CN111647066B - Wt1多肽肿瘤抑制剂 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了提供一种由9条来自于WT1蛋白序列的多肽组成的抗原。该抗原是通过计算机软件对WT1靶点进行了分析，将该蛋白抗原性最好的一部分进行序列拆分，组合成为9条长肽做为抗原序列。本发明的多肽组合具有抗肿瘤效果更好，谱系更广的优点。

Description

WT1多肽肿瘤抑制剂
技术领域
本发明创造涉及肿瘤治疗领域，具体涉及一种WT1多肽肿瘤抑制剂。
背景技术
恶性肿瘤的主动特异性免疫治疗的关键在于选择合适的抗原靶点，2009年美国国家癌症研究所(National Cancer Institute，NCI)分析对比了75个恶性肿瘤抗原，最终发现成肾细胞瘤1(nephroblastoma or Wilm’s tumor1，WT1)是最佳的恶性肿瘤抗原。
多肽抗原制备方法简单，但发挥抗癌作用的机制非常复杂，进入体内后通过DC细胞递呈给T细胞才能清除癌细胞。据研究表明，目前国际上所采取的单一多肽、短肽抗原(少于35个氨基酸)无法完全覆盖所有患者产生较好疗效。且目前国际上针对此靶点所研发的适应症主要集中在血液瘤、骨髓瘤。针对其他实体瘤的该靶点药物有待研发。
本发明旨在提供一种由9条来自于WT1蛋白序列的多肽组成的抗原。该抗原是通过计算机软件对WT1靶点进行了分析，将该蛋白抗原性最好的一部分进行序列拆分，组合成为9条长肽做为抗原序列。
发明内容
本发明的目的是提供一种由9条来自于WT1蛋白序列的多肽组成的抗原。
一种WT1多肽肿瘤抑制剂，其包括如下序列的9条多肽：
Figure BDA0002565024000000011
Figure BDA0002565024000000021
本发明的优点：
本发明旨在提供一种由9条来自于WT1蛋白序列的多肽组成的抗原。该抗原是通过计算机软件对WT1靶点进行了分析，将该蛋白抗原性最好的一部分进行序列拆分，组合成为9条长肽做为抗原序列。目前国际上所采取的单一多肽、短肽抗原(少于35个氨基酸)无法完全覆盖所有患者产生较好疗效，主要集中在血液瘤、骨髓瘤，本发明的多肽组合具有抗肿瘤效果更好，谱系更广的优点。此外，还发现了本发明的9条短肽组合物有十分不错的体外抑制效果，可以进一步增加使用治疗范围。
附图说明
图1为WT1抗原性分析。
图2为WT1抗原表位分析。
图3为WT1对乳腺癌的药效分析图。
图4为WT1对乳腺癌的爬坡试验图。
图5为WT1对结肠癌的爬坡试验图。
具体实施方式
下面详细描述本发明的实施例，所述实施例仅用于解释本发明，而不能理解为对本发明的限制。
本发明的具体实施例如以下说明。
本发明的动物实验委托方广州吉妮欧生物进行，蛋白抗原委托方南京铭研生物进行合成。
实施例1
根据蛋白分析和抗原表位分析结果，图1为WT1抗原性分析，图2为WT1抗原表位分析。
将WT1蛋白进行了密码子优化后，选取核心区域序列进行重组设计，并拆分为9条多肽。通过动物实验对其药效进行验证。
所述9条多肽的序列如下：
Figure BDA0002565024000000031
Figure BDA0002565024000000041
实施例2
(1)建模方案
根据实验目标，拟建立包括直肠癌，结肠癌，肝癌，乳腺癌四种动物模型
(2)建模流程
培养WT1高表达肿瘤细胞株；
将肿瘤细胞移植至CDX小鼠；
CDX小鼠模型生长至100mm3后，进行分组如下：
阴性对照组(PBS)，实验处理组原始蛋白W-P001，实验处理组重组蛋白W-P001(342-449)，实验处理组多肽(9种多肽按照等摩尔9等份混合)，共四组，各2只小鼠。
3.给药方案
每只小鼠按照5天一次给药，2mg，多点注射于小鼠淋巴各处。
实验结果：
小鼠乳腺癌给药预实验结果：
参见附图3，乳腺癌给药实验，多肽组肿瘤生长明显减缓，低于对照组及蛋白组，初步判断本发明的多肽组具有针对小鼠的肿瘤抑制性效果，初步药效成立。
实施例3
研究在不同剂量下，三种药物在CT26-hWT1(结肠癌)和4T1-hWT1(乳腺癌)肿瘤皮下异种移植小鼠动物模型中的抗肿瘤作用。
实验设计
本实验主要包含两部分：前期的模型实验及后期的药效试验。
实验分组
对照组、W-P001(342-449)(低剂量)、W-P001(342-449)(中剂量)、W-P001(342-449)(高剂量)、W-P001(低剂量)、W-P001(中剂量)、W-P001(高剂量)、多肽(低剂量)、多肽(中剂量)和多肽(高剂量)10组，每组6只，两种细胞，共120只。
实验处理组多肽(9种多肽按照等摩尔9等份混合)。
前期的模型实验：
表1.小鼠皮下肿瘤模型的实验设计
Figure BDA0002565024000000061
Figure BDA0002565024000000071
皮下药效实验
药效实验每组的动物数及详细的给药途径、剂量和方案见下表。
表2模型药效实验的给药途径、剂量及方案
Figure BDA0002565024000000072
Figure BDA0002565024000000081
注：BIW，一周二次。
实验结果如附图4，5所示，可见，低剂量组效果反而更好。
实施例4对宫颈癌的体外抑制作用
子宫颈癌是人体最常见的癌瘤之一，不但在女性生殖器官癌瘤中占首位，而且是女性各种恶性肿瘤中最多见的癌瘤，但其发病率有明显的地区差异。我国宫颈癌的发生，在地理分布上的特点是高发区常连接成片，各省宫颈癌相对高发区的市、县也常有互相连接现象。总的趋势是农村高于城市，山区高于平原。根据29个省、市，自治区回顾调查我国宫颈癌死亡率占总癌症死亡率的第四位，占女性癌的第二位。宫颈癌患者的平均发病年龄，各国、各地报道也有差异，我国发病年龄以40～50岁为最多，60～70岁又有一高峰出现，20岁以前少见。
除了对实体瘤的通过免疫的抑制效果增强了，本研发团队还发现，因为需要通过免疫细胞发挥抗肿瘤作用，WT1原始蛋白和重组蛋白对宫颈癌细胞的体外抑制效果不明显，但是预料不到的是，本发明的9条短肽组合物却有十分不错的体外抑制效果，这为后续进一步研究其抑制癌症的其他机理奠定了基础。
将对数生长期宫颈癌HeLa细胞制成单细胞悬液，将细胞密度调整为每孔5×103个，在96孔培养板培养6小时后贴壁。设阴性对照组(PBS)，实验处理1组(原始蛋白W-P001)，实验处理2组(重组蛋白W-P001(342-449))，实验处理3组(含有多肽序列1、4、7，按照等摩尔3等份混合)，实验处理4组(含有多肽序列2、5、8，按照等摩尔3等份混合)，实验处理5组(含有多肽序列3、6、9，按照等摩尔3等份混合)，实验处理6组(含有9种多肽，按照等摩尔9等份混合)，实验组1-6多肽的总共终浓度都是9μmol/L，同时设置空白对照组(PBS)，每组均设5个复孔，于72h后停止培养。细胞形态及密度在倒置显微镜下观察，在每孔加入5mg·mL-1MTT溶液20μL，保持37℃培养箱内连续孵育4h，弃上清液，每孔加入DMSO 150μL，最后避光摇匀，10min后采用酶标仪测定吸光度(A值)，波长为490nm。计算不同实验组的细胞增殖抑制率。细胞增殖抑制率(％)＝(1-实验组/对照组)×100％。
数据均采用SPSS16.0版统计软件进行分析。计量资料采用均数±标准差(x±s)表示，多组间均数比较采取单因素方差分析，两组间均数比较采用t检验。以P＜0.05表示差异有统计学意义。
结果如表1所示，各实验组之间无统计学差异。
表1
Figure BDA0002565024000000091
Figure BDA0002565024000000101
可见，WT1原始蛋白和重组蛋白对宫颈癌细胞的体外抑制效果不明显(需要通过抗原效应其作用)，只含有部分多肽的组别有一定作用，实验组4好于实验组3和实验组5，但是随着时间的变化，提升作用并不明显。而本发明的9条短肽组合物有十分不错的体外抑制效果，这说明混合后多条多肽相互之间很很强大的协同作用，推测可能和细胞因子的分泌，信号通道等因素有关。
需要说明的是，以上所述仅为本发明的优选具体的实施例，若依本发明的构想所作变动，其产生的功能作用，仍未超出说明书所涵盖的精神时，均应在本发明的范围内。
在本说明书的描述中，参考术语“一个实施例”、“一些实施例”、“示例”、“具体示例”、或“一些示例”等的描述意指结合该实施例或示例描述的具体特征、结构、材料或者特点包含于本发明的至少一个实施例或示例中。在本说明书中，对上述术语的示意性表述不一定指的是相同的实施例或示例。而且，描述的具体特征、结构、材料或者特点可以在任何的一个或多个实施例或示例中以合适的方式结合。
尽管已经示出和描述了本发明的实施例，本领域的普通技术人员可以理解：在不脱离本发明的原理和宗旨的情况下可以对这些实施例进行多种变化、修改、替换和变型，本发明的范围由权利要求及其等同物限定。

Claims (5)

1.一种WT1多肽肿瘤抑制剂，其包括如下序列的9条多肽：
1）
SNPARYEFLMHSRKHTGEKPYQCDFKDCERRFSRSDQLKVLEHVVRVNARVRI
2）
LSNPARYEFLKRHQRRHTGVKPFQCKTCQVLEHVVRVNARVRIRKF
3）
LSNPARYEFLKRHQRRHTGVKPFVLEHVVRVNARVRIQCK
4）
HSNPARYEFLTRTHTGKTSEKPFSVLEHVVRVNARVRICRW
5）
TSEKPFSCRVLEHVVRVNARVRI
6）
CRWPSCQKKVLEHVVRVNARVRI
7）
QKKFARSDEVLEHVVRVNARVRI
8）
SDELVRHHNVLEHVVRVNARVRI
9）
HHNMHQRNMVLEHVVRVNARVRI。
2.权利要求1所述的WT1多肽肿瘤抑制剂，其特征在于，还进一步包括辅剂。
3.权利要求1或2所述的WT1多肽肿瘤抑制剂的制备方法。
4.权利要求1或2所述的WT1多肽肿瘤抑制剂用于制备抗肿瘤药物的应用，所述肿瘤是结肠癌，宫颈癌，乳腺癌。
5.权利要求4所述的应用，其特征在于，所述肿瘤是宫颈癌。
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