JP4987698B2 - 癌関連抗原アナログペプチド、およびその利用 - Google Patents
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Description
大久保光夫, 細胞治療, pp948-957, 輸血学改訂第3版, 遠山博他編著, 中外医学社, 東京, 2004. Rosenberg SA, Spiess P, Lafreiere R: A new approach to the adoptive immunotherapy of cancer with tumor-infiltrating lymphocyte. Science. 233:1318-21,1986. Rosenberg SA, Yang JC, Schwartzentruber DJ, et. al: Immunologic and therapeutic evaluation of a synthetic peptide vaccine for the treatment of patients with metastatic melanoma. Nature Med. 4:321-327, 1998. Mehrotra S, Stevens R, Zengou R, et al: Regulation of melanoma epitope-specific cytolytic T lymphocyte response by immature and activated dendritic cells, in vitro. Cancer Research. 63:5607-5614, 2003.
上記の解析の結果、卵巣癌抗原の特定のアミノ酸配列(アナログペプチド)を認識するT細胞が患者末梢単核球中に平均約4%の頻度で存在することが初めて明かとなった。
(1)下記式を含むペプチド:
X1−X2−X3−X4−X5−X6
(式中、X1、X2、X3、X5、およびX6は、任意に含まれていてもよいアミノ酸残基、またはアミノ酸配列であり、
X4は、Phe-Thr-Leu-Asn-Phe-Thr-Ile-Thr-Asn(配列番号:1)である。)
(2)X3が、ProまたはLeuである、(1)に記載のペプチド。
(3)X2が、
Gly-His-Thr-Ala-Pro-Val-Pro-Leu-Leu-Ile(配列番号:4)、
Gly-His-Thr-Ala-Pro-Gly-Pro-Leu-Leu-Val(配列番号:5)、
Arg-Pro-Ile-Val-Pro-Gly-Pro-Leu-Leu-Val(配列番号:6)、
Glu-Thr-Thr-Ala-Thr-Gly-Pro-Leu-Leu-Val(配列番号:7)、
Gly-Pro-Thr-Thr-Ala-Ser-Pro-Leu-Leu-Val(配列番号:8)、
Gly-Pro-Ser-Ala-Ala-Ser-Pro-Leu-Leu-Val(配列番号:9)、または、
Gly-Thr-Ser-Gly-Thr-Pro-Ala-Ser-Leu-Pro-Gly-His-Thr-Ala-Pro-Gly-Pro-Leu-Leu-Val(配列番号:13)のいずれかである、(1)または(2)に記載のペプチド。
(4)X2が、
Ala-Pro-Val-Pro-Leu-Leu-Ile(配列番号:46) 、
Ala-Pro-Gly-Pro-Leu-Leu-Val(配列番号:47) 、
Ala-Ser-Pro-Leu-Leu-Val(配列番号:48) 、
Gly-Pro-Leu-Leu-Val (配列番号:49)、または
Pro-Leu-Leu-Val(配列番号:50) のいずれかである、(1)または(2)に記載のペプチド。
(5)X5が、
Leu-Arg-Tyr-Glu-Glu-Asn-Met-Arg-His-Pro(配列番号:10)である、(1)〜(4)のいずれかに記載のペプチド。
(6)アミノ酸残基数が30個以下である、(1)〜(5)のいずれかに記載のペプチド。
(7)卵巣癌関連抗原CA125のコアタンパク質MUC16由来である(1)〜(6)のいずれかに記載のペプチド。
(8)(1)〜(7)のいずれかに記載のペプチドをコードしているDNA。
(9)(8)に記載のDNAを含むベクター。
(10)(9)記載のベクターが導入された形質転換体。
(11)(10)に記載の形質転換体を培養もしくは育種し、該細胞またはその培養上清から組換えタンパク質を回収する工程を含む、(1)〜(8)のいずれかに記載のペプチドの製造方法。
(12)(1)〜(7)のいずれかに記載のペプチドに結合する抗体。
(13)モノクローナル抗体である(12)に記載の抗体。
(14)(12)または(13)に記載の抗体を対象に投与する工程を含む、対象における癌細胞、癌細胞関連抗原、または子宮の内側以外の部位に発生した子宮内膜細胞を検出する方法。
(15)(1)〜(7)のいずれかに記載のペプチドを対象に投与する工程を含む、対象におけるT細胞を活性化させる方法。
(16)T細胞がIL-4を産生するヒトCD4陽性T細胞、IFNγを産生するヒトCD4陽性T細胞、TNFαを産生するヒトCD4陽性T細胞,TNFαを産生するヒトCD8陽性T細胞、である(15)に記載の方法。
(17)(15)または(16)に記載の方法によって、活性化されたT細胞。
(18)(1)〜(7)のいずれかに記載のペプチドを対象に投与する工程を含む、対象における癌疾患または子宮内膜症を、予防または治療する方法。
(19)(12)または(13)に記載の抗体を対象に投与する工程を含む、対象における癌疾患または子宮内膜症を、予防または治療する方法。
(20)対象における癌疾患または子宮内膜症を、予防または治療する方法であって、以下の工程(a)〜(c)を含む方法。
(a)(1)〜(7)のいずれかに記載のペプチドをT細胞に添加する工程、
(b)(a)のT細胞を培養する工程、
(c)(b)で得られたT細胞を対象に投与する工程。
(21)工程(a)の前に、対象に抗癌剤による化学療法を行う工程を含む、(20)に記載の方法。
(22)抗癌剤による化学療法が自己末梢血幹細胞移植併用化学療法である、(21)に記載の方法。
(23)癌疾患が、卵巣癌、膵臓癌、または肺癌である(18)〜(22)のいずれかに記載の方法。
(24)子宮内膜症が、子宮腺筋症である(18)〜(22)のいずれかに記載の方法。
(25)(1)〜(7)のいずれかに記載のペプチドを有効成分とする、癌疾患または子宮内膜症を、予防または治療するための薬剤。
(26)(12)または(13)に記載の抗体を有効成分とする、癌疾患または子宮内膜症を、予防または治療する薬剤。
(27)(17)に記載のT細胞を有効成分とする、癌疾患または子宮内膜症を、予防または治療する薬剤。
(28)癌疾患が、卵巣癌、膵臓癌、または肺癌である(25)〜(27)のいずれかに記載の薬剤。
(29)子宮内膜症が、子宮腺筋症である(25)〜(27)のいずれかに記載の方法。
(30)(12)または(13)に記載の抗体を有効成分とする、癌腫瘍マーカー、免疫染色用抗体、または子宮内膜細胞マーカー。
X1−X2−X3−X4−X5−X6
式中、X4は、Phe-Thr-Leu-Asn-Phe-Thr-Ile-Thr-Asn(配列番号:1)であり、X1、X2、X3、X5、およびX6は、任意に含まれていてもよいアミノ酸残基、またはアミノ酸配列であり、本発明のペプチドと機能的に同等である限り、アミノ酸の配列構成については特に限定をされない。
上記式X3に相当するアミノ酸残基としては、ProまたはLeuが挙げられるが、特に限定されるものではない。
Ala-Pro-Gly-Pro-Leu-Leu-Val(配列番号:47) 、Ala-Ser-Pro-Leu-Leu-Val(配列番号:48) 、Gly-Pro-Leu-Leu-Val(配列番号:49) 、またはPro-Leu-Leu-Val(配列番号:50) のいずれか一つを挙げることができるが、特に限定されるものではない。
本発明のペプチドの由来は特に限定されないが、好ましくは癌関連抗原由来のペプチド、より好ましくは卵巣癌関連抗原CA125のコアタンパク質MUC16由来のペプチドを、本発明のペプチドとして例示することが出来る。
本発明のDNAは、例えば、癌関連抗原のエピトープの大量発現、または組み換えペプチドの大量調製などに利用することが可能である。
ベクターの例としては、M13系ベクター、pUC系ベクター、pBR322、pBluescript、pCR-Scriptなどが挙げられる。また、cDNAのサブクローニング、切り出しを目的とした場合、上記ベクターの他に、例えば、pGEM-T、pDIRECT、pT7などが挙げられる。
原核細胞を使用する場合、細菌細胞を用いる産生系がある。細菌細胞としては、大腸菌(E. coli)、例えば、JM109、DH5α、HB101等が挙げられ、その他、枯草菌が知られている。
例えば、目的とするDNAを、ヤギβカゼインのような乳汁中に固有に産生されるタンパク質をコードする遺伝子との融合遺伝子として調製する。次いで、この融合遺伝子を含むDNA断片をヤギの胚へ注入し、この胚を雌のヤギへ移植する。胚を受容したヤギから生まれるトランスジェニックヤギ又はその子孫が産生する乳汁から、目的のタンパク質を得ることができる。トランスジェニックヤギから産生されるタンパク質を含む乳汁量を増加させるために、適宜ホルモンをトランスジェニックヤギに使用してもよい。
本発明は、該ペプチドに結合する抗体に関する。
また、本発明は、本発明のタンパク質と結合する抗体を提供する。本発明の抗体としては、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、抗体変異体、これらの断片等が例示できる。
本発明において、「対象とは」、本発明の薬剤(マーカー等を含む)を投与する生物体、該生物体の体内の一部分、または生物体より摘出または排出されたその一部分をいう。生物体は、特に限定されるものではないが、動物(例えば、ヒト、家畜動物種、野生動物)を含む。
本発明において癌細胞とは、より具体的には、白血病、大腸癌、肺癌、乳癌、頭頚部扁平上皮癌、食道癌、胃癌、甲状腺癌、骨および軟部肉腫、卵巣癌、子宮癌、腎癌、膵癌、またはグリオブラストーマにおける癌細胞を例示することができる。本発明における癌細胞は特に限定されないが、より好ましくは、卵巣癌、膵臓癌、または肺癌おける癌細胞を挙げることが出来る。また、本発明において子宮内膜細胞とは、より具体的には子宮内膜症において子宮の内側以外の部位に発生した子宮内膜細胞を挙げることが出来る。子宮の内側以外の部位とは、特に限定されるものではないが、好ましくは子宮筋層を挙げることができる。子宮内膜症において、内膜の生育が子宮筋層に限局した症状を、子宮腺筋症と呼ぶ。
経口的な投与としては、経口剤という形での投与を挙げることができ、経口剤としては、顆粒剤、散剤、錠剤、カプセル剤、溶剤、乳剤、あるいは懸濁剤等の剤型を選択することができる。
本発明の薬剤には、保存剤や安定剤等の製剤上許容しうる担体を添加してもよい。製剤上許容しうるとは、それ自体は上記の活性を有さない材料であって、上記の薬剤とともに投与可能な製剤上許容される材料を意味する。
投与量は、患者の年齢、性別、体重および症状、治療効果、投与方法、処理時間、あるいは該薬剤に含有される活性成分の種類などにより異なるが、通常成人一人あたり、一回につき0.1mgから500mgの範囲で、好ましくは0.5mgから20mgの範囲で投与することができる。しかし、投与量は種々の条件により変動するため、上記投与量よりも少ない量で充分な場合もあり、また上記の範囲を超える投与量が必要な場合もある。
また、本発明において「接触」は、生物体の状態に応じて行う。例えば、生物体の一部への本薬剤の散布、あるいは、生物体の一部の破砕物への本薬剤の添加等を挙げることができるが、これらの方法に制限されない。生物体の一部が培養細胞の場合には、該細胞の培養液への本薬剤の添加あるいは、本発明のオリゴヌクレオチドを含むDNAを、生物体の一部を構成する細胞へ導入することにより、上記「接触」を行うことも可能である。
以下において使用される「対象」および「投与」という記載は、上記の意味を示すものとする。
本発明において、活性化されるT細胞は、特に限定されない。好ましい例として、免疫応答を促進するヘルパーT細胞、逆に免疫反応を抑制するサプレッサーT細胞、病原体に感染した細胞や癌細胞を直接殺すキラーT細胞を挙げることが出来る。
より好ましい例として、IL-4を産生するヒトCD4陽性T細胞、IFNγを産生するヒトCD4陽性T細胞、TNFαを産生するヒトCD4陽性T細胞、またはTNFαを産生するヒトCD8陽性T細胞を挙げることが出来る。
本発明において、T細胞が活性化される期間は特に限定されないが、T細胞の活性化は一時的な増強であってもよいし、一定期間の増強であってもよい。
一時的な増強とは、本発明のペプチドの投与に起因する、T細胞が活性化された状態が一定期間継続し、その後、T細胞の活性が再度定常状態に戻ることをいう。
本発明は、該ペプチドまたは該抗体を対象に投与する工程を含む、対象における癌疾患を予防または治療する方法に関する。
(a)該ペプチドをT細胞に添加する工程、
(b)(a)のT細胞を培養する工程、
(c)(b)で得られたT細胞を対象に投与する工程。
本発明は、該ペプチドを有効成分とする癌疾患または子宮内膜症を、予防または治療するための薬剤に関する。また、該抗体を有効成分とする癌疾患または子宮内膜症を、予防または治療する薬剤に関する。さらに、該T細胞を有効成分とする、癌疾患または子宮内膜症を、予防または治療する薬剤に関する。
安定剤としては、0.2%程度のゲラチンやデキストラン、0.1-1.0%のグルタミン酸ナトリウム、あるいは約5%の乳糖や約2%のソルビトールなどを使用することが出来るが、これらに限定されるものではない。保存剤としては、0.01%程度のチメロサールや0.1%程度のベータプロピオノラクトンなどを使用することが出来るが、これらに限定されるものではない。
どの接種方法が適切かは薬剤の種類、接種する対象の種類等を考慮して決定される。容器はバイアル、プレフィルド シリンジ製品(pre-filled syringe)が可能である。必要に応じて、溶液状でも凍結乾燥などによる粉末製品でもよい。一回接種用でも複数回接種用でも良い。投与量は、接種する対象の種類や体重や年齢、投与方法などにより変動するが、当業者であれば適当な投与量を適宜選択することが可能である。
なお本明細書において引用された全ての先行技術文献は、参照として本明細書に組み入れられる。
各実施例は、以下の対象、実験条件に基づいて行われた。
埼玉医科大学倫理委員会(日本)で承認を受けた「卵巣癌に対する細胞治療に関する研究」の説明を行い、同意の得られた卵巣癌患者25名と健常人8名から、本研究に使用する末梢静脈血液(T細胞、B細胞、抗原提示細胞等を単核球分画として含む)サンプル(以下血液サンプル)の提供を受け、無名化して解析した(1人1血液サンプル)。これとは別に抗癌剤投与中の卵巣癌患者6例からは卵巣癌に対する化学療法(Ikeba K, Okubo M, Takeda S, et al: Five-year results of cyclic semi-high dose chemotherapy supported by autologous peripheral blood stem cell transplantation in patients with advanced ovarian cancer. Int J Clin Oncol. 9: 113-119, 2004.)後の血液サンプルの提供も受けた。血液サンプルは、医師が参加者の静脈から約10mlの血液を抗凝固剤(ヘパリンナトリウム)入り試験管内へ安全に採血した。
細胞培養に関する操作は全て無菌的に行った。まず、血液サンプルから比重遠心法によりヒト末梢血単核球分画(T細胞、B細胞、マクロファージなどを含む、以下単核球サンプルという)を調整した。次にこの単核球を以下の組成からなる完全培地に1x105個/mlとなるように浮遊させた。
完全培地:RPMI1640培養液(Gibco Laboratries Inc., Grand Island, NY)に10% fetal bovine serum (Cell Culture Laboratories, Cleveland, OH)と0.2 mM L-glutamineと 100 U/mL penicillin, 100 μg/mL streptomycin (Gibco Laboratories Inc.)と0.2 ng/mL recombinant human IL-2 (大日本製薬、東京、日本)を混合させたもの。
T細胞膜上のCDマーカーのCD4とCD8およびT細胞内のサイトカインの検出を二重染色により同時に解析するために、蛍光の異なる複数のマウス由来特異的抗ヒトモノクローナル抗体(以下モノクローナル抗体)を用いた。モノクローナル抗体は蛍光物質であるphycoerythrin(以下PE)または fluorescein isothiocyanate(以下FITC)で標識されている(Miltenyi Biotec, Glandbach, Germany)製品を用いた。検出はフローサイトメトリ-機器 FACScan(Becton Dickinson)を用いて、モノクローナル抗体が結合した細胞頻度を測定した。フローサイトメトリー機器では陽性細胞の検出は自動的に処理される。その概要は、細胞にレーザーを照射して、目的とする抗体が結合した細胞にのみ励起する蛍光を捕らえて、コンピューター上で陽性細胞数を計算して表示させるというものである。
抗癌剤は免疫抑制あるいは骨髄抑制の副作用が存在する。卵巣癌における化学療法では、患者末梢血の細胞分画に変化、特にT細胞数減少の可能性がある。そこで、抗癌剤による化学療法後の末梢血白血球数が正常値に回復した日(平均14日後)の6例の患者の血液サンプルに含まれる細胞分画を解析した。血液細胞のクラスター分類(以下CD)用のCD3(汎T細胞)、CD4(ヘルパーT細胞)、CD8(細胞障害性T細胞)、CD25(活性化T細胞)、CD45RA(ナイーブT細胞)、CD4RO(メモリーT細胞)、CD14(単球)、CD19(B細胞)のモノクローナル抗体(藤沢薬品工業、東京、日本)で血液サンプルを蛍光免疫染色して、フローサイトメトリー機器FACScan(Becton Dickinson, San Jose, CA)により陽性細胞数を解析した。
CA125は、1981年にBast RC Jr.らが卵巣癌細胞株抗原をマウスに免疫して作製したモノクローナル抗体が認識する抗原名として報告されたものである(Bast RC, Fenney M, Lazarus H. Reactivity of a monoclonal antibody with human ovarian carcinoma. J Clin Invest. 68: 1331-1337, 1981.)。CA125は卵巣癌全体での陽性率が約70%、卵巣癌で最も頻度の高い細胞型の漿液性腺癌での陽性率が約90%と高く、癌の進行に伴って絶対量が増加するという特徴を持ち、卵巣癌細胞にもっとも特徴的な腫瘍マーカーとして利用されていた。しかし、分子構造が明かとなったのはごく最近である。CA125全長のアミノ酸配列を配列番号:44に示す。CA125は蛋白に糖鎖が付加されたもので、ムチンと呼ばれる高分子のひとつである。ムチンにちなみコア蛋白部分はMUCと呼ばれており、生体内に存在する複数のMUCのひとつとしてCA125はMUC16と命名された。このMUC16のコアタンパク質のアミノ酸配列は2001年にYin B.らが報告している(Yin BW, Lloyd KO. Molecular cloning of the CA125 ovarian cancer antigen identification as a new mucin, MUC16. J Biol Chem. 276: 27371-27375, 2001.)。しかし、CA125は今まで癌隔絶抗原(癌細胞排除のために免疫学的に認識される抗原)として利用できるかどうかについての検討は全くなされていなかった。そのため、本発明では卵巣癌関連抗原であるCA125を癌隔絶抗原として利用した。
抗原特異的T細胞が活性化するとIFNγあるいはIL-4を産生することがわかっている(藤原大美.T細胞の免疫応答,T細胞系の免系学 pp 155-174.藤原大美編著,中外医学社,東京.1993.)。もし、T細胞を含む単核球分画に卵巣癌抗原MUC16アナログペプチドを加えて培養刺激した際に、IL-4あるいはIFNγを発現するT細胞が検出された場合、MUC16抗原特異的なT細胞が存在することの証明となり、かつその卵巣癌抗原MUC16アナログペプチドはT細胞エピトープを内包していることになる。しかし、どの卵巣癌抗原MUC16アナログペプチドでも活性化できなかった場合には、MUC16抗原特異的なT細胞は存在しないことになる。
抗原特異的に活性化されたT細胞が腫瘍細胞などの標的とする細胞を傷害する際には、T細胞はTNFα(tumor necrosis factor;腫瘍壊死因子)を産生することが知られている。そこで、〔実施例3〕から求められたOVCA11で刺激したT細胞が、実際にTNFαを産生しているかどうかを〔実施例3〕と同様の方法でCD4とTNFαおよぼCD8とTNFαの組み合わせで、フローサイトメトリーにより解析した。その結果の典型例を図12に示す。OVCA刺激前のCD4陽性でTNFα陽性のT細胞頻度は0.44%であったが、OVCA11刺激後では5.76%に増加した。また、細胞傷害活性がより強いことが知られているCD8陽性TNFα陽性T細胞は同じく0.28%から3.98%に増加した。この結果から、OVCA11アナログペプチドはCD4陽性細胞を抗原特異的に活性化し、IL-4とIFNγを産生するだけではなく、CD4陽性とCD8陽性細胞にさらにTNFαを産生させる事が確認できた。
〔実施例3〕の結果からT細胞エピトープを含む部位は(本来の配列ではない)アナログペプチドOVCA11:GHTAPGPLLVPFTLNFTITN(配列番号:11)とOVCA12:PFTLNFTITNLRYEENMRHP(配列番号:12)の範囲内に限定された。
Claims (18)
- 下記式:
X2−X3−X4、X3−X4またはX3−X4−X5
で示される、T細胞の活性化を誘導し得るペプチド:
式中、X2は、Gly-His-Thr-Ala-Pro-Gly-Pro-Leu-Leu-Val(配列番号:5)であり、
X3は、ProまたはLeuであり、
X4は、Phe-Thr-Leu-Asn-Phe-Thr-Ile-Thr-Asn(配列番号:1)であり、及び
X5は、Leu-Arg-Tyr-Glu-Glu-Asn-Met-Arg-His-Pro(配列番号:10)である。 - 該ペプチドが、Pro-Phe-Thr-Leu-Asn-Phe-Thr-Ile-Thr-Asn(配列番号:2)、Leu-Phe-Thr-Leu-Asn-Phe-Thr-Ile-Thr-Asn(配列番号:3)、Gly-His-Thr-Ala-Pro-Gly-Pro-Leu-Leu-Val-Pro-Phe-Thr-Leu-Asn-Phe-Thr-Ile-Thr-Asn(配列番号:11)またはPro-Phe-Thr-Leu-Asn-Phe-Thr-Ile-Thr-Asn-Leu-Arg-Tyr-Glu-Glu-Asn-Met-Arg-His-Pro(配列番号12)のいずれかである、請求項1に記載のペプチド。
- 該ペプチドが、Gly-His-Thr-Ala-Pro-Gly-Pro-Leu-Leu-Val-Pro-Phe-Thr-Leu-Asn-Phe-Thr-Ile-Thr-Asn(配列番号:11)またはPro-Phe-Thr-Leu-Asn-Phe-Thr-Ile-Thr-Asn-Leu-Arg-Tyr-Glu-Glu-Asn-Met-Arg-His-Pro(配列番号:12)である、請求項2に記載のペプチド。
- 卵巣癌関連抗原CA125のコアタンパク質MUC16由来である請求項1または2に記載のペプチド。
- 請求項1〜4のいずれかに記載のペプチドをコードしているDNA。
- 請求項5に記載のDNAを含むベクター。
- 請求項6記載のベクターが導入された形質転換体。
- 請求項7に記載の形質転換体を培養もしくは育種し、該細胞またはその培養上清から組換えタンパク質を回収する工程を含む、請求項1〜4のいずれか一項に記載のペプチドの製造方法。
- 請求項1〜4のいずれか一項に記載のペプチドを体外でヒト単核球サンプルに接触させる工程を含む、活性化されたT細胞を調製する方法。
- T細胞がIL-4を産生するヒトCD4陽性T細胞、IFNγを産生するヒトCD4陽性T細胞、TNFαを産生するヒトCD4陽性T細胞,TNFαを産生するヒトCD8陽性T細胞、である請求項9に記載の方法。
- 該ヒト単核球サンプルが、癌疾患または子宮内膜症を有する対象から採取されたものである、請求項9または10に記載の方法。
- 該対象が、抗癌剤による化学療法を受けたことのある対象である、請求項11に記載の方法。
- 抗癌剤による化学療法が自己末梢血幹細胞移植併用化学療法である、請求項12に記載の方法。
- 癌疾患が、卵巣癌、膵臓癌、または肺癌である請求項11〜13のいずれか一項に記載の方法。
- 子宮内膜症が、子宮腺筋症である請求項11に記載の方法。
- 請求項1〜4のいずれか一項に記載のペプチドを有効成分とする、癌疾患または子宮内膜症を、予防または治療するための薬剤。
- 癌疾患が、卵巣癌、膵臓癌、または肺癌である請求項16に記載の薬剤。
- 子宮内膜症が、子宮腺筋症である請求項16に記載の薬剤。
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