KR20020011967A

KR20020011967A - ＭＡＧＥ 5, 8, 9 및 11의 ｃＤＮＡ 클로닝 및 이를이용한 암 진단 방법

Info

Publication number: KR20020011967A
Application number: KR1020017011090A
Authority: KR
Inventors: 알폰소 세라노; 버나드 레더; 크리스토프 루르퀸; 에티엔 데플라엔; 도나타 리몰디; 티에리 분-팔로르
Original assignee: 에드워드 에이. 맥더모트, 주니어; 루드비히 인스티튜트 포우 캔써 리써치
Priority date: 1999-03-02
Filing date: 2000-03-01
Publication date: 2002-02-09
Also published as: AU3389500A; JP2003512814A; NZ513739A; EP1194542A1; CA2366059A1; WO2000052163A1

Abstract

본 발명은 유전자 발현 수준을 증대시키고자 개발된 방법에 따라 분리 및 동정된 cDNA 분자에 관한 것이다.

본 발명은 또한 상기 cDNA 분자를 기본으로 하는 단백질 및 펩티드 뿐아니라, 상기 물질을 다양한 진단 및 치료 용도로 사용하는 것에 관한 것이다.

Description

ＭＡＧＥ 5, 8, 9 및 11의 ｃＤＮＡ 클로닝 및 이를 이용한 암 진단 방법{Cloning of cDNA of MAGE's 5,8,9 and 11 and their uses in diagnosis of cancer}

문헌 "Van der Bruggen, et al., Science 254: 1643-1647 (1991)"에 의해, 인체 백혈구 항원("HLAs")과 복합체를 형성하여 자가유래 세포용해성(autologous cytolytic) T 세포에 의한 반응을 유발시키는 종양 거부 항원계의 존재가 밝혀졌다[상기 문헌 외에도, Boon et al.의 미국 특허 제5,342,774호 참조; 상기 문헌은 본 명세서에 참고문헌으로 인용됨]. 이들 문헌들에는 또한, 프로세싱 과정을 거쳐 상기한 종양 거부 항원이 되는 단백질을 암호화하는 유전자에 대한 분리 기술이 개시되어 있다. 지속적인 연구 결과, 밀접한 관련이 있는 12종의 유전자들을 발견하게 되었다. 이들 유전자들은 X 염색체의 q28 영역내에 위치하는 것으로밝혀졌다. 처음에는 이들 유전자들을 MAGE-1 내지 MAGE-12로 명명하였으나, 또다른 유전자들의 연이은 발견으로, 지금은 이들을 MAGE-A1 내지 MAGE-A12로 지칭하고 있다. X 염색체의 p21 영역내에는 MAGE-B 유전자 클러스터로 지칭되는 4종의 또다른 관련 유전자들이 위치한다. 또한 MAGE-C1 및 MAGE-C2로 명명된 또다른 MAGE계 분자들이 q26 영역에 위치하고 있다.

여러 가지 이유로, MAGE 유전자 발현에 대한 분석이 요구되어 왔고, 또한 현재 요구되고 있다. 각종 종양 샘플, 종양 세포주 및 정상 조직내에서 역 전사-중합효소 연쇄 반응("RT-PCR")에 의해 이루어지는 MAGE-A의 발현 패턴에 대한 분석은 해당 분야에서 어려운 작업으로 여겨져 왔다. 필수적으로, 전사 및 발현 수준이 RT-PCR을 통해 반-정량적으로 확립되어야 한다. 이는 아가로즈 겔상에서 밴드의 강도를 평가하고, 이를 기준 또는 대조용 물질의 표준 희석액과 비교하는 과정을 필요로 한다. 연구 결과, 유전자 MAGE-A1, A2, A3, A4, A6 및 A12는 많은 종양에서 높은 수준으로 전사되는 것으로 밝혀졌다. 유전자 MAGE-A8이 1종의 종양에서 높은 수준으로 발현되는데 반해, MAGE-A5, A9, A10 및 A11은 양성 종양들에서 다소 약하게 전사되는 것으로 나타났다. MAGE-A 유전자는 정소 및 태반(몇몇 경우에서)을 제외한 정상 조직에서는 발현되지 않는 것으로 밝혀졌다[참조: Brasseur, et al., Int. J. Cancer 52: 839-841 (1992); Brasseur, et al., Int. J. Canc 63: 375-380 (1995); De Plaen, et al., Immunogenetics 40: 360-369 (1994); van der Bruggen, et al.,supra, and Weynants, et al., Int. J. Canc 56: 826-829 (1994)]. 정소내 MAGE-A 유전자의 발현은 정자형성기의 초기 단계에 있는 생식선 세포로 제한된다[참조: Takahashi et al., Canc. Res. 55: 3478-3482 (1995)]. 정소에서는 MAGE-A7을 제외한 모든 MAGE-A 유전자가 발현된다. MAGE-A4, A8, A9, A10 및 A11은 태반에서도 전사되는 것으로 밝혀졌다.

CTL이 TRA 및 HLA의 복합체를 인지하기 위해서는, 특정 수준에 이르는 관련 MAGE-A 유전자의 발현이 요구되는 것으로 보인다. 문헌 "DePlaen, et al., Methods 12: 125-142 (1997); Lethe, et al., Melanoma Res 7: Suppl 2: S83-8 (1997)"에 따르면, 흑색종에서 HLA-A1에 의해 제시된 MAGE-A1 펩티드를 인지하기 위해서는 MAGE-A1의 발현 수준이 참고 세포주 MZ2-MEL내 수준의 10%를 초과해야 하는 것으로 밝혀졌다. MAGE-A2, A3, A4, A6 및 A12의 발현 수준은 반-정량적 RT-PCR을 통했을 때 MAGE-A1과 유사한 것으로 나타났는데, 이는 이들 유전자가 CTL 인지를 위해 제시되는 형태인 TRA로 프로세싱될 수 있음을 암시한다. MAGE-A1 및 A3으로부터 유래된 몇몇 펩티드는 HLA에 의해 제시된 후, 혼합 임파구-종양 세포 배양액으로부터 유래된 자가유래 CTL에 의해 인지되는 것으로 실제 밝혀졌다.

최근 들어, MAGE-A1에 대해 반응성인 모노클로날 항체가 흑색종에서 발현된 다른 단백질과 교차 반응하는 것으로 보고되었다[참조: 미국 특허 출원 일련번호 제 08/724,774 호(1996년 10월 3일) 및 Carrel, et al., Int. J. Canc 67: 417-422 (1996); 두 문헌 모두 본 명세서에 참고문헌으로 인용됨]. 이후, 상기 교차-반응성 단백질은 MAGE-A10에 의해 암호화되는 것으로 밝혀졌다. MZ2-MEL내에서, 이 단백질의 양은 MAGE-A1 단백질과 마찬가지로 풍부한 것으로 나타났다. RT-PCR에 의해 측정했을 때 MAGE-A10의 발현 수준이 MZ2-MEL에서 아주 낮게 나타났기 때문에, 상기한 결과는 매우 놀라운 것이었다. 상기한 바는 RT-PCR에서 MAGE-A10을 증폭하는데 사용된 프라이머가 그리 효율적이지 않음을 의미한다.

본 발명은 1999년 3월 2일에 출원된 미국특허출원 제09/260,978호의 일부계속출원으로서, MAGE계에 속하는 핵산 분자, 이들의 용도 및 이들의 발현을 검출 및 측정하는 방법에 관한 것이다. 본 발명은 또한, 이들 핵산 분자의 단편, 전체 핵산 분자 및 단편 모두에 의해 암호화된 단백질, MHC 또는 HLA 분자와 복합체를 형성하는 이들의 펩티드, 융합 단백질, 폴리토프(polytopes) 등에 관한 것이다.

도 1은 MAGE-A5, A8, A9 및 A11(서열 17, 18, 19 및 20)을 포함한 MAGE 유전자의 엑손/인트론(exon/intron) 구조를 나타낸 것이다.

따라서, 본 발명자들은 프라이머로 인한 오류가 없는 유전자의 발현 빈도 평가 방법을 개발하게 되었다. 본 발명의 특징중 하나는 이러한 방법을 통해 본 발명에 따른 핵산 분자를 분리해내는 것이다.

실시예 1

본 실시예에서는 프라이머의 선택이 RT-PCR을 통한 발현 빈도 측정시 얻어지는 수치에 영향을 미치는지의 여부를 결정하기 위한 실험을 실시하였다. MAGE-A10의 발현 빈도는 세포주 MZ2-MEL과 다음 2쌍의 프라이머중 하나를 사용하여 측정하였다. 그 첫번째 쌍은 문헌 "De Plaen, et al., Immunogenetics 40: 360-369 (1994)"에 개시된 것이다:

CACAGAGCAG CACTGAAGGA G (서열 1) 및

CTGGGTAAAG ACTCACTGTC TGG (서열 2), 또는

AGCAGCCAAA AGGAGGAGAG TC (서열 3) 및

TGACCTCCTC AGGGGTGCAG TA (서열 4).

서열 번호 3 및 4는 MAGE-A10의 최종 엑손에 상보적인 서열에 해당한다.

MAGE-A1의 발현 빈도는 세포주 LB11-OC1 및 다음 2쌍의 프라이머를 사용하여 측정하였다:

CGGCCGAAGG AACCTGACCC AG (서열 5) 및

GCTGGAACCC TCACTGGGTT GCC (서열 6), 또는

TCAGGGGACA GGCCAACCC (서열 7) 및

CTTGCACTGA CCTTGATCAC ATA (서열 8).

본 실험에서는, 세포로부터 전(total) RNA를 추출하였다. 이후, 상기 웨이난츠 등(Weynants, et al.,)의 문헌에 따라, 2㎍의 샘플을 역 전사에 사용하였다. 이후, 전 cDNA의 1/10을 사용하고, 2.5㎕의 10 x PCR 완충액, 2.5㎕의 10mM dNTP, 10pmoles의 프라이머 및 0.5 유니트의 중합효소와 함께, 총 25㎕의 용적이 되도록 물을 보충하여 PCR을 수행하였다. 각 혼합물을 94℃에서 5분 동안 가열한 후, 30회 증폭과정을 수행하였다. 서열 1-4, 7 & 8의 경우, 1회 증폭 과정을 94℃에서 1분, 65℃에서 2분 및 72℃에서 3분 수행하였다. 서열 5 & 6의 경우에는 94℃에서 1분 및 72℃에서 3분으로 1회 증폭 과정을 수행하고, 최종 사슬 연장은 72℃에서 5분간 수행하여 전체 증폭 과정을 종결하였다. 5㎕의 샘플을 사용하여 각각에 대해 1% 아가로즈 겔상에서 전개시키고, 표준 에티듐 브로마이드 염색 관찰을 통해 분석을 실시하였다.

서열 1 & 2를 사용한 경우에 있어서는, MAGE-A10의 발현 수준이 낮게 나타난 반면, 서열 3 & 4의 경우는 MAGE-A1과 동등한 발현 수준을 나타냈다. 이 결과는동등한 발현 수준을 나타낸 상기 캐럴 등(Carrel, et al.,)의 웨스턴 블롯팅 작업 결과와도 일치한다.

서열 3 & 4가 MAGE-A10의 최종 엑손 영역에 대응하는 경우, 오염 게놈 DNA도 증폭되었을 가능성이 있다. 이 가능성에 대해 시험하기 위해, 역 전사 단계를 생략하고 증폭을 실시하였다. 그러나, 증폭이 관찰되지 않았으며, 이를 통해 오염의 가능성이 없음을 확인할 수 있었다. 프라이머로서 서열 3 & 4를 사용하여 많은 PCR 산물에 대해 서열결정을 수행한 결과, 모두 MAGE-A10에 해당하는 것으로 나타났다.

MAGE-A1에 대한 프라이머를 사용하여 얻은 결과와 비교해 볼 때, 서열 5 & 6에 비해 서열 7 & 8의 발현 수준이 높게 나타나는 결과가 제시되었다.

종전에 MAGE-A5, A9 및 A11의 경우는 매우 낮은 발현 수준이 관찰되었다. 따라서, 프라이머의 교체가 상기한 결과를 나타내는 요인임을 추측할 수 있었다.

실시예 2

상기 실시예에서 얻은 결과로부터, 유전자, 예를 들면 MAGE 유전자의 발현 빈도를 결정하기 위한 보다 우수한 방법의 필요성을 확인할 수 있었다. 따라서 본 실시예에서는 이를 위해 개발된 방법에 대해 설명하고자 한다.

표준 절차[참조: De Plaen, et al., Methods 12: 125-142 (1997); 본 명세서 참고문헌으로 인용됨]에 따라, MAGE-A 양성 샘플로부터 cDNA 라이브러리를 제작하고, 이를 대장균내에서 재조합 플라스미드로 유지하였다.

구체적으로 설명하면, 샘플을 구아니딘 티오시아네이트중에서 균질화시켜 용균물을 형성한 후, 이를 CsCl 쿠션 상단에 로딩하였다. 이후, 2개의 연속올리고(dT) 셀룰로즈 컬럼을 통해 전 RNA를 프로세싱하여 폴리(A)+ RNA를 분리하였다. 분리된 폴리(A)+ RNA를 NotI 제한 부위를 포함하는 올리고(dT) 프라이머를 사용하여 cDNA로 전환시켰다. 수득된 cDNA를 BstXI 어댑터에 연결시키고, NotI로 분해한 후, 발현 벡터 pcDNAI/Amp의 BstXI 및 NotI 부위내로 삽입하였다. 수득된 재조합 플라스미드를 표준 전기영동 기술을 이용하여 대장균 DH5∝내로 도입한 후, 앰피실린(25㎍/㎖)으로 선별하였다.

모든 라이브러리들을 앰피실린이 보강된 LB 배지중에 희석시켜 ㎕당 3-6개의 클론을 수득하였다. 이후, 9.6㎖의 희석액을 각각 취해 96 마이크로웰 플레이트(마이크로웰당 100㎕)에 시딩하였다. 모든 라이브러리를 2 또는 3개의 플레이트에 시딩하여 플레이트 전반에 걸쳐 확산된 약 100,000개의 독립적인 클론들을 수득하였다. 플레이트를 37℃에서 밤새 배양한 후, 모든 마이크로웰로부터 10㎕씩 모아, 모든 플레이트에서 20종의 상이한 푸울(즉, 라인별로 8종의 푸울 및 컬럼별로 12종의 푸울)을 수득하였다. 플레이트와 푸울을 증배(duplicate)시키고, 동결된 마스터(-70℃, 20% 글리세롤 함유 LB 배지)와 증배물을 PCR 분석을 위해 4℃에서 유지시켰다.

생 균주 및 동결 균주 모두에 대해 PCR 분석을 실시하는데, 라인별 및 컬럼별로 모은 푸울에 대해 1차 분석을 수행하였다. 양성 라인과 양성 컬럼의 교차점에서 양성 마이크로웰이 발견되었다. 증폭 분석 수행을 위해, 3㎕의 생 균주에 2.5㎕의 10 x PCR 완충액, 2.5㎕의 10mM dNTP, 10 pmoles의 각 프라이머 및 0.5 유니트의 중합효소와 함께, 총 25㎕의 용적이 되도록 물을 보충하였다.

대부분의 경우에 있어, 플레이트내 양성 웰의 수는 20% 미만으로 나타났다. 유해물의 분포에 따라, 양성 클론의 비율이 20% 미만인 경우 웰내 단일 클론을 가질 가능성은 90% 이상이 된다. 웰의 10% 미만이 양성이 되는 시점까지 제한 희석을 실시하면, 예상 정확도가 95%에 이르게 된다.

실험 결과, 양성의 수치는 20% 미만이었다. 각 웰내 독립적인 클론의 수를 감안하여, 라이브러리내 상이한 MAGE-A cDNA의 풍요도(abundance)를 계산할 수 있었다.

총 12종의 MAGE-A 유전자에 대해 7개의 cDNA 라이브러리(5종의 종양 세포주, 1종의 정소 라이브러리, 1종의 태반 라이브러리)를 대상으로 실험을 반복하였다. 그 결과가 하기 표 1에 제시되어 있다. 표 1은 종양 세포주, 정소 및 태반에서의 MAGE-A 유전자의 발현 수준을 나타낸 것이다.

주) 종양 세포주명 또는 조직명 방향으로 첫번째 줄은 유해물 분포에 따라, PCR 분석 결과 양성으로 결정된 마이크로웰의 수(괄호안의 수치)로부터 계산된 라이브러리내에 클로닝된 MAGE-A cDNA의 풍요도를 나타낸 것이다. 하나의 마이크로웰에는 350 내지 860개의 상이한 클론이 포함되어 있다. 두번째 줄은 클로닝되지 않은 cDNA에 대해 실시한 PCR 분석 결과를 나타낸 것이다. 아가로즈 겔중에서 PCR 산물을 분리함으로써 얻어진 밴드의 강도에 따라 발현 수준을 평가하여 ++++, +++, ++, + 또는 +/- 로 표시하였다. 산물 부재는 -로 표시되어 있다. 첫번째 평가 결과는 종래의 프라이머(De Plaen et al., 1994)를 사용하여 얻었으며, 유전자 MAGE-A1, 9 및 10에 대해 괄호안에 제시된 두번째 평가 결과는 최근 개발된 프라이머쌍을 사용하여 얻은 것이다.

상기 표 1에 제시된 바와 같이, 결과들을 RT-PCR에서 얻은 결과들과 비교하였다. MAGE-A1, A9 및 A10에 대해서는 상이한 프라이머쌍을 사용하여 이중으로 평가하고, 아가로즈 겔상의 밴드 강도를 기준으로 발현 수준을 추산하였다.

제한 희석 분석 결과, MAGE-A10의 발현 수준은 서열 3 및 4를 사용하여 얻은 수치에 버금가고, 서열 1 및 2를 사용하여 얻은 수치에 비해서는 높게 나타났다. 이와 같은 수치 상승은 상기 캐럴 등의 문헌 및 1996년 10월 3일자 미국 특허 출원 일련번호 제 08/724,774 호(두 문헌 모두 본 명세서에 참고문헌으로 인용됨)에 보고된 웨스턴 블롯팅 작업의 결과와 일치한다. 빈도 또한 여러 라인에서 MAGE-A1의 빈도 수치와 필적하게 나타났다. 다른 라인에서는 수준이 감소되었지만, A1, A2 또는 A12의 경우에 대해서는 여전히 필적할만한 수준을 나타냈다.

A1, A2, A3, A4, A6 및 A12에 대한 빈도 계산치는 RT-PCR에 의해 얻어진 결과와 본질적으로 일치하였다. 하나의 라이브러리에서는, 서열 7 및 8을 사용하여 얻은 결과와는 일치하였으나, 서열 5 및 6을 사용하여 얻은 결과와는 일치하지 않는 결과(분석 124,000당 1개의 클론)가 나타났는데, 이는 서열 5 및 6이 전사물 측정에 더욱 효율적인 반면, 서열 7 및 8은 발현 수준 측정에 유리함을 암시한다.

실시예 3

상기 실험 결과중 후속 연구를 진행시키게 한 양태는 MAGE-A8의 발현에 대한 것이었다. 항상 미약한 발현이 관찰되었으나, 세포주 TT-THYR에서는 예외적으로 반-정량적 PCR 분석시 높은 수준의 발현을 나타냈다.

TT-THYR 라이브러리내 삽입체의 평균 크기는 0.9kb에 불과하며, MAGE-A8 mRNA의 최종 450 뉴클레오티드 분절을 증폭하도록 프라이머를 고안하였다. MAGE-A1, A2, A4 및 A8에 대해서도 유사한 프라이머를 다음과 같이 고안하였다:

서열 9 GAAGAGAGCGGTCAGTGTTC-3 (센스)

서열 10 AATCCAGGTATGCATATATCTTTA (안티-센스)

서열 11 GCCTCTTTGAAGAGAGCAGTC (센스)

서열 12 CAAAGAAGCAAAAACATACACATA (안티-센스)

서열 13 CACTCTGTTTGAAGAAAATAGTC (센스)

서열 14 AGTATCTTTTAATTTATCTCACCTA (안티-센스)

서열 15 AGCATGTTGGGTGTGAGGGA (센스)

서열 16 AGGGTACACTAAGAGGTACAG (안티-센스)

(서열 9 및 10은 A1을, 서열 11 및 12는 A2를, 서열 13 및 14는 A4를 그리고 서열 15 및 16은 A8을 증폭시키는데 사용)

전술한 바와 같이, 상기 프라이머를 사용하여 RT-PCR을 수행하였다. 완결 시점에서, MAGE-A8의 발현 빈도는 훨씬 높게 즉, MAGE-A2와 같은 수준으로 나타났다.

정소에 대한 분석 결과에서는, MAGE-A4의 발현 수준이 MAGE-A1에 비해 높은 것으로 밝혀졌으며, A2, A3, A8, A9 및 A11의 수준은 낮게 나타나고, A6, A10 또는 A12에 대한 cDNA는 발견되지 않았다. 이러한 결과는 MAGE-A1 및 MAGE-A10에 대해 상기 캐럴 등의 문헌에 제시된 결과와 일치한다.

태반에 대해서는, MAGE-A10이 최고의 발현 수준을 나타낸 반면, A1-A7, A9 및 A12는 분석된 230,000개의 클론중에서 전혀 발견되지 았았다.

실시예 4

MAGE-A 유전자에 대한 문헌은 많으나, 이들중 몇몇에 대한 cDNA는 MAGE-A1을 기초로 한 구조에 관한 추론이 있을 뿐, 별도로 분리된 바가 전혀 없었다.

상기 실시예 2에 기술된 방법에 의해, MAGE-A5, A8, A9, A10 및 A11에 대한 cDNA를 분리할 수 있었다. MAGE-A10에 대한 cDNA만이 1996년 10월 3일자 미국 특허 출원 일련번호 제 08/724,774 호(본 명세서에 참고문헌으로 인용됨)에 개시되어 있을 뿐, 다른 것들은 공지된 바가 없었다. A5, A8, A9 및 A11에 대한 cDNA가 서열 17-20으로 각각 제시되어 있다. 또한, cDNA의 서열에 대한 정보로부터, 도 1에 제시된 바와 같이, 유전자의 엑손/인트론 구조를 완성할 수 있었다.

MAGE-A5 cDNA의 서열결정으로, 이것이 MAGE-A10의 첫번째 2개의 엑손, 미지의 엑손 서열 후, MAGE-A5의 2개의 엑손으로 이루어진다는 흥미로운 사실을 발견할 수 있었다.

상기 실시예들은 본 발명을 설명하는 것으로, 본 명세서에 제시된 핵산 분자 외에, 관심있는 특정 유전자의 발현 빈도를 측정하는 방법을 포함한다. 이 방법은 샘플로부터 cDNA를 제조한 후, 이 cDNA를 세포내로 형질전환 또는 형질감염시켜 형질전환체/형질감염체의 라이브러리를 생성하는 것으로 이루어진다. 이들 세포는 이후, 대략 동일한 크기를 갖는 다수의 샘플로 나눈 후, cDNA의 존재(함량 대비)에 대해 각 샘플을 분석한다. 양성 샘플의 수는 시험된 샘플 총수의 20% 이하이어야 하며, 시험된 샘플 수의 10% 이하가 더욱 바람직하다. 양성체의 수가 소정 수치 이상이면, 라이브러리를 희석하고, 샘플을 나누어 재차 분석을 반복 실시한다. 양성 수치가 소정의 수치 이하일 때, 각 MAGE cDNA의 빈도를 측정한다.

상기 방법은 샘플을 상이한 비율로 모을 수 있도록 소정의 어레이(array)내에 분배하여 실시하는 것이 바람직하다. 샘플을 상기한 방법으로 배열하면, 2개의 샘플 푸울이 교차하는 위치를 결정함으로써, 관심의 cDNA를 포함하는 샘플을 결정할 수 있다. 수직선과 수평선으로 배열된 직사각형의 샘플 어레이를 예를 들어 생각하면, 수평선을 "A", "B", "C" 등의 문자로 표시하고, 수직선을 "1", "2", "3" 등의 숫자로 표시하여, 푸울 "A", "B", "2", "3" 등을 생성할 수 있다. 각 수직선과 수평선이 교차하는 지점을 "A1", "B2", "C3", "D4" 등과 같은 부호로 표시한다. 푸울 "B"와 푸울 "7"이 양성이면, "B7" 지점의 샘플은 양성이라는 결론에 도달할수 있다. 이와 같은 방법에 의하면, 관심 샘플을 포함하는 웰을 동정할 수 있다.

발현 측정 외에도, 상기 방법에 의하면 관심의 cDNA 분자, 특히 저 빈도로 존재하는 분자에 대한 동정이 가능하다. 본 명세서에서 설명한 바와 같이, 본 발명의 실시로 다양한 MAGE 유전자에 대한 cDNA를 분리할 수 있었다. 이러한 cDNA는 종전에는 분리된 적이 없는 것들로, 본 발명은 또한 서열 18, 19 또는 20에 의해 암호화된 단백질의 아미노산 서열을 갖는 단백질을 암호화하는 cDNA 분자와 같이, MAGE-A8, MAGE-A9 및 MAGE-A11 단백질을 암호화하는 분리된 cDNA 분자를 특징으로 한다.

또한, 본 발명은 서열 17에 개시된 바와 같은 신규 분리된 핵산 분자 또는 기타 유사 분자들 즉, 특정 뉴클레오티드 서열을 사이에 두고, MAGE-A5의 2개의 엑손과 MAGE-A10의 2개의 엑손을 포함하는 분자 뿐아니라, MAGE-A5 부분과 MAGE-A10 부분 모두에 혼성화되는 부분을 포함하는 핵산 분자에 관한 것이다. 이들 핵산 분자 즉, 본 명세서에 제시된 모든 핵산 분자들을 사용하여, 프로모터에 작동가능하게 연결된 핵산 분자를 포함하는 발현 벡터를 제작할 수 있다. 이들 벡터 및 분리된 핵산 분자 자체는 세포를 형질전환 또는 형질감염시키는데 사용하여 재조합 세포를 제조할 수 있다.

이들 핵산 분자는 또한 진단용 및 치료용 모두에 사용할 수 있다. 진단 분야에 있어서는, 중합효소 연쇄 반응과 같은 표준 방법에 따라, 올리고머 프로브를 사용하여 세포 함유 샘플, 세포 용해물 등과 같은 샘플을 본 발명의 핵산 분자의 발현 여부에 대해 검사할 수 있다. 또한, 상기 핵산 분자에 의해 암호화된 단백질의존재 여부에 대한 측정을 통해 상기 샘플을 분석하는 것도 가능하다.

본 발명은 또한, 상기 신규 동정 및 분리된 분자를 기초로 하는 방법들에 관한 것이다. 예를 들면, 관심의 MAGE 핵산 분자에 특이적으로 혼성화하는 1종 이상의 올리고뉴클레오티드를 샘플과 접촉시킴으로써 MAGE 유전자의 발현을 측정할 수 있다. 예를 들면, MAGE-A1의 측정에는 서열 9 및 서열 10을 사용할 수 있으며, 서열 11 및/또는 12를 사용하면 MAGE-A2를 측정할 수 있다. 예시한 바와 같이, PCR에 국한하지 않고, 어떠한 형태의 혼성화-의거 분석 방법도 사용가능하다. 항체 분석 같은 표준 방법이나 단백질 측정을 위한 기타 시스템에 의해 MAGE 단백질에 대한 분석을 실시할 수도 있다.

본 발명은 또한, 본 발명에 따른 MAGE 단백질의 아미노산 서열상에서 상호 연결된 약 8 내지 약 25개의 아미노산으로 이루어진 펩티드에 관한 것이다. 상기 펩티드는 HLA-A1, A2, A3, A24, B7, B8, B35, B44, B52 및 CW6 같은 HLA 분자를 포함하여, MHC I군 또는 II군 분자와 같은 MHC 분자에 대한 특이적 결합체이다. 관련 서열들은 예를 들면 문헌 "Parker, et al., J. Immunol 152: 163 (1994), D'Amaro et al., Hum. Immunol. 43: 13-18 (1995), Drijfhout, et al., Hum. Immunol. 43: 1-12 또는 Sturniolo, et al., Nat. Biotechnol 17(6): 555-61 (1999); 상기 문헌 모두 본 명세서에 참고문헌으로 인용됨" 또는 NIH 월드와이드 웹 사이트 URL http://bimas.dcrt.hih.gov. 및 http://www.unituebingen.de/uni/kxc(이들 모두 본 명세서에 참고로 인용됨) 같은 웹 사이트에 제시된 방법을 이용하여 결정하였다. 하기 제시된 목록들은 관련 MAGE 아미노산 서열과 함께 몇몇의 이러한 펩티드를 나타낸 것이다. 완성된 아미노산 서열은 서열 21-24에 제시되어 있는데, 서열 21은 MAGE-A5, 서열 22는 MAGE-A8, 서열 23은 MAGE-A9 및 서열 24는 MAGE-A11에 대한 것이다:

MAGE A5: HLA-A1 결합체

98-107 SPDPESVFR

69-78 SAIPTAIDF

32-41 TTEEQEAVS

116-125 LIHFLLLKY

113-122 VADLIHFLL

115-124 DLIHFLLLK

2-11 SLEQKSQHC

77-86 FTLWRQSIK

73-82 TAIDFTLWR

74-83 AIDFTLWRQ

15-24 GLDTQEEAL

MAGE A5: HLA-A2 결합체

112-123 KVADLIHFL

108-117 ALSKKVADL

24-33 GLVGVQAAT

70-79 AIPTAIDFT

38-47 AVSSSSPLV

22-31 ALGLVGVQA

15-24 GLDTQEEAL

45-54 LVPGTLGEV

31-40 ATTEEQEAV

71-80 IPTAIDFTL

113-122 VADLIHFLL

25-34 LVGVQAATT

78-87 TLWRQSIKG

48-57 GTLGEVPAA

18-27 TQEEALGLV

MAGE A5: HLA-A3 결합체

115-124 DLIHFLLLK

103-112 SVFRAALSK

108-116 ALSKKVADL

15-23 GLDTQEEAL

77-85 FTLWRQSIK

116-124 LIHFLLLKY

24-32 GLVGVQAAT

73-81 TAIDFTLWR

22-30 ALGLVGVQA

MAGE A5: HLA-A24 결합체

112-120 KVADLIHFL

42-50 SSPLVPGTL

17-25 DTQEEALGL

37-45 EAVSSSSPL

76-84 DFTLWRQSI

113-121 VADLIHFLL

71-79 IPTAIDFTL

15-23 GLDTQEEAL

108-116 ALSKKVADL

69-77 SAIPTAIDF

97-105 TSPDPESVF

63-71 KSPQGASAI

109-117 LSKKVADLI

67-75 GASAIPTAI

114-122 ADLIHFLLL

111-119 KKVADLIHF

MAGE A5: HLA-B7 결합체

71-79 IPTAIDFTL

112-123 KVADLIHFL

108-116 ALSKKVADL

37-45 EAVSSSSPL

17-25 DTQEEALGL

42-50 SSPLVPGTL

113-121 VADLIHFLL

38-47 AVSSSSPLV

60-68 GPLKSPQGA

54-62 PAAGSPGPL

114-122 ADLIHFLLL

67-75 GASAIPTAI

15-23 GLDTQEEAL

45-53 LVPGTLGEV

30-38 AATTEEQEA

31-39 ATTEEQEAV

100-108 DPESVFRAA

8-16 QHCKPEEGL

25-33 LVGVQAATT

109-117 LSKKVADLI

MAGE A5: HLA-B8 결합체

108-117 ALSKKVADL

37-46 EAVSSSSPL

109-118 LSKKVADLI

71-80 IPTAIDFTL

67-75 GASAIPTAI

42-50 SSPLVPGTL

102-110 ESVFRAALS

MAGE A5: HLA-B35 결합체

71-79 IPTAIDFTL

97-105 TSPDPESVF

109-118 LSKKVADLI

42-50 SSPLVPGTL

63-71 KSPQGASAI

112-120 KVADLIHFL

37-46 EAVSSSSPL

69-77 SAIPTAIDF

17-25 DTQEEALGL

60-68 GPLKSPQGA

116-124 LIHFLLLKY

67-75 GASAIPTAI

108-116 ALSKKVADL

113-121 VADLIHFLL

100-107 DPESVFRAA

31-39 ATTEEQEAV

106-114 RAALSKKVA

41-49 SSSPLVPGT

102-110 ESVFRAALS

30-38 AATTEEQEA

MAGE A5: HLA-B44 결합체

69-77 SAIPTAIDF

34-42 EEQEAVSSS

20-28 EEALGLVGV

33-41 TEEQEAVSS

90-98 QEEEGPSTS

51-59 GEVPAAGSP

114-122 ADLIHFLLL

41-49 SSSPLVPGT

92-100 EEGPSTSPD

97-105 TSPDPESVF

48-56 GTLGEVPAA

91-99 EEEGPSTSP

36-44 QEAVSSSSP

116-124 LIHFLLLKY

56-64 AGSPGPLKS

23-31 LGLVGVQAA

13-23 EEGLDTQEE

75-83 IDFTLWRQS

100-108 DPESVFRAA

17-25 DTQEEALGL

MAGE A5: HLA-B52 결합체

18-26 TQEEALGLV

97-105 TSPDPESVF

45-53 LVPGTLGEV

109-117 LSKKVADLI

71-79 IPTAIDFTL

63-71 KSPQGASAI

23-31 LGLVGVQAA

67-75 GASAIPTAI

20-28 EEALGLVGV

69-77 SAIPTAIDF

46-54 VPGTLGEVP

14-22 EGLDTQEEA

106-114 RAALSKKVA

113-121 VADLIHFLL

31-39 ATTEEQEAV

60-68 GPLKSPQGA

76-84 DFTLWRQSI

96-104 STSPDPESV

89-107 NQEEEGPST

112-120 KVADLIHFL

MAGE A5: HLA-CW6 결합체

112-120 KVADLIHFL

108-116 ALSKKVADL

71-79 IPTAIDFTL

113-121 VADLIHFLL

116-124 LIHFLLLKY

105-113 FRAALSKKV

67-75 GASAIPTAI

18-26 TQEEALGLV

37-45 EAVSSSSPL

114-122 ADLIHFLLL

45-53 LVPGTLGEV

42-50 SSPLVPGTL

15-23 GLDTQEEAL

8-16 QHCKPEEGL

20-28 EEALGLVGV

17-25 DTQEEALGL

41-49 SSSPLVPGT

63-71 KSPQGASAI

76-84 DFTLWRQSI

109-117 LSKKVADLI

MAGE A11: HLA-A1 결합체

376-384 GTDPACYEF

281-290 EVDPTSHSY

211-220 LIDPESFSQ

71-80 NLEDRSPRR

142-150 QAEEQEAAF

352-360 FGEPKRLLT

MAGE A11: HLA-A2 결합체

313-321 GLLIIVLGV

350-358 FLFGEPKRL

221-229 ILHDKIIDL

89-97 VLWGPITQI

333-341 VMWEVLSIM

384-392 FLWGPRAHA

271-279 MQLLFGIDV

225-233 KIIDLVHLL

398-406 KVLEYIANA

337-345 VLSIMGVYA

289-297 YVLVTSLNL

316-324 IIVLGVIFM

335-353 WEVLSIMGV

MAGE A11: HLA-A3 결합체

272-280 QLLFGIDVK

228-236 DLVHLLLRK

89-97 VLWGPITQI

359-367 LTQNWVQEK

313-321 GLLIIVLGV

MAGE A11: HLA-A24 결합체

343-351 VYAGREHFL

255-263 NYEDYFPEI

351-359 LFGEPKRLL

225-234 KIIDLVHLL

288-296 SYVLVTSLN

236-244 KYRVKGLIT

82-90 RITGGEQVL

311-319 KSGLLIIVL

413-421 SYPSLYEDA

MAGE A11: HLA-B7 결합체

98-106 FPTVRPADL

414-422 YPSLYEDAL

283-291 DPTSHSYVL

64-73 QVFREQANL

76-84 SPRRTQRIT

289-297 YVLVTSLNL

127-135 QAQEEDLGL

307-315 QSMPKSGLL

266-279 EASVCMQLL

147-155 EAAFFSSTL

MAGE A11: HLA-B8 결합체

98-106 FPTVRPADL

221-229 ILHDKIIDL

241-250 GLITKAEML

234-242 LRKYRVKGL

2-10 ETQFRRGGL

309-317 MPKSGLLII

307-315 QSMPKSGLL

MAGE A11: HLA-B5 결합체

374-382 VPGTDPACY

410-418 DPTSYPSLY

102-110 RPADLTRVI

394-402 TSKMKVLEY

309-317 MPKSGLLII

283-291 DPTSHSYVL

181-190 SPTAMDAIF

414-422 YPSLYEDAL

98-106 FPTVRPADL

389-497 RAHAETSKM

48-56 APYGPQLQW

311-319 KSGLLIIVL

378-386 DPACYEFLW

MAGE A11: HLA-B44 결합체

143-151 AEEQEAAFF

58-66 QDLPRVQVF

256-269 YEDYFPEIF

392-400 AETSKMKVL

166-174 AESPSPPQS

144-152 EEQEAAFFS

394-402 TSKMKVLEY

280-288 KEVDPTSHS

265-273 REASVCMQL

406-414 ANGRDPTSY

410-418 DPTSYPSLY

335-343 WEVLSIMGV

146-154 QEAAFFSST

331-339 EEVMWEVLS

MAGE A11: HLA-B52 결합체

309-318 MPKSGLLII

102-110 RPADLTRVI

314-322 LLIIVLGVI

333-341 VMWEVLSIM

271-279 MQLLFGIDV

218-226 SQDILHDKI

181-189 SPTAMDAIF

315-323 LIIVLGVIF

29-37 FGLQVSTMF

219-227 QDILHDKII

57-65 SQDLPRVQV

90-98 LWGPITQIF

245-254 KAEMLGSVI

329-338 IPEEVMWEV

256-264 YEDYFPEIF

58-66 QDLPRVQVF

128-136 AQEEDLGLV

283-291 DPTSHSYVL

87-95 EQVLWGPIT

325-334 EGNCIPEEV

MAGE A11: HLA-CW6 결합체

225-233 KIIDLVHLL

311-319 KSGLLIIVL

287-295 HSYVLVTSL

221-229 ILHDKIIDL

147-155 EAAFFSSTL

229-237 LVHLLLRKY

269-277 VCMQLLFGI

244-252 TKAEMLGSV

313-321 GLLIIVLGV

222-230 LHDKIIDLV

184-192 AMDAIFGSL

MAGE A9: HLA-A1 결합체

94-103 SVDPAQLEF

167-176 EVDPAGHSY

262-271 GSDPAHYEF

134-143 MLESVIKNY

153-162 ASEFMQVIF

189-198 LGDGHSMPK

238-247 YGEPRKLLT

112-121 VAELVHFLL

246-255 TQDWVQENY

280-289 TSYEKVINY

249-258 WVQENYLEY

MAGE A9: HLA-A2 결합체

199-208 ALLIIVLGV

223-232 ALSVMGVYV

102-111 FMFQEALKL

307-316 VLGEEQEGV

270-279 FLWGSKAHA

175-184 YILVTALGL

157-166 MQVIFGTDV

140-149 KNYKRYFPV

219-228 VIWEALSVM

290-299 VMLNAREPI

284-293 KVINYLVML

221-230 WEALSVMGV

24-33 GLMGAQEPT

187-196 SMLGDGHSM

MAGE A9: HLA-A3 결합체

235-244 HMFYGEPRK

114-123 ELVHFLLHK

203-212 IVLGVILTK

225-234 SVMGVYVGK

102-111 FMFQEALKL

134-143 MLESVIKNY

158-167 QVIFGTDVK

118-127 FLLHKYRVK

199-208 ALLIIVLGV

107-116 ALKLKVAEL

270-279 FLWGSKAHA

148-157 VIFGKASEF

MAGE A9: HLA-A24 결합체

281-290 SYEKVINYL

237-246 FYGEPRKLL

229-238 VYVGKEHMF

71-80 VYYTLWSQF

141-150 NYKRYFPVI

236-245 MFYGEPRKL

284-293 KVINYLVML

MAGE A9: HLA-B7 결합체

169-178 DPAGHSYIL

300-309 YPSLYEEVL

127-136 EPVTKAEML

284-293 KVINYLVML

111-120 KVAELVHFL

197-206 KAALLIIVL

17-26 EAQGEDLGL

107-116 ALKLKVAEL

193-202 HSMPKAALL

195-204 MPKAALLII

228-237 GVYVGKEHM

181-190 LGLSCDSML

201-210 LIIVLGVIL

173-182 HSYILVTAL

175-184 YILVTALGL

92-101 SSSVDPAQL

67-76 SSISVYYTL

102-111 FMFQEALKL

112-121 VAELVHFLL

180-189 ALGLSCDSM

MAGE A9: HLA-B8 결합체

107-116 ALKLKVAEL

127-136 EPVTKAEML

195-204 MPKAALLII

193-202 HSMPKAALL

169-178 DPAGHSYIL

300-309 YPSLYEEVL

MAGE A9: HLA-B52 결합체

195-204 MPKAALLII

200-209 LLIIVLGVI

219-228 VIWEALSVM

157-166 MQVIFGTDV

104-113 FQEALKLKV

131-140 KAEMLESVI

152-161 KASEFMQVI

96-105 DPAQLEFMF

201-210 LIIVLGVIL

300-309 YPSLYEEVL

212-221 DNCAPEEVI

169-178 DPAGHSYIL

278-287 AETSYEKVI

141-150 NYKRYFPVI

MAGE A9: HLA-CW6 결합체

197-206 KAALLIIVL

111-120 KVAELVHFL

173-182 HSYILVTAL

107-116 ALKLKVAEL

199-208 ALLIIVLGV

100-109 LEFMFQEAL

130-139 TKAEMLESV

115-124 LVHFLLHKY

201-210 LIIVLGVIL

MAGE A9: HLA-B44 결합체

105-113 QEALKLKVA

221-229 WEALSVMGV

47-55 EEVSAAGSS

296-304 EPICYPSLY

280-288 TSYEKVINY

217-225 EEVIWEALS

255-263 LEYRQVPGS

278-286 AETSYEKVI

166-174 KEVDPAGHS

33-41 GEEEETTSS

96-104 DPAQLEFMF

222-230 EALSVMGVY

MAGE A9: HLA-B35 결합체

260-269 VPGSDPAHY

296-305 EPICYPSLY

195-204 MPKAALLII

300-309 YPSLYEEVL

127-136 EPVTKAEML

96-105 DPAQLEFMF

169-178 DPAGHSYIL

280-289 TSYEKVINY

65-74 ASSSISVYY

264-273 DPAHYEFLW

92-101 SSSVDPAQL

18-27 AQGEDLGLM

222-231 EALSVMGVY

64-73 GASSSISVY

197-206 KAALLIIVL

MAGE A8: HLA-A1 결합체

171-180 EVDPAGHSY

266-275 GSDPVRYEF

138-147 MLESVIKNY

157-166 ASECMQVIF

250-259 TQEWVQENY

98-107 SPDPAHLES

116-125 VAELVRFLL

253-262 WVQENYLEY

193-202 LGDDQSTPK

181-190 LVTCLGLSY

MAGE A8: HLA-B52 결합체

199-208 TPKTGLLII

223-232 AIWEALSVM

161-170 MQVIFGIDV

286-295 YVKVLEHVV

204-213 LLIIVLGMI

135-144 KAEMLESVI

262-271 RQAPGSDPV

205-214 LIIVLGMIL

156-165 KASECMQVI

173-182 DPAGHSYIL

MAGE A8: HLA-A3 결합체

280-289 ALAETSYVK

118-127 ELVRFLLRK

122-131 FLLRKYQIK

1-10 MLLGQKSQR

203-212 GLLIIVLGM

210-219 GMILMEGSR

162-171 QVIFGIDVK

138-147 MLESVIKNY

2-11 LLGQKSQRY

111-120 ALDEKVAEL

274-283 FLWGPRALA

29-38 QIPTAEEQK

24-33 GLMDVQIPT

253-262 WVQENYLEY

MAGE A8: HLA-B7 결합체

299-308 RVRISYPSL

304-313 YPSLHEEAL

173-182 DPAGHSYIL

22-31 APGLMDVQI

64-73 SPEGASSSL

240-249 SVYWKLRKL

115-124 KVAELVRFL

37-46 KAASSSSTL

17-26 QAQGEAPGL

199-208 TPKTGLLII

216-225 GSRAPEEAI

196-205 DQSTPKTGL

116-125 VAELVRFLL

MAGE A8: HLA-B8 결합체

197-206 QSTPKTGLL

199-208 TPKTGLLII

240-249 SVYWKLRKL

297-306 NARVRISYP

111-120 ALDEKVAEL

299-308 RVRISYPSL

MAGE A8: HLA-A2 결합체

288-297 KVLEHVVRV

274-283 FLWGPRALA

24-33 GLMDVQIPT

111-120 ALDEKVAEL

115-124 KVAELVRFL

45-54 LIMGTLEEV

179-188 YILVTCLGL

161-170 MQVIFGIDV

203-212 GLLIIVLGM

191-200 GLLGDDQST

223-232 AIWEALSVM

71-80 SLTVTDSTL

279-288 RALAETSYV

251-260 QEWVQENYL

184-193 CLGLSYDGL

MAGE A8: HLA-A24 결합체

241-250 VYWKLRKLL

145-154 NYKNHFPDI

273-282 EFLWGPRAL

121-130 RFLLRKYQI

126-135 KYQIKEPVT

115-124 KVAELVRFL

285-294 SYVKVLEHV

303-312 SYPSLHEEA

201-210 KTGLLIIVL

116-125 VAELVRFLL

299-308 RVRISYPSL

37-46 KAASSSSTL

205-214 LIIVLGMIL

17-26 QAQGEAPGL

64-73 SPEGASSSL

131-140 EPVTKAEML

179-188 YILVTCLGL

185-194 LGLSYDGLL

42-51 SSTLIMGTL

111-120 ALDEKVAEL

MAGE A8: HLA-CW6 결합체

115-124 KVAELVRFL

201-210 KTGLLIIVL

177-186 HSYILVTCL

240-249 SVYWKLRKL

111-120 ALDEKVAEL

241-250 VYWKLRKLL

119-128 LVRFLLRKY

205-214 LIIVLGMIL

104-113 LESLFREAL

42-51 SSTLIMGTL

134-143 TKAEMLESV

MAGE A8: HLA-B35 결합체

264-273 APGSDPVRY

199-208 TPKTGLLII

304-313 YPSLHEEAL

131-140 EPVTKAEML

173-182 DPAGHSYIL

100-109 DPAHLESLF

39-48 ASSSSTLIM

268-277 DPVRYEFLW

MAGE A8: HLA-B44 결합체

282-291 AETSYVKVL

20-29 GEAPGLMDV

225-234 WEALSVMGL

33-42 AEEQKAASS

234-243 YDGREHSVY

109-118 REALDEKVA

221-230 EEAIWEALS

170-179 KEVDPAGHS

34-43 EEQKAASSS

296-305 VNARVRISY

226-235 EALSVMGLY

237-246 REHSVYWKL

본 발명은 또한 상기 분자들을 주성분으로 하는 조성물, 예를 들면 본 발명에 따른 MAGE 단백질, 및 사이토킨, 인터류킨(예, IL-2, IL-4, IL-12 등) 또는 GM-CSF 같은 약학적으로 허용되는 보조제를 포함하는 조성물에 관한 것이다. 마찬가지로, 전술한 1종 이상의 펩티드 및 보조제, HLA 또는 MHC 분자와 펩티드의 복합체 및 보조제를 포함하는 조성물 또한 본 발명의 일부분이다.

상기 복합체들은 그 자체로서 또는 수상돌기(dendritic) 세포 같은 항원 제시 세포상에 결합하여, 비-증식성이 되도록 함으로써 치료 효과를 거둘 수 있다.

당해 기술 분야의 기술자들은 펩티드 또는 단백질을 암호화하는 핵산 분자들을 리포좀(liposome) 조성물 같은 적합한 조성물의 형태로 사용할 수 있음을 알 수 있을 것이다. 본 발명은 또한 상기 펩티드 및 이것의 MHC 결합 파트너 즉, HLA 분자의 복합체에 특이적인 분리된 세포용해성 T 세포주에 관한 것이다.

HLA 분자에 결합할 수 있는 상기 펩티드의 능력을 이용하여, 펩티드가 샘플내 세포에 결합하는지의 여부를 측정함으로써 HLA-A^*0201 양성 세포 같은 특정 HLA 분자에 대해 양성인 세포의 존재를 결정하기 위한 제제로서 펩티드를 유용하게 사용할 수 있다. 이러한 "리간드/수용체" 유형의 반응은 당해 기술분야에 잘 알려져 있으며, 이를 측정하기 위한 다양한 방법이 이용될 수 있다.

본 발명의 또다른 양태는 세포 형질감염을 통해 변형된 데카펩티드의 직접 합성에 필요한 정보를 운반하는 소위 "미니-유전자"에 관한 것이다. 미니 유전자는 1종 이상의 항원성 펩티드를 암호화하여, 플라스미드를 이용한 형질감염 또는 백시니아(vaccinia)나 아데노바이러스내로의 클로닝을 통해 숙주 세포 게놈으로 형질전이되도록 고안될 수 있다[참조예: Zajac, et al.,Int. J. Cancer71: 496 (1997); 본 명세서에 참고문헌으로 인용됨]. 재조합 백시니아 바이러스 벡터 같은 상기 재조합 벡터는 융합 단백질을 생산하도록 구성할 수 있다. 예를 들면, 융합 단백질의 일부분을 목적하는 종양 거부 항원 전구체 또는 종양 거부 항원으로 하고, 별도의 단백질 또는 펩티드 분절이 포함될 수 있도록 융합 단백질을 구성할 수 있다. 융합 단백질에 부가될 수 있는 별도의 단백질 또는 펩티드 분절의 예로는 리포터 단백질 또는 펩티드 즉, 그린 형광 단백질 같이, 발현이 일어났음을 나타내기 위해 관측가능한 시그날을 주는 단백질 또는 펩티드를 들 수 있다. 추가 리포터 단백질로는 β-갈락토시다제, 루시페라제, dhfr 및 "eGFP" 같은 단백질 또는 문헌 "Cheng, etal., Nature Biotechnology 14: 606 (1996); 본 명세서에 참고문헌으로 인용됨"에 기술된 바와 같은 향상된 그린 형광 단백질 등이 있으나, 이들로만 제한되지는 않는다. 당해 기술분야의 기술자들이 이용할 수 있는 다양한 리포터 단백질을 다른 방법으로 사용할 수도 있다. 예컨대, "GFP" 및 "eGFP"의 경우, 감염 세포에 사용하여 이를 가시화함으로써, 유동 세포계산법(flow cytometry)을 이용한 감염 세포의 탐지 및 분리를 용이하게 할 수도 있다. 다른 리포터 단백질의 경우는 웨스턴 블롯팅, 면역침전 등의 방법 이용시 유용하다. 이러한 기술은 당해 기술분야에서 통용되는 표준 기술로서, 본 명세서에서는 반복 설명하지 않도록 하겠다. 융합 펩티드로부터 종양 거부 항원 전구체 또는 종양 거부 항원을 절단하는데 도움을 주는 단백질 또는 펩티드 분절 또한 포함될 수 있다. 융합 단백질에는 전술한 1종 이상의 종양 거부 항원과 함께, 관련 MHC 분자로 종양 거부 항원 또는 항원들의 전달을 촉진시키는 단백질 또는 펩티드도 또한 포함될 수 있다. 이러한 단백질 및 펩티드 또한 당해 기술분야에 잘 알려져 있어, 본 명세서에서는 별도로 설명하지 않도록 하겠다.

본 발명은 또한, 상기 재조합 벡터로 형질감염된 재조합 세포에 관한 것이다. 이러한 세포로는 예컨대 어떠한 유형의 진핵 세포도 가능하며, 인체 세포가 특히 바람직하다. 이러한 세포는 이후, 종양 거부 항원 전구체 또는 종양 거부 항원을 생산하는데 사용할 수 있다. 이는 또한, 생체외에서 사용시 특정 MHC 분자와 종양 거부 항원의 복합체에 특이적인 세포용해성 T 세포를 생산할 수도 있다. 이러한 작업은 형질감염된 세포를 혈액 샘플과 같은 T 세포원에 접촉시켜, 융합 단백질의발현 및 TRA(즉, 종양 거부 항원)의 프로세싱 결과 생성된 MHC 분자와 TRA의 복합체에 특이적인 샘플내 특정 세포의 증식을 유발시킴으로써 간단히 수행될 수 있다. 이러한 세포는 비-증식성이 된 경우, 백신 재료로 사용될 수도 있는데, 이것은 이후 표면상에 관련 복합체를 제시하여 본 명세서에 제시된 바와 같이 생체내에서 동일한 유형의 T 세포 반응을 유발시키게 된다. 마찬가지로, 벡터 또한 그 자체로서 백신 재료로 사용하여 세포 표면상에 MHC 분자와 펩티드의 복합체에 대한 T 세포 반응을 요하는 환자에게 투여할 수 있다. 물론, 생체외에서 생산된 T 세포 또한 환자 치료시 사용할 수 있다.

상기 펩티드는 다른 종양 거부 항원으로부터 유래된 펩티드와 결합하여 '폴리토프(polytope)'를 형성할 수도 있다. 이러한 펩티드의 예가 미국 특허 출원 일련번호 제 08/672,351 호, 제 08/718,964 호(현 미국 특허 제__호), 제 08/487,135 호(현 미국 특허 제__호), 제 08/530,569 호 및 제 08/880,963 호(상기 문헌 모두 본 명세서에 참고문헌으로 인용됨)에 제시되어 있다.

사용가능한 또다른 펩티드들이 미국 특허 제 5,405,940 호; 제 5,487,974 호; 제 5,519,117 호; 제 5,530,096 호; 제 5,554,506 호; 제 5,554,724 호; 5,559,995 호; 제 5,585,461 호; 제 5,589,334 호; 제 5,648,226 호; 및 제 5,683,886 호; PCT 국제 공개 제 92/20356 호; 제 94/14459 호; 제 96/10577 호; 제 96/21673 호; 제 97/10837 호; 제 97/26535 호; 및 제 97/31017 호 뿐아니라, 계류중인 미국 출원 일련번호 제 08/713,354 호(상기 문헌 모두 본 명세서에 참고문헌으로 인용됨)에 개시되어 있다.

폴리토프는 2종 이상의 잠재적 면역원성 또는 면역 자극성 펩티드의 그룹으로, 다양한 방법으로 함께 결합시켜 해당 유형의 분자가 면역 반응을 자극 및/또는 유발시킬 것인지의 여부를 결정할 수 있다.

이들 펩티드는 서로 직접적으로 또는 플랭킹 서열을 사용하여 결합할 수 있다[관련 에피토프성 서열의 직접 결합과 관련하여서는 문헌 "Thompson et al.,Proc. Natl. Acad. Sci. USA92(13): 5845-5849 (1995)" 참조]. 백신으로서 폴리토프를 사용하는 것에 대해서는 잘 알려져 있다[참조예: Gilbert et al.,Nat. Biotechnol. 15(12): 1280-1284 (1997); Thomson et al.,supra; Thomson et al.,J. Immunol.157(2): 822-826 (1996); Tam et al.,J. Exp. Med.171(1): 299-306 (1990); 상기 문헌 모두 본 명세서에 참고문헌으로 인용됨]. 상기 탐의 문헌은 특히 폴리토프가 마우스 모델에서 항체 및 보호성 면역을 산출하는데 유용함을 제시하고 있다. 또한, 상기 문헌은 폴리토프가 분해시에, MHC가 될 수 있거나 또는 이것에 의해 제시되는 펩티드를 산출함을 밝히고 있다. 탐은 CTL을 통해 폴리토프 '스트링(strings)'로부터 프로세싱된 개별적 에피토프의 인지를 보여줌으로써 이를 입증하고 있다. 이러한 접근은 예컨대, 폴리토프에서 결합하여 인지를 유발할 수 있는 에피토프의 수를 결정하는데, 그리고 상이한 에피토프 조합의 효력을 결정하기 위해 이용될 수 있다. 상이한 조합이라 함은 특정 서브세트(subsets)의 종양 거부 항원을 발현하는 환자에 맞게 '주문-제작'된 것을 의미한다. 이들 폴리토프는 폴리펩티드 구조체로서 또는 핵산 전달 시스템을 이용하여 도입될 수 있다. 당해 기술분야에는 전술한 바와 같은 개개의 에피토프 또는 폴리토프를 암호화하는 DNA를 도입하기 위한 많은 다른 방법들이 있다[참조예: Allsopp et al.,Eur. J. Immunol.26(8); 1951-1959 (1996); 본 명세서에 참고문헌으로 인용됨]. 아데노바이러스, 폭스-바이러스(pox-virus), Ty-바이러스형 입자, 플라스미드, 박테리아 등이 사용가능하다. 상기 시스템을 마우스 모델에서 시험함으로써 제시된 인체내 상황에 가장 적합한 시스템을 결정할 수 있다. 또한 인체에 임상 시험할 수도 있다.

본 발명의 특징은 또한, 상기 펩티드를 사용하여 샘플내에서 세포용해성 T 세포의 존재를 결정하는 것에 관한 것이다. 샘플내 CTL이 펩티드/MHC 복합체와 반응하게 된다는 사실은 상기에서 밝힌 바 있다. 따라서, CTL이 샘플내에 존재함을 알고 있다면, 특정 HLA 분자에 대해 양성인 세포는 HLA-A2 양성 세포와 같은 양성 세포에 본 발명의 펩티드를 첨가하여 "용해"시킨 후, 예를 들면 방사능 크로뮴 방출, TNF 생성 등의 방법을 통해 T 세포 활성을 측정할 수 있다. 마찬가지로, 본 발명의 펩티드중 1종을 HLA 양성 세포와 함께 샘플에 첨가하고,⁵¹Cr 방출, TNF 존재 검출 등을 통해 HLA 양성 세포의 용해를 측정함으로써, 샘플내에 특이적 종양 침투 임파구("TILs")가 존재하는지의 여부를 결정할 수도 있다. 또한 CTL은 ELISPOT 분석[참조예: Schmittel et al., (1997).J. Immunol. Methods210: 167-174 및 Lalvani et al., (1997).J. Exp. Med.126: 859] 또는 MHC I군/펩티드의 형광발생 테트라머 복합체의 FACS 분석[참조: Dunbar et al., (1998),Current Biology8: 413-416, Romero, et al.,J. Exp. Med.188: 1641-1650 (1998); 상기 문헌 모두 본 명세서에 참고문헌으로 인용됨]에 의해 검출할 수도 있다.

물론, 상기 펩티드를 CTL 생성 유발에 사용할 수도 있다. 전술한 바와 같이, CTL 전구체는 적합한 복합체 대면시, CTL로 전환될 수 있다. 그 자체로서 상기한 "대면(confrontation)"을 유발시킴으로써, CTL을 생성할 수도 있다. 이러한 것은 생체내에서 뿐아니라 생체외에서도 상기 CTL을 산출하는데 유용하다.

본 발명의 다른 양태들은 당해 기술분야의 기술자라면 잘 알 수 있을 것이므로, 본 명세서에서는 특별히 한정하지 않기로 한다.

본 명세서에서 사용된 용어 및 표현은 제한을 하기 위한 것이 아니라 설명을 위한 것으로, 상기한 용어와 표현이 본 명세서에 제시 및 개시된 특징에 해당하는 부분 또는 그 일부분을 배제하는 의도로 사용되어서는 안되며, 본 발명의 다양한 변형 또한 본 발명의 범주내에 속함을 명시하고자 한다.

본 발명은 상술한 바와 같이 다양한 진단 및 치료의 용도에 사용될 수 있다.

Claims

서열 18, 서열 19 및 서열 20에 제시된 뉴클레오티드 서열로 이루어진 핵산 분자에 의해 암호화된 단백질을 암호화하는 분리된, 상보성 DNA 분자.
제 1 항에 있어서,

서열 18에 의해 암호화된 단백질을 암호화하는 분리된, 상보성 DNA 분자.
제 1 항에 있어서,

서열 19에 의해 암호화된 단백질을 암호화하는 분리된, 상보성 DNA 분자.
제 1 항에 있어서,

서열 20에 의해 암호화된 단백질을 암호화하는 분리된 핵산 분자.
제 1 항에 있어서,

서열 18의 뉴클레오티드 서열로 이루어진 분리된, 상보성 DNA 분자.
제 1 항에 있어서,

서열 19의 뉴클레오티드 서열로 이루어진 분리된, 상보성 DNA 분자.
제 1 항에 있어서,

서열 20의 뉴클레오티드 서열로 이루어진 분리된 핵산 분자.
프로모터에 작동가능하게 연결된, 제 1 항의 상보성 DNA 분자를 포함하는 발현 벡터.
제 1 항의 분리된 상보성 DNA 분자를 포함하는 재조합 세포.
제 8 항의 발현 벡터를 포함하는 재조합 세포.
(i) 엄격한 조건(stringent condition)하에서, MAGE-A10을 암호화하는 분리된 핵산 분자에 혼성화하는 제 1 뉴클레오티드 서열,

(ii) 엄격한 조건하에서, MAGE-A5를 암호화하는 분리된 핵산 분자에 혼성화하는 제 2 뉴클레오티드 서열 및

(iii) 상기 (i)과 (ii) 사이에 게재된 제 3 뉴클레오티드 서열을 포함하는 분리된 핵산 분자.
제 11 항에 있어서,

서열 17에 제시된 뉴클레오티드 서열을 포함하는 분리된 핵산 분자.
프로모터에 작동가능하게 연결된, 제 11 항의 분리된 핵산 분자를 포함하는 발현 벡터.
제 11 항의 분리된 상보성 핵산 분자를 포함하는 재조합 세포.
제 12 항의 분리된 핵산 분자를 포함하는 재조합 세포.
샘플내에서, 서열 17, 18, 19 또는 20의 뉴클레오티드 서열을 포함하는 핵산 분자의 존재를 측정하고, 상기 핵산 분자의 존재를 통해 샘플내 발암 여부를 결정하는 것을 포함하는, 샘플내 암 선별 방법.
제 16 항에 있어서,

중합효소 연쇄 반응을 통해 상기 핵산 분자의 존재를 측정하는 것을 포함하는 방법.