KR102121638B1 - Wt1 항원 펩티드 콘쥬게이트 백신 - Google Patents

Wt1 항원 펩티드 콘쥬게이트 백신 Download PDF

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히토시 반
유키히로 니시오
마사시 고토
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요스케 다카나시
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다이닛본 스미토모 세이야꾸 가부시끼가이샤
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Abstract

본 발명은, 식 (1)
Figure 112015103012119-pct00153

[식 중, Xa 및 Ya는 단결합 등을 나타내고, 암 항원 펩티드 A는 7 내지 30 잔기의 아미노산을 포함하는 MHC 클래스 I 구속성 WT1 펩티드를 나타내고, R1은 수소 원자,
식 (2)
Figure 112015103012119-pct00154

(식 중, Xb 및 Yb는 단결합 등을 나타내고, 암 항원 펩티드 B는, 암 항원 펩티드 A와는 서열이 상이하고 또한 7 내지 30 잔기의 아미노산을 포함하는 MHC 클래스 I 구속성 WT1 펩티드를 나타냄)
로 표현되는 기, 또는 암 항원 펩티드 C를 나타내고, 암 항원 펩티드 C는, 암 항원 펩티드 A와는 서열이 상이하고 또한 1개의 시스테인 잔기를 포함하는 7 내지 30 잔기의 아미노산을 포함하는 MHC 클래스 I 구속성 WT1 펩티드 또는 MHC 클래스 II 구속성 WT1 펩티드를 나타냄]
로 표현되는 화합물 또는 그의 염 등을 제공한다.

Description

WT1 항원 펩티드 콘쥬게이트 백신{WT1-ANTIGEN PEPTIDE CONJUGATE VACCINE}
본 발명은, 암 면역 요법의 분야에 속하며, 펩티드 분해 효소 ERAP1에 의해 트리밍을 받을 수 있는, WT1 항원 단백질 유래의 암 항원 펩티드 전구체를 황-황 공유 결합을 통해서 복합화한, 세포 상해성 T 세포를 효율적으로 유도하는 복합화(콘쥬게이트) 백신에 관한 것이다.
생체에 의한 암 세포의 배제에는, 주로 세포성 면역, 특히 세포 상해성 T 세포(세포 상해성 T 임파구, 세포독성 T-림프구(Cytotoxic T-lymphocyte), 세포독성 T-세포(Cytotoxic T-cell); 이하, CTL이라고 함)가 중요한 작용을 하고 있다. CTL은, 암 항원 단백질 유래의 항원 펩티드(암 항원 펩티드)와 MHC 클래스 I 분자에 의해 형성되는 복합체를 인식한 전구체 T 세포가 분화 증식해서 생성되는 것으로, 암 세포를 공격한다.
윌름스(Wilms) 종양의 암 억제 유전자 WT1(WT1 유전자)는, 백혈병 및 고형 암에 있어서의 새로운 암 항원 단백질이라고 여겨지고 있다(비특허문헌 1 참조).
당해 WT1 단백질에 대해서, 예를 들어 이하의 MHC 클래스 I에 결합해서 제시되는 암 항원 펩티드가 보고되어 있다(특허문헌 1, 2 참조).
WT1126 -134 펩티드: RMFPNAPYL(Arg-Met-Phe-Pro-Asn-Ala-Pro-Tyr-Leu)(서열 번호: 2),
WT1235 -243 펩티드: CMTWNQMNL(Cys-Met-Thr-Trp-Asn-Gln-Met-Asn-Leu)(서열 번호: 3),
WT110 -18 펩티드: ALLPAVPSL(Ala-Leu-Leu-Pro-Ala-Val-Pro-Ser-Leu)(서열 번호: 5),
WT1187 -195 펩티드: SLGEQQYSV(Ser-Leu-Gly-Glu-Gln-Gln-Tyr-Ser-Val)(서열 번호: 6),
WT1302 -310 펩티드: RVPGVAPTL(Arg-Val-Pro-Gly-Val-Ala-Pro-Thr-Leu)(서열 번호: 7) 등.
암 면역 요법에 있어서 헬퍼 T 세포(helper T cell)의 활성화도, CTL을 포함하는 다른 T 세포의 기능 항진에 중요하다. 일반적으로, 항원 단백질은 세포내 리소좀으로 분해되어, 13 내지 17 잔기 정도의 아미노산을 포함하는 펩티드로 구성되는 단편 펩티드의 일부가, 항원 펩티드로서 MHC 클래스 II 분자에 결합하여, 헬퍼 T 세포의 TCR·CD3 복합체에 제시됨으로써 헬퍼 T 세포를 활성화한다. WT1 단백질에 대해서, 예를 들어 이하의 MHC 클래스 II에 결합해서 제시되는 암 항원 펩티드가 보고되어 있다(특허문헌 3 내지 5 참조).
WT1332 -347 펩티드: KRYFKLSHLQMHSRKH(Lys-Arg-Tyr-Phe-Lys-Leu-Ser-His-Leu-Gln-Met-His-Ser-Arg-Lys-His)(서열 번호: 8),
WT1328 -349 펩티드: PGCNKRYFKLSHLQMHSRKHTG(Pro-Gly-Cys-Asn-Lys-Arg-Tyr-Phe-Lys-Leu-Ser-His-Leu-Gln-Met-His-Ser-Arg-Lys-His-Thr-Gly)(서열 번호: 10),
WT1122 -140 펩티드: SGQARMFPNAPYLPSCLES(Ser-Gly-Gln-Ala-Arg-Met-Phe-Pro-Asn-Ala-Pro-Tyr-Leu-Pro-Ser-Cys-Leu-Glu-Ser)(서열 번호: 11) 등.
WT1의 백신 항원으로서, 주로 항원 단백질 그 자체 또는 상술한 바와 같은 항원 단백질 유래의 항원 펩티드가 사용된다(비특허문헌 2 참조). 단백질을 사용한 암 백신은, 통상 다양한 암 항원 펩티드를 포함하기 때문에, 복수의 CTL이나 헬퍼 T 세포를 동시에 유도 가능한 한편, 안정된 공급이나 품질의 관리에 과제를 갖기 때문에, 제조·품질 관리가 용이한 펩티드가 WT1의 암 항원으로서 범용되고 있다. 그러나, 일반적으로, 지금까지의 펩티드 백신은, 주로 단일한 MHC 클래스 I 제시 펩티드 항원으로 구성되어 있어, CTL을 효율적으로 유도하기 위해서는, 새로운 개량이 필요한 것이 최근 지적되고 있다(비특허문헌 3 참조).
그 해결책의 하나로서, 다가 항원 펩티드 제시형 WT1 펩티드 암 백신을 들 수 있다. 이러한 펩티드 암 백신으로서는, MHC 클래스 I 및 클래스 II에 제시되는 펩티드 항원을 복수 혼합한 칵테일 백신(비특허문헌 4 참조), MHC 클래스 I 및 클래스 II에 제시되는 펩티드 항원을 아미드 결합으로 연결한 장쇄 펩티드 백신 등이 보고되어 있다(비특허문헌 5 참조). 그러나, 칵테일 백신의 경우, 다양한 아미노산으로 조성된 각 펩티드 항원이 다양한 물성을 나타내기 때문에, 효율적으로 그것들에 대응하는 CTL을 유도하는 최적의 제제의 개발이 곤란한 경우가 많다. 또한, 장쇄 펩티드 백신의 경우, 단백질과 마찬가지로 그 제조에 과제를 갖는 경우가 있고, 또한 장쇄 펩티드 백신은 클래스 I 및 클래스 II에 제시되는 펩티드 항원을 임의의 펩티드 스페이서를 통해 결합하기 때문에, 세포내 효소에 의한 절단 부위의 제어 및 예측이 곤란하다. 한편, 2개의 펩티드 단량체가 서로 디술피드 결합에 의해 결합하고 있는 펩티드 이량체가 보고되어 있다(특허문헌 6 참조). 이들은, 칵테일 백신과 달리, 단일 펩티드 2개가 결합되어 있기 때문에, 단일한 물성을 가지면서 또한 간편하게 제조 가능하다. 한편, 복합화하기 위해서는, WT1 암 항원 펩티드는, 그 아미노산 서열 내에 시스테인을 포함할 필요가 있어, 그 범용성은 낮다. 또한, 암 항원 펩티드의 N 말단 시스테인을, 시스테인, 글루타티온 또는 티오글리콜산과 디술피드 결합으로 축합시켜서 얻어진 개변체도 보고되어 있다(특허문헌 7 참조).
MHC 클래스 I로의 암 항원 펩티드 제시에는 복수의 펩티다아제가 관여한다. 이들 펩티다아제 중 소포체 아미노펩티다아제 1(Endoplasmic reticulum aminopeptidase 1)(이하, ERAP1이라고 함)은, 소포체(Endoplasmic reticulum, 이하 ER이라고 함) 내의 트리밍 효소의 하나이며, 특정한 항원 펩티드 서열 및 펩티드의 길이를 인식해서, 암 항원 펩티드 전구체를 N-말단으로부터 절단하여, MHC 클래스 I에 대한 결합에 최적인 길이로 조절하는 것이 보고되어 있다(비특허문헌 6 내지 8 참조). 그러나, 지금까지, ERAP1에 의한 트리밍 기능에 의해 N-말단으로부터 길이 조절되는 시스테인을 포함하는 WT1 펩티드 암 항원 전구체의 보고는 없었다.
국제 공개 제00/06602호 국제 공개 제00/18795호 국제 공개 제2005/045027호 국제 공개 제2007/047764호 국제 공개 제2007/120673호 국제 공개 제2004/063217호 국제 공개 제2007/063903호
The Journal of Immunology, 2000;164(4);1873-1880 The Oncologist, 2012;17(2);250-259 Cancer Journal, 2011;17(5);343-350 Blood, 2010;166(2);171-179 Cancers, 2011;3;3991-4009 Proceedings of the National Academy of Sciences of United States of America, 2005;102(47);17107-17112 The Journal of Immunology, 2009;183;5526-5536 The Journal of Immunology, 2010;184;4725-4732
본 발명의 과제는, CTL을 효율적으로 유도하는 WT1 콘쥬게이트 백신을 제공하는 데 있다.
본 발명자들은, 상기 과제를 해결하고자 예의 검토한 결과, 콘쥬게이트 백신을 채용하는 것을 검토하는 중에, WT1 암 항원 펩티드에 시스테인을 부가하는 것을 착상하고, 또한 ERAP1이, 세포 내에서의 디술피드 결합의 환원적 개열에 의해 발생한 WT1 암 항원 펩티드 전구체의 N-말단으로부터 시스테인을 절단하여, 암 항원 펩티드로 효율적으로 변환하는 것이, 생체내 동물 모델에서의 약리 시험 등의 결과에 의해 강하게 시사되는 것을 확인함으로써, 체내에서 CTL을 유도할 수 있는 다가 항원 펩티드 제시형 콘쥬게이트 백신의 발견에 이르러, 본 발명을 완성하였다.
구체적으로는, 상기 과제의 해결책을 검토하는 과정에서, 상이한 2개의 WT1 암 항원 펩티드를 복합화할 때 필요한 시스테인을, MHC 클래스 I으로의 항원 제시에 영향을 받지 않고, N-말단 또는 C-말단에 임의의 위치에 도입하는 방법을 착상하였다. 더욱 검토한 결과, WT1 암 항원 펩티드의 N 말단에 시스테인을 포함하는 0 내지 5개의 아미노산을 도입한 펩티드나, 당해 펩티드의 시스테인을 통한 디술피드 결합을 포함하는 콘쥬게이트체를 창제하였다. 그리고, 당해 펩티드나 콘쥬게이트체가, 시험관내 및/또는 생체내에서 ERAP1에 의한 트리밍을 받기 쉽고, 그 결과 암 항원 펩티드를 생성하는 것을 본 발명자들이 처음으로 확인하여, 본 발명이 완성되었다.
제조가 용이하고, 범용성이 우수하고, 또한 CTL을 효율적으로 유도하는 신규의 다가 WT1 항원 펩티드 제시형 펩티드 암 백신의 개발이 요망되고 있었던 가운데, 본 발명자들이 발명한 콘쥬게이트체에 의해, CTL이 효율적으로 유도되고, 물리 화학적 성질이 우수하고, 제조가 용이하고, 제조의 관리도 용이하여, 범용성이 우수한 WT1 콘쥬게이트 백신을 개발하는 것이 가능하게 되었다.
즉, 본 발명은 이하의 것에 관한 것이다.
1. 제1 형태
항 1. 식 (1):
[화학식 1]
Figure 112015103012119-pct00001
[식 중, Xa 및 Ya는, 독립하여, 단결합 또는 1 내지 4 잔기의 아미노산을 포함하는 펩티드의 2가 기를 나타내고, Xa의 아미노산 잔기수와 Ya의 아미노산 잔기수의 합은 0 내지 4의 정수이며,
암 항원 펩티드 A는, 7 내지 30 잔기의 아미노산을 포함하는 MHC 클래스 I 구속성 WT1 펩티드를 나타내고, 암 항원 펩티드 A의 N 말단 아미노산의 아미노기가 식 (1) 중의 Ya와 결합하고, 암 항원 펩티드 A의 C 말단 아미노산의 카르보닐기가 식 (1) 중의 수산기와 결합하고,
R1은 수소 원자, 식 (2):
[화학식 2]
Figure 112015103012119-pct00002
(식 중, Xb 및 Yb는, 독립하여, 단결합 또는 1 내지 4 잔기의 아미노산을 포함하는 펩티드의 2가 기를 나타내고, Xb의 아미노산 잔기수와 Yb의 아미노산 잔기수의 합은 0 내지 4의 정수이며,
암 항원 펩티드 B는, 암 항원 펩티드 A와는 서열이 상이하면서 또한 7 내지 30 잔기의 아미노산을 포함하는 MHC 클래스 I 구속성 WT1 펩티드를 나타내고, 암 항원 펩티드 B의 N 말단 아미노산의 아미노기가 식 (2) 중의 Yb와 결합하고, 암 항원 펩티드 B의 C 말단 아미노산의 카르보닐기가 식 (2) 중의 수산기와 결합하고,
식 (2) 중의 티오에테르기가 식 (1) 중의 티오에테르기와 결합함)
로 표현되는 기, 또는 암 항원 펩티드 C를 나타내고,
암 항원 펩티드 C는, 암 항원 펩티드 A와는 서열이 상이하면서 또한 1개의 시스테인 잔기를 포함하는 7 내지 30 잔기의 아미노산을 포함하는 MHC 클래스 I 구속성 WT1 펩티드, 또는 1개의 시스테인 잔기를 포함하는 7 내지 30 잔기의 아미노산을 포함하는 MHC 클래스 II 구속성 WT1 펩티드를 나타내고, 암 항원 펩티드 C의 시스테인 잔기의 티오에테르기가 식 (1) 중의 티오에테르기와 결합하고,
단, R1이 수소 원자인 경우, 식 (1)로 표현되는 화합물의 서열은 WT1 단백의 부분 서열과 동일하지 않음]
로 표현되는 화합물 또는 그의 약학상 허용되는 염;
항 2. Xa가 2 잔기의 아미노산을 포함하는 펩티드의 2가 기이며 또한 Ya가 단결합이거나, Xa 및 Ya가 독립하여 1 잔기의 아미노산을 포함하는 펩티드의 2가 기이거나, Xa가 단결합이며 또한 Ya가 2 잔기의 아미노산을 포함하는 펩티드의 2가 기이거나, Xa가 1 잔기의 아미노산을 포함하는 펩티드의 2가 기이며 또한 Ya가 단결합이거나, Xa가 단결합이며 또한 Ya가 1 잔기의 아미노산을 포함하는 펩티드의 2가 기이거나, 또는 Xa 및 Ya가 단결합인, 항 1에 기재된 화합물 또는 그의 약학상 허용되는 염;
항 3. Xa가 단결합이며, Ya가 단결합, 알라닌 잔기, 류신 잔기 또는 메티오닌 잔기인, 항 1 또는 2에 기재된 화합물 또는 그의 약학상 허용되는 염;
항 4. Xa가 단결합 또는 1 잔기의 아미노산을 포함하는 펩티드의 2가 기이며, Ya가 단결합인, 항 1 또는 2에 기재된 화합물 또는 그의 약학상 허용되는 염;
항 5. Xa 및 Ya가 단결합인, 항 1 내지 4 중 어느 한 항에 기재된 화합물 또는 그의 약학상 허용되는 염;
항 6. 암 항원 펩티드 A가 7 내지 15 잔기인 아미노산을 포함하는 MHC 클래스 I 구속성 WT1 펩티드인, 항 1 내지 5 중 어느 한 항에 기재된 화합물 또는 그의 약학상 허용되는 염;
항 7. 암 항원 펩티드 A가, 이하의 아미노산 서열:
RMFPNAPYL (서열 번호: 2),
CMTWNQMNL (서열 번호: 3),
ALLPAVPSL (서열 번호: 5),
SLGEQQYSV (서열 번호: 6) 및
RVPGVAPTL (서열 번호: 7)
중에서 선택되는 어느 하나의 아미노산 서열을 포함하는 펩티드이거나, 또는 서열 번호: 2, 3, 5, 6 및 7 중에서 선택되는 어느 하나의 아미노산 서열 중에 아미노산 잔기의 개변을 함유하는 개변 아미노산 서열을 포함하고 또한 CTL 유도 활성을 갖는 펩티드인, 항 1 내지 6 중 어느 한 항에 기재된 화합물 또는 그의 약학상 허용되는 염;
항 8. 암 항원 펩티드 A가, 이하의 아미노산 서열:
RMFPNAPYL (서열 번호: 2),
CMTWNQMNL (서열 번호: 3),
CYTWNQMNL (서열 번호: 4),
ALLPAVPSL (서열 번호: 5),
SLGEQQYSV (서열 번호: 6) 및
RVPGVAPTL (서열 번호: 7)
중에서 선택되는 어느 하나의 아미노산 서열을 포함하는 펩티드인, 항 1 내지 7중 어느 한 항에 기재된 화합물 또는 그의 약학상 허용되는 염;
항 9. R1이 수소 원자인, 항 1 내지 8 중 어느 한 항에 기재된 화합물 또는 그의 약학상 허용되는 염;
항 10. 식 (1)로 표현되는 화합물이, 이하의 아미노산 서열:
CRMFPNAPYL (서열 번호: 13),
CCMTWNQMNL (서열 번호: 14),
CCYTWNQMNL (서열 번호: 15),
CALLPAVPSL (서열 번호: 16),
CSLGEQQYSV (서열 번호: 17) 및
CRVPGVAPTL (서열 번호: 18)
중에서 선택되는 어느 하나의 아미노산 서열을 포함하는 펩티드인, 항 1 내지 9 중 어느 한 항에 기재된 화합물 또는 그의 약학상 허용되는 염;
항 11. R1이 식 (2)로 표현되는 기인, 항 1 내지 8 중 어느 한 항에 기재된 화합물 또는 그의 약학상 허용되는 염;
항 12. Xb가 2 잔기의 아미노산을 포함하는 펩티드의 2가 기이며 또한 Yb가 단결합이거나, Xb 및 Yb가 독립하여 1 잔기의 아미노산을 포함하는 펩티드의 2가 기이거나, Xb가 단결합이며 또한 Yb가 2 잔기의 아미노산을 포함하는 펩티드의 2가 기이거나, Xb가 1 잔기의 아미노산을 포함하는 펩티드의 2가 기이며 또한 Yb가 단결합이거나, Xb가 단결합이며 또한 Yb가 1 잔기의 아미노산을 포함하는 펩티드의 2가 기이거나, 또는 Xb 및 Yb가 단결합인, 항 1 내지 8 및 11 중 어느 한 항에 기재된 화합물 또는 그의 약학상 허용되는 염;
항 13. Xb가 단결합이며, Yb가 단결합, 알라닌 잔기, 류신 잔기 또는 메티오닌 잔기인, 항 1 내지 8 및 11 내지 12 중 어느 한 항에 기재된 화합물 또는 그의 약학상 허용되는 염;
항 14. Xb가 단결합 또는 1 잔기의 아미노산을 포함하는 펩티드의 2가 기이며, Yb가 단결합인, 항 1 내지 8 및 11 내지 12 중 어느 한 항에 기재된 화합물 또는 그의 약학상 허용되는 염;
항 15. Xb 및 Yb가 단결합인, 항 1 내지 8) 및 11 내지 14 중 어느 한 항에 기재된 화합물 또는 그의 약학상 허용되는 염;
항 16. 암 항원 펩티드 B가 7 내지 15 잔기의 아미노산을 포함하는 MHC 클래스 I 구속성 WT1 펩티드인, 항 1 내지 8 및 11 내지 15 중 어느 한 항에 기재된 화합물 또는 그의 약학상 허용되는 염;
항 17. 암 항원 펩티드 B가, 이하의 아미노산 서열:
RMFPNAPYL (서열 번호: 2),
CMTWNQMNL (서열 번호: 3),
ALLPAVPSL (서열 번호: 5),
SLGEQQYSV (서열 번호: 6) 및
RVPGVAPTL (서열 번호: 7)
중에서 선택되는 어느 하나의 아미노산 서열을 포함하는 펩티드이거나, 또는 서열 번호: 2, 3, 5, 6 및 7 중에서 선택되는 어느 하나의 아미노산 서열 중에 아미노산 잔기의 개변을 함유하는 개변 아미노산 서열을 포함하고 또한 CTL 유도 활성을 갖는 펩티드인, 항 1 내지 8 및 11 내지 16 중 어느 한 항에 기재된 화합물 또는 그의 약학상 허용되는 염;
항 18. 암 항원 펩티드 B가, 이하의 아미노산 서열:
RMFPNAPYL (서열 번호: 2),
CMTWNQMNL (서열 번호: 3),
CYTWNQMNL (서열 번호: 4),
ALLPAVPSL (서열 번호: 5),
SLGEQQYSV (서열 번호: 6) 및
RVPGVAPTL (서열 번호: 7)
중에서 선택되는 어느 하나의 아미노산 서열을 포함하는 펩티드인, 항 1 내지 8 및 11 내지 17 중 어느 한 항에 기재된 화합물 또는 그의 약학상 허용되는 염;
항 19. 식 (1)로 표현되는 화합물이 식 (3):
[화학식 3]
Figure 112015103012119-pct00003
(식 중, C와 C 사이의 결합은 디술피드 결합을 나타냄)
으로 표현되는 화합물인, 항 1 내지 8 및 11 내지 18 중 어느 한 항에 기재된 화합물 또는 그의 약학상 허용되는 염;
항 20. R1이 암 항원 펩티드 C인, 항 1 내지 8 중 어느 한 항에 기재된 화합물 또는 그의 약학상 허용되는 염;
항 21. 암 항원 펩티드 C가 7 내지 15 잔기의 아미노산을 포함하는 MHC 클래스 I 구속성 WT1 펩티드인, 항 1 내지 8 및 20 중 어느 한 항에 기재된 화합물 또는 그의 약학상 허용되는 염;
항 22. 암 항원 펩티드 C가, 이하의 아미노산 서열:
CMTWNQMNL (서열 번호: 3)
을 포함하는 펩티드이거나, 또는 서열 번호: 3의 아미노산 서열 중에 아미노산 잔기의 개변을 함유하는 개변 아미노산 서열을 포함하고 또한 CTL 유도 활성을 갖는 펩티드인, 항 1 내지 8 및 20 내지 21 중 어느 한 항에 기재된 화합물 또는 그의 약학상 허용되는 염;
항 23. 암 항원 펩티드 C가, 이하의 아미노산 서열:
CMTWNQMNL (서열 번호: 3) 및
CYTWNQMNL (서열 번호: 4)
중에서 선택되는 어느 하나의 아미노산 서열을 포함하는 펩티드인, 항 1 내지 8 및 20 내지 22 중 어느 한 항에 기재된 화합물 또는 그의 약학상 허용되는 염;
항 24. 식 (1)로 표현되는 화합물이 식 (4):
[화학식 4]
Figure 112015103012119-pct00004
(식 중, C와 C 사이의 결합은 디술피드 결합을 나타냄)
로 표현되는 화합물, 또는 식 (5):
[화학식 5]
Figure 112015103012119-pct00005
(식 중, C와 C 사이의 결합은 디술피드 결합을 나타냄)
로 표현되는 화합물인, 항 1 내지 8 및 20 내지 23 중 어느 한 항에 기재된 화합물 또는 그의 약학상 허용되는 염;
항 25. 암 항원 펩티드 C가 14 내지 30 잔기의 아미노산을 포함하는 MHC 클래스 II 구속성 WT1 펩티드인, 항 1 내지 8 및 20 중 어느 한 항에 기재된 화합물 또는 그의 약학상 허용되는 염;
항 26. 암 항원 펩티드 C가, 이하의 아미노산 서열:
SGQARMFPNAPYLPSC (서열 번호: 19),
SGQARMFPNAPYLPSCLES (서열 번호: 11),
PGCNKRYFKLSHLQMHSRK (서열 번호: 20),
PGCNKRYFKLSHLQMHSRKH (서열 번호: 21),
PGCNKRYFKLSHLQMHSRKHTG (서열 번호: 10),
CNKRYFKLSHLQMHSRK (서열 번호: 22),
CNKRYFKLSHLQMHSRKH (서열 번호: 23) 및
CNKRYFKLSHLQMHSRKHTG (서열 번호: 24)
중에서 선택되는 어느 하나의 아미노산 서열을 포함하는 펩티드이거나, 또는 서열 번호: 10 내지 11 및 19 내지 24 중에서 선택되는 어느 하나의 아미노산 서열 중에 아미노산 잔기의 개변을 함유하는 개변 아미노산 서열을 포함하고 또한 헬퍼 T 세포 유도 활성을 갖는 펩티드인, 항 1 내지 8, 20 및 25 중 어느 한 항에 기재된 화합물 또는 그의 약학상 허용되는 염;
항 27. 암 항원 펩티드 C가, 이하의 아미노산 서열:
SGQARMFPNAPYLPSC (서열 번호: 19),
SGQAYMFPNAPYLPSC (서열 번호: 25),
SGQARMFPNAPYLPSCLES (서열 번호: 11),
SGQAYMFPNAPYLPSCLES (서열 번호: 12),
PGCNKRYFKLSHLQMHSRK (서열 번호: 20),
PGCNKRYFKLSHLQMHSRKH (서열 번호: 21),
PGCNKRYFKLSHLQMHSRKHTG (서열 번호: 10),
CNKRYFKLSHLQMHSRK (서열 번호: 22),
CNKRYFKLSHLQMHSRKH (서열 번호: 23) 및
CNKRYFKLSHLQMHSRKHTG (서열 번호: 24)
중에서 선택되는 어느 하나의 아미노산 서열을 포함하는 펩티드인, 항 1 내지 8, 20, 및 25 내지 26 중 어느 한 항에 기재된 화합물 또는 그의 약학상 허용되는 염;
항 28. 식 (1)로 표현되는 화합물이 식 (6):
[화학식 6]
Figure 112015103012119-pct00006
(식 중, C와 C 사이의 결합은 디술피드 결합을 나타냄)
으로 표현되는 화합물, 식 (7):
[화학식 7]
Figure 112015103012119-pct00007
(식 중, C와 C 사이의 결합은 디술피드 결합을 나타냄)
로 표현되는 화합물, 식 (8):
[화학식 8]
Figure 112015103012119-pct00008
(식 중, C와 C 사이의 결합은 디술피드 결합을 나타냄)
로 표현되는 화합물, 또는 식 (9):
[화학식 9]
Figure 112015103012119-pct00009
(식 중, C와 C 사이의 결합은 디술피드 결합을 나타냄)
로 표현되는 화합물인, 항 1 내지 8, 20, 및 25 내지 27 중 어느 한 항에 기재된 화합물 또는 그의 약학상 허용되는 염;
항 29. 항 1 내지 28 중 어느 한 항에 기재된 화합물 또는 그의 약학상 허용되는 염 및 약학적으로 허용되는 담체를 함유하는 의약 조성물;
항 30. 암 백신으로서 사용되는, 항 29에 기재된 의약 조성물;
항 31. 항 1 내지 28 중 어느 한 항에 기재된 화합물 또는 그의 약학상 허용되는 염의, 암 백신을 제조하기 위한 용도;
항 32. 암을 치료 또는 예방하기 위한 방법으로서, 항 1 내지 28 중 어느 한 항에 기재된 화합물 또는 그의 약학상 허용되는 염의 치료 또는 예방에 유효한 양을, 그것을 필요로 하고 있는 WT1 양성의 암 환자에게 투여하는 것을 포함하는 방법; 및
항 33. 항 1 내지 28 중 어느 한 항에 기재된 화합물 또는 그의 약학상 허용되는 염을 ERAP1과 반응시킴으로써, 2개의 상이한 MHC 클래스 I 구속성 에피토프, 또는 MHC 클래스 I 구속성 에피토프 및 MHC 클래스 II 구속성 에피토프를 얻는 방법,
2. 제2 형태
항 1. 식 (1):
[화학식 10]
Figure 112015103012119-pct00010
[식 중, Xa 및 Ya는, 독립하여, 단결합 또는 1 내지 4 잔기의 아미노산을 포함하는 펩티드의 2가 기를 나타내고, Xa의 아미노산 잔기수와 Ya의 아미노산 잔기수의 합은 0 내지 4의 정수이며,
암 항원 펩티드 A는, 7 내지 30 잔기의 아미노산을 포함하는 MHC 클래스 I 구속성 WT1 펩티드를 나타내고, 암 항원 펩티드 A의 N 말단 아미노산의 아미노기가 식 (1) 중의 Ya와 결합하고, 암 항원 펩티드 A의 C 말단 아미노산의 카르보닐기가 식 (1) 중의 수산기와 결합하고,
R1은 수소 원자, 식 (2):
[화학식 11]
Figure 112015103012119-pct00011
(식 중, Xb 및 Yb는, 독립하여, 단결합 또는 1 내지 4 잔기의 아미노산을 포함하는 펩티드의 2가 기를 나타내고, Xb의 아미노산 잔기수와 Yb의 아미노산 잔기수의 합은 0 내지 4의 정수이며,
암 항원 펩티드 B는, 암 항원 펩티드 A와는 서열이 상이하고 또한 7 내지 30 잔기의 아미노산을 포함하는 MHC 클래스 I 구속성 WT1 펩티드를 나타내고, 암 항원 펩티드 B의 N 말단 아미노산의 아미노기가 식 (2) 중의 Yb와 결합하고, 암 항원 펩티드 B의 C 말단 아미노산의 카르보닐기가 식 (2) 중의 수산기와 결합하고,
식 (2) 중의 티오에테르기가 식 (1) 중의 티오에테르기와 결합함)
로 표현되는 기, 또는 암 항원 펩티드 C를 나타내고,
암 항원 펩티드 C는, 암 항원 펩티드 A와는 서열이 상이하고 또한 1개의 시스테인 잔기를 포함하는 7 내지 30 잔기의 아미노산을 포함하는 MHC 클래스 I 구속성 WT1 펩티드 또는 1개의 시스테인 잔기를 포함하는 7 내지 30 잔기의 아미노산을 포함하는 MHC 클래스 II 구속성 WT1 펩티드를 나타내고, 암 항원 펩티드 C의 시스테인 잔기의 티오에테르기가 식 (1) 중의 티오에테르기와 결합하고,
단, R1이 수소 원자인 경우, 식 (1)로 표현되는 화합물의 서열은 WT1 단백의 부분 서열과 동일하지 않음]
로 표현되는 화합물 또는 그의 약학상 허용되는 염;
항 2. Xa가 2 잔기의 아미노산을 포함하는 펩티드의 2가 기이며 또한 Ya가 단결합이거나, Xa 및 Ya가 독립하여 1 잔기의 아미노산을 포함하는 펩티드의 2가 기이거나, Xa가 단결합이며 또한 Ya가 2 잔기의 아미노산을 포함하는 펩티드의 2가 기이거나, Xa가 1 잔기의 아미노산을 포함하는 펩티드의 2가 기이며 또한 Ya가 단결합이거나, Xa가 단결합이며 또한 Ya가 1 잔기의 아미노산을 포함하는 펩티드의 2가 기이거나, 또는 Xa 및 Ya가 단결합인, 항 1에 기재된 화합물 또는 그의 약학상 허용되는 염;
항 3. Xa가 단결합이며, Ya가 단결합, 알라닌 잔기, 류신 잔기 또는 메티오닌 잔기인, 항 1 또는 2에 기재된 화합물 또는 그의 약학상 허용되는 염;
항 4. Xa가 단결합 또는 1 잔기의 아미노산을 포함하는 펩티드의 2가 기이며, Ya가 단결합인, 항 1 또는 2에 기재된 화합물 또는 그의 약학상 허용되는 염;
항 5. Xa 및 Ya가 단결합인, 항 1 내지 4 중 어느 한 항에 기재된 화합물 또는 그의 약학상 허용되는 염;
항 6. 암 항원 펩티드 A가 7 내지 15 잔기의 아미노산을 포함하는 MHC 클래스 I 구속성 WT1 펩티드인, 항 1 내지 5 중 어느 한 항에 기재된 화합물 또는 그의 약학상 허용되는 염;
항 7. 암 항원 펩티드 A가, 이하의 아미노산 서열:
RMFPNAPYL (서열 번호: 2),
CMTWNQMNL (서열 번호: 3),
ALLPAVPSL (서열 번호: 5),
SLGEQQYSV (서열 번호: 6) 및
RVPGVAPTL (서열 번호: 7)
중에서 선택되는 어느 하나의 아미노산 서열을 포함하는 펩티드이거나, 또는 서열 번호: 2, 3, 5, 6 및 7 중에서 선택되는 어느 하나의 아미노산 서열 중에 아미노산 잔기의 개변을 함유하는 개변 아미노산 서열을 포함하고 또한 CTL 유도 활성을 갖는 펩티드인, 항 1 내지 6 중 어느 한 항에 기재된 화합물 또는 그의 약학상 허용되는 염;
항 8. 암 항원 펩티드 A가, 이하의 아미노산 서열:
RMFPNAPYL (서열 번호: 2),
CMTWNQMNL (서열 번호: 3),
CYTWNQMNL (서열 번호: 4),
ALLPAVPSL (서열 번호: 5),
SLGEQQYSV (서열 번호: 6) 및
RVPGVAPTL (서열 번호: 7)
중에서 선택되는 어느 하나의 아미노산 서열을 포함하는 펩티드인, 항 1 내지 7 중 어느 한 항에 기재된 화합물 또는 그의 약학상 허용되는 염;
항 9. R1이 수소 원자인, 항 1 내지 8 중 어느 한 항에 기재된 화합물 또는 그의 약학상 허용되는 염;
항 10. 식 (1)로 표현되는 화합물이, 이하의 아미노산 서열:
CRMFPNAPYL (서열 번호: 13),
CCMTWNQMNL (서열 번호: 14),
CCYTWNQMNL (서열 번호: 15),
CALLPAVPSL (서열 번호: 16),
CSLGEQQYSV (서열 번호: 17) 및
CRVPGVAPTL (서열 번호: 18)
중에서 선택되는 어느 하나의 아미노산 서열을 포함하는 펩티드인, 항 1 내지 9 중 어느 한 항에 기재된 화합물 또는 그의 약학상 허용되는 염;
항 11. R1이 식 (2)로 표현되는 기인, 항 1 내지 8 중 어느 한 항에 기재된 화합물 또는 그의 약학상 허용되는 염;
항 12. Xb가 2 잔기의 아미노산을 포함하는 펩티드의 2가 기이며 또한 Yb가 단결합이거나, Xb 및 Yb가 독립하여 1 잔기의 아미노산을 포함하는 펩티드의 2가 기이거나, Xb가 단결합이며 또한 Yb가 2 잔기의 아미노산을 포함하는 펩티드의 2가 기이거나, Xb가 1 잔기의 아미노산을 포함하는 펩티드의 2가 기이며 또한 Yb가 단결합이거나, Xb가 단결합이며 또한 Yb가 1 잔기의 아미노산을 포함하는 펩티드의 2가 기이거나, 또는 Xb 및 Yb가 단결합인, 항 1 내지 8 및 11 중 어느 한 항에 기재된 화합물 또는 그의 약학상 허용되는 염;
항 13. Xb가 단결합이며, Yb가 단결합, 알라닌 잔기, 류신 잔기 또는 메티오닌 잔기인, 항 1 내지 8 및 11 내지 12 중 어느 한 항에 기재된 화합물 또는 그의 약학상 허용되는 염;
항 14. Xb가 단결합 또는 1 잔기의 아미노산을 포함하는 펩티드의 2가 기이며, Yb가 단결합인, 항 1 내지 8 및 11 내지 12 중 어느 한 항에 기재된 화합물 또는 그의 약학상 허용되는 염;
항 15. Xb 및 Yb가 단결합인, 항 1 내지 8 및 11 내지 14 중 어느 한 항에 기재된 화합물 또는 그의 약학상 허용되는 염;
항 16. 암 항원 펩티드 B가 7 내지 15 잔기의 아미노산을 포함하는 MHC 클래스 I 구속성 WT1 펩티드인, 항 1 내지 8 및 11 내지 15 중 어느 한 항에 기재된 화합물 또는 그의 약학상 허용되는 염;
항 17. 암 항원 펩티드 B가, 이하의 아미노산 서열:
RMFPNAPYL (서열 번호: 2),
CMTWNQMNL (서열 번호: 3),
ALLPAVPSL (서열 번호: 5),
SLGEQQYSV (서열 번호: 6) 및
RVPGVAPTL (서열 번호: 7)
중에서 선택되는 어느 하나의 아미노산 서열을 포함하는 펩티드이거나, 또는 서열 번호: 2, 3, 5, 6 및 7 중에서 선택되는 어느 하나의 아미노산 서열 중에 아미노산 잔기의 개변을 함유하는 개변 아미노산 서열을 포함하고 또한 CTL 유도 활성을 갖는 펩티드인, 항 1 내지 8 및 11 내지 16 중 어느 한 항에 기재된 화합물 또는 그의 약학상 허용되는 염;
항 18. 암 항원 펩티드 B가, 이하의 아미노산 서열:
RMFPNAPYL (서열 번호: 2),
CMTWNQMNL (서열 번호: 3),
CYTWNQMNL (서열 번호: 4),
ALLPAVPSL (서열 번호: 5),
SLGEQQYSV (서열 번호: 6) 및
RVPGVAPTL (서열 번호: 7)
중에서 선택되는 어느 하나의 아미노산 서열을 포함하는 펩티드인, 항 1 내지 8 및 11 내지 17 중 어느 한 항에 기재된 화합물 또는 그의 약학상 허용되는 염;
항 19. 식 (1)로 표현되는 화합물이 식 (3):
[화학식 12]
Figure 112015103012119-pct00012
(식 중, C와 C 사이의 결합은 디술피드 결합을 나타냄)
로 표현되는 화합물인, 항 1 내지 8 및 11 내지 18 중 어느 한 항에 기재된 화합물 또는 그의 약학상 허용되는 염;
항 20. Yb가 알라닌 잔기인, 항 13에 기재된 화합물 또는 그의 약학상 허용되는 염;
항 21. 암 항원 펩티드 B가, 1개의 시스테인 잔기를 포함하는 MHC 클래스 I 구속성 WT1 펩티드인 경우, 암 항원 펩티드 B 중의 티오에테르기가, 식 (16):
[화학식 13]
Figure 112015103012119-pct00013
(식 중, Xd 및 Yd는, 독립하여, 단결합 또는 1 내지 4 잔기의 아미노산을 포함하는 펩티드의 2가 기를 나타내고, Xd의 아미노산 잔기수와 Yd의 아미노산 잔기수의 합은 0 내지 4의 정수이며,
암 항원 펩티드 D는, 7 내지 30 잔기의 아미노산을 포함하는 MHC 클래스 II 구속성 WT1 펩티드를 나타내고, 암 항원 펩티드 D의 N 말단 아미노산의 아미노기가 식 (16) 중의 Yd와 결합하고, 암 항원 펩티드 D의 C 말단 아미노산의 카르보닐기가 식 (16) 중의 수산기와 결합함)
중의 티오에테르기와 결합하고 있는, 또는 1개의 시스테인 잔기를 포함하는 7 내지 30 잔기의 아미노산을 포함하는 MHC 클래스 II 구속성 WT1 펩티드인 암 항원 펩티드 E의 시스테인 잔기의 티오에테르기와 결합하고 있는, 항 1 내지 8, 11 내지 13 및 20 중 어느 한 항에 기재된 화합물 또는 그의 약학상 허용되는 염;
항 22. 암 항원 펩티드 B가 7 내지 15 잔기의 아미노산을 포함하는 MHC 클래스 I 구속성 WT1 펩티드인, 항 21에 기재된 화합물 또는 그의 약학상 허용되는 염;
항 23. 암 항원 펩티드 B가, 이하의 아미노산 서열:
CMTWNQMNL (서열 번호: 3) 및
CYTWNQMNL (서열 번호: 4)
중에서 선택되는 어느 하나의 아미노산 서열을 포함하는 펩티드인, 항 21 내지 22 중 어느 한 항에 기재된 화합물 또는 그의 약학상 허용되는 염;
항 24. Xd가 2 잔기의 아미노산을 포함하는 펩티드의 2가 기이며 또한 Yd가 단결합이거나, Xd 및 Yd가 독립하여 1 잔기의 아미노산을 포함하는 펩티드의 2가 기이거나, Xd가 단결합이며 또한 Yd가 2 잔기의 아미노산을 포함하는 펩티드의 2가 기이거나, Xd가 1 잔기의 아미노산을 포함하는 펩티드의 2가 기이며 또한 Yd가 단결합이거나, Xd가 단결합이며 또한 Yd가 1 잔기의 아미노산을 포함하는 펩티드의 2가 기이거나, 또는 Xd 및 Yd가 단결합인, 항 21 내지 23 중 어느 한 항에 기재된 화합물 또는 그의 약학상 허용되는 염;
항 25. Xd가 단결합이며, Yd가 단결합, 알라닌 잔기, 류신 잔기 또는 메티오닌 잔기인, 항 21 내지 24 중 어느 한 항에 기재된 화합물 또는 그의 약학상 허용되는 염;
항 26. Xd가 단결합 또는 1 잔기의 아미노산을 포함하는 펩티드의 2가 기이며, Yd가 단결합인, 항 21 내지 24 중 어느 한 항에 기재된 화합물 또는 그의 약학상 허용되는 염;
항 27. Xd 및 Yd가 단결합인, 항 21 내지 26 중 어느 한 항에 기재된 화합물 또는 그의 약학상 허용되는 염;
항 28. 암 항원 펩티드 D가, 14 내지 30 잔기의 아미노산을 포함하는 MHC 클래스 II 구속성 WT1 펩티드인, 항 21 내지 27 중 어느 한 항에 기재된 화합물 또는 그의 약학상 허용되는 염;
항 29. 암 항원 펩티드 D가, 이하의 아미노산 서열:
SGQARMFPNAPYLPSC (서열 번호: 19),
SGQAYMFPNAPYLPSC (서열 번호: 25),
SGQARMFPNAPYLPSCLES (서열 번호: 11),
SGQAYMFPNAPYLPSCLES (서열 번호: 12),
PGCNKRYFKLSHLQMHSRK (서열 번호: 20),
PGCNKRYFKLSHLQMHSRKH (서열 번호: 21),
PGCNKRYFKLSHLQMHSRKHTG (서열 번호: 10),
CNKRYFKLSHLQMHSRK (서열 번호: 22),
CNKRYFKLSHLQMHSRKH (서열 번호: 23),
CNKRYFKLSHLQMHSRKHTG (서열 번호: 24) 및
WAPVLDFAPPGASAYGSL (서열 번호: 244)
중에서 선택되는 어느 하나의 아미노산 서열을 포함하는 펩티드인, 항 21 내지 28 중 어느 한 항에 기재된 화합물 또는 그의 약학상 허용되는 염;
항 30. 식 (1)로 표현되는 화합물이, 식 (15):
[화학식 14]
Figure 112015103012119-pct00014
(식 중, C와 C 사이의 결합은 디술피드 결합을 나타냄)
로 표현되는 화합물인, 항 1 내지 8, 11 내지 13, 및 20 내지 29 중 어느 한 항에 기재된 화합물 또는 그의 약학상 허용되는 염;
항 31. 암 항원 펩티드 E가, 14 내지 30 잔기의 아미노산을 포함하는 MHC 클래스 II 구속성 WT1 펩티드인, 항 21 내지 23 중 어느 한 항에 기재된 화합물 또는 그의 약학상 허용되는 염;
항 32. 암 항원 펩티드 E가, 이하의 아미노산 서열:
SGQARMFPNAPYLPSC (서열 번호: 19),
SGQAYMFPNAPYLPSC (서열 번호: 25),
SGQARMFPNAPYLPSCLES (서열 번호: 11),
SGQAYMFPNAPYLPSCLES (서열 번호: 12),
PGCNKRYFKLSHLQMHSRK (서열 번호: 20),
PGCNKRYFKLSHLQMHSRKH (서열 번호: 21),
PGCNKRYFKLSHLQMHSRKHTG (서열 번호: 10),
CNKRYFKLSHLQMHSRK (서열 번호: 22),
CNKRYFKLSHLQMHSRKH (서열 번호: 23) 및
CNKRYFKLSHLQMHSRKHTG (서열 번호: 24)
중에서 선택되는 어느 하나의 아미노산 서열을 포함하는 펩티드인, 항 21 내지 23 및 31 중 어느 한 항에 기재된 화합물 또는 그의 약학상 허용되는 염;
항 33. R1이 암 항원 펩티드 C인, 항 1 내지 8 중 어느 한 항에 기재된 화합물 또는 그의 약학상 허용되는 염;
항 34. 암 항원 펩티드 C가 7 내지 15 잔기의 아미노산을 포함하는 MHC 클래스 I 구속성 WT1 펩티드인, 항 1 내지 8 및 33 중 어느 한 항에 기재된 화합물 또는 그의 약학상 허용되는 염;
항 35. 암 항원 펩티드 C가, 이하의 아미노산 서열:
CMTWNQMNL (서열 번호: 3)
을 포함하는 펩티드이거나, 또는 서열 번호: 3의 아미노산 서열 중에 아미노산 잔기의 개변을 함유하는 개변 아미노산 서열을 포함하고 또한 CTL 유도 활성을 갖는 펩티드인, 항 1 내지 8 및 33 내지 34 중 어느 한 항에 기재된 화합물 또는 그의 약학상 허용되는 염;
항 36. 암 항원 펩티드 C가, 이하의 아미노산 서열:
CMTWNQMNL (서열 번호: 3) 및
CYTWNQMNL (서열 번호: 4)
중에서 선택되는 어느 하나의 아미노산 서열을 포함하는 펩티드인, 항 1 내지 8 및 33 내지 35 중 어느 한 항에 기재된 화합물 또는 그의 약학상 허용되는 염;
항 37. 식 (1)로 표현되는 화합물이, 식 (4):
[화학식 15]
Figure 112015103012119-pct00015
(식 중, C와 C 사이의 결합은 디술피드 결합을 나타냄)
로 표현되는 화합물 또는 식 (5):
[화학식 16]
Figure 112015103012119-pct00016
(식 중, C와 C 사이의 결합은 디술피드 결합을 나타냄)
로 표현되는 화합물인, 항 1 내지 8 및 33 내지 36 중 어느 한 항에 기재된 화합물 또는 그의 약학상 허용되는 염;
항 38. 1개의 시스테인 잔기를 포함하는 1 내지 4 잔기의 아미노산을 포함하는 펩티드가 암 항원 펩티드 C의 N 말단에 또한 결합하고 있는 경우, 암 항원 펩티드 C의 N 말단에 결합하고 있는 펩티드의 시스테인 잔기의 티오에테르기가, 식 (16):
[화학식 17]
Figure 112015103012119-pct00017
(식 중, Xd 및 Yd는, 독립하여, 단결합 또는 1 내지 4 잔기의 아미노산을 포함하는 펩티드의 2가 기를 나타내고, Xd의 아미노산 잔기수와 Yd의 아미노산 잔기수의 합은 0 내지 4의 정수이며,
암 항원 펩티드 D는, 7 내지 30 잔기의 아미노산을 포함하는 MHC 클래스 II 구속성 WT1 펩티드를 나타내고, 암 항원 펩티드 D의 N 말단 아미노산의 아미노기가 식 (16) 중의 Yd와 결합하고, 암 항원 펩티드 D의 C 말단 아미노산의 카르보닐기가 식 (16) 중의 수산기와 결합함)
중의 티오에테르기와 결합하고 있거나, 또는 1개의 시스테인 잔기를 포함하는 7 내지 30 잔기의 아미노산을 포함하는 MHC 클래스 II 구속성 WT1 펩티드인 암 항원 펩티드 E의 시스테인 잔기의 티오에테르기와 결합하고 있는, 항 1 내지 8 및 33 중 어느 한 항에 기재된 화합물 또는 그의 약학상 허용되는 염;
항 39. 암 항원 펩티드 C의 N 말단에 결합하고 있는 1개의 시스테인 잔기를 포함하는 1 내지 4 잔기의 아미노산을 포함하는 펩티드가, CA를 포함하는 디펩티드인, 항 38에 기재된 화합물 또는 그의 약학상 허용되는 염;
항 40. 암 항원 펩티드 C가 7 내지 15 잔기의 아미노산을 포함하는 MHC 클래스 I 구속성 WT1 펩티드인, 항 38 내지 39 중 어느 한 항에 기재된 화합물 또는 그의 약학상 허용되는 염;
항 41. 암 항원 펩티드 C가, 이하의 아미노산 서열:
CMTWNQMNL (서열 번호: 3) 및
CYTWNQMNL (서열 번호: 4)
중에서 선택되는 어느 하나의 아미노산 서열을 포함하는 펩티드인, 항 38 내지 40 중 어느 한 항에 기재된 화합물 또는 그의 약학상 허용되는 염;
항 42. Xd가 2 잔기의 아미노산을 포함하는 펩티드의 2가 기이며 또한 Yd가 단결합이거나, Xd 및 Yd가 독립하여 1 잔기의 아미노산을 포함하는 펩티드의 2가 기이거나, Xd가 단결합이며 또한 Yd가 2 잔기의 아미노산을 포함하는 펩티드의 2가 기이거나, Xd가 1 잔기의 아미노산을 포함하는 펩티드의 2가 기이며 또한 Yd가 단결합이거나, Xd가 단결합이며 또한 Yd가 1 잔기의 아미노산을 포함하는 펩티드의 2가 기이거나, 또는 Xd 및 Yd가 단결합인, 항 38 내지 41 중 어느 한 항에 기재된 화합물 또는 그의 약학상 허용되는 염;
항 43. Xd가 단결합이며, Yd가 단결합, 알라닌 잔기, 류신 잔기 또는 메티오닌 잔기인, 항 38 내지 42 중 어느 한 항에 기재된 화합물 또는 그의 약학상 허용되는 염;
항 44. Xd가 단결합 또는 1 잔기의 아미노산을 포함하는 펩티드의 2가 기이며, Yd가 단결합인, 항 38 내지 42 중 어느 한 항에 기재된 화합물 또는 그의 약학상 허용되는 염;
항 45. Xd 및 Yd가 단결합인, 항 38 내지 44 중 어느 한 항에 기재된 화합물 또는 그의 약학상 허용되는 염;
항 46. 암 항원 펩티드 D가, 14 내지 30 잔기의 아미노산을 포함하는 MHC 클래스 II 구속성 WT1 펩티드인, 항 38 내지 45 중 어느 한 항에 기재된 화합물 또는 그의 약학상 허용되는 염;
항 47. 암 항원 펩티드 D가, 이하의 아미노산 서열:
SGQARMFPNAPYLPSC (서열 번호: 19),
SGQAYMFPNAPYLPSC (서열 번호: 25),
SGQARMFPNAPYLPSCLES (서열 번호: 11),
SGQAYMFPNAPYLPSCLES (서열 번호: 12),
PGCNKRYFKLSHLQMHSRK (서열 번호: 20),
PGCNKRYFKLSHLQMHSRKH (서열 번호: 21),
PGCNKRYFKLSHLQMHSRKHTG (서열 번호: 10),
CNKRYFKLSHLQMHSRK (서열 번호: 22),
CNKRYFKLSHLQMHSRKH (서열 번호: 23),
CNKRYFKLSHLQMHSRKHTG (서열 번호: 24) 및
WAPVLDFAPPGASAYGSL (서열 번호: 244)
중에서 선택되는 어느 하나의 아미노산 서열을 포함하는 펩티드인, 항 38 내지 46 중 어느 한 항에 기재된 화합물 또는 그의 약학상 허용되는 염;
항 48. 식 (1)로 표현되는 화합물이, 식 (14):
[화학식 18]
Figure 112015103012119-pct00018
(식 중, C와 C 사이의 결합은 디술피드 결합을 나타냄)
로 표현되는 화합물인, 항 38 내지 47 중 어느 한 항에 기재된 화합물 또는 그의 약학상 허용되는 염;
항 49. 암 항원 펩티드 E가, 이하의 아미노산 서열:
SGQARMFPNAPYLPSC (서열 번호: 19),
SGQAYMFPNAPYLPSC (서열 번호: 25),
SGQARMFPNAPYLPSCLES (서열 번호: 11),
SGQAYMFPNAPYLPSCLES (서열 번호: 12),
PGCNKRYFKLSHLQMHSRK (서열 번호: 20),
PGCNKRYFKLSHLQMHSRKH (서열 번호: 21),
PGCNKRYFKLSHLQMHSRKHTG (서열 번호: 10),
CNKRYFKLSHLQMHSRK (서열 번호: 22),
CNKRYFKLSHLQMHSRKH (서열 번호: 23) 및
CNKRYFKLSHLQMHSRKHTG (서열 번호: 24)
중에서 선택되는 어느 하나의 아미노산 서열을 포함하는 펩티드인, 항 38 내지 41 및 44 중 어느 한 항에 기재된 화합물 또는 그의 약학상 허용되는 염;
항 50. 식 (1)로 표현되는 화합물이, 식 (12):
[화학식 19]
Figure 112015103012119-pct00019
(식 중, C와 C 사이의 결합은 디술피드 결합을 나타냄)
로 표현되는 화합물인, 항 38 내지 41 및 49 중 어느 한 항에 기재된 화합물 또는 그의 약학상 허용되는 염;
항 51. 암 항원 펩티드 C가 14 내지 30 잔기의 아미노산을 포함하는 MHC 클래스 II 구속성 WT1 펩티드인, 항 1 내지 8 및 33 중 어느 한 항에 기재된 화합물 또는 그의 약학상 허용되는 염;
항 52. 암 항원 펩티드 C가, 이하의 아미노산 서열:
SGQARMFPNAPYLPSC (서열 번호: 19),
SGQARMFPNAPYLPSCLES (서열 번호: 11),
PGCNKRYFKLSHLQMHSRK (서열 번호: 20),
PGCNKRYFKLSHLQMHSRKH (서열 번호: 21),
PGCNKRYFKLSHLQMHSRKHTG (서열 번호: 10),
CNKRYFKLSHLQMHSRK (서열 번호: 22),
CNKRYFKLSHLQMHSRKH (서열 번호: 23) 및
CNKRYFKLSHLQMHSRKHTG (서열 번호: 24)
중에서 선택되는 어느 하나의 아미노산 서열을 포함하는 펩티드이거나, 또는 서열 번호: 10 내지 11 및 19 내지 24 중에서 선택되는 어느 하나의 아미노산 서열 중에 아미노산 잔기의 개변을 함유하는 개변 아미노산 서열을 포함하고 또한 헬퍼 T 세포 유도 활성을 갖는 펩티드인, 항 1 내지 8, 33 및 51 중 어느 한 항에 기재된 화합물 또는 그의 약학상 허용되는 염;
항 53. 암 항원 펩티드 C가, 이하의 아미노산 서열:
SGQARMFPNAPYLPSC (서열 번호: 19),
SGQAYMFPNAPYLPSC (서열 번호: 25),
SGQARMFPNAPYLPSCLES (서열 번호: 11),
SGQAYMFPNAPYLPSCLES (서열 번호: 12),
PGCNKRYFKLSHLQMHSRK (서열 번호: 20),
PGCNKRYFKLSHLQMHSRKH (서열 번호: 21),
PGCNKRYFKLSHLQMHSRKHTG (서열 번호: 10),
CNKRYFKLSHLQMHSRK (서열 번호: 22),
CNKRYFKLSHLQMHSRKH (서열 번호: 23) 및
CNKRYFKLSHLQMHSRKHTG (서열 번호: 24)
중에서 선택되는 어느 하나의 아미노산 서열을 포함하는 펩티드인, 항 1 내지 8, 33 및 51 내지 52 중 어느 한 항에 기재된 화합물 또는 그의 약학상 허용되는 염;
항 54. 식 (1)로 표현되는 화합물이, 식 (6):
[화학식 20]
Figure 112015103012119-pct00020
(식 중, C와 C 사이의 결합은 디술피드 결합을 나타냄)
으로 표현되는 화합물, 식 (7):
[화학식 21]
Figure 112015103012119-pct00021
(식 중, C와 C 사이의 결합은 디술피드 결합을 나타냄)
로 표현되는 화합물, 식 (8):
[화학식 22]
Figure 112015103012119-pct00022
(식 중, C와 C 사이의 결합은 디술피드 결합을 나타냄)
로 표현되는 화합물 또는 식 (9):
[화학식 23]
Figure 112015103012119-pct00023
(식 중, C와 C 사이의 결합은 디술피드 결합을 나타냄)
로 표현되는 화합물인, 항 1 내지 8, 33 및 51 내지 53 중 어느 한 항에 기재된 화합물 또는 그의 약학상 허용되는 염;
항 55. 7 내지 30 잔기의 아미노산을 포함하는 MHC 클래스 II 구속성 WT1 펩티드의 개변체;
항 56. 이하의 아미노산 서열:
CWAPVLDFAPPGASAYGSL (서열 번호: 242) 및
WAPVLDFAPPGASAYGSLC (서열 번호: 243)
인, 항 55에 기재된 개변체;
항 57. 식 (10):
[화학식 24]
Figure 112015103012119-pct00024
(식 중, C와 C 사이의 결합은 디술피드 결합을 나타냄)
으로 표현되는 화합물 또는 그의 약학상 허용되는 염;
항 58. 식 (3):
[화학식 25]
Figure 112015103012119-pct00025
(식 중, C와 C 사이의 결합은 디술피드 결합을 나타냄)
으로 표현되는 화합물, 식 (4):
[화학식 26]
Figure 112015103012119-pct00026
(식 중, C와 C 사이의 결합은 디술피드 결합을 나타냄)
로 표현되는 화합물 및 식 (5):
[화학식 27]
Figure 112015103012119-pct00027
(식 중, C와 C 사이의 결합은 디술피드 결합을 나타냄)
로 표현되는 화합물로 이루어지는 군에서 선택되는 화합물과 이하의 아미노산 서열:
CNKRYFKLSHLQMHSRK (서열 번호: 22),
CNKRYFKLSHLQMHSRKH (서열 번호: 23),
CNKRYFKLSHLQMHSRKHTG (서열 번호: 24),
WAPVLDFAPPGASAYGSL (서열 번호: 244),
CWAPVLDFAPPGASAYGSL (서열 번호: 242) 및
WAPVLDFAPPGASAYGSLC (서열 번호: 243)
로 이루어지는 군에서 선택되는 아미노산 서열을 포함하는 펩티드를 포함하는 조성물;
항 59. 항 1 내지 54 및 57 중 어느 한 항에 기재된 화합물 또는 그의 약학상 허용되는 염, 또는 항 58에 기재된 조성물, 및 약학적으로 허용되는 담체를 함유하는 의약 조성물;
항 60. 암 백신으로서 사용되는, 항 59에 기재된 의약 조성물;
항 61. 항 1 내지 54 및 57 중 어느 한 항에 기재된 화합물 또는 그의 약학상 허용되는 염 또는 항 58에 기재된 조성물의, 암 백신을 제조하기 위한 용도;
항 62. 암을 치료 또는 예방하기 위한 방법으로서, 항 1 내지 54 및 57 중 어느 한 항에 기재된 화합물 또는 그의 약학상 허용되는 염 또는 항 58에 기재된 조성물의 치료 또는 예방에 유효한 양을, 그것을 필요로 하고 있는 WT1 양성의 암 환자에게 투여하는 것을 포함하는 방법;
항 63. 항 1 내지 54 및 57 중 어느 한 항에 기재된 화합물 또는 그의 약학상 허용되는 염을 ERAP1과 반응시킴으로써, 2개의 상이한 MHC 클래스 I 구속성 에피토프, 또는 MHC 클래스 I 구속성 에피토프 및 MHC 클래스 II 구속성 에피토프를 얻는 방법; 및
항 64. 이하의 공정을 포함하는, 화합물의 합성 방법:
(1) Fmoc-C(Mmt)A-SBn 및 암 항원 펩티드 C를 사용하여, C(Mmt)A의 C 말단 아미노산의 카르보닐기와 암 항원 펩티드 C의 N 말단 아미노기가 결합한 펩티드를 합성하는 공정이며, 항원 펩티드 C는, 1개의 시스테인 잔기를 포함하는 7 내지 30 잔기의 아미노산을 포함하는 MHC 클래스 I 구속성 WT1 펩티드, 또는 1개의 시스테인 잔기를 포함하는 7 내지 30 잔기의 아미노산을 포함하는 MHC 클래스 II 구속성 WT1 펩티드를 나타내는 공정,
(2) 상기 공정 (1)에서 얻어진 펩티드 및 Npys기로 보호된 1개의 시스테인 잔기가 N 말단에 결합하고 있는 암 항원 펩티드 A를 사용하여, 상기 공정 (1)에서 얻어진 펩티드 중의 암 항원 펩티드 C의 시스테인 잔기의 티오에테르기와 암 항원 펩티드 A의 N 말단에 결합하고 있는 시스테인 잔기의 티오에테르기가 결합한 펩티드를 합성하는 공정이며, 암 항원 펩티드 A는, 7 내지 30 잔기의 아미노산을 포함하는 MHC 클래스 I 구속성 WT1 펩티드를 나타내는 공정, 및
(3) 상기 공정 (2)에서 얻어진 펩티드 및 SPy기로 보호된 시스테인 잔기를 포함하는 암 항원 펩티드 D를 사용하여, 상기 공정 (2)에서 얻어진 펩티드 중의 암 항원 펩티드 A의 N 말단에 결합하고 있는 시스테인 잔기의 티오에테르기와 암 항원 펩티드 D의 시스테인 잔기의 티오에테르기가 결합한 펩티드를 합성하는 공정이며, 암 항원 펩티드 D는, 1개의 시스테인 잔기가 N 말단에 결합하고 있는 7 내지 30 잔기의 아미노산을 포함하는 MHC 클래스 II 구속성 WT1 펩티드, 또는 1개의 시스테인 잔기를 포함하는 7 내지 30 잔기의 아미노산을 포함하는 MHC 클래스 II 구속성 WT1 펩티드를 나타내는 공정.
3. 제3 형태
항 1. 식 (1):
[화학식 28]
Figure 112015103012119-pct00028
[식 중, Xa 및 Ya는 단결합을 나타내고,
암 항원 펩티드 A는, 이하의 아미노산 서열:
RMFPNAPYL (서열 번호: 2),
ALLPAVPSL (서열 번호: 5),
SLGEQQYSV (서열 번호: 6) 및
RVPGVAPTL (서열 번호: 7)
중에서 선택되는 어느 하나의 아미노산 서열을 포함하는 펩티드를 나타내고, 암 항원 펩티드 A의 N 말단 아미노산의 아미노기가 식 (1) 중의 Ya와 결합하고, 암 항원 펩티드 A의 C 말단 아미노산의 카르보닐기가 식 (1) 중의 수산기와 결합하고,
R1은 암 항원 펩티드 C를 나타내고,
암 항원 펩티드 C는, 암 항원 펩티드 A와는 서열이 상이하고 또한 이하의 아미노산 서열:
CMTWNQMNL (서열 번호: 3) 및
CYTWNQMNL (서열 번호: 4)
중에서 선택되는 어느 하나의 아미노산 서열을 포함하는 펩티드를 나타내고, 암 항원 펩티드 C의 시스테인 잔기의 티오에테르기가 식 (1) 중의 티오에테르기와 결합함]
로 표현되는 화합물 또는 그의 약학상 허용되는 염;
항 2. 식 (1)로 표현되는 화합물이 식 (4):
[화학식 29]
Figure 112015103012119-pct00029
(식 중, C와 C 사이의 결합은 디술피드 결합을 나타냄)
로 표현되는 화합물인, 항 1에 기재된 화합물 또는 그의 약학상 허용되는 염;
항 3. 식 (1)로 표현되는 화합물이 식 (5):
[화학식 30]
Figure 112015103012119-pct00030
(식 중, C와 C 사이의 결합은 디술피드 결합을 나타냄)
로 표현되는 화합물인, 항 1에 기재된 화합물 또는 그의 약학상 허용되는 염;
항 4. 항 1 내지 3 중 어느 한 항에 기재된 화합물 또는 그의 약학상 허용되는 염 및 약학적으로 허용되는 담체를 함유하는 의약 조성물;
항 5. 항 4에 기재된 의약 조성물이며,
이하의 아미노산 서열:
CNKRYFKLSHLQMHSRK (서열 번호: 22),
CNKRYFKLSHLQMHSRKH (서열 번호: 23),
CNKRYFKLSHLQMHSRKHTG (서열 번호: 24),
WAPVLDFAPPGASAYGSL (서열 번호: 244),
CWAPVLDFAPPGASAYGSL (서열 번호: 242) 및
WAPVLDFAPPGASAYGSLC (서열 번호: 243),
로 이루어지는 군에서 선택되는 아미노산 서열을 포함하는 펩티드를 하나 이상 포함하는 조성물; 및
항 6. 식 (4):
[화학식 31]
Figure 112015103012119-pct00031
(식 중, C와 C 사이의 결합은 디술피드 결합을 나타냄)
로 표현되는 화합물 및 식 (5):
[화학식 32]
Figure 112015103012119-pct00032
(식 중, C와 C 사이의 결합은 디술피드 결합을 나타냄)
로 표현되는 화합물로 이루어지는 군에서 선택되는 화합물과,
이하의 아미노산 서열:
CNKRYFKLSHLQMHSRK (서열 번호: 22),
CNKRYFKLSHLQMHSRKH (서열 번호: 23),
CNKRYFKLSHLQMHSRKHTG (서열 번호: 24),
WAPVLDFAPPGASAYGSL (서열 번호: 244),
CWAPVLDFAPPGASAYGSL (서열 번호: 242) 및
WAPVLDFAPPGASAYGSLC (서열 번호: 243)
로 이루어지는 군에서 선택되는 아미노산 서열을 포함하는 펩티드를 하나 이상 포함하는 조성물
에 관한 것이다.
본 발명에 의해, 암 면역 요법제로서 유용한 상기 식 (1)로 표현되는 화합물(이하, 본 발명의 화합물이라고도 함)을 제공하는 것이 가능하게 되었다. 본 발명의 화합물에 의해, 생체내 및 시험관내에서 CTL을 효율적으로 유도하는 암 백신이나 암 면역 요법제를 제공하는 것이 가능하게 되었다. 상세하게는, 본 발명의 화합물에 의해, 서열이 상이한 2개의 MHC 클래스 I 구속성 WT1 펩티드 또는 서열이 상이한 2개의 MHC 클래스 I 구속성 WT1 에피토프, MHC 클래스 IWT1 구속성 펩티드 및 MHC 클래스 II 구속성 WT1 펩티드, MHC 클래스 IWT1 구속성 WT1 에피토프 및 MHC 클래스 II 구속성 WT1 에피토프, 서열이 상이한 2개의 MHC 클래스 I 구속성 WT1 펩티드 및 MHC 클래스 II 구속성 WT1 펩티드, 또는 서열이 상이한 2개의 MHC 클래스 I 구속성 WT1 에피토프 및 MHC 클래스 II 구속성 WT1 에피토프를, 생체내 및 시험관내에서 생성하여, CTL을 효율적으로 유도하는 것이 가능하게 되었다.
그 중에서도, 서열이 상이한 2개의 MHC 클래스 I 구속성 WT1 펩티드의 HLA의 서브 타입에 관하여, A02 타입(A-0201, A0206 등)의 펩티드와 A24 타입(A-2402 등)의 펩티드를 조합해서 얻어지는 본 발명의 화합물(콘쥬게이트체)이 특히 바람직하다. 구미인(Caucasian)에게 있어서는, HLA-A0201 타입 또는 HLA-A0206 타입인 집단(Population)이 약 47％로 가장 많고，계속해서 HLA-A2402 타입이 약 13％이며, 이들 타입의 총합은, 중복(즉, 양쪽의 타입을 갖는 인간을 이중으로 계산하는 것)을 제외하면 약 56％를 차지한다(Human Immunol. 62:1009;2001). 한편 일본인 등에게 있어서는, HLA-A2402인 집단이 약 60％로 가장 많고，계속해서 HLA-A0201 또는 HLA-A0206이 약 39％이며, 이들 타입의 총합은, 중복(즉, 양쪽의 타입을 갖는 인간을 이중으로 계산하는 것)을 제외하면 약 81％를 차지한다(www.bmdc.irc.or.jp/GF-A.htm). 따라서, 본 발명의 화합물의 이점으로서는 구체적으로는, 보다 큰 집단을 하나의 본 발명의 화합물로 커버한다는 이점 및 반드시 투여하기 사전에 환자의 HLA의 서브 타입을 선별하는 것이 필수적이지 않게 될 수 있다는 이점 등을 들 수 있다. 본 발명의 화합물의 이러한 이점의 관점에서, 식 (3), 식 (4) 또는 식 (5)로 표현되는 화합물이 바람직하고, 식 (5)로 표현되는 화합물이 보다 바람직하다.
또한, 본 발명의 화합물에 의해, 물리 화학적 성질이나 안정성이 우수하고, 제조나 그 제어가 용이한 암 백신의 유효 성분을 제공하는 것이 가능하게 되었다. 이에 의해, 암 백신의 제제화도 용이하게 되었다.
구체적으로는, 물리 화학적 성질로서는, 용해도, 용액의 점도, 이에 수반되는 정제의 용이성, 동결 건조 후의 취급 용이성, 이에 수반되는 정제의 용이성 등을 들 수 있다. 안정성으로서, 염 치환한 후의 안정성, 흡습성, 열 안정성, 에멀전 형성 후의 안정성 등을 들 수 있다. 또한 약리 활성으로서는, 암 백신으로서의 약효, API(Active Pharmaceutical Ingredient, 의약품 유효 성분)에 의해 발생하는 차이, 제제 중의 첨가제와의 상호 작용 등을 들 수 있다. 이 중 API에 의해 발생하는 차이란, API에 의한 암 백신으로서의 차이이며, 구체적으로는, 용해도가 크게 상이한 2개의 API에 있어서는, 용해도가 작은 API의 경우 석출되기 쉬워, 의약품에는 필수 요건인 멤브레인 필터의 여과에 의한 멸균 처리를 할 수 없게 될 가능성이 충분히 예상된다. 또는, 간신히 용해도가 작은 API의 여과에 의한 멸균 처리를 행해도, 여과액에 포함되는 API의 양이 크게 감소하여, 암 백신으로서 필수적인 CTL 유도능도 현저하게 저하될 것으로 생각된다. 따라서, 용해도가 작은 API로는, 생산상의 효율이 현저하게 저하된다는 단점이 용이하게 예상된다.
도 1은, 시험 예 1에서, 실시예 2 내지 5에서 합성된 서열 번호: 13, 16, 17 및 18의 각 펩티드에 대해서, ERAP1에 의한 N 말단 아미노산의 트리밍 경시 변화를 시험한 결과를 도시하는 도면이다.
도 2는, 시험 예 2에서, 실시예 1에서 합성된 식 (5)로 표현되는 화합물에 대해서, HLA-A0201 유전자 도입 마우스를 사용한 IFNγ ELISPOT 검정에 의한 생체내에서의 CTL 유도능을 시험한 결과를 도시하는 도면이다.
도 3은, 시험 예 2에서, 실시예 1에서 합성된 식 (5)로 표현되는 화합물에 대해서, HLA-A2402 유전자 도입 마우스를 사용한 IFNγ ELISPOT 검정에 의한 생체내에서의 CTL 유도능을 시험한 결과를 도시하는 도면이다.
도 4는, 시험 예 4에서, 실시예 6에서 합성된 식 (3)으로 표현되는 화합물에 대해서, HLA-A0201 유전자 도입 마우스를 사용한 IFNγ ELISPOT 검정에 의한 생체내에서의 CTL 유도능을 시험한 결과를 도시하는 도면이다.
도 5는, 시험 예 5에서, 실시예 7에서 합성된 식 (6)으로 표현되는 화합물에 대해서, 서열 번호: 2의 펩티드 펄스 또는 비펄스에서의, HLA-A0201 유전자 도입 마우스를 사용한 IFNγ ELISPOT 검정에 의한 생체내에서의 서열 번호: 24의 펩티드 반응성 세포의 유도능을 시험한 결과를 도시하는 도면이다.
도 6은, 시험 예 5에서, 실시예 7에서 합성된 식 (6)으로 표현되는 화합물에 대해서, 서열 번호: 24의 펩티드 펄스 또는 비펄스에서의, HLA-A0201 유전자 도입 마우스를 사용한 IFNγ ELISPOT 검정에 의한 생체내에서의 서열 번호: 24의 펩티드 반응성 세포의 유도능을 시험한 결과를 도시하는 도면이다.
도 7은, 시험 예 6에서, 실시예 9에서 합성된 식 (8)로 표현되는 화합물에 대해서, 서열 번호: 2의 펩티드 펄스 또는 비펄스에서의, HLA-A0201 유전자 도입 마우스를 사용한 IFNγ ELISPOT 검정에 의한 생체내에서의 CTL 유도능을 시험한 결과를 도시하는 도면이다.
도 8은, 시험 예 6에서, 실시예 9에서 합성된 식 (8)로 표현되는 화합물에 대해서, 서열 번호: 22의 펩티드 펄스 또는 비펄스에서의, HLA-A0201 유전자 도입 마우스를 사용한 IFNγ ELISPOT 검정에 의한 생체내에서의 서열 번호: 22의 펩티드 반응성 세포의 유도능을 시험한 결과를 도시하는 도면이다.
도 9는, 시험 예 8에서, 실시예 8에서 합성된 식 (7)로 표현되는 화합물에 대해서, 서열 번호: 2의 펩티드 펄스 또는 비펄스에서의, HLA-A0201 유전자 도입 마우스를 사용한 IFNγ ELISPOT 검정에 의한 생체내에서의 CTL 유도능을 시험한 결과를 도시하는 도면이다.
도 10은, 시험 예 8에서, 실시예 8에서 합성된 식 (7)로 표현되는 화합물에 대해서, 서열 번호: 23의 펩티드 펄스 또는 비펄스에서의, HLA-A0201 유전자 도입 마우스를 사용한 IFNγ ELISPOT 검정에 의한 생체내에서의 서열 번호: 23의 펩티드 반응성 세포의 유도능을 시험한 결과를 도시하는 도면이다.
도 11은, 시험 예 9에서, 실시예 10에서 합성된 식 (9)로 표현되는 화합물에 대해서, 서열 번호: 5의 펩티드 펄스 또는 비펄스에서의, HLA-A0201 유전자 도입 마우스를 사용한 IFNγ ELISPOT 검정에 의한 생체내에서의 CTL 유도능을 시험한 결과를 도시하는 도면이다.
도 12는, 시험 예 9에서, 실시예 10에서 합성된 식 (9)로 표현되는 화합물에 대해서, 서열 번호: 24의 펩티드 펄스 또는 비펄스에서의, HLA-A0201 유전자 도입 마우스를 사용한 IFNγ ELISPOT 검정에 의한 생체내에서의 서열 번호: 24의 펩티드 반응성 세포의 유도능을 시험한 결과를 도시하는 도면이다.
도 13은, 비교예 1에서, 참고 예 8 및 9에서 합성된 서열 번호: 238 및 239로 표현되는 펩티드에 대해서, 서열 번호: 2의 펩티드 펄스 또는 비펄스에서의, HLA-A0201 유전자 도입 마우스를 사용한 IFNγ ELISPOT 검정에 의한 생체내에서의 CTL 유도능을 시험한 결과를 도시하는 도면이다.
도 14는, 비교예 1에서, 참고 예 8 및 9에서 합성된 서열 번호: 238 및 239로 표현되는 펩티드에 대해서, 서열 번호: 4의 펩티드 펄스 또는 비펄스에서의, HLA-A2402 유전자 도입 마우스를 사용한 IFNγ ELISPOT 검정에 의한 생체내에서의 CTL 유도능을 시험한 결과를 도시하는 도면이다.
도 15는, 비교예 2에서, 참고 예 10 및 11에서 합성된 서열 번호: 240 및 241로 표현되는 펩티드에 대해서, 서열 번호: 2의 펩티드 펄스 또는 비펄스에서의, HLA-A0201 유전자 도입 마우스를 사용한 IFNγ ELISPOT 검정에 의한 생체내에서의 CTL 유도능을 시험한 결과를 도시하는 도면이다.
도 16은, 비교예 2에서, 참고 예 10 및 11에서 합성된 서열 번호: 240 및 241로 표현되는 펩티드에 대해서, 서열 번호: 4의 펩티드 펄스 또는 비펄스에서의, HLA-A2402 유전자 도입 마우스를 사용한 IFNγ ELISPOT 검정에 의한 생체내에서의 CTL 유도능을 시험한 결과를 도시하는 도면이다.
도 17은, 시험 예 11에서, 실시예 13에서 합성된 식 (10)으로 표현되는 화합물에 대해서, 서열 번호: 2의 펩티드 펄스 또는 비펄스에서의, HLA-A0201 유전자 도입 마우스를 사용한 IFNγ ELISPOT 검정에 의한 생체내에서의 CTL 유도능을 시험한 결과를 도시하는 도면이다.
도 18은, 비교예 3에서, 참고 예 12에서 합성된 식 (11)로 표현되는 화합물에 대해서, 서열 번호: 2의 펩티드 펄스 또는 비펄스에서의, HLA-A0201 유전자 도입 마우스를 사용한 IFNγ ELISPOT 검정에 의한 생체내에서의 CTL 유도능을 시험한 결과를 도시하는 도면이다.
도 19는, 시험 예 12에서, 실시예 14에서 합성된 식 (12)로 표현되는 화합물에 대해서, 서열 번호: 2의 펩티드 펄스 또는 비펄스에서의, HLA-A0201 유전자 도입 마우스를 사용한 IFNγ ELISPOT 검정에 의한 생체내에서의 CTL 유도능을 시험한 결과를 도시하는 도면이다.
도 20은, 시험 예 12에서, 실시예 14에서 합성된 식 (12)로 표현되는 화합물에 대해서, 서열 번호: 4의 펩티드 펄스 또는 비펄스에서의, HLA-A2402 유전자 도입 마우스를 사용한 IFNγ ELISPOT 검정에 의한 생체내에서의 CTL 유도능을 시험한 결과를 도시하는 도면이다.
도 21은, 시험 예 13에서, 실시예 15에서 합성된 식 (14)로 표현되는 화합물에 대해서, 서열 번호: 2의 펩티드 펄스 또는 비펄스에서의, HLA-A0201 유전자 도입 마우스를 사용한 IFNγ ELISPOT 검정에 의한 생체내에서의 CTL 유도능을 시험한 결과를 도시하는 도면이다.
도 22는, 시험 예 13에서, 실시예 15에서 합성된 식 (14)로 표현되는 화합물에 대해서, 서열 번호: 4의 펩티드 펄스 또는 비펄스에서의, HLA-A2402 유전자 도입 마우스를 사용한 IFNγ ELISPOT 검정에 의한 생체내에서의 CTL 유도능을 시험한 결과를 도시하는 도면이다.
도 23은, 시험 예 14에서, 실시예 1에서 합성된 식 (5)로 표현되는 화합물과 참고 예 1에서 합성된 서열 번호: 22로 표현되는 펩티드를 혼합한 칵테일 백신에 대해서, 서열 번호: 2의 펩티드 펄스 또는 비펄스에서의, HLA-A0201 유전자 도입 마우스를 사용한 IFNγ ELISPOT 검정에 의한 생체내에서의 CTL 유도능을 시험한 결과를 도시하는 도면이다.
도 24는, 시험 예 15에서, 실시예 1에서 합성된 식 (5)로 표현되는 화합물과 참고 예 13에서 합성된 서열 번호: 244로 표현되는 펩티드를 혼합한 칵테일 백신에 대해서, 서열 번호: 2의 펩티드 펄스 또는 비펄스에서의, HLA-A0201 유전자 도입 마우스를 사용한 IFNγ ELISPOT 검정에 의한 생체내에서의 CTL 유도능을 시험한 결과를 도시하는 도면이다.
도 25는, 시험 예 16에서, 실시예 1에서 합성한 식 (5)로 표현되는 화합물과 참고 예 2에서 합성한 서열 번호: 24로 표현되는 펩티드를 혼합한 칵테일 백신에 대해서, 서열 번호: 2의 펩티드 펄스 또는 비펄스에서의, HLA-A0201 유전자 도입 마우스를 사용한 IFNγ ELISPOT 검정에 의한 생체내에서의 CTL 유도능을 시험한 결과를 도시하는 도면이다.
도 26은, 시험 예 17에서, 실시예 1에서 합성한 식 (5)로 표현되는 화합물과 실시예 11에서 합성한 서열 번호: 242로 표현되는 펩티드를 혼합한 칵테일 백신에 대해서, 서열 번호: 2의 펩티드 펄스 또는 비펄스에서의, HLA-A0201 유전자 도입 마우스를 사용한 IFNγ ELISPOT 검정에 의한 생체내에서의 CTL 유도능을 시험한 결과를 도시하는 도면이다.
도 27은, 시험 예 18에서, 실시예 1에서 합성한 식 (5)로 표현되는 화합물과 실시예 11에서 합성한 서열 번호: 243으로 표현되는 펩티드를 혼합한 칵테일 백신에 대해서, 서열 번호: 2의 펩티드 펄스 또는 비펄스에서의, HLA-A0201 유전자 도입 마우스를 사용한 IFNγ ELISPOT 검정에 의한 생체내에서의 CTL 유도능을 시험한 결과를 도시하는 도면이다.
이하, 본 발명의 실시 형태에 대해서 상세하게 설명한다.
본 발명에서의 「아미노산 잔기」란, 펩티드 또는 단백질 분자상에서, 펩티드 또는 단백질을 구성하고 있는 아미노산의 1단위에 해당하는 부분을 의미한다. 「아미노산 잔기」로서는, 천연 또는 비천연의 α-아미노산 잔기, β-아미노산 잔기, γ-아미노산 잔기 또는 δ-아미노산 잔기를 들 수 있다. 구체적으로는, 천연의 α-아미노산 잔기, 오르니틴 잔기, 호모세린 잔기, 호모시스테인 잔기, β-알라닌, γ-아미노부탄산 또는 δ-아미노펜탄산 등을 들 수 있다. 「아미노산 잔기」에, 광학 활성체가 있을 수 있는 경우, L체, D체 중 어느 것이어도 되지만, L체가 바람직하다.
본 발명에서의 「아미노산 잔기」를 약호로 표시하는 경우, 다음의 약호로 기술한다.
Ala 또는 A: 알라닌 잔기
Arg 또는 R: 아르기닌 잔기
Asn 또는 N: 아스파라긴 잔기
Asp 또는 D: 아스파라긴산 잔기
Cys 또는 C: 시스테인 잔기
Gln 또는 Q: 글루타민 잔기
Glu 또는 E: 글루탐산 잔기
Gly 또는 G: 글리신 잔기
His 또는 H: 히스티딘 잔기
Ile 또는 I: 이소류신 잔기
Leu 또는 L: 류신 잔기
Lys 또는 K: 리신 잔기
Met 또는 M: 메티오닌 잔기
Phe 또는 F: 페닐알라닌 잔기
Pro 또는 P: 프롤린 잔기
Ser 또는 S: 세린 잔기
Thr 또는 T: 트레오닌 잔기
Trp 또는 W: 트립토판 잔기
Tyr 또는 Y: 티로신 잔기
Val 또는 V: 발린 잔기
Abu: 2-아미노부티르산 잔기(α-아미노부티르산 잔기라고도 함)
Orn: 오르니틴 잔기
Cit: 시트룰린 잔기
본 발명에서의 「펩티드」의 아미노산 서열은, 통상법에 따라서, N 말단 아미노산의 아미노산 잔기가 좌측에 위치하고, C 말단 아미노산의 아미노산 잔기가 우측에 위치하도록 기술한다. 또한 「펩티드」에 있어서, 특별히 언급이 없는 한, N 말단 아미노산의 아미노산 잔기의 아미노기는 수소 원자와 결합하고, C 말단 아미노산의 아미노산 잔기의 카르보닐기는 수산기와 결합하고 있다. 펩티드의 2가 기란, N 말단 아미노산의 아미노산 잔기의 아미노기 및 C 말단 아미노산의 아미노산 잔기의 카르보닐기를 통해 결합하는 기를 의미한다.
본 발명의 화합물에 있어서, 예를 들어 식 (3) 내지 (9)로 표현되는 화합물에 있어서, 그의 부분 구조에 해당하는 펩티드에 대해서도, 특별히 언급이 없는 한, N 말단 아미노산의 아미노산 잔기의 아미노기는 수소 원자와 결합하고, C 말단 아미노산의 아미노산 잔기의 카르보닐기는 수산기와 결합하고 있다.
본 발명에서의 「Xa」 및 「Ya」는, 독립하여, 단결합 또는 1 내지 4 잔기의 아미노산을 포함하는 펩티드의 2가 기를 나타낸다. Xa의 아미노산 잔기수와 Ya의 아미노산 잔기수의 합은 0 내지 4의 정수이다. 예를 들어, 당해 합이 0의 정수라는 것은, Xa 및 Ya가 단결합인 것을 의미한다. 또한, 당해 합이 4의 정수인 경우로서는, 예를 들어 Xa 및 Ya가 독립하여 2 잔기의 아미노산을 포함하는 펩티드의 2가 기인 경우, Xa가 3 잔기의 아미노산을 포함하는 펩티드의 2가 기이며 또한 Ya가 1 잔기의 아미노산을 포함하는 펩티드의 2가 기인 경우, Xa가 4 잔기의 아미노산을 포함하는 펩티드의 2가 기이며 또한 Ya가 단결합인 경우 등을 들 수 있다.
당해 합의 정수로서, 바람직하게는 0 내지 2를 들 수 있고, 보다 바람직하게는 0 내지 1을 들 수 있고, 가장 바람직하게는 0을 들 수 있다. 즉, Xa 및 Ya로서는, 모두 단결합인 경우가 가장 바람직하다.
당해 합의 정수가 2인 경우로서는, Xa가 2 잔기의 아미노산을 포함하는 펩티드의 2가 기이며 또한 Ya가 단결합인 경우, Xa 및 Ya가 독립하여 1 잔기의 아미노산을 포함하는 펩티드의 2가 기인 경우, 또는 Xa가 단결합이며 또한 Ya가 2 잔기의 아미노산을 포함하는 펩티드의 2가 기일 경우를 들 수 있다.
당해 합의 정수가 1인 경우로서는, Xa가 1 잔기의 아미노산을 포함하는 펩티드의 2가 기이며 또한 Ya가 단결합인 경우, 또는 Xa가 단결합이며 또한 Ya가 1 잔기의 아미노산을 포함하는 펩티드의 2가 기인 경우를 들 수 있다. 이 중 바람직하게는, Xa가 단결합이며 또한 Ya가 알라닌 잔기, 류신 잔기 또는 메티오닌 잔기인 경우를 들 수 있다.
본 발명에서의 「암 항원 펩티드 A」란, 7 내지 30 잔기의 아미노산을 포함하는 MHC 클래스 I 구속성 WT1 펩티드이다. 식 (1)에서 암 항원 펩티드 A는, N 말단 아미노산의 아미노기가 식 (1) 중의 Ya와 결합하고, C 말단 아미노산의 카르보닐기가 식 (1) 중의 수산기와 결합한다.
먼저, 본 발명에서의 「MHC 클래스 I 구속성」이란, 주요 조직 적합 항원(Major Histocompatibility Complex, MHC)의 클래스 I인 MHC 클래스 I 분자와 결합해서 CTL을 유도하는 특성을 의미한다.
MHC는, 인간에서는 인간 백혈구형 항원(HLA)이라고 불린다. MHC 클래스 I 분자에 상당하는 HLA는, HLA-A, B, Cw, F 및 G 등의 서브 타입으로 분류된다. 「MHC 클래스 I 구속성」으로서, 바람직하게는 HLA-A 구속성, HLA-B 구속성 또는 HLA-Cw 구속성을 들 수 있다.
HLA의 각 서브 타입에 대해서, 다형(대립 유전자)이 알려져 있다. HLA-A의 다형으로서는, HLA-A1, HLA-A0201, HLA-A24 등의 27종 이상을 들 수 있고, HLA-B의 다형으로서는, HLA-B7, HLA-B40, HLA-B4403 등의 59종 이상을 들 수 있고, HLA-Cw의 다형으로서는, HLA-Cw0301, HLA-Cw0401, HLA-Cw0602 등의 10종 이상을 들 수 있다. 이들 다형 중, 바람직하게는 HLA-A0201이나 HLA-A24를 들 수 있다.
이어서, 본 발명에서의 「WT1 펩티드」란, 서열 번호: 1에 기재된 인간의 WT1의 아미노산 서열에 있어서 연속되는 7 내지 30 잔기의 아미노산을 포함하는 부분 펩티드이다.
따라서, 본 발명에서의 「MHC 클래스 I 구속성 WT1 펩티드」란, 시험관내 및/또는 생체내에서, MHC 클래스 I 항원에 결합하여, 복합체로서 제시되는 펩티드이며, 또한 해당 복합체가 전구체 T 세포에 인식된 결과 CTL을 유도하는 펩티드를 의미한다. 「MHC 클래스 I 구속성 WT1 펩티드」의 아미노산 잔기수는, 7 내지 30이며, 바람직하게는 7 내지 15이며, 보다 바람직하게는 8 내지 12이며, 더욱 바람직하게는 8 내지 11이며, 가장 바람직하게는 8 또는 9이다.
7 내지 12 잔기 또는 바람직하게는 9 잔기의 아미노산을 포함하는 「MHC 클래스 I 구속성 WT1 펩티드」는, 「MHC 클래스 I 구속성 WT1 에피토프」라고도 불린다. 본 발명에서의 「MHC 클래스 I 구속성 WT1 에피토프」란, MHC 클래스 I 항원과 결합해서 복합체로서 제시되는 펩티드 그 자체를 의미한다. 즉, 「MHC 클래스 I 구속성 WT1 펩티드」가, 시험관내 및/또는 생체내에서, 감마-인터페론-유도성 리소좀 티올 리덕타아제(Gamma-Interferon-inducible Lysosomal Thiol Reductase)(GILT, GLT) 등의 프로테오솜 및/또는 프로테아제에 의한 세포 내에서의 본 발명 화합물의 분해(Proteolysis, 디술피드 결합의 환원적 개열), 및/또는 소포체 아미노펩티다아제 1(ERAP1, ER-아미노펩티다아제 1)에 의한 최적의 잔기수로의 절단(트리밍이라고도 함)에 의해, 「MHC 클래스 I 구속성 WT1 에피토프」를 생성한다. 당해 생성에 있어서는, 먼저 프로테오솜 및/또는 프로테아제에 의한 분해의 결과 「MHC 클래스 I 구속성 WT1 에피토프」의 C 말단 아미노산이 발생하고, 다음으로 ERAP1에 의한 트리밍(절단)의 결과 「MHC 클래스 I 구속성 WT1 에피토프」의 N 말단 아미노산이 발생한다는 생성 과정을 주로 생각할 수 있다. 단, 당해 생성에 있어서는, 당해 생성 과정 이외의 과정도 경유할 수 있다. 또한, 현재, ERAP1은, ERAAP(항원 제시와 연관된 ER 아미노펩티다아제(ER aminopeptidase associated with antigen presentation))라고도 불리며, 이전에는, A-LAP, PILS-AP 또는 ARTS-1이라고도 불렸다.
따라서, 「MHC 클래스 I 구속성 WT1 펩티드」로서는, 7 내지 12 잔기의 아미노산을 포함하는 「MHC 클래스 I 구속성 WT1 에피토프」의 C 말단 아미노산의 카르보닐기에 1 내지 23 잔기의 아미노산이 부가되어서 생성되는 7 내지 30 잔기의 아미노산을 포함하는 펩티드가 바람직하다.
「MHC 클래스 I 구속성 WT1 펩티드」로서는, 예를 들어 표 1 내지 44에 기재된 펩티드를 들 수 있다. 각 표 중, 「위치」란, 서열 번호: 1에 기재된 인간의 WT1의 아미노산 서열에서의 위치를 나타낸다.
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Figure 112015103012119-pct00034
Figure 112015103012119-pct00035
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Figure 112015103012119-pct00047
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Figure 112015103012119-pct00076
「MHC 클래스 I 구속성 WT1 펩티드」로서, 바람직하게는 이하의 아미노산 서열:
RMFPNAPYL (서열 번호: 2),
CMTWNQMNL (서열 번호: 3),
ALLPAVPSL (서열 번호: 5),
SLGEQQYSV (서열 번호: 6) 및
RVPGVAPTL (서열 번호: 7)
중에서 선택되는 어느 하나의 아미노산 서열을 포함하는 펩티드, 또는 서열 번호: 2, 3, 5, 6 및 7 중에서 선택되는 어느 하나의 아미노산 서열 중에 아미노산 잔기의 개변을 함유하는 개변 아미노산 서열을 포함하고 또한 CTL 유도 활성을 갖는 펩티드를 들 수 있다. 더욱 바람직하게는, 서열 번호: 2, 3, 5, 6 및 7 중에서 선택되는 어느 하나의 아미노산 서열을 포함하는 펩티드를 들 수 있다.
본 발명에서의 「아미노산 서열을 포함하는 펩티드」란, 통상과 같이, 당해 아미노산 서열의 N 말단 아미노산 및/또는 C 말단 아미노산에 새로운 아미노산이 부가된 펩티드를 의미한다. 「암 항원 펩티드 A」 및 「암 항원 펩티드 B」에서의 「MHC 클래스 I 구속성 WT1 펩티드」가 부가되는 경우, C 말단측에 부가된 펩티드가 바람직하다. 「MHC 클래스 I 구속성 WT1 에피토프」가 부가되는 경우, C 말단측으로의 부가가 바람직하다.
본 발명에서의 「아미노산 서열 중에 아미노산 잔기의 개변을 함유하는 개변 아미노산 서열을 포함하고 또한 CTL 유도 활성을 갖는 펩티드」는, 「개변 킬러 펩티드」라고도 불린다. 당해 개변 킬러 펩티드는, 아미노산 서열에 있어서, 1 내지 3개의 아미노산이 결실, 치환 및/또는 부가된 아미노산 서열을 포함하고, MHC 클래스 I에 결합하여, CTL을 유도하는 펩티드를 의미한다. 치환되는 아미노산의 치환 위치로서는, 9 잔기의 아미노산을 포함하는 펩티드의 경우, 1위치(N 말단), 2위치, 3위치 및 9위치를 들 수 있다. 부가(삽입도 포함됨)되는 아미노산의 수는 바람직하게는 1 또는 2이며, 보다 바람직하게는 1이다. 바람직한 부가 위치로서는, C 말단을 들 수 있다. 결실되는 아미노산의 수는 바람직하게는 1이다. 개변에 있어서, 부가되는 아미노산 또는 치환되는 아미노산은, 유전자에 의해 코드되는 20종류의 아미노산 이외의 비천연 아미노산이어도 된다.
HLA의 서브 타입의 다형마다, HLA 항원에 결합할 수 있는 펩티드의 아미노산 서열의 규칙성(결합 모티프)이 존재하는 것으로 알려져 있다. 예를 들어, HLA-A24의 결합 모티프로서, 8 내지 11 잔기의 아미노산을 포함하는 펩티드에 있어서, 2위치의 아미노산이 Tyr, Phe, Met 또는 Trp이며, C 말단의 아미노산이 Phe, Leu, Ile, Trp 또는 Met인 것으로 알려져 있다(J. Immunol., 152, p3913, 1994, J. Immunol., 155, p4307, 1994, Immunogenetics, 41, p178, 1995). 따라서, 예를 들어 9 잔기의 아미노산을 포함하는 펩티드의 경우, 2위치가 Tyr, Phe, Met 또는 Trp에 의해, 및/또는 9위치가 Phe, Leu, Ile, Trp 또는 Met에 의해 치환되는 것이 가능하고, 당해 치환이 이루어진 펩티드가 개변 킬러 펩티드로서 바람직하다. 마찬가지로, HLA-A0201의 결합 모티프로서, 8 내지 11 잔기의 아미노산을 포함하는 펩티드에 있어서, 2위치의 아미노산이 Leu 또는 Met이며, C 말단의 아미노산이 Val 또는 Leu인 것이 알려져 있으므로, 예를 들어 9 잔기의 아미노산을 포함하는 펩티드의 경우, 2위치가 Leu 또는 Met에 의해, 및/또는 9위치가 Val 또는 Leu에 의해 치환되는 것이 가능하고, 당해 치환이 이루어진 펩티드가 개변 킬러 펩티드로서 바람직하다.
개변 킬러 펩티드로서는 예를 들어, 다음과 같은 펩티드를 들 수 있다.
RMFPNAPYL (서열 번호: 2)의 개변 킬러 펩티드임
RYFPNAPYL (서열 번호: 223)(국제 공개 03/106682호 참조);
FMFPNAPYL (서열 번호: 224),
RLFPNAPYL (서열 번호: 225),
RMMPNAPYL (서열 번호: 226),
RMFPNAPYV (서열 번호: 227) 또는
YMFPNAPYL (서열 번호: 228)(국제 공개 제2009/072610호 참조);
CMTWNQMNL (서열 번호: 3)의 개변 킬러 펩티드임
CYTWNQMNL (서열 번호: 4)(국제 공개 제02/79253호 참조);
Xaa-Met-Thr-Trp-Asn-Gln-Met-Asn-Leu (서열 번호: 229)
(본 서열 중 Xaa는 Ser 또는 Ala를 나타냄) 또는
Xaa-Tyr-Thr-Trp-Asn-Gln-Met-Asn-Leu (서열 번호: 230)
(본 서열 중 Xaa는 Ser, Ala, Abu, Arg, Lys, Orn, Cit, Leu, Phe 또는 Asn을 나타냄)(국제 공개 2004/026897호 참조);
ALLPAVPSL (서열 번호: 5)의 개변 킬러 펩티드임
AYLPAVPSL (서열 번호: 231)(국제 공개 제2003/106682호 참조);
SLGEQQYSV (서열 번호: 6)의 개변 킬러 펩티드임
FLGEQQYSV (서열 번호: 232),
SMGEQQYSV (서열 번호: 233) 또는
SLMEQQYSV (서열 번호: 234)(국제 공개 제2009/072610호 참조); 또는
RVPGVAPTL (서열 번호: 7)의 개변 킬러 펩티드임
RYPGVAPTL (서열 번호: 235)(국제 공개 제2003/106682호 참조)
본 발명에서의 「R1」은, 수소 원자, 상기의 식 (2)로 표현되는 기 또는 암 항원 펩티드 C를 나타내고, 바람직하게는 상기의 식 (2)로 표현되는 기 또는 암 항원 펩티드 C를 들 수 있다.
R1이 수소 원자인 경우, 식 (1)의 화합물은 식 (1-1):
[화학식 33]
Figure 112015103012119-pct00077
(식 중, Xa, Ya 및 암 항원 펩티드 A는 식 (1)에서의 상기와 동의이며, Cys는 시스테인 잔기를 나타냄)
로 표현되는 화합물, 즉 펩티드이다.
R1이 수소 원자인 식 (1)의 화합물, 즉 식 (1-1)로 표현되는 펩티드에 대해서는, 그 서열은 WT1 단백의 부분 서열과 동일하지 않다. 식 (1)의 요건 「서열은 WT1 단백의 부분 서열과 동일하지 않다」란, 식 (1-1)로 표현되는 펩티드가 서열 번호: 1에 기재된 인간의 WT1의 아미노산 서열에 있어서 연속되는 8 내지 35 잔기의 아미노산을 포함하는 부분 펩티드는 아님을 의미한다.
즉, R1이 수소 원자인 식 (1)의 화합물은, 서열 번호: 1에 기재된 인간의 WT1의 아미노산 서열에 있어서 연속되는 8 내지 35 잔기의 아미노산을 포함하는 부분 펩티드는 아니다. 암 항원 펩티드 A가 WT1138-146 펩티드인 경우를 예로 들어 구체적으로 설명한다. WT1138 -146 펩티드는, 그 아미노산 서열이 LESQPAIRN(서열 번호: 78)이며, 서열 번호: 1에 기재된 인간의 WT1의 아미노산 서열에서의 138위치 내지 146위치가 연속되는 9 잔기의 아미노산을 포함하는 부분 펩티드이다. 서열 번호: 1에서는, WT1138-146 펩티드의 N 말단측에 연속되는 137위치는 C이다. 따라서, WT1137-146 펩티드(CLESQPAIRN)(서열 번호: 236)는, 서열 번호: 1에 기재된 인간의 WT1의 아미노산 서열에 있어서 연속되는 10 잔기의 아미노산을 포함하는 부분 펩티드에 해당한다. 한편, 본원 발명의 요건 「R1이 수소 원자인 식 (1)의 화합물은, 서열 번호: 1에 기재된 인간의 WT1의 아미노산 서열에 있어서 연속되는 8 내지 35 잔기의 아미노산을 포함하는 부분 펩티드는 아니다」에 기초하여, R1이 수소 원자인 식 (1)의 화합물에 있어서, 암 항원 펩티드 A가 WT1138-146 펩티드(LESQPAIRN)(서열 번호: 78)인 경우에는, WT1137 -146 펩티드(CLESQPAIRN)(서열 번호: 236)는 본원 발명의 화합물에서 제외되므로, Xa 및 Ya가 동시에 단결합으로 되지는 않는다.
R1이 수소 원자인 식 (1)의 화합물로서, 이하의 아미노산 서열:
CRMFPNAPYL (서열 번호: 13),
CCMTWNQMNL (서열 번호: 14),
CCYTWNQMNL (서열 번호: 15),
CALLPAVPSL (서열 번호: 16),
CSLGEQQYSV (서열 번호: 17) 및
CRVPGVAPTL (서열 번호: 18)
중에서 선택되는 어느 하나의 아미노산 서열을 포함하는 펩티드가 바람직하다.
「R1」이 상기한 식 (2)로 표현되는 기인 경우, 식 (1)의 화합물은 식 (1-2):
[화학식 34]
Figure 112015103012119-pct00078
(식 중, Xa, Ya 및 암 항원 펩티드 A는 식 (1)에서의 상기와 동의이며, Xb, Yb 및 암 항원 펩티드 B는 식 (2)에서의 상기와 동의임)로 표현되는 화합물이다.
본 발명에서의 「Xb」 및 「Yb」는, 독립하여, 단결합 또는 1 내지 4 잔기의 아미노산을 포함하는 펩티드의 2가 기를 나타낸다. Xb의 아미노산 잔기수와 Yb의 아미노산 잔기수의 합은 0 내지 4의 정수이다. 예를 들어, 당해 합이 0의 정수라는 것은, Xb 및 Yb가 단결합인 것을 의미한다. 또한, 당해 합이 4의 정수인 경우로서는, 예를 들어 Xb 및 Yb가 독립하여 2 잔기의 아미노산을 포함하는 펩티드의 2가 기인 경우, Xb가 3 잔기의 아미노산을 포함하는 펩티드의 2가 기이며 또한 Yb가 1 잔기의 아미노산을 포함하는 펩티드의 2가 기인 경우, Xb가 4 잔기의 아미노산을 포함하는 펩티드의 2가 기이며 또한 Yb가 단결합인 경우 등을 들 수 있다.
당해 합의 정수로서, 바람직하게는 0 내지 2를 들 수 있고, 보다 바람직하게는 0 내지 1을 들 수 있고, 가장 바람직하게는 0을 들 수 있다. 즉, Xb 및 Yb로서는, 모두 단결합인 경우가 가장 바람직하다.
당해 합의 정수가 2인 경우로서는, Xb가 2 잔기의 아미노산을 포함하는 펩티드의 2가 기이며 또한 Yb가 단결합인 경우, Xb 및 Yb가 독립하여 1 잔기의 아미노산을 포함하는 펩티드의 2가 기인 경우, 또는 Xb가 단결합이며 또한 Yb가 2 잔기의 아미노산을 포함하는 펩티드의 2가 기인 경우를 들 수 있다.
당해 합의 정수가 1인 경우로서는, Xb가 1 잔기의 아미노산을 포함하는 펩티드의 2가 기이며 또한 Yb가 단결합인 경우, 또는 Xb가 단결합이며 또한 Yb가 1 잔기의 아미노산을 포함하는 펩티드의 2가 기인 경우를 들 수 있다. 이 중 바람직하게는, Xb가 단결합이며 또한 Yb가 알라닌 잔기, 류신 잔기 또는 메티오닌 잔기인 경우를 들 수 있다.
본 발명에서의 「암 항원 펩티드 B」란, 7 내지 30 잔기의 아미노산을 포함하는 MHC 클래스 I 구속성 WT1 펩티드이다. 당해 「MHC 클래스 I 구속성 WT1 펩티드」에 대해서는 상기와 동의이다. 단, 식 (1)로 표현되는 화합물에 있어서, 암 항원 펩티드 A와 암 항원 펩티드 B가 동시에 동일한 펩티드인 경우는 없다. 즉, 암 항원 펩티드 B는, 「암 항원 펩티드 A와는 달리」라는 요건으로 한정된다.
암 항원 펩티드 A와 암 항원 펩티드 B가 동시에 동일한 펩티드인 경우는 없으므로, R1이 상기한 식 (2)로 표현되는 기인 식 (1)의 화합물은, 가령 Xa 및 Xb가 동일하고 또한 Ya 및 Yb가 동일해도, 호모 이량체가 아니라, 헤테로 이량체이다. 호모 이량체는, 동일한 펩티드 단량체가 이량체화된 이량체를 의미하고, 헤테로 이량체는, 서로 다른 펩티드 단량체가 이량체화된 이량체를 의미한다.
암 항원 펩티드 B에 있어서, N 말단 아미노산의 아미노기는 식 (2) 중에서는 Yb와 결합하고(즉, 식 (1-2) 중에서도 Yb와 결합하고), C 말단 아미노산의 카르보닐기가 식 (2) 중의 수산기와 결합한다.
R1이 식 (2)로 표현되는 기인 경우의 식 (1)의 화합물, 즉, 식 (1-2)의 화합물로서, 바람직하게는 식 (3):
[화학식 35]
Figure 112015103012119-pct00079
(식 중, C와 C 사이의 결합은 디술피드 결합을 나타냄)
으로 표현되는 화합물을 들 수 있다.
또한, 본 발명에서, 「암 항원 펩티드 B」가, 1개의 시스테인 잔기를 포함하는 MHC 클래스 I 구속성 WT1 펩티드인 경우, 식 (1)의 화합물은, 암 항원 펩티드 B 중의 티오에테르기가 식 (16):
[화학식 36]
Figure 112015103012119-pct00080
중의 티오에테르기와 결합하고 있는 화합물, 또는 암 항원 펩티드 E의 시스테인 잔기의 티오에테르기와 결합하고 있는 화합물이어도 된다.
본 발명에서의 「Xd」 및 「Yd」는, 독립하여, 단결합 또는 1 내지 4 잔기의 아미노산을 포함하는 펩티드의 2가 기를 나타낸다. Xd의 아미노산 잔기수와 Yd의 아미노산 잔기수의 합은 0 내지 4의 정수이다. 예를 들어, 당해 합이 0의 정수라는 것은, Xd 및 Yd가 단결합인 것을 의미한다. 또한, 당해 합이 4의 정수인 경우로서는, 예를 들어 Xd 및 Yd가 독립하여 2 잔기의 아미노산을 포함하는 펩티드의 2가 기인 경우, Xd가 3 잔기의 아미노산을 포함하는 펩티드의 2가 기이며 또한 Yd가 1 잔기의 아미노산을 포함하는 펩티드의 2가 기인 경우, Xd가 4 잔기의 아미노산을 포함하는 펩티드의 2가 기이며 또한 Yd가 단결합인 경우 등을 들 수 있다.
당해 합의 정수로서, 바람직하게는 0 내지 2를 들 수 있고, 보다 바람직하게는 0 내지 1을 들 수 있고, 가장 바람직하게는 0을 들 수 있다. 즉, Xd 및 Yd로서는, 모두 단결합인 경우가 가장 바람직하다.
당해 합의 정수가 2인 경우로서는, Xd가 2 잔기의 아미노산을 포함하는 펩티드의 2가 기이며 또한 Yd가 단결합인 경우, Xd 및 Yd가 독립하여 1 잔기의 아미노산을 포함하는 펩티드의 2가 기인 경우, 또는 Xd가 단결합이며 또한 Yd가 2 잔기의 아미노산을 포함하는 펩티드의 2가 기인 경우를 들 수 있다.
당해 합의 정수가 1인 경우로서는, Xd가 1 잔기의 아미노산을 포함하는 펩티드의 2가 기이며 또한 Yd가 단결합인 경우, 또는 Xd가 단결합이며 또한 Yd가 1 잔기의 아미노산을 포함하는 펩티드의 2가 기인 경우를 들 수 있다. 이 중 바람직하게는, Xd가 단결합이며 또한 Yd가 알라닌 잔기, 류신 잔기 또는 메티오닌 잔기인 경우를 들 수 있다.
본 발명에서의 「암 항원 펩티드 D」란, 7 내지 30 잔기의 아미노산을 포함하는 MHC 클래스 II 구속성 WT1 펩티드이다. 식 16에서 암 항원 펩티드 D는, N 말단 아미노산의 아미노기가 식 (16) 중의 Yd와 결합하고, C 말단 아미노산의 카르보닐기가 식 (16) 중의 수산기와 결합한다.
본 발명에서의 「MHC 클래스 II 구속성」이란, MHC 클래스 II 분자와 결합해서 헬퍼 T 세포를 유도하는 특성을 의미하고, 후술하는 「암 항원 펩티드 C」에서의 정의와 동의이다.
MHC 클래스 II 분자에 상당하는 HLA는, HLA-DR, DQ 및 DP 등의 서브 타입으로 분류된다. 「MHC 클래스 II 구속성」으로서, 바람직하게는 HLA-DR 구속성, HLA-DQ 구속성 또는 HLA-DP 구속성을 들 수 있다.
따라서, 본 발명에서의 「MHC 클래스 II 구속성 WT1 펩티드」란, 시험관내 및/또는 생체내에서 MHC 클래스 II 항원에 결합하여, 헬퍼 T 세포를 유도하는 펩티드를 의미한다. 「MHC 클래스 II 구속성 WT1 펩티드」의 아미노산 잔기수는 7 내지 30이며, 바람직하게는 14 내지 30이다.
「암 항원 펩티드 D」로서는, 후술하는 「암 항원 펩티드 C」에서 들 수 있는 아미노산 서열과 마찬가지로, 이하의 아미노산 서열:
SGQARMFPNAPYLPSC (서열 번호: 19),
SGQAYMFPNAPYLPSC (서열 번호: 25),
SGQARMFPNAPYLPSCLES (서열 번호: 11),
SGQAYMFPNAPYLPSCLES (서열 번호: 12),
PGCNKRYFKLSHLQMHSRK (서열 번호: 20),
PGCNKRYFKLSHLQMHSRKH (서열 번호: 21),
PGCNKRYFKLSHLQMHSRKHTG (서열 번호: 10),
CNKRYFKLSHLQMHSRK (서열 번호: 22),
CNKRYFKLSHLQMHSRKH (서열 번호: 23),
CNKRYFKLSHLQMHSRKHTG (서열 번호: 24) 및
WAPVLDFAPPGASAYGSL (서열 번호: 244)
중에서 선택되는 어느 하나의 아미노산 서열을 포함하는 펩티드를 들 수 있다.
식 (1)의 화합물에 있어서, 「암 항원 펩티드 B」가, 1개의 시스테인 잔기를 포함하는 MHC 클래스 I 구속성 WT1 펩티드인 경우, 암 항원 펩티드 B 중의 티오에테르기가 식 (16) 중의 티오에테르기와 결합하고 있는 화합물로서, 바람직하게는 식 (15):
[화학식 37]
Figure 112015103012119-pct00081
(식 중, C와 C 사이의 결합은 디술피드 결합을 나타냄)
로 표현되는 화합물을 들 수 있다.
본 발명에서의 「암 항원 펩티드 E」란, 1개의 시스테인 잔기를 포함하는 7 내지 30 잔기의 아미노산을 포함하는 MHC 클래스 II 구속성 WT1 펩티드를 나타내고, 후술하는 「암 항원 펩티드 C」에서의 「1개의 시스테인 잔기를 포함하는 7 내지 30 잔기의 아미노산을 포함하는 MHC 클래스 II 구속성 WT1 펩티드」의 정의와 동의이다.
「암 항원 펩티드 E」로서는, 후술하는 「암 항원 펩티드 C」에서 들 수 있는 아미노산 서열과 마찬가지로, 이하의 아미노산 서열:
SGQARMFPNAPYLPSC (서열 번호: 19),
SGQAYMFPNAPYLPSC (서열 번호: 25),
SGQARMFPNAPYLPSCLES (서열 번호: 11),
SGQAYMFPNAPYLPSCLES (서열 번호: 12),
PGCNKRYFKLSHLQMHSRK (서열 번호: 20),
PGCNKRYFKLSHLQMHSRKH (서열 번호: 21),
PGCNKRYFKLSHLQMHSRKHTG (서열 번호: 10),
CNKRYFKLSHLQMHSRK (서열 번호: 22),
CNKRYFKLSHLQMHSRKH (서열 번호: 23) 및
CNKRYFKLSHLQMHSRKHTG (서열 번호: 24)
중에서 선택되는 어느 하나의 아미노산 서열을 포함하는 펩티드를 들 수 있다.
R1이 암 항원 펩티드 C인 경우, 암 항원 펩티드 C의 시스테인 잔기의 티오에테르기가 식 (1) 중의 티오에테르기와 결합한다.
암 항원 펩티드 C는, 1개의 시스테인 잔기를 포함하는 7 내지 30 잔기의 아미노산을 포함하는 MHC 클래스 I 구속성 WT1 펩티드, 또는 1개의 시스테인 잔기를 포함하는 7 내지 30 잔기의 아미노산을 포함하는 MHC 클래스 II 구속성 WT1 펩티드를 나타낸다.
본 발명의 「1개의 시스테인 잔기를 포함하는 7 내지 30 잔기의 아미노산을 포함하는 MHC 클래스 I 구속성 WT1 펩티드」에 있어서는, 당해 펩티드의 아미노산 서열에 있어서, 적어도 1개의 시스테인 잔기를 포함하고 있으면 되고, 포함되는 시스테인 잔기수로서는 1 내지 3이 바람직하고, 1 내지 2가 보다 바람직하고, 1이 가장 바람직하다. 당해 「MHC 클래스 I 구속성 WT1 펩티드」에 대해서는, 상기와 동의이다. R1이 「1개의 시스테인 잔기를 포함하는 7 내지 30 잔기의 아미노산을 포함하는 MHC 클래스 I 구속성 WT1 펩티드」인 식 (1)의 화합물도 호모 이량체가 아니라, 헤테로 이량체이다.
「1개의 시스테인 잔기를 포함하는 7 내지 30 잔기의 아미노산을 포함하는 MHC 클래스 I 구속성 WT1 펩티드」로서는, 바람직하게는 표 45 내지 52에 기재된 펩티드를 들 수 있다. 각 표 중, 「위치」란, 서열 번호: 1에 기재된 인간의 WT1의 아미노산 서열에 있어서의 위치를 나타낸다.
Figure 112015103012119-pct00082
Figure 112015103012119-pct00083
Figure 112015103012119-pct00084
Figure 112015103012119-pct00085
Figure 112015103012119-pct00086
Figure 112015103012119-pct00087
Figure 112015103012119-pct00088
Figure 112015103012119-pct00089
「1개의 시스테인 잔기를 포함하는 7 내지 30 잔기의 아미노산을 포함하는 MHC 클래스 I 구속성 WT1 펩티드」로서, 보다 바람직하게는, 이하의 아미노산 서열:
CMTWNQMNL (서열 번호: 3)
을 포함하는 펩티드, 또는 서열 번호: 3의 아미노산 서열 중에 아미노산 잔기의 개변을 함유하는 개변 아미노산 서열을 포함하고 또한 CTL 유도 활성을 갖는 펩티드를 들 수 있다. 당해 「아미노산 서열을 포함한다」 및 「아미노산 서열 중에 아미노산 잔기의 개변을 함유하는 개변 아미노산 서열을 포함하고 또한 CTL 유도 활성을 갖는 펩티드」는 상기와 동의이다. 가장 바람직하게는, 이하의 아미노산 서열:
CMTWNQMNL (서열 번호: 3) 및
CYTWNQMNL (서열 번호: 4)
중에서 선택되는 어느 하나의 아미노산 서열을 포함하는 펩티드를 들 수 있다.
R1이 「1개의 시스테인 잔기를 포함하는 7 내지 30 잔기의 아미노산을 포함하는 MHC 클래스 I 구속성 WT1 펩티드」인 경우의 식 (1)의 화합물로서, 바람직하게는 식 (4):
[화학식 38]
Figure 112015103012119-pct00090
(식 중, C와 C 사이의 결합은 디술피드 결합을 나타냄)
로 표현되는 화합물, 또는 식 (5):
[화학식 39]
Figure 112015103012119-pct00091
(식 중, C와 C 사이의 결합은 디술피드 결합을 나타냄)
로 표현되는 화합물을 들 수 있다. 이 중, 식 (5)로 표현되는 화합물이 보다 바람직하다.
또한, 본 발명에 있어서, MHC 클래스 I 구속성 WT1 펩티드인 「암 항원 펩티드 C」의 N 말단이 1개의 시스테인 잔기를 포함하는 1 내지 4 잔기의 아미노산을 포함하는 펩티드가 또한 결합하고 있는 경우, 상기한 식 (1)의 화합물은, 암 항원 펩티드 C의 N 말단에 결합하고 있는 펩티드의 시스테인 잔기의 티오에테르기가 식 (16):
[화학식 40]
Figure 112015103012119-pct00092
중의 티오에테르기와 결합하고 있는 화합물 또는 암 항원 펩티드 E의 시스테인 잔기의 티오에테르기와 결합하고 있는 화합물이어도 된다.
본 발명에서의 「Xd」, 「Yd」, 「암 항원 펩티드 D」 및 「암 항원 펩티드 E」는, 상기한 「Xd」, 「Yd」, 「암 항원 펩티드 D」 및 「암 항원 펩티드 E」에서의 정의와 동의이다.
본 발명이 있어서, MHC 클래스 I 구속성 WT1 펩티드인 「암 항원 펩티드 C」의 N 말단에 결합하고 있는 「1개의 시스테인 잔기를 포함하는 1 내지 4 잔기의 아미노산을 포함하는 펩티드」는, 바람직하게는 CA를 포함하는 디펩티드이다.
식 (1)의 화합물에 있어서, MHC 클래스 I 구속성 WT1 펩티드인 「암 항원 펩티드 C」의 N 말단에 1개의 시스테인 잔기를 포함하는 1 내지 4 잔기의 아미노산을 포함하는 펩티드가 또한 결합하고 있는 경우, 암 항원 펩티드 C의 N 말단에 결합하고 있는 펩티드의 시스테인 잔기의 티오에테르기가 상기 식 (16) 중의 티오에테르기와 결합하고 있는 화합물로서, 바람직하게는 식 (14):
[화학식 41]
Figure 112015103012119-pct00093
(식 중, C와 C 사이의 결합은 디술피드 결합을 나타냄)
로 표현되는 화합물을 들 수 있다.
또한, 식 (1)의 화합물에 있어서, MHC 클래스 I 구속성 WT1 펩티드인 「암 항원 펩티드 C」의 N 말단에 1개의 시스테인 잔기를 포함하는 1 내지 4 잔기의 아미노산을 포함하는 펩티드가 또한 결합하고 있는 경우, 암 항원 펩티드 C의 N 말단에 결합하고 있는 펩티드의 시스테인 잔기의 티오에테르기가 「암 항원 펩티드 E」 중의 티오에테르기와 결합하고 있는 화합물로서, 바람직하게는 식 (12):
[화학식 42]
Figure 112015103012119-pct00094
(식 중, C와 C 사이의 결합은 디술피드 결합을 나타냄)
로 표현되는 화합물을 들 수 있다.
본 발명의 「1개의 시스테인 잔기를 포함하는 7 내지 30 잔기의 아미노산을 포함하는 MHC 클래스 II 구속성 WT1 펩티드」에 있어서는, 당해 펩티드의 아미노산 서열에 있어서, 적어도 1개의 시스테인 잔기를 포함하고 있으면 되고, 포함되는 시스테인 잔기수로서는 1 내지 3이 바람직하고, 1 내지 2가 보다 바람직하고, 1이 가장 바람직하다.
본 발명에서의 「MHC 클래스 II 구속성」이란, MHC 클래스 II 분자와 결합해서 헬퍼 T 세포를 유도하는 특성을 의미한다.
MHC 클래스 II 분자에 상당하는 HLA는, HLA-DR, DQ 및 DP 등의 서브 타입으로 분류된다. 「MHC 클래스 II 구속성」으로서, 바람직하게는 HLA-DR 구속성, HLA-DQ 구속성 또는 HLA-DP 구속성을 들 수 있다.
따라서, 본 발명에서의 「MHC 클래스 II 구속성 WT1 펩티드」란, 시험관내 및/또는 생체내에서 MHC 클래스 II 항원에 결합하여, 헬퍼 T 세포를 유도하는 펩티드를 의미한다. 「MHC 클래스 II 구속성 WT1 펩티드」의 아미노산 잔기수는 7 내지 30이며, 바람직하게는 14 내지 30이다.
「1개의 시스테인 잔기를 포함하는 7 내지 30 잔기의 아미노산을 포함하는 MHC 클래스 II 구속성 WT1 펩티드」의 예로서는, 예를 들어 표 53에 기재된 펩티드를 들 수 있다. 각 표 중, 「위치」란, 서열 번호: 1에 기재된 인간의 WT1의 아미노산 서열에 있어서의 위치를 나타낸다.
Figure 112015103012119-pct00095
「1개의 시스테인 잔기를 포함하는 7 내지 30 잔기의 아미노산을 포함하는 MHC 클래스 II 구속성 WT1 펩티드」로서, 바람직하게는 이하의 아미노산 서열:
SGQARMFPNAPYLPSCLES (서열 번호: 11) 및
PGCNKRYFKLSHLQMHSRKHTG (서열 번호: 10),
중에서 선택되는 어느 하나의 아미노산 서열을 포함하는 펩티드, 또는 서열 번호: 10 내지 11 중에서 선택되는 어느 하나의 아미노산 서열 중에 아미노산 잔기의 개변을 함유하는 개변 아미노산 서열을 포함하고 또한 헬퍼 T 세포 유도 활성을 갖는 펩티드를 들 수 있다.
「아미노산 서열을 포함하는 펩티드」란, 상기한 바와 같이, 당해 아미노산 서열의 N 말단 아미노산 및/또는 C 말단 아미노산에 새로운 아미노산이 부가된 펩티드를 의미한다. 「1개의 시스테인 잔기를 포함하는 MHC 클래스 II 구속성 WT1 펩티드」에 있어서는, 부가되는 경우, N 말단측 또는/및 C 말단측에 부가되어도 된다.
본 발명에서의 「아미노산 서열 중에 아미노산 잔기의 개변을 함유하는 개변 아미노산 서열을 포함하고 또한 헬퍼 T 세포 유도 활성을 갖는 펩티드」는, 「개변 헬퍼 펩티드」라고도 불린다. 당해 개변 헬퍼 펩티드는, 아미노산 서열에 있어서, 1 내지 3개의 아미노산이 결실, 치환 및/또는 부가된 아미노산 서열을 포함하고, MHC 클래스 II에 결합하여, 헬퍼 T 세포를 유도하는 펩티드를 의미한다. 부가(삽입도 포함됨)되는 아미노산의 수는 바람직하게는 1 내지 3이다. 결실되는 아미노산의 수는 바람직하게는 1 내지 5이다. 개변에 있어서, 부가되는 아미노산 또는 치환되는 아미노산은, 유전자에 의해 코드되는 20종류의 아미노산 이외의 비천연 아미노산이어도 된다.
개변 헬퍼 펩티드로서는 예를 들어, 다음과 같은 펩티드를 들 수 있다.
SGQARMFPNAPYLPSCLES (서열 번호: 11)의 개변 헬퍼 펩티드임
SGQAYMFPNAPYLPSCLES (서열 번호: 12)(특허문헌 6 참조),
SGQARMFPNAPYLPSC (서열 번호: 19) 또는
SGQAYMFPNAPYLPSC (서열 번호: 25); 또는
PGCNKRYFKLSHLQMHSRKHTG (서열 번호: 10)의 개변 헬퍼 펩티드임
PGCNKRYFKLSHLQMHSRK (서열 번호: 20),
PGCNKRYFKLSHLQMHSRKH (서열 번호: 21),
CNKRYFKLSHLQMHSRK (서열 번호: 22),
CNKRYFKLSHLQMHSRKH (서열 번호: 23) 또는
CNKRYFKLSHLQMHSRKHTG (서열 번호: 24).
「1개의 시스테인 잔기를 포함하는 7 내지 30 잔기의 아미노산을 포함하는 MHC 클래스 II 구속성 WT1 펩티드」로서, 보다 바람직하게는, 이하의 아미노산 서열:
SGQARMFPNAPYLPSC (서열 번호: 19),
SGQAYMFPNAPYLPSC (서열 번호: 25),
SGQARMFPNAPYLPSCLES (서열 번호: 11),
SGQAYMFPNAPYLPSCLES (서열 번호: 12),
PGCNKRYFKLSHLQMHSRK (서열 번호: 20),
PGCNKRYFKLSHLQMHSRKH (서열 번호: 21),
PGCNKRYFKLSHLQMHSRKHTG (서열 번호: 10),
CNKRYFKLSHLQMHSRK (서열 번호: 22),
CNKRYFKLSHLQMHSRKH (서열 번호: 23) 및
CNKRYFKLSHLQMHSRKHTG (서열 번호: 24)
중에서 선택되는 어느 하나의 아미노산 서열을 포함하는 펩티드를 들 수 있다.
R1이 「1개의 시스테인 잔기를 포함하는 7 내지 30 잔기의 아미노산을 포함하는 MHC 클래스 II 구속성 WT1 펩티드」인 경우의 식 (1)의 화합물로서, 바람직하게는 식 (6):
[화학식 43]
Figure 112015103012119-pct00096
(식 중, C와 C 사이의 결합은 디술피드 결합을 나타냄)
으로 표현되는 화합물, 식 (7):
[화학식 44]
Figure 112015103012119-pct00097
(식 중, C와 C 사이의 결합은 디술피드 결합을 나타냄)
로 표현되는 화합물, 식 (8):
[화학식 45]
Figure 112015103012119-pct00098
(식 중, C와 C 사이의 결합은 디술피드 결합을 나타냄)
로 표현되는 화합물 또는 식 (9):
[화학식 46]
Figure 112015103012119-pct00099
(식 중, C와 C 사이의 결합은 디술피드 결합을 나타냄)
로 표현되는 화합물을 들 수 있다.
본 발명은 또한, 본 발명의 화합물과 1개 이상의 MHC 클래스 II 구속성 WT1 펩티드를 포함하는 조성물을 제공한다.
본 발명의 조성물에 포함되는 본 발명의 화합물로서는,
식 (3):
[화학식 47]
Figure 112015103012119-pct00100
(식 중, C와 C 사이의 결합은 디술피드 결합을 나타냄)
으로 표현되는 화합물, 식 (4):
[화학식 48]
Figure 112015103012119-pct00101
(식 중, C와 C 사이의 결합은 디술피드 결합을 나타냄)
로 표현되는 화합물 및 식 (5):
[화학식 49]
Figure 112015103012119-pct00102
(식 중, C와 C 사이의 결합은 디술피드 결합을 나타냄)
로 표현되는 화합물을 들 수 있다.
본 발명의 조성물에 포함되는 MHC 클래스 II 구속성 WT1 펩티드로서는, 이하의 아미노산 서열:
CNKRYFKLSHLQMHSRK (서열 번호: 22),
CNKRYFKLSHLQMHSRKH (서열 번호: 23),
CNKRYFKLSHLQMHSRKHTG (서열 번호: 24),
WAPVLDFAPPGASAYGSL (서열 번호: 244),
CWAPVLDFAPPGASAYGSL (서열 번호: 242) 및
WAPVLDFAPPGASAYGSLC (서열 번호: 243)
을 들 수 있다.
본 발명은 또한, 2개의 상이한 MHC 클래스 I 구속성 WT1 펩티드 및 MHC 클래스 II 구속성 WT1 펩티드, 또는 2개의 상이한 MHC 클래스 I 구속성 WT1 에피토프 및 MHC 클래스 II 구속성 WT1 에피토프를 각각 디술피드 결합을 통해서 결합시킨 화합물의 합성 방법을 제공한다. 본 발명의 방법은 이하의 공정 (1) 내지 (3)을 포함한다.
본 발명의 공정 (1)에서는, Fmoc-C(Mmt)A-SBn 및 암 항원 펩티드 C를 사용하여, C(Mmt)A의 C 말단 아미노산의 카르보닐기와 암 항원 펩티드 C의 N 말단 아미노기가 결합한 펩티드를 합성한다.
「암 항원 펩티드 C」는, 상기한 「암 항원 펩티드 C」의 정의와 동의이다. 「Fmoc」는 9-플루오레닐메톡시카르보닐기를 나타낸다. 「Mmt」는, 모노메톡시트리틸기를 나타낸다. 「SBn」은, 티오벤질기를 나타낸다.
본 발명의 공정 (2)에서는, 상기 공정 (1)에서 얻어진 펩티드 및 Npys기로 보호된 1개의 시스테인 잔기가 N 말단에 결합하고 있는 암 항원 펩티드 A를 사용하여, 상기 공정 (1)에서 얻어진 펩티드 중의 암 항원 펩티드 C의 시스테인 잔기의 티오에테르기와 암 항원 펩티드 A의 N 말단에 결합하고 있는 시스테인 잔기의 티오에테르기가 결합한 펩티드를 합성한다.
「암 항원 펩티드 A」는, 상기한 「암 항원 펩티드 A」의 정의와 동의이다. 「Npys」는 3-니트로-2-피리딜티오기를 나타낸다.
본 발명의 공정 (3)에서는, 상기 공정 (2)에서 얻어진 펩티드 및 SPy기로 보호된 시스테인 잔기를 포함하는 암 항원 펩티드 D를 사용하여, 상기 공정 (2)에서 얻어진 펩티드 중의 암 항원 펩티드 A의 N 말단에 결합하고 있는 시스테인 잔기의 티오에테르기와 암 항원 펩티드 D의 시스테인 잔기의 티오에테르기가 결합한 펩티드를 합성한다.
「암 항원 펩티드 D」는, 상기한 「암 항원 펩티드 D」의 정의와 동의이다. 「SPy」는, 2-피리딜 술피드기를 나타낸다.
본 발명의 화합물 및 펩티드 및 그것들의 중간체에 해당하는 펩티드는, 본 명세서의 실시예에 기재된 방법, 또는 통상의 펩티드 합성에서 사용되는 방법에 준해서 제조할 수 있다. 제조 방법으로서는, 문헌(펩타이드·신서시스(Peptide Synthesis), Interscience, New York, 1966; 더 프로틴즈(The Proteins), Vol 2, Academic Press Inc., New York, 1976; 펩티드 합성, 마루젠(주), 1975; 펩티드 합성의 기초와 실험, 마루젠(주), 1985; 의약품의 개발 속 제14권·펩티드 합성, 히로카와 서점, 1991) 등에 기재되어 있는 방법을 들 수 있다.
예를 들어, Fmoc법 또는 Boc법을 사용해서 고상 합성기로 제조하는 방법이나, Boc-아미노산 또는 Z-아미노산을 액상 합성법으로 순차 축합시켜서 제조하는 방법을 들 수 있다(Fmoc는 9-플루오레닐메톡시카르보닐기, Boc는 t-부톡시카르보닐기, Z는 벤질옥시카르보닐기를 각각 나타냄).
본 발명의 화합물을 제조하기 위한 중간체에 있어서, 아미노기, 카르복시기, 머캅토기 등의 관능기는, 필요에 따라 보호, 탈보호의 기술을 사용하여 적당한 보호기로 보호하고, 또한 탈보호할 수 있다. 적합한 보호기, 보호하는 방법 및 탈보호하는 방법으로서는, 「Protective Groups in Organic Synthesis 2nd Edition(John Wiley & Sons, Inc.; 1990)」등에 상세하게 기재되어 있다. 예를 들어, 머캅토기의 보호기로서는 아세트아미드메틸기 또는 트리틸기 등을 들 수 있다.
본 발명의 화합물이 디술피드 결합을 갖는 경우, 통상의 펩티드 화학에 사용되는 방법에 준하여, 시스테인 잔기를 포함하는 상이한 2개의 펩티드간에서, 또는 시스테인 잔기를 포함하는 펩티드와 시스테인간에서, 당해 디술피드 결합을 형성할 수 있다. 디술피드 결합의 형성 방법은, 문헌(펩타이드·신서시스(Peptide Synthesis), Interscience, New York, 1966; 더 프로틴즈(The Proteins), Vol 2, Academic Press Inc., New York, 1976; 펩티드 합성, 마루젠(주), 1975; 펩티드 합성의 기초와 실험, 마루젠(주), 1985; 의약품의 개발 속 제14권·펩티드 합성, 히로카와 서점, 1991) 등에 기재되어 있는 방법을 들 수 있다.
구체적으로는, 펩티드에 포함되는 시스테인 잔기가 1개의 경우, 시스테인 측쇄상의 머캅토기의 보호기를 포함하는 모든 보호기를 제거한 후, 불활성 용매 중에서 산화시킴으로써, 디술피드 결합을 갖는 화합물(디술피드 화합물)을 제조할 수 있다. 또한, 머캅토기를 갖는 2개의 중간체를 적당한 용매 중에 혼합해서 산화함으로써 제조할 수 있다. 당해 산화의 방법으로서는, 통상의 펩티드 합성으로 디술피드 결합을 형성시키는 공지된 방법을 적절히 선택하면 된다. 예를 들어, 요오드 산화, 알칼리 조건 하에서 공기 산화 반응에 적용하는 방법, 또는 알칼리성 또는 산성 조건 하 산화제를 첨가해서 디술피드 결합을 형성하는 방법 등을 들 수 있다. 여기서, 산화제로서는, 요오드, 디메틸술폭시드(DMSO), 페리시안화칼륨 등을 들 수 있다. 용매로서는 물, 아세트산, 메탄올, 클로로포름, DMF 또는 DMSO 등, 또는 이들의 혼합액을 사용할 수 있다. 산화 반응에 의해 종종, 대칭, 비대칭성 디술피드 화합물의 혼합물을 부여한다. 원하는 비대칭성 디술피드 화합물은 다양한 크로마토그래피 또는 재결정 등으로 정제함으로써 얻을 수 있다. 또는 활성화된 머캅토기를 가지는 중간체와 머캅토기를 가지는 중간체를 혼합함으로써 선택적인 디술피드 결합을 형성할 수 있다. 활성화된 머캅토기를 가지는 중간체로서는, Npys기(3-니트로-2-피리딘술페닐기)가 결합한 머캅토기 등을 들 수 있다. 또는, 미리 한쪽의 중간체와, 예를 들어 2,2'-디티오비스(5-니트로피리딘)을 혼합함으로써 머캅토기를 활성화한 후, 다른 쪽의 중간체를 가함으로써 선택적인 디술피드 결합을 형성할 수 있다(Tetrahedron Letters. Vol.37. No.9, pp.1347-1350).
펩티드에 포함되는 시스테인 잔기가 2개 이상인 경우도, 상기와 마찬가지의 방법을 사용할 수 있다. 이 경우에는 디술피드 결합 양식이 상이한 이성체가 얻어진다. 시스테인 측쇄의 보호기를 특정한 조합으로 함으로써, 원하는 시스테인 잔기간에서 디술피드 결합을 형성한 이량체를 얻을 수 있다. 상기 보호기의 조합으로서는, MeBzl(메틸벤질)기와 Acm(아세트아미드메틸)기, Trt(트리틸)기와 Acm기, Npys(3-니트로-2-피리딜티오)기와 Acm기, S-Bu-t(S-tert-부틸)기와 Acm기 등을 들 수 있다. 예를 들어 MeBzl기와 Acm기의 조합인 경우, 먼저 MeBzl기와 시스테인 측쇄 이외의 기타 보호기를 제거한 후, 펩티드 단량체를 포함하는 용액을 공기 산화 반응에 적용하여 탈보호된 시스테인 잔기간에 디술피드 결합을 형성하고, 계속해서 요오드에 의한 탈보호 및 산화를 행해서 Acm기로 보호되고 있던 시스테인 잔기간에 디술피드 결합을 형성하는 방법 등을 들 수 있다.
얻어진 본 발명의 화합물, 펩티드 및 중간체는, 당업자에게 공지된 방법이나 통상의 펩티드 화학에 사용되는 방법에 준해서 정제할 수 있다. 예를 들어, 다양한 크로마토그래피(예를 들어, 실리카 겔 칼럼 크로마토그래피, 이온 교환 칼럼 크로마토그래피, 겔 여과, 또는 역상 크로마토그래피) 또는 재결정 등으로 정제할 수 있다. 예를 들어, 재결정 용매로서는, 메탄올, 에탄올 또는 2-프로판올 등의 알코올계 용매, 디에틸에테르 등의 에테르계 용매, 아세트산에틸 등의 에스테르계 용매, 벤젠 또는 톨루엔 등의 방향족 탄화수소계 용매, 아세톤 등의 케톤계 용매, 헥산 등의 탄화수소계 용매, 디메틸포름아미드 또는 아세토니트릴 등의 비프로톤계 용매, 물 또는 이들의 혼합 용매 등을 사용할 수 있다. 그 밖의 정제 방법으로서는, 실험 화학 강좌(일본화학회 편, 마루젠) 1권 등에 기재된 방법 등을 사용할 수 있다.
디술피드 화합물의 정제 방법은, 문헌(펩타이드·신서시스(Peptide Synthesis), Interscience, New York, 1966; 더 프로틴즈(The Proteins), Vol 2, Academic Press Inc., New York, 1976; 펩티드 합성, 마루젠(주), 1975; 펩티드 합성의 기초와 실험, 마루젠(주), 1985; 의약품의 개발 속 제14권·펩티드 합성, 히로카와 서점, 1991) 등에 기재되어 있다. 그 중에서도, HPLC가 바람직하다.
본 발명의 화합물에 있어서, 1개 이상의 비대칭 점이 있는 경우, 통상의 방법에 따라서, 그 비대칭 점을 갖는 원료(아미노산)를 사용함으로써, 제조할 수 있다. 또한, 본 발명의 화합물의 광학 순도를 올리기 위해서, 제조 공정의 적당한 단계에서 광학 분할 등을 행해도 된다. 광학 분할법으로서 예를 들어, 본 발명의 화합물 또는 그 중간체를 불활성 용매 중(예를 들어, 메탄올, 에탄올, 또는 2-프로판올 등의 알코올계 용매, 디에틸에테르 등의 에테르계 용매, 아세트산에틸 등의 에스테르계 용매, 톨루엔 등의 탄화수소계 용매, 또는 아세토니트릴 등의 비프로톤계 용매 및 이들의 혼합 용매), 광학 활성인 산(예를 들어, 만델산, N-벤질옥시알라닌, 또는 락트산 등의 모노카르복실산, 타르타르산, o-디이소프로필리덴타르타르산 또는 말산 등의 디카르복실산, 또는 캄포술폰산 또는 브로모캄포술폰산 등의 술폰산)과 염을 형성시키는 디아스테레오머법에 의해 행할 수 있다. 본 발명의 화합물 또는 중간체가 카르복시기 등의 산성 관능기를 갖는 경우에는, 광학 활성인 아민(예를 들어 α-페네틸아민, 퀴닌, 퀴니딘, 신코니딘, 신코닌, 스트리크닌 등의 유기 아민)과 염을 형성시킴으로써 광학 분할을 행할 수도 있다.
염을 형성시키는 온도로서는, 실온부터 용매의 비점까지의 범위에서 선택된다. 광학 순도를 향상시키기 위해서는, 일단, 용매의 비점 부근까지 온도를 올리는 것이 바람직하다. 석출된 염을 여과 취출할 때, 필요에 따라서 냉각해서 수율을 향상시킬 수 있다. 광학 활성인 산 또는 아민의 사용량은, 기질에 대하여 약 0.5 내지 약 2.0당량의 범위, 바람직하게는 1당량 전후의 범위가 적당하다. 필요에 따라 결정을 불활성 용매 중(예를 들어, 메탄올, 에탄올, 2-프로판올 등의 알코올계 용매, 디에틸에테르 등의 에테르계 용매, 아세트산에틸 등의 에스테르계 용매, 톨루엔 등의 탄화수소계 용매, 아세토니트릴 등의 비프로톤계 용매 및 이들의 혼합 용매)에서 재결정하여, 고순도의 광학 활성인 염을 얻을 수도 있다. 또한, 필요에 따라 광학 분할한 염을 통상의 방법으로 산 또는 염기로 처리해서 프리체로서 얻을 수도 있다.
본 발명에서의 「약학상 허용되는 염」으로서는, 산 부가염 및 염기 부가염을 들 수 있다. 예를 들어, 산 부가염으로서는, 염산염, 브롬화수소산염, 황산염, 요오드화수소산염, 질산염, 인산염 등의 무기산염, 구연산염, 옥살산염, 아세트산염, 포름산염, 프로피온산염, 벤조산염, 트리플루오로아세트산염, 말레산염, 타르타르산염, 메탄술폰산염, 벤젠술폰산염, 파라톨루엔술폰산염 등의 유기산염을 들 수 있고, 염기 부가염으로서는 나트륨염, 칼륨염, 칼슘염, 마그네슘염, 암모늄염 등의 무기 염기염, 트리에틸암모늄염, 트리에탄올암모늄염, 피리디늄염, 디이소프로필암모늄염 등의 유기 염기염 등을 들 수 있고, 나아가 아르기닌, 아스파라긴산, 글루탐산 등의 염기성 또는 산성 아미노산과 같은 아미노산염을 들 수 있다.
본 발명의 화합물 또는 그의 약학상 허용되는 염의 수화물, 에탄올 용매화물 등의 용매화물도 본 발명에 포함된다. 또한, 본 발명은 식 (1)로 표현되는 화합물의 모든 디아스테레오머, 에난티오머 등의 존재할 수 있는 모든 입체 이성체 및 모든 형태의 결정형도 포함하고 있다.
일반적으로 펩티드의 제조에 있어서는, 광학 활성인 α-아미노산을 축합하는 공정, 다양한 보호기를 제거하는 공정 또는 펩티드를 수지로부터 잘라내는 공정 등에서, 아미노산이 결손된 펩티드, 가수분해나 산화 등에 의해 분해한 펩티드, 아미노산이 라세미화한 펩티드 등 다양한 부생성물이 발생한다. 실험실 스케일로는, 다양한 크로마토그래피(예를 들어, 실리카 겔 칼럼 크로마토그래피, 이온 교환 칼럼 크로마토그래피, 겔 여과, 또는 역상 크로마토그래피)를 조합함으로써, 이들 불순물을 제거하여 고순도의 펩티드나 화합물을 얻을 수 있다. 그러나, 의약품으로서 제공하기 위해 공업적인 스케일로 고순도의 펩티드나 화합물을 얻는 것은 용이하지 않다.
본 발명의 화합물은, 그의 물리 화학적 성질에 있어서도, 의약품 원약으로서 대량 제조 가능한 성질을 갖는다. 구체적으로는, 용해성이 높은, 용액 중 안정성이 우수한, 또는 농축되었을 때 겔화하기 어려운 등의 성질을 갖고, 역상 HPLC 등의 칼럼 크로마토그래피에 의한 정제 공정에서, 대량 스케일에 있어서도 용이하게 고순도의 화합물을 원약으로서 제조할 수 있다.
이와 같이 하여 제조된 본 발명의 화합물은, 시스테인 잔기가 디술피드 결합을 형성하고 있음으로써, 용액 중에서의 산화제 등에 대한 안정성이 우수하여, 의약품 원료로서 일정한 품질과 효율적인 CTL 유도 활성을 유지하는 것이다.
본 발명의 화합물은, 암 면역 요법에 있어서의 CTL 유도제의 유효 성분으로서, 암 백신의 유효 성분으로서, 또한 의약 조성물의 유효 성분으로서 유용하다. 즉 본 발명의 화합물은, 본 명세서의 실시예에 나타내는 바와 같이, 우수한 면역원성을 갖고, 우수한 CTL 유도 활성을 효율적으로 나타낼 수 있다. 또한, 본 발명의 화합물에 의해 유도되는 CTL은 놀랍게도, 암 세포가 본래 보유하는 WT1의 천연형 부분 펩티드를 인식할 수 있다.
CTL 유도 활성은, HLA 테트라머법(Int. J. Cancer: 100, 565-570(2002)) 또는 한계 희석법(Nat. Med.: 4, 321-327(1998))에 의해 CTL의 수를 측정함으로써 확인할 수 있다. 또는, 예를 들어 HLA-A24 구속성의 CTL 유도 활성의 경우, 국제 공개 제02/47474호, 및 Int. J. Cancer: 100, 565-570(2002)에 기술된 HLA-A24 모델 마우스를 사용하는 것 등에 의해 조사할 수 있다.
따라서, 본 발명의 화합물은, WT1 유전자가 발현하고 있는 암이나 WT1 유전자의 발현 레벨의 상승을 수반하는 암의 치료약 또는 예방약(재발 방지약)으로서 사용할 수 있다. 당해 암으로서는, 예를 들어 백혈병, 골수 이형성 증후군, 다발성 골수종 또는 악성 임파종 등의 혈액성 암 또는 위암, 대장암, 폐암, 유방암, 배세포암, 간암, 피부암, 방광암, 전립선암, 자궁암, 자궁경부암, 난소암 또는 뇌종양 등의 고형 암을 들 수 있다.
본 발명의 화합물 또는 그의 약학상 허용되는 염은, 각 화합물 또는 각 염에 따라서 적절한 형태로 함으로써, 암의 세포성 면역 요법에 있어서의 CTL 유도제의 유효 성분, 암 백신의 유효 성분 또는/및 의약 조성물의 유효 성분으로 할 수 있다.
본 발명의 화합물의 세포성 면역이 효과적으로 성립하도록, 의약으로서 허용되는 캐리어, 예를 들어 적당한 아쥬반트와 함께 투여할 수 있다. 아쥬반트로서는, 문헌(Clin. Microbiol. Rev., 7: 277-289, 1994)에 기재된 것 등이 응용 가능하고, 구체적으로는, 균체 유래 성분, GM-CSF, 인터류킨-2, 인터류킨-7 또는 인터류킨-12 등의 사이토카인, 식물 유래 성분, 해양 생물 유래 성분, 수산화알루미늄과 같은 광물 겔, 리소레시틴, 플루로닉 폴리올와 같은 계면 활성제, 폴리 음이온, 펩티드 또는 유유탁액(에멀전 제제) 등을 들 수 있다. 균체 유래 성분으로서는, 리피드 A(lipid A), 그의 유도체인 모노포스포릴 리피드 A(monophosphoryl lipid A), 세균(BCG균 등의 미코박테리움(Mycobacterium)속 세균을 들 수 있음)의 사균, 세균 유래의 단백질, 폴리뉴클레오티드, 프로인트 불완전 아쥬반트(Freund's Incomplete Adjuvant), 프로인트 완전 아쥬반트(Freund's Complete Adjuvant), 세포벽 골격 성분(예를 들어 BCG-CWS 등을 들 수 있음), 트레할로스 디미콜레이트(TDM) 등을 들 수 있다.
또한 본 발명의 화합물은, 리포솜 제제, 직경 수㎛의 비즈에 결합시킨 입자상의 제제, 리피드를 결합시킨 제제 등으로 해서 투여할 수도 있다.
또한 본 발명의 화합물(콘쥬게이트체)은, MHC 클래스 II 구속성 WT1 펩티드(즉, 헬퍼 펩티드)와 함께 투여할 수 있다. 함께 투여하는 방법으로서는, 콘쥬게이트체와 헬퍼 펩티드를 개별로 투여하는 것도 가능하지만, 하나의 의약 조성물 중에 콘쥬게이트체와 헬퍼 펩티드를 포함하는 칵테일 제제(칵테일제, 칵테일)가 보다 바람직하다. 본 칵테일 제제는, MHC 클래스 I 구속성 WT1 펩티드(즉, 킬러 펩티드)를 발생시킬 수 있는 콘쥬게이트체 및 MHC 클래스 II 구속성 WT1 펩티드(즉, 헬퍼 펩티드)를 포함하는 것이다. 따라서, 암 면역 요법에 있어서의 암 백신으로서, 헬퍼 펩티드를 함유한 본 칵테일 제제를 투여함으로써, CTL을 포함하는 다른 T 세포의 기능 항진에 중요한 헬퍼 T 세포(helper T cell)의 활성화도 가능하게 되어, 콘쥬게이트체의 기능·약효(세포성 면역능 등)를 향상시킬 수 있다.
MHC 클래스 II 구속성 WT1 펩티드(즉, 헬퍼 펩티드)에 대해서는, 본원 명세서 중에 기재한 바와 같다. 본 칵테일 제제의 헬퍼 펩티드로서는, 이하의 아미노산 서열:
CNKRYFKLSHLQMHSRK (서열 번호: 22),
CNKRYFKLSHLQMHSRKH (서열 번호: 23),
CNKRYFKLSHLQMHSRKHTG (서열 번호: 24),
WAPVLDFAPPGASAYGSL (서열 번호: 244),
CWAPVLDFAPPGASAYGSL (서열 번호: 242) 및
WAPVLDFAPPGASAYGSLC (서열 번호: 243)
를 들 수 있다. 그 중에서도, WAPVLDFAPPGASAYGSL (서열 번호: 244)이 바람직하다.
본 칵테일 제제는, 세포성 면역능 등의 암 백신으로서의 약효가 향상된 것임을, 일례로서 본원 명세서의 실시예나 시험 예로서 나타낸 바와 같이 확인할 수 있었다.
제제 중의 본 발명의 화합물의 투여량은, 치료 목적의 질환, 환자의 연령, 체중 등에 따라 적절히 조정할 수 있지만, 통상 0.0001mg 내지 1000mg, 바람직하게는 0.001mg 내지 1000mg, 보다 바람직하게는 0.1mg 내지 10mg이다.
투여 방법으로서는, 피내 투여, 피하 투여, 근육내 투여, 정맥내 투여, 경피 투여 등을 들 수 있다. CTL을 효율적으로 유도하는 피내 투여나 피하 투여가 바람직하다. 투여 횟수 및 투여 간격은, 치료 또는 예방 목적의 질환, 환자의 개체 차에 따라 적절히 조정할 수 있지만, 통상 복수 회이며, 수일 내지 수월에 1회 투여하는 것이 바람직하다.
이러한 본 발명의 화합물을 유효 성분으로 하는 의약 조성물을 WT1 양성의 환자에게 투여함으로써, 암을 치료 또는 예방하기 위한 방법을 제공할 수 있다.
실시예
이하, 실시예에 의해 본 발명을 구체적으로 설명하는데, 본 발명은 이들에 의해 전혀 한정되는 것은 아니다.
실시예 1
식 (5):
[화학식 50]
Figure 112015103012119-pct00103
(식 중, C와 C 사이의 결합은 디술피드 결합을 나타냄)
로 표현되는 화합물의 합성
공정 1. H-Cys(Npys)-Arg-Met-Phe-Pro-Asn-Ala-Pro-Tyr-Leu-OH의 합성
(C(Npys)RMFPNAPYL의 합성)
Fmoc-Leu-Alko-수지(Alko는 p-알콕시벤질알코올) 282mg(와타나베 화학 제조; 0.71mmol/g, 0.2mmol)을 출발 원료로 해서 Fmoc/tBu법에 의한 고상 합성에 의해 펩티드쇄의 결집을 행하였다. 고상 합성에는 CS Bio사 제조 CS336X형 펩티드 합성기를 사용하고, Fmoc기의 탈보호는 20％ 피페리딘의 DMF 용액으로 5분간 및 20분간 처리함으로써 행하였다. 보호 아미노산의 커플링은 1.05mmol의 보호 아미노산, 1mmol의 HBTU, 2mmol의 DIPEA의 DMF 용액과 1시간 반응시킴으로써 행하였다. 얻어진 수지를 DMF 및 에테르로 세정 후 감압 건조함으로써, Boc-Cys(Npys)-Arg(Pmc)-Met-Phe-Pro-Asn(Trt)-Ala-Pro-Tyr(tBu)-Leu-Alko-수지 630mg을 얻었다. 이 펩티드 수지에 TFA/H2O/TIS=95/2.5/2.5의 혼합액 10ml를 첨가하고, 실온에서 2시간 진탕하였다. 수지를 여과 제거한 후, 반응액을 감압 농축하였다. 반응액을 빙냉하여 디에틸에테르 50ml를 첨가하였다. 발생한 침전물을 여과 취출해서 에테르로 세정한 후 감압 건조함으로써 조 펩티드 217mg을 얻었다. 얻어진 조 펩티드 용액을 20％ 아세트산수 7ml와 아세토니트릴 1ml의 혼합액에 용해하여 역상 HPLC로 정제하였다.
펌프: 시마즈(Shimadzu) 제조; LC-8A 형
칼럼: YMC ODS-A 3cmφ×25cmL, 10㎛
용출액 1: H2O/0.1％ TFA
용출액 2: CH3CN/0.1％ TFA
유속: 20ml/min
검출: UV220nm
2액 농도 15％로 평형화시킨 칼럼에 조 펩티드 용액을 주입하였다. 그 후 2액 농도를 10분간 37％로 상승시키고, 그 후 1분간 0.24％의 비율로 상승시켰다. 목적물을 포함하는 획분을 모아 동결 건조함으로써, H-Cys(Npys)-Arg-Met-Phe-Pro-Asn-Ala-Pro-Tyr-Leu-OH 53mg을 얻었다.
질량 분석: LC-ESI/MS m/z =1366.1 [M+1]+(이론 값=1366.6)
공정 2. (H-Cys-Tyr-Thr-Trp-Asn-Gln-Met-Asn-Leu-OH)(H-Cys-Arg-Met-Phe-Pro-Asn-Ala-Pro-Tyr-Leu-OH) 디술피드 결합의 합성
〔즉, 식 (5):
[화학식 51]
Figure 112015103012119-pct00104
(식 중, C와 C 사이의 결합은 디술피드 결합을 나타냄)
로 표현되는 화합물의 합성〕
공정 (1)에서 얻은 H-Cys(Npys)-Arg-Met-Phe-Pro-Asn-Ala-Pro-Tyr-Leu-OH 50mg과 공지된 방법(예를 들어 WO07/063903)으로 합성한 H-Cys-Tyr-Thr-Trp-Asn-Gln-Met-Asn-Leu-OH(즉, CYTWNQMNL(서열 번호: 4)) 43mg을 혼합하고, DMSO 1mL를 첨가하여, 실온에서 20분간 교반하였다. 반응액을 0.1％ TFA수 5ml로 희석해서 역상 HPLC로 정제하였다.
펌프: 시마즈 제조; LC-8A형
칼럼: YMC ODS-A 3cmφ×25cmL, 10㎛
용출액 1: H2O/0.1％ TFA
용출액 2: CH3CN/0.1％ TFA
유속: 20ml/min
검출: UV220nm
2액 농도 25％로 평형화시킨 칼럼에 당해 반응액을 주입하였다. 그 후 2액 농도를 1분간 0.25％의 비율로 상승시켰다. 목적물을 포함하는 획분을 모아 동결 건조한 후, 역상 HPLC에 의한 재 정제, 동결 건조를 행함으로써, (H-Cys-Tyr-Thr-Trp-Asn-Gln-Met-Asn-Leu-OH)(H-Cys-Arg-Met-Phe-Pro-Asn-Ala-Pro-Tyr-Leu-OH) 디술피드 결합(즉, 식 (5)로 나타내는 화합물) 21mg을 얻었다.
질량 분석: LC-ESI/MS m/z =1191.8 [M+2]2+(이론 값=1191.9)
실시예 2
이하의 아미노산 서열:
CRMFPNAPYL (서열 번호: 13)
을 포함하는 펩티드의 합성
공정 1. Fmoc-Leu-Alko-수지(Alko는 p-알콕시벤질알코올) 338mg(와타나베 화학 제조; 0.74mmol/g, 0.25mmol)을 출발 원료로 하여, 실시예 1에 기재된 방법과 마찬가지의 고상 합성을 2회 행함으로써 H-Cys(Trt)-Arg(Pmc)-Met-Phe-Pro-Asn(Trt)-Ala-Pro-Tyr(tBu)-Leu-Alko-수지 1.54g을 얻었다. 이 펩티드 수지에 TFA/H2O/TIS=95/2.5/2.5의 혼합액 15ml를 첨가하고, 실온에서 3시간 진탕하였다. 수지를 여과 제거한 후, 반응액을 감압 농축하였다. 반응액을 빙냉하여 디에틸에테르 50ml를 첨가하였다. 발생한 침전물을 여과 취출해서 에테르로 세정한 후 감압 건조함으로써 조 펩티드 637mg을 얻었다.
질량 분석: LC-ESI/MS m/z=1211.9 [M+1]+(이론 값=1212.5)
공정 2. 공정 1에서 얻어진 조 펩티드 321mg을 TFA 10ml에 용해하고, HPLC(시마즈 제조; LC6AD형) 1액=H2O/0.1％ TFA로 평형화하고 있는 YMC-PACK ODS-A 3cmφ×25cmL의 칼럼에 HPLC의 펌프로 충전하였다. 그 상태에서 약 20분간 유지하고, 20분 후, 2액=CH3CN/0.1％ TFA의 농도를 27％까지 상승하였다. 그 후, 목적으로 하는 펩티드의 용출액을 220nm의 UV로 모니터하면서, 2액 농도를 1분간당 0.25％의 비율로 상승시켜서, 목적물을 포함하는 분획을 모았다. 동결 건조 후에 얻어진 펩티드 100mg을 다시 동일 조건에서 역상 정제하고, 아세토니트릴을 감압 증류 제거해서 동결 건조함으로써 목적으로 하는 펩티드(CRMFPNAPYL (서열 번호: 13)) 37.2mg을 얻었다.
펌프: 시마즈 제조; LC-6A형
칼럼: YMC ODS-A 3cmφ×25cmL, 10㎛
용출액 1: H2O/0.1％ TFA
용출액 2: CH3CN/0.1％ TFA
유속: 20ml/min 검출: UV220nm
질량 분석: LC-ESI/MS m/z =1212.0 [M+1]+(이론 값=1211.6)
실시예 3 내지 5
실시예 2와 마찬가지의 방법으로, 서열 번호: 16, 18 또는 17의 아미노산 서열을 포함하는 펩티드를 합성하였다. 표 54에, 합성량 및 질량 분석 결과를 나타냈다.
Figure 112015103012119-pct00105
시험 예 1
ERAP1에 의한 N 말단 아미노산의 트리밍 경시 변화
실시예 2 내지 5에서 합성한 서열 번호: 13, 16, 18 및 17의 각 펩티드에 대해서, ERAP1(PLoS One November 2008, vol.3, Issue 11, e3658)에 의한 N 말단 아미노산의 트리밍을 평가하였다.
30μl의 ERAP1(2.0mg/ml) PBS 버퍼 용액을 258μl의 Tris·HCl 버퍼에 첨가하였다. 10mM의 각 펩티드의 DMSO 용액 12.0μl를 상술한 ERAP1 용액에 가해서, 잘 혼화한 후에 실온에서 정치하였다. 1.0, 2.0, 4.0, 8.0시간 후에 50μl의 샘플을 150μl의 MeOH에 가해서 반응을 정지하고, 25μl를 UFLC(분석 조건은 이하에 나타냄)에 박아 넣어, 목적으로 하는 펩티드의 AUC를 구하였다. 트리밍에 의해 얻어지는 펩티드를 별도로 화학적으로 합성하고, 효소가 없는 마찬가지의 조건에서 분석해서 얻어진 AUC를 기초로 하여, 트리밍에 의해 얻어진 펩티드의 생성률을 구하였다.
분석 조건
펌프: 시마즈사 제조 UFLC
칼럼: 심-팩(Shim-pack) XR-ODS 3.0mm i.d.x75mm
용액: 0.1％ TFA H2O(A)-0.1％ TFA CH3CN(B)
오븐 온도: 40℃
유속: 1.0ml/min
검출 파장: λ=220nm
구배:
1. 0.0min부터 5.0min으로 B액 농도를 1.0％에서 70％까지 상승
2. 0.0min부터 5.0min으로 B액 농도를 1.0％에서 50％까지 상승
목적하는 펩티드:
실시예 2 내지 5에서 합성한 펩티드에 대해서, ERAP1에 의한 N 말단 아미노산의 트리밍에 의해 얻어진 펩티드의 아미노산 서열을 표 55에 나타냈다.
Figure 112015103012119-pct00106
트리밍에 의해 얻어진 펩티드의 생성률의 경시 변화를, 표 56 및 도 1에 나타내었다.
Figure 112015103012119-pct00107
본 트리밍 결과는, 어떤 Cys 연장 펩티드(서열 번호: 13, 16, 17 및 18)에서든, 연장된 N 말단의 Cys를 ERAP-1이 선택적으로 절단, 즉 Cys 연장 펩티드가, 펩티드 서열에 크게 의존하지 않고, ERAP-1에 의한 적절한 트리밍을 받아, 최종적으로 목적하는 암 항원 펩티드(서열 번호: 2, 5, 6 및 7)로 변환되는 것을 강하게 시사한다.
시험 예 2
HLA-A0201 유전자 도입 마우스 및 HLA-A2402 유전자 도입 마우스를 사용한, 생체내에서의 CTL 유도능의 평가
실시예 1에서 합성한 식 (5)로 표현되는 화합물의 CTL 유도능을, HLA-A0201 유전자 도입 마우스 및 HLA-A2402 유전자 도입 마우스를 사용한 생체내 CTL 유도 시험에 의해 평가하였다. 식 (5):
[화학식 52]
Figure 112015103012119-pct00108
(식 중, C와 C 사이의 결합은 디술피드 결합을 나타냄)
로 표현되는 화합물은, 상기한 식 (1)에 비추어 보면, 특히 암 항원 펩티드 A가 RMFPNAPYL(서열 번호: 2)이며 또한 암 항원 펩티드 B가 CYTWNQMNL(서열 번호: 4)인 화합물이다. RMFPNAPYL(서열 번호: 2)은 HLA-A0201 구속성 WT1 펩티드이며, CYTWNQMNL(서열 번호: 4)은 HLA-A24 구속성 에피토프 WT1 펩티드이다.
HLA-A0201 유전자 도입 마우스(C57BL/6CrHLA-A2.1DR1)는, 마우스의 MHC를 결손시켜, 인간의 MHC인 HLA-A0201과 마우스 MHC인 H-2Db의 키메라 HLA 및 HLA-DRB1*0101을 발현하는 마우스이며, 본 마우스를 사용함으로써, HLA-A02 양성의 인간에게서 CTL을 유도할 수 있는 펩티드의 선택이 가능하다(Eur J Immunol. 2004;34:3060-9). 한편, HLA-A2402 유전자 도입 마우스(C57BL/6CrHLA-A2402/Kb)는, 인간의 MHC인 HLA-A2402와 마우스 MHC인 H-2Kb의 키메라 HLA를 발현하는 마우스이며, 본 마우스를 사용함으로써, HLA-A24 양성의 인간에서 CTL을 유도할 수 있는 펩티드의 선택이 가능하다(Int J Cancer. 2002;100:565-70).
식 (5)로 표현되는 화합물의 투여에 의해, 목적하는 펩티드(서열 번호: 2, 4)에 대한 CTL이 유도되는지 여부는, 식 (5)로 표현되는 화합물을 투여한 상기 마우스 유래의 비세포를 펩티드(서열 번호: 2, 4)로 재자극을 행한 경우에 IFNγ를 산생하는지 측정함으로써 판단하였다.
구체적으로는, 식 (5)로 표현되는 화합물을 디메틸술폭시드(DMSO)로 40mg/mL로 용해하고, 또한 주사용수로 5mg/mL로 희석한 뒤, 등량의 불완전 프로인트 아쥬반트(IFA)와 혼합해서 에멀전화시켰다. 에멀전화시킨 화합물을, 마우스의 미근부 피내에 250μg/부위로 4군데 투여하였다. 1주일 후에, 마우스를 CO2 가스에 의해 안락사시킨 뒤 비장을 적출하여, 비세포를 제조하였다. IFNγ 산생의 측정에는, IFNγ ELISPOT 검정 키트를 사용하였다. 비세포 제조 전날에, ELISPOT 플레이트를 항 마우스 IFNγ 항체로 처리하고, 당일에 10％ FBS를 포함하는 RPMI1640 배지에서 블로킹하였다. 제조한 HLA-A0201 유전자 도입 마우스 유래의 비세포를 0.15×106 세포/웰로, HLA-A2402 유전자 도입 마우스 유래의 비세포를 1×106 세포/웰로, 블로킹한 ELISPOT 플레이트에 파종하였다. 펩티드(서열 번호: 2, 4)를 DMSO로 40mg/mL로 용해하고, 또한 10％ FBS를 포함하는 RPMI1640 배지에서 40μg/mL로 희석하였다. 희석한 펩티드(서열 번호: 2)를, 최종 농도 10μg/mL로 HLA-A0201 유전자 도입 마우스 유래의 비세포에 첨가하였다. 또한, 희석한 펩티드(서열 번호: 4)를, 최종 농도 10μg/mL로 HLA-A2402 유전자 도입 마우스 유래의 비세포에 첨가하였다. 펩티드를 첨가한 비세포를, 20시간, 37℃, 5％ CO2 하에서 배양함으로써, 시험관내에서의 펩티드 재자극을 가하였다. 배양 후에 상청을 제거하고, ELISPOT 플레이트를, 첨부의 프로토콜에 따라서 발색시켰다. 발색한 스폿 수는, 이뮤노스폿 애널라이저(ImmunoSpot Analyzer)(C.T.L.사 제조)에 의해 측정하였다.
HLA-A0201 유전자 도입 마우스를 사용한 IFNγ ELISPOT 검정의 결과를 도 2에, HLA-A2402 유전자 도입 마우스를 사용한 IFNγ ELISPOT 검정의 결과를 도 3에 도시하였다.
각 도면에서, 종축은 파종 세포수 중에 반응한 세포수를 나타낸다. 도 2의 흑색 막대 및 백색 막대는 HLA-A0201 유전자 도입 마우스 유래의 비세포를 서열 번호: 2로 표현되는 목적하는 펩티드의 존재 하 및 비존재 하에서 배양한 결과를, 도 3의 흑색 막대 및 백색 막대는 HLA-A2402 유전자 도입 마우스 유래의 비세포를 서열 번호: 4로 표현되는 목적하는 펩티드의 존재 하 및 비존재 하에서 배양한 결과를 나타낸다. 즉, 흑색 막대와 백색 막대의 값의 차가, 식 (5)로 표현되는 화합물의 투여에 의해 마우스 생체 내에서 유도된 목적하는 각 펩티드 특이적 CTL의 수를 나타낸다.
각 도면 중에서 백색 막대의 값은 인정되지 않았다. 이것은 목적하는 펩티드 비존재 하에서는 각각의 유전자 도입 마우스의 비세포는 전혀 반응하지 않은 것을 나타내고 있다. 본 시험의 결과, HLA-A0201 유전자 도입 마우스 유래의 비세포에 있어서는 서열 번호: 2로 표현되는 목적하는 펩티드 특이적인 IFNγ 산생이, HLA-A2402 유전자 도입 마우스 유래의 비세포에 있어서는 서열 번호: 4로 표현되는 목적하는 펩티드 특이적인 IFNγ 산생이 확인되었다.
이로부터, 식 (5)로 표현되는 화합물은 서열 번호: 2로 표현되는 펩티드 특이적인 CTL 및 서열 번호: 4로 표현되는 펩티드 특이적인 CTL을 유도할 수 있는 것이 명확해졌다. 식 (5)로 표현되는 화합물은, 마우스 생체 내에서 디술피드 결합의 절단과 ERAP-1에 의한 적절한 트리밍을 받아, 서열 번호: 2 및 서열 번호: 4의 펩티드에 실제로 생성되는 것이 강하게 시사되었다.
즉, 본 발명의 화합물의 일례인 식 (5)로 표현되는 화합물은, 서로 다른 2종의 WT1 펩티드를 식 (1)에 나타낸 바와 같은 디술피드 결합을 통해서 복합화된 콘쥬게이트체이며, 실제로 생체내에서 서로 다른 2종의 CTL을 유도할 수 있는 WT1 암 항원 펩티드 콘쥬게이트 백신인 것이 명확해졌다.
참고 예 1 내지 7
실시예 2와 마찬가지의 방법으로, 서열 번호: 22, 24, 23, 2, 4, 6 및 5의 각 아미노산 서열을 포함하는 각 펩티드를 합성하였다. 표 57에 질량 분석 결과를 나타냈다. 서열 번호: 22, 24, 23, 2, 4, 6 및 5는 본원 발명의 화합물이 아니므로, 모두 참고 예로서 기재하였다.
Figure 112015103012119-pct00109
실시예 6 내지 9
실시예 1과 마찬가지의 방법으로, 식 (3), (6), (7) 및 (8)로 표현되는 각 화합물(콘쥬게이트체)을 합성하였다. 표 58에 질량 분석 결과를 나타냈다(각 식 중, C와 C 사이의 결합은 디술피드 결합을 나타냄).
Figure 112015103012119-pct00110
시험 예 3
용해도 측정
공정 1. 등장 완충액의 제조
1.75％ 인산수소이나트륨 수용액과 5.53％ 시트르산 수용액을 혼합하여, pH6.0 및 7.4의 각 완충액을 제조하였다.
공정 2. 시험 용액의 제조
피검물을 1mg 정도 칭량하고, 등장 완충액을 0.5mL 첨가해서 이것을 시험 용액으로 하였다. 제조한 시험 용액은 실온에서 90분간 진탕(진탕 조건: 타이테크(TAITEC)사 제조 레시프로 쉐이커(RECIPRO SHAKER) SR-1N, 속도=8)한 후, 원심 분리(15000rpm, 5분간, 실온)를 행하여, 원심 분리 후의 상청을 시험 용액으로 하였다.
공정 3. 표준액의 제조
피검물 약 1mg을 정칭하고, 0.1％ TFA수/아세토니트릴=1/1로 용해하여, 전량을 10mL로 해서 이것을 피검물의 표준액으로서 사용하였다.
공정 4. 피검물의 농도 측정
피검물의 표준액 및 시험 용액을 HPLC(분석 조건은 표 59에 기재)로 분석하여, 표준액의 피크 면적비로부터 피검물의 용해도를 산출하였다.
HPLC 측정 조건
칼럼: 켐코팩 퀵졸브(ChemcoPack Quicksorb)(4.6mmφ×150mm, 5㎛)켐코 가부시끼가이샤 제조
이동상: A액; 0.1％ TFA수, B액; 0.1％ TFA 아세토니트릴 용액
칼럼 온도: 실온
유속: 1mL/min
검출 파장: UV 254nm, 230nm(2파장 검출)
샘플 주입량: 10μL
Figure 112015103012119-pct00111
참고 예 1 내지 2 및 4 내지 7에서 합성한 펩티드, 및 실시예 1, 7 및 9에서 합성한 화합물(콘쥬게이트체)에 대해서, 상기의 용해도 측정을 행하여, 각 용해도를 표 60에 나타냈다.
Figure 112015103012119-pct00112
시험 예 4
HLA-A0201 유전자 도입 마우스를 사용한, 생체내에서의 CTL 유도능의 평가
실시예 6에서 합성한 식 (3)으로 표현되는 화합물의 CTL 유도능을, HLA-A0201 유전자 도입 마우스를 사용한 생체내 CTL 유도 시험에 의해 평가하였다. 식 (3):
[화학식 53]
Figure 112015103012119-pct00113
(식 중, C와 C 사이의 결합은 디술피드 결합을 나타냄)
으로 표현되는 화합물은, 상기한 식 (1)에 비추어 보면, 특히 암 항원 펩티드 A가 RMFPNAPYL(서열 번호: 2)이며 또한 암 항원 펩티드 B가 SLGEQQYSV(서열 번호: 6)인 화합물이다. RMFPNAPYL(서열 번호: 2) 및 SLGEQQYSV(서열 번호: 6)는 HLA-A0201 구속성 WT1 펩티드이다.
HLA-A0201 유전자 도입 마우스에 대해서는, 시험 예 2에 기재한 바와 같다.
식 (3)으로 표현되는 화합물의 투여에 의해, 목적하는 펩티드(서열 번호: 2, 6)에 대한 CTL이 유도되는지 여부는, 식 (3)으로 표현되는 화합물을 투여한 상기 마우스 유래의 비세포를 펩티드(서열 번호: 2, 6)로 재자극을 행한 경우에 IFNγ을 산생하는지 측정함으로써 판단하였다.
구체적으로는, 식 (3)으로 표현되는 화합물을 주사용수로 10mg/mL에 용해한 뒤, 등량의 불완전 프로인트 아쥬반트(IFA)와 혼합해서 에멀전화시켰다. 에멀전화시킨 화합물을, 마우스의 미근부 피내에 500μg/부위로 2군데 투여하였다. 1주일 후에, 마우스를 CO2 가스에 의해 안락사시킨 뒤 비장을 적출하여, 비세포를 제조하였다. IFNγ 산생의 측정에는, IFNγ ELISPOT 검정 키트를 사용하였다. 비세포 제조 전날에, ELISPOT 플레이트를 항 마우스 IFNγ 항체로 처리하고, 당일에 10％ FBS를 포함하는 RPMI1640 배지에서 블로킹하였다. 제조한 HLA-A0201 유전자 도입 마우스 유래의 비세포를 0.75×106 세포/웰로, 블로킹한 ELISPOT 플레이트에 파종하였다. 펩티드(서열 번호: 2, 6)를 DMSO로 40mg/mL에 용해하고, 또한 10％ FBS를 포함하는 RPMI1640 배지에서 40μg/mL로 희석하였다. 희석한 펩티드(서열 번호: 2, 6)를 최종 농도 10μg/mL로 HLA-A0201 유전자 도입 마우스 유래의 비세포에 첨가하였다. 펩티드를 첨가한 비세포를, 20시간, 37℃, 5％ CO2 하에서 배양함으로써, 시험관내에서의 펩티드 재자극을 가하였다. 배양 후에 상청을 제거하고, ELISPOT 플레이트를, 첨부의 프로토콜에 따라서 발색시켰다. 발색한 스폿 수는, 이뮤노스폿 애널라이저(C.T.L.사 제조)에 의해 측정하였다.
HLA-A0201 유전자 도입 마우스를 사용한 IFNγ ELISPOT 검정의 결과를 도 4에 도시하였다.
도 4에서, 종축은 파종 세포수 중에 반응한 세포수를 나타낸다. 도 4의 흑색 막대, 사선 막대는 HLA-A0201 유전자 도입 마우스 유래의 비세포를 서열 번호: 2, 6으로 표현되는 각 펩티드를 펄스하면서 배양한 결과를 나타내고, 백색 막대는 비펄스로 배양한 결과를 나타낸다. 즉, 흑색 막대 또는 사선 막대와 백색 막대의 값의 차가 펩티드 특이적 CTL의 수를 나타내고, 식 (3)으로 표현되는 화합물의 투여에 의해 마우스 생체 내에서 서열 번호: 2, 6으로 표현되는 각 펩티드에 특이적인 CTL이 유도된 것을 나타낸다. 도 4에서 백색 막대의 값은 인정되지 않았다. 이것은 목적하는 펩티드를 펄스하지 않은 경우에는 HLA-A0201 유전자 도입 마우스의 비세포는 전혀 반응하지 않은 것을 나타내고 있다. 본 시험의 결과, HLA-A0201 유전자 도입 마우스 유래의 비세포에 있어서 서열 번호: 2, 6으로 표현되는 펩티드에 특이적인 IFNγ의 산생이 확인되었다.
이로부터, 식 (3)으로 표현되는 화합물은 서열 번호: 2, 6으로 표현되는 각 펩티드 특이적인 CTL을 유도할 수 있는 것이 명확해졌다. 식 (3)으로 표현되는 화합물은, 마우스 생체 내에서 디술피드 결합의 절단과 ERAP-1에 의한 적절한 트리밍을 받아, 서열 번호: 2 및 6으로 표현되는 펩티드에 실제로 생성되는 것이 강하게 시사되었다. 즉, 본 발명의 화합물의 일례인 식 (3)으로 표현되는 화합물은, 상이한 2종의 펩티드를 식 (1)에 나타낸 바와 같은 디술피드 결합을 통해서 복합화된 콘쥬게이트체이며, 실제로 생체내에서 상이한 2종의 CTL을 유도할 수 있는 WT1 암 항원 펩티드 콘쥬게이트 백신인 것이 명확해졌다.
시험 예 5
HLA-A0201 유전자 도입 마우스를 사용한, 생체내에서의 CTL 유도능의 평가
실시예 7에서 합성한 식 (6)으로 표현되는 화합물의 CTL 유도능을, HLA-A0201 유전자 도입 마우스를 사용한 생체내 CTL 유도 시험에 의해 평가하였다. 식 (6):
[화학식 54]
Figure 112015103012119-pct00114
(식 중, C와 C 사이의 결합은 디술피드 결합을 나타냄)
으로 표현되는 화합물은, 상기한 식 (1)에 비추어 보면, 특히 암 항원 펩티드 A가 RMFPNAPYL(서열 번호: 2)이며 또한 암 항원 펩티드 C가 CNKRYFKLSHLQMHSRKHTG(서열 번호: 24)인 화합물이다. RMFPNAPYL(서열 번호: 2)은 HLA-A0201 구속성 WT1 펩티드이며, CNKRYFKLSHLQMHSRKHTG(서열 번호: 24)는 MHC 클래스 II 구속성 WT1 펩티드(즉, 헬퍼 펩티드)이다.
HLA-A0201 유전자 도입 마우스에 대해서는, 시험 예 2에 기재한 바와 같다. 본 마우스를 사용함으로써 HLA-A02 양성의 인간에서 CTL을 유도할 수 있는 펩티드의 선택이 가능한 것 외에, 인간의 HLA-DRB1*0101에 결합해서 헬퍼 T 세포를 유도할 수 있는 헬퍼 펩티드의 CTL 유도 증강 효과를 평가하는 것도 가능하다.
식 (6)으로 표현되는 화합물의 투여에 의해, 목적하는 펩티드(서열 번호: 2)에 대한 CTL 및 헬퍼 펩티드(서열 번호: 24) 반응성의 세포가 유도되는지 여부는, 식 (6)으로 표현되는 화합물을 투여한 상기 마우스 유래의 비세포를 펩티드(서열 번호: 2, 24)로 재자극을 행한 경우에 IFNγ를 산생하는지 측정함으로써 판단하였다. 또한, 식 (6)으로 표현되는 화합물을 투여한 상기 마우스 유래의 비세포와, 서열 번호: 2로 표현되는 화합물을 투여한 상기 마우스 유래의 비세포를, 펩티드(서열 번호: 2)로 재자극을 행한 경우의 IFNγ 산생 세포수를 비교하였다.
구체적으로는, 서열 번호: 2로 표현되는 펩티드를 주사용수로 6mg/mL에 용해한 뒤, 등량의 불완전 프로인트 아쥬반트(IFA)와 혼합해서 에멀전화시켰다. 에멀전화시킨 펩티드를, 마우스의 미근부 피내에 150μg/부위로 2군데 투여하였다. 식 (6)으로 표현되는 화합물을 주사용수로 19.8mg/mL에 용해한 뒤, 등량의 불완전 프로인트 아쥬반트(IFA)와 혼합해서 에멀전화시켰다. 에멀전화시킨 화합물을, 마우스의 미근부 피내에 495μg/부위로 2군데 투여하였다. 식 (6)으로 표현되는 화합물의 마우스 1마리당 투여량에 포함되는 서열 번호: 2의 펩티드의 물질량은, 서열 번호: 2로 표현되는 펩티드의 마우스 1마리당의 투여량에 포함되는 물질량과 동등해지도록 조정하였다. 1주일 후에, 마우스를 CO2 가스에 의해 안락사시킨 뒤 비장을 적출하여, 비세포를 제조하였다. IFNγ 산생의 측정에는, IFNγ ELISPOT 검정 키트를 사용하였다. 비세포 제조 전날에, ELISPOT 플레이트를 항 마우스 IFNγ 항체로 처리하고, 당일에 10％ FBS를 포함하는 RPMI1640 배지에서 블로킹하였다. 제조한 HLA-A0201 유전자 도입 마우스 유래의 비세포를 0.25×106 세포/웰 또는 0.5×106 세포/웰로, 블로킹한 ELISPOT 플레이트에 파종하였다. 펩티드(서열 번호: 2, 24)를 DMSO로 40mg/mL에 용해하고, 또한 10％ FBS를 포함하는 RPMI1640 배지에서 40μg/mL로 희석하였다. 희석한 펩티드(서열 번호: 2, 24)를 최종 농도 10μg/mL로 HLA-A0201 유전자 도입 마우스 유래의 비세포에 첨가하였다. 펩티드를 첨가한 비세포를, 20시간, 37℃, 5％ CO2 하에서 배양함으로써, 시험관내에서의 펩티드 재자극을 가하였다. 배양 후에 상청을 제거하고, ELISPOT 플레이트를 첨부의 프로토콜에 따라서 발색시켰다. 발색한 스폿 수는, 이뮤노스폿 애널라이저(C.T.L.사 제조)에 의해 측정하였다.
HLA-A0201 유전자 도입 마우스를 사용한 IFNγ ELISPOT 검정의 결과를 도 5 및 6에 나타냈다.
도 5 및 6에서, 종축은 파종 세포수 중에 반응한 세포수를, 횡축은 마우스에 투여한 화합물 또는 펩티드를 나타낸다. 도 5의 흑색 막대는 HLA-A0201 유전자 도입 마우스 유래의 비세포를 서열 번호: 2로 표현되는 펩티드를 펄스하면서 배양한 결과를 나타내고, 백색 막대는 비펄스로 배양한 결과를 나타낸다. 즉, 흑색 막대와 백색 막대의 값의 차가 펩티드 특이적 CTL의 수를 나타내고, 서열 번호: 2로 표현되는 펩티드 또는 식 (6)으로 표현되는 화합물의 투여에 의해 마우스 생체 내에서 서열 번호: 2로 표현되는 펩티드에 특이적인 CTL이 유도된 것을 나타낸다. 도 5에서 백색 막대의 값은 인정되지 않았다. 이것은 목적하는 펩티드를 펄스하지 않은 경우에는 HLA-A0201 유전자 도입 마우스의 비세포는 전혀 반응하지 않은 것을 나타내고 있다. 본 시험의 결과, HLA-A0201 유전자 도입 마우스 유래의 비세포에 있어서 서열 번호: 2로 표현되는 펩티드에 특이적인 IFNγ의 산생이 확인되었다. 또한, 도 5에서 식 (6)으로 표현되는 화합물의 투여에 의해 유도된 서열 번호: 2로 표현되는 펩티드에 특이적인 IFNγ 산생 세포의 수는, 서열 번호: 2로 표현되는 펩티드의 투여에 의해 유도된 펩티드 특이적인 IFNγ 산생 세포의 수보다 많았다.
또한, 도 6의 흑색 막대는 HLA-A0201 유전자 도입 마우스 유래의 비세포를 서열 번호: 24로 표현되는 펩티드를 펄스하면서 배양한 결과를 나타내고, 백색 막대는 비펄스로 배양한 결과를 나타낸다. 즉, 흑색 막대와 백색 막대의 값의 차가 펩티드 반응성 세포의 수를 나타내고, 식 (6)으로 표현되는 화합물의 투여에 의해 마우스 생체 내에서 서열 번호: 24로 표현되는 헬퍼 펩티드 반응성의 세포가 유도되고, 서열 번호: 2로 표현되는 화합물의 투여에 의해 마우스 생체 내에서 서열 번호: 24로 표현되는 펩티드 반응성의 세포가 유도되지 않은 것을 나타낸다. 도 6에서 백색 막대의 값은 인정되지 않았다. 이것은 목적하는 펩티드를 펄스하지 않은 경우에는 HLA-A0201 유전자 도입 마우스의 비세포는 전혀 반응하지 않은 것을 나타내고 있다.
이로부터, 식 (6)으로 표현되는 화합물은 서열 번호: 2로 표현되는 펩티드에 특이적인 CTL과, 서열 번호: 24로 표현되는 헬퍼 펩티드에 반응성의 세포를 유도할 수 있는 것이 명확해졌다. 식 (6)으로 표현되는 화합물은, 마우스 생체 내에서 디술피드 결합의 절단과 ERAP-1에 의한 적절한 트리밍을 받아, 서열 번호: 2 및 24로 표현되는 펩티드에 실제로 생성되는 것이 강하게 시사되었다. 식 (6)으로 표현되는 화합물로부터 생성된 서열 번호: 24로 표현되는 헬퍼 펩티드에 반응성의 세포가 유도됨으로써, 서열 번호: 2로 표현되는 펩티드에 특이적인 CTL의 유도가 증강되어, 서열 번호: 2로 표현되는 펩티드를 투여한 경우와 비교해서 많은 서열 번호: 2로 표현되는 펩티드에 특이적인 IFNγ 산생 세포가 인정된 것이라 추정되었다.
즉, 본 발명의 화합물의 일례인 식 (6)으로 표현되는 화합물은, 상이한 2종의 펩티드를 식 (1)에 나타낸 바와 같은 디술피드 결합을 통해서 복합화된 콘쥬게이트체이며, 실제로 생체내에서 CTL 및 헬퍼 펩티드 반응성 세포를 유도할 수 있는 WT1 암 항원 펩티드 콘쥬게이트 백신인 것이 명확해졌다.
시험 예 6
HLA-A0201 유전자 도입 마우스를 사용한, 생체내에서의 CTL 유도능의 평가
실시예 9에서 합성한 식 (8)로 표현되는 화합물의 CTL 유도능을, HLA-A0201 유전자 도입 마우스를 사용한 생체내 CTL 유도 시험에 의해 평가하였다. 식 (8):
[화학식 55]
Figure 112015103012119-pct00115
(식 중, C와 C 사이의 결합은 디술피드 결합을 나타냄)
로 표현되는 화합물은, 상기한 식 (1)에 비추어 보면, 특히 암 항원 펩티드 A가 RMFPNAPYL(서열 번호: 2)이며 또한 암 항원 펩티드 C가 CNKRYFKLSHLQMHSRK(서열 번호: 22)인 화합물이다. RMFPNAPYL(서열 번호: 2)은 HLA-A0201 구속성 WT1 펩티드이며, CNKRYFKLSHLQMHSRK(서열 번호: 22)는 MHC 클래스 II 구속성 WT1 펩티드(즉, 헬퍼 펩티드)이다.
HLA-A0201 유전자 도입 마우스에 대해서는, 시험 예 2, 5에 기재한 바와 같다.
식 (8)로 표현되는 화합물의 투여에 의해, 목적하는 펩티드(서열 번호: 2)에 대한 CTL 및 헬퍼 펩티드(서열 번호: 22) 반응성의 세포가 유도되는지 여부는, 식 (8)로 표현되는 화합물을 투여한 상기 마우스 유래의 비세포를 펩티드(서열 번호: 2, 22)로 재자극을 행한 경우에 IFNγ을 산생하는지 측정함으로써 판단하였다. 또한, 식 (8)로 표현되는 화합물을 투여한 상기 마우스 유래의 비세포와, 서열 번호: 2로 표현되는 화합물을 투여한 상기 마우스 유래의 비세포를, 펩티드(서열 번호: 2)로 재자극을 행한 경우의 IFNγ 산생 세포수를 비교하였다.
구체적으로는, 서열 번호: 2로 표현되는 펩티드를 주사용수로 6mg/mL에 용해한 뒤, 등량의 불완전 프로인트 아쥬반트(IFA)와 혼합해서 에멀전화시켰다. 에멀전화시킨 펩티드를, 마우스의 미근부 피내에 150μg/부위로 2군데 투여하였다. 식 (8)로 표현되는 화합물을 주사용수로 18mg/mL에 용해한 뒤, 등량의 불완전 프로인트 아쥬반트(IFA)와 혼합해서 에멀전화시켰다. 에멀전화시킨 화합물을, 마우스의 미근부 피내에 450μg/부위로 2군데 투여하였다. 식 (8)로 표현되는 화합물의 마우스 1마리당 투여량에 포함되는 서열 번호: 2의 펩티드 물질량은, 서열 번호: 2로 표현되는 펩티드의 마우스 1마리당 투여량에 포함되는 물질량과 동등해지도록 조정하였다. 1주일 후에, 마우스를 CO2 가스에 의해 안락사시킨 뒤 비장을 적출하여, 비세포를 제조하였다. IFNγ 산생의 측정에는, IFNγ ELISPOT 검정 키트를 사용하였다. 비세포 제조 전날에, ELISPOT 플레이트를 항 마우스 IFNγ 항체로 처리하고, 당일에 10％ FBS를 포함하는 RPMI1640 배지에서 블로킹하였다. 제조한 HLA-A0201 유전자 도입 마우스 유래의 비세포를 0.25×106 세포/웰 또는 0.5×106 세포/웰로, 블로킹한 ELISPOT 플레이트에 파종하였다. 펩티드(서열 번호: 2, 22)를 DMSO로 40mg/mL에 용해하고, 또한 10％ FBS를 포함하는 RPMI1640 배지에서 40μg/mL로 희석하였다. 희석한 펩티드(서열 번호: 2, 22)를 최종 농도 10μg/mL로 HLA-A0201 유전자 도입 마우스 유래의 비세포에 첨가하였다. 펩티드를 첨가한 비세포를, 20시간, 37℃, 5％ CO2 하에서 배양함으로써, 시험관내에서의 펩티드 재자극을 가하였다. 배양 후에 상청을 제거하고, ELISPOT 플레이트를, 첨부의 프로토콜에 따라서 발색시켰다. 발색한 스폿 수는, 이뮤노스폿 애널라이저(C.T.L.사 제조)에 의해 측정하였다.
HLA-A0201 유전자 도입 마우스를 사용한 IFNγ ELISPOT 검정의 결과를 도 7 및 8에 나타냈다.
도 7 및 8에서, 종축은 파종 세포수 중에 반응한 세포수를, 횡축은 마우스에 투여한 화합물 또는 펩티드를 나타낸다. 도 7의 흑색 막대는 HLA-A0201 유전자 도입 마우스 유래의 비세포를 서열 번호: 2로 표현되는 펩티드를 펄스하면서 배양한 결과를 나타내고, 백색 막대는 비펄스로 배양한 결과를 나타낸다. 즉, 흑색 막대와 백색 막대의 값의 차가 펩티드 특이적 CTL의 수를 나타내고, 서열 번호: 2로 표현되는 펩티드 또는 식 (8)로 표현되는 화합물의 투여에 의해 마우스 생체 내에서 서열 번호: 2로 표현되는 펩티드에 특이적인 CTL이 유도된 것을 나타낸다. 도 7에서 백색 막대의 값은 인정되지 않았다. 이것은 목적하는 펩티드를 펄스하지 않은 경우에는 HLA-A0201 유전자 도입 마우스의 비세포는 전혀 반응하지 않은 것을 나타내고 있다. 본 시험의 결과, HLA-A0201 유전자 도입 마우스 유래의 비세포에 있어서 서열 번호: 2로 표현되는 펩티드에 특이적인 IFNγ의 산생이 확인되었다. 또한, 도 7에서 식 (8)로 표현되는 화합물의 투여에 의해 유도된 서열 번호: 2로 표현되는 펩티드에 특이적인 IFNγ 산생 세포의 수는, 서열 번호: 2로 표현되는 펩티드의 투여에 의해 유도된 펩티드 특이적인 IFNγ 산생 세포의 수보다 많았다.
또한, 도 8의 흑색 막대는 HLA-A0201 유전자 도입 마우스 유래의 비세포를 서열 번호: 22로 표현되는 펩티드를 펄스하면서 배양한 결과를 나타내고, 백색 막대는 비펄스로 배양한 결과를 나타낸다. 즉, 흑색 막대와 백색 막대의 값의 차가 펩티드 반응성 세포의 수를 나타내고, 식 (8)로 표현되는 화합물의 투여에 의해 마우스 생체 내에서 서열 번호: 22로 표현되는 헬퍼 펩티드 반응성의 세포가 유도되고, 서열 번호: 2로 표현되는 펩티드의 투여에 의해 마우스 생체 내에서 서열 번호: 22로 표현되는 펩티드 반응성의 세포가 유도되지 않은 것을 나타낸다. 도 8에서 백색 막대의 값은 인정되지 않았다. 이것은 목적하는 펩티드를 펄스하지 않은 경우에는 HLA-A0201 유전자 도입 마우스의 비세포는 전혀 반응하지 않은 것을 나타내고 있다.
이로부터, 식 (8)로 표현되는 화합물은, 서열 번호: 2로 표현되는 펩티드에 특이적인 CTL과, 서열 번호: 22로 표현되는 헬퍼 펩티드에 반응성의 세포를 유도할 수 있는 것이 명확해졌다. 식 (8)로 표현되는 화합물은, 마우스 생체 내에서 디술피드 결합의 절단과 ERAP-1에 의한 적절한 트리밍을 받아, 서열 번호: 2 및 22로 표현되는 펩티드에 실제로 생성되는 것이 강하게 시사되었다. 식 (8)로 표현되는 화합물로부터 생성된 서열 번호: 22로 표현되는 헬퍼 펩티드에 반응성의 세포가 유도됨으로써, 서열 번호: 2로 표현되는 펩티드에 특이적인 CTL의 유도가 증강되어, 서열 번호: 2로 표현되는 화합물을 투여한 경우와 비교해서 많은 서열 번호: 2로 표현되는 펩티드에 특이적인 IFNγ 산생 세포가 인정된 것이라 추정되었다.
즉, 본 발명의 화합물의 일례인 식 (8)로 표현되는 화합물은, 상이한 2종의 펩티드를 식 (1)에 나타낸 바와 같은 디술피드 결합을 통해서 복합화된 콘쥬게이트체이며, 실제로 생체내에서 CTL 및 헬퍼 펩티드 반응성 세포를 유도할 수 있는 WT1 암 항원 펩티드 콘쥬게이트 백신인 것이 명확해졌다.
실시예 10
실시예 1과 마찬가지의 방법으로, 식 (9)로 표현되는 각 화합물(콘쥬게이트체)을 합성하였다. 표 61에 질량 분석 결과를 나타냈다(식 중, C와 C 사이의 결합은 디술피드 결합을 나타냄).
Figure 112015103012119-pct00116
참고 예 8 내지 9
실시예 2와 마찬가지의 방법으로, 서열 번호 238 내지 239의 아미노산 서열을 포함하는 펩티드를 합성하였다. 표 62에 질량 분석 결과를 나타냈다. 표에 기재된 펩티드는 본 발명의 화합물이 아니므로 참고 예로서 기재하였다.
Figure 112015103012119-pct00117
참고 예 10 내지 11
실시예 2와 마찬가지의 방법으로, 서열 번호 240 내지 241의 아미노산 서열을 포함하는 펩티드를 합성하였다. 표 63에 질량 분석 결과를 나타냈다. 표에 기재된 펩티드는 본 발명의 화합물이 아니므로 참고 예로서 기재하였다.
Figure 112015103012119-pct00118
표 63에 나타내는 펩티드는 비특허문헌 [Cancer Science January 2012, Vol.103, no.1, 150-153.]를 참고로 합성하였다.
시험 예 7
콘쥬게이트체 및 칵테일화 백신의 안정성 시험
공정 1
콘쥬게이트체(식 번호: (6)) 2.4mg을 120μL 주사용수에 용해하고, 차광 하에 실온에서 보존하였다.
공정 2
칵테일화 백신으로서 서열 번호: 2로 표현되는 펩티드 1.1mg을 180μL의 주사용수에 용해하고, 이것을 123μL 사용해서 서열 번호: 24로 표현되는 펩티드 1.3mg을 용해하고, 차광 하 실온에서 보존하였다.
공정 3
공정 1 및 공정 2에서 얻어진 용액 2.5μL를 주사용수 50μL로 희석한 후, HPLC에 의한 분석(분석 조건은 이하에 나타냄)을 행하여, 보존 개시 직후의 면적 값을 100％로 해서, 콘쥬게이트체 및 펩티드의 수용액 중의 함유율을 측정하고, 콘쥬게이트체의 함유율을 표 64에, 칵테일화 백신 중의 각 펩티드의 함유율을 표 65에 기재하였다.
분석 조건
펌프: 시마즈사 제조 UFLC
칼럼: 키네텍스(Kinetex) 2.6u C18 100A 3.0mm i.d.x75mm
이동상: A액; 0.1％ TFA수, B액; 0.1％ TFA 아세토니트릴 용액
칼럼 온도: 40℃
유속: 1mL/min
검출 파장: UV 220, 254nm(2파장 검출)
샘플 주입량: 10μL
Figure 112015103012119-pct00119
Figure 112015103012119-pct00120
시험 예 7에서 식 번호 (6)으로 표현되는 콘쥬게이트체는 용액 제조 후 2주일 시점에서, 식 (6)으로 표현되는 화합물이 96％ 잔존하고 있었다. 이에 반해, 칵테일화 백신인 서열 번호 2와 서열 번호 24의 혼합 용액에서는 1일 경과 시점에서 서열 번호 24의 함유율이 65％까지 저하되고, 2주일 후에는 6％까지 저하되어 있었다. 이러한 결과로부터, 수용액으로 보존된 콘쥬게이트체는 동일한 조건에서 보존된 칵테일화 백신에 비해 안정한 것으로 나타났다.
시험 예 8
HLA-A0201 유전자 도입 마우스를 사용한, 생체내에서의 CTL 유도능의 평가
실시예 8에서 합성한 식 (7)로 표현되는 화합물의 CTL 유도능을, HLA-A0201 유전자 도입 마우스를 사용한 생체내 CTL 유도 시험에 의해 평가하였다. 식 (7):
[화학식 56]
Figure 112015103012119-pct00121
(식 중, C와 C 사이의 결합은 디술피드 결합을 나타냄)
로 표현되는 화합물은, 상기한 식 (1)에 비추어 보면, 특히 암 항원 펩티드 A가 RMFPNAPYL(서열 번호: 2)이며 또한 암 항원 펩티드 C가 CNKRYFKLSHLQMHSRKH(서열 번호: 23)인 화합물이다. RMFPNAPYL(서열 번호: 2)은 HLA-A0201 구속성 WT1 펩티드이며, CNKRYFKLSHLQMHSRKH(서열 번호: 23)는 MHC 클래스 II 구속성 WT1 펩티드(즉, 헬퍼 펩티드)이다.
HLA-A0201 유전자 도입 마우스에 대해서는, 시험 예 2, 5에 기재한 바와 같다.
식 (7)로 표현되는 화합물의 투여에 의해, 목적하는 펩티드(서열 번호: 2)에 대한 CTL 및 헬퍼 펩티드(서열 번호: 23) 반응성의 세포가 유도되는지 여부는, 식 (7)로 표현되는 화합물을 투여한 상기 마우스 유래의 비세포를 펩티드(서열 번호: 2, 23)로 재자극을 행한 경우에 IFNγ을 산생하는지 측정함으로써 판단하였다. 또한, 식 (7)로 표현되는 화합물을 투여한 상기 마우스 유래의 비세포와, 서열 번호: 2로 표현되는 화합물을 투여한 상기 마우스 유래의 비세포를, 펩티드(서열 번호: 2)로 재자극을 행한 경우의 IFNγ 산생 세포수를 비교하였다.
구체적으로는, 서열 번호: 2로 표현되는 펩티드를 주사용수로 6mg/mL에 용해한 뒤, 등량의 불완전 프로인트 아쥬반트(IFA)와 혼합해서 에멀전화시켰다. 에멀전화시킨 펩티드를, 마우스의 미근부 피내에 150μg/부위로 2군데 투여하였다. 식 (7)로 표현되는 화합물을 주사용수로 19mg/mL에 용해한 뒤, 등량의 불완전 프로인트 아쥬반트(IFA)와 혼합해서 에멀전화시켰다. 에멀전화시킨 화합물을, 마우스의 미근부 피내에 475μg/부위로 2군데 투여하였다. 식 (7)로 표현되는 화합물의 마우스 1마리당 투여량에 포함되는 서열 번호: 2의 펩티드의 물질량은, 서열 번호: 2로 표현되는 펩티드의 마우스 1마리당 투여량에 포함되는 물질량과 동등해지도록 조정하였다. 1주일 후에, 마우스를 CO2 가스에 의해 안락사시킨 뒤 비장을 적출하여, 비세포를 제조하였다. IFNγ 산생의 측정에는, IFNγ ELISPOT 검정 키트를 사용하였다. 비세포 제조 전날에, ELISPOT 플레이트를 항 마우스 IFNγ 항체로 처리하고, 당일에 10％ FBS를 포함하는 RPMI1640 배지에서 블로킹하였다. 제조한 HLA-A0201 유전자 도입 마우스 유래의 비세포를 0.25×106 세포/웰 또는 0.5×106 세포/웰로, 블로킹한 ELISPOT 플레이트에 파종하였다. 펩티드(서열 번호: 2, 23)를 DMSO로 40mg/mL에 용해하고, 또한 10％ FBS를 포함하는 RPMI1640 배지에서 40μg/mL로 희석하였다. 희석한 펩티드(서열 번호: 2, 23)를 최종 농도 10μg/mL로 HLA-A0201 유전자 도입 마우스 유래의 비세포에 첨가하였다. 펩티드를 첨가한 비세포를, 17시간, 37℃, 5％ CO2 하에서 배양함으로써, 시험관내에서의 펩티드 재자극을 가하였다. 배양 후에 상청을 제거하고, ELISPOT 플레이트를, 첨부의 프로토콜에 따라서 발색시켰다. 발색한 스폿 수는, 이뮤노스폿 애널라이저(C.T.L.사 제조)에 의해 측정하였다.
HLA-A0201 유전자 도입 마우스를 사용한 IFNγ ELISPOT 검정의 결과를 도 9 및 10에 나타냈다. 도 9 및 10에서, 종축은 파종 세포수 중에 반응한 세포수를, 횡축은 마우스에 투여한 화합물 또는 펩티드를 나타낸다. 도 9의 흑색 막대는 HLA-A0201 유전자 도입 마우스 유래의 비세포를 서열 번호: 2로 표현되는 펩티드를 펄스하면서 배양한 결과를 나타내고, 백색 막대는 비펄스로 배양한 결과를 나타낸다. 즉, 흑색 막대와 백색 막대의 값의 차가 펩티드 특이적 CTL의 수를 나타내고, 서열 번호: 2로 표현되는 펩티드 또는 식 (7)로 표현되는 화합물의 투여에 의해 마우스 생체 내에서 서열 번호: 2로 표현되는 펩티드에 특이적인 CTL이 유도된 것을 나타낸다. 도 9에서 백색 막대의 값은 인정되지 않았다. 이것은 목적하는 펩티드를 펄스하지 않은 경우에는 HLA-A0201 유전자 도입 마우스의 비세포는 전혀 반응하지 않은 것을 나타내고 있다. 본 시험의 결과, HLA-A0201 유전자 도입 마우스 유래의 비세포에 있어서 서열 번호: 2로 표현되는 펩티드에 특이적인 IFNγ의 산생이 확인되었다. 또한, 도 9에서 식 (7)로 표현되는 화합물의 투여에 의해 유도된 서열 번호: 2로 표현되는 펩티드에 특이적인 IFNγ 산생 세포의 수는, 서열 번호: 2로 표현되는 펩티드의 투여에 의해 유도된 펩티드 특이적인 IFNγ 산생 세포의 수보다 많았다.
또한, 도 10의 흑색 막대는 HLA-A0201 유전자 도입 마우스 유래의 비세포를 서열 번호: 23으로 표현되는 펩티드를 펄스하면서 배양한 결과를 나타내고, 백색 막대는 비펄스로 배양한 결과를 나타낸다. 즉, 흑색 막대와 백색 막대의 값의 차가 펩티드 반응성 세포의 수를 나타내고, 식 (7)로 표현되는 화합물의 투여에 의해 마우스 생체 내에서 서열 번호: 23으로 표현되는 헬퍼 펩티드 반응성의 세포가 유도되고, 서열 번호: 2로 표현되는 펩티드의 투여에 의해 마우스 생체 내에서 서열 번호: 23으로 표현되는 펩티드 반응성의 세포가 유도되지 않은 것을 나타낸다. 도 10에서 백색 막대의 값은 인정되지 않았다. 이것은 목적하는 펩티드를 펄스하지 않은 경우에는 HLA-A0201 유전자 도입 마우스의 비세포는 전혀 반응하지 않은 것을 나타내고 있다.
이로부터, 식 (7)로 표현되는 화합물은 서열 번호: 2로 표현되는 펩티드에 특이적인 CTL과, 서열 번호: 23으로 표현되는 헬퍼 펩티드에 반응성의 세포를 유도할 수 있는 것이 명확해졌다. 식 (7)로 표현되는 화합물은, 마우스 생체 내에서 디술피드 결합의 절단과 ERAP-1에 의한 적절한 트리밍을 받아, 서열 번호: 2 및 23으로 표현되는 펩티드에 실제로 생성되는 것이 강하게 시사되었다. 식 (7)로 표현되는 화합물로부터 생성된 서열 번호: 23으로 표현되는 헬퍼 펩티드에 반응성의 세포가 유도됨으로써, 서열 번호: 2로 표현되는 펩티드에 특이적인 CTL의 유도가 증강되어, 서열 번호: 2로 표현되는 화합물을 투여한 경우와 비교해서 많은 서열 번호: 2로 표현되는 펩티드에 특이적인 IFNγ 산생 세포가 인정된 것이라 추정되었다.
즉, 본 발명의 화합물의 일례인 식 (7)로 표현되는 화합물은, 상이한 2종의 펩티드를 식 (1)에 나타낸 바와 같은 디술피드 결합을 통해서 복합화된 콘쥬게이트체이며, 실제로 생체내에서 CTL 및 헬퍼 펩티드 반응성 세포를 유도할 수 있는 WT1 암 항원 펩티드 콘쥬게이트 백신인 것이 명확해졌다.
시험 예 9
HLA-A0201 유전자 도입 마우스를 사용한, 생체내에서의 CTL 유도능의 평가
실시예 10에서 합성한 식 (9)로 표현되는 화합물의 CTL 유도능을, HLA-A0201 유전자 도입 마우스를 사용한 생체내 CTL 유도 시험에 의해 평가하였다. 식 (9):
[화학식 57]
Figure 112015103012119-pct00122
(식 중, C와 C 사이의 결합은 디술피드 결합을 나타냄)
로 표현되는 화합물은, 상기한 식 (1)에 비추어 보면, 특히 암 항원 펩티드 A가 ALLPAVPSL(서열 번호: 5)이며 또한 암 항원 펩티드 C가 CNKRYFKLSHLQMHSRKHG(서열 번호: 24)인 화합물이다. ALLPAVPSL(서열 번호: 5)은 HLA-A0201 및 HLA-A2402 구속성 WT1 펩티드이며, CNKRYFKLSHLQMHSRKHG(서열 번호: 24)는 MHC 클래스 II 구속성 WT1 펩티드(즉, 헬퍼 펩티드)이다.
HLA-A0201 유전자 도입 마우스에 대해서는, 시험 예 2, 5에 기재한 바와 같다.
식 (9)로 표현되는 화합물의 투여에 의해, 목적하는 펩티드(서열 번호: 5)에 대한 CTL 및 헬퍼 펩티드(서열 번호: 24) 반응성의 세포가 유도되는지 여부는, 식 (9)로 표현되는 화합물을 투여한 상기 마우스 유래의 비세포를 펩티드(서열 번호: 5, 24)로 재자극을 행한 경우에 IFNγ을 산생하는지 측정함으로써 판단하였다. 또한, 식 (9)로 표현되는 화합물을 투여한 상기 마우스 유래의 비세포와, 서열 번호: 5로 표현되는 화합물을 투여한 상기 마우스 유래의 비세포를, 펩티드(서열 번호: 5)로 재자극을 행한 경우의 IFNγ 산생 세포수를 비교하였다.
구체적으로는, 서열 번호: 5로 표현되는 펩티드를 주사용수로 6mg/mL에 용해한 뒤, 등량의 불완전 프로인트 아쥬반트(IFA)와 혼합해서 에멀전화시켰다. 에멀전화시킨 펩티드를, 마우스의 미근부 피내에 150μg/부위로 2군데 투여하였다. 식 (9)로 표현되는 화합물을 주사용수로 23.6mg/mL에 용해한 뒤, 등량의 불완전 프로인트 아쥬반트(IFA)와 혼합해서 에멀전화시켰다. 에멀전화시킨 화합물을, 마우스의 미근부 피내에 590μg/부위로 2군데 투여하였다. 식 (9)로 표현되는 화합물의 마우스 1마리당 투여량에 포함되는 서열 번호: 5의 펩티드 물질량은, 서열 번호: 5로 표현되는 펩티드의 마우스 1마리당 투여량에 포함되는 물질량과 동등해지도록 조정하였다. 1주일 후에, 마우스를 CO2 가스에 의해 안락사시킨 뒤 비장을 적출하여, 비세포를 제조하였다. IFNγ 산생의 측정에는, IFNγ ELISPOT 검정 키트를 사용하였다. 비세포 제조 전날에, ELISPOT 플레이트를 항 마우스 IFNγ 항체로 처리하고, 당일에 10％ FBS를 포함하는 RPMI1640 배지에서 블로킹하였다. 제조한 HLA-A0201 유전자 도입 마우스 유래의 비세포를 0.25×106 세포/웰 또는 0.75×106 세포/웰로, 블로킹한 ELISPOT 플레이트에 파종하였다. 펩티드(서열 번호: 5, 24)를 DMSO로 40mg/mL에 용해하고, 또한 10％ FBS를 포함하는 RPMI1640 배지에서 40μg/mL로 희석하였다. 희석한 펩티드(서열 번호: 5, 24)를 최종 농도 10μg/mL로 HLA-A0201 유전자 도입 마우스 유래의 비세포에 첨가하였다. 펩티드를 첨가한 비세포를, 17시간, 37℃, 5％ CO2 하에서 배양함으로써, 시험관내에서의 펩티드 재자극을 가하였다. 배양 후에 상청을 제거하고, ELISPOT 플레이트를, 첨부의 프로토콜에 따라서 발색시켰다. 발색한 스폿 수는, 이뮤노스폿 애널라이저(C.T.L.사 제조)에 의해 측정하였다.
HLA-A0201 유전자 도입 마우스를 사용한 IFNγ ELISPOT 검정의 결과를 도 11 및 12에 나타냈다. 도 11 및 12에서, 종축은 파종 세포수 중에 반응한 세포수를, 횡축은 마우스에 투여한 화합물 또는 펩티드를 나타낸다. 도 11의 흑색 막대는 HLA-A0201 유전자 도입 마우스 유래의 비세포를 서열 번호: 5로 표현되는 펩티드를 펄스하면서 배양한 결과를 나타내고, 백색 막대는 비펄스로 배양한 결과를 나타낸다. 즉, 흑색 막대와 백색 막대의 값의 차가 펩티드 특이적 CTL의 수를 나타내고, 서열 번호: 5로 표현되는 펩티드 또는 식 (9)로 표현되는 화합물의 투여에 의해 마우스 생체 내에서 서열 번호: 5로 표현되는 펩티드에 특이적인 CTL이 유도된 것을 나타낸다. 도 11에서 백색 막대의 값은 인정되지 않았다. 이것은 목적하는 펩티드를 펄스하지 않은 경우에는 HLA-A0201 유전자 도입 마우스의 비세포는 전혀 반응하지 않은 것을 나타내고 있다. 본 시험의 결과, HLA-A0201 유전자 도입 마우스 유래의 비세포에 있어서 서열 번호: 5로 표현되는 펩티드에 특이적인 IFNγ의 산생이 확인되었다. 또한, 도 11에서 식 (9)로 표현되는 화합물의 투여에 의해 유도된 서열 번호: 5로 표현되는 펩티드에 특이적인 IFNγ 산생 세포의 수는, 서열 번호: 5로 표현되는 펩티드의 투여에 의해 유도된 펩티드 특이적인 IFNγ 산생 세포의 수보다 많았다.
또한, 도 12의 흑색 막대는 HLA-A0201 유전자 도입 마우스 유래의 비세포를 서열 번호: 24로 표현되는 펩티드를 펄스하면서 배양한 결과를 나타내고, 백색 막대는 비펄스로 배양한 결과를 나타낸다. 즉, 흑색 막대와 백색 막대의 값의 차가 펩티드 반응성 세포의 수를 나타내고, 식 (9)로 표현되는 화합물의 투여에 의해 마우스 생체 내에서 서열 번호: 24로 표현되는 헬퍼 펩티드 반응성의 세포가 유도되고, 서열 번호: 5로 표현되는 펩티드의 투여에 의해 마우스 생체 내에서 서열 번호: 24로 표현되는 펩티드 반응성의 세포가 유도되지 않은 것을 나타낸다. 도 12에서 백색 막대의 값은 거의 인정되지 않았다. 이것은 목적하는 펩티드를 펄스하지 않은 경우에는 HLA-A0201 유전자 도입 마우스의 비세포는 반응하지 않은 것을 나타내고 있다.
이로부터, 식 (9)로 표현되는 화합물은 서열 번호: 5로 표현되는 펩티드에 특이적인 CTL과, 서열 번호: 24로 표현되는 헬퍼 펩티드에 반응성의 세포를 유도할 수 있는 것이 명확해졌다. 식 (9)로 표현되는 화합물은, 마우스 생체 내에서 디술피드 결합의 절단과 ERAP-1에 의한 적절한 트리밍을 받아, 서열 번호: 5 및 24로 표현되는 펩티드에 실제로 생성되는 것이 강하게 시사되었다. 식 (9)로 표현되는 화합물로부터 생성된 서열 번호: 24로 표현되는 헬퍼 펩티드에 반응성의 세포가 유도됨으로써, 서열 번호: 5로 표현되는 펩티드에 특이적인 CTL의 유도가 증강되어, 서열 번호: 5로 표현되는 화합물을 투여한 경우와 비교해서 많은 서열 번호: 5로 표현되는 펩티드에 특이적인 IFNγ 산생 세포가 인정된 것이라 추정되었다.
즉, 본 발명의 화합물의 일례인 식 (9)로 표현되는 화합물은, 상이한 2종의 펩티드를 식 (1)에 나타낸 바와 같은 디술피드 결합을 통해서 복합화된 콘쥬게이트체이며, 실제로 생체내에서 CTL 및 헬퍼 펩티드 반응성 세포를 유도할 수 있는 WT1 암 항원 펩티드 콘쥬게이트 백신인 것이 명확해졌다.
비교예 1
HLA-A0201 유전자 도입 마우스 및 HLA-A2402 유전자 도입 마우스를 사용한, 생체내에서의 CTL 유도능의 평가
실시예 1에서 합성한 식 (5)로 표현되는 화합물, 및 참고 예 8 및 9에서 합성한 서열 번호: 238 및 239로 표현되는 펩티드의 CTL 유도능을, HLA-A0201 유전자 도입 마우스 및 HLA-A2402 유전자 도입 마우스를 사용한 생체내 CTL 유도 시험에 의해 평가하였다. 식 (5):
[화학식 58]
Figure 112015103012119-pct00123
(식 중, C와 C 사이의 결합은 디술피드 결합을 나타냄)
로 표현되는 화합물에 대해서는, 시험 예 2에 기재한 바와 같다. 서열 번호: 238 및 239로 표현되는 펩티드는, HLA-A0201 구속성 WT1 펩티드인 RMFPNAPYL(서열 번호: 2) 및 HLA-A2402 구속성 WT1 펩티드인 CYTWNQMNL(서열 번호: 4)을 아미드 결합으로 연결한 장쇄 펩티드이다.
HLA-A0201 유전자 도입 마우스 및 HLA-A2402 유전자 도입 마우스에 대해서는, 시험 예 2에 기재한 바와 같다.
식 (5)로 표현되는 화합물 및 서열 번호: 238, 239로 표현되는 펩티드의 투여에 의해, 목적하는 펩티드(서열 번호: 2, 4)에 대한 CTL이 유도되는지 여부는, 식 (5)로 표현되는 화합물 및 서열 번호: 238, 239로 표현되는 펩티드를 투여한 상기 마우스 유래의 비세포를 펩티드(서열 번호: 2, 4)로 재자극을 행한 경우에 IFNγ을 산생하는지 측정함으로써 판단하였다.
구체적으로는, 식 (5)로 표현되는 화합물 및 서열 번호: 238, 239로 표현되는 펩티드를 각각 디메틸술폭시드(DMSO)로 40mg/mL에 용해하고, 또한 주사용수로 5mg/mL로 희석한 뒤, 등량의 불완전 프로인트 아쥬반트(IFA)와 혼합해서 에멀전화시켰다. 에멀전화시킨 화합물을, 마우스의 미근부 피내에 250μg/부위로 4군데 투여하였다. 1주일 후에, 마우스를 CO2 가스에 의해 안락사시킨 뒤 비장을 적출하여, 비세포를 제조하였다. IFNγ 산생의 측정에는, IFNγ ELISPOT 검정 키트를 사용하였다. 비세포 제조 전날에, ELISPOT 플레이트를 항 마우스 IFNγ 항체로 처리하고, 당일에 10％ FBS를 포함하는 RPMI1640 배지에서 블로킹하였다. 제조한 HLA-A0201 유전자 도입 마우스 유래의 비세포를 0.25×106 세포/웰로, HLA-A2402 유전자 도입 마우스 유래의 비세포를 1×106 세포/웰로, 블로킹한 ELISPOT 플레이트에 파종하였다. 펩티드(서열 번호: 2, 4)를 DMSO로 40mg/mL에 용해하고, 또한 10％ FBS를 포함하는 RPMI1640 배지에서 40μg/mL로 희석하였다. 희석한 펩티드(서열 번호: 2)를 최종 농도 10μg/mL로 HLA-A0201 유전자 도입 마우스 유래의 비세포에 첨가하였다. 또한, 희석한 펩티드(서열 번호: 4)를 최종 농도 10μg/mL로 HLA-A2402 유전자 도입 마우스 유래의 비세포에 첨가하였다. 펩티드를 첨가한 비세포를, 18시간, 37℃, 5％ CO2 하에서 배양함으로써, 시험관내에서의 펩티드 재자극을 가하였다. 배양 후에 상청을 제거하고, ELISPOT 플레이트를, 첨부의 프로토콜에 따라서 발색시켰다. 발색한 스폿 수는, 이뮤노스폿 애널라이저(C.T.L.사 제조)에 의해 측정하였다.
HLA-A0201 유전자 도입 마우스를 사용한 IFNγ ELISPOT 검정의 결과를 도 13에, HLA-A2402 유전자 도입 마우스를 사용한 IFNγ ELISPOT 검정의 결과를 도 14에 도시하였다.
각 도면에서, 종축은 파종 세포수 중에 반응한 세포수를 나타낸다. 도 13의 흑색 막대 및 백색 막대는 HLA-A0201 유전자 도입 마우스 유래의 비세포를 서열 번호: 2로 표현되는 목적하는 펩티드의 존재 하 및 비존재 하에서 배양한 결과를, 도 14의 흑색 막대 및 백색 막대는 HLA-A2402 유전자 도입 마우스 유래의 비세포를 서열 번호: 4로 표현되는 목적하는 펩티드의 존재 하 및 비존재 하에서 배양한 결과를 나타낸다. 즉, 흑색 막대와 백색 막대의 값의 차가, 식 (5)로 표현되는 화합물 및 서열 번호: 238, 239로 표현되는 펩티드의 투여에 의해 마우스 생체 내에서 유도된 목적하는 각 펩티드 특이적 CTL의 수를 나타낸다.
각 도면 중에서 백색 막대의 값은 인정되지 않았다. 이것은 목적하는 펩티드 비존재 하에서는 각각의 유전자 도입 마우스의 비세포는 전혀 반응하지 않은 것을 나타내고 있다. 본 시험의 결과, 식 (5)로 표현되는 화합물을 투여한 HLA-A0201 유전자 도입 마우스 유래의 비세포에 있어서는 서열 번호: 2로 표현되는 목적하는 펩티드 특이적인 IFNγ 산생이, 식 (5)로 표현되는 화합물을 투여한 HLA-A2402 유전자 도입 마우스 유래의 비세포에 있어서는 서열 번호: 4로 표현되는 목적하는 펩티드 특이적인 IFNγ 산생이 각각 확인되었다. 한편, 서열 번호 238로 표현되는 펩티드를 투여한 HLA-A0201 유전자 도입 마우스 유래의 비세포에 있어서는 서열 번호: 2로 표현되는 목적하는 펩티드 특이적인 IFNγ 산생이 확인되었지만, 식 (5)로 표현되는 화합물을 투여한 HLA-A2402 유전자 도입 마우스 유래의 비세포와 비교하면, 그 수는 매우 적었다. 서열 번호 238로 표현되는 펩티드를 투여한 HLA-A2402 유전자 도입 마우스 유래의 비세포에 있어서는, 서열 번호: 4로 표현되는 목적하는 펩티드 특이적인 IFNγ 산생이 확인되었다. 서열 번호 239로 표현되는 펩티드를 투여한 HLA-A0201 유전자 도입 마우스 유래의 비세포에 있어서는, 서열 번호: 2로 표현되는 목적하는 펩티드 특이적인 IFNγ 산생은 인정되었지만, 식 (5)로 표현되는 화합물을 투여한 HLA-A0201 유전자 도입 마우스 유래의 비세포와 비교하면 그 수는 적었다. 서열 번호 239로 표현되는 펩티드를 투여한 HLA-A2402 유전자 도입 마우스 유래의 비세포에 있어서는, 서열 번호: 4로 표현되는 목적하는 펩티드 특이적인 IFNγ 산생이 확인되었다.
이로부터, 본 발명의 식 (5)로 표현되는 화합물은 서열 번호: 2로 표현되는 펩티드 특이적인 CTL 및 서열 번호: 4로 표현되는 펩티드 특이적인 CTL을 양쪽 모두 효율적으로 유도할 수 있는 것이 명확해졌다. 한편, 서열 번호: 238, 239로 표현되는 장쇄 펩티드는, 서열 번호: 2로 표현되는 펩티드 특이적인 CTL 및 서열 번호: 4로 표현되는 펩티드 특이적인 CTL을 양쪽 모두 효율적으로 유도할 수는 없었다.
비교예 2
HLA-A0201 유전자 도입 마우스 및 HLA-A2402 유전자 도입 마우스를 사용한, 생체내에서의 CTL 유도능의 평가
실시예 1에서 합성한 식 (5)로 표현되는 화합물, 및 참고 예 10 및 11에서 합성한 서열 번호: 240 및 241로 표현되는 펩티드의 CTL 유도능을, HLA-A0201 유전자 도입 마우스 및 HLA-A2402 유전자 도입 마우스를 사용한 생체내 CTL 유도 시험에 의해 평가하였다. 식 (5):
[화학식 59]
Figure 112015103012119-pct00124
(식 중, C와 C 사이의 결합은 디술피드 결합을 나타냄)
로 표현되는 화합물에 대해서는, 시험 예 2에 기재한 바와 같다. 서열 번호: 240 및 241로 표현되는 펩티드는, HLA-A0201 구속성 WT1 펩티드인 RMFPNAPYL(서열 번호: 2) 및 HLA-A2402 구속성 WT1 펩티드인 CYTWNQMNL(서열 번호: 4)을 펩티드 스페이서로 해서 6개의 글리신을 통해 아미드 결합으로 연결한 장쇄 펩티드이다.
HLA-A0201 유전자 도입 마우스 및 HLA-A2402 유전자 도입 마우스에 대해서는, 시험 예 2에 기재한 바와 같다.
식 (5)로 표현되는 화합물 및 서열 번호: 240, 241로 표현되는 펩티드의 투여에 의해, 목적하는 펩티드(서열 번호: 2, 4)에 대한 CTL이 유도되는지 여부는, 식 (5)로 표현되는 화합물 및 서열 번호: 240, 241로 표현되는 펩티드를 투여한 상기 마우스 유래의 비세포를 펩티드(서열 번호: 2, 4)로 재자극을 행한 경우에 IFNγ을 산생하는지 측정함으로써 판단하였다.
구체적으로는, 식 (5)로 표현되는 화합물을 디메틸술폭시드(DMSO)로 80mg/mL에 용해하고, 또한 주사용수로 10mg/mL로 희석한 뒤, 등량의 불완전 프로인트 아쥬반트(IFA)와 혼합해서 에멀전화시켰다. 에멀전화시킨 화합물을, 마우스의 미근부 피내에 500μg/부위로 2군데 투여하였다. 또한, 서열 번호: 240, 241로 표현되는 펩티드를 디메틸술폭시드(DMSO)로 80mg/mL에 용해하고, 또한 주사용수로 11mg/mL로 희석한 뒤, 등량의 불완전 프로인트 아쥬반트(IFA)와 혼합해서 에멀전화시켰다. 에멀전화시킨 화합물을, 마우스의 미근부 피내에 550μg/부위로 2군데 투여하였다. 1주일 후에, 마우스를 CO2가스에 의해 안락사시킨 뒤 비장을 적출하여, 비세포를 제조하였다. IFNγ 산생의 측정에는, IFNγ ELISPOT 검정 키트를 사용하였다. 비세포 제조 전날에, ELISPOT 플레이트를 항 마우스 IFNγ 항체로 처리하고, 당일에 10％ FBS를 포함하는 RPMI1640 배지에서 블로킹하였다. 제조한 HLA-A0201 유전자 도입 마우스 유래의 비세포를 0.25×106 세포/웰로, HLA-A2402 유전자 도입 마우스 유래의 비세포를 1.5×106 세포/웰로, 블로킹한 ELISPOT 플레이트에 파종하였다. 펩티드(서열 번호: 2, 4)를 DMSO로 40mg/mL에 용해하고, 또한 10％ FBS를 포함하는 RPMI1640 배지에서 40μg/mL로 희석하였다. 희석한 펩티드(서열 번호: 2)를 최종 농도 10μg/mL로 HLA-A0201 유전자 도입 마우스 유래의 비세포에 첨가하였다. 또한, 희석한 펩티드(서열 번호: 4)를 최종 농도 10μg/mL로 HLA-A2402 유전자 도입 마우스 유래의 비세포에 첨가하였다. 펩티드를 첨가한 비세포를, 17시간, 37℃, 5％ CO2 하에서 배양함으로써, 시험관내에서의 펩티드 재자극을 가하였다. 배양 후에 상청을 제거하고, ELISPOT 플레이트를, 첨부의 프로토콜에 따라서 발색시켰다. 발색한 스폿 수는, 이뮤노스폿 애널라이저(C.T.L.사 제조)에 의해 측정하였다.
HLA-A0201 유전자 도입 마우스를 사용한 IFNγ ELISPOT 검정의 결과를 도 15에, HLA-A2402 유전자 도입 마우스를 사용한 IFNγ ELISPOT 검정의 결과를 도 16에 나타냈다.
각 도면에서, 종축은 파종 세포수 중에 반응한 세포수를 나타낸다. 도 15의 흑색 막대 및 백색 막대는 HLA-A0201 유전자 도입 마우스 유래의 비세포를 서열 번호: 2로 표현되는 목적하는 펩티드의 존재 하 및 비존재 하에서 배양한 결과를, 도 16의 흑색 막대 및 백색 막대는 HLA-A2402 유전자 도입 마우스 유래의 비세포를 서열 번호: 4로 표현되는 목적하는 펩티드의 존재 하 및 비존재 하에서 배양한 결과를 나타낸다. 즉, 흑색 막대와 백색 막대의 값의 차가, 식 (5)로 표현되는 화합물 및 서열 번호: 240, 241로 표현되는 펩티드의 투여에 의해 마우스 생체 내에서 유도된 목적하는 각 펩티드 특이적 CTL의 수를 나타낸다.
각 도면 중에서 백색 막대의 값은 인정되지 않았다. 이것은 목적하는 펩티드 비존재 하에서는 각각의 유전자 도입 마우스의 비세포는 반응하지 않은 것을 나타내고 있다. 본 시험의 결과, 식 (5)로 표현되는 화합물을 투여한 HLA-A0201 유전자 도입 마우스 유래의 비세포에 있어서는 서열 번호: 2로 표현되는 목적하는 펩티드 특이적인 IFNγ 산생이, 식 (5)로 표현되는 화합물을 투여한 HLA-A2402 유전자 도입 마우스 유래의 비세포에 있어서는 서열 번호: 4로 표현되는 목적하는 펩티드 특이적인 IFNγ 산생이 각각 확인되었다. 한편, 서열 번호 240으로 표현되는 펩티드를 투여한 HLA-A0201 유전자 도입 마우스 유래의 비세포에 있어서는 서열 번호: 2로 표현되는 목적하는 펩티드 특이적인 IFNγ 산생은 매우 적었지만, 서열 번호 240로 표현되는 화합물을 투여한 HLA-A2402 유전자 도입 마우스 유래의 비세포에 있어서는 서열 번호: 4로 표현되는 목적하는 펩티드 특이적인 IFNγ 산생이 확인되었다. 또한, 서열 번호 241로 표현되는 펩티드를 투여한 HLA-A0201 유전자 도입 마우스 유래의 비세포에 있어서는 서열 번호: 2로 표현되는 목적하는 펩티드 특이적인 IFNγ 산생은 매우 적고, 서열 번호 241로 표현되는 펩티드를 투여한 HLA-A2402 유전자 도입 마우스 유래의 비세포에 있어서는 서열 번호: 4로 표현되는 목적하는 펩티드 특이적인 IFNγ 산생이 확인되었지만, 식 (5)로 표현되는 화합물을 투여한 HLA-A2402 유전자 도입 마우스 유래의 비세포와 비교하면 그 수는 매우 적었다.
이로부터, 본 발명의 식 (5)로 표현되는 화합물은, 서열 번호: 2로 표현되는 펩티드 특이적인 CTL 및 서열 번호: 4로 표현되는 펩티드 특이적인 CTL을 양쪽 모두 효율적으로 유도할 수 있는 것이 명확해졌다. 한편, 서열 번호: 240, 241로 표현되는 펩티드 스페이서를 포함하는 장쇄 펩티드는, 서열 번호: 2로 표현되는 펩티드 특이적인 CTL 및 서열 번호: 4로 표현되는 펩티드 특이적인 CTL을 양쪽 모두 효율적으로 유도할 수는 없었다.
시험 예 10
참고 예 3에서 합성한 펩티드, 및 실시예 6 및 9에서 합성한 화합물(콘쥬게이트체)에 대해서, 시험 예 3과 마찬가지의 방법으로 용해도 측정을 행하여, 각 용해도를 표 66에 나타냈다.
Figure 112015103012119-pct00125
실시예 11 내지 12
실시예 2와 마찬가지의 방법으로, 서열 번호 242 내지 243의 아미노산 서열을 포함하는 펩티드를 합성하였다. 표 67에 질량 분석 결과를 나타냈다. 표 67에 기재된 펩티드는 본 발명의 화합물이다.
Figure 112015103012119-pct00126
실시예 13
실시예 1과 마찬가지의 방법으로, 식 (10)으로 표현되는 각 화합물(콘쥬게이트체)을 합성하였다. 표 68에 질량 분석 결과를 나타냈다(식 중, C와 C 사이의 결합은 디술피드 결합을 나타냄).
Figure 112015103012119-pct00127
참고 예 12
실시예 1과 마찬가지의 방법으로, 식 (11)로 표현되는 각 화합물(콘쥬게이트체)을 합성하였다. 표 69에 질량 분석 결과를 나타냈다(식 중, C와 C 사이의 결합은 디술피드 결합을 나타냄). 표에 기재된 펩티드는 본 발명의 화합물이 아니므로 참고 예로서 기재하였다.
Figure 112015103012119-pct00128
실시예 14
식 (12)
[화학식 60]
Figure 112015103012119-pct00129
(식 중, C와 C 사이의 결합은 디술피드 결합을 나타냄)
로 표현되는 화합물의 합성
공정 1. Fmoc-Cys(Mmt)-Ala-SBn의 합성(Mmt는 4-메톡시트리틸)
(Fmoc-C(Mmt)A-SBn의 합성)
Fmoc-Cys(Mmt)-OH(4.80g), N,N-디이소프로필에틸아민(2.56mL), 헥사플루오로인산(벤조트리아졸-1-일옥시)트리피롤리디노포스포늄(4.50g) 및 공지된 방법(예를 들어, Journal of Organic Chemistry, Vol.64, No.248761-8769)으로 합성된 H-Ala-SBn의 클로로포름(20mL) 용액을 실온에서 1시간 교반하였다. 반응액을 칼럼 크로마토그래피(용출 용매는 헥산/아세트산에틸)로 정제함으로써 목적 화합물인 Fmoc-C(Mmt)A-SBn(2.80g)을 얻었다.
Figure 112015103012119-pct00130
공정 2. H-Cys(Mmt)-Ala-Cys-Tyr-Thr-Trp-Asn-Gln-Met-Asn-Leu-OH의 합성
(C(Mmt)ACYTWNQMNL의 합성)
공정 1에서 얻은 Fmoc-Cys(Mmt)-Ala-SBn(11mg)과 공지된 방법(예를 들어 WO07/063903)으로 합성한 H-Cys-Tyr-Thr-Trp-Asn-Gln-Met-Asn-Leu-OH(21mg), N,N-디이소프로필에틸아민(200μL), 3,3',3"-포스파네트리일트리프로판산염산염(1mg), 4-머캅토페닐아세트산(1mg) 및 0.1M 인산나트륨 완충액(pH 7.5, 200μL)의 DMF(400μL) 용액을 실온에서 4시간 교반하였다. 반응액에 디에틸아민(200μL)을 첨가해서 또한 15분 교반하였다. 반응액을 역상 HPLC로 정제함으로써, 목적 화합물인 C(Mmt)ACYTWNQMNL(7mg)을 얻었다.
질량 분석: LC-ESI/MS m/z=810.2 [M+2H]2+(이론 값=810.5)
공정 3. (H-Cys(Mmt)-Ala-Cys-Tyr-Thr-Trp-Asn-Gln-Met-Asn-Leu-OH)(H-Cys-Arg-Met-Phe-Pro-Asn-Ala-Pro-Tyr-Leu-OH) 디술피드 결합의 합성
〔즉, 식 (13):
[화학식 61]
Figure 112015103012119-pct00131
(식 중, C와 C 사이의 결합은 디술피드 결합을 나타냄)
으로 표현되는 화합물의 합성〕
공정 2에서 얻은 H-Cys(Mmt)-Ala-Cys-Tyr-Thr-Trp-Asn-Gln-Met-Asn-Leu-OH(51mg)와 실시예 1의 공정 1에서 얻은 (H-Cys(Npys)-Arg-Met-Phe-Pro-Asn-Ala-Pro-Tyr-Leu-OH(43mg)의 DMF(4mL) 용액을 실온에서 2시간 교반하였다. 반응액을 역상 HPLC로 정제함으로써 목적 화합물인 (H-Cys(Mmt)-Ala-Cys-Tyr-Thr-Trp-Asn-Gln-Met-Asn-Leu-OH)(H-Cys-Arg-Met-Phe-Pro-Asn-Ala-Pro-Tyr-Leu-OH) 디술피드 결합〔즉, 식 (13)으로 나타내는 화합물〕을 39mg을 얻었다.
질량 분석: LC-ESI/MS m/z=1414.4 [M+2H]2+(이론 값=1415.2)
공정 4. H-Cys(SPy)-Asn-Lys-Arg-Tyr-Phe-Lys-Leu-Ser-His-Leu-Gln-Met-His-Ser-Arg-Lys-OH의 합성
(C(SPy)NKRYFKLSHLQMHSRK의 합성)
참고 예 1에서 얻은 H-Cys-Asn-Lys-Arg-Tyr-Phe-Lys-Leu-Ser-His-Leu-Gln-Met-His-Ser-Arg-Lys-OH(182mg)와 2,2'-디피리딜비술피드(0.2M 이소프로판올 용액, 544μL)의 20％ w/w 아세트산수(4mL) 용액을 실온에서 17시간 교반하였다. 반응액을 역상 HPLC로 정제함으로써 목적 화합물인 H-Cys(SPy)-Asn-Lys-Arg-Tyr-Phe-Lys-Leu-Ser-His-Leu-Gln-Met-His-Ser-Arg-Lys-OH를 177mg 얻었다.
질량 분석: LC-ESI/MS m/z=1143.5 [M+2H]2+(이론 값=1142.9)
공정 5. 식 (12):
[화학식 62]
Figure 112015103012119-pct00132
(식 중, C와 C 사이의 결합은 디술피드 결합을 나타냄)로 표현되는 화합물의 합성
공정 3에서 얻은 (H-Cys(Mmt)-Ala-Cys-Tyr-Thr-Trp-Asn-Gln-Met-Asn-Leu-OH)(H-Cys-Arg-Met-Phe-Pro-Asn-Ala-Pro-Tyr-Leu-OH) 디술피드 결합〔즉, 식 (13)으로 나타나는 화합물〕(9mg), 공정 4에서 얻은 H-Cys(SPy)-Asn-Lys-Arg-Tyr-Phe-Lys-Leu-Ser-His-Leu-Gln-Met-His-Ser-Arg-Lys-OH(24mg) 및 트리이소프로필실란(10μL)의 트리플루오로아세트산(190μL) 용액을 실온에서 1시간 교반하였다. 반응액을 역상 HPLC로 정제함으로써 목적 화합물인 식 (12)로 표현되는 화합물을 5mg 얻었다.
질량 분석: LC-ESI/MS m/z=1577.2 [M+3H]3+(이론 값=1577.9)
실시예 15 내지 16
실시예 14와 마찬가지의 방법으로, 식 14 내지 15로 표현되는 각 화합물(콘쥬게이트체)을 합성하였다. 표 70에 질량 분석 결과를 나타냈다(식 중, C와 C 사이의 결합은 디술피드 결합을 나타냄).
Figure 112015103012119-pct00133
참고 예 13
실시예 2와 마찬가지의 방법으로, 서열 번호 244의 아미노산 서열을 포함하는 펩티드를 합성하였다. 표 71에 질량 분석 결과를 나타냈다. 표에 기재된 펩티드는 본 발명의 화합물이 아니므로 참고 예로서 기재하였다.
Figure 112015103012119-pct00134
시험 예 11
HLA-A0201 유전자 도입 마우스를 사용한, 생체내에서의 CTL 유도능의 평가
실시예 13에서 합성한 식 (10)으로 표현되는 화합물의 CTL 유도능을, HLA-A0201 유전자 도입 마우스를 사용한 생체내 CTL 유도 시험에 의해 평가하였다. 식 (10):
[화학식 63]
Figure 112015103012119-pct00135
(식 중, C와 C 사이의 결합은 디술피드 결합을 나타냄)
으로 표현되는 화합물은, 상기한 식 (1)에 비추어 보면, 특히 암 항원 펩티드 A가 RMFPNAPYL(서열 번호: 2)이며 또한 암 항원 펩티드 B가 WAPVLDFAPPGASAYGSL(서열 번호: 244)인 화합물이다. RMFPNAPYL(서열 번호: 2)은 HLA-A0201 구속성 WT1 펩티드이며, WAPVLDFAPPGASAYGSL(서열 번호: 244)은 MHC 클래스 II 구속성 WT1 펩티드(즉, 헬퍼 펩티드)이다.
HLA-A0201 유전자 도입 마우스에 대해서는, 시험 예 2, 5에 기재한 바와 같다.
식 (10)으로 표현되는 화합물의 투여에 의해, 목적하는 펩티드(서열 번호: 2)에 대한 CTL이 유도되는지 여부는, 식 (10)으로 표현되는 화합물을 투여한 상기 마우스 유래의 비세포를 펩티드(서열 번호: 2)로 재자극을 행한 경우에 IFNγ을 산생하는지 측정함으로써 판단하였다. 또한, 헬퍼 펩티드(서열 번호: 244)가 생체 내에서 작용하고 있는지 여부는, 식 (10)으로 표현되는 화합물을 투여한 상기 마우스 유래의 비세포와, 서열 번호: 2로 표현되는 펩티드를 투여한 상기 마우스 유래의 비세포를, 펩티드(서열 번호: 2)로 재자극을 행한 경우의 IFNγ 산생 세포수를 비교함으로써 판단하였다.
구체적으로는, 서열 번호: 2로 표현되는 화합물을 디메틸술폭시드(DMSO)로 80mg/mL에 용해하고, 또한 주사용수로 3mg/mL로 희석한 뒤, 등량의 불완전 프로인트 아쥬반트(IFA)와 혼합해서 에멀전화시켰다. 에멀전화시킨 화합물을, 마우스의 미근부 피내에 150μg/부위로 2군데 투여하였다. 또한, 식 (10)으로 표현되는 화합물을 디메틸술폭시드(DMSO)로 80mg/mL에 용해하고, 또한 주사용수로 8.5mg/mL로 희석한 뒤, 등량의 불완전 프로인트 아쥬반트(IFA)와 혼합해서 에멀전화시켰다. 에멀전화시킨 화합물을, 마우스의 미근부 피내에 425μg/부위로 2군데 투여하였다. 식 (10)으로 표현되는 화합물의 마우스 1마리당 투여량에 포함되는 서열 번호: 2의 펩티드의 물질량은, 서열 번호: 2로 표현되는 펩티드의 마우스 1마리당 투여량에 포함되는 물질량과 동등해지도록 조정하였다. 또한, 각 에멀전에 포함되는 DMSO 농도도 일정하게 하였다. 1주일 후에, 마우스를 CO2 가스에 의해 안락사시킨 뒤 비장을 적출하여, 비세포를 제조하였다. IFNγ 산생의 측정에는, IFNγ ELISPOT 검정 키트를 사용하였다. 비세포 제조 전날에, ELISPOT 플레이트를 항 마우스 IFNγ 항체로 처리하고, 당일에 10％ FBS를 포함하는 RPMI1640 배지에서 블로킹하였다. 제조한 HLA-A0201 유전자 도입 마우스 유래의 비세포를 0.125×106 세포/웰로, 블로킹한 ELISPOT 플레이트에 파종하였다. 펩티드(서열 번호: 2)를 DMSO로 40mg/mL에 용해하고, 또한 10％ FBS를 포함하는 RPMI1640 배지에서 40μg/mL로 희석하였다. 희석한 펩티드(서열 번호: 2)를 최종 농도 10μg/mL로 HLA-A0201 유전자 도입 마우스 유래의 비세포에 첨가하였다. 펩티드를 첨가한 비세포를, 19시간, 37℃, 5％ CO2 하에서 배양함으로써, 시험관내에서의 펩티드 재자극을 가하였다. 배양 후에 상청을 제거하고, ELISPOT 플레이트를, 첨부의 프로토콜에 따라서 발색시켰다. 발색한 스폿 수는, 이뮤노스폿 애널라이저(C.T.L.사 제조)에 의해 측정하였다.
HLA-A0201 유전자 도입 마우스를 사용한 IFNγ ELISPOT 검정의 결과를 도 17에 나타냈다. 도 17에서, 종축은 파종 세포수 중에 반응한 세포수를, 횡축은 마우스에 투여한 화합물 또는 펩티드를 나타낸다. 도 17의 흑색 막대는 HLA-A0201 유전자 도입 마우스 유래의 비세포를 서열 번호: 2로 표현되는 펩티드를 펄스하면서 배양한 결과를 나타내고, 백색 막대는 비펄스로 배양한 결과를 나타낸다. 즉, 흑색 막대와 백색 막대의 값의 차가 펩티드 특이적 CTL의 수를 나타내고, 서열 번호: 2로 표현되는 펩티드 또는 식 (10)으로 표현되는 화합물의 투여에 의해 마우스 생체 내에서 서열 번호: 2로 표현되는 펩티드에 특이적인 CTL이 유도된 것을 나타낸다. 도 17에서 백색 막대의 값은 인정되지 않았다. 이것은 목적하는 펩티드를 펄스하지 않은 경우에는 HLA-A0201 유전자 도입 마우스의 비세포는 전혀 반응하지 않은 것을 나타내고 있다. 본 시험의 결과, HLA-A0201 유전자 도입 마우스 유래의 비세포에 있어서 서열 번호: 2로 표현되는 펩티드에 특이적인 IFNγ의 산생이 확인되었다. 또한, 도 17에서 식 (10)으로 표현되는 화합물의 투여에 의해 유도된 서열 번호: 2로 표현되는 펩티드에 특이적인 IFNγ 산생 세포의 수는, 서열 번호: 2로 표현되는 펩티드의 투여에 의해 유도된 펩티드 특이적인 IFNγ 산생 세포의 수보다 많았다.
이로부터, 식 (10)으로 표현되는 화합물은 서열 번호: 2로 표현되는 펩티드에 특이적인 CTL을 유도할 수 있는 것이 명확해졌다. 또한, 식 (10)으로 표현되는 화합물을 투여한 경우에, 서열 번호: 2로 표현되는 펩티드를 투여한 경우와 비교해서 서열 번호: 2로 표현되는 펩티드에 특이적인 IFNγ 산생 세포가 많이 인정된 것은, 식 (10)으로 표현되는 화합물로부터 생성된 서열 번호: 244로 표현되는 헬퍼 펩티드에 반응성의 세포가 유도됨으로써, 서열 번호: 2로 표현되는 펩티드에 특이적인 CTL의 유도가 증강되었기 때문이라고 추정되었다. 따라서, 식 (10)으로 표현되는 화합물은, 마우스 생체 내에서 디술피드 결합의 절단과 ERAP-1에 의한 적절한 트리밍을 받아, 서열 번호: 2 및 244로 표현되는 펩티드에 실제로 생성되는 것이 강하게 시사되었다.
즉, 본 발명의 화합물의 일례인 식 (10)으로 표현되는 화합물은, 상이한 2종의 펩티드를 식 (1)에 나타낸 바와 같은 디술피드 결합을 통해서 복합화된 콘쥬게이트체이며, 실제로 생체내에서 CTL 및 헬퍼 펩티드 반응성 세포를 유도할 수 있는 WT1 암 항원 펩티드 콘쥬게이트 백신인 것이 명확해졌다.
비교예 3
HLA-A0201 유전자 도입 마우스를 사용한, 생체내에서의 CTL 유도능의 평가
참고 예 12에서 합성한 식 (11)로 표현되는 화합물의 CTL 유도능을, HLA-A0201 유전자 도입 마우스를 사용한 생체내 CTL 유도 시험에 의해 평가하였다. 식 (11):
[화학식 64]
Figure 112015103012119-pct00136
(식 중, C와 C 사이의 결합은 디술피드 결합을 나타냄)
로 표현되는 화합물은, 상기한 식 (1)에 비추어 보면, 특히 암 항원 펩티드 A가 RMFPNAPYL(서열 번호: 2)이며 또한 암 항원 펩티드 C가 WAPVLDFAPPGASAYGSLC(서열 번호: 243)인 화합물이다. RMFPNAPYL(서열 번호: 2)은 HLA-A0201 구속성 WT1 펩티드이며, WAPVLDFAPPGASAYGSL(서열 번호: 244)은 MHC 클래스 II 구속성 WT1 펩티드(즉, 헬퍼 펩티드)이다.
HLA-A0201 유전자 도입 마우스에 대해서는, 시험 예 2, 5에 기재한 바와 같다.
식 (11)로 표현되는 화합물의 투여에 의해, 목적하는 펩티드(서열 번호: 2)에 대한 CTL이 유도되는지 여부는, 식 (11)로 표현되는 화합물을 투여한 상기 마우스 유래의 비세포를 펩티드(서열 번호: 2)로 재자극을 행한 경우에 IFNγ을 산생하는지 측정함으로써 판단하였다. 또한, 헬퍼 펩티드(서열 번호: 244)가 생체 내에서 작용하고 있는지 여부는, 식 (11)로 표현되는 화합물을 투여한 상기 마우스 유래의 비세포와, 서열 번호: 2로 표현되는 펩티드를 투여한 상기 마우스 유래의 비세포를, 펩티드(서열 번호: 2)로 재자극을 행한 경우의 IFNγ 산생 세포수를 비교함으로써 판단하였다.
시험 예 11과 마찬가지의 방법으로 CTL 유도 시험을 행하였다.
HLA-A0201 유전자 도입 마우스를 사용한 IFNγ ELISPOT 검정의 결과를 도 18에 나타냈다. 도 18에서, 종축은 파종 세포수 중에 반응한 세포수를, 횡축은 마우스에 투여한 화합물 또는 펩티드를 나타낸다. 도 18의 흑색 막대는 HLA-A0201 유전자 도입 마우스 유래의 비세포를 서열 번호: 2로 표현되는 펩티드를 펄스하면서 배양한 결과를 나타내고, 백색 막대는 비펄스로 배양한 결과를 나타낸다. 즉, 흑색 막대와 백색 막대의 값의 차가 펩티드 특이적 CTL의 수를 나타내고, 서열 번호: 2로 표현되는 펩티드 또는 식 (11)로 표현되는 화합물의 투여에 의해 마우스 생체 내에서 서열 번호: 2로 표현되는 펩티드에 특이적인 CTL이 유도된 것을 나타낸다. 도 18에서 백색 막대의 값은 인정되지 않았다. 이것은 목적하는 펩티드를 펄스하지 않은 경우에는 HLA-A0201 유전자 도입 마우스의 비세포는 전혀 반응하지 않은 것을 나타내고 있다. 본 시험의 결과, HLA-A0201 유전자 도입 마우스 유래의 비세포에 있어서 서열 번호: 2로 표현되는 펩티드에 특이적인 IFNγ의 산생이 확인되었다. 한편, 도 18에서 식 (11)로 표현되는 화합물의 투여에서는, 서열 번호: 2로 표현되는 펩티드의 투여에 의해 유도된 서열 번호: 2로 표현되는 펩티드에 특이적인 IFNγ 산생 세포의 증가는 확인되지 않았다.
시험 예 11과 비교예 3의 결과로부터, MHC 클래스 II 구속성 WT1 펩티드로서 WAPVLDFAPPGASAYGSL(서열 번호: 244)을 사용하는 경우, 상기 식 (1)에서 암 항원 펩티드 B가 WAPVLDFAPPGASAYGSL(서열 번호: 244)인 것이, 암 항원 펩티드 C가 WAPVLDFAPPGASAYGSLC(서열 번호: 243)인 것에 비해, 더 바람직한 발명의 실시 형태인 것이 시사되었다.
시험 예 12
HLA-A0201 유전자 도입 마우스 및 HLA-A2402 유전자 도입 마우스를 사용한, 생체내에서의 CTL 유도능의 평가
실시예 14에서 합성한 식 (12)로 표현되는 화합물의 CTL 유도능을, HLA-A0201 유전자 도입 마우스 및 HLA-A2402 유전자 도입 마우스를 사용한 생체내 CTL 유도 시험에 의해 평가하였다. 식 (12):
[화학식 65]
Figure 112015103012119-pct00137
(식 중, C와 C 사이의 결합은 디술피드 결합을 나타냄)
로 표현되는 화합물에 포함되는 RMFPNAPYL(서열 번호: 2)은 HLA-A0201 구속성 WT1 펩티드, CYTWNQMNL(서열 번호: 4)은 HLA-A2402 구속성 WT1 펩티드이며, CNKRYFKLSHLQMHSRK(서열 번호: 22)는 MHC 클래스 II 구속성 WT1 펩티드(즉, 헬퍼 펩티드)이다.
HLA-A0201 유전자 도입 마우스 및 HLA-A2402 유전자 도입 마우스에 대해서는, 시험 예 2, 5에 기재한 바와 같다.
식 (12)로 표현되는 화합물의 투여에 의해, 목적하는 펩티드(서열 번호: 2, 4)에 대한 CTL이 유도되는지 여부는, 식 (12)로 표현되는 화합물을 투여한 상기 마우스 유래의 비세포를 펩티드(서열 번호: 2, 4)로 재자극을 행한 경우에 IFNγ을 산생하는지 측정함으로써 판단하였다. 또한, 헬퍼 펩티드(서열 번호: 22)가 생체 내에서 작용하고 있는지 여부는, 식 (12)로 표현되는 화합물을 투여한 상기 마우스 유래의 비세포와, 식 (5)로 표현되는 화합물을 투여한 상기 마우스 유래의 비세포를, 펩티드(서열 번호: 2, 4)로 재자극을 행한 경우의 IFNγ 산생 세포수를 비교함으로써 판단하였다.
구체적으로는, 식 (5)로 표현되는 화합물을 디메틸술폭시드(DMSO)로 80mg/mL에 용해하고, 또한 주사용수로 3mg/mL로 희석한 뒤, 등량의 몬타나이드 ISA51VG와 혼합해서 에멀전화시켰다. 에멀전화시킨 화합물을, 마우스의 미근부 피내에 150μg/부위로 2군데 투여하였다. 또한, 식 (12)로 표현되는 화합물을 디메틸술폭시드(DMSO)로 80mg/mL에 용해하고, 또한 주사용수로 6mg/mL에 희석한 뒤, 등량의 몬타나이드 ISA51VG와 혼합해서 에멀전화시켰다. 에멀전화시킨 화합물을, 마우스의 미근부 피내에 300μg/부위로 2군데 투여하였다. 식 (12)로 표현되는 화합물의 마우스 1마리당 투여량에 포함되는 식 (5)의 화합물의 물질량은, 식 (5)로 표현되는 화합물의 마우스 1마리당 투여량에 포함되는 물질량과 동등해지도록 조정하였다. 또한, 각 에멀전에 포함되는 DMSO 농도도 일정하게 하였다. 1주일 후에, 마우스를 CO2 가스에 의해 안락사시킨 뒤 비장을 적출하여, 비세포를 제조하였다. IFNγ 산생의 측정에는, IFNγ ELISPOT 검정 키트를 사용하였다. 비세포 제조 전날에, ELISPOT 플레이트를 항 마우스 IFNγ 항체로 처리하고, 당일에 10％ FBS를 포함하는 RPMI1640 배지에서 블로킹하였다. 제조한 HLA-A0201 유전자 도입 마우스 유래의 비세포 및 HLA-A2402 유전자 도입 마우스 유래의 비세포를 각각 0.25×106 세포/웰로, 블로킹한 ELISPOT 플레이트에 파종하였다. 펩티드(서열 번호: 2, 4)를 DMSO로 40mg/mL에 용해하고, 또한 10％ FBS를 포함하는 RPMI1640 배지에서 40μg/mL로 희석하였다. 희석한 펩티드(서열 번호: 2)를 최종 농도 10μg/mL로 HLA-A0201 유전자 도입 마우스 유래의 비세포에 첨가하였다. 또한, 희석한 펩티드(서열 번호: 4)를 최종 농도 10μg/mL로 HLA-A2402 유전자 도입 마우스 유래의 비세포에 첨가하였다. 펩티드를 첨가한 비세포를, 17시간, 37℃, 5％ CO2 하에서 배양함으로써, 시험관내에서의 펩티드 재자극을 가하였다. 배양 후에 상청을 제거하고, ELISPOT 플레이트를, 첨부의 프로토콜에 따라서 발색시켰다. 발색한 스폿 수는, 이뮤노스폿 애널라이저(C.T.L.사 제조)에 의해 측정하였다.
HLA-A0201 유전자 도입 마우스를 사용한 IFNγ ELISPOT 검정의 결과를 도 19에, HLA-A2402 유전자 도입 마우스를 사용한 IFNγ ELISPOT 검정의 결과를 도 20에 나타냈다.
각 도면에서, 종축은 파종 세포수 중에 반응한 세포수를 나타낸다. 도 19의 흑색 막대 및 백색 막대는 HLA-A0201 유전자 도입 마우스 유래의 비세포를 서열 번호: 2로 표현되는 목적하는 펩티드의 존재 하 및 비존재 하에서 배양한 결과를, 도 20의 흑색 막대 및 백색 막대는 HLA-A2402 유전자 도입 마우스 유래의 비세포를 서열 번호: 4로 표현되는 목적하는 펩티드의 존재 하 및 비존재 하에서 배양한 결과를 나타낸다. 즉, 흑색 막대와 백색 막대의 값의 차가, 식 (5) 및 식 (12)로 표현되는 화합물의 투여에 의해 마우스 생체 내에서 유도된 목적하는 각 펩티드 특이적 CTL의 수를 나타낸다.
각 도면 중에서 백색 막대의 값은 인정되지 않았다. 이것은 목적하는 펩티드 비존재 하에서는 각각의 유전자 도입 마우스의 비세포는 반응하지 않은 것을 나타내고 있다. 본 시험의 결과, 식 (5) 및 식 (12)로 표현되는 화합물을 투여한 HLA-A0201 유전자 도입 마우스 유래의 비세포에 있어서는 서열 번호: 2로 표현되는 목적하는 펩티드 특이적인 IFNγ 산생이, 식 (5) 및 식 (12)로 표현되는 화합물을 투여한 HLA-A2402 유전자 도입 마우스 유래의 비세포에 있어서는 서열 번호: 4로 표현되는 목적하는 펩티드 특이적인 IFNγ 산생이 각각 확인되었다. 또한, 도 19에서 식 (12)로 표현되는 화합물의 투여에 의해 유도된 서열 번호: 2로 표현되는 펩티드에 특이적인 IFNγ 산생 세포의 수는, 식 (5)로 표현되는 화합물의 투여에 의해 유도된 펩티드 특이적인 IFNγ 산생 세포의 수보다 많았다. 한편, 도 20에서 식 (12)로 표현되는 화합물의 투여에 의해 유도된 서열 번호: 4로 표현되는 펩티드에 특이적인 IFNγ 산생 세포의 수는, 식 (5)로 표현되는 화합물의 투여에 의해 유도된 펩티드 특이적인 IFNγ 산생 세포의 수와 비교해서 큰 차는 인정되지 않았다.
이로부터, 식 (12)로 표현되는 화합물은, 서열 번호: 2, 4로 표현되는 펩티드에 특이적인 CTL을 유도할 수 있는 것이 명확해졌다. 또한, 식 (12)로 표현되는 화합물을 투여한 경우에, 식 (5)로 표현되는 화합물을 투여한 경우와 비교해서 서열 번호: 2로 표현되는 펩티드에 특이적인 IFNγ 산생 세포가 많이 인정된 것은, 식 (12)로 표현되는 화합물로부터 생성된 서열 번호: 22로 표현되는 헬퍼 펩티드에 반응성의 세포가 유도됨으로써, 서열 번호: 2로 표현되는 펩티드에 특이적인 CTL의 유도가 증강되었기 때문이라고 추정되었다. 한편, 식 (12)로 표현되는 화합물을 투여한 경우와 식 (5)로 표현되는 화합물을 투여한 경우를 비교해서, 서열 번호: 4로 표현되는 펩티드에 특이적인 IFNγ 산생 세포수에 큰 차가 인정되지 않은 것은, HLA-A2402 유전자 도입 마우스는 인간의 MHC 클래스 II를 발현하지 않으므로 서열 번호: 22로 표현되는 헬퍼 펩티드에 반응성의 세포가 유도되지 않았기 때문이라고 추정되었다. 따라서, 식 (12)로 표현되는 화합물은, 마우스 생체 내에서 디술피드 결합의 절단과 ERAP-1에 의한 적절한 트리밍을 받아, 서열 번호: 2, 4 및 22로 표현되는 펩티드에 실제로 생성되는 것이 강하게 시사되었다.
즉, 본 발명의 화합물의 일례인 식 (12)로 표현되는 화합물은, 상이한 3종의 펩티드를 디술피드 결합을 통해서 복합화된 콘쥬게이트체이며, 실제로 생체내에서 CTL 및 헬퍼 펩티드 반응성 세포를 유도할 수 있는 WT1 암 항원 펩티드 콘쥬게이트 백신인 것이 명확해졌다.
시험 예 13
HLA-A0201 유전자 도입 마우스 및 HLA-A2402 유전자 도입 마우스를 사용한, 생체내에서의 CTL 유도능의 평가
실시예 15에서 합성한 식 (14)로 표현되는 화합물의 CTL 유도능을, HLA-A0201 유전자 도입 마우스 및 HLA-A2402 유전자 도입 마우스를 사용한 생체내 CTL 유도 시험에 의해 평가하였다. 식 (14):
[화학식 66]
Figure 112015103012119-pct00138
(식 중, C와 C 사이의 결합은 디술피드 결합을 나타냄)
로 표현되는 화합물에 포함되는 RMFPNAPYL(서열 번호: 2)은 HLA-A0201 구속성 WT1 펩티드, CYTWNQMNL(서열 번호: 4)은 HLA-A2402 구속성 WT1 펩티드이며, WAPVLDFAPPGASAYGSL(서열 번호: 244)은 MHC 클래스 II 구속성 WT1 펩티드(즉, 헬퍼 펩티드)이다.
HLA-A0201 유전자 도입 마우스 및 HLA-A2402 유전자 도입 마우스에 대해서는, 시험 예 2, 5에 기재한 바와 같다.
식 (14)로 표현되는 화합물의 투여에 의해, 목적하는 펩티드(서열 번호: 2, 4)에 대한 CTL이 유도되는지 여부는, 식 (14)로 표현되는 화합물을 투여한 상기 마우스 유래의 비세포를 펩티드(서열 번호: 2, 4)로 재자극을 행한 경우에 IFNγ을 산생하는지 측정함으로써 판단하였다. 또한, 헬퍼 펩티드(서열 번호: 244)가 생체 내에서 작용하고 있는지 여부는, 식 (14)로 표현되는 화합물을 투여한 상기 마우스 유래의 비세포와, 식 (5)로 표현되는 화합물을 투여한 상기 마우스 유래의 비세포를, 펩티드(서열 번호: 2)로 재자극을 행한 경우의 IFNγ 산생 세포수를 비교함으로써 판단하였다.
시험 예 12와 마찬가지의 방법으로 CTL 유도 시험을 행하였다. 단, 식 (14)로 표현되는 화합물은 디메틸술폭시드(DMSO)로 80mg/mL에 용해하고, 또한 주사용수로 5.6mg/mL로 희석한 뒤, 등량의 몬타나이드 ISA51VG와 혼합해서 에멀전화시켰다. 에멀전화시킨 화합물을, 마우스의 미근부 피내에 280μg/부위로 2군데 투여하였다.
HLA-A0201 유전자 도입 마우스를 사용한 IFNγ ELISPOT 검정의 결과를 도 21에, HLA-A2402 유전자 도입 마우스를 사용한 IFNγ ELISPOT 검정의 결과를 도 22에 나타냈다.
각 도면에서, 종축은 파종 세포수 중에 반응한 세포수를 나타낸다. 도 21의 흑색 막대 및 백색 막대는, HLA-A0201 유전자 도입 마우스 유래의 비세포를 서열 번호: 2로 표현되는 목적하는 펩티드의 존재 하 및 비존재 하에서 배양한 결과를, 도 22의 흑색 막대 및 백색 막대는, HLA-A2402 유전자 도입 마우스 유래의 비세포를 서열 번호: 4로 표현되는 목적하는 펩티드의 존재 하 및 비존재 하에서 배양한 결과를 나타낸다. 즉, 흑색 막대와 백색 막대의 값의 차가, 식 (5) 및 식 (14)로 표현되는 화합물의 투여에 의해 마우스 생체 내에서 유도된 목적하는 각 펩티드 특이적 CTL의 수를 나타낸다.
각 도면 중에서 백색 막대의 값은 인정되지 않았다. 이것은 목적하는 펩티드 비존재 하에서는 각각의 유전자 도입 마우스의 비세포는 반응하지 않은 것을 나타내고 있다. 본 시험의 결과, 식 (5) 및 식 (14)로 표현되는 화합물을 투여한 HLA-A0201 유전자 도입 마우스 유래의 비세포에 있어서는 서열 번호: 2로 표현되는 목적하는 펩티드 특이적인 IFNγ 산생이, 식 (5) 및 식 (14)로 표현되는 화합물을 투여한 HLA-A2402 유전자 도입 마우스 유래의 비세포에 있어서는 서열 번호: 4로 표현되는 목적하는 펩티드 특이적인 IFNγ 산생이 각각 확인되었다. 또한, 도 21, 22에서 식 (14)로 표현되는 화합물의 투여에 의해 유도된 서열 번호: 2, 4로 표현되는 펩티드에 특이적인 IFNγ 산생 세포의 수는, 식 (5)로 표현되는 화합물의 투여에 의해 유도된 펩티드 특이적인 IFNγ 산생 세포의 수보다 많았다.
이로부터, 식 (14)로 표현되는 화합물은 서열 번호: 2, 4로 표현되는 펩티드에 특이적인 CTL을 유도할 수 있는 것이 명확해졌다. 또한, 식 (14)로 표현되는 화합물을 투여한 경우에, 식 (5)로 표현되는 화합물을 투여한 경우와 비교해서 서열 번호: 2로 표현되는 펩티드에 특이적인 IFNγ 산생 세포가 많이 인정된 것은, 식 (14)로 표현되는 화합물로부터 생성된 서열 번호: 244로 표현되는 헬퍼 펩티드에 반응성의 세포가 유도됨으로써, 서열 번호: 2로 표현되는 펩티드에 특이적인 CTL의 유도가 증강되었기 때문이라고 추정되었다. 한편, 식 (14)로 표현되는 화합물을 투여한 경우에, 식 (5)로 표현되는 화합물을 투여한 경우와 비교해서 서열 번호: 4로 표현되는 펩티드에 특이적인 IFNγ 산생 세포가 많이 인정된 것은, HLA-A2402 유전자 도입 마우스에서 발현하는 마우스 MHC 클래스 II에 서열 번호: 244로 표현되는 펩티드가 결합하고, 헬퍼 펩티드에 반응성의 세포가 유도됨으로써, 서열 번호: 4로 표현되는 펩티드에 특이적인 CTL의 유도가 증강되었기 때문이라고 추정되었다. 따라서, 식 (14)로 표현되는 화합물은, 마우스 생체 내에서 디술피드 결합의 절단과 ERAP-1에 의한 적절한 트리밍을 받아, 서열 번호: 2, 4 및 244로 표현되는 펩티드에 실제로 생성되는 것이 강하게 시사되었다.
즉, 본 발명의 화합물의 일례인 식 (14)로 표현되는 화합물은, 상이한 3종의 펩티드를 디술피드 결합을 통해서 복합화된 콘쥬게이트체이며, 실제로 생체내에서 CTL 및 헬퍼 펩티드 반응성 세포를 유도할 수 있는 WT1 암 항원 펩티드 콘쥬게이트 백신인 것이 명확해졌다.
시험 예 14
HLA-A0201 유전자 도입 마우스를 사용한, 생체내에서의 CTL 유도능의 평가
실시예 1에서 합성한 식 (5)로 표현되는 화합물과 참고 예 1에서 합성한 서열 번호: 22로 표현되는 펩티드를 혼합한 칵테일 백신의 CTL 유도능을, HLA-A0201 유전자 도입 마우스를 사용한 생체내 CTL 유도 시험에 의해 평가하였다. 식 (5):
[화학식 67]
Figure 112015103012119-pct00139
(식 중, C와 C 사이의 결합은 디술피드 결합을 나타냄)
로 표현되는 화합물에 포함되는 RMFPNAPYL(서열 번호: 2)은 HLA-A0201 구속성 WT1 펩티드, CYTWNQMNL(서열 번호: 4)은 HLA-A2402 구속성 WT1 펩티드이며, CNKRYFKLSHLQMHSRK(서열 번호: 22)는 MHC 클래스 II 구속성 WT1 펩티드(즉, 헬퍼 펩티드)이다.
HLA-A0201 유전자 도입 마우스에 대해서는, 시험 예 2, 5에 기재한 바와 같다.
식 (5)로 표현되는 화합물의 투여에 의해, 목적하는 펩티드(서열 번호: 2)에 대한 CTL이 유도되는지 여부는, 식 (5)로 표현되는 화합물을 투여한 상기 마우스 유래의 비세포를 펩티드(서열 번호: 2)로 재자극을 행한 경우에 IFNγ을 산생하는지 측정함으로써 판단하였다. 또한, 식 (5)과 혼합한 헬퍼 펩티드(서열 번호: 22)가 생체 내에서 작용하고 있는지 여부는, 식 (5)로 표현되는 화합물을 단독 투여한 상기 마우스 유래의 비세포와, 식 (5)로 표현되는 화합물과 서열 번호: 22로 표현되는 펩티드의 칵테일 백신을 투여한 상기 마우스 유래의 비세포를, 펩티드(서열 번호: 2)로 재자극을 행한 경우의 IFNγ 산생 세포수를 비교함으로써 판단하였다.
구체적으로는, 식 (5)로 표현되는 화합물을 디메틸술폭시드(DMSO)로 80mg/mL에 용해하고, 또한 주사용수로 3mg/mL로 희석한 뒤, 등량의 몬타나이드 ISA51VG와 혼합해서 에멀전화시켰다. 에멀전화시킨 화합물을, 마우스의 미근부 피내에 150μg/부위로 2군데 투여하였다. 또한, 식 (5)로 표현되는 화합물과 서열 번호: 22로 표현되는 펩티드를 디메틸술폭시드(DMSO)로 80mg/mL에 용해한 후, 주사용수로 희석한 후의 농도가 식 (5)로 표현되는 화합물이 3mg/mL, 서열 번호: 22로 표현되는 펩티드가 2.7mg/mL가 되도록 혼합하였다. 이 희석액을 등량의 몬타나이드 ISA51VG와 혼합해서 에멀전화시켰다. 이 식 (5)로 표현되는 화합물이 150μg/부위, 서열 번호: 22로 표현되는 펩티드가 137μg/부위 포함되는 칵테일 백신을 마우스의 미근부 피내에 2군데 투여하였다. 각 에멀전에 포함되는 DMSO 농도는 일정하게 하였다. 1주일 후에, 마우스를 CO2 가스에 의해 안락사시킨 뒤 비장을 적출하여, 비세포를 제조하였다. IFNγ 산생의 측정에는, IFNγ ELISPOT 검정 키트를 사용하였다. 비세포 제조 전날에, ELISPOT 플레이트를 항 마우스 IFNγ 항체로 처리하고, 당일에 10％ FBS를 포함하는 RPMI1640 배지에서 블로킹하였다. 제조한 HLA-A0201 유전자 도입 마우스 유래의 비세포를 0.25×106 세포/웰로, 블로킹한 ELISPOT 플레이트에 파종하였다. 펩티드(서열 번호: 2)를 DMSO로 40mg/mL에 용해하고, 또한 10％ FBS를 포함하는 RPMI1640 배지에서 40μg/mL로 희석하였다. 희석한 펩티드(서열 번호: 2)를 최종 농도 10μg/mL로 HLA-A0201 유전자 도입 마우스 유래의 비세포에 첨가하였다. 펩티드를 첨가한 비세포를, 17시간, 37℃, 5％ CO2 하에서 배양함으로써, 시험관내에서의 펩티드 재자극을 가하였다. 배양 후에 상청을 제거하고, ELISPOT 플레이트를, 첨부의 프로토콜에 따라서 발색시켰다. 발색한 스폿 수는, 이뮤노스폿 애널라이저(C.T.L.사 제조)에 의해 측정하였다.
HLA-A0201 유전자 도입 마우스를 사용한 IFNγ ELISPOT 검정의 결과를 도 23에 나타냈다.
도 23에서, 종축은 파종 세포수 중에 반응한 세포수를 나타낸다. 도 23의 흑색 막대 및 백색 막대는, HLA-A0201 유전자 도입 마우스 유래의 비세포를 서열 번호: 2로 표현되는 목적하는 펩티드의 존재 하 및 비존재 하에서 배양한 결과를 나타낸다. 즉, 흑색 막대와 백색 막대의 값의 차가, 식 (5)로 표현되는 화합물 및 헬퍼 펩티드(서열 번호: 22)를 포함하는 칵테일 백신의 투여에 의해 마우스 생체 내에서 유도된 목적하는 각 펩티드 특이적 CTL의 수를 나타낸다.
도 23에서 백색 막대의 값은 인정되지 않았다. 이것은 목적하는 펩티드 비존재 하에서는 각각의 유전자 도입 마우스의 비세포는 반응하지 않은 것을 나타내고 있다. 본 시험의 결과, 식 (5)로 표현되는 화합물을 단독 투여 및 헬퍼 펩티드(서열 번호: 22)를 포함하는 칵테일 백신을 투여한 HLA-A0201 유전자 도입 마우스 유래의 비세포에 있어서는 서열 번호: 2로 표현되는 목적하는 펩티드 특이적인 IFNγ 산생이 확인되었다. 또한, 도 23에서 헬퍼 펩티드(서열 번호: 22)를 포함하는 칵테일 백신의 투여에 의해 유도된 서열 번호: 2로 표현되는 펩티드에 특이적인 IFNγ 산생 세포의 수는, 식 (5)로 표현되는 화합물의 단독 투여에 의해 유도된 펩티드 특이적인 IFNγ 산생 세포의 수보다 많았다.
이로부터, 식 (5)로 표현되는 화합물과 서열 번호: 22로 표현되는 펩티드를 혼합한 칵테일 백신은 서열 번호: 2로 표현되는 펩티드에 특이적인 CTL을 유도할 수 있는 것이 명확해졌다. 또한 식 (5)로 표현되는 화합물을 단독 투여한 경우와 비교해서 칵테일 백신을 투여한 경우에 서열 번호: 2로 표현되는 펩티드에 특이적인 IFNγ 산생 세포가 많이 인정된 것은, 칵테일 백신에 포함되는 서열 번호: 22로 표현되는 헬퍼 펩티드에 반응성의 세포가 유도됨으로써, 서열 번호: 2로 표현되는 펩티드에 특이적인 CTL의 유도가 증강되었기 때문이라고 추정되었다. 따라서, 식 (5)로 표현되는 화합물과 헬퍼 펩티드를 포함하는 칵테일 백신은 식 (5)로 표현되는 화합물의 단독 투여에 비해, 마우스 생체 내에서 강하게 CTL을 유도할 수 있음이 명확해졌다.
시험 예 15
HLA-A0201 유전자 도입 마우스를 사용한, 생체내에서의 CTL 유도능의 평가
실시예 1에서 합성한 식 (5)로 표현되는 화합물과 참고 예 13에서 합성한 서열 번호: 244로 표현되는 펩티드를 혼합한 칵테일 백신의 CTL 유도능을, HLA-A0201 유전자 도입 마우스를 사용한 생체내 CTL 유도 시험에 의해 평가하였다. 식 (5):
[화학식 68]
Figure 112015103012119-pct00140
(식 중, C와 C 사이의 결합은 디술피드 결합을 나타냄)
로 표현되는 화합물에 포함되는 RMFPNAPYL(서열 번호: 2)은 HLA-A0201 구속성 WT1 펩티드, CYTWNQMNL(서열 번호: 4)은 HLA-A2402 구속성 WT1 펩티드이며, WAPVLDFAPPGASAYGSL(서열 번호: 244)은 MHC 클래스 II 구속성 WT1 펩티드(즉, 헬퍼 펩티드)이다.
HLA-A0201 유전자 도입 마우스에 대해서는, 시험 예 2, 5에 기재한 바와 같다.
식 (5)로 표현되는 화합물의 투여에 의해, 목적하는 펩티드(서열 번호: 2)에 대한 CTL이 유도되는지 여부는, 식 (5)로 표현되는 화합물을 투여한 상기 마우스 유래의 비세포를 펩티드(서열 번호: 2)로 재자극을 행한 경우에 IFNγ을 산생하는지 측정함으로써 판단하였다. 또한, 식 (5)와 혼합한 헬퍼 펩티드(서열 번호: 244)가 생체 내에서 작용하고 있는지 여부는, 식 (5)로 표현되는 화합물을 단독 투여한 상기 마우스 유래의 비세포와, 식 (5)로 표현되는 화합물과 서열 번호: 244로 표현되는 펩티드의 칵테일 백신을 투여한 상기 마우스 유래의 비세포를, 펩티드(서열 번호: 2)로 재자극을 행한 경우의 IFNγ 산생 세포수를 비교함으로써 판단하였다.
시험 예 14와 마찬가지의 방법으로 CTL 유도 시험을 행하였다. 단, 칵테일 백신은 식 (5)로 표현되는 화합물과 서열 번호: 244로 표현되는 펩티드를 디메틸술폭시드(DMSO)로 80mg/mL에 용해한 후, 주사용수로 희석한 후의 농도가 식 (5)로 표현되는 화합물이 3mg/mL, 서열 번호: 244로 표현되는 펩티드가 2.3mg/mL가 되도록 혼합하였다. 이 희석액을 등량의 몬타나이드 ISA51VG와 혼합해서 에멀전화시켰다. 이 식 (5)로 표현되는 화합물이 150μg/부위, 서열 번호: 244로 표현되는 펩티드가 115μg/부위 포함되는 칵테일 백신을 마우스의 미근부 피내에 2군데 투여하였다.
HLA-A0201 유전자 도입 마우스를 사용한 IFNγ ELISPOT 검정의 결과를 도 24에 나타냈다.
도 24에서, 종축은 파종 세포수 중에 반응한 세포수를 나타낸다. 도 24의 흑색 막대 및 백색 막대는, HLA-A0201 유전자 도입 마우스 유래의 비세포를 서열 번호: 2로 표현되는 목적하는 펩티드의 존재 하 및 비존재 하에서 배양한 결과를 나타낸다. 즉, 흑색 막대와 백색 막대의 값의 차가, 식 (5)로 표현되는 화합물 및 헬퍼 펩티드(서열 번호: 244)를 포함하는 칵테일 백신의 투여에 의해 마우스 생체 내에서 유도된 목적하는 각 펩티드 특이적 CTL의 수를 나타낸다.
도 24에서 백색 막대의 값은 인정되지 않았다. 이것은 목적하는 펩티드 비존재 하에서는 각각의 유전자 도입 마우스의 비세포는 반응하지 않은 것을 나타내고 있다. 본 시험의 결과, 식 (5)로 표현되는 화합물을 단독 투여 및 헬퍼 펩티드(서열 번호: 244)를 포함하는 칵테일 백신을 투여한 HLA-A0201 유전자 도입 마우스 유래의 비세포에 있어서는 서열 번호: 2로 표현되는 목적하는 펩티드 특이적인 IFNγ 산생이 확인되었다. 또한, 도 24에서 헬퍼 펩티드(서열 번호: 244)를 포함하는 칵테일 백신의 투여에 의해 유도된 서열 번호: 2로 표현되는 펩티드에 특이적인 IFNγ 산생 세포의 수는, 식 (5)로 표현되는 화합물의 단독 투여에 의해 유도된 펩티드 특이적인 IFNγ 산생 세포의 수보다 많았다.
이로부터, 식 (5)로 표현되는 화합물과 서열 번호: 244로 표현되는 펩티드를 혼합한 칵테일 백신은 서열 번호: 2로 표현되는 펩티드에 특이적인 CTL을 유도할 수 있음이 명확해졌다. 또한 식 (5)로 표현되는 화합물을 단독 투여한 경우와 비교해서 칵테일 백신을 투여한 경우에 서열 번호: 2로 표현되는 펩티드에 특이적인 IFNγ 산생 세포가 많이 인정된 것은, 칵테일 백신에 포함되는 서열 번호: 244로 표현되는 헬퍼 펩티드에 반응성의 세포가 유도됨으로써, 서열 번호: 2로 표현되는 펩티드에 특이적인 CTL의 유도가 증강되었기 때문이라고 추정되었다. 따라서, 식 (5)로 표현되는 화합물과 헬퍼 펩티드를 포함하는 칵테일 백신은 식 (5)로 표현되는 화합물의 단독 투여에 비해, 마우스 생체 내에서 강하게 CTL을 유도할 수 있음이 명확해졌다.
2개의 WT1 항원 펩티드를 함유하는 백신을 제작하는 경우의 일례로서, 2개의 상이한 펩티드를 하나의 제제로 하는 칵테일화 백신을 들 수 있다. 칵테일화 백신을 제작할 때, 문제가 되는 것이 혼합하는 암 항원 펩티드의 물성이 하나의 문제가 된다. 표 60 및 표 66에 나타낸 바와 같이, 2개 WT1 항원 펩티드를 칵테일화할 때는 용해도, 즉 물성이 상이한 2개의 펩티드를 하나의 제제로 하게 된다. 이에 반해, 본 발명의 콘쥬게이트체는 2개의 WT1 항원 펩티드를 디술피드 결합에 의해 결합한 화합물이며, 단일한 용해도, 즉 물성을 나타냈다. 이것은 본 발명의 콘쥬게이트체가 단일한 물성일 뿐 아니라 시험 예 2에 나타낸 바와 같이 2개의 WT1 항원 펩티드에 대한 응답하는 성질을 갖는 것을 나타내고 있다. 이 점에서, 본 발명의 콘쥬게이트체는, 칵테일화 백신과 같이 2개의 WT1 항원 펩티드끼리의 상호 작용 등을 고려하지 않고 2개의 WT1 항원 펩티드에 대한 응답을 야기할 수 있는 화합물인 것으로 나타났다.
시험 예 16
HLA-A0201 유전자 도입 마우스를 사용한, 생체내에서의 CTL 유도능의 평가
실시예 1에서 합성한 식 (5)로 표현되는 화합물과 참고 예 2에서 합성한 서열 번호: 24로 표현되는 펩티드를 혼합한 칵테일 백신의 CTL 유도능을, HLA-A0201 유전자 도입 마우스를 사용한 생체내 CTL 유도 시험에 의해 평가하였다. 식 (5);
[화학식 69]
Figure 112015103012119-pct00141
(식 중, C와 C 사이의 결합은 디술피드 결합을 나타냄)
로 표현되는 화합물에 포함되는 RMFPNAPYL(서열 번호: 2)은 HLA-A0201 구속성 WT1 펩티드, CYTWNQMNL(서열 번호: 4)은 HLA-A2402 구속성 WT1 펩티드이며, CNKRYFKLSHLQMHSRKTG(서열 번호: 24)는 MHC 클래스 II 구속성 WT1 펩티드(즉, 헬퍼 펩티드)이다.
HLA-A0201 유전자 도입 마우스에 대해서는, 시험 예 2, 5에 기재한 바와 같다.
식 (5)로 표현되는 화합물의 투여에 의해, 목적하는 펩티드(서열 번호: 2)에 대한 CTL이 유도되는지 여부는, 식 (5)로 표현되는 화합물을 투여한 상기 마우스 유래의 비세포를 펩티드(서열 번호: 2)로 재자극을 행한 경우에 IFNγ을 산생하는지 측정함으로써 판단하였다. 또한, 식 (5)와 혼합한 헬퍼 펩티드(서열 번호: 24)가 생체 내에서 작용하고 있는지 여부는, 식 (5)로 표현되는 화합물을 단독 투여한 상기 마우스 유래의 비세포와, 식 (5)로 표현되는 화합물과 서열 번호: 24로 표현되는 펩티드의 칵테일 백신을 투여한 상기 마우스 유래의 비세포를, 펩티드(서열 번호: 2)로 재자극을 행한 경우의 IFNγ 산생 세포수를 비교함으로써 판단하였다.
구체적으로는, 식 (5)로 표현되는 화합물을 디메틸술폭시드(DMSO)로 80mg/mL에 용해하고, 또한 주사용수로 3mg/mL로 희석한 뒤, 등량의 몬타나이드 ISA51VG와 혼합해서 에멀전화시켰다. 에멀전화시킨 화합물을, 마우스의 미근부 피내에 150μg/부위로 2군데 투여하였다. 또한, 식 (5)로 표현되는 화합물과 서열 번호: 24로 표현되는 펩티드를 디메틸술폭시드(DMSO)로 80mg/mL에 용해한 후, 주사용수로 희석한 후의 농도가 식 (5)로 표현되는 화합물이 3mg/mL, 서열 번호: 24로 표현되는 펩티드가 3.11mg/mL가 되도록 혼합하였다. 이 희석액을 등량의 몬타나이드 ISA51VG와 혼합해서 에멀전화시켰다. 이 식 (5)로 표현되는 화합물이 150μg/부위, 서열 번호: 24로 표현되는 펩티드가 156μg/부위 포함되는 칵테일 백신을 마우스의 미근부 피내에 2군데 투여하였다. 각 에멀전에 포함되는 DMSO 농도는 일정하게 하였다. 1주일 후에, 마우스를 CO2 가스에 의해 안락사시킨 뒤 비장을 적출하여, 비세포를 제조하였다. IFNγ 산생의 측정에는, IFNγ ELISPOT 검정 키트를 사용하였다. 비세포 제조 전날에, ELISPOT 플레이트를 항 마우스 IFNγ 항체로 처리하고, 당일에 10％ FBS를 포함하는 RPMI1640 배지에서 블로킹하였다. 제조한 HLA-A0201 유전자 도입 마우스 유래의 비세포를 0.25×106 세포/웰로, 블로킹한 ELISPOT 플레이트에 파종하였다. 펩티드(서열 번호: 2)를 DMSO로 40mg/mL에 용해하고, 또한 10％ FBS를 포함하는 RPMI1640 배지에서 40μg/mL로 희석하였다. 희석한 펩티드(서열 번호: 2)를 최종 농도 10μg/mL로 HLA-A0201 유전자 도입 마우스 유래의 비세포에 첨가하였다. 펩티드를 첨가한 비세포를, 19시간, 37℃, 5％ CO2 하에서 배양함으로써, 시험관내에서의 펩티드 재자극을 가하였다. 배양 후에 상청을 제거하고, ELISPOT 플레이트를, 첨부의 프로토콜에 따라서 발색시켰다. 발색한 스폿 수는, 이뮤노스폿 애널라이저(C.T.L.사 제조)에 의해 측정하였다.
HLA-A0201 유전자 도입 마우스를 사용한 IFNγ ELISPOT 검정의 결과를 도 25에 나타냈다.
도 25에서, 종축은 파종 세포수 중에 반응한 세포수를 나타낸다. 도 25의 흑색 막대 및 백색 막대는 HLA-A0201 유전자 도입 마우스 유래의 비세포를 서열 번호: 2로 표현되는 목적하는 펩티드의 존재 하 및 비존재 하에서 배양한 결과를 나타낸다. 즉, 흑색 막대와 백색 막대의 값의 차가, 식 (5)로 표현되는 화합물 및 헬퍼 펩티드(서열 번호: 24)를 포함하는 칵테일 백신의 투여에 의해 마우스 생체 내에서 유도된 목적하는 각 펩티드 특이적 CTL의 수를 나타낸다.
도 25에서 백색 막대의 값은 인정되지 않았다. 이것은 목적하는 펩티드 비존재 하에서는 각각의 유전자 도입 마우스의 비세포는 반응하지 않은 것을 나타내고 있다. 본 시험의 결과, 식 (5)로 표현되는 화합물을 단독 투여 및 헬퍼 펩티드(서열 번호: 24)를 포함하는 칵테일 백신을 투여한 HLA-A0201 유전자 도입 마우스 유래의 비세포에 있어서는 서열 번호: 2로 표현되는 목적하는 펩티드 특이적인 IFNγ 산생이 확인되었다. 또한, 도 25에서 헬퍼 펩티드(서열 번호: 24)를 포함하는 칵테일 백신의 투여에 의해 유도된 서열 번호: 2로 표현되는 펩티드에 특이적인 IFNγ 산생 세포의 수는, 식 (5)로 표현되는 화합물의 단독 투여에 의해 유도된 펩티드 특이적인 IFNγ 산생 세포의 수보다 많았다.
이로부터, 식 (5)로 표현되는 화합물과 서열 번호: 24로 표현되는 펩티드를 혼합한 칵테일 백신은 서열 번호: 2로 표현되는 펩티드에 특이적인 CTL을 유도할 수 있음이 명확해졌다. 또한 식 (5)로 표현되는 화합물을 단독 투여한 경우와 비교해서 칵테일 백신을 투여한 경우에 서열 번호: 2로 표현되는 펩티드에 특이적인 IFNγ 산생 세포가 많이 인정된 것은, 칵테일 백신에 포함되는 서열 번호: 24로 표현되는 헬퍼 펩티드에 반응성의 세포가 유도됨으로써, 서열 번호: 2로 표현되는 펩티드에 특이적인 CTL의 유도가 증강되었기 때문이라고 추정되었다. 따라서, 식 (5)로 표현되는 화합물과 헬퍼 펩티드를 포함하는 칵테일 백신은 식 (5)로 표현되는 화합물의 단독 투여에 비해, 마우스 생체 내에서 강하게 CTL을 유도할 수 있음이 명확해졌다.
시험 예 17
HLA-A0201 유전자 도입 마우스를 사용한, 생체내에서의 CTL 유도능의 평가
실시예 11에서 합성한 서열 번호: 242는 서열 번호: 244의 N 말단 시스테인 연장체이다. 또한, 서열 번호: 244는 시험 예 15에 나타낸 칵테일 백신에 있어서 CTL 유도의 증강 효과를 나타내고 있다. 따라서 본 시험에서는, 실시예 1에서 합성한 식 (5)로 표현되는 화합물과 서열 번호: 242로 표현되는 펩티드를 혼합한 칵테일 백신의 CTL 유도능을, HLA-A0201 유전자 도입 마우스를 사용한 생체내 CTL 유도 시험에 의해 평가하였다. 식 (5):
[화학식 70]
Figure 112015103012119-pct00142
(식 중, C와 C 사이의 결합은 디술피드 결합을 나타냄)
로 표현되는 화합물에 포함되는 RMFPNAPYL(서열 번호: 2)은 HLA-A0201 구속성 WT1 펩티드, CYTWNQMNL(서열 번호: 4)은 HLA-A2402 구속성 WT1 펩티드이며, CWAPVLDFAPPGASAYGSL(서열 번호: 242)에 포함되는 WAPVLDFAPPGASAYGSL(서열 번호: 244)은 MHC 클래스 II 구속성 WT1 펩티드(즉, 헬퍼 펩티드)이다.
HLA-A0201 유전자 도입 마우스에 대해서는, 시험 예 2, 5에 기재한 바와 같다.
식 (5)로 표현되는 화합물의 투여에 의해, 목적하는 펩티드(서열 번호: 2)에 대한 CTL이 유도되는지 여부는, 식 (5)로 표현되는 화합물을 투여한 상기 마우스 유래의 비세포를 펩티드(서열 번호: 2)로 재자극을 행한 경우에 IFNγ을 산생하는지 측정함으로써 판단하였다. 또한, 식 (5)와 혼합한 헬퍼 펩티드(서열 번호: 242)가 생체 내에서 작용하고 있는지 여부는, 식 (5)로 표현되는 화합물을 단독 투여한 상기 마우스 유래의 비세포와, 식 (5)로 표현되는 화합물과 서열 번호: 242로 표현되는 펩티드의 칵테일 백신을 투여한 상기 마우스 유래의 비세포를, 펩티드(서열 번호: 2)로 재자극을 행한 경우의 IFNγ 산생 세포수를 비교함으로써 판단하였다.
시험 예 16과 마찬가지의 방법으로 CTL 유도 시험을 행하였다. 단, 칵테일 백신은 식 (5)로 표현되는 화합물과 서열 번호: 242로 표현되는 펩티드를 디메틸술폭시드(DMSO)로 80mg/mL에 용해한 후, 주사용수로 희석한 후의 농도가 식 (5)로 표현되는 화합물이 3mg/mL, 서열 번호: 242로 표현되는 펩티드가 2.42mg/mL가 되도록 혼합하였다. 이 희석액을 등량의 몬타나이드 ISA51VG와 혼합해서 에멀전화시켰다. 이 식 (5)로 표현되는 화합물이 150μg/부위, 서열 번호: 242로 표현되는 펩티드가 121μg/부위 포함되는 칵테일 백신을 마우스의 미근부 피내에 2군데 투여하였다.
HLA-A0201 유전자 도입 마우스를 사용한 IFNγ ELISPOT 검정의 결과를 도 26에 나타냈다.
도 26에서, 종축은 파종 세포수 중에 반응한 세포수를 나타낸다. 도 26의 흑색 막대 및 백색 막대는 HLA-A0201 유전자 도입 마우스 유래의 비세포를 서열 번호: 2로 표현되는 목적하는 펩티드의 존재 하 및 비존재 하에서 배양한 결과를 나타낸다. 즉, 흑색 막대와 백색 막대의 값의 차가, 식 (5)로 표현되는 화합물 및 헬퍼 펩티드(서열 번호: 242)를 포함하는 칵테일 백신의 투여에 의해 마우스 생체 내에서 유도된 목적하는 각 펩티드 특이적 CTL의 수를 나타낸다.
도 26에서 백색 막대의 값은 인정되지 않았다. 이것은 목적하는 펩티드 비존재 하에서는 각각의 유전자 도입 마우스의 비세포는 반응하지 않은 것을 나타내고 있다. 본 시험의 결과, 식 (5)로 표현되는 화합물을 단독 투여 및 헬퍼 펩티드(서열 번호: 242)를 포함하는 칵테일 백신을 투여한 HLA-A0201 유전자 도입 마우스 유래의 비세포에 있어서는, 서열 번호: 2로 표현되는 목적하는 펩티드 특이적인 IFNγ 산생이 확인되었다. 또한, 도 26에서 헬퍼 펩티드(서열 번호: 242)를 포함하는 칵테일 백신의 투여에 의해 유도된 서열 번호: 2로 표현되는 펩티드에 특이적인 IFNγ 산생 세포의 수는, 식 (5)로 표현되는 화합물의 단독 투여에 의해 유도된 펩티드 특이적인 IFNγ 산생 세포의 수보다 많았다.
이로부터, 식 (5)로 표현되는 화합물과 서열 번호: 242로 표현되는 펩티드를 혼합한 칵테일 백신은, 서열 번호: 2로 표현되는 펩티드에 특이적인 CTL을 유도할 수 있음이 명확해졌다. 또한 식 (5)로 표현되는 화합물을 단독 투여한 경우와 비교해서 칵테일 백신을 투여한 경우에 서열 번호: 2로 표현되는 펩티드에 특이적인 IFNγ 산생 세포가 많이 인정된 것은, 칵테일 백신 중의 서열 번호: 242로 표현되는 펩티드에 포함되는 서열 번호: 244로 표현되는 헬퍼 펩티드에 반응성의 세포가 유도됨으로써, 서열 번호: 2로 표현되는 펩티드에 특이적인 CTL의 유도가 증강되었기 때문이라고 추정되었다. 따라서, 식 (5)로 표현되는 화합물과 헬퍼 펩티드를 포함하는 칵테일 백신은, 식 (5)로 표현되는 화합물의 단독 투여에 비해, 마우스 생체 내에서 강하게 CTL을 유도할 수 있음이 명확해졌다.
시험 예 18
HLA-A0201 유전자 도입 마우스를 사용한, 생체내에서의 CTL 유도능의 평가
실시예 12에서 합성한 서열 번호: 243은 서열 번호: 244의 C 말단 시스테인 연장체이다. 또한, 서열 번호: 244는 시험 예 15에 나타낸 칵테일 백신에 있어서 CTL 유도의 증강 효과를 나타내고 있다. 따라서 본 시험에서는, 실시예 1에서 합성한 식 (5)로 표현되는 화합물과 서열 번호: 243으로 표현되는 펩티드를 혼합한 칵테일 백신의 CTL 유도능을, HLA-A0201 유전자 도입 마우스를 사용한 생체내 CTL 유도 시험에 의해 평가하였다. 식 (5):
[화학식 71]
Figure 112015103012119-pct00143
(식 중, C와 C 사이의 결합은 디술피드 결합을 나타냄)
로 표현되는 화합물에 포함되는 RMFPNAPYL(서열 번호: 2)은 HLA-A0201 구속성 WT1 펩티드, CYTWNQMNL(서열 번호: 4)은 HLA-A2402 구속성 WT1 펩티드이며, WAPVLDFAPPGASAYGSLC(서열 번호: 243)에 포함되는 WAPVLDFAPPGASAYGSL(서열 번호: 244)은 MHC 클래스 II 구속성 WT1 펩티드(즉, 헬퍼 펩티드)이다.
HLA-A0201 유전자 도입 마우스에 대해서는, 시험 예 2, 5에 기재한 바와 같다.
식 (5)로 표현되는 화합물의 투여에 의해, 목적하는 펩티드(서열 번호: 2)에 대한 CTL이 유도되는지 여부는, 식 (5)로 표현되는 화합물을 투여한 상기 마우스 유래의 비세포를 펩티드(서열 번호: 2)로 재자극을 행한 경우에 IFNγ을 산생하는지 측정함으로써 판단하였다. 또한, 식 (5)와 혼합한 헬퍼 펩티드(서열 번호: 243)가 생체 내에서 작용하고 있는지 여부는, 식 (5)로 표현되는 화합물을 단독 투여한 상기 마우스 유래의 비세포와, 식 (5)로 표현되는 화합물과 서열 번호: 243으로 표현되는 펩티드의 칵테일 백신을 투여한 상기 마우스 유래의 비세포를, 펩티드(서열 번호: 2)로 재자극을 행한 경우의 IFNγ 산생 세포수를 비교함으로써 판단하였다.
시험 예 16과 마찬가지의 방법으로 CTL 유도 시험을 행하였다. 단, 칵테일 백신은 식 (5)로 표현되는 화합물과 서열 번호: 243으로 표현되는 펩티드를 디메틸술폭시드(DMSO)로 80mg/mL에 용해한 후, 주사용수로 희석한 후의 농도가 식 (5)로 표현되는 화합물이 3mg/mL, 서열 번호: 243으로 표현되는 펩티드가 2.42mg/mL가 되도록 혼합하였다. 이 희석액을 등량의 몬타나이드 ISA51VG와 혼합해서 에멀전화시켰다. 이 식 (5)로 표현되는 화합물이 150μg/부위, 서열 번호: 243으로 표현되는 펩티드가 121μg/부위 포함되는 칵테일 백신을 마우스의 미근부 피내에 2군데 투여하였다.
HLA-A0201 유전자 도입 마우스를 사용한 IFNγ ELISPOT 검정의 결과를 도 27에 나타냈다.
도 27에서, 종축은 파종 세포수 중에 반응한 세포수를 나타낸다. 도 27의 흑색 막대 및 백색 막대는, HLA-A0201 유전자 도입 마우스 유래의 비세포를 서열 번호: 2로 표현되는 목적하는 펩티드의 존재 하 및 비존재 하에서 배양한 결과를 나타낸다. 즉, 흑색 막대와 백색 막대의 값의 차가, 식 (5)로 표현되는 화합물 및 헬퍼 펩티드(서열 번호: 243)를 포함하는 칵테일 백신의 투여에 의해 마우스 생체 내에서 유도된 목적하는 각 펩티드 특이적 CTL의 수를 나타낸다.
도 27에서 백색 막대의 값은 인정되지 않았다. 이것은 목적하는 펩티드 비존재 하에서는 각각의 유전자 도입 마우스의 비세포는 반응하지 않은 것을 나타내고 있다. 본 시험의 결과, 식 (5)로 표현되는 화합물을 단독 투여, 및 헬퍼 펩티드(서열 번호: 243)를 포함하는 칵테일 백신을 투여한 HLA-A0201 유전자 도입 마우스 유래의 비세포에 있어서는 서열 번호: 2로 표현되는 목적하는 펩티드 특이적인 IFNγ 산생이 확인되었다. 또한, 도 27에서 헬퍼 펩티드(서열 번호: 243)를 포함하는 칵테일 백신의 투여에 의해 유도된 서열 번호: 2로 표현되는 펩티드에 특이적인 IFNγ 산생 세포의 수는, 식 (5)로 표현되는 화합물의 단독 투여에 의해 유도된 펩티드 특이적인 IFNγ 산생 세포의 수보다 많았다.
이로부터, 식 (5)로 표현되는 화합물과 서열 번호: 243으로 표현되는 펩티드를 혼합한 칵테일 백신은 서열 번호: 2로 표현되는 펩티드에 특이적인 CTL을 유도할 수 있음이 명확해졌다. 또한 식 (5)로 표현되는 화합물을 단독 투여한 경우와 비교해서 칵테일 백신을 투여한 경우에 서열 번호: 2로 표현되는 펩티드에 특이적인 IFNγ 산생 세포가 많이 인정된 것은, 칵테일 백신 중의 서열 번호: 243으로 표현되는 펩티드에 포함되는 서열 번호: 244로 표현되는 헬퍼 펩티드에 반응성의 세포가 유도됨으로써, 서열 번호: 2로 표현되는 펩티드에 특이적인 CTL의 유도가 증강되었기 때문이라고 추정되었다. 따라서,식 (5)로 표현되는 화합물과 헬퍼 펩티드를 포함하는 칵테일 백신은 식 (5)로 표현되는 화합물의 단독 투여에 비해, 마우스 생체 내에서 강하게 CTL을 유도할 수 있음이 명확해졌다.
2개의 WT1 항원 펩티드를 함유하는 백신을 제작하는 경우의 일례로서, 2개의 상이한 펩티드를 하나의 제제로 하는 칵테일화 백신을 들 수 있다. 칵테일화 백신을 제작할 때, 문제가 되는 것이 혼합하는 암 항원 펩티드의 물성이 하나의 문제가 된다. 표 60 및 표 66에 나타낸 바와 같이, 2개 WT1 항원 펩티드를 칵테일화할 때는 용해도, 즉 물성이 상이한 2개의 펩티드를 하나의 제제로 하게 된다. 이에 반해, 본 발명의 콘쥬게이트체는 2개의 WT1 항원 펩티드를 디술피드 결합에 의해 결합한 화합물이며, 단일한 용해도, 즉 물성을 나타냈다. 이것은 본 발명의 콘쥬게이트체가 단일한 물성일 뿐 아니라 시험 예 2에 나타낸 바와 같이 2개의 WT1 항원 펩티드에 대한 응답하는 성질을 갖는 것을 나타내고 있다. 이 점에 있어서, 본 발명의 콘쥬게이트체는 칵테일화 백신과 같이 2개의 WT1 항원 펩티드끼리의 상호 작용 등을 고려하지 않고 2개의 WT1 항원 펩티드에 대한 응답을 야기할 수 있는 화합물인 것으로 나타났다.
시험 예 19
필터 여과를 거친 후에, HLA-A2402 유전자 도입 마우스를 사용한, 생체내에서의 CTL 유도능의 평가
디술피드 결합을 통해서 형성한 서열 번호 4의 호모 이량체 및 식 (5)로 표현되는 화합물을 3 내지 10mg/mL가 되도록 주사용수로 용해한다. 각 화합물의 약리 활성을, CTL 유도 활성을 지표로 해서 HLA-A2402 유전자 도입 마우스(C57BL/6CrHLA-A2402/Kb)를 이용해서 평가한다. HLA-A2402 유전자 도입 마우스에 투여함에 있어서, 주사용수로 용해한 화합물을 단백질 저결합성의 필터(주사제의 멸균 처리를 목적으로 한 그레이드의 멤브레인 필터)로 여과 멸균한 뒤, 불완전 프로인트 아쥬반트와 혼합해서 에멀전화시킨다.
에멀전화시킨 화합물은 HLA-A2402 유전자 도입 마우스의 미근부 피내에 투여한다. 투여 1주일 후, 마우스를 CO2 가스에 의해 안락사시킨 뒤 비장 또는 서혜부 림프절을 적출하여, 비세포 또는 림프절 세포를 제조한다. IFNγ 산생의 측정에는, IFNγ ELISPOT 검정 키트를 사용한다. 세포 제조 전날에, ELISPOT 플레이트를 항 마우스 IFNγ 항체로 처리하고, 당일에 10％ FBS를 포함하는 RPMI1640 배지에서 블로킹한다. 제조한 마우스 유래의 세포를 블로킹한 ELISPOT 플레이트에 파종한다. 펩티드(서열 번호: 4)를 DMSO로 40mg/mL에 용해하고, 또한 10％ FBS를 포함하는 RPMI1640 배지에서 40μg/mL로 희석한다. 희석한 펩티드(서열 번호: 4)를, 최종 농도 10μg/mL로 HLA-A2402 유전자 도입 마우스 유래의 비세포 또는 림프절 세포에 첨가한다. 펩티드를 첨가한 세포를, 16 내지 20시간, 37℃, 5％ CO2 하에서 배양함으로써, 시험관내에서의 펩티드 재자극을 첨가한다. 배양 후에 상청을 제거한 뒤, ELISPOT 플레이트를, 첨부의 프로토콜에 따라서 발색시킨다. 발색한 스폿 수는, 이뮤노스폿 애널라이저(C.T.L.사 제조)에 의해 측정한다.
[산업상 이용 가능성]
본 발명의 화합물은, CTL을 효율적으로 유도하고 또한 제조가 용이한 암 백신의 유효 성분으로서 유용하다. 본 출원은, 일본에서 출원된 일본 특허 출원 제2013-072173(출원일: 2013년 3월 29일) 및 일본 특허 출원 제2013-158383(출원일: 2013년 7월 31일)을 기초로 하고 있으며, 그 내용은 모두 본 명세서에 포함되는 것으로 한다.
SEQUENCE LISTING <110> Sumitomo Dainippon Pharma Co., Ltd. International Institute of Cancer Immunology, Inc. <120> WT1 ANTIGEN PEPTIDE CONJUGATE VACCINE <130> 672495 <150> JP 2013-072173 <151> 2013-03-29 <150> JP 2013-158383 <151> 2013-07-31 <160> 244 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 449 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 1 Met Gly Ser Asp Val Arg Asp Leu Asn Ala Leu Leu Pro Ala Val Pro 1 5 10 15 Ser Leu Gly Gly Gly Gly Gly Cys Ala Leu Pro Val Ser Gly Ala Ala 20 25 30 Gln Trp Ala Pro Val Leu Asp Phe Ala Pro Pro Gly Ala Ser Ala Tyr 35 40 45 Gly Ser Leu Gly Gly Pro Ala Pro Pro Pro Ala Pro Pro Pro Pro Pro 50 55 60 Pro Pro Pro Pro His Ser Phe Ile Lys Gln Glu Pro Ser Trp Gly Gly 65 70 75 80 Ala Glu Pro His Glu Glu Gln Cys Leu Ser Ala Phe Thr Val His Phe 85 90 95 Ser Gly Gln Phe Thr Gly Thr Ala Gly Ala Cys Arg Tyr Gly Pro Phe 100 105 110 Gly Pro Pro Pro Pro Ser Gln Ala Ser Ser Gly Gln Ala Arg Met Phe 115 120 125 Pro Asn Ala Pro Tyr Leu Pro Ser Cys Leu Glu Ser Gln Pro Ala Ile 130 135 140 Arg Asn Gln Gly Tyr Ser Thr Val Thr Phe Asp Gly Thr 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Cys Ala Tyr Pro Gly Cys Asn Lys 1 5 <210> 160 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> peptide <400> 160 Cys Ala Tyr Pro Gly Cys Asn Lys Arg 1 5 <210> 161 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> peptide <400> 161 Ala Tyr Pro Gly Cys Asn Lys Arg Tyr 1 5 <210> 162 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> peptide <400> 162 Tyr Pro Gly Cys Asn Lys Arg Tyr Phe 1 5 <210> 163 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> peptide <400> 163 Gly Cys Asn Lys Arg Tyr Phe Lys Leu 1 5 <210> 164 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> peptide <400> 164 Lys Arg Tyr Phe Lys Leu Ser His Leu 1 5 <210> 165 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> peptide <400> 165 Tyr Phe Lys Leu Ser His Leu Gln Met 1 5 <210> 166 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> peptide <400> 166 Leu Ser His Leu Gln Met His Ser Arg 1 5 <210> 167 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> peptide <400> 167 Leu Gln Met His Ser Arg Lys His Thr 1 5 <210> 168 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> peptide <400> 168 His Ser Arg Lys His Thr Gly Glu Lys 1 5 <210> 169 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> peptide <400> 169 Arg Lys His Thr Gly Glu Lys Pro Tyr 1 5 <210> 170 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> peptide <400> 170 His Thr Gly Glu Lys Pro Tyr Gln Cys 1 5 <210> 171 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> peptide <400> 171 Gly Glu Lys Pro Tyr Gln Cys Asp Phe 1 5 <210> 172 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> peptide <400> 172 Lys Pro Tyr Gln Cys Asp Phe Lys Asp 1 5 <210> 173 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> peptide <400> 173 Gln Cys Asp Phe Lys Asp Cys Glu Arg 1 5 <210> 174 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> peptide <400> 174 Asp Phe Lys Asp Cys Glu Arg Arg Phe 1 5 <210> 175 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> peptide <400> 175 Lys Asp Cys Glu Arg Arg Phe Ser Arg 1 5 <210> 176 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> peptide <400> 176 Arg Arg Phe Ser Arg Ser Asp Gln Leu 1 5 <210> 177 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> peptide <400> 177 Arg Phe Ser Arg Ser Asp Gln Leu Lys 1 5 <210> 178 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> peptide <400> 178 Phe Ser Arg Ser Asp Gln Leu Lys Arg 1 5 <210> 179 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> peptide <400> 179 Arg Ser Asp Gln Leu Lys Arg His Gln 1 5 <210> 180 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> peptide <400> 180 Asp Gln Leu Lys Arg His Gln Arg Arg 1 5 <210> 181 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> peptide <400> 181 Lys Arg His Gln Arg Arg His Thr Gly 1 5 <210> 182 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> peptide <400> 182 Arg His Gln Arg Arg His Thr Gly Val 1 5 <210> 183 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> peptide <400> 183 His Gln Arg Arg His Thr Gly Val Lys 1 5 <210> 184 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> peptide <400> 184 Arg Arg His Thr Gly Val Lys Pro Phe 1 5 <210> 185 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> peptide <400> 185 Gly Val Lys Pro Phe Gln Cys Lys Thr 1 5 <210> 186 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> peptide <400> 186 Phe Gln Cys Lys Thr Cys Gln Arg Lys 1 5 <210> 187 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> peptide <400> 187 Gln Cys Lys Thr Cys Gln Arg Lys Phe 1 5 <210> 188 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> peptide <400> 188 Lys Thr Cys Gln Arg Lys Phe Ser Arg 1 5 <210> 189 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> peptide <400> 189 Thr Cys Gln Arg Lys Phe Ser Arg Ser 1 5 <210> 190 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> peptide <400> 190 Gln Arg Lys Phe Ser Arg Ser Asp His 1 5 <210> 191 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> peptide <400> 191 Arg Lys Phe Ser Arg Ser Asp His Leu 1 5 <210> 192 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> peptide <400> 192 Lys Phe Ser Arg Ser Asp His Leu Lys 1 5 <210> 193 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> peptide <400> 193 Arg Ser Asp His Leu Lys Thr His Thr 1 5 <210> 194 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> peptide <400> 194 Asp His Leu Lys Thr His Thr Arg Thr 1 5 <210> 195 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> peptide <400> 195 His Thr Arg Thr His Thr Gly Lys Thr 1 5 <210> 196 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> peptide <400> 196 Thr Gly Lys Thr Ser Glu Lys Pro Phe 1 5 <210> 197 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> peptide <400> 197 Lys Thr Ser Glu Lys Pro Phe Ser Cys 1 5 <210> 198 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> peptide <400> 198 Thr Ser Glu Lys Pro Phe Ser Cys Arg 1 5 <210> 199 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> peptide <400> 199 Ser Glu Lys Pro Phe Ser Cys Arg Trp 1 5 <210> 200 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> peptide <400> 200 Lys Pro Phe Ser Cys Arg Trp Pro Ser 1 5 <210> 201 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> peptide <400> 201 Ser Cys Arg Trp Pro Ser Cys Gln Lys 1 5 <210> 202 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> peptide <400> 202 Cys Arg Trp Pro Ser Cys Gln Lys Lys 1 5 <210> 203 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> peptide <400> 203 Arg Trp Pro Ser Cys Gln Lys Lys Phe 1 5 <210> 204 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> peptide <400> 204 Trp Pro Ser Cys Gln Lys Lys Phe Ala 1 5 <210> 205 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> peptide <400> 205 Pro Ser Cys Gln Lys Lys Phe Ala Arg 1 5 <210> 206 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> peptide <400> 206 Ser Cys Gln Lys Lys Phe Ala Arg Ser 1 5 <210> 207 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> peptide <400> 207 Lys Lys Phe Ala Arg Ser Asp Glu Leu 1 5 <210> 208 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> peptide <400> 208 Lys Phe Ala Arg Ser Asp Glu Leu Val 1 5 <210> 209 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> peptide <400> 209 Phe Ala Arg Ser Asp Glu Leu Val Arg 1 5 <210> 210 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> peptide <400> 210 Ala Arg Ser Asp Glu Leu Val Arg His 1 5 <210> 211 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> peptide <400> 211 Arg Ser Asp Glu Leu Val Arg His His 1 5 <210> 212 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> peptide <400> 212 Ser Asp Glu Leu Val Arg His His Asn 1 5 <210> 213 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> peptide <400> 213 Asp Glu Leu Val Arg His His Asn Met 1 5 <210> 214 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> peptide <400> 214 Val Arg His His Asn Met His Gln Arg 1 5 <210> 215 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> peptide <400> 215 Arg His His Asn Met His Gln Arg Asn 1 5 <210> 216 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> peptide <400> 216 His His Asn Met His Gln Arg Asn Met 1 5 <210> 217 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> peptide <400> 217 Asn Met His Gln Arg Asn Met Thr Lys 1 5 <210> 218 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> peptide <400> 218 Met His Gln Arg Asn Met Thr Lys Leu 1 5 <210> 219 <211> 21 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> peptide <400> 219 Cys Gln Lys Lys Phe Ala Arg Ser Asp Glu Leu Val Arg His His Asn 1 5 10 15 Met His Gln Arg Asn 20 <210> 220 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> peptide <400> 220 Gln Arg Asn Met Thr Lys Leu Gln Leu 1 5 <210> 221 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> peptide <400> 221 Arg Asn Met Thr Lys Leu Gln Leu Ala 1 5 <210> 222 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> peptide <400> 222 Asn Met Thr Lys Leu Gln Leu Ala Leu 1 5 <210> 223 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> peptide <400> 223 Arg Tyr Phe Pro Asn Ala Pro Tyr Leu 1 5 <210> 224 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> peptide <400> 224 Phe Met Phe Pro Asn Ala Pro Tyr Leu 1 5 <210> 225 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> peptide <400> 225 Arg Leu Phe Pro Asn Ala Pro Tyr Leu 1 5 <210> 226 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> peptide <400> 226 Arg Met Met Pro Asn Ala Pro Tyr Leu 1 5 <210> 227 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> peptide <400> 227 Arg Met Phe Pro Asn Ala Pro Tyr Val 1 5 <210> 228 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> peptide <400> 228 Tyr Met Phe Pro Asn Ala Pro Tyr Leu 1 5 <210> 229 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> peptide <220> <221> misc_feature <222> (1)..(1) <223> Xaa is Ser or Ala <400> 229 Xaa Met Thr Trp Asn Gln Met Asn Leu 1 5 <210> 230 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> peptide <220> <221> misc_feature <222> (1)..(1) <223> Xaa is selected from the group consisting of Ser, Ala, Abu, Arg, Lys, Orn, Cit, Leu, Phe and Asn <400> 230 Xaa Tyr Thr Trp Asn Gln Met Asn Leu 1 5 <210> 231 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> peptide <400> 231 Ala Tyr Leu Pro Ala Val Pro Ser Leu 1 5 <210> 232 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> peptide <400> 232 Phe Leu Gly Glu Gln Gln Tyr Ser Val 1 5 <210> 233 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> peptide <400> 233 Ser Met Gly Glu Gln Gln Tyr Ser Val 1 5 <210> 234 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> peptide <400> 234 Ser Leu Met Glu Gln Gln Tyr Ser Val 1 5 <210> 235 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> peptide <400> 235 Arg Tyr Pro Gly Val Ala Pro Thr Leu 1 5 <210> 236 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> peptide <400> 236 Cys Leu Glu Ser Gln Pro Ala Ile Arg Asn 1 5 10 <210> 237 <211> 23 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> peptide <400> 237 Pro Ser Gln Ala Ser Ser Gly Gln Ala Arg Met Phe Pro Asn Ala Pro 1 5 10 15 Tyr Leu Pro Ser Cys Leu Glu 20 <210> 238 <211> 18 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> peptide <400> 238 Arg Met Phe Pro Asn Ala Pro Tyr Leu Cys Tyr Thr Trp Asn Gln Met 1 5 10 15 Asn Leu <210> 239 <211> 18 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> peptide <400> 239 Cys Tyr Thr Trp Asn Gln Met Asn Leu Arg Met Phe Pro Asn Ala Pro 1 5 10 15 Tyr Leu <210> 240 <211> 24 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> peptide <400> 240 Arg Met Phe Pro Asn Ala Pro Tyr Leu Gly Gly Gly Gly Gly Gly Cys 1 5 10 15 Tyr Thr Trp Asn Gln Met Asn Leu 20 <210> 241 <211> 24 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> peptide <400> 241 Cys Tyr Thr Trp Asn Gln Met Asn Leu Gly Gly Gly Gly Gly Gly Arg 1 5 10 15 Met Phe Pro Asn Ala Pro Tyr Leu 20 <210> 242 <211> 19 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> peptide <400> 242 Cys Trp Ala Pro Val Leu Asp Phe Ala Pro Pro Gly Ala Ser Ala Tyr 1 5 10 15 Gly Ser Leu <210> 243 <211> 19 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> peptide <400> 243 Trp Ala Pro Val Leu Asp Phe Ala Pro Pro Gly Ala Ser Ala Tyr Gly 1 5 10 15 Ser Leu Cys <210> 244 <211> 18 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> peptide <400> 244 Trp Ala Pro Val Leu Asp Phe Ala Pro Pro Gly Ala Ser Ala Tyr Gly 1 5 10 15 Ser Leu

Claims (20)

  1. 식 (1):
    Figure 112019123706159-pct00144

    [식 중, Xa 및 Ya는 단결합을 나타내고,
    암 항원 펩티드 A는, 이하의 아미노산 서열:
    Figure 112019123706159-pct00145

    중에서 선택되는 어느 하나의 아미노산 서열로 이루어진 펩티드를 나타내고, 암 항원 펩티드 A의 N 말단 아미노산의 아미노기가 식 (1) 중의 Ya와 결합하고, 암 항원 펩티드 A의 C 말단 아미노산의 카르보닐기가 식 (1) 중의 수산기와 결합하고,
    R1은 암 항원 펩티드 C를 나타내고,
    암 항원 펩티드 C는, 암 항원 펩티드 A와는 서열이 상이하고 또한 이하의 아미노산 서열:
    Figure 112019123706159-pct00146

    중에서 선택되는 어느 하나의 아미노산 서열로 이루어진 펩티드를 나타내고, 암 항원 펩티드 C의 시스테인 잔기의 티오에테르기가 식 (1) 중의 티오에테르기와 결합함]
    로 표현되는 화합물 또는 그의 약학상 허용되는 염.
  2. 제1항에 있어서,
    식 (1)로 표현되는 화합물이 식 (4):
    Figure 112018095826182-pct00147

    (식 중, C와 C 사이의 결합은 디술피드 결합을 나타냄)
    로 표현되는 화합물인, 화합물 또는 그의 약학상 허용되는 염.
  3. 제1항에 있어서,
    식 (1)로 표현되는 화합물이 식 (5):
    Figure 112018095826182-pct00148

    (식 중, C와 C 사이의 결합은 디술피드 결합을 나타냄)
    로 표현되는 화합물인, 화합물 또는 그의 약학상 허용되는 염.
  4. 제1항에 기재된 화합물 또는 그의 약학상 허용되는 염을 함유하는 조성물.
  5. 제4항에 있어서, (A) 식 (4):
    Figure 112019123706159-pct00182

    (식 중, C와 C 사이의 결합은 디술피드 결합을 나타냄)
    로 표현되는 화합물 및 식 (5):
    Figure 112019123706159-pct00183

    (식 중, C와 C 사이의 결합은 디술피드 결합을 나타냄)
    로 표현되는 화합물로 이루어지는 군에서 선택되는 화합물과,
    (B) 아미노산 서열:
    Figure 112019123706159-pct00184

    로 이루어지는 군에서 선택되는 아미노산 서열로 이루어진 펩티드를 하나 이상 포함하는 조성물.
  6. 제5항에 있어서, 화합물 (A)가 식 (4):
    Figure 112019123706159-pct00185

    (식 중, C와 C 사이의 결합은 디술피드 결합을 나타냄)
    로 표현되는 것인 조성물.
  7. 제5항에 있어서, 화합물 (A)가 식 (5):
    Figure 112019123706159-pct00186

    (식 중, C와 C 사이의 결합은 디술피드 결합을 나타냄)
    로 표현되는 것인 조성물.
  8. 제5항에 있어서, 하나 이상의 펩티드 (B)가 아미노산 서열:
    Figure 112019123706159-pct00187

    로 이루어지는 군에서 선택되는 아미노산 서열로 이루어진 것인 조성물.
  9. 식 (4):
    Figure 112019123706159-pct00188

    (식 중, C와 C 사이의 결합은 디술피드 결합을 나타냄)
    로 표현되는 화합물과,
    아미노산 서열:
    Figure 112019123706159-pct00189

    로 이루어진 펩티드를 포함하는 조성물.
  10. 식 (5):
    Figure 112019123706159-pct00190

    (식 중, C와 C 사이의 결합은 디술피드 결합을 나타냄)
    로 표현되는 화합물과,
    아미노산 서열:
    Figure 112019123706159-pct00191

    로 이루어진 펩티드를 포함하는 조성물.
  11. 제1항에 기재된 화합물 또는 그의 약학상 허용되는 염, 및 약학적으로 허용되는 담체를 함유하는 암을 치료 또는 예방하기 위한 의약 조성물.
  12. 제11항에 있어서, 식 (4):
    Figure 112018095826182-pct00192

    (식 중, C와 C 사이의 결합은 디술피드 결합을 나타냄)
    로 표현되는 화합물을 포함하는 의약 조성물.
  13. 제11항에 있어서, 식 (5):
    Figure 112018095826182-pct00193

    (식 중, C와 C 사이의 결합은 디술피드 결합을 나타냄)
    로 표현되는 화합물을 포함하는 의약 조성물.
  14. 제11항에 있어서, 식 (4):
    Figure 112019123706159-pct00194

    (식 중, C와 C 사이의 결합은 디술피드 결합을 나타냄)
    로 표현되는 화합물과,
    아미노산 서열:
    Figure 112019123706159-pct00195

    로 이루어진 펩티드를 포함하는 의약 조성물.
  15. 제11항에 있어서, 식 (5):
    Figure 112019123706159-pct00196

    (식 중, C와 C 사이의 결합은 디술피드 결합을 나타냄)
    로 표현되는 화합물과,
    아미노산 서열:
    Figure 112019123706159-pct00197

    로 이루어진 펩티드를 포함하는 의약 조성물.
  16. 제11항에 있어서, WT1 유전자가 발현하고 있는 암이나 WT1 유전자의 발현 레벨의 상승을 수반하는 암의 치료에 사용하기 위한 의약 조성물.
  17. 제11항에 있어서, 암의 세포성 면역 요법에서 CTL의 유도에 사용하기 위한 의약 조성물.
  18. 제11항에 있어서, 암 백신으로서 사용하기 위한 의약 조성물.
  19. 제16항 내지 제18항 중 어느 한 항에 있어서, 암이 백혈병, 골수 이형성 증후군, 다발성 골수종 및 악성 임파종 중에서 선택되는 혈액성 암, 또는 위암, 대장암, 폐암, 유방암, 배세포암, 간암, 피부암, 방광암, 전립선암, 자궁암, 자궁경부암, 난소암 및 뇌종양 중에서 선택되는 고형 암인 의약 조성물.
  20. 암 항원 펩티드 A의 N 말단에 결합된 시스테인 잔기와 암 항원 펩티드 C의 시스테인 잔기 사이에 디술피드 결합을 형성하는 것을 포함하며,
    상기 암 항원 펩티드 A는 이하의 아미노산 서열:
    Figure 112019123706159-pct00198

    중에서 선택되는 어느 하나의 아미노산 서열로 이루어진 펩티드이고,
    암 항원 펩티드 C는, 이하의 아미노산 서열:
    Figure 112019123706159-pct00199

    중에서 선택되는 어느 하나의 아미노산 서열로 이루어진 펩티드인,
    제1항에 기재된 식 (1)로 표현되는 화합물의 제조 방법.
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