JP2003512814A - ＭＡＧＥ５、８、９および１１のｃＤＮＡのクローニングならびに癌の診断におけるそれらの使用 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 本発明は遺伝子発現レベルを容易にするべく開発された方法によって単離、同定されたcDNA分子に関する。これらのcDNA分子に基づくタンパク質およびペプチドならびにこれらの物質の様々な診断的および治療的使用法についても記載する。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】 （関連出願） 本願は、1999年3 月2 日に出願され参照により本明細書に組み込まれる米国特
許出願第09/260,978号の一部継続出願である。

【０００２】 （発明の属する技術分野） 本発明は、MAGEファミリーのメンバーである核酸分子、それらの使用およびそ
れらの発現を決定し定量する方法に関する。また、上記核酸分子の断片、核酸分
子全体がコードするタンパク質、核酸分子の断片がコードするタンパク質の両方
、それらに基づくペプチドであってMHC またはHLA 分子と複合体を形成するもの
、融合タンパク質、ポリトープ（polytope）なども本発明の一部である。

【０００３】 （発明の背景と従来技術） ヒト白血球抗原（「HLA 」）と複合体を形成して自己由来細胞傷害性T 細胞に
よる応答を誘発する腫瘍拒絶抗原のファミリーが存在することは、Van der Brug
gen ら，Science 254 ：1643-1647 （1991）によって明らかにされた。上記Van
der Bruggen らの文献に加えて、参照により本明細書に組み込まれるBoonらの米
国特許第5,342,774 号も参照されたい。これらの文献には、これらの腫瘍拒絶抗
原にプロセシングされるタンパク質をコードする遺伝子の単離も記載されている
。さらなる研究により極近縁の遺伝子が12種類発見されている。これらの遺伝子
はX 染色体のq28 領域に位置することがわかっている。これらの遺伝子は当初MA
GE-1〜MAGE-12 と名付けられたが、その後の発見を考慮して現在ではMAGE-A1 〜
MAGE-A12と呼ばれている。詳しく述べると、さらに4 つの近縁遺伝子がX 染色体
のp21 領域に見出され、MAGE-B遺伝子クラスターと呼ばれている。さらにq26 領
域にも別のMAGEファミリーメンバーが見出され、MAGE-C1 およびMAGE-C2 と名付
けられている。

【０００４】 当然の理由から、過去も現在も、MAGE遺伝子の発現を解析することが望まれて
いる。この領域では広範な研究が行われており、MAGE-Aの発現パターンは逆転写
- ポリメラーゼ連鎖反応（「RT-PCR」）により様々な腫瘍試料、腫瘍細胞株およ
び正常組織で解析されている。基本的に転写と発現のレベルはRT-PCRによって半
定量的に確定される。これには、アガロースゲル上のバンドの強度を評価し、そ
れらを基準または対照から得られる物質の標準希釈液と比較することが伴なう。
この研究により、MAGE-A1 、A2、A3、A4、A6およびA12 遺伝子が多くの腫瘍で高
レベルに転写されることが確認された。MAGE-A8 遺伝子は1 つの腫瘍で高レベル
に発現し、MAGE-A5 、A9、A10 およびA11 は陽性腫瘍で弱く転写されるようだっ
た。どのMAGE-A遺伝子も、精巣と数例での胎盤とを除いて、正常組織で発現する
例は見出されなかった。Brasseurら，Int ．J ．Cancer 52 ：839-841 （1992）
、Brasseurら，Int ．J ．Canc 63 ：375-380 （1995）、De Plaenら，Immunoge
netics 40 ：360-369 （1994）、van der Bruggen ら（前掲）、Weynantsら，In
t ．J ．Canc 56 ：826-829 （1994）を参照されたい。精巣でのMAGE-A遺伝子の
発現は精子形成初期の生殖系列細胞に限られていた。Takahashi ら，Canc．Res
．55：3478-3482 （1995）を参照されたい。精巣ではMAGE-A7 を除く全てのMAGE
-A遺伝子が発現する。MAGE-A4 、A8、A9、A10 およびA11 は胎盤で転写されるこ
とが見出されている。

【０００５】 CTL がTRA とHLA の複合体を認識するには関連するMAGE-A遺伝子の発現が一定
レベルに達する必要があるらしい。DePlaen ら，Methods 12：125-142 （1997）
およびLethe ら，Melanoma Res 7：Suppl 2 ：S83-8 （1997）は、HLA-A1によっ
て提示されるMAGE-A1 ペプチドの認識を観察するには、MAGE-A1 の発現レベルが
基準細胞株MZ2-MEL に見出されるレベルの10％を越えなければならないことを示
している。MAGE-A2 、A3、A4、A6およびA12 遺伝子の発現レベルはMAGE-A1 と似
ていることが半定量的RT-PCRによって示され、これらの遺伝子は、提示されてCT
L に認識されるTRA にプロセシングされうることが示唆された。実際、MAGE-A1
とA3から得られるいくつかのペプチドはHLA によって提示され、次いでリンパ球
- 腫瘍細胞混合培養から得られる自己由来CTL によって認識されることが見出さ
れている。

【０００６】 最近、MAGE-A1 と反応するモノクローナル抗体がメラノーマ中で発現される別
のタンパク質と交差反応すると報告された。特許された米国特許出願第08/724,7
74号（1996年10月3 日出願）とCarrelら，Int ．J ．Canc 67 ：417-422 （1996
）を参照されたい（これらは共に参照により本明細書に組み込まれるものとする
）。その後、この交差反応性タンパク質はMAGE-A10によってコードされることが
わかった。MZ2-MEL では、このタンパク質の存在量はMAGE-A1 タンパク質の存在
量と同程度だった。これらは予想外の結果だった。なぜならRT-PCRによってMZ2-
MEL に見出されていたMAGE-A10の発現レベルは極めて低かったからである。この
ことから、当該RT-PCRでMAGE-A10を増幅するために使用されたプライマーの効率
があまり良くないことが示唆された。そこで、プライマーによる狂いに左右され
ない遺伝子発現頻度の評価方法を開発することにした。本明細書に記載するその
方法を応用することにより、本発明の特徴である本明細書記載の核酸分子が単離
された。

【０００７】 （好ましい態様の詳細な説明） 実施例1 RT-PCRによって発現頻度を定量する場合にプライマーの選択が得られる値を左
右するかどうかを決定するための実験を行なった。MAGE-A10の発現頻度をMZ2-ME
L 細胞株と2 対のプライマーのうちの1 対とを使って決定した。第1 のプライマ
ー対はDe Plaenら，Immunogenetics 40:360-369 （1994）に記載されている。す
なわち、CACAGAGCAG CACTGAAGGA G （配列番号1 ）とCTGGGTAAAG ACTCACTGTC TG
G （配列番号2 ）またはAGCAGCCAAA AGGAGGAGAG TC（配列番号3 ）とTGACCTCCTC
AGGGGTGCAG TA（配列番号 4）である。配列番号3 および4 はMAGE-A10の最後の
エキソンに相補的な配列に相当する。

【０００８】 MAGE-A1 の発現頻度はLB11-OC1細胞株と2 対のプライマー、すなわちCGGCCGAA
GG AACCTGACCC AG（配列番号5 ）とGCTGGAACCC TCACTGGGTT GCC （配列番号6 ）
またはTCAGGGGACA GGCCAACCC（配列番号7 ）とCTTGCACTGA CCTTGATCAC ATA （配
列番号8 ）を使って決定した。

【０００９】 これらの実験では細胞から全RNA を抽出した。次にWeynantsら（前掲）に従い
、2 μg の試料を使って逆転写を行なった。次に全cDNAの1/10を使用し、10×PC
R 緩衝液2.5 μl 、10mMのdNTP 2.5μl 、プライマー10pmolおよびポリメラーゼ
0.5 単位を補足し、体積が25μl になるように水を加えてPCR を行なった。各混
合物を94℃に5 分間加熱した後、30サイクルの増幅を行なった。配列番号1 〜4
、7 および8 の場合は94℃で1 分、65℃で2 分および72℃で3 分を1 サイクルと
した。配列番号5 および6 については94℃で1 分および72℃で3 分を1 サイクル
とした。サイクル反応は72℃で5 分間の最終伸長で終了させた。解析は5 μl の
試料を使って行ない、各試料を1 ％アガロースゲルで泳動し、標準的臭化エチジ
ウム染色法によって可視化した。

【００１０】 配列番号1 および2 を使用した場合、見出されるMAGE-A10の発現レベルは低か
ったが、配列番号3 および4 を使用すると、MAGE-A1 の発現レベルに匹敵する発
現レベルが認められた。この結果は、発現レベルが同等であることを示したCarr
elら（前掲）のウェスタンブロット法による研究と一致している。

【００１１】 配列番号3 および4 はMAGE-A10の最後のエキソンの領域に相当することから、
混入したゲノムDNA も増幅されている可能性があった。この可能性を検証するた
めに、逆転写段階を省いて増幅を行なった。しかし増幅は観察されず、混入はお
そらくないことが示された。配列番号3 および4 をプライマーとして使用した場
合のPCR 産物をいくつか配列決定した。いずれもMAGE-A10に一致した。

【００１２】 MAGE-A1 用のプライマーを使って得られた結果を比較したところ、発現レベル
の相違が観察され、配列番号7 および8 は配列番号5 および6 より高い発現レベ
ルを示した。

【００１３】 MAGE-A5 、A9およびA11 については極めて低い発現レベルが以前に観察されて
いた。したがってプライマーを変えることにより、これが解決されるかもしれな
いと推測された。

【００１４】 実施例2 上で得た結果から、遺伝子（例えばMAGE遺伝子）発現頻度のより良い決定法が
必要であることが示唆された。開発した方法をこの実施例で説明する。

【００１５】 標準的方法（参照により本明細書に組み込まれるDe Plaenら，Methods 12：12
5-142 （1997）を参照されたい）に従って MAGE-A 陽性試料からcDNAライブラリ
ーを調製し、大腸菌中に組換えプラスミドとして維持した。

【００１６】 具体的には試料をチオシアン酸グアニジン中でホモジナイズして溶解液を形成
させ、その溶解液をCsClクッションの上にのせた。次に、連続した2 本のオリゴ
(dT)セルロースカラムで全RNA を処理することにより、ポリ(A) ＋RNA を単離し
た。単離されたポリ(A) ＋RNA を、NotI制限部位を含有するオリゴ(dT)プライマ
ーでcDNAに変換した。得られたcDNAをBstXI アダプターに連結し、NotIで消化し
た後、発現ベクターpcDNAI/AmpのBstXI およびNotI部位に挿入した。得られた組
換えプラスミドを、標準的なエレクトロポレーション法によって大腸菌DH5 αに
導入した後、アンピシリン（25μg/ml）で選択した。

【００１７】 次に、アンピシリンを補足したLB培地に、3 〜6 クローン/ μl になるよう全
ライブラリーを希釈した。その後、各希釈液9.6ml を96マイクロウェルプレート
に接種した（1 つのマイクロウェルあたり100 μl ）。約100,000 個の独立した
クローンがプレート上に分布するように、各ライブラリーにつき2 、3 枚のプレ
ートに接種した。次に、プレートを37℃で終夜インキュベートした後、各マイク
ロウェルから採取した10μl ずつを合わせて、各プレートにつき20種類のプール
（すなわち各行から8 プールおよび各列から12プール）を得た。プレートとプー
ルの複製を作製し、マスターサンプルを凍結し（−70℃、20％グリセロールを含
有するLB培地）、複製はPCR アッセイ用に4 ℃に保った。

【００１８】 PCR アッセイは生細菌と凍結細菌の両方で行ない、最初のアッセイは各行およ
び列から調製したプールに対して行なった。陽性行と陽性列の交差点に陽性マイ
クロウェルを見出した。増幅アッセイを行なうため、3 μl の生細菌に10×PCR
緩衝液2.5 μl 、10mM dNTP 2.5 μl 、各プライマー10pmol、ポリメラーゼ0.5
単位および水を補足して、体積を25μl にした。

【００１９】 ほとんどの場合、プレートの陽性ウェル数は20％未満だった。ポアソン分布に
よれば陽性クローンの百分率が20％未満である場合、1 つのウェルにただ一つの
クローンが存在する可能性は90％以上になるはずである。陽性ウェルが10％未満
で推定される正確度が95％になる点まで限界希釈を行なうことができるだろう。

【００２０】 これらの実験では上記のように陽性の数は20％未満だった。次に、各ウェル中
の独立クローン数を考慮して、ライブラリー中の異なるMAGE-A cDNA の存在量を
計算することができた。

【００２１】 7 つのcDNAライブラリー（腫瘍細胞株5 、精巣ライブラリー1 、胎盤ライブラ
リー1 ）で12種類のMAGE-A遺伝子全てについてこれらの実験を繰返した。結果を
次の表に示す。

【００２２】

【表１】 上記の表に示すように、結果をRT-PCRアッセイで得られる結果と比較した。MA
GE-A1 、A9およびA10 は異なるプライマー対を使って2 回評価し、アガロースゲ
ルでのバンド形成の強度に基づいて発現レベルを見積もった。

【００２３】 限界希釈アッセイによって明らかになったMAGE-A10の発現レベルはプライマー
配列番号3 および4 を使って得られるレベルに匹敵し、配列番号1 および2 を使
って得られるレベルより高かった。これら高い方の値は、Carrelらの文献（前掲
）および特許された米国特許出願第0/724,774 号（1996年10月3 日出願）に報告
されたウェスタンブロット法による研究と一致している。頻度はいくつかの株で
MAGE-A1 の頻度と同等だった。他の株ではレベルは低下したものの、なおA1、A2
またはA12 のレベルに匹敵した。

【００２４】 A1、A2、A3、A4、A6およびA12 について計算された頻度は、基本的にRT-PCRに
よって得られる結果と一致していた。あるライブラリーでの結果（解析した124,
000 クローン中1 クローン）は配列番号7 および8 で得られる結果と一致したが
、配列番号5 および6 で得られる結果とは一致しなかったことから、存在する転
写物を決定するには配列番号5 および6 の方が効率的だが、発現レベルを決定す
るには配列番号7 および8 の方が良いことが示唆された。

【００２５】 実施例3 上記実験結果の一側面であってさらなる研究を誘発したのは、MAGE-A8 の発現
である。半定量的PCR アッセイで高い発現レベルを示したTT-THYR 細胞株を除い
て、常に弱い発現が観察された。

【００２６】 TT-THYR ライブラリー中のインサートの平均サイズは0.9kb しかないので、MA
GE-A8 mRNAの最後の450 ヌクレオチドのセグメントを増幅するプライマーを設計
した。同様のプライマーをMAGE-A1 、A2、A4およびA8についても設計した。すな
わち、 配列番号9 ： GAAGAGAGCGGTCAGTGTTC-3 （センス） 配列番号10：AATCCAGGTATGCATATATCTTTA（アンチセンス） 配列番号11：GCCTCTTTGAAGAGAGCAGTC （センス） 配列番号12：CAAAGAAGCAAAAACATACACATA（アンチセンス） 配列番号13：CACTCTGTTTGAAGAAAATAGTC （センス） 配列番号14：AGTATCTTTTAATTTATCTCACCTA （アンチセンス） 配列番号15：AGCATGTTGGGTGTGAGGGA（センス） 配列番号16：AGGGTACACTAAGAGGTACAG （アンチセンス） （配列番号9 および10はA1を増幅し、配列番号11および12はA2を増幅し、配列番
号13および14はA4を増幅し、配列番号15および16はA8を増幅する）である。これ
らのプライマーを使って上述のようにRT-PCRを行なった。これにより、MAGE-A8
の発現頻度ははるかに高くて、MAGE-A2 と同等であることがわかった。

【００２７】 精巣に関する結果を解析したところ、MAGE-A4 の発現レベルはMAGE-A1 より高
いことがわかり、A2、A3、A8、A9およびA11 のレベルは低く、A6、A10 またはA1
2 のcDNAは見つからなかった。これらの結果は、Carrelら（前掲）がMAGE-A1 と
MAGE-A10について示した結果と一致している。

【００２８】 胎盤の場合はMAGE-A10が最も高い発現レベルを示し、A1〜A7とA9およびA12 は
解析した230,000 クローンに全く見つからなかった。

【００２９】 実施例4 MAGE-A遺伝子に関する文献はたくさんあるが、このファミリーのいくつかのメ
ンバーについては、その構造がMAGE-A1 の構造に基づいて推測されているにも関
わらず、cDNAは一度も単離されていない。

【００３０】 上記実施例2 に記載のアプローチにより、MAGE-A5 、A8、A9、A10 およびA11
のcDNAが単離されることになった。MAGE-A10のcDNAは、例えば参照により本明細
書に組み込まれる特許出願第08/724,774号（1996年10月3 日出願）に記載されて
いたが、その他は知られていなかった。A5、A8、A9およびA11 のcDNAをそれぞれ
配列番号17〜20に示す。さらにcDNA配列の知見により、図1 に示すように、遺伝
子のエキソン/ イントロン構造を完成させることが可能になった。

【００３１】 MAGE-A5 cDNAを配列決定したところ、興味深い結果がいくつか得られた。とい
うのは、それはMAGE-A10の最初の2 つのエキソンと、それに続く今まで知られて
いなかった1 つのエキソンおよびMAGE-A5 の2 つのエキソンから構成されていた
からである。

【００３２】 上記の実施例は、本明細書に記載する核酸分子の他に、特定の遺伝子または目
的遺伝子の発現頻度を決定する方法も包含する本願発明を説明している。この方
法では試料からcDNAを調製し、そのcDNAを細胞に形質転換またはトランスフェク
トして、形質転換体/ トランスフェクタントのライブラリーを作製する。次にこ
れらの細胞をほぼ同じサイズの多数の試料に分割した後、各試料をcDNAの（量と
の対比で）存否についてアッセイする。陽性試料の数は総数の20％以下、より好
ましくは被験試料数の10％以下になるべきである。陽性の数が選択した値より大
きい場合は、そのライブラリーを希釈し、複数の試料に分割して、アッセイを繰
り返す。陽性値が選択した値より低い場合は、各MAGE cDNA の頻度が決定される
。

【００３３】 この方法は、好ましくは、試料の様々な部分をプールできるように所定の配置
で試料を分配することによって行なわれる。試料をそのように配置させると、2
つの試料プールの交差点がどこであるかを決定することによって、どの試料が目
的cDNAを含有するかを決定することができる。例えば、垂直方向と水平方向の列
に配置された長方形配置の試料を考える。水平方向の列を文字（すなわち「A 」
「B 」「C 」など）で表し、垂直方向の列を数字（すなわち「1 」「2 」「3 」
など）で表すとすると、「A 」「B 」「2 」「3 」などのプールを作ることがで
きる。垂直方向と水平方向の各列は1 点で交差し、その交差点は「A1」「B2」「
C3」「D4」などの記号で表される。仮にプール「B 」とプール「7 」の両方が陽
性だとすると、点「B7」の試料は陽性であると結論できる。こうすることにより
、目的の試料を含有するウェルを割り出すことができる。

【００３４】 発現量の定量の他に、当業者は本方法によって目的のcDNA分子（特に低頻度で
存在するもの）を同定することができる。ここに記述したように、本発明の実施
によって様々なMAGE遺伝子のcDNAが単離された。これらのcDNAは今まで単離され
ていなかったcDNAであり、本発明のさらなる特徴、すなわちMAGE-A8 、MAGE-A9
およびMAGE-11 タンパク質をコードする単離されたcDNA分子、例えば配列番号18
、19または20のいずれかによってコードされるタンパク質のアミノ酸配列を持
つタンパク質をコードするcDNA分子である。

【００３５】 また新たに単離された核酸分子、例えば配列番号17に記載の核酸分子または他
の類似の分子、すなわちMAGE-A5 配列とMAGE-A10配列の間にあるヌクレオチド配
列によって分離されたMAGE-A5 の2 つのエキソンとMAGE-A10の2 つのエキソンを
含む核酸分子、ならびにMAGE-A5 部分とMAGE-A10部分の両方にハイブリダイズす
る部分を含む核酸分子も、本発明の一部である。これらの核酸分子、すなわち本
明細書に記載する全ての核酸分子は、プロモーターに作動可能に連結された当該
核酸分子を含む発現ベクターを作製するために使用できる。これらのベクターと
、単離された核酸分子そのものは、細胞の形質転換またはトランスフェクション
に使用でき、それによって組換え細胞を作出することができる。

【００３６】 これらの核酸分子は、診断的にも治療的にも使用できる。診断領域では、ポリ
メラーゼ連鎖反応などの標準的方法でオリゴマープローブを使用することにより
、例えば細胞含有試料、細胞溶解液などの試料を本明細書に記載の核酸分子の発
現について調べることができる。また、それがコードするタンパク質の存否を決
定することによって、上述のような試料をアッセイすることもできる。

【００３７】 また、新たに同定され単離されたこれらの分子に基づく方法も本発明の一部で
ある。例えば試料を、目的とするMAGE核酸分子に特異的にハイブリダイズする1
または複数のオリゴヌクレオチドと接触させることによって、MAGE遺伝子の発現
を決定することができる。例えばMAGE-A1 の決定には配列番号9 および／または
配列番号10を使用でき、MAGE-A2 の決定には配列番号11および／または12を使用
できる。抗体アッセイなどの標準的方法論や他のタンパク質決定用の系を使って
、MAGEタンパク質のアッセイも行なうことができる。

【００３８】 また、本発明の一部であるMAGEタンパク質のアミノ酸配列に従って互いに連結
された約8 〜約25アミノ酸からなるペプチドも本発明の一部である。これらのペ
プチドは、HLA-A1、A2、A3、A24 、B7、B8、B35 、B44 、B52 およびCW6 などの
HLA 分子を含むMHC クラスI またはクラスII分子などのMHC 分子にとって特異的
結合ペプチドである。関連する配列の決定は、例えばParkerら，J ．Immunol 15
2 ：163 （1994）、D'Amaro ら，Hum ．Immunol 43：13-18 （1995）、Drijfhou
t ら，Hum ．Immunol 43：1-12もしくはSturniolo ら，Nat ．Biotechnol 17(6)
：555-61（1999）（これらは全て参照により本明細書に組み込まれるものとする
）またはNIH ワールドワイドウェブサイト（URL はhttp://bimas.dcrt.nih.gov.
）やhttp://www.uni-tuebingen.de/uni/kxc などのウェブサイト（これらは参照
により本明細書に組み込まれるものとする）を使って行なうことができる。これ
らのペプチドの一部を、関連するMAGEアミノ酸配列を挙げて以下の表に列挙する
。完全なアミノ酸配列は配列番号21〜24に示す。配列番号21はMAGE A5 、配列番
号22はMAGE A8 、配列番号23はMAGE A9 、配列番号24はMAGE A11の全アミノ酸
配列である。

【００３９】 MAGE A5: HLA-A1 結合ペプチド 98-107 SPDPESVFR 69-78 SAIPTAIDF 32-41 TTEEQEAVS 116-125 LIHFLLLKY 113-122 VADLIHFLL 115-124 DLIHFLLLK 2-11 SLEQKSQHC 77-86 FTLWRQSIK 73-82 TAIDFTLWR 74-83 AIDFTLWRQ 15-24 GLDTQEEAL。

【００４０】 MAGE A5: HLA-A2 結合ペプチド 112-123 KVADLIHFL 108-117 ALSKKVADL 24-33 GLVGVQAAT 70-79 AIPTAIDFT 38-47 AVSSSSPLV 22-31 ALGLVGVQA 15-24 GLDTQEEAL 45-54 LVPGTLGEV 31-40 ATTEEQEAV 71-80 IPTAIDFTL 113-122 VADLIHFLL 25-34 LVGVQAATT 78-87 TLWRQSIKG 48-57 GTLGEVPAA 18-27 TQEEALGLV。

【００４１】 MAGE A5: HLA-A3 結合ペプチド 115-124 DLIHFLLLK 103-112 SVFRAALSK 108-116 ALSKKVADL 15-23 GLDTQEEAL 77-85 FTLWRQSIK 116-124 LIHFLLLKY 24-32 GLVGVQAAT 73-81 TAIDFTLWR 22-30 ALGLVGVQA。

【００４２】 MAGE A5: HLA-A24結合ペプチド 112-120 KVADLIHFL 42-50 SSPLVPGTL 17-25 DTQEEALGL 37-45 EAVSSSSPL 76-84 DFTLWRQSI 113-121 VADLIHFLL 71-79 IPTAIDFTL 15-23 GLDTQEEAL 108-116 ALSKKVADL 69-77 SAIPTAIDF 97-105 TSPDPESVF 63-71 KSPQGASAI 109-117 LSKKVADLI 67-75 GASAIPTAI 114-122 ADLIHFLLL 111-119 KKVADLIHF。

【００４３】 MAGE A5: HLA-B7 結合ペプチド 71-79 IPTAIDFTL 112-123 KVADLIHFL 108-116 ALSKKVADL 37-45 EAVSSSSPL 17-25 DTQEEALGL 42-50 SSPLVPGTL 113-121 VADLIHFLL 38-47 AVSSSSPLV 60-68 GPLKSPQGA 54-62 PAAGSPGPL 114-122 ADLIHFLLL 67-75 GASAIPTAI 15-23 GLDTQEEAL 45-53 LVPGTLGEV 30-38 AATTEEQEA 31-39 ATTEEQEAV 100-108 DPESVFRAA 8-16 QHCKPEEGL 25-33 LVGVQAATT 109-117 LSKKVADLI。

【００４４】 MAGE A5: HLA-B8 結合ペプチド 108-117 ALSKKVADL 37-46 EAVSSSSPL 109-118 LSKKVADLI 71-80 IPTAIDFTL 67-75 GASAIPTAI 42-50 SSPLVPGTL 102-110 ESVFRAALS。

【００４５】 MAGE A5: HLA-B35結合ペプチド 71-79 IPTAIDFTL 97-105 TSPDPESVF 109-118 LSKKVADLI 42-50 SSPLVPGTL 63-71 KSPQGASAI 112-120 KVADLIHFL 37-46 EAVSSSSPL 69-77 SAIPTAIDF 17-25 DTQEEALGL 60-68 GPLKSPQGA 116-124 LIHFLLLKY 67-75 GASAIPTAI 108-116 ALSKKVADL 113-121 VADLIHFLL 100-107 DPESVFRAA 31-39 ATTEEQEAV 106-114 RAALSKKVA 41-49 SSSPLVPGT 102-110 ESVFRAALS 30-38 AATTEEQEA。

【００４６】 MAGE A5: HLA-B44結合ペプチド 69-77 SAIPTAIDF 34-42 EEQEAVSSS 20-28 EEALGLVGV 33-41 TEEQEAVSS 90-98 QEEEGPSTS 51-59 GEVPAAGSP 114-122 ADLIHFLLL 41-49 SSSPLVPGT 92-100 EEGPSTSPD 97-105 TSPDPESVF 48-56 GTLGEVPAA 91-99 EEEGPSTSP 36-44 QEAVSSSSP 116-124 LIHFLLLKY 56-64 AGSPGPLKS 23-31 LGLVGVQAA 13-23 EEGLDTQEE 75-83 IDFTLWRQS 100-108 DPESVFRAA 17-25 DTQEEALGL。

【００４７】 MAGE A5: HLA-B52結合ペプチド 18-26 TQEEALGLV 97-105 TSPDPESVF 45-53 LVPGTLGEV 109-117 LSKKVADLI 71-79 IPTAIDFTL 63-71 KSPQGASAI 23-31 LGLVGVQAA 67-75 GASAIPTAI 20-28 EEALGLVGV 69-77 SAIPTAIDF 46-54 VPGTLGEVP 14-22 EGLDTQEEA 106-114 RAALSKKVA 113-121 VADLIHFLL 31-39 ATTEEQEAV 60-68 GPLKSPQGA 76-84 DFTLWRQSI 96-104 STSPDPESV 89-107 NQEEEGPST 112-120 KVADLIHFL。

【００４８】 MAGE A5: HLA-CW6結合ペプチド 112-120 KVADLIHFL 108-116 ALSKKVADL 71-79 IPTAIDFTL 113-121 VADLIHFLL 116-124 LIHFLLLKY 105-113 FRAALSKKV 67-75 GASAIPTAI 18-26 TQEEALGLV 37-45 EAVSSSSPL 114-122 ADLIHFLLL 45-53 LVPGTLGEV 42-50 SSPLVPGTL 15-23 GLDTQEEAL 8-16 QHCKPEEGL 20-28 EEALGLVGV 17-25 DTQEEALGL 41-49 SSSPLVPGT 63-71 KSPQGASAI 76-84 DFTLWRQSI 109-117 LSKKVADLI。

【００４９】 MAGE A11: HLA-A1結合ペプチド 376-384 GTDPACYEF 281-290 EVDPTSHSY 211-220 LIDPESFSQ 71-80 NLEDRSPRR 142-150 QAEEQEAAF 352-360 FGEPKRLLT。

【００５０】 MAGE A11: HLA-A2結合ペプチド 313-321 GLLIIVLGV 350-358 FLFGEPKRL 221-229 ILHDKIIDL 89-97 VLWGPITQI 333-341 VMWEVLSIM 384-392 FLWGPRAHA 271-279 MQLLFGIDV 225-233 KIIDLVHLL 398-406 KVLEYIANA 337-345 VLSIMGVYA 289-297 YVLVTSLNL 316-324 IIVLGVIFM 335-353 WEVLSIMGV。

【００５１】 MAGE A11: HLA-A3結合ペプチド 272-280 QLLFGIDVK 228-236 DLVHLLLRK 89-97 VLWGPITQI 359-367 LTQNWVQEK 313-321 GLLIIVLGV。

【００５２】 MAGE A11: HLA-A24 結合ペプチド 343-351 VYAGREHFL 255-263 NYEDYFPEI 351-359 LFGEPKRLL 225-234 KIIDLVHLL 288-296 SYVLVTSLN 236-244 KYRVKGLIT 82-90 RITGGEQVL 311-319 KSGLLIIVL 413-421 SYPSLYEDA。

【００５３】 MAGE A11: HLA-B7結合ペプチド 98-106 FPTVRPADL 414-422 YPSLYEDAL 283-291 DPTSHSYVL 64-73 QVFREQANL 76-84 SPRRTQRIT 289-297 YVLVTSLNL 127-135 QAQEEDLGL 307-315 QSMPKSGLL 266-279 EASVCMQLL 147-155 EAAFFSSTL。

【００５４】 MAGE A11: HLA-B8結合ペプチド 98-106 FPTVRPADL 221-229 ILHDKIIDL 241-250 GLITKAEML 234-242 LRKYRVKGL 2-10 ETQFRRGGL 309-317 MPKSGLLII 307-315 QSMPKSGLL。

【００５５】 MAGE A11: HLA-B5結合ペプチド 374-382 VPGTDPACY 410-418 DPTSYPSLY 102-110 RPADLTRVI 394-402 TSKMKVLEY 309-317 MPKSGLLII 283-291 DPTSHSYVL 181-190 SPTAMDAIF 414-422 YPSLYEDAL 98-106 FPTVRPADL 389-497 RAHAETSKM 48-56 APYGPQLQW 311-319 KSGLLIIVL 378-386 DPACYEFLW。

【００５６】 MAGE A11: HLA-B44 結合ペプチド 143-151 AEEQEAAFF 58-66 QDLPRVQVF 256-269 YEDYFPEIF 392-400 AETSKMKVL 166-174 AESPSPPQS 144-152 EEQEAAFFS 394-402 TSKMKVLEY 280-288 KEVDPTSHS 265-273 REASVCMQL 406-414 ANGRDPTSY 410-418 DPTSYPSLY 335-343 WEVLSIMGV 146-154 QEAAFFSST 331-339 EEVMWEVLS。

【００５７】 MAGE A11: HLA-B52 結合ペプチド 309-318 MPKSGLLII 102-110 RPADLTRVI 314-322 LLIIVLGVI 333-341 VMWEVLSIM 271-279 MQLLFGIDV 218-226 SQDILHDKI 181-189 SPTAMDAIF 315-323 LIIVLGVIF 29-37 FGLQVSTMF 219-227 QDILHDKII 57-65 SQDLPRVQV 90-98 LWGPITQIF 245-254 KAEMLGSVI 329-338 IPEEVMWEV 256-264 YEDYFPEIF 58-66 QDLPRVQVF 128-136 AQEEDLGLV 283-291 DPTSHSYVL 87-95 EQVLWGPIT 325-334 EGNCIPEEV。

【００５８】 MAGE A11: HLA-CW6 結合ペプチド 225-233 KIIDLVHLL 311-319 KSGLLIIVL 287-295 HSYVLVTSL 221-229 ILHDKIIDL 147-155 EAAFFSSTL 229-237 LVHLLLRKY 269-277 VCMQLLFGI 244-252 TKAEMLGSV 313-321 GLLIIVLGV 222-230 LHDKIIDLV 184-192 AMDAIFGSL。

【００５９】 MAGE A9: HLA-A1 結合ペプチド 94-103 SVDPAQLEF 167-176 EVDPAGHSY 262-271 GSDPAHYEF 134-143 MLESVIKNY 153-162 ASEFMQVIF 189-198 LGDGHSMPK 238-247 YGEPRKLLT 112-121 VAELVHFLL 246-255 TQDWVQENY 280-289 TSYEKVINY 249-258 WVQENYLEY。

【００６０】 MAGE A9: HLA-A2 結合ペプチド 199-208 ALLIIVLGV 223-232 ALSVMGVYV 102-111 FMFQEALKL 307-316 VLGEEQEGV 270-279 FLWGSKAHA 175-184 YILVTALGL 157-166 MQVIFGTDV 140-149 KNYKRYFPV 219-228 VIWEALSVM 290-299 VMLNAREPI 284-293 KVINYLVML 221-230 WEALSVMGV 24-33 GLMGAQEPT 187-196 SMLGDGHSM。

【００６１】 MAGE A9: HLA-A3 結合ペプチド 235-244 HMFYGEPRK 114-123 ELVHFLLHK 203-212 IVLGVILTK 225-234 SVMGVYVGK 102-111 FMFQEALKL 134-143 MLESVIKNY 158-167 QVIFGTDVK 118-127 FLLHKYRVK 199-208 ALLIIVLGV 107-116 ALKLKVAEL 270-279 FLWGSKAHA 148-157 VIFGKASEF。

【００６２】 MAGE A9: HLA-A24結合ペプチド 281-290 SYEKVINYL 237-246 FYGEPRKLL 229-238 VYVGKEHMF 71-80 VYYTLWSQF 141-150 NYKRYFPVI 236-245 MFYGEPRKL 284-293 KVINYLVML。

【００６３】 MAGE A9: HLA-B7 結合ペプチド 169-178 DPAGHSYIL 300-309 YPSLYEEVL 127-136 EPVTKAEML 284-293 KVINYLVML 111-120 KVAELVHFL 197-206 KAALLIIVL 17-26 EAQGEDLGL 107-116 ALKLKVAEL 193-202 HSMPKAALL 195-204 MPKAALLII 228-237 GVYVGKEHM 181-190 LGLSCDSML 201-210 LIIVLGVIL 173-182 HSYILVTAL 175-184 YILVTALGL 92-101 SSSVDPAQL 67-76 SSISVYYTL 102-111 FMFQEALKL 112-121 VAELVHFLL 180-189 ALGLSCDSM。

【００６４】 MAGE A9: HLA-B8 結合ペプチド 107-116 ALKLKVAEL 127-136 EPVTKAEML 195-204 MPKAALLII 193-202 HSMPKAALL 169-178 DPAGHSYIL 300-309 YPSLYEEVL。

【００６５】 MAGE A9: HLA-B52結合ペプチド 195-204 MPKAALLII 200-209 LLIIVLGVI 219-228 VIWEALSVM 157-166 MQVIFGTDV 104-113 FQEALKLKV 131-140 KAEMLESVI 152-161 KASEFMQVI 96-105 DPAQLEFMF 201-210 LIIVLGVIL 300-309 YPSLYEEVL 212-221 DNCAPEEVI 169-178 DPAGHSYIL 278-287 AETSYEKVI 141-150 NYKRYFPVI。

【００６６】 MAGE A9: HLA-CW6結合ペプチド 197-206 KAALLIIVL 111-120 KVAELVHFL 173-182 HSYILVTAL 107-116 ALKLKVAEL 199-208 ALLIIVLGV 100-109 LEFMFQEAL 130-139 TKAEMLESV 115-124 LVHFLLHKY 201-210 LIIVLGVIL。

【００６７】 MAGE A9: HLA-B44結合ペプチド 105-113 QEALKLKVA 221-229 WEALSVMGV 47-55 EEVSAAGSS 296-304 EPICYPSLY 280-288 TSYEKVINY 217-225 EEVIWEALS 255-263 LEYRQVPGS 278-286 AETSYEKVI 166-174 KEVDPAGHS 33-41 GEEEETTSS 96-104 DPAQLEFMF 222-230 EALSVMGVY。

【００６８】 MAGE A9: HLA-B35結合ペプチド 260-269 VPGSDPAHY 296-305 EPICYPSLY 195-204 MPKAALLII 300-309 YPSLYEEVL 127-136 EPVTKAEML 96-105 DPAQLEFMF 169-178 DPAGHSYIL 280-289 TSYEKVINY 65-74 ASSSISVYY 264-273 DPAHYEFLW 92-101 SSSVDPAQL 18-27 AQGEDLGLM 222-231 EALSVMGVY 64-73 GASSSISVY 197-206 KAALLIIVL。

【００６９】 MAGE A8: HLA-A1 結合ペプチド 171-180 EVDPAGHSY 266-275 GSDPVRYEF 138-147 MLESVIKNY 157-166 ASECMQVIF 250-259 TQEWVQENY 98-107 SPDPAHLES 116-125 VAELVRFLL 253-262 WVQENYLEY 193-202 LGDDQSTPK 181-190 LVTCLGLSY。

【００７０】 MAGE A8: HLA-B52結合ペプチド 199-208 TPKTGLLII 223-232 AIWEALSVM 161-170 MQVIFGIDV 286-295 YVKVLEHVV 204-213 LLIIVLGMI 135-144 KAEMLESVI 262-271 RQAPGSDPV 205-214 LIIVLGMIL 156-165 KASECMQVI 173-182 DPAGHSYIL。

【００７１】 MAGE A8: HLA-A3 結合ペプチド 280-289 ALAETSYVK 118-127 ELVRFLLRK 122-131 FLLRKYQIK 1-10 MLLGQKSQR 203-212 GLLIIVLGM 210-219 GMILMEGSR 162-171 QVIFGIDVK 138-147 MLESVIKNY 2-11 LLGOKSQRY 111-120 ALDEKVAEL 274-283 FLWGPRALA 29-38 QIPTAEEQK 24-33 GLMDVQIPT 253-262 WVQENYLEY。

【００７２】 MAGE A8: HLA-B7 結合ペプチド 299-308 RVRISYPSL 304-313 YPSLHEEAL 173-182 DPAGHSYIL 22-31 APGLMDVQI 64-73 SPEGASSSL 240-249 SVYWKLRKL 115-124 KVAELVRFL 37-46 KAASSSSTL 17-26 QAQGEAPGL 199-208 TPKTGLLII 216-225 GSRAPEEAI 196-205 DQSTPKTGL 116-125 VAELVRFLL。

【００７３】 MAGE A8: HLA-B8 結合ペプチド 197-206 QSTPKTGLL 199-208 TPKTGLLII 240-249 SVYWKLRKL 297-306 NARVRISYP 111-120 ALDEKVAEL 299-308 RVRISYPSL。

【００７４】 MAGE A8: HLA-A2 結合ペプチド 288-297 KVLEHVVRV 274-283 FLWGPRALA 24-33 GLMDVQIPT 111-120 ALDEKVAEL 115-124 KVAELVRFL 45-54 LIMGTLEEV 179-188 YILVTCLGL 161-170 MQVIFGIDV 203-212 GLLIIVLGM 191-200 GLLGDDQST 223-232 AIWEALSVM 71-80 SLTVTDSTL 279-288 RALAETSYV 251-260 QEWVQENYL 184-193 CLGLSYDGL。

【００７５】 MAGE A8: HLA-A24結合ペプチド 241-250 VYWKLRKLL 145-154 NYKNHFPDI 273-282 EFLWGPRAL 121-130 RELLRKYQI 126-135 KYQIKEPVT 115-124 KVAELVRFL 285-294 SYVKVLEHV 303-312 SYPSLHEEA 201-210 KTGLLIIVL 116-125 VAELVRFLL 299-308 RVRISYPSL 37-46 KAASSSSTL 205-214 LIIVLGMIL 17-26 QAQGEAPGL 64-73 SPEGASSSL 131-140 EPVTKAEML 179-188 YILVTCLGL 185-194 LGLSYDGLL 42-51 SSTLIMGTL 111-120 ALDEKVAEL。

【００７６】 MAGE A8: HLA-CW6結合ペプチド 115-1241 KVAELVRFL 201-210 KTGLLIIVL 177-186 HSYILVTCL 240-249 SVYWKLRKL 111-120 ALDEKVAEL 241-250 VYWKLRKLL 119-128 LVRFLLRKY 205-214 LIIVLGMIL 104-113 LESLFREAL 42-51 SSTLIMGTL 134-143 TKAEMLESV。

【００７７】 MAGE A8: HLA-B35結合ペプチド 264-273 APGSDPVRY 199-208 TPKTGLLII 304-313 YPSLHEEAL 131-140 EPVTKAEML 173-182 DPAGHSYIL 100-109 DPAHLESLF 39-48 ASSSSTLIM 268-277 DPVRYEFLW。

【００７８】 MAGE A8: HLA-B44結合ペプチド 282-291 AETSYVKVL 20-29 GEAPGLMDV 225-234 WEALSVMGL 33-42 AEEQKAASS 234-243 YDGREHSVY 109-118 REALDEKVA 221-230 EEAIWEALS 170-179 KEVDPAGHS 34-43 EEQKAASSS 296-305 VNARVRISY 226-235 EALSVMGLY 237-246 REHSVYWKL。

【００７９】 これらの分子に基づく組成物、例えば本発明のMAGEタンパク質とサイトカイン
、インターロイキン（例：IL-2、IL-4、IL-12 など）またはGM-CSFなどの医薬的
に許容できる佐剤とを含有する組成物なども、本発明の一部である。同様に、1
または複数の上述したペプチドと佐剤とを含有する組成物、HLA またはMHC 分子
と上記ペプチドとの複合体に佐剤を加えたものも、本発明の一部である。

【００８０】 これらの複合体はそのままで、または樹状細胞などの抗原提示細胞（非増殖性
にするなどの処理を施してもよい）上で結合させることができる。

【００８１】 ペプチドまたはタンパク質をコードする核酸分子をリポソーム型組成物などの
適当な組成物の形で使用できることは、当業者には理解されるだろう。また、こ
れらのペプチドとそのMHC 結合パートナー（すなわちHLA 分子）との複合体に特
異的な単離された細胞傷害性T 細胞株も、本発明の一部である。

【００８２】 これらのペプチドはHLA 分子に結合できるので、特定のHLA 分子について陽性
な細胞（例えばHLA-A ^* 0201陽性細胞など）の存否をペプチドが試料中の細胞に
結合するかどうかを決定することによって決定するための薬剤として役立つ。こ
の「リガンド／レセプター」型の反応は当技術分野では周知であり、その決定に
は様々な方法論を利用できる。

【００８３】 本発明のさらなる側面はいわゆる「ミニ遺伝子」であって、そのミニ遺伝子を
トランスフェクトした細胞による修飾デカペプチドの合成を指示するのに必要な
情報を保有しているものである。1 または複数の抗原性ペプチドをコードし、プ
ラスミドを使ったトランスフェクションまたはワクシニアもしくはアデノウイル
スへのクローニングによって宿主細胞ゲノムに導入されるミニ遺伝子を設計する
ことができる。例えば参照により本明細書に組み込まれるZajac ら，Int ．J ． Cancer 71 ：496 （1997）を参照されたい。組換えワクシニアウイルスベクター
などのこれらの組換えベクターは、融合タンパク質が製造されるように構築する
ことができる。例えば、融合タンパク質の一部が所望の腫瘍拒絶抗原前駆体また
は腫瘍拒絶抗原であり、追加のタンパク質またはペプチドセグメントを含めるこ
とが可能な融合タンパク質を構築することができる。融合タンパク質に加えるこ
とができる追加タンパク質またはペプチドセグメントの代表的な種類（ただし決
して唯一の選択肢ではない）はリポータータンパク質またはリポーターペプチド
、すなわち発現が起こったことを示すように観測可能なシグナルを与える緑色蛍
光タンパク質などのタンパク質またはペプチドである。他のリポータータンパク
質には、β- ガラクトシダーゼ、ルシフェラーゼ、dhfrおよび参照により本明細
書に組み込まれるCheng ら，Nature Biotechnology 14 ：606 （1996）に記載の
「eGFP」（エンハンスト緑色蛍光タンパク質）などがあるが、決してこれらに限
るわけではない。当業者にとって入手可能な様々なリポータータンパク質は様々
な方法で利用することができ、また様々な方法で利用されている。例えば「GFP
」と「eGFP」は、感染細胞を可視化して、フローサイトメトリーを使用する場合
の追跡と、そのように感染した細胞の単離を容易にするために利用できる。他の
リポータータンパク質は，ウェスタンブロット法や免疫沈降法などの方法を使用
する場合に役立つ。これらの技術は当技術分野では標準的技術であり、ここで繰
返して述べる必要はない。腫瘍拒絶抗原前駆体または腫瘍拒絶抗原の融合ペプチ
ドからの切断を容易にするタンパク質またはペプチドセグメントを含めてもよい
。融合タンパク質には上述のように2 以上の腫瘍拒絶抗原を含めることができ、
関連するMHC 分子への1 または複数の腫瘍拒絶抗原の送達を促進するタンパク質
またはペプチドを含めることもできる。そのようなタンパク質とペプチドは当技
術分野では周知であり、ここに詳述する必要はない。

【００８４】 また、本明細書に記載の組換えベクターでトランスフェクトされた組換え細胞
も、本発明の一部である。そのような細胞は例えば任意の種類の真核生物細胞で
あってよく、ヒト細胞は特に好ましい。これらの細胞は例えば腫瘍拒絶抗原前駆
体または腫瘍拒絶抗原の製造などに使用できる。またこれらの細胞は、エクスビ
ボで、MHC 分子と腫瘍拒絶抗原との特定の複合体に特異的な細胞傷害性T 細胞を
生成させるために使用することもできる。これは、融合タンパク質の発現とTRA
（すなわち腫瘍拒絶抗原）のプロセシングに続いて生成するMHC 分子とTRA との
複合体に特異的な試料中の細胞の増殖が誘発されるように、トランスフェクト細
胞を血液試料などのT 細胞源と接触させるだけで行なうことができる。これらの
細胞はその表面に適切な複合体を提示し、本明細書に示すようにインビボでも同
じタイプのT 細胞応答を誘発するので、非増殖性にすればこれらの細胞をワクチ
ン物質として使用することもできる。同様に、ベクターをワクチン物質そのもの
として使用して、細胞表面上のMHC 分子とペプチドとの複合体に対するT 細胞応
答を必要としている患者に投与することができる。もちろん、エクスビボで生成
したT 細胞を患者の処置に使用することもできる。

【００８５】 本ペプチドを他の腫瘍拒絶抗原由来のペプチドと組み合わせて「ポリトープ」
を形成させてもよい。代表的ペプチドには、米国特許出願第08/672,351号、第08
/718,964号（現在、米国特許第__号）、第08/487,135号（現在、米国特許第__号
）、第08/530,569号および第08/880,963号（これらは全て参照により本明細書に
組み込まれるものとする）に挙げられているペプチドがある。

【００８６】 次の文献（全て参照により本明細書に組み込まれるものとする）に記載されて
いるペプチドも使用できる。米国特許第5,405,940 号、第5,487,974 号、第5,51
9,117 号、第5,530,096 号、第5,554,506 号、第5,554,724 号、第5,558,995 号
、第5,585,461 号、第5,589,334 号、第5,648,226 号および第5,683,886 号、PC
T 国際公開番号92/20356、94/14459、96/10577、96/21673、97/10837、97/26535
および97/31017ならびに係属中の米国特許出願第08/713,354号。

【００８７】 ポリトープは、このタイプの分子が免疫応答を刺激および/ または誘発するか
どうかを決定するために様々な方法で一つに結合できる2 以上の潜在的に免疫原
性または免疫刺激性のペプチドのグループである。

【００８８】 これらのペプチドは直接または隣接する配列を介して一つに結合できる。関連
するエピトープ配列の直接結合を教示するThompsonら，Proc．Natl．Acad．Sci ．USA 92(13)：5845-5849 （1995）を参照されたい。ワクチンとしてのポリトー
プの使用はよく知られている。例えばGilbert ら，Nat ．Biotechnol． 15(12)
：1280-1284 （1997）、Thomson ら（前掲）、Thomson ら，J ．Immunol ． 157
(2) ：822-826 （1996）、Tam ら，J ．Exp ．Med ． 171(1) ：299-306 （1990
）（これらは全て参照により本明細書に組み込まれるものとする）を参照された
い。特にTam の文献は、マウスモデルで使用するとポリトープが抗体および感染
防御免疫の生成に役立つことを明らかにしている。さらに、この文献はポリトー
プが消化されると、MHC によって提示されることが可能であってMHC によって提
示されるペプチドが生じることを明らかにしている。Tam は、「ひも」状のポリ
トープからプロセシングされた個々のエピトープのCTL による認識を示すことに
よって、これを明らかにした。このアプローチは、例えば1 つのポリトープ中に
つなぎ合わせてなお認識を誘発できるエピトープの個数を決定する際に、また異
なるエピトープの組み合わせの効力を決定するために使用できる。異なる組み合
わせは、腫瘍拒絶抗原の特定のサブセットを発現させる患者に合わせた「テーラ
ーメード」であってもよい。これらのポリトープはポリペプチド構造として導入
するか、核酸送達システムを使って導入することができる。詳しく述べると、当
技術分野では、個々のエピトープまたは上述したようなポリトープをコードする
DNA を導入するために多種多様な方法を利用できる。例えば参照により本明細書
に組み込まれるAllsopp ら，Eur ．J ．Immunol ． 26(8)：1951-1959 （1996）
を参照されたい。アデノウイルス、ポックスウイルス、Tyウイルス様粒子、プラ
スミド、細菌などを使用できる。これらの系はマウスモデルで試験することによ
り、ヒトでの類似する所定の状況にどの系が最も適切らしいか決定することがで
きる。また、これらの系はヒト臨床試験でも試験できる。

【００８９】 また、試料中の細胞傷害性T 細胞の存否を決定するためにこれらのペプチドを
使用することも、本発明の特徴である。試料中のCTL がペプチド/MHC複合体と反
応することは上に示した。したがって、CTL が試料中にあることがわかっている
場合は、本発明のペプチドを陽性細胞（例えばHLA-A2陽性細胞）に加えた後、例
えば放射性クロム放出、TNF 産生などを決定するか、T 細胞活性を決定する他の
任意の方法によって、特定のHLA 分子について陽性な細胞を「溶解」することが
できる。同様に、本願に係るペプチドの1 つをHLA 陽性細胞と共に試料に加え、
そのHLA 陽性細胞の溶解を例えば⁵¹Cr放出、TNF の存在などによって決定するこ
とにより、特異的腫瘍浸潤リンパ球（「TIL 」）が試料中に存在するかどうかを
決定することもできる。またCTL は、ELISPOT 分析法（例えばSchmittel ら，(1
997)，J ．Immunol ．Methods 210 ：167-174 およびLalvani ら，(1997)，J ． Exp ．Med ． 126：859 を参照されたい）やMHC クラスI/ペプチドの蛍光性テト
ラマー複合体のFACS分析（Dunbarら，(1998 ），Current Biology 8 ：413-416
、Romeroら，J ．Exp ．Med ． 188：1641-1650 （1998））によって検出しても
よい（これらの文献は全て参照により本明細書に組み込まれるものとする）。

【００９０】 もちろん、本ペプチドはCTL の産生を誘発するために使用してもよい。上述し
たように、CTL 前駆体は適当な複合体に対峙するとCTL に成長する。そのような
いわば「対峙」を引き起こすことによって、CTL を生成させることができる。こ
れはそのようなCTL の生成にインビボでもエクスビボでも有用である。

【００９１】 本発明の他の側面は当業者には明らかであり、ここでは限定しない。

【００９２】 ここで使用した用語と表現は説明のために使用したものであって、限定を目的
とするものではなく、これらの用語と表現の使用に、本明細書に示し説明した特
徴またはその一部と等価なものを排除しようとする意図はないので、本発明の範
囲内で様々な変更態様が可能であると考えられる。

【配列表】

【図面の簡単な説明】

【図１】 MAGE-A5 、A8、A9およびA11 （配列番号17、18、19および20）を含むMAGE遺伝
子のエキソン/ イントロン構造を表す図。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ｃ１２Ｑ 1/68 Ｃ１２Ｎ 5/00 Ａ (72)発明者 ラルキン クリストフ ベルギー ブリュッセル ビー−1200 ユ ーシーエル 7459、 アベニュー ヒッポ クレイト 74 (72)発明者 デ プラエン エティエンヌ ベルギー ブリュッセル ビー−1200 ユ ーシーエル 7459、 アベニュー ヒッポ クレイト 74 (72)発明者 リモルディ ドネイタ スイス エパリンゲス シーエイチ−1066 ケミン デ ボベレセス 155 (72)発明者 ブーン−ファロウ ティエリー ベルギー ブリュッセル ビー−1200 ユ ーシーエル 7459、 アベニュー ヒッポ クレイト 74 Ｆターム(参考） 4B024 AA12 CA09 FA02 GA11 HA14 4B063 QA01 QA19 QQ02 QQ08 QQ42 QR08 QR32 QR42 QR55 QR59 QR62 QS25 QS34 QX01 4B065 AA93Y AB01 AC14 BA02 CA23 CA46

Claims (17)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 配列番号18、配列番号19および配列番号20に記載のヌクレオ
   チド配列からなる核酸分子によってコードされるタンパク質をコードする単離さ
   れた相補DNA 分子。
2. 【請求項２】 配列番号18によってコードされるタンパク質をコードする請
   求項１に記載の単離された相補DNA 分子。
3. 【請求項３】 配列番号19によってコードされるタンパク質をコードする請
   求項１に記載の単離された相補DNA 分子。
4. 【請求項４】 配列番号20によってコードされるタンパク質をコードする請
   求項１に記載の単離された核酸分子。
5. 【請求項５】 配列番号18のヌクレオチド配列からなる請求項１に記載の単
   離された相補DNA 分子。
6. 【請求項６】 配列番号19のヌクレオチド配列からなる請求項１に記載の単
   離された相補DNA 分子。
7. 【請求項７】 配列番号20のヌクレオチド配列からなる請求項１に記載の単
   離された核酸分子。
8. 【請求項８】 プロモーターに作動可能に連結された請求項１に記載の相補
   DNA 分子を含む発現ベクター。
9. 【請求項９】 請求項１に記載の単離された相補DNA 分子を含む組換え細胞
   。
10. 【請求項１０】 請求項７に記載の発現ベクターを含む組換え細胞。
11. 【請求項１１】 （i ）MAGE-A10をコードする単離された核酸分子にストリ
    ンジェントな条件下でハイブリダイズするヌクレオチド配列、 （ii）MAGE-A5 をコードする単離された核酸分子にストリンジェントな条件下で
    ハイブリダイズする第2 のヌクレオチド配列、および （iii ）（i ）と(ii ）の間に置かれた第3 のヌクレオチド配列 を含む単離された核酸分子。
12. 【請求項１２】 配列番号17に記載のヌクレオチド配列を含む請求項１１に
    記載の単離された核酸分子。
13. 【請求項１３】 プロモーターに作動可能に連結された請求項１１に記載の
    単離された核酸分子を含む発現ベクター。
14. 【請求項１４】 請求項１１に記載の単離された核酸分子を含む組換え細胞
    。
15. 【請求項１５】 請求項１２に記載の単離された核酸分子を含む組換え細胞
    。
16. 【請求項１６】 試料中の癌をスクリーニングする方法であって、前記試料
    中の配列番号17、18、19または20のヌクレオチド配列を含む核酸分子の存否を決
    定することからなり、前記核酸分子の存在が前記試料中の癌の指標である方法。
17. 【請求項１７】 前記核酸分子の存否がポリメラーゼ連鎖反応によって決定
    される請求項１６に記載の方法。