UA124875C2 - Пептид для застосування в імунотерапії епітеліального раку яєчника та інших видів раку - Google Patents

Пептид для застосування в імунотерапії епітеліального раку яєчника та інших видів раку Download PDF

Info

Publication number
UA124875C2
UA124875C2 UAA201712985A UAA201712985A UA124875C2 UA 124875 C2 UA124875 C2 UA 124875C2 UA A201712985 A UAA201712985 A UA A201712985A UA A201712985 A UAA201712985 A UA A201712985A UA 124875 C2 UA124875 C2 UA 124875C2
Authority
UA
Ukraine
Prior art keywords
peptide
cells
cancer
peptides
cell
Prior art date
Application number
UAA201712985A
Other languages
English (en)
Inventor
Гейко Шустер
Жанет Пепер
Філіп Вагнер
Филип Вагнер
Ханс-Георг Рамменсе
Original Assignee
Імматікс Біотекнолоджіс Гмбх
Имматикс Биотекнолоджис Гмбх
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Імматікс Біотекнолоджіс Гмбх, Имматикс Биотекнолоджис Гмбх filed Critical Імматікс Біотекнолоджіс Гмбх
Publication of UA124875C2 publication Critical patent/UA124875C2/uk

Links

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K35/00—Medicinal preparations containing materials or reaction products thereof with undetermined constitution
    • A61K35/12—Materials from mammals; Compositions comprising non-specified tissues or cells; Compositions comprising non-embryonic stem cells; Genetically modified cells
    • A61K35/14—Blood; Artificial blood
    • A61K35/17—Lymphocytes; B-cells; T-cells; Natural killer cells; Interferon-activated or cytokine-activated lymphocytes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K7/00—Peptides having 5 to 20 amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof
    • C07K7/04—Linear peptides containing only normal peptide links
    • C07K7/06—Linear peptides containing only normal peptide links having 5 to 11 amino acids
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/70—Carbohydrates; Sugars; Derivatives thereof
    • A61K31/7088—Compounds having three or more nucleosides or nucleotides
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/0005—Vertebrate antigens
    • A61K39/0011—Cancer antigens
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/46—Cellular immunotherapy
    • A61K39/461—Cellular immunotherapy characterised by the cell type used
    • A61K39/4611—T-cells, e.g. tumor infiltrating lymphocytes [TIL], lymphokine-activated killer cells [LAK] or regulatory T cells [Treg]
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/46—Cellular immunotherapy
    • A61K39/464—Cellular immunotherapy characterised by the antigen targeted or presented
    • A61K39/4643—Vertebrate antigens
    • A61K39/4644—Cancer antigens
    • A61K39/464466—Adhesion molecules, e.g. NRCAM, EpCAM or cadherins
    • A61K39/464468—Mesothelin [MSLN]
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/46—Cellular immunotherapy
    • A61K39/464—Cellular immunotherapy characterised by the antigen targeted or presented
    • A61K39/4643—Vertebrate antigens
    • A61K39/4644—Cancer antigens
    • A61K39/464469—Tumor associated carbohydrates
    • A61K39/46447—Mucins, e.g. MUC-1
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A61P35/02—Antineoplastic agents specific for leukemia
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A61P37/02—Immunomodulators
    • A61P37/04—Immunostimulants
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/46—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates
    • C07K14/47—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates from mammals
    • C07K14/4701—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates from mammals not used
    • C07K14/4727—Mucins, e.g. human intestinal mucin
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/46—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates
    • C07K14/47—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates from mammals
    • C07K14/4701—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates from mammals not used
    • C07K14/4748—Tumour specific antigens; Tumour rejection antigen precursors [TRAP], e.g. MAGE
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/705—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants
    • C07K14/70503—Immunoglobulin superfamily
    • C07K14/7051—T-cell receptor (TcR)-CD3 complex
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/705—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants
    • C07K14/70503—Immunoglobulin superfamily
    • C07K14/70539—MHC-molecules, e.g. HLA-molecules
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/2803—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against the immunoglobulin superfamily
    • C07K16/2833—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against the immunoglobulin superfamily against MHC-molecules, e.g. HLA-molecules
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/30—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants from tumour cells
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K7/00—Peptides having 5 to 20 amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof
    • C07K7/04—Linear peptides containing only normal peptide links
    • C07K7/08—Linear peptides containing only normal peptide links having 12 to 20 amino acids
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
    • C12N15/115—Aptamers, i.e. nucleic acids binding a target molecule specifically and with high affinity without hybridising therewith ; Nucleic acids binding to non-nucleic acids, e.g. aptamers
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
    • C12N5/0602—Vertebrate cells
    • C12N5/0634—Cells from the blood or the immune system
    • C12N5/0636—T lymphocytes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P21/00—Preparation of peptides or proteins
    • C12P21/02—Preparation of peptides or proteins having a known sequence of two or more amino acids, e.g. glutathione
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6876—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes
    • C12Q1/6881—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for tissue or cell typing, e.g. human leukocyte antigen [HLA] probes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6876—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes
    • C12Q1/6883—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for diseases caused by alterations of genetic material
    • C12Q1/6886—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for diseases caused by alterations of genetic material for cancer
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/574—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for cancer
    • G01N33/57484—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for cancer involving compounds serving as markers for tumor, cancer, neoplasia, e.g. cellular determinants, receptors, heat shock/stress proteins, A-protein, oligosaccharides, metabolites
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/505—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising antibodies
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/51—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising whole cells, viruses or DNA/RNA
    • A61K2039/515—Animal cells
    • A61K2039/5158—Antigen-pulsed cells, e.g. T-cells
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
    • C12N2310/10—Type of nucleic acid
    • C12N2310/16—Aptamers
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2510/00—Genetically modified cells
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
    • C12Q2600/136—Screening for pharmacological compounds
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
    • C12Q2600/156—Polymorphic or mutational markers
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
    • C12Q2600/158—Expression markers
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2333/00—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature
    • G01N2333/435—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature from animals; from humans
    • G01N2333/705—Assays involving receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • G01N2333/70503—Immunoglobulin superfamily, e.g. VCAMs, PECAM, LFA-3
    • G01N2333/70539—MHC-molecules, e.g. HLA-molecules
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2500/00—Screening for compounds of potential therapeutic value
    • G01N2500/04—Screening involving studying the effect of compounds C directly on molecule A (e.g. C are potential ligands for a receptor A, or potential substrates for an enzyme A)

Abstract

Винахід стосується пептиду, нуклеїнової кислоти, вектора, клітини-хазяїна, Т-клітинного рецептора, активованого Т-лімфоциту, фармацевтичної композиції, терапевтичного комплекту та їх застосування в імунотерапії раку.

Description

Цей винахід стосується пептидів, білків, нуклеїнових кислот та клітин для їх застосування в імунотерапії. Зокрема, цей винахід стосується імунотерапії раку. Цей винахід також стосується епітопів пухлино-асоційованих пептидів Т-клітин, які самостійно або в комбінації з іншими пухлино-асоційованими пептидами можуть, наприклад, служити активними фармацевтичними інгредієнтами композицій вакцин, які стимулюють протипухлинні імунні відповіді, або стимулювати Т-клітини ех мімо з їх перенесенням в організм пацієнта. Пептиди, зв'язані з молекулами головного комплексу гістосумісності (МНС), або пептиди як такі можуть також бути мішенями для антитіл, розчинних Т-клітинних рецепторів та інших зв'язувальних молекул.
Цей винахід стосується декількох нових пептидних послідовностей та їх варіантів, отриманих із молекул НГА І класу, а також із молекул НГА ІІ класу пухлинних клітин людини, які можуть застосовуватися у вакцинних композиціях з метою викликати протипухлинну імунну відповідь або являють собою мішені для розробки фармацевтично або імунологічно активних сполук і клітин.
ПЕРЕДУМОВА СТВОРЕННЯ ВИНАХОДУ
Епітеліальний рак яєчника (ЕРЯ) залишається головною причиною смерті від злоякісних гінекологічних пухлин і п'ятою серед головних причин смерті від раку у західному світі, яка призвела орієнтовно до 22 000 вперше діагностованих хворих і 14 000 смертей у США у 2014 році(1). Єдиним наявним варіантом радикального лікування є повне хірургічне видалення пухлини на ранній неметастатичній стадії. Однак більшість пацієнтів (270 95) діагностується на стаді захворювання ШШ або ІМ, що пояснюється відсутністю ранніх специфічних симптомів.
Незважаючи на прогрес у хіміотерапевтичних схемах і нещодавно отриманий дозвіл використовувати бевацизумаб для терапії першої лінії, у більшості пацієнтів спостерігається рецидив протягом декількох місяців або років після первинного лікування (2, 3).
Зважаючи на важкі побічні ефекти і витрати, пов'язані з лікуванням раку, існує потреба ідентифікувати фактори, які можливо буде використовувати для лікування раку взагалі і раку яєчника зокрема. Є також потреба в ідентифікації інших чинників, які виконують роль біомаркерів раку взагалі і раку яєчника зокрема, які забезпечать кращу діагностику раку, оцінку прогнозу і передбачення успіху лікування.
Імунотерапія раку являє собою варіант специфічного націлювання на ракові клітини, у той
Зо же час зводячи до мінімуму побічні ефекти. У імунотерапії раку використовується існування пухлино-асоційованих антигенів. Сучасна класифікація пухлино-асоційованих антигенів (ТАА) охоплює наступні головні групи: а) Раково-тестикулярні антигени: Перші будь-коли ідентифіковані ТАА, які можуть бути розпізнані Т-клітинами, належать до цього класу, які були спочатку названі раково- тестикулярними (СТ) антигенами завдяки експресії його представників у гістологічно різних пухлинах людини і, поряд із нормальними тканинами, тільки в сперматоцитах/сперматогоніальних клітинах яєчок і іноді в плаценті. Оскільки клітини яєчок не експресують молекули НГА І та ІЇ класу, ці антигени не можуть розпізнаватися Т-клітинами у нормальних тканинах і можуть, таким чином, вважатися пухлинно-специфічними, з точки зору імунології. Добре відомими прикладами СТ антигенів є члени сімейства МАСЕ і МУ-ЕБО-1. б) Антигени диференціації: Ці ТАА розподілені між пухлинами та нормальними тканинами, з яких виникла пухлина. Більшість з відомих антигенів диференціації знайдена в меланомах і нормальних меланоцитах. Багато цих білків, пов'язаних із диференціацією у меланоцити, беруть участь у біосинтезі меланіну і тому не є пухлино-специфічними, але, тим не менше, широко застосовуються для імунотерапії раку. Приклади включають, без обмеження, тирозиназу і Меіап-А/МАВТ-1 для меланоми або ПСА для раку передміхурової залози. в) Надмірно експресовані ТАА: Гени, що кодують ТАА, які широко експресуються, були виявлені в гістологічно різних типах пухлин, а також у багатьох нормальних тканинах, загалом з нижчими рівнями експресії. Можливо, що багато епітопів, що були процесовані і, можливо, презентовані нормальними тканинами, присутні у кількості, що нижча за пороговий рівень розпізнання Т-клітинами, в той час як їх надекспресія в пухлинних клітинах може запустити антиракову реакцію, порушивши раніш встановлену толерантність. Відомими прикладами для цього класу ТАА є Нег-2/пеи, сурвівін, теломераза або М/11. г) Пухлино-специфічні антигени: Ці унікальні ТАА утворюються в результаті мутацій нормальних генів (таких як бета-катенін, СОК4 тощо). Деякі з цих молекулярних змін зв'язані з неопластичною трансформацією і (або) прогресуванням пухлини. Пухлино-специфічні антигени загалом можуть викликати сильні імунні відповіді, не спричиняючи ризику аутоїмунних реакцій проти нормальних тканин. З іншого боку, ці ТАА у більшості випадків мають відношення тільки до певної пухлини, на якій вони були ідентифіковані, і зазвичай не є спільними для багатьох бо окремих пухлин. Специфічність пептиду до пухлини (або асоціація з пухлиною) може також виникати, якщо пептид походить із екзону пухлини (пухлино-асоційованого екзону) у випадку білків з пухлиноспецифічними (-асоційованими) ізоформами. д) ТАА, що виникають в результаті посттрансляційних модифікацій: Такі ТАА можуть виникати з білків, які не є ні специфічними, ні надмірно експресованими у пухлинах, але, незважаючи на це, стають асоційованими з пухлинами в результаті посттрансляційних процесів, первинно активних у пухлинах. Прикладами ТАА цього класу є антигени, що виникають в результаті змін характеру гликозилювання, що приводить до утворення у пухлинах нових епітопів, таких як МОСТІ, або таких подій як білковий сплайсинг під час деградації, які можуть бути пухлино-специфічними, а можуть і не бути. е) Онковірусні білки: Ці ТАА є вірусними білками, які можуть відігравати вирішальну роль в онкогенному процесі і, оскільки вони є чужорідними (не походять від людини), вони можуть викликати відповідь Т-клітин. Прикладами таких білків є білки вірусу папіломи людини типу 16,
Еб і Е7, які експресуються клітинами карциноми шийки матки.
На протязі останніх двох десятиріч ЕРЯ був визнаний високоїмуногенною пухлиною, виходячи з різноманітних клінічних результатів. Демонструючи часті випадки інфільтрації імунними клітинами, ЕРЯ був одним із перших ракових захворювань, за яких виявилося можливим встановити остаточний зв'язок інфільтрації Т-клітинами і клінічного прогнозу. У цій популяції інфільтруючих Т-клітин були ідентифіковані Т-клітини з протипухлинною активністю і антиген-специфічні Т-клітини. На відміну від цього, внутрішньопухлинні Т-клітини (Тгедз) негативно корелюють із кінцевим клінічним результатом. До того ж, було показано, що імуностимулюючі цитокіни викликають незрівнянні пухлинні відповіді у індивідуальних пацієнтів.
Ефективність імунотерапевтичних підходів до протиракової терапії на прикладі лікування меланоми була проілюстрована нещодавньою розробкою і дозволом на використання інгібіторів, які діють на імунні контрольні точки. Більш того, вакцинація антиген-специфічними пептидами і адоптивне перенесення Т-клітин почали демонструвати ефективність при лікуванні меланоми та інших імуногенних пухлин, наприклад, нирково-клітинної карциноми.
Персоналізована імунотерапія навіть демонструє цілющий потенціал, і отримані вражаючі результати для індивідуальних пацієнтів.
Мішенями імунотерапії з використанням Т-клітин є пептидні епітопи, отримані з пухлино-
Зо асоційованих або пухлино-специфічних білків, які презентуються молекулами головного комплексу гістосумісності (МНС). Антигенами, які розпізнаються пухлино-специфічними Т- лімфоцитами, тобто їхніми епітопами, можуть бути молекули, що отримані з усіх класів білків, таких як ферменти, рецептори, фактори транскрипції тощо, які експресуються і, у порівнянні з незміненими клітинами того ж походження, активність яких підвищена у клітинах відповідної пухлини.
Існує два класи молекул МНС, МНС | класу і МНС І класу. Молекули МНС І! класу складаються з альфа-важких ланцюгів і бета-2-мікроглобуліну, молекули МНС | класу складаються з альфа- і бета-ланцюгів. Їхня тримірна конформація приводить до утворення зв'язувальної щілини, що використовується для нековалентної взаємодії з пептидами.
Молекули МНС І класу можна виявити в більшості клітин, що мають ядро. Вони презентують пептиди, які утворюються в результаті розщеплення протеолітичними ферментами переважно ендогенних білків, дефектних рибосомальних продуктів (ОКІР) та більш великих пептидів.
Однак пептиди, одержані з ендосомальних компартментів чи екзогенних джерел, також часто зустрічаються на молекулах МНС | класу. Цей некласичний спосіб презентації | класом називається у науковій літературі крос-презентацієй (Вго55ап апа Вемап, 1997; Носк еї аї., 1990). Молекули МНС Ії класу містяться головним чином на професійних антигенпрезентуючих клітинах (АПК) і презентують головним чином пептиди екзогенних або трансмембранних білків, які поглинаються АПК в ході ендоцитозу і згодом процесуються.
Комплекси пептидів і молекул МНС І класу розпізнаються СО8-позитивними Т-клітинами, що несуть відповідний Т-клітинний рецептор (ТКР), в той час як комплекси пептиду і молекул МНС
МП класу розпізнаються СО4-позитивними Т-хелперами, що несуть відповідний ТКР.
Загальновідомо, що ТКР, пептид і МНС, таким чином, є присутніми у стехіометричних кількостях у співвідношенні 1:1:1.
Сора-позитивні Т-хелпери відіграють важливу роль, викликаючи та підтримуючи ефективну відповідь СЮО8-позитивних цитотоксичних Т-клітин. Ідентифікація епітопів СО4-позитивних Т- клітин, отриманих із пухлино-асоційованих антигенів (ТАА), може мати велике значення під час розробки фармацевтичних засобів для ініціювання протипухлинних імунних реакцій (Спайс єї а. 2003). У місці локалізації пухлини Т-хелперні клітини підтримують сприятливе для цитотоксичних Т-клітин (ЦТЛ) цитокінове середовище (Мопага єї аї., 2006) і притягують ефекторні клітини, такі як ЦТЛ, природні кілерні (МК) клітини, макрофаги і гранулоцити (Нжапд еїа!., 2007).
За відсутності запалення експресія молекул МНС Ії класу обмежується головним чином клітинами імунної системи, особливо професійними антиген-презентуючими клітинами (АПК), наприклад, моноцитами, клітинами, що походять з моноцитів, макрофагами, дендритними клітинами. Було виявлено, що клітини пухлин у хворих на рак пацієнтів експресують молекули
МНЄе Ії класу (Оеєпадіеї! єї а!., 2006).
Подовжені (довші) пептиди за винаходом можуть діяти як епітопи, активні по відношенню до молекул МНС ІІ класу.
Т-хелперні клітини, активовані зв'язаними з молекулами МНС ІІ класу епітопами, відіграють важливу роль в регуляції ефекторної функції ЦТЛ у протипухлинному імунітеті. Епітопи Т- хелперних клітин, які ініціюють реакцію Т-хелперів типу ТНІ, підтримують ефекторні функції
СОв-позитивних Т-кілерів, котрі включають цитотоксичні функції, спрямовані проти клітин пухлини, що презентують комплекси пухлино-асоційованого пептиду/мМмНС на поверхнях своїх клітин. У такий спосіб епітопи пухлино-асоційованих пептидів Т-хелперів самостійно або в комбінації з іншими пухлино-асоційованих пептидами можуть служити активними фармацевтичними інгредієнтами композицій вакцин, які стимулюють протипухлинні імунні реакції.
На моделях тварин-ссавців, наприклад, на мишах, було показано, що навіть за відсутності
СОрв8-позитивних Т-лімфоцитів, присутності СЮО4-позитивних Т-клітин виявляється достатньо для послаблення клінічних проявів пухлин шляхом інгібування ангіогенезу за рахунок секреції інтерферону-гамма (ІФН-у) (Вєайну апа Раїегзоп, 2001; Митрбега еї а!., 1999). Існують докази, що
Т-клітини є ефекторними клітинами прямої протипухлинної дії (ВгайтиїПег еї а!., 2013; Тгап еї аї., 2014).
Оскільки конститутивна експресія молекул НГ А ІІ класу зазвичай обмежується клітинами імунної системи, раніше вважалося неможливим виділити пептиди ІЇ класу безпосередньо з первинних пухлин. Однак ЮОепадіеІ і співавт. вдалося ідентифікувати декілька зв'язаних з молекулами МНС ІІ класу епітопів безпосередньо із пухлин (ММО 2007/028574, ЕР 1 760 088 В1).
Оскільки обидва типи відповіді, залежні від СО8 та СО4, спільно та синергічно роблять свій
Зо внесок у протипухлинну дію, для розробки протипухлинних вакцин важливими є ідентифікація та визначення характеристик пухлино-асоційованих антигенів, які розпізнаються або СОвТ- клітинами (ліганд: молекули МНС | класу ї- пептидний епітоп), або СО4- позитивними Т- хелперними клітинами (ліганд: молекули МН ІІ класу т пептидний епітоп).
Щоб пептид, зв'язаний з молекулою МНС Іі класу, ініціював (викликав) клітинну імунну відповідь, він також має зв'язатися з молекулою МНС. Цей процес залежить від алеля молекули
МНС ії специфічних поліморфізмів амінокислотної послідовності пептиду. Пептиди, що зв'язуються з молекулами МНС | класу, зазвичай мають 8-12 амінокислотних залишків у довжину і зазвичай містять два консервативні залишки ("якорі") у своїй послідовності, які взаємодіють з відповідною зв'язувальною щілиною молекули МНС. У такий спосіб кожний алель
МНС має "зв'язувальний мотив", що визначає, які пептиди зможуть специфічно зв'язатися зі зв'язувальною щілиною.
В імунній реакції, залежній від молекул МНС І класу, пептиди не тільки мають бути здатними зв'язатися з певними молекулами МН І класу, що експресуються клітинами пухлини, але вони також мають розпізнаватися Т-клітинами, що несуть специфічний Т-клітинний рецептор (ТКР).
Для того, щоб білки розпізнавалися Т-лімфоцитами як пухлино-специфічні або пухлино- асоційовані антигени, та щоб їх було можливо застосовувати в терапії, необхідно створити особливі передумови. Антиген має експресуватися, головним чином, пухлинними клітинами і не експресуватися або експресуватися у порівняно невеликих кількостях нормальними здоровими тканинами. В переважному втіленні вищезгаданий пептид має надмірно презентуватися пухлинними клітинами у порівнянні з нормальними здоровими тканинами. До того ж бажано, щоб відповідний антиген не тільки був присутнім у пухлині певного типу, але також був присутнім у високих концентраціях (тобто як декілька копій відповідного пептиду на клітину).
Пухлино-специфічні та пухлино-асоційовані антигени часто отримують із білків, які беруть безпосередню участь у трансформації нормальної клітини в пухлинну клітину, завдяки їх функції, наприклад, в контролі клітинного циклу або пригніченні апоптозу. Крім цього, низхідні мішені білків, що також є безпосередньою причиною трансформації, можуть мати підвищену експресію і, таким чином, можуть бути опосередковано пухлино-асоційованими. Такі опосередковано пухлино-асоційовані антигени також можуть бути мішенями у вакцинаційному підході (біпдп-Уазціа єї а!., 2004). Важливим є те, щоб в амінокислотній послідовності антигену були присутні епітопи, оскільки такий пептид ("їмуногенний пептид"), отриманий із пухлино- асоційованого антигену, має приводити до відповіді Т-клітин іп міїго або іп мімо.
По суті, будь-який пептид, що здатний зв'язуватися з молекулою МНС, може відігравати роль епітопу Т-клітини. Передумовою індукції відповіді Т-клітин іп міго або іп мімо є присутність
Т-клітин із відповідним ТКР і відсутність імунологічної толерантності до цього конкретного епітопу.
Таким чином, ТАА є стартовою точкою для розробки Т-клітинної терапії, включаючи, але не обмежуючись ними, протипухлинні вакцини. Методи ідентифікації та визначення характеристик
ТАА зазвичай базуються на використанні Т-клітин, які можна виділити з організму пацієнтів або здорових суб'єктів, або вони грунтуються на генерації різних профілів транскрипції або різному характері експресії пептидів тканинами пухлин і нормальними тканинами. Проте ідентифікація генів, які надмірно експресуються пухлинними тканинами або лініями пухлинних клітин людини, або селективно експресуються в таких тканинах або клітинних лініях, не дає точної інформації щодо використання антигенів, що кодуються цими генами, в імунній терапії. Причиною цього є те, що тільки окрема субпопуляція епітопів цих антигенів придатна для такого застосування, оскільки має бути присутня Т-клітина з відповідним ТКР, і імунологічна толерантність по відношенню до цього епітопу повинна бути відсутньою або мінімальною. Отже, у більш переважному втіленні цього винаходу важливо вибрати тільки ті надмірно або селективно презентовані пептиди, проти яких можна знайти функціонуючу Т-клітину і (або) Т-клітину, здатну до проліферації. Така функціонуюча Т-клітина визначається як Т-клітина, яка за стимуляції специфічним антигеном може бути клонована і здатна виконувати функції ефектору
Сефекторна Т-клітина").
У випадку націлювання специфічних ТКР (наприклад, розчинних ТКР) і антитіл або інших зв'язувальних молекул (каркасів) за цим винаходом імуногенність базових пептидів є вторинною. У цих випадках визначальним фактором є презентація.
КОРОТКЕ ФОРМУЛЮВАННЯ СУТНОСТІ ВИНАХОДУ
Згідно з першим аспектом цього винаходу, пропонується пептид, що містить амінокислотну послідовність, вибрану з групи послідовностей від ЗЕО ІЮ МО: 1 до 5ЕО ІЮ МО: 549 або варіант його послідовності, який принаймні на 7795, переважно принаймні на 8895 гомологічний
Зо (переважно принаймні на 77 95 або принаймні на 88 95 ідентичний) послідовності від ЗЕО ІЮ МО: 1 до 5ЕО ІЮ МО: 549, де згаданий варіант зв'язується з МНС і (або) викликає перехресну реакцію Т-клітин із згаданим пептидом або його фармацевтично прийнятною сіллю, де згаданий пептид не є базовим повнорозмірним поліпептидом.
Цей винахід також стосується пептиду, що містить послідовність, вибрану з групи послідовностей від 5ЕО ІЮ МО: 1 до 5ЕО ІЮ МО: 549 або його варіанту, який принаймні на 77 Об, переважно принаймні на 88 95 гомологічний (переважно принаймні на 77 95 або принаймні на 88 95 ідентичний) послідовності від «ЕО ІЮ МО: 1 до ЗЕО ІЮ МО: 549, де згаданий пептид або його варіант має загальну довжину між 8 і 100, переважно між 8 і 30 і найбільш переважно між 8 і 14 амінокислот.
У нижче наведеній таблиці описані пептиди за цим винаходом, їх відповідні зЗЕО ІЮ МО і очікувані вихідні (основні) гени для пептидів. Усі пептиди у Таблиці 1 і Таблиці 2 зв'язуються з
НІГА-А"02. Пептиди Таблиці 2 були розкриті раніше у великих списках як результати високопродуктивного скринінгу з великою частотою помилок або були розраховані з використанням алгоритмів, але їхній зв'язок з раковими захворюваннями взагалі не був встановлений. Пептиди, наведені у Таблиці 3, є додатковими пептидами, які доцільно використовувати у комбінації з іншими пептидами за винаходом. Наведені у Таблиці 4 пептиди також можуть використовуватися в діагностиці і (або) лікуванні різних інших злоякісних пухлин, пов'язаних з надмірною експресією або надмірною презентацією відповідних базових поліпептидів.
Таблиця 1
Пептиди за цим винаходом; Х-5, К або б 11176 ФОАСТРІМТЇ 77777777 |мОСі6 |В'ЄО! 111178 ФОРУКАТАМ 77777777 |мМОСі6 |В'ї С/г: 71179 ФЕРЕТТТ5ЕТМ 77777777 |мОСі6 86777777:
Таблиця 1
Пептиди за цим винаходом; Х-5, К або б 60 |5ТА5Б5БІЗК 77777777 |МОСІ6 ФАЧ:7/7/7/:Г 66 (|ТЕББ5Б5ВТБІ 77777777 |мОСі6 |8в'Яб! 77 68 (|ТЕТЕАІНМЕГ/////77777777777777777 0 |мОСі6 |вч8 77777 1.69 (ТЕУ5АТЕМ 77777777 |моСі6 |8в'Яб! 7777 1180 |МРОРБКАББАМ 77777777 |мМОСі6 |8'ЗЄ5777////7:Г 1186 (БЕАОРРАРМАЇГ///7777777777777771ЕБ5В1! (А 797 11789 ФАРНІНІЄААГ//////777777777777777 |КІКтбо о |В'бЄЄТТ 1780 |ВАСАКР 77777777 |КІКто |В'ОВЛАТ? 97 11796 |МРЕООРОМТ. 77777777 |ммР7 86777777: 11798 (МЕЕНМЕУМИ 77777777 Ф(ЕМА2 /|8'ЯЮ?Т 7:97 1.89 (|мМаблатТРК 77777777 Ф1ЕМА?2 ФАЗ 77
Таблиця 1
Пептиди за цим винаходом; Х-5, К або б
Таблиця 1
Пептиди за цим винаходом; Х-5, К або б
Таблиця 2
Додаткові пептиди за цим винаходом; Х-5, К або б 180 |ОКАЄЕТААТТЕУА Г/Л |мосСі6 7777777: 181 фЕСОРУТОВМБІМММ 7777777 07 |мосі6 77/77/7777 182 Ф|ЕСОРУТОВМБІМММО 77777777 07 |мосі677/7/7/7/7/: 183 |БОКАРЕТААТТЕУЗА Г/Л |мОСі6 7777777: 184 фОаРУТОВМБІМУМ 77777777 07 |мосі6в6777/7/7/77/:7Г 185 фСаРУТОВОБІМММ 77777777 07 |мосі677/7/7/7/7/: 186 фСаРУТОВМБІМММ 77777777 07 |мосі6777/7/7/77/:7Г 187 фСаРУТОВМВІМММО 77777777 07 |мосі677/7/7/77/: 188 |5ТЕТТВІТЕРЕМТЯЇГ/-:/77777777 07 |мосі67777777/7Г 189 фЕОМЕОАОСМІКН 77777777 0 |ммР;7 - 190 фЕСОМЕОАОСМІКНЕ. //:/77777777 0 |ммР;7 5 Ф Ф 1191 |СІМЕСМААТНЕСЯНВ 77777777 07 |мММР;7 -/- Ф 192 Ц(СОМЕОАОЮСМІКВ. 77777777 07 |ммР;7 -/- 193 Ц(СОМЕОАОСМІКВЕ 77777777 07 |ммР;7 - 194 |5ЕОМЕОАО0СМІКА 77777777 0 |ммР;7 - 195 |5ЕОМЕОАОСМІКНЕ. Г/Л |ммР;7 - Ф 1196 |МРУМЕТРУРОРА.ЇГ//:/77777777777777 07 (ЕРБВЛ ГГ 11197 |УМРУМІТРУРОРАЇГ/-/-/777777777777 07 (ЕРБВЛГ/// 198 ОММУКІИВБЕМЕЕЕЄ 77777777 07 |ЇСВАВР27///7/7//:У 17199 ОММУКІВБЕМЕЕБНІК 77777777 0 |СВАВР27////:З 200 |ММУКІВБЕМЕЕЕЄ 77777777 07 |ЇСВАВР2/////: 201 |РМЕБОММУКІВБЕМЕ Г/Л |ЇСВАВР2/////:З 11202 |ММІВКІАУДААБКРАЇГ//-://. ЛИ |ЇСВАВР27//////:ЗУ ТЦ 203 |МУКІВБЕМРЕЕЄ 77777777 0 |ЇСВАВР2/////: 204 Ц(ОВУ55ОРТОАІТ 77777777 07 (вс 7/7: 205 |МРІТМОМОУМРЕОК.ЇГ/-:/777777777 (| (БсВ/--З
Таблиця 2
Додаткові пептиди за цим винаходом; Х-5, К або б 206 |МРТТМОМОУМРЕОКУ //-:7777777 07 (вав //:З 207 ф|рроабоєууттМРУММОЇ /-::/ 7 077777 (со: 208 |ОКЕОКУРУВІТООСАЮТРРЇГ/:/. 07777 (со: 77777777 209 |ОКЕОКУРУВІТООСАЮСТРРМЇГ/-:/ Г/Л 7/7 (со: 77/77/7777 210 фокмметімамМтаміїдГ//777777777777 0777 (соті: 77777777 211 фокмметімамтамієЇдГ 77777777 07777 (сот: 212 ФОРБЕІРОКММЕТІМАМТОЇГ/-:77777 077 (со: 7777/7777 213 ФОРЕІРОКММЕТІМАМТОМІЇ 077 (со: 77777777 214 ФОРЕІРОКММЕТІМАМТОМІЗЇГ/-/-:/ 0777 (со: 77777777 215 |ОРЕІРОКММЕТІМАМТОМІЗМ.Ї 077 (со: 77777777 216 Ф(ОРЕІРОКММЕТІМАМТаМІЗУММЇд/-: 0777 (со: 77777777 217 |ОРЕІРОКММЕТІМАМТаМІЗУМТЇГ/- 07777 (со: 218 |ОММТУМААІАУТИВ -/-:/ 7 0 (со: 219 |ОММТУМААІАУТИЗО -::/ 7 07 (со: 220 |вОКУРУБІТаОбАЮТ Г/Л (соті: 221 |ЕОКУЕУБІТООСАЮТРРЇГ/:/.777 07777777 (со: 222 |БОКУМЕУБІТООСАЮТРРМ.ЇГ/:. 07777777 (со: 223 |БРОКММЕТІМАМТОМІЗЇГ/-/-: 7 0777 (со: 77777777 224 фаоОгУМтТтМРУММ 77777777 077 (со: 77777777 225 ф|акуЕуВІТаОвАЮСТ 77777777 07777777 (со: 12286 |ОРЕРКМІМОК5МКОК.ЇГ//::/ 0777 (со: 77777777 1227 |ОРЕРКМІМОК5МКОКЕ /-:/ 07 (со: 7777/7777 228 |ОРЕРКМІМОК5МКОКЕОК. Г/Л 77777 (со: 77777777 229 |кмМметІМАМТаМІ 77777777 07777 (соті 230 ф|кмметімАМТаМіІЄЇГ//-/-//7777777777777 07777 (со: 231 ЦіІРОКММЕТІМВМТОЇГ/-: 77777777 0777 (со: 232 Ц|ІРОКММЕТІМВМТОМЇ 77777777 07777 (со 233 Ц|ІРОКММЕТІМВМТОМІЗЇГ/-:/ 7777 0777 (со: 77777777 234 |РЕРОКММЕТІМАМТОМІЇ //-: 7 077 (со: 235 |РЕРОКММЕТІМАМТОМІЄЇ /-/-:/ 077 (со: 77777777 236 |ООРБІРОКММЕТІМАМТОМІЄЇ /-/-:/ 0777 (со: 77777777 237 |5ООРЕІРОКММЕТІМАМТОМІЄЇ 07 7 (со: 77777777 238 |5ООРЕІРОКММЕТІМАМТаМІЗУМТ 07 7 (со 7777 239 |5МРВАМІРВРАМРОЕЇ /-:/ 77777777 077 (со:777777777 240 |ТООМІТУКВРІВЕНМРО Г-/-:/ 7 077777 (со: 7777/7777 241 |ТВАБЕОВЕОРЕНУК.ДГ/:/.////77777777777 077777 (соті: 242 |МРВМІРВРАМРОЄЇГ/-:/ 77777777 077 (сон:77777777Г 243 ФАЕРВАГЕРОСІ Г/Л фАсВМ7777//7/:У 1244 ФАЕЕВАЕРОСИ Г/Л фАсВМ777//7/:У 11245 |ОТВІЕРУМРАРРУЇГ/::777777777777777 0 ФАСВАМ7/////:/ 11246 |ОТВІРРУМРАРРУЇГ/://77777777777777 07 ФАСВАМ7/////: 1247 |ОТВІРРУМРАРРУЮМЇГ/:/77777777777 07 ФАСВАМ7/////:/ 1248 |ОТВІРРУММРАРРМІМІРГ//77777777 07 ФАСВАМ7/////:/ 249 |ОТВІРРУМРАРРУМРАЇГ/-:7777 ЛИ ФАСВАМ7/////: 250 (ЕЕВАСТЕРОВІ Г/Л фАсВМ77///7/: 251 |ОАРУРАРЕОНБЗЕСАЄРТІЇГ/-/-/ ЛИ ФАСАМ/////: о 2Б2 |ООТВІЄРММРАРРМІМРГ/7777 07 ФАСВАМ/////: 253 |ООТВІЄРММРАРРУМРА Г/Л ФАСВАМ/////:У 254 ДМОУНЕОРТТАЕВАРОЇГ/:/.77777777 0 фАСВАМ77/////:У 255 |КУВУМВАМІКОКОЇМАВ 77777777 07 фАбВМ777/7/7/7/: 256 ДГАГЕРВАГЕРОСІЇ Г/Л ФАСАМ7////7/:/ 257 ЦДЕЕВАСЕРОВІИ Г/Л ФАСВАМ77/////:У 258 |БОРЕГАОЕМОЕЄЗН./З77777777777 07 фАсВМ7777/7///:У
Таблиця 2
Додаткові пептиди за цим винаходом; Х-5, К або б 259 |ТООТВІРРММРАРРУМУРА Г/Л ФАСАМ7/////: 260 |ТВІЕЕММРАРРУСЇ Г/Л ФАСВАМ7/////:/ 261 |МОУНЕОРТТАЕВАРОЇГ//://7777777777 ЛИ фАСВМ77///7/:У 262 |МОУНЕОРТТАЕВАРОМ.ЇГ//:/77777777 ЛИ фАСВАМ77////7/:У 263 |МВУМВМІКОКОЇМАВ Г/Л фАсВМ77/7/7/7/: 1264 |АРУРАРЕСНЗЕАЕРТГ/З/7 ЛИ ФЇАСАМ7/////:У/ 265 |АРУРАРЕСНЗЕАЕРТІ.ЇГ/-// ЛИ ФЇАСВМ7/////:У 266 Ф(АІВОШРМООРІИВ 77777777 07 ЇмМ5ІчГ7/7/7/7/:Г 267 |0ІРОВРУАЕЗАЕМІР.//-/-:// ЛИ МБ Г77/7/7/:Г 268 |ОІРОВЕРУАЕЗАЕМІРН.ЇГ/-:// ЛИ МБ мМ Г7/7/7/:Г 269 |ООРІВБІРОВІМ Г-/-::/ 7777 07 Їм5ІчГ/7/7/7/Г 270 |ООРИІВБІРОВІМА.ЇГ//://///:/:////://Г/ 07 ЇмМ5ІМГ/7/7/Г 271 (ДСЗОРИВБІРОСІМА.ЇГ//://77777777777 0 МБ Г77/7/7/:Г 272 Ц|ІРААГАСМОУВОВ Г/Л МБ Г7/7/7//:Г 273 Ц|ІРОВЕМАЕЗЗАЕМ. Г/Л |ЇмМ5БІ Мч 777/7//:Г 274 Ц|ІРОВЕМАЕЗАЕМІР Г/Л МБ Г77/7/7//:УГ 275 Ц|ІРОВЕМАЕЗАЕМІРА.Ї Г/Л МБ Г7/7/7/:Г 276 (Іва РУЯОРІВЇ 77777777 077 Їм5ІчГ7/7/7/7/Г 277 |РОВРУЛЕЗАЕМІРН.ЇГ/-://77777777 ЛИ ЇмМ5І Мч Г77/7/7/:Г1 278 |РОВЕУМАЕЗАЕМІРНЇГ/-:// ЛИ МБ Г7/7/7/:Г 1279 |ОРІВБІРОВІМА.ЇГ//:////:/:///./:/ 5: /Г/ 07 Їм Г/7/7/7/:Г 280 |ВОПРМООРІВЇ //-:/ 7 07 Їм5ІчГ/7/ 281 |5ВТАСЕТООБААРГ/://77777777777 ЛИ МБ М ГГ7/7/7/:Г 282 |5БТЕВУВЕАУААОКГ/777777777777 ЛИ |МБІМГГ/Г/:Г 283 |ТОАМІРІТМАЕМОЇГ/-://777777777777 07 ЇмМ5ІчГ/7/7/7/:Г 284 |МАЕМОКЛОаРНУВЯЇГ/:777777777 0777 Їм5ІчГ/7/7/ГГ 285 |МАЕМОКОЯРНУЕВІК Г/Л Їм5ІчГ/7/7/7/Г 286 |МООРІВБІРОЇМАЇГ-:/ 7 0 МБ Г7/7/7/:Г1 287 |МВОБИЗЕАСУВАТЯ -/-::/7777777 ЛИ МБ Г77/7/7//:Г 288 |МВОБИЗЕАСУВАТЯЯ /-: ЛИ МБ Мт Г7/7/7/:Г 289 |ІРААГАСМОУВОБІ. Г/Л |ЇМБІМГГ/7/7/:Г 290 Ф|АКМІВЕМІЄРКАМКЕ /-:/777 ЛИ фЕВНБВ2/:УО 291 |ОРОРІОНУЗЕОРТМРІР5Ї ЛИ фЕВНБВ27//:УЗ 292 |ОРБРІОНУБЕОРТМРІРБЕ /-:/ ЛИ фЕВНБВ27/:УЗ 293 |БЕМБЕЕЗВМАНО Г/Л фЕВНБВ2Г///:У 294 |БЕМ5ЕЕЄЗЄВМАВОРО Г/Л (ЕВНБВ2Г///:У 295 | ІРМАКМІВЕМІЗРКАМКЕ -:/ Ли фЕВНБВ27Г/:ГЗ 296 |ВАВІОЕТЕІМЕРІТРЕЇ Г/Л фЕВНБВ2///:У 297 |5РОРЕУММОРОУАВРОРР.Г|:|; /;!/;/"/./ 0 ///// (ЕВНБВ2Ї7/:УЗ 298 |МКРОЇБЗУМРМУКЕРОЄ /-:/77777 07 (ЕВНВВ2Г//:У 299 |АБОМАМІАТІМЕМНАЇГ/-/777777777 0 фооВТ7/7/: 300 М АБОМАМІАТІМЕУНАЇГ/7777777777 07 фооВТ77/7/:
З01 |КЕУКІМБНІКОРМ,ЇГ/77777777777777 07 фроВ7/7/:З 302 ЦІМОРІЗАНОГЕОК 77777777 07 фроВі7/7/7/Г:З 303 |МРАУВІШАТМАВРР.Г/://7777777 ЛИ ф0ОВТ77/7/7/: 1304 |МРАУВІШАТМАВРРАЯ.ЇГ//:/.//// ЛИ ф0ОВТ7/7/7/Г:З 305 |5МРАУВІШАТУАВРРЇГ/://7777777 ЛИ ф0ОВТ77/7/7/:З 306 |5МРАУВІШАТУАВРРЯЇГ/://. ЛИ ф00ВТ77/7/7/Г:у 307 |ОРБТОУУМОВБОВОЗЕ, -:/ (7 07777 (мот 7/7/7/7/ ГГ 308 |МЕТОЕМОУКТЕААБАЇГ/З//77777777777 ЛИ (Моє 7777/7/7/7/: 309 фОВОУМУУТОАЗМОРА /-:/ 07 |МмМмР9 7/7: 310 |МОІМРКООКУМВЕяЕЯ 7777777 07 |ммМмР9 7:97 з11 0 |ЇВОУМУУТОА5МОоРА. 77777777 07 7 фммР95 77/77:
Таблиця 2
Додаткові пептиди за цим винаходом; Х-5, К або б 812 |5ОВОМУМУТЯАЗМІЯ 77777777 0ММР9 С/Г 313 |5ОВОМУМУТОАЗМОР 77777777 0ММР9 С: 314 |5ОВОМУМУТЗАЗМОРА. Г/Л 0ММР9 С: 315 |МОРВЗАБЕМОВМЕРОЇГ/-://777777777 1 0ММР9/:Г 11316 |СЕМАРОАКЗЕМІМЇ Г/Л АВ 11317 ДІТУКІРОСУЕЄРКЕРМНІМІЇ Г/Л ЕбАІВІ7 318 |МАСЕМАРОАКЗЕМІМ Г/Л ба 819 |МАСЕМАРОАКЗЕМІМІ /-/-:/7777771/ 0 ба
Таблиця З
Додаткові пептиди, які доцільно використовувати для терапії раку; Х-5, К або о 117320 ФАТЗКІРІАС 77777771! |МОСІЄ 77777777
ДЕ УТ ПЕ ЕТ: Я КК ПОН КУТОК: ПО
ДЕ У У В ГЕТЕ ГТК ПОДЯКУ ТЄ То: ПО 117323 |ТАТ5РМУРАЄ Г/Л! |МОСІЄ 7777777 117324 |ПІРЕЗВРВГ/:/7777777777777771717111!11117|МОсівЄ7777777 17325 |МЕЩВАМІАР 77777777 1! ДІяЕМм 1117326 ФАБОМИНКЕ 77777771! |мМвР2/////////: 1179327 |ВБОЕНОМ 77777771! (мМВР///////7 117328 |ОТКОРАМІЕМ Г/-::/ 77777777! 0тщ87/7/7/Г/СС(-СП 17329 МШБКША 77777771! 0тщ877/7/7/7/7/:Г 17330 |ЗЕБІВТЕЕ 77777777! 0тп8777/7/7/7/: 1179331 |МАБМАК 77777771! 0тщ87777/7/7/7/7/:Г 1179832 ЦІМТІВІШЕ 77777771 0377777 7333 ФАГОРІШНІМ 77777771! шо 7334 |ВІМОМРОЇ 77777771! шо 179335 (ШІ5РІВЕС ГГ: фрохо777/7/7/77Г 7336 ФфАОБКМИЕ 77777777! фМмовВ35777/777/7/Г 17337 |О5ШЕОАММАЇЇГ////77777777777777777771 1: Мов: 338 фоМосІКЕУКАЇГ/////7777777777777777777171: фМмов35777/777/7/7 7339 фЕММОУГОВЕ 77777771! фМмов35777/77/7/7
ДЕ ТИ АТС ТИ ЕТ ООН КК ПОН СМС С Де УН 841 І8ІШТРІОРКЇГГ/Г///77777777777777771717171717111! мов 17842 |ТАБОКШМ 77777771! мов 343 фамкм'ває 77777777! їмо 7777/7777 17344 |КУКсЕМКІКЇГГ/////////77777777777777777171717111777777 їмо 77/77 7345 |З55ЕРМНАКЇГГ/////77777777777777777777/7!777777777 їмо 7777/7777: 346 |555ЕРУНАККЇГГ/Г/://///777777777/7!777777777 їМоС 7777/7777 17347 ДІЗО0ОГАСАЇГ////7777777777777777777777771 1! ФОМАЗЕЇ ГГ: 7348 ЦІ5ОМЕКМЇГ/Г///7777777777777771717171711711111111110МмоВва?777777/7/:У 117349 |ВІЮОНММАМ 77777771! |МмоВва?7777/777/: 350 |800ООМ5М 77777771! ВІ 77777/7/ 7З51 |8пОРБОТВЯК 77777777! ІВ 77/7/7/7/7// 9352 0 ДМЕВООЕРКІЇГ///777777777777777777771171! ІВ 77/77/7777 7353 |МІВЕКЕА.Г//77777777777777777777711! ІВ 777/7/7/7/7//7 354 |ТВООАОА 77777777! (РОГ: 17355 |МААРЕНІЗМ ГГ: 77777771! |РОА2ЗЇГ//:З 7356 |М5КККМА.Г/////777777777777777777777171!фрохб27777/7//: 7357 фОМ5КККМА. 77777777! фрохб27777/7/7/: 9358 |вВоМТУНнеЕ 77777777 0! фрохб?7//7/7/:
Таблиця З
Додаткові пептиди, які доцільно використовувати для терапії раку; Х-5, К або о 7359 |КОМ5ЕЕМІМ 77777777 1: |ВАБОЕРІВ З 7360 |КТКРОБЮВ /-/-:777777777777777777171111 |ВАБОЕРІВ З 117361 |ТНІІВННЕВС 77777777: |ВАБОЕРІВ З 179362 МАРКО 77777777: |ВАБОЕРІВ З 363 |0АБУБОВМ 77777771! ВС 7777/7777 17364 |КРКОРБЕКУМГ/:/77777777777777171717171111111111 ВС /777/7/7//:Г 1179365 |МРАЕТІКЕЇ 77777771! |ВІССТ 7/7: 7366 |ЗАМКЕСТАМ 77777777! ВС 7777/7//: 117367 Щ|ЕБЕКІОДАЄГ//777777777777777777777/ 1! |СОММою ( 7368 фОБЕЕМОКМ 77777777! (ЕМСТГ//ГС 7369 ФОБУКМТАЄГ///77777777777777777777117!111777777 (ЕМСТГ// СГС 117370 |ЕТМОСІММУ 77777777! (ЕМСТЇГ//С 11371 ФЕРОТАІМВЕ 77777771! (ЕМСТГ// С 117372 |ЗЕРОККАра. 77777777 1! (ЕМСТЇГ//-ГГЗС 7373 фО5МО5ЕЗЕКГГ///////77777777777777777771/7!1117777777 (ЕМСТЇГ// С 17374 МвШОсуТаВнІ 77777777! (ЕМСТЇГ//С 117375 ЦПРРЕМОВІЇГ//7777777777777777777171171!1111177771 (ЕМСТГ//ГС 111376 ЦІРУЄРОМОЇЇ////7777777777777777771171!111117771 (ЕМСТГ// С 111377 ФОМАРРМІКАЯЇГ/://777777777777777171717171!77777 (ЕМСТЇГ// 117378 |ТЕКММАА 77777777! (ЕМСТГ//-ГГ 1117379 |МОКМКЕАВ 77777777! (ЕМСТЇГ// С 9380 |ЇМРЕЗНУМЇ//7777777777777771171!111177 (ЕМО: 381 0 ЇМУМОМУМІК 77777771 (ЕМСТЇГ//ГС 7382 |УРУЕКООМГГ////777777777777777711711111177771 (ЕМСЯГ//-С 7983 ФАА0ОБАЮКМ 77777777! МЕ? 7/7: 7384 ІННКЕКОТОМ Г/М? 7/7: 79385 |КОТОМААЕМ 77777777! МЕ? 7/7: 117386 |КЗАЕРАОБК 77777771! им? 7/7: 117387 |МЕММОМНААЇГ//7777777777777717171717171711!1 ие? 7/7: 7388 |ЗЕ0ІМКНМ. 77777771: фиМЕ2і?///7//:Г
ЕЕ: В СЕТ ХП М ООН КК ПООНО КЕ ТоУСч НО 17390 |ОРКСАБВІ. 77777771! |ВСАТ777/7/7/7//: 117391 |ОУККРІКАЇГ///777777777777777777717171171! |ІВСАТ 7777/7777: 1117392 |КЕКРОРММ. ГГ: |ВСАТ7777/7///: 393 |КУбЕВМІТМ 77777771! |ІВСАТ 7777/7777: 117394 ЦІРМЕЮКЕЕС 77777771! |ВСАТГ77/7/7/7/7//: 7395 | І5КШТРЮМ 77777771! |ІВСАТ 7777/7777 396 фОС5МІМКО 77777771! Мові? 117397 |ВММОМЕЗОВІК 77777777! 0МмоВі277/7/7/7/7/7/: 17398 |ЗРІ5НМША Г/-:77777777777777771717111!|МОоВІ2777/7/7/7/7/Г 7399 |МБЕУМЕКМЇГГ/////7777777777777777771711711 мові? 1117400 |МЕВМКМКАЇГ//77777777777777777771711:0МмОоВі2777/7/77//7 1117401 |ВЕАУЗКЕ 77777777! |РАМК2ЇГ//-Г 117402 ЦММООМ5ІНВА 77777777 1: |5ТХВР6//:З 7403 |КОгЕо5ТЗЕ 77777777 1: |5Т1хВР67/7//: 1117404 |ЕЕЕВОЕНЕЇГ//77777777777777777777171711117777 фоАВСССССССС 1117405 ф|ЕТІРЗЕЮМЕГ////777777777777777777717171171111111111711 ОА 117406 |ЕМОЕАІКТМЇГ/://7777777777777171711111777771 0оМмо777/7/7/7/7/СС 1117407 |КЕРЕВО 77777777 71711777 0омо77/7/7/7/7/СС п: В ГЕСТе ТТН М ПОН КС СУ» КО 117409 |МММІТЕМААТ Г/Л! 0оМо7777/7/7/СС 410 ФАЮЮКІРОМ 77777771: |снснОоЄ 7/7: 411 фЇЕРМЕОКОЕГ////77777777777777777777771 01 |5МАВСА0І З
Таблиця З
Додаткові пептиди, які доцільно використовувати для терапії раку; Х-5, К або о 412 (аОТКЕМІМ 77777777 |5МАВСА0І 7/7: 413 |КШЕБТЯТМ 77777777 17 |5МАВСА0І 7/7: 117414 |КРУХОКМОЇЇГ/////7777777777777777777771111 |5МАВСА0І 7/7: 415 ЇКОЕВІМІК 77777777 17 |5МАВСА0І 7/7: 11416 0 |МАММАШ 77777777 01 |5МАВСА0І З: 11417 |ЗЕУРМОКЕМ 77777777 11 |5МАВСА0І 7/7: 418 0 |ТММОВІАВЇГ//777777777777777777771717111! |РАМК2ЇГ///- 17419 фрАКОВТУВ 77777777! фоРХВ7//7/7//:, 117420 МіКККЕОС 77777771! 0оРХВ7/7/7/7/7//:Г 17421 фОМОММОА 77777771: |Сгботеї: 117422 (БЕК 77777777 |Сгботеї 117423 |ЗОРЕКТОЕЄ 77777771! |Сгботвї 117424 |ОБОВИММЕ 77777771! 0О5РМЯГ7Г/7/Г 117425 |ННеМРМБ 77777771! фО5РЯГ7/7/7//:Г 1117426 Ц(ЕРБИКМ 77777771! фО5РЯГ7/7/7/: 117427 |МТМРІМК 77777771! фО5РЯГ/7/:Г 117428 |ЗООМАВІВ 77777777! фО5РЯГ7Г/7/7//:Г 1117429 |ТНЕЗЕРІВС 77777771! фО5РЯГ/7/7/:Г 7430 |тМо5УТОКЕ 77777771 0о5РАГ7/7/7//: 1117431 ФАЕБІМЕІВЕГ///77777777777777777777711!фтМе5 77 1117432 фОБЕНЯІТНІМЇ 77777777! 0тМе5777 547 0 ПЙТЕМТВЄ 77777771! |мМОосівЄ7777777 17548 |КМІБАІРТ. 77777771! |МОСІ6Є 77777777 017549 00 |ЇТУЗЕКТТІвЇ 77777771 |мМосів7777С
Таблиця 4
Додаткові пептиди, які доцільно використовувати для терапії раку; Х-5, К або о 117433 0АШРРОМОРРМММЇГ/:7777777771717111 ПРО 117434 0АШБРОМОРРУМУКТЇГ/:/7777777711 ПРО Г/Г/7//// 117435 ОБРОМОРРУМУК.ЇГ/:/777777777717111 ПРО ГГ 117436 ОБРОМОРРУМУКТЇГ/-:/7777777771711 ПРО ГГ 117437 ОБРОМОРРУМУКТОМ /-/-:/ 777777 ПРВОГГ/Г/// 17438 ОБРОМОРРУМУКТОМ. Г/Л ПРВОГ/Г/// 17439 ОБРОМОРРУМУКТОМІМ -/-:/ 7/1 РВС: 117440 ГОЛІОРРОМОРРУМУКТОМ /-:/ 1 ПРВОГ/Г/: СУ 1111441 ОАІОРЕОМОРРММУК.ЇГ//:/.ССС777777711Л ПРО ГГ 1117442 ОРРНЕУУРУМТУММОКР Г/Л ПРО: 17443 5РІОДІОРРОМОРРУМУКТ /-:/ 1 ПРВОГ/Г/: 17444 5РІОДІОРРОМОРРУМУКТОМ /-:/ 1 ПЛРВОЇГ/: 17445 5РІОАДІОРРОМОРРУМУКТОМІМ ЛО бЛРйВОГ/Г/: 117446 ОРРЕБББОВІРУУРА.ЇГ/://77777 1 фоРАЄЇЇГ//:З 1117447 1 ІРОБІМММІРАНОМЇ /-:/ 7777777 фОоРАЄЇЇГ///:З 117448 0 ІРОБІМММІРАНОМЕ /-:(/ 7 1 фОРАЄЇЇГ///:З 449 |ІРОБІМММІРАНОМЕ. 7777 0177 (оРНЄЄЇГ//--/-/-:Ж 450 5РІСЕОРІЄРОРЗАРІЇ/-:// 1 фОРНЄЄЇЇГ///:ГЗО 11451 ОЕМТОРЕМОЕКТАБІВЇГ/-/77777 7 |РСОНВВЇГ//:З 1452 КУРЕЇМІОКАІЮОВЕЕН.Ї Г/Л |РСОНВВЇГ//:З 1453 КУРЕМІОКАІОВЕЕНРЕ 1 |РСОНВВЇГ//:З 1454 МТОРЕМОЕКТАІВЇГ/-:/7777777777 7 |РСОНВВЇГ//:З 455 |ООВТПУ0СЕСТРУУБРО.ЇГ/:/ 7 |! демМОСТГ/ССГИ
456 |ООАПУБІЕСТРМУБРОСЇ /-:/ 7 07 фМОСТ Г///// 1457 |ОКРІБІСОКРІМАЇ 77777777 7 МОЄ Т 458 |СОСАТУСІЕСТРУУБРО /-/-:/ 0 фМОСТ 459 |сООАТУбІЕсСТРУУБРОЯ /-/-:/ 0 фМОСТ 460 |СОбОВТУРІЕсСТРУУЗРО 7 07 фМОСТ 461 фсОбоВтУрІЕстТРУУЄРОЯЇЯ 0 МОЄ Т 462 |ОВПУСІЕСТРУУБРОЇ/-/-//777777 7 МОЄ Т 463 |КУКЕМІЗУАРАІКРЕ////7777777777/ 0777 фЕМОСТ ГГ 464 |КУКЕМІЗУАРАІКРЕО 77777777 07 фЕМОЄТ ГГ 465 ОСОСВПУРІЕСТРУУВРОСЄ /-:/ 0 фМОСТ 466 |АТНЕЖККСАЗЕЗМУМЇГ///7777777777/ 07 МОЄ Т 1467 |МКЕМІЗУАРАІКРЕ 77777777 07 фЕМОЄТ 468 УЗКТОУМОУРЗЕОРЕНТРО 0 |схАОВСГСГС/С/ССГ 469 ААРМІЗАМОАІРУМІРЇ 7777777 07 |СХАОВГГ/Г//:И «С 11470 Ю|ААРМІЗАМОАІРУМІРАЇ////77777/ 077 |СХАОВГГ/Г//:ИО"С 11471 ДАРМІЗВМОАІРУМІРЇГ///777777777/ 07777 |СХАОВССГС/С/СС 1472 |АРМІЗВМОАІРУМІРАд//////777777777/// 0 |СХАОВГСГ/Г/С/С:(С 473 |СУЗКТОУМОУРЗЕОРЕНТРО 0 |схАаОВСГСГС/С/ССГ 1474 |ЗКТОУМОУРЗЕОРЕНЇ 77777777 07 |схАаОВС 475 |ЗКТОУМОУРЗЕОРЕНТРЇ/-/-/ 0 |СхАОВССГС/С/СС 476 |ЗКТОУМОУРЗЕОРЕВНТРО 0 |СхАОВСГС/С/ССГ 11477 ДМААРМІЗАМОАІРУМІРАЇд/-/-/7 0 77// |СХАОВГГ/Г//:ИО С 478 |МПУЗООКІМЮ 77777771 111111 схАоВС 479 |УЗКТОУМОУРЗЕОРЕН.ЇГ/-/7777777/ 07 |схАОВСС 1480 |СНІРААВІОУЄ 77777777 0 фРСОНВІГ///:Г 11481 ЮДААЕРОМІМТКУМАМОС ЇЙ фРСОНВЗГ///:ЗГ 1482 |ААЕРОМІМТКУМАМОСЮ 77777 0 фРСОНВЗГ///:З 483 ААЕРОМІМТКУМАМОСЮ5 0 ф|РСОНВЗЇГ///:З 1484 ЮДААЕРСОМІМТКУМАМрОр5аа 0 ф|РСОНВЗЇГ///ЗЗ 1485 |АЕРОМІМІКММАМрЯ 77777777 0 фРСОНВЗГ///:ЗГ 486 АЕРОМІМТКУМАМрОЮ 7777777 0 фРСОНВЗЇГ///:ЗГ 1487 |АЕРОМІМТКУМАМрОЮ5 777777 0 фРСОНВЗЇГ///:З 488 ЕРОМІМІКУМАУраї/////7777777777/ 0 фРСОНВІГ///:ЗГ 489 ЕРОМІМІКУМАУрОЮ. 77777777 0 фРСОНВІГ///:ЗГ 490 ЕРОМІМТКУМАУМрОр8 77777777 0 фРСОНВЗГ///:З 11481 Щ|АЕРОМІМІКУМАМОЇ////77777777777 0 фРСОНВІГ///:Г 14982 |АОЗТЕРВРМАРУРІМЇГ///77777777 0 СТР: 493 АОЗТЕРВРМАРУРІМО 7777777 0 СТР: 1484 |ОАОЗТЕЕВРМАРУРІМЇ///77777 0 СТР: 1495 |ОАОЗТЕЕВРМАРУРІМО 777 0 СТР: 496 |ОАОЗТЕЕВРМАРУРІМОМ 0777 СТР: 1497 |ОАОЗТЕЕВРМАРУРІМОМРЇ///// 0 СТР: 498 ОАОЗТЕРВРМАРУРІМОМРЕ 0 СТР: 1499 О5ТЕЕВРМАРУРІЇГ///7777777777777/ 0 СТР: 500 ІО5ТЕЕВРМАРУРІМЇ/-//777777771/ 077 СТР: 11501 ІО5ТЕЕВРМАРУРІМЇ///77777777777 07 СТР: 502 |ОЗТЕРВРМАРУРІМО 777777 0 СТР: 503 ОЗТЕРВРМАРУРІМОМРЇ/-///777/ 07 СТР: 504 ОЗТЕРЕВРМАРУРІМОМРЕ 0777 СТР: 505 КОАОЗТЕЕАРМАРУРІМО 0 СТР: 1506 ІЗТЕРАРМАРУРІ Г/М СТР: 11507 |ЗТЕЕАРМАРУРІМЇ 77777777 07 |стР2 ГГ: 508 ІЗТЕРАРМАРУРІМО 77777777 0 |сСтР2 ГГ: 509 |ЗТЕЕАРМАРУРІМОМР 7777777 07 |сСтР2 З 1510 ІАСОУПАМАВКЦОЄ, 77777777 077777 8Р2//// 11511 9ЕТЕНОЄВС 77777771 17171711 рМо 11512 ДАОПТУАЛЕАОЗЕЗУКЇГ//777777777/ 0 (БАТТГ//////// 1153 0 |ОПТУАЕАОЗЕЗУКЇГ//777777777777/ 0 (РА Г/Г//7////
1514 |КВОМУСІКУМАБОНОЄ, 77777 0 РАС 1515 |КВОМУСІКУМАБОНОЕК. 777 0 РАС 516 |ВОЕЗЕМОВОВОВІК 77777777 0 РАС 111517 |ВОМУСІКУУАБОНОЄ.ЇГ 77777777 БАС 11518 |5РЗЕОВОРАМАМТЇГ//777777777 БАС 519 (ТРРОЕЗБУКМНУТЗРОЇ Г/Л БАС 111520 ІМРІРООЕЕРМУЇГ///77777777777111111 1111111 БАС 521 |ОРОШРНМОРБСТЕМО 7777777 0 РЗМА5//-З 522 Щ|ОКМУРЕСТОУАВУРТОР 777 0 АМАЗ///З 523 |ОКМУРЕСТОУАВУРТОРН.Ї 7 077 АМАЗ///-З 524 Щ|ОБ5КРІМТРОЗБРОМ 77777777 0 АМАЗ///З 505 ЦПОВОМКЕІМБІОБОРТ 77777777 0 АМАЗ///З 506 |КМУБЕОТОУАНУРТ 77777777 077 АМАЗ////З 1527 |КМУБЕОТОУАВУРТОР//////777777// 07 АМАЗ///З 528 |КМУБЕОТОУАВУРТОРН.Ї 77 0777 АМАЗ////З 529 |5РВМУРМЕЗІРІИРІРЇ 77777777 7 РТРНО////ЗЖО 530 |5РВМУРМЕЗІРИРІРОЇ 777777 0 РТРНОГ////ЗЖО 11531 |55РАМУРМЕБІРИРЇ 77777777 7 РТРНОГ////ЗЖО 532 |5ЗРАМУРМЕБІРИРІРЇ 7777777 0 РТРНОГ////ЗО 533 |55РАМУРМЕБІРИРІРОЇ 77 0 РТРНОГ////ЗЖО 534 |ООКОУТМНРБІТВРУ 77777 0 САСНТГГ///: 535 |ОМОСАСУУУТІБНТІНВ 777777 0 САСНТГГ/Г//:З 1536 |БбАСУМУТІЗНТІН 77777777 0 САСНТГГ/Г//: 11537 |БбАСУМУТІЗНТІНВЇ 77777777 0 САСНТГГ/Г/Г//: 538 |ОСАСУМУТІЗНТІНЇ 77777777 0 САСНТГГ/Г/Г//: 539 |ОСАСУМУТІЗНТІНВЇ 7777777 0 САСНТГГ///: 540 Щ|МОСАСУУУТІЗНТІНВЇ 7777777 0 сСАСНОТГГ/Г//: 11541 |МТАТЕНОГЕОМАУКНОВаа 77 0 ЕВМРІ Г//// 1542 |ВТЕНОЕОМАУКАЇГ/////777777777// 7 ЕВМРІ З 543 |ВТЕНОГЕОМАУКВОВО. 77777 0 ЕВМРІ З ( 1544 |5ОТЕРЕРУЗЗМРАМРК//777777// 0 ЕВМРІ //// ( 1545 |5ОТЕЕРУЗЗМРАМРКР Г/Л ЕВМРІ З 546 |ТВТЕНОГЕОМАУКАЇГ//7777777777// 0 ЕВМРІ ГГ
Цей винахід також загалом стосується пептидів за цим винаходом для застосування для лікування проліферативних захворювань, таких як, наприклад, рак яєчника, недрібноклітинний рак легенів, дрібноклітинний рак легенів, рак нирки, рак головного мозку, рак товстої або прямої кишки, рак шлунка, рак печінки, рак підшлункової залози, рак передміхурової залози, лейкоз, рак молочної залози, карцинома з клітин Меркеля, меланома, рак стравоходу, рак сечового міхура, рак матки, рак жовчного міхура, рак жовчних протоків і інші пухлини, які виявляють надмірну експресію білка, з якого отриманий пептид з послідовністю від ЗЕО ІЮО Мо. 1 до 5ЕО ІО Мо. 319.
Особливо переважними є пептиди - для застосування самостійно або в комбінації - за цим винаходом, вибрані з групи послідовностей від 5ЕО ІЮ МО: 1 до ЗЕО ІЮО МО: 549. Більш переважними є пептиди - для застосування самостійно або в комбінації - вибрані з групи послідовностей від ЗЕО ІЮО МО: 1 до ЗЕО ІЮ МО: 319 (див. Таблиці 1 і 2) і їх застосування при імунотерапії раку яєчника, недрібноклітинного раку легенів, дрібноклітинного раку легенів, раку нирки, раку головного мозку, раку товстої або прямої кишки, раку шлунка, раку печінки, раку підшлункової залози, раку передміхурової залози, лейкозу, раку молочної залози, карциноми з клітин Меркеля (ККМ), меланоми, раку стравоходу, раку сечового міхура, раку матки, раку жовчного міхура, раку жовчних протоків і переважно раку яєчника.
Отже, у ще одному аспекті цей винахід стосується застосування пептидів за цим винаходом для - бажано комбінованого - лікування проліферативного захворювання, вибраного з групи раку яєчника, недрібноклітинного раку легенів, дрібноклітинного раку легенів, раку нирки, раку головного мозку, раку товстої або прямої кишки, раку шлунка, раку печінки, раку підшлункової залози, раку передміхурової залози, лейкозу, раку молочної залози, карциноми з клітин
Меркеля, меланоми, раку стравоходу, раку сечового міхура, раку матки, раку жовчного міхура і раку жовчних протоків.
Цей винахід також стосується пептидів за цим винаходом, які здатні зв'язуватись з молекулою головного комплексу гістосумісності (МНС) людини І класу або - у подовженій формі, такій як відмінний за довжиною варіант - МН ІІ класу.
Цей винахід також стосується пептидів за цим винаходом, де згадані пептиди (кожний із них) складаються або по суті складаються з амінокислотної послідовності від ЗЕО ІЮ МО: 1 до 5ЕО
ІО МО: 549.
Цей винахід також стосується пептидів за цим винаходом, де згаданий пептид є модифікованим і (або) включає непептидні зв'язки.
Цей винахід також стосується пептидів за цим винаходом, де згаданий пептид є частиною злитого білка, зокрема злитого з М-термінальними амінокислотами НІГА-ОК антиген- асоційованого інваріантного ланцюга (Ії) або злитого з послідовністю (або вбудованого у послідовність) антитіла, наприклад, антитіла, що є специфічним до дендритних клітин.
Цей винахід також стосується нуклеїнової кислоти, що кодує пептиди за цим винаходом.
Цей винахід також стосується нуклеїнової кислоти за цим винаходом, яка являє собою ДНК,
КДНК, ПНК, РНК чи їх комбінацію.
Цей винахід також стосується вектора експресії, що здатний експресувати і (або) експресує нуклеїнову кислоту за цим винаходом.
Цей винахід також стосується пептиду за цим винаходом, нуклеїнової кислоти за цим винаходом або вектора експресії за цим винаходом для застосування для лікування захворювань і в медицині, зокрема в лікуванні раку.
Цей винахід також стосується антитіл, які є специфічними по відношенню до пептидів за цим винаходом або комплексів згаданих пептидів за цим винаходом з МНС та способів їх отримання.
Цей винахід також стосується Т-клітинних рецепторів (ТКР), зокрема розчинних ТКР (ртКР), і клонованих ТКР, вбудованих у аутологічні або алогенні Т-клітини, та способів їх отримання, а також МК-клітин або інших клітин, що несуть згаданий ТКР або вступають у перехресну реакцію із згаданими ТКР.
Антитіла і (або) ТКР є додатковими втіленнями імунотерапевтичного застосування пептидів за винаходом що розглядається.
Зо Цей винахід також стосується клітини-хазяїна за цим винаходом, що містить нуклеїнову кислоту за цим винаходом або вектор експресії, як зазначено вище. Цей винахід також стосується клітини-хазяїна за цим винаходом, де антиген-презентуюча клітина є дендритною клітиною, і переважно дендритною клітиною.
Цей винахід також стосується способу отримання пептиду за цим винаходом, причому спосіб включає культивування клітини-хазяїна за цим винаходом і виділення пептиду зі згаданого клітини-хазяїна або її культурального середовища.
Цей винахід також стосується способу за цим винаходом, де антиген навантажують на молекули МНС І або ІЇ класу, що експресуються на поверхні відповідної антиген-презентуючої клітини або штучної антиген-презентуючої клітини шляхом контакту достатньої кількості антигену з антиген-презентуючою клітиною.
Цей винахід також стосується способу за цим винаходом, де антиген-презентуюча клітина містить вектор експресії, що здатний експресувати або експресує згаданий пептид, що містить послідовність від ЗЕ ІО Мо. 1 до 5БЕО ІЮО Мо. 549, переважно, що містить послідовність від
ЗЕО ІЮ Мо. 1 до ЗЕО ІО Мо. 319 або варіант амінокислотної послідовності.
Цей винахід також стосується активованих Т-клітин, отриманих згідно способу за цим винаходом, де згадана Т-клітина селективно розпізнає клітину, яка експресує поліпептид, що містить амінокислотну послідовність за цим винаходом.
Цей винахід також стосується способу знищення клітин-мішеней в організмі пацієнта, клітини-мішені якого аберантно експресують поліпептид, що містить будь-яку амінокислотну послідовність за цим винаходом, причому спосіб включає введення в організм пацієнта ефективної кількості Т-клітин за цим винаходом.
Цей винахід також стосується застосування будь-якого пептиду, що описаний тут, нуклеїнової кислоти за цим винаходом, вектора експресії за цим винаходом, клітини за цим винаходом або активованого Т-лімфоцита, Т-клітинного рецептора або антитіла або інших молекул, що зв'язують пептид або комплекс пептид-МНОС, за цим винаходом як лікарського засобу або в процесі виробництва лікарського засобу. Переважно, якщо лікарський засіб виявляє протиракову активність.
Переважно, якщо згаданий лікарський засіб призначений для клітинної терапії, є вакциною або білком на основі розчинного ТКР або антитілом.
Цей винахід також стосується застосування за цим винаходом, де згадані ракові клітини є клітинами раку яєчника, недрібноклітинного раку легенів, дрібноклітинного раку легенів, раку нирки, раку головного мозку, раку товстої або прямої кишки, раку шлунка, раку печінки, раку підшлункової залози, раку передміхурової залози, лейкозу, раку молочної залози, карциноми з клітин Меркеля, меланоми, раку стравоходу, раку сечового міхура, раку матки, раку жовчного міхура і раку жовчних протоків і переважно раку яєчника.
Цей винахід також стосується біомаркерів на основі пептидів за цим винаходом, які у цьому документі іменуватимуться як "мішені", які можуть використовуватися в діагностиці раку, переважно раку яєчника. Маркером може бути надмірна презентація самого(-их) пептиду(-ів) або надмірна експресія відповідного(-их) гена(-ів). Маркери також можуть використовуватися для передбачення вірогідності успіху лікування, переважно імунотерапії, і найбільш переважно імунотерапії, націленої на ту ж мішень, що ідентифікується біомаркером. Наприклад, антитіло або розчинний ТКР може використовуватися для барвлення зрізів пухлини для виявлення присутності досліджуваного пептиду у комплексі з МНС.
Необов'язково, антитіло містить додаткову функціональну ділянку, таку як імуностимулюючий домен або токсин.
Цей винахід також стосується цих нових мішеней у контексті лікування раку.
Як терапевтичне застосування проти інших типів раку, так і діагностичне застосування розкриті у наведеному нижче більш детальному описі продуктів експресії (поліпептидів), які є базовими для пептидів за цим винаходом.
ПОВНИЙ ОПИС ВИНАХОДУ
Стимуляція імунної відповіді залежить від присутності антигенів, що сприймаються імунною системою хазяїна як чужорідні. Відкриття пухлино-асоційованих антигенів зробило можливим використання імунної системи хазяїна для втручання в ріст пухлини. Зараз вивчається можливість використання для імунотерапії раку різних механізмів задіяння як гуморальної, так і клітинної ланки імунної системи.
Специфічні елементи клітинної імунної відповіді здатні специфічно розпізнавати та знищувати пухлинні клітини. Виділення Т-клітин із популяцій пухлино-інфільтруючих клітин або з периферичної крові говорить про те, що такі клітини відіграють важливу роль у природному
Зо імунному захисті проти раку. Важливу роль у цій відповіді відіграють, зокрема, СО8-позитивні Т- клітини, які розпізнають пептиди, зв'язані з молекулами головного комплексу гістосумісності І класу (МНС). Ці пептиди зазвичай складаються з 8-10 амінокислотних залишків, що отримані з білків або дефектних рибосомальних продуктів (ОРІР), які містяться у цитозолі. Молекули МНС людини також визначаються як лейкоцитарні антигени людини (НІ А).
Цей винахід також стосується пептидів за цим винаходом, де згаданий пептид є модифікованим і (або) включає непептидні зв'язки, як описано нижче у цьому документі.
Цей винахід також стосується пептидів за цим винаходом, де згаданий пептид є частиною злитого білка, зокрема злитого з М-термінальними амінокислотами НІГА-ОК антиген- асоційованого інваріантного ланцюга (Ії) або злитого з послідовністю (або вбудованого у послідовність) антитіла, наприклад, антитіла, що є специфічним до дендритних клітин, тобто зв'язується з дендритними клітинами.
Цей винахід також стосується нуклеїнової кислоти, що кодує пептид за цим винаходом. Цей винахід також стосується нуклеїнової кислоти за цим винаходом, яка являє собою ДНК, кКДНК,
ПНК, РНК чи їх комбінацію.
Цей винахід також стосується вектору експресії, що здатний експресувати, експресує і (або) презентує нуклеїнову кислоту за цим винаходом.
Цей винахід також стосується пептиду за цим винаходом, нуклеїнової кислоти за цим винаходом або вектору експресії за цим винаходом для застосування в медицині.
Цей винахід також стосується антитіл за цим винаходом, як описано нижче, та способів їх отримання. Переважними є антитіла, специфічні до пептидів за цим винаходом і (або) до пептидів за цим винаходом, якщо вони зв'язані з їхніми МНС. Переважні антитіла можуть бути моноклональними.
Цей винахід також стосується Т-клітинних рецепторів (ТКР), зокрема розчинних ТКР (рТКР), що націлені на пептиди за цим винаходом і (або) їхні комплекси пептид-МНС, та способів їх отримання.
Цей винахід також стосується антитіл та інших зв'язувальних молекул, що націлені на пептиди за цим винаходом і (або) їхні комплекси пептид-МНС, та способів їх отримання.
Цей винахід також стосується клітини-хазяїна за цим винаходом, що містить нуклеїнову кислоту за цим винаходом або вектор експресії, як зазначено вище. Цей винахід також бо стосується клітини-хазяїна за цим винаходом, яка є антиген-презентуючою клітиною. Цей винахід також стосується клітини-хазяїна за цим винаходом, де антиген-презентуюча клітина є дендритною клітиною.
Цей винахід також стосується способу отримання пептиду за цим винаходом, причому спосіб включає культивування клітини-хазяїна за цим винаходом і виділення пептиду з клітини- хазяїна і (або) її культурального середовища.
Цей винахід також стосується способу отримання активованих Т-клітин іп міго, причому спосіб включає контактування іп міго Т-клітин із навантаженими антигеном молекулами МНС людини І або ІІ класу, що експресуються на поверхні відповідної антиген-презентуючої клітини протягом періоду часу, достатнього для активації згаданої Т-клітини шляхом набуття нею специфічності до антигену, де згаданий антиген є принаймні одним пептидом за цим винаходом.
Цей винахід також стосується способу, де антиген навантажують на молекули МНС І або ЇЇ класу, що експресуються на поверхні відповідної антиген-презентуючої клітини шляхом контакту достатньої кількості антигену з антиген-презентуючою клітиною.
Цей винахід також стосується способу за цим винаходом, де антиген-презентуюча клітина містить вектор експресії, здатний експресувати згаданий пептид, що містить послідовність від
ЗЕО ІЮ МО: 1 до ЗЕО ІЮ МО: 549 або варіант амінокислотної послідовності.
Цей винахід також стосується активованих Т-клітин, отриманих згідно способу за цим винаходом, які селективно розпізнають клітину, яка аберантно експресує поліпептид, що містить амінокислотну послідовність за цим винаходом.
Цей винахід також стосується способу знищення клітин-мішеней в організмі пацієнта, клітини-мішені якого аберантно експресують поліпептид, що містить будь-яку амінокислотну послідовність за цим винаходом, причому спосіб включає введення в організм пацієнта ефективної кількості Т-клітин за цим винаходом.
Цей винахід також стосується застосування будь-якого пептиду, що описаний тут, нуклеїнової кислоти за цим винаходом, вектору експресії за цим винаходом, клітини за цим винаходом, або активованої Т-клітини за цим винаходом, як лікарського засобу або в процесі виробництва лікарського засобу.
Цей винахід також стосується застосування за цим винаходом, де згаданий лікарський засіб
Зо являє собою вакцину, клітину, популяцію клітин, таку як, наприклад, лінія клітин, рТКР і моноклональні антитіла.
Цей винахід також стосується застосування за цим винаходом, де лікарський засіб виявляє протиракову активність.
Цей винахід також стосується застосування за цим винаходом, де згадані ракові клітини є клітинами раку яєчника.
Цей винахід також стосується конкретних маркерних білків і біомаркерів на основі пептидів за цим винаходом, які можуть використовуватися в діагностиці і (або) визначенні прогнозу перебігу раку яєчника.
Крім цього, цей винахід стосується застосування цих нових мішеней для лікування раку.
Цей винахід також стосується способу отримання персоналізованої протиракової вакцини для застосування для конкретного пацієнта з використанням бази даних (яка також визначається у цьому документі як "сховище") заздалегідь "просіяних" пухлино-асоційованих пептидів.
Стимуляція імунної відповіді залежить від присутності антигенів, що сприймаються імунною системою хазяїна як чужорідні. Відкриття пухлино-асоційованих антигенів зробило можливим використання імунної системи хазяїна для втручання в ріст пухлини. Зараз вивчається можливість використання для імунотерапії раку різних механізмів задіяння як гуморальної, так і клітинної ланки імунної системи.
Специфічні елементи клітинної імунної відповіді здатні специфічно розпізнавати та знищувати пухлинні клітини. Виділення Т-клітин із популяції пухлино-інфільтруючих клітин або з периферичної крові говорить про те, що такі клітини відіграють важливу роль у природному імунному захисті проти раку. Важливу роль у цій відповіді відіграють, зокрема, СО8-позитивні Т- клітини, які розпізнають пептиди, зв'язані з молекулами головного комплексу гістосумісності І класу (МНС). Ці пептиди зазвичай складаються з 8-10 амінокислотних залишків, що отримані з білків або дефектних рибосомальних продуктів (ОРІР), які містяться у цитозолі. Молекули МНС людини також визначаються як лейкоцитарні антигени людини (НІ А).
Величезний прогрес у галузі імунотерапії раку, досягнутий за останні роки, привів до її широкого визнання як потенційно цілющого доповнення або альтернативи стандартним хіміотерапевтичним підходам. У декількох статтях показана важливість презентованих бо молекулами НІ А пухлино-асоційованих антигенів, мутованих або дикого типу, як цінних антигенів відторгнення пухлини. Отже, широкомасштабна ідентифікація презентованих молекулами НГ А раково-специфічних пухлинних антигенів додає ще один важливий елемент до нашого розуміння того, як імунна система ідентифікує і розпізнає пухлинні клітини.
У цьому винаході його автори сконцентрувалися на епітеліальному раку яєчника (ЕРЯ) з метою вичерпно вивчити імунопептидом ЕРЯ і оцінити презентовані молекулами НГА антигени щодо придатності їх використання у клінічній практиці. На цей час лише декілька презентованих молекулами НІ А антигенів були ідентифіковані для ЕРЯ, і більшість клінічних досліджень базувалося на передбачуваних або встановлених раково-тестикулярних антигенах, не обов'язково також часто презентованих пухлинами ЕРЯ, цей факт може бути підтверджений аналізом, проведеним авторами винаходу.
Автори винаходу демонструють стійку і високу експресію молекул НІА І класу на клітинах пухлин яєчнику, що узгоджується з раніш опублікованими даними. Більш того, автори винаходу показують на рівні окремих клітин, що ЕРЯ також виявляє високий рівень експресії молекул
НІГА-ОМК. Цей високий рівень експресії був також підтверджений проведеною авторами ідентифікацією великих кількостей лігандів молекул МНС І класу, які походять із пухлин яєчника, а також із високо збагачених фракцій пухлинних клітин.
Вивчення профілів імунопептидому 34 пухлин яєчника у порівнянні з більш ніж 85 джерелами доброякісних тканин різного походження виявило кілька сотень ЕРЯ-асоційованих антигенів. Серед групи ТОР100 (100 елементів із найвищою зустрічальністю) ЕРЯ-асоційованих антигенів НГА І класу, які не були присутні на жодній із тканин у масиві даних для доброякісних тканин, який був у наявності у авторів винаходу, МОС16б був чітко найбільш винятковим.
Стосовно як кількості ідентифікованих лігандів НГА (280), так і частоти зустрічальності у когорті пацієнтів (80 95), це є безпрецедентним для будь-якого іншого пухлинного антигену і виду пухлини з тих, які автори винаходу на цей час досліджували. Більш того, авторам вдалося встановити, що більш ніж 70 95 лігандів НА, отриманих із МОС16, є імуногенними і здатними примувати Т-клітини у здорових індивідів, що робить муцин 16 неперевершеним першокласним антигеном для імунотерапії ЕРЯ. Вивчення профілю імунопептидому також дає наочну картину справжнього проникнення у механізми ЕРЯ, яке знаходить відображення у лігандомі НГ А як для лігандів НГА І класу, так і лігандів НГА ІЇ класу. Можна згадати, лише для прикладу, ліганди НГА
Зо із важливих кіназ і фосфатаз (0ОКІ, ЕМА2), факторів транскрипції (50ОХ9, 5ОХ17), білків, асоційованих із імуносупресією (І0О1, галектин 1), а також із встановлених і передбачуваних молекулярних маркерів ЕРЯ (МОСТІ, КІК10, РОЇ КІ). Слід відзначити стосовно НГА ІІ класу, що мезотелін як встановлений ліганд МОС16 був ідентифікований як ТОРІ пухлино-асоційований антиген. У декількох дослідженнях була продемонстрована визначальна роль осі МОС16/М5І- М для інвазії клітин і утворення метастазів у ЕРЯ, а також у інших пухлинах, таких як рак підшлункової залози або мезотеліома, що наводить на думку, що Т-клітинні епітопи цих антигенів слід також дослідити у інших злоякісних пухлинах. Автори винаходу змогли показати, що забарвлення МОЇМ позитивно корелює із забарвленням МИОС16б і що високий рівень експресії МБ5І-М є негативним прогностичним фактором при ЕРЯ.
Для вивчення селективного профілю імунопептидому таким методом вперше було використано декілька різних доброякісних тканин і видів клітин (МКПК, кісткового мозку, печінки, нирки, товстої кишки, яєчника). Внаслідок обмеженої кількості різних тканин, доступних для дослідження, автори винаходу не можуть повністю виключити той факт, що індивідуальні антигени можуть також презентуватися молекулами НГА і в інших органах. Однак встановлена функціональна значущість цих антигенів для ЕРЯ і особливо імуногенність відповідних пептидів у здорових індивідів робить презентацію цих антигенів у інших тканинах малоймовірною.
Термін "Т-клітинна відповідь" означає специфічну проліферацію та активацію ефекторних функцій, індукованих пептидом іп міїго чи іп мімо. Для цитотоксичних Т-клітин, обмежених МНЕ |І класу, ефекторними функціями можуть бути лізис клітин-мішеней, оброблених пептидом чи пептидним прекурсором чи клітин-мішеней, природно презентуючих пептид, секреція цитокінів, переважно гамма-інтерферону, ТМЕ-альфа або ІЛ-2, індукована пептидом, секреція ефекторних молекул, переважно гранзимів чи перфоринів, індукована пептидом, або дегрануляція.
Термін "пептид" використовується в цьому описі для позначення серії амінокислотних залишків, що з'єднані один 3 одним зазвичай пептидним зв'язком між альфа-аміно та карбонільними групами сусідніх амінокислот. Бажано, щоб пептиди були довжиною у 9 амінокислот, але можуть бути такими короткими, як довжиною у 8 амінокислот, і такими довгими, як довжиною у 10, 11 або 12 амінокислот, а у випадку пептидів, що зв'язані з молекулами МНС ЇЇ класу (подовжені варіанти пептидів за цим винаходом), вони можуть досягати такої довжини, як 15, 16, 17, 18, 19 або 20 амінокислот.
Термін "пептид" використовується також для позначення солей серії амінокислотних залишків, що з'єднані один 3 одним зазвичай пептидним зв'язком між альфа-аміно та карбонільними групами сусідніх амінокислот. Переважно, щоб ці солі були фармацевтично прийнятними солями пептидів, наприклад, такими як хлорид або ацетат (трифторацетат). Треба зазначити, що солі пептидів за цим винаходом суттєво відрізняються від пептидів у їхньому стані іп мімо, оскільки пептиди не є солями іп мімо.
Термін "пептид" повинен також включати "олігопептид". Термін "олігопептид" використовується в цьому описі для позначення серії амінокислотних залишків, що з'єднані один з одним зазвичай пептидними зв'язками між альфа-аміно та карбонільними групами сусідніх амінокислот. Довжина олігопептиду не є критичною для цього винаходу за умови, що він містить правильний епітоп чи епітопи. Олігопептиди зазвичай коротші, ніж довжиною близько 30 амінокислотних залишків, і довші, ніж довжиною близько 15 амінокислотних залишків.
Термін "пептиди за цим винаходом" повинен також включати пептиди, що складаються або містять пептид згідно з наведеним вище визначенням відповідно до послідовностей від ЗЕО ІЮ
МО: 1 до 5ЕО ІО МО: 549.
Термін "поліпептид" використовується для позначення серії амінокислотних залишків, що з'єднані один з одним зазвичай пептидними зв'язками між альфа-аміно та карбонільними групами сусідніх амінокислот. Довжина поліпептиду не є критичною для цього винаходу за умови, що він містить правильні епітопи. На відміну до термінів "пептид" і "олігопептид", під терміном "поліпептид" маються на увазі молекули, що містять більш ніж 30 амінокислотних залишків.
Пептид, олігопептид, білок або полінуклеотид, що кодує таку молекулу, має назву "Імуногенного" (і, отже, є ""імуногеном" в межах цього винаходу), якщо він здатний індукувати імунну відповідь. У межах цього винаходу імуногенність точніше визначається як здатність викликати відповідь Т-клітин. Отже, "іімуногеном" може бути молекула, яка здатна індукувати імунну відповідь, і що стосується цього винаходу, молекула, що здатна індукувати відповідь Т- клітин. В іншому аспекті імуноген може бути пептидом, комплексом пептиду з МНС, олігопептидом і/або білком, який використовується для продукції специфічних антитіл або ТКР проти нього.
Зо "Епітоп" | класу Т-клітини потребує короткого пептиду, який зв'язаний із рецептором молекули МНС І класу, утворюючи потрійний комплекс (альфа-ланцюг молекули МНС І класу, бета-2-мікроглобулін і пептид), який може розпізнаватися Т-клітиною, що несе відповідний Т- клітинний рецептор, який зв'язується із комплексом МНС/пептид із належної афінністю.
Пептиди, які зв'язані з молекулами МНе І класу, зазвичай мають довжину в 8-14 амінокислот, і, найбільш типово, довжину в 9 амінокислот.
У людини є три різні генетичні локуси, які кодують молекули МНС І класу (молекули МНС людини мають також визначаються як лейкоцитарні антигени людини (НГА)): НГА-А, НІ А-В і
НІГ А-С. НІ А-А"О1, НІ А-А"О02 і НГ А-В"07 є прикладами різних алелів МНС І класу, які можуть експресуватися з цих локусів.
Таблиця 5
Частоти експресії Е для НІ А"Аб2 і НІ А-А"24 і найбільш поширених серотипів НІ А-ОВ.
Частоти, отримані з частот виявлення гаплотипів СОЇ серед населення США, адаптовано з публікації Могі і співавт. (Могтгі еї а!., 1997), з використанням формули Харді-Вайнберга: Е-1- (1- 92. Комбінація А"02 або А"24 з певними алелями НІ А-ОК внаслідок неврівноваженого зчеплення може бути збагаченою або збідненою у порівнянні з передбачуваною на основі індивідуальних частот виявлення. Докладну інформацію див. у Спапоск і співавт. (Спапоск еї а!., 2004). частоти алелів
Вб (Європеоїднараса(ПівнчнаАмерика)д /-/:///////|77771717171711126б71С
ОВО (Європеоїднараса(ПівнчнаАмерика)ї /-/:////|Ї7777717171711112сС1С рвб |Афроамериканці(ПівнчнаАмерика)ї 11111111 3370961 рво |Афроамериканці(ПівнчнаАмерика)ї 11111111 580961
Вб |Американцімонголоїдної раси (ПівнічнаАмерика)ї | 25095
ВО (|Американцімонголоїдної раси (ПівнічнаАмерика) | 1860956
Вб |Латиноамериканці(ПівнчнаАмерика)д 11117111 Зоо 1
ОВО |Латиноамериканці(ПівнчнаАмерика)д 17777171
АТЯЮ2 сЯпонія.д/777777777711111111111111111111111111111111111111111111159б61СсСсСС
Таблиця 5
Частоти експресії Е для НІ А"Аб2 і НІ А-А"24 і найбільш поширених серотипів НІ А-ОВ.
Частоти, отримані з частот виявлення гаплотипів СОЇ серед населення США, адаптовано з публікації Могі і співавт. (Могтгі еї а!., 1997), з використанням формули Харді-Вайнберга: Е-1- (1- 92. Комбінація А"02 або А"24 з певними алелями НІ А-ОК внаслідок неврівноваженого зчеплення може бути збагаченою або збідненою у порівнянні з передбачуваною на основі індивідуальних частот виявлення. Докладну інформацію див. у Спапоск і співавт. (Спапоск еї а!., 2004). частоти алелів
ПС 771: ПОН НО.
РІ КТ: ПОН НО: ке
Пептиди за винаходом, переважно якщо введені до складу вакцини за винаходом, як описано в цьому документі, зв'язуються з різними типами НІ А. Вакцина може також містити пептиди, що універсально зв'язуються з молекулами МНС Її класу, і пептиди, які зв'язуються з іншими алелями, які будуть корисними для персоналізованих ліків. Таким чином, вакцина за винаходом може застосовуватися для лікування раку у пацієнтів, що є А"02-позитивними, у той час як немає необхідності вибору алотипів МНС ІІ класу завдяки здатності цих пептидів до універсальності зв'язування.
У переважному втіленні термін "нуклеотидна послідовність" стосується гетерополімеру дезоксирибонуклеотида.
Нуклеотидна послідовність, що кодує конкретний пептид, олігопептид або поліпептид, може зустрічатися в природі або може бути сконструйована синтетично. Загалом, сегменти ДНК, які кодують пептиди, поліпептиди та білки за цим винаходом, зібрані з фрагментів кДНК і коротких олігонуклеотидних лінкерів або з серії олігонулеотидів з утворенням синтетичного гена, що здатний експресуватися в рекомбінантній транскрипційній одиниці, що містить регуляторні елементи, які отримані з оперона мікроорганізму або вірусу.
Термін "нуклеотидне кодування пептиду" в контексті цього винаходу означає нуклеотидну послідовність, що кодує пептид, включаючи штучні (створені руками людини) старт- і стоп- кодони, сумісні з біологічною системою, якою ця послідовність буде експресуватися, наприклад, з дендритними клітинами або іншою системою клітин, застосовних для отримання ТКР.
Для цілей цього винаходу посилання на послідовність нуклеїнової кислоти означає як одноланцюгову, так і дволанцюгову нуклеїнову кислоту. Отже, наприклад, для ДНК, конкретна послідовність, якщо контекст на вказує на інше, відноситься до одноланцюгової ДНК такої послідовності, дуплекса такої послідовності з її комплементом (дволанцюгова ДНК), і комплементу такої послідовності.
Термін "кодуюча ділянка" відноситься до тієї частини гена, яка або природно, або нормально кодує продукт експресії цього гена в його природному геномному оточенні, тобто до ділянки, що кодує іп мімо природний продукт експресії гена.
Кодуюча ділянка може бути ділянкою немутованого ("нормального"), мутованого або зміненого гена, або навіть ділянкою послідовності ДНК або гена, повністю синтезованого в лабораторії з використанням методів, добре відомих фахівцям у галузі синтезу ДНК.
Термін "продукт експресії" означає поліпептид або білок, котрий є природним трансляційним продуктом гена та будь-якої нуклеїново-кислотної послідовності, що кодує еквіваленти, які є результатом виродження генетичного коду, і, таким чином, кодує ту ж амінокислоту (ті ж амінокислоти).
Термін "фрагмент", стосовно кодуючої послідовності, означає частину ДНК, яка містить менш ніж повну кодуючу ділянку, і продукт експресії якої зберігає по суті ту ж біологічну функцію чи активність, що й продукт експресії повної кодуючої ділянки.
Термін "сегмент ДНК" відноситься до полімеру ДНК у формі окремого фрагмента чи як компонент більшої конструкції ДНК, що одержаний з ДНК, виділеної принаймні один раз по суті в чистій формі, тобто без забруднюючих ендогенних матеріалів та в кількості чи концентрації, яка дає змогу ідентифікувати, виконувати маніпуляції та відновлювати сегмент і його складові нуклеотидні послідовності за допомогою стандартних біохімічних методів, наприклад, з використанням вектора клонування. Такі сегменти надаються у формі відкритої рамки зчитування, без порушень внутрішніми нетрансльованими послідовностями, чи інтронів, які зазвичай присутні в еукаріотичних генах. Послідовності нетрансльованих ДНК можуть бути присутні за відкритою рамкою зчитування, де вони не заважають маніпуляціям або експресії кодуючих ділянок.
Термін "праймер" означає коротку нуклеїново-кислотну послідовність, котра може бути спарена з одним ланцюгом ДНК та надає вільний З'ОН-кінець, на якому ДНК-полімераза починає синтез дезоксирибонуклеотидного ланцюга.
Термін "промотор" означає ділянку ДНК, яка бере участь у зв'язуванні РНК-полімерази для ініціації транскрипції.
Термін "виділений" означає, що матеріал видаляється зі свого первісного середовища (наприклад, природного середовища, якщо він має природне походження). Наприклад, існуючий у природі полінуклеотид чи поліпептид, присутній у живих тваринах, не є виділеним, але той самий полінуклеотид чи поліпептид, відокремлений від якихось чи всіх співіснуючих матеріалів в природній системі, є виділеним. Такі полінуклеотиди можуть бути часткою вектора, і (або) такі полінуклеотиди чи поліпептиди можуть становити частину композиції і все ж таки бути виділеними, якщо такий вектор чи композиція не є частиною свого природного середовища.
Ці полінуклеотиди та рекомбінантні чи імуногенні поліпептиди, розкриті відповідно до цього винаходу, також можуть бути в "очищеній" формі. Термін "очищений" не вимагає абсолютної чистоти; скоріше він має відносне значення та може включати препарати високого ступеню очищення або препарати, які тільки частково очищені, в тому сенсі, як спеціалісти в цій галузі розуміють такі терміни. Наприклад, окремі клони, виділені з бібліотеки кДНК, були стандартним чином очищені до електрофоретичної однорідності. Очищення вихідного матеріалу чи природного матеріалу принаймні на порядок величини, переважно на два-три порядки, та більш
Зо переважно, на чотири-п'ять порядків величини, чітко передбачається в цьому винаході. Крім того, заявлений поліпептид, котрий має чистоту переважно в 99,999, або принаймні в 99,99 95 чи 99,9 95; і навіть бажано 99 95 за масою чи більше, також чітко розкритий у винаході.
Нуклеїнові кислоти та поліпептиди як продукти експресі, що розкриваються відповідно до цього винаходу, а також вектори експресії, які містять такі нуклеїнові кислоти і (або) такі поліпептиди, можуть бути в "збагаченій формі". Термін "збагачений" в тому виді, в якому він використовується тут, означає, що концентрація матеріалу принаймні приблизно в 2, 5, 10, 100 або 1000 разів перевищує його природну концентрацію (наприклад), бажано 0,01 95, за масою, принаймні краще приблизно 0,195 за масою. Також маються на увазі збагачені препарати приблизно в 0,5 9, 1 У, 5 Уо, 10 95 та 20 95 за масою. Послідовності, конструкції, вектори, клони та інші матеріали, які складають цей винахід, можуть, що більш сприятливо, бути у збагаченій чи виділений формі.
В цьому винаході терміни "частка", "сегмент" і "фрагмент", якщо вони використовуються по відношенню до поліпептидів, означають безперервну послідовність залишків, таких як амінокислотні залишки, причому ця послідовність утворює підгрупу більшої послідовності.
Наприклад, якщо поліпептид був підданий обробці будь-якою з типових ендопептидаз, таких як трипсин або хімотрипсин, олігопептиди, одержані в результаті такої обробки, будуть представляти частки, сегменти чи фрагменти початкового поліпептиду. Якщо такі терміни використовуються стосовно полінуклеотидів, вони означають продукти, одержані після обробки згаданих полінуклеотидів будь-якою з типових ендонуклеаз.
Відповідно до цього винаходу, термін "відсоткова ідентичність" або "відсоток ідентичності" відносно послідовності означає, що послідовність порівнюється із заявленою або описаною послідовністю після вирівнювання послідовності, яка порівнюється ("Послідовність, що порівнюється"), з описаною або заявленою послідовністю ("Контрольна послідовність").
Відсоткова ідентичність визначається відповідно до наведеної нижче формули:
Відсоткова ідентичність - 100 (1-(С/В) де С - кількість відмінностей між Контрольною послідовністю та Послідовністю, що порівнюється, на довжині вирівнювання між Контрольною послідовністю та Послідовністю, що порівнюється, де () кожна основа чи амінокислота в Контрольній послідовності, котра не має відповідної бо вирівняної основи чи амінокислоти у Послідовності, що порівнюється, і
(ії) кожний розрив у Контрольній послідовності та () кожна вирівняна основа чи амінокислота в Контрольній послідовності, котра не має відповідної вирівняної основи чи амінокислоти у Послідовності, що порівнюється, становить відмінність, і (іїї) вирівнювання повинне починатися з позиції 1 вирівняних послідовностей; і К є числом основ або амінокислот у Контрольній послідовності по довжині вирівнювання з
Послідовністю, що порівнюється, причому будь-який розрив, створений у Контрольній послідовності, також вважається основою або амінокислотою.
Якщо існує вирівнювання між Послідовністю, що порівнюється, та Контрольною послідовністю, для якої відсоткова ідентичність, що розрахована вище, є приблизно рівною чи більшою, ніж зазначена мінімальна Відсоткова ідентичність, то Послідовність, що порівнюється, має зазначену мінімальну відсоткову ідентичність до Контрольної послідовності, хоча можуть існувати вирівнювання, в яких розрахована, як описано вище, Відсоткова ідентичність є меншою, ніж зазначена Відсоткова ідентичність.
Як згадано вище, цей винахід також стосується пептиду, що містить послідовність, вибрану з групи послідовностей від ЗЕО ІЮО МО: 1 до 5ЕО ІО МО: 549 або їхній варіант, який на 88 95 є гомологічним послідовностям від ЗЕО ІЮ МО: 1 до 5ЕО ІЮ МО: 549 або їхнього варіанту, який викликає перехресну реакцію Т-клітин із зазначеним пептидом. Пептиди за винаходом здатні зв'язуватися з молекулою головного комплексу гістосумісності (МНС) людини | класу, або подовжені версії згаданих пептидів - з молекулою ЇЇ класу.
У цьому винаході термін "гомологічний" означає ступінь ідентичності (див. "Відсоткова ідентичність" вище) послідовностей двох амінокислотних послідовностей, тобто пептидних або поліпептидних послідовностей. Згадана вище "гомологія" визначається порівнянням двох послідовностей, що були вирівняні в оптимальних умовах щодо послідовностей, які порівнюються. Таку гомологічність послідовностей можна розрахувати, створивши вирівнювання за допомогою, наприклад, алгоритму СіивіаіМУ. Загальнодоступне програмне забезпечення для аналізу послідовностей, більш конкретно, Месіог МТІ, ЗЕМЕТУХ або інші інструменти можна знайти у базах даних у вільному доступі.
Фахівець у цій галузі в змозі оцінити, чи будуть Т-клітини, індуковані варіантом конкретного пептиду, вступати в перехресну реакцію із самим пептидом (Аррау вї а!., 2006; Соіотрені еї аї., 2006; опа евї аї., 2001; 7агетрба еї аї., 1997).
Під терміном "варіант" даної амінокислотної послідовності автори винаходу мають на увазі, що бокові ланцюги, наприклад, одного чи двох амінокислотних залишків змінюються (зокрема, шляхом заміни їх боковим ланцюгом залишку іншої природно існуючої амінокислоти чи якимось іншим боковим ланцюгом) таким чином, що пептид все ще здатний зв'язуватися з молекулою
НГА, по суті, у такий же спосіб, як і пептид, що складається з даної амінокислотної послідовності від ЗЕО ІЮ МО: 1 до 5ЕО ІО МО: 549. Наприклад, пептид може бути модифікований так, що він буде принаймні зберігати, чи навіть поліпшувати, здатність взаємодіяти та зв'язуватися зі зв'язувальною щілиною прийнятної молекули МНС, такої як НІ А-А"02 або -ОК, і у такий спосіб принаймні зберігати чи навіть поліпшувати здатність зв'язуватися з ТКР активованих Т-клітин.
Ці Т-клітини можуть згодом вступати в перехресну реакцію із клітинами і знищувати клітини, які експресують поліпептид, що містить природну амінокислотну послідовність спорідненого пептиду як визначено в аспектах цього винаходу. Як можна дізнатися з наукових публікацій і баз даних (Наттепзвзеє еї аї., 1999; Соакіп сеї а!., 1997), окремі позиції пептидів, що зв'язують НІ А, є типово якірними залишками, які формують ключову послідовність, що відповідає зв'язувальному мотиву рецептора НІА, який визначається полярністю, електрофізичними, гідрофобними властивостями і просторовою структурою поліпептидних ланцюгів, що утворюють зв'язувальну щілину. Отже, фахівець у цій галузі зможе модифікувати амінокислотну послідовність від 5ЕО ІЮ МО: 1 до ЗЕО ІЮО МО 549, зберігаючи відомі якірні залишки, і буде здатний визначити, чи зберігають такі варіанти здатність зв'язувати молекули МНС І або Ії класу. Варіанти за цим винаходом зберігають здатність зв'язуватися з ТКР активованої Т- клітини, який потім може вступати в перехресну реакцію 3з- і знищувати клітини, які експресують поліпептид, що містить природну амінокислотну послідовність спорідненого пептиду як визначено в аспектах винаходу.
Первісні (немодифіковані) пептиди, що розкриваються в цьому винаході, можуть модифікуватися заміщенням одного чи кількох залишків на різних, можливо, селективних, ділянках пептидного ланцюга, якщо не зазначено інакше. Переважно, щоб ці заміщення знаходилися на кінці амінокислотного ланцюга. Такі заміщення можуть бути консервативного характеру, наприклад, коли одна амінокислота замінюється амінокислотою подібної структури бо та характеристик, наприклад, коли гідрофобна амінокислота замінюється іншою гідрофобною амінокислотою. Навіть більш консервативною буде заміна амінокислот такого ж чи подібного розміру та хімічного характеру, наприклад, коли лейцин замінюється на ізолейцин. В дослідженнях варіацій послідовностей в сімействах природних гомологічних білків певні амінокислотні заміщення допускаються частіше, ніж інші, і вони часто демонструють кореляцію зі схожістю за розміром, зарядом, полярністю та гідрофобністю між первісною амінокислотою та її заміною, і це є основою для визначення "консервативних заміщень".
Консервативні заміщення визначаються в цьому документі як обмін в межах однієї з наведених нижче п'яти груп: група 1 - малі аліфатичні, неполярні чи слабо полярні залишки (Аа, зег, Тпг, Рго, Су); група 2 - полярні, негативно заряджені залишки та їх аміди (А5р, Авп,
Сім, СІп); група З - полярні, позитивно заряджені залишки (Ні, Аго, Гуз); група 4 - великі аліфатичні неполярні залишки (Меї, Геи, Пе, Маї, Сув); та група 5 - великі ароматичні залишки (Ре, Тут, Пр).
Менш консервативні заміщення можуть включати заміну однієї амінокислоти іншою, котра має подібні характеристики, але дещо відрізняється за розміром, наприклад, заміна аланіну залишком ізолейцину. Високо-неконсервативні заміни можуть включати заміщення кислої амінокислоти полярною, або навіть такою, що є основною за своїм характером. Такі "радикальні" заміщення не можуть, однак, відхилятись як потенційно неефективні, оскільки їх хімічні наслідки не є повністю прогнозованими, та радикальні заміщення також можуть несподівано призвести до сприятливих ефектів, які неможливо передбачити за простими хімічними принципами.
Звичайно, такі заміщення можуть включати структури, що відрізняються від звичайних |І- амінокислот. Отже, Ю-амінокислоти можуть заміщуватися І-амінокислотами, котрі зазвичай виявляються в антигенних пептидах цього винаходу та все ж охоплюються розкриттям в ньому.
Крім того, нестандартні амінокислоти (тобто інші, ніж стандартні амінокислоти природних білків), також можуть використовуватись для заміщення з метою отримання імуногенів та імуногенних поліпептидів відповідно до цього винаходу.
Якщо виявляється, що заміщення в більш ніж одній позиції приводять до утворення пептиду по суті з еквівалентною чи більшою антигенною активністю, як визначено нижче, тоді комбінації цих заміщень будуть досліджуватись з метою визначення, чи мають комбіновані заміщення додатковий чи синергічний вплив на антигенність пептиду. Як правило, в пептиді замінюються одночасно не більш ніж 4 позиції.
Пептид, що по суті складається з амінокислотної послідовності як зазначено у цьому документі, може мати одну або дві неякірні амінокислоти (див. нижче пояснення щодо якірного мотиву), що були замінені без того, щоб здатність пептиду зв'язуватись з молекулою головного комплексу гістосумісності (МНС) людини | або І класу суттєво змінилася або піддалася негативному впливу у порівнянні з немодифікованим пептидом. У іншому пептиді, що складається або по суті складається з цієї амінокислотної послідовності як зазначено у цьому документі, одна або дві амінокислоти можуть бути замінені партнерами по консервативній заміні (також див. нижче у цьому документі) без того, щоб здатність пептиду зв'язуватись з молекулою головного комплексу гістосумісності (МНС) людини І або І класу суттєво змінилася або піддалася негативному впливу у порівнянні з немодифікованим пептидом.
Ті амінокислотні залишки, що не є суттєвими для взаємодії з Т-клітинним рецептором, можуть бути модифіковані шляхом заміни іншою амінокислотою, введення якої не має суттєвого впливу на реактивність Т-клітин та не виключає зв'язування із відповідним МНС. Отже, за винятком зазначеної умови, пептид за винаходом може бути будь-яким пептидом (до цього терміну автори винаходу відносять олігопептид чи поліпептид), котрий включає амінокислотні послідовності або їхню частину чи її варіант, як він є.
Більш довгі (подовжені) пептиди також можуть бути придатними. Можливо, щоб епітопи комплексу МН І класу, хоча вони мають зазвичай довжину 8-11 амінокислот, утворювались шляхом процесингу з більш довгих пептидів чи білків, які включають фактичний епітоп. Бажано, щоби бокові залишки фактичного епітопу не завдавали значного впливу на протеолітичне розщеплення, необхідне для презентації фактичного епітопу під час процесингу.
Пептиди за цим винаходом можуть бути подовжені аж до чотирьох амінокислот, тобто 1, 2, З або 4 амінокислоти можуть біти додані до будь-якого кінця у будь-якій комбінації між 4:0 і 04.
Комбінації подовжень за цим винаходом можуть бути проілюстровані у Таблиці 6.
Таблиця 6:
Комбінації подовжень у пептидах за цим винаходом нини нн ЛИ 01111111 б,абої,абог,абоЗ,або4./-://-З нини нн ЛИ 01111111 б,абої,абог,абоЗ,або4./-://-/З
Амінокислотами для подовжень/елонгацій можуть бути пептиди вихідної послідовності білка або будь-яка інша амінокислота. Подовження може використовуватися для підвищення стабільності або розчинності пептидів.
Отже, епітопи відповідно цього винаходу можуть бути ідентичними природним пухлино- асоційованим та пухлино-специфічним епітопам або можуть включати епітопи, які відрізняються не більше ніж на чотири залишки від контрольного пептиду, за умови, що вони мають по суті ідентичну антигенну активність.
У альтернативному втіленні пептид є подовженим з будь-якого або з обох боків на більш ніж чотири амінокислоти, переважно до загальної довжини 30 амінокислот. Це може привести до утворення пептидів, що зв'язуються з молекулами МНС ІІ класу. Зв'язування з молекулами МНС
ЇЇ класу може бути перевірено методами, відомими в цій галузі.
Відповідно, за цим винаходом також пропонуються пептидні епітопи і епітопи пептидних варіантів, що зв'язуються з молекулами МНС І класу, де згаданий пептид або його варіант має загальну довжину від 8 до 100, переважно від 8 до 30, та найбільш переважно від 8 до 14, а саме 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14 амінокислот, а у випадку подовжених пептидів, що зв'язуються з молекулами НГА ЇЇ класу, вони можуть також досягати довжини 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21 або 22 амінокислоти.
Зрозуміло, що пептид або його варіант за цим винаходом здатний зв'язуватися з молекулою головного комплексу гістосумісності (МНС) людини І або ІІ класу. Зв'язування пептиду або його варіанту з комплексом МНС може бути досліджено методами, відомими в цій галузі.
Переважно, коли Т-клітини, специфічні по відношенню до пептиду за цим винаходом, досліджують у порівнянні із заміщеними пептидами, причому концентрація пептиду, за якої заміщені пептиди досягають половини максимального росту лізису відносно фонових значень, є не більше ніж 1 мМ, переважно не більше ніж 1 мкМ, ще більш переважно не більше ніж приблизно 1 нМ, і ще більш переважно не більше ніж приблизно 100 пМ, і найбільш переважно не більше ніж приблизно 10 пМ. Переважно також, щоб заміщений пептид розпізнавався Т- клітинами, отриманими від більш ніж однієї особи, принаймні двох, і більш переважно трьох
Зо осіб.
У особливо переважному втіленні цього винаходу пептид складається або по суті складається з амінокислотної послідовності від ЗЕО ІЮ МО: 1 до 5ЕО ІЮ МО: 549. "По суті складається 3" означає, що пептид за винаходом, на додаток до послідовності відповідно до будь якої послідовності від 560 ІЮ МО: 1 до 5ЕО ІЮО МО 549, чи його варіант, містить додаткові М- і (або) С-термінальні фрагменти послідовності амінокислот, які не обов'язково формують частину пептиду, що функціонує як епітоп для молекул МНС.
Проте ці фрагменти можуть бути важливими для забезпечення ефективного введення пептиду відповідно до цього винаходу в клітини. В одному з втілень цього винаходу пептид є частиною гібридного білка, який містить, наприклад, 80 М-термінальних амінокислот НІ А-ОВ- антиген-асоційованого інваріантного ланцюга (р33, надалі "Ії"), одержаного з МСВІ, інвентарний номер в генному банку (СепВапкК) Х00497. У інших злиттях пептиди за цим винаходом можуть бути злиті з антитілом, як описано в цьому документі, або з його функціональною частиною, зокрема з послідовністю антитіла, щоби бути специфічно націленими згаданими антитілами,
або, наприклад, злиті з антитілом або з послідовністю антитіла, що є специфічним до дендритних клітин, як описано в цьому документі.
Крім того, пептид чи його варіант може бути додатково модифікований для поліпшення його стабільності і (або) зв'язку з молекулами МНС, щоб викликати сильнішу імунну відповідь.
Методи такої оптимізації пептидної послідовності добре відомі в цій галузі та включають, наприклад, введення реверсованих пептидних зв'язків чи непептидних зв'язків.
В реверсованому пептидному зв'язку амінокислотні залишки не з'єднуються пептидними зв'язками (-СО-МН-), а пептидний зв'язок реверсується. Такі ретро-інверсивні пептидні міметики можуть бути отримані методами, відомими в даній галузі, наприклад, описаними в роботі
Мелієге і співавт. (1997) (Ме?лієге сеї а!ї., 1997), яка включена в цей документ шляхом посилання.
Такий підхід включає формування псевдо-пептидів, які містять зміни із залученням остова, а не орієнтації бокових ланцюгів. Мелієге і співавт. (Ме?ієге еї аї!., 1997) показують, що для відповіді
МН і Т-клітин-хелперів зазначені псевдо-пептиди є прийнятними. Ретро-інверсивні пептиди, які містять зв'язки МН-СО замість пептидних зв'язків СО-МН, набагато більш стійкі до протеолізу.
Непептидний зв'язок - це, наприклад, -СН2-МН, -СНе5-, -СНаСНе-, -«СН-СН-, -СОСН»-, -
СнН(ОН)СН»- та -СНг5О-. У патенті США 4 897 445 пропонується метод твердофазного синтезу непептидних зв'язків (-СН2-МН) в поліпептидних ланцюгах, що включає поліпептиди, синтезовані за допомогою стандартних методик, та непептидний зв'язок, синтезований шляхом реакції аміноальдегіду та амінокислоти в присутності МасСМВН»з.
Пептиди, що включають послідовності, описані вище, можуть бути синтезовані з додатковими хімічними групами, присутніми на їхніх аміно- і (або) карбоксильних кінцях, для посилення стабільності, біологічної доступності і (або) афінності пептидів. Наприклад, гідрофобні групи, такі як карбобензоксильні, данзильні чи трет-бутилоксикарбонільні, можуть додаватися до аміно-кінців пептидів. Подібним чином, на аміно-кінцях пептидів може розміщуватись ацетильна група чи 9-флуоренілметоксикарбонільна група. До карбоксильних кінців пептидів може бути додана також гідрофобна група, трет-бутилоксикарбонільна чи амідо- група.
Крім того, пептиди за винаходом можуть бути синтезовані для зміни їхньої просторової конфігурації. Наприклад, може використовуватися О-ізомер одного чи кількох амінокислотних залишків пептиду, а не звичайний І-ізомер. До того ж, принаймні один з амінокислотних залишків пептидів за винаходом може замінюватись одним з добре відомих амінокислотних залишків неприродного походження. Такі заміни можуть служити для підвищення стабільності, біологічної доступності і (або) здатності до зв'язування пептидів за винаходом.
Подібним чином, пептид чи його варіант за винаходом може модифікуватися хімічно, шляхом реакції окремих амінокислот до чи після синтезу пептиду. Приклади таких модифікацій добре відомі в цій галузі та узагальнені, зокрема, в роботі К. І ипабіад, Спетіса! Кеадепів ог
Ргоївіп Моаіїісайтоп, За еа. СВС Ргев5, 2004 (І ипаріад, 2004), яка включена в цей документ шляхом посилання. Хімічна модифікація амінокислот включає, але не обмежується ними, модифікацію шляхом ацилювання, амідинування, піридоксилювання лізину, відновлювального алкілування, тринітробензилювання аміногруп 2,4,6-тринітробензолсульфоновою кислотою (ТМВ5), амідну модифікацію карбоксильних груп та сульфгідрильну модифікацію шляхом окиснення пермурашиною кислотою цистеїну в цистеїнову кислоту, формування похідних ртуті, утворення змішаних дисульфідів з іншими тіольними сполуками, реакцію з імідом малеїнової кислоти, карбоксиметилювання йодоцтовою кислотою чи йодацетамідом та карбамоїлування ціанатом при лужному рН, хоча способи модифікації не обмежуються наведеними тут. В цьому відношенні досвідчений фахівець може звернутися до Глави 15 публікації Ситепі Ргоїосої5 Іп
Ргоївіп бсіепсе, Ед5. Соїїдап еї аї. (ойп Уміеу апа 5оп5 МУ 1995-2000) (Соїїдап еї а!., 1995), де докладно описано методику відносно хімічної модифікації білків.
Стисло, модифікація, наприклад, аргінільних залишків часто базується на реакції віцинальних дикарбонільних сполук, таких як фенілгліоксаль, 2,3-бутандіон і 1,2- циклогександіон, з утворенням адукту. Іншим прикладом є реакція метилгліоксалю з аргініновими залишками. Цистеїн може бути модифікований без супутньої модифікації інших нуклеофільних сайтів, таких як лізин та гістидин. В результаті велика кількість реагентів є доступною для модифікації цистеїну. Веб-сайти таких компаній, як Зідта-Аїагісн (перулумливідта-аїагісп.сот), надають інформацію щодо конкретних реагентів.
Селективне відновлення дисульфідних зв'язків також є поширеним. Дисульфідні зв'язки можуть утворюватися і окислюватися під час теплової обробки біофармацевтичних препаратів.
К-реагент Вудворда може використовуватися для модифікації деяких залишків глутамінової кислоти. М-(З-диметиламінопропіл)-М'-етилкарбодіїмід може використовуватися для утворення бо внутрішньомолекулярних зшивок між залишками лізину і глутамінової кислоти. Наприклад,
диетилпірокарбонат є реагентом для модифікації гістидильних залишків у білках. Для модифікації гістидину може також використовуватися 4-гідрокси-2ноненаль. Реакція залишків лізину та інших альфа-аміногруп є, наприклад, прийнятною для зв'язування пептидів до поверхонь або поперечного зшивання білків/пептидів. Лізин є сайтом для прикріплення поліетиленгліколю і головним сайтом модифікації при глікозилюванні білків. Метіонінові залишки у білках можна модифікувати, наприклад, йодацетамідом, брометиламіном і хлораміном Т.
Тетранітрометан і М-ацетилімідазол можуть використовуватися для модифікації тирозильних залишків. Поперечне зшивання шляхом утворення дитирозину може здійснюватися пероксидом водню/іонами міді.
У недавніх дослідженнях модифікації триптофану використовувалися М-бромсукцинімід, 2- гідрокси-о-нітробензилбромід або 3-бром-3-метил-2-(2-нітрофенілмеркапто)-ЗН-індол.: (ВМРЗ- скатол).
Успішна модифікація ПЕГ (поліетиленгліколем) терапевтичних білків та пептидів, що часто асоціюється з подовженням напівперіоду циркуляції при перехресному зшиванні білків із глутаральдегідом, поліетиленглікольдіакрилатом та формальдегідом, використовується для приготування гідрогелів. Хімічна модифікація алергенів для використання в імунотерапії часто досягається шляхом карбамоїлування ціанатом калію.
Пептид чи його варіант, де пептид є модифікованим або включає непептидні зв'язки, є переважним втіленням цього винаходу. Загалом, пептиди і їх варіанти (принаймні такі, що містять пептидні зв'язки між амінокислотними залишками) можуть бути синтезовані Етос- поліамідним методом твердофазного синтезу пептидів, як це розкрито у роботі І иКах і співавт. (І иКаз еї а!., 1981) і в посиланнях, що є в ній. Тимчасовий захист М-аміногрупи забезпечується 9-флуоренілметилоксикарбонільною (Етос) групою. Повторювальне розщеплення цієї дуже нестійкої до дії луг захисної групи виконується за допомогою 20 90 піперидину у М, М- диметилформаміді. Можна захистити функціональні групи бокових ланцюгів, такі як бутилові етери (у випадку серину, треоніну та тирозину), бутилові естери (у випадку глутамінової кислоти і аспарагінової кислоти), бутилоксикарбонільне похідне (у випадку лізину і гістидину), тритильне похідне (у випадку цистеїну) і 4-метокси-2,3,6-триметилбензосульфонільне похідне (у випадку
Зо аргініну). У сполуках, в яких С-термінальними залишками є глутамін або аспарагін, для захисту амідогруп бокових ланцюгів використовують 4,4"-диметоксибензгідрильну групу. Основою твердофазного носія є полідиметилакриламідний полімер, що складається з трьох мономерів: диметилакриламіду (каркасний мономер), біс-акрилоїлетилендіаміну (компонент для перехресного зшивання) і акрилоїлсаркозинметилового естеру (функціоналізуючий агент). Як агент, що утворює зв'язок пептиду і смоли, який піддається розщепленню, використовується нестійке до дії кислот похідне 4-гідроксиметилфеноксиоцтової кислоти. Всі амінокислотні похідні додають у вигляді заздалегідь синтезованих симетричних ангідридних похідних за винятком аспарагіну і глутаміну, які додають з використанням зворотної М,М-дициклогексилкарбодіїмід/1 - гідроксибезотриазол-опосередкованої реакції сполучення. Усі реакції сполучення і зняття захисту відслідковували за допомогою методів контролю з використанням нінгідрину, тринітробензолсульфонової кислоти і ізотину. Після завершення синтезу пептиди віддеплюють від смоли-носія з супутнім видаленням захисних груп бокових ланцюгів шляхом обробки 95 95 трифтороцтовою кислотою, що містить 5095 суміші поглиначів. Зазвичай використовувані поглиначі включають етандитіол, фенол, анізол і воду, конкретний вибір залежить від амінокислотних складових пептиду, що синтезується. Для синтезу пептидів можливе також використання комбінації твердофазних і рідкофазних методик (див., наприклад, (ВгисКаопег єї а!., 2004) і посилання, наведені в цій роботі).
Трифтороцтову кислоту видаляють випаровуванням у вакуумі з подальшим подрібнюванням із діетиловим етером, що забезпечує отримання сирого пептиду. Будь-які поглиначі, які присутні в матеріалі, видаляються простою процедурою екстракції, яка після ліофілізації водної фази дозволяє отримати сирий пептид, вільний від поглиначів. Реагенти для синтезу пептидів, як правило, можна придбати, наприклад, у компанії СаІріоспет-Момабріоспет (Нотінггем, Велика
Британія).
Очищення може виконуватися за допомогою одного будь-якого методу або їх комбінації, таких як перекристалізація, ексклюзійна хроматографія, іонообмінна хроматографія, хроматографія гідрофобної взаємодії та (зазвичай) зворотно-фазна високоефективна рідинна хроматографія із градієнтним розділенням, наприклад, з використанням системи ацетонітрил/вода.
Аналіз пептидів може виконуватися за допомогою тонкошарової хроматографії, бо електрофорезу, зокрема, капілярного електрофорезу, твердофазної екстракції (ТФЕ), зворотно-
фазної високоефективної рідинної хроматографії, амінокислотного аналізу після кислотного гідролізу та мас-спектрометрії із бомбардуванням прискореними атомами (ЕАВ), а також мас- спектрометричного аналізу МАО та Е5БІ-О-ТОБЕ.
Щоб вибрати надмірно презентовані пептиди, розраховується профіль презентації, який дозволяє оцінити медіану презентації у зразку, а також варіацію повторних вимірювань.
Профіль зіставляє зразки пухлини, що вивчається, з фоновим рівнем зразків нормальних тканин. Кожний із цих профілів можна потім консолідувати у показник надмірної презентації, підрахувавши р-значення за допомогою лінійної моделі змішаних ефектів (Ріпнеїго еїаї.,2015), з поправкою на багаторазове тестування за методом аналізу долі хибно-позитивних ідентифікацій (Вепіатіпі апа Носпбрега, 1995).
З метою ідентифікації і відносного кількісного визначення НІ А-лігандів методом мас- спектрометрії молекули НІГ А зразків тканин після шокової заморозки були очищені, і були виділені пептиди, що зв'язуються з молекулами НГА. Виділені пептиди були розділені, а їх послідовності були ідентифіковані методом рідинної хроматографії і мас-спектрометрії (РХ-МС) у режимі реального часу з іонізацією у наноелектроспреї. Отримані пептидні послідовності були перевірені порівнянням шаблону фрагментації природних ТОМАР, записаного для зразків раку яєчника, із шаблонами фрагментації відповідних синтетичних контрольних пептидів із ідентичними послідовностями. Оскільки було безпосередньо виявлено, що пептиди є лігандами молекул НГА на клітинах первинних пухлин, ці результати надали прямі докази природного процесингу і презентації ідентифікованих пептидів на тканинах первинних ракових пухлин, отриманих від пацієнтів, хворих на рак яєчника.
Патентовані інформаційні канали з наукової розробки ХРКЕЕБІОЕМТФ м2.1 (див., наприклад, заявку США 2013-0096016, яка таким чином включена в цей документ шляхом посилання в усій повноті) дозволяють ідентифікувати і виділяти відповідні кандидати у вакцини на базі надмірно презентованих пептидів, застосовуючи метод прямого відносного кількісного визначення рівнів
НІГ А-рестриктованих пептидів на ракових тканинах у порівнянні з декількома різними нераковими тканинами і органами. Цього вдалося досягти за рахунок розробки методу диференційного кількісного визначення на основі даних РХ-МС без використання ізотопної мітки, що були оброблені патентованими інформаційними каналами аналізу даних, в яких
Зо об'єднані алгоритми для ідентифікації послідовностей, спектральної кластеризації, підрахунку іонів, вирівнювання часу утримання, деконволюції за зарядовими станами і нормалізації.
Були встановлені рівні презентації, включаючи оцінку похибок для кожного пептиду і зразка.
Були ідентифіковані пептиди, що презентуються виключно на пухлинних тканинах, і пептиди, надмірно презентовані на пухлинних тканинах у порівнянні з нераковими тканинами і органами.
Комплекси НІ А-пептид, отримані із зразків тканин раку яєчника, були очищені, і пептиди, зв'язані з молекулами НІ А, були виділені і проаналізовані методом РХ-МС (див. приклади). Усі досліджувані ТОМАР були за допомогою цього підходу ідентифіковані на зразках пухлин первинного раку яєчника, що підтвердило факт їх презентації на клітинах первинного раку яєчника.
Ідентифіковані на тканинах багатьох пухлин раку яєчника і на нормальних тканинах ТОМАР були кількісно визначені методом РХ-МС без застосування ізотопних міток з реєстрацією спектрів у режимі підрахунку іонів. Цей метод базується на припущенні, що площі піків РХ-МС пептиду корелюють з його кількістю у зразку. Усі сигнали, які залежать від кількості пептиду, у різних експериментах за методом РХ-МС, були нормалізовані на основі середніх значень, усереднені по зразках і злиті у гістограму, що має назву профілю презентації. Профіль презентації об'єднує дані різних методів аналізу, таких як пошук по базах даних для білків, спектральної кластеризації, деконволюції за зарядовими станами (розрядження) і вирівнювання часу утримання і нормалізації.
Предметом цього винаходу є пептиди для лікування раку та інших пухлин, переважно раку яєчника, які надмірно чи виключно презентують пептиди за цим винаходом. Ці пептиди, за даними мас-спектрометрії, презентуються природно молекулами НІА на зразках тканин первинного раку яєчника людини.
Багато з вихідних генів/білків (які також визначаються як "повнорозмірні білки" або "базові білки"), із яких отримані пептиди, як було показано, відзначаються високою надекспресією у клітинах раку у порівнянні з нормальними тканинами - "нормальні тканини" у контексті даного винаходу означає або здорові клітини тканин яєчника, або клітини інших здорових тканин, що свідчить про високий ступінь зв'язку пухлин із вихідними генами. Більш того, самі пептиди дуже надмірно презентуються на тканинах пухлини - "пухлинні тканини" у контексті даного винаходу означає зразок від пацієнта, що страждає на рак яєчника, але не на нормальних тканинах.
Зв'язані з НГА пептиди можуть розпізнаватися імунною системою, а саме Т-лімфоцитами. Т- клітини можуть руйнувати клітини, що презентують розпізнаний комплекс НіА/пептид, наприклад, клітини раку яєчника, що презентують отримані пептиди.
Було показано, що пептиди за цим винаходом здатні стимулювати відповідь Т-клітин і (або) надмірно презентуються, і, таким чином, можуть використовуватися для отримання антитіл і (або) ТКР, таких як розчинні ТКР, за цим винаходом. Більш того, пептиди, якщо вони утворюють комплекси з відповідними молекулами МНС, також можуть використовуватися для продукції антитіл і (або) ТКР, особливо рТКР за цим винаходом. Відповідні способи добре відомі фахівцю у цій галузі, і їх описи можна знайти також у відповідній літературі. Отже, пептиди за цим винаходом можуть використовуватись для генерації імунної відповіді організму пацієнта, завдяки чому клітини пухлини можуть бути зруйновані. Імунна відповідь організму пацієнта може індукуватися прямим введенням пацієнту описаних пептидів або відповідних прекурсорних речовин (наприклад, подовжених пептидів, білків або нуклеїнових кислот, які кодують ці пептиди), ідеально в комбінації з агентом, що підвищує імунну реакцію (тобто ад'ювантом). Можна очікувати, що імунна відповідь, що виникає в результаті такої терапевтичної вакцинації, є високо специфічною по відношенню до клітин пухлини, оскільки цільові пептиди за цим винаходом не є присутніми на нормальних тканинах у достатній кількості копій, що попереджає ризик небажаних аутоїмунних реакцій проти нормальних клітин в організмі пацієнта.
Цей винахід також стосується Т-клітинних рецепторів (ТКР), що містять альфа- ланцюг і бета-ланцюг ("альфа/бета ТКР"М. Предметом цього винаходу також є пептиди НАМСМК1-001, здатні зв'язуватися з ТКР і антитілами, якщо вони презентуються молекулою МНС. Цей опис стосується також нуклеїнових кислот, векторів і клітин-хазяїв для експресії ТКР і пептидів за цим описом і способів їх використання.
Термін "Т-клітинний рецептор" (скорочено ТКР) означає гетеродимерну молекулу, що містить альфа-поліпептидний ланцюг (альфа-ланцюг) і бета-поліпептидний ланцюг (бета- ланцюг), де гетеродимерний рецептор здатний зв'язуватися з пептидним антигеном, що презентується молекулою НГ А. Цей термін також охоплює так звані гамма/дельта ТКР.
В одному з втілень пропонується спосіб отримання ТКР, як описано у цьому документі, де
Зо згаданий спосіб включає культивування клітини-хазяїна, здатної експресувати ТКР за умов, прийнятних для сприяння експресії цих ТКР.
Цей винахід в іншому аспекті стосується способів за цим описом, де антиген навантажують на молекули МНС | або І класу, що експресуються на поверхні відповідної антиген- презентуючої клітини або штучної антиген-презентуючої клітини шляхом контакту достатньої кількості антигену з антиген-презентуючою клітиною або антиген навантажують на тетрамери
МНЄ І або ІІ класу шляхом тетрамеризації мономерних комплексів антиген/МнНе І або ЇІ класу.
Альфа- і бета-ланцюги альфа/бета ТКР і гамма- і дельта-ланцюги гамма/дельта ТКР взагалі вважаються як такі, кожний із яких має два "домени", а саме варіабельні і константні домени.
Варіабельний домен складається з послідовно розташованих варіабельного сегменту (М) і з'єднувального сегменту (У). Варіабельний домен може також включати лідерний сегмент (І).
Бета- і дельта-ланцюги можуть також включати ЮО-сегмент. Альфа- і бета- константні домени можуть також містити С-кінцеві трансмембранні (ТМ) домени, які заякорюють альфа- і бета- ланцюги на клітинній мембрані.
Що стосується гамма/дельта ТКР, термін "гамма-варіабельний домен ТКР" у тому вигляді, в якому він використовується тут, означає зчеплення сегменту гамма М ТКР (ТЕОУ) без лідерного сегменту (І) і сегменту ТКР гамма У (ТКС)), а термін "константний домен ТКР гамма" означає позаклітинний сегмент ТКОС або С-кінцеву усічену послідовність ТКОС. Подібним чином, термін "дельта-варіабельний домен ТКР" означає зчеплення сегменту ТКР дельта М (ТКОМ) без лідерного сегменту (І) і сегменту ТКР дельта 0/7) (ТКОБ/ТКО))), а термін "константний домен
ТКР дельта" означає позаклітинний сегмент ТКЕОС або С-кінцеву усічену послідовність ТКОС.
ТКР за цим описом переважно з'єднуються з комплексом пептид за цим винаходом- молекула НГА зі спорідненістю (КО) приблизно 100 мкМ або менше, приблизно 50 мкМ або менше, приблизно 25 мкМ або менше, або приблизно 10 мкМ або менше. Більш переважними є високоафінні ТКР, які мають спорідненості приблизно 1 мкМ або менше, приблизно 100 нМ або менше, приблизно 50 нМ або менше, приблизно 25 нМ або менше. Приклади, що не мають обмежувального характеру, переважних діапазонів спорідненості для ТКР за цим винаходом включають від приблизно 1 нМ до приблизно 10 нМ, від приблизно 10 нМ до приблизно 20 нМ, від приблизно 20 нМ до приблизно 30 нМ, від приблизно 30 нМ до приблизно 40 нМ, від приблизно 40 нМ до приблизно 50 нМ, від приблизно 50 нМ до приблизно 60 нМ, від приблизно
Зо
60 нМ до приблизно 70 нМ, від приблизно 70 нМ до приблизно 80 нМ, від приблизно 80 нМ до приблизно 90 нМ, від приблизно 90 нМ до приблизно 100 нМ.
В тому виді, в якому він використовується тут, у зв'язку з ТКР за цим винаходом, "специфічне зв'язування" та його граматичні варіанти використовуються для позначення ТКР, що має спорідненість (КО) для комплексу пептид НАМСН1-001-молекула НІГ А 100 мкМ або менше.
Альфа/бета гетеродимерні ТКР за цим винаходом можуть мати введені дисульфідні зв'язки між їх константними доменами. Переважними ТКР цього типу включають такі, що мають послідовність константних доменів ТКАС і послідовність константних доменів ТЕВС1 або
ТКВС2, за винятком того, що Тпг 48 послідовності ТЕАС і бег 57 послідовності ТКВСІ1 або
ТКВС2 заміщені залишками цистеїну, причому згадані цистеїни утворюють дисульфідний зв'язок між послідовністю константних доменів ТКАС і послідовністю константних доменів
ТАВСІ1 або ТКВС2 Т-клітинного рецептору.
З введеним згаданим вище міжланцюговим зв'язком або без нього, альфа/бета гетеродимерні ТКР за цим винаходом можуть мати послідовність константних доменів ТКАС і послідовність константних доменів ТЕВСІ або ТЕВС2, а послідовність константних доменів
ТКАС і послідовність константних доменів ТЕВСІ або ТКВС2 Т-клітинного рецептору можуть бути з'єднані природним дисульфідним зв'язком між Субз4 екзону 2 у ТКАС ії Суз2 екзону 2 у
ТЕВС1 або ТКВС2.
ТКР за цим описом можуть включати детектовану мітку, вибрану з групи, що складається з радіонукліду, флуорофору і біотину. ТКР за цим описом можуть бути кон'юговані з терапевтично активною речовиною, такою як радіонуклід, хіміотерапевтичний препарат або токсин.
У одному втіленні ТКР за цим винаходом, що має принаймні одну мутацію в альфа-ланцюгу і (або) має принаймні одну мутацію у бета-ланцюгу, має модифіковане глікозилювання у порівнянні з немутованим ТКР.
У одному втіленні ТКР, що містить принаймні одну мутацію в альфа-ланцюгу і (або) у бета- ланцюгу ТКР має спорідненість до і (або) напівперіод зв'язування з комплексом пептид за цим винаходом-молекула НГА, які принаймні вдвічі вище таких для ТКР, що містить немутований альфа-ланцюг ТКР і (або) немутований бета-ланцюг ТКР. Підсилення афінності пухлино-
Зо специфічних ТКР та її застосування грунтується на існуванні "вікна" для оптимальної афінності
ТКР. Існування такого вікна базується на спостереженнях, що ТКР, специфічні до патогенів, рестриктованих за молекулами НІ А-А2, мають значення КО, які, як правило, приблизно у 10 разів нижчі, якщо їх порівняти з ТКР, специфічних до "своїх" власних антигенів (аутоантигенів), рестриктованих за молекулами НІ А-А2. Зараз відомо, що хоча пухлинні антигени мають потенціал ставати імуногенними, оскільки пухлини виникають із власних клітин індивідуума, тільки мутовані білки або білки зі зміненою трансляційною модифікацією будуть сприйматися імунною системою як чужорідні. Антигени, які мають підвищену активність або надмірно експресуються (так звані аутоантигени), зовсім необов'язково викликають функціональну імунну відповідь на пухлину. Т-клітини, що експресують ТКР, які є високореактивними по відношенню до цих антигенів, будуть піддаватися негативному відбору у тимусі у процесі, відомому як центральна толерантність, що означає, що залишаться лише Т-клітини з низькоафінними ТКР до аутоантигенів. Таким чином, афінність ТКР або їх варіантів за цим описом до пептиду за цим винаходом можна підвищити методами, добре відомими фахівцям у цій галузі.
Цей винахід також стосується способу ідентифікації і виділення ТКР відповідно до цього опису, причому згаданий спосіб включає інкубування МКПК, отриманих у НІ А-А"02-негативних здорових донорів, із А2г/мономерами пептидів за цим винаходом, інкубування МКПК з тетрамер- фікоеритрином (ФЕ) і виділення високоавідних Т-клітин методом флуоресцентного сортування клітин на аналізаторі ЕАС5 Саїїриг.
Цей винахід також стосується способу ідентифікації і виділення ТКР відповідно до цього опису, де згаданий спосіб включає отримання трансгенної миші з цілими локусами генів людини
ТКРОбВ (1,1 ї 0,7 п. н.), Т-клітини якої експресують широкий спектр ТКР людини, які компенсують дефіцит ТКР у миші, імунізацію миші пептидом за цим винаходом, інкубування МКПК, отриманих від трансгенної миші, з тетрамер-фікоеритрином (ФЕ) і виділення високоавідних Т-клітин методом флуоресцентного сортування клітин на аналізаторі ЕАС5 Саїїриг.
Згідно з одним аспектом винаходу, для отримання Т-клітин, що експресують ТКР за цим винаходом, нуклеїнові кислоти, які кодують ТКР-альфа і (або) ТКР-бета ланцюги за цим винаходом, клонують у вектори експресії, такі як гамма-ретровірус або лентівірус. Рекомбінантні віруси отримують, а потім перевіряють на функціональність, таку як специфічність до антигену і функціональну авідність. Аліквоту кінцевого продукту після цього використовують для трансдукції цільової популяції Т-клітин (як правило очищених від МКПК пацієнта), яку культивують перед введенням пацієнту.
У іншому аспекті, з метою отримання Т-клітин, які експресують ТКР за цим описом, синтезують РНК ТКР за методиками, відомими фахівцям у цій галузі, наприклад, використанням систем транскрипції іп міго. Синтезовані іп міго РНК ТКР потім вводять у первинні СОв'ж Т- клітини, отримані від здорових донорів електропорацією для повторної експресії альфа- і (або) бета-ланцюгів ТКР, специфічних для пухлини.
З метою підвищення рівня експресії нуклеїнові кислоти, що кодують ТКР за цим описом, можна функційно зв'язати із сильними промоторами, такими як довгі кінцеві повтори ретровірусу (ТК), цитомегаловірусу (СМУМ), вірусу стовбурових клітин мишей (М5СМ) З, фосфогліцераткіназа (РОК), бета-актин, убіквітин і композиційний промотор мавпячого вірусу 40 (5М40)/2043, фактор елонгації (ЕБ)-їа і промотор вірусу некрозу селезінки (ЗЕЕМ). У переважному втілення промотор є гетерологічним по відношенню до нуклеїнової кислоти, що експресується.
На додаток до сильних промоторів, касети експресії ТКР за цим описом можуть містити додаткові елементи, які можуть посилити трансгенну експресію, включаючи центральний поліпуриновий тракт (СРРТ), який сприяє ядерній транслокації лентівірусних конструкцій (Боїеплі і співавт., 2000), посттранскрипційний регуляторний елемент вірусу гепатиту Вучук американських байбаків (мРКЕ), який підвищує рівень трансгенної експресії шляхом підвищення стабільності РНК (7ийегеу і співавт., 1999).
Альфа- і бета-ланцюги ТКР за цим винаходом можуть кодуватися нуклеїновими кислотами, розташованими у різних векторах, або кодуватися полінуклеотидами, розташованими у одному і тому ж векторі.
Щоб досягти високого рівня поверхневої експресії ТКР, необхідно, щоб як альфа-, так і бета- ланцюги ТКР введеного ТКР транскрибувалися на високому рівні. Щоб досягти цього, альфа- і бета-ланцюги ТКР за цим описом можуть бути клоновані у біцистронні конструкції в одному векторі, які, як було показано, здатні подолати цю перешкоду. Використання ділянки внутрішньої посадки рибосоми вірусу (ІКЕ5) між альфа- і бета-ланцюгами ТКР приводить до координованої експресії обох ланцюгів, оскільки альфа- і бета-ланцюги ТКР утворюються з
Зо одного транскрипту, який розділяється на два білки в ході трансляції, забезпечуючи утворення рівних молярних співвідношень альфа- і бета-ланцюгів ТКР. (Зсптій і співавт. 2009).
Нуклеїнові кислоти, що кодують ТКР за цим описом, можуть бути кодон-оптимізовані для підвищення рівня експресії клітиною-хазяїном. Надмірність генетичного коду дозволяє деяким кислотам кодуватися більш ніж одним кодоном, але певні кодони є менш "оптимальними" ніж інші внаслідок відносній наявності відповідних РНК, а також інших факторів (Зивіаї550оп і співавт., 2004). Як було показано, модифікація послідовностей генів альфа- і бета-ланцюгів ТКР таким чином, щоб кожна амінокислота кодувалася оптимальним кодоном для експресії генів у ссавців, а також видалення мотивів нестабільності ІРНК або прихованих сайтів сплайсингу, значно підвищує експресію генів альфа- і бета-ланцюгів ТКР (ЗспокКеп і співавт., 2006).
Крім того, порушення парування між введеними і ендогенними ланцюгами ТКР може привести до набуття таких видів специфічності, які становлять значний ризик для аутоімунності.
Наприклад, утворення суміші димерів ТКР може знизити кількість молекул СОЗ, що доступні для утворення належнім чином спарених комплексів ТКР, і у такий спосіб може значно зменшити функціональну авідність клітин, які експресують введені ТКР (Киваї! і співавт., 2007).
Для зменшення порушень парування, С-кінцевий домен ланцюгів введеного ТКР за цим описом можна модифікувати, щоб підвищити взаємодію між ланцюгами, у той же час зменшити здатність введених ланцюгів утворювати пари з ендогенним ТКР. Ці підходи можуть включати заміну С-кінцевих доменів альфа- і бета-ланцюгів ТКР їх мишачими двійниками (наближений до мишачого С-кінцевий домен), утворюючи другий міжланцюговий дисульфідний зв'язок у С- кінцевому домені шляхом введення другого залишку цистеїну як у альфа-ланцюги ТКР, такі у бета-ланцюги ТКР введеного ТКР (цистеїнова модифікація); перестановка взаємодіючих залишків С-кінцевих доменів альфа- і бета-ланцюгів ТКР ("виступ-у-западину"); і злиття варіабельних доменів альфа- і бета-ланцюгів ТКР безпосередньо з СОЗС (злиття СОЗС). (ФСП і співавт. 2009).
У одному втіленні клітина-хазяїн отримана методами генної інженерії з метою експресувати
ТКР за цим описом. У переважних втіленнях клітина-хазяїн є Т-клітиною людини або попередником Т-клітини людини. У деяких втіленнях Т-клітина або попередник Т-клітини отримані від хворого на рак пацієнта. У інших втіленнях Т-клітина або попередник Т-клітини отримані від здорового донора. Клітини-хазяї за цим описом можуть бути алогенними або аутологічними по відношенню до пацієнта, якого належить лікувати. У одному втіленні клітиною- хазяїном є гамма/дельта Т-клітина, трансформована для експресії альфа/бета ТКР. "Фармацевтична композиція" є переважно композицією, прийнятною для введення людині у медичній установі. Переважно, фармацевтична композиція є стерильною і виробляється відповідно до вимог належної виробничої практики (ЗМР).
Фармацевтичні композиції включають пептиди або у вільній формі, або у формі фармацевтично прийнятної солі (див. також вище). Термін "фармацевтично прийнятна сіль" в контексті цього винаходу означає похідну сполуку розкритих пептидів, в якій пептид модифікується шляхом створення кислої чи основної солі речовини. Наприклад, кислі солі готуються з вільної основи (як правило, де нейтральна форма лікарського засобу має нейтральну -МН2-групу), за участю реакції з прийнятною кислотою. Прийнятні кислоти для приготування кислих солей включають органічні кислоти, такі, наприклад, як оцтова кислота, пропіонова кислота, гліколева кислота, піровиноградна кислота, щавлева кислота, яблучна кислота, малонова кислота, бурштинова кислота, малеїнова кислота, фумарова кислота, винна кислота, лимонна кислота, бензойна кислота, корична кислота, мигдальна кислота, метансульфокислота, етансульфокислота, п-толуолсульфокислота, саліцилова кислота і т. ін., а також неорганічні кислоти, наприклад, соляна кислота, бромистоводнева кислота, сірчана кислота, азотна кислота, фосфорна кислота і т. ін. | навпаки, приготування основних солей кислотних компонентів, які можуть бути присутніми на пептиді, здійснюється з використанням фармацевтично прийнятної основи, такої як гідроксид натрію, гідроксид калію, гідроксид амонію, гідроксид кальцію, триметиламін і тому подібні.
В особливо переважному втіленні фармацевтичні композиції містять пептиди у вигляді солей оцтової кислоти (ацетати), трифторацетатів або солей соляної кислоти (хлориди).
Переважно, лікарський засіб за цим винаходом є імунотерапевтичним засобом, таким як вакцина. Вона може вводитися безпосередньо пацієнту, в уражений орган або системно в/ш, в/м, п/ш, в/ч і в/в, або вноситися ех мімо у клітини, отримані від пацієнта, чи у клітинну лінію людини, котрі згодом вводяться пацієнту, або використовуватись іп мійго для селекції субпопуляції з імунних клітин, які отримані від пацієнта і які потім знов вводяться йому. Якщо нуклеїнова кислота вводиться у клітини іп міго, тоді може бути корисним, щоби клітини були
Зо трансфекованими, щоби спільно експресувати імуностимулюючі цитокіни, наприклад, інтерлейкін-2. Пептид може бути, по суті, чистим, або поєднаним з імуностимулюючим ад'ювантом (див. нижче), чи використовуватись в комбінації з імуностимулюючими цитокінами, або вводитися з належною системою доставки, наприклад, ліпосомами. Пептиди також можуть бути кон'юговані з належним носієм, таким як гемоціанін фісурели (КІН) або маннан (див. патентну заявку УМО 95/18145 та роботу (І опаєпескКег евї аї., 1993)). Пептид також може бути міченим або бути злитим білком чи гібридною молекулою. Очікується, що пептиди, послідовності яких наведені у цьому винаході, стимулюють СО4 або СО8 Т-клітини. Проте стимуляція СО8Т-клітин є більш ефективною за умови сприяння з боку СО4 Т-хелперних клітин.
Таким чином, для епітопів МНС І класу, які ссимулюють СО8 Т-клітини, партнер по злиттю або сегменти гібридної молекули принагідно постачають епітопи, які стимулюють СО4-позитивні Т- клітини. СО4- ії СО8-стимулюючі епітопи добре відомі фахівцям в цій галузі і включають епітопи, ідентифіковані в цьому винаході.
Згідно з одним аспектом винаходу, вакцина містить принаймні один пептид, який має амінокислотну послідовність від ЗЕО ІЮ МО:1 до 5ЗЕО ІЮ МО:549, і принаймні один додатковий пептид, переважно, від двох до 50, більш переважно, від двох до 25, ще більш переважно, від двох до 20, і найбільш переважно, два, три, чотири, п'ять, шість, сім, вісім, дев'ять, десять, одинадцять, дванадцять, тринадцять, чотирнадцять, п'ятнадцять, шістнадцять, сімнадцять або вісімнадцять пептидів. Пептид(и) може (можуть) бути виділений (виділені) з одного або більшої кількості специфічних ТАА ії може (можуть) зв'язатися з молекулами МНС І класу.
Згідно з ще одним аспектом винаходу пропонується нуклеїнова кислота (наприклад, полінуклеотид), що кодує пептид чи його варіант за винаходом. Полінуклеотид може бути, наприклад, ДНК, кКДНК, ПНК, СНК, РНК чи їх комбінацією, як одноланцюговою, так і (або) дволанцюговою, або природними чи стабілізованими формами полінуклеотидів, такими як, наприклад, полінуклеотиди з фосфоротіоатним скелетом; він може містити або не містити інтрони, за умови, що він кодує пептид. Звичайно, що тільки пептиди, що містять природно існуючі амінокислотні залишки, з'єднані природно існуючими пептидними зв'язками, можуть бути кодовані полінуклеотидом. Згідно з ще одним аспектом цього винаходу, пропонується вектор експресії, здатний експресувати поліпептид відповідно до винаходу.
Було розроблено багато способів зв'язування полінуклеотидів, особливо ДНК, з векторами, 60 наприклад, за допомогою комплементарних липких кінців. Наприклад, можуть бути додані комплементарні гомополімерні хвости до сегменту ДНК, щоб бути вставленими у вектор ДНК.
Цей вектор і сегмент ДНК потім з'єднують водневим зв'язком між комплементарними гомополімерними хвостами з утворенням молекул рекомбінантної ДНК.
Синтетичні лінкери, що містять один або більше сайтів рестрикції, забезпечують альтернативний спосіб об'єднання фрагментів ДНК у вектори. Синтетичні лінкери, що містять різноманітні сайти впізнавання рестрикційних ендонуклеаз, комерційно доступні у декількох джерелах, включаючи компанію Іпіегпайопаї! Віотесппоіодіез Іпс., Нью Хейвен, Конектикут, США.
У бажаному методі модифікації ДНК, що кодує поліпептид за винаходом, використовується полімеразна ланцюгова реакція, як це розкрито у роботі ЗаїКі КК і співавт. (ЗаїКі єї аї!., 1988).
Цей метод може використовуватися для введення цієї ДНК у відповідний вектор, наприклад, шляхом створення відповідних сайтів рестрикції, або його можна застосовувати для модифікації
ДНК у інший прийнятний спосіб, відомий фахівцеві у цій галузі. Якщо використовуються вірусні вектори, переважними є вектори на основі поксвірусу або аденовірусу.
Ця ДНК (або, у випадку ретровірусного вектора, РНК) може потім експресуватися у відповідному організмі-хазяїні, утворюючи поліпептид, що містить пептид або чи його варіант за винаходом. Таким чином, ДНК, яка кодує пептид чи його варіант за винаходом, може використовуватися відповідно до відомих методик, належним чином модифікованих виходячи з ідей, розкритих у цьому описі, для конструювання вектора експресії, який після цього використовується для трансформації відповідних клітин-хазяїв таким чином, щоб вони набули здатність експресувати і виробляти пептиди за винаходом. Ці методики включають такі, що розкриті, наприклад, у патентах США 4 440 859, 4 530 901,4 582800,4677 063, 4 678 751, 4 704 362, 4 710 463, 4 757 006, 4 76607514 810 648.
Ця ДНК (або, у випадку ретровірусного вектора, РНК), яка кодує поліпептид, що є предметом цього винаходу, може бути з'єднана з широким спектром інших послідовностей ДНК для введення у відповідну клітину-хазяїна. Ця супутня ДНК буде залежати від природи хазяїна, способу представлення ДНК хазяїну, і від того, необхідне утримання в епісомальній чи інтегрованій формі.
Зазвичай ДНК вставляється у вектор експресії, такий як плазміда, у належній орієнтації і коректній рамці зчитування для експресії. Якщо необхідно, ДНК може бути зв'язаною з
Зо відповідними нуклеотидними послідовностями, що забезпечують координацію транскрипції і трансляції, що розпізнаються бажаним хазяїном, хоча такі контрольні елементи зазвичай містяться у векторі експресії. Вектор згодом вводиться хазяїну із використанням стандартних методик. Загалом, не всі хазяї трансформуються вектором. Отже, необхідно виділити трансформовані клітини-хазяї. Одна з методик виділення включає введення до складу вектора експресії такої послідовності ДНК із будь-якими необхідними контрольними елементами, яка кодує вибрану ознаку у трансформованій клітині, таку як резистентність до антибіотиків.
Як альтернатива, ген для такої вибраної ознаки може бути вбудованим в інший вектор, який використовується для спільної трансформації бажаної клітини-хазяїна.
Клітини-хазяї, які були трансформовані рекомбінантною РНК за винаходом, потім культивують протягом достатнього періоду часу у відповідних умовах, які відомі фахівцеві в цій галузі з точки зору ідей, розкритих тут, з метою дати можливість експресувати поліпептид, який потім може бути виділений.
Фахівцям відомі багато експресійних систем, включаючи бактерії (наприклад, Е. сої ії Васійи5 5,ибБій5), дріжджі (наприклад, басспаготусе5 сегемізіаеє), міцеліальні гриби (наприклад,
Азрегдійи5 5рес.), клітини рослин, тварин і комах. Переважно, система може бути клітинами ссавців, таких як клітини СНО, які комерційно доступні від Американської колекції типових культур АТСС.
Типова векторна плазміда клітин ссавців для конститутивної експресії включає вірус СММУ або опромотор 5М40 з відповідним поліаденільним хвостом роїу(А)-їай і маркером резистентності, таким є неоміцин. Одним із прикладів є рем, доступний від компанії Ріагтасіа,
Піскатеуей, Нью-Джерсі, США. Прикладом вектора індуцибельної експресії у ссавців є рРМ5О, також доступний від компанії Рпагтасіа. Корисними є плазмідні вектори дріжджів рК5403-406 і рАб413-416, які доступні від компанії Зігаїадепе Сіопіпд Зузіет5, Ла Джола, Каліфорнія 92037,
США. Плазміди рКк5403, рК5404, рїК5405 і рК5406 є дріжджовими інтегруючими плазмідами (Сир) і включають дріжджові селективні маркери НІЗЗ, ТКРІ1, ГЕЦО2 ї ОКАЗ. Плазміди рК5413- 416 є дріжджовими плазмідами з центромерами (Уср). Вектори на базі промотору СММ (наприклад, від компанії бідта-АїЇдгісй) забезпечують тимчасову або стабільну експресію, цитоплазматичну експресію або секрецію і М-термінальне або С-термінальне мічення для різних комбінацій ЕРГАС, ЗхХРГАС, с-тус або МАТ. Ці злиті білюию можна використовувати для виявлення, очищення і аналізу рекомбінантного білка. Злиття з використанням двох міток забезпечує гнучкість під час виявлення.
Сильна регуляторна область промотора цитомегаловірусу (СММ) людини підвищує рівні конститутивної експресії білка у клітинах лінії СО5 до таких високих значень, як 1 мг/л. У разі не таких активних ліній клітин рівні білка зазвичай становлять «0,1 мл/л. Присутність ділянки початку реплікації у фрагменті 5440 приводить до високих рівнів реплікації ДНК у пермісивних клітинах СО5. Вектори СМУ, наприклад, можуть містити РМВ1 (похідне рВК322) ділянку початку реплікації у клітинах бактерій, ген бета-лактамази для вибору резистентності бактерій до ампіциліну, роїу(А) гормону росту людини і ділянку початку реплікації 7. Вектори, що містять лідерну послідовність препротрипсину (РРТ), можуть направляти секрецію злитих білків РІГ АС в культуральному середовищі на очищення антитіл проти ЕГАсС, смол і планшетів. Інші вектори і експресійні системи також добре відомі у цій галузі для використанні у багатьох клітинах- хазяїнах.
В іншому втіленні два або більше пептидів або варіантів пептидів за винаходом кодуються і, отже, експресуються послідовно (подібно до конструкцій "вузли на мотузці"). При цьому пептиди або варіанти пептидів можуть бути зв'язані або злиті одне з одним фрагментами лінкерних амінокислотних послідовностей, такими, наприклад, які ГГ, або можуть зв'язатися без будь- яких додаткових пептидів між ними. Ці конструкції можуть також застосовуватися для терапії раку і можуть індукувати імунну відповідь за участі як молекул МН І класу, так і МНС ІІ класу
Цей винахід також стосується клітини-хазяїна, трансформованої полінуклеотидною векторною конструкцією за винаходом. Клітина-хазяїн може бути або прокаріотичною, або еукаріотичною. Бактеріальні клітини можуть бути переважно прокаріотичними клітинами- хазяїнами у деяких обставинах, а зазвичай це штам Е. соїї, такий як, наприклад, штам ОН5 Е. соїї, доступний від компанії Ве(пезаа Кезеагесй І абогайогіез Іпс., Бетесда, Меріленд, США, і КАК, доступний від Американської колекції типових культур АТСС, Роквіл, Меріленд, США (Номер
АТСС 31343). Переважні еукаріотичні клітини-хазяї включають клітини дріжджів, комах і ссавців, переважно клітини хребетних, такі як лінії фібробластних клітин і клітин товстої кишки від мишей, пацюків, мавп або людини. Дріжджові клітини-хазяї включають УРІН499, УРН5БОО і
УРН5БОЇ, які зазвичай доступні від компанії Зігаїадепе Сіопіпд Зузіет5, Ла Джола, 92037,
Зо Каліфорнія, США. Переважні клітини-хазяї ссавців включають клітини яєчника китайського хом'яка (СНО), доступні як штам АТСС ССІ161, клітини ембріонів швейцарської миші штаму
МІН/ЗТЗ, доступні з колекції АТСС СК. 1658, клітини СО5-1 з нирок мавп, доступні з колекції
АТСС СНІ 1650 і клітини 293 нирок ембріонів людини. Переважними клітинами комах є клітини 519, що можуть бути трансфековані векторами експресії бациловірусу. Огляд публікацій щодо вибору відповідних клітин-хазяїв для експресії можна знайти, наприклад, у підручнику: Рашіїпа
Ва!ба:х апа Агодеїїа Гогепсе "Меїнпод5 іп МоіІесціаг Віоїюсду Несотбіпапі Сепе Ехргезвіоп, Немієм/5 апа РгоїосоЇ5, " Рай Опе, Зесопа Еайайоп, ІЗ5ВМ 978-1-58829-262-9, і інших літературних джерелах, відомих фахівцю у цій галузі.
Трансформація відповідних клітин-хазяїв за допомогою ДНК-конструкції за цим винаходом здійснюється добре відомими методами, вибір яких, як правило, залежить від типу вектора, що використовується. Щодо трансформації прокаріотичних клітин-хазяїв див., наприклад, Сопеп і співавт. (СоНеп еї аї!., 1972) і (Стеєп апа Затьгоок, 2012). Трансформація дріжджових клітин описана в роботі Зпегпгтап і співавт. (Зпептап еї а!., 1986) Метод Ведоз (Ведов, 1978) також є корисним. Щодо клітин хребетних, реагенти, придатні для трансфекції таких клітин, наприклад, фосфат кальцію і ДЕАЕ-декстран або ліпосомні препарати, доступні від компанії Зігаїадепе
СіІопіпд Зузіетв, або І Те Тесппоїіодієз Іпс., Гейтерсберг, Меріленд 20877, США. Електропорація також придатна для трансформації і (або) трансфекції клітин і відома в цій галузі як метод трансформації клітин дріжджів, клітин бактерій, клітин комах і клітин хребетних.
Успішно трансформовані клітини, наприклад, клітини, що містять ДНК-конструкцію за цим винаходом, можуть бути ідентифіковані добре відомими методами, такими як ПлР.
Альтернативно, присутність білка у супернатанті можна виявити за допомогою антитіл.
Зрозуміло, що певні клітини-хазяї за винаходом здатні синтезувати пептиди за винаходом, наприклад, клітини бактерій, дріжджів і комах. Проте в певних терапевтичних методах можуть використовуватися інші клітини-хазяї. Наприклад, антиген-презентуючі клітини, такі як дендритні клітини, можуть принагідно використовуватися, щоби експресувати пептиди за винаходом, які можуть бути навантажені на відповідні молекули МНС. Отже, цей винахід також стосується клітини-хазяїна, що містить нуклеїнову кислоту або вектор експресії за цим винаходом.
У переважному втіленні клітина-хазяїн є антиген-презентуючою клітиною, зокрема дендритною клітиною або антиген-презентуючою клітиною. Управління з контролю за бо харчовими продуктами та лікарськими засобами (ЕБА) США 29 квітня 2010 року схвалило застосування АПК, навантажених рекомбінантним злитим білком, що містить простатичну кислу фосфатазу (РАР), для лікування метастатичного НКРС (гормон-рефрактерного раку передміхурової залози), що протікає безсимптомно або з мінімально вираженими симптомами (сіпулейцел-Т) (Віпі єї а!., 2006; Зтаї! єї а!., 2006).
Згідно з ще одним аспектом винаходу пропонується спосіб отримання пептиду або його варіанту, причому спосіб включає культивування клітини-хазяїна і виділення пептиду з клітини- хазяїна або її культурального середовища.
В іншому втіленні пептид, нуклеїнова кислота або вектор експресії за винаходом застосовуються у медицині. Наприклад, пептид або його варіант може бути приготований для внутрішньовенного (в/в) введення, підшкірного (п/ш) введення, внутрішньошкірного (в/ш) введення, внутрішньочеревного (в/ч) введення, внутрішньом'язового (в/м) введення. Переважні способи введення пептиду - це п/ш, в/ш, в/ч, в/м і в/в. Переважними способами введення ДНК є в/ш, в/м, п/ш, в /ч і в/в. Можуть вводитись дози від 50 мкг до 1,5 мг, переважно від 125 мкг до 500 мкг пептиду або ДНК залежно від відповідного пептиду чи ДНК. Дози в цьому діапазоні успішно використовувались в попередніх дослідженнях (УМаїег еї аї., 2012).
Полінуклеотид, що застосовується для активної вакцинації, може бути по суті чистим або включеним в належний вектор чи в систему доставки. Нуклеїнова кислота може бути, наприклад, ДНК, кКДНК, ПНК, РНК чи їхньою комбінацією. Методи конструювання і введення такої нуклеїнової кислоти добре відомі фахівцям в цій галузі. Їх огляд наведений, наприклад, у роботі Тешеї! і співавт. (Тешєї єї а), 2005). Полінуклеотидні вакцини легко приготувати, але механізм дії цих векторів у виникненні імунної відповіді повністю не з'ясований. Прийнятні векторні системи і системи доставки включають вірусну ДНК і (або) РНК, такі як системи на базі аденовірусу, вірусу коров'ячої віспи, ретровірусу, вірусу герпесу, аденоасоційованого вірусу або гібридів, що містять елементи більш ніж одного вірусу. Невірусні системи доставки включають катіонні ліпіди та катіонні полімери, добре відомі в галузі засобів доставки ДНК. Також може використовуватись фізична доставка, наприклад, за допомогою "генної гармати". Пептид або пептиди, що кодуються нуклеїновою кислотою, може (можуть) бути злитим білком, наприклад, з епітопом, що стимулює Т-клітини щодо відповідних протилежних СОК, як відзначається вище.
Лікарський засіб за винаходом може також включати один або більше ад'ювантів. Ад'юванти
Зо є речовинами, які у неспецифічний спосіб підвищують або підсилюють імунну відповідь (наприклад, імунну відповідь на антиген, яку опосередкують СОв-позитивні Т-клітини і Т- хелпери (ТН), і, отже, можуть вважатися корисними для використання у лікарському засобі за винаходом. Відповідні адюванти включають, але не обмежуються ними, 1018 І55, солі алюмінію, АМРІ ЇМАХФ, А5Б15, ВСО, СР-870893, Сро7909, СуаА, азі ІМ, флагелін чи ліганди
ТІК5, які походять з флагеліну, ліганд РІТ3, ГМ-КСФ, ІСЗО, ІСЗ31, іміквімод (АГОАКАФ), резиквімод, ІтигРасі ІМР321, інтерлейкіни, такі як ІЛ-2, ІЛ-13, ІЛ-21, інтерферон-альфа чи -бета, або їхні пегільовані похідні, І5 Раїсі, ІЗ5, ІЗСОМАТЕЇХ, імуностимулюючі комплекси ІЗСОМ,
УиміттипеФф, ГіромМас, МАГР2, МЕ59, монофосфориловий ліпід А, монтанід ІМ5 1312, монтанід
ІЗА 206, монтанід ІЗА 50У, монтанід ІЗА-51, емульсії "вода у маслі" та "масло у воді", ОК-432,
ОМ-174, ОМ-197-МР-ЕС, ОМТАК, О5рА, векторну систему Рертеїб, мікрочастинки на основі полілактиду когліколіду ІРО) та декстрану, талактоферин, 5КІ 172, віросоми та інші вірусоподібні частинки, УЕ-17О0, МЕСЕ ігар, К848, бета-глюкан, Ратз3Сув, стимулон 0521 Адпиіїа, який виділяється з сапоніну, мікобактеріальні екстракти та синтетичні імітатори стінок бактеріальних клітин, а також інші патентовані ад'юванти, наприклад, Оейох компанії РібБі, ОціїЇ чи зЗирего5. Переважними є такі ад'юванти, як ад'ювант Фрейнда або ГМ-КОФ. Декілька імунологічних ад'ювантів (наприклад, МЕ59), специфічних до дендритних клітин, та способи їх приготування були описані раніше (АїЇЇїзоп апа Киттвеї!, 1995). Також можуть застосовуватися цитокіни. Окремі цитокіни були прямо співвіднесені з впливом на міграцію дендритних клітин до лімфоїдних тканин (наприклад, ТМЕ-), прискорюючи дозрівання дендритних клітин до ефективних антиген-презентуючих клітин для Т-лімфоцитів (наприклад, ГМ-КСФ, ІЛ-1 та ІЛ-4) (Патент США 5 849 589, конкретно включений в цей документ шляхом посилання в усій повноті) та діючі як імуноад'юванти (наприклад, ІЛ-12, ІЛ-15, ІЛ-23, ІЛ-7, ІФН-альфа, ІФН-бета) (Сабпоміснй єї а!., 1996).
Також доповідалося про те, що імуностимулюючі Сро-олігонуклеотиди посилюють ефект ад'ювантів у складі вакцин. Якщо не вдаватися у подробиці теорії, Сро-олігонуклеотиди діють шляхом активації природної (не здобутої) імунної системи за допомогою ТоїІ-подібних рецепторів (ТІК), переважно ТКУ. Активація ТІКО, ініційована Сро, посилює антиген- специфічні гуморальні та клітинні реакції на широкий спектр антигенів, включаючи пептидні чи білкові антигени, живі або знищені віруси, вакцини на основі дендритних клітин, аутологічні бо клітинні вакцини та полісахаридні кон'юЮпгати як в профілактичних, так і в терапевтичних вакцинах. Важливішим є те, що посилюється визрівання та диференціація дендритних клітин, що в результаті збільшує активацію ТНІ-клітин та інтенсивну генерацію цитотоксичних Т- лімфоцитів (ЦТЛ) навіть за відсутності підтримки з боку СО4 Т-клітин. Активація ТНІ, індукована стимуляцією ТІ КО, зберігається навіть у присутності вакцинних ад'ювантів, таких як галун чи неповний ад'ювант Фрейнда (ІГА), котрі зазвичай сприяють активації ТН2. Сро-олігонуклеотиди демонструють навіть більшу ад'ювантну активність, коли переводяться в лікарську форму або вводяться разом з іншими ад'ювантами чи в таких формах, як мікрочастинки, наночастинки, ліпідні емульсії або подібні композиції, особливо необхідні для індукування сильної відповіді, коли антиген відносно слабкий. Вони також прискорюють імунну відповідь та дозволяють зменшити дози антигену приблизно на два порядки в порівнянні з відповідями антитіл на вакцину в повній дозі без Сро, як спостерігалося в деяких експериментах (Кгієд, 2006). У патенті США б 406 705 В1 описується комбіноване застосування Сро-олігонуклеотидів, ад'ювантів, що не містять нуклеїнові кислоти, та антигену для індукування антиген-специфічної імунної відповіді Сро ТІ КО-антагоністом є азІІМ (імуномодулятор із структурою типу дволанцюжкове стебло-петля) компанії Моїодеп (Берлін, Німеччина), котрий є переважним компонентом фармацевтичної композиції за цим винаходом. Також можуть використовуватись інші ТІ К-зв'язувальні молекули, наприклад, ТІ Р. 7, ТІ К 8 і (або) ТІ К 9, що зв'язуються з РНК.
Інші приклади прийнятних ад'ювантів включають, без обмежень, хімічно модифіковані Сро (наприклад, Срк, Ідега), аналоги длРНК, такі як полі(І:С) та їхні похідні (наприклад, АтріїбЗепФф),
НійопоїФ, полі-(ІСІ С), полі(ІС-К), полі(:С12)), бактеріальні ДНК або РНК, відмінні від Сро, а також невеликі імунологічно активні молекули та антитіла, такі як циклофосфамід, сунітиніб, бевацизумаб, целебрекс, МСХ-4016, сілденафіл, тадалафіл, варденафіл, сорафеніб, темозоломід, темзиролімус, ХІ -999, СР-547632, пазопаніб, МЕСЕ Тгар, 202171, А2О2171, анти-
СТІ А4, інші антитіла, націлені на ключові структури імунної системи (наприклад, анти-С040-, анти-ТОЕбета-, анти-ТМЕальфа-рецептори) та 5358175, які можуть діяти терапевтично і (або) як ад'юванти. Кількості та концентрації ад'ювантів та добавок, прийнятних в контексті цього винаходу, можуть бути легко визначені досвідченим фахівцем без зайвого експериментування.
Переважними ад'ювантами є анти-СО40-антитіла, іміквімод, резиквімод, ГМ-КСОФ, циклофосфамід, сунітиніб, бевацизумаб, інтерферон-альфа, Сро олігонуклеотиди та їх похідні,
Зо полі-(І: С) та її похідні, РНК, сілденафіл і композиції з твердих мікрочастинок з РІ С або віросоми.
В переважному втіленні фармацевтичної композиції за винаходом ад'ювант вибирається з групи, що складається з колонієстимулюючих факторів, таких як Фактор стимулювання утворення колоній гранулоцитів-макрофагів (ГМ-КСФ, сарграмостим), циклофосфамід, іміквімод, резиквімод та інтерферон-альфа.
В переважному втіленні фармацевтичної композиції за винаходом ад'ювант вибирається з групи, що складається з колонієстимулюючих факторів, таких як Фактор стимулювання утворення колоній гранулоцитів-макрофагів (ГМ-КСФ, сарграмостим), циклофосфамід, іміквімод і резиквімод. У переважному втіленні фармацевтичної композиції за винаходом ад'ювантом є циклофосфамід, іміквімод чи резиквімод. Навіть більш переважними ад'ювантами є монтанід
ІМ5 1312, монтанід ІЗА 206, монтанід ІЗА 50М, монтанід ІЗА-51, полі-ІСЇ С (НійопоїФ) і моноклональні анти-СО040-антитіла або їх комбінація.
Ця композиція може застосовуватися для парентерального введення, наприклад, підшкірного, внутрішньошкірного, внутрішньом'язового або для перорального застосування Для цього пептиди і необов'язково інші молекули розчиняють або суспендують у фармацевтично прийнятному, переважно водному носієві. Крім того, композиція може містити допоміжні речовини, такі як буфери, зв'язувальні речовини, розпушувачі, розріджувачі, ароматизатори, антифрикційні речовини тощо. Пептиди можна також ввести разом із імуностимуляторами, такими як цитокіни. Великий перелік допоміжних речовин, які можна використовувати у такій композиції, можна знайти, наприклад, у посібнику А. Кірре, Напароок ої РНагтасеціїсаї
Ехсірієпів (Кірбе, 2000). Ця композиція може застосовуватися для попередження, профілактики і (або) лікування аденоматозних або ракових захворювань. Приклади фармацевтичних композицій наведені, наприклад, у ЕР2113253.
Важливо розуміти, що імунна відповідь, ініційована вакциною за винаходом, спрямована проти ракових клітин на різних стадіях клітинного циклу і на різних стадіях розвитку пухлини.
Більш того, атака здійснюється на різні асоційовані з раковими пухлинами сигнальні шляхи. Це є перевагою над вакцинами, які направлені тільки на одну чи малу кількість мішеней, що може привести до легкої адаптації пухлини до атаки (уникання пухлиною). Більш того, не усі індивідуальні пухлини експресують одну й ту саму картину антигенів. Таким чином, комбінація декількох пухлино-асоційованих пептидів гарантує, що кожна окрема пухлина несе принаймні бо деякі з мішеней. Композиція була створена виходячи з того, що, як очікується, кожна пухлина експресує декілька антигенів і охоплює декілька незалежних сигнальних шляхів, необхідних для росту і розвитку пухлини. Таки чином, вакцину може легко використовувати у "готовому для застосування" вигляді для більшої популяції пацієнтів. Це означає, що попередній відбір пацієнтів, що потребують лікування цією вакциною, можна обмежити типуванням за НІ А, не потребує будь-якого додаткового дослідження біомаркерів експресії антигенів, але все ж забезпечується одночасна атака декількох мішеней у вигляді індукованої імунної відповіді, що є важливим для ефективності (Вапспегеаи еї аї., 2001; УУанег еї а!ї., 2012).
Термін "каркас" в контексті цього винаходу означає молекулу, яка специфічно зв'язується з (наприклад, антигенною) детермінантою. В одному з втілень каркас здатний направляти об'єкт, до якого він приєднаний (наприклад, (другий) антиген-зв'язувальний елемент) до сайта-мішені, наприклад, до клітини конкретного виду пухлини або до строми пухлини, що несе антигенну детермінанту (наприклад, комплекс пептид-МНе відповідно до цього підходу). В іншому втіленні каркас здатний активувати сигнальний шлях через його антиген-мішень, наприклад, антиген комплексу Т-клітинного рецептора. Каркаси включають, але не обмежуються ними, антитіла і їх фрагменти, антиген-зв'язувальні домени антитіл, що містять варіабельну ділянку важкого ланцюга антитіла і варіабельну ділянку легкого ланцюга антитіла, зв'язувальні білки, що містять принаймні один модуль анкіринового повтору і однодоменні антиген-зв'язувальні (З5ОАВ) молекули, аптамери, (розчинні) ТКР і (модифіковані) клітини, такі як алогенні або аутологічні Т- клітини. Щоб оцінити, чи буде молекула каркасом, що зв'язується з мішенню, можна провести аналіз зв'язування. "Специфічне" зв'язування означає, що каркас зв'язує досліджуваний комплекс пептид-МНО краще ніж інші природно існуючі комплекси пептид-МНС до такої міри, що каркас, споряджений активною молекулою, яка здатна знищувати клітину, що несе конкретну мішень, не здатний знищувати іншу клітину без конкретної мішені, але таку, що презентує інший(-ї) комплекс(-и) пептид-МНеО. Зв'язування з іншими комплексами пептид-МНС не має значення, якщо пептид, що бере участь у перехресній реакції, не зустрічається в природі, тобто не отриманий із пептидому НІ А. Тести для оцінки знищення клітин-мішеней добре відомі фахівцям в цій галузі.
Їх потрібно виконувати з використанням клітин-мішеней (первинних клітинних культур або клітинних ліній) із незміненою презентацією пептидів молекулами МНС, або клітин,
Зо навантажених пептидами, у такий спосіб, щоб були досягнуті природні рівні комплексів пептид-
МН.
Кожний каркас містить мітку, яка забезпечує можливість виявлення зв'язаного каркаса шляхом визначення присутності або відсутності сигналу, який генерує мітка. Наприклад, каркас може бути міченим флуоресцентним барвником або іншою застосовною маркерною молекулою клітини. Такі маркерні молекули добре відомі в цій галузі. Наприклад, флуоресцентне мічення, наприклад, флуоресцентним барвником, може забезпечити візуалізацію зв'язаного аптамеру за допомогою флуоресценції або лазерної сканувальної мікроскопії або проточної цитометрії.
Кожний каркас може бути кон'югованим із другою активною молекулою, такою як, наприклад, ІЛ-21, антитіло проти СОЗ, антитіло проти СО28.
Додаткову інформацію про поліпептидні каркаси див., наприклад, у розділі "Передумова створення винаходу" у заявці УМО 2014/0719784А1 і у посиланнях, наведених в ній.
Цей винахід також стосується аптамерів. Аптамери (див., наприклад, УМО 2014/191359 і посилання, наведені в цій роботі) є молекулами коротких одноланцюгових нуклеїнових кислот, які можуть складатися у певні тримірні структури і розпізнавати специфічні структури-мішені.
Вони, очевидно, є прийнятними альтернативами для розробки таргетної терапії. Було показано, що аптамери селективно зв'язуються з багатьма складними мішенями з високою афінністю і специфічністю.
Аптамери, що розпізнають розташовані на поверхні молекули, були ідентифіковані у минулому десятиріччі і забезпечують засоби для розробки діагностичних і терапевтичних підходів. Оскільки було показано, що аптамери майже не проявляють жодної токсичності і імуногенності, вони є перспективними кандидатами у речовини для біомедичних застосувань.
Справді, аптамери, наприклад, такі, що розпізнають простат-специфічні мембранні антигени, були успішно застосовані для таргетної терапії, і було показано, що вони виявляють ці функції в трансплантатних моделях іп мімо. Більш того, були ідентифіковані аптамери, які розпізнають конкретні лінії пухлинних клітин.
Можуть бути вибрані аптамери ДНК, що проявляють розпізнавальні властивості широкого спектру по відношенню до різних ракових клітин, особливо до таких, що отримані з солідних пухлин, у той час як непухлиногенні і первинні здорові клітини ними не розпізнаються. Якщо ідентифіковані аптамери розпізнають не тільки підтип конкретної пухлини, але скоріше взаємодіють з рядом пухлин, це надає аптамерам властивість бути застосовними в якості так званих діагностичних і терапевтичних засобів широкого спектру.
Далі, дослідження зв'язувальних властивостей по відношенню до клітин методом проточної цитометрії показало, що аптамери виявляють дуже добру позірну афінність, яка знаходиться у наномолярному діапазоні.
Аптамери можуть використовуватися для діагностичних і терапевтичних цілей. Далі, можна показати, що деякі аптамери поглинаються пухлинними клітинами і таким чином можуть використовуватися як молекулярні носії для цілеспрямованої доставки протиракових препаратів, таких як міРНК, у пухлинні клітини.
Аптамери можуть бути вибрані проти складних мішеней, таких як клітини і тканини і комплекси пептидів, що включають, переважно що складаються з послідовності відповідно до будь якої послідовності від ЗЕО ІЮ МО 1 до ЗЕО ІЮО МО 549 за цим винаходом із молекулою
МНС оз використанням методики ЗБЕЇЕХ (Систематична еволюція лігандів шляхом експоненційного збагачення).
Пептиди за цим винаходом можуть використовуватися для продукції і розробки антитіл, специфічних до комплексів МНС/пептид. Вони можуть застосовуватися для лікування, націлюючи токсини або радіоактивні речовини на хворі тканини. Іншим використанням цих антитіл може бути націлювання радіонуклідів на хворі тканини з метою формування зображень, таких як позитронна емісійна томографія (ПЕТ). Таке використання може виявляти невеликі метастази або визначати розмір і точну локалізацію хворих тканин.
Таким чином, в ще одному аспекті цей винахід стосується способу отримання рекомбінантного антитіла, яке специфічно зв'язується з головним комплексом гістосумісності (МНС) людини | або ІІ класу, який входить до складу комплексу з антигенами, обмеженими за
НА, причому спосіб включає: імунізацію клітинами ссавців нелюдського походження, отриманих методами генної інженерії що експресують згаданий головний комплекс гістосумісності (МНС) людини І або ІЇ класу із розчинною формою молекули МН І або ІІ класу, яка входить до складу комплексу зі згаданими антигенами, обмеженими за НІ А; виділення молекул ІРНК із клітин згаданих ссавців нелюдського походження, що продукують антитіла; отримання бібліотеки фагового дисплея, що містить фаги, які експонують молекули білка, який кодується згаданими молекулами іРНК; і виділення принаймні одного фага із згаданої бібліотеки фагового дисплея, причому згаданий принаймні один фаг експонує згадане антитіло, що специфічно зв'язується із згаданим головним комплексом гістосумісності (МНС) людини І або ІЇ класу, який входить до складу комплексу із згаданим антигеном, обмеженим за НІ А.
У ще одному аспекті цей винахід стосується антитіла, яке специфічно зв'язується з головним комплексом гістосумісності (МНС) людини І або І класу, який входить до складу комплексу з антигенами, рестриктованими за НіГА, в якому антитіло переважно є поліклональним антитілом, моноклональним антитілом, біспецифічним антитілом і (або) хімерним антитілом.
Відповідні способи отримання таких антитіл і одноланцюгових головних комплексів гістосумісності (МНС) І класу, а також інших інструментів отримання цих антитіл розкриті в заявках УМО 03/068201, УМО 2004/084798, УМО 01/72768, ММО 03/070752 і статтях (Сопнеп еї аї., 200За; Сопеп еї а!., 20036; ЮРепкбего еї аї., 2003), які для цілей цього винаходу всі у прямій формі включені в цей документ шляхом посилання в усій повноті.
Переважно, антитіло зв'язується з спорідненістю на рівні нижче 20 наномолів, переважно нижче 10 наномолів, у комплекс, який вважається "специфічним" у контексті цього винаходу.
Цей винахід також стосується пептиду, що містить послідовність, вибрану з групи послідовностей від ЗЕО ІЮ МО: 1 до 5ЕО ІЮО МО: 549 або їхній варіант, який принаймні на 88 95 є гомологічним (переважно ідентичним) послідовностям від 5ЕО ІЮО МО: 1 до ЗЕО ІО МО: 549 або їхнього варіанту, що викликає перехресну реакцію Т-клітин із зазначеним пептидом, де зазначений пептид не є базовим повнорозмірним поліпептидом.
Цей винахід також стосується пептиду, що містить послідовність, вибрану з групи послідовностей від ЗЕО ІЮ МО: 1 до 5ЕО ІЮО МО: 549 або їхній варіант, який принаймні на 88 95 є гомологічним (переважно ідентичним) послідовностям від ЗЕО ІЮ МО: 1 до 5ЕО ІЮО МО: 549, де зазначений пептид або його варіант має загальну довжину між 8 і 100, переважно між 8 і з0і найбільш переважно між 8 і 14 амінокислот.
Цей винахід також стосується пептидів за цим винаходом, які здатні зв'язуватись з молекулою головного комплексу гістосумісності (МНС) людини І або ЇЇ класу.
Цей винахід також стосується пептидів за цим винаходом, де згадані пептиди складаються або по суті складаються з амінокислотної послідовності від ЗЕО ІЮО МО: 1 до ЗЕО ІЮО МО: 549.
Цей винахід також стосується пептидів за цим винаходом, де згаданий пептид є (хімічно) модифікованим і (або) включає непептидні зв'язки.
Цей винахід також стосується пептидів за цим винаходом, де згаданий пептид є частиною злитого білка, зокрема злитим із М-термінальними амінокислотами НІГА-ОК антиген- асоційованого інваріантного ланцюга (Ії), або де пептид є злитим із антитілом (або вбудованим в антитіло), наприклад, із антитілом, що є специфічним до дендритних клітин.
Інше втілення цього винаходу стосується пептиду неприродного походження, де згаданий пептид складається або по суті складається з амінокислотної послідовності від ЗЕО ІЮ Мо: 1 до
ЗЕО ІЮО МО: 48 і був отриманий синтезом (наприклад, синтезований) у вигляді фармацевтично прийнятної солі. Способи синтетичного отримання пептидів добре відомі фахівцю у цій галузі.
Солі пептидів за цим винаходом суттєво відрізняються від пептидів за їхнім станом (їхніми станами) іп мімо, оскільки пептиди, які генеруються іп мімо, не є солями. Сольова форма пептиду неприродного походження опосередковує розчинність цього пептиду, особливо у контексті фармацевтичних композицій, які містять ці пептиди, наприклад, пептидні вакцини, як це розкрито тут. Достатня і принаймні суттєва розчинність пептиду (пептидів) є необхідною умовою для того, щоб ефективно доставити пептиди суб'єкту, якого належить лікувати. Переважно, щоб ці солі були фармацевтично прийнятними солями пептидів. Ці солі за винаходом включають лужні і лужноземельні солі, такі як солі із серії Гофмейстера, які містять аніони РО4У, 50427,
СНЗСОО, СГ, Вг, МОз, Сіог, Г, ЗОМ: і катіони МН", Вр», КУ, Мах, С87, Гі, 7пе, Мр, Са, Ми?» би ї Ва". Переважно солі вибирають із (МНа)зРО»4, (МНа)2НРО», (МНа)НегРО»х, (МНа)»650х,
МНАСНЗСОО, МНАСІ, МНаВг, МНаАМО», МНаСІОх, МНаЇ, МНаАЗСМ, АрзРОх, Ар2НРО», ВЬБНгРО»,
Вр2505, НБАСНЗСОО, АраСІ, ВБаВг, АБаМО»з, АБаСіІОз, АраІЇ, АБАЗСМ, КзРОх, КаНРО»х, КНегРО»,
К»5Ох, КСНЗСОО, КС, КВ, КМО»з, КСІОх, КІ, КО5СМ, МазРОх, МагНРО»х, МанНегРО», Ма2505, маснзоСоо, Масі, МаВг, МаМмоОз, МасСіОх, Маї, Мазсм, 2пСіІ» СвзРО»4, С52НРО»х, СвНеРоОх, С52505,
С5СНзСОО, 50, С5Вг, Се5МОз, СебСіОл, С5іІ, Сб55СМ, ГізРОх, П2НРО», ГІНегРО», 12505,
ПСНзСОО, СІ, СВ, ГМО», ГіСІОя, СГ, 15СМ, бцигбОз, Маз(РОз)г, Мог2НРО», Ма(НегРоОз)»,
М9250х5, Моа(СНзСО0)2, МосіІг, МаВіг, Ма(МОз)2, Ма(СіОз)2, Мао!і», Моа(ЗСМ)», Мписіг, Саз(РоОх),,
СагНРО», Са(НгРОз)2, Сабо», Са(СНзСОО)», Сасі», СаВгг, Са(МОз)г, Са(СІОз4)», Са!», Са(5СМ)»,
Ваз(РОз)г2, Ваг?НРО», Ва(НгРОз4)2, ВабзО», Ва(СНзСО0)», Васі», ВавВгг, Ва(МОз)», Ва(СіІОл)», Ваї? і
Ко) Ва(ЗСМ)». Особливо переважними є ацетат МН, МосСі», КН»РО», Ма50О», КСІ, Масі їі Сасі»г, такі як, наприклад, хлоридні або ацетатні (трифторацетатні) солі.
Загалом, пептиди і їх варіанти (принаймні такі, що містять пептидні зв'язки між амінокислотними залишками) можуть бути синтезовані Етос-поліамідним методом твердофазного синтезу пептидів, як це розкрито у роботі І иКаз і співавт. (І иКаз еї аї!., 1981) і в посиланнях, що є в ній. Тимчасовий захист М-аміногрупи забезпечується /-9- флуоренілметилоксикарбонільною (Рітос) групою. Повторювальне розщеплення цієї дуже нестійкої до дії луг захисної групи виконується за допомогою 2095 піперидину у М, М- диметилформаміді. Можна захистити функціональні групи бокових ланцюгів, такі як бутилові етери (у випадку серину, треоніну та тирозину), бутилові естери (у випадку глутамінової кислоти і аспарагінової кислоти), бутилоксикарбонільне похідне (у випадку лізину і гістидину), тритильне похідне (у випадку цистеїну) і 4-метокси-2,3,6-триметилбензосульфонільне похідне (у випадку аргініну). У сполуках, в яких С-термінальними залишками є глутамін або аспарагін, для захисту амідогруп бокових ланцюгів використовують 4,4"-диметоксибензгідрильну групу. Основою твердофазного носія є полідиметилакриламідний полімер, що складається з трьох мономерів: диметилакриламіду (каркасний мономер), біс-акрилоїлетилендіаміну (компонент для перехресного зшивання) і акрилоїлсаркозинметилового естеру (функціоналізуючий агент). Як агент, що утворює зв'язок пептиду і смоли, який піддається розщепленню, використовується нестійке до дії кислот похідне 4-гідроксиметилфеноксиоцтової кислоти. Всі амінокислотні похідні додають у вигляді заздалегідь синтезованих симетричних ангідридних похідних за винятком аспарагіну і глутаміну, які додають з використанням зворотної М, М-дициклогексилкарбодіїмід/1- гідроксибезотриазол-опосередкованої реакції сполучення. Усі реакції сполучення і зняття захисту відслідковували за допомогою методів контролю з використанням нінгідрину, тринітробензолсульфонової кислоти і ізотину. Після завершення синтезу пептиди віддеплюють від смоли-носія з супутнім видаленням захисних груп бокових ланцюгів шляхом обробки 95 95 трифтороцтовою кислотою, що містить 50 9о суміші поглиначів. Зазвичай використовувані поглиначі включають етандитіол, фенол, анізол і воду, конкретний вибір залежить від амінокислотних складових пептиду, що синтезується. Для синтезу пептидів можливе також використання комбінації твердофазних і рідкофазних методик (див., наприклад, (ВгисКаопег єї а!., 2004) і посилання, наведені в цій роботі).
Трифтороцтову кислоту видаляють випаровуванням у вакуумі з подальшим подрібнюванням із діетиловим етером, що забезпечує отримання сирого пептиду. Будь-які поглиначі, які присутні в матеріалі, видаляються простою процедурою екстракції, яка після ліофілізації водної фази дозволяє отримати сирий пептид, вільний від поглиначів. Реагенти для синтезу пептидів, як правило, можна придбати, наприклад, у компанії СаІріоспет-Момабріоспет (Нотінггем, Велика
Британія).
Очищення може виконуватися за допомогою одного будь-якого методу або їх комбінації, таких як перекристалізація, ексклюзійна хроматографія, іонообмінна хроматографія, хроматографія гідрофобної взаємодії та (зазвичай) зворотно-фазна високоефективна рідинна хроматографія із градієнтним розділенням, наприклад, з використанням системи ацетонітрил/вода.
Цей винахід також стосується нуклеїнової кислоти, що кодує пептиди за цим винаходом за умови, що пептид не є повністю (цілковито) людським білком.
Цей винахід також стосується нуклеїнової кислоти за цим винаходом, яка являє собою ДНК,
КДНК, ПНК, РНК чи їх комбінацію.
Цей винахід також стосується вектора експресії що здатний експресувати нуклеїнову кислоту за цим винаходом.
Цей винахід також стосується пептиду за цим винаходом, нуклеїнової кислоти за цим винаходом або вектора експресії за цим винаходом для застосування в медицині, зокрема в лікуванні раку яєчника.
Цей винахід також стосується клітини-хазяїна, що містить нуклеїнову кислоту за цим винаходом або вектор експресії за цим винаходом.
Цей винахід також стосується клітини-хазяїна за цим винаходом, яка є антиген- презентуючою клітиною, і переважно дендритною клітиною.
Цей винахід також стосується способу отримання пептиду за цим винаходом, причому спосіб включає культивування клітини-хазяїна за цим винаходом і виділення пептиду зі згаданого клітини-хазяїна або її культурального середовища.
Цей винахід також стосується способу за цим винаходом, де антиген навантажують на молекули МНС І або ІЇ класу, що експресуються на поверхні відповідної антиген-презентуючої
Зо клітини шляхом контакту достатньої кількості антигену з антиген-презентуючою клітиною.
Цей винахід також стосується способу за цим винаходом, де антиген-презентуюча клітина містить вектор експресії, здатний експресувати згаданий пептид, що містить послідовність від
ЗЕО ІЮ МО: 1 до 5ЕО ІЮ МО: 549 або згаданий варіант амінокислотної послідовності.
Цей винахід також стосується активованих Т-клітин, отриманих згідно способу за цим винаходом, де згадані Т-клітини селективно розпізнають клітину, яка експресує поліпептид, що містить амінокислотну послідовність за цим винаходом.
Цей винахід також стосується способу знищення клітин-мішеней в організмі пацієнта, клітини-мішені якого аберантно експресують поліпептид, що містить будь-яку амінокислотну послідовність за цим винаходом, причому спосіб включає введення в організм пацієнта ефективної кількості Т-клітин за цим винаходом.
Цей винахід також стосується застосування будь-якого пептиду, що описаний тут, нуклеїнової кислоти за цим винаходом, вектора експресії за цим винаходом, клітини за цим винаходом, або активованого цитотоксичного Т-лімфоцита за цим винаходом, як лікарського засобу або в процесі виробництва лікарського засобу. Цей винахід також стосується застосування за цим винаходом, де лікарський засіб виявляє протиракову активність.
Цей винахід також стосується застосування за цим винаходом, де лікарський засіб являє собою вакцину. Цей винахід також стосується застосування за цим винаходом, де лікарський засіб виявляє протиракову активність.
Цей винахід також стосується застосування за цим винаходом, де згадані ракові клітини є клітинами раку яєчника або клітинами інших солідних або гематологічних пухлин, таких як рак підшлункової залози, рак головного мозку, рак нирки, рак товстої або прямої кишки, лейкоз.
Цей винахід також стосується конкретних маркерних білків і біомаркерів на основі пептидів за цим винаходом, які у цьому документі іменуватимуться як "мішені", які можуть використовуватися в діагностиці і (або) визначенні прогнозу перебігу раку яєчника. Цей винахід також стосується застосування цих нових мішеней для лікування раку.
Термін "антитіло" або "антитіла" використовується в тут у широкому сенсі і включає як поліклональні, так і моноклональні антитіла. На додаток до інтактних або "повнорозмірних" молекул імуноглобуліну, до терміну "антитіла" також входять фрагменти (наприклад, фрагменти
СОК, Ем, Раб і Ес) або полімери цих молекул імуноглобуліну і гуманізовані версії молекул бо імуноглобуліну, за умови, що вони виявляють будь-які з бажаних властивостей (наприклад,
специфічне зв'язування поліпептидного маркера раку яєчника, доставка токсину до клітини раку яєчника, що експресує ген-маркер раку легенів на підвищеному рівні, і (або) інгібування активності поліпептидного маркера раку яєчника) відповідно до цього винаходу.
За найменшої можливості антитіла за винаходом слід закуповувати у комерційних підприємств. Антитіла за винаходом можуть бути отримані з використанням добре відомих методів. Кваліфікований фахівець зрозуміє, що для отримання антитіл за винаходом можуть бути використані як повнорозмірні поліпептидні маркери раку яєчника або їх фрагменти.
Поліпептид, який буде використовуватися для отримання антитіл за винаходом, може бути повністю чи частково очищеним компонентом природного джерела або може бути отриманий за допомогою технології рекомбінантних ДНК.
Наприклад, кКДНК, що кодує пептид за цим винаходом, такий як пептид з послідовністю від
ЗБЕО ІЮ МО: 1 до 5ЕО ІЮ МО: 549 або його варіант чи фрагмент, може експресуватися в прокаріотичних клітинах (наприклад, бактерій) або еукаріотичних клітинах (наприклад, клітинах дріжджів, комах або ссавців), після чого рекомбінантний білок можна очистити і використати для отримання препарату моноклональних або поліклональних антитіл, які специфічно зв'язують поліпептидний маркер раку яєчника, що був використаний для отримання антитіл за цим винаходом.
Фахівцю ов цій галузі відомо, що отримання двох або більше різних комплектів моноклональних або поліклональних антитіл максимально збільшує ймовірність отримання антитіла, що буде мати специфічність та афінність, необхідні для використання за призначенням (наприклад, для ЕГІ5А, імуногістохімічних методів, візуалізації іп мімо, лікування імунотоксинами). Антитіла досліджують на бажану активність добре відомими методами, відповідно до цілей, у яких мають використовуватися антитіла (наприклад, ЕГІЗА, імуногістохімічні методи, імунотерапія тощо; додаткові відомості щодо отримання і перевірки антитіл див., наприклад, Сгеепієїа, 2014 (Стеепіїєїд, 2014)). Наприклад, антитіла можуть бути досліджені методами ЕГІЗА, Вестерн-блотингу, імуногістохімічним забарвлюванням фіксованих формаліном зрізів тканини раку легенів або заморожених зрізів тканини. Після попередніх досліджень іп міго антитіла, які мають використовуватися для терапевтичних цілей або для діагностики іп мімо, досліджують з використанням відомих методів клінічного дослідження.
Зо Термін "моноклональне антитіло" в тому виді, в якому він використовується тут, означає антитіло, отримане із по суті гомогенної популяції антитіл, тобто індивідуальні антитіла, що складають популяцію, є ідентичними, за винятком мутантних форм, що спостерігаються в природі, які можуть бути присутніми в незначній кількості. Моноклональні антитіла за цим патентом конкретно включають "химерні" антитіла, у яких частина важкого і (або) легкого ланцюга ідентична або гомологічна відповідним послідовностям в антитілах, отриманих із окремого виду, або які належать до окремого класу чи підкласу антитіл, в той час як решта ланцюга (ланцюгів) ідентична або гомологічна відповідним послідовностям в антитілах, отриманих із іншого виду або які належать до іншого класу чи підкласу антитіл, а також фрагментів таких антитіл, за умови, що вони виявляють бажану антагоністичну активність (Пат.
США 4 816 567, включений в цей документ шляхом посилання в усій повноті).
Моноклональні антитіла за винаходом можуть бути отримані гібридомними технологіями. У гібридомних технологіях мишу або іншу прийнятну тварину-хазяїна, як правило, імунізують імунізуючим агентом для створення лімфоцитів, які продукують або здатні продукувати антитіла, які специфічно зв'язуються з імунізуючим агентом. Альтернативно, лімфоцити можуть бути імунізовані іп міїго.
Моноклональні антитіла можуть також бути створені технологіями рекомбінантних ДНК, такими як описані в патенті США 4 816 567. ДНК, що кодує моноклональні антитіла за винаходом, можна легко виділити і секвенувати з використанням традиційних методик (наприклад, використовуючи олігонуклеотидні зонди, здатні специфічно зв'язуватися з генами, що кодують важкі та легкі ланцюги антитіл миші).
Методи Іп міго також придатні для створення одновалентних антитіл. Розщеплення антитіл з метою отримання їх фрагментів, зокрема, Бар-фрагментів, можна провести з використанням стандартних методик, відомих у галузі. Наприклад, розщеплення можна виконати за допомогою папаїну. Приклади розщеплення за допомогою папаїну описані у заявці УМО 94/29348 і в патенті
США 4 342 566. При розщепленні антитіл за допомогою папаїну, як правило, утворюються два ідентичних антиген-зв'язувальних фрагменти, які звуться Еаб-фрагментами, кожний з одним антиген-зв'язувальним сайтом, і залишковим Ес фрагментом. Обробка пепсином дає фрагмент
К(абв)2 і фрагмент рЕс'.
Фрагменти антитіл, чи то з'єднані з іншими послідовностями, чи ні, можуть також включати бо вставки, делеції, заміни або інші вибрані модифікації окремих частин або амінокислотних залишків за умови, що активність фрагмента не є значно зміненою або пошкодженою у порівнянні з немодифікованим антитілом або фрагментом антитіла. Ці модифікації можуть надати деякі додаткові властивості, такі як видалити/додати амінокислоти, що здатні до дисульфідного зв'язування, підвищити біологічну довговічність, змінити секреторні властивості тощо. У будь-якому випадку, фрагмент антитіла має виявляти біологічну активність, таку як зв'язувальна активність, регулювання зв'язування у зв'язувальному домені тощо. Функціональні або активні центри антитіла можуть бути ідентифіковані шляхом мутагенезу конкретної ділянки білка, який супроводжується експресією і перевіркою експресованого поліпептиду. Такі методи є цілююм очевидними для фахівця у цій галузі і можуть включати сайт-специфічний мутагенез нуклеїнової кислоти, що кодує фрагмент антитіла.
Антитіла за винаходом можуть додатково включати гуманізовані антитіла або людські антитіла. Гуманізованими формами антитіл нелюдського походження (наприклад, мишачі) є химерні імуноглобуліни, ланцюги імуноглобулінів або їх фрагменти (такі як Ем, Раб, Раб" та інші антиген-зв'язувальні послідовності антитіл), які містять мінімальну послідовність, отриману з імуноглобуліну нелюдського походження. Гуманізовані антитіла включають імуноглобуліни людини (антитіло-реципієнт), в яких залишки від комплементарної детермінантної групи (СОК) реципієнта заміщені залишками від СОК нелюдського походження (антитіло-донор), такого як від миші, пацюка або кроля, що має бажану специфічність, афінність і зв'язувальну здатність. У деяких випадках Ем каркасні (ЕК) залишки імуноглобуліну людини є заміщеними відповідними залишками нелюдського походження. Гуманізовані антитіла можуть включати залишки, які не були виявлені ні в антитілі-реципієнті, ні в імпортованих СОМК або послідовностях каркаса. Як правило, гуманізоване антитіло буде містити по суті всі з принаймні одного, а зазвичай двох варіабельних доменів, в яких всі або по суті всі із діллнок СОК відповідають ділянкам імуноглобуліну нелюдського походження і всі або по суті всі із ділянок ЕК є ділянками консенсусної послідовності імуноглобуліну людини. Оптимально, якщо гуманізоване антитіло містить також принаймні частину константної ділянки імуноглобуліну (Ес), зазвичай ділянку імуноглобуліну людини.
Методи гуманізації нелюдських антитіл добре відомі фахівцю у цій галузі. Загалом, гуманізоване антитіло має один або більше амінокислотних залишків, введених в нього з джерела, яке є нелюдського походження. Ці амінокислотні залишки нелюдського походження часто називають "імпортними" залишками, які зазвичай беруть із "імпортного" варіабельного домену. Гуманізацію можна по суті провести шляхом заміщення СОК або послідовностей СОМ гризунів відповідними послідовностями людського антитіла. Відповідно, такі "гуманізовані" антитіла є химерними антитілами (патент США 4 816 567), в яких суттєво менша частина ніж інтактний варіабельний домен людини була заміщена відповідною послідовністю біологічних видів, відмінних від людини. На практиці гуманізовані антитіла є зазвичай людськими антитілами, в яких деякі залишки СОК і, можливо, залишки ЕК є заміщеними залишками з аналогічних сайтів антитіл гризунів.
Можуть використовуватися трансгенні тварини (наприклад, миші), які після імунізації набувають здатність продукувати повний спектр людських антитіл в умовах відсутності виробки ендогенного імуноглобуліну. Наприклад, було описано, що гомозиготна делеція гена, що кодує ділянку з'єднання важких ланцюгів антитіла, у химерних клітин і лінії клітин зародків мутантних мишей приводить до повного інгібування виробки ендогенних антитіл. Перенесення генної матриці імуноглобуліну клітин зародків людини у лінію клітин зародків мутантних мишей приводить до виробки людських антитіл після антигенної стимуляції. Людські антитіла можуть також бути виділені методом фагового дисплея з комбінаторної бібліотеки.
Антитіла за винаходом переважно вводять суб'єкту у фармацевтично прийнятному носієві.
Як правило, для надання фармацевтичній композиції ізотонічності використовують відповідну кількість фармацевтично прийнятної солі. Приклади фармацевтично прийнятного носія включають фізіологічний розчин, розчин Рінгера і розчин глюкози. рН розчину переважно має становити приблизно від 5 до 8, і більш переважно приблизно від 7 до 7,5. Додатково пропонуються носії, що включають препарати з тривалим вивільненням, такі як напівпроникні матриці твердих гідрофобних полімерів, які містять антитіла, причому ці матриці мають вигляд сформованих предметів, наприклад, плівок, ліпосом або мікрочастинок. Фахівцю в цій галузі зрозуміло, що певні носії можуть бути більш переважними, залежно від, наприклад, способу введення і концентрації антитіла, що вводиться.
Антитіла можна вводити суб'єкту, пацієнту або в клітину шляхом ін'єкції (наприклад, внутрішньовенної, внутрішньочеревної, підшкірної, внутрішньом'язової) або іншими методами, такими як інфузія, яка гарантує їх доставку у кровотік у ефективній формі. Антитіла можуть 60 також бути введені внутрішньопухлинним або перитуморальним шляхом з метою отримати місцевий, а також системний терапевтичний ефект. Кращими є місцеве або внутрішньовенне введення.
Ефективні дози і режими дозування для введення антитіл можна визначити емпіричним шляхом, такі визначення знайомі фахівцю в цій галузі. Фахівцю в цій галузі зрозуміло, що дози антитіл, які необхідно вводити, залежать, наприклад, від суб'єкта, який отримує антитіла, шляху введення, конкретного типу використовуваних антитіл та інших лікарських препаратів, які вводяться. Типова щоденна доза при застосуванні антитіл як монотерапії може становити від приблизно 1 мкг/кг до 100 мг/кг маси тіла або більше на добу, залежно від вищезгаданих факторів. Після введення антитіл, переважно з метою лікування раку яєчника, ефективність терапевтичної дії антитіл можна оцінити різними способами, відомими фахівцю в цій галузі.
Наприклад, розмір, кількість і (або) розповсюдження раку легенів в організмі суб'єкта, що отримує лікування, можна контролювати за допомогою стандартних методик візуалізації пухлин.
Введене з терапевтичними цілями антитіло, яке затримує ріст пухлини, приводить до скорочення пухлини і (або) запобігає розвитку нових пухлин у порівнянні з перебігом захворювання, який би спостерігався за відсутності введення антитіла, є ефективним антитілом для лікування раку легенів.
У ще одному аспекті цей винахід стосується способу отримання розчинного Т-клітинного рецептора (рТКР), що розпізнає конкретний комплекс пептиду і МНС. Такі розчинні Т-клітинні рецептори можуть бути отримані зі специфічних клонів Т-клітин, і їх спорідненість можна підвищити мутагенезом, націленим на комплементарні детермінантні групи. З метою вибору Т- клітинних рецепторів може використовуватися метод фагового дисплея (Заявка США 20100113300, (ГПідау еї аї.,, 2012)». З метою стабілізації Т-клітинних рецепторів у процесі фагового дисплея і у разі застосування як лікарського препарату альфа- і бета-ланцюги можуть буди зв'язані, наприклад ненативними дисульфідними зв'язками або іншими ковалентними зв'язками (одноланцюговий Т-клітинний рецептор) або доменами димеризації (ВошНег єї аї., 2003; Сага єї аї., 2004; М/йсох єї аїЇ., 1999). Т-клітинний рецептор може бути зв'язаний з токсинами, лікарськими препаратами, цитокінами (див., наприклад, заявку США 2013/0115191), доменами, що залучають ефекторні клітини, такі як домени антитіл проти СОЗ тощо, щоб виконувати конкретні функції на клітинах-мішенях. Більш того, він може експресуватися у Т-
Зо клітинах, що використовуються для адоптивного переносу. Додаткову інформацію можна знайти у заявках УМО 2004/033685А1 і УМО 2004/074322А1. Комбінація рРТКР описана у заявці УМО 2012/056407А1. Інші способи отримання розкриті у заявці УМО 2013/057586А1.
Крім того, пептиди і (або) ТКР, або антитіла, або інші зв'язувальні молекули за цим винаходом можуть використовуватися для підтвердження діагнозу "рак", поставленому патоморфологом на основі дослідження біоптату.
Ці антитіла або ТКР можуть використовуватися також для діагностики іп мімо. Зазвичай антитіла мітять радіонуклідами (такими як "и, 99Тс, 120, 191|, ЗН, 82 Р або 955), щоб пухлину можна було локалізувати, використовуючи імуносцинтіграфію. В одному з втілень антитіла або їх фрагменти зв'язуються з зовнішньоклітинними доменами двох або більше таких мішеней білка, вибраного з групи, що складається з вищезгаданих білків., із константою зв'язування (Ка) меншою ніж 1 х 10 мкМ.
Антитіла для діагностичного застосування можна мітити зондами, що підходять для виявлення різними методами візуалізації Методи виявлення зондів включають, але не обмежуються ними, флуоресценцію, світлову, конфокальну і електронну мікроскопію, магнітно- резонансну візуалізацію і спектроскопію, флуороскопію, комп'ютерну томографію та позитронну емісійну томографію. Відповідні зонди включають, але не обмежуються ними, флуоресцеїн, родамін, еозин та інші флуорофори, радіоїзотопи, золото, гадоліній та інші лантаноїди, парамагнітне залізо, фтор-18 та інші радіонукліди, що випромінюють позитрони. Крім цього, зонди можуть бути бі- або багатофункціональними і виявлятися більш ніж одним із зазначених методів. Ці антитіла можуть бути безпосередньо або опосередковано мічені вищезгаданими зондами. Прикріплення зондів до антитіл включає ковалентне зв'язування зонда, включення зонда в антитіло і ковалентне прикріплення хелатуючої сполуки для зв'язування зонда, серед інших методів, добре відомих фахівцю у цій галузі. У разі імуногістохімічних методів зразок хворої тканини може бути свіжим чи замороженим або може бути залитим у парафін і фіксованим за допомогою консерванту, такого як формалін. Фіксовані або залиті зразки зрізів тканин приводять у контакт із міченим первинним антитілом і вторинним антитілом, де антитіло використовується для виявлення експресії цих білків іп іш.
Згідно з іншим аспектом цього винаходу пропонується спосіб отримання активованих Т- клітин іп мійго, причому спосіб включає контактування іп мійго Т-клітин із навантаженими бо антигеном молекулами МНС, що експресуються на поверхні відповідної антиген-презентуючої клітини протягом періоду часу, достатнього для активації Т-клітини шляхом набуття нею специфічності до антигену, де згаданий антиген є пептидом за винаходом. Переважно з антиген-презентуючою клітиною використовують достатню кількість антигену.
Переважно клітина ссавців не має пептидного транспортера ТАР чи має його знижений рівень або знижену функціональну активність. Відповідні клітини з дефіцитом пептидного транспортера ТАР включають клітини Т2, КМА-5 і клітини дрозофіли. ТАР є транспортером, асоційованим із процесингом антигену.
Лінія людських клітин з недостатністю Т2, на які завантажуються пептиди, доступна для придбання у Американській колекції типових культур АТСС за адресою 12301 РагКіамлт Огіме,
КоскКміїе, Магуїапа 20852, США, номер за каталогом СК. 1992; лінія клітин дрозофіли Зсппеїдег 2 доступна для придбання в АТСС, номер за каталогом СКІ. 19863; клітинна лінія миші КМА-5 описана у Ципдаогеп і співавт. (І їипддгеп апа Каїте, 1985).
Переважно, клітина-хазяїн до трансфекції не експресує суттєвої кількості молекул МНС І класу. Також переважно клітина-стимулятор експресує молекулу, яка є важливою для забезпечення додаткового стимулюючого сигналу для Т-клітин, таку як будь-яка з молекул В7.1,
В7.2, ІСАМ-1 ії БА 3. Послідовності нуклеїнових кислот багатьох молекул МНС І класу і костимуляторних молекул є у вільному доступі в базах даних сСепВапк і ЕМВІ..
У випадку, коли роль антигенів відіграють епітопи комплексу МНС І класу, Т-клітини є СО8- позитивними Т-клітинами.
Якщо антиген-презентуючи клітину трансфекують для експресії такого епітопу, клітина переважно містить вектор експресії, здатний експресувати пептид, що містить послідовності від
ЗЕО ІЮ МО: 1 до 5ЕО ІЮ МО: 549, або варіант його амінокислотної послідовності.
Ряд інших способів може використовуватися для отримання Т-клітин іп міго. Наприклад, для отримання ЦТЛ можуть використовуватися аутологічні лімфоцити, які інфільтрують пухлину.
Ріебапзкі і співавт. (Ріерап:хкі еї а!., 1995) використовували аутологічні лімфоцити периферійної крові (РІВ) для отримання Т-клітин. Більш того, можливе створення аутологічних Т-клітин шляхом обробки дендритних клітин пептидом або поліпептидом або інфікуванням рекомбінантним вірусом. Для отримання аутологічних Т-клітин можуть також використовуватися
В-клітини. Крім того, для отримання аутологічних Т-клітин можуть використовуватися
Зо макрофаги, оброблені пептидом або поліпептидом або інфіковані рекомбінантним вірусом. 5.
Умацег і співавт. (У/аег еї а!., 2003) описують примування Т-клітин іп міго за допомогою штучних антиген-презентуючих клітин (штучні АПК), що також є прийнятним способом отримання Т- клітин проти вибраного пептиду. В цьому винаході штучні АПК отримували шляхом прикріплення заздалегідь сформованих комплексів МНС-пептид до поверхні полістирольних частинок (мікрогранул)у за допомогою системи біотин-стрептавідин. Ця система забезпечує точний контроль щільності МНС на штучних АПК, що дозволяє селективно викликати високо- або низькоавідні специфічні до антигену відповіді Т-клітин з високою ефективністю для зразків крові. Окрім комплексів МНО-пептид, штучні АПК мають нести інші білки з костимулювальною активністю, такі як антитіла проти СО28, прикріплені до їхньої поверхні. До того ж такі системи на базі штучних АПК часто вимагають додавання відповідних розчинних елементів, наприклад, цитокінів, таких як інтерлейкін-12.
Алогенні клітини також можуть використовуватися для отримання Т-клітин, і відповідний спосіб докладно описаний у заявці М/О 97/26328, яка включена в цей документ шляхом посилання. Наприклад, окрім клітин ЮОго5орпйа і клітин Т2, інші клітини можуть використовуватися для презентації антигенів, такі як клітини СНО, інфіковані бациловірусом клітин комах, бактеріальні, дріжджові клітини та клітини-мішені, інфіковані коров'ячою віспою.
Крім того, можуть використовуватись віруси рослин (див., наприклад, роботу Рогіа і співавт. (Ропа єї аї., 1994), в якій описується розробка мозаїчного вірусу вігни як високопродуктивної системи для презентації чужорідних пептидів.
Активовані Т-лімфоцити, які спрямовані проти пептидів за винаходом, є корисними в терапії.
Отже, згідно з ще одним аспектом винаходу пропонуються активовані Т-клітини, які можна отримати за допомогою вищезгаданих способів за винаходом.
Активовані Т-клітини, які отримані вищезгаданим способом, селективно розпізнають клітину, яка аберантно експресує поліпептид, який містить амінокислотну послідовність від 5ЕО ІЮ МО: 1 до 5ЕО ІЮ МО 549.
Переважно, Т-клітина розпізнає цю клітину шляхом взаємодії свого Т-клітинного рецептора з комплексом НІ А/пептид (наприклад, зв'язуванням). Т-клітини є корисними у способі знищення клітин-мішеней в організмі пацієнта, клітини-мішені якого аберантно експресують поліпептид, що містить амінокислотну послідовність за винаходом, за яким пацієнту вводиться ефективна бо кількість активованих Т-клітин. Ці Т-клітини, що вводяться пацієнту, можуть бути виділені з організму пацієнта і активовані як описано вище (тобто вони є аутологічними Т-клітинами). Як альтернатива, ці Т-клітини одержуються не з організму пацієнта, а від іншої людини. Зрозуміло, що переважно ця людина є здоровою людиною. Під терміном "здорова людина" автори винаходу мають на увазі, що людина має хороший загальний стан здоров'я, переважно має адекватну імунну систему та, ще більш переважно, не страждає від якогось захворювання, на яке її можна легко перевірити і виявити.
Іп мімо, клітини-мішені для СО8-позитивних Т клітин за цим винаходом можуть бути клітинами пухлини (які іноді експресують МНС ЇЇ класу) і (або) клітинами строми, що оточують пухлину (пухлинні клітини) (які іноді також експресують МН ІІ класу; (Оєпа/є! еї а!., 2006)).
Т-клітини за цим винаходом можуть використовуватися як активні інгредієнти терапевтичної композиції. Отже, предметом цього винаходу також є спосіб знищення клітин-мішеней в організмі пацієнта, клітини-мішені якого аберантно експресують поліпептид, що містить амінокислотну послідовність за винаходом, причому спосіб включає введення пацієнту ефективної кількості Т-клітин згідно визначеному вище.
Під терміном "аберантно експресовані" автори винаходу мають на увазі, що поліпептид є надмірно експресованим у порівнянні з нормальними рівнями експресії або що ген є "мовчазним" у тканині, з якої походить пухлина, але він експресується в пухлині. Під терміном "надмірно експресований" автори винаходу мають на увазі, що поліпептид присутній на рівні, що принаймні у 1,2 рази вищий за рівень у нормальній тканині, переважно принаймні у 2 рази, та більш переважно принаймні у 5 або 10 разів вищий за рівень у нормальній тканині.
Т-клітини можуть бути отримані способами, що відомі в галузі, наприклад, тими, що описані вище.
Протоколи для цього так званого адоптивного перенесення Т-клітин добре відомі в цій галузі. Огляди можна знайти, наприклад, у роботах Ссайціопі і співавт. і Могдап і співавт. (Саціпопі єї аі!., 2006; Могаап еї а!., 2006).
У ще одному аспекті цей винахід стосується застосування пептидів, які входить до складу комплексу з МНС, для отримання Т-клітинного рецептора, нуклеїнова кислота якого клонована і введена у клітину-хазяїн, переважно Т-клітину. Ця отримана методами генної інженерії Т- клітина може потім бути перенесена в організм пацієнта для лікування раку.
Зо Будь-яка молекула за винаходом, тобто пептид, нуклеїнова кислота, антитіло, вектор експресії, клітина, активована Т-клітина, Т-клітинний рецептор або нуклеїнова кислота, яка її кодує, є прийнятною для лікування захворювань, для яких є характерним те, що клітини уникають імунної відповіді. Таким чином, будь-яка молекула за цим винаходом може застосовуватися як лікарський засіб або в процесі виробництва лікарського засобу. Згадана молекула може використовуватися сама по собі або у комбінації з іншою молекулою (іншими молекулами) за винаходом або відомою молекулою (відомими молекулами).
Оскільки базові поліпептиди пептидів за винаходом, як згадано у наведених вище Таблицях, експресуються на високому рівні при раку яєчника і експресуються на досить низькому або надзвичайно низькому рівні у нормальних клітинах, цільові пептиди, отримані з білків-продуктів наступних генів, можуть бути переважно частиною терапевтичної стратегії.
Предметом цього винаходу є лікарський засіб, який може застосовуватися при лікуванні раку, зокрема, раку яєчника та інших злоякісних захворювань.
За цим винаходом також пропонується комплект, що включає: (а) контейнер, який містить фармацевтичну композицію як зазначено вище, у розчині або у ліофілізованій формі; (Б) необов'язково, другий контейнер, що містить розріджувач або розчин для відновлення ліофілізованої композиції, і (с) необов'язково, інструкції із (ї застосування розчину або (ії) відновлення і (або) застосування ліофілізованої композиції.
Комплект може додатково включати один або більше (іїї) буферів, (ім) розріджувачів, (м) фільтрів, (мі) голок або (мії) шприців. Контейнер є переважно пляшкою, флаконом, шприцом або пробіркою; і він може бути контейнером багаторазового застосування. Фармацевтична композиція є переважно ліофілізованою.
Комплекти за винаходом, переважно, включають ліофілізовану композицію за цим винаходом в належному контейнері та інструкції з її відновлення і (або) застосування. Належні контейнери включають, наприклад, пляшки, флакони (наприклад, двокамерні флакони), шприци (такі як двокамерні шприци) і пробірки. Контейнер може бути виготовленим із багатьох видів матеріалів, таких як скло або пластмаса. Переважно, комплект і (або) контейнер містить(ять) інструкції із застосування контейнера або пов'язані з контейнером, які містять вказівки щодо бо відновлення і (або) застосування. Наприклад, на етикетці може вказуватися, що ліофілізована лікарська форма має бути відновлена до таких концентрацій пептидів як зазначено вище. На етикетці, крім того, може бути зазначено, що лікарська форма є прийнятною для або призначена для підшкірного введення.
Контейнер із лікарською формою може бути флаконом багаторазового застосування, котрий дозволяє робити повторні введення (наприклад, від 2 до б введень) відновленої лікарської форми. Комплект додатково може включати другий контейнер, що містить прийнятний розріджувач (наприклад, розчин бікарбонату натрію).
Після змішування розріджувача та ліофілізованої форми остаточна концентрація пептиду у відновленій формі переважно становить принаймні 0,15 мг/мл/пептиду (-75 мкг) та переважно не більше З мг/мл/пептиду (-1500 мкг). Комплект додатково може включати інші матеріали, бажані з комерційної точки зору та з точки зору користувача, включаючи інші буфери, розріджувачі, фільтри, голки, шприци та вкладиші в упаковку з інструкціями із застосування.
Комплекти за цим винаходом можуть включати один контейнер, який містить лікарську форму фармацевтичних композицій відповідно до цього винаходу з іншими компонентами чи без них (наприклад, інші сполуки або фармацевтичні композиції цих інших сполук) чи включати окремі контейнери для кожного компоненту.
Переважно, комплекти за винаходом включають композицію за винаходом, упаковану для використання, в комбінації з одночасним введенням другої сполуки, такої, як ад'юванти (наприклад, ГМ-КСФ), хіміотерапевтичний агент, природний продукт, гормон чи антагоніст, анти- ангіогенезний агент чи інгібітор, апоптоз-індукуючий агент або хелатор) чи їхню фармацевтичну композицію Компоненти комплекту до введення пацієнту можуть бути завчасно змішані, чи кожний компонент може бути в окремому контейнері. Компоненти комплекту можуть бути надані в одному чи кількох рідких розчинах, переважно, водному розчині, більш переважно, стерильному водному розчині Компоненти комплекту також можуть надаватись як речовини у твердому стані, які можуть бути переведені на рідини шляхом додання прийнятних розчинників, котрі переважно містяться в іншому окремому контейнері.
Контейнер терапевтичного комплекту може являти собою флакон, пробірку, колбу, пляшку, шприц або будь-який інший засіб для вміщення твердої речовини чи рідини. Зазвичай, коли є більш ніж один компонент, комплект включає другий флакон чи другий контейнер, який дозволяє окреме дозування. Комплект може також включати інший контейнер для фармацевтично прийнятної рідини. Переважно, терапевтичний комплект буде включати апарат (наприклад, одну чи кілька голок, шприци, очні піпетки, піпетку та ін.), який робить можливим введення речовин відповідно винаходу, що є компонентами цього комплекту.
Ця лікарська форма є формою, прийнятною для введення пептидів будь-яким зручним способом, наприклад, пероральним (ентеральним), назальним, очним, підшкірним, внутрішньошкірним, внутрішньом'язовим, внутрішньовенним або трансдермальним. Переважно, введення може здійснюватися підшкірно, та найбільш переважно, внутрішньошкірно інфузійним насосом.
Оскільки пептиди за винаходом були виділені з тканин раку яєчника, лікарський засіб за винаходом переважно застосовується для лікування раку яєчника.
Цей винахід також стосується способу отримання персоналізованого фармацевтичного засобу для застосування для конкретного пацієнта, який включає виготовлення фармацевтичної композиції, яка містить принаймні один пептид, вибраний із "сховища" заздалегідь "просіяних" ТОМАР, в якому щонайменше один пептид, використаний у фармацевтичній композиції, вибраний таким чином, щоб підходити конкретному пацієнту. В одному з втілень фармацевтична композиція є вакциною. Спосіб може також бути пристосованим для отримання клонів Т-клітин для подальшого використання, такого як виділення ТКР, або розчинних антитіл та інших варіантів лікування. "Персоналізований фармацевтичний засіб" означає засоби лікування, спеціально адаптовані для конкретного пацієнта, які будуть застосовані для лікування лише цього конкретного пацієнта, включаючи активно персоналізовані протиракові вакцини і засоби адоптивної клітинної терапії з використанням аутологічних тканин, отриманих від пацієнта.
Термін "сховище" в контексті цього винаходу означає групу пептидів, яка заздалегідь пройшла "просіяння" (скринінг) на імуногенність і (або) надмірну презентацію у конкретному виді пухлин. Термін "сховище" не означає, що конкретні пептиди, що входять до складу вакцини, були заздалегідь виготовлені і зберігалися у фізичному об'єкті, хоча така можливість мається на увазі. Прямо передбачається, що пептиди можуть бути виготовлені де помо для кожної отриманої персоналізованої вакцини або вони можуть бути виготовлені заздалегідь і зберігатися. "Сховище" (наприклад, у формі бази даних) складається з пухлино-асоційованих бо пептидів, що були високо експресовані тканинами пухлин хворих на рак яєчника пацієнтів із різними алелями НІ А-А, НІ А-В і НГА-С. Воно може містити пептиди, що зв'язані з молекулами
МНС І класу і з молекулами МНС ЇЇ класу або подовжені пептиди, що зв'язані з молекулами
МН І класу. На додаток до пухлино-асоційованих пептидів, отриманих із декількох тканин раку яєчника, сховище може містити маркерні пептиди, що зв'язані з НІ А-А"02 ії НГА-А"24, а також з іншими, присутніми у менших кількостях типами молекул НГА. Ці пептиди дозволяють кількісно порівняти інтенсивність Т-клітинної відповіді, індукованої ТОМАР, і таким чином дозволяє зробити важливий висновок відносно здатності вакцини викликати протипухлинну відповідь. По- друге, вони виконують функцію важливих пептидів позитивного контролю, отриманих з "не- свого" антигену, у випадку, якщо у пацієнта не спостерігаються жодні вакцино-індуковані Т- клітинні відповіді на ТОМАР, отримані зі "своїх" власних антигенів пацієнта. | по-третє, воно дозволяє зробити висновки щодо стану імунокомпетентності пацієнта.
ТОМАР для "сховища" ідентифікуються за допомогою підходу інтегрованої функціональної геноміки, що поєднує аналіз генної експресії, мас-спектрометрію і Т-клітинну імунологію (ХРгезідепі Ф). Цей підхід гарантує, що тільки ТОМАР, насправді присутні у великому відсотку пухлин, але не взагалі неекспресовані або лише мінімально експресовані на нормальних тканинах, будуть вибрані для подальшого аналізу. Для первинного вибору пептидів зразки раку яєчника пацієнтів і зразки крові від здорових донорів аналізували з використанням поетапного підходу: 1. НІ А-ліганди зі злоякісного матеріалу ідентифікували методом мас-спектрометрії 2. Аналіз експресії інформаційної рибонуклеїнової кислоти (ІРНК) в усьому геномі використовували для ідентифікації генів, що надмірно експресовані у злоякісній тканині (раку яєчника) у порівнянні з рядом нормальних органів і тканин 3. Ідентифіковані НІ А-ліганди порівнювали з даними генної експресії Пептиди, надмірно або селективно презентовані на пухлінній тканині, переважно такі, що кодуються селективно експресованими або надмірно-експресованими генами, як було визначено на етапі 2, вважали прийнятними ТОМАР-кандидатами для включення до складу мультипептидної вакцини. 4. Пошук літератури був проведений для ідентифікації додаткових свідоцтв, що підтверджують доречність використання ідентифікованих пептидів як ТОМАР 5. Доречність надмірної експресії на рівні ІРНК була підтверджена повторним виявленням
Зо вибраних ТОМАР етапу З на пухлинній тканині і їх відсутністю (або рідким виявленням) на здорових тканинах. б. Для оцінки того, чи є здійсненною індукція вибраними пептидами Т-клітинної відповіді іп мімо, був проведений аналіз імуногенності іп міго з використанням Т-клітин людини, отриманих від здорових донорів, а також від пацієнтів, хворих на рак яєчника.
В одному з аспектів пептиди проходять попередній скринінг на імуногенність перед тим, як їх включать до "сховища". Як приклад, що не має обмежувального значення, імуногенність пептидів, доданих до "сховища", визначають методом, що включає примування Т-клітин іп міт шляхом повторних стимуляцій СО8--Т-клітин від здорових донорів клітинами, що презентують штучний антиген, навантаженими комплексами пептид/МНе і антитілами проти СО28.
Цей метод є переважним для видів раку, що рідко спостерігаються, і для пацієнтів з рідкісними профілями експресії. На відміну від мультипептидних коктейлів зі сталим складом, які у даний час вже розроблені, "сховище" дозволяє забезпечити значно кращий збіг з вакциною реальної експресії антигенів у пухлині. Вибрані "готові для застосування" індивідуальні пептиди або комбінації декількох пептидів будуть використані для кожного пацієнта у багатоцільовому підході. Теоретично, підхід, який базується на виборі, наприклад, 5 різних антигенних пептидів із бібліотеки з 50 пептидів, вже мав би привести приблизно до 17 мільйонів можливих складів лікарських препаратів.
В одному варіанті винаходу пептиди вибираються для включення до складу вакцини на основі їхньої прийнятності для конкретного пацієнта на основі способу за цим винаходом як вже описано в цьому документі або як викладено нижче.
З матеріалу пухлини і зразків крові пацієнта будуть зібрані дані щодо фенотипу НГА, транскриптомного і пептидомного аналізу з метою ідентифікувати найбільш прийнятні для кожного пацієнта пептиди "сховища" і унікальні для пацієнта (тобто мутовані) ТОМАР. Будуть вибрані ті пептиди, які селективно або надмірно експресуються в пухлинах пацієнтів і, де можливо, демонструють сильну імуногенність іп мйго, якщо вони були досліджені на зразках
МКПК індивідуальних пацієнтів.
Переважно, пептиди, що входять до складу вакцини, ідентифіковані методом, що включає: (а) ідентифікацію пухлино-асоційованих пептидів (ТОМАР), які презентуються зразком пухлини від конкретного пацієнта; (б) порівняння пептидів, ідентифікованих в (а), зі сховищем (базою бо даних) пептидів як зазначено вище; і (в) вибір принаймні одного пептиду зі сховища (бази даних), який корелює з пухлино-асоційованим пептидом, ідентифікованим у пацієнта.
Наприклад, ТОМАР, які презентуються зразком пухлини, ідентифікуються за допомогою: (а1) порівняння даних експресії зі зразка пухлини з даними експресії зі зразка нормальної тканини, що відповідає типу тканини зразка пухлини, для ідентифікації білків, які надмірно експресуються або аберантно експресуються у зразку пухлини; і (аг) проведення кореляції даних експресії з послідовностями лігандів МНС, зв'язаних із молекулою МНС І класу і (або) ІІ класу, в зразку пухлини для ідентифікації лігандів МНС, отриманих із білків, що надмірно експресуються або аберантно експресуються пухлиною. Переважно, послідовності лігандів МНС ідентифікуються елююванням зв'язаних пептидів із їхніх комплексів із молекулами МНС, виділених із зразка пухлини, і секвенуванням елюйованих лігандів. Переважно, зразок пухлини і нормальна тканина отримані від того самого пацієнта.
На додаток до (або як альтернатива йому) вибору пептидів з використанням моделі "сховища", ТОМАР можуть бути ідентифіковані у пацієнта де помо і потім введені до складу вакцини. Як один приклад, ТОМАР-кандидати можуть бути ідентифіковані у пацієнта шляхом (а1ї) порівняння даних експресії зі зразка пухлини з даними експресії зі зразка нормальної тканини, що відповідає типу тканини зразка пухлини, для ідентифікації білків, які надмірно експресуються або аберантно експресуються у зразку пухлини; і (а2) проведення кореляції даних експресії з послідовностями лігандів МНС, зв'язаних із молекулою МНС І класу і (або) ЇЇ класу, в зразку пухлини для ідентифікації лігандів МНС, отриманих із білків, що надмірно експресуються або аберантно експресуються пухлиною. Як інший приклад, білки можуть бути ідентифіковані як такі, що містять мутації, які є унікальними для зразка пухлини, по відношенню до відповідної нормальної тканини конкретного пацієнта, а ТОМАР можуть бути ідентифіковані як такі, що специфічно націлені на цю мутацію. Наприклад, геном пухлинної клітини і геном клітин відповідної нормальної тканини можливо секвенувати методом повногеномного секвенування: для викриття несинонімічних мутацій у білок-кодуючій ділянці генів геномні ДНК і
РНК екстрагують із пухлинних тканин, а нормальну немутовану геномну ДНК лінії зародкових клітин екстрагували з мононуклеарних клітин периферичної крові (МКПК). Використаний метод секвенування нового покоління (МО5) зводиться до повторного секвенування білок-кодуючих ділянок (ресеквенування екзому). З цією метою екзонну ДНК із зразків людини уловлюють за допомогою комплектів збагачення цільовими фрагментами, придбаних у постачальника, з наступним секвенуванням, наприклад, за допомогою НізЗед2000 (Шиптіпа). Крім цього, ІРНК пухлинних клітин секвенують для прямого кількісного визначення генної експресії і підтвердження того, що мутовані гени експресуються у пухлинах пацієнтів. Отримані мутації послідовностей зчитування обробляють з використанням програмно-реалізованих алгоритмів.
Таблиця результатів містить мутації і показники генної експресії. Пухлиноспецифічні соматичні мутації визначають шляхом порівняння з варіаціями зародкових ліній, що походять від МКПК, і розміщують у відповідності до пріоритету. Ідентифіковані де помо пептиди можуть згодом бути досліджені на імуногенність як викладено вище для "сховища", а і ТОМАР-кандидати, що мають прийнятну імуногенність, вибирають для включення до складу вакцини.
В одному з прикладів втілень пептиди, що входять до складу вакцини, ідентифікуються таким чином: (а) ідентифікацією пухлино-асоційованих пептидів (ТОМАР), які презентуються зразком пухлини від конкретного пацієнта описаними вище методами; (б) порівнянням пептидів, ідентифікованих в а), зі сховищем пептидів, які пройшли попередній скринінг на імуногенність і на надмірну експресію у пухлинах у порівнянні з відповідною нормальною тканиною; (в) вибором принаймні одного пептиду зі сховища, який корелює з пухлино-асоційованим пептидом, ідентифікованим у пацієнта, і г) необов'язково, вибором принаймні одного пептиду, ідентифікованого де помо в (а) і підтвердженням його імуногенності.
В одному з прикладів втілень пептиди, що входять до складу вакцини, ідентифікуються таким чином: (а) ідентифікацією пухлино-асоційованих пептидів (ТОМАР), які презентуються зразком пухлини від конкретного пацієнта; і (б) вибором принаймні одного пептиду, ідентифікованого де помо в (а) і підтвердженням його імуногенності.
Після вибору пептидів для персоналізованої вакцини на основі пептиді виготовляється вакцина. Ця вакцина переважно є рідкою лікарською формою, що складається з окремих пептидів, розчинених у ДМСО концентрацією від 20 до 40 95, переважно приблизно від 30 до 35 95, такій як приблизно 33 95 ДМСО.
Кожен пептид, який належить включити до композиції, розчиняють у ДМСО. Концентрацію розчинів окремих пептидів необхідно вибирати залежно від кількості пептидів, які належить включити до складу продукту. Розчини окремих пептидів у ДМСО змішують у рівних частинах, щоб отримати розчин, який містить усі пептиди, які належить включити до складу продукту, з бо концентрацією 2,5 мг/мл для кожного пептиду. Змішаний розчин потім розводять у співвідношенні 1:3 водою для ін'єкцій з метою досягти концентрацію 0,826 мг/мл для кожного пептиду у 33 96 ДМСО. Розведений розчин фільтрують через стерильний фільтр із розміром пор 0,22 мкм. Отримують нерозфасований кінцевий розчин.
Нерозфасований кінцевий розчин розливають по флаконах і зберігають при температурі - 20 7С аж до використання. Один флакон вміщує 700 мкл розчину, що містить 0,578 мг кожного пептиду. 500 мкл цього розчину (приблизно 400 мкг кожного пептиду) будуть використані для внутрішньошкірної ін'єкції.
На додаток до можливості використання для лікування раку, пептиди за цим винаходом можуть також використовуватися як діагностичні реактиви. Оскільки пептиди генерувалися з клітин раку яєчника і оскільки було визначено, що ці пептиди не є присутніми у нормальних тканинах або присутні у низькій кількості, ці пептиди можуть використовуватися для діагностики наявності раку.
Присутність пептидів за цим винаходом на біоптатах тканин у зразках крові може допомогти патоморфологу в діагностуванні раку. Виявлення певних пептидів за допомогою антитіл, мас- спектрометрії або інших методів, відомих фахівцям у цій галузі, може надати патоморфологу інформацію, чи є тканина злоякісною або запаленою або взагалі ураженою хворобою, або може використовуватися як біомаркер раку яєчника. Наявність груп пептидів може дозволити віднести хворі тканини до певного класу чи підкласу.
Виявлення пептидів на зразках хворої тканини дає можливість прийняти рішення відносно користі від методів лікування за участю імунної системи, особливо якщо відомо або передбачається, що Т-лімфоцити причетні до механізму дії. Втрата експресії МНС є добре відомим механізмом, за яким інфіковані або злоякісні клітини уникають імунного контролю.
Отже, наявність пептидів свідчить про те, що цей механізм не використовується клітинами, що аналізуються.
Пептиди за цим винаходом можливо використовувати для аналізу відповіді лімфоцитів на дію таких пептидів, такої як реакція Т-клітин або відповідь антитіл на пептид або комплекс пептиду і молекул МНС. Ці відповіді лімфоцитів можливо використовувати як прогностичні маркери для прийняття рішень щодо наступних терапевтичних дій. Ці відповіді можна також використовувати як сурогатні маркери в імунотерапевтичних підходах, що мають на меті
Зо викликати відповіді лімфоцитів у різний спосіб, наприклад, вакцинацією білками, нуклеїновими кислотами, аутологічними матеріалами, адоптивним перенесенням лімфоцитів. В закладах, де застосовують генну терапію, для оцінки побічних ефектів рекомендується проаналізувати реакції лімфоцитів на пептиди. Моніторинг реакцій лімфоцитів може також бути цінним інструментом під час обстеження при подальшому спостереженні після трансплантації, наприклад, для виявлення реакцій "трансплантат проти хазяїна" та "хазяїн проти трансплантата".
Цей винахід буде проілюстрований наведеними нижче прикладами, які описують його переважні втілення, але не обмежуються наведеними тут. Для цілей цього винаходу всі цитовані джерела включені в цей документ шляхом посилання в усій повноті.
ФІГУРИ
На Фігурі 1 показані рівні експресії НІ А-А, В,С (а) ії НГСА-ОК (Б) різними підгрупами клітин раку яєчника і доброякісних тканин яєчника. Для отримання Фігури 1 був використаний непарний двобічний І-критерій Стьюдента з поправкою Уелча у зв'язку з різною дисперсією у двох груп порівняння. Експресія молекул НГА І класу (А) і НГСА-ОК (В) на різних видах клітин
ЕРЯ і доброякісних тканин яєчника, які піддано ферментативній дисоціації, характеризується певними маркерами клітинної поверхні (лейкоцитарний компартмент: СО45- пухлинні клітини/епітеліальний клітинний компартмент: СО45-ЕрСат», ендотеліальний клітинний компартмент: СО45-СО031ж). Кожна точка даних являє собою середнє трьох паралельних експериментів, проведених для кожного зразка. Двобічний І-критерій використовувався для визначення рівня значущості ("р«е0,05; их ре0,01).
На Фігурах 2А-О наведене порівняння профілів імунопептидомів ЕРЯ і доброякісних тканин. (А) Порівняння профілів вихідних білків лігандів НІГА | класу, представлених у ЕРЯ (п-34) і доброякісних тканинах. НІ А-рестриктована частота зустрічальності вихідних білків наведена на осі "у" окремо для ЕРЯ (вище осі "х") і для доброякісних тканин (нижче осі "х"). Вихідні білки були розміщені у ряд (зліва направо) відповідно до частоти їх ЕРЯ-специфічної зустрічальності.
Прямокутник у лівій частині виділяє групу ТОР100 вихідних білків лігандів НГА, ексклюзивно презентованих ЕРЯ. (В) "Хмара" слів, що описують групу ТОР 100 для ЕРЯ-специфічних вихідних білків лігандів НГА І класу (назви генів, рекомендовані базою даних Опірго). Розмір шрифту (5-26) корелює з абсолютною кількістю хворих на рак пацієнтів, що є носіями лігандів 60 НА відповідних вихідних білків. (С) Порівняння профілів вихідних білків лігандів НГА ЇЇ класу, 5О0 представлених у ЕРЯ (п-22) і доброякісних тканинах. (0) "Хмара" слів, що описують групу ТОР 100 для ЕРЯ-специфічних вихідних білків лігандів НГА ІІ класу (назви генів, рекомендовані базою даних Опірго). Розмір шрифту (3-11) корелює з абсолютною кількістю хворих на рак пацієнтів, що є носіями лігандів НГ А відповідних вихідних білків.
На Фігурі З показане клітинне походження групи ТОР100 ЕРЯ-асоційованих лігандів НГА І класу. Вулканоподібні графіки відносної присутності лігандів НГА у імунопептидомі | класу збагачених популяцій клітин ОмСа 84, кількісно проаналізованих без застосування міток. На панелі показані: зліва (А) -лейкоцити, які інфільтрують пухлину (СО45-) у порівнянні з клітинами пухлини (СО45-Ерсатт), справа (В) - клітини строми (СО45-ЕрСат-) у порівнянні з клітинами пухлини. Горизонтальна пунктирна лінія позначає поріг значущості (р « 0,05). Виділеними є група ТОР100 лігандів, ексклюзивно презентованих ЕРЯ (МОС16 (червоним кольором), СОКІ,
ЕМА2, 5ОХУ, ТІК, ОАБІ), а також ліганди, отримані з лейкоцит-асоційованих антигенів (20132, СО8, І 5РІ1) і антигенів, асоційованих із ендотеліальними клітинами строми (ММ/Е).
На Фігурі 4 показані імуногістохімічне забарвлення і сироваткові рівні як сурогатні маркери презентації лігандів. Імуногістохімічне забарвлення серозних карцином яєчника високого ступеня злоякісності для МОС16 (СА-125) з низьким (ІК54), середнім (ІК5б) і високим (ІК512) показником імунореактивності (А). Імуногістохімічне забарвлення для мезотеліну (справа, ІКЗ8) і 1001 (зліва, ІК5 12; усе зі збільшенням 200 х) (В). Кореляція презентації лігандів НГА і експресії вихідних білків для вибраної групи ТОР100О0 ЕРЯ-асоційованих антигенів. Експресію
МИиС16 (п-23), ІБО1 (п-23) і М5І М (п-16) аналізували імуногістохімічним барвленням (С) або визначенням сироваткового маркера СА-125 (п-30) у день проведення хірургічної операції (0).
Для М5ІМ були включені тільки випадки, для яких були наявні дані імунопептидому НГА ЇЇ класу. Для визначення рівня статистичної значущості (р«0,05 вважався значущим) використовували непараметричний критерій Манна-Уітні.
На Фігурі 5 показана прогностична значущість МОС16 і М5І М. Імуногістохімічне барвлення виконувалося на тканинних матрицях із 71 зразком серозного ЕРЯ високого ступеня злоякісності, отриманим у пацієнтів із документованим оптимальним хірургічним видаленням максимально можливого об'єму пухлинної тканини. (А) Графік Каплана-Мейера, що зображує вплив на загальну виживаність експресії МОС16 (ліва частина, низький бал експресії «7, п-41;
Зо високий бал експресії 27, п-30) і експресії М5І-М (права частина, низький бал експресії «6, п-15; високий бал експресії 26, п-52). (В) Вплив на загальну виживаність пацієнтів інфільтрації СОЗ Т- клітинами внутрішньоепітеліального компартменту (ліва частина СОЗЕ, низький показник інфільтрації «7 клітин/НРЕ, п-13 високий показник інфільтрації 27, п-57) або фіброваскулярну строму (права частина, СОЗ5, низький показник інфільтрації «7 клітин/НРЕ, п-40; високий показник інфільтрації 27, п-30). (С) Аналіз підгруп комбінованого забарвлення СОЗ і МІ-М (усі порогові значення як наведено вище) для інтраєпітеліаальних СОЗ Т-клітин (верхня частина, низький М5І М/високий СОЗЕ, п-11; низький МО М/низький СОЗЕ, п-40; високий МО М/низький
СОЗЕ, п-14; високий М5І М/високий СОЗЕ, п-1) або фіброваскулярних СОЮЗ Т-клітин (нижня частина, низький М5ІМ/високий СОЗ5, п-30; високий М5ІМ/низький СО35, п-7; низький
М5І М/низький СОЗ5, п-21; високий МОЇ М/високий СОЗ5, п-8).
На Фігурі 6 наведені результати аналізу методом протокової цитометрії ЕРЯ і доброякісної тканини яєчника. Типова презентація стратегії гейтування для ОмСа 48, що показує вибір СЮО45 лейкоцитів, СО45-СО031-- ендотеліальних клітин і СО45-ЕрСат-- клітин пухлини або епітелію.
На Фігурі 7 показані результати аналізу насиченості для ідентифікації вихідних білків лігандів
НІА для ЕРЯ. Результати аналізу насиченості для ідентифікації вихідних білків зображені окремо для білків-лігандів НІ А І класу (А) і НГА ІІ класу (В). Середнє число унікальних вихідних білків було розраховано для кожного джерела з 1000 випадкових вибірок із 34 джерел ЕРЯ. Для визначення розрахункового максимально досяжного охоплення інвентарних білків для ЕРЯ використовувалася експоненціальна регресія (точкова лінія).
На Фігурі 8 показані частота і кількість презентацій лігандів НГ А у зразках ЕРЯ. Презентацію молекулами НГА вибраних ЕРЯ-асоційованих антигенів, а також кількість різних презентованих молекулами НІ А пептидів (кольорове кодування) візуалізовано для кожного індивідуального випадку ЕРЯ (номер пацієнта зверху кожного стовпчика) як для антигенів класу І (зверху), так і для антигенів класу Ії (знизу).
ПРИКЛАДИ
Матеріали і методи
Зразки тканин
Усі зразки тканин були зібрані в Університетській клініці Тюбінгена після отримання від пацієнта письмової інформованої згоди відповідно до протоколу Гельсінкської Декларації. Усі бо протоколи дослідження були схвалені експертною радою лікувально-профілактичного закладу.
Зразки зберігали за температури -80 "С до використання, якщо не зазначено інакше. НІ А- типування до другого знаку було проведене ПЛР з використанням алель-специфічних праймерів (55Р) на системі НІ А-Кеаду Сепе Зузіет (Іппоїгаіп, Кронберг, Німеччина) і кількісно оцінене за допомогою програми 5СОКЕ Зоймжаге (ОІегир, Стокгольм, Швеція) у Відділенні трансфузійної медицини Університетської клініки Тюбінгена. Ні А-типування високої розділювальної здатності до четвертого знаку було проведене за методикою секвенування "наступного покоління" на секвенсері (5 дипіог Зедцепсег з використанням набору праймерів о5 сТуре НГА Ргітег зеї (обидва від компанії Коспе, Базель, Швейцарія). Нормальні тканини були отримані з компаній Віо-Оріїоп5 Іпс., Каліфорнія, США, ВіозЗегме, Белтсвілл, Меріленд,
США, Саріа! Віозсієпсе Іпс., Роквілл, Меріленд, США, Сепеїісіві Іпс., Глендейл, Каліфорнія,
США, Університетської клініки Женеви, Університетської клініки Гейдельберга, Університетської клініки Мюнхена, компанії РгоїеосСепех Іпс., Калвер Сіті, Каліфорнія, США, Університетської клініки Тюбінгена. До хірургічного видалення тканин або аутопсії була одержана письмова інформована згода від усіх пацієнтів. Тканини були заморожені шоковим способом безпосередньо після вирізування та зберігались до виділення ТОМАР при температурі -70 С або нижче.
Дезінтеграція тканин
Тканини ЕРЯ, а також доброякісні тканини яєчника і фаллопієвих труб були свіжозібрані у пацієнтів, які проходили резекцію пухлини або хірургічне видалення максимально можливого об'єму пухлинної тканини, або сальпінгоофоректомію. Тканини були подрібнені на невеликі шматки розміром «2 мм: і перенесені у розчин для ферментативної дисоціації, який містив 400
Од/мл колагенази типу ІМ, 5 Од/мл диспази (обидві від компанії І їе Тесппоіодіє5, Карлобад,
Каліфорнія, США) ії 0,1 мг/мл ДНКази (Коспе, Базель Швейцарія) у ОМЕМ (І їе Тесппоїодіев) із 10 95 фетальної телячої сироватки (опа, Базель, Швейцарія). Дезінтеграцію проводили на обертовому струшувачі (Іптог5 НТ, Базель, Швейцарія) протягом З годин за температури 37 "С.
Фрагменти тканин, що залишилися (зазвичай розміром «1 95 від первинної ваги) видаляли за допомогою 100 мкм клітинного фільтра (ВО, Франклін Лейкс, Нью-Джерсі, США). Одноклітинні суспензії промивали двічі буфером РВЕ, і лізис еритроцитів здійснювали у буфері для лізису з хлоридом амонію.
Зо Визначення кількості молекул НГА на поверхні
Експресію НІГА на поверхні клітин аналізували з використанням набору ОІРІКІТ для кількісного визначення методом протокової цитометрії (бако, Глоструп, Данія) відповідно до інструкцій виробника. Зразки забарвлювали моноклональними антитілами УУб/32, специфічними до молекул НГА І класу, специфічними до НГА-ОК моноклональними антитілами І/243 або контрольним зразком відповідного ізотипу. Розрізнення клітин за типами базувалося на забарвленні поверхневих маркерів із флуоресцентно міченими антитілами проти СО45 (АтСуап клону 201, ВО), СОЗ31 (РеСу7, клону МУМ59, ВіоІедепа, Сан-Дієго, Каліфорнія, США), ЕрСат (АРС, клону НЕАТ125, Мікепуї, Бергіш-Гладбах, Німеччина) і СО34 (АРССУу7, клону 581,
Віоіедепа). Безпосередньо перед проведенням аналізу на приладі (ЗК 5ОКР ГЕопезза (ВО) додавали 7-ААО (ВіоЇ едепа) як маркер життєздатності. Результати трьох паралельних вимірів були записані для кожного зразка. Медіанні значення інтенсивності флуоресценції використовували для розрахунку експресії молекул на поверхні.
Розділення клітин
Розділення клітин було проведено за допомогою двох послідовних процедур розділення клітин з магнітною сепарацією (МАС) відповідно до інструкцій виробника (Мінепуї). Розділення було проведено з використанням колонок Х5 і сепаратора зирегМАС5 (обидва від Мінепуї).
Перше розділення мало на меті позитивний відбір СО45" лейкоцитів. Негативну фракцію потім збагачували пухлинними клітинами ЕрСат". СО45'ЕрСат: фракцію, що залишалася, вважали такою, що являє собою фракцію клітин строми.
Виділення лігандів НГ А
Молекули НГА І ї ІЇ класу були виділені за допомогою стандартного очищення методом імуноафінної хроматографії як описано раніше 77. Для виділення молекул НІА | класу використовували моноклональні антитіла М/6/32, специфічні до всього | класу молекул НГА, а для виділення молекул НІГА І класу використовувалися моноклональні антитіла Тй39, специфічні до всього ІІ класу молекул НГА, а також моноклональні антитіла І 243, специфічні до молекул НІ А-ОВ.
Аналіз імунопептидому методом РХ-МС/МС
Аналіз імунопептидому проводили на мас-спектрометрі ТО Огрбйгарх! (Тпегто Рівпег,
Уолтем, Масачусетс, США), обладнаний джерелом іонів за принципом іонізації у наноспреї і бо сполучений із системою ультрависокоефективної рідинної хроматографії (ФНРІ С) Ойітаїте 3000
К5БІ С Мапо (ПОіопех, Саннівейл, Каліфорнія, США). Зразки пептидів завантажували разом із З Фо розчинником В (2095 Н2гО, 80 95 ацетонітрилу і 0,04 95 мурашиної кислоти) у 2 см-колонку
РерМар 100 С18 Мапоїгар (Оіопех) за швидкості потоку 4 мкл/хв протягом 10 хвилин.
Розділення здійснювали на 50 см-колонці РерМар С18 з розміром частинок 2 мкм (біопех), яка розташовується у термостаті колонки з встановленою температурою 50 "С. Застосований діапазон градієнту становив від З до 30 95 розчинника В протягом 140 хв за швидкості потоку! 75 нілІпіЦ/хв. (Розчинник А: 99 95 НгО, 1 95 АЦН і 0,1 95 мурашиної кислоти; Розчинник В: 20 95 Н2О, 8096 АЦН і 0,1 96 мурашиної кислоти). Мас-спектрометричний аналіз виконували у режимі незалежного від даних аналізу з використанням методу "ор йме" (тобто під час кожного сканування спектрів п'ять найбільш поширених іонів-прекурсорів вибирали для фрагментації).
Скани спектрів записували на Огрігар із розділювальною здатністю 60 000. МС/МС аналіз здійснювали методом ініційованої зіткненнями дисоціації (СІЮ, нормалізована енергія зіткнень 35956, час активації ЗО мс, ширина ізоляції мас 1,3 т/7) з наступним аналізом з лінійною квадрупольною пасткою (ТО). Діапазон мас для лігандів НГА І класу був обмежений 400-650 т/7 їз можливими станами заряду 2-5 і З, вибраними для фрагментації. Для лігандів НГА ЇЇ класу діапазон мас був встановлений на 300-1500 т/7, що дозволяло проводити фрагментацію з позитивними станами заряду 22.
Зразки НГА І класу аналізували у 5 технічних реплікатах, у той час як для зразків НА ЇЇ класу зазвичай отримували дані на З технічних реплікатах. Перші прогони здійснювали без динамічного виключення, тоді як для наступних прогонів було активоване динамічне виключення 55.
Обробка і аналіз даних мас-спектрометрії
Аналіз даних МС виконували з використанням програмного забезпечення Ргоїеоте діб5сомегег 1.3 (ТпептоРїізпег). У списку піків проводили пошук у порівнянні з протеомом людини, який міститься у базі даних Зуіз5-Ргої (м/мли.ипіргої.огд, видання від 27 вересня 2013 року; містить 20 279 описаних білкових послідовностей), з використанням пошукової системи Мазсої зеагсі (Мазсої 2.2.04, Маїгіх 5сіепсе, Бостон, Масачусетс, США). Розбіжність між теоретичною і експериментальною масою для обробки даних становила 5 ррт для іонів-прекурсорів і 0,5 Да для осколкових іонів. Певної специфічності розщеплення вибрано не було, і єдиною дозволеною динамічною модифікацією був окиснений метіонін. Довірчий інтервал для пептидів був визначений за допомогою алгоритму Регсоїайог із цільовим значенням 4:0,05 (5 95 хибно- позитивних ідентифікацій). Додатковими фільтрами наступною обробки були кількість балів достовірності мас-спектрометричної ідентифікації іонів (Мавбсої Іопосоге) 220, ранг за пошуковою системою - 1 і довжина пептидів 8-12 амінокислот для лігандів НГА І класу і 12-25 амінокислот для лігандів НІГ А І класу. Групування білків було деактивоване з метою забезпечити множинну ідентифікацію пептидів, якщо послідовності картуються у декілька білків завдяки наявності консервативних ділянок. Ідентифікацію НІ А здійснювали з використанням алгоритмів передбачення НІА, які містяться у програмах ЗМЕРЕЇТН (ммлм.зуїрейні.ае) і
МЕТМНС 3.4 (пНр://млум.сЬз. ми. ак/зегмісе5/МеїМНС/). У випадку неоднозначних результатів посилалися на множинні алелі. Для порівняння профілів із обох баз даних були вилучені "сенсаційні компоненти", тобто білки, детектовані тільки за одним пептидом, тобто присутні лише в одному джерелі, з кількістю збігів пептидних спектрів (РМ) «5.
Кількісне визначення, без застосування міток, пептидів на клітинах пухлини у порівнянні з
СбОр45: клітинами і на клітинах пухлини у порівнянні з клітинами строми було здійснене з використанням сита 5ієме 2.1 (Тпегто Різпег). Принаймні З реплікати вихідних файлів даних МС для кожної збагаченої фракції клітин, а також результати осадження МНС із зразків цільних тканин вирівнювали із максимальним значенням зсуву часу утримання (КТ) 2,5 хвилин. Рамки генерували на основі сигналів на сканах МО: із максимальною шириною КТ 3,5 хв і розбіжністю між теоретичною і експериментальною масою у 5 ррт. Ідентифікації були імпортовані із програми Ргоїеоте аїзсомегег з використанням результатів пошукової системи Мавзсої зеагсп (див. вище). Для врахування різниці інтенсивностей сигналів зразків використовувалася нормалізація хроматограм сумарного іонного струму.
Аналіз імуногенності лігандів НГА Її класу
Примування пептид-специфічних цитотоксичних лімфоцитів (ЦтТЛ) проводилося з використанням загальноприйнятого протоколу із задіянням штучних антиген-презентуючих клітин (штучних АПК)У30). Штучними АПК служили полістирольні гранули, покриті стрептавідином (5,6 мкм у діаметрі, Вапо5 Іарогайогіеєх, Фішерс, Індіана, США). Гранули ресуспендували у кількості 2 х 105 частинок на мілілітр і інкубували з 10 нМ біотинільованих комплексів пептид-МНе і 10 нМ стимулювальних антитіл проти СО28 (клону 9.3, отриманого з бо колекції АТСС, Манасас, Вірджінія, США), кожну протягом 30 хв за кімнатної температури. Т-
клітини виділяли з цільної крові здорових донорів із застосуванням набору для виділення СО8 методом магнітної сепарації клітин (Мійепуї). Один мільйон Т-клітин на лунку культивували у планшетах на 96 лунок (Согппіпо, Корнінг, Нью-Йорк, США) і стимулювали такою самою кількістю навантажених штучних АПК у присутності 5 нг/мл ІЛ-12 (РготосеїЇ, Гейдельберг, Німеччина). Т- клітини стимулювали загалом З рази з щотижневим інтервалом стимуляції. Через 2 дні після кожної стимуляції додавали 40 Од/мл ІЛ-2. Примування Т-клітин оцінювали барвленням МНО- мультимерами за один тиждень після останнього циклу стимуляції.
Виготовлення тканинних мікроматриць
Із архіву Інституту патології були отримані послідовно приготовані залиті у парафін зразки пухлин пацієнтів із серозною карциномою яєчника або фаллопієвих труб (ЕРЯ) високого ступеню злоякісності, зі стадією щонайменше ППІ-ІЇ за РІО, які пройшли хірургічну операцію в
Університетській жіночій клініці Тюбінгена у період між 1999 і 2008 роками. Після підтвердження гістологічного підтипу і ступеню злоякісності відповідно до опублікованих критеріїв (43) зразки 154 хворих були спочатку включені в дослідження. Тканинну матрицю (ТМА) виготовляли як описано раніше (44). Автори винаходу використовували шість тканинних стовпчиків діаметром 0,6 мм від кожного пацієнта (не більше трьох тканинних стовпчиків кожного із двох різних ділянок первинної пухлини - щонайменше два окремих тканинних стовпчики). На додаток автори винаходу виготовили ТМА із використанням залитої у парафін тканини первинних пухлин, проспективно отриманої від пацієнтів для аналізу лігандому. Із зразків було виготовлено зрізи товщиною З мкм, повторно гідратовано і піддано специфічній імуногістохімічній обробці.
Загалом індекс імунореактивності і кореляцію з даними імунопептидому оцінювали на 23 зразках пацієнтів.
Імуногістохімічний аналіз
Для імуногістохімічного аналізу були використані наступні первинні антитіла і розведення:
СОЗ3 (1:100, моноклональні антитіла щура 5Р7, ОС5, Гамбург, Німеччина), СО8 (1:200, моноклональні антитіла миші С8/1448, ОАКО), МОС16 (1:450, моноклональні антитіла миші
М11, САКО, Глоструп, Данія), ІБО1 (1:25, моноклональні антитіла миші, АВСАМ, Кембрідж,
Велика Британія) і М5І/М (1:100, моноклональні антитіла миші 5РМ143, СепетТех, Ірвайн,
Каліфорнія, США). Зрізи тканини було витримано протягом 36 хвилин у буферному розчині з
Зо ЕДТА (рН 8,6) за температури 95 "С. Імуногістохімічне барвлення виконували на автоматичному імуностейнері відповідно до інструкцій виробника, з використанням набору для виявлення ЇмМіех/ рАВ (обидва від Мепіапа, Таксон, Аризона, США).
Визначення індексу імунореактивності
Кількісне визначення лімфоцитів, що інфільтрують пухлину (ЛІП), виконували передусім оцінюванням середньої кількості клітин, що піддалися імунному барвленню, у полі зору мікроскопа під великим збільшенням (НРЕ-400х), шляхом підрахунку принаймні у двох НРЕ для кожного тканинного стовпчика. На другому етапі розраховували середнє число лімфоцитів на
НРЕ для лівого і правого наборів з трьох тканинних стовпчиків і для усіх тканинних стовпчиків разом. Це середнє значення для двобічного підрахунку використовували для подальших розрахунків. Фіброваскулярна строма пухлини (СО35 і СО85) і внутрішньоепітеліальний компартмент пухлини (СОЗЕ і СО8Е) оцінювалися окремо.
Індекс інтенсивності забарвлення для вираження експресії СА 125, ІРО і М5ІМ становив від О до 3; для вираження процентної долі пухлинних клітин цей індекс помножено на значення показника від 1 до 4 (1: 0-10 95; 2: 10-50 90; З: 50-80 90; 4: від 80 до 100 95). Для усіх показників випадки були розділені на квартилі, а найкраще розділення між двома квартилями визначало порогове значення між високою і низькою експресією. Із 154 випадків ТМА 71 пацієнт був підданий документованому оптимальному хірургічному видаленню максимально можливого об'єму пухлинної тканини (розмір залишкової пухлини «1 см) і міг успішно пройти оцінювання на
ЛІП ї на рівень експресії білків. Визначення індексу імунореактивності і аналіз клінічних даних були проведені незалежними дослідниками.
Статистичний аналіз / візуалізація
Якщо не зазначено інакше, усі фігури і дані статистичного аналізу були отримані з використанням програм Сгарпрад Ргізт 6.0 (сгарпрад зопймаге, Ла Джола, Каліфорнія, США) або Місгозой ОйПісе 2010 (Місго5ої). "Хмари" слів були створені за допомогою онлайнового аплету (мм угогаіе.пе). Аналіз за методом Каплана-Мейера був виконаний за допомогою статистичного програмного забезпечення 5Р5З5 (версія 21, ІВМ Согр., Армонк, Нью-Йорк, США).
Застосовувався непарний двобічний іІ-критерій Стьюдента, якщо не зазначено інакше. Р- значення, менші за 0,05, вважалися статистично значущими. Для перевірки існування нормального розподілу застосовувався складений критерій Д'Агостіно-Пірсона, а для перевірки бо рівної дисперсії - Е-тест. Для отримання Фігури 1 був використаний непарний двобічний 1-
критерій Стьюдента з поправкою Уелча у зв'язку з різною дисперсією у двох груп порівняння.
Непараметричний критерій Манна-Уітні використовувався при побудові Фігури 4, оскільки нормальний розподіл неможливо оцінити в усіх випадках внаслідок невеликих розмірів вибірки.
Кореляція за Спірменом використовувалася для проведення кореляції між ІГХ показником для
М5ІМ ії МОС16, оскільки масиви даних не характеризувалися нормальним розподілом. р- значення порівняння двох кривих виживаності за методом Каплана-Мейера на Фігурі 5 розраховували з використанням логрангового критерію (Кокса-Мантеля) у програмі Старпрайд
Ріїзт.
Приклад 1: Кількість молекул НГ А на клітинній поверхні і типування за НІ А
Головною передумовою для розробки опосередкованих Т-клітинами засобів імунотерапії є експресія молекул МНС на поверхні пухлинних клітин. Отже, автори винаходу проаналізували і визначили кількість молекул НГА-А, В, С, а також НГА-ОК методом проточної цитометрії на клітинах різних підгруп пухлин яєчника (п-11), а також доброякісних тканин яєчника і фаллопієвих труб (п-8), отриманих ферментативним розщепленням. Аналіз мав на меті роздільне кількісне визначення клітиноспецифічної експресії НГА для лейкоцитів (СО455), пухлинних/епітеліальних клітин (Ерсат") і ендотеліальних клітин (СО31-; останні з них тільки у підгрупі з 7 пухлин яєчника). Інформацію про стратегію гейтування див. на Фігурі 6. Медіанні кількості молекул НІГА на клітину були неоднорідними як для різних видів клітин, так і для окремих пацієнтів і знаходилися у діапазоні від 5000 до 150 000 молекул НІ А І класу і від 4500 до 330 000 молекул НІ А-ОК. Кількість молекул НІ А-А, В і С була значуще вищою (р-0,0205) на лейкоцитах, виділених із пухлин, у порівнянні з доброякісною тканиною, що свідчить про запальну реакцію, яка продовжує відбуватися усередині пухлини. Сильна різниця в експресії молекул НГА І класу спостерігалася також при порівнянні пухлинних клітин із епітеліальними клітинами, отриманими із доброякісних тканин. Рівень експресії молекул НІ А | класу був значуще (р-0,0021) вищим на пухлинних клітинах (75 000 молекул/клітину), але залишався у діапазоні інших клітин строми, таких як ендотеліальні клітини (795 000 молекул/клітину).
Несподівано автори винаходу спостерігали високу (7105 000 молекул/клітину), до деякої міри надзвичайно високу експресію молекул НІГ А-ОК на клітинах ЕРЯ (7300 000 молекул/клітину), тоді як доброякісні епітеліальні клітини були практично негативними за експресією НІ А-ЮОВ
Зо (р-0,0108). Підсумовуючи, автори винаходу спостерігали підвищену експресію молекул МНС |І класу і ІІ класу у пухлинах.
Аналіз лігандому НГА і порівняння профілів виявили ЕРЯ-специфічну презентацію антигенів.
Щоб картувати весь спектр лігандів НГА у ЕРЯ, автори винаходу виділили молекули НГА із тканинної маси пухлини і провели мас-спектрометричний аналіз для визначення характеристик лігандому НГА загалом для 34 випадків ЕРЯ (характеристики пацієнтів і типування за НГ А див. у Таблиці 7).
Таблиця 7
Ід. номер Стадія за НІГ А-типування пацієнта з Вид ПИ НІГ А-типування молекул раком пухлини класифікацією молекул МН І МН І! класу
ТММ класу яєчника рОВ1703:01, ОЮОАТ1"03:01, серозна А"02:01, А"О3:01, род1т705:01, ОАВ1711:01,
ОмСа 9 65 |карцинома | ТЗсемхмМісегВ1 в'о7:02, 8В"40:02, ряив1704:01, О!НВЗ"02:02, яєчника Сб07:02, С712:01 ряваО1:01, ОРВТ 02:01,
ОРВІ1713:01 ров1702:02, 0О81705:01, серозна А"02:01, А"11:01, род1т701:01, ООАТ1703:01,
ОмСа 10 карцинома | ТЗЬМІМІСе В В'44:05, 8"51:01, ряв1701:01, ОА!АВ1709:01, яєчника Со02:02, 2715:02 ряиваО1:01, ОРВ1"04:01, рРВ1705:01 ровВ1703:01, 0О8В1705:04, серозна А"24:02, А"31:01, род1і701:02, ПОАТ1703:01,
ОмсСа 12 б2 |карцинома| ТЗеМосево В"35:03, В"49:01, ряв1701:01, ОА!АВ1704:01, яєчника Сб"07:01, С712:03 ряиваО1:01, ОРВІ1"02:01, рРВ1705:01
Таблиця 7
Ід. номер й пацієнта з Вид Стадія за НІ-А-типування НІГ А-типування молекул аком ПУХЛИНИ класифікацією молекул МН І МНС 1 клас явчника що ТММ класу у серозна и и ж х и
А"О2, В"35, В'40, ров1"04, 0ОВ1706,
ОуСа 13 тіемтозно Сто3, Ст04 оВВІ08, ОВ 13 яєчника серозна А-11:01, А24:02, | 0ОВ1703:01, ООА1705:01,
ОмСа15 | 75 |карцинома тТЗзсМосзВОо | В'07:02, 8"55:01, | ОВВ1711:01, ОВВ1703:17, яєчника с"03:03,0707:02 | ОВ8В3702:02, ОРВ1703:01
Оусатв | 45 карцинома тзрмісзно 02, 840, В'Я4, ровтов, ОНВтоВ,
Р С"03, С"05 рвв1713, ОВВ1714, ОВВЗ яєчника серозна и и ж х и
А"О1, А"О3, В"О8, рові"о2, бОВ1703,
ОуСа 23 тзам'єзно вВ'35,с704,с707 | ОВВІ1703, ОВВІ1712, ОВВЗ яєчника серозна А?01:01, А02:01, пен т пого
ОмСа 28 карцинома! тТ2грмоазно вВ'27:05, "52:01, рве 14 "свв В 2 яєчника се01:02, С02:02 01 03, 5:02, че, ' ОВВ5701:02, ОРВ1"04:01 серозна А"25:01, АХ31:01, ВАВ Б ооо
ОуСа 39 45 |карцинома| ТЗсМ1аЗзВв1 в'о7:02, В"18:01, овВ5" 1. 1 овВ5" 141. яєчника сС12:03, С707:02 90101, ТО, ' ОРВІ1"04:01, ОРВІ1"04:02 серозна і ендомет- « ж ж « « до А"О2, А"24, В'Я8, | 0ОВІ703, 007, ОВВ1711,
ОусСа 41 ріоїдна тЗзсМосЗА1 в'яї, Со2, Ст? ов карцинома яєчника серозна ж ж ж ж ж
А?Ог2, А"32, В'Я8, | рОВІ"03, 0ОВІ1705, 0О9,
ОуСа 43 тЗсемТоЗНг В'35,с704,с707 | ОВВІ01, ОВВ1707, ОВВА яєчника карцинома яєчника зі змішаною диферент- ж ж ж ж ж рер А"О1, А"23, В"О8, рові"о2, ОВВ1703,
ОубСа45 ) 63 / ціацією | Т1СМОБЗНО | веди сео4,ст07 | оВВІ07, ОВВЗ, ОВВА (головним чином ендомет- ріоїдна) серозна А?"02:01, А"25:01, оо зо ВАВ ву
ОмСа 48 71 |карцинома| ТЗ3сеМ1ОЗВо В"15:01, В'А1:02, оВВ1213:03. ово 01. яєчника С"03:04, С17:01 ДА А ' ОВВ4701:01, ОРВ1"02:01 серозна х и и х ж
А?Ог2, Аго3, В'27, | ровігог, рОВ1703, 0О7,
ОуСа 53 ТЗБМІ1О3ВО 1 вхав, сто, ст04 | овВВІг03, ОВВІ1, ОВВЗ яєчника серозна А?"02:01, АЧ11:01, оо зо ВАВ ото
ОмСа 54 карцинома | ТЗеМІіМмтісазНа2 В"35:01, В"35:03, оВВ1214:01. оВВ3202:02. яєчника С"04:01, 12:03 ВО щи ' ОРВІ"04:01, ОРВ17"02:01 ендометрі- оїдна А"25, А"32, В'15, ровіго5, ОВ17О6,
ОуСаз/ | 58 карцинома) СМОСТНО 3) вху8,с03,с12 | ОВО, ОВВ1715, ОВВ5 яєчника
Таблиця 7
Ід. номер й пацієнта з Вид Стадія за мслтипування НІГ А-типування молекул аком пухлини класифікацією молекул МНЄОе ІІ класу
Р ТММ класу яєчника серозна х и х
ОуСса58 | 74 карцинома! тТЗсмісзві | 7702, ОЗ, В'З5, ровіго5, ОВВ1701 с03, С04 яєчника серозна х и х
Оуса5е | 47 карцинома! тЗсміс3в2 | 798, се В78, | ровіхог, овв1"07, ОВВА яєчника
Й й рАВІ1708:01, ОВВ1713:01, серозна А"24:02, А"25:01, рові"04:02. БОВ1706:03
ОСуСабо | 50 |карцинома) ТЗсМ1ОЗВІ В'З302, ВВ І ДОдІ0401 ООАТ01 03 яєчника с12:03, С706:02 ОРВ1702:01 ОРВ1"03:01 серозна х и х
Оуса 64 тасмісзві | 1, Со В'О8, | рові»ог, овв1"0о3, ОВВЗ яєчника серозна и и х х и
А"О1, А"24, В'15, ровіо3, ОВ1705,
ОуСа 65 ТЗСМІМТОЗАТ ) дхяв, сто4,с14 | оВВІ10, ОВВІ11, ОАВЗ яєчника рАВІ1703, ОВВ"0701, серозна А"11:01, А"29:02, | ОВВ30202, ОВВА"О101,
ОмСабб | 73 |карцинома ТгЬМОСЗВО | В18:01,8744:03, | 0ОВ1702:01, ООВ1702:О2, яєчника С"05:01, 16:01 роА1702:01, ООА17"05:01,
ОРВІ1"02:02, ОРВ17"03:01 й й рввВІ1710:01, ОВВ1204:01, серозна А"02:01, А"О1:01, овВвАг04:01. РОВ1205:01
ОуСа 68 карцинома| ТЗсМ1сЗВ1 вВ'44:02, В"37:01, рОВІ1203:01. ОА 1 яєчника с"о6:02, С705:01 ОРВІ1"04:01 п серозна
ОмСа 69 карцинома! ТЗсеМОс1 1 п/Ла п/а яєчника серозна « « « ров1703, БОВ1705,
ОуСа70 | 48 карцинома | тземімістві | 797; с В'О7, | овві»09, ОВвВІ1-14, ОВВЗ, яєчника рі й й рАВІ701:01, ОВВ1703:01, серозна А"О03:01, А"О01:01, овВвВ3701:01, РОВ1705:01
ОмсСа 72 53 |карцинома| тТЗзЬМтаЗзВо вВ'О08:01, "07:02, рОВІ1202:01. род 01. яєчника с"07:02, С707:01 ОРВІ1"04:01 п серозна рАв1703:01, ОВВ1703:42,
А?"01:01, 808:01, | ОВВ3701:01, ОВВЗ3701 14,
ОуСа 73 карцинома) ТЗемТ'єЗВО с"07:01 рОВІ1702:01, ООА1705:01 яєчника ОРВІ1"04:01 ендомет- рвв1711:04, ОВВ1207:01, як й А?"02:01, В"18:01, | ОВВЗ3702:02, ОВВА"О1:01,
ОуСа74..79 ка ин Ома) ТЗОМХхСтВІ В'51:01,с707:02, | рОВІ1703:01, ФОВ17"02:02, зника СБ: РОАІ1702:01, ООА1705:01,
ОРВІ1"04:02, ОРВІ1"02:01 ендомет- и и рОВвВ1703:03, ООА1702:01, до А?01:01, А"31:01, й те
Оуса79 | 57 карцинома ТгьМос2Во | вВ'о8:01, В'51:01, опа ОВ яєчника сто7:01, Сл5ог ОРВ1"02:01 й й рвВ1701:01, ОВВ1712:01, серозна А"25:01, А"З2:01, овв3702:02. РОВ1703:01
ОСуСа80 | 93 |карцинома| ТЗсмхО3Н2 | В'"18:01, В"39:01, Под т, нка сті2:03 РОВІ1705:01, ООА1201:01, ' ПРОА1705:01, ОРВ1"04:01
Таблиця 7
Ід. номер й пацієнта з Вид Стадія за НІ-А-типування НІГ А-типування молекул раком пухлини класифікацією молекул МН І МН І! класу
ТММ класу яєчника серозна А"02:01, 8'45:01, | ОН!АВ1704:02, ОНВВ1711:01,
ОмсСа 81 78 |карцинома| ТЗсеМхаЗзН2 В'56:01, С707:02, ряивао1:01, ОА!ВЗ702:02, яєчника с"01:02 рОВвВ1703:01, 0ОВ1703:02 рянв1704:02, ОА!АВ1703:01, серозна А"01:01, А"О3:01, ряивао1:01, ОАВЗ701:01,
ОмСа 82 48 Ікарцинома| ТЗсеМ1азво В'08:01, "38:01, ров1702:01, 0ОВ1703:02, яєчника с"07:01, 12:03 рОА1703:01, ОЮОА1705:01,
ОРВІ1704:01, ОРВ17"13:01 серозна А02 Ач. ВІ ров1703, БОВ1705,
ОмСа 83 50 |карцинома| ТтІсМосеВо вВ'ББ со ся ряв1709, ОНВ1714, ОВАВЗ, яєчника ' ' рнва серозна А"02:01, В'07:02, ряв1715:01, О!АВ5О01:01,
ОмСа 84 70 |карцинома| ТЗеМтаЗзА1 вВ'44:02, 0707:02, ров1706:02, ООАТ1701:02, яєчника С"05:01 ОРВІ1704:01, ОРВ1"04:02
Для молекул МНС І класу автори винаходу ідентифікували 22 920 унікальних пептидів (у середньому 1263/зразок), які походять із 9136 різних вихідних білків (у середньому 1239/зразок), досягнувши значення 290 95 розрахункового максимально досяжного охоплення (див. Фігуру та).
Приклад 2, ідентифікація найкращих асоційованих з раком НІ А-лігандів
Маючи на меті виділити найбільш специфічні НІ А-ліганди для ЕРЯ із цього величезного каталогу даних, автори винаходу порівнювали вихідні білки лігандів НА з власною базою даних доброякісних джерел ("масив даних щодо доброякісних лігандомів НІ А"), що складається із зразків із МКПК (п-30), кісткового мозку (п-10), печінки (п-15), товстої кишки (п-12), яєчника (п-4) і нирки (п-16). Масив даних щодо доброякісних лігандомів НГ А містить 31 032 пептиди, які відповідають 10 012 вихідним білкам. Він був створений з використанням крові і кісткового мозку здорових донорів, а також із нормальних тканин, які пройшли гістопатологічний аналіз, усі вони були проаналізовані із точно таким самим каналом інформації, який використовувався у випадку ЕРЯ. Для порівняння профілів із обох баз даних були вилучені "сенсаційні компоненти" (тобто пептиди, присутні лише в одному джерелі, з низькою кількістю РЗМ) для урахування хибно-позитивних ідентифікацій. Порівняльний аналіз двох відповідних масивів даних (див.
Фігуру 2А) виявив 379 вихідних білків молекул МНС І класу, які презентуються виключно пухлинами ЕРЯ у щонайменше трьох досліджених пацієнтів, виділивши спектр ЕРЯ- специфічних пептидів НІГ А. Група ТОР100 ЕРЯ-специфічних вихідних білків, розміщених в ряд відповідно до частоти зустрічальності, візуалізована на Фігурі 28. Найбільш важливим із ЕРЯ- специфічних вихідних білків лігандів НІ А, відповідно до результатів цього аналізу, виявився муцин 16 (МОС16), також відомий як раковий антиген 125 (СА-125). Загалом більше ніж 80 різних НІ А-лігандів, отриманих із МОС16 (див. Таблицю 8), були присутніми у приблизно 80 95 пацієнтів (26 із 34).
Таблиця 8
АСТРІМТІЇ 77777771 Ї7171717171717176111111117111ОуСа74 | вбтї вимку 00000170 охала! ов рАЇ МІ КУ 7 ОусСа 79, ОуСа 83 В'51
ОмсСа 10, ОмСа 41,
ОмусСа 69 ОмуСа 74,
ОРУКАТЗАМ ОусСа 79, ОуСа 83 В'51
ЕРЕТТТЗНТМ 77777717 Ї771717171717179 11111111 ОуСабб// | -- вз5
Таблиця 8 вояж 0000101 вк
ЕТІСТЕНАЄР 11 ОмСа 80 Ат25 вію 31 т 19000 хх
ЕМІЗЗНОИТОМ 12 ОмсСа 64, ОмСа 80 Ат25 вет 221101
ЕМТЗБОаВТ5І 14 ОмСа 80 Ат25 шете 3231 2 1 вв
ЕРНЗЕЇІТТІ. 17 ОмСа 53 В'З5 засто 1010ю0 ЗЛЕ ве
ЗАРЕЗНЗТУ 40 ОмсСа 79, ОмСа 83 В'51 зе 231401 овви
ЗАТЕВ5ЗАБІ. А ОмсСа 70 С"о3/7?
РЕМ ПИШУЧИ Б ВІ НЕ
ЗРАСЕАН5БІ. 45 ОмСа 84 вВ'07/8756
РЕМ ПІЧНЕ сс ПИШНИЙ
ЗРНРУТАЇ. 48 ОмСа 84 в'о7:02 вати 231901 вовеорю -
ЗРОМІ ВМТ. 50 ОмСа 84 вВ'"3з5/8707:02
Таблиця 8 зажеа 01 ш 90000 вшвою
ОмсСа 39, ОуСа 69,
ЗРОКАРЕАБІ. 53 ОумусСа 72, ОмСа 84 в'з5/8'07:02
ЗТАБЗБІЗК 77777777 |77717171760771711 177 буСав3 | - АЛ
Ре РИН ПИ Кс ай НИМИ
ЗТЕТОЗТМІ У 2 ОмСа 68 А"О1
ТЕІБ5З5АТВІ 7777777 | 7777117166 7711 ОуУСат2 | ваз 9
ТЕТЕАІНУМЕ 77777777 |777171717168 | ОуСа41,ОуСаво | вав
ТЕУБАТЕМЇ 77777777 Ї771717171717169111111 17711 ОуУСаїт2 | ва меш 20202015 СО вжи
ТЕХМ ОСС. 70 ОмСа 70 В'40/844/7?
ОумусСа 9, ОмСа 23, ше 18 БО вшшен тТРОаСаТАОБІ. 71 ОмСа 84 В'07:02/8735 теж 23232312 1 ворюв
ТРОМВАЇБІ. 72 ОмСа 84 В'07:02/8735 пе 331.8 |З ще
ТУЗЕКТТІЕ 549 ОусСа 60, ОуСа 65 А"24 шви 333315 | ворювж
МРАЗААТТІ. 77 ОмСа 84 В'07:02/8735
ІМРОРЗКАБЗАМ 77/77/7807 | буСабб/// | в
Ці дані виділяють частий процесинг і презентацію МОС16 багатьма різними алотипами НГА, які не перевершує жодний інший ЕРЯ-специфічний антиген, і його відзеркаленням є лише часто (х95 95) презентовані службові білки, такі як бета-актин (було ідентифіковано загалом 149 різних пептидів). Серед білків групи ТОР100 ЕРЯ-специфічних вихідних білків були ідентифіковані інші добре відомі пухлино-асоційовані антигени, такі як МОСТІ або КІКІ10, а також антигени із документально підтвердженою здатністю уникати імунної відповіді, такі як індоламін-2,3- диоксигеназа (І0ОЇ1) або галектин 1 (І БАЇ 51).
Завдяки здатності СО4 Т-клітин підтримувати або викликати протипухлинну імунну відповідь автори винаходу використали такий самий підхід до подальшого аналізу пептидів, презентованих молекулами МНС І класу в ЕРЯ (п-22), який виявив 9162 пептиди (у середньому 598/зразок), які представляють 2330 вихідних білків (у середньому 319/зразок), досягнувши 280 95 від максимально досяжного охоплення (див. Фігуру 7В). Масив даних доброякісних лігандів НІ А для молекул МНС ІІ класу містив 7267 пептидів, які представляють 1719 вихідних білків, отриманих із кісткового мозку (п-5), МКПК (п-13), товстої кишки (п-2), печінки (п--7) ії нирки (п-17). Аналіз групи ТОР100 антигенів, презентованих молекулами МНЕ Ії бо класу, виявив більш неоднорідну і складну картину (Фігура 2С). Слід відзначити, що презентовані молекулами МНС пептиди мезотеліну (М5І М), добре відомого ліганду МОС16, вдалося виявити у приблизно 50 95 пацієнтів (10 із 22, Фігура 2030. Сам МОС16 не входив у групу
ТОРІ00 антигенів І класу, але відповідні ліганди були ти не менш виявлені у чотирьох пацієнтів.
Крім ТОР100 ЕРЯ-специфічних вихідних білків лігандів НІ А, автори винаходу також провели пошук добре відомих раково-тестикулярних і пухлино-асоційованих антигенів, які раніше застосовувалися у клінічній практиці для підтвердження високої частоти їх присутності (Негг2пеи,
МУТ1, ММ-ЕБЗО-1, пТеп і р53). Хоча автори винаходу змогли ідентифікувати НІ А-презентовані пептиди для усіх антигенів за виключенням МУ-Е5О-1, жоден із них не був виключно присутнім на пухлинах ЕРЯ (Таблиця 9). Єдиними лігандами, які продемонстрували ЕРЯ-специфічну зустрічальність, хоча й низьку її частоту (З із 34), були ліганди НГ А І класу (але не НГ А ІІ класу) із Нег2пеи.
Таблиця 9
Обмеження за ерела, в яких він я на ся з тирозинпротеїнкіназа егоВ-2 м 00000010 Ф|БілокпухлиниВільмса./////77/ 17111111 0 0мев11111111111111 11111111 |Теломераза-зворотнатранскриптаза|./-/://// | ' /г::/ пил ГУ: ОХ КОНЯ КО 00110101 |Клітиннийпухлиннийантиенро3.їд/ | 77777777 я 4 МКПК, 2 печінки, 2 я 1 МКПК, 1 печінка, 1
Приклад 3: Клітинне походження ЕРЯ-асоційованих НІ А-презентованих пептидів
Оскільки клітини ЕРЯ містять в собі не тільки ракові клітини, а скоріше являють собою гетерогенну суміш клітин різних видів, автори винаходу задалися питанням, чи дійсно антигени
МНС І класу групи ТОР100 первісно презентуються раковими клітинами. З метою вирішення цього питання автори винаходу здійснили травлення клітин ЕРЯ і виділили СО457 лейкоцити,
ЕрСат" пухлинні клітини, а також клітини строми, негативні за двома маркерами (інформацію про ефективність збагачення див. у Таблиці 10) і після цього автори винаходу провели лігандоміку НГ А окремо для кожної підгрупи.
Таблиця 10
Ефективність збагачення клітин:
Процентні долі наведені для кожної фракції до (Ргезогі) і після розділення клітин з магнітною сепарацією МАСзоОгпіпд
Ребої | СО45'фракця | ЕрСат"фракція | ЕрСат фракція:
Життє- Життє- Життє- Життє-
СО45чЧЕрСат:| здат- ІСО45ЧЕрСат:!| здат- ІСО45ЧЕрСат:| здат- ІСО45ЧЕрСат"| здат- ність ність ність ність 70|176,2| 883 | 789 | 96 | 13 827 | 34 | 94 | 664 |З | 45 | 654 60/77,4| 52 | 923 Щ|948| 1,7 | 902 52 | 797 | 88,7 | 3,8 | 10,7 | 895 57|31,9 | 505 | 941 Щ|936| 50 | 906 | 14 | 953 | 96,7 |08 | 72 | 953
Автори винаходу використовували кількісне визначення без застосування міток для визначення джерела кожного ідентифікованого ліганду НГА загалом у 5 зразках ЕРЯ (типовий приклад див. на Фігурі 3). Як очікувалося, отримані із МОС16 НІ А-ліганди, ідентифіковані на 4 із 5 зразків ЕРЯ, як виявилося, завжди надмірно презентовані на збагачених ракових клітинах із медіанною 5-кратною надмірною презентацією (у діапазоні 1,8-135 разів) залежно від ефективності збагачення. Це саме є дійсним для декількох інших часто презентованих антигенів групи ТОР100, таких як ООКІ, 5ОХ9, СКАВРІ1/2, ЕМА2, | АМС2, МИСІ або КІ К10. Однак що стосується ряду інших антигенів, особливо таких, про які відомо, що вони позитивно регулюються інтерфероном, як ТоїІ-подібні рецептори (ТІ КЗ, ТІ К7) або протеїнсинтетаза, подібна до 2'-5'-олігоаденілатсинтетази (ОАБІ), то неможливо однозначно показати, що вони презентуються пухлинними клітинами, але скоріше вони виявляють сильну надмірну презентацію на СО45- лейкоцитах і (або) клітинах строми. Окрім пухлино-асоційованих антигенів, автори винаходу також розпізнали ліганди із вихідних білків із клітинно-специфічною експресією. Наприклад, виявилося, що ліганди, отримані з СО8, СО132 або лімфоцит- специфічного білка 1 (І5Р'11), в значній мірі надмірно презентуються на СО45-- клітинах, і, як було визначено, фактор Віллебранда (М/Л/Б), який, дуже ймовірно, експресується ендотеліальними клітинами у стромі, у значній мірі надлишково презентується у підгрупі клітин строми, що підкреслює правомірність специфічного підходу до цього типу клітин.
Приклад 4: Аналіз імуногенності лігандів, отриманих із МОС16б
Для застосовності пептидних вакцин імуногенність є головною передумовою. З метою оцінки імуногенетичного потенціалу ідентифікованих лігандів НА автори винаходу використали протокол примування Т-клітин із задіянням штучних антиген-презентуючих клітин і Т-клітин, виділених із крові здорових донорів. Результати цього аналізу для МОС16, ЕРЯ-асоційованого антигену номер один, наведені у Таблиці 11. Було показано, що з 23 різних досліджених на цей час пептидів 18 є імуногенними у принаймні 1/3 донорів. Цей показник розпізнавання у близько 80 95 підтверджує присутність наївних Т-клітин, які розпізнають МОС16, у людській популяції.
Аналогічні результати були отримані для інших антигенів із групи ТОР100 (наприклад, ІБОЇ1,
ІСАЇ 51).
Коо)
Таблиця 11
Аналіз імуногенності презентованих ЕРЯ лігандів НГА, отриманих із МОС16/СА-125 донори
Таблиця 11
Аналіз імуногенності презентованих ЕРЯ лігандів НГА, отриманих із МОС16/СА-125 донори в'ЄЇ /////////// 0ОРУКАТТВАМЇГ// | 777/8771717Ї7717171717171717173/3С1С (8/ЛОалотипов |18/2ЗліандівНЕА | (| 7777777/с34/731
Приклад 5: Біомаркери презентації лігандів НГ А
Антиген-специфічна імунотерапія раку (наприклад, вакцинація пептидами і адоптивне перенесення Т-клітин) потребує прискіпливого вибору кандидатів у антигени у короткому проміжку часу. Однак аналіз лігандому НГА не завжди можливий внаслідок недостатньої кількості відповідного матеріалу. Можливою альтернативою може бути використання біомаркерів для передбачення присутності лігандів НГА на клітинах пухлини. З метою оцінити, чи може експресія білка, оцінена імуногістохімічними методами (показник імунореактивності
ІК5), служити сурогатним маркером для презентації лігандів НГА, автори винаходу проаналізували такі антигени із групи ТОР100 антигенів, презентованих молекулами МНС класу, як МОС16 і ІБО1, а також антиген М5І М із групи ТОР100 антигенів, презентованих молекулами МНС ІІ класу, за допомогою імуногістохімічних методів, і провели кореляцію інтенсивності забарвлення (Фігура 4А) з присутністю або відсутністю лігандів НА на однакових пухлинах. Як для МОСТІ16, так і для М5І М індекс забарвлення був значно вищим на пухлинах, які презентували ліганди НГА із відповідних вихідних білків (Фігура 4С). Це саме є дійсним для сироваткових рівнів СА-125, отриманих у день проведення хірургічної операції (Фігура 40), що свідчить про те, що ці показники можуть використовуватися для належного вибору кандидатів у антигени для вакцинації пептидами. У протилежність цьому, ІБОЇ1 не показав значущої асоціації з презентацією лігандів.
Приклад 6: Прогностична значущість осі МОС16/М5І- М
У зв'язку з їх важливістю як мішеней для імунотерапії автори винаходу планували оцінити, чи мають М5ІМ і МОС16 також прогностичну значущість для пацієнтів по аналогії до колективу, у якого вони отримали зразки для аналізу імунопептидому. З цією метою автори винаходу проаналізували рівні експресії обох антигенів, а також ступінь інфільтрації Т-клітин імуногістохімічними методами на матрицях тканин (ТМА) серозного раку яєчника високого ступеня злоякісності (стадій І-Ш за РІО). Для того, щоб запобігти прогностично значущим факторам, які спотворюють результати, автори винаходу обмежили свій аналіз 71 пацієнтом з оптимальним хірургічним видаленням максимально можливого об'єму ракової тканини (розмір залишкової пухлини «1 см).
Зо Хоча автори винаходу не спостерігали ніякого прогностичного ефекту для забарвлення
МИС16, інтенсивне забарвлення М5ЇМ асоціювалося з помітним, із граничною значущістю (р-0,0572), зменшенням медіани загальної виживаності з 50 до 28 місяців (Фігура 5А).
Незважаючи на їх різну прогностичну значущість, індекс забарвлення для МОС16 і М5І М показав пряму і високо значущу кореляцію (коефіцієнт кореляції за Спірменом г-0,5237; 95 Фо д.і. - 0,3159-0,6835, двобічна значущість р«е0,001).
Для оцінки інфільтрації Т-клітин автори винаходу оцінили кількість СОЗ Т-клітин. у внутрішньоепітеліальному компартменті пухлини (СОЗЕ) і у фіброваскулярній стромі СОЗ5)
окремо. Слід відзначити, що лише деяка кількість внутрішньоепітеліальних Т-клітин показала значущі (р«0,0063) прогностичні наслідки, у той час як сама лише інфільтрація оточуючої строми не мала прогностичної значущості (Фігура 58). Лише у аналізі у підгрупах комбінації забарвлення М5ІМ ії СОЗ спостерігалася значуща прогностична користь для пухлин із низьким рівнем М5І-М і високим рівнем інфільтрації Т-клітин (Фігура 5С) як для СОЗЕ (р«е0,001) ії СОЗ5 (р-0,0049). Що вражає найбільше, комбінація високої внутрішньопухлинної інфільтрації Т- клітинами (СОЗЕ) і низький рівень забарвлення М5ЇМ визначив підгрупу хворих на рак із тривалим виживанням (10 із 11 пацієнтів з підтвердженим виживанням більше 3 років).
Цитовані посилання
АЇІзоп, у). Р. егаі., Зсієпсе 270 (1995)
Апаегзеп, В. 5. еї а!., Маї. Ргоїос. 7 (2012)
Аррау, М. ега!і., ЄБик.у Іттипої!. 36 (2006)
ВапснНегеаи, -. єї аї., Сеї! 106 (2001)
Веацу, а. евї а!., У Іттипої! 166 (2001)
Ведазв, «4. 0., Майте 275 (1978)
Вепіатіпі, М. єї аї., Чоштаї! ої Ше Воуаї 5аїйвіїса! босівеїу.бегієз В (Меїподоіодіса!), Мої.57 (1995)
Вошнег, У. М. еї а!ї., Реоїєїп Епа 16 (2003)
Вгаштипет", Н. еї аї., Маїиге (2013)
Вгоззані, Р. еї аї., Віоса 90 (1997)
Впискаогтетг", Т. ег а. Сит.РНагт.Віоїеснпої. 5 (2004)
Сага, К. Р. єї а)., Сапсег Іттипої.ІттипоїНег. 53 (2004)
СНапоск, 5. У. еї а)І., Нит.Іттипої!. 65 (2004)
Сопеп, С. У. єї аї., У Мої.Весоопії. 16 (200За)
Сопеп, С. У. єї аї., У Іттипої. 170 (20035)
Сопеп, 5. М. еї а!., Ргос.Маї|.Асад.5сі.0.5.А 69 (1972)
Соїїдап ЧЕ еї аї., (1995)
Соіотренці, 5. єї аї., ) Іттипої. 176 (2006)
Оепаіеї, «у. еї аї., Сіїп Сапсег Нез 12 (2006)
Репкбего, а. єї аї., У Іттипої. 171 (2003) еакк, К. еїаї., Маїите 351 (1991)
Еопа, Ї. єї аї!., Ргос.Маїй.Асай.5сі.0.5.А 98 (2001)
Сабтомісн, 0. І. егаі., Маї.Меа 2 (1996)
Саціпопі, І. єї а)., Маї.Вем.Іттипої. 6 (2006)
Спайс, 5. єї а!., Ргос Маї.Асайд.5сі.0.5.А 100 (2003)
Соакіп, А. еї аї., Іл Іттипої 9 (1997)
Стееп МЕ евї аї., АН, (2012)
СтеепівЇа ЕА, 2па, (2014)
Нулапа, М. І. еї аї., у Іттипої. 179 (2007)
Уипо, С. єї аї., Ргос Маї! Асай 5сі 0 5 А 84 (1987)
Кірбе АН, га, (2000)
Кіїєд, А. М., Маї.Рем.Ога бівсом. 5 (2006)
Паау, М. еї а!., Маї.Меа. 18 (2012)
Ципоадгеп, Н. а. еї аї., У Ехр.Меа 162 (1985)
Ї опдепескег", В. М. єї аі!., Апп М.У.Асад.5сі. 690 (1993)
Ї иКав, Т. у. егаі., Ргос.Маїй.Асай.5сі.0.5.А 78 (1981)
Г ипабіая ВІ, Зга, (2004)
Меієге, С. єї а!., У Іттипої 159 (1997)
Могаап, В. А. вії а!., 5сіепсе 314 (2006)
Моті, М. еї а!., Тгап5ріапіайоп 64 (1997)
Мопага, І. єї аї., Сіїп Сапсег Вев. 12 (2006)
Миеї!ег, Г.. М. еї аї., У Ргоїєоте.Нез. 7 (2008)
Миеї!ег, Ї.. М. єї а!., Ргоїєотісв. 7 (2007)
Митрего, 0. єї аї., Ргос.Ма!ї.Асайд.5сі.0.5.А 96 (1999)
Ріпнеїго У еї аї., (2015)
Ріевбап:кі, М. еї аї., Єиг.) Іттипої 25 (1995)
Ропа, С. єї аї., Мігоїоду 202 (1994)
Ваттепзев, Н. а. єї аї!., Іттиподепеїїсв 50 (1999)
Віпі, В. І. егаіІ., Сапсег 107 (2006) 60 Воск, К. І. єї а)., 5сіепсе 249 (1990)
Водепко, В. еї аї., Маї. Реоїос. 1 (2006) заїкі, В. К. егаі., Зсієпсе 239 (1988) зЗеедетг, Е. Н. ві а!., Іттиподепеїйсз 49 (1999)
ЗПпептап Е єї а!., (1986) зЗіпдп-Уавзціа, Н. еї аї!., Сапсег Іттипої.ІттипоїНег. 53 (2004) зтаї), Е. 9. єї аї., / Сіїп Опсої!. 24 (2006)
ЗіШпт, М. еї а!., ВМСО.Віоіптоптаїсв. 9 (2008)
Тешеї, В. евї а!., Сеї! Мої. Те сі. 62 (2005)
Тгап, Е. єег аі., Зсієпсе 344 (2014)
Муацетг, 5. еї аї., У Іттипої. 171 (2003)
Муанег, 5. єї а!., Маї Меа. 18 (2012)
М сох, В. Е. єї а!., Ргоївіп 5сі. 8 (1999) 7агетрва, 5. ве аі., Сапсег Вев. 57 (1997) зієедеї, В., Ма, 4., 20и, 7. в детаї, СА Сапсег у. Сіїп. 64, 9-29 (2014).
СоІетап, В.Г.еї а! Маї. Веу. Сііп. Опсої. 10, 211-224 (2013).
Не!209, Т.9. б Роїпигі, В... Маї. Сіїп. Ргасі. Опсої. 3, 604-611 (2006).
Капааїай, І.Е., Ромеї!, О.9., уг., Зіпдн, М. в СоикКов, а. у. Сіїп. Опсої. 29, 925-933 (2011). «папа, Ї.., егаї. М. Епаї. У). Мед. 348, 203-213 (2003). зЗеПііїепдег, К., єї а). Сіїп. Сапсег Везв. 9, 1517-1527 (2003).
Маїзи?акі, «)., еї а. Ргос. Маї). Асад. бсі. 0. 5. А. 107, 7875-7880 (2010).
ЕївК, В., Вієміпв, Т.І, УУпапоп, .Т. 48, Ісаппіде5, С.С. ). Ехр. Мед. 181, 2109-2117 (1995).
Сигіє!, Т.у., еї а). Маї. Мед. 10, 942-949 (2004).
Міад, А.М., єї аІ. Сапсег Іттипої. ІттипоїНег. 59, 293-301 (2010).
Ноді, Р.5., еї а. Ргос. Маї!. Асад. сі. 0. 5. А. 105, 3005-3010 (2008).
Вобеті, С., ві а. І апсеї 384, 1109-1117 (2014).
Муо!споК, У.0., еї а. М. Епо)ї. У. Мед. 369, 122-133 (2013).
Козепрего, 5.А., еї а... Сіїп. Сапсег Нев. 17, 4550-4557 (2011).
Мапнег, 5., еї а). Маї. Меа. 18, 1254-1261 (2012).
Возепбега, 5.А. зсі. Тгапві. Меа. 4, 127ре128 (2012).
Тгап, Е., ес а... зсіепсе 344, 641-645 (2014).
Мапііа-зтаїІдопе, Са.М., Соїт, В. 5 Спи, 0.5. Нит. Массіп. ІттипоїНег. 8, 1179-1191 (2012).
Нагідав, О., еї а. ЕАБЕВ 3). 28, 4183-4199 (2014). репо, »-., єї аї. Сапсег Меїазіазів Неу. 32, 535-551 (2013).
Ї по, Г.М., еаІ. Сапсег Невз. 63, 807-811 (2003).
Оуйеппоме, С., єї а. Маї. Мед. 9, 1269-1274 (2003). зЗогепзеп, Е.В., еї аІ... РІ о5 Опе 4, е6910 (2009). мап деп Вгшіе, Р., еї а. І ар. Іпмеві. 83, 377-386 (2003).
Вибіпвівїіп, М., еї аІ. Сапсег Сеї! 5, 241-251 (2004).
Реге2-Оіе2, А., єї а. Віоса 109, 5346-5354 (2007).
Вгашйтипег", Н., еї а). Маїшиге 494, 361-365 (2013).
Наззанп, В. 8 Но, М. Бик. У. Сапсег 44, 46-53 (2008).
Зсподаїпв, УЛМУ., еї аІ. Маште 472, 481-485 (2011).
Ууапнетг, 5., еї а. у. Іттипої. 171, 4974-4978 (2003).
Соигіп-Егапкеї, У. Сапсег іттипоїНпегару. Зсієпсе 342, 1432-1433 (2013).
МеїІтап, І., СоиКов, Сх. 5 Огапой, сії. Майте 480, 480-489 (2011).
Реге, 5.А., ві аі. Сапсег 116, 2071-2080 (2010).
Маїзизна, Н., єеї а). Майте 482, 400-404 (2012).
Вобрбіпв, Р.Р., еї а). Маї. Мед. 19, 747-752 (2013).
Ссибіп, М.М., еї а. Майиге 515, 577-581 (2014).
Апаегзеп, В.5., вї а. Сапсег Вез. 72, 1642-1650 (2012). ги, М.б., еї а. Сііп. Сапсег Вев. 20, 3401-3410 (2014).
Воїапа, Р., Оєеп, 5., Зсой, І. ЮОитапі, ГО а Зрепаїоме, І. Сіп. Сапсег Вез. 13, 3591-3596 (2007).
Спепа, МУ. Р., єї а). Вг. У. Сапсег 100, 1144-1153 (2009).
Вепіп, С., еї а). еикетіа (2014).
Віайвівїп, А. 5 Киптап, В.У. Віаивівїп'є раїйоіоду ої Ше Тетаїе депіїа! гасі, (Зргіпдег, Мем
Уоїк, МУ, 2011).
Ріат, О.І.., еї а. Ійї. У. Супесої. Раїної. 32, 358-367 (2013).
ПЕРЕЛІК ПОСЛІДОВНОСТЕЙ
«110» тиштаєіс5 Бтіоїесппоїовдіев сеВН «120» Нові пептиди та комбінації пептидів для застосування для імунотералії епітеліального раку яєчника та інших видів раку «1305 т32745ЖО «1502 бвічі123859.5 «151» 2035-07-15 «150 пвбгизаг,виУй «і15зіх 8015-07-15 «1бО0» 558 «170» РатевтІів Уегятоп 3.5 «іх 1 «211» 9 «12 РЕТ «її» Ното зарієйь5 «Оп» 1 їзіп вйе т1Те ТВгощБеє ТК оАЗа тТВг вве 1 5 «21023 2 «1ї1х З «21йз ВЕ І «15юх Ново зарівпа «300х 7 заготВг біб тТвеоб5аєк ТВг Уві іван о Тук 1 2 «810» 5 «211 9 «вї12» РТ «215 Ново зарівпх «4002: 3
Аіа НіЗ Берг і у5 Ііе тТВг отр о Аія мет 1 ву «210 «21їз 11 «вій» РЕТ І «12» Ното зарієйпз5 «Ох а аіа хаїф іу5 Тк осів тТВго5Зек ТК обБег сів Арго 1 з 10 «210» 5 «Ккіїх З «вій» ВНТ «215» Новю 5арівипз «4000» 5 діа Уві Тег одяп о Уді Ага Тег бег тів ії З «іх 6 «гії» а «12» РЕТ І «212» Нота зарівйп5
«щЮз 5 дер АЇа ге тТВгоРБго ізо за! ТВг тів ії 5 «30 у «Д1іїх 8 «212з РТ «вії» Ношщео зарівйе «ху
АБр Аїд івц уді ген оіух ТНК о Уді 1 5 «21пз 8 «гіїх 8 «Дій» РЕ «213» Нове зарівпе «4300» В
Ачр о Рго Тук БУ Аїва Таб обег діа ді 1 з «гій» 95 «211» 11 «вір» РЕТ й «2152 Наша зарівнпу «Ада» 9 піц Бко бій тТвготвг тТВгб оЗек о РВе тів ТБЕК туг 1 З ій «30» Та «квії1» 95 «212з рН «13» Новю заріепа «400 10 січ ага бек обро Уді т1іе біп о ТвБр ог в 1 з «вій» 11 «11» З «в12з РЕТ й «215 Ноша 5зарівйх «00» 11 бій тТйгоЕтТе бецч таговБВе Ні дія ре ії 5 «30» 19 «ії» 10 «Р12» РТ «213» Ношто заріеай5 «А0бй» 17
Зіп Заї ті бек обеє Ага бі ТвВке обеє Мет 1 і 10 «21й» 13 «211» 10 «Рій» РЕ «215х Новою зарівпа «Ой» 13 бій Уві Тіе тб обек бек о Ака ТВ отак тів 1 5 15
«я10х І «?Р1їз 16 «йї2» РЕТ «213» Ното зарієпв «ох 14 зіц чаї тр обег о чеє сіу Ага тТвВгохеє тв 1 З 10 «Р10з 15 хКіїїх З «212» РЕТ І «15» Новою харівнпа «Зх 15
Ре Бго о біч гу5 ТВботТВгоНів 5егорНе ї а «їх 16 «Р1їз 10 х«йі2х РНТ -213з5 Нощто зарієпь «400: 15
Ва вго Ніз бегобБіц біц о тве ТВг о тБг Меї 1 З іп «210» 1 кйіїх З «вій» РЕТ І «гї1їх Ното зарієп»5 «вх 17
Рре Бго Ніз зек бів їіе тк о твгР ог ев 1 з «їх 15 хеіїх З «212» ВНТ «й1У» Ношйо зарівпа «400» 18 вва біп ака сій біу бів тег о діз г ец 1 З «їх 15 «2112 9 «йї2 РЕТ «2113» Ното зарієейь «400 19 бЗіу др оУуа! Рго Аго РБго Заг бег ген 1 5 «8103 29 «кіїх З «2122 РВТ І «йї35х Нопю варівнпа «Я» 20 сіу Ні Біб Заг Щі5 баг вго Аїд г ви ї з «Е10х 81 «Ріїз З «й12х РТ хЕї13х Новю зарієнпе5 «ЗНУ. 81 біу Ніз Тк тТВг о Уді бак ТЕ бег Мат ії з «ех й «Ії» квї12х РТ «2132 Ношо зарівих -40й5 22 5ІіУ тТвг Ні беговго Уді Те обівп Ага ії 5 й «В» 23 квіїх З хаї3х Ново заріепз «80» 23 біу так озЗег бі таговБго Ууді 5ег ої ув ії з «вій 24 «Ії кеї12 РЕТ «213 Ноно зарівих «дах 24
Ні вго АзроРго бій зако обкга сбіу гвец 1 я. «ВМ» 25 квгіїх З хаї3х Ново заріепз «З00х 25
Тіе Рга дго Уді Ре тТВг зак обак 1ів 1 з «гї1й0х 25 «ії» й каї2ж РЕТ «ВІ135» Ното зарівпхз «4003 96 ті зек А5зро сій Маї Уді ТВг Агд Б ец 1 я. «ВМЕх 27 «231 а «вїги РТ «Рі3х Ноше зарієпе5 «800 87 тіе бек ті біу ТВг оті вго Ага Іі 1 з «2105 25 «її З «125 РЕ «ВіЗ» Ношто зарівпх; «4005 78 їі баг оіУу5 ім Авроуві ТВг озек тів ї 5 «з 0025 «2115 З кіз ВБЕ «Ії3з5 Ното зврівепх «р» ОО
Ті тав бів твК обег Ата ді ви отУг ії 5 «ВІ» зо «231х З «2122 ВАТ «2133 Ново заріепе «чне 35 їїе твг Ага рей Бго ТВго5егс 5ег о ї1е ї 5 «2313: 31 «Ії» З «йїй» РЕТ хРіз» Номо зарієпь «Ве 31
У А«р оте дія Ні тк обів дія Меї ії 5 «ве 32 «21ї1» З кто» Вт «21і13» Ношо зарівгпя «400: 32 їу5 ін АЗр обЗег ТВг о АТа іву За! Ме 1 5 «І» 533 «231 16 «2122 РТ «гії» Ноте 5зартепь хат 33 їв бір Уа)! таб озЗак бек баг озев УзДь ів 1 5 10 «2їаз 34 «211» З «2125 ВЕК «Ті3» Ноешщо зарігпх «НН 38
Кей Рго Ні зегобіц тіе Ве отвгоїец 1 5 «Вт 35 «231з З «2129 РВК «2135 Ноте зартепь «ен 35 їево о твг оті бек так оНів Гух тпг тів 1 5 «2105 35
«2115 В «12» РТ «21ї13з Нопе зайпівзпе5 «адОх 35 іеп о твгеоїух зек бів сів аг тве 1ів 1 5 «2105 39 «11 З «2125 БВ «В13» Нопю 5арієнз «00» 37
Ага Азрозег оівц о Тук Уді деп обзіу РНе 1 В каз 38 «2115 хто» РТ «2335 Нащо 5арігпе «4а00з 38 ага бій тТвВгобег о тБгозек бів і у тів 1 5 «230» 39 кг1ї1х 5 «212аз БТ хві3» Ною зарієп5 «ай» 39
Ака Бек бЗек біу Узі ТВг РБе дев Ага 1 5 «2305 40 «ВІР» ко» ВВЕ «813» Нео зарівих «00» 40
Зег дів Ре зіч Зег Ні бек ТВг хді 1 5 «10» А «2115 я «12» РЕТ «213: Нощо 5арізп5 «400» 41 пек о Аїа Тк обій Ага бег Аїда Зек ген 1 5 «2105 45 «21ї1х 9 «еї8аз РТ хРіЗ3» Нощюо б5арівпе «ПО» А? 5ег бій Аза зевбобіц Тк отВг дія їец 1 в «230» 453 «2115 «12 РТ «2135 Ношо 5арізепх
«вОбх 43 зар бів іп АКо Таг обак о Бка бег ор ец і 5 «2310» 834 «Ріїх 9 «21Х» РАТ «Дії» Ношао зарієпу «0» 48 звгобіцч ЗекоРБго Яебе тТБг хів уз і ве 1 5 «210» 45 «ії» 9 «Рій РЕ «К134х Ново заріапе «ах 8 зер овБго АтТа бі бій Аів Ні 5ег ог гц ії З «гій» 46 «2113 11 «812» РН «Різ Ношо 5зарівп5 «(» 46 зег о вго Аїазв сіу вів Аїд Ні Зег іен івци АВ і З 10 «ВЗ» Ву «211» 9 «217з РТ «К1йх Нови зарівпе5 «800 87 егорго Ні» Бго Уві 5ег Тк отак вве 1 5 «гі» АВ кеїї1» З «війх РТ «215» Ношо зарівпх «а00х 38
Зек о Бго Ні Рго ді тВг о Аїа івц з ец і З «кійх 89 «211» 9 «від» РТ «Різ Нота зарівгп5 «Ол» 43 зегорго ем вве сів Аго ЗекобЗег ев 1 5 «2107: 50 «іїх З «217з ВНТ «К13х Нове зарзіепа «ах 5
Зек РБго біп А5поіви Ага АБа тТВг ог ги 1 З
«10» 51 «213ї1х 12 «2185 РТ «213 Ното 5арієпь «я 5 зегоРгОо Аг гей А5о тб осів біу А5б тТбг Аїд рен 1 5 1 «10 32 «211» 8 «812 РЕ «13» що зарівепух «АН» 5? его рго бек бій Аіа ті Тк дак ін 1 5 «Ві» 53 «211з 8 «215» ВНТ «к;і3х Ноте зарієп5 «адОоз 35 зек Бга 5ег їу5 Аіва РБе Аа бЗегоі ен 1 5 «2305 з4 «11» З «їз РЕТ «аі13У бопо зарієпь «Зп» 054 аг Рго бЗагобає Рко ТНК ово уч Уді і 5 кві» 55 «21» 5 «212 РТ «213» НсКещо зарівпя «4005 55 зег Бго Зак обег Сіп АІа Рго чаї і ев 1 5 «Рі» 56 «2115 9 «2195» ВТ «213» Нопо зартепь «ЗУ» 56 зак обіп біу Ва зако Ні 5ег о біп Маї 1 5 -234а5 57 «211» З «212 РЕ «13» ікно зарігпх «005
Зег Ага тВгозічз Уаї ї1іе бер о звг Ага 1 5 «Ві» 58 -2315 8 «212» РТ
«813» Новю заріепа «Ой БВ бек Чек Аїа ді бак Так оте тТВг тів х Кк а щі «іх 5 «віт» а «12» ЕТ «2153 Ніндо здрівп5 «АС» 53 заг оБек Рго іец Ага Уді тр обег і ер 1 З «30» бо «21ї» 9 «Різ» РЕТ «2135 Ношщо зарієепье5 «об» ва 5ег тВйг Аді Заг бак бег огвцу баг | ув 1 х «2іП» БІ «11» З «212» ЕТ «213» Ноаю зартеп» «ан: 1
Зек Тйг обзіп Ага Ууаі тТВг о тТБг 5ег Меє 1 в. «210 52 «21їз 11 533 кеійв РЕ «213» Нанцю заврієпе5 «Ой» 852 звготьг зак обів зін тів Ні бЗег АТа ТОг і у 1 5 10 «2 ВЗ «11 Ій «212з вт «132» Ново зарівпе «00» 653 бег Уві Ген Аїд Ахроіен уа! ТНг отак ої ув 1 з 15 «віх 4 «211» 10 «12» РЕТ «2152 Ніндо зарівп» «А» Ба заг охаї Рго Азр тів гц бек ТВг озек тер 1 З 10 «3» 65 «211» 9 «217» РТ «13 Ноню заврієпье5 «Ой» 65
ТВгоАтя еіу рко тйготБе ніх біп вве 3 5 «2105 88 кйіїх 3 «212з БЕ «В13» Но зарівих5 кан» Бо
ТВг осів тів баг озаг обЗек Ага тВг о Зег тів і в 10 ке 57 «сії» З «і» РНК «т132 Нсето зарігпх «005 б
ТВг обі А5а те о сіу іх біц іув іец 3 5 «Кі» 68 к211»х З «217» РТ «8135 Ноте зартелпь «Ки: ОБ
ТНг бів тВгбобін Аа ї1Те Ні Уяаі Рпе ії 5 «10» 9 «її» З «2ї13з ВЕ «2132 БНощто зарігпх «НюЮ па
ТВгобій Узі бек Ага тТБКкобів Уві тів ї З хаі о «2315 З х2127 РВТ Й «2ї3з Нощше зарівпе «Кс» «Рі» мізс о Теаїцкае «Ей 3.33 «223» Хаа сап Ве зег, Ага сг обі «Кі» Уа
ТВг бін хХад був івец бій о1у зіец і ец ї 5 квійзм 51 «211 8 «212» РВТ «2ї3х Ноще зарйієпь кчи- і
ТВг вра бі біу ТК оАго біп 5ег ів 1 5 «10» 72 квії»х З «2ї12з БЕ «Р13» Но зазрівенп: «МО» 72
Тег о Рго б0іу деп Ага Аза тіе бег зе 1 5 «230» УЗ «вії 10 «212з РЕ «кі3» Новю чарівна: «АЛОх 73
ТВг РКО Ахп бак оаАвра біу бім ТвВгобег і ец 1 5 10 «23 78 «вії» а «212» РЕ «213» Ново зарівп5 «а» 74
ТВгобагосбіу Ркоа оМаї Твгеобіч Буя Тук 1 5 «К3Зйх У «-211з3 10 «212» РАТ «213» Но зартівп5 «Ай» 75 тТвго5ег о Бго діа зіу біц Аів Ні зег і вц 1 5 10 «230» ув «гії» З «217з РТ «212» Новою звріенпе «ай» уУй чаї Ніз біз бег Ніз бек бек Уді і ги «17 «211» За «2125 РЕТ «2155 Ніно 5арівп» «АС у чаї вБго дяка Бег АТа Аїя тТпг о тпгої ев 1 5 «230» УК «21ї» 9 «2172» РЕ «2135 Ноню зарієепье «Ай Кк тд Вг о зак А ка пі я Зав тів
Уа! тТйпгозак Аіва Рга біУу Аг бак тів 1 5 «Дій» а «11» а «вій» РТ «213» Ново зарівпе «ах 9 чаї Тагозеб 5ег баг Ага ТНб о 5ег тів 1 5 хаіх 850 «2315 11 «Ти» РТ «213 Ноще зайівпз5 «асо во
Туг Рго А5ровгоОо закобу5 АТа 5Зег зак Аа Мет 1 5 12 «2105 Ві «квіїх З «212з БЕ «13» Ното зарієнз «НН» 51
Аїа Аіа тгрівц Ага баг Аїд Аїд Аа і В «ЗВ» 8 «21ї» 10 хаіоз РН «23135 Нащо зарігп5 «4005 82
Аїа вго Аза Афіа тгроівгц Ага бег Аїя Аїа 1 5 12 «2105 53 «211» 11 «21аз РЕТ «2335 Ноше зарівлез «по» 83
Аїа Рга Аїд АЇа тгрів; Агоу баг Аїда АЇїЇв дід і 5 їо «230 84 «21» «232з ВВ «213» НоБю заріви5 «005 54 іеш о Бго зак оБко заї АяроАїва Аа Ре 1 5 «Ву 5 «2115 11 «12» РТ «2133 Ното зарізпз «адОх 5
Ака сі ха) Вго зак осів 118 Ах» АЇва Аїа РБа 1 5 12 «2105 8565 «21ї1х З «21їйз ВЕТ «В13» Нощпю 5арієнз «00» 86 сін Аіа сіу вго Рго АЇв РБбе ту АгОЯ 1 В каїй0х 87 «2115 хто» РТ «23135 Немо 5арігпе
«МЩЮх 8;
Зак ТВг о бег ек Ні бег бач біп і ув 1 а кі» 5 «ії» 8 «212х вВт «2152 Ново зарівнпх «400» 8
За вго Ніз іец Ні івц бег Аїа 1 З «вій» 5 «21ї1х: З «Вій» РТ «2ї3х Ново зарієпь5 «8(НУух В
Аїа Рго Ні івец Ні Ген баг Аїа Аа 1 2 «21йз о «11» З «віїйх РТ «РІі15» Ново зарівпх «4003 0
АЖ АЇвВ іен Аїда уз іп ви рго га; 1 з «Ек 1 «ї1ї1х З «Віл» РТ «гїї2х Ново зарзтепь «8(НУух ЗІ чек Аїд Аа Зек о біу АЇд Ага АЇв ген 1 5 «2305 а; «11» З «8125 РЕ «Різ» Ношто заріви5 «ЗО» 02 чаї ів сві дБробівп бав твор оУаі ів ії 5 «ВУ 93 «21ї1х 8 «аІї2х РЕТ -233з Нота здріепе «або» 93
Авр отук івц о іуБ Акад РБае Тук івп отуг 1 5 «23аз 94 хеіїїх З «2 12 з ВНТ й «Ії15» Ново зхарівна «ЗО» ек бі твг ог Ачп АЇва Азпозег їі ву
1 5 «10з: 5 «11» З «2ї2х ВЕК «213» іо зарівпуе «Оз 5зег зак Аз ого Ап о АЇВв Уві Мет туг 1 5 «ух Зо «2315 16 «В1йи» РТ «2135 Нощо зарівпе «а00з ча
Тук Вга ВБе Ар обіу Бра біу Аза ТВр овен 1 5 10 «103 Я «ії» 12 «212з БЕ «213їх Нотео зарієп5 «З» 97
Туг Вго Ре А5о обі Рга о сзіу АБпП отТНпг іен Аа Ні 1 в 10 «з 8 «2115 З «812 РЕ «13» БНсото заріепх «В0Оз ВА
Ап оБіц тів бін дга Уві Ве ді Тгр 1 5 кві» ве «21ї1з 16 «217» вит «713» Ноте зарієпь5 хо» 95
Азпозаї сіу 5іМ іву ІїТе сіу ТР орго г у 1 5 то «230: 100 «11» З «2ї2з ВБЕТ «213» Ното зарігпх «з 10
Ага Уаф іубв Бій Меї тук Аа тТВгоОтуг 1 5 «ій 1 «211 8 «12» РТ «2135 Нопюо зарієпь «00» 101 зекг АЇа Рго іви Аго Уа! бек сбіп і вн 1 5 «2105 102 кві1їх З
«212» РТ І к2ї3У Ново зарієепь кОм 102
Ар отВгоАБробін Туб уаї гівно фуз Тук 1 а «2305 103 «811» 8 «212х Вт «213» Цю зарівпх5 «002 103 уз Ар обак ТВг ог ув Те о АЇвя Ре 1 з «вій» 104 «231 В «Вт2» РЕТ к7і3х Ново зарієепь5 хЗпОх ї1п4 пекоїіуч Аа Бго Уві Бем так оТуг 1 5 «2305 105 «2115 10 «212х РЕ «13» їсню зарівп5 «0» 105
Ата бій Туг Те Аяр о Ууді івц о біп і уз Іїе 1 з їй «ВО» 106 «21ї1х З «12» РВТ к213юх Новю зарієепь «400 105 сів тує тТВг о Ач» Уві їви о біп іу5 112 і 5 «2305 107 «211» 8 «212з ВЕ І «2183» Ното зарівпа «НН» 307
Ага о вБго Ні Беч ТПг обав Або Аїд 1 2 «вх 18 «21їз З хаї2х РЕТ «2335 Ното зарієп»5 «400 108
Ака вка Ні ге) ТВе 5ег Ахр Аа Уві 1 5 «2105 зда хаїїх 1 «2125 ВвВТ І «15» Ното зарівпа «НН» 009 ака вго Ніз і2ецу ТБг обек а5р аз а|ї АЇв 1 5 10 «210» 310 кгіїх З «12 РВЕ «213» Нопо зартієле «а» 110 зав АїЇа іу5 чек тів тук біц бів Ага 1 и: «232ах 111 «К1ї» 8 «232 РЕ «ВІЗ» Нео зврієпх «вх 111 ес вго бів біб біу АтТа Агя Уді Туг 1 5 «ій» 1317 «231 З «212» ват «233 Ното зарієвпа: «ами 115 зав пів ТУг Бго Уді Аза ні іа ді 1 и: «2105 113 каії» З «Р12х ВТ й «213» ЗкКнюо харівпх «Ой» 113
Туг о Бго Уді Ап о Нія ієц о Ууді ТВг о вва 1 5 «Р 114 «231 З «212» ват «233 Ното зартепа «ав 114
Аів вів Аїд Зег дів 1тїе і ух чаї її 1 5 «2105 115 «Вії» 11 «Рій» Вт й «213» КН хвоіепх «А» 315 ті Ні А5роНіз Уаї Ачп Бго іуз йіа ББе вве 1 5 15 «30» 316 «231 З «212» ват «й13з Ното харіеве «бах 116
Ап овго уз АіЗз Рве РБе Заг оеді ген і 5
«г» 317 «2115 8 «12» РАТ «213з Ноще зарієпье «оз 317
Ап овго 5ег о Уді Ако біб Рбе ді ів 1 5 «2105 118 хг1іїх 10 «2125 ВВ «213» Ношюо харієйз «в ЗІ
Ага бек отуб Ні івц бів Тіа ові ТБг і уз 1 в їй каз 115 «21ї» за хі» вит «2133 Нощо зарігпх сеню» 119 ага о тук Меї Рко Рго АтТа Ні Ако ази вБе 1 5 10 «2105 1270 «211» З «вїйи» РЕТ «2335 Ното зартепь «ацдох 150
Твг обі РБе бін о біп тук о ївц Ні РНпе і 5 «230 1231 «?1ї5 Зо -232з ВЕТ «213» Нощо зарігпу5 «ню» 191 чаї 5зег Ар діа жхег Зак Аа та! Туг тук ї 5 10 «кій» 159 «21ї»5 8 «аї2» РТ «2і35 Ното 5артапе «4а0д0х 1272 діа зії тТ1іе бій дів Азродго ек Тук 1 5 «105 193 «11» З «2125 ВТ «13» Но зарієйз5 «Не» 123
Аіа біп іж5 мя)! Ар о твгК о Аго Аїа ух 1 в кох 24 «Ії» 9 хто» РТ «23135 Ното 5аріапе
«005 124
НІі5 вго Бак Аїд Ні Азроуді тів і во 1 5 «2105 125 ккії» З «18» ВТ «813 Ноще зартепь «0» 125
Ага Ії1іге іу5 біп о їух Аїд Ар обег і ву і 5 «2310з 125 «211» 30 кві?» РЕК «2135 Нащо зарівпх «-4005 125 зек о біц біу Аїд бег Ага бег їіви сбіу ген 1 5 12 «810» 197 «1ї1ї1х 16 «215» ВвВТ «кйі3»х Ноще зартієп5 ха» 127 пегома! двробій бів сту геч за! ге ен 1 5 19 «230: 128 «11» З «2125 Вт «213» ікщо зарієепу5 «000» 198 5зег Уді Нів уз тів тк оЗек твг Ра 1 5 «їй» ї2й «-2115 З «12» РАТ «2335 Нощюо зарієпь «да 129
Твгоага біз Аіїв твгобів Аїда бій тів 1 5 «2105 139 хЕії» З «2185 РТ «13 Ноще зартепь «ант» 130 чаі Тк вве Ууді Аіа Ргоа дід туз РНе і в «10 3151 «211» З «212з РЕК «213» Нощо зарівпх «-4005 131
Аїа Вгао бів бак Аз НІ Аїд Аїд рве ії З кеїйх 139 сеїї» З хата» РЕК «2135 Нощо 5арівпа «чне 152 біч таб отТіе ч1іе ті РБе Ні5 5ег гец 3 5 «Рій» 133 кеїїх 8 «і» БТ «Рї3» Ношо зарієйп5 «153
ТНг бів ївц бен Узі і уз Аїд тує 1 5 «аа» 134 «ії» ії кеїг» РЕ «ВІ13» Нео харівих «цк 134
Теробів бів бі дга Аїа Зек обі ТВгоМаії Тук ї 5 15 «їй» 335 «її» З «812 РВК «2335 Нощо 5аріепе «чни- 155 їіе Ага 5вгбобін Ап Ре біз бій і ев ї 5 «ій» 313 к811х З «їз РЕ «йїі3» Ношо зарієйь5 «а» 138 іуз« тів АіЇа уві Аїд Аа АЇз зегогух ії 5 «зве 15У «2і1ї15 З «12» вт «2ї13»5 Нощо заріепа «00 1359 дп Уаії Меї ів Аго 1у5 тів Аа ді ї 5 «ТІ» ЗК «3 її «2125 РТ к?13ю Ношо зартепь «нне- 135
Ака аіц їеч тб Ап А5робіу бій їеб їте гец 1 5 ій «їз 139 «Ії» З
«їз РЕ «213» Нео зарівпх «4005 139 заї Аїа дід дід бег їу5 Рго діа хді 1 5 «10 140 «2315 8 «812» рт «2135 Ноте зарієп5 «Зо» 140 зак Бра Ап Аіза тів Ре і у5 АЇВ іван 1 5 «2105 141 хіх 10 «2ї1йиз ВВ й «13» Но зарівпх «ННІ» 141 заг баг оіу5 АБ5поіу5 Рго Ні Уді ух Ага 1 Б їй «21» 149 «21їз я хаї2х РЕТ «2313: Нощо харівгпх «-а00з 142
ТНговВго Аїд бек дія бБіу Ніз Уді Тгр 1 5 «210» 143 «211ї1х 10 «2їаз РТ хй13» Нощо бзарівне «8пОох 143
Тут ТВг одер НІ біп АхпоЗег о зев о Зако Тур 1 в її «530 144 «2115 5 «232з ВВ й «213» Но зарівп5 «0» 0144
Ата бід Ууді Ге ієц Рго Агд г ве 1 5 хх 145 «2115 12 «212» РТ «2135 Ното 5арізп5 «4і00з 145
Аа Уві івеч Бго ів о твг Ма) АїЇв бів Уві сіп і у5 1 5 10 «2105 146 хг11х 8 «2125 ВВ «ВіЗ» Нощшо зарієйне «НН» 146 іви Рго ТВгоАіз Ага Рко іец гай і В «2130» 147 «2115 З хвіо» ВНТ «23135 Нашою 5арігп: «4005 147 ага Уаї Ага сій ієц АтТа Уві Аїда і ец 1 5 «210» 1458 «211» З «212» РТ «2135 Номео зартівп5 «ЗВдох 145
Азпоіец Рго 11 Ре іви Рго Агро оуді 1 в «230 148 «211» З «2312з ВВ «213» Нощо зарівгпу5 «ем» 149 ага Маї Ні Бко біц біц бів пі Тгр 1 5 «ках 150 «2115 В «212» РТ «2ї13з Нопео зарівпе «доз 150
ТВгохаї ія вго зЗагосіу ГУ ВгО Ага 1 5 «2105 151 хг1ї1х З «2125 ВВ «Ві13» Номо зарієйпз «В» 151
Тук Туг сів Ні Уаї Гуз Аїд Ако РНе 1 В кій 159 «21ї1з5 ха1і2» РТ «23335 Нащо 5арігпе «005 152 аа АЇа Агя Рко дія Бім Аїа тВгоїец 1 5 «2105 153 кг1і1їх 10 «213аз РВТ «2135 Ноше зарівль «ЗдОх 153
Меї вва дя о вго біц пі Ага тує Так о РНе 1 5 10
«2105 154 «РІ1їх й «212х РЕ «-213з3 Ношо зарігп5 -йа0й» 154
Ре тТуг тів губ ТВг Баг тйгК о тТВкК УВІ 1 З «вій» 155 «віїх З «213 РТ «йі3х Новю заріене «800» 155 ака тТВге отпк бін т1іе Аби Вйпе і уз ді 1 з «В10х 155 «?і11» 8 «12х РЕ «2132 Ноно зарівєйх5 «40050155
ТуУук зів гу ТВг бек Тк отТВе Уві 1 5 «Вій» 157 кг1іїх 5 «123 РВТ «813» Ношао зарієне «ЗО00х 157 сіу сіп АтТа Аїа сів зі Вро Тк оОтіє 1 з «810х 158 «8211» В «212» РЕ й «21У» Ноя зарівнп; «400: 155
НІ Аго Ре ігец АЇЗ Бі АЗродія і вц 1 З «й1йх 15 «211» а «812» РТ І «13 Нота зарієпе «ах 159 сін сії хаї Аіїа Ага РБе тТуг Аїа діа 1 5 «-210з 1650 «11 З «12» РЕ й «215» Ношо зарівп»5 «4005 160
Ап о Вго А5зповіз бій Уві Аїд Ага вве 1 5 «10» 1651 «211з 10 «212» РЕ І «13 Ново зарієпя
«вних 181
Ахп о вго Ап обій бі ді Аа дгЯ о рРае туг 1 5 15 «830» 1652 «2112 8 «12 РЕТ «215 Ніно 5зарівп5 «Ал» 162
Буях Заг о біп ТВг оіеніівц бі Був 1 З «230» 183 «В1їх 8 «212з РЕ «13» Новю зарівпе «400» 183
Ахробіц бен тів баг оі ув заб ЕНе й є «23» 165 «11» а «вір» РдТ «-215з Ното зартви5 «ЩЕ: 165
Ні Ар обін ей тіе Зев огуз 5ег Рів 1 5 «23пм 185 «211 9 «212» РЕТ «213» Ноню зарієейя «Ой» 165 пі ага Аів Тукоівен Ре Ахп Заг оуді 1 5 «2 165 -2її» З «212» РВТ «213» Ново зарівпе5 «а0йм 185
Туг ген Ре А5п бак осді ді АБ Уді 1 5 «213» 1657 «211: 8 «212 РЕТ «2155 Ніно 5арівп» «АЛ» 167 діа Бго А5р о Азп Ага го АЇв і гц 1 5 «210з 165 «21їх 8 «2172» РЕ «2135 Ноню зарієепье «400» 168
Ніз Ні заг Ар о тТаг о рго тег о тТНг і г
1 5 «Т10» 359 «211» З «їй» РЕТ кхвїі3З» Ношо здарієнь «по» 169
Ніз Рго Мек бек Бій тук Рго тс Тук 1 я: «230 178 «7115 8 «212» РТ «2135 Ношо зарізепх; «ню» ії70 іечз бів Ага Азротів бек обі Меї 1 5 «2102 371 «213155 8 «1355 РТ «2135 Ношю 5артапь «оз 171 іен осів аго Азр Вів бег біц мМеї вБе 1 5 «2305 1772 «хг11х З «2125 ВЕ «13» Ношо харієй: «НК» 177
Аа тів Аїд бій тів бі А5в зіп іец 1 5 ком 173 «21ї» За кві» вит «2133 Ноюо зарігпх «4005 173
Азв Уві! аа біп Узі ТБг сі Аїв ід Ага 1 5 10 «2105 174 «211» З «вїйи» РЕТ х»і3У Номо зарієлй»5 «п» 3174 завгобіц дер іен Рго Ага діа Уді тів 1 5 «230 175 «?1ї» З «212» вит «213» Ношо зарігпя «ню» 195
Зіа Рго А5родіа іуУух бек БВе осві ге 1 5 «210» 378 «231» 8 ха1і2» РТ «2335 Нащо 5арігпе «4005 176 зів Ууаї АТа Бго АЗо Ага їух бек Рвае 1 5 «2107» 177 к21їх 11 «212з БТ хаі3» Ново зарієп5 «пс» 179
Бе Рго вве біп Рго біу чек уві Аїда бій ді 1 5 10 «23105 178 «Вії» 17 кі2» ВВЕ «2133 Нею зарівпх «4005 178 біу бій хаві діа Рго Аяр о Аїа уч Бег РНа Уві ге 1 5 10 «810» 170 «2115 З «217» вт «213 Нопо взартепь «4005 179 іецп Бга А5робіу Тук сів РБе г у5 РвВе 1 5 «2305: 180 «211» 13 «212 вв «213» Зно хзарівгпх «по» 180
А5роіуз Аіа Ре тТБг о АЇВ Аа тВг тб обіц уаї звг дго 1 5 10 «Вій» 81 «2115 15 «212» вит «2135 Ношо зарізепх «4005 181 бів гвец о біу Бко тук ТК о ї8ц Ах» Ага АБпобеб о рац о Тук уві АБА 1 5 10 15 «10» 182 «2131»: 16 «2125 РЕТ «213 Нощмо зарієп5 «По» 182 сій їеб біу Рго Туг тк оїен Ар оАга А5побег о Бен о Тук Уді А5повіу і Бі 10 15 «230 183 «2115 14 «212з РЕ «213» ото зарівпх -400: 183
Рне Азроіуз Аіа пе тк одіяа діа ті отвКк осі Уді зекоако 1 в 10 «210» 384 «23ї» 13 кій» РТ -233з: Нощо заріепе «400з 154 сіу ВгОо Тук пк оівгц АЗр о АгяЯ Ахп обег оігн о Тук ді дав 1 5 30 «7105 185 «211» 34 «12» рт «713» Нотео зарієль5 «ку 3185 іви сіу Рго ту Тк оіец дер Аг АВроБер оіец Тук Уді Аза і 5 10 к«3аз 155 гії» 14 «2ї9з ВЕ «213» БНощо зарігпх «ВО» іа іец біу Бго тук ТБг оівгц А5роаАко дяп бак оіви о Тує маї Ап 1 5 13 «Вій» 1857 «2115: 15 «12» Ра «2ї3х Ноще зарівепь «ОО» 1857 івгн сіу Рго тТуг тТйгоіев дер о Агш Аа Бег обеч Туг Узі Аза сіу 1 5 30 15 «710» 185 кВі1їх 156 «2123 БЕ «В13» Нею зарівнх «щу» 18Е вт о тТвг о Бічц тВг оті тк оАго ву ойвк тк о РвВе вго вВБе Уді ТВгобіу і в 10 15 «кВ» ї585 «тії» 13 «ві» РНК «231325 Наию 5арігпе «во» 189 січ івгц бів ткросіц бій Аїд іп о А5р о тТук івц гук АгОо 1 5 30 «1075 190 «211» 34 «і2з» РТ «8135 Нощмю 5арівлпз5 «нку їі вій іец зі тгробБіц іп діа бій Ар отук о гец гу Ага РвБе 1 В їй
«2303 19 «ії» 15 каії2» РВЕ «2135 Нощо зарівпх -4005 151 сіу ті Адяп РБе івгц тує діа Аїд ТВгоНІіЗ біц ів оіу Ні Заг 1 5 15 15 «810» 11 «21ї1х 15 «21955 ВВТ «ії» Нощо в5артепь5 «щу. 155 іп бів теробій біп Аїа бій Ар оТук іп У АБа 1 5 то «230: 193 «В11» 13 «2125 вВт «213» іо харівпх «по» 393 іем бів тгрозій біп Аїва бів дз тУгГ зем фі у5 Ага вве 1 5 10 «и 194 «2115 14 «12» РАТ «213» Нощшо зарізипх «0аз 194 зекобБіч іви біп о тго біз біп Аів біп Або оТук гвц іув5 Ака 1 5 30 «21005 195 «ії» ії «2125 РЕТ «13 Ноще зартіейпв «ап» 195 5ег сі їец віп тТгробій бій діа біп АзроТуг бен о Буз Ага рве і в 10 15 «230з 195 «2115 13 «212 ВЕ «213» Нощо зарівепх «-4005 155 зві Вго Тук Ап оті ін о тТвБвоРКо туго БКго біу РКО Ага 1 5 10 «вій» 137 «211з 14 «212» РТ «713» Нотео зарієль5 «вну» 197
Тук Ууаї Рго тук Азп о Іт1Тїе гей те о ВБго тує Рко біу Рго Ага 1 5 1 «2305 195 гії» 14 «2ї9з ВЕ «213» БНощо зарівих
«400 1985 сіу АБп о тгрогув тів І1тТе Ага бек бів АБп РБе бід бів ев 1 5 10 «2105 199 «11» 15 «еі8з РТ «візЗ» Нощо зарівень «а» 1 біу Ахп Тгробуз ті тів Аг зегобіц А5а РВе сів сіціфіем ів іу» 1 5 16 15 «23 20оа «211» 13 «212» РТ «213» Ноещо зарівгп: «400з 200
АзпоТгроііух тів тів Акго бек бій Ап РБе піч бій геї 1 5 10 «10» ММ «213ї1з 15 «2125 РТ «213їх Нощтео зартіейп5 «ке
Ркго АБпоРБе зек о біу А5потгроїу» тів ІТе дгд 5ег бів Аб5поРБе 1 5 10 15 «210з 802 «211» 15 «212 РЕ «2135 НоОощо заріепх «3003 80 чаї меж їев Агро іух тів Аіїа хаії Аа Аїда АЇв бебі ух Рго Ав 1 5 10 15 «Вій» ваЗ «21ї1з 12 «212» ВНТ «213з Нопю 5арівпь5 «а0Оз г
Твору Тіе тів дра его біцч Ап РВе він січ г ец 1 5 10 «105: 708 «211» 13 «фіз БТ хЕі3» Ною зарієп5 «дддх зм ів біп АКа тук бек бак Азровбго Те о Сіу Аів ген тТвЕ 1 5 16 хаійх 205 «2115 14 каі2» ВВЕ «213» нНоещо харівпх «005 0 2о5
АзповгОо о тТВаготТВг туго зіп Меї АзроУаї дп Рго біц оіу уз
1 5 їй «103 26 «211» 15 «2125 РЕ «2135 БНощо зарівпх «оз 80б5
Ап о Вго ТВготвг Туг біп Меї аврохаї Аяп Ро сів б0іу уз Тук 1 5 10 ії «Аїр «211 17 «212» РТ «213з Номо 5арівп5 «аз ОБ
Азв Аврое1іу бі біп РБе Уаії ді ТаготБНг АБа Рго Уа АБп о АБА Ар 1 5 что 15 сіУ «ух оп «2115 19 «В1й» РТ «2ї3х Ноще запйівпе5 «ОО ОВ
Азробуя віч біу іуз чаї РБе тур бак їТе ТВг обі бів офі АТ дер 1 5 10 15
ТНг о вго вго «А» Ом к«21тхМ 26 «217» РТ «ії Ною 5артевлп5 «ах лю
Азвоікя біц бі уз Уа! Рбе Туг Зак ї1Те ТБгобіу біп сту Аа Ар 1 5 то 15
ТБговго Рго Уа «нує 210 «21ї5 14 «1» РТ «2135 Ното зартіепе5 «ЗУ 210
Азв'іуз Ап Меї Ре тТНг ті Ап Ага Аза тб бі Уді І1їе 1 5 10 «із 81 кЕії» 13 «2123 ВЕ «213» Нощо зарівгпу5 «о 11
Азроішв Адяв мет РПпе тр оті Ап Ага Аза ТВгобіу Уяї ї1Те бег 1 В 10 15 «аз 215 «21їзз 17 «12» РТ
«2135 Нощмео зарієп5 «00 219
Азр о Бга біц іецн Рго Азрої у Ап Маї РБе тТВг оті Ап Ака дяпотаг 1 5 10 15 сіу «В» 213 «21ї1»х 19 «212» РТ «233 Нопо взартепь «8 213
Азр о Рга біц ген РБго А5роіУу« Ап Маї РБе тВг отів Ап АКоа два Таг 1 5 10 15 сіу Уа! Тіє «210» 714 «211 20 «Рій» РТ «813 Номе 5арівпз5 «ап 214
АзроРга бін їецй вго Аброїу5 Ап Меї Ре тТБг оті АВ Ака дяп о тТаг 1 5 то 15 біу хаї Ті бек «210» 215 «231 21 «2185 вт «213 Нощмо зарієп5 «0» 215
Ар оБга біц іє Рго А5роіуя Ачп Маї РБе тТВготів Ап о Ако да Таг 1 5 10 15 біу Узі Ті бек Уді 20 «2105 16 «21їх 82 «Вій» рт х7і3»х Ноте зарієлй5 хау» гів
Азр о Рко сів івц о Рго Авроіж5 Аа Меї Ре тТБг оті Ап Ака Ап отТвг 1 5 то 15 сіу хаї їіе бег хді ха! 20 «Ві» 217 кг1ї»м 23 «212з БВТ х»ї13» Ново зарієйп» «00 217
Ар о Бга піц ген Рго Азроіу5 Ап Маї РБе тВг оті Ап АКа два Тпг 1 5 10 15 сіу Уві тїіе бег оді Уаї ТЕГ 20
«230» 818 «1їх 15 «Різ» РЕТ «131» Ново заврієнпе «Оп» 218 авпозаї Ап о тТвВкотТує Ап о АЇв Аів тіе Аїд тує Таг оті гец о зег 1 ч 10 15 «іп» 519 «11» ІВ «вї12х РЕТ «-215» Нема зарівй5 «Я» 815
А«воУді АП ОТГ о тТУуг Ап о АТа дід тів АЇа тук ТВг тів їв о бЯвк бій ї 5 10 15 «21йх ий «Р1ї» 15 «212» РТ «13» Ноню зарієйе «Ой» хо сіц обіу їуз уві ББе тує бек їі ТБг о біх біп бі АТа аБДОТВе 1 іі 10 15 «21 291 «11» 17 «Рі?» Рв «й13х Нащо яаріапа «Оп» вР1 бів бі уз Узі Рпе туго Зег тів Так обіу іп бі АТа АхротвК Рга 1 5 18 15 рка «НЕ фра «11» ІВ «212» вв «213» Новю зартапае «з ти сів біу уз Уді Ре Туг озег тів таб осі іп бік Аа др отвг вгео 1 з 10 15
Вка Уді «231П» 223 «1ї» ІБ «Дій» РВТ «155 Новою зарівпо «Оп» 823 бій ін Бго дер уз Ап оМеї Ре тйготів Азп Ага Азпотвг озіу Уаї ї 5 їй 15 118 5ег «НЕ 298 «211» 13 «212з вт «213» Новю зарівпа
«800ж 224 сіУу сіу бів вва Уді Уді ТК о тТВК Ап Рго ові Ап Ап і 2 12 «ах 235 «ії» 14 «212х РЕК «13» ню зарівпх «Оз 0825 біу ух Уді РВе Туг баг ї1Те ТВг обіу бів біу АЇВЗ АввотВе 1 5 ів «30» дра «23ї1х 16 «212» РТ «г1ах Ношо зартепь «8(Нує а бі Вкго Ре го гу Ахпоівгн о Ууді іп тів ух зак АзпоіУу5 А5р Рух і Кі їй 15 «2303 028 «231» 17 «232 РЕК «213» БНонщю зарієп; «Оз 80 бі Вго вве вра рух Ап ів оУд)і біп тів їує бег Азп іу5 Ар іх 1 5 їй 15 сій «вх 298 «ії» 13 «хі2х РНК «213» Бо зарівпх «Оз 825 біу вВго Ве Ро гу5 Ап оіви УдДІ бів ІтІ1і8 їу5 бер АБп о іух А5роі ув 1 5 10 15 біц біу і ув «ах За «ії» 13 хіх РН «213» Ноше зарієпе «Ох 2259 уз Ап о Меї РБе Тпг оті Азп Ага АзпотТВк обі заї І11Те 1 5 їв «2105 530 «1їх 14 «2312з ВВ «ВІї13» Новю сартіепа «ЗНУ 230 іуз ап Мет БВае ТВг оті АБп Ага Аза тТВгобіу Уді тів баг ії 2 12 «ах 231 «ії» 14
«2125 РТ «13» Ношо зарієйпе5 «Оп» 231 іем РгОо Ар уз Азп Меї Ре тк тів Ач Ага Аза тТВг обу 1 5 10 «2305 2372 «21ї1» 16 «12» ВНТ «2135 Ношщо 5аріепе «00 2372 іейп овга Аярофуз Ап Мет РБе пк о хів Аза о Аго Ап тйг обіУу Уді тів 1 5 10 іх «2105 233 «231 17 «12 РТ «213 Нота зартепв «У» 933 іейпоРго а5рофузх Ап оМеї РБе тйг жів А5поАгд о Аяип так осту Уа! тів 1 5 їй 15 зЗег «10» х34 «211» 15 «2122 ВНТ «213» Номе зартеп5 «ке 234 го сів іец Бго Авроіуз Аза Мет вне тк оті А5п Ага АзпотВг обіу 1 в ій 15
Уві Ітте «2105 235 кг1ї1х 15 «ій» РК хаі3» Ношто зарієйп5 «ПО» 235
БВко пі іву о Бго Азроіуя Ази Меї Ре тк о тів Ап Аго Аза оТВг о біу 1 5 їй 15 чві т1т2 5ег «2105 238 «23їх ді «2172 ВНТ «2131» Ноште зартепь «По» за сіп о Азрорго Бін івц Ркго дер іух Ай Меї Ре ТБг о тів А5п Ага А5в ії в 10 15
ТБгобі Ууді їі6 бБег «2105 737 «211» 25 «їй» РТ «Вії» Ношо зарієп5
«800» 937 зак сіп А5роБго бій іец вго А5роі у Аха мет Бе ТК отів А5п о Аго ії ЮК 10 15 азп оте осіу ді 1ів 5егб аа «2105 238 хае1зїтх 85 «2125 ВР «135» Новю харівпа «ВНТ» 38 зак о біп АБровго сій іец вго А5рої ух Ада Мет Ве тег о тів А5п Аго ії З 10 15 аБпотвкЕобіу ді їі его оУді Уді Твг зо 25 «21йз 235 «11» 14 «в12х РТ «13» Новю зхарівпе «ЗОН» 235
Зекг ді Рко два туго ів Бго дко Бго Аїд АзпоРКо Ар бів 1 5 10 «ки ау «211» 17 ка12х РНТ «213» Ношо здріепе5 «400» 240
ТВгоАБросіу Заї 1іе ТВгоМдї їуб5 аАго Рго фен Або Ре Ні Ап овго 1 5 10 15 бій «ик 41 «гії» 14 «127» РТ к«в1їх Ново заріепь «400 241
ТНК Ага АТа бів ін од Ага бін АБЗ Ре бій Ні Заф і ух 1 5 10 «21йз 242 «11» 13 «212 РТ «13» Новю зхарівпе «00» в42 чаї вго АвБа ТУуг о рац о врго Ако Рка АТЗ Аа вго дер обі 1 5 10 «Кк» 843 «211х 13 «12 РНТ «213» Ношо здріепе5 «400» 243
Аіа іец о біц Бйе ага дід ій бів вро бій біу ів і во 1 5 10 хеіОх 244 «31» 14 «ВІі2 РТ «23ї3з Ноте зарівпе5 «40до0х 244
Аа фей бін РБе Аго Аіа ївец бі РБго зі бі іаціец ге 1 5 10 «210» 745 ха1їх 13 «232з ВВЕ «13» Ното зарієне «8НуУє 245
Ар о тТвгоАга тів РБе Ре уаії АБа Рго АРїв Рго Бга о тук 1 5 10 ком 245 «ії» 14 хвіг» РНК «2135 Ното зарігпх «00» 46 азр отак Ага ті Ре вне Ууді АхпоРго Аїа Рго Рго Туг їгц 1 5 30 «230» 247 «1їх 15 «Е1йи» РН «533 Нотео зартіепь5 «4йоОх 247
АЗзвОтТвВг оАго тів Рйе Бе уд) Аа Бго Аїз Рга Бго Тук гей тго 1 5 10 15 «вах 245 хкії»х 165 «232» ВвВт «13» Нею зарівих «НІ» гав вар Так оАга тів Ра рпе узі дв5поРго АЇв Бго Ррго туго зїем о Ткр о вга 1 З 10 15 «Ми 34 «її» 17 «кій» РТ «233з Ното зарігп5 «Ох 249
Азв отак оАга тів РБе вне Уді Ахп РКО Аа Вго Ррга туго іви о тТерорра 1 5 30 15
Ата «вій» 50 «23ї1з 12 «212» вт «2333 Ното харігпе «пз 25 зів вна аг Ав ів зії Рго біп біу ген івц і в 1 5 зо
«2 251 «К11У ІВ «212» ВВ «213» Новю зарівнпа «я: 251 біу АіЇа Рго ді Рго Аіда РБе січ бі Ага бек о РБе ей Аїа РББе Рго ї а 10 15
Тег оїец «Рій» 253 «211» 15 «212» ЕТ «кі3хУ Нове зарівп5 «ЗОй»х вай
ОіУу Азр оте Ага т1іе ББе РБе Уаї Ап РБго Аза Рга Рго туго ів тгр 1 з 10 15
Рка «21 253 хкіїх ІВ «212з ВТ «2313» Новою зарівпа «а» 253 біу Ар о тТБК оАгЯ Тіе Ре РБе Уді Ап Рго діа Рго Рго Туг о їігц тТгр ї з 10 15
Рго дія «в1пз 258 «11 ІВ «21йх РТ «213» Новю зартепа «400» 54
Тіз узі А5р уд) Ні Бе АБо Рго ТК отв діа РБе Ага АЇаД РБго АБр 1 з 10 15 «ій» 855 «2113 16 «12» РЕ «213» Ношта зарівпх «Ай» 253 іу« ха! Аго Уаї Тероаго Тук ев іу5 сі із Ахріен ха! А1З АгО 1 5 10 15 «23» 956 «й1і1ї» 13 «212з РЕ «213» Новю з«артепа «00» аб іви біб ве Ага Аїа ев біч его бів біу ввів іє 1 З 10 «Вій» 255 «211» 13 «212з РТ «2155 Нощо 5зарівпу
«Зх 25 заг сбіу Рго Рйвоіву АЇВ Аяр Рв Ап сОіу Ре Зег Нія 1 в їй к«3аз 258 «т1ї1» 1З «12 РЕ «213» Нощо зарігпх «005 55
ТвВг обі А5вр о тТвг око тів Бе РБе зді Ай о Бго Аїа Рго го Ту гів 1 5 10 15
Тер Рго дід «210 859 «211» 13 каії2» ВВЕ «2135 Нощо зарівпх «4005 258
ТНг Ага тів РБе Ре хаі А5а РКО діа Вго Бго Туг іви 1 5 15 «10» го «211» 15 «217» РТ «213 Ното взартепь «Ох 260
Уві АвБрома)| Ні Ре Авробго Те о тТйг о АтТа РБае Ага Аід Рго дер 1 5 10 15 «210з 851 «11» 15 «212 вв «213» ік-що хзарівгпх «300» 2651 чаї Ар уаі Ніз РБе Ар оРго ТТГ ОТГ о АТа Ре АКо Аїд Рго Ар оУув! 1 5 16 15 «Вій» 252 -23ї1з 15 «12» ЕТ «2135 Ноешо зарізпх: «а00з 8852
Уві Ага Уаії тКр Ага тує івец туз біу Бу А5р ої ви чаї АТа АгЯ 1 5 10 15 «10» 263 «211» 15 «218» РТ «213» Нощто зарієп5 «З» 263
Аіа Рго хаі вго Аїа Рне січ сіу Ага бБег РВе гбец Аз РБе Рго тв 1 В і 15 ««21й0з ва «211» 17 каії2з ВЕ «2135 Ноещо зарівпх «005 га
Аіфів Бго ха! бго Аіа РВе бін бі Ага бег ББе о їец Аїа Ре вго твг 1 5 15 15 їец «230 265 «21ї» 15 «217» РЕ «213» Ново зарівпо5 «400» вх
АіІв івен о Ага біу гей іен о Ргоа Уві ів біу біп Рко тів тів Ага 1 5 і 15 «віпйз еще «211з3 16 «212» РЕТ «213» Нгво зартівп5 «АС» 565 двроїєец вго Оіу Ага РБе Уа! діа зі 5ег А!з біб Уві івец фей Рго 1 З їй 15 «230» вв «к21ї» 17 «217з РТ «213» Ново звріенпе «а0Ой»м й?
Авроівц Вго біу Ага РБе Узі Аіа пів б5ег Аїз бів ба! іец ген вго 1 З 10 15 до «210з 265 «211» 13 «217» РЕ «2135 Ношо чарієепье5 «Ой» БА бСбіу біп вго ті тів Ага баб тів Рго бів Біу тів о Уді 1 2 10 «21й» 265 «211» 14 «вій» РТ «213з Ното зартепз «вх 255 сіу іп Рко 112 112 АгЯ бер тів Бго 5ів 01у 112 Ха! Аїд 1 5 і «8310» тУй «211» 15 «РІЙ» РВТ «213» Ношо звріепе «а» 270 ів дід іа бів Вб Ага АЇв іев зі Рго біп біу іерівц ви 1 5 10 15 «НЕ 271 «ії» 15 «212» ВРВТ «13» Ново зартейз
«Оз виї їец бі сів Рго Іїв тів Ага бег тї1ів вго біп сі ІТ ді Аїд 1 5 ів 15 «гі 57 хг1їіїх 14 «212» РТ х813х Ново зарієпь «800» 272 іви Рго Аїа Аїд іву Ав Суб тТгросіу а! арго 5іу Баг їев 1 2 10 «23 В «231» 14 «332 РЕК «213» бою зарівпу; «Я000з 23 іец вго піу Аго вве узі Аїд бі зеб Аїд бій Уа ів івц 1 5 10 «аї10- 274 «23і1х 15 «212» РК «213х Номо зарієпь «300х 274 івци о Ргоа бі Аг вве Уві Аїа бі) Зебс Аа біз Удт іен о ївц Бго 1 5 10 15 «230 275 «211» 16 «аіїйх ВЕ «2135 Нею зарівпх5 «000 85
Кеш о рБго біу дко Рпа о Уді Атїа біз 5ег Аїв бів яр о іев ів о Бко де 1 5 їй 15 «Ей» 278 «213їх 14 «212» РТ «213 Нове 5арівпо ках 275 іенп о Ага бі ге) іван оРко Ма! іев біу іп Бго хтів ї1те Ага 1 5 10 «30 у «211» 15 «2123 ВЕ «В13У Нова зарівпа «Нюх Оу
Рго біу Ага Ре ма)! Аїв бін бег Аа біз УВІ іецоієм рго Аго 1 2 їй 15 «В» ЛУК «Е3ї» 16 «ві2 РТ «23135 Нотео заріепе «ах 2775
Рко аіх Ага Ре Ууаї Аїа біч зер Аза Зіц Ма)! ів ів Рго Асі ву
1 З іп 15 «2310» 5 «11» 13 «21?» РЕ й «в1їх Новою зартапа «400» 85 сіп РБго ті тів Аго 5ег ІТ Бго сів сіє тів Уді АїЇа ї з 1а «вій» 250 «211з 13 «й12з РТ «Різ Наша 5зарівп5 «М» 280
Ага сбіу бе о бвеч Рго Узі ге сіу біп вго ї1іе 118 Ага ії 25 іп «вій» вві «їх 15 «212з РТ «Рі13з Нощто зарівепе «ДОП БІ его дго тпгоїен діа іх бій те осбіу бій бій аЇв Аїа Рго їец 1 5 10 15 «21йз 253 «1ї1х Ії «Рій» ВВ «213» Новю зарівпа «400» ВА
Зек Тийг о сів дга Уаії Аго сів Ген Аза Уаії Аїа іеч АтТа бів і у5 1 з 10 15 «210б0з 253 «2113 13 «ві2Уу РЕ «2152 Ноша зарівепу «Ай» 253 тТвг др о АЇВ Уаї іец Рг фец твг ув! дід бій Уді Ів 1 З іп «230» 84 «літ» 14 «?212з ВНТ «213» Новю з«артепа «00» 884 чаї ді біц Уа сів губ Рец оіви спі Бко Ні УЗД; сів сіш 1 З 10 «Вій» 255 «211» Ів «й12з РТ «215: Нощо 5зарівпу «М»: 85 чаї Азїа сін Уаї біп о іуз ген оіем обіу ВБго Ні аї Є біу гені ух ії 5 ій 15 «21й» 886 «21ї» 15
«2і1ї РВт «і13» Ново чзвріейе «40» зб чаї ген бі біп Рго Іі ті Акад баг тів Бго біп бі Тів уд! Аїд 1 з 12 15 «2310» 287 «2131» 15 «212» РЕТ «813» ВНошо заріви» «Ме 287
Уві Ага 0іу бЗег оіен оі2гцу бег о бій Аїа АзроУа! АгОо Аіа тез сім 1 5 10 15 «210» 88 «2112 16 «212» РЕТ «213» Ново зввріепе «й» ака ха! Ага бі бЗег о івец о івц Зако біб Аа Ар оМаї Аго АТа івец біу біу 1 З 10 15 «2: 285 «811» 15 «212» РВТ «213» Новю зартайа «00» З іец Бго дід діа іен Аїд Суз Тгбробікю Уві Ага бі бек іецр їв ї 5 10 15 «кіз по «21їз 16 «12 РЕТ «213» Ношо заріеєйх «Ай» 250
Аід тів гу Уві ан Ага ОЇ Ап ТК бак о рго іуз АТЗ Ап іув 1 1 2 їй 15 «210з 251 «Зі» ІВ «2125 РЕТ «213» Ново зарієйе «щоб» 91
Ар овго бек о Бго Ге бій Ага Туг о бег бів А5роБго тТвгожа)| вро ії ву 1 з 12 15
Бго Зак «230» ви «21ї» 18 «217з РТ «13» Новю зарівеп5 «а00х 802
АвроРго зако Бгб ів бій Агд о Тук баб 6іЧ А5рорго ТВг Ма)! Бго і во 1 З 18 15 вБго Заг осів
«КЕ» 593 «231тх 15 «212 РЕ «213» Ношпе б5артепо «ВЕ 293 бій ізн ді баг о біц Ре бек Аго Маї Аїд Акао А5в ї 5 їй «2їаз 894 «211» 34 «212 ВЕК «ті3»2 Ношо зарігпх «005 ва бій ів хаії зегобіц Ре бек дго Меї Аа Ага Ар о Рго бій ії З 10 «Вт» 995 «211 15 «217» РТ «13 Ношо зартепь «з 295 їі Рго ха! АЇз їі Гуз Уаії рей Аго біб аАБпа ТБг бак Рго вух дід ї 5 12 15 двпіу5 о хі» 295 «231» 16 «ВЕІі2» РАК «213 Нащо зарієпе «Оз 2955
АКО Ага їеч єн біп бів ТВгобін ів Уві січ Рго фе ТК Рго 5ег 1 5 їй 15 «Ії 205 кРії»х 419 «212з БЕК «Різ» Номо харієп: «гай заг о Рго зів вго біц тук обдаі Ази бій Рго Ахроув)і Ага Рго сів вго ії В 10 їх рко «210О0з 898 «Ії» 15 «їі» РЕ «Ріїх Ношо зарієйп5 «300» 298
Уаї іу5 Рго Ар оіец зак о туг Мет Рга тів Торо уз Ра РгОо Ахр Бін 1 5 10 15 «й 295 «ії» 15 к212» вт «її» ною 5аріепа «аа 2899
Аіа бег сіу Меї Ага Тут івц Аїв ТВгої ен Ап оВБе чаї Ні Ага
1 5 10 15 «21» оп «Р31х 16 «Кіз РЕТ «213» Нопо 5артейпь5 «Щі З тів АїЇа 5ег біу Меї Акп отуг ген Аівя ТБг оїец Ав ВВБе уві Ні Ага ї 5 10 15 «230 зо1 «211» 13 «іа» РЕ «135 Но хавдівпх «ах 301
ЕЕ біц Узі гу 116 Меї зЗег Ага ген Рух АЗзровга дер 1 5 13 «210» 309 «831 13 «2125 РЕТ «133 Но зарівп:5 «ам ЗО; іеп Аза іп Рпа івеб о бег Аїа Ні біп ев біч Азр губ 1 5 то «23ах 353 «21ї» 15 «212 РЕ І «Д1М» Но зарівлпх «М» 0303 дп ого Аїа ТУуг Акад іч їв о гец діа тк отТув Аа Ага вго Бге 1 5 10 15 «а Зой «21315 ів «2195 РВК «213х Нопю зардівенп:5 «ие ЗО
Ап о Рго дія Туг Ага іеноівц о ієц Аіва тТВг о Туг АТЗ Ака Рга Рго Ага ї 5 12 15 «2105 305 «?ії» 15 «232 ЕТ «Різ» Но заврієйпзї «В» 0305
Зек Ачп о Рко йіа Тук Агд їев гец оівц АїЇв ТВготТук Аїа Агд Бко Бго 1 5 16 15 «Рій» зо «2315 17 «212» ват «233» Нопо зарієп5 «ад» зоб
Зег деп Рго Аїд Тук Ага івц іви іп Аїа ТК туго Аіа Ага ко рРго ї 5 10 15
Ако
«210» 305 кДії» 16 «ій» РЕК «?РіЗ» Ножо зарієй»5 «Ве» 307
Ав» Бго Бег ТБ Ар отук тТук біп біц івн сій Ага Або) хів бег бін 1 5 10 15 «23 зо «Кії» 15 «ДРУ» РЕ «13» Ною заріепя «Ой» За
Уаїф бін так обів РВе Ай бій туго ід ТК бін Аїа дія зекг Ак 1 5 10 15 «Вій» 309 «21ї» 16 «е12з РЕК «213» Ното зарієйп5 «аю ЗОВ біУу агя сіп о Ууді тгроуді тує тв обі Аїд его баі гів піу Ргро Ага 1 5 15 15 «231х 3105 «ії» 19 ха32м вит «213» Нощо хврієйх «Ой» 310
Ап обій ів Тук оіеб вБе їу5 А5росіу уз Тук Теродго вне зак осів 1 5 10 15 іх «іп ЗІ «Кії» 15 «ДРУ» РЕ , «ії» Нощо хартепе «або» зії
Ага бій Узі Ткрооаї ТуУук ТВКосіу Аіз бек омаії іво о сіу Вго Ак 1 5 10 15 «Вій» 317 «21ї1з 15 «еі12з РЕК «?2і3» Ното зарієйп5 «ав 315 зак сіу йго бій Маї Ткрозаї тує так обіу дія бек УЗ ген сіуУ 1 5 15 15 «23» 313 «ії» 15 «Дій» РЕ «ії» Нато хврієейх5 «ою» 313 бЗег обіу Ага бів Уаї Тгроуді туго ТВг обі Аіа его оУуа| ген о біу Рго 1 5 10 15
«210 З14 «211» 17 «212» РТ «2135 Ноещо зарівгпх «4,00: 314 чего обі Агя біп о Ууаі ТероУуді туго тТВгБосзіу Аїд бак оса рен обіу ро 1 З 10 15
Ага «а» 315 «гії» 15 «вій» РН «2132 Бо зарівгпх «-а000з 315 зві АБр ого Ако Зег Аїа бек біб ді АвроАгар Меаї Ре Вго сіу 1 5 30 15 «2105 316 «211» 13 «2127» РТ «2ї3х Нопю зартівпо5 «ЗНУ: 315 сіУу біб Уа| Аїа Рго АЗр дід уз зак о РВе ді іец АВ і В 10 «231053 317 «11» 15 «212з ВЕ «213» Бющо зарівгпх «НЮ» 317
Бен тпк Узі гу іец Рго А5зр осі Тук бін Ве гу РВе Вго Аза АКго 1 5 ї10 15 іги дьп ген «210з 315 «2115 15 кіз ВВЕ «213» Нощо запівепух «Ну» 31 чаї Ага бі біб Уаї Аїз Бго да дія уз зак Рве уві рах Аа 1 З 13 15 «10» 315 с«еїїх 17 хаіб» РТ «2135 Нащо зарігп5 «ах 319
Уві Ага бі бій УЩі АТа Рго Ар Аіа уз бег Ре Уа ів дп і ви 1 З 10 15 бсіУ «нує Зо «2315 9 «ти» РТ «їз» Ноще зарівп5
«Ох 320
АіфіВд тТВг обаег гу тів Рго гвгц Аїд і 2 -к іа ї й «із 351 «ії» 8 «в12У РЕТ «8135» Новю зарівйз «(НЕ Зрі тів тйк бек о бег Ага тв те Тв 1 5 «230» 3272 «Рії» 9 «212» РЕТ «-213» Ношщо харієпя «Ой» 392 іви деп о ВНе Твке о тіе ТВг Ап іви сів 4 г їі ї «РЕ 393 «211 Ій «212» вт «213» Новю зартівйа «НІ» 323
ТвВг оАїа твг обЗег о Бго Меї Уві Рго А1а Зак 1 з 105 «10» за «Дії» а «212 РЕТ «2113» Ношо хдріейх «ДОП» 374
ТВгОотТпк ген о рко Біц Зак Ак РКо Мег 1 5 «Р» 325 «вії» З «гій» РВТ «21535 Новю зарзівеп: «400» 395
Уа! біч іч Ага Уаї іец Аїа іви РРО -к іа ї х «21Пбйз 375 «211» З «г12У РЕ «813» Новю зартівйз «(НЕ 128
Аіа Бін Ар одяп о івн о тів Ні іу5 Рпе 1 5 «230» 327 «ії» З «212 РЕТ «г13з Ношто здрієепе «00 3957 ака б5іц Арі сів ака фівц о біу ма! 1 З
«Рій» 3278 «К1ї» 10 «212» РТ «вії» Новою зчврівенпе5 «0ОПйх 328
АБротаг офуУу5 АЗроБго Аза Ууді ТВг осі тгр 1 5 185 «іп» За ка» З «12» РЕТ «213з Ношйо зартейз «ах 3275 тів іван Ііїе Бегіу5 івпоівц біу Аїд 1 Кк: «Р1йбх ЗО «Вії» 9 «2172» РА «213» Ноно зврієйе «АС» 330 -вгобіц зак оіец Ага ТВгоіен обі РНе 1 5 «210з 331 «її я «2127 РЕ «18» Новю яарітапа «800» зі чаї ів Аїа бім ів са Аїд зух і ви х Кк й 7 «10» 332 «211» З «2122 РЕТ «?15» Нінво зарівп» «АС» 332 тів дзп о тВкобег тів івц фено тів вна з З «210» 335 «Вії» 5 «212» РЕ «кі3» Новю «варіан: «400» 333 дід рец о біп Бкго іец о івц Ні ТВгохді 1 5 «іп» 334 «811 З «від» РЕ «215» Ношо 5зартей» «АК» 354
Аги оіен о Меї Ар о Аяп о іенв Рга біп г ви 1 З «10» 315 «21ї» 9 «212» РТ
«2313» Новю зартепа «вних 335 їец тів ІчІ16є 5ег Рго ТВг Ага сім г ви х Кк й 7 «23» 336 «211ї1з В «а12з РЕТ «?15» Нінво зарівп5 «АК» 336 діда азр бек ік Уа! іви ен рве 1 З «230» 339 «11 11 «212 РЕ «213» Новю «арівпе «00» 317
Ар о чЗег бен оіви бі зів Аід А5п АЗп Аїд 118 1 5 10 «231» 338 «хв1іх 10 «вір» РДТ «2155 Ношо зартей» «0» 355
Ачр о Тук бів біу тів іуз Рье Уаі 1у5 Ага 1 5 18 «30» 339 «2112 9 «212» РЕТ «213» Ноню хаврієепе5 «АС» 333 зіц Уаї Уді біу Тут Ре бі Ака вне 1 5 «210: 380 «вії»х З «212» РЕТ «813» Новю звріепа «Ом зай іу5 Туг уд! зуз біу ген Кіа 5ег тів х Кк.
КУ м «1» 341 «11 З «2122 РЕТ «215» Німво 5зарівп» «А» 381 заг тів біу тТВг о БгоОо їіец А5Ю РКО г ух 1 5 «230» 347 «21ї» 5 «212» ВЕ «213» Ново зарієепье5 «400» 342
ТВг о А1а Зек Азроіув ІТе івци тів худі «230» 383 «11 З «122 РЕТ «215» Німво заріви» «по» 3453 біу уві Іч1Тїе ух МАТ тів бек біу вна 1 5 «23» 344 «ії» 9 «212» РЕ «213» Ново зарієйз5 «АК» 384 іу« ма! їуз ін січ д5п о іув і ен і у5 1 і «2307» 345 «31» «2125 РТ «233» Ношо хартапе «ан» 345
Зег аг о заебг бім Рго Уві Ні дід у х Кк й 7 «210» 34В «-211з 10 «12з РЕТ «2135» Ноша зартейпу» «Ап» 346 «ак Заг бак о бів Бго Уді Ніз ліз і уз 1 ух 1 5 10 «230» 347 «211 5 «212з вит «134» Новою хаврівнпе5 «Ох 347 іец о зег Ар біп ге АТа бій Аїд 112 1 5 «230» ЗАВ «211 9 «212» РЕТ «213з Ношйо зартей» «пох 348 івц бак А5р о тів МАТ тів ЗТ Бу тТук 1 я: «230» за «ії» 9 «212» РЕТ «213» Ноню звріепе «АС» 383 звгорец Ар оАзо Ні Уаї Уді АТа худі 1 х «230: 350
«211» 9 «212» РЕ «213» Ноно заріепье «400» з5а
Зек бів тів Ар бів сів Ай бек оуді ї с «230» 351 «231» 11 «212» РТ «РІі1З5» Ношо зарівих; «з 351
Зег ТВг о ІчІТ6є д5роРго бЗегосіу ТВг Ага бег і уз 1 5 і «210» 352 «2112 З «12» РЕ «213» Ново зхарієейяч «ЩО» 352 тді вБе Ага Авробіп біз Рго г у5 112 1 5 «211: 353 «й1їх З «212» РВТ «213» Новю зартапа «0Ойх 353 чаї ен ага біз із ів Аа Аа і г х їі «810О0з 354 «21ї»: 9 «812 РЕТ «21535з Ношйо зартей» «ен 255
ТР Ага іви біп бій Аїд біп Аіз ге 1 2 «210» 355 «211» 9 «212» РЕТ «кі13» Ново зарівйя «00» 355 ча! Аїх Аїа рРко сів нів І1іе бер отуг ї 2 «210» 358 «211» В «212» РЕТ «213» Новю зартенпа «ще 358
А5п заг о фіує гу і у5 Уді Аїд ївец ї ії: «210» 357 «211» З «212 РЕТ «РіЗ» Ноше зарієйї
«800» 257 іп о АЗзп о бег іуз їу5 і уз хв) Аза ви 1 В кОм 355 «21ї» 5 хвіг» РНК «2132 Бо зарівпх «00» 3558 ага Ар Аза тТВгоха)| Ні зак Ре 1 5 «2105 359 «231 «212» РЕТ «233 Ноше зарівлз «300» 35 іуз іп та) ек бій бе Мет тТиг тео 1 5 «2105 ЗБ «й1ї1їх З «232» ВвВт «13» Нею зарівих «НН» ЗБ
Гу Тк оїуб5 Рко сіп о 5ек тів зіп Ага і Бі «ах Зб1 «21ї» Ж «аії2» РЕТ «233 Нощто зарівп5 «4адОх 351
ТБконі5 тів сій ів Біб Агдіву 1 5 «2105 363 «її» В «в12з ВЕТ «Вії» Нопю 5арівнз кЗ80Ох 362 їіе Аїа Бго іуз тів ге оіп і гц 1 В «ЗО 353 «211» В «тож РЕ «213» Ново зарівгпх «НН» 363 а5р тів діа бегоді Бек обіУу Ако о тко 1 5 «10» 3654 кзїх З «Е1йиУ РТ «213 Ноше зайівпь5 «ЗООм 364 іу5 Рга іу5 біп Рго бегоіу5 зег Уві 1 5
«ій» 3655 «211: 9 хаї2х РЕТ І «її» Ното зарівенйь «Оп 355
Мат вго АтТд сі тпге тів Гуз сін гер 1 5 «Рід» 3656 «іїх З «2122 ВВт «е15х Новю зарівзнпа «4З0йх ЗБЕ
Зак АЇя Ма! Гуз бід сіу ТЕ о Аїа Меї 1 а «ій» 357 «811: З хаїідУ РТ «2132 Нощо зарієепу5 «4003 357 іш Бін бів іу5 іен бів Аїя діа вБпе 1 я. «0» ЗБЕ «2іїх 58 «12» РЕТ «аі3х Ното зарієп5 «00» ЗБ а5росіц Впа Ап іво сіп іу5 МАЄ 1 З «ій» 358 хйіїїх 5 -212з вт «1У» Новою зарівпа «00» 365
Ар обі тує гуя Маї тв АтТа вве 1 з «їх 370 «Р1їз 8 «кір РЕТ -213з Ното заріей»5 «АП» 370 піц тк Аза тів біу біу ій Ап оте 1 З «Рібз ЗУ «11» З «2122: ВВТ «15 Новю зарівнпа «400 ЗУ
Ре РБго бій тйг о Аіа їец о хаії 5ек РБе 1 а «АЗПх 379 «Рі1їт» 11 «аїрх РТ
«2135 Ноещо зарівгпх «4005 372 сіу зіч РБбе бі їуз Гуз Аїда Ахр о сСіу ген і вц 1 5 12 «2105 373 «2131» З «215» РТ «213їх Нопю бзартелпь «ЗП» 373 біу бек Мет іїзіу зЗег Рне бег о зіц їух 1 Б «230з 374 «211» 11 «212 РЕ «2135 Бощо зарівпх «-4005 374
Ті Ра їец тіе др о бБіу Узі ТВгобіу Ага тів 1 5 10 «10» 375 «21ї1з Кк «212» РТ «213з Нота 5арівп5 «ЗО 5375
Тіе гга Рго бій Узі віп Ага тів 1 5 «2305 376 «Вії» З «2ї19з ВЕ «213» БНощо зарівгпх «80» ЗУБ їів Рго тТук век о вга Ахроуві сіп тів і 5 хх 377 «2113 З «Е1йи» РТ «2135 Нео зарівпх «4005 377 сіп Уа Аїд Ро Бго Уа! ів8ц і у5 АгО 1 5 «2105 378 «211» 8 «215» РТ «213» о Нопю зарієп5 «ЗУ 37
Тнг осів іуб5 АБ5п о Узі Кі дід АаЇд і ви 1 Б «230 379 «811» З «212 РЕ «213» Бо зарігпх «00» за чаї сі ув Узі Гуз РНе Аїда его гав 1 5 «310 з5а «211» 5 ках ВВЕ «21335 Нею зарівпх «НН» За чаії Бго вве зегоНіх дії А5па Ііє 1 5 «ЕІ З «23ї1х З «212» РТ «21325 Ношо зарієпе «а000х з51
Уві ча! Тук біп Туг ТкроаАяп тТаг ог уз і 5 «2305 353 «11 З «ій» РТ х»і3»х Новою бзарівне «300» 382
Туг ВБго бек о іуч бій РНе Азр о уді г ец 1 5 «г3Ох 353 «2315 З «212 вит «-213з Ною 5арівпх «-й0о» 353
Аіа АТа Ар Ар бек Аа Ар ог ув ді 1 5 «ВО» 384 «213їх» 9 «2125 РЕТ «713х Нопюо зарієп5 «ВНУ. 384
НІ Нія і біц уз зіп ТгоАхо Уді 1 5 «230 355 «211» З «212 РЕ «213» Новою зарівепх «НН» 385 уз біп Тк оавр чаї АЇв Аа сів ха! 1 5 «Вій» З8Б «231 З «212» вит «13 Ношмо зарієпь «Ох 355 їуз зек Аїа Ре РБго Аа бій Зег г уз і 5 «2305 3857
«811 З «вій» РЕ «215» Ношо 5зартейх «Ще З
Азп сін ча! Уві біп Уді Ні дія АЇїЗ і А: «7510» З88 «Віт» о «12» РЕ «213» Ново 58рпрієейпе5 «йо» За «ве бів Ахрогец Ап ої ух Ні Уві г ец 1 5 «2: За «Е3ї» З «212» РВТ «213» Новю зартенпа «поз Зо сіу біц тк оті Ніз тів Бго ТБг Мет ї с «ій» З «гії» З «12» РЕТ «21Х» Нонюе забієеп5 «ЩЕ 390 їі Бга уз Без АТа Баг Ако тів і ву з З «210» З «ії» 8 «212» РЕ «213» Ноно зврівйе «ОО» ЗІ сі Уа вуз їуз Рко ТВготїуз Аїд і ви і: й «2і10й» 382 «811» З «Вій» РЕ «213» Нове зартівп5 «397 іїуз Бір гу Рго Ар оБго А5подяп г ец і З «210» 393 «211» а «212» РЕТ «213» Ново харіейв «ОО» 3953 і Ма! Зек Біб Ага Тугоіви ТВк Мет 1 З «Рій» Зод «8115 а «212» РЕТ «213» Новю 5зартена
«Ох 394 іец о Бга за)! Ва А5о уз біц бій їер 1 5 «2105 395 «11» З «212 ВЕ хв1і3» Нощюо б5арівпя «00» З ч5 іем зак оїу5з гбецп ТБг Ар тів зіп Туг 1 5 хау За «211 5 «Роз вит «2135 Ношюо 5арізепх «-400з 3965
Азв'івец баг Ап тів КТ Ап іуз і ви 1 5 «0» ЗИ «231 11 «2185 РТ «713 Нопе зарієйв «Я» ОЗ
Ага заї тгро ар Уві оЇй бег обіу 5зег ів г у5 1 5 10 «210з 395 «21» В «212з ЕЕ «213» БНощо запівпх «в000з 395 его рго ТВготТВг обег Ні Уві бі дід 1 З «3» 3 «її З «212» РТ к;і3х Ноте зарієлй5 «а00х 399
Уві зіч тіе біц тук ві біц і Уу5 Тук 1 З «230з: 400 «11» З «212 РЕ хиї3і» Ново зарієйпз «8» 0 АЙ чаї СБ Ага дБп іУух ді їу5 Аїд ії ец 1 5 «З а «211 З «212» вт «2135 Нео зарівпя «4005: ав
Ага Ззіч Аїа Ууаї бЗег уз БІН Арі 1 5
«230 407 «2115 11 ко» ВВЕ «2135 Нею зарівпх «4005 402 тів мат бі Зі деп озек тів івп о Ніх Ззек АївВ8 1 5 10 «10» пз «2315 З «217» вВТ «213 Нопо взартелпь «400» 403 іувз піп РБе бій біу бек ТВг обек Ре 1 5 «2305 04 «В11» З «2325 ВВЕ «2132 Но зарівпх «ПО» АМ бім бі вве ви Ага біп біб нія РБе 1 5 «Вій» 4п5 «2115 10 «212» РТ «2135 Ношо 5арізепх «4005 405 бів тв отіе Рго бек обі тТіе біп уді Ре 1 5 120 «2105 406 «231 10 «2125 РКТ «213 Номо зарієйп5 «ЗП» Апв бін чаї сіу зійц Аіа гіеціу5з ТВг Уа г ец і Бі 10 «2305 407 «2115 8 «812з РЕ «213» Нощо зарівпх «40053 407 ух іви бів йзроівц біз бів зіп їв 1 5 «Вій» АСВ «21ї1їз Кк «212» РТ «713 Ноте зарієль5 «З Яп5 іеноіуз тів біп заг т1Т16е Аїд їй 1 5 «23105 «ра «вії 11 «219 ВЕ
«2132 Наша зарівгап5 «Ай» ап
Мет азп о Уді еп твгобіц тгрівн діа Аїд тваг 1 5 10 «НЕ 410 «21їх з «217з РЕ «13» Новою чарівне «а00м 810
АЗіа тів бій А5роіуз їен РНе іп Уді х Кк я в «30 411 «211» З «212» РЕТ «215 Ніво заріва5 «А 411
Ева Рго ад5п Ре Абр іух Оп оіц гер 1 5 «230» 8172 «211» 9 «212» РТ «2135 Ново зарієпье «400» 812 пціу біп тнкоїув пін уаї рей ові тів 1 КІ «230» 413 «11 а «212» РЕт «813» Ношо зарівй» «ані» 8153 іУу5 ів ІчІ1іе бій бак о тТВг озегб тТВгомеї х Кк й 7 «810 814 «211» В «12» РЕТ «213: Нео зарівгпу «АЛ» 414
Буч Бго Тук біп і у Уяі біу ген 1 іі «РЕ: 415 «1ї1х о «212» РК «а1їз Нав зарівпе «-400х 815 іуз біп бін 5ег тіє гаї еп іуз і г 1 5 «230» 415 «тії В «21 РИТ «2135з Ношо зартейх» «(ну 418
Ап Аїд Ап Ап Ак івм івн ге 1 5 «210» 415 «211» З кеійз» РЕ «ії» Ношо зарієп»5 «ще 417 зав бів тУаї Рг Ап бі їУу5 бін Уді 1 5 «віх 415 «Ккії» 5 «212» вит «213» Ношо зврівпх «Ой» 418
ТВг оАЗа Ав їіе сСіу бек тів Аїд дгд 1 5 «Вій» 419 «231» 9 «212» РТ «233 Нощо зартепз «ще 415
Ав о АЇа іуз біУу Ага твпгоУа)! заг ів і 5 «210» 428 «Рії» 8 «Рі?» Вт й «13» Бсово звпіепх «ЩО» 420 т1іе тів їуз Гуз гу БІічЧ Азрієц 1 5 «Рій» 421 «231 З «212» ВРВт «213х Нопюо зартіепь5 «ик: 471
Ачо ові т11е Ахр о УаДї уві сій АіЇвз і ев 1 5 «2105 492 «Дії» 8 «Рі?х ВТ й «213» Но хвпівепх «АСю А? іч бій вве уз Ті тТпкобЗег Ре 1 5 «ій» аз «231 В «2122 вт І «а13х Нопю зарівпь5 «бах 423
Зег Аз Ре бій іу5 ТБ ау вве 1 5 «210» 4284
«811» З «г32х РЕ «13» Нею заврігпх «00» 424
Ар оБіц Ахр Аго іец оігц Узі таї Ре 1 5 «1» 4Ар5 «2313 8 «В12» РТ «813 Нойю зарівпао «800» 425
НІ НІ бек Ахп зів Рго Меї зЗегоі вн 1 5 «2105 4256 «ії» З «23из ВВ «213» Ношюо зарівгпх «НІ» 426 іец РНе Рго бегоівц тів іу5з А5по і вц і 5 «Ох 427 «2315 В «ВІі2 РТ «2313з Ноте зарівпе5 «4305 427
АзпотТвг Аз тіе РБго хів біу Ап оіуз 1 5 «2105 ар хе1іїх 8 «2125 ВВ «813» Нощео зарієп5 «00» 428 5Зек Авр осів Уві Аіїа Азроієецн Аго 1 В «Зх 42а «В1ї1х З «232х РВт «213» Нею запрівгпх «00» 429
ТВЕ Ні5 Ре бег РБе Рго їев Акд ге 1 5 «Ну 430 «2315 З «12» рт «533 Нотео зартіепь5 «ЗдОх аа
ТЕготук А5робев чаї ТВг одер гу РАе 1 5 «2105 а хиїії» З «232» ВвВт «13» Нею зарівих
«Ай 431 діа січ Зак оївев Туб біц Бі Ака Рве 1 і «210» 432 «211» 10 «вій» вет «213» Новою зартепе «ан» 837
Ачв о біб Ре гей біу іев ТЕ НІ ТК оОтуг 1 5 15 «8310» 833 «-211з 13 «12з РЕТ «215: Ноша зартейпу «Асі» 433 діа їем о Ахр оре вне біу Ап біУу вро рго ді Ахпоту 1 5 10 «230» 434 «21їх 15 «212з РТ «813» Новою чарівне «аОйх 434
Аіз іен о А5Зо Ре Ре сіу Ап пі Рго Рго Уві Ап тубі ув ТВг 1 5 10 15 «23 435 «2311» 15 «212» РЕТ «21535з Ношйо зартей» «АЕ 435
Ар Ре РБе біу Ачп о біу Рка Рго уд! Аа тТук г ух 1 и: 10 «7320» 836 «211» 13 «212» РЕТ «213» Ноню зарієпе5 «Ай» 435 шт РНе вна пі1У Акт іх тя кт чаї вдня тую зт тек в;вр зв оБпе бі АБ обі Бго Бго уд: деп туго губ Ток 1 5 10 «2Мйз 437 «-21ї1х 15 «212» РЕТ «й13х Ново яарітапа «вн» 837
А«ро вве РБе біш А«п обі вро Бра Уді Аа туго іУух тк о біу двп 1 5 15 15 «710» 838 «211» 16 «12 РЕТ «215 Ніно 5зарівп5 «Ал» 438
Авровпе РНе біу Ази о біу Рро Рко Уві Ап о тук оіу5 Тк о сіу Ахп і вн 1 З 10 15
«210» 4395 к«1їх 17 «18» ВТ «й13х Ноео зарієпь5 «по» Аза
Азр о РБе РБе біу Азп о сіу Рго Бго Маї АзпоТуг гу Так о сіу Ап ген 1 5 10 15 ту Го «210 440 хЕіїїх 19 «2122 ВТ ха13х Нощме зарієпь5 «00» 440 іви іп Аід газ Ар о РвБе рве піу Ап Сіу Рго БгОо Уді Ап туго г ух 1 В то 15
ТВгосіу дек «210» 441 «їх 15 «212з РЕТ «13» Ново 5зарієпйе «по» 441 сів Аїа іен Ар Ре Рве біу Ап о біу Рко Рка Уді АБ тТУБ Гуз і 5 їо 15 «830 442 «211» 16 «212» вит «2132 Нощо запізпх «НН» 445 біповго вро Ні біц Тук уді Рка Ткроуаії твер оУуді Ап обіу іуз вка 1 5 10 15 «230» аз «Р3їМ 85 «Рій» РТ «2335 Нота 5арізпз5 «400» 443 бегорго Геч о біп АЇва ев Ар оБве вйе сію АБп обіу вго Рко ді Ав 1 5 10 15
Тут ух Тк о сіу 2о кій» 484 «231 81 «212» ВНТ «З3» Ношме зарієпь5 «адОх 444 век оБго іївец обіп діа ген А5р оре вАйе обіу Ап біу вго Рго Уді Ав 1 5 1 15
Туг іу5 Тк осіу деп «210» 445
«вії» 23 «Ріг» РЕ «13» Ново хвріевпь «Ой» 445 заговго івц о біп Аіа ів АЗр бе Ре біу ад5п обі Рво Рго Уді Ап 1 2 12 15
Тук ух тк осіу Ап і ву тТук го «Раз 4465 «ккії» 15 «212» РЕ «13» Ношо запітавп5 «Ой» Я4б зі Рго Вго ВНе бвгоЗеє 5ек о бів бЗег тТіа Бго Маіїф ді РгО Аг 1 5 18 15 «ій» 445 «211» 14 каі2» РЕТ «і3х Ношо заріенпе «поз 447 іер о РБго бег оХег іец Меї А5подяп о іец о Бго Аа Ні Ар Меї 1 5 10 «ві1йх 445 «21т» 15 «212х РЕТ «вії» Ноеше заріейпе «щах 448 іеч Рго зекозЗегоіец Мет Ахп Аза іец Рго Аїва Ні Азр Ме бін 1 5 18 15 «ге 445 «ії» 16 «дій» РЕ «213» Ношо зартвнве «абййм 445 їев Рго бег о Бег рай Межї Абзподеп о іви Бго Аіа Ніях Азр Меє бів і ец 1 з 12 15 «кій» 450 «21їз 1; «212» РЕТ «1іЗ» Но зарівп5 «ас» А5О зак Рга тіе біу бій їі бів Рго івц оЗек о Рко біп Бго бек Аїд Рго 1 З їй 15 тів «2105 451 «ії» 19 «12» РЕТ «215» Ноша зартейп»ь «АС» 451 дзробіц Удаї тВг Бій Рго Ре Уві тт Ар обіц їу5 ТБ АТа сі те 1 З 10 15
Ага «Ох 455 «21їз 18 кхвій» РТ «233з Ното зарізп5 -400з 45 у Тук Рго Сів іен узі ви Ахрофу5 Аа ів А5а АгоО Бін бін АкЯ 1 5 10 15
Бго 51 «10» 453 «ії» 15 «тож РЕ «2333 Нампо заріепе «00 453
Уві твге обій Бго РВе ува! Ті Ахвобіб бу ТВг о АТа бів т1е дра 1 5 185 15 «210» А5А «23їх 17 «18» ВТ ха13х Новю зарієпь «ЗПОх 54
Азроаіїх Ага тве лів сві Азроїев бів сіу ТВгоБго Уді Уві бег Бго 1 В 10 15
АзЗо «210» 455 ха1їіїх 18 «212» РТ «813» Нощо зарієп5 «300» 455
Азр сіУ Ага тТвг оті Уа Абврогац бі біу тТВговБго Уді Уді бег о вБго 1 8 10 15 азо о БіУ «РІ» 436 «21ї»х 14 «їх» РЕ хиї3х Новою зарієпь «айс 456
Азроііуя« Рго тів іву бегоївец біу Біу губ5 Рроа іван о Ууді Пі 1 В 10 «230 457 «211» 18 «212» вт «2135 Нею зарізпх «300» 457 бІ1У Авробіу ак тТБг оті Уві азрієц біц біу ТВг оБго Узі Уві баг 1 5 18 15
Бго дер
«21» 45 «211ї1з 19 «12» РЕТ «215» Ніво зарівп5 «АП» 458 біу Ав оіу Ага тТвготів Уві дар огіец бів біу ТВгоВго Уді Заї бег 1 5 10 15
Рго Азв біу «ій» Я «г1їх 19 «21» РДТ «215з Ношйо зартей» «ап» 450 пі сіу аА5робіу Ага твВг о Бівє ві Азвоіви бій біу тк о Бго Уді зві 1 2 їй 15 5ег Рго Ар «іп» ако «211з 20 «12» РЕТ «2135» Неша зартепу5 «Ме 450 біу бік Азробіу Ага тк отіе Уві А5роівен о біц біу Те обго Уві ді ії 5 їй 15 бек Рго АБробіу га «300» аді «11 11 «12» МА «213з Ношо зарівй» «АЮ 451 пеіУуйотУуя й «230» ав7 «211» 16 «212 РЕТ «213» Ново зхврієеп: «ща» 452 і ха! уз бій Тук Ііе іви бек оТук Ата Вго дів іец іу5 Вго Рав 1 З 18 15 «210» 463 «31» 15 «212» РВТ «213» Нове зартенпа «апоз 453 іуз Уві Гуз біц тук хів ів озег тТук Аїда Рго дія ій іїуб5 Рка Ре її 5 18 15 піу «2107» 464 «231» 1 хто» РТ «23133 Нащо 5арігпе «оз аа іецп зі 61у Ачзробіу Ага тТВг оті Узі АБЗ оіен бі біу Твг орга тд! і 5 10 15 чаї бак вго Аб5Ба біх го «у 465 «211: 15 «Е1йи» РТ «2ї3х Ноще зайівпь5 «400: ав
Ага Тнгоніз сід 112 гу уз іву Аїа зег о біц бак озаї Туг ді 1 5 10 1 «2105 або квіїх 15 «21ї2з ВБЕТ «В13» Нопю зарівних «ЗНУ. бе чаі іуУуб5 бін ТУугб тів іви хек тТуг Аїда Рго ліз іец фу Рко РБе і в їй 15 «з абу «21ї»5 13 «2ї12х РЕ «213» Бо зарігпх «4002 457
Туг 5зек їуз ТВг осів тує Азп о сіп да) Вго бек обі Ар ве бін Ага 1 5 їз 15
ТНг вРго бів «530з 458 «2115 16 «212» вит «2135 Ношщо зарізпх «005 ав
Ата АЇва Вго АБпоівц бек Ага Меї біу АЇва їі Рго уаї Мет тів Рго 1 5 і 15 «210» 465 «231» 17 «2155 РЕТ «213 Нощо зарієп5 кМоз 469 діа Аїд Рго Аяпоівб его дгу Меї біу АТа т1іе Рго Уді Меї тів Рго 1 5 10 15
Аіа «10» Ай «211» 15 «217» РТ к7і3х Нотео зарієл5 «ЗО» 470
АіВв РБго Ап оїец баг Аго Мет бі Аївз тів Бго Узі Меї тів РгОо
І Б. 15 15 «ій» а/1 «21ї: 16 «к1гу РЕТ «213» Ноше заріейпх «АЦЕх 4уї
Аід Бго А5п о гец обег Ага Меї біу Аїд тів рго ві Меї тів Рго діз ї З 15 15 «210з 472 «вії» 20 «212» РЕ «ві13» Ноню зарієйя «Ой» 472 сбіу Туг зек офїуз ТВг Осій тТук Аз соіп Уа)! вро зако 010 Абро Ра 1 1 З 183 15 дра тпг о вго бів й «210» 473 «її» 15 «217з РТ «212» Новою звріенпе «800» 473
Явгогух ТНК обів ТуУук Ази біп Уві Рро 5вгобім Ар РВе січ Ага 1 з 10 15 «21» 474 «11» 17 «2125 РЕТ «2155 Ніно 5арівп» «АСУ 494 зек фуз ТВг о біп тук Ав оіп о Уді Бго бек обі АбЗробБпе біб АКо ТЕ 1 5 1 15 рга «кій» а/5 «11» ІК «вій» РТ «213з Нопо зартепз «В 475 зав о фруз ТВгосій туго Ап іп ові Бго бек біб дяр ва біз Ака таг ї Ко 12 15
Рка сій «іп» 476 «211» її «2125 РЕТ «2135: Ново 5зарівп5 «апйй» 476
Уа? Аїа Аїда Рго Ап овен обег Ага мет біу Аїд тів Рго Узі Меї тів 1 з 10 15
Рго діа
«30» 47 «23ї1х 12 «2195 РТ «7133» Нопо зарієй5 «ЗП» ААУ
Ууаї її Ії грец Тук зег біу Ар ув ІТе Туг Авр 1 5 10 «230з 475 «211» 16 «212» ЕЕ «2Іі3» Новю запівпх «НМ» ук
Тук бак о їу5 ТВг обій Тук Аза бій Уаії Бго зако бів А5р опе бів дга 1 З 103 ї15 «Еї10» АТО «231: 15 «212» вит к»і3х Ноше зарієп5 «а0йх 479 їуз Тук Рго бід ів ува! із Ачзроїуз Аїа ем Ар Ага іч вій АгОа 1 З то 15 «2105: а «Ії 19 «ій» РТ хиї3х Ново зарієпь «а» АдО біу і5 їен РБе дід ем о АгО его оїец Ахротуг бін і 5 10 «Ех АВ «711» 16 «212» вт «2135 Нео запізвпх «пз аді
Аіїа Аіа біцшц Рко сСіу ТтТук о іви Ууді тб обуз Уві ді Аіа ха! А5робіу 1 5 10 15 «ВО» 482 «23їх 17 «212» РЕТ «213ю Нове зарієй5 «8(Нує 452
Аіїа діа бін Вго Сі тує Ген омаї ТакоБує Уді Маї Аіа Уа! А5рос1уУ 1 5 10 15
Аво «105 483 «21ї1»х 18 «еі9з ВТ «813 Ноте 5арівп5 «Зх 483
Аїа Аіа січ Рго бі туго їеч Уаі тик ову5 худ) Ма? Афіа ха! АЮ бу і і. 10 15
А5р о зег «230» Ада «21ї1х 19 «21» РДТ «21353з Ношйо зартей» «Ой» Я84
Аів Аіїа бів Рго біу Тук огвуч Уаі1ї ТВкоїув Уві Уаії Аїв ді Авао біу 1 5 ї0 15
Ар Зег віу «210» 485 «231» 15 «212» РЕТ «233» Новю зартепз «Ме: 485
Аіа бін РБка біу Тут ів ба! ТВг ої у5 маі Уві АЇз Уа Ар сію 1 5 їй 15 «81» аб «2112 16 «812» РЕТ «213» Ново зарієпе «ща» ака діа бій Рго соі1у туго івуи Уа тТВг ог уз Уді чаї АЇа хаї Ар б1у АзЗо 1 з 10 15 «2115 487 «31» 17 «212» РВТ «213» Нове зартенпе «поз 87
Аівяа бБіц вго 6біу Туг оіен узі ТНгоі ув са) Уві Аіа Уаї Ар о БіуУ Ар 1 5 10 15 заг «21п2» АВЕ «831» 14 «2125 РТ «233» Ново зхартапе «вон» 85 бів вБго віу Туг іец саі ТНгоїух уді зві діа Уаії Ар біу 1 5 ії «21» аа «-211з: 15 «12з РЕТ «213» Ноша зартейпз» «Аді» Аа піц бга бі Тугкоівц оУді ТК оїуб5 уві ді Аївз Уа А5зоробіх Ав 1 і: 10 15 «230 90 «А1ї» 16 «219» вт «вії» Новою зврівейпе5
«адох ача зів вго біу Тук бан од! ТК оїув уві баз Аза Уа АЗо о біУу Ар зве 1 5 18 із «г10з а5іІ «11» 14 квійх РТ «15» Новю харівпх «002 ЗЕ діа бів Бко біу Туг ів ба! ТВгоїУу5 Уаі Уві АТа Маї АЗв 1 5 їв «и» ап; «ії» 16 хк12х РЕТ «йі3» Ноше зарієейп5 «ад0х ач авіа АБО бег те сів РБе Ага Бго А5п АТа Рго Уві Бка івцч ді рів 1 З 10 15 «210» 493 хкіїх 15 «212» РТ кхй15» Новю 5аріапа «ЗУ» 493
АТа Ар озек ТВгобін Вйе Ака Рго Аза Аіа Бко чаї Рго іен оса! тів і 5 10 їх
А» «10 4954 «211» 17 «кав1?х вит й «2133 Нашю зарівах5 «00» А дер о аів Азробег тпг обі РБе дго Рго Ап Аа Рго Маї Бго гей худі 1 5 ї10 15 тів «г10з а5ь «21ї1» 18 «к«212х РТ й «2135 Ноно зарівп5 «400» 495 дер аів Азробег Таг обі вве дго Бго Ахп Аа Бго Маї вго гей Уді 1 5 їв 15 тів А5о к1йх ач «е1ї» 13 хе12х РЕТ «2135 Ношо зарівпх «400з 495 авр о Аїа Азр обБег тк обіц Ре Ага вго Ап Аїд Рго Уа рр г еу зді 3 5 10 15 їі АБр Мат «2105 497 «ії» 20 «23аз ВЕ «213» Нощо зарівгп5 «300 437
Азр о аіа Азрозег тк Осій ввБе о адгоа Рго Ахп о Аіа вБго Уа Рго іец худ! 1 5 10 15 їіїе д5ор Мет го «210» 495 хіх 21 «212» ВВТ «ВіЗ» Ното зарієне «НН» АчЕ
Ар АіЇв АЗрояеє Твгобім вве дго Рго Ахп Аіа Бго Уді Рго фев уві 1 5 10 15 тТіе А5роМет Рго бів 20 «23105 498 «Ії 13 «232 ВЕ «213» Ново зарігпх «80» дя
А«робак те біз РБа Ага о вго Авп діа Рго уаї Бго ії ви 1 5 10 «210» 50й «211 14 «Е1йиУ РТ «2135 Нею запівпх «4005 Зоо
Азр зак ТЕ бі) Бе Ага о Рго Ахп о Аіа вго Удаі Рго ген Уві 1 5 10 «105 01 «231» 15 «21» РЕТ х«а13х Нощмео зартієпь5 «Ву ОЗ
АхроЗак ТВгобіц Ре АвБа Вго АБ Аіа Рко Уаї Бгао гвец о Уді Ті і в їв 15 «2305 502 «Ії» 16 «2ї12х РЕ «13» Бо зарігпх «003 302 азр о зек тТВк обі вБе дра рго Ап дія вго Узі Ргоа ген Уа! тів Аза 1 5 16 15 «Ех 503 «231» 15 «212» РТ «813 Ноше з5арівпз
«00» 503
Ар озак о тТВг о біц вне Агя Рко Адлп о АфЇа Бго УаіЇ Рго івен о Уді Ііє д5р 1 з 10 15 мет во «21» 554 «11 15 «2125 РЕТ «?15» Нінво зарівп5 «АК» 504
Аврозаек твк осів вве АгЯ Рго АБпоАіа Рго Уа! Рго ігец о Уув)| тів АБО 1 з 10 15
Меї Бго бін «аї1йз» 505 «211» 19 «12 РЕТ «21ї» Нешо зартіейх» «Ас» 55 уз Аза АЇв Азробек Те бів Ре Ага Бго Азп о АЇя Вго Уді Рко і ец 1 Ко 10 15 чаї тів АБр «210» 536 «211з 17 «12» РЕТ «213» Ноша зартей5 «АС» 506 «ак Тапг обі ББе Ага Рго Ап Аа вго Ууді Рг і ви 1 з 10 «210» 5037 «гії» 14 «219з РТ «13» Новю зврівп5 «400пх 507 авг о тТаг обі вве Ага Рго Ап Аїва Рго ді Рго ів уві Те 1 З 13 «21й» 508 «211» 15 «1?» РЕТ «21353з Нойо зартівй5 «ай 505 ак о ТВко0ів Ра Ага о Бго АБподія Рго ді Бво іїец о Маї ЖІ1в АБр 1 и: ід 15 «210» 505 «2112 17 «212» РЕТ «213» Нова зарієпз5 «АК» 503 -вготТВг обі РБе Ага Рго Ап о Аіа Рго Уа)! Бго ів уві ІТе Ар Мей 1 х 10 15
РКО
«3 5:18 «211» 15 каїйх РЕ «2135 Нео зарівпх «ВМ» 531
Аіа біУу Азротуг тб Бі Аїд дБп Аїд Аг іх ів тів Ахробів ії 5 15 15 «ЕМ уя 511 «231 З «Вій» РТ «233 Наю зарієпе «ах 31 січ тТнг їз біб Аг івн бій бій г 8 1 З «2105 з12 хиї1ї» 15 «еі93з РТ хаї3х Нолю зарієне «300» 0512
Аїа Ар тів ТВг отТуг АЇв тів пі Аа А5робЗаг Бі 5его зді Рг ув і 5 10 15 «23Ох 533 «Р1ї» 14 катом РТ «213» Нощо 5зарівпх «-4005 513 азротіа Те туго дія тів бій АЗі8 Азрозеє бій бак оєаі ув і 5 10 «310» 514 «23їх 15 «212» РЕТ кй33х Нопо зарівп5 «8(Нує 514 їУу5 Акод азроАхп Тук сій тів фу Уві ма! Аїд 5ег Ар Ні біу бій 1 5 10 15 «2305 535 «11» 17 «віїйМ РЕ «13» Бо зарівпх «Зп00» 515 1їу5 Ага Азроавп Туг біп 11 уз чаї Уа! Аіа бЗеб о дер оНіз біу бін 1 5 10 їч іх «в30х 515 «вії» 15 «232 ВЕ «ВІЗ» Новю зарівпх «б 00515
АГРО Ахробів бег РБе Узі ІТів А5роага біп озЗек 0іу Агд івц фі ув
1 Б 10 15 «й 517 «21ї» 15 «212» РВТ І «213» Ною зартенпе «ау 317
Ака Аз о Азп о Тук сій 118 іух Ууді УЗ АтТа б5ег Ахро Ні зіу Бій ї 5 10 15 «ій» 518 «211» 15 «212 РЕТ «213» Номо зарівейпх «ВИЩк» 518 зек оБга бег сій іецй АЗзр Ага А5роБго Аїд Туг АТа тів Уді тВг 1 х 10 15 «ак Зі «2315 17 «210» РТ «Кі3» Но хапігиач «-2005 з18
ТВговго Бго біп РБе зего5зек оуді іу5 Уаї тів Ні ар твг о б5ег Рго ї 5 12 15 сів
ДТ НУК, «2115 15 «210» РТ І «233» Нопюо зардзтапе «а З
Уаї вго івц о Бга АЗор її бів біц ББе вро АБ тус ї 5 12 «2105 5921 «21ї» 15 «212 РЕТ І «213» Но зарівпх «Ак» Зі сім Бго сів бе вне Ніз Мет А5роБго Зак осіу Те Ре Уді бій 1 5 10 15 «ЦЕ за «2315 17 «212» рРЕВТ «13» Но хапігпч «200 з92
Азр ув Ап о Туг РВе зі біу пгосбіу туг Аїд Ага Уа! го таг о оїпйВ ї 5 12 15
Рга «акт 523 «2115 18 «212» ват «133 Нотю зарівп:5 а У
АБрогух Аа туго вна біз сОіу тВговіу Туг дід дго Узі бго твгобівй 1 5 10 15
Вго Ні «віх ва «21їз 15 «ві2» РЕТ І «іх» Нсщтоа запрівп5 «Ай» 5иа 35зробег іув Рго їец о Туг ТК оРко Зег 5ег бек ББе бі ха бек 1 5 10 15 «23 п» 5275 «ії» 15 «21їз РТ , «213» Ното зхапзтепе «ай» 595 тів зів АгРа біп УдТ іу5 5 тів Ап баг ово бій бак о Азр вве Те 1 З 18 1ї15 «гій» 520 хргії» 14 «12» РЕТ «2і5» Ніна зартіей»ь «АП» 59б іх5 Аза тТук Ре бій о біу ТБбобіу тук Аїд ако ві РБго Твк 1 5 10 «ій 597 «211» 16 «Різ» РЕ «ії» Ново хвозепь «Ай» 52 іуч Ап тТук о Рве сіц бі тб обіу тТуг Дід Ага УВІ РБка о тВгобів вго 1 5 19 їх «Рій» 538 «211» 15 «Вій» РЕ «213» Нощо харівзпе «Ой 595 іув А5п тує РНе бій біу ТБгобіу тук АТа дго заії Бго ТВгосіпй Рго 1 5 ії0 15
НІ
«ЦЕ 599 «21ї» ІВ «212» РВТ «33» Ношто зартівнпа: «а» 52 бег Рго Ага Уаї Уді Рго деп обій бек о Тів Рго ті Ііе Рго тів Рга 1 5 12 15 «210» 530 «гії 17 «212х РЕТ І «ій» Нео заріейп
«400 530 пековго АгеЗаії Уві Бра Ай о біц Зек Тіе Рго Тіев тів Рра тів Рго 1 5 1 15
Ар «Вій 531 «211» 15 «12» рт «533 Нотео зартіепь5 «300» 531 зек о зек Рге Ага о Уді Уа! Рге Ахп біб бег тів Рго тів тів ко 1 5 10 15 «2105 533 хаїї» 17 «23из ВвВт «2813» Нощо зарівгп5 «НН» 53 5ег бек Рго ага Уа! Уа! Рго ап обін бек 1і2е Рго ті Біє Рко Ії і Бі 10 15
РКО
«230 533 «21їх 18 «212з ВТ «Віз» Нопю 5арієнз «0» 533
Зег бак о Бго дго Уаі Ма! Рго двзп обіц бек о їів Бгро Ті тів Рко Іїв 1 5 10 15
БКго А5р «2305 534 «її 16 «232» ВЕ «213» Ново зарігпх «ЗП» 534
АзроАвроіув зі Ту ТНкКоїен Меї Ніх Рго бего овен ТБг Ага Рко Туг і 5 10 15 хом 5135 «231» 17 «ій РТ «2132 Нею запівпх «4005 535
Азр о Уаї біу січ АіЇїа віу Тук уді ді ТБг їі бак о ніз ТБ тів Ні 1 5 12 15 хег «В» 536 «21ї» 13 хід» РН «23135 Ното зарігп5 «4а00х 536
Іі Аїа біу Туг УВІ Уа! Тк оті бек НІ Тйг тів Ні 3 5 10 «еі0з» 337 «811» 14 «232з ВЕ «13» НОощо зарівпх «00» 537 бі діа біу туг чаї Уа! ТВг тів бЗаеконНіз тТвВг от1іе Ні бек ї 5 10 кеїОх 5315 «ії» 14 каїйих ВВЕ «із» Ново зарівепх «002 538 сіу віУу Аїд біу ту узі Уаі тпВгозів баб Ні ТВготів НІ ї 5 10 «гій» 539 «231» 15 «12» рРНТ «кРі3х Ношмо зарієпь «З0с0х 539 сі сі Аїд о біу Туг Уа! ді тТаг отіе бер нія Твг оті Ні 5ег ії В 10 15 «2305 з4а «11» 16 «232 ВРЕТ «ВІЗ» Ново зарівпх «а00з 0 54о
Заї біу сі дід біу тук о Ууді Уа! ТВгоОтів Зак оніє ТВг оті Ні 5вг і 5 105 15 «іх 541 «211» 18 «Вій РН «г13х Нощео зарівеп»5 «адох 541
Меї тТнгоАгяЯ пВговБе Ні Ар оіен бів зіу а5п Аза таї бу Агар Ар 3 5 10 1 чек біу «ЕК у» 545 «ії» 13 хеі2х РН «213 Нею зарієпе «400х 547 акоа тТвг о РБбе Ні АЗроівновіц біу Ап Аа ді г Уу5 Аго ії 5 103 «210» 543 к«21їх 15 «е1і3з5 РТ х»іЗ3х Ною бзарівне «300» 545
Ага таке о вве Ні АЗроієц бів зЗіу Ап о АЇв Уві бує Ак Ахр бак Б1У 1 5 ів 15 «ТІ» за «її»: 15 «21» РЕТ кйі3»х Ноште зарієп5 «400» 544 пекосфу ТВг овББе вве Бкго Тук обер бек о а5п о Рго АТа Ап врго вух ї 5 10 15 «21053 45 «11» 16 «212 РЕ «ві13» Нощо зарієй5 «ЗО» 545 5ег бі ТВгоРБе Ре Рго Туг его 5ег Ахп о Рго Аія А5п о Рго ув вго 1 5 160 15 «нує Зав «2115 14 «212» вит «2135 Нео зарівпх «4305 346
ТВгоАга тТБбеоББе Ні Авроіви біб Сбіу А5п о Аїд Уді г уз Ага 1 5 10 «В» За «213ї1х 8 «2125 РЕТ «213 Нощо зарієп5 кп» 547 тів ті тВгобзіц Узі хів ТТГ о Агоа і ви 1 в «210з 548 «211» З «2125 РЕ «2135 БНощо зарівпх «а00з 545 іу5 Меї тів чек діа Ті Рго ТВгоїец 1 5 «В10» 545 «213153 З «212» РТ «813 Ноще зарівп5 «ОО 349
ТВготуг заг о біц іуз ТЕ Тр оре) вАйв 1 5 «230з 550 «11» З «212з ВЕ «213» Бющо зарівгпх «ЗНУ» зай
Аїд іви іен Бго Аїд ба! Рго чего івц 1 5 хевх 551
«115 З «Рій» РТ «13 НоОошо зарівпа «ах. 51
Оіу алко дбзп оБег о Бе бів Уа! Ага уді 1 5 «кій» 552 «Дії» З «А12з РТ «віх» нНоОошо зарівпх «Ай» 557
Ага Бга тіе Бен Тк ті тів тНгоїец 1 5 «23» 555 «кії» їй «212» РЕВТ , «13» Ношо «аптапе «бах 555
ТВг оТуг о звкоРко діа іен Ап іуз Мет РБра 1 5 18 «вій» 558 «21» Ії «125 РЕВТ «213» Ноша зартепь «ап» 554
Те Тук їв оРго Тр оА5а Аїз бЗег оіви зак РБе 1 5 їй «23ах 555 «ії» 5 «219» ВНТ «213» Ножо 5врівейх «ой» 553 бі маї Ве о Ака сіУу ІТ1іе бій АЗр о Уві 1 5 «ій» 556 «ії» З «Рій» РАТ «233» Ношо 53р1епе «ах 556 іец Меї бвгбомаі Тук уві Уа! біц і ви 1 5 «кій» 555 «Дії» З «2125 РВК «2135» Неша 5арівп5 «АП» 555
Зіп Ага Ап Меї ТБг іух вн бБіп і вец і 5 «23 555 «ії» 5 «ії» ВНТ , «13» Ношо заптаевпе «вадах 558
АБО Меї Ре го Ап дід рго Туг і ву х Кк. 3 2

Claims (29)

ФОРМУЛА ВИНАХОДУ
1. Пептид, придатний для лікування та/або діагностики раку, довжиною до 30 амінокислот, що містить амінокислотну послідовність зЗЕО ІЮ МО: 1 та/або 2, або його фармацевтично прийнятна сіль.
2. Пептид за п. 1, що має загальну довжину до 16 амінокислот.
3. Пептид за п. 1 або 2, де пептид включає непептидні зв'язки.
4. Пептид за будь-яким з пп. 1-3, де згаданий пептид є частиною злитого білка, зокрема який містить М-термінальні амінокислоти антигенасоційованого інваріантного ланцюга (Ії) НСА-ОВ.
5. Пептид за п. 1, що має амінокислотну послідовність, вибрану з 5ЕО ІО МО: 1 та/або 2.
6. Т-клітинний рецептор - ТКР, придатний для лікування та/або діагностики раку, що реагує з лігандом НГА, де згаданий ліганд складається з амінокислотної послідовності, вибраної з БЗЕО ІО МО: 1 та/або 2.
7. Т-клітинний рецептор за п. 6, у якому зазначений ліганд є частиною комплексу пептид-МНО.
8. Т-клітинний рецептор за п. 6 або 7, який є розчинним або зв'язаним з мембраною.
9. Т-клітинний рецептор за будь-яким з пп. 6-8, який має додаткову ефекторну функцію, таку як імуностимулюючий домен або токсин.
10. Нуклеїнова кислота, що кодує пептид за будь-яким з пп. 1-5.
11. Нуклеїнова кислота, що кодує ТКР за будь-яким з пп. 6-9.
12. Нуклеїнова кислота за п. 10 або 11, яка зв'язана з гетерологічною послідовністю промотору.
13. Вектор експресії, здатний експресувати нуклеїнову кислоту за будь-яким з пп. 10-12.
14. Рекомбінантна клітина-хазяїн, що містить пептид за будь-яким з пп. 1-5.
15. Рекомбінантна клітина-хазяїн, що містить нуклеїнову кислоту за будь-яким з пп. 10-12 або вектор експресії за п. 13.
16. Рекомбінантна клітина-хазяїн за п. 14 або 15, яка є антигенпрезентуючою клітиною.
17. Рекомбінантна клітина-хазяїн за п. 16, яка є дендритною клітиною.
18. Спосіб отримання пептиду за будь-яким з пп. 1-5, де спосіб включає культивування рекомбінантної клітини-хазяїна за будь-яким з пп. 14-17 і виділення пептиду з клітини-хазяїна або її культурального середовища. Зо
19. Спосіб отримання Т-клітинного рецептора за будь-яким з пп. 6-9, де спосіб включає культивування рекомбінантної клітини-хазяїна за будь-яким з пп. 14-17 і виділення Т-клітинного рецептора з клітини-хазяїна або її культурального середовища.
20. Активована Т-клітина, придатна для лікування та/або діагностики раку, одержана способом, який включає контактування /л уйго Т-клітин з навантаженими антигенами молекулами МНС людини | або ІЇ класу, експресованими на поверхні придатної антигенпрезентуючої клітини, протягом періоду часу, достатнього для активації згаданих Т-клітин шляхом набуття ними специфічності до антигену, де згаданий антиген є пептидом відповідно до п. 1 або 4, який селективно розпізнає клітину, що презентує поліпептид, що містить амінокислотну послідовність, визначену в будь-якому з пп. 1 або 4.
21. Застосування активної речовини, вибраної з групи, що включає пептид за будь-яким з пп. 1- 5, ТКР за будь-яким з пп. 6-9, нуклеїнову кислоту за будь-яким з пп. 10-12, вектор експресії за п. 13, рекомбінантну клітину-хазяїна за будь-яким з пп. 14-17 та активовану Т-клітину за п. 20 в діагностиці та/або лікуванні раку.
22. Застосування активної речовини, вибраної з групи, що включає пептид за будь-яким з пп. 1- 5, ТКР за будь-яким з пп. 6-9, нуклеїнову кислоту за будь-яким з пп. 10-12, вектор експресії за п. 13, рекомбінантну клітину-хазяїна за будь-яким з пп. 14-17 або активовану Т-клітину за п. 20 у виробництві лікарського засобу проти раку.
23. Застосування за п. 21 або 22, де рак вибраний з групи, що включає рак яєчника, недрібноклітинний рак легенів, дрібноклітинний рак легенів, рак нирки, рак головного мозку, рак товстої або прямої кишки, рак шлунка, рак печінки, рак підшлункової залози, рак передміхурової залози, лейкоз, рак молочної залози, карциному з клітин Меркеля, меланому, рак стравоходу, рак сечового міхура, рак матки, рак жовчного міхура, рак жовчних протоків і інші пухлини, які проявляють надмірну експресію білка МОСТ16, з якого походить пептид з послідовністю 5ЗЕО ІЮ МО: 1 та/або 2.
24. Фармацевтична композиція, що містить активний інгредієнт, вибраний з групи, що включає пептид за будь-яким з пп. 1-5, ТКР за будь-яким з пп. 6-9, нуклеїнову кислоту за будь-яким з пп. 10-12, вектор експресії за п. 13, рекомбінантну клітину-хазяїна за будь-яким з пп. 14-17 та активовану Т-клітину за п. 20, і фармацевтично прийнятний носій.
25. Фармацевтична композиція за п. 24, яка додатково містить фармацевтично прийнятну 60 допоміжну речовину і/або стабілізатор.
26. Терапевтичний комплект, що містить контейнер, який містить фармацевтичну композицію за п. 24 або 25 у розчині або у ліофілізованій формі.
27. Терапевтичний комплект за п. 26, який додатково містить другий контейнер, що містить розріджувач або розчин для відновлення ліофілізованої композиції.
28. Терапевтичний комплект за п. 26 або 27, який додатково містить принаймні ще один пептид, що містить послідовність, вибрану з групи від ЗЕО ІЮ МО: 1 до 5ЕО ІЮО МО: 549.
29. Терапевтичний комплект за будь-яким з пп. 26-28, який додатково містить інструкції із (ї) застосування розчину або (ії) відновлення і/або застосування ліофілізованої композиції. А в ВАВ ВАС вих Шн хх | й аю; що ння - допйрояхісний зечиек і І |: В І й галшинневи з чо ши КИМ пиши ше . ! фалленієви труба шої ' - Гек І М зву Ши з шо бю. п : ЖЕ ве ож Р кт но | І пак зечника НЕ лиш ! ми шк хх КН во ' : : о В, і -к і а ш ІЗ - км, 5. - нини я їе ро "Дис НИШИННИ о, о. : Ко фо І : Ж ВІ, ті : ше ія х я І: 4 не М . за З . я жі чині й. шк : , ; щ що сшожо що Сщох ш Ж вЕ Ж Ш ШО б вк ЕВ ВЕ 5 Б ВЕ ЕЕ я ОО ШОЖ до пі що шо БЖ дав БУ В од Вк ро. 3 Дощ - ре кое в ИН К Б - п ж о Фіг
А ше ! ! Й шк о У : НИ ії: ши. ж КРУ хо лопуюжейстх дев У суші ат ща МКК ЩО: НИ п і ЕН ЩОХОЩо до |ефрееессссос ВО ЗО ВО ЗНАВ МАХ м они юю м ЖТЛІЖ ШВИ ЖИ МЕЖ ЕС ТЕТ ! ЕТ ши ни ши ЕЕ БЕ щи в. Ж ніс БПихоуднох артку; ліана БОЇ вом МЕ мств
В. ча ше» У ох МТК онсех Мексики еще ЗАМ ОЕБЯЕЯІ еще КЕ Кока кет» во манні МО КН нь, п Еко КК В » ; Мроеее ЕМО ЕЕ ККЗ хх АК КК МКУ зве ще яким МН ня ско ша ЗК ненке КІ ЗО не ОКУ БО ес МЕМ М КИ Ох ек ях КВ Б»
с. КОВО М кдюв ще з - по
Г. "с Г. ї їй кої МОВИ м дийрехкму джек ша | ща І ВЖЕ с, Е х Е 2 Іжа КК КККТК В ее ЯН ВЕН нь нн хх йо БИЛОДЕЕ ЩІК ШОЕ ї в В ПООШМИ ШЕ ОК Е ОщЕ ШІ т тнкнкш ООЛИП ОВ Ж ЖЖ ОМІТІ ЕВ ПОЛЕ ЕІ 5 ю нини - ни и - поОжО ? НЯ Си : їз Вихідні й ліканлів НЕО В каєж . В й їв НАШ м МОХ й У ера, пан ХО мн ваше іі дна ев Мн тя це ке пів М ут ная тк в ван ВХ ТМх
Фіг. ДЖ Пухлива Строма Пухлина че пи: ик : : нм Е 1 ТВ) щи ' - Я: ту з ца й: Бе дм от, : ие ти ; : ЕОМ КЕ орі ши ш п с бра - ни з ВЕ ж чі - мя ки к М с ій Ще т БО Ж зх вол у ее й я Ф як шо сказ г пе п и ННЯ КОЖ й 7 пада и хх Ж, че ї . ДЕМО С ОА, ши шо г ОК яв ЕЕ : тт СПИТЕ ВКА В Й пи ЛК М У ЯН : и ен В т Щ ши як ШШ Е 1556 Яке о ЕІ ак СОЖТКИ Я КЕ шк МЕ Хе вот ан Ол у ден, В КВУ Ту ме ЦИ ШЕ Ше М 4 ша фоскаечкйстки ки КК Анни кячникнтик м сокакінкижнни ЕММА кю ожианчк ие 2-й КОЖНЕ г й кВ Ра й : Рх005 ШИ МК ох хо ййх Ох Шок Шк й ж щк Розмір пулу ефекторних. Розмір пулу ефек торипях клІТИН КЛІТИН іспіВВІДНОШеННЯ) іспіввідношення)
Фіг.З д. МОС16 (СА-155) МО В В НК В В В В в у 5 о с КО Зо ОО я о о В . В ОКХ В В В В В В В т ОХ УК ОО, ОК А САКЕ хо с . СА о М М
НН. с с 3 пп хи. ння В; міч о а З З ВОБВх кекс: М о М А ОО є о. ПАСОК о Я тн ГУ М ЯКІКНО) скруту нина. ДУ кутветревів Міка х я побори Мізнки тики х мон ія - чч ЖевоО е ЕЗ ій я Е от ШК ооо Ж їх х и 5 пе зі ши я ї зак і ж ху і . і заїу « І: я ) ї у ; І: Е т " ре ще х ее х із ї М зх ке УЖ ї З 3-3 х в ще ЖЕ 7 НЕАа зйзняа стримані й Ні ду ев, Фсрмаманіії 0 МЕлуааняи ламані В мисі мезогелівх й
В. ну авг Зізкна ко Є нах, Й 7 зх мак й оо і жо Но з БУ і бе х Й нінінінінініні інінініні пінні нініпінінініх іслінінінінннй до жа: В. ОН ян вмам; сБоквані ІЗ М СА-Ея Фа
А стік, сиве й -Е -Е С банк В зизький БВ ск низки От х низький 5 Бо В КВК КВ що САЗІЛЯ ОБ ВО іно МЯЕМО СЕ ще ей ОЇ зав С ою ння ге ї В вноцй САУ свой - Ко, НИ ШоОз ж в ж м ЖЕ Вод юне ак (місяці Чаємісякі!
в. т - ше кН Мерів синів уч че, ва о висоБий СОЗН я дв і що Од Керекевенннютннннкнніннкннюю Я дає вк МК оо очреві вд поши ЖОВ, вибокнВ СОЯ Б'Я о М 0овіввкей я ЖОВ Ве ЕВ чен Ср шо ям бі Я Е м Кн шо «а во НВ о ве ВИШНЯ с Тл ож о Ох 1 бро пін в НН ж У ЕІ тя що Я55 ЯК и Я вон 25 час імісяці) Час імісний я Ж АЯросннносттнтноє ою нурінокВ: МІ Моввеокні: СТЕ о що ШИ шві ее АЗК МБ чний СЛ їй З 5 Чінх з нОсОЗКНИ М низь 133 ж св Ма нави ЕВ й т шни ее Високий МУ М високі СОМ ШО Соч б ях до лу 39 НАВ ш- Часімісяці ке - 30 оо кар ВИ ав ау ж й з а, - НИЗЬКЕ Я МЕ млн Са що в кої й В жі с, г СОКОМ зі астзвг ктжж Ж вро в, і - ВИСОКИЙ МОЇ МлоовкиВ СТА Ж ОоБа і 7 ї - є то схучук тори й КПК Е ї во : я -- нАЗЬКИВ МЖК из СІВ ее ВІ Кв іо евисохнй МОМ знеокий СТО Еш ти дей Н Я Коб о За кох ук ма 55 Чис сазени Ффіг.5
ЗЕ нн я Ку ун. ж ее о с. режи ОО З оз п й УК І ОН ко ше шк ї ши щі фот кит щі | п ЕХ, фо в ри плводивь рок ія ПО Я ов а: ВИ о де Б ці ше Кнінйкннонніннтнн п я о ах кН пок о КО мані НН ВА ШЕ я Вони о ООН: ев: ШИН НН Прим М МИТ й :ОЛО ОСТ а о ни еІИ 5 СИ СОДУ ЕрсСапи сраг сптлУусози сх сука Бех пр Ге скочн я ук та Пухлянні Пухлина Енлотевіатьні КклІтННИ Н не мщетрУючі клНни уж М клчу ка хто лЛенКкОоцити
Фнг.б А ре Же и У ши ит Н вх х зе МНН То7 (ндконих деоціанні Ш вінюу дненопюиижнткюкиттт КОКО Ж зав кВ Но» яв і вай НА Ей класу Ж б юю бе для свй код. шк й 3 бьохоплення ж Б Й Г1ЛО фякових асодкний) г--е Ен мі ЖЕН й жо і
- г. 5 З ж хо за в - кічькість лжерея Ма Я -к ТО ЛО (крзжених дона Що яд ж аж жжежею юю, НААН класу Ж ре ов Ви ані що ж я Е «в во ооо ск НЛеННН БИ Ше 3330 білкових веспіаннНИ щак 5 Е ФР Еоннннннорннннн нні інкіннннннннннтн й ше ше: Ви - кіжькієть джерел мою
Фіг.
ке я в-10 і ІЙ аж жи зе Бе й шин ях 1 вепжня 3-х й й Й З з 21 НЕ й г нпентидів ПСГ ИДІВ пептидів і у як Ко КЕ МНС І класу Ома Но: 2 та! х г У ШчА як х ТВ КТ В ОО З А ВХ БЕХ В Ви В і З ОБО а З МО ВЕК ВІ В НУ М НН ХМ М и МОН НН М а: и ши ши є и и о ш шишн сш ші сш ши шен ром кі Ж ОБ о: Ї СЕ МОЮ БОЇ БО: С : ях ьо нь фу ЛА вих Кен а ль кіль АЖ льльть ль АЖ пььіьтьтьтьфльтьдьтьтььььькА ЛЯ се Ні ГК 3 Я ШЕ КК І ЗИ З Кос па нс ні 7 ШИ що ! о о о НИ ВИ З ОО НН КМ БЕР РОБИ Ша Н ни м пи п І З ВИ МИ І І У ДЕ В ЗВО РО НН ННЯ ий Н ! му 111: ЖИ ОКО БЖ ЮК ОБШР З Б БО РО БНРОЇ ОБ : пе МИ: ЗИ МИ ЗИ ЗИ З МИ І НМ З З ОН НИ : Н ЕКО З КИ ЗИ ЗМ НБН НН : ТЕГ ОТГ ОГОГОР ОГС ЕСЕСЕСЕСЕСЕЕ СЕ ЕЕ ОО Бас БОР КЕ А Н РРО ОБО БО Ом о: о ВВ УЖЕ 1 ОМА ЩО її 101 1 ОЇ ОЇ Її 011 БО 111 в і і 3 БР ЕР РІ БІ Р: Б ОЇ 011 1 1 ОС КУ ин осн: нини спи С НИ В НИ Бо ї ши ши шишишниннши ши ши шини шшшшш ши ру ор ОБОМОВ З РОБ Р ОР ОБР РОБ Р ОБО БОР ОФОР ОР ОРОООРЕЕ БІ НН сх; МЕН спи нин Зоо зви зи зай З зви й З З Зі З інн мі по пав со ях ех мох ння х З ї 310 ї п РОЖИЩЕ и 0 ВХ Н З 111: Б 1 РР РЕ: РІ Б 1! 1 1111 ОБ ВООЯ р ВЕ ав ав сини ни ин и и кни ви носи ми ми ів айс аварій - их но НИ Ин МИШІ ЩО СЕА КЗ МИ МИ ме зм ЗМ З З ЗИ ЗИ ЗИ ЗИ ЗИ ЗИ МИ З ВИ М и МИ ОО ВЕ ЕВ Я ли нишининишинишни МИ ї ес чНчНнНнНЧчНннНнн , ,пНОМНеННжЖжНЕНжНжНи НН НН ж НА НН НН НК КН А КН КЕ НІ НН ІНН кт дн о Я ПО МНС П класу ІК Я КЛрНеу - Пооанн со ни н В ту Но НК о о м Ки ПРИН НА ЗО вн оо вх ВНУ сш. и 5 ши ши ши Н Моеттінн с сн А НВ енттт кін М нні Н С МН З В В о ВК ВН ши зе ОА НО їх ми и и в в о и В НА МИ І ВД ОХ ООЯЯ Н ну Ж 100001:10010ООБИМЯ МК кни З и ВЕН НН НС НН СХ Я і о: ОКХ ЗК МА 8 11 ОО МАВ 5 З пл М ОВ І М ! і ШЕ ТЗ 1 ОБУ ПОЕ МОНЕ У до: ВВЯ ко КОВКИ : ДН Н 1110 КУ 1 МИ 100 МІЙ ОВ с ШІ ї ще БО ЕК КІ МВА ОО БИ ОЇ ОО БМ М ве ЗШ ШИНИ п і ОМА ок 0 БО МИ! ВЕ Ко В еВ пав Ва ВК о, Ма о в о Й Й о В й а с й с м т РЕННЯ 13:11 ЖЕ ще У ун уж мен Ум ОО КИ: Мо КЕ ХУ ІС З 33:13 МАКРО З З НОМИС: НИ НС І З 7 ме ми Мав я сх и Кл Иия ТТ ХВ ВО Я Я жк Н іде і 101: ВУ МО ОБО В т НВ ЗВ як 101 Б Б ої Ж ті ЗМ 3:11 Я РОМНИ ОБ БОБ ВВ Па ОО РОБКИ Б ВМ ОМ ОБО КМ о НК ПА НН НААН кі ЩЕ я і т ге ГІ лані відсутні я; «
Фн.8
UAA201712985A 2015-07-15 2016-07-14 Пептид для застосування в імунотерапії епітеліального раку яєчника та інших видів раку UA124875C2 (uk)

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US201562192670P 2015-07-15 2015-07-15
GBGB1512369.8A GB201512369D0 (en) 2015-07-15 2015-07-15 Novel peptides and combination of peptides for use in immunotherapy against epithelial ovarian cancer and other cancers
PCT/EP2016/066706 WO2017009400A1 (en) 2015-07-15 2016-07-14 Novel peptides and combination of peptides for use in immunotherapy against epithelial ovarian cancer and other cancers

Publications (1)

Publication Number Publication Date
UA124875C2 true UA124875C2 (uk) 2021-12-08

Family

ID=54013984

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
UAA201712985A UA124875C2 (uk) 2015-07-15 2016-07-14 Пептид для застосування в імунотерапії епітеліального раку яєчника та інших видів раку

Country Status (37)

Country Link
US (22) US9889159B2 (uk)
EP (2) EP3705491A1 (uk)
JP (10) JP6862411B2 (uk)
KR (2) KR20220075451A (uk)
CN (2) CN114163501A (uk)
AU (4) AU2016293047B9 (uk)
BR (2) BR122023024959A2 (uk)
CA (2) CA3221097A1 (uk)
CL (5) CL2018000124A1 (uk)
CO (1) CO2018000252A2 (uk)
CR (4) CR20180027A (uk)
CY (1) CY1123505T1 (uk)
DK (1) DK3322717T3 (uk)
EA (1) EA201890027A1 (uk)
ES (1) ES2807832T3 (uk)
GB (1) GB201512369D0 (uk)
HK (1) HK1253574A1 (uk)
HR (1) HRP20201281T1 (uk)
HU (1) HUE049937T2 (uk)
IL (3) IL308200A (uk)
LT (1) LT3322717T (uk)
MA (3) MA41717A1 (uk)
MD (1) MD3322717T2 (uk)
ME (1) ME03808B (uk)
MX (1) MX2018000543A (uk)
MY (1) MY189596A (uk)
NZ (1) NZ739128A (uk)
PE (1) PE20180693A1 (uk)
PH (1) PH12018500005A1 (uk)
PL (1) PL3322717T3 (uk)
PT (1) PT3322717T (uk)
RS (1) RS60647B1 (uk)
SG (7) SG10202100298SA (uk)
SI (1) SI3322717T1 (uk)
UA (1) UA124875C2 (uk)
WO (1) WO2017009400A1 (uk)
ZA (1) ZA201800129B (uk)

Families Citing this family (53)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
DK3176170T3 (en) 2012-06-13 2019-01-28 Incyte Holdings Corp SUBSTITUTED TRICYCLIC RELATIONS AS FGFR INHIBITORS
ES2893725T3 (es) 2013-04-19 2022-02-09 Incyte Holdings Corp Heterocíclicos bicíclicos como inhibidores del FGFR
US10851105B2 (en) 2014-10-22 2020-12-01 Incyte Corporation Bicyclic heterocycles as FGFR4 inhibitors
MA41551A (fr) 2015-02-20 2017-12-26 Incyte Corp Hétérocycles bicycliques utilisés en tant qu'inhibiteurs de fgfr4
CN107438607B (zh) 2015-02-20 2021-02-05 因赛特公司 作为fgfr抑制剂的双环杂环
GB201507030D0 (en) * 2015-04-24 2015-06-10 Immatics Biotechnologies Gmbh Immunotherapy against lung cancers, in particular NSCLC
MY189596A (en) 2015-07-15 2022-02-18 Immatics Biotechnologies Gmbh A novel peptides for use in immunotherapy against epithelial ovarian cancer and other cancers
PE20181535A1 (es) 2015-12-16 2018-09-26 Gritstone Oncology Inc Identificacion, fabricacion y uso de neoantigeno
JP7075125B2 (ja) 2016-05-25 2022-05-25 イマティクス バイオテクノロジーズ ゲーエムベーハー 標的としてのおよび胆嚢がんおよび胆管がんおよびその他のがんに対する免疫療法で使用するための新規ペプチド、ペプチド組み合わせ
GB201609193D0 (en) 2016-05-25 2016-07-06 Immatics Biotechnologies Gmbh Novel peptides, combination of peptides as targets for use in immunotherapy against gallbladder cancer and cholangiocarcinoma and other cancers
EP4317432A3 (en) 2016-12-08 2024-04-17 Immatics Biotechnologies GmbH T cell receptors with improved pairing
DE102016123893A1 (de) 2016-12-08 2018-06-14 Immatics Biotechnologies Gmbh T-Zellrezeptoren mit verbesserter Bindung
TWI796314B (zh) * 2017-01-27 2023-03-21 德商英麥提克生物技術股份有限公司 用於卵巢癌和其他癌症免疫治療的新型肽和肽組合物
LT3573647T (lt) 2017-01-27 2023-06-12 Immatics Biotechnologies Gmbh Nauji peptidai ir peptidų deriniai, skirti naudoti imunoterapijai prieš kiaušidžių ir kitų tipų vėžį
AR110857A1 (es) 2017-01-27 2019-05-08 Immatics Biotechnologies Gmbh Péptidos y combinaciones de péptidos para el uso en la inmunoterapia contra el cáncer de ovario y otros tipos de cáncer
AR111960A1 (es) 2017-05-26 2019-09-04 Incyte Corp Formas cristalinas de un inhibidor de fgfr y procesos para su preparación
RS61817B1 (sr) 2017-07-14 2021-06-30 Immatics Biotechnologies Gmbh Poboljšani polipeptidni molekul sa dvojnom specifičnošću
EP3694532A4 (en) 2017-10-10 2021-07-14 Gritstone Oncology, Inc. IDENTIFICATION OF NEOANTIGENS BY MEANS OF HOT SPOTS
JP2021503897A (ja) 2017-11-22 2021-02-15 グリットストーン オンコロジー インコーポレイテッド 新生抗原のためのジャンクションエピトープ提示の低減
DE102017127984B4 (de) 2017-11-27 2019-12-05 Immatics US, Inc. Verfahren für die Vermehrung und Aktivierung von γδ-T-Zellen
WO2019157298A1 (en) 2018-02-09 2019-08-15 Immatics US, Inc. Methods for manufacturing t cells
BR112020022392A2 (pt) 2018-05-04 2021-02-02 Incyte Corporation formas sólidas de um inibidor de fgfr e processos para preparação das mesmas
MA52493A (fr) 2018-05-04 2021-03-10 Incyte Corp Sels d'un inhibiteur de fgfr
CN110531077B (zh) * 2018-05-25 2023-07-07 荣昌生物制药(烟台)股份有限公司 间皮素免疫组化检测试剂盒
WO2020028562A1 (en) * 2018-07-31 2020-02-06 Loma Linda University Snail sirna-loaded mesoporous silica nanoparticles
WO2020185532A1 (en) 2019-03-08 2020-09-17 Incyte Corporation Methods of treating cancer with an fgfr inhibitor
US20200297768A1 (en) 2019-03-19 2020-09-24 Immatics US, Inc. Cd28 t cell cultures, compositions, and methods of using thereof
MX2021014552A (es) 2019-05-27 2022-02-11 Immatics Us Inc Vectores viricos y uso de los mismos en terapias celulares adoptivas.
EP3980776A1 (en) 2019-06-06 2022-04-13 Immatics Biotechnologies GmbH Sorting with counter selection using sequence similar peptides
EP3990483A4 (en) * 2019-06-25 2024-02-21 Univ Montreal NOVEL TUMOR-SPECIFIC ANTIGENS FOR OVARIAN CANCER AND THEIR APPLICATIONS
US11591329B2 (en) 2019-07-09 2023-02-28 Incyte Corporation Bicyclic heterocycles as FGFR inhibitors
US20210032370A1 (en) 2019-08-02 2021-02-04 Immatics Biotechnologies Gmbh Recruiting agent further binding an mhc molecule
CR20220169A (es) 2019-10-14 2022-10-27 Incyte Corp Heterociclos bicíclicos como inhibidores de fgfr
US11566028B2 (en) 2019-10-16 2023-01-31 Incyte Corporation Bicyclic heterocycles as FGFR inhibitors
JP2023505258A (ja) 2019-12-04 2023-02-08 インサイト・コーポレイション Ｆｇｆｒ阻害剤としての三環式複素環
WO2021113462A1 (en) 2019-12-04 2021-06-10 Incyte Corporation Derivatives of an fgfr inhibitor
CA3168729A1 (en) 2020-02-24 2021-09-02 Melinda MATA Methods for expanding t cells for the treatment of cancer and related malignancies
DE102020106710A1 (de) 2020-03-11 2021-09-16 Immatics US, Inc. Wpre-mutantenkonstrukte, zusammensetzungen und zugehörige verfahren
DE102020111571A1 (de) 2020-03-11 2021-09-16 Immatics US, Inc. Wpre-mutantenkonstrukte, zusammensetzungen und zugehörige verfahren
TW202227616A (zh) 2020-08-21 2022-07-16 美商英麥提克斯股份有限公司 分離ｃｄ８＋選擇ｔ細胞的方法
WO2022147029A2 (en) 2020-12-31 2022-07-07 Immatics US, Inc. Cd8 polypeptides, compositions, and methods of using thereof
EP4326858A1 (en) * 2021-04-23 2024-02-28 VLP Therapeutics, Inc. Galectin-targeting immunotherapy
WO2022233957A1 (en) 2021-05-05 2022-11-10 Immatics Biotechnologies Gmbh Bma031 antigen binding polypeptides
CN113241177A (zh) * 2021-05-19 2021-08-10 上海宝藤生物医药科技股份有限公司 一种评估免疫力水平的方法、装置、设备及存储介质
WO2022261160A1 (en) 2021-06-09 2022-12-15 Incyte Corporation Tricyclic heterocycles as fgfr inhibitors
WO2023025851A1 (en) * 2021-08-24 2023-03-02 Immatics US, Inc. Selection of immune cells using peptide mhc complexes generated by conditional ligand exchange
TW202332765A (zh) 2021-09-20 2023-08-16 美商英麥提克斯股份有限公司 用於ｔ細胞療法之ｔ細胞群體的單核球耗盡
WO2023081925A1 (en) 2021-11-08 2023-05-11 Immatics Biotechnologies Gmbh Adoptive cell therapy combination treatment and compositions thereof
US20230348561A1 (en) 2022-04-28 2023-11-02 Immatics US, Inc. Dominant negative tgfbeta receptor polypeptides, cd8 polypeptides, cells, compositions, and methods of using thereof
WO2023212697A1 (en) 2022-04-28 2023-11-02 Immatics US, Inc. Membrane-bound il-15, cd8 polypeptides, cells, compositions, and methods of using thereof
US20240066127A1 (en) 2022-04-28 2024-02-29 Immatics US, Inc. Il-12 polypeptides, il-15 polypeptides, il-18 polypeptides, cd8 polypeptides, compositions, and methods of using thereof
WO2023215825A1 (en) 2022-05-05 2023-11-09 Immatics US, Inc. Methods for improving t cell efficacy
CN114657158B (zh) * 2022-05-25 2022-10-21 深圳吉诺因生物科技有限公司 Ido1相关疫苗及其应用

Family Cites Families (24)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2004006837A2 (en) 2002-07-12 2004-01-22 The Johns Hopkins University Mesothelin vaccines and model systems
AU2003299643A1 (en) * 2002-12-04 2004-06-23 Diadexus, Inc. Compositions, splice variants and methods relating to colon specific genes and proteins
DE102004026135A1 (de) 2004-05-25 2006-01-05 Immatics Biotechnologies Gmbh An MHC-Moleküle bindende Tumor-assoziierte Peptide
US20110177079A1 (en) * 2004-09-08 2011-07-21 Ludwig Institute For Cancer Research Cancer-testis antigens
WO2006106912A1 (ja) * 2005-03-31 2006-10-12 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha 癌関連抗原アナログペプチド、およびその利用
EP1760089B1 (en) * 2005-09-05 2009-08-19 Immatics Biotechnologies GmbH Tumor-associated peptides binding to human leukocyte antigen (HLA) class I or II molecules and related anti-cancer vaccine
DE602005020047D1 (de) 2005-09-05 2010-04-29 Immatics Biotechnologies Gmbh Tumor-assoziierte Peptide, welche an unterschiedliche menschliche Leukozytenantigene der Klasse II binden
US8124408B2 (en) * 2006-10-04 2012-02-28 Janssen Pharmaceutica N.V. Preparation of inactivated artificial antigen presenting cells and their use in cell therapies
US8097242B2 (en) 2006-10-05 2012-01-17 The Board Of Trustees Of The University Of Arkansas Target CA125 peptides for cancer immunotherapy
CA2863010C (en) * 2007-07-27 2017-01-24 Immatics Biotechnologies Gmbh Novel immunotherapy against neuronal and brain tumors
MX2010001090A (es) * 2007-07-27 2010-04-07 Immatics Biotechnologies Gmbh Nuevos epitopos inmunogenicos para inmunoterapia.
US20100260764A1 (en) * 2007-08-29 2010-10-14 Marinkovich M Peter Compositions and methods for inhibiting squamous cell carcinoma
DK2119726T5 (en) 2008-05-14 2018-03-26 Immatics Biotechnologies Gmbh Novel and powerful MHC class II peptides derived from survivin and neurocan
ES2536465T3 (es) * 2008-10-01 2015-05-25 Immatics Biotechnologies Gmbh Composición de péptidos tumor-asociados y relacionados con la vacuna contra el cáncer para el tratamiento de glioblastoma (GBM) y otros cánceres
GB201004551D0 (en) 2010-03-19 2010-05-05 Immatics Biotechnologies Gmbh NOvel immunotherapy against several tumors including gastrointestinal and gastric cancer
GB201006360D0 (en) * 2010-04-16 2010-06-02 Immatics Biotechnologies Gmbh Method for differentially quantifying naturally processed HLA-restricted peptides for cancer, autoimmune and infectious diseases immunotherapy development
US9688991B2 (en) * 2012-07-13 2017-06-27 Albert Einstein College Of Medicine, Inc. Aptamer-targetted antigen delivery
TWI666026B (zh) * 2013-03-29 2019-07-21 日商大日本住友製藥股份有限公司 Ｗｔ１抗原胜肽結合疫苗
TWI714869B (zh) 2013-08-05 2021-01-01 德商伊瑪提克斯生物科技有限公司 新穎肽類，細胞及其用於治療多種腫瘤的用途，其製造方法及包含其等之醫藥組成物
GB201319446D0 (en) * 2013-11-04 2013-12-18 Immatics Biotechnologies Gmbh Personalized immunotherapy against several neuronal and brain tumors
IL260877B2 (en) * 2015-03-27 2023-10-01 Immatics Biotechnologies Gmbh New peptides and a combination of peptides for use in immunotherapy against different types of tumors
GB201505305D0 (en) * 2015-03-27 2015-05-13 Immatics Biotechnologies Gmbh Novel Peptides and combination of peptides for use in immunotherapy against various tumors
GB201507030D0 (en) 2015-04-24 2015-06-10 Immatics Biotechnologies Gmbh Immunotherapy against lung cancers, in particular NSCLC
MY189596A (en) 2015-07-15 2022-02-18 Immatics Biotechnologies Gmbh A novel peptides for use in immunotherapy against epithelial ovarian cancer and other cancers

Also Published As

Publication number Publication date
PL3322717T3 (pl) 2020-11-16
ME03808B (me) 2021-04-20
US20210260123A1 (en) 2021-08-26
JP2020171283A (ja) 2020-10-22
AU2020203971B2 (en) 2021-11-25
JP2018531581A (ja) 2018-11-01
SI3322717T1 (sl) 2020-09-30
US20200316125A1 (en) 2020-10-08
JP2020167995A (ja) 2020-10-15
JP7074369B2 (ja) 2022-05-24
CN114163501A (zh) 2022-03-11
US20230285458A1 (en) 2023-09-14
LT3322717T (lt) 2020-08-25
US11819518B2 (en) 2023-11-21
CL2019003313A1 (es) 2020-03-13
EP3322717B1 (en) 2020-06-10
JP7239993B2 (ja) 2023-03-15
JP7205919B2 (ja) 2023-01-17
CR20200408A (es) 2020-10-08
MA50542A (fr) 2020-09-09
DK3322717T3 (da) 2020-08-10
GB201512369D0 (en) 2015-08-19
PE20180693A1 (es) 2018-04-23
AU2022200745A1 (en) 2022-02-24
US20210260122A1 (en) 2021-08-26
SG10202100294WA (en) 2021-02-25
US10722538B2 (en) 2020-07-28
JP7074367B2 (ja) 2022-05-24
US20200155603A1 (en) 2020-05-21
IL256697B (en) 2022-05-01
IL308200A (en) 2024-01-01
RS60647B1 (sr) 2020-09-30
US20230241106A1 (en) 2023-08-03
EP3322717A1 (en) 2018-05-23
SG10202100296PA (en) 2021-02-25
ES2807832T3 (es) 2021-02-24
US20190381103A1 (en) 2019-12-19
US20180117085A1 (en) 2018-05-03
AU2016293047B2 (en) 2020-09-17
EA201890027A1 (ru) 2018-06-29
CO2018000252A2 (es) 2018-05-31
HRP20201281T1 (hr) 2020-11-13
US20210252066A1 (en) 2021-08-19
SG10202100291XA (en) 2021-02-25
CR20180027A (es) 2018-07-23
MX2018000543A (es) 2018-05-22
CN107922469A (zh) 2018-04-17
NZ739128A (en) 2022-04-29
EP3705491A1 (en) 2020-09-09
SG10202100297QA (en) 2021-02-25
HUE049937T2 (hu) 2020-11-30
US20200000849A1 (en) 2020-01-02
CL2018000124A1 (es) 2018-05-18
PH12018500005A1 (en) 2018-07-09
US11071756B2 (en) 2021-07-27
US10639332B2 (en) 2020-05-05
IL292131A (en) 2022-06-01
US20200000850A1 (en) 2020-01-02
US11246889B2 (en) 2022-02-15
MD3322717T2 (ro) 2020-11-30
CL2019003311A1 (es) 2020-03-13
US11806366B2 (en) 2023-11-07
BR122023024959A2 (pt) 2024-01-16
BR112017028558A2 (pt) 2018-09-04
US11278571B2 (en) 2022-03-22
US10639331B2 (en) 2020-05-05
JP2020127401A (ja) 2020-08-27
HK1253574A1 (zh) 2019-06-21
US9889159B2 (en) 2018-02-13
US10888587B2 (en) 2021-01-12
AU2022200745B2 (en) 2024-01-18
AU2016293047B9 (en) 2020-10-29
US10568909B2 (en) 2020-02-25
SG10202100298SA (en) 2021-02-25
US20210106623A1 (en) 2021-04-15
WO2017009400A1 (en) 2017-01-19
KR20180030506A (ko) 2018-03-23
AU2020203971A1 (en) 2020-07-02
US20230190813A1 (en) 2023-06-22
US10881690B2 (en) 2021-01-05
SG10202100295RA (en) 2021-02-25
JP7074370B2 (ja) 2022-05-24
US20210106624A1 (en) 2021-04-15
MY189596A (en) 2022-02-18
JP2020198875A (ja) 2020-12-17
US20230086100A1 (en) 2023-03-23
AU2016293047A1 (en) 2018-02-08
JP2020182458A (ja) 2020-11-12
CA2992506A1 (en) 2017-01-19
SG10202100292VA (en) 2021-02-25
JP2020156480A (ja) 2020-10-01
US20210252064A1 (en) 2021-08-19
KR20220075451A (ko) 2022-06-08
JP7239992B2 (ja) 2023-03-15
CL2019003310A1 (es) 2020-04-24
ZA201800129B (en) 2018-12-19
CA3221097A1 (en) 2017-01-19
CY1123505T1 (el) 2022-03-24
JP2020182451A (ja) 2020-11-12
US20170035807A1 (en) 2017-02-09
CL2019003312A1 (es) 2020-03-13
JP2021000078A (ja) 2021-01-07
US20200316127A1 (en) 2020-10-08
MA42441B1 (fr) 2020-07-29
US10463696B2 (en) 2019-11-05
PT3322717T (pt) 2020-07-27
AU2020256318A1 (en) 2020-11-12
IL256697A (en) 2018-03-29
CR20200410A (es) 2020-10-12
US20200316126A1 (en) 2020-10-08
AU2016293047A2 (en) 2018-03-15
MA41717A1 (fr) 2019-05-31
JP6862411B2 (ja) 2021-04-21
US10869897B2 (en) 2020-12-22
US20230241107A1 (en) 2023-08-03
US20230201259A1 (en) 2023-06-29
CR20200409A (es) 2020-10-16
US20210252065A1 (en) 2021-08-19
JP2020191862A (ja) 2020-12-03

Similar Documents

Publication Publication Date Title
UA124875C2 (uk) Пептид для застосування в імунотерапії епітеліального раку яєчника та інших видів раку
UA124575C2 (uk) Пептид для лікування раку
UA125816C2 (uk) Пептид, придатний для лікування та/або діагностики раку
UA124519C2 (uk) Пептид, здатний зв'язуватися з молекулою головного комплексу гістосумісності (mhc) людини i класу
UA123941C2 (uk) Пептид та його застосування для лікування раку
TW201734036A (zh) 用於nhl和其他癌症免疫治療的新型肽和肽組合物
UA123392C2 (uk) Пептид, здатний зв'язуватися з молекулою головного комплексу гістосумісності (mhc) людини i класу, та його застосування для лікування раку
UA124577C2 (uk) Пептид для лікування раку
TW201726723A (zh) 用於對抗多種癌症的免疫療法的新胜肽及胜肽組合
TW201710289A (zh) 用於骨髓瘤和其他癌症免疫治療的新型細胞表位和細胞表位組合物
TW201841934A (zh) 用於治療癌症免疫治療的新穎肽及其肽組合物
TW201738274A (zh) 子宮癌治療
TW201841937A (zh) 用於白血病和其他癌症免疫治療的新穎肽和肽組合物
UA126787C2 (uk) Пептид, нуклеїнова кислота, вектор експресії, клітина-хазяїн, спосіб отримання пептиду, активовані цитотоксичні t-лімфоцити та спосіб їх отримання та застосування, спосіб лікування раку
UA124411C2 (uk) Фармацевтично прийнятна сіль пептиду та її застосування для лікування раку
CN109734777B (zh) 用于各种癌症免疫治疗的新型肽、肽组合物和支架
TW201738266A (zh) 用於aml和其他癌症免疫治療的新型肽和肽組合物
CN114028549A (zh) 用于nhl和其他癌症免疫治疗的新型肽和肽组合物