico mensageiro (mRNA) em todo o genoma, empregando microarrays ou perfis de expressão baseados em sequenciamento, compreendendo a identificação de genes sobrexpressos em tecidos malignos em comparação com um ou mais tecidos normais; bc. Comparação dos ligantes de HLA identificados com os referidos dados de expressão gênica; bd. Seleção de peptídeos codificados por genes sobrexpressos ou expressos seletivamente detectados na etapa bc; be. Nova detecção dos TUMAPs selecionados na etapa bd em tecidos tumorais e pouca ou nenhuma detecção em tecidos saudáveis e confirmação da relevância da sobrexpressão ao nível de mRNA; e bf. Determinação da indução de respostas de células T in vivo pelos peptídeos selecionados a partir de ensaios de imunogenicidade in vitro em células T humanas de doadores saudáveis ou do referido paciente.

28. MÉTODO de acordo com qualquer uma das reivindicações 23 a 27, caracterizado pela imunogenicidade dos peptídeos incluídos no depósito ser determinada por um método que compreende ensaios de imunogenicidade in vitro, monitoramento da imunidade do paciente para detecção de ligação a HLAs individuais, coloração para multímeros de MHC, ensaios ELISPOT e/ou coloração para citoquinas intracelulares.

29. MÉTODO de acordo com qualquer uma das reivindicações 23 a 28, caracterizado pelo referido depósito compreender uma pluralidade de peptídeos selecionados do grupo formado por SEQ No 1 a SEQ No 286 e SEQ No 289 a SEQ No 291.

30. MÉTODO de acordo com qualquer uma das reivindicações 23 a 29, caracterizado por compreender a identificação de pelo menos uma mutação exclusiva para a amostra tumoral em relação ao tecido normal correspondente de um paciente individual e seleção de um peptídeo que se correlaciona com a mutação para inclusão na vacina ou na criação de terapias celulares.

31. MÉTODO de acordo com a reivindicação 30, caracterizado por pelo menos uma mutação ser identificada por sequenciamento de genoma inteiro.

Frequência de detecção Apresentação relativa [unidades arbitrárias] Células sang. Figura 1A Vsang Cérebro Risco alto Peptídeo: Coração Fígado Pulmão Glsuprarr Ducto biliar Esôf. Ves. biliar Risco médio Rim Nervo perif. Pâncreas Pele Medula espin. Baço Estômago Tireoide Traqueia

LMA

CAM Apresentação de peptídeos 1 Petição 870210048608, de 28/05/2021, pág. 403/637 Câncer

CCC

LLC CaCR

CVB

GBM

CG

CHC

CCECP

MEL

LNH adenoCPCNP CPCNPoutro CPCNPescam

CO

CE outro

CP CPr

CCR

CPPC

CB

CAU

Frequência de detecção Apresentação relativa [unidades arbitrárias] Figura 1B Células sang. Vsang Cérebro Risco alto Peptídeo: Coração Fígado Pulmão Glsuprarr Ducto biliar Esôf. Risco médio Vesb Rim Nervo perif. Pâncreas Pele Med. espn. Baço Estômago Tireoide Traqueia

LMA

CAM 2 Apresentação de peptídeos Petição 870210048608, de 28/05/2021, pág. 404/637 Câncer

CCC

LLC CaCR

CVB

GBM

CG

CHC

CCECP

MEL

LNH adenoCPCNP CPCNPoutro CPCNPescam

CO

CE outro

CP CPr

CCR

CPPC

CB

CAU

Frequência de detecção Apresentação relativa [unidades arbitrárias] Figura 1C Células sang. Vsang Cérebro Peptídeo: Coração Risco alto Fígado Pulmão Glsuprarr Ducto biliar Esôf. Risco médio Vesb Rim Nervo perif. Pâncreas Pele Med. espin. Baço Estômago Tireoide Traqueia

LMA

CAM 3 Petição 870210048608, de 28/05/2021, pág. 405/637 Apresentação de peptídeos Câncer

CCC

LLC CaCR

CVB

GBM

CG

CJGE

CHC

CCECP

MEL

LNH adenoCPCNP CPCNPoutro CPCNPescam

CO

CE

CP CPr

CCR

CPPC

CB

CAU

Frequência de detecção Apresentação relativa [unidades arbitrárias] Figura 1D Células sang. Vsang Cérebro Peptídeo: Risco alto Coração Fígado Pulmão Glsuprarr Ducto biliar Esôf. Risco médio Vesb Rim Nervo perif. Pâncreas Pele Med. espin. Baço Estômago Tireoide Traqueia

LMA

CAM Apresentação de peptídeos 4 Petição 870210048608, de 28/05/2021, pág. 406/637 Câncer

CCC

LLC CaCR

CVB

GBM

CG

CJGE

CHC

CCECP

MEL

LNH adenoCPCNP CPCNPoutro CPCNPescam

CO

CE

CP CPr

CCR

CPPC

CB

CAU

Frequência de detecção Apresentação relativa [unidades arbitrárias] Células sang. Figura 1E Vsang Cérebro Risco alto Peptídeo: Coração Fígado Pulmão Glsuprarr Ducto biliar Esôf. Vesb Risco médio Rim Nervo perif. Pâncreas Pele Medula espin. Baço Estômago Tireoide Traqueia

LMA

CAM 5 Apresentação de peptídeos Petição 870210048608, de 28/05/2021, pág. 407/637 Câncer

CCC

LLC CaCR

CVB

GBM

CG

CJGE

CHC

CCECP

MEL

LNH adenoCPCNP CPCNPoutro CPCNPescam

CO

CE

CP CPr

CCR

CPPC

CB

CAU

Frequência de detecção Apresentação relativa [unidades arbitrárias] Células sang. Figura 1F Vsang Cérebro Risco alto Peptídeo: Coração Fígado Pulmão Glsuprarr Ducto biliar Esôf. Risco médio Vesb Rim Nervo perif. Pâncreas Pele Med. espin. Baço Estômago Tireoide Traqueia

LMA Apresentação de peptídeos

CAM 6 Petição 870210048608, de 28/05/2021, pág. 408/637 Câncer

CCC

LLC CaCR

CVB

GBM

CG

CHC

CCECP

MEL

LNH adenoCPCNP CPCNPoutro CPCNPescam

CO

CE outro

CP CPr

CCR

CPPC

CB

CAU

Frequência de detecção Apresentação relativa [unidades arbitrárias] Células sang. Figura 1G Vsang Cérebro Risco alto Peptídeo: Coração Fígado Pulmão Glsuprarr Ducto biliar Esôf. Vesb Risco médio Rim Nervo perif. Pâncreas Pele Medula espin. Baço Estômago Tireoide Traqueia

LMA

CAM 7 Petição 870210048608, de 28/05/2021, pág. 409/637 Apresentação de peptídeos Câncer

CCC

LLC CaCR

CVB

GBM

CG

CJGE

CHC

CCECP

MEL

LNH adenoCPCNP CPCNPoutro CPCNPescam

CO

CE

CP CPr

CCR

CPPC

CB

CAU

Frequência de detecção Apresentação relativa [unidades arbitrárias] Células sang- Figura 1H Vsang Cérebro Coração Risco alto Peptídeo: Fígado Pulmão Medula Glsuprarr Ducto biliar Bexiga Medula óssea Risco médio Esôf. Vesb Cabeça&pesc. Int. grosso Int. delgado Rim Linfonodo Nervo perif. Pâncreas Hipóf. Pele Baço Estômago Tireoide 8 Apresentação de peptídeos Petição 870210048608, de 28/05/2021, pág. 410/637 Traqueia Mama baixo Risco Placenta Útero

LMA

CAM Câncer

CCC

LLC CaCR

CVB

GBM

CG

CJGE

CHC

CCECP

MEL

LNH adenoCPCNP CPCNPoutro CPCNPescam

CO

CE

CP CPr

CCR

CPPC

CB

CAU

Frequência de detecção Apresentação relativa [unidades arbitrárias] Figura 1I Células sang. Vsang Cérebro Coração Risco alto Peptídeo: Fígado Pulmão Medula Glsuprarr Ducto biliar Bexiga Medula óssea Risco médio Esôf. Vesb Cabeça&pesc. Int. grosso Int. delgado Rim Linfonodo Nervo perif. Pâncreas Hipóf. Pele Baço Estômago Tireoide 9 Petição 870210048608, de 28/05/2021, pág. 411/637 Traqueia Apresentação de peptídeos Mama Placenta Útero Risco baixo

LMA

CAM

CCC Câncer

LLC CaCR

CVB

GBM

CG

CJGE

CHC

CCECP

MEL

LNH adenoCPCNP CPCNPoutro CPCNPescam

CO

CE

CP CPr

CCR

CPPC

CB

CAU

Frequência de detecção Apresentação relativa [unidades arbitrárias] Células sang. Figura 1J Vsang Cérebro Coração Risco alto Peptídeo: Fígado Pulmão Medula Glsuprarr Ducto biliar Bexiga Medula óssea Risco médio Esôf. Vesb Cabeça&pesc. Int. grosso Int. delgado Rim Linfonodo Nervo perif. Pâncreas Hipóf. Pele Baço Estômago Tireoide Apresentação de peptídeos Traqueia 10 Petição 870210048608, de 28/05/2021, pág. 412/637 Mama Placenta Útero

LMA

CAM

CCC Risco baixo Câncer

LLC CaCR

CVB

GBM

CG

CJGE

CHC

CCECP

MEL

LNH adenoCPCNP CPCNPoutro CPCNPescam

CO

CE

CP CPr

CCR

CPPC

CB

CAU

Frequência de detecção Apresentação relativa [unidades arbitrárias] Células sang. Figura 1K Vsang Cérebro Coração Risco alto Peptídeo: Fígado Pulmão Medula Glsuprarr Ducto biliar Bexiga Medula óssea Risco médio Esôf. Vesb Cabeça&pesc. Int. grosso Int. delgado Rim Linfonodo Nervo perif. Pâncreas Hipóf. Pele Baço Estômago Tireoide Traqueia Apresentação de peptídeos 11 Petição 870210048608, de 28/05/2021, pág. 413/637 Mama Placenta Útero

LMA

CAM

CCC Risco baixo Câncer

LLC CaCR

CVB

GBM

CG

CJGE

CHC

CCECP

MEL

LNH adenoCPCNP CPCNPoutro CPCNPescam

CO

CE

CP CPr

CCR

CPPC

CB

CAU

Frequência de detecção Apresentação relativa [unidades arbitrárias] Células sang. Figura 1L Vsang Cérebro Coração Risco alto Peptídeo: Fígado Pulmão Medula Glsuprarr Ducto biliar Bexiga Medula óssea Risco médio Esôf. Vesb Cabeça&pesc. Int. grosso Int. delgado Rim Linfonodo Nervo perif. Pâncreas Hipóf. Pele Baço Estômago Tireoide Traqueia Apresentação de peptídeos Mama 12 Petição 870210048608, de 28/05/2021, pág. 414/637 Placenta Risco baixo Útero

LMA

CAM

CCC Câncer

LLC CaCR

CVB

GBM

CG

CJGE

CHC

CCECP

MEL

LNH adenoCPCNP CPCNPoutro CPCNPescam

CO

CE

CP CPr

CCR

CPPC

CB

CAU

Frequência de detecção Apresentação relativa [unidades arbitrárias] Células sang. Figura 1M Vsang Cérebro Coração Risco alto Fígado Peptídeo: Pulmão Medula Adiposo Glsuprarr Ducto biliar Bexiga Medula óssea Risco médio Esôf. Olho Vesb Cabeça&pescoço Int. grosso Int. delgado Rim Linfonodo Nervo centr. Nervo perif. Pâncreas Paratir. Perit. Hipóf. Pleura Mús. esquel. Pele Baço Estômago Tireoide 13 Petição 870210048608, de 28/05/2021, pág. 415/637 Traqueia Ureter Mama Ovário Placenta Próstata Testículo Risco baixo Timo Útero

LMA

CAM

CCC Câncer

LLC CaCR

CVB

GBM

CG

CJGE

CHC

CCECP

MEL

LNH adenoCPCNP CPCNPoutro CPCNPescam

CO

CE

CP CPr

CCR

CPPC

CB

CAU

Frequência de detecção Apresentação relativa [unidades arbitrárias] Células sang. Figura 1N Vsang Cérebro Coração Risco alto Peptídeo: Fígado Pulmão Medula Adiposo Glsuprarr Ducto biliar Bexiga Medula óssea Risco médio Esôf. Olho Vesb Cabeça&pescoço Int. grosso Int. delgado Rim Linfonodo Nervo centr. Nervo perif. Pâncreas Paratir. Perit. Hipóf. Pleura Mús. esquel. Pele Baço Estômago 14 Tireoide Petição 870210048608, de 28/05/2021, pág. 416/637 Traqueia Ureter Mama Ovário Placenta Próstata Testículo Risco baixo Útero

LMA

CAM

CCC Câncer

LLC CaCR

CVB

GBM

CG

CJGE

CHC

CCECP

MEL

LNH adenoCPCNP CPCNPoutro CPCNPescam

CO

CE

CP CPr

CCR

CPPC

CB

CAU

Frequência de detecção Apresentação relativa [unidades arbitrárias] Células sang. Figura 1O Vsang Cérebro Coração Risco alto Fígado Peptídeo: Pulmão Medula Adiposo Glsuprarr Ducto biliar Bexiga Medula óssea Risco médio Esôf. Olho Vesb Cabeça&pescoço Int. grosso Int. delgado Rim Linfonodo Nervo centr. Nervo perif. Pâncreas Paratir. Perit. Hipóf. Pleura Mús. esquel. Pele Baço Estômago Tireoide 15 Petição 870210048608, de 28/05/2021, pág. 417/637 Traqueia Ureter Mama Ovário Placenta Próstata Testículo Risco baixo Timo Útero

LMA

CAM

CCC Câncer

LLC CaCR

CVB

GBM

CG

CJGE

CHC

CCECP

MEL

LNH adenoCPCNP CPCNPoutro CPCNPescam

CO

CE

CP CPr

CCR

CPPC

CB

CAU

FPKM relativo do éxon Células sang. Vsang Figura 2A Cérebro Coração Risco alto Fígado Pulmão Adiposo Gene: Glsuprarr Peptídeo: Ducto biliar Bexiga Medula óssea Risco médio Esôf. Olho Vesb Cabeça&pescoço Int. grosso Int. delgado Rim Linfonodo Nervo perif. Pâncreas Paratir. Perit. Hipóf. Pleura Mús. esquel. Pele Medula espinhal Baço Estômago Tireoide Traqueia 16 Ureter Petição 870210048608, de 28/05/2021, pág. 418/637 Mama Ovário Placenta Próstata Testículo Risco baixo Timo Útero

LMA

CAM

CCC Câncer

LLC CaCR

CVB

GBM

CG

CHC

CCECP

MEL

LNH adenoCPCNP CPCNPoutro CPCNPescam

CO

CE outro

CP CPr

CCR

CPPC

CB

CAU

FPKM relativo do éxon Células sang. Vsang Figura 2B Cérebro Coração Risco alto Fígado Pulmão Adiposo Gene: Glsuprarr Peptídeo: Ducto biliar Bexiga Medula óssea Risco médio Esôf. Olho Vesb Cabeça&pescoço Int. grosso Int. delgado Rim Linfonodo Nervo perif. Pâncreas Paratir. Perit. Hipóf. Pleura Mús. esquel. Pele Medula espinhal Baço Estômago Tireoide Traqueia 17 Petição 870210048608, de 28/05/2021, pág. 419/637 Ureter Mama Ovário Placenta Próstata Testículo Risco baixo Timo Útero

LMA

CAM

CCC Câncer

LLC CaCR

CVB

GBM

CG

CHC

CCECP

MEL

LNH adenoCPCNP CPCNPoutro CPCNPescam

CO

CE outro

CP CPr

CCR

CPPC

CB

CAU

FPKM relativo do éxon Células sang. Vsang Cérebro Figura 2C Coração Risco alto Fígado Pulmão Adiposo Gene: Glsuprarr Peptídeo: Ducto biliar Bexiga Medula óssea Risco médio Esôf. Olho Vesb Cabeça&pescoço Int. grosso Int. delgado Rim Linfonodo Nervo perif. Pâncreas Paratir. Perit. Hipóf. Pleura Mús. esquel. Pele Medula espinhal Baço Estômago Tireoide Traqueia Ureter 18 Petição 870210048608, de 28/05/2021, pág. 420/637 Mama Ovário Placenta Próstata Testículo Risco baixo Timo Útero

LMA

CAM

CCC Câncer

LLC CaCR

CVB

GBM

CG

CHC

CCECP

MEL

LNH adenoCPCNP CPCNPoutro CPCNPescam

CO

CE outro

CP CPr

CCR

CPPC

CB

CAU

FPKM relativo do éxon Células sang. Vsang Figura 2D Cérebro Coração Risco alto Fígado Pulmão Gene: Adiposo Glsuprarr Peptídeo: Ducto biliar Bexiga Medula óssea Risco médio Esôf. Olho Vesb Cabeça&pescoço Int. grosso Int. delgado Rim Linfonodo Nervo perif. Pâncreas Paratir. Perit. Hipóf. Pleura Mús. esquel. Pele Medula espinhal Baço Estômago Tireoide Traqueia 19 Petição 870210048608, de 28/05/2021, pág. 421/637 Ureter Mama Ovário Placenta Próstata Testículo Risco baixo Timo Útero

LMA

CAM

CCC Câncer

LLC CaCR

CVB

GBM

CG

CHC

CCECP

MEL

LNH adenoCPCNP CPCNPoutro CPCNPescam

CO

CE outro

CP CPr

CCR

CPPC

CB

CAU

FPKM relativo do éxon Células sang. Vsang Figura 2E Cérebro Coração Risco alto Fígado Pulmão Adiposo Gene: Glsuprarr Peptídeo: Ducto biliar Bexiga Medula óssea Risco médio Esôf. Olho Vesb Cabeça&pescoço Int. grosso Int. delgado Rim Linfonodo Nervo perif. Pâncreas Paratir. Perit. Hipóf. Pleura Mús. esquel. Pele Medula espinhal Baço Estômago Tireoide Traqueia 20 Petição 870210048608, de 28/05/2021, pág. 422/637 Ureter Mama Ovário Placenta Próstata Testículo Risco baixo Timo Útero

LMA

CAM

CCC Câncer

LLC CaCR

CVB

GBM

CG

CHC

CCECP

MEL

LNH adenoCPCNP CPCNPoutro CPCNPescam

CO

CE outro

CP CPr

CCR

CPPC

CB

CAU

FPKM relativo do éxon Células sang. Vsang Figura 2F Cérebro Coração Risco alto Fígado Pulmão Adiposo Gene: Glsuprarr Peptídeo: Ducto biliar Bexiga Medula óssea Risco médio Esôf. Olho Vesb Cabeça&pescoço Int. grosso Int. delgado Rim Linfonodo Nervo perif. Pâncreas Paratir. Perit. Hipóf. Pleura Mús. esquel. Pele Medula espinhal Baço Estômago Tireoide Traqueia 21 Petição 870210048608, de 28/05/2021, pág. 423/637 Ureter Mama Ovário Placenta Próstata Testículo Risco baixo Timo Útero

LMA

CAM

CCC Câncer

LLC CaCR

CVB

GBM

CG

CHC

CCECP

MEL

LNH adenoCPCNP CPCNPoutro CPCNPescam

CO

CE outro

CP CPr

CCR

CPPC

CB

CAU

FPKM relativo do éxon Células sang. Figura 2G vsang Cérebro Coração Risco alto Fígado Pulmão Gene: Adiposo Glsuprarr Peptídeo: Ducto biliar Bexiga Medula óssea Risco médio Esôf. Olho Vesb Cabeça&pescoço Int. grosso Int. delgado Rim Linfonodo Nervo perif. Pâncreas Paratir. Perit. Hipóf. Pleura Mús. esquel. Pele Medula espinhal Baço Estômago Tireoide 22 Petição 870210048608, de 28/05/2021, pág. 424/637 Traqueia Ureter Mama Ovário Placenta Próstata Testículo Risco baixo Timo Útero

LMA

CAM

CCC Câncer

LLC CaCR

CVB

GBM

CG

CHC

CCECP

MEL

LNH adenoCPCNP CPCNPoutro CPCNPescam

CO

CE outro

CP CPr

CCR

CPPC

CB

CAU

FPKM relativo do éxon Células sang. Vsang Figura 2H Cérebro Coração Risco alto Fígado Pulmão Gene: Adiposo Glsuprarr Peptídeo: Ducto biliar Bexiga Medula óssea Risco médio Esôf. Olho Vesb Cabeça&pescoço Int. grosso Int. delgado Rim Linfonodo Nervo perif. Pâncreas Paratir. Perit. Hipóf. Pleura Mús. esquel. Pele Medula espinhal Baço Estômago Tireoide Traqueia Ureter 23 Petição 870210048608, de 28/05/2021, pág. 425/637 Mama Ovário Placenta Próstata Testículo Risco baixo Timo Útero

LMA

CAM

CCC Câncer

LLC CaCR

CVB

GBM

CG

CHC

CCECP

MEL

LNH adenoCPCNP CPCNPoutro CPCNPescam

CO

CE outro

CP CPr

CCR

CPPC

CB

CAU

FPKM relativo do éxon Figura 2I Células sang. Vsang Cérebro Coração Risco alto Fígado Pulmão Adiposo Gene: Glsuprarr Ducto Peptídeo: biliar Bexiga Medula óssea Risco médio Esôf. Olho Vesb Cabeça&pescoço Int. grosso Int. delgado Rim Linfonodo Nervo perif. Pâncreas Paratir. Perit. Hipóf. Pleura Mús. esquel. Pele Medula espinhal Baço Estômago Tireoide Traqueia 24 Petição 870210048608, de 28/05/2021, pág. 426/637 Ureter Mama Ovário Placenta Próstata Testículo Risco baixo Timo Útero

LMA

CAM

CCC Câncer

LLC CaCR

CVB

GBM

CG

CHC

CCECP

MEL

LNH adenoCPCNP CPCNPoutro CPCNPescam

CO

CE outro

CP CPr

CCR

CPPC

CB

CAU

FPKM relativo do éxon Células sang. Vsang Figura 2J Cérebro Coração Risco alto Fígado Pulmão Medula espinhal Gene: Adiposo Peptídeo: Glsuprarr Ducto biliar Bexiga Medula óssea Risco médio Esôf. Olho Vesb Cabeça&pescoço Int. grosso Int. delgado Rim Linfonodo Nervo perif. Pâncreas Paratir. Perit. Hipóf. Pleura Mús. esquel. Pele Baço Estômago Tireoide Traqueia Ureter Mama 25 Petição 870210048608, de 28/05/2021, pág. 427/637 Ovário Placenta Próstata Testículo Risco baixo Timo Útero

LMA

CAM

CCC Câncer

LLC CaCR

CVB

GBM

CG

CHC

CCECP

MEL

LNH adenoCPCNP CPCNPoutro CPCNPescam

CO

CE

CP CPr

CCR

CPPC

CB

CAU

FPKM relativo do éxon Células sang. Figura 2K Vsang Cérebro Coração Risco alto Fígado Pulmão Medula espinhal Gene: Adiposo Peptídeo: Glsuprarr Ducto biliar Bexiga Medula óssea Risco médio Esôf. Olho Vesb Cabeça&pescoço Int. grosso Int. delgado Rim Linfonodo Nervo perif. Pâncreas Paratir. Perit. Hipóf. Pleura Mús. esquel. Pele Baço Estômago Tireoide Traqueia Ureter Mama Ovário 26 Petição 870210048608, de 28/05/2021, pág. 428/637 Placenta Próstata Testículo Risco baixo Timo Útero

LMA

CAM

CCC Câncer

LLC CaCR

CVB

GBM

CG

CHC

CCECP

MEL

LNH adenoCPCNP CPCNPoutro CPCNPescam

CO

CE

CP CPr

CCR

CPPC

CB

CAU

FPKM relativo do éxon Células sang. Vsang Cérebro Figura 2L Coração Risco alto Fígado Pulmão Medula espinhal Gene: Adiposo Peptídeo: Glsuprarr Ducto biliar Bexiga Medula óssea Risco médio Esôf. Olho Vesb Cabeça&pescoço Int. grosso Int. delgado Rim Linfonodo Nervo perif. Pâncreas Paratir. Perit. Hipóf. Pleura Mús. esquel. Pele Baço Estômago Tireoide Traqueia Ureter Mama Ovário 27 Petição 870210048608, de 28/05/2021, pág. 429/637 Placenta Próstata Testículo Risco baixo Timo Útero

LMA

CAM

CCC Câncer

LLC CaCR

CVB

GBM

CG

CHC

CCECP

MEL

LNH adenoCPCNP CPCNPoutro CPCNPescam

CO

CE

CP CPr

CCR

CPPC

CB

CAU

FPKM relativo do éxon Células sang. Vsang Figura 2M Cérebro Coração Risco alto Fígado Pulmão Gene: Medula espinhal Adiposo Peptídeo: Glsuprarr Ducto biliar Bexiga Medula óssea Risco médio Esôf. Olho Vesb Cabeça&pescoço Int. grosso Int. delgado Rim Linfonodo Nervo perif. Pâncreas Paratir. Perit. Hipóf. Pleura Mús. esquel. Pele Baço Estômago Tireoide Traqueia Ureter Mama 28 Petição 870210048608, de 28/05/2021, pág. 430/637 Ovário Placenta Próstata Testículo Risco baixo Timo Útero

LMA

CAM

CCC Câncer

LLC CaCR

CVB

GBM

CG

CJGE

CHC

CCECP

MEL

LNH adenoCPCNP CPCNPoutro CPCNPescam

CO

CE

CP CPr

CCR

CPPC

CB

CAU

FPKM relativo do éxon Células sang. Vsang Cérebro Figura 2N Coração Risco alto Fígado Pulmão Medula espinhal Gene: Adiposo Peptídeo: Glsuprarr Ducto biliar Bexiga Medula óssea Risco médio Esôf. Olho Vesb Cabeça&pescoço Int. grosso Int. delgado Rim Linfonodo Nervo perif. Pâncreas Paratir. Perit. Hipóf. Pleura Mús. esquel. Pele Baço Estômago Tireoide Traqueia Ureter Mama 29 Petição 870210048608, de 28/05/2021, pág. 431/637 Ovário Placenta Próstata Testículo Risco baixo Timo Útero

LMA

CAM

CCC Câncer

LLC CaCR

CVB

GBM

CG

CJGE

CHC

CCECP

MEL

LNH adenoCPCNP CPCNPoutro CPCNPescam

CO

CE

CP CPr

CCR

CPPC

CB

CAU

FPKM relativo do éxon Células sang. Vsang Figure 2O Cérebro Coração Risco alto Fígado Pulmão Gene: Medula espinhal Adiposo Peptídeo: Glsuprarr Ducto biliar Bexiga Medula óssea Risco médio Esôf. Olho Vesb Cabeça&pescoço Int. grosso Int. delgado Rim Linfonodo Nervo perif. Pâncreas Paratir. Perit. Hipóf. Pleura Mús. esquel. Pele Baço Estômago Tireoide Traqueia Ureter Mama 30 Ovário Petição 870210048608, de 28/05/2021, pág. 432/637 Placenta Próstata Testículo Risco baixo Timo Útero

LMA

CAM

CCC Câncer

LLC CaCR

CVB

GBM

CG

CJGE

CHC

CCECP

MEL

LNH adenoCPCNP CPCNPoutro CPCNPescam

CO

CE

CP CPr

CCR

CPPC

CB

CAU

FPKM relativo do éxon Células sang. Vsang Figura 2P Cérebro Risco alto Coração Fígado Pulmão Medula espinhal Gene: Adiposo Peptídeo: Glsuprarr Ducto biliar Bexiga Medula óssea Risco médio Esôf. Olho Vesb Cabeça&pescoço Int. grosso Int. delgado Rim Linfonodo Nervo perif. Pâncreas Paratir. Perit. Hipóf. Pleura Mús. esquel. Pele Baço Estômago Tireoide Traqueia Ureter 31 Mama Petição 870210048608, de 28/05/2021, pág. 433/637 Ovário Placenta Próstata Testículo Risco baixo Timo Útero

LMA

CAM

CCC Câncer

LLC CaCR

CVB

GBM

CG

CJGE

CHC

CCECP

MEL

LNH adenoCPCNP CPCNPoutro CPCNPescam

CO

CE

CP CPr

CCR

CPPC

CB

CAU

FPKM relativo do éxon Células sang. Vsang Figura 2Q Cérebro Coração Risco alto Fígado Pulmão Medula espinhal Gene: Adiposo Peptídeo: Glsuprarr Ducto biliar Bexiga Medula óssea Risco médio Esôf. Olho Vesb Cabeça&pescoço Int. grosso Int. delgado Rim Linfonodo Nervo perif. Pâncreas Paratir. Perit. Hipóf. Pleura Mús. esquel. Pele Baço Estômago Tireoide Traqueia Ureter Mama 32 Petição 870210048608, de 28/05/2021, pág. 434/637 Ovário Placenta Próstata Testículo Risco baixo Timo Útero

LMA

CAM

CCC Câncer

LLC CaCR

CVB

GBM

CG

CJGE

CHC

CCECP

MEL

LNH adenoCPCNP CPCNPoutro CPCNPescam

CO

CE

CP CPr

CCR

CPPC

CB

CAU

FPKM relativo do éxon Células sang. Vsang Cérebro Figura 2R Coração Risco alto Fígado Pulmão Gene: Medula espinhal Adiposo Peptídeo: Glsuprarr Ducto biliar Bexiga Medula óssea Risco médio Esôf. Olho Vesb Cabeça&pescoço Int. grosso Int. delgado Rim Linfonodo Nervo perif. Pâncreas Paratir. Perit. Hipóf. Pleura Mús. esquel. Pele Baço Estômago Tireoide Traqueia Ureter Mama Ovário 33 Petição 870210048608, de 28/05/2021, pág. 435/637 Placenta Próstata Testículo Risco baixo Timo Útero

LMA

CAM

CCC Câncer

LLC CaCR

CVB

GBM

CG

CJGE

CHC

CCECP

MEL

LNH adenoCPCNP CPCNPoutro CPCNPescam

CO

CE

CP CPr

CCR

CPPC

CB

CAU

FPKM relativo do éxon Células sang. Vsang Figura 2S Cérebro Coração Risco alto Fígado Pulmão Medula espinhal Gene: Adiposo Peptídeo: Glsuprarr Ducto biliar Bexiga Medula óssea Risco médio Esôf. Olho Vesb Cabeça&pescoço Int. grosso Int. delgado Rim Linfonodo Nervo perif. Pâncreas Paratir. Perit. Hipóf. Pleura Mús. esquel. Pele Baço Estômago Tireoide Traqueia Ureter Mama Ovário 34 Petição 870210048608, de 28/05/2021, pág. 436/637 Placenta Próstata Testículo Risco baixo Timo Útero

LMA

CAM

CCC Câncer

LLC CaCR

CVB

GBM

CG

CJGE

CHC

CCECP

MEL

LNH adenoCPCNP CPCNPoutro CPCNPescam

CO

CE

CP CPr

CCR

CPPC

CB

CAU

FPKM relativo do éxon Células sang. Vsang Figura 2T Cérebro Coração Risco alto Fígado Pulmão Medula espinhal Gene: Adiposo Peptídeo: Glsuprarr Ducto biliar Bexiga Medula óssea Risco médio Esôf. Olho Vesb Cabeça&pescoço Int. grosso Int. delgado Rim Linfonodo Nervo perif. Pâncreas Paratir. Perit. Hipóf. Pleura Mús. esquel. Pele Baço Estômago Tireoide Traqueia Ureter Mama Ovário 35 Petição 870210048608, de 28/05/2021, pág. 437/637 Placenta Próstata Testículo Risco baixo Timo Útero

LMA

CAM

CCC Câncer

LLC CaCR

CVB

GBM

CG

CJGE

CHC

CCECP

MEL

LNH adenoCPCNP CPCNPoutro CPCNPescam

CO

CE

CP CPr

CCR

CPPC

CB

CAU

FPKM relativo do éxon Células sang. Vsang Cérebro Figura 2U Coração Risco alto Fígado Pulmão Medula espinhal Gene: Adiposo Peptídeo: Glsuprarr Ducto biliar Bexiga Medula óssea Risco médio Esôf. Olho Vesb Cabeça&pescoço Int. grosso Int. delgado Rim Linfonodo Nervo perif. Pâncreas Paratir. Perit. Hipóf. Pleura Mús. esquel. Pele Baço Estômago Tireoide Traqueia Ureter Mama 36 Petição 870210048608, de 28/05/2021, pág. 438/637 Ovário Placenta Próstata Testículo Risco baixo Timo Útero

LMA

CAM

CCC Câncer

LLC CaCR

CVB

GBM

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CJGE

CHC

CCECP

MEL

LNH adenoCPCNP CPCNPoutro CPCNPescam

CO

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CP CPr

CCR

CPPC

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CAU

FPKM relativo do éxon Células sang. Vsang Cérebro Figura 2V Coração Risco alto Fígado Pulmão Medula espinhal Gene: Adiposo Peptídeo: Glsuprarr Ducto biliar Bexiga Medula óssea Risco médio Esôf. Olho Vesb Cabeça&pescoço Int. grosso Int. delgado Rim Linfonodo Nervo perif. Pâncreas Paratir. Perit. Hipóf. Pleura Mús. esquel. Pele Baço Estômago Tireoide Traqueia Ureter Mama 37 Petição 870210048608, de 28/05/2021, pág. 439/637 Ovário Placenta Próstata Testículo Risco baixo Timo Útero

LMA

CAM

CCC Câncer

LLC CaCR

CVB

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CCECP

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LNH adenoCPCNP CPCNPoutro CPCNPescam

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CP CPr

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CAU

FPKM relativo do éxon Células sang. Vsang Figura 2W Cérebro Coração Risco alto Fígado Pulmão Gene: Medula espinhal Adiposo Peptídeo: Glsuprarr Ducto biliar Bexiga Medula óssea Risco médio Esôf. Olho Vesb Cabeça&pescoço Int. grosso Int. delgado Rim Linfonodo Nervo perif. Pâncreas Paratir. Perit. Hipóf. Pleura Mús. esquel. Pele Baço Estômago Tireoide Traqueia Ureter 38 Petição 870210048608, de 28/05/2021, pág. 440/637 Mama Ovário Placenta Próstata Testículo Risco baixo Timo Útero

LMA

CAM

CCC Câncer

LLC CaCR

CVB

GBM

CG

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CHC

CCECP

MEL

LNH adenoCPCNP CPCNPoutro CPCNPescam

CO

CE

CP CPr

CCR

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CB

CAU

FPKM relativo do éxon Células sang. Vsang Figura 2X Cérebro Coração Risco alto Fígado Gene: Pulmão Medula espinhal Peptídeo: Adiposo Glsuprarr Ducto biliar Bexiga Medula óssea Risco médio Esôf. Olho Vesb Cabeça&pescoço Int. grosso Int. delgado Rim Linfonodo Nervo perif. Pâncreas Paratir. Perit. Hipóf. Pleura Mús. esquel. Pele Baço Estômago Tireoide Traqueia Ureter 39 Mama Petição 870210048608, de 28/05/2021, pág. 441/637 Ovário Placenta Próstata Testículo Risco baixo Timo Útero

LMA

CAM

CCC Câncer

LLC CaCR

CVB

GBM

CG

CJGE

CHC

CCECP

MEL

LNH adenoCPCNP CPCNPoutro CPCNPescam

CO

CE

CP CPr

CCR

CPPC

CB

CAU

FPKM relativo do éxon Células sang. Vsang Cérebro Figura 2Y Coração Risco alto Fígado Pulmão Medula espinhal Gene: Adiposo Peptídeo: Glsuprarr Ducto biliar Bexiga Medula óssea Risco médio Esôf. Olho Vesb Cabeça&pescoço Int. grosso Int. delgado Rim Linfonodo Nervo perif. Pâncreas Paratir. Perit. Hipóf. Pleura Mús. esquel. Pele Baço Estômago Tireoide Traqueia Ureter 40 Petição 870210048608, de 28/05/2021, pág. 442/637 Mama Ovário Placenta Próstata Testículo Risco baixo Timo Útero

LMA

CAM

CCC Câncer

LLC CaCR

CVB

GBM

CG

CJGE

CHC

CCECP

MEL

LNH adenoCPCNP CPCNPoutro CPCNPescam

CO

CE

CP CPr

CCR

CPPC

CB

CAU

Figura 3

Estimulação Estimulação controle negativo 28,76% 0,05%

Estimulação Estimulação controle negativo 2,68% 0,01%

Figura 3 (continuação)

Estimulação Estimulação controle negativo 1,11% 0,00%

Estimulação Estimulação controle negativo 8,10% 0,06%

Figura 3 (continuação)

Estimulação Estimulação controle negativo 3,21% 0,09%

Estimulação Estimulação controle negativo

7,91% 0,01%

Figura 3 (continuação)

Estimulação Estimulação controle negativo 5,33% 0,07%