ITMI20081119A1 - Frammenti di muc16 ad attivita antigenica e composizioni farmaceutiche che li contengono - Google Patents
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Description
Descrizione del brevetto per invenzione industriale avente per titolo:
“FRAMMENTI DI MUC16 AD ATTIVITÀ ANTIGENICA E COMPOSIZIONI FARMACEUTICHE CHE LI CONTENGONO”
Campo dell’invenzione
L’invenzione riguarda composizioni farmaceutiche per somministrazione parenterale come vaccini. Più in particolare vengono identificati frammenti della proteina MUC16 (CA125) con caratteristiche immunogeniche e si descrivono formulazioni farmaceutiche che li contengono, da soli o in miscela fra loro, per un utilizzo preferenziale come vaccino antitumorale.
Stato dell’arte
MUC16 (nota anche come CA125, sequenza disponibile sul sito www.expasy.ch della Swiss-Prot/TrEMBL (accession number Q8WXI7, secondary number Q6ZQW5 Q96RK2); si vedano anche Tumor Biology 2002; 23:154-169 e Tumor Biology 2001; 22:348-366) è una glicoproteina ad alto peso molecolare, facente parte della famiglia delle mucine. È una proteina di membrana, che, a seguito di taglio proteolitico, può essere rilasciata nello spazio extracellulare.
MUC16 è espressa nell’epitelio celomatico e nei suoi derivati, nell’epitelio del tratto genitale femminile, del pancreas, dello stomaco, del polmone, del rene e della mammella, sulla superficie oculare. È inoltre presente in forma solubile nelle secrezioni dei tessuti epiteliali e nelle ghiandole submucosali dell’apparato respiratorio umano.
La peculiarità di questa proteina è di essere sovraespressa sulla membrana delle cellule di diversi tipi di tumore, in particolare nel carcinoma ovarico epiteliale. Inoltre i livelli sierici della proteina sono elevati in oltre l'80% delle pazienti con questa patologia. Per questo motivo, la concentrazione sierica di CA125 è normalmente utilizzata come marker tumorale per le pazienti con carcinoma ovarico.
La proteina fu originariamente identificata nel 1981, grazie all’utilizzo di un anticorpo monoclonale murino (denominato OC125), capace di legarsi alla superficie delle cellule di tumore ovarico. La struttura è stata definitivamente chiarita solo diversi anni dopo (O’Brien et al; Tumor Biol 2001, 22: 349-366; O’Brien et al; Tumor Biol 2002, 23: 154-169). MUC16 è costituita da 22152 aminoacidi, che possono essere suddivisi in tre domini:
- una regione carbossiterminale, costituita da una regione transmembrana e da una breve coda intracitoplasmatica
- una regione contenente un numero elevato (circa 60) di Tandem Repeat (ciascuno da 156 aminoacidi) e un linker (229 aa) prossimale alla membrana plasmatica
- una estesa regione aminoterminale O-glicosilata (12068 residui aminoacidici).
Sia la parte amino-terminale che i Tandem Repeat sono particolarmente ricchi in residui di treonina e serina e sono altamente glicosilati.
Il dominio centrale è altamente conservato; in particolare, all’interno di ogni Tandem Repeat è presente una sequenza di 19 aminoacidi, preceduta e seguita da cisteine, che presenta il più alto grado di omologia. Tale sequenza può formare un loop di cisteine e potenzialmente potrebbe avere un ruolo determinante nelle interazioni con le altre proteine della matrice extracellulare.
Il rilascio della MUC16 come proteina solubile nello spazio extracellulare sembra essere mediato dalla fosforilazione di serine e/o treonine nel breve dominio citoplasmatico. Il rilascio, e il conseguente aumento della concentrazione plasmatica, avviene quando è presente una patologia tumorale, ma anche in presenza di infiammazione. La funzione di MUC16 nel normale contesto fisiologico o nel cancro non è stata pienamente delucidata. Evidenze sperimentali suggeriscono che questa proteina possa avere più funzioni. È stato suggerito un ruolo di lubrificante, atto a prevenire l’adesione delle membrane, di immunosoppressore, sia per proteggere l’embrione da una eventuale reazione immunitaria della madre, sia come meccanismo di tumour escape nelle patologie tumorali (Kui Wong et al.; J. Biol. Chem.; 2003: 278 (31): 28619-34). Inoltre è stato dimostrato il binding della MUC16 a diverse proteine, quali ad esempio la galectina-1 e la mesotelina, entrambe implicate nella progressione tumorale.
La sovraespressione della MUC16 sulla membrana delle cellule tumorali (in particolare nella maggior parte dei tumori epiteliali ovarici) ne ha determinato l’identificazione quale Antigene Tumorale (TAA: Tumour Associated Antigen). Pur essendo sovraespressa, la MUC16 non viene tuttavia riconosciuta come estranea dal sistema immunitario delle pazienti che, quindi, nella maggior parte dei casi, non sviluppano una risposta immune specifica contro questa molecola. È stato dimostrato che, nelle pazienti con carcinoma ovarico, è possibile ottenere la rottura della tolleranza immunologica verso MUC16 tramite la vaccinazione con Abagovomab, un vaccino antitumorale costituito da un anticorpo monoclonale anti-idiotipo (EP700305, WO2008000789) diretto contro l’anticorpo monoclonale murino anti-MUC16 denominato OC125.
Grazie alla sua capacità di legarsi al sito di riconoscimento dell’antigene di OC125, Abagovomab costituisce un’immagine speculare di tale sito, riproducendo quindi la struttura della porzione di MUC16 riconosciuta da OC125.
La risposta immune, sia cellulare che umorale, indotta dalla vaccinazione con Abagovomab, è quindi diretta, oltre che contro l’abagovomab stesso, anche contro porzioni della MUC16 (Sabatini et al 2006, 12 (18): 5503-10).
Studi clinici in pazienti con carcinoma ovarico hanno suggerito l’esistenza di una correlazione tra l’attivazione della risposta immune indotta dalla vaccinazione con abagovomab e un prolungamento della sopravvivenza delle pazienti. Pertanto, strategie mirate ad attivare una risposta immune specifica contro MUC16 rappresentano potenziali approcci per controllare, - eliminandola o riducendola, - la crescita del tumore.
La disponibilità di Abagovomab non ha comunque esaurito la necessità di trovare dei metodi efficienti per stimolare una risposta immune verso CA125 allo scopo di contrastare o ridurre la crescita del tumore ovarico.
Descrizione dettagliata dell’invenzione
Dal momento che abagovomab mima una porzione della MUC-16, è stato ipotizzato e dimostrato che specifici epitopi di tale proteina, opportunamente formulati e somministrati, sono in grado di indurre una risposta immune, capace di interferire con la crescita e/o la metastatizzazione di cellule tumorali positive per la MUC16.
Sorprendentemente, abbiamo potuto dimostrare che, benché la proteina MUC16 intera non sia di per sé immunogenica, frammenti di MUC16 di diversa lunghezza, somministrati da soli, in combinazione, con o senza adiuvante, sono in grado di indurre una risposta immune specifica, sia anticorpale che cellulare in modelli animali, e sono pertanto candidati allo sviluppo di vaccini antitumorali nell’uomo.
In particolare abbiamo dimostrato che peptidi con sequenze specifiche, presenti all’interno dei Tandem Repeat, quando opportunamente somministrati in modelli animali, inducono la produzione di anticorpi capaci di riconoscere non solo il peptide stesso, ma anche la proteina MUC16 integra. In particolare sono risultati attivi peptidi di 19 aminoacidi, la cui sequenza risulta altamente conservata nei diversi Tandem Repeat, dove sono preceduti e seguiti da residui di cisteine. All’interno di tali peptidi sono stati identificati frammenti con sequenze di 15, 12 e 9 aminoacidi capaci di indurre, quando opportunamente somministrati, anche una risposta immune cellulo-mediata contro MUC16.
Pertanto, peptidi derivati dalle sequenze dei Tandem Repeat, da soli o in combinazione, eventualmente in presenza di specifici adiuvanti, possono essere utilizzati come vaccini per indurre una risposta immunologica contro l’antigene MUC16, sovraespresso sulla superficie delle cellule tumorali.
Un primo aspetto dell’invenzione si riferisce a un frammento peptidico della proteina MUC16 umana, detto frammento peptidico essendo scelto all’interno del seguente gruppo:
1) RLTLLRSEKDGAATGVDAI
2) RLTSLRSEKDGAATGVDAI
3) RLTLLRPEKDGAATGVDAI
4) RLTLLRPEKHGAATGVDAI
5) RLISLRSEKDGAATGVDAI
6) RLTLLRPKKDGAATGVDAI
7) RLTLLRPEKDGTATGVDAI
8) RLTLLRPEKRGAATGVDTI
9) RLTLLRPEKDGAATRVDAV
10) RLTLLRPEKNGAATGMDAI
11) RLTLLRPKKDGAATKVDAI
12) RLTLLRPEKDGAATRVDAA
13) RLTLLRPEKDKAATRVDAI
14) RLTLLRPEKDGVATRVDAI
15) RLTSLRPEKDGAATGMDAV
16) RLTLLRPEKQEAATGVDTI
17) RLTLLRPEKHEAATGVDTI
18) RLTLLRPEKDGEATGVDAI
19) RLTTLRPKKDGAATKVDAI
20) RLTLLRPEKNGATTGMDAI
21) RLTLLRPEKNGAATRVDAV
22) RLASLRPEKDSSAMAVDAI
L’invenzione comprende inoltre un analogo di detto frammento peptidico, avente, rispetto a quest’ultimo, un’identità di sequenza di almeno 80%, preferibilmente almeno 90%, più preferibilmente almeno 95%.
Inoltre, l’invenzione comprende un frammento di MUC16, come sopra definito, alle cui estremità N- e C-terminali sono legate, indipendentemente una dall’altra, due sequenze aggiuntive contenenti da 1 a 6 amminoacidi, identiche alle sequenze presenti nelle corrispondenti posizioni della proteina MUC16 oppure aventi, rispetto a queste ultime, un’identità di almeno 50%.
In una realizzazione preferita dell’invenzione, i frammenti della proteina MUC16 umana sopra identificati recano due residui Cys aggiuntivi alle estremità amminica e carbossilica. La presenza di cisteine rende possibile la formazione di un ciclo mediante un legame S-S, sia a livello di preparazione sia direttamente nel sistema biologico, con la conseguente acquisizione di una struttura secondaria simile a quella presente nella proteina intera.
In un altro aspetto l’invenzione si riferisce a un frammento della proteina MUC16 umana, contenente 15 amminoacidi contigui all’interno di una delle sequenze sopra identificate (1-21), o un suo analogo con identità di sequenza di almeno 80%. Preferibilmente detto frammento di 15 aa è scelto all’interno del seguente gruppo:
23) RLTLLRSEKDGAATG
24) LTLLRSEKDGAATGV
25) TLLRSEKDGAATGVD
26) LLRSEKDGAATGVDA
27) LRSEKDGAATGVDAI
28) RLTLLRPEKDGAATG
29) LTLLRPEKDGAATGV
30) TLLRPEKDGAATGVD
31) LLRPEKDGAATGVDA
32) LRPEKDGAATGVDAI
In un ulteriore aspetto l’invenzione si riferisce a un frammento della proteina MUC16 umana, contenente 12 amminoacidi contigui all’interno di una delle sequenze sopra identificate (1-21), o un suo analogo con identità di sequenza di almeno 80%. Preferibilmente detto frammento di 12 aa è scelto all’interno del seguente gruppo:
33) RLTLLRSEKDGA
34) LTLLRSEKDGAA
35) TLLRSEKDGAAT
36) LLRSEKDGAATG
37) LRSEKDGAATGV
38) RSEKDGAATGVD
39) SEKDGAATGVDA
40) EKDGAATGVDAI
41) RLTLLRPEKDGA
42) LTLLRPEKDGAA
43) TLLRPEKDGAAT
44) LLRPEKDGAATG
45) LRPEKDGAATGV
46) RPEKDGAATGVD
47) PEKDGAATGVDA
In un ulteriore aspetto l’invenzione si riferisce a un frammento della proteina MUC16 umana, contenente 9 amminoacidi contigui all’interno di una delle sequenze sopra identificate (1-21), o un suo analogo con identità di sequenza di almeno 80%. Preferibilmente detto frammento di 9 aa è scelto all’interno del seguente gruppo:
48) RLTLLRPEK
49) LTLLRPEKD
50) TLLRPEKDG
51) LLRPEKDGA
52) LRPEKDGAA
53) RPEKDGAAT
54) PEKDGAATG
55) EKDGAATGV
56) KDGAATGVD
57) DGAATGVDA
58) GAATGVDAI
59) RLTLLRSEK
60) LTLLRSEKD
61) TLLRSEKDG
62) LLRSEKDGA
63) LRSEKDGAA
64) RSEKDGAAT
65) SEKDGAATG
Sono anche compresi nell’invenzione i sali farmaceuticamente accettabili di detti frammenti, ottenuti con acidi scelti preferibilmente fra cloridrico, fosforico, acetico.
In una realizzazione preferita, le estremità N- e C-terminali possono essere, indipendentemente fra di loro, rispettivamente acetilata e ammidata.
In un ulteriore aspetto l’invenzione si riferisce a un frammento della proteina MUC16 umana comprendente unità Tandem Repeats multiple (identificate a partire dalla sequenza della proteina disponibile sul sito www.expasy.ch della Swiss-Prot/TrEMBL), detto frammento essendo preferibilmente scelto all’interno del gruppo comprendente le sequenze 1-60 riportate in Figura. Sono altresì compresi nell’invenzione gli analoghi di detto frammento, aventi, rispetto a questo, un’identità di sequenza di almeno 80%, preferibilmente almeno 90%, più preferibilmente almeno 95%.
I frammenti della MUC16 descritti, da soli o in miscele, sono stati usati per la preparazione di composizioni farmaceutiche utilizzabili come vaccini antitumorali per la stimolazione di una risposta immune contro la MUC-16 sovraespressa da cellule cancerose. Tali composizioni sono adatte per il trattamento di patologie tumorali umane in pazienti che necessitano di tale trattamento.
Un ulteriore aspetto dell’invenzione riguarda pertanto una composizione farmaceutica contenente, in qualità di principio attivo, uno o più frammenti della proteina MUC16 umana come sopra definiti.
In una realizzazione preferita, detta composizione farmaceutica contiene una delle seguenti miscele di frammenti (questi ultimi sono identificati dai numeri progressivi riportati sopra):
a) 1-5
b) 6-10
c) 11-15
d) 16-22
e) 1-3
f) 4-6
h) 11-13
i) 14-16
j) 17-22
k) 1-22
l) 23-27
m) 28-32
n) 33-40
o) 41-47
p) 48-65
q) 48-54
r) 55-58
s) 59-65
Preferibilmente la composizione farmaceutica è in forma di vaccino antitumorale. La quantità di principio attivo può variare da 0,05 mg a 10 mg per singola dose, preferibilmente da 0,2 mg a 3 mg per singola dose, e ancora più preferibilmente da 1 a 2,5 mg per dose.
A seconda dei volumi impiegati si potrà ottenere una concentrazione di principio attivo, come peptidi singoli o in miscela, da 0,02 mg/ml a 5 mg/ml, preferibilmente da 1 mg/ml a 2,5 mg/ml.
In aggiunta al principio attivo si potrà impiegare uno o più adiuvanti scelti fra quelli comunemente utilizzati nella tecnica per la preparazioni di vaccini. Sono preferiti, come adiuvanti, i sali di alluminio, quali Al(OH)3, alluminio idrossido gel (Alugel) o alluminio fosfato, i sali di calcio, quali il fosfato di calcio. Maggiormente preferiti sono i sali di alluminio. Nel caso dei sali di alluminio, la quantità di adiuvante preferita è da 0,1 mg di ione alluminio Al<3+>a 7 mg di Al<3+>, preferibilmente da 0,5 mg a 4 mg di ione Al<3+>. A seconda dei volumi impiegati si potrà avere una concentrazione di ione alluminio Al<3+>che varia da 0,05 mg/ml a 7 mg/ml, preferibilmente da 0,5 a 4 mg/ml.
Le composizioni usate sono in genere a base acquosa, ma possono contenere anche una percentuale, comunque inferiore al 20%, di altri solventi, quali alcoli o glicoli.
Nelle composizioni si possono anche impiegare sistemi tampone; preferiti sono i tamponi a base di sali contenenti fosfati o citrati.
Nelle composizioni possono essere eventualmente presenti anche altri eccipienti farmaceuticamente accettabili, quali stabilizzanti, antiossidanti.
Le composizioni farmaceutiche sono in forma adatta per una somministrazione parenterale, preferibilmente come iniezioni per via sottocutanea o intramuscolare.
Il volume di ogni unità di dosaggio così preparata può essere compreso fra 0,1 ml e 3 ml, preferibilmente fra 0,3 ml e 2 ml, il volume fra 0,8 e 1,2 ml essendo in assoluto il preferito.
Esempi non limitanti di composizioni secondo la presente invenzione sono: Esempio 1: sospensione per iniezione
Ingredienti mg/ml
Peptide n1 2,00
Al(OH)310,00
KCl 0,20
KH2PO40,20
NaCl 8,00
Na2HPO4x 7 H2O 2,16
Acqua per iniezioni qb 1,00 ml Esempio 2: sospensione per iniezione Ingredienti mg/ml Peptide n3 1,5 Al(OH)37,5 KCl 0,15 KH2PO40,15 NaCl 6,00 Na2HPO4x 7 H2O 1,62 Acqua per iniezioni qb 0,75 ml Esempio 3: sospensione per iniezione Ingredienti mg/ml Peptide n9 2,00 Al(OH)310,00 KCl 0,20 KH2PO40,20 NaCl 8,00 Na2HPO4x 7 H2O 2,16 Acqua per iniezioni qb 0,75 ml Esempio 4: sospensione per iniezione Ingredienti mg/ml Peptide n 22 2,00 Al(OH)310,00 KCl 0,20 KH2PO40,20 NaCl 8,00 Na2HPO4x 7 H2O 2,16 Acqua per iniezioni qb 1,20 ml Esempio 5: sospensione per iniezione Ingredienti mg/ml Peptide n 39 2,50 Al(OH)315,00 KCl 0,25 KH2PO40,25 NaCl 10,00 Na2HPO4x 7 H2O 2,70 Acqua per iniezioni qb 1,20 ml Esempio 6: sospensione per iniezione Ingredienti mg/ml Peptide n64 2,00 Al(OH)310,00 KCl 0,20 KH2PO40,20 NaCl 8,00 Na2HPO4x 7 H2O 2,16 Acqua per iniezioni qb 1,00 ml Esempio 7: sospensione per iniezione Ingredienti mg/ml Miscela n k 2,00 AlPO410,00 KCl 0,20
KH2PO40,20
NaCl 8,00
Na2HPO4x 7 H2O 2,16
Acqua per iniezioni qb 1,00 ml
Esempio 8: sospensione per iniezione
Ingredienti mg/ml
Miscela n a 2,00
Al(OH)310,00
KCl 0,20
KH2PO40,20
NaCl 8,00
Na2HPO4x 7 H2O 2,16
Acqua per iniezioni qb 1,00 ml
Esempio 9: sospensione per iniezione
Ingredienti mg/ml
Miscela n q 2,00
Al(OH)310,00
KCl 0,20
KH2PO40,20
NaCl 8,00
Na2HPO4x 7 H2O 2,16
Acqua per iniezioni qb 1,00 ml
Sintesi e verifica della sequenza e della purezza
Tutte le sintesi dei peptidi sono state condotte in fase solida mediante l’ausilio di un sintetizzatore Symphony (Protein Technologies) usando una classica strategia Fmoc (8-fluorenil-metossicarbonile). I peptidi con l’estremità carbossilica libera sono stati accresciuti sull’opportuna resina WANG precaricata con il primo amminoacido della sequenza (acquistabili da catalogo Novabiochem), ed eventualmente acetilati sull’estremità N-terminale per trattamento con anidride acetica e di-isopropil-etil-ammina (DIPEA) in DMF. I peptidi ammidati all’estremità carbossiterminale sono invece stati costruiti usando una classica resina ammidica, scelta tra Fmoc-PAL-PEG-PS-resin (applied Biosistems), Rink amide AM resin e Rink amide HMBA resin (Novabiochem). Anche in questi casi si è usata una classica strategia Fmoc e l’eventuale acetilazione sull’NH2terminale è stata effettuata per trattamento con anidride acetica e DIPEA in DMF. Ogni accoppiamento ha previsto l’utilizzo di 4 eq di Fmoc-aminoacido, ove necessario opportunamente protetto sulla catena laterale, 4 eq di O-(Benzotriazol-1-il)-N,N,N’,N’-tetrametiluronio tetrafluoroborato (TBTU) e 8 eq di DIPEA in DMF per tempi compresi tra 30 minuti e 1 ora. Per ogni aminoacido è stato routinariamente effettuato un doppio accoppiamento nelle condizioni sopradescritte. Per lo sblocco del gruppo Fmoc è stata utilizzata una soluzione di piperidina al 20% in DMF mantenuta in contatto con la resina per 2 periodi di 5 minuti. Tutti i lavaggi e i rigonfiamenti sono stati effettuati in DMF tranne quello che ha preceduto il distacco dalla resina che ha previsto l’utilizzo del diclorometano. Il distacco è condotto per trattamento con una miscela acido trifluoroacetico (TFA) / acqua / Triisopropilsilano (TIPS) in rapporto 95/2.5/2.5 v/v/v per tempi compresi tra le 2 e le 3 ore. I peptidi così ottenuti sono stati precipitati con etere etilico. I filtrati, seccati sotto vuoto, sono stati analizzati per HPLC in fase inversa utilizzando una colonna Luna C8 (2) di dimensioni 250 x 4,6 mm, granulometria 5 micron, montata su un HPLC 1100 agilent, usando gradienti Acqua / acetonitrile contenenti l’1% di TFA. I peptidi sono quindi stati purificati su una colonna Luna C8 (2) di dimensioni 250 x 50 mm, granulometria 15 micron, con l’ausilio di uno strumento Waters Prep 4000, usando gradienti Acqua / acetonitrile contenenti l’1% di TFA. Tutti i prodotti sono stati ottenuti con una purezza HPLC > 95% (a 210 nm). La conferma dell’identità strutturale è stata condotta tramite analisi di MS su sistema HPLC-MS LCQ thermofinnigan interfacciato con un HPLC-1100 Agilent dotato anch’esso di detector UV diode- array. La tecnica di ionizzazione usata è l’electrospray positivo. I campioni sono stati analizzati mediante massa singola e MS/MS “data dependent”, usando una finestra di isolamento di 2 unità di massa, un q di attivazione = 0,2, e una energia di collisione normalizzata relativa = 40%.
Test biologici: descrizione e risultati
È stata valutata la capacità del vaccino di indurre una risposta immune specifica in conigli New Zealand White Specific Pathogen Free (peso 2 kg; 9-11 settimane di età). La specie e il ceppo sono stati scelti perché studi svolti in precedenza hanno dimostrato che la MUC16 è espressa in questi animali con un pattern di espressione simile a quello presente nell’uomo.
Sono stati utilizzati 5 animali per gruppo. Il vaccino è stato somministrato per via sottocutanea, nel dorso, dopo rasatura delle superficie interessata. Il trattamento (2 mg di peptide) è stato somministrato una volta a settimana per 4 settimane. Al termine della quarta settimana è stato prelevato un campione di sangue per eseguire gli opportuni saggi immunologici. Alcuni animali sono stati vaccinati con un peptide di controllo, con sequenza non correlata.
Durante il periodo di trattamento non sono stati registrati segni di tossicità, con esclusione di alcuni casi di lieve infiammazione al sito di iniezione.
Valutazione della risposta anticorpale
La risposta immune è stata valutata misurando la presenza nel siero degli animali vaccinati di anticorpi diretti contro il peptide utilizzato per la vaccinazione e contro la MUC16 intera, utilizzando un saggio ELISA. In breve, il peptide (o la MUC16) è stato fatto aderire alla plastica di piastre da 96 pozzetti (2h, temperatura ambiente, in agitazione).
I pozzetti sono poi stati lavati ed è stata aggiunta la soluzione di bloccaggio (1h, temperatura ambiente, in agitazione). Dopo opportuni lavaggi (3x), è stato aggiunto il siero ottenuto dagli animali (1h, temperatura ambiente, in agitazione).
Dopo lavaggio, la presenza di anticorpi specifici è stata valutata utilizzando un anticorpo anti- IgG di coniglio, specifico per Fc, coniugato a HRP (1h, temperatura ambiente, in agitazione).
Le piastre sono poi state lavate per 3 volte ed è stato aggiunto il substrato ABTS. Le piastre sono state tenute al riparo dalla luce. La lettura (405nm, reference wavelenght 492 nm) è stata effettuata 30 minuti dopo l’aggiunta del substrato, utilizzando un lettore per micropiastre.
Si riportano a titolo esemplificativo, ma non limitante, alcuni dei risultati ottenuti:
Tabella I: Frammenti di 19 aminoacidi
Tabella II: Frammenti di 15 aminoacidi
Tabella III: Frammenti con 12 aminoacidi
Combinazioni
Valutazione della risposta cellulare
La risposta cellulare è stata valutata misurando la proliferazione dei PBMC o dei linfociti linfonodali prelevati da coniglio immunizzati o non con le diverse preparazioni.
Il saggio è fatto in triplicato in piastre da 96 pozzetti, utilizzando un kit commerciale (Roche Cell proliferation ELISA cat n° 11647229001).
In breve, 1,2 x10<5>cellule sospese in RPMI 2% rabbit serum vengono coltivate in ciascun pozzetto della piastra in presenza di un mitogeno standard come PHA (5, 1, 0,1 µg/ml) o del/dei peptide/i utilizzati per la vaccinazione per un periodo di tempo di 4-5 gg o di 10 gg. 24 h prima della fine del periodo d’incubazione viene aggiunta BrdU alla concentrazione di 10 µM. Alla fine del periodo d’incubazione, le piastre contenenti i linfociti sono centrifugate ed il terreno di coltura dei pozzetti in parte aspirato. Le piastre sono messe ad essiccare a 65°C per due ore. Dopo l’essiccatura vengono aggiunti 200 µl di FixDen solution per 1 ora, quindi la blocking solution per bloccare l’aspecifico, ed infine l’anticorpo anti BrdU dil 1:100 per 1 ora e mezza.
Al termine dell’incubazione con l’anticorpo si fanno 5-6 lavaggi con il Washing buffer, quindi si aggiunge la soluzione substrato per 5-10 min e si blocca la reazione con 25 µl di soluzione bloccante. Infine si legge la piastra a 450 nm (lunghezza d’onda di riferimento 600 nm).
Si riporta a titolo esemplificativo, ma non limitante, alcuni dei risultati ottenuti.
Combinazioni
Nella presente descrizione gli amminoacidi naturali vengono indicati nella notazione ad una sola lettera. Di seguito si riporta una tabella esemplificativa ove si riportano le notazioni ad una lettera ed a tre lettere per gli ammino acidi naturali.
LISTA DELLE SEQUENZE
<110> Menarini International Operation Luxembourg S.A.
<120> Frammenti di MUC16 ad attività antigenica e composizioni farmaceutiche che li contengono
<130> 8325M
<160> 65
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 19
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 1
Arg Leu Thr Leu Leu Arg Ser Glu Lys Asp Gly Ala Ala Thr Gly Val 1 5 10 15
Asp Ala Ile
<210> 2
<211> 19
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 2
Arg Leu Thr Ser Leu Arg Ser Glu Lys Asp Gly Ala Ala Thr Gly Val 1 5 10 15
Asp Ala Ile
<210> 3
<211> 19
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 3
Arg Leu Thr Leu Leu Arg Pro Glu Lys Asp Gly Ala Ala Thr Gly Val 1 5 10 15
Asp Ala Ile
<210> 4
<211> 19
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 4
Arg Leu Thr Leu Leu Arg Pro Glu Lys His Gly Ala Ala Thr Gly Val 1 5 10 15
Asp Ala Ile
<210> 5
<211> 19
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 5
Arg Leu Ile Ser Leu Arg Ser Glu Lys Asp Gly Ala Ala Thr Gly Val 1 5 10 15
Asp Ala Ile
<210> 6
<211> 19
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 6
Arg Leu Thr Leu Leu Arg Pro Lys Lys Asp Gly Ala Ala Thr Gly Val 1 5 10 15
Asp Ala Ile
<210> 7
<211> 19
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 7
Arg Leu Thr Leu Leu Arg Pro Glu Lys Asp Gly Thr Ala Thr Gly Val 1 5 10 15
Asp Ala Ile
<210> 8
<211> 19
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 8
Arg Leu Thr Leu Leu Arg Pro Glu Lys Arg Gly Ala Ala Thr Gly Val 1 5 10 15
Asp Thr Ile
<211> 19
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 9
Arg Leu Thr Leu Leu Arg Pro Glu Lys Asp Gly Ala Ala Thr Arg Val 1 5 10 15
Asp Ala Val
<210> 10
<211> 19
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 10
Arg Leu Thr Leu Leu Arg Pro Glu Lys Asn Gly Ala Ala Thr Gly Met 1 5 10 15
Asp Ala Ile
<210> 11
<211> 19
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 11
Arg Leu Thr Leu Leu Arg Pro Lys Lys Asp Gly Ala Ala Thr Lys Val 1 5 10 15
Asp Ala Ile
<210> 12
<211> 19
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 12
Arg Leu Thr Leu Leu Arg Pro Glu Lys Asp Gly Ala Ala Thr Arg Val 1 5 10 15
Asp Ala Ala
<210> 13
<211> 19
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 13
Arg Leu Thr Leu Leu Arg Pro Glu Lys Asp Lys Ala Ala Thr Arg Val 1 5 10 15
Asp Ala Ile
<210> 14
<211> 19
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 14
Arg Leu Thr Leu Leu Arg Pro Glu Lys Asp Gly Val Ala Thr Arg Val 1 5 10 15
Asp Ala Ile
<210> 15
<211> 19
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 15
Arg Leu Thr Ser Leu Arg Pro Glu Lys Asp Gly Ala Ala Thr Gly Met 1 5 10 15
Asp Ala Val
<210> 16
<211> 19
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 16
Arg Leu Thr Leu Leu Arg Pro Glu Lys Gln Glu Ala Ala Thr Gly Val 1 5 10 15
Asp Thr Ile
<210> 17
<211> 19
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 17
Arg Leu Thr Leu Leu Arg Pro Glu Lys His Glu Ala Ala Thr Gly Val 1 5 10 15
Asp Thr Ile
<210> 18
<211> 19
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 18
Arg Leu Thr Leu Leu Arg Pro Glu Lys Asp Gly Glu Ala Thr Gly Val 1 5 10 15
Asp Ala Ile
<210> 19
<211> 19
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 19
Arg Leu Thr Thr Leu Arg Pro Lys Lys Asp Gly Ala Ala Thr Lys Val 1 5 10 15
Asp Ala Ile
<210> 20
<211> 19
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 20
Arg Leu Thr Leu Leu Arg Pro Glu Lys Asn Gly Ala Thr Thr Gly Met 1 5 10 15
Asp Ala Ile
<210> 21
<211> 19
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 21
Arg Leu Thr Leu Leu Arg Pro Glu Lys Asn Gly Ala Ala Thr Arg Val 1 5 10 15
Asp Ala Val
<211> 19
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 22
Arg Leu Ala Ser Leu Arg Pro Glu Lys Asp Ser Ser Ala Met Ala Val 1 5 10 15
Asp Ala Ile
<210> 23
<211> 15
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 23
Arg Leu Thr Leu Leu Arg Ser Glu Lys Asp Gly Ala Ala Thr Gly 1 5 10 15
<210> 24
<211> 15
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 24
Leu Thr Leu Leu Arg Ser Glu Lys Asp Gly Ala Ala Thr Gly Val 1 5 10 15
<210> 25
<211> 15
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 25
Thr Leu Leu Arg Ser Glu Lys Asp Gly Ala Ala Thr Gly Val Asp 1 5 10 15
<210> 26
<211> 15
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 26
Leu Leu Arg Ser Glu Lys Asp Gly Ala Ala Thr Gly Val Asp Ala 1 5 10 15
<210> 27
<211> 15
<212> PRT
<213> Homo sapiens
Leu Arg Ser Glu Lys Asp Gly Ala Ala Thr Gly Val Asp Ala Ile 1 5 10 15
<210> 28
<211> 15
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 28
Arg Leu Thr Leu Leu Arg Pro Glu Lys Asp Gly Ala Ala Thr Gly 1 5 10 15
<210> 29
<211> 15
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 29
Leu Thr Leu Leu Arg Pro Glu Lys Asp Gly Ala Ala Thr Gly Val 1 5 10 15
<210> 30
<211> 15
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 30
Thr Leu Leu Arg Pro Glu Lys Asp Gly Ala Ala Thr Gly Val Asp 1 5 10 15
<210> 31
<211> 15
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 31
Leu Leu Arg Pro Glu Lys Asp Gly Ala Ala Thr Gly Val Asp Ala 1 5 10 15
<210> 32
<211> 15
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 32
Leu Arg Pro Glu Lys Asp Gly Ala Ala Thr Gly Val Asp Ala Ile 1 5 10 15
<210> 33
<211> 12
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 33
Arg Leu Thr Leu Leu Arg Ser Glu Lys Asp Gly Ala 1 5 10
<210> 34
<211> 12
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 34
Leu Thr Leu Leu Arg Ser Glu Lys Asp Gly Ala Ala 1 5 10
<210> 35
<211> 12
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 35
Thr Leu Leu Arg Ser Glu Lys Asp Gly Ala Ala Thr 1 5 10
<210> 36
<211> 12
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 36
Leu Leu Arg Ser Glu Lys Asp Gly Ala Ala Thr Gly 1 5 10
<210> 37
<211> 12
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 37
Leu Arg Ser Glu Lys Asp Gly Ala Ala Thr Gly Val 1 5 10
<210> 38
<211> 12
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 38
Arg Ser Glu Lys Asp Gly Ala Ala Thr Gly Val Asp 1 5 10
<210> 39
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 39
Ser Glu Lys Asp Gly Ala Ala Thr Gly Val Asp Ala 1 5 10
<210> 40
<211> 12
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 40
Glu Lys Asp Gly Ala Ala Thr Gly Val Asp Ala Ile 1 5 10
<210> 41
<211> 12
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 41
Arg Leu Thr Leu Leu Arg Pro Glu Lys Asp Gly Ala 1 5 10
<210> 42
<211> 12
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 42
Leu Thr Leu Leu Arg Pro Glu Lys Asp Gly Ala Ala 1 5 10
<210> 43
<211> 12
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 43
Thr Leu Leu Arg Pro Glu Lys Asp Gly Ala Ala Thr 1 5 10
<210> 44
<211> 12
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 44
Leu Leu Arg Pro Glu Lys Asp Gly Ala Ala Thr Gly 1 5 10 <211> 12
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 45
Leu Arg Pro Glu Lys Asp Gly Ala Ala Thr Gly Val 1 5 10
<210> 46
<211> 12
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 46
Arg Pro Glu Lys Asp Gly Ala Ala Thr Gly Val Asp 1 5 10
<210> 47
<211> 12
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 47
Pro Glu Lys Asp Gly Ala Ala Thr Gly Val Asp Ala 1 5 10
<210> 48
<211> 9
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 48
Arg Leu Thr Leu Leu Arg Pro Glu Lys
1 5
<210> 49
<211> 9
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 49
Leu Thr Leu Leu Arg Pro Glu Lys Asp
1 5
<210> 50
<211> 9
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 50
Thr Leu Leu Arg Pro Glu Lys Asp Gly
1 5
<211> 9
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 51
Leu Leu Arg Pro Glu Lys Asp Gly Ala 1 5
<210> 52
<211> 9
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 52
Leu Arg Pro Glu Lys Asp Gly Ala Ala 1 5
<210> 53
<211> 9
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 53
Arg Pro Glu Lys Asp Gly Ala Ala Thr 1 5
<210> 54
<211> 9
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 54
Pro Glu Lys Asp Gly Ala Ala Thr Gly 1 5
<210> 55
<211> 9
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 55
Glu Lys Asp Gly Ala Ala Thr Gly Val 1 5
<210> 56
<211> 9
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 56
Lys Asp Gly Ala Ala Thr Gly Val Asp 1 5
<211> 9
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 57
Asp Gly Ala Ala Thr Gly Val Asp Ala 1 5
<210> 58
<211> 9
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 58
Gly Ala Ala Thr Gly Val Asp Ala Ile 1 5
<210> 59
<211> 9
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 59
Arg Leu Thr Leu Leu Arg Ser Glu Lys 1 5
<210> 60
<211> 9
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 60
Leu Thr Leu Leu Arg Ser Glu Lys Asp 1 5
<210> 61
<211> 9
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 61
Thr Leu Leu Arg Ser Glu Lys Asp Gly 1 5
<210> 62
<211> 9
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 62
Leu Leu Arg Ser Glu Lys Asp Gly Ala 1 5
<211> 9
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 63
Leu Arg Ser Glu Lys Asp Gly Ala Ala 1 5
<210> 64
<211> 9
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 64
Arg Ser Glu Lys Asp Gly Ala Ala Thr 1 5
<210> 65
<211> 9
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 65
Ser Glu Lys Asp Gly Ala Ala Thr Gly 1 5
Claims (19)
- RIVENDICAZIONI 1. Frammento della proteina MUC16 umana, avente una sequenza scelta dal gruppo comprendente: 1. RLTLLRSEKDGAATGVDAI 2. RLTSLRSEKDGAATGVDAI 3. RLTLLRPEKDGAATGVDAI 4. RLTLLRPEKHGAATGVDAI 5. RLISLRSEKDGAATGVDAI 6. RLTLLRPKKDGAATGVDAI 7. RLTLLRPEKDGTATGVDAI 8. RLTLLRPEKRGAATGVDTI 9. RLTLLRPEKDGAATRVDAV 10. RLTLLRPEKNGAATGMDAI 11. 1RLTLLRPKKDGAATKVDAI 12. RLTLLRPEKDGAATRVDAA 13. RLTLLRPEKDKAATRVDAI 14. RLTLLRPEKDGVATRVDAI 15. RLTSLRPEKDGAATGMDAV 16. RLTLLRPEKQEAATGVDTI 17. RLTLLRPEKHEAATGVDTI 18. RLTLLRPEKDGEATGVDAI 19. RLTTLRPKKDGAATKVDAI 20. RLTLLRPEKNGATTGMDAI 21. RLTLLRPEKNGAATRVDAV 22. RLASLRPEKDSSAMAVDAI o un suo analogo avente un’identità di sequenza di almeno 80%, preferibilmente almeno 90%, più preferibilmente almeno 95%.
- 2. Frammento secondo la rivendicazione 1, alle cui estremità sono legate, indipendentemente una dall’altra, due sequenze aggiuntive contenenti da 1 a 6 amminoacidi, identiche alle sequenze presenti nelle corrispondenti posizioni della proteina MUC16 oppure aventi, rispetto a queste ultime, un’identità di almeno 50%.
- 3. Frammento della proteina MUC16 umana secondo la rivendicazioni 2, alle cui estremità è legato un residuo aggiuntivo di cisteina.
- 4. Frammento della proteina MUC16 umana, contenente 15 amminoacidi contigui all’interno di una delle sequenze identificate nella rivendicazione 1 con i numeri progressivi 1-21, o un suo analogo con identità di sequenza di almeno 80%.
- 5. Frammento secondo la rivendicazione 4, scelto dal gruppo comprendente: 23) RLTLLRSEKDGAATG 24) LTLLRSEKDGAATGV 25) TLLRSEKDGAATGVD 26) LLRSEKDGAATGVDA 27) LRSEKDGAATGVDAI 28) RLTLLRPEKDGAATG 29) LTLLRPEKDGAATGV 30) TLLRPEKDGAATGVD 31) LLRPEKDGAATGVDA 32) LRPEKDGAATGVDAI
- 6. Frammento della proteina MUC16 umana, contenente 12 amminoacidi contigui all’interno di una delle sequenze identificate nella rivendicazione 1 con i numeri progressivi 1-21, o un suo analogo con identità di sequenza di almeno 80%.
- 7. Frammento secondo la rivendicazione 6, scelto dal gruppo comprendente: 33) RLTLLRSEKDGA 34) LTLLRSEKDGAA 35) TLLRSEKDGAAT 36) LLRSEKDGAATG 37) LRSEKDGAATGV 38) RSEKDGAATGVD 39) SEKDGAATGVDA 40) EKDGAATGVDAI 41) RLTLLRPEKDGA 42) LTLLRPEKDGAA 43) TLLRPEKDGAAT 44) LLRPEKDGAATG 45) LRPEKDGAATGV 46) RPEKDGAATGVD 47) PEKDGAATGVDA
- 8. Frammento della proteina MUC16 umana, contenente 9 amminoacidi contigui all’interno di una delle sequenze identificate nella rivendicazione 1 con i numeri progressivi 1-21, o un suo analogo con identità di sequenza di almeno 80%.
- 9. Frammento secondo la rivendicazione 8, scelto dal gruppo comprendente: 48) RLTLLRPEK 49) LTLLRPEKD 50) TLLRPEKDG 51) LLRPEKDGA 52) LRPEKDGAA 53) RPEKDGAAT 54) PEKDGAATG 55) EKDGAATGV 56) KDGAATGVD 57) DGAATGVDA 58) GAATGVDAI 59) RLTLLRSEK 60) LTLLRSEKD 61) TLLRSEKDG 62) LLRSEKDGA 63) LRSEKDGAA 64) RSEKDGAAT 65) SEKDGAATG
- 10. Frammento della proteina MUC16 umana secondo le rivendicazioni 1-9, le cui estremità N- e C-terminali possono essere, indipendentemente fra di loro, rispettivamente acetilata e ammidata.
- 11. Composizione farmaceutica contenente come principio attivo uno o più frammenti della proteina MUC16 umana come definiti nelle rivendicazioni 1-10.
- 12. Composizione farmaceutica secondo la rivendicazione 11, contenente una delle seguenti miscele di frammenti (identificati dai numeri progressivi secondo le rivendicazioni 1, 5, 7 e 9): a) 1-5 b) 6-10 c) 11-15 d) 16-22 e) 1-3 f) 4-6 g) 7-10 h) 11-13 i) 14-16 j) 17-22 k) 1-22 l) 23-27 m) 28-32 n) 33-40 o) 41-47 p) 48-65 q) 48-54 r) 55-58 s) 59-65
- 13. Composizione farmaceutica secondo le rivendicazioni 11-12, in forma di vaccino antitumorale.
- 14. Composizione farmaceutica secondo le rivendicazione 11-13, contenente una quantità di principio attivo da 0,05 mg a 10 mg per singola dose.
- 15. Composizione farmaceutica secondo la rivendicazione 14, contenente una quantità di principio attivo da 0,2 mg a 3 mg per singola dose.
- 16. Composizione farmaceutica secondo la rivendicazione 15, contenente una quantità di principio attivo da 1 mg a 2,5 mg per singola dose.
- 17. Composizione farmaceutica secondo le rivendicazioni 11-16, contenente, in aggiunta al principio attivo, uno o più adiuvanti adatti alla preparazione di vaccini o altri eccipienti farmaceuticamente accettabili.
- 18. Composizione farmaceutica secondo le rivendicazioni 11-17, in forma adatta alla somministrazione parenterale
- 19. Uso di un frammento della proteina MUC16 umana secondo le rivendicazioni 1-10, o di una composizione secondo le rivendicazioni 11-18, per la preparazione di un vaccino per il trattamento preventivo o terapeutico del tumore.
Priority Applications (2)
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| ITMI20081119 ITMI20081119A1 (it) | 2008-06-19 | 2008-06-19 | Frammenti di muc16 ad attivita antigenica e composizioni farmaceutiche che li contengono |
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Applications Claiming Priority (1)
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Family Applications (1)
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|---|---|---|---|
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2008
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