BR122023024959A2 - Peptídeo, receptor de célula t, anticorpo, linfócito t ativado, bem como métodos para produzi-los, ácido nucleico, célula hospedeira recombinante, composição farmacêutica, uso e kit - Google Patents

Peptídeo, receptor de célula t, anticorpo, linfócito t ativado, bem como métodos para produzi-los, ácido nucleico, célula hospedeira recombinante, composição farmacêutica, uso e kit Download PDF

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Abstract

peptídeo, receptor de célula t, anticorpo, linfócito t ativado, bem como métodos para produzi-los, ácido nucleico, célula hospedeira recombinante, composição farmacêutica, uso e kit. a presente invenção refere-se a peptídeos, proteínas, ácidos nucleicos e células para utilização em métodos de imunoterapia. mais especificamente, a presente invenção refere-se à imunoterapia do câncer. a presente invenção refere-se também a epítopos de peptídeos obtidos de células t associadas a tumores, isoladamente ou combinados com outros peptídeos associados a tumores, que podem, por exemplo, atuar como ingredientes farmacêuticos ativos de composições vacinais que estimulam respostas imunes antitumorais ou que estimulam células t ex vivo, que são depois transferidas a pacientes. peptídeos, quer ligados a moléculas do complexo principal de histocompatibilidade (mhc) ou peptídeos como tal, também podem ser alvos de anticorpos, de receptores de células t solúveis e de outras moléculas ligantes.

Description

[001] A presente invenção refere-se a peptídeos, proteínas, ácidos nucleicos e células para utilização em métodos de imunoterapia. Mais especificamente, a presente invenção refere-se à imunoterapia do câncer. A presente invenção refere-se também a epítopos de peptídeos obtidos de células T associadas a tumores, isoladamente ou combinados com outros peptídeos associados a tumores, que podem, por exemplo, atuar como ingredientes farmacêuticos ativos de composições vacinais que estimulam respostas imunes antitumorais ou que estimulam células T ex vivo, que são depois transferidas a pacientes. Peptídeos, quer ligados a moléculas do complexo principal de histocompatibilidade (MHC) ou peptídeos como tal, também podem ser alvos de anticorpos, de receptores de células T solúveis e de outras moléculas ligantes.
[002] A presente invenção refere-se a diversas novas sequências peptídicas e a variantes das mesmas, ambas derivadas tanto de moléculas de HLA classe I como de moléculas de HLA classe II, de células Tumorais humanas, que podem ser utilizadas em composições vacinais para produzir respostas imunes antitumorais ou como alvos para o desenvolvimento de compostos e células com atividade imunofarmacêutica.
ANTECEDENTES DA INVENÇÃO
[003] O câncer epitelial de ovário (CEO) continua sendo a maior causa de morte por câncer ginecológico e a quinta maior causa de morte por câncer no Ocidente, sendo responsável por cerca de 22.000 novos diagnósticos e 14.000 óbitos nos EUA em 2014(1). A única opção de tratamento curativo é a retirada completa do tumor em um estágio precoce e sem metástases. Contudo, a maioria das pacientes (>70%) são diagnosticadas com a doença nos estágios 3 ou 4, pois não existem sintomas precoces específicos. Embora tenha havido avanços nos esquemas de quimioterapia e o bevacizumabe tenha sido aprovado recentemente para tratamento de primeira linha, a maioria das pacientes sofre recorrência em poucos meses ou anos após o tratamento inicial (2, 3).
[004] Como o tratamento do câncer é dispendioso e produz graves efeitos colaterais, existe uma necessidade de identificação de fatores que possam se empregados no tratamento do câncer em geral e em especial no câncer de ovário. Também é necessário identificar fatores que representem biomarcadores de câncer em geral e em especial de câncer de ovário. Isso permitiria melhorar o diagnóstico, avaliar o prognóstico e prever o sucesso do tratamento do câncer.
[005] A imunoterapia é uma modalidade que age sobre antígenos associados a tumores existentes e serve como opção que age especificamente sobre as células Tumorais e, ao mesmo tempo, minimiza os efeitos colaterais. A classificação atual de antígenos associados a tumores (AATs) compreende os seguintes grupos principais: a) Antígenos de câncer testicular: Os primeiros AATs reconhecíveis por células T a serem identificados pertencem a essa classe, que foi denominada inicialmente antígenos de câncer testicular (CT) porque seus membros são expressos em tumores humanos histologicamente diferentes ao passo que nos tecidos normais ocorrem apenas em espermatócitos e espermatogônias nos testículos e, ocasionalmente, na placenta. Como as células Testiculares não expressam moléculas de HLA classe I e II, esses antígenos não podem ser reconhecidos pelas células T em tecidos normais e podem, portanto, ser considerados imunologicamente específicos para o tumor. Alguns exemplos bem conhecidos de antígenos de CT são os membros da família MAGE e o NY- ESO-1. b) Antígenos de diferenciação: Estes AATs são compartilhados por tumores e pelos tecidos normais dos quais o tumor se originou, e a maioria dos antígenos de diferenciação conhecidos se concentram em melanomas e em melanócitos normais. Muitas dessas proteínas relacionadas à linhagem melanocitária participam da biossíntese da melanina e, portanto, não são específicas para tumores, embora sejam amplamente utilizadas para imunoterapia do câncer. Alguns exemplos são, entre outros, a tirosinase e Melan-A/MART-1 em melanoma e PSA em câncer de próstata. c) AATs superexpressos: Os genes que codificam AATs amplamente expressos foram detectados tanto em tumores de diversos tipos histológicos como em muitos tecidos normais, geralmente com níveis de expressão mais baixos. É possível que muitos dos epítopos processados e que podem ser apresentados por tecidos normais estejam abaixo do limiar para reconhecimento pelas células T, ao passo que sua superexpressão em células Tumorais pode desencadear uma resposta anticâncer ao quebrar a tolerância estabelecida anteriormente. Alguns exemplos conhecidos desta classe de AAT são o Her-2/neu, a survivina, a telomerase ou WT1. d) Antígenos específicos para tumores: Estes AATs únicos se originam de mutações de genes normais (por exemplo ß-catenina, CDK4, etc.). Algumas dessas alterações moleculares estão associadas a transformação e/ou progressão neoplásica. Os antígenos específicos para tumores são geralmente capazes de induzir fortes respostas imunológicas sem criar risco de reações imunes contra tecidos normais. Por outro lado, estes AATs são, na maioria dos casos, relevantes apenas ao tumor específico em que foram identificados e geralmente não são compartilhados por vários tumores individuais. Um peptídeo também pode ser específico para tumores (ou associado a tumores) se for originário de um éxon presente em (ou associado a) um tumor no caso de proteínas com isoformas específicas para (ou associadas a) tumores. e) AATs originários de modificações pós-tradutórias anormais: Estes AATs podem se originar de proteínas que não são nem específicas nem superexpressas em tumores, mas mesmo assim adquirem associação tumoral por processos pós-tradutórias que atuam sobretudo em tumores. Alguns exemplos dessa classe surgem de alterações de padrões de glicosilação, que produzem novos epítopos em tumores como no MUC1 ou eventos como "splicing" de proteínas durante a degradação, que podem ou não ser específicos para tumores. f) Proteínas oncovirais: Estes AATs são proteínas virais que podem desempenhar um importante papel no processo oncogênico e, por serem de origem estranha (não humana), podem produzir respostas de células T. São exemplos destas proteínas as proteínas do papilomavírus humano tipo 16, E6 e E7, que são expressas no carcinoma de colo do útero.
[006] Nas últimas duas décadas, o CEO vem sendo reconhecido como um tumor altamente imunogênico em razão de vários achados clínicos. Foi demonstrado que muitos CEOs são infiltrados por células imunes, e isso permitiu estabelecer uma associação definitiva entre a infiltração por células T e o prognóstico clínico. Nessa população de células T infiltrantes, foram identificadas células T que reagem ao tumor e são específicas para antígenos. Os linfócitos T reguladores (Treg) residentes em tumores apresentam correlação negativa com a evolução clínica. Demonstrou-se também que as citocinas imunoestimulatórias induziram fortes respostas antitumorais em alguns pacientes.
[007] A eficácia da abordagem imunoterapêutica ao tratamento do câncer foi ilustrada recentemente pelo desenvolvimento e aprovação de inibidores de "checkpoint" imune para tratamento de melanoma. A vacinação com peptídeos específicos para antígenos e a transferência adaptativa de células T começou a mostrar resultados no melanoma e em outros tumores imunogênicos como, por exemplo, o carcinoma de células renais. A imunoterapia personalizada mostrou até potencial curativo e resultados impressionantes em alguns pacientes individuais.
[008] A imunoterapia baseada em células T age contra epítopos peptídicos derivados de proteínas associadas a ou específicas para tumores, que são apresentadas por moléculas do complexo principal de histocompatibilidade (MHC). Os antígenos reconhecidos por linfócitos T específicos para tumores, ou seja, epítopos dos mesmos, podem ser moléculas derivadas de todas as classes de proteínas, como enzimas, receptores, fatores de transcrição, etc., que são expressas e normalmente apresentam regulação positiva em células do tumor em comparação com células inalteradas da mesma origem.
[009] As moléculas do MHC podem ser de duas classes: MHC classe I e MHC classe II. As moléculas de MHC classe I consistem em uma cadeia pesada alfa e em uma beta-2 microglobulina. As moléculas de MHC classe II consistem em uma cadeia alfa e outra beta. Sua conformação tridimensional produz um sulco de ligação, que é empregado na interação não-covalente com peptídeos.
[0010] As moléculas do MHC classe I são encontradas na maioria das células nucleadas. Elas apresentam peptídeos derivados da clivagem proteolítica de proteínas predominantemente endógenas, produtos ribossômicos defeituosos (DRIPs) e peptídeos maiores. Entretanto, os peptídeos derivados de compartimentos endossômicos ou de fontes exógenas também são frequentemente encontrados em moléculas de MHC classe I. Na literatura, essa apresentação não-clássica de MHC classe I é denominada apresentação cruzada (Brossart e Bevan, 1997; Rock et al., 1990). As moléculas de MHC classe II são encontradas predominantemente em células apresentadores de antígenos (APC) profissionais e apresentam sobretudo peptídeos de proteínas exógenas ou de proteínas transmembrana, que são captadas pelas APC, por exemplo, durante a endocitose e depois processadas.
[0011] Os complexos formados por peptídeos e MHC classe I são reconhecidos por células T CD8-positivas que apresentam o receptor de célula (TCR) apropriado, ao passo que complexos de peptídeos com moléculas de MHC classe II são reconhecidos por células T auxiliares CD4-positivas que apresentam o TCR apropriado. É bem sabido que, em razão dessa configuração o TCR, o peptídeo e o MHC estão presentes em proporções estequiométricas de 1:1:1.
[0012] As células T auxiliares CD4-positivas desempenham um importante papel em induzir e manter respostas eficazes de células T citotóxicas CD8-positivas. A identificação de epítopos CD4-positivos de células T derivados de antígenos associados a tumores (AAT) é de grande importância para o desenvolvimento de produtos farmacêuticos para desencadear respostas imunes antitumorais (Gnjatic et al., 2003). No sítio do tumor, as células T auxiliares suportam um meio com células T citotóxicas propício para LTC (Mortara et al., 2006) e atraem células efetoras como, por exemplo, LTCs, células "natural killer" (NK), macrófagos e granulócitos (Hwang et al., 2007).
[0013] Na ausência de inflamação, a expressão de moléculas de MHC classe II restringe-se basicamente a células do sistema imunológico, especialmente células apresentadoras de antígenos (APC) profissionais, como monócitos, células derivadas de monócitos, macrófagos e células dendríticas. Em pacientes com câncer, constatou-se que as células Tumorais expressam moléculas de MHC classe II (Dengjel et al., 2006).
[0014] Os peptídeos alongados (mais longos) da invenção podem atuar como epítopos ativos de MHC classe II.
[0015] As células T auxiliares ativadas por epítopos do MHC classe II desempenham um importante papel em orquestrar a função efetora de LTC na imunidade antitumoral. Os epítopos de células T auxiliares que desencadeiam a resposta de células T auxiliares do tipo TH1 auxiliam as funções efetoras de células T killer CD8-positivas, incluindo funções citotóxicas dirigidas contra células Tumorais cujas superfícies apresentam complexos de peptídeos associados a tumor e MHC. Desse modo, os epítopos peptídicos em células T auxiliares associadas a tumores podem, isoladamente ou em associação com outros peptídeos associados a tumores, atuar como ingredientes farmacêuticos ativos de composições vacinais que estimulam respostas imunes antitumorais.
[0016] Mostrou-se em modelos animais mamíferos (por exemplo camundongos) que, mesmo na ausência de linfócitos T CD8-positivos, as células T CD4-positivas são suficientes para inibir a manifestação de tumores por meio da inibição da angiogênese mediada pela secreção de interferon- gama (IFNY) (Beatty e Paterson, 2001; Mumberg et al., 1999). Algumas evidências indicam que as células T CD4 exercem efeitos antitumorais diretos (Braumuller et al., 2013; Tran et al., 2014).
[0017] Como a expressão constitutiva de moléculas HLA classe II é geralmente limitada a células do sistema imunológico, a possibilidade de isolar peptídeos de classe II diretamente de tumores primários era considerada implausível. Entretanto, Dengjel et al. conseguiram identificar uma série de epítopos de MHC classe II diretamente em tumores (WO 2007/028574, EP 1760088B1).
[0018] Como ambos os tipos de resposta (dependente de CD4 e de CD8) contribuem conjunta e sinergisticamente para o efeito antitumoral, a identificação e caracterização de antígenos associados a tumores reconhecidos tanto por células T CD8+ (cujo ligante é a molécula de MHC classe I e seu epítopo peptídico) como por células T auxiliares CD4-positivas (cujo ligante é a molécula de MHC classe II e seu epítopo peptídico) são importantes para o desenvolvimento de vacinas antitumorais.
[0019] Para que um peptídeo de MHC classe I possa desencadear (provocar) uma resposta imune celular, ele precisa ligar-se a uma molécula de MHC. O processo depende do alelo da molécula de MHC e de polimorfismos específicos da sequência de aminoácidos do peptídeo. Os peptídeos ligantes de MHC classe I geralmente possuem 8 a 12 resíduos de aminoácidos de comprimento e geralmente contêm dois resíduos conservados ("âncoras") em suas sequências que interagem com o sulco de ligação correspondente da molécula de MHC. Dessa forma, cada alelo de MHC possui um "motivo de ligação" que determina quais peptídeos podem se ligar especificamente ao sulco de ligação.
[0020] Nas reações imunes dependentes do MHC classe I, os peptídeos precisam tanto ser capazes de ligarem-se a certas moléculas de MHC classe I expressas em células Tumorais como serem então reconhecidos por células T que apresentam receptores de células T (TCR) específicos.
[0021] Para as proteínas serem reconhecidas pelos linfócitos T como antígenos específicos de ou associados a tumores, e serem usadas como tratamentos, alguns pré-requisitos precisam ser atendidos. O antígeno deve ser expresso principalmente por células Tumorais e não expresso ou expresso apenas em quantidades comparativamente pequenas por tecidos normais saudáveis. Em uma modalidade preferida, o peptídeo deve ser apresentado de maneira exacerbada pelas células Tumorais em comparação com os tecidos normais. Outrossim, é desejável também que o respectivo antígeno esteja presente apenas em um determinado tipo de tumor, mas também em concentrações elevadas (isto é, números de cópias do respectivo peptídeo por célula). Os antígenos específicos para ou associados a tumores são frequentemente derivados de proteínas que participam diretamente da transformação de uma célula normal em uma célula tumoral devido à sua função; por exemplo controle do ciclo celular ou supressão da apoptose. Além disso, alvos distais da proteína que causa diretamente a transformação podem apresentar regulação positiva e, portanto, associarem-se indiretamente ao tumor. Tais antígenos associados indiretamente a tumores também podem ser alvos de abordagens vacinais (Singh-Jasuja et al., 2004). É essencial que os epítopos estejam presentes na sequência de aminoácidos do antígeno para garantir que o peptídeo ("peptídeo imunogênico") derivado de um antígeno associado a tumor produza uma resposta de células T in vivo ou in vitro.
[0022] Basicamente, qualquer peptídeo capaz de se ligar a uma molécula de MHC pode funcionar como epítopo de célula T. Um pré-requisito para indução de resposta de células T in vitro ou in vivo é a presença de uma célula T com um TCR correspondente e ausência de tolerância imunológica para o epítopo em questão.
[0023] Portanto, os AATs servem como ponto de partida para desenvolver tratamentos à base de células T, incluindo, entre outros, vacinas antitumorais. Os métodos utilizados para identificar e caracterizar os AATs normalmente se baseiam na utilização de células T, que podem ser isoladas de pacientes ou de indivíduos saudáveis ou baseadas na geração de perfis diferentes de transcrição ou de expressão peptídica em tumores e em tecidos normais. Entretanto, a identificação de genes superexpressos em tecidos tumorais ou em linhagens de tumores humanos ou expressos seletivamente em tais tecidos ou linhagens celulares não proporciona informações precisas sobre a utilização dos antígenos que são transcritos a partir desses genes em imunoterapia. Isso ocorre porque apenas uma determinada subpopulação de epítopos desses antígenos é apropriada para tal aplicação, pois uma célula T com um TCR correspondente precisa estar presente e é preciso que haja pouca ou nenhuma tolerância imunológica ao epítopo em questão. Portanto, é importante, em uma configuração bastante preferida da invenção, selecionar apenas peptídeos superexpressos ou apresentados seletivamente contra os quais se possa encontrar células T funcionais e/ou em proliferação. Tais células T funcionais são definidas como células T que, quando estimuladas por um antígeno específico, podem se expandir de forma clonal e são capazes de executar funções efetoras ("célula T efetora").
[0024] No caso de TCRs específicos contra complexos peptídeo-MHC (por exemplo TCRs solúveis) e anticorpos ou outras moléculas ligantes "scaffolds" (arcabouços) de acordo com a invenção, a imunogenicidade dos peptídeos subjacentes é secundária. Nesses casos, o fator determinante é a apresentação.
SUMÁRIO DA INVENÇÃO
[0025] Em um primeiro aspecto da presente invenção, a mesma refere- se a um peptídeo que compreende uma sequência de aminoácidos selecionada do grupo formado por SEQ ID N°: 1 a SEQ ID N°: 549 ou a uma sequência variante dos mesmos com pelo menos 77% de homologia (preferivelmente pelo menos 88% ou pelo menos 88% idêntica) com SEQ ID N°: 1 a SEQ ID N°: 549, caracterizado pelo fato de que a referida variante se liga ao MHC e/ou induz reação cruzada de células T com o referido peptídeo, ou um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo, sendo que o referido peptídeo não corresponde ao polipeptídeo completo original.
[0026] A presente invenção refere-se a um peptídeo da presente invenção que compreende uma sequência selecionada do grupo formado por SEQ ID N°: 1 a SEQ ID N°: 549 ou uma variante das mesmas que seja pelo menos 77%, e preferivelmente pelo menos 88%, homóloga (preferivelmente pelo menos 77% ou pelo menos 88% idêntica) à SEQ ID N°: 1 a SEQ ID N°: 549, sendo que cada um dos peptídeos referidos ou variantes dos mesmos possui comprimento total de 8 a 100, preferivelmente de 8 a 30 e, mais preferivelmente, de 8 a 14 aminoácidos.
[0027] As tabelas a seguir mostram os peptídeos de acordo com a presente invenção, seus respectivos números de SEQ e os genes que podem originá-los (subjacentes). Todos os peptídeos na Tabela 1 e Tabela 2 se ligam ao HLA-A*02. Os peptídeos na Tabela 2 foram divulgados anteriormente em grandes listas geradas por triagens de alto rendimento, mas com altas taxas de erro, ou calculados por algoritmos, mas nenhum deles havia sido associado com câncer até agora. Os peptídeos na Tabela 3 são peptídeos adicionais que podem ser úteis em associação com outros peptídeos da invenção. Os peptídeos na Tabela 4 também são úteis para diagnóstico ou tratamento de diversas doenças malignas nas quais ocorre superexpressão ou apresentação exacerbada dos respectivos polipeptídeos subjacentes. TABELA 1: Peptídeos de acordo com a presente invenção. X = S, R ou G
[0028] A presente invenção refere-se também, geralmente, a peptídeos de acordo com a presente invenção para uso no tratamento de doenças proliferativas como, por exemplo, câncer de ovário, câncer de pulmão de células não-pequenas, câncer de pulmão de pequenas células, câncer de rim, câncer cerebral, câncer de cólon ou reto, câncer de estômago, câncer de fígado, câncer de pâncreas, câncer de próstata, leucemia, câncer de mama, carcinoma de células de Merkel, melanoma, câncer de esôfago, câncer de bexiga, câncer de útero, câncer da vesícula biliar, câncer do ducto biliar e outros tumores que apresentem superexpressão de uma proteína das quais sejam derivados peptídeos de SEQ ID N°: 1 a SEQ ID N°: 319.
[0029] São particularmente preferidos, isoladamente ou em associações, os peptídeos de acordo com a presente invenção selecionados do grupo formado por SEQ ID N°: 1 a SEQ ID N°: 549. São mais preferidos, isoladamente ou em associações, os peptídeos selecionados do grupo formado por SEQ ID N°: 1 a SEQ ID N°: 319 (ver Tabela 1 e Tabela 2) de acordo com a presente invenção, seja isolado ou em associações, e seu emprego na imunoterapia de câncer de ovário, câncer de pulmão de células não-pequenas, câncer de pulmão de pequenas células, câncer de rim, câncer cerebral, câncer de cólon ou reto, câncer de estômago, câncer de fígado, câncer de pâncreas, câncer de próstata, leucemia, câncer de mama, carcinoma de células de Merkel, melanoma, câncer de esôfago, câncer de bexiga, câncer de útero, câncer da vesícula biliar, câncer do ducto biliar e, preferivelmente, câncer de ovário.
[0030] Portanto, outro aspecto da presente invenção refere-se ao uso dos peptídeos de acordo com a presente invenção, preferivelmente em associações, para tratamento de doenças proliferativas do grupo formado por câncer de ovário, câncer de pulmão de células não-pequenas, câncer de pulmão de pequenas células, câncer de rim, câncer de cérebro, câncer de cólon ou de reto, câncer de estômago, câncer de fígado, câncer de pâncreas, câncer de próstata, leucemia, câncer de mama, carcinoma de células de Merkel, melanoma, câncer de esôfago, câncer de bexiga, câncer de útero, câncer da vesícula biliar e câncer do ducto biliar.
[0031] A presente invenção refere-se também aos peptídeos de acordo com a presente invenção que possuem a capacidade de se ligarem a uma molécula do complexo principal de histocompatibilidade (MHC) humano classe I ou, em uma forma alongada, a uma variante de comprimento diferente do MHC classe II.
[0032] A presente invenção refere-se também aos peptídeos de acordo com a presente invenção, onde (cada) um de tais peptídeos consiste ou consiste principalmente em uma sequência de aminoácidos de acordo com SEQ ID N°: 1 a SEQ ID N°: 549.
[0033] A presente invenção refere-se também aos peptídeos de acordo com a presente invenção nos quais os referidos peptídeos são modificados e/ou incluem ligações não-peptídicas.
[0034] A presente invenção refere-se também aos peptídeos de acordo com a presente invenção, nos quais os referidos peptídeos constituem parte de uma proteína de fusão, em particular fusão com aminoácidos N-terminais da cadeia invariante associada ao antígeno do HLA-DR (Ii) ou fundido a (ou incorporado à sequência de) um anticorpo, tal como, por exemplo, um anticorpo específico para células dendríticas.
[0035] A presente invenção refere-se também a um ácido nucleico que codifica os peptídeos de acordo com a presente invenção. A presente invenção refere-se também ao ácido nucleico de acordo com a presente invenção que consista em DNA, cDNA, PNA, RNA ou combinações destes.
[0036] A presente invenção refere-se também a um vetor de expressão capaz de expressar e/ou que expresse um ácido nucleico de acordo com a presente invenção.
[0037] A presente invenção refere-se também a um peptídeo de acordo com a presente invenção, um ácido nucleico de acordo com a presente invenção ou um vetor de expressão de acordo com a presente invenção para emprego no tratamento de doenças e em medicina, em especial para o tratamento de câncer.
[0038] A presente invenção refere-se também aos anticorpos específicos contra os peptídeos de acordo com a presente invenção ou complexos de tais peptídeos de acordo com a presente invenção com MHC e métodos para produzi-los.
[0039] A presente invenção refere-se ainda a receptores de células T (TCR, "T-cell receptors") e em particular a TCRs solúveis (sTCR) e a TCRs clonados introduzidos por engenharia genética em células T autólogas ou alogênicas, assim como a métodos de produzi-las, além de células NK ou outras células que apresentam o referido TCR ou que participem de reações cruzadas com os referidos TCRs.
[0040] Os anticorpos e os TCRs são configurações adicionais do uso imunoterapêutico dos peptídeos de acordo com a invenção ora em pauta.
[0041] A presente invenção refere-se também a células hospedeiras que compreendem um ácido nucleico de acordo com a presente invenção ou um vetor de expressão conforme descrito anteriormente. A presente invenção refere-se também as células hospedeiras de acordo com a presente invenção, que são células apresentadoras de antígenos e, preferivelmente, células dendríticas.
[0042] A presente invenção refere-se também a um método de produção de um peptídeo de acordo com a presente invenção, sendo que o referido método compreende o cultivo da célula hospedeira de acordo com a presente invenção e o isolamento do peptídeo da referida célula hospedeira ou do respectivo meio de cultura.
[0043] A presente invenção trata também do referido método de acordo com a presente invenção, sendo que o antígeno é carregado em moléculas de MHC classe I ou II expressas na superfície de uma célula apresentadora de antígenos apropriada ou de uma célula apresentadora de antígenos artificial colocando-se uma quantidade suficiente do antígeno em contato com uma célula apresentadora de antígenos.
[0044] A presente invenção refere-se também a um método de acordo com a presente invenção, no qual a célula apresentadora de antígenos compreende um vetor de expressão que expressa ou é capaz de expressar o referido peptídeo contendo as sequências SEQ ID N°: 1 a SEQ ID N°: 549, preferivelmente contendo SEQ ID N°: 1 a SEQ ID N°: 319, ou uma sequência de aminoácidos variante das mesmas.
[0045] A presente invenção relaciona-se também com células T ativadas produzidas de acordo com o método da presente invenção, sendo que as referidas células T reconhecem seletivamente células que expressam um polipeptídeo que compreende uma sequência de aminoácidos de acordo com a presente invenção.
[0046] A presente invenção refere-se também a um método para destruir células-alvo em um paciente no qual as células-alvo expressam de forma aberrante um polipeptídeo que compreende qualquer sequência de aminoácidos de acordo com a presente invenção, sendo que o método compreende a administração ao paciente de um número eficaz de células T produzidas de acordo com a presente invenção.
[0047] A presente invenção refere-se também ao uso de qualquer peptídeo conforme descrito, ao ácido nucleico de acordo com a presente invenção, ao vetor de expressão de acordo com a presente invenção, à célula de acordo com a presente invenção, ao linfócito T ativado, ao receptor de célula T ou ao anticorpo ou a outro peptídeo e/ou a moléculas ligantes de peptídeo e MHC de acordo com a presente invenção como medicamento ou para fabricação de um medicamento. Preferivelmente, o medicamento possui atividade anticâncer.
[0048] Preferivelmente, o referido medicamento destina-se a uma terapia celular, uma vacina ou uma proteína baseada em um TCR solúvel ou anticorpo.
[0049] A presente invenção refere-se também a um emprego de acordo com a presente invenção, no qual as referidas células de câncer são células de câncer de ovário, câncer de pulmão de células não-pequenas, câncer de pulmão de pequenas células, câncer de rim, câncer cerebral, câncer de cólon ou reto, câncer gástrico, câncer hepático, câncer de pâncreas, câncer de próstata, leucemia, câncer de mama, carcinoma de células de Merkel, melanoma, câncer esofágico, câncer de bexiga, câncer de útero, câncer da vesícula biliar, câncer do ducto biliar e, preferivelmente, células de câncer de ovário.
[0050] A presente invenção refere-se também a biomarcadores baseados em peptídeos de acordo com a presente invenção, aqui denominados "alvos", que podem ser usados para diagnóstico de câncer, preferivelmente de câncer de ovário. O marcador poderá ser a apresentação exacerbada de peptídeo(s) em si ou a superexpressão do(s) gene(s) correspondente(s). Os marcadores também podem ser empregados para prever a possibilidade de sucesso de um determinado tratamento, preferivelmente uma imunoterapia, sendo mais preferida uma imunoterapia que atue sobre os alvos identificados pelo biomarcador. Pode-se, por exemplo, usar um anticorpo ou TCR solúvel para corar cortes de um tumor para detectar um peptídeo relevante em complexo com MHC.
[0051] Opcionalmente, o anticorpo exerce outra função efetora, como um domínio de estimulação imunológica ou uma toxina.
[0052] A presente invenção refere-se também ao uso desses novos alvos no âmbito do tratamento do câncer.
[0053] Aplicações terapêuticas e diagnósticas contra outras doenças oncológicas são divulgadas na descrição mais detalhada a seguir dos produtos de expressão (polipeptídeos) subjacentes dos peptídeos de acordo com a invenção.
DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO
[0054] A estimulação de uma resposta imune depende da presença de antígenos reconhecidos como estranhos pelo sistema imune do hospedeiro. A descoberta da existência de antígenos associados a tumores levantou a possibilidade de usar o sistema imune do hospedeiro para intervir no crescimento tumoral. Vários mecanismos para acionar tanto a imunidade humoral como a celular vêm sendo explorados para imunoterapia do câncer.
[0055] Alguns elementos específicos da resposta imune celular são capazes de reconhecer e destruir especificamente as células Tumorais. O isolamento de células T de populações de células infiltrantes de tumor ou do sangue periférico sugere que tais células podem contribuir significativamente para a defesa imune natural contra o câncer. Em particular, as células T CD8- positivas capazes de reconhecer moléculas de classe I do complexo principal de histocompatibilidade (MHC), que normalmente possuem 8 a 10 resíduos de aminoácidos derivados de proteínas ou proteínas produtos de defeitos ribossômicos (DRIPS, "defect ribosomal products") localizadas no citoplasma, desempenham um importante papel nessa resposta. As moléculas de MHC humanas também são designadas antígenos leucocitários humanos (HLA, "human leucocyte antigen").
[0056] A presente invenção refere-se também a um peptídeo de acordo com a presente invenção, sendo que o referido peptídeo é modificado e/ou possui ligações não-peptídicas, conforme descrito a seguir.
[0057] A presente invenção refere-se também a um peptídeo de acordo com a presente invenção, sendo que o referido peptídeo constitui parte de uma proteína de fusão, em particular fusão com aminoácidos N-terminais da cadeia invariante (Ii) associada ao antígeno do HLA-DR ou fusão a (ou incorporação à sequência de) um anticorpo, tal como, por exemplo, um anticorpo específico para células dendríticas, isto é, que se liga a células dendríticas.
[0058] A presente invenção refere-se também a um ácido nucleico que codifica um peptídeo de acordo com a presente invenção. A presente invenção refere-se também ao ácido nucleico de acordo com a presente invenção que consista em DNA, cDNA, PNA, RNA ou combinações dos mesmos.
[0059] A presente invenção refere-se também a um vetor de expressão capaz de expressar, que expresse e/ou apresente um ácido nucleico de acordo com a presente invenção.
[0060] A presente invenção refere-se também a um peptídeo de acordo com a presente invenção, um ácido nucleico de acordo com a presente invenção ou um vetor de expressão de acordo com a presente invenção para emprego em medicina.
[0061] A presente invenção refere-se também a anticorpos descritos mais detalhadamente a seguir e a métodos de produzi-los. São preferidos anticorpos específicos para os peptídeos da presente invenção e/ou para peptídeos da presente invenção que estejam ligados aos seus respectivos MHC. Os anticorpos preferidos podem ser monoclonais.
[0062] A presente invenção refere-se também a receptores de células T (TCR), em particular TCR solúveis (sTCR) que agem sobre os peptídeos de acordo com a invenção e/ou complexos peptídeo-MHC dos mesmos e a métodos de produzi-los.
[0063] A presente invenção refere-se também a anticorpos ou outras moléculas de ligação que se ligam a peptídeos de acordo com a invenção e/ou complexos peptídeo-MHC da mesma, assim como a métodos de produzi-los.
[0064] A presente invenção refere-se também a células hospedeiras que compreendem um ácido nucleico de acordo com a presente invenção ou a um vetor de expressão conforme descrito anteriormente. A presente invenção refere-se também as células hospedeiras de acordo com a presente invenção que são células apresentadoras de antígenos. A presente invenção refere-se também as células hospedeiras de acordo com a presente invenção, sendo que as células apresentadoras de antígenos são células dendríticas.
[0065] A presente invenção refere-se também a um método de produção de um peptídeo de acordo com a presente invenção, sendo que o referido método compreende o cultivo da célula hospedeira de acordo com a presente invenção e o isolamento do peptídeo da célula hospedeira e/ou do meio de cultura da mesma.
[0066] A presente invenção refere-se também a um método in vitro de produção de células T ativadas, sendo que o método compreende colocar células T portadoras de moléculas de MHC humanas de classe I ou II expressas na superfície de uma célula apresentadora e antígenos em contato in vitro por um período suficientemente longo para ativar as referidas células T de forma específica para o antígeno, sendo que tal antígeno consiste em pelo menos um dos peptídeos de acordo com a invenção.
[0067] A presente invenção refere-se também a um método no qual o antígeno é carregado em moléculas de MHC classe I ou II expressas na superfície de uma célula apresentadora de antígenos apropriada colocando-se uma quantidade suficiente do antígeno em contato com uma célula apresentadora de antígenos.
[0068] A presente invenção refere-se também a um método de acordo com a presente invenção, no qual a célula apresentadora de antígenos compreende um vetor de expressão capaz de expressar o referido peptídeo contendo SEQ ID N°: 1 a SEQ ID N°: 549 ou uma sequência de aminoácidos variante do mesmo.
[0069] A presente invenção relaciona-se também com células T ativadas produzidas de acordo com a presente invenção que reconhecem seletivamente células com expressão aberrante de um polipeptídeo que compreende uma sequência de aminoácidos de acordo com a presente invenção.
[0070] A presente invenção refere-se também a um método para destruir células-alvo em um paciente no qual as células-alvo expressam aberrantemente um polipeptídeo que compreende qualquer sequência de aminoácidos de acordo com a presente invenção, sendo que o método compreende a administração ao paciente de um número eficaz de células T ativadas de acordo com a presente invenção.
[0071] A presente invenção refere-se também à utilização de qualquer um dos peptídeos descritos, um ácido nucleico de acordo com a presente invenção, um vetor de expressão de acordo com a presente invenção, uma célula de acordo com a presente invenção ou uma célula T ativada de acordo com a presente invenção como medicamento ou para fabricação de um medicamento.
[0072] A presente invenção refere-se também a uma utilização de acordo com a presente invenção, na qual o referido medicamento é uma vacina, uma célula, uma população de células, tal como, por exemplo, uma linhagem celular, sTCRs e anticorpos monoclonais.
[0073] A presente invenção refere-se também a uma utilização de acordo com a presente invenção, onde o medicamento possui atividade anticâncer.
[0074] A presente invenção refere-se também a uma utilização de acordo com a presente invenção, onde as referidas células cancerosas são células de câncer de ovário.
[0075] A presente invenção refere-se também a proteínas marcadoras e biomarcadores específicos baseados nos peptídeos de acordo com a presente invenção que podem ser utilizados para diagnóstico ou determinação do prognóstico de câncer de ovário.
[0076] Outrossim, a presente invenção refere-se ao uso desses novos agentes para tratamento do câncer.
[0077] Outrossim, a presente invenção refere-se a um método de produção de uma vacina anticâncer personalizada para um paciente individual usando um banco de dados (doravante designado "depósito") de peptídeos associados a tumores rastreados previamente.
[0078] A estimulação de uma resposta imune depende da presença de antígenos reconhecidos como estranhos pelo sistema imune do hospedeiro. A descoberta da existência de antígenos associados a tumores levantou a possibilidade de usar o sistema imune do hospedeiro para intervir no crescimento tumoral. Vários mecanismos para acionar tanto a imunidade humoral como a celular vêm sendo explorados para imunoterapia do câncer.
[0079] Alguns elementos específicos da resposta imune celular são capazes de reconhecer e destruir especificamente células Tumorais. O isolamento de células T de populações de células infiltrantes de tumor ou do sangue periférico sugere que tais células podem desempenhar um importante papel nas defesas imunes naturais contra o câncer. Em particular, as células T CD8-positivas que reconhecem moléculas de classe I do complexo principal de histocompatibilidade (MHC), que normalmente possuem 8 a 10 resíduos de aminoácidos derivados de proteínas ou proteínas produtos de defeitos ribossômicos (DRIPS, "defect ribosomal products") localizadas no citoplasma, desempenham um importante papel nessa resposta. As moléculas de MHC humanas também são designadas antígenos leucocitários humanos (HLA, "human leucocyte antigen").
[0080] Houve enorme progresso na imunoterapia do câncer nos últimos anos, e essa modalidade vem sendo considerada uma abordagem complementar ou alternativa aos tratamentos quimioterápicos padrões. Várias publicações demonstraram a importância da apresentação pelo HLA de antígenos tumorais, tanto os mutantes como os de tipo selvagens, como antígenos valiosos para a rejeição tumoral. Portanto, a identificação em grande escala de antígenos tumorais malignos apresentados por HLA é outro importante componente para que se compreenda como o sistema imune identifica e reconhece células Tumorais.
[0081] Na presente invenção, os inventores focaram no câncer epitelial de ovário (CEO), visando a caracterizar completamente o imunopeptidoma do CEO e avaliar a utilidade dos antígenos apresentados por HLA quanto à sua utilidade em aplicações clínicas. Até agora, poucos antígenos apresentados por HLA foram identificados em CEO, e a maioria dos ensaios clínicos se basearam em antígenos de câncer testicular (previstos ou estabelecidos), cuja apresentação no CEO nem sempre é frequente. A nossa análise confirmou esse fato.
[0082] A partir de dados publicados anteriormente, os inventores demonstraram uma expressão consistente e elevada de moléculas de HLA classe I em células de tumor de ovário. Os inventores também demonstraram que o CEO também apresenta forte expressão de moléculas de HLA-DR em nível unicelular. Essa forte expressão também foi destacada por nossa identificação de grandes quantidades de ligantes de MHC classe II originários de tumores de ovário e de frações altamente enriquecidas em células Tumorais.
[0083] A comparação dos imunopeptidomas de 34 tumores de ovário com os de 85 fontes benignas de outras origens revelou várias centenas de antígenos associados ao CEO. Dos antígenos TOP100 de HLA classe I apresentados em CEO mas não em tecidos benignos no nosso conjunto de dados, o MUC16 foi claramente o que mais se destacou. O MUC16 apresentou mais de 80 ligantes de HLA identificados e cerca de 80% de apresentação na coorte de pacientes. Essa combinação não tem precedentes em nenhum antígeno tumoral nem em qualquer outra entidade tumoral investigada pelos inventores até agora. Os inventores também constataram que mais de 70% dos ligantes de HLA derivados de MUC16 são imunogênicos e capazes de iniciar células T de indivíduos saudáveis, o que torna a mucina 16 o melhor antígeno de primeira classe para imunoterapia do CEO. Os perfis de imunopeptidoma também servem para demonstrar possíveis aspectos do mecanismo do CEO, que se refletem no ligandoma de ligantes de HLA classe I ou classe II. Podem-se citar, entre muitos outros, os ligantes de HLA quinases e fosfatases importantes (DDR1, EYA2), os fatores de transcrição (SOX9, SOX17) e as proteínas associadas com imunossupressão (IDO1, galectina 1), assim como marcadores moleculares suspeitos e confirmados de CEO (MUC1, KLK10, FOLR1). Cabe notar que, no HLA classe II, a mesotelina é um ligante estabelecido de MUC16 e foi identificada como o antígeno associado a tumores TOP1. Vários estudos demonstraram o papel crucial do eixo MUC16/MSLN na invasão celular e metástase de CEO e de outros tumores (por exemplo câncer de pâncreas ou mesotelioma). Isso sugere que os epítopos de células T desses antígenos devem ser testados também em outros tumores malignos. Os inventores conseguiram demonstrar que a coloração para MSLN se correlaciona diretamente com a coloração para MUC16 e que níveis elevados de expressão de MSLN são um fator prognóstico negativo para CEO.
[0084] Pela primeira vez, vários tecidos benignos e tipos celulares diferentes (CMSPs, medula óssea, fígado, rim, cólon, ovário) foram usados para obter esse tipo de perfil seletivo de imunopeptidoma. Devido a restrições do número de tipos de tecido disponíveis para a pesquisa, os inventores não podem descartar completamente a possibilidade de que antígenos individuais também possam ser apresentados por moléculas de HLA em outros órgãos. Contudo, a relevância funcional estabelecida desses antígenos na CEO, e em especial a imunogenicidade dos respectivos peptídeos em indivíduos saudáveis, tornam improvável a apresentação desses antígenos em outros tecidos.
[0085] O termo "resposta de célula T" significa a proliferação específica e a ativação das funções efetoras induzidas por um peptídeo in vitro ou in vivo. No caso de células T citotóxicas restritas por MHC classe I, as funções efetoras podem consistir em lise de células alvo que foram pulsadas com peptídeos ou com precursores de peptídeos ou que apresentam os peptídeos naturalmente; pela secreção de citocinas induzida pelo peptídeo, preferivelmente interferon- gama, TNF-a ou IL-2, ou ainda pela secreção induzida por peptídeo de moléculas efetoras, preferivelmente granzimas ou perforinas; ou por degranulação.
[0086] O termo "peptídeo" é aqui utilizado para designar uma série de resíduos de aminoácidos conectados uns aos outros, tipicamente por ligações peptídicas entre os grupamentos alfa-amino e carbonila de aminoácidos adjacentes. Preferivelmente, os peptídeos possuem 9 aminoácidos de comprimento, mas podem ter apenas 8 aminoácidos de comprimento ou até 10, 11 ou 12 aminoácidos; os peptídeos de MHC classe II (variantes alongadas dos peptídeos da invenção) podem ter comprimento de até 15, 16, 17, 18, 19 ou 20 aminoácidos de comprimento.
[0087] O termo "peptídeo" designa também sais de uma série de resíduos de aminoácidos conectados uns aos outros, tipicamente por ligações peptídicas entre os grupamentos alfa-amino e carbonila de aminoácidos adjacentes. Preferivelmente, tais sais são sais farmaceuticamente aceitáveis de peptídeos como, por exemplo, sais de cloreto ou acetato (trifluoracetato). Cabe notar que os sais dos peptídeos de acordo com a presente invenção diferem substancialmente dos peptídeos em seu estado in vivo, pois esses peptídeos não se apresentam como sais in vivo.
[0088] O termo "peptídeo" abrange também "oligopeptídeo". O termo "oligopeptídeo" é aqui utilizado para designar uma série de resíduos de aminoácidos conectados uns aos outros, tipicamente por ligações peptídicas entre os grupamentos alfa-amino e carbonila de aminoácidos adjacentes. O comprimento do oligopeptídeo não é essencial para a invenção, conquanto o epítopo ou epítopos corretos sejam nele mantidos. Os oligopeptídeos tipicamente possuem mais de cerca de 15 e menos de cerca de 30 resíduos de aminoácidos de comprimento.
[0089] O termo "peptídeos da presente invenção" inclui peptídeos que consistem em ou compreendem um peptídeo conforme definido anteriormente de acordo com as SEQ ID N°: 1 a SEQ ID N°: 549.
[0090] O termo "polipeptídeo" designa uma série de resíduos de aminoácidos conectados uns aos outros, tipicamente por ligações peptídicas entre os grupamentos alfa-amino e carbonila de aminoácidos adjacentes. O comprimento do polipeptídeo não é essencial para a invenção, conquanto os epítopos corretos sejam nele mantidos. Ao contrário dos termos peptídeo e oligopeptídeo, o termo polipeptídeo designa apenas moléculas com mais de cerca de 30 resíduos de aminoácidos.
[0091] Um peptídeo, oligopeptídeo, proteína ou polinucleotídeo que codifica tal molécula é "imunogênico" (e, portanto, "imunogênico" no escopo da presente invenção) se for capaz de induzir uma resposta imune. No caso da presente invenção, a imunogenicidade é definida mais especificamente como a capacidade de induzir uma resposta por células T. Portanto, um "imunógeno" seria uma molécula capaz de induzir uma resposta imune e, no caso da presente invenção, uma molécula capaz de induzir uma resposta por células T. Em outro aspecto, o imunógeno pode ser o peptídeo, o complexo peptídeo-MHC, o oligopeptídeo e/ou proteína empregada para produzir anticorpos específicos ou TCRs contra ele.
[0092] Um "epítopo" de células T classe I requer um peptídeo curto ligado a um receptor de MHC classe I formando um complexo ternário (cadeia alfa de MHC classe I, beta-2 microglobulina e peptídeo), que pode ser reconhecido por receptores de células T que se ligam com afinidade apropriada ao complexo de MHC-peptídeo. Os peptídeos que se ligam a moléculas de MHC classe I geralmente possuem de 8 a 14 aminoácidos de comprimento, e mais tipicamente 9 aminoácidos de comprimento.
[0093] Em seres humanos, três lócus genéticos diferentes codificam as moléculas de MHC classe I. (As moléculas de MHC de seres humanos também são designadas antígenos leucocitários humanos (HLA, "human leukocyte antigens")). O HLA-A, HLA-B e HLA-C. HLA-A*01, HLA-A*02 e HLA-B*07 são exemplos de alelos de MHC classe I diferentes que podem ser expressos a partir desses lócus. TABELA 5: Frequências de expressão (F) do HLA-A*02 e HLA-A*24 e dos sorotipos mais frequentes de HLA-DR. As frequências são deduzidas das frequências dos haplótipos Gf na população Americana, adaptado de Mori et al. (Mori et al., 1997) e empregando a fórmula de Hardy-Weinberg F=1-(1-Gf)2. Combinações de A*02 ou A*24 com determinados alelos de HLA-DR podem apresentar-se enriquecidas ou com frequência menor que a esperada em função das frequências individuais devido a desequilíbrios entre ligações. Para obter mais detalhes, consulte Chanock et al. (Chanock et al., 2004).
[0094] Os peptídeos da invenção, preferivelmente quando incluídos em uma vacina da invenção conforme aqui descrita, ligam-se a vários tipos de HLA. Uma vacina também pode apresentar ligação a todos os peptídeos de MHC classe II e peptídeos que se ligam a outros alelos e podem ser úteis em medicamentos personalizados. Portanto, a vacina da invenção pode ser empregada para tratar o câncer em pacientes positivos para A*02, ao passo que nenhuma seleção de alótipos de MHC classe II é necessária porque esses peptídeos se ligam a todos os MHC classe II.
[0095] Em uma modalidade preferida, o termo "sequência de nucleotídeos" refere-se a um heteropolímero de desoxirribonucleotídeos.
[0096] A sequência de nucleotídeos que codifica um determinado peptídeo, oligopeptídeo ou polipeptídeo pode ocorrer naturalmente ou ser construída por meios sintéticos. Em geral, os segmentos de DNA que codificam peptídeos, polipeptídeos e proteínas desta invenção são construídos a partir de fragmentos de cDNA e ligantes oligonucleotídeos curtos ou de uma série de oligonucleotídeos de modo a fornecer um gene sintético capaz de ser expresso em uma unidade de transcrição recombinante que compreende elementos regulatórios derivados de um operon microbiano ou viral.
[0097] Conforme aqui utilizado, o termo "nucleotídeo codificador (ou que codifica) um peptídeo" refere-se a uma sequência de nucleotídeos que codifica o peptídeo, incluindo códons de início e parada artificiais (produzidos pelo homem) compatíveis com o sistema biológico que será expresso, por exemplo, por uma célula dendrítica ou por outro sistema celular útil para a produção de TCRs.
[0098] Conforme aqui utilizadas, referências a uma sequência de ácido nucleico abrangem tanto ácidos nucleicos de fita única como de dupla fita. Portanto, por exemplo, para DNA, a sequência específica refere-se, salvo indicação em contrário no contexto, ao DNA de fita única de tal sequência, à forma dúplex de tal sequência com o respectivo complemento (DNA de dupla fita) e ao complemento de tal sequência.
[0099] O termo "região codificadora" refere-se à porção do gene que, natural ou normalmente, codifica o produto expresso pelo gene em questão em seu ambiente genômico natural, isto é, a região codificadora in vivo do produto de expressão nativo do gene em questão.
[00100] A região codificadora pode ser derivada de um gene não- mutante ("normal"), mutante ou alterado e pode até mesmo ser derivada de uma sequência de DNA ou gene sintetizado inteiramente em laboratório empregando métodos bem conhecidos dos versados na técnica de síntese de DNA.
[00101] O termo "produto de expressão" significa o polipeptídeo ou proteína que é o produto de tradução natural do gene e de quaisquer sequências de ácidos nucleicos que produzam codificação equivalente resultantes da natureza degenerada do código genético produzindo o(s) mesmo(s) aminoácido(s).
[00102] O termo "fragmento" significa, quando se refere a uma sequência codificante, uma porção do DNA que compreende menos que a região codificadora completa, cujo produto de expressão retém basicamente a mesma função ou atividade biológica que o produto de expressão da região codificante completa.
[00103] O termo "segmento de DNA" refere-se a um polímero de DNA, seja como fragmento separado ou como componente de uma estrutura de DNA maior, derivado do DNA isolado pelo menos uma vez de forma basicamente pura, isto é, livre de materiais contaminantes endógenos e em quantidade ou concentração suficientes para permitir identificação, manipulação e recuperação do segmento e das sequências de nucleotídeos componentes empregando-se métodos bioquímicos padrão como, por exemplo, um vetor de clonagem. Tais segmentos são fornecidos como um "frame" (matriz) de leitura aberta sem interrupções de sequências internas não traduzidas, denominadas íntrons, que geralmente estão presentes em genes eucarióticos. As sequências de DNA não traduzido podem estar presentes em posição distal à matriz de leitura aberta, onde a mesma não interfere na manipulação nem na expressão das regiões codificantes.
[00104] O termo "iniciador" significa uma sequência curta de ácidos nucleicos que pode ser pareada com uma fita de DNA e fornece uma terminação 3'OH livre na qual a DNA polimerase inicia a síntese de uma cadeia de desoxirribonucleotídeos.
[00105] O termo "promotor" significa uma região do DNA envolvida em ligar a RNA polimerase para iniciar a transcrição.
[00106] O termo "isolado" significa que o material foi retirado de seu ambiente original (por exemplo o ambiente original em que ocorria naturalmente). Por exemplo, polinucleotídeos que ocorrem na natureza ou que estão presentes em um animal vivo não são considerados isolados, mas o mesmo polinucleotídeo ou polipeptídeo é considerado isolado quando é separado de alguns ou de todos os materiais que com ele coexistem em um sistema natural. Tais polinucleotídeos podem formar parte de um vetor e/ou tais polinucleotídeos ou polipeptídeos podem ser parte de uma composição e mesmo assim ser isolados, mesmo que tal vetor ou composição não seja parte de seu ambiente natural.
[00107] Os polinucleotídeos e os polipeptídeos recombinantes ou imunogênicos divulgados de acordo com a presente invenção também podem estar em forma "purificada". O termo "purificado" não requer pureza absoluta; é uma definição relativa e abrange tanto preparações altamente purificadas como preparações apenas parcialmente purificadas, conforme tais termos são compreendidos pelos versados na técnica relevante. Por exemplo, clones individuais isolados de uma biblioteca de cDNA foram purificados empregando-se técnicas convencionais para se obter homogeneidade eletroforética. A purificação de um material inicial ou de material natural em pelo menos uma ordem de grandeza, e preferivelmente em duas ou três ordens, e mais preferivelmente em quatro a cinco ordens de magnitude é expressamente contemplada. Outrossim, o polipeptídeo reivindicado que possui pureza de, preferivelmente 99,999% ou pelo menos 99,99% ou 99,9% e, ainda desejavelmente, 99% por peso ou mais, fica expressamente divulgado.
[00108] Os ácidos nucleicos e produtos da expressão de polipeptídeos divulgados de acordo com a presente invenção, assim com os vetores de expressão que contêm tais ácidos nucleicos e/ou tais polipeptídeos, podem estar presentes em "forma enriquecida". Conforme aqui utilizado, o termo "enriquecido" significa que a concentração do material é de pelo menos 2, 5, 10, 100 ou 1000 vezes sua concentração natural (por exemplo), vantajosamente 0,01% por peso e preferivelmente pelo menos 0,1% por peso. Preparações enriquecidas de cerca de 0,5%, 1%, 5%, 10% e 20% por peso também são contempladas. As sequências, produtos de construção, vetores, clones e outros materiais que compreendem a presente invenção podem, vantajosamente, estar em forma enriquecida ou isolada.
[00109] Conforme aqui utilizados, os termos "porção", "segmento" e "fragmento" referem-se, quando usados em relação a peptídeos, a uma sequência contínua de resíduos, como resíduos de aminoácidos, que forma um subconjunto de uma sequência maior. Por exemplo, se um polipeptídeo for sujeito a tratamento com qualquer uma das endopeptidases comuns como a tripsina ou a quimotripsina, os oligopeptídeos resultantes de tal tratamento representariam porções, segmentos ou fragmentos do polipeptídeo inicial. Quando utilizados em relação a polinucleotídeos, esses termos referem-se a produtos produzidos pelo tratamento dos referidos nucleotídeos com qualquer uma das endonucleases.
[00110] De acordo com a presente invenção, os termos "porcentual de identidade" e "porcentagem de idênticos" significam, quando usados em referência a uma sequência, que uma sequência é comparada com uma sequência reivindicada ou descrita após alinhamento da sequência a ser comparada ("Sequência de Comparação") com a sequência descrita ou reivindicada ("Sequência de Referência"). O porcentual de identidade é então determinado de acordo com a seguinte fórmula: percentual de identidade = 100 [1 - (C/R)]
[00111] onde C é o número de diferenças entre a Sequência de Referência e a Sequência de Comparação ao longo do alinhamento entre a Sequência de Referência e a Sequência de Comparação, onde: (i) cada base ou aminoácido da Sequência de Referência que não possui uma base ou aminoácido alinhado correspondente na Sequência de Comparação; e (ii) cada lacuna na sequência; e (iii) cada base ou aminoácido da Sequência de Referência diferente da base ou aminoácido alinhado correspondente na Sequência de Comparação constitui uma diferença; e (iv) o alinhamento deve começar na posição 1 das sequências alinhadas;
[00112] e R é o número de bases ou aminoácidos na Sequência de Referência ao longo do comprimento do alinhamento com a Sequência de Comparação, sendo que quaisquer lacunas criadas na Sequência de Referência também são consideradas como uma base ou aminoácido.
[00113] Se existir um alinhamento entre a Sequência de Comparação e a Sequência de Referência para o qual o porcentual de identidade calculado acima for igual ou superior a um porcentual de identidade mínimo especificado, a Sequência de Comparação possui o porcentual de identidade mínimo especificado em relação à Sequência de Referência, mesmo que possa haver alinhamentos em que o porcentual de identidade calculado acima seja inferior à identidade porcentual especificada.
[00114] Conforme mencionado anteriormente, a presente invenção refere-se, portanto, a um peptídeo que compreende uma sequência de aminoácidos selecionada do grupo formado por SEQ ID N°: 1 a SEQ ID N°: 549 ou a uma variante dos mesmos com 88% de homologia com SEQ ID N°: 1 a SEQ ID N°: 549 ou uma variante da mesma que induz reação cruzada de células T com o referido peptídeo. Os peptídeos da presente invenção possuem capacidade de ligação com uma das moléculas do complexo principal de histocompatibilidade humano (MHC) de classe I ou com versões alongadas dos referidos peptídeos a moléculas de classe II.
[00115] Na presente invenção, o termo "homólogo" refere-se ao grau de identidade (ver o conceito de percentual de identidade descrito anteriormente) entre duas sequências de aminoácidos, isto é, sequências de peptídeos ou de polipeptídeos. A "homologia" mencionada anteriormente é determinada comparando-se duas sequências alinhadas sob condições ideais com as sequências a serem comparadas. Tal homologia entre sequências pode ser calculada criando- se um alinhamento utilizando-se, por exemplo, o algoritmo ClustalW. Alguns softwares de análise de sequências comumente disponíveis, mais especificamente o Vetor NTI, o GENETYX e outras ferramentas de análise, são disponibilizados por bancos de dados abertos ao público.
[00116] Os versados na técnica poderão avaliar se as células T induzidas por um peptídeo variante de um peptídeo específico podem apresentar reação cruzada com o peptídeo original (Appay et al., 2006; Colombetti et al., 2006; Fong et al., 2001; Zaremba et al., 1997).
[00117] Por "variante" da sequência de aminoácidos apresentada, os inventores entendem que as cadeias laterais de, por exemplo, um ou dois resíduos de aminoácidos são alterados (por exemplo, substituindo-os pela cadeia lateral de outro resíduo de aminoácido encontrado na natureza ou alguma outra cadeia lateral) de modo que o peptídeo continue sendo capaz de se ligar a uma molécula de HLA basicamente da mesma maneira que um peptídeo com a mesma sequência de aminoácidos que as SEQ ID N°: 1 a SEQ ID N°: 549. Por exemplo, um peptídeo pode ser modificado de modo a pelo menos manter, ou até melhorar, sua capacidade de interagir com e se ligar ao sulco de ligação de uma molécula de MHC apropriada, tal como HLA-A*02 ou -DR, e dessa forma pelo menos manter, ou até melhorar, a capacidade de ligar-se ao TCR de células T ativadas.
[00118] Em seguida, essas células T ativadas podem participar de reação cruzada com outras células e destruir células que expressam um polipeptídeo que contém a sequência natural de aminoácidos do peptídeo cognato, conforme definido nos aspectos da invenção. Como se pode depreender da literatura e de bancos de dados científicos (Rammensee et al., 1999; Godkin et al., 1997), determinadas posições em peptídeos ligantes de HLA são geralmente resíduos de ancoragem que formam uma sequência central que se fixa ao motivo ligante do receptor de HLA, que é definido por propriedades de polaridade, eletrofísicas, hidrofóbicas e espaciais das cadeias polipeptídicas que constituem o sulco de ligação. Assim, os versados na técnica saberão modificar as sequências de aminoácidos apresentadas em SEQ ID N°: 1 a SEQ ID N°: 549 mantendo os resíduos de ancoragem conhecidos e serão capazes de determinar se tais variantes preservam sua capacidade de ligação com moléculas de MHC classe I ou classe II. As variantes da presente invenção preservam a capacidade de ligação ao TCR de células T ativadas, que podem participar posteriormente de reações cruzadas e destruir células que expressam um polipeptídeo contendo a sequência natural de aminoácidos do peptídeo cognato, conforme definido nos aspectos da invenção.
[00119] Os peptídeos originais (não modificados) aqui divulgados podem ser modificados por substituição de um ou mais resíduos em sítios diferentes, e possivelmente seletivos, dentro da cadeia peptídica, salvo indicação em contrário. Preferivelmente, essas substituições se encontram no final da cadeia de aminoácidos. Tais substituições podem ser de natureza conservadora, substituindo-se por exemplo, um aminoácido por outro de estrutura e características semelhantes, como, por exemplo, substituir um aminoácido hidrofóbico por outro aminoácido hidrofóbico. Ainda mais conservador seria substituir aminoácidos de tamanho e natureza química semelhantes ou idênticos, como substituir leucina por isoleucina. Em estudos de variações de sequências em famílias de proteínas homólogas que ocorrem naturalmente, determinadas substituições de aminoácidos são toleradas com muito mais frequência que outras, e estas frequentemente mostram correlação com semelhanças de tamanho, carga, polaridade e hidrofobicidade entre o aminoácido original e seu substituto, sendo esta a base para definição de "substituições conservadoras".
[00120] As substituições conservadoras são aqui definidas como trocas dentro de um dos seguintes grupos: Grupo 1: Resíduos pequenos alifáticos, apolares ou ligeiramente polares (Ala, Ser, Tre, Pro, Gli); Grupo 2: Resíduos polares com carga negativa e as respectivas amidas (Asp, Asn, Glu, Gln); Grupo 3: Resíduos polares com carga positiva (His, Arg, Lis); Grupo 4: Resíduos alifáticos grandes e apolares (Met, Leu, Ile, Val, Cis); e Grupo 5: resíduos aromáticos grandes (Fen, Tir, Trp).
[00121] Algumas substituições menos conservadoras podem consistir em substituição de um aminoácido por outro com características semelhantes mas algo diferente em tamanho, como substituição de uma alanina por um resíduo de isoleucina. Substituições pouquíssimo conservadoras podem consistir em substituir um aminoácido ácido por outro polar ou até mesmo por outro básico. Entretanto, tais substituições "radicais" não podem ser descartadas como possivelmente ineficazes, pois seus efeitos químicos não são totalmente previsíveis e as substituições radicais podem produzir efeitos fortuitos que não podem ser previstos de outra forma a partir de princípios químicos simples.
[00122] Evidentemente, tais substituições podem envolver outras estruturas que não os L-aminoácidos comuns. Portanto, os D-aminoácidos podem ser substituídos pelos L-aminoácidos comumente encontrados em peptídeos antigênicos da invenção, não deixando de ser contemplados pela presente divulgação. Além disso, aminoácidos não-padrão (isto é, outros aminoácidos que não os 20 aminoácidos proteinogênicos) também podem ser empregados para finalidades de substituição de modo a produzir imunógenos e polipeptídeos imunogênicos de acordo com a presente invenção.
[00123] Se for constatado que substituições em mais de uma posição produzem peptídeos com atividade antigênica substancialmente equivalente ou maior conforme definido a seguir, combinações dessas substituições serão testadas para determinar se as substituições combinadas produzem efeitos aditivos ou sinergísticos sobre a antigenicidade do peptídeo. No máximo, não mais de quatro posições no peptídeo devem ser substituídas simultaneamente.
[00124] Um peptídeo que consiste essencialmente na sequência de aminoácidos aqui indicada pode possuir um ou dois aminoácidos não-âncoras (o motivo âncora é descrito mais detalhadamente a seguir), que são trocados sem que a capacidade de ligação a uma molécula do complexo principal de histocompatibilidade (MHC) humano classe I ou II seja modificada significativamente ou prejudicada em comparação com o peptídeo não modificado. Em outra configuração, que consiste essencialmente na sequência de aminoácidos aqui indicada, um ou dois aminoácidos podem ser trocados por elementos de troca conservadores (ver adiante) sem que a capacidade de ligação a uma molécula do complexo principal de histocompatibilidade (MHC) humano classe I ou II seja modificada significativamente ou prejudicada em comparação com o peptídeo não modificado.
[00125] Os resíduos de aminoácidos que não contribuem significativamente para as interações com o receptor de células T podem ser modificados substituindo-se com outro aminoácido, cuja incorporação não afeta significativamente a reatividade de células T nem elimina a ligação ao MHC relevante. Assim, considerando-se a condição acima, o peptídeo da invenção pode ser qualquer peptídeo (termo sob o qual os inventores incluem oligopeptídeo e polipeptídeo), incluindo sequência de aminoácidos ou uma porção ou variante das mesmas conforme apresentadas.
[00126] Peptídeos mais longos (alongados) também podem ser apropriados. Também é possível que epítopos de MHC classe I, embora normalmente tenham de 8 a 11 aminoácidos de comprimento, sejam gerados pelo processamento de peptídeos mais longos ou por proteínas que incluam o epítopo real. É preferível que os resíduos que flanqueiam o epítopo sejam resíduos que não afetem significativamente a clivagem proteolítica necessária para expor o epítopo durante o processamento.
[00127] Os peptídeos da invenção podem ser alongados em até quatro aminoácidos, ou seja, podem-se adicionar 1, 2, 3 ou 4 aminoácidos a qualquer extremidade em qualquer combinação entre 4:0 e 0:4. A Tabela 6 apresenta combinações de alongamentos de acordo com a invenção: TABELA 6: Algumas combinações de peptídeos alongados da presente invenção
[00128] Os aminoácidos do alongamento/extensão podem ser os peptídeos da sequência original da proteína ou quaisquer outros aminoácidos. O alongamento pode ser utilizado para tornar os peptídeos mais estáveis ou mais solúveis.
[00129] Portanto, os epítopos da presente invenção podem ser idênticos a epítopos que ocorrem naturalmente e que são associados a ou específicos para tumores, ou podem incluir epítopos que diferem em no máximo quatro resíduos do peptídeo de referência, conquanto apresentem atividade antigênica substancialmente idêntica.
[00130] Em uma configuração alternativa, o peptídeo é alongado em mais de quatro aminoácidos em um ou ambos os lados, preferivelmente até atingir um comprimento total de 30 aminoácidos. Assim, podem-se criar peptídeos ligantes de MHC classe II. A ligação ao MHC classe II pode ser testada por métodos conhecidos na técnica.
[00131] Dessa forma, a presente invenção fornece peptídeos e variantes de epítopos de MHC classe I nas quais o peptídeo ou variante tem comprimento total entre 8 e 100, preferivelmente entre 8 e 30, mais preferivelmente entre 8 e 14, especificamente, 8, 9, 10, 11, 12, 13 ou 14 aminoácidos; no caso de peptídeos ligantes de classe II prolongados o comprimento também pode ser de 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21 ou 22 aminoácidos.
[00132] Evidentemente, o peptídeo ou variante de acordo com a presente invenção terá a capacidade de se ligar a uma molécula do complexo principal de histocompatibilidade (MHC) classe I ou II. A ligação de um peptídeo ou variante a um complexo de MHC pode ser testada por métodos conhecidos na técnica.
[00133] Preferivelmente, quando células T específicas para um peptídeo de acordo com a presente invenção são testadas contra os peptídeos substituídos, a concentração de peptídeos em que os peptídeos substituídos produzem metade do aumento máximo de lise em relação aos níveis basais é de não mais que cerca de 1 mM, preferivelmente não mais que cerca de 1 µM, mais preferivelmente não mais que cerca de 1 nM e ainda mais preferivelmente não mais que cerca de 100 pM e, mais preferivelmente, não mais que 10 pM. É preferível também que o peptídeo substituído possa ser reconhecido por células T citotóxicas de mais de um indivíduo, de pelo menos dois e, mais preferivelmente, de três indivíduos.
[00134] Em uma configuração especialmente preferida da invenção, o(s) peptídeo(s) consiste(m) basicamente em uma sequência de aminoácidos de acordo com SEQ ID N°: 1 a SEQ ID N°: 549.
[00135] "Consiste essencialmente em" significa que um peptídeo de acordo com a presente invenção contém, além da sequência de acordo com qualquer sequência de SEQ ID N°: 1 a SEQ ID N°: 549 ou variante das mesmas, outros prolongamentos formados por segmentos aminoácidos N- e/ou C- terminais, que não necessariamente formam parte do peptídeo que funciona como epítopo para epítopos que possuem moléculas de MHC.
[00136] Contudo, esses segmentos podem ser importantes para tornar eficiente a introdução do peptídeo de acordo com a presente invenção em células. Em uma configuração da presente invenção, o peptídeo é parte de uma proteína de fusão que compreende, por exemplo, os 80 aminoácidos N-terminais da cadeia invariante associada ao antígeno HLA-DR (p33, no seguinte "Ii") conforme derivado do NCBI, GenBank número de acesso X00497. Em outras fusões, os peptídeos da presente invenção podem ser fundidos com um anticorpo conforme aqui descrito ou com uma parte funcional do mesmo, e em particular com uma sequência de um anticorpo, de modo a se tornar um alvo específico do referido anticorpo ou, por exemplo, em ou no interior de um anticorpo específico para células dendríticas, conforme aqui descrito.
[00137] O peptídeo ou variante também pode ser modificado ainda mais para melhorar a estabilidade e/ou a ligação a moléculas de MHC a fim de produzir uma resposta imune mais forte. Os métodos de otimização de tais sequências peptídicas são bem conhecidos na técnica e incluem, por exemplo, a introdução de ligações peptídicas reversas ou de ligações não peptídicas.
[00138] Em uma ligação peptídica reversa, os aminoácidos não se ligam por meio de ligações peptídicas (-CO-NH-), mas por uma ligação peptídica invertida. Tal peptideomimetismo retroinvertido pode ser produzido usando-se métodos conhecidos na técnica, como, por exemplo, os descritos por Mezière et al (1997) (Meziere et al., 1997), que fica aqui incorporado por referência. Esta abordagem inclui criar pseudopeptídeos contendo alterações na cadeia básica e não na orientação das cadeias laterais. Mezière et al. (Meziere et al., 1997) demonstraram que esses pseudopeptídeos podem ser úteis para respostas de ligação de MHC e de células T auxiliares. Os peptídeos retroinvertidos, que contêm ligações NH-CO em vez de CO-NH, são muito mais resistentes à proteólise.
[00139] São exemplos de ligações não peptídicas, -CH2-NH, -CH2S-, - CH2CH2-, -CH=CH-, -COCH2-, -CH(OH)CH2-, e -CH2SO-. A patente US 4.897.445 fornece um método para síntese em fase sólida de ligações não-peptídicas (-CH2- NH) em cadeias polipeptídicas envolvendo polipeptídeos sintetizados por procedimentos padrão, onde a ligação não peptídica é sintetizada pela reação de um aminoaldeído com um aminoácido na presença de NaCNBH3.
[00140] Os peptídeos que compreendem as sequências descritas acima podem ser sintetizados com outros grupamentos químicos presentes em suas terminações amina ou carboxila para melhorar a estabilidade, biodisponibilidade e/ou afinidade dos peptídeos. Por exemplo, grupamentos hidrofóbicos como a carbobenzoxila, dansila ou t-butiloxicarbonila podem ser adicionados à amina terminal dos peptídeos. Da mesma forma, um grupamento acetila ou um grupamento 9-fluorenilmetóxi-carbonila pode ser adicionado à amina terminal dos peptídeos. Além disso, o grupamento hidrofóbico t-butiloxicarbonila ou um grupamento amida podem ser adicionados às carboxilas terminais dos peptídeos.
[00141] Outrossim, os peptídeos descritos podem ser sintetizados de forma a alterar suas configurações estéricas. Por exemplo, o D-isômero de um ou mais resíduos de aminoácidos do peptídeo pode ser utilizado em vez do L- isômero. Ainda mais, um ou mais resíduos de aminoácidos dos peptídeos da invenção podem ser substituídos por um dos resíduos de aminoácidos bem conhecidos e que não ocorrem naturalmente.
[00142] Alterações como essas podem contribuir para aumentar a estabilidade, a biodisponibilidade ou a ação ligante dos peptídeos da invenção.
[00143] Da mesma forma, um peptídeo da invenção ou variante do mesmo pode ser modificado quimicamente por meio de reações com aminoácidos específicos antes ou depois da síntese do peptídeo. Alguns exemplos de tais modificações são bem conhecidos na técnica e resumidos em, por exemplo, R. Lundblad, Chemical Reagents for Protein Modification, 3rd ed. CRC Press, 2004 (Lundblad, 2004), que fica aqui incorporado por referência. A modificação química de aminoácidos inclui, entre outras, modificação por acilação, amidinação, piridoxilação de lisina, alquilação redutora, trinitrobenzilação de grupamentos amina com ácido 2,4,6-trinitrobenzeno sulfônico (TNBS), modificação amídica de grupamentos carboxila e modificações sulfidrila mediante oxidação por ácido perfórmico de cisteína formando ácido cisteico, formação de derivados mercuriais, formação de dissulfetos mistos com outros compostos de tiol, reação com maleimida, carboximetilação com ácido iodoacético ou iodoacetamida e carbamoilação com cianato em pH alcalino, sem limitar-se a estes. Em relação a isso, os versados na técnica podem referir-se ao Capítulo 15 de Current Protocols In Protein Science, Eds. Coligan et al. (John Wiley & Sons NY 1995-2000) (Coligan et al., 1995) para obter mais detalhes sobre as metodologias de modificação química de proteínas.
[00144] Resumidamente, a modificação de, por exemplo, resíduos de arginila em proteínas baseia-se muitas vezes na reação de compostos como dicarbonilas vicinais como fenilglioxal, 2,3-butanediona e 1,2-ciclohexanediona para formar um adutor. Outro exemplo é a reação de metilglioxal com resíduos de arginina. A cisteína pode ser modificada sem alteração concomitante de outros sítios nucleofílicos como a lisina e a histidina. Com isso, grande número de reagentes estão disponíveis para modificar a cisteína. Os websites de empresas como a Sigma-Aldrich (http://www.sigma-aldrich.com) apresentam informações sobre reagentes específicos.
[00145] A redução seletiva de ligações dissulfeto em proteínas também é comum. As ligações dissulfeto podem ser encontradas e oxidadas durante o tratamento térmico de produtos biofarmacêuticos. O Reagente K de Woodward pode ser empregado para modificar resíduos específicos de ácido glutâmico. A N-(3-(dimetilamino)propil)-N’-etilcarbodi-imida pode ser empregada para formar ligações cruzadas intramoleculares entre resíduos de lisina e um resíduo de ácido glutâmico. Por exemplo, o dietilpirocarbonato é um reagente para modificação de resíduos histidil em proteínas.
[00146] A histidina também pode ser modificada usando-se 4-hidroxi-2- nonenal. A reação de resíduos de lisina e outros grupamentos a-amino é útil, por exemplo, para ligar peptídeos a superfícies ou para ligação cruzada de proteínas ou peptídeos. A lisina é o local de fixação do poli(etileno)glicol e é o principal sítio de modificação na glicosilação de proteínas. Os resíduos de metionina das proteínas podem ser modificados por, por exemplo, iodoacetamida, bromoetilamina e cloramina T.
[00147] O tetranitrometano e o N-acetilimidazol podem ser usados para modificar os resíduos de tirosila. A ligação cruzada por meio da formação de ditirosina pode ser efetuada com peróxido de hidrogênio e íons de cobre.
[00148] Estudos recentes sobre a modificação do triptofano vem empregando a N-bromosuccinimida, 2-hidróxi-5-nitrobenzil brometo ou 3- bromo-3-metil-2-(2-nitrofenilmercapto)-2H-indol (BPNS-escatol).
[00149] A modificação bem-sucedida de proteínas e peptídeos terapêuticos com PEG frequentemente prolonga a meia-vida na circulação, e a ligação cruzada de proteínas com glutaraldeído, polietilenoglicol diacrilato e formaldeído é empregada para preparar hidrogéis. Muitos alérgenos são modificados para imunoterapia por carbamilação com cianato de potássio.
[00150] Um peptídeo ou variante onde o peptídeo é modificado ou inclui ligações não peptídicas é uma modalidade preferida da invenção. Geralmente, os peptídeos e variantes (pelo menos aquelas que contêm ligações peptídicas entre resíduos de aminoácidos) podem ser sintetizadas pelo método Fmoc-poliamida ou por síntese de peptídeos em fase sólida, conforme divulgado por Lukas et al. (Lukas et al., 1981) e nas respectivas referências. O grupamento 9-fluorenilmetiloxicarbonil (Fmoc) protege temporariamente o grupamento N-amino. A clivagem repetitiva do grupo protetor altamente base lábil é efetuada usando-se 20% piperidina em N, N- dimetilformamida. Os grupamentos em cadeias laterais podem ser protegidos como seus: éteres butílicos (para serina, treonina e tirosina), ésteres butílicos (para ácido glutâmico e ácido aspártico), derivados butiloxicarbonila (para lisina e histidina), derivados tritila (para cisteína) e derivados 4-metoxi-2,3,6-trimetilbenzenossulfonil (para arginina). Se houver resíduos C-terminais de glutamina ou asparagina, o grupamento 4,4'-dimetoxibenzidrila é usado para proteger os grupamentos amido das cadeias laterais. O suporte de fase sólida é baseado em um polímero de polidimetil-acrilamida constituído por três monômeros: dimetilacrilamida (monômero da cadeia básica), bisacriloiletileno diamina (ligante cruzado) e acriloilsarcosina metil éster (agente funcionalizante). O agente clivável da ligação peptídeo-resina empregado é um derivado ácido lábil do ácido 4-hidroximetil- fenoxiacético. Todos os derivados de aminoácidos são adicionados na forma de anidridos simétricos pré-formados, com exceção de asparagina e glutamina, que são adicionadas usando-se um procedimento de acoplamento reverso mediado por N, N-dicicloexilcarbodi-imida/1-hidroxibenzotriazol. Todas as reações de acoplamento e desproteção são monitoradas por procedimentos de teste com ninhidrina, ácido trinitrobenzenossulfônico ou isotina. Ao final da síntese, os peptídeos são clivados da resina de suporte e, ao mesmo tempo, os grupamentos protetores das cadeias laterais são removidos por tratamento com ácido trifluoracético a 95% contendo uma mistura de 50% de "sequestrantes". Alguns sequestrantes comumente utilizados são etanoditiol, fenol, anisol e água, e a escolha exata depende dos aminoácidos constituintes do peptídeo que está sendo sintetizado. Também é possível combinar metodologias de fase sólida e fase em solução para sintetizar peptídeos (ver, por exemplo, (Bruckdorfer et al., 2004), e referências por ele citadas).
[00151] O ácido trifluoracético é removido por evaporação a vácuo seguida de trituração com éter dietílico para produzir o peptídeo bruto. Quaisquer sequestrantes que ainda estiverem presentes serão retirados por um procedimento de extração simples, no qual a liofilização da fase aquosa produz o peptídeo bruto livre de sequestrantes. Os reagentes para síntese de peptídeos são geralmente fornecidos por, por exemplo, Calbiochem-Novabiochem (Nottingham, Reino Unido).
[00152] A purificação pode ser realizada por qualquer uma ou por uma combinação de técnicas como recristalização, cromatografia de exclusão por tamanho molecular, cromatografia de troca iônica, cromatografia de interação hidrofóbica e (geralmente) cromatografia líquida de alto desempenho de fase reversa empregando, por exemplo, um gradiente de separação de acetonitrilo/água.
[00153] A análise dos peptídeos pode ser realizada empregando-se cromatografia em camada fina, eletroforese — sobretudo a eletroforese capilar com extração em fase sólida (CSPE, "capillary solid phase extraction") —, cromatografia líquida de alto desempenho de fase reversa, análise de aminoácidos após hidrólise ácida e por espectrometria de massa com bombardeio por átomos rápidos (FAB, "fast atom bombardment"), assim como análise espectrométrica de massa por MALDI e ESI-Q-TOF.
[00154] Para selecionar peptídeos apresentados de forma exacerbada, um perfil de apresentação é calculado para mostrar a apresentação mediana da amostra e a variação entre réplicas. O perfil justapõe amostras da entidade tumoral relevante a uma base de tecidos tumorais normais. Em seguida, cada um desses perfis pode ser consolidado em um escore de apresentação aumentada calculando-se o valor p de um modelo misto de efeitos lineares (Pinheiro et al., 2015) com ajuste para testes múltiplos pelo método da taxa de falsas descobertas (Benjamini e Hochberg, 1995).
[00155] Para identificação e quantificação relativa de ligantes de HLA por espectrometria de massa, moléculas de HLA de amostras de tecido congeladas criogenicamente foram purificadas e peptídeos associados ao HLA foram isolados. Os peptídeos isolados foram separados e suas sequências foram identificadas por ensaios de cromatografia líquida com espectrometria de massa (LC-MS) com ionização por nanoeletrospray (nanoESI). As sequências peptídicas resultantes foram verificadas comparando-se o padrão de fragmentação dos TUMAPs ("tumor-associated peptides") naturais registrado em amostras de câncer de ovário com os padrões de fragmentação de peptídeos de referência sintéticos correspondentes com sequências idênticas. Como os peptídeos foram identificados diretamente como ligantes de moléculas de HLA de tumores primários, esses resultados constituem evidência direta de que os peptídeos identificados são processados e apresentados naturalmente nos tecidos cancerosos primários obtidos de pacientes com câncer de ovário.
[00156] O processo de desenvolvimento de descoberta XPRESIDENT® v2.1 (ver, por exemplo, US 2013-0096016, que fica aqui integralmente incorporada por referência) permite identificar e selecionar peptídeos candidatos relevantes apresentados de forma aumentada para uso vacinal com base na quantificação relativa direta dos níveis de peptídeo restrito por HLA em tecidos cancerosos em comparação com diversos outros tecidos e órgãos não- cancerosos. Isso foi obtido mediante desenvolvimento de quantificação diferencial sem marcadores com emprego dos dados adquiridos por cromatografia líquida com espectrometria de massa (LC-MS), que foram processados por um processo de desenvolvimento de dados exclusivo. O processo combina algoritmos de identificação de sequências, agregação espectral, contagem de íons, alinhamento de tempos de retenção e deconvolução e normalização de estados de carga.
[00157] Os níveis de apresentação, que incluem estimativas de erro para cada peptídeo, foram estabelecidos. Foram identificados peptídeos apresentados exclusivamente em tecidos tumorais e peptídeos apresentados de forma aumentada em tumores em comparação com tecidos e órgãos não- cancerosos.
[00158] Os complexos peptídeo-HLA de amostras de tecidos de câncer de ovário foram purificados, e os peptídeos associados com HLA foram isolados e analisados por LC-MS (ver exemplos). Todos os TUMAPs contidos na presente solicitação foram identificados por meio dessa abordagem em amostras de tecidos de casos de câncer de ovário confirmando sua apresentação no câncer de ovário primário.
[00159] Os TUMAPs identificados em várias amostras de câncer de ovário e em tecidos normais foram quantificados por dados de contagem de íons em LC-MS sem marcadores. O método pressupõe que as áreas de sinal de LC-MS de um peptídeo se correlacionam com sua abundância na amostra. Todos os sinais quantitativos de um peptídeo em vários experimentos de LC-MS foram normalizados com base na tendência central, e as médias por amostra foram calculadas e consolidadas em um gráfico de barras para criar o perfil de apresentação. O perfil de apresentação consolida vários métodos de análise diferentes, como buscas em bancos de dados de proteínas, agregação espectral, deconvolução do estado de carga (eliminação da carga) e alinhamento e normalização do tempo de retenção.
[00160] A presente invenção fornece peptídeos úteis no tratamento do câncer e de tumores, preferivelmente câncer de ovário que apresentam o peptídeo da invenção de forma exacerbada ou exclusiva. A espectrometria de massa mostrou que esses peptídeos são apresentados naturalmente por moléculas de HLA em amostras de câncer de ovário primárias.
[00161] Muitas das proteínas e genes originais (também designadas "proteínas completas" ou "proteínas subjacentes") dos quais os peptídeos são derivados apresentaram altos níveis de superexpressão no câncer em comparação com tecidos normais. Para fins desta invenção, "tecidos normais" significa células de tecidos ovarianos saudáveis ou outros tecidos normais que demonstram o mesmo grau elevado de associação tumoral que os genes originais. Os peptídeos também são apresentados de forma muito aumentada em tecidos tumorais, mas não em tecidos normais. Em relação a esta invenção "tecido tumoral" significa uma amostra de um paciente que apresenta câncer de ovário.
[00162] Os peptídeos ligados ao HLA podem ser reconhecidos pelo sistema imunológico, especificamente pelos linfócitos T. As células T podem destruir células que apresentam o complexo HLA-peptídeo reconhecido, por exemplo células de câncer de ovário que apresentem os peptídeos derivados.
[00163] Os peptídeos da presente invenção mostraram-se capazes de estimular respostas de células T e/ou são apresentados de forma aumentada; portanto, pode-se usá-los para produzir anticorpos e/ou TCR, tais como sTCR solúveis de acordo com a presente invenção. Além disso, os peptídeos da presente invenção também podem ser usados, quando formam complexos com os respectivos MHCs, para produzir anticorpos e/ou sTCR, sobretudo sTCR, de acordo com a presente invenção. Os respectivos métodos são bem conhecidos de indivíduos versados na técnica e também podem ser encontrados na respectiva literatura. Assim, os peptídeos da presente invenção são úteis para gerar uma resposta imune em um paciente, por meio da qual as células Tumorais podem ser destruídas. Pode-se induzir uma resposta imune em um paciente administrando-se os peptídeos descritos ou substâncias precursoras apropriadas (por exemplo peptídeos alongados, proteínas ou ácidos nucleicos que codificam tais peptídeos) diretamente ao paciente, idealmente em combinação com agentes que promovem a imunogenicidade (isto é, um adjuvante). Pode-se esperar que a resposta imune originária de tal vacinação terapêutica seja altamente específica contra células Tumorais porque os peptídeos-alvo da presente invenção não são apresentados em tecidos normais em números de cópias semelhantes, evitando o risco de reações autoimunes indesejadas contra células normais do paciente.
[00164] A presente descrição refere-se também a receptores de células T (TCRs) que compreendem uma cadeia alfa e uma cadeia beta (TCRs alfa/beta). Também são fornecidos peptídeos HAVCR-1001 capazes de se ligar a TCR e anticorpos quando apresentados por uma molécula de MHC. A presente descrição refere-se também a ácidos nucleicos, vetores e células hospedeiras para expressão de TCRs e peptídeos da presente descrição, assim como a métodos de usar os mesmos.
[00165] O termo "receptor de células T" (abreviatura TCR) refere-se a uma molécula heterodimérica que compreende uma cadeia polipeptídica alfa (cadeia alfa) e uma cadeia polipeptídica beta (cadeia beta), na qual o receptor heterodimérico é capaz de se ligar a um antígeno peptídico apresentado por uma molécula de HLA. O termo também inclui os chamados TCRs gama/delta.
[00166] Em uma configuração, a descrição fornece um método de produção de um TCR conforme aqui descrito, sendo que o método compreende cultivar células hospedeiras capazes de expressar o TCR em condições apropriadas para promover a expressão do TCR.
[00167] Em outro aspecto, a descrição refere-se a métodos de acordo com a descrição, sendo que o antígeno é carregado em moléculas de MHC classe I ou II expressas na superfície de uma célula apresentadora de antígenos apropriada ou de uma célula apresentadora de antígenos artificial colocando-se uma quantidade suficiente do antígeno em contato com uma célula apresentadora de antígenos ou o antígeno é carregado em tetrâmetros de MHC classe I ou II por meio da tetramerização de monômeros de complexos antígenos-MHC classe I ou II.
[00168] As cadeias alta e beta dos TCRs alfa/beta e as cadeias gama e delta dos TCRs gama/delta são geralmente consideradas como possuindo dois "domínios" cada, quais sejam, um domínio variável e um domínio constante. O domínio variável consiste na concatenação de uma região variável (V) com uma região da dobradiça (J). O domínio variável também pode incluir uma região líder (L), e as cadeias beta e delta também podem apresentar uma região de diversidade (D). Os domínios constantes das cadeias alfa e beta também podem incluir domínios transmembrana (TM) C-terminais que ancoram as cadeias alfa e beta à membrana celular.
[00169] Em relação aos TCRs gama/delta, o termo "domínio variável do TCR gama" conforme aqui utilizado refere-se à concatenação da região gama V do TCR (TRGV) sem região líder (L) com a região TCR gama J (TRGJ), e o termo TCR gama de domínio constante refere-se à região extracelular do TRGC ou a uma sequência de TRGC com truncamento C-terminal. Da mesma forma, o termo "domínio variável de TCR delta" refere-se à concatenação da região TCR delta V (TRDV) sem região líder (L) com a região TCR delta D/J (TRDD/TRDJ), e o termo "domínio constante do TCR delta" refere-se à região extracelular do TRDC ou a uma sequência de TRDC com truncamento C-terminal.
[00170] Os TCRs da presente invenção se ligam preferivelmente a um complexo do peptídeo da invenção com HLA com afinidade de ligação (KD) de cerca de 100 µM ou menos, cerca de 50 µM ou menos, cerca de 25 µM ou menos ou cerca de 10 µM ou menos. São mais preferíveis os TCRs de alta afinidade cujas afinidades de ligação sejam de aproximadamente 1 µM ou menos, cerca de 100 nM ou menos, cerca de 50 nM ou menos ou cerca de 25 nM ou menos. São exemplos não limitantes dos intervalos de afinidade de ligação preferidos de TCRs da presente invenção cerca de 1 nM a cerca de 10 nM; cerca de 10 nM a cerca de 20 nM; cerca de 20 nM a cerca de 30 nM; cerca de 30 nM a cerca de 40 nM; cerca de 40 nM a cerca de 50 nM; cerca de 50 nM a cerca de 60 nM; cerca de 60 nM a cerca de 70 nM; cerca de 70 nM a cerca de 80 nM; cerca de 80 nM a cerca de 90 nM; e cerca de 90 nM a cerca de 100 nM.
[00171] Conforme aqui utilizado em relação aos TCRs da presente descrição, "ligação específica" e variações gramaticais do termo são usados para designar um TCR com afinidade de ligação (KD) de 100 µM ou menos para um complexo de HLA com peptídeo HAVCR-001.
[00172] As TCRs alfa/beta heterodiméricas da presente descrição podem ter uma ligação dissulfeto introduzida entre seus domínios constantes.Os TCRs preferidos deste tipo incluem aqueles com uma sequência de domínio TRAC constante e uma sequência de TRBC1 ou TRBC2 constante, exceto que a Tre 48 do TRAC e a Ser 57 do TRBC1 ou TRBC2 são substituídas por resíduos de cisteína, e essas cisteínas formam uma ponte dissulfeto entre a sequência de domínio constante do TRAC e a sequência de domínio constante do TRBC1 ou TRBC2 do TCR.
[00173] Com ou sem a introdução da ligação entre cadeias mencionada anteriormente, os TCRs alfa/beta heterodiméricos da presente descrição podem apresentar um domínio com sequência constante codificado pelo gene TRAC e um domínio TRBC1 ou TRBC2 com sequência constante, e as sequências do domínio constante TRAC e dos domínios constantes TRBC1 ou TRBC2 do TCR podem ser ligadas uma à outra pela ligação dissulfeto nativa entre a Cis4 do éxon 2 da TRAC e a Cis2 do éxon 2 da TRBC1 ou da TRBC2.
[00174] Os TCRs da presente descrição podem compreender um marcador detectável, selecionado do grupo formado por um radionuclídeo, um fluoróforo e biotina. Os TCRs da presente descrição podem ser conjugados com um agente terapeuticamente ativo, como um radionuclídeo, um agente quimioterápico ou uma toxina.
[00175] Em uma configuração, um TCR da presente descrição que apresenta pelo menos uma mutação na cadeia alfa e/ou apresenta pelo menos uma mutação na cadeia beta exibe glicosilação modificada em comparação com o TCR sem mutação.
[00176] Em uma configuração, um TCR que compreende pelo menos uma mutação na cadeia alfa do TCR e/ou a cadeia beta do TCR possui afinidade de ligação por e/ou meia-vida de ligação para um complexo de peptídeo da invenção com molécula de HLA que corresponde a pelo menos o dobro do de um TCR que compreende a cadeia alfa não-mutante do TCR e/ou a cadeia beta não-mutante do TCR. A melhora da afinidade de TCRs específicas para tumores e sua exploração depende da existência de uma janela na qual o TCR apresenta máxima afinidade. A existência dessa janela baseia-se em observações de que TCRs específicos para patógenos restritos por HLA-A2 geralmente possuem valores de KD 10 vezes menores que os de TCRs específicos para autoantígenos associados a tumor restritos por HLA-A2. Sabe-se atualmente que, embora os antígenos tumorais tenham potencial imunogênico, apenas proteínas mutantes ou cujo processamento pós-tradução foi alterado serão consideradas estranhas pelo sistema imune; afinal, os tumores se originam das células do próprio indivíduo. Os antígenos regulados positivamente ou superexpressos (os chamados autoantígenos) nem sempre induzem uma resposta imune funcional contra o tumor. As células T que expressam TCRs reativos a esses antígenos são selecionadas negativamente no timo por um processo conhecido como tolerância central, no qual apenas células T com TCRs de baixa afinidade para autoantígenos permanecem. Portanto, a afinidade dos TCRs ou de variantes da presente descrição para o peptídeo da invenção pode ser melhorada por métodos bem conhecidos na técnica.
[00177] A presente descrição se refere também a um método de identificação de isolamento de um TCR de acordo com a presente invenção, sendo que o referido método compreende a incubação de células mononucleares do sangue periférico (PBMC) de doadores negativos para HLA- A*02 com monômeros do peptídeo da invenção com A2, incubação das PBMC com ficoeritrina tetramérica (PE) e isolamento das células T que apresentam avidez elevada por separação celular ativada por fluorescência (FACS)-Calibur.
[00178] A presente descrição refere-se também a um método de identificação e isolamento de TCR de acordo com a presente descrição, sendo que o referido método compreende a obtenção de camundongos transgênicos com a totalidade dos lócus do gene TCRaß humano (1,1 e 0,7 Mb), no qual as células T expressam um repertório diversificado de TCR humano que compensa a deficiência de TCR do camundongo e imuniza o animal com o peptídeo da invenção; refere-se ainda à incubação de PBMC obtidas de camundongos transgênicos com ficoeritrina tetramérica (PE) e isolamento de células T de alta avidez por separação de células ativadas por fluorescência segundo FACS- Calibur.
[00179] Em um aspecto, para obter células T que expressem TCRs da presente descrição, os ácidos nucleicos que codificam as cadeias TCR-alfa e/ou TCR-beta da presente descrição são clonadas em vetores de expressão, como retrovírus gama ou lentivírus. Uma vez gerados, os vírus recombinantes têm sua funcionalidade testada, incluindo especificidade para antígenos e avidez funcional. Em seguida, uma alíquota do produto final é utilizada para transdução da população de células T alvo (geralmente purificada de PBMC do paciente), que é então expandida antes de ser infundida no paciente.
[00180] Em outro aspecto, para se obter TCRs que expressam células T da presente descrição, RNAs de TCR são sintetizados por meio de procedimentos conhecidos na técnica, por exemplo sistemas de transcrição in vitro. Os RNAs de TCRs sintetizados in vitro são então introduzidos em células T CD8+ primárias obtidas de doadores saudáveis por eletroporação para que reexpressem as cadeias TCR-alfa e/ou TCR-beta específicas para tumores.
[00181] Para aumentar a expressão, os ácidos nucleicos que codificam os TCRs da presente descrição podem ser ligados operacionalmente a promotores fortes, tais como repetição terminal longa (LTRs) em retrovírus, citomegalovírus (CMV), vírus de células Tronco murinas (MSCV) U3, fosfoglicerato quinase (PGK), ß-actina, ubiquitina e um promotor composto de vírus símio 40 (SV40)/CD43, fator de alongamento (EF)-1a e o promotor do vírus formador de foco esplênico (SFFV). Em uma modalidade preferida, o promotor é heterólogo em relação ao ácido nucleico expresso. Além dos promotores fortes, os cassetes de expressão de TCR da presente descrição podem conter outros elementos que podem incentivar a expressão de transgenes, tais como um trato central de polipurina (cPPT), que promove a translocação central de estruturas lentivirais (Follenzi et al., 2000), e o elemento regulatório pós- transcricional do vírus da hepatite da marmota (wPRE), que aumenta os níveis da expressão do transgene ao melhorar a estabilidade do RNA (Zufferey et al., 1999).
[00182] As cadeias alfa e beta de um TCR da presente invenção podem ser codificadas por ácidos nucleicos localizados em vetores separados ou por polinucleotídeos localizados no mesmo vetor.
[00183] Para obter níveis elevados de expressão superficial de TCR, tanto a cadeia TCR-alfa como a TCR-beta do TCR introduzido precisam ser transcritas em volumes elevados.
[00184] Isso requer que as cadeias TCR-alfa e TCR-beta da presente descrição sejam clonadas com formação de estruturas bicistrônicas em um único vetor, o que se mostrou suficiente para superar esse obstáculo. O uso de um sítio de entrada intra-ribossômico viral (IRES) entre as cadeias TCR-alfa e TCR-beta induz a expressão coordenada das duas cadeias, pois as cadeias TCR-alfa e TCR- beta são ambas geradas a partir de um único produto de transcrição, que é clivado em duas proteínas durante a tradução, garantindo que as cadeias TCR- alfa e TCR-beta sejam produzidas em proporção equimolar (Schmitt et al. 2009).
[00185] Os ácidos nucleicos que codificam os TCRs da presente descrição podem ser otimizados ao nível de seus códons para aumentar a expressão em uma célula hospedeira. O código genético é redundante e permite que alguns aminoácidos sejam codificados por mais de um códon, mas alguns códons são menos adequados que outros devido a fatores como, por exemplo, a disponibilidade relativa de tRNAs correspondentes (Gustafsson et al., 2004). Foi demonstrado que a modificação das sequências dos genes TCR-alfa e TCR-beta de modo que cada aminoácido seja codificado pelo códon ideal para expressão de genes de mamíferos, bem como a eliminação da instabilidade de motivos ou de sítios de splicing crípticos aumenta significativamente a expressão de genes de TCR-alfa e TCR-beta (Scholten et al., 2006).
[00186] Além disso, erros de pareamento entre a cadeia de TCR endógena e a introduzida podem criar especificidades que acarretam risco significativo de autoimunidade. Por exemplo, a formação de dímeros mistos de TCR pode reduzir o número de moléculas CD3 disponíveis para formar complexos TCR devidamente pareados, o que diminui significativamente a avidez funcional das células que expressam o TCR introduzido (Kuball et al., 2007).
[00187] Para reduzir erros de pareamento, o domínio C-terminal das cadeias do TCR introduzidas na presente descrição pode ser modificado para promover afinidade entre cadeias e, ao mesmo tempo, tornar as cadeias introduzidas menos capazes de emparelhar com o TCR endógeno. Essas estratégias podem consistir em substituição dos domínios C-terminais de TCR- alfa e TCR-beta humanos por seus correspondentes murinos (domínio C-terminal murinizado), geração de uma segunda ponte dissulfeto entre as cadeias no domínio C-terminal introduzindo-se um segundo resíduo de cisteína tanto na cadeia TCR-alfa como na cadeia TCR-beta do TCR introduzido (modificação por cisteína), troca de resíduos que interagem nos domínios C-terminais das cadeias TCR-alfa TCR-beta ("knob-in-hole") e fusão dos domínios variáveis das cadeias TCR-alfa e TCR-beta diretamente no CD3Z (fusão de CD3Z) (Schmitt et al. 2009).
[00188] Em uma configuração, uma célula hospedeira é modificada para expressar um TCR da presente descrição. Em configurações preferidas, a célula hospedeira é uma célula T humana ou um progenitor de célula T. Em algumas configurações, a célula T ou a célula progenitora de célula T é obtida de um paciente com câncer. Em outras configurações, a célula T ou a célula progenitora de célula T é obtida de um doador saudável. As células hospedeiras da presente descrição podem ser alogênicas ou autólogas em relação ao paciente a ser tratado. Em uma configuração a célula hospedeira é uma célula T gama/delta transformada para expressar um TCR alfa/beta.
[00189] Uma "composição farmacêutica" significa uma composição apropriada para administração a um ser humano em um ambiente clínico. Preferivelmente, a composição farmacêutica é estéril e produzida de acordo com as diretrizes de Boas Práticas de Fabricação.
[00190] As composições farmacêuticas compreendem os peptídeos tanto em forma livre como na forma de um sal farmaceuticamente aceitável (ver também o texto anterior). Conforme aqui utilizado, "sal farmaceuticamente aceitável" refere-se a um derivado dos peptídeos divulgados onde o peptídeo é modificado elaborando-se sais ácidos ou básicos do agente. Por exemplo, os sais ácidos são preparados a partir da base livre (geralmente onde a forma neutra da droga possui um grupamento NH2 neutro) envolvendo reação com um ácido apropriado. Entre os ácidos apropriados para preparar sais ácidos estão tanto ácidos orgânicos (por exemplo ácido acético, ácido propiônico, ácido glicólico, ácido pirúvico, ácido oxálico, ácido málico, ácido malônico, ácido succínico, ácido maleico, ácido fumárico, ácido tartárico, ácido cítrico, ácido benzoico, ácido cinâmico, ácido mandélico, ácido metanossulfônico, ácido etanossulfônico, ácido p-toluenossulfônico, ácido salicílico e assemelhados) como ácidos inorgânicos (por exemplo ácido clorídrico, ácido bromídrico, ácido sulfúrico, ácido nítrico, ácido fosfórico e assemelhados. Por outro lado, a preparação de sais básicos de grupamentos ácidos que podem estar presentes em um peptídeo são preparados usando-se uma base farmaceuticamente aceitável como hidróxido de sódio, hidróxido de potássio, hidróxido de amônia, hidróxido de cálcio, trimetilamina ou assemelhados.
[00191] Em uma configuração especialmente preferida, as composições farmacêuticas compreendem os peptídeos na forma de sais do ácido acético (acetatos), de trifluoracetatos ou do ácido clorídrico (cloretos).
[00192] Preferivelmente, o medicamento da presente invenção é um imunoterápico como uma vacina. Ela pode ser administrada ao paciente, seja no órgão afetado ou por via sistêmica i.d., i.m., s.c., i.p. e i.v. ou aplicada ex vivo em células derivadas do paciente ou de linhagens celulares humanas que são posteriormente administradas ao paciente ou usadas in vitro para selecionar uma subpopulação de células imunes derivadas do paciente, que são então readministradas ao paciente. Se o ácido nucleico for administrado a células in vitro, pode ser útil que as células sejam transfectadas para que coexpressem citocinas imunoestimulatórias como a interleucina 2. O peptídeo pode ser basicamente puro ou associado a um adjuvante imunoestimulatório (ver adiante) ou usado em associação com citocinas imunoestimulatórias ou ser administrado por um sistema de administração apropriado como, por exemplo, lipossomos. O peptídeo também pode ser conjugado com um transportador apropriado, como a hemocianina de lapa (KLH, "keyhole limpet hemocyanin") ou manana (ver WO 95/18145 e (Longenecker et al., 1993)). O peptídeo também pode ser marcado por uma proteína de fusão ou ser uma molécula híbrida. Espera-se que os peptídeos cujas sequências são mostradas na presente invenção sejam capazes de estimular células T CD4 ou CD8. Entretanto, a estimulação de células T CD8 é mais eficiente na presença do auxílio proporcionado por células T auxiliares CD4. Portanto, para epítopos de MHC classe I que estimulam células T CD8, o elemento de fusão ou seções de uma molécula híbrida proporcionam epítopos de maneira apropriada, que estimulam células T CD4-positivas. Os epítopos estimulantes de CD4 e CD8 são bem conhecidos na técnica e incluem aqueles identificados na presente invenção.
[00193] Em um aspecto, a vacina compreende pelo menos um peptídeo cuja sequência de aminoácidos é apresentada em SEQ ID N°: 1 a SEQ ID N°: 549 e pelo menos um outro peptídeo, preferivelmente de 2 a 50, mais preferivelmente de 2 a 25, ainda mais preferivelmente de 2 a 20 e, mais preferivelmente de todos, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17 ou 18 peptídeos. Os peptídeos podem ser derivados de um ou mais AATs específicos e podem se ligar a moléculas de MHC classe I.
[00194] Outro aspecto da invenção proporciona um ácido nucleico (por exemplo, um polinucleotídeo) que codifica um peptídeo ou variante de um peptídeo da invenção. O polinucleotídeo pode ser, por exemplo, DNA, cDNA, PNA, RNA ou combinações dos mesmos, tanto de fita única como de dupla fita, ou formas nativas ou estabilizadas de polinucleotídeos como, por exemplo, polinucleotídeos com uma cadeia básica de fosforotioato, e pode ou não conter íntrons, contanto que codifique o peptídeo. Evidentemente, apenas peptídeos que contenham os resíduos de aminoácidos que ocorrem naturalmente e unidos por ligações peptídicas que ocorrem naturalmente podem ser codificados por um polinucleotídeo. Outro aspecto da invenção fornece um vetor de expressão capaz de expressar um polipeptídeo de acordo com a invenção.
[00195] Diversos métodos foram desenvolvidos para ligar polinucleotídeos, sobretudo de DNA, a vetores empregando, por exemplo, terminações coesivas complementares. Por exemplo, trechos de homopolímeros complementares podem ser adicionados ao segmento de DNA a ser inserido no DNA do vetor. Em seguida, o vetor e o segmento de DNA são unidos pela ponte de hidrogênio entre as caudas homopoliméricas complementares para formar moléculas de DNA recombinante.
[00196] Ligantes sintéticos que contêm um ou mais sítios de restrição constituem um método alternativo de unir o segmento de DNA aos vetores. Ligantes sintéticos contendo diversos sítios de endonucleases de restrição estão disponíveis comercialmente de diversas fontes, tais como a International Biotechnologies Inc. New Haven, CT, EUA.
[00197] Um método desejável de modificar o DNA que codifica o polipeptídeo da invenção emprega a reação em cadeia de polimerase, conforme descrita por Saiki RK, et al. (Saiki et al., 1988). Esse método pode ser usado introduzindo-se DNA em um vetor apropriado, por exemplo, mediante engenharia de sítios de restrição apropriados, ou pode-se usá-lo para modificar o DNA de outras formas úteis, como é conhecido na técnica. Se forem usados vetores virais, são preferidos os vetores de varíola ou adenovírus.
[00198] O DNA (ou RNA, no caso de vetores retrovirais) pode então ser expresso em um hospedeiro apropriado para produzir um polipeptídeo que compreende um peptídeo da invenção ou variante do mesmo. Portanto, o DNA que codifica o peptídeo da invenção ou variante do mesmo pode ser usado de acordo com técnicas conhecidas e modificado apropriadamente conforme os ensinamentos aqui apresentados para construir um vetor de expressão, que é então utilizado para transformar uma célula hospedeira apropriada e produzir o polipeptídeo da invenção. Tais técnicas incluem as divulgadas nas, por exemplo, em US 4.440.859, 4.530.901, 4.582.800, 4.677.063, 4.678.751, 4.704.362, 4.710.463, 4.757.006, 4.766.075 e 4.810.648.
[00199] O DNA (ou, no caso de vetores retrovirais, RNA) que codifica o polipeptídeo que constitui o composto da invenção pode ser unido a várias outras sequências de DNA para introdução em um hospedeiro apropriado. O DNA acompanhante dependerá da natureza do hospedeiro, do modo como o DNA é introduzido no hospedeiro e em se o desejado é a manutenção epissômica ou a integração.
[00200] Em geral, o DNA é inserido em um vetor de expressão como um plasmídeo na orientação correta e no "frame" de leitura correto para expressão. Se necessário, o DNA pode ser ligado às sequências de nucleotídeos de controle regulatória da transcrição e tradução reconhecidas pelo hospedeiro desejado, embora tais controles geralmente estejam disponíveis no vetor de expressão. Em seguida, o vetor é introduzido no hospedeiro por meio de técnicas padrão. Em geral, nem todos os hospedeiros serão transformados pelo vetor. Portanto, será necessário selecionar as células Transformadas do hospedeiro. Uma técnica de seleção consiste em incorporar ao vetor de expressão uma sequência de DNA, junto com os elementos de controle necessários, que codifique uma característica selecionada na célula transformada, como resistência a um antibiótico.
[00201] Como alternativa, o gene para tal característica selecionável pode estar em outro vetor, que é usado para transformar em conjunto a célula hospedeira desejada.
[00202] As células hospedeiras transformadas pelo DNA recombinante da invenção são então cultivadas por um período de tempo suficiente e sob condições apropriadas, bem conhecidas dos versados na técnica em vista dos ensinamentos aqui divulgados, para permitir a expressão do polipeptídeo, que poderá então ser recuperado.
[00203] Muitos vetores de expressão são conhecidos, incluindo bactérias (por exemplo E. coli e Bacillus subtilis), leveduras (por exemplo Saccharomyces cerevisiae), fungos filamentosos (por exemplo Aspergillus sp.), células vegetais, células animais e células de insetos. Preferivelmente, o sistema pode consistir em células mamíferas como células CHO disponibilizadas pela ATCC Cell Biology Collection.
[00204] Um vetor plasmídeo típico para expressão constitutiva em célula mamífera compreende o promotor de CMV ou SV40 com uma cauda poliA apropriada e um marcador de resistência como a neomicina. Um exemplo é o pSVL, disponibilizado pela Pharmacia, Piscataway, NJ, EUA. Um exemplo de vetor de expressão induzível para células mamíferas é o pMSG, também fornecido pela Pharmacia. O pRS403-406 e o pRS413-416 são vetores plasmídicos úteis, que são geralmente disponibilizados pela Stratagene Cloning Systems, La Jolla, CA 92037, EUA. Os plasmídeos pRS403, pRS404, pRS405 e pRS406 são plasmídeos de integração a leveduras (YIps, "Yeast Integrating plasmids") e incluem os marcadores selecionáveis de leveduras HIS3, TRP1, LEU2 e URA3. Os plasmídeos pRS413-416 são plasmídeos de centrômeros de leveduras (Ycps, "Yeast Centromere plasmids"). Os vetores à base de promotor de CMV (por exemplo os fornecidos pela Sigma-Aldrich) proporcionam expressão transitória ou estável, expressão citoplasmática ou secreção, e a marcação N-terminal ou C-terminal em várias combinações de FLAG, 3xFLAG, c-myc ou MAT. Essas proteínas de fusão permitem detectar, purificar e analisar a proteína recombinante, e as proteínas de fusão com marcação dupla aumentam a flexibilidade de detecção.
[00205] A região regulatória promotora forte do citomegalovírus humano (CMV) promove a expressão de níveis constitutivos de proteína de até 1 mg/L em células COS. Em linhagens celulares menos potentes, os níveis proteicos são geralmente ~0,1 mg/L.A presença da origem de replicação do SV40 proporciona níveis elevados de replicação de DNA em células COS que permitem a replicação de SV40. Os vetores de CMV podem conter, por exemplo, a origem pMB1 (derivada de pBR322) para permitir a replicação em células bacterianas, o gene de ß-lactamase para seleção de resistência à ampicilina em bactérias, poliA de hGH e a origem f1. Os vetores que contêm a sequência líder de preprotripsina (PPT) podem direcionar a secreção de proteínas de fusão FLAG no meio de cultura para purificação mediante o uso de anticorpos anti-FLAG, resinas e placas. Outros vetores e sistemas de expressão são bem conhecidos na técnica para emprego com diversas células hospedeiras.
[00206] Em outra configuração, dois ou mais peptídeos ou variantes de peptídeos da invenção são codificados e, portanto, expressos em ordem sucessiva, numa estrutura semelhante a "contas em um colar". Ao fazê-lo, os peptídeos ou variantes de peptídeos podem ser ligados ou fundidos por trechos de aminoácidos ligantes, como, por exemplo, LLLLLL, ou podem ser ligados um ao outro sem nenhum outro peptídeo entre eles. Essas estruturas podem ser usadas para tratamento do câncer e podem induzir respostas imunes que envolvem tanto MHC I como MHC II.
[00207] A presente invenção refere-se também a uma célula hospedeira transformada por uma estrutura de vetor polinucleotídeo da presente invenção. A célula hospedeira pode ser procariota ou eucariota. As células bacterianas, que podem ser, preferivelmente, procariotas em algumas situações e normalmente são uma cepa de E. coli como, por exemplo, as cepas de E. coli DH5 fornecidas por Bethesda Research Laboratories Inc., Bethesda, MD, EUA e RR1, fornecidas pela American Type Culture Collection (ATCC) de Rockville, MD, EUA (ATCC N°. 31343). As células eucariotas preferidas são as de levedura, inseto e mamífero, preferivelmente células de vertebrados como camundongo, rato, macaco ou linhagens celulares de fibroblastos ou cólon humano. São células hospedeiras de levedura YPH499, YPH500 e YPH501, que são geralmente disponibilizadas por Stratagene Cloning Systems, La Jolla, CA 92037, EUA. São células preferidas de hospedeiros mamíferos as de ovário de hamster chinês (CHO) fornecidas pela ATCC sob o número CCL61, células embrionárias NIH/3T3 de camundongo suíço do NIH fornecidas pela ATCC sob o número CRL 1658, células COS-1 derivadas de rim de macaco fornecidas pela ATCC sob o número CRL 1650 e células HEK-293 derivadas de rim embrionário humano. As células de inseto preferidas são as células Sf9, que podem ser transfectadas por vetores de expressão baseados em baculovírus. Uma visão geral da escolha de células hospedeiras apropriadas para expressão é apresentada, por exemplo, no livro-texto de Paulina Balbás e Argelia Lorence "Methods in Molecular Biology Recombinant Gene Expression, Reviews and Protocols", Part One, Second Edition, ISBN 978-1-58829-262-9 e em outras publicações conhecidas dos versados na técnica.
[00208] A transformação de células hospedeiras apropriadas por uma estrutura de DNA da presente invenção é realizada por métodos bem conhecidos na técnica, que normalmente dependem do tipo de vetor utilizado. Em relação à transformação de células hospedeiras procariotas, ver, for exemplo, Cohen et al. (Cohen et al., 1972) e (Green e Sambrook, 2012). A transformação de células de levedura foi descrita por Sherman et al. (Sherman et al., 1986). O método de Beggs (Beggs, 1978) também é útil. A Stratagene Cloning Systems e a Life Technologies Inc., Gaithersburg, MD 20877, EUA fornecem reagentes úteis para transfectar células de vertebrados (por exemplo fosfato de cálcio, DEAE- dextrana e formulações de lipossomos). A eletroporação também pode ser empregada para transformar e/ou transfectar células e é bem conhecida na técnica como processo para transformação de células de leveduras, células de bactérias, células de insetos e células de vertebrados.
[00209] As células cuja transformação foi bem-sucedida, isto é, células contendo uma estrutura de DNA da presente invenção, podem ser identificadas por técnicas bem conhecidas, como PCR. Alternativamente, a presença de proteínas no sobrenadante pode ser detectada usando-se anticorpos.
[00210] Perceber-se-á que algumas células hospedeiras da invenção são úteis na preparação dos peptídeos da invenção, como, por exemplo, células bacterianas, de levedura e de inseto. Entretanto, outras células hospedeiras podem ser úteis em determinados métodos terapêuticos. Por exemplo, células apresentadoras de antígenos, como as células dendríticas, podem ser utilizadas com proveito para expressar os peptídeos da invenção de forma que possam ser carregados em moléculas de MHC apropriadas. Portanto, a presente invenção fornece uma célula hospedeira que compreende um ácido nucleico ou um vetor de expressão de acordo com a invenção.
[00211] Em uma modalidade preferida, a célula hospedeira é uma célula apresentadora de antígenos, em particular uma célula dendrítica ou uma célula apresentadora de antígenos. Em 29 de abril de 2010, a Food and Drug Administration (FDA) aprovou o sipuleucel-T, que consiste em APCs carregadas com uma proteína de fusão recombinante que contém fosfatase ácida prostática (PAP), para tratamento de CPRC assintomático ou minimamente sintomático (Rini et al., 2006; Small et al., 2006).
[00212] Outro aspecto da invenção fornece um método de produção de um peptídeo ou de uma variante do mesmo, sendo que o método compreende o cultivo de uma célula hospedeira descrita e isolamento do peptídeo da célula hospedeira ou do meio de cultura da mesma.
[00213] Em outra configuração, o peptídeo, o ácido nucleico ou o vetor de expressão da invenção são usados em medicina. Por exemplo, o peptídeo ou uma variante do mesmo podem ser preparados para injeção intravenosa (i.v.), injeção subcutânea (s.c.), injeção intradérmica (i.d.), injeção intraperitoneal (i.p.) ou injeção intramuscular (i.m.). Os métodos preferidos de injeção de peptídeos são s.c., i.d., i.p., i.m. e i.v. Os métodos preferidos de injeção de DNA são i.d., i.m., s.c., i.p. e i.v. Doses de, por exemplo, 50 µg a 1,5 mg e, preferivelmente 125 µg a 500 µg de peptídeo ou DNA, podem ser administradas, dependendo do peptídeo ou do DNA em questão. O uso de doses nesse intervalo já foi bem- sucedido em ensaios clínicos (Walter et al., 2012).
[00214] O polinucleotídeo usado para vacinação ativa pode ser basicamente puro ou contido em um sistema apropriado de vetor ou de transporte. Os ácidos nucleicos podem ser DNA, cDNA, PNA, RNA ou uma combinação dos mesmos. Os métodos usados para projetar e introduzir tais ácidos nucleicos são bem conhecidos na técnica. Uma visão geral é apresentada em, por exemplo, Teufel et al. (Teufel et al., 2005). Vacinas de polinucleotídeos são fáceis de preparar, mas o modo de ação pelo qual esses vetores induzem uma resposta imune não é totalmente compreendido. Os vetores e sistemas de administração apropriados utilizam DNA e/ou RNA viral, tais como sistemas baseados em adenovírus, vírus da vaccínia, retrovírus, herpesvírus, vírus associados à adenovírus ou híbridos contendo elementos de mais de um vírus. Alguns sistemas não virais consistem em lipídios catiônicos e polímeros catiônicos, que são bem conhecidos na técnica de administração de DNA. A administração física por dispositivos como o "gene gun" (canhão gênico) também pode ser empregada. O(s) peptídeo(s) codificado(s) pelos ácidos nucleicos pode(m) ser uma proteína de fusão, por exemplo, com um epítopo que estimula as células T do respectivo CDR oposto, conforme descrito anteriormente.
[00215] O medicamento da invenção também pode incluir um ou mais adjuvantes. Os adjuvantes são substâncias que promovem ou potencializam de maneira inespecífica a resposta imune (por exemplo a resposta imune mediada por células T CD8-positivas e células T auxiliares (TH)) contra um antígeno e que, portanto, seriam consideras úteis no medicamento da presente invenção. Alguns adjuvantes apropriados são, entre outros, 1018 ISS, sais de alumínio, AMPLIVAX®, AS15, BCG, CP-870.893, CpG7909, CyaA, dSLIM, flagelina ou ligantes TLR5 derivados da flagelina, ligante FLT3, GM-CSF, IC30, IC31, Imiquimod (ALDARA®), resiquimod, ImuFact IMP321, interleucinas como IL-2, IL-13, IL-21, interferon alfa ou beta ou derivados peguilados dos mesmos, IS Patch, ISS, ISCOMATRIX, ISCOMs, JuvImmune®, LipoVac, MALP2, MF59, monofosforil lipídio A, Montanide IMS 1312, Montanide ISA 206, Montanide ISA 50V, Montanide ISA-51, emulsões de água- em-óleo ou óleo-em-água, OK-432, OM-174, OM-197-MP-EC, ONTAK, OspA, sistema de vetor PepTel®, micropartículas à base de poli(lactídeo coglicolídeo) [PLG] e dextrana, talactoferrina, SRL172, virossomas e outras partículas semelhantes a vírus, YF-17D, armadilha de VEGF, R848, beta-glicana, Pam3Cys, estimulon QS21 de Áquila (derivado da saponina), extratos micobacterianos e simuladores da parede celular bacteriana e outros adjuvantes exclusivos como Ribi's Detox, Quil ou Superfos. São preferidos adjuvantes como o de Freund ou GM-CSF. Vários adjuvantes imunológicos (por exemplo MF59) específicos para células dendríticas e suas preparações já foram descritos anteriormente (Allison e Krummel, 1995). Citocinas também podem ser usadas. Várias citocinas (por exemplo TNF-) foram associadas diretamente à influência sobre a migração de células dendríticas para tecidos linfoides, acelerando a maturação de células dendríticas de modo a formar células apresentadoras de antígenos que interagem de forma eficiente com linfócitos T (por exemplo GM-CSF, IL-1 e IL-4) (Pat. EUA N°. 5.849.589, que fica específica e integralmente incorporada por referência) e que possuam atividade imunoadjuvante (por exemplo IL-12, IL-15, IL-23, IL-7, IFN- alfa e IFN-beta) (Gabrilovich et al., 1996).
[00216] Descreveu-se também que os oligonucleotídeos CpG imunoestimulatórios podem potencializar os efeitos dos adjuvantes em situações vacinais. Sem restringir-se a nenhuma teoria, os oligonucleotídeos CpG agem ativando o sistema imune inato (não adaptativo) por meio de receptores do tipo Toll (TLR, "Toll-like receptors"), especialmente o TLR9. A ativação de TLR9 desencadeada pelo CpG promove respostas humorais e celulares específicas contra diversos antígenos, incluindo antígenos peptídicos ou proteicos, vírus vivos ou mortos, vacinas de células dendríticas, vacinas celulares autólogas e conjugados de polissacarídeos, em vacinas tanto profiláticas como terapêuticas. Ainda mais importante, o CpG promove a maturação e diferenciação de células dendríticas, produzindo ativação de células TH1 e forte geração de linfócitos T citotóxicos (LTC), mesmo na ausência de auxílio por células T CD4. O viés para TH1 induzido pela estimulação por TLR9 se mantém mesmo na presença de adjuvantes vacinais como o alúmen ou o adjuvante incompleto de Freund (AIF), que normalmente promovem um viés para TH2. Os oligonucleotídeos CpG apresentam atividade adjuvante ainda mais acentuada quando formulados ou coadministrados com outros adjuvantes ou em formulações como micropartículas, nanopartículas, emulsões lipídicas ou formulações semelhantes, que são especialmente necessárias para induzir uma resposta acentuada a antígenos relativamente fracos. Eles também aceleram a resposta imune, permitindo reduzir as doses de antígenos em cerca de duas ordens de grandeza e obter uma resposta de anticorpos comparável à obtida com a dose plena da vacina sem CpG em alguns experimentos (Krieg, 2006). A patente US 6.406.705 B1 descreve a utilização combinada dos oligonucleotídeos CpG, adjuvantes que não consistem em ácidos nucleicos e um antígeno para induzir uma resposta imune antígeno-específica. Um antagonista de CpG TLR9 é o dSLIM ("double Stem Loop Immunomodulator"), produzido pela Mologen (Berlim, Alemanha), que é o componente preferido para a composição farmacêutica da presente invenção. Outras moléculas ligantes de TLR como o TLR 7, TLR 8 e/ou TLR 9 ligantes de RNA também podem ser utilizadas.
[00217] Outros exemplos de adjuvantes úteis são, entre outros, CpGs modificados quimicamente (por exemplo CpR, Idera), análogos de dsRNA como o Poli(I:C) e derivados do mesmo (por exemplo AmpliGen®, Hiltonol®, poli-(ICLC), poli(IC-R), poli(I:C12U), DNA ou RNA bacteriano sem CpG e moléculas pequenas ou anticorpos com atividade imunológica como a ciclofosfamida, sunitinibe, bevacizumabe®, Celebrex, NCX-4016, sildenafila, tadalafila, vardenafila, sorafenibe, temozolomida, temsirolimus, XL-999, CP-547632, pazopanibe, armadilha de VEGF, ZD2171, AZD2171 e anti-CTLA4, outros anticorpos contra estruturas-chave do sistema imune (por exemplo anti-CD40, anti-TGF-beta e antirreceptor de TNF-a) e SC58175, que podem exercer ação terapêutica e/ou como adjuvantes. As quantidades e concentrações de adjuvantes e aditivos úteis no contexto da presente invenção podem ser determinadas facilmente e sem experimentação excessiva por indivíduos praticantes da técnica.
[00218] São adjuvantes preferidos o anti-CD40, imiquimod, resiquimod, GM-CSF, ciclofosfamida, sunitinibe, bevacizumabe, interferon-a, oligonucleotídeos CpG e derivados, poli-(I:C) e derivados, RNA, sildenafila e formações particuladas com PLG ou virossomos.
[00219] Em uma modalidade preferida da composição farmacêutica de acordo com a invenção, o adjuvante é selecionado de um grupo formado por fatores estimuladores de colônias como o fator estimulador de colônias de granulócitos e macrófagos (GM-CSF, sargramostina), ciclofosfamida, imiquimod, resiquimod e interferon-a.
[00220] Em uma modalidade preferida da composição farmacêutica de acordo com a invenção, o adjuvante é selecionado de um grupo formado por fatores estimuladores de colônias como o fator estimulador de colônias de granulócitos e macrófagos (GM-CSF, sargramostim), ciclofosfamida, imiquimod e resiquimod. Em uma modalidade preferida da composição farmacêutica de acordo com a invenção, o adjuvante é a ciclofosfamida, o imiquimod ou o resiquimod. São adjuvantes ainda mais preferidos o Montanide IMS 1312, Montanide ISA 206, Montanide ISA 50V, Montanide ISA-51, poli-ICLC (Hiltonol®) e anticorpos monoclonais anti-CD40 ou combinações dos mesmos.
[00221] Esta composição é usada para administração parenteral, como por via subcutânea, intradérmica, intramuscular, ou por administração oral. Para esse fim, os peptídeos e, opcionalmente, outras moléculas, são dissolvidos ou suspensos em um veículo farmaceuticamente aceitável, preferivelmente um veículo aquoso. A composição também pode conter excipientes como tampões, agentes de ligação, agentes abrasivos, diluentes, flavorizantes, lubrificantes, etc. Os peptídeos também podem ser administrados conjuntamente com substâncias estimuladoras do sistema imune, como as citocinas. Uma ampla lista de excipientes que podem ser empregados em tais composições pode ser encontrada em, por exemplo, A. Kibbe, Handbook of Pharmaceutical Excipients, (Kibbe, 2000). A composição pode ser usada para prevenção, profilaxia e/ou tratamento de doenças adenomatosas ou cancerosas.
[00222] Podem-se encontrar formulações exemplares em, por exemplo, EP2112253.
[00223] Cabe ressaltar que a resposta imune produzida pela vacina de acordo com a invenção ataca o câncer em diferentes estágios celulares e em vários estágios de desenvolvimento. Além disso, outras vias de sinalização associadas com o câncer também são atacadas. Isso constitui uma vantagem em relação às vacinas que agem apenas sobre um ou poucos alvos, pois o tumor pode se adaptar a esse tipo de ataque (escape tumoral) e nem todos os tumores expressam o mesmo padrão de antígenos. Por isso, uma combinação de vários peptídeos associados a tumores garante que todos os tumores apresentarão pelo menos alguns dos alvos. A composição foi projetada para tumores que expressem vários dos antígenos e age sobre diversas vias independentes necessárias para o crescimento e a manutenção do tumor. Portanto, a vacina pode ser usada sem individualização em uma população maior de pacientes. Isso significa que os pacientes a serem tratados com a vacina podem ser selecionados apenas por tipagem de HLA e não requerem análise de outros biomarcadores de expressão antigênica. Mesmo assim, a resposta imune induzida ataca vários alvos ao mesmo tempo, o que é importante para a eficácia (Banchereau et al., 2001; Walter et al., 2012).
[00224] Conforme aqui utilizado, o termo "scaffold" (arcabouço) designa uma molécula que se liga especificamente a um determinante (por exemplo antigênico). Em uma configuração, o arcabouço é capaz de direcionar a entidade à qual está vinculado (por exemplo um (segundo) grupamento ligante de antígeno) a um sítio alvo como, por exemplo, um tipo específico de célula tumoral ou estroma tumoral que apresenta um determinante antigênico (por exemplo um complexo de peptídeo com MHC de acordo com a aplicação ora contemplada). Em outra configuração, o arcabouço é capaz de ativar a sinalização por meio de seu antígeno alvo, que pode ser, por exemplo, um antígeno de um complexo receptor de células T. Os arcabouços incluem, entre outros, anticorpos e fragmentos dos mesmos, domínios ligantes de antígenos em um anticorpo, que compreendem uma região de cadeia pesada do anticorpo e uma região de cadeia leve do anticorpo, proteínas ligantes que compreendem pelo menos um motivo repetitivo de anquirina e molécula ligantes de antígenos de domínio único (SDAB), aptâmeros, TCRs (solúveis) e células (modificadas) como, por exemplo células T alogênicas ou autólogas. Para avaliar se uma molécula funciona como arcabouço e se liga a um alvo, podem ser realizados ensaios de ligação.
[00225] Uma ligação "específica" significa que o arcabouço se liga ao complexo peptídeo-MHC relevante melhor que a outros complexos peptídeo- MHC, de modo que um arcabouço dotado de uma molécula ativa capaz de matar uma célula portadora de um alvo específico não seja capaz de destruir outra célula que não possui o alvo específico mas apresenta outros complexos de peptídeo- MHC. A ligação a outros complexos peptídeo-MHC é irrelevante quando o peptídeo do complexo peptídeo- MHC que produz reação cruzada não ocorre naturalmente, isto é, não é derivado do peptidoma do HLA humano. Os ensaios de avaliação da morte de células alvo são bem conhecidos na técnica e devem ser realizados usando células-alvo (células primárias ou linhagens celulares) nas quais o complexo peptídeo-MHC seja apresentado inalterado ou células carregadas com peptídeos de modo que se atinjam os níveis observados naturalmente de complexos peptídeo- MHC.
[00226] Um arcabouço pode incluir uma marcação que permite detectá- lo por meio da determinação da presença ou não do sinal fornecido pelo marcador. Por exemplo, o arcabouço pode ser marcado por um corante fluorescente ou qualquer outra molécula marcadora celular pertinente. Tais moléculas marcadoras são bem conhecidas na técnica. Por exemplo, a marcação fluorescente proporcionada, por exemplo, por um corante fluorescente, pode permitir a visualização do aptâmero ligado por meio de microscopia de fluorescência ou de varredura a laser ou detecção por citometria de fluxo.
[00227] Os arcabouços podem ser conjugados com uma segunda molécula ativa como, por exemplo, IL-21, anti-CD3, anti-CD28.
[00228] Para mais informações sobre arcabouços polipeptídicos, ver, por exemplo, a seção geral de WO 2014/071978A1 e as referências nela citadas.
[00229] A presente invenção refere-se também a aptâmeros. Os aptâmeros (ver, por exemplo, WO 2014/191359 e a literatura nela citada) são moléculas curtas de ácido nucleico de fita única, que podem se dobrar formando estruturas tridimensionais e reconhecer estruturas-alvo específicas. Eles parecem ser opções apropriadas para o desenvolvimento de terapias direcionadas. Os aptâmeros se mostraram capazes de se ligar seletivamente e com alta afinidade e especificidade a diversos alvos complexos.
[00230] Na última década, foram identificados aptâmeros que reconhecem moléculas da superfície celular e proporcionam meios para o desenvolvimento de abordagens diagnósticas e terapêuticas. Como são praticamente atóxicos e não imunogênicos, os aptâmeros são candidatos promissores para aplicações biomédicas. Com efeito, aptâmeros como aqueles que reconhecem o antígeno prostático específico na membrana celular foram empregados com sucesso como terapias direcionadas e demonstraram sua funcionalidade em modelos de xenoenxerto in vivo. Também foram identificados aptâmeros que reconhecem linhagens específicas de células Tumorais.
[00231] Podem-se selecionar aptâmeros de DNA que revelem propriedades de reconhecimento de amplo espectro para várias células oncológicas, sobretudo aquelas derivadas de tumores sólidos, e que não reconheçam células não-tumorigênicas nem células saudáveis primárias. Se os aptâmeros identificados, em vez de reconhecer um subtipo tumoral específico, interagissem com diversos tumores, isso os tornaria úteis para o diagnóstico e tratamento dito de amplo espectro.
[00232] Além disso, pesquisas sobre o comportamento da ligação celular, realizadas por citometria de fluxo, mostraram que os aptâmeros apresentaram excelentes afinidades aparentes na faixa de nanomoles.
[00233] Os aptâmeros podem ter aplicações diagnósticas e terapêuticas. Também foi demonstrado que alguns aptâmeros são captados por células Tumorais e, portanto, podem funcionar como veículos moleculares para administração dirigida de agentes anticâncer (por exemplo siRNA) a células Tumorais.
[00234] Podem-se selecionar aptâmeros contra alvos complexos como células e tecidos e complexos de peptídeos que compreendem ou, preferivelmente, que consistem em uma sequência de acordo com SEQ ID N°: 1 a SEQ ID N°: 549 da invenção ora em pauta com a molécula de MHC empregando a técnica de seleção cell-SELEX (Systematic Evolution of Ligands by Exponential Enrichment).
[00235] Os peptídeos da presente invenção podem ser empregados para gerar e desenvolver anticorpos específicos contra complexos MHC-peptídeo, que podem ser usados para tratamentos nos quais toxinas ou substâncias radioativas são guiadas até o tecido patológico. Outra aplicação desses anticorpos é guiar radionuclídeos ao tecido patológico para exames de imagem como o PET. Esta aplicação pode ajudar a detectar metástases pequenas ou determinar o tamanho e a localização exata dos tecidos patológicos.
[00236] Portanto, constitui outro aspecto da invenção o fornecimento de um método de produção de um anticorpo recombinante que se ligue especificamente a um complexo principal de histocompatibilidade (MHC) humano classe I ou II que forme um complexo com um antígeno restrito por HLA, sendo que o método compreende imunizar um mamífero não-humano submetido à engenharia genética com células que expressam o referido complexo principal de histocompatibilidade (MHC) humano classe I ou II com uma forma solúvel de uma molécula de MHC classe I ou II que forme complexo com o referido antígeno restrito por HLA; isolar moléculas de mRNA de células produtoras de anticorpo do referido mamífero não-humano; produzir uma biblioteca de exposição em fagos que exiba as moléculas de proteína codificadas pelas referidas moléculas de mRNA; e isolar ao menos um fago da referida biblioteca de exposição em fagos, sendo que o pelo menos um fago referido expõe o referido anticorpo e se liga especificamente ao referido complexo principal de histocompatibilidade (MHC) humano classe I ou II em complexo com o referido antígeno restrito por HLA.
[00237] Constitui outro aspecto da presente invenção o fornecimento de um anticorpo que se ligue especificamente a um complexo principal de histocompatibilidade (MHC) humano classe I ou II em complexo com um antígeno restrito por HLA, no qual o anticorpo é preferivelmente um anticorpo policlonal, um anticorpo monoclonal, um anticorpo biespecífico ou um anticorpo quimérico.
[00238] Os respectivos métodos usados para produzir tais anticorpos e complexos principais de histocompatibilidade classe I de cadeia única, assim como outras ferramentas empregadas para produzir tais anticorpos, são divulgados em WO 03/068201, WO 2004/084798, WO 01/72768, WO 03/070752 e em publicações (Cohen et al., 2003a; Cohen et al., 2003b; Denkberg et al., 2003) que, para as finalidades da presente invenção, ficam aqui integralmente incorporadas por referência.
[00239] Preferivelmente, o anticorpo se liga ao complexo com afinidade inferior a 20 nanomolares, e preferivelmente inferior a 10 nanomolares, o que é considerado "específico" no contexto da presente invenção.
[00240] A presente invenção refere-se a um peptídeo que compreende uma sequência de aminoácidos selecionada do grupo formado por SEQ ID N°: 1 a SEQ ID N°: 549 ou a uma variante dos mesmos com pelo menos 88% de homologia (preferivelmente idêntico) com SEQ ID N°: 1 a SEQ ID N°: 549 ou uma variante da mesma que induz reação cruzada de células T com o referido peptídeo, sendo que o referido peptídeo não é o peptídeo completo subjacente.
[00241] A presente invenção refere-se ainda a um peptídeo que compreende uma sequência selecionada do grupo formado por SEQ ID N°: 1 a SEQ ID N°: 549 ou uma variante das mesmas que seja pelo menos 88% homóloga (preferivelmente idêntico) à SEQ ID N°: 1 a SEQ ID N°: 549, sendo que cada um dos peptídeos referidos ou variantes possui comprimento total de 8 a 100, preferivelmente de 8 a 30 e, mais preferivelmente que todos, de 8 a 14 aminoácidos.
[00242] A presente invenção refere-se também aos peptídeos de acordo com a invenção que possuem a capacidade de se ligarem a uma molécula do complexo principal de histocompatibilidade (MHC) humano classe I ou II.
[00243] A presente invenção refere-se também aos peptídeos de acordo com a presente invenção, nos quais o referido peptídeo consiste ou consiste essencialmente em uma sequência de aminoácidos de acordo com SEQ ID N°: 1 a SEQ ID N°: 549.
[00244] A presente invenção refere-se também aos peptídeos de acordo com a invenção, sendo que o peptídeo é modificado quimicamente e/ou inclui ligações não-peptídicas.
[00245] A presente invenção refere-se também aos peptídeos de acordo com a invenção, nos quais o peptídeo constitui parte de uma proteína de fusão, compreendendo em particular aminoácidos N-terminais da cadeia invariante associada ao antígeno do HLA-DR (Ii), ou nos quais o peptídeo é fundido a (ou incorporado à sequência de) um anticorpo, tal como, por exemplo, um anticorpo específico para células dendríticas.
[00246] Outra configuração da presente invenção refere-se a um peptídeo que não ocorre naturalmente, sendo que o referido peptídeo consiste essencialmente em uma sequência de aminoácidos de acordo com SEQ ID N°: 1 a SEQ ID N°: 48 e foi produzido sinteticamente (por exemplo sintetizado) na forma de um sal farmaceuticamente aceitável.
[00247] Os métodos de produção sintética de peptídeos são bem conhecidos na técnica.
[00248] Os sais dos peptídeos de acordo com a presente invenção diferem substancialmente dos peptídeos em seu estado in vivo, pois esses peptídeos não se apresentam como sais in vivo. O peptídeo em forma de sal não- natural medeia a solubilidade do peptídeo, sobretudo no âmbito de composições farmacêuticas que compreendem os peptídeos (por exemplo as vacinas peptídicas aqui divulgadas). Para fornecer eficientemente os peptídeos ao indivíduo a ser tratado, requer-se uma solubilidade suficiente e pelo menos substancial do(s) peptídeos(s). Preferivelmente, os sais são sais farmaceuticamente aceitáveis dos peptídeos. Esses sais de acordo com a invenção incluem sais de metais alcalinos e alcalino-terrosos, tais como os sais de Hofmeister compreendendo os ânions PO43-, SO42-, CH3COO-, Cl-, Br-, NO3-, ClO4-, I-, SCN- e, como cátions NH4+, Rb+, K+, Na+, Cs+, Li+, Zn2+, Mg2+, Ca2+, Mn2+, Cu2+ and Ba2+. São selecionados sais específicos de (NH4)3PO4, (NH4)2HPO4, (NH4)H2PO4, (NH4)2SO4, NH4CH3COO, NH4Cl, NH4Br, NH4NO3, NH4CIO4, NH4I, NH4SCN, Rb3PO4, Rb2HPO4, RbH2PO4, Rb2SO4, Rb4CH3COO, Rb4Cl, Rb4Br, Rb4NO3, Rb4CIO4, Rb4I, Rb4SCN, K3PO4, K2HPO4, KH2PO4, K2SO4, KCH3COO, KCl, KBr, KNO3, KClO4, KI, KSCN, Na3PO4, Na2HPO4, NaH2PO4, Na2SO4, NaCH3COO, NaCl, NaBr, NaNO3, NaCIO4, NaI, NaSCN, ZnCI2 Cs3PO4, Cs2HPO4, CsH2PO4, Cs2SO4, CsCH3COO, CsCl, CsBr, CsNO3, CsCIO4, CsI, CsSCN, Li3PO4, Li2HPO4, LiH2PO4, Li2SO4, LiCH3COO, LiCl, LiBr, LiNO3, LiClO4, LiI, LiSCN, Cu2SO4, Mg3(PO4)2, Mg2HPO4, Mg(H2PO4)2, Mg2SO4, Mg(CH3COO)2, MgCl2, MgBr2, Mg(NO3)2, Mg(ClO4)2, MgI2, Mg(SCN)2, MnCl2, Ca3(PO4), Ca2HPO4, Ca(H2PO4)2, CaSO4, Ca(CH3COO)2, CaCl2, CaBr2, Ca(NO3)2, Ca(ClO4)2, CaI2, Ca(SCN)2, Ba3(PO4)2, Ba2HPO4, Ba(H2PO4)2, BaSO4, Ba(CH3COO)2, BaCl2, BaBr2, Ba(NO3)2, Ba(ClO4)2, BaI2, and Ba(SCN)2. São particularmente preferidos o NH acetato, MgCl2, KH2PO4, Na2SO4, KCl, NaCl e CaCl2, tais como, por exemplo, sais cloreto ou acetato (trifluoroacetato).
[00249] Geralmente, os peptídeos e variantes (pelo menos aquelas que contêm ligações peptídicas entre resíduos de aminoácidos) podem ser sintetizadas pelo método Fmoc-poliamida ou por síntese de peptídeos em fase sólida, conforme divulgado por Lukas et al. e nas respectivas referências. O grupamento 9-fluorenilmetiloxicarbonil (Fmoc) protege temporariamente o grupamento N-amino. A clivagem repetitiva do grupo protetor altamente base- lábil é efetuada usando-se 20% piperidina em N, N-dimetilformamida. Os grupamentos em cadeias laterais podem ser protegidos mediante formação dos respectivos éteres butílicos (para treonina e tirosina), ésteres butílicos (para ácido glutâmico e ácido aspártico), derivados butiloxicarbonila (para lisina e histidina), derivados tritila (para cisteína) e derivados 4-metoxi-2,3,6- trimetilbenzenossulfonil (para arginina). Se houver resíduos C-terminais de glutamina ou asparagina, o grupamento 4,4'-dimetoxibenzidrila é usado para proteger os grupamentos amido das cadeias laterais. O suporte de fase sólida é baseado em um polímero de polidimetil-acrilamida constituído a partir de três monômeros: dimetilacrilamida (monômero da cadeia básica), bisacriloiletileno diamina (ligante cruzado) e acriloilsarcosina metil éster (agente funcionalizante). O agente clivável da ligação peptídeo-resina empregado é um derivado ácido- lábil do ácido 4-hidroximetil-fenoxiacético. Todos os derivados de aminoácidos são adicionados na forma de anidridos simétricos pré-formados, com exceção de asparagina e glutamina, que são adicionadas por um procedimento de acoplamento reverso mediado por N, N-dicicloexilcarbodi-imida e 1- hidroxibenzotriazol. Todas as reações de acoplamento e desproteção são monitoradas por procedimentos de teste com ninhidrina, ácido trinitrobenzenossulfônico ou isotina.
[00250] Ao final da síntese, os peptídeos são clivados da resina de suporte e, ao mesmo tempo, os grupamentos protetores das cadeias laterais são removidos por tratamento com ácido trifluoracético a 95% contendo uma mistura de 50% de captantes. Alguns captantes comumente utilizados são etanoditiol, fenol, anisol e água, e a escolha exata depende dos aminoácidos constituintes do peptídeo que está sendo sintetizado. Também é possível combinar metodologias de fase sólida e fase em solução para sintetizar peptídeos (ver, por exemplo, e referências por ele citadas).
[00251] O ácido trifluoracético é removido por evaporação a vácuo seguida de trituração com éter dietílico para produzir o peptídeo bruto. Quaisquer captantes que ainda estiverem presentes serão retirados por um procedimento de extração simples, no qual a liofilização da fase aquosa produz o peptídeo bruto livre de captantes. Os reagentes para síntese de peptídeos são geralmente fornecidos por, por exemplo, Calbiochem-Novabiochem (Nottingham, Reino Unido).
[00252] A purificação pode ser realizada por qualquer uma ou por uma combinação de técnicas como recristalização, cromatografia de exclusão por tamanho, cromatografia de troca iônica, cromatografia de interação hidrofóbica e (geralmente) cromatografia líquida de alto desempenho de fase reversa empregando, por exemplo, um gradiente de separação de acetonitrilo e água.
[00253] A presente invenção refere-se também a um ácido nucleico que codifica os peptídeos de acordo com a invenção, conquanto tal peptídeo não seja uma proteína humana completa (total).
[00254] A presente invenção refere-se também ao ácido nucleico de acordo com a invenção que consista em DNA, cDNA, PNA, RNA ou combinações dos mesmos.
[00255] A presente invenção refere-se também a um vetor de expressão capaz de expressar um ácido nucleico de acordo com a presente invenção.
[00256] A presente invenção refere-se também a um peptídeo de acordo com a presente invenção, a um ácido nucleico de acordo com a presente invenção ou a um vetor de expressão de acordo com a presente invenção para emprego em medicina, em especial para o tratamento de câncer de ovário.
[00257] A presente invenção refere-se também a uma célula hospedeira que compreende um ácido nucleico de acordo com a invenção ou um vetor de expressão de acordo com a invenção.
[00258] A presente invenção refere-se também a células hospedeiras de acordo com a presente invenção, que sejam células apresentadoras de antígenos e, preferivelmente, células dendríticas.
[00259] A presente invenção refere-se também a um método de produção de um peptídeo de acordo com a presente invenção, sendo que o referido método compreende o cultivo da célula hospedeira de acordo com a presente invenção e o isolamento do peptídeo da referida célula hospedeira ou do meio de cultura da mesma.
[00260] A presente invenção refere-se também ao método de acordo com a presente invenção, sendo que o referido antígeno é carregado em moléculas de MHC classe I ou II expressas na superfície de uma célula apresentadora de antígenos apropriada colocando-se uma quantidade suficiente do antígeno em contato com uma célula apresentadora de antígenos.
[00261] A presente invenção refere-se também ao método de acordo com a presente invenção, sendo que a célula apresentadora de antígenos compreende um vetor de expressão capaz de expressar o referido peptídeo contendo SEQ ID N°: 1 a SEQ ID N°: 549 ou a referida sequência variante de aminoácidos.
[00262] A presente invenção relaciona-se também com células T ativadas produzidas de acordo com o método da presente invenção, sendo que as referidas células T reconhecem seletivamente células com expressão aberrante de um polipeptídeo que compreende uma sequência de aminoácidos de acordo com a presente invenção.
[00263] A presente invenção refere-se também a um método para destruir células-alvo em um paciente no qual as células-alvo expressam aberrantemente um polipeptídeo que compreende qualquer sequência de aminoácidos de acordo com a presente invenção, sendo que o método compreende a administração ao paciente de um número eficaz de células T ativadas de acordo com a presente invenção.
[00264] A presente invenção refere-se também à utilização de qualquer um dos peptídeos descritos, de um ácido nucleico de acordo com a presente invenção, de um vetor de expressão de acordo com a presente invenção, de uma célula de acordo com a presente invenção ou de um linfócito T citotóxico ativado de acordo com a presente invenção como medicamento ou para fabricação de um medicamento. A presente invenção refere-se também a uma utilização de acordo com a presente invenção, onde o medicamento possui atividade anticâncer.
[00265] A presente invenção refere-se também a uma utilização de acordo com a invenção, na qual o medicamento é uma vacina. A presente invenção refere-se também a uma utilização de acordo com a invenção, onde o medicamento possui atividade anticâncer.
[00266] A presente invenção refere-se também ao emprego de acordo com a invenção, no qual as referidas células de câncer são células de câncer de ovário ou de outros tumores sólidos ou hematológicos como, por exemplo, câncer de pâncreas, câncer cerebral, câncer de rim, câncer colorretal ou leucemia.
[00267] A presente invenção refere-se também a proteínas marcadoras específicas e a biomarcadores baseados em peptídeos de acordo com a presente invenção, aqui denominados "alvos", que podem ser usados para diagnóstico e/ou determinação do prognóstico de câncer de ovário. A presente invenção refere-se também ao uso desses novos agentes para tratamento do câncer.
[00268] O termo "anticorpo" ou "anticorpos" é aqui utilizado em sentido amplo e inclui tanto anticorpos policlonais como monoclonais. Além de moléculas intactas ou "completas" de imunoglobulina, o termo "anticorpos" também inclui fragmentos (por exemplo fragmentos CDRs, Fv, Fab e Fc) ou polímeros dessas imunoglobulinas e versões humanizadas de moléculas de imunoglobulinas, conquanto apresentem qualquer uma das propriedades desejadas (por exemplo ligação específica a um polipeptídeo marcador de câncer de ovário, carreamento de uma toxina para uma célula de câncer de ovário que expressa um gene marcador de câncer em nível mais elevado e/ou inibição da atividade de um polipeptídeo marcador de câncer de ovário) de acordo com a invenção.
[00269] Sempre que possível, os anticorpos da invenção podem ser adquiridos de fontes comerciais. Os anticorpos da invenção também podem ser gerados usando-se métodos bem conhecidos. Os versados na técnica perceberão que peptídeos completos e polipeptídeos marcadores de câncer de ovário ou fragmentos dos mesmos podem ser empregados para gerar os anticorpos da invenção. Um polipeptídeo para uso na geração de um anticorpo da invenção pode ser total ou parcialmente purificado a partir de uma fonte natural ou pode ser produzido usando-se técnicas de DNA recombinante.
[00270] Por exemplo, um cDNA que codifica um peptídeo de acordo com a presente invenção (por exemplo um peptídeo de acordo com os polipeptídeos em SEQ ID N°: 1 a SEQ ID N°: 549) ou uma variante ou fragmento do mesmo pode ser expresso em células procariotas (por exemplo bactérias) ou em células eucariotas (por exemplo células de levedura, inseto ou mamífero). Em seguida, pode-se purificar a proteína recombinante e usá-la para gerar um preparado de anticorpos mono ou policlonais que se ligam especificamente ao peptídeo marcador de câncer de ovário usado para gerar o anticorpo de acordo com a invenção.
[00271] Os versados na técnica perceberão que a geração de dois ou mais conjuntos diferentes de anticorpos monoclonais ou policlonais maximiza a possibilidade de obter um anticorpo com a especificidade e a afinidade necessárias para o uso pretendido (por exemplo ELISA, imunohistoquímica, imagem in vivo, imunoterapia com toxinas). Os anticorpos foram testados para avaliar se possuíam a atividade desejada usando-se métodos conhecidos de acordo com o propósito para o qual os anticorpos serão empregados (por exemplo ELISA, imunohistoquímica, imunoterapia, etc.; para mais informações sobre a geração e teste de anticorpos, consulte, por exemplo, Greenfield, 2014 (Greenfield, 2014)). Por exemplo, os anticorpos podem ser testados em ensaios ELISA, Western Blot ou coloração imunohistoquímica de cânceres de pulmão fixados em formalina ou cortes de tecido congelado. Após serem caracterizados inicialmente in vitro, os anticorpos destinados a emprego terapêutico ou diagnóstico in vivo são testados de acordo com métodos de ensaio clínico bem conhecidos.
[00272] Conforme aqui utilizado, o termo "anticorpo monoclonal" refere-se a um anticorpo obtido de uma população substancialmente homogênea de anticorpos, isto é, os anticorpos individuais que compreendem a população são idênticos, exceto por mutações que podem ocorrer naturalmente e estar presentes em pequenas quantidades. Os anticorpos monoclonais aqui descritos incluem especificamente anticorpos "quiméricos" nos quais uma parte das cadeias leves e/ou pesadas é idêntica ou homóloga às sequências correspondentes de anticorpos derivados de uma espécie específica ou pertencentes a uma classe ou subclasse de anticorpos específicos, ao passo que o restante da(s) cadeia(s) é idêntico ou homólogo às sequências correspondentes de anticorpos derivados de outra espécie ou pertencentes a outra classe ou subclasse de anticorpos, assim como fragmentos de tais anticorpos, conquanto apresentem a atividade antagonista desejada (Pat. US 4.816.567, que fica aqui integralmente incorporada).
[00273] Os anticorpos monoclonais da invenção podem ser preparados usando métodos com hibridomas. Em um método com hibridoma, um camundongo ou outro animal hospedeiro apropriado é tipicamente imunizado com um agente imunizante para produzir linfócitos que produzam ou sejam capazes de produzir anticorpos que se ligam especificamente ao agente imunizante. Como alternativa, os linfócitos podem ser imunizados in vitro.
[00274] Os anticorpos monoclonais também podem ser produzidos por métodos de DNA recombinante, tais como os descritos em US 4.816.567. O DNA que codifica os anticorpos monoclonais da invenção pode ser prontamente isolado e sequenciado mediante procedimentos convencionais (por exemplo usando sondas de oligonucleotídeos capazes de se ligar especificamente aos genes que codificam as cadeias leves e pesadas de anticorpos murinos).
[00275] Os métodos in vitro também são apropriados para preparar anticorpos monovalentes. A digestão de anticorpos para produzir fragmentos dos mesmos, sobretudo fragmentos Fab, pode ser realizada usando-se técnicas rotineiras conhecidas na técnica. Por exemplo, a digestão pode ser realizada usando-se papaína. Alguns exemplos de digestão por papaína são descritos em WO 94/29348 e Pat. US 4.342.566. A digestão de anticorpos por papaína geralmente produz dois fragmentos idênticos ligantes de antígenos denominados fragmentos Fab, cada um dos quais com um único sítio de ligação para o antígeno e um fragmento Fc residual. O tratamento com pepsina produz um fragmento F(ab')2 e um fragmento pFc'.
[00276] Sejam ou não conectados a outras sequências, os fragmentos de anticorpos podem incluir inserções, deleções, substituições ou outras modificações selecionadas de regiões específicas ou de resíduos de aminoácidos específicos, com a condição de que a atividade do fragmento não seja significativamente alterada ou prejudicada em comparação com o anticorpo ou fragmento de anticorpo não modificado. Essas modificações podem proporcionar novas propriedades, como a retirada ou inclusão de aminoácidos capazes de formar pontes dissulfeto para aumentar a biolongevidade, alterar as caraterísticas secretórias, etc. Em qualquer caso, o fragmento de anticorpos deve possuir uma propriedade bioativa, como atividade de ligação, regulação da ligação no domínio de ligação, etc. As regiões funcionais ou ativas do anticorpo podem ser identificadas por mutagênese de uma região específica da proteína, seguida de expressão e teste do polipeptídeo expresso. Tais métodos, que serão prontamente evidentes para os versados na técnica, podem incluir mutagênese em sítios específicos do ácido nucleico codificador do fragmento de anticorpo.
[00277] Os anticorpos da invenção também podem compreender anticorpos humanizados ou anticorpos humanos. As formas humanizadas de anticorpos não-humanos (por exemplo murinos) são imunoglobulinas quiméricas, cadeias de imunoglobulina ou fragmentos das mesmas (como Fv, Fab, Fab' ou outra subsequência ligante de antígeno de um anticorpo) que contêm a sequência mínima derivada de uma imunoglobulina não-humana. Os anticorpos humanizados incluem imunoglobulinas humanas (anticorpo receptor) nas quais os resíduos de uma região determinante complementar (CDR, "complementary determining region") do receptor são substituídas por resíduos do CDR de uma espécie não-humana (anticorpo doador) como camundongo, rato ou coelho, que tenha especificidade, afinidade e capacidade desejadas. Em alguns casos, resíduos da estrutura Fv (FR) da imunoglobulina humana são substituídos por resíduos não-humanos correspondentes. Os anticorpos humanizados também podem compreender resíduos que não são encontrados nem no anticorpo recipiente nem no CDR importado ou nas sequências da estrutura. Em geral, os anticorpos humanizados compreendem basicamente ao menos um, e tipicamente dois, domínios variáveis nos quais todas ou substancialmente todas as regiões do CDR correspondem às de uma imunoglobulina não-humana e todas ou substancialmente todas as regiões FR são de uma sequência de consenso de imunoglobulina humana. Idealmente, o anticorpo humanizado compreende também ao menos parte de uma região constante de imunoglobulina (Fc), tipicamente uma região de imunoglobulina humana.
[00278] Os métodos de humanização de anticorpos não-humanos são bem conhecidos na técnica. De forma geral, um anticorpo humanizado recebe um ou mais resíduos de aminoácidos obtidos de uma fonte não-humana. Esses resíduos de aminoácidos não-humanos são frequentemente denominados resíduos "importados", pois são obtidos de um domínio variável "importado". Essencialmente, a humanização pode ser realizada usando-se CDRs ou sequências de CDR de roedores para substituir sequências correspondentes de um anticorpo humano. Portanto, tais anticorpos "humanizados" são anticorpos quiméricos (Pat. US 4.816.567) nos quais uma porção substancialmente menor que um domínio variável humano intacto foi substituída pela sequência correspondente de uma espécie não-humana. Na prática, os anticorpos humanizados são tipicamente anticorpos humanos nos quais alguns resíduos de CDR e talvez alguns resíduos de FR foram substituídos por resíduos de sítios análogos de anticorpos de roedores.
[00279] Podem ser empregados animais transgênicos (por exemplo camundongos) capazes de, quando imunizados, produzir um repertório completo de anticorpos humanos na ausência de produção de imunoglobulina endógena. Por exemplo, foi descrito que a deleção homozigota do gene na região da dobradiça da cadeia pesada dos anticorpos em camundongos quiméricos com mutação germinativa inibe completamente a produção endógena de anticorpos. Nesses camundongos com mutação germinativa, a transferência do conjunto de genes de imunoglobulina de linhagem germinativa humana leva à produção de anticorpos humanos após exposição antigênica. Também é possível produzir anticorpos humanos usando bibliotecas de exposição de fagos.
[00280] Preferivelmente, os anticorpos da invenção devem ser administrados a indivíduos em um veículo farmaceuticamente aceitável. Em geral, usa-se uma formulação contendo uma quantidade apropriada de um sal farmaceuticamente aceitável para tornar a formulação isotônica. Alguns exemplos de veículos farmaceuticamente aceitáveis são solução salina, solução de Ringer e solução de dextrose. O pH da solução é preferivelmente de cerca de 5 a cerca de 8, e mais preferivelmente de cerca de 7 a cerca de 7,5. Outros veículos possíveis são preparações de liberação prolongada como matrizes semipermeáveis de polímeros hidrofóbicos sólidos contendo o anticorpo, sendo que as matrizes possuem o formato de artigos moldados (por exemplo filmes, lipossomos ou micropartículas). Os versados na técnica perceberão que alguns veículos podem ser mais preferíveis, dependendo, por exemplo, da via de administração e da concentração do anticorpo a ser administrado.
[00281] Os anticorpos podem ser administrados ao indivíduo, paciente ou célula por injeção (por exemplo intravenosa, intraperitoneal, subcutânea ou intramuscular) ou por outros métodos, como a infusão, para garantir a introdução na circulação de forma eficaz. Os anticorpos também podem ser administrados pelas vias intra ou peritumoral para que produzam efeitos terapêuticos locais e sistêmicos. A injeção local ou intravenosa é preferida.
[00282] As doses efetivas e cronogramas de administração dos anticorpos podem ser determinados empiricamente, e a realização dessas determinações são contempladas pelas habilidades conhecidas na técnica. Os versados na técnica compreenderão que a dose de anticorpos que precisa ser administrada variará dependendo, por exemplo, do indivíduo que receberá o anticorpo, da via de administração, do tipo específico de anticorpo utilizado e de outras drogas administradas. Uma dose diária típica do anticorpo usado isoladamente pode variar de cerca de 1 µg/kg até 100 mg/kg de peso corporal por dia, dependendo dos fatores mencionados anteriormente. Após administração de um anticorpo, preferivelmente para tratamento de câncer de ovário, a eficácia do anticorpo terapêutico pode ser avaliada de várias maneiras bem conhecidas dos versados na técnica. Por exemplo, o tamanho, o número e/ou a distribuição do câncer de pulmão em um indivíduo em tratamento podem ser monitorados por técnicas padrão de imagem tumoral. Um anticorpo administrado com finalidade terapêutica que detenha o crescimento tumoral, faça o tumor encolher e/ou impeça que surjam novos tumores (em relação a como a doença evoluiria se não se administrasse o anticorpo) constitui um anticorpo eficaz para tratamento de câncer de pulmão.
[00283] Outro aspecto da invenção é o fornecimento de um método de produção de um receptor de células T solúvel (sTCR) que reconheça um complexo peptídeo-MHC específico. Esses receptores de células T solúveis podem ser gerados a partir de clones específicos de células T, e sua afinidade pode ser aumentada por mutagênese nas regiões determinantes de complementaridade. Para selecionar receptores de células T, pode-se empregar a exibição em fagos (US 2010/0113300, (Liddy et al., 2012)). Para estabilizar os receptores de células T durante a exibição em fagos e em aplicações práticas envolvendo sua utilização como droga, podem-se ligar as cadeias alfa e beta uma à outra por, por exemplo, ligações dissulfeto não-nativas, outras ligações covalentes (receptor de células T de cadeia única) ou domínios de dimerização (Boulter et al., 2003; Card et al., 2004; Willcox et al., 1999). O receptor de célula T pode ser ligado a toxinas, drogas, citocinas (ver, por exemplo, US 2013/0115191), domínios de recrutamento de células efetoras (por exemplo domínio anti-CD3), etc., para executar funções específicas em células-alvo. O receptor também poderia ser expresso em células T usadas para transferência adotiva. Para mais informações, consulte WO 2004/033685A1 e WO 2004/074322A1. Uma combinação de sTCR é descrita em WO 2012/056407A1. Outros métodos para sua produção são divulgados em WO 2013/057586A1.
[00284] Os peptídeos e/ou TCRs ou anticorpos ou outras moléculas ligantes da presente invenção podem ser usadas também para verificar o diagnóstico de câncer de um patologista a partir de uma amostra de biópsia.
[00285] Os anticorpos ou TCRs também podem ser usados para ensaios diagnósticos in vivo. Geralmente, o anticorpo é marcado com um radionucleotídeo (como 111In, 99Tc, 14C, 131I, 3H, 32P ou 35S) para que se possa localizar o tumor por imunocintilografia. Em uma configuração, anticorpos ou fragmentos dos mesmos se ligam aos domínios extracelulares de dois ou mais alvos de uma proteína selecionada do grupo formado pelas proteínas supramencionadas, e o coeficiente de afinidade (Kd) é menor que 1 x 10 µM.
[00286] Os anticorpos para uso diagnóstico podem ser marcados com sondas apropriadas para detecção por vários métodos de imagem. São métodos para detecção de sondas, entre outros, fluorescência, microscopia óptica, confocal ou eletrônica; imagem e espectroscopia de ressonância magnética; fluoroscopia; tomografia computadorizada; e tomografia por emissão de pósitrons. São sondas apropriadas, entre outras, fluoresceína, rodamina, eosina e outros fluoróforos, radioisótopos, ouro, gadolínio e outros lantanídeos, ferro paramagnético, flúor-18 e outros radionuclídeos emissores de pósitrons. As sondas também podem ser bi- ou multifuncionais e os métodos de detecção podem incluir mais de um dos métodos listados anteriormente. Esses anticorpos podem ser marcados direta ou indiretamente pelas referidas sondas. A conexão das sondas aos anticorpos requer ligação covalente da sonda, incorporação da sonda ao anticorpo e ligação covalente de um composto quelante para ligação da sonda, entre outros procedimentos bem conhecidos na técnica. Para imunohistoquímica, a amostra de tecido patológico pode ser fresca, congelada ou incluídas em parafina e fixada com um conservante como a formalina. O corte fixado ou incluído contendo a amostra é colocado em contato com um anticorpo primário marcado e com um anticorpo secundário, sendo que o anticorpo é usado para detectar a expressão de proteínas in situ.
[00287] Outro aspecto da presente invenção inclui um método in vitro de produção de células T ativadas, sendo que o método compreende colocar células T em contato in vitro com moléculas de MHC humano expressas na superfície de uma célula apresentadora de antígenos por um período suficientemente longo para ativar a célula T de forma específica para o antígeno, sendo que o antígeno é um peptídeo de acordo com a invenção. Preferivelmente, emprega-se uma quantidade de antígeno apropriada junto com uma célula apresentadora de antígeno.
[00288] Preferivelmente, as células de mamíferos não possuem ou apresentam níveis reduzidos de função do transportador de peptídeos TAP. Algumas células apropriadas, que não possuem o transportador de peptídeos TAP, são as células T2, RMA-S e células de drosófila. O TAP é o transportador associado ao processamento de antígenos.
[00289] A linhagem celular T2, que é deficiente em carregamento de peptídeos humanos, está disponível na American Type Culture Collection, 12301 Parklawn Drive, Rockville, Maryland 20852, EUA, com n° de catálogo CRL 1992; a linhagem celular de drosófila Schneider 2 está disponível na ATCC com N° de catálogo CRL 19863; a linhagem celular de camundongo RMA-S é descrita em Ljunggren et al. (Ljunggren e Karre, 1985).
[00290] Preferivelmente, antes da transfecção a célula hospedeira praticamente não expressa moléculas de MHC classe I. Também é preferível que a célula estimulatória expresse uma molécula importante para o fornecimento de um sinal coestimulatório para células T, tais como qualquer um entre B7.1, B7.2, ICAM-1 e LFA 3. As sequências de ácidos nucleicos de várias moléculas de MHC classe I e de moléculas coestimulatórias estão disponíveis publicamente nos bancos de dados GenBank e EMBL.
[00291] No caso de epítopos de MHC classe I usados como antígeno, as células T são células T CD8-positivas.
[00292] Se uma célula apresentadora de antígeno transfectada para expressar um desses epítopos, a célula deve compreender, preferivelmente, um vetor de expressão capaz de expressar um peptídeo contendo SEQ ID N°: 1 a 549 ou uma sequência de aminoácidos variante dos mesmos.
[00293] Diversos outros métodos podem ser usados para gerar células T in vitro. Por exemplo, linfócitos autólogos infiltrantes de tumores podem ser usados para geração de LTC. Plebanski et al. (Plebanski et al., 1995) utilizaram linfócitos autólogos de sangue periférico (PLBs) para preparar células T. Pode-se produzir células T citotóxicas autólogas pulsando células dendríticas com peptídeos ou polipeptídeos ou mediante infecção por um vírus recombinante. As células B também podem ser usadas para produzir células T autólogas. Macrófagos pulsados com peptídeos ou polipeptídeos ou infectados com vírus recombinantes também podem ser usados para preparar células T autólogas. S. Walter et al. (Walter et al., 2003) descreveram a preparação ("priming") in vitro de células T por meio de células apresentadoras de antígenos (aAPCs) artificiais, que também são uma maneira apropriada de gerar células T contra o peptídeo escolhido. Na presente invenção, as aAPCs foram geradas acoplando-se complexos MHC-peptídeo pré-formados à superfície de partículas de poliestireno (microesférulas) por bioquímica de biotina:estreptavidina. Esse sistema permite controlar exatamente a densidade de MHC sobre as aAPCs, permitindo induzir, de forma seletiva e altamente eficiente, respostas de células T específicas para antígenos de avidez baixa ou elevada em amostras de sangue. Além dos complexos MHC-peptídeo, as aAPCs devem transportar outras proteínas com atividade coestimulatória como anticorpos anti-CD28 acoplados à sua superfície. Além disso, tais sistemas à base de aAPC frequentemente requerem adição de fatores solúveis apropriados, como, por exemplo, citocinas como a interleucina 12.
[00294] Células alogênicas também podem ser usadas para preparar células T, e um método é descrito detalhadamente em WO 97/26328, que fica aqui incorporada por referência.
[00295] Por exemplo, além de células de Drosophila e células T2, podem- se usar outras células para apresentar antígenos, tais como células CHO, células de inseto infectadas por baculovírus, bactérias, leveduras e células-alvo infectadas por vaccínia.
[00296] Também podem ser usados vírus de plantas (ver, por exemplo, Porta et al. (Porta et al., 1994), que descreve o desenvolvimento do vírus do mosaico de caupi como um sistema de alto rendimento para apresentação de peptídeos exógenos).
[00297] As células T ativadas direcionadas contra os peptídeos da invenção possuem utilidade terapêutica. Portanto, outro aspecto da invenção fornece células T ativadas que podem ser obtidas pelos métodos da invenção apresentados anteriormente.
[00298] As células T ativadas produzidas pelo método descrito anteriormente reconhecem seletivamente células com expressão aberrante de um polipeptídeo que compreende qualquer sequência de aminoácidos do grupo SEQ ID N°: 1 a SEQ ID N°: 549.
[00299] Preferivelmente, a célula T reconhecerá a célula ao interagir através de seu TCR com o complexo HLA-peptídeo (por exemplo, ligação). As células T são úteis em um método de destruição de células-alvo em um paciente cujas células-alvo apresentem expressão aberrante de um polipeptídeo que compreenda uma sequência de aminoácidos da invenção, sendo que o paciente recebe um número eficaz de células T ativadas. As células T administradas ao paciente podem ser derivadas do próprio paciente e ativadas conforme descrito anteriormente (isto é, são células T autólogas). Alternativamente, as células T não são do paciente, mas de outro indivíduo. Evidentemente, prefere-se que o indivíduo seja um indivíduo saudável. Por "indivíduo saudável", os inventores designam um indivíduo com boa saúde geral, preferivelmente com um sistema imune competente e, mais preferivelmente, que não apresente nenhuma doença que possa ser facilmente detectada por exames.
[00300] In vivo, as células-alvo das células T CD8-positivas de acordo com a presente invenção podem ser células Tumorais (que às vezes expressam MHC classe II) e/ou células estromais que circundam o tumor (células Tumorais) (que às vezes também expressam MHC classe II (Dengjel et al., 2006)).
[00301] As células T da presente invenção podem ser utilizadas como ingredientes ativos de uma composição terapêutica. Portanto, a invenção fornece também um método de destruição de células-alvo em um paciente cujas células-alvo apresentam expressão aberrante de um polipeptídeo que compreende uma sequência de aminoácidos da invenção, sendo que o método compreende administrar ao paciente um número eficaz de células T, conforme definido anteriormente.
[00302] Com o termo "expressão aberrante", os inventores também querem dizer que o polipeptídeo é superexpresso em comparação com os níveis normais de expressão ou que o gene é silencioso nos tecidos dos quais o tumor se origina mas é expresso nos tecidos tumorais. Com o termo "superexpresso", os autores querem dizer que o peptídeo está presente em níveis pelo menos 1,2 vez o nível encontrado no tecido normal, preferivelmente pelo menos 2 vezes e, mais preferivelmente pelo menos 5 ou 10 vezes o nível encontrado no tecido normal.
[00303] As células T podem ser obtidas por métodos conhecidos na técnica, por exemplo os métodos descritos anteriormente.
[00304] Os protocolos para a chamada transferência adotiva de células T são bem conhecidos na técnica. São apresentadas revisões em Gattioni et al. e Morgan et al. (Gattinoni et al., 2006; Morgan et al., 2006).
[00305] Outro aspecto da presente invenção inclui o uso de peptídeos em complexo com MHC para gerar um receptor de células T cujo ácido nucleico seja clonado e introduzido na célula hospedeira, preferivelmente uma célula T. Essa célula T modificada pode então ser introduzida em um paciente para tratamento do câncer.
[00306] Qualquer molécula da invenção, isto é, o peptídeo, ácido nucleico, anticorpo, vetor de expressão, célula, célula T ativada, receptor de célula T ou ácido nucleico que o codifique, é útil no tratamento de distúrbios caracterizados por células que escapam de uma resposta imune. Portanto, qualquer molécula da presente invenção pode ser empregada como medicamento ou na fabricação de um medicamento. A molécula pode ser empregada isoladamente ou combinada com outras moléculas da invenção ou com moléculas conhecidas.
[00307] Como os polipeptídeos subjacentes aos peptídeos da presente invenção são conforme mencionado nas Tabelas a seguir, expressos em altos níveis no câncer de ovário e em níveis baixos ou baixíssimos em células normais, a ação sobre peptídeos derivados de produtos proteicos dos seguintes genes pode ser, preferivelmente, integrados em uma estratégia terapêutica.
[00308] A presente invenção fornece também um medicamento útil no tratamento do câncer, em especial o câncer de ovário e outras doenças malignas.
[00309] A presente invenção refere-se também a um kit que compreende: (a) um recipiente que contém uma composição farmacêutica conforme descrito anteriormente, em solução ou em forma liofilizada; (b) opcionalmente, um segundo recipiente contendo um diluente ou solução para reconstituição de uma formulação liofilizada; e (c) opcionalmente, instruções de (i) uso da solução ou (ii) reconstituição e/ou uso da formulação liofilizada.
[00310] O kit pode compreender também um ou mais dentre (iii) um tampão, (iv) um diluente, (v) um filtro, (vi) uma agulha ou (v) uma seringa. O recipiente é preferivelmente um frasco, uma ampola, uma seringa ou um tubo de ensaio e pode ser um recipiente multiuso. A composição farmacêutica é preferivelmente liofilizada.
[00311] Kits da presente invenção compreendem preferivelmente uma formulação liofilizada da presente invenção em um recipiente apropriado e instruções para sua reconstituição e uso. São recipientes adequados, por exemplo, frascos, ampolas (por exemplo ampolas de câmara dupla), seringas (como seringas de câmara dupla) e tubos de ensaio. O recipiente pode ser constituído de diversos materiais como vidro ou plástico. Preferivelmente, o kit e/ou o recipiente contêm instruções no ou associadas ao recipiente que apresentam instruções para reconstituição e/ou utilização. Por exemplo, o rótulo pode indicar que a formulação liofilizada pode ser reconstituída até atingir as concentrações peptídicas descritas anteriormente. O rótulo também pode indicar que a formulação é útil ou destina-se a administração subcutânea.
[00312] O recipiente contendo a formulação pode ser um frasco multiuso, que permite administrações repetidas (por exemplo de 2 a 6 administrações) da formulação reconstituída.
[00313] O kit pode compreender também um segundo recipiente que contém um diluente apropriado (por exemplo solução de bicarbonato de sódio).
[00314] Ao misturar o diluente e a formulação liofilizada, a concentração final do peptídeo na formulação reconstituída é preferivelmente pelo menos 0,15 g/mL/peptídeo (75 µg) e preferivelmente não mais que 3 mg/mL/peptídeo (1500 µg). O kit pode incluir também outros materiais desejáveis do ponto de vista comercial e do usuário, como outros tampões, diluentes, filtros, agulhas, seringas e bulas com instruções de uso.
[00315] Os kits da presente invenção podem conter um único recipiente que contém a formulação das composições farmacêuticas de acordo com a presente invenção, com ou sem outros componentes (por exemplo outros compostos ou composições farmacêuticas desses outros compostos) ou pode possuir recipientes distintos para cada componente.
[00316] Preferivelmente, os kits da presente invenção contêm uma formulação farmacêutica embalada para uso em associação com a coadministração de um segundo composto (como os adjuvantes (por exemplo GM-CSF), um agente quimioterápico, um produto natural, um hormônio ou antagonista, um agente antiangiogênese ou inibidor, um agente indutor de apoptose ou um quelante) ou uma composição farmacêutica dos mesmos. Os componentes do kit podem ser pré-complexados ou cada componente pode ser fornecido em um recipiente diferente e separado antes da administração a um paciente. Os componentes do kit podem ser fornecidos em uma ou mais soluções líquidas, preferivelmente soluções aquosas e, mais preferivelmente, soluções aquosas estéreis. Os componentes do kit também podem ser fornecidos no estado sólido e serem convertidos em líquido adicionando-se solventes apropriados, que são preferivelmente fornecidos em outro recipiente separado.
[00317] O recipiente de um kit terapêutico pode ser uma ampola, tubo de ensaio, frasco, garrafa, seringa ou qualquer outro meio de envasar um sólido ou líquido. Usualmente, quando existe mais de um componente, o kit conterá um segundo frasco ou outro recipiente, que permitirá administração separada. O kit também pode conter outro recipiente para um líquido farmaceuticamente aceitável. Preferivelmente, um kit terapêutico contém um aparato (por exemplo uma ou mais agulhas, seringas, conta-gotas, pipetas, etc.), que permite administrar os agentes da invenção que são componentes do presente kit.
[00318] A presente formulação é de um tipo apropriado para administração de peptídeos por qualquer via aceitável, como a oral (entérica), nasal, oftálmica, subcutânea, intradérmica, intramuscular, intravenosa ou transdérmica. A administração deve ser preferivelmente s.c. e, mais preferivelmente, i.d., podendo também ser realizada por uma bomba de infusão.
[00319] Como os peptídeos da invenção foram isolados de câncer de ovário, o medicamento da invenção é usado preferivelmente para tratar o câncer de ovário.
[00320] A presente invenção inclui também um método de produção de um medicamento personalizado para um paciente individual, que compreende a fabricação de uma composição farmacêutica que compreende pelo menos um peptídeo selecionado de um depósito de TUMAPs pré-selecionados, no qual pelo menos um peptídeo empregado na composição farmacêutica é selecionado conforme seja mais apropriado para o paciente individual. Em uma configuração, a composição farmacêutica é uma vacina. O método também pode ser adaptado para produzir clones de células T para aplicações subsequentes, tais como isolamento de TCR, ou anticorpos solúveis e outras opções terapêuticas.
[00321] "Medicamento personalizado" significa tratamentos adaptados especificamente a um paciente e que serão usados apenas para tratamento desse paciente, incluindo vacinas anticâncer personalizadas ativamente e terapias adotivas com células usando tecido autólogo do paciente.
[00322] Conforme aqui utilizado, o termo "depósito" refere-se a um grupo ou conjunto de peptídeos pré-selecionados por sua imunogenicidade e apresentação aumentada em um determinado tipo de tumor. O termo "depósito" não pretende sugerir que os peptídeos específicos incluídos na vacina foram pré-fabricados e armazenados em uma instalação física, embora se contemple essa possibilidade. Contempla-se expressamente que os peptídeos podem ser fabricados de novo para cada vacina individualizada fabricada ou podem ser pré-fabricados e armazenados. O depósito, que pode ser, por exemplo, um banco de dados, contém peptídeos associados a tumores que foram superexpressos em níveis muito altos em tecidos tumorais de pacientes com câncer de ovário e com diversos alelos de HLA-A, HLA-B e HLA-C. Podem conter peptídeos de MHC classe I ou MHC classe II ou peptídeos alongados de MHC classe I. Além dos peptídeos associados a tumores obtidos de diversos tecidos de câncer de ovário, o depósito pode conter HLA-A*02 e HLA-A*24 e também HLAs cujos peptídeos marcadores são menos abundantes. Esses peptídeos permitem comparar quantitativamente a magnitude da imunidade mediada por células T induzida por TUMAPs, permitindo assim tirar importantes conclusões sobre a capacidade da vacina de produzir respostas antitumorais. Segundo, os peptídeos funcionam como importantes controles positivos derivados de um antígeno "não-próprio" ("não-self") nos casos em que não se observam respostas de células T induzidas pela vacina a TUMAPs derivados de antígenos "próprios" ("self") em um paciente. Terceiro, eles podem permitir tirar conclusões sobre o nível de imunocompetência do paciente.
[00323] Os TUMAPs do depósito foram identificados por meio de uma abordagem de genômica funcional integrada que combina análise de expressão gênica, espectrometria de massa e imunologia de células T (XPresident®). Essa abordagem garante que apenas TUMAPs que estejam realmente presentes em uma porcentagem elevada de tumores e sejam minimamente ou nada expressos em tecidos normais sejam selecionados para análises posteriores. Para a seleção inicial de peptídeos, amostras de pacientes com câncer de ovário e sangue de doadores saudáveis foram analisados de acordo com as seguintes etapas: l) Ligantes de HLA do material maligno foram identificados por espectrometria de massa m) Foi usada a expressão de ácido ribonucleico mensageiro (mRNA) de todo o genoma para identificar genes superexpressos no tecido maligno de câncer de ovário em comparação com diversos órgãos e tecidos normais. n) Os ligantes de HLA identificados foram comparados com os dados de expressão gênica. Os peptídeos apresentados de forma exacerbada ou seletivamente em tecidos tumorais, preferivelmente codificados por genes expressos seletivamente ou expressos de forma excessiva conforme detectados na etapa 2, foram considerados candidatos a TUMAPs apropriados para uma vacina multipeptídica. o) Uma busca na literatura foi realizada para identificar mais evidências indicativas da relevância dos peptídeos identificados como TUMAPs. s) A relevância da superexpressão ao nível de mRNA foi confirmada pela detecção dos TUMAPs selecionados na etapa 3 em tecido tumoral e pela detecção baixa ou ausente em tecidos saudáveis. t) Para avaliar se é viável induzir respostas de células T in vivo empregando os peptídeos selecionados, foram realizados ensaios de imunogenicidade in vitro usando células T humanas tanto de doadores saudáveis como de pacientes com câncer de ovário.
[00324] Em um aspecto, os peptídeos são pré-selecionados por sua imunogenicidade antes de serem incluídos no depósito. A título exemplificativo e não limitante, a imunogenicidade dos peptídeos incluídos no depósito é determinada por um método que compreende a preparação ("priming") in vitro de células T mediante estimulações repetidas de células T CD8+ de doadores saudáveis com células apresentadoras de antígenos artificiais carregadas com complexos peptídeo-MHC e anticorpo anti-CD28.
[00325] Esse método é preferido para cânceres raros e pacientes com perfis de expressão raros. Ao contrário dos coquetéis multipeptídicos com composição fixa desenvolvidos atualmente, o depósito permite obter correspondências significativamente melhores entre a vacina e a expressão efetiva de antígenos do tumor. Peptídeos selecionados disponíveis comercialmente ou combinações dos mesmos serão usados para cada paciente em uma abordagem multialvo. Teoricamente, uma abordagem baseada na seleção de, por exemplo, 5 peptídeos antigênicos diferentes de uma biblioteca de 50 proporcionaria cerca de 17 milhões de possíveis composições de produtos medicamentosos (PM).
[00326] Em um aspecto, os peptídeos são selecionados para inclusão na vacina com base em sua adequação ao paciente individual baseado no método de acordo com a presente invenção conforme aqui descrito ou conforme apresentado a seguir.
[00327] Os dados de fenótipo de HLA, transcriptoma e peptidoma são coligidos do material obtido do tumor do paciente e de amostras de sangue para identificar os peptídeos mais apropriados para cada paciente contendo TUMAPs do depósito específicos para o paciente (isto é, mutantes). Serão selecionados peptídeos expressos de forma excessiva ou seletiva nos tumores dos pacientes e que, sempre que possível, mostrem forte imunogenicidade in vitro quando testados com células mononucleares do sangue periférico (PBMC) do paciente.
[00328] Preferivelmente, os peptídeos incluídos na vacina são identificados por um método que compreende: (a) identificação de peptídeos associados ao tumor (TUMAPs) apresentados por uma amostra tumoral de um paciente individual; (b) comparação dos peptídeos identificados em (a) com um depósito (banco de dados) de peptídeos conforme descrito anteriormente; e (c) seleção de pelo menos um peptídeo do depósito (banco de dados) que se correlacione com um peptídeo associado ao tumor identificado no paciente. Por exemplo, os TUMAPs apresentados em amostras tumorais são identificados da seguinte maneira: (a1) comparação dos dados de expressão da amostra tumoral com os dados de expressão de uma amostra de tecido normal correspondente ao tipo de tecido da amostra tumoral para identificar proteínas que são superexpressas ou apresentam expressão aberrante na amostra tumoral; e (a2) correlação dos dados de expressão com sequências de ligantes de MHC ligados a moléculas de MHC classe I e/ou classe II na amostra tumoral para identificar ligantes de MHC derivados de proteínas superexpressas ou expressas de forma aberrante pelo tumor. Preferivelmente, as sequências dos ligantes de MHC são identificadas eluindo-se os peptídeos ligados das moléculas de MHC isoladas da amostra tumoral e sequenciando-se os ligantes eluídos. Preferivelmente, a amostra de tumor e a amostra de tecido normal devem ser obtidas do mesmo paciente.
[00329] Além de, ou como alternativa a, selecionar peptídeos usando um modelo de depósito (banco de dados), os TUMAPs podem ser identificados em pacientes de novo e incluídos na vacina. Como exemplo, os TUMAPs candidatos podem ser identificados no paciente da seguinte maneira: (a1) comparação dos dados de expressão da amostra tumoral com os dados de expressão de uma amostra de tecido normal correspondente ao tipo de tecido da amostra tumoral para identificar proteínas que são superexpressas ou apresentam expressão aberrante na amostra tumoral; e (a2) correlação dos dados de expressão com sequências de ligantes de MHC ligados a moléculas de MHC classe I e/ou classe II na amostra tumoral para identificar ligantes de MHC derivados de proteínas superexpressas ou expressas de forma aberrante pelo tumor. Como outro exemplo, podem-se identificar proteínas que contêm mutações específicas para a amostra tumoral em relação ao tecido normal correspondente de um paciente individual, e podem-se identificar TUMAPs que atuam especificamente sobre a mutação. Por exemplo, os genomas do tumor e do tecido normal correspondente podem ser sequenciados por sequenciamento de genoma inteiro. Para descobrir mutações não-sinônimas nas regiões codificadoras de proteínas dos genes, o DNA e o RNA genômicos são extraídos de tecidos tumorais e o DNA germinativo não-mutante do genoma normal é extraído de células mononucleares do sangue periférico (PBMCs). A abordagem NGS aplicada restringe-se ao ressequenciamento de regiões codificadoras de proteínas (ressequenciamento do exoma). Para essa finalidade, o DNA exônico de amostras humanas é capturado usando kits de enriquecimento fornecidos comercialmente seguido por sequenciamento usando, por exemplo, um instrumento HiSeq2000 (Illumina). O mRNA tumoral também é sequenciado para quantificação direta da expressão gênica e validação do fato de que os tumores dos pacientes expressam os genes mutantes.
[00330] As milhões de leituras de sequências assim produzidas são processadas por algoritmos em software. A lista produzida contém mutações e expressão gênica. As mutações somáticas específicas para tumores são determinadas comparando-se as variações germinativas derivadas de PBMC, e essas derivações recebem prioridade.
[00331] Os peptídeos identificados de novo podem então ter sua imunogenicidade testada conforme descrito anteriormente em relação ao depósito, e os TUMAPs candidatos que possuírem imunogenicidade apropriada são selecionados para inclusão na vacina.
[00332] Em uma configuração exemplar, os peptídeos incluídos na vacina são identificados pelo seguinte procedimento: (a) identificação de peptídeos associados a tumor (TUMAPs) apresentados por uma amostra tumoral de um paciente individual usando o método descrito anteriormente; (b) comparação dos peptídeos identificados na etapa a) com um depósito de peptídeos pré-selecionados de acordo com a imunogenicidade e apresentação aumentada em tumores em comparação com os tecidos normais correspondentes; (c) seleção de pelo menos um peptídeo do depósito que se correlaciona com um peptídeo associado a tumores identificado no paciente; e (d) opcionalmente, seleção de pelo menos um peptídeo identificado de novo em (a) para confirmar sua imunogenicidade.
[00333] Em uma configuração exemplar, os peptídeos incluídos na vacina são identificados pelo seguinte procedimento: (a) identificação de peptídeos associados a tumor (TUMAPs) apresentados por uma amostra tumoral de um paciente individual; e (b) seleção de pelo menos um peptídeo identificado de novo em (a) para confirmar sua imunogenicidade.
[00334] Uma vez selecionados os peptídeos para uma vacina peptídica personalizada, a vacina é produzida. Preferivelmente, a vacina é uma formulação líquida que consiste em peptídeos individuais dissolvidos em 20% a 40% de DMSO, preferivelmente de 30% a 35% de DMSO, como cerca de 33% de DMSO.
[00335] Todos os peptídeos a serem incluídos em um produto são dissolvidos em DMSO. A concentração das soluções de peptídeo único deve ser escolhida em função do número de peptídeos a serem incluídos no produto. Soluções de um peptídeo em DMSO são misturadas em partes iguais para criar uma solução contendo todos os peptídeos a serem incluídos no produto a uma concentração de ~2,5 mg/mL por peptídeo. A solução misturada é então diluída 1:3 em água para injeção de forma a atingir uma concentração de 0,826 mg/mL por peptídeo em DMSO a 33%. A solução diluída é filtrada por um filtro estéril de 0,22 µm. A solução bruta final é obtida.
[00336] A solução bruta final é acondicionada em ampolas e armazenada a -20°C até o momento do uso. Cada ampola contém 700 µL de uma solução que contém 0,578 mg de cada peptídeo. Destes, 500 µL (cerca de 400 µg por peptídeo) serão administrados por injeção intradérmica.
[00337] Além de ser usados no tratamento do câncer, os peptídeos da presente invenção também têm aplicações diagnósticas. Como esses peptídeos foram gerados a partir de células de câncer de ovário e como foi determinado que esses peptídeos estão ausentes ou presentes em níveis baixos em tecidos normais, esses peptídeos podem ser empregados para diagnosticar a presença de um câncer.
[00338] A presença dos peptídeos reivindicados em biópsias de tecidos ou em amostras de sangue pode ajudar um patologista a diagnosticar câncer. A detecção de determinados peptídeos por meio de anticorpos, espectrometria de massa ou outros métodos conhecidos na técnica pode dizer ao patologista que o tecido da amostra é maligno, está inflamado ou apresenta patologia em geral ou pode ser usada como biomarcador de câncer de ovário. A presença de grupos de peptídeos pode permitir a classificação ou subclassificação de tecidos patológicos.
[00339] A detecção de peptídeos em amostras de tecido doente pode permitir a decisão sobre o benefício de tratamentos que envolvem o sistema imune, sobretudo se os linfócitos T participarem ou se esperar que participem do mecanismo de ação. A perda da expressão de MHC é um mecanismo bem descrito pelo qual células malignas infectadas escapam da imunovigilância. Portanto, a presença de peptídeo mostra que esse mecanismo não é explorado pelas células analisadas.
[00340] Os peptídeos da presente invenção podem ser empregados para analisar respostas linfocitárias contra esses peptídeos, tais como respostas de células T ou de anticorpos contra o peptídeo ou contra o peptídeo em complexo com moléculas de MHC. Essas respostas podem ser usadas como marcadores prognósticos para tomar decisões sobre as próximas etapas do tratamento. Essas respostas também podem ser empregadas como marcadores de resposta sucedâneos em abordagens imunoterapêuticas que visam a induzir respostas linfocitárias por outros meios (por exemplo vacinação com proteínas, ácidos nucleicos, materiais autólogos e transferência adotiva de linfócitos). No âmbito de terapias gênicas, as respostas linfocitárias contra peptídeos podem ser consideradas na avaliação dos efeitos colaterais. O monitoramento das respostas linfocitárias também pode ser um valioso recurso para exames de acompanhamento de tratamentos envolvendo transplantes; por exemplo para detectar doença enxerto-versus-hospedeiro ou hospedeiro-versus-enxerto.
[00341] A presente invenção será agora descrita nos seguintes exemplos, que descrevem configurações preferidas da mesma, mas sem limitar- se aos exemplos. Para os fins da presente invenção, todas as referências aqui citadas ficam integralmente incorporadas por referência.
FIGURAS
[00342] A Figura 1 mostra a expressão de HLA-A, B, C (a) e HLA-DR (b) em diferentes subconjuntos de células de câncer de ovário e em tecido ovariano benigno. Na Figura 1, foi usado o teste t de Student não pareado com correção de Welch devido à desigualdade entre as variâncias dos dois grupos comparados. A expressão de HLA classe I (A) e HLA-DR (B) em diferentes tipos celulares dentro de CEO e em tecido ovariano benigno após dissociação enzimática é caracterizada por marcadores diferentes na superfície celular, sendo CD45+ nos compartimentos leucocitários, CD45-EpCam+ nos compartimentos de células Tumorais e epiteliais e CD45-CD31+nos compartimentos de células endoteliais. Cada ponto de dados representa a média de experimentos realizados em triplicata para cada amostra.
[00343] Testes t bilaterais foram usados para testar a significância (*p<0,05; ** p<0,01).
[00344] As Figuras 2A a D mostram uma comparação dos perfis do imunopeptidoma de CEO em comparação com tecidos benignos. (A) Comparação dos perfis de proteínas-fonte ligantes HLA classe I em CEO (n=34) e em tecidos benignos. A frequência da apresentação restrita por HLA das proteínas fontes é indicada separadamente no eixo y para CEO (acima do eixo x) e para fontes benignas (abaixo do eixo x). As proteínas-fonte foram classificadas (da esquerda para a direita) de acordo com sua frequência na apresentação específica em CEO. A caixa no lado esquerdo destaca as destaca as proteínas- fontes do ligante TOP100 de HLA, que são apresentadas exclusivamente pelo CEO. (B) Nuvem de palavras das proteínas-fontes de TOP100 específicas do ligante de HLA classe I em CEO (nome do gene recomendado pela uniprot). O tamanho da fonte (5 a 26) se correlaciona com o número absoluto de pacientes com câncer que apresentam ligantes de HLA das respectivas proteínas fonte. (C) Comparação dos perfis de proteínas-fonte ligantes HLA classe I em CEO (n=22) e em tecidos benignos. (D) Nuvem de palavras das proteínas-fontes de TOP100 específicas do ligante de HLA classe II em CEO (nome do gene recomendado pela uniprot). O tamanho da fonte (3 a 11) se correlaciona com o número absoluto de pacientes com câncer que apresentam ligantes de HLA das respectivas proteínas fonte.
[00345] A Figura 3 mostra a origem celular do CEO de TOP100 associado com ligantes de HLA classe I. Os gráficos vulcão da abundância relativa de ligantes de HLA no imunopeptidoma classe I de populações celulares enriquecidas de CAOvário 84 foram analisadas por quantificação sem marcação. Os painéis mostram, à esquerda (A) linfócitos infiltrantes de tumores (CD45+) e células Tumorais (CD45-Epcam+), e à direita células estromais (B) (CD45-EpCam) em comparação com células Tumorais.
[00346] A linha pontilhada horizontal indica o limiar de significância (p < 0,05). Os ligantes exclusivos de TOP100 em CEO — MUC16 (vermelho), DDR1, EYA2, SOX9, TLR7, OASL — e os ligantes derivados de antígenos associados a leucócitos (CD132, CD8, LSP1) e os antígenos associados ao estroma (célula endotelial) (vWF) aparecem em destaque.
[00347] A Figura 4 mostra a coloração imunohistoquímica e os níveis séricos de marcadores substitutos da apresentação de ligantes. Coloração imunohistoquímica de carcinomas serosos de ovário de alto grau para MUC16 (CA-125) com escores de imunorreatividade baixos (IRS4), intermediário (IRS6) e elevado (IRS12) (A).
[00348] Coloração imunohistoquímica para mesotelina (à direita, IRS8) e IDO1 (à esquerda, IRS2). Correlação entre apresentação do ligante de HLA e expressão de proteínas-fonte para alguns antígenos selecionados associados ao TOP100 de CEO. A expressão de MUC16 (n=23), IDO1 (n=23) e MSLN (n=16) foi analisada por coloração imunohistoquímica (C) ou por análise de marcadores séricos de CA-125 (n=30) no dia da cirurgia (D). Para o MSLN, os casos nos quais os dados do imunopeptidoma de HLA classe II estavam disponíveis foram incluídos. O teste não-paramétrico de Mann-Whitney foi usado para testar a significância estatística, sendo que p<0,05 foi considerado significativo.
[00349] A Figura 5 mostra a relevância prognóstica da MUC16 e da MSLN.
[00350] Foram realizadas colorações imunohistoquímicas em "microarrays" de tecidos com 71 amostras de CEO seroso de alto grau nos quais foi documentada citorredução ideal. (A) Gráfico de Kaplan-Meier ilustrando a influência da expressão de MUC16 (painel à esquerda, escore de expressão baixa menor que 7, n=41; escore de expressão alta > 7, n=30) e da expressão de MSLN (painel à direita, expressão baixa < 6, n=15; e expressão alta > 6, n=52) na sobrevida geral. (B) Impacto da infiltração de células T CD3 no compartimento intraepitelial (painel esquerdo CD3E, baixa infiltração < 7 células/campo de grande aumento, n=13; alta infiltração> 7, n=57) ou no estroma fibrovascular (painel direito, CD3S, baixa infiltração < 7 células/campo de grande aumento, n=40; alta infiltração > 7, n=30) na sobrevida geral das pacientes. (C) Análise de subgrupo da coloração combinada de CD3 e MLN (com limiares de pontuação idênticos ao anterior) para células T CD3 intraepiteliais (painel superior, MSLN baixa e CD3E alto, n=11; MSLN baixa e CD3E baixa, n=40; MSLN alta e CD3E baixa, n=14; MSLN alta e CD3E alta, n=1) ou células T CD3 fibrovasculares (painel inferior, MSLN baixa/CD3S alta, n=30; MSLN alta e CD3S baixa, n=7; MSLN baixa e CD3S baixa, n=21; MSLN alta e CD3S alta, n=8).
[00351] A Figura 6 mostra ensaios de citometria de fluxo em CEO e em tecido ovariano não maligno. Apresentação exemplar da estratégia de seleção para CAOvário 48 mostrando a seleção de leucócitos CD45+, células endoteliais CD45-CD31+ e células Tumorais ou epiteliais CD45-EpCam+.
[00352] A Figura 7 mostra a análise de saturação para identificação da proteína-fonte ligante de HLA em CEO. A análise de saturação para identificar proteínas fontes é mostrada separadamente para proteínas ligantes de HLA classe I (A) e classe II (B). O número médio de proteínas de fonte única foi calculado para cada fonte por meio de 1000 amostragens aleatórias de 34 CEOs fontes. Foi usada regressão exponencial para determinar a cobertura máxima calculada que poderia ser atingida (linhas pontilhadas) em CEO.
[00353] A Figura 8 mostra a frequência e o número de apresentação de ligantes de HLA entre amostras de CEO. A apresentação de HLA de antígenos selecionados associados ao CEO, assim como o número de peptídeos associados ao HLA (códigos de cores), é visualizado para cada CEO (dos pacientes cujo número aparece no alto de cada colune) tanto para antígenos de classe I (parte superior) como os de classe II (parte inferior).
EXEMPLOS Materiais e Métodos Amostras de Tecido
[00354] Todas as amostras de tecido foram colhidas no Hospital Universitário de Tübingen após se obter consentimento livre e esclarecido dos pacientes consoante aos princípios da Declaração de Helsinque. Todos os protocolos do estudo foram aprovados pelo comitê de ética em pesquisa local. Salvo indicação em contrário, todas as amostras foram armazenadas a -80°C até o momento do uso. A tipagem de HLA com dois dígitos foi realizada por PCR com inciador específico para sequência (SSP, "sequence specific inciador") pelo sistema HLA-Ready Gene System (Innotrain, Kronberg, Alemanha) e avaliada pelo software SCORE (Olerup, Estocolmo, Suécia) no Departamento de Medicina Transfusional do Hospital Universitário de Tübingen. A tipagem de alta resolução com quatro dígitos foi realizada por sequenciamento de próxima geração em um sequenciador GS Junior Sequencer usando conjuntos de "inciadores" de HLA GS GType (ambos Roche, Basileia, Suíça). Tecidos normais foram obtidos de BioOptions Inc, CA, EUA; BioServe, Beltsville, MD, EUA; Capital BioScience Inc., Rockville, MD, EUA; Geneticist Inc, Glendale, CA, EUA; Hospital Universitário de Genebra; Hospital Universitário de Heidelberg; Hospital Universitário de Munique; ProteoGenex Inc., Culver City, CA, EUA e Hospital Universitário de Tübingen. Todos os pacientes deram consentimento livre e esclarecido antes da cirurgia ou autópsia. Os tecidos foram criocongelados logo após a excisão e armazenados a -70°C ou menos até o isolamento dos TUMAPs.
Dissociação de tecidos
[00355] O CEO e os tecidos benignos de ovário e de trompa de Falópio foram colhidos frescos de pacientes submetidas à ressecção tumoral, citorredução ou salpingo-ooforectomia. Os tecidos foram macerados em pequenos pedaços menores que 2 mm3 e transferidos para uma solução enzimática de dissociação contendo colagenase tipo IV 400 U/mL, dispase 5 U/mL (ambos da Life Technologies, Carlsbad, CA) e DNAse 0,1 mg/mL (Roche, Basileia, Suíça) em DMEM (Life Technologies) com 10% de soro fetal bovino (Lonza, Basileia, Suíça). A dissociação foi realizada em um agitador giratório (Infors HT, Basileia, Suíça) por 3 horas a 37°C. Os fragmentos de tecido restantes (geralmente menos de 1% do peso inicial) foram removidos por uma peneira celular de 100 µm (BD, Franklin Lakes, NJ). As suspensões de células isoladas foram lavadas duas vezes em PBS e os eritrócitos foram lisados por um tampão de lise de cloreto de amônia.
Quantificação de moléculas de HLA na superfície
[00356] A expressão superficial de HLA foi determinada por quantificação usando o ensaio de citometria de fluxo QIFIKIT (Dako, Glostrup, Dinamarca) de acordo com as instruções do fabricante. As células foram coradas com anticorpo monoclonal panespecífico para HLA classe I W6/32, com o anticorpo específico para HLA-DR L243 ou com o respectivo controle isotópico. A distinção entre os tipos celulares baseou-se em colorações para marcadores de superfície usando anticorpos com marcadores fluorescentes contra CD45 (clone 2D1 de AmCyan, BD), CD31 (clone PeCy7 de WM59, BioLegend, San Diego, CA), EpCam (clone APC de HEA125; Miltenyi, Bergisch-Gladbach, Alemanha) e CD34 (clone 581 de APCCy7, BioLegend). O 7AAD (BioLegend) foi adicionado como marcador de viabilidade imediatamente antes dos ensaios, que foram realizados em um analisador LSR SORP Fortessa (BD). Cada amostra foi medida me triplicata, e as intensidades medianas de fluorescência foram usadas para calcular a expressão molecular nas superfícies.
Separação de Células
[00357] A separação de células foi realizada segundo dois protocolos de separação celular ativada magneticamente (MACS) de acordo com as instruções do fabricante (Miltenyi). As separações foram realizadas em colunas XS e em um separado superMACS (ambos Miltenyi). A primeira separação buscou a seleção positiva de leucócitos CD45+. A fração negativa foi posteriormente enriquecida para células Tumorais EpCam+. A fração restante de EpCam CD45 foi considerada como representante da fração de células estromais.
Isolamento de Ligantes de HLA
[00358] As moléculas de HLA classe I e II foram isoladas pela técnica padrão de purificação por imunoafinidade, conforme descrito anteriormente42. Foram empregados um anticorpo monoclonal W6/32 panespecífico para HLA classe I, um anticorpo monoclonal Tü39 específico para HLA classe II e um anticorpo monoclonal L243 específico para HLA-DR para isolamento de HLA classe II.
Análise do Imunopeptidoma por LC-MS/MS
[00359] Os imunopeptidomas foram analisados por um espectrômetro de massa LTQ OrbitrapXL (Thermo Fisher, Waltham, MA) equipado com uma fonte de íons do tipo nano-eletrospray e acoplado a um sistema Ultimate 3000 RSLC Nano UHPLC (Dionex, Sunnyvale, CA). As amostras de peptídeos foram carregadas com 3% de solvente B (H2O 20%, ácido acetonitrílico 80% e ácido fórmico 0,04%) em uma coluna PepMap 100 C18 Nanotrap de 2 cm (Dionex) com taxa de fluxo de 4 µL/minuto por 10 minutos. A separação foi realizada em uma coluna PepMap C18 de 50 cm com partículas de 2 µm (Dionex) montada em um forno de colunas aquecido a 50°C. O gradiente aplicado variou de 3% a 30% de B em 140 minutos com taxa de fluxo de 175 nil/minuto. (solvente A: H2O 99%, ACN 1% e ácido fórmico 0,1%; solvente B: H2O 20%, ACN 80% e ácido fórmico 0,1%). As análises de espectrometria de massa foram realizadas em um modo de aquisição dependente de dados empregando um método de atuação sobre os cinco maiores peptídeos, ou seja, um método no qual em cada varredura os cinco íons precursores mais abundantes são selecionados para fragmentação. As varreduras foram realizadas no Orbitrap a uma resolução de 60.000. A análise MS/MS foi realizada com dissociação induzida por colisão (CID, "collision induced dissociation") com energia de colisão normalizada de 35%, tempo de ativação de 30 ms, largura de isolamento de 1,3 m/z) e análise subsequente em "trap" iônico linear quadripolar (LTQ). O intervalo de massas para ligantes de HLA classe I foi limitado em 400 a 650 m/z e os possíveis estados de carga 2+ e 3+ selecionados para fragmentação. Para HLA classe II, intervalo de massas foi ajustado para 300 a 1500 m/z, permitindo fragmentação com estados de carga positivos iguais ou maiores que 2.
[00360] Tipicamente, as amostras de HLA classe I foram analisadas em cinco réplicas técnicas e as de classe II em três replicas técnicas. As sequências iniciais foram realizadas sem exclusão dinâmica, mas em sequências consecutivas uma exclusão dinâmica de 5 s foi habilitada.
Processamento e Análise de Dados de Espectrometria de Massa
[00361] As análises de dados de MS foram realizadas pelo Proteome Discoverer 1.3 (ThermoFisher). As listas de picos foram comparadas com o proteoma humano conforme mostrado pelo banco de dados Swiss-Prot (www.uniprot.org, edição de 27 de setembro de 2013; que inclui 20.279 sequências de proteínas analisadas) usando o motor de busca Mascot (Mascot 2.2.04, Matrix Science, Boston, MA). A tolerância de massa no processamento foi de 5 ppm para íons precursores e de 0,5 Da para íons fragmentados. Nenhuma especificidade de clivagem foi selecionada, e a única modificação dinâmica permitida foi oxidação de metionina. A confiança nos peptídeos foi determinada por um algoritmo de percolação com meta q<0,05 (taxa de descobertas falsas de 5%). Foram usados os filtros de pós-processamento Mascot Ionscore maior ou igual a 20, classificação no motor de busca igual a 1 e comprimento do peptídeo de 8 a 12 aminoácidos para ligantes de HLA classe I e 12 a 25 aminoácidos para ligantes de HLA classe II. O agrupamento de proteínas foi desabilitado para permitir várias anotações de peptídeos cujas sequências correspondem a várias proteínas devido à conservação. A anotação de HLA foi realizada usando algoritmos preditores de HLA hospedados em SYFPEITHI (www.syfpeithi.de) e em NETMHC 3.4 (http://www.cbs.dtu.dk/services/NetMHC/).
[00362] Nos casos com resultados ambíguos, vários alelos são mencionados. Nos perfis comparativos, os peptídeos seletivos procurados, isto é, aqueles que foram apresentados em apenas uma fonte com contagem menor ou igual a 5, foram retirados de ambos os conjuntos de dados.
[00363] A quantificação sem marcação do tumor em comparação com CD45+ e do tumor em comparação com células estromais foi realizada pelo Sieve 2.1 (Thermo Fisher).
[00364] Foram alinhados pelo menos três réplicas de arquivos brutos de MS para cada fração enriquecida em células, e os resultados das precipitações de MHC de todo o tecido foram todos alinhados, com deslocamento máximo de tempo de retenção (TR) de 2,5 minutos. Os "frames" foram gerados a partir de eventos de rastreamento de MS2, com largura máxima de TR de 3,5 minutos e tolerância de massa de 5 ppm. As identificações foram importadas do descobridor Proteome a partir dos resultados de busca em Mascot, conforme descrito anteriormente. A normalização da corrente iônica total nos cromatogramas foi usada para ajustar para diferenças entre as intensidades das amostras.
Análise da Imunogenicidade de Ligantes de HLA Classe I
[00365] O "priming" de linfócitos T citotóxicos (LTCs) específicos para peptídeos foi realizado segundo um protocolo bem estabelecido que envolve células apresentadoras de antígenos artificiais (aAPCs) (30), sendo que as aAPCs consistem em contas de poliestireno recobertas de estreptavidina (5,6 µm de diâmetro; Bangs Laboratories, Fishers, IN). As contas foram ressuspensas a 2x106 por mL e incubadas com complexos peptídeo-MHC biotinilados a 10 nM e 10 nM de anticorpo estimulador anti-CD28 (clone 9.3, derivado de ATCC, Manassas, VA) cada por 30 minutos em temperatura ambiente. As células T foram isoladas do sangue total de doadores saudáveis usando um kit de isolamento magnético de CD8 (Miltenyi). Um milhão de células T por cavidade foram cultivadas em 96 cavidades em placas (Corning, Corning, NY, EUA) e estimuladas com o mesmo número de aAPCs carregadas na presença de 5 ng/mL de IL-12 (PromoCell, Heidelberg, Alemanha).
[00366] As células T foram estimuladas três vezes ao todo, com intervalo de estimulação semanal. Dois dias após cada estimulação, foram adicionadas 40 U/mL de IL-2.
[00367] O "priming" de células T foi avaliado por coloração de multímeros de MHC uma semana depois da última rodada de estimulação.
Construção de Tecidos de "microarrays" (TMA)
[00368] Amostras emblocadas de tumores de pacientes com carcinoma seroso de alto grau do ovário ou da trompa de Falópio (CEO) em estágio FIGO igual ou superior a 2 ou 3 operadas no University Women’s Hospital de Tübingen entre 1999 e 2008 foram recuperadas dos arquivos do Instituto de Patologia da instituição. Após confirmação do subtipo histológico e classificação de acordo com critérios publicados (43), 154 casos foram incluídos inicialmente no estudo. Um "microarray" de tecidos (TMA) foi construído conforme descrito anteriormente (44). Foram usados seis partes centrais de 0,6 mm de diâmetro de cada paciente, sendo no máximo três partes centrais cada de dois locais diferentes de tumores primários e pelo menos duas partes centrais de áreas separadas. Também foi construído um TMA usando tecidos emblocados em parafina de tumores primários de casos coletados prospectivamente para análise do ligandoma. Cortes de 3 µm de espessura foram obtidos e sujeitos a pré-tratamento específico para imunohistoquímica. Um total de 23 casos foram avaliados por escore imune e correlacionados com dados do imunopeptidoma.
Imunohistoquímica
[00369] Os anticorpos primários e as respectivas diluições usadas para imunohistoquímica foram as seguintes: CD3 (1:100, SP7 monoclonal de rato, DCS, Hamburgo, Alemanha), CD8 (1:200, C8/144B monoclonal de camundongo, DAKO), MUC16 (1:450, M11 monoclonal de camundongo, DAKO, Glostrup, Dinamarca), IDO1 (1:25, ABCAM monoclonal de camundongo, Cambridge, Reino Unido) e MSLN (1:100, SPM143 monoclonal de camundongo, GeneTex, Irvine, CA, EUA). Os cortes de tecido foram pré-tratados com uma solução tampão de EDTA (pH 8,6) a 95°C por 36 minutos. A coloração imunohistoquímica foi realizada em um imunomarcador automatizado de acordo com as instruções do fabricante usando as instruções do fabricante do kit de detecção iView DAB (ambos Ventana, Tucson, AZ, EUA).
Pontuação de Coloração Imune
[00370] Os TILs foram quantificados primeiramente avaliando-se o número médio de células imunomarcadas por campo de grande aumento (CGA, 400x) contando-se pelo menos 2 CGA para cada parte central. Em uma segunda etapa, o número médio de linfócitos por CGA para o conjunto de partes centrais esquerda e direita foi calculado para a totalidade das partes centrais, e essa contagem média bilateral foi usada para os cálculos subsequentes. O estroma fibrovascular (CD3S e CD8S) e o compartimento intraepitelial do tumor (CD3E e CD8E) foram avaliados separadamente.
[00371] Para expressão de CA 125, a intensidade da coloração por IDO1 e MSLN foi classificada de 0 a 3 e multiplicada por um escore de 1 a 4 para se obter a porcentagem de células Tumorais (1 para 0-10%; 2 para 0-50%; 3 para 50-80%; e 4 para 80-100%). Em todos os casos, os parâmetros foram categorizados em quartis, e a melhor separação entre dois quartis foi definida como valor de corte entre níveis altos ou baixos de expressão. Das 154 pacientes com TMA, 71 haviam sido submetidas a citorredução ideal do tumor (< 1 cm de massa tumoral residual) e puderam ser adequadamente avaliadas para TILs e expressão de proteínas. A pontuação de coloração imune e a análise de dados clínicos foram realizadas por pesquisadores independentes.
Análise Estatística e Visualização
[00372] Salvo menção em contrário, todas as figuras e análises estatísticas foram geradas pelo Graphpad Prism 6.0 (Graphpad software, La Jolla, CA, EUA) ou Microsoft Office 2010 (Microsoft). Nuvens de palavras foram criadas usando-se um aplicativo online (www.wordle.net). As análises de Kaplan-Meier foram realizadas pelo software estatístico SPSS (versão 21, IBM Corp., Armonk, NY, EUA). Exceto onde especificado o contrário, foram realizados testes do t de Student não pareados bicaudados. Valores de P inferiores a 0,05 foram considerados estatisticamente significativos. O teste "omnibus" de D’Agostino- Pearson foi usado para verificar a normalidade e o teste-F para verificar se as variâncias eram iguais. Na Figura 1, foi usado o teste t de Student não pareado com correção de Welch devido à desigualdade entre as variâncias dos dois grupos comparados. O teste não paramétrico de Mann-Whitney foi usado na Figura 4 porque a normalidade da distribuição não pôde ser avaliada em razão dos tamanhos reduzidos das amostras.
[00373] A correlação de Spearman foi usada para correlacionar os escores de IHQ da MSLN e da MUC16, pois os conjuntos de dados não mostravam distribuição normal. Na Figura 5, os p-valores da comparação das duas curvas de sobrevida de Kaplan-Meier forma calculados pelo teste de logrank (Mantel-Cox).
Exemplo 1:Contagem de HLA na superfície celular e tipagem de HLA
[00374] Um importante pré-requisito para o desenvolvimento de imunoterapias mediadas por células T é a expressão de moléculas de MHC na superfície das células Tumorais. Portanto, os inventores analisaram e quantificaram o número de moléculas de HLA A, B, C e DR usando citometria de fluxo em diferences subconjuntos de células de tumores ovarianos (n=11) e em tecidos benignos do ovário e da trompa de Falópio (n=8) obtidos por dissociação enzimática. A análise visou à quantificação separada da expressão de HLA específica para cada tipo celular de leucócitos (CD45+), células epiteliais ou tumorais (Epcam+) e células endoteliais (CD31+; esta última em um subconjunto de apenas 7 tumores ovarianos). A estratégia completa de seleção é exibida na Figura 6. O número mediano de moléculas de HLA por célula variou bastante, tanto entre tipos celulares diferentes como entre pacientes individuais, variando de cerca de 5.000 a 150.000 moléculas de HLA classe I e cerca de 500 a 330.000 moléculas de HLA-DR. O número de moléculas de HLA-A, B e C foi significativamente maior (p=0,0205) em leucócitos isolados de tumores que em tecidos benignos. Isso indica uma reação inflamatória ativa dentro do tumor.
[00375] A comparação de células Tumorais com células epiteliais derivadas de tecidos não-malignos também revelou fortes diferenças na expressão de HLA classe I. A expressão de moléculas de HLA classe I foi significativamente (p=0,0021) maior em células Tumorais (cerca de 75.000 moléculas/célula), mas permaneceu no mesmo intervalo em outras células estromais como, por exemplo, as células endoteliais (cerca de 95.000 moléculas/célula). Surpreendentemente, os inventores encontraram evidências de expressão forte (105.000 moléculas/célula) e até certo ponto extraordinariamente elevada de HLA-DR em células CEO (mais de 300.000 moléculas/célula), ao passo que células epiteliais benignas foram praticamente negativas para HLA-DR (p=0,0108). Ao todo, os inventores constataram amento da expressão de MHC classe I e II entre os tumores.
[00376] As análises do ligandoma de HLA e os perfis comparativos divulgaram apresentação de antígenos específica para CEO. A fim de mapear o repertório de ligantes de CEO, os inventores isolaram moléculas de HLA do tecido tumoral e realizaram espectrometria de massa para caracterizar o ligandoma de HLA para um total de 34 CEOs. (A Tabela 7 mostra as características dos pacientes na tipagem de HLA.) TABELA 7
[00377] Para o MHC classe I, os inventores identificaram 22.920 peptídeos únicos (média de 1.263 por amostra) oriundos de 9.136 proteínas fonte diferentes (média de 1.239 por amostra), atingindo mais de 90% da cobertura máxima possível estimada (ver Figura 7a).
Exemplo 2, Identificação dos principais ligantes de HLA associados com câncer
[00378] A fim de tentar extrair os ligantes de HLA mais específicos para CEO de um enorme catálogo de dados, os inventores compararam as proteínas originais dos ligantes de DNA com um banco de dados desenvolvido internamente a partir de fontes benignas ("banco de dados do ligandoma de HLA benigno"), que consiste em amostras de PBMC (n=30), medula óssea (n=10), fígado (n=15), cólon (n=12), ovário (n=4) e rim (n=16). O banco de dados de ligandoma de HLA benigno contém 31.032 peptídeos que representam 10.012 proteínas originais e foi estabelecido usando sangue ou medula óssea de doadores saudáveis e tecidos com histopatologia normal, que foram todos analisados por um protocolo idêntico ao usado para CEOs. Nos perfis comparativos, os peptídeos que tiveram sucesso só uma vez, ou seja, os peptídeos presentes em apenas uma origem e com contagem baixa de PSM), foram retirados de ambos os conjuntos de dados para ajustes quanto a falsos positivos. A análise comparativa dos dois conjuntos de dados respectivos (ver Figura 2A) revelou 379 proteínas originais de MHC classe I que eram apresentados exclusivamente em CEO em pelo menos três dos pacientes testados de modo a destacar um repertório de peptídeos ligantes de HLA específicos para CEO. As proteínas TOP100 específicas de CEO são mostradas na Figura 2B classificadas de acordo com a frequência de apresentação. Essa análise indicou que a principal proteína original ligante de HLA em CEO foi a mucina 16 (MUC16), também conhecida como antígeno de câncer 125 (CA-125). Ao todo, mais de 80 ligantes diferentes de HLA derivados de MUC16 (ver Tabela 8) eram apresentados em mais de 80% dos pacientes (26/34). TABELA 8
[00379] Esses dados destacam que o processamento e a apresentação da MUC16 por diversos alótipos de HLA é frequente, não encontra paralelo em outros antígenos específicos para CEO e é acompanhado apenas por proteínas de "housekeeping" expressas frequentemente, tais como a beta-actina. Foram identificados um total de 149 peptídeos diferentes. Entre as proteínas-fonte TOP100 específicas para CEO, foram identificados outros antígenos tumorais bem estabelecidos como MUC1 e KLK10, além de antígenos com funções bem documentadas de evasão imune, como indolamina-2,3-dioxigenase (IDO1) e galectina 1 (LGALS1).
[00380] Como as células T CD4 podem suportar ou promover uma resposta imune antitumoral, os inventores usaram a mesma abordagem para analisar melhor os peptídeos apresentados pelo MHC classe II em CEO (n=22). Foram identificados 9.162 peptídeos (média de 598 por amostra), representando 2.330 proteínas-fonte (média de 319 por amostra), atingindo mais de 80% da cobertura possível (ver Figura 7B). O conjunto de dados de ligantes de HLA benignos continha 7.267 peptídeos, que representavam 1.719 proteínas fontes derivadas de medula óssea (n=5), CMSPs (n=13), cólon (n=2), fígado (n=7) e rim (n=17). A análise dos antígenos TOP100 apresentados por MHC classe II revelou um quadro mais heterogêneo e complexo (Figura 2C). Cabe notar que os peptídeos apresentados para o MHC da mesotelina (MSLN), que é um ligante estabelecido de MUC16, pôde ser identificada em quase 50% das pacientes (10 de 22; Figura 2D). O MUC16 não estava entre os antígenos TOP11 de classe II, mas ligantes do mesmo foram detectados em quatro pacientes.
[00381] Além das proteínas TOP100 de CEO ligantes específicas de HLA, os inventores também procuraram antígenos estabelecidos de câncer testicular e antígenos associados a tumores que já foram empregados em aplicações clínicas para caracterizar sua abundância (Her2neu, WT1, NY-ESO-1, hTert e p53). Embora os inventores tenham sido capazes de identificar peptídeos apresentados por HLA de todos os antígenos exceto NY-ESO-1, nenhum deles foi apresentado exclusivamente em CEO (Tabela 9). Os únicos ligantes cuja apresentação foi específica para CEO, mas mesmo assim com baixa frequência (3 de 34), foram os ligantes de HLA classe I (mas não de classe II) do Her2neu. TABELA 9
Exemplo 3: Origem celular dos peptídeos apresentados por HLA associados com CEO
[00382] Como os CEOs não contém apenas células malignas, mas também incluem uma mistura heterogênese de vários tipos celulares, os inventores questionaram se os antígenos TOP100 de MHC classe I estavam realmente presentes nas células malignas. Para essa finalidade, os inventores digeriram as CEOs e separaram leucócitos CD45+, células Tumorais EpCam+ e células estromais negativas para ambos esses marcadores (ver eficiências de enriquecimento na Tabela 10); em seguida, os inventores realizaram análise do ligandoma de HLA separadamente para cada um desses subconjuntos.
TABELA 10: Eficiência do enriquecimento celular:
[00383] Os porcentuais de células são mostrados em cada fração antes (PreSort) e depois do MACSorting
[00384] Os inventores usaram quantificação sem marcação para determinar a fonte de cada ligante de HLA identificado em um total de 5 CEOs. (A Figura 3 apresenta uma amostra representativa). Conforme esperado, os ligantes de HLA derivados de MUC16, que foram identificados em 4 de 5 amostras de CEO, foram sempre sobrerrepresentados em células de câncer enriquecidas, com sobrerrepresentação mediana de 5 vezes (intervalo de 1,8 a 135), dependendo da eficiência do enriquecimento. O mesmo ocorreu para vários outros antígenos TOP100 cuja representação é frequente, tais como DDR1, SOX9, CRABP1/2, EYA2, LAMC2, MUC1 e KLK10. Entretanto, não foi possível demonstrar inequivocamente a presença em células Tumorais de alguns outros antígenos — em especial aqueles sobrerregulados pelo interferon como os receptores do tipo Toll (TLR, "Toll-like receptors") (TLR3, TLR7) ou a proteína sintase semelhante à 2',-5'-oligoadenilato (OASL), mas esses antígenos mostraram forte sobrerrepresentação em linfócitos CD45+ e/ou em células estromais. Além dos antígenos associados a tumores, os inventores também reconheceram que os ligantes de proteínas fonte com expressão específica em tumores celulares. Por exemplo, os ligantes derivados de CD8, CD132 ou proteína específica de linfócitos 1 (LSP1) tiveram forte sobrerrepresentação em células CD45+, e o fator de von Willebrand (vWF), cuja possibilidade de expressão em células estromais, apresentou forte sobrerrpresentação na subpopulação estromal. Esses achados demonstram a capacidade dessa abordagem específica para tipos celulares.
Exemplo 4: Análise da Imunogenicidade de Ligantes Derivados de MUC16
[00385] Para demonstrar a exequibilidade das vacinas peptídicas, a imunogenicidade é imprescindível. Para avaliar o potencial imunogênico dos ligantes de HLA identificados, os inventores usaram um protocolo de "priming" de células T com células apresentadoras de antígenos artificiais e células T isoladas do sangue de doadores saudáveis. A Tabela 11 mostra os resultados dessa análise para o principal antígeno associado ao CEO, que é o MUC16. Dos 23 peptídeos diferentes testados até agora, 18 se mostraram imunogênicos em pelo menos um terço dos doadores. Essa taxa de reconhecimento de quase 80% verifica a presença de células T novas que reconhecem MUC16 em populações humanas. Foram obtidos resultados semelhantes com outros antígenos TOP100 (por exemplo IDO1, LGALS1). TABELA 11: Análise da imunogenicidade de ligantes de HLA apresentados por CEO (MUC16 e CA-125).
Exemplo 5: Biomarcadores da apresentação de ligantes de HLA
[00386] A imunoterapia anticâncer específica para antígenos (por exemplo vacinação com peptídeos, transferência adotiva de células T) requer uma rigorosa seleção de antígenos candidatos em um curto período. Contudo, a análise do ligandoma de HLA nem sempre é possível devido a falta de material apropriado. Uma alternativa exequível seria o uso de biomarcadores para prever a presença de ligantes de HLA em células Tumorais. Para avaliar se a expressão proteica analisada por imunohistoquímica (escore de imunorreatividade, ou IRS) pode servir como marcador substituto da apresentação de ligantes de HLA, os inventores analisaram os antígenos TOP100 de MHC classe I MUC16 e IDO1 e o antígeno TOP100 de MHC classe II MSLN por imunohistoquímica e correlacionaram a intensidade da coloração (Figura 4A) com a presença ou não de ligantes de HLA nos mesmos tumores. Os escores de coloração pra MUC16 e MSLN foram significativamente maiores em tumores com HLAs ligantes dessas proteínas fontes. O mesmo ocorreu com os níveis de CA-125 dosados no dia da cirurgia (Figura 4D). Isso indicou que esses parâmetros podiam ser usados para selecionar antígenos candidatos para vacinação peptídica. Por outro lado, o IDO1 não mostrou associação significativa com a apresentação de ligantes.
Exemplo 6: Relevância prognóstica do eixo MUC16/MSLN
[00387] Devido à sua importância como alvos de imunoterapia, os inventores, queriam avaliar se a MSLN e a MUC16 também possuem relevância prognóstica em pacientes semelhantes ao conjunto que usamos para avaliar imunopeptidomas. Para essa finalidade, os inventores analisaram a expressão de ambos os antígenos e a extensão de infiltração por células T por imunohistoquímica em um "microarray" de tecidos (TMA, "tissue microarray") de tumores serosos malignos de ovário de alto grau (estágios FIGO 2 e 3). Para evitar fatores que pudessem confundir o prognóstico, os inventores restringiram a análise a 71 pacientes submetidas a citorredução ideal dos tumores (massa residual inferior a 1 cm).
[00388] Embora os inventores não tenham observado nenhum efeito prognóstico da coloração para MUC16, colorações fortes para MSLN foram associadas com uma diminuição de significância limítrofe (p=0,0572) da sobrevida geral mediana de 50 para 28 meses (Figura 5A). Apesar das diferenças entre suas relevâncias prognósticas, os escores de coloração para MUC16 e MSLN mostraram correlação direta e altamente significativa (r=0.5237; IC 95%=0.3159-0.6835 e significância bicaudada p<0,001).
[00389] Para avaliar a infiltração por células T, os inventores analisaram separadamente o número de células T CD3 no compartimento intraepitelial do tumor (CD3E) e no estroma fibrovascular (CD3S). Um achado notável é que o número de células T intraepiteliais mostro impacto prognóstico significativo (p<0,0063), ao passo que a infiltração isolada do estroma adjacente não teve nenhuma relevância prognóstica (Figura 5B). Apenas em uma análise de subgrupo que associou MSLN com coloração para CD3 foi observado benefício prognóstico significativo em tumores com MSLN baixo e infiltração elevada de células T (Figura 5C), tanto para CD3E (p<0,001) como para CD3S (p<0,0049). O achado mais saliente foi que a associação de infiltração intramural elevada de células T (CD3E) com baixa coloração para MSLN definiu um subconjunto de pacientes com câncer de sobrevida prolongada (10 de 11 tiveram sobrevida confirmada superior a 3 anos). REFERÊNCIAS CITADAS Allison, J. 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Claims (14)

1. Peptídeo, caracterizado pelo fato de que consiste na sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 2.
2. Peptídeo de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que inclui ligações não-peptídicas.
3. Peptídeo de acordo com a reivindicação 1 ou 2, caracterizado pelo fato de que é parte de uma proteína de fusão, em particular, compreendendo aminoácidos N-terminais da cadeia invariante (Ii) associada ao antígeno HLA-DR.
4. Receptor de célula T, preferivelmente um receptor de célula T recombinante solúvel ou ligado à membrana, caracterizado pelo fato de que é reativo com um ligante HLA, em que o referido ligante consiste na sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 2.
5. Anticorpo, em particular um anticorpo solúvel ou ligado a membrana, caracterizado pelo fato de que reconhece especificamente o peptídeo definido na reivindicação 1, preferivelmente, o peptídeo definido na reivindicação 1, quando ligado a uma molécula de MHC.
6. Ácido nucleico, caracterizado pelo fato de que codifica um peptídeo definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 3, ou um receptor de célula T definido na reivindicação 4, ou um anticorpo definido na reivindicação 5, opcionalmente ligado a uma sequência promotora heteróloga, ou um vetor de expressão que expressa o referido ácido nucleico.
7. Célula hospedeira recombinante, caracterizada pelo fato de que compreende o peptídeo definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 3, ou o ácido nucleico ou o vetor de expressão definidos na reivindicação 6, em que a referida célula hospedeira é, preferivelmente, uma célula apresentadora de antígenos, tal como, uma célula dendrítica.
8. Método para produzir o peptídeo definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 3, ou para produzir o receptor de célula T definido na reivindicação 4, ou o anticorpo definido na reivindicação 5, caracterizado pelo fato de que compreende cultivar a célula hospedeira definida na reivindicação 7, que apresenta o peptídeo definido na reivindicação 1, ou que expressa o ácido nucleico ou o vetor de expressão definidos na reivindicação 6, e isolar o peptídeo, o receptor de célula T ou o anticorpo a partir da célula hospedeira ou do seu meio de cultura.
9. Método in vitro para produzir linfócitos T ativados, caracterizado pelo fato de que compreende: colocar células T em contato in vitro com moléculas de MHC classe I humanas carregadas com antígeno expressas na superfície de células apresentadoras de antígeno adequadas ou uma construção artificial que mimetiza uma célula apresentadora de antígeno por um período suficiente para ativar as referidas células T de forma específica para o antígeno, em que o referido antígeno é um peptídeo definido na reivindicação 1.
10. Linfócito T ativado produzido pelo método definido na reivindicação 9, caracterizado pelo fato de que reconhece seletivamente uma célula que apresenta um polipeptídeo que compreende uma sequência de aminoácidos definida na reivindicação 1.
11. Composição farmacêutica, caracterizada pelo fato de que compreende pelo menos um ingrediente ativo selecionado a partir do grupo que consiste no peptídeo definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 3, no ácido nucleico ou no vetor de expressão definidos na reivindicação 6, na célula definida na reivindicação 7, no linfócito T ativado definido na reivindicação 10, no anticorpo definido na reivindicação 5, ou no receptor de célula T definido na reivindicação 4, e um veículo farmaceuticamente aceitável e, opcionalmente, excipientes e/ou estabilizantes farmaceuticamente aceitáveis.
12. Uso de um peptídeo definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 3, do ácido nucleico ou do vetor de expressão definidos na reivindicação 6, do linfócito T ativado definido na reivindicação 10, ou do anticorpo definido na reivindicação 5, ou do receptor de célula T definido na reivindicação 4, caracterizado pelo fato de ser para a fabricação de um medicamento para medicina, preferivelmente para o diagnóstico e/ou tratamento de câncer.
13. Uso de acordo com a reivindicação 12, caracterizado pelo fato de que o referido câncer é selecionado a partir do grupo de câncer de ovário, câncer de pulmão de células não-pequenas, câncer de pulmão de células pequenas, câncer renal, câncer de cérebro, câncer de cólon ou reto, câncer de estômago, câncer de fígado, câncer de pâncreas, câncer de próstata, leucemia, câncer de mama, carcinoma de células de Merkel, melanoma, câncer de esôfago, câncer de bexiga urinária, câncer uterino, câncer da vesícula biliar, câncer do ducto biliar e outros tumores que apresentam superexpressão de uma proteína da qual o peptídeo de SEQ ID NO: 2 é derivado, em particular câncer de ovário.
14. Kit, caracterizado pelo fato de que compreende: (a) um recipiente que compreende uma composição farmacêutica que contém o peptídeo definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 3, o ácido nucleico ou o vetor de expressão definidos na reivindicação 6, a célula definida na reivindicação 7, o linfócito T ativado definido na reivindicação 10, ou o anticorpo definido na reivindicação 5, ou o receptor de célula T definido na reivindicação 4, em solução ou em forma liofilizada; (b) opcionalmente, um segundo recipiente contendo um diluente ou solução para reconstituição de uma formulação liofilizada; (c) opcionalmente, pelo menos mais um peptídeo selecionado a partir do grupo que consiste em SEQ ID NO: 1 a SEQ ID NO: 549; (d) opcionalmente, instruções para (i) uso da solução ou (ii) reconstituição e/ou uso da formulação liofilizada; e (e) opcionalmente, compreendendo ainda um ou mais de (iii) um tampão, (iv) um diluente, (v) um filtro, (vi) uma agulha, ou (vii) uma seringa.
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