CN114225019A - 癌疫苗及使用其的治疗方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及癌疫苗及使用其的治疗方法。公开的是疫苗组合物，其包含编码一种或多种选自由以下组成的组的氨基酸序列的一种或多种核酸：酪氨酸酶、酪氨酸酶‑相关蛋白1、酪氨酸酶‑相关蛋白2、黑色素瘤‑相关抗原4蛋白、生长激素释放激素、MART‑1/melan‑A抗原、癌睾丸抗原NY‑ESO‑1、癌睾丸抗原NY‑ESO‑2、在黑色素瘤中优先表达的抗原、维尔姆斯肿瘤1以及人端粒酶逆转录酶的氨基酸序列。该疫苗组合物可进一步包含编码一种或多种其他抗原的核酸，包括前列腺特异性抗原。还公开了预防或治疗有此需要的受试者的癌症的方法，包括向受试者施用包含特定数量的癌抗原的疫苗组合物以治疗或预防特定癌症。
Description
本申请是申请日为2014年3月14日的题为“癌疫苗及使用其的治疗方法”的中国专利申请No.201480011372.2的分案申请。
相关申请的交叉参考
本申请要求2013年3月15日提交的的优先权美国临时专利申请No.61/799,952的优先权，其全部内容在此通过引用并入。
技术领域
本文中公开了用于治疗癌症的组合物和方法，且特别地是治疗并提供抵御肿瘤生长的保护的疫苗。
背景技术
癌症是全世界死亡的主要原因之一，并且在美国是第二常见的死亡原因，每4例死亡中几乎占据1例。癌症产生于已从正常细胞转化成肿瘤细胞的单个细胞。这样的转化通常是多阶段过程，从癌变前损伤进展至恶性肿瘤。多个因素促成该进展，包括衰老、遗传贡献和对外部试剂诸如物理致癌物(例如，紫外辐射和电离辐射)、化学致癌物(例如，石棉、烟草烟的组分等)和生物致癌物(例如，某些病毒、细菌和寄生虫)的暴露。
癌症的预防、诊断和治疗可采取许多不同的形式。预防可包括筛选诱病因素(例如，特定基因变体)、改变行为(例如，吸烟、饮食和身体活动量)和抗病毒(例如，人乳头状瘤病毒、乙型肝炎病毒)疫苗接种。治疗可包括化学疗法、放射疗法和肿瘤或癌组织的手术切除。尽管可获得许多预防和治疗方法，但此类方法在有效地预防和/或治疗当前的癌症中通常达到有限的成功。
因此，存在对用于预防和/或治疗癌症以促进抵御疾病和疾病进展的保护作用的临床管理的组合物和方法的鉴定和开发的需要。此外，需要更有效的治疗来延缓疾病进展和/或减少患有癌症的受试者的死亡率。
发明内容
本发明涉及包含不再是自身抗原并且刺激针对特定癌症或与特定癌症相关的肿瘤的免疫应答的一种或多种核酸或氨基酸序列的疫苗。疫苗还可包含阻止免疫系统中的任何组分诸如MHC类呈递、T细胞呈递和/或分化、B细胞呈递和/或分化、或用于免疫细胞增殖和/或分化的任何细胞因子、趋化因子或信号转导的抑制的免疫检查点抑制剂，诸如抗-PD-1和抗-PDL-1抗体。疫苗的一种或多种癌抗原可以是编码一种或多种选自由以下组成的组的氨基酸序列的核酸：与酪氨酸酶(Tyr)的氨基酸序列具有95％或更大的同一性的氨基酸序列；酪氨酸酶-相关蛋白1(TYRP1)的氨基酸序列；与酪氨酸酶-相关蛋白2(TYRP2)的氨基酸序列具有95％或更大的同一性的氨基酸序列；与黑色素瘤-相关抗原4蛋白(MAGEA4)的氨基酸序列具有95％或更大的同一性的氨基酸序列；与生长激素释放激素(GHRH)的氨基酸序列具有95％或更大的同一性的氨基酸序列；与MART-1/melan-A抗原(MART-1/Melan-A)的氨基酸序列具有95％或更大的同一性的氨基酸序列；与癌睾丸抗原(NY-ESO-1)的氨基酸序列具有95％或更大的同一性的氨基酸序列；与癌睾丸抗原II(NY-ESO-2)的氨基酸序列具有95％或更大的同一性的氨基酸序列；与PRAME的氨基酸序列具有95％或更大的同一性的氨基酸序列；与WT1的氨基酸序列具有95％或更大的同一性的氨基酸序列；与hTERT的氨基酸序列具有95％或更大的同一性的氨基酸序列；或其组合。疫苗还可包含编码一种或多种选自由以下组成的组的抗原的核酸：PSA、PSMA、STEAP、PSCA、MAGE A1、gp100、病毒抗原及其组合。
本发明进一步涉及用于预防或治疗有此需要的受试者的癌症的方法，所述方法包括向有此需要的受试者施用用于治疗或预防特定癌症的包含特定数量的癌抗原疫苗。所述方法可以包括向有此需要的受试者施用包含CMV癌抗原的疫苗以治疗或预防成胶质细胞瘤或向有此需要的受试者施用包含与癌抗原hTERT、NY-ESO-1、MAGE-A1或WT1中的任一种或多种组合的CMV癌抗原的疫苗以治疗或预防成胶质细胞瘤；向有此需要的受试者施用包含一种或多种癌抗原PSA、PSMA或STEAP的疫苗以治疗或预防前列腺癌或向有此需要的受试者施用包含与癌抗原hTERT、NY-ESO-1、MAGE-A1或WT1中的任一种或多种组合的PSA、PSMA或STEAP的疫苗以治疗或预防前列腺癌；向有此需要的受试者施用包含一种或多种癌抗原酪氨酸酶、PRAME或GP-100的疫苗以治疗或预防黑色素瘤或向有此需要的受试者施用包含与癌抗原hTERT、NY-ESO-1、MAGE-A1或WT1中的任一种或多种组合的酪氨酸酶、PRAME或GP-100的疫苗以治疗或预防黑色素瘤；向有此需要的受试者施用包含一种或多种癌抗原HPV 16E6或HPV 16E7的疫苗以治疗或预防头颈癌或向有此需要的受试者施用包含与癌抗原hTERT、NY-ESO-1、MAGE-A1或WT1中的任一种或多种组合HPV 16E6或HPV 16E7的疫苗以治疗或预防头颈癌；向有此需要的受试者施用包含一种或多种癌抗原酪氨酸酶、PRAME或GP-100的疫苗以治疗或预防黑色素瘤或向有此需要的受试者施用包含与癌抗原hTERT、NY-ESO-1、MAGE-A1或WT1中的任一种或多种组合的酪氨酸酶、PRAME或GP-100的疫苗以治疗或预防黑色素瘤；向有此需要的受试者施用包含一种或多种癌抗原HPV6、HPV 11或HPV 16的疫苗以治疗或预防肛门癌或向有此需要的受试者施用包含与癌抗原hTERT、NY-ESO-1、MAGE-A1或WT1中的任一种或多种组合的HPV 6、HPV 11或HPV 16的疫苗以治疗或预防肛门癌；向有此需要的受试者施用包含一种或多种癌抗原HBV核心抗原、HBV表面抗原、HCV NS34A、HCV NS5A、HCVNS5B或HCV NS4B的疫苗以治疗或预防肝癌或向有此需要的受试者施用包含与癌抗原hTERT、NY-ESO-1、MAGE-A1或WT1中的任一种或多种组合的HBV核心抗原、HBV表面抗原、HCVNS34A、HCV NS5A、HCV NS5B或HCV NS4B的疫苗以治疗或预防肝癌；向有此需要的受试者施用包含一种或多种癌抗原HPV 16E6/E7或HPV 18E6/E7的疫苗以治疗或预防子宫颈癌或向有此需要的受试者施用包含与癌抗原hTERT、NY-ESO-1、MAGE-A1或WT1中的任一种或多种组合的HPV16E6/E7或HPV 18E6/E7的疫苗以治疗或预防子宫颈癌；或向有此需要的受试者施用包含一种或多种癌抗原PRAME、WT-1或hTERT的疫苗以治疗或预防血癌或向有此需要的受试者施用包含与癌抗原NY-ESO-1或MAGE-A1中的任一种或多种的PRAME、WT-1或hTERT的疫苗以治疗或预防血癌，其中所述方法可进一步包括将(a)-(i)的施用步骤与选自由抗-PD-1抗体、抗-PD-L1抗体及其组合组成的组的免疫检查点抑制剂组合。
附图说明
图1-A至1-E显示pTyr的构建体。
图2-A和2-B分别显示免疫策略和通过Tyr DNA接种进行的细胞介导的免疫应答的诱导。
图3显示对照小鼠和免疫的小鼠的流式荧光激活细胞分选(FACS)。
图4-A和4-B显示免疫的小鼠的酪氨酸酶-特异性抗体的诱导。
图5-A和5-B分别显示在对照小鼠和免疫的小鼠中进行肿瘤攻击后的卡普兰-迈耶存活曲线和肿瘤体积曲线。
图6-A和6-B显示免疫的小鼠和未免疫的小鼠中的MDSC细胞群体。
图7显示利用pVax1和pTyr免疫的小鼠中的MDSC的染色。
图8-A和8-B显示通过MDSC的MCP-1分泌。
图9显示指示的生物体间Tyr核苷酸序列的系统发育关系。
图10显示(A)举例说明pPRAME(在本文中也称为pGX1411)的质粒图谱的示意图；(B)利用DAPI对RD和293T细胞的细胞核的染色和共有PRAME抗原的染色；和(C)来自非转染细胞(“对照”)、利用pVAX(“pVAX”)转染的细胞和利用pPRAME(“PRAME-pVAX”)转染的细胞的裂解物中的共有PRAME抗原的免疫印迹。
图11在(A)和(B)中显示标绘小鼠的组对比针对干扰素γ(IFN-γ)的斑形成单位(SFU)/106个脾细胞的图。
图12显示(A)举例说明pNY-ESO-1(在本文中也称为pGX1409)的质粒图谱的示意图；(B)利用DAPI对细胞的细胞核的染色和共有NY-ESO-1抗原的染色；和(C)来自非转染细胞(“对照”)、利用pVAX(“pVAX”)转染的细胞和利用pNY-ESO-1(“pNY-ESO-1”)转染的细胞的RD和293T裂解物中的共有NY-ESO-1抗原的免疫印迹。
图13显示标绘小鼠的组对比针对干扰素γ(IFN-γ)的斑形成单位(SFU)/106个脾细胞的图。
图14显示标绘小鼠的组对比针对干扰素γ(IFN-γ)的斑形成单位(SFU)/106个脾细胞的图。
图15显示举例说明各种具有一些它们的相关癌抗原的癌症的示意图。
具体实施方式
本发明涉及可被定制用于特定癌症和肿瘤的疫苗。待用于疫苗的特定癌症相关抗原诸如酪氨酸酶(Tyr)(在黑色素瘤中优先表达的抗原(PRAME))、酪氨酸酶相关蛋白1(Tyrp1)、癌睾丸抗原(NY-ESO-1)、乙型肝炎病毒抗原和维尔姆斯肿瘤1抗原(WT-1)的抗原共有序列已被设计用来允许定制的疫苗预防或治疗特定癌症。例如，酪氨酸酶抗原可被用于疫苗来预防或治疗黑色素瘤的疫苗。本发明的疫苗可提供用于需要治疗的受试者的癌症的特定预防或治疗的特定癌抗原的任意组合。
设计重组癌抗原的核酸及其编码的氨基酸序列的一个方式是通过引入改变天然癌抗原的完整氨基酸序列中的特定氨基酸的突变。突变的引入不会太多地改变癌抗原(以至其不能被普遍地跨哺乳动物受试者(优选地人或狗受试者)施用)，但使其改变得足以使所得氨基酸序列打破耐受性或被当作外源抗原以产生免疫应答。另一方式可以是生成与其相应的天然癌抗原具有至少85％和高达99％的氨基酸序列同一性、优选至少90％和高达98％的序列同一性、更优选至少93％和高达98％的序列同一性或甚至更优选至少95％和高达98％的序列同一性的共有重组癌抗原。在某些情况下，所述重组癌抗原与其相应的天然癌抗原具有95％、96％、97％、98％或99％的氨基酸序列同一性。所述天然癌抗原是通常与特定癌症或癌症肿瘤相关的抗原。取决于癌抗原，癌抗原的共有序列可跨哺乳动物物种或在种的亚型内或跨病毒株或血清型。一些癌抗原不会与癌抗原的野生型氨基酸序列变化很大。一些癌抗原具有在种间具有如此大的差异以致不能产生共有序列的核酸/氨基酸序列。在这些情况下，产生可打破耐受性和产生免疫应答的重组癌抗原，所述重组癌抗原与其相应的天然癌抗原具有至少85％和高达99％的氨基酸序列同一性、优选至少90％和高达98％的序列同一性、更优选至少93％和高达98％的序列同一性或甚至更优选至少95％和高达98％的序列同一性。在某些情况下，所述重组癌抗原与其相应的天然癌抗原具有95％、96％、97％、98％或99％的氨基酸序列同一性。可组合前述方法，以使得最终的重组癌抗原具有如上论述的与天然癌抗原氨基酸序列的百分比相似性。
所述重组癌抗原可诱导抗原特异性T细胞和/或高滴度抗体应答，从而诱导或引发针对表达该抗原的癌症或肿瘤或与所述癌症或肿瘤反应的免疫应答。在一些实施方案中，诱导或引发的免疫应答可以是细胞、体液或细胞和体液免疫应答。在一些实施方案中，诱导或引发的细胞免疫应答可包括干扰素-γ(IFN-γ)和/或肿瘤坏死因子α(TNF-α)的诱导或分泌。在其它实施方案中，诱导或引发的免疫应答可减少或抑制促进表达该抗原的肿瘤或癌症的生长的一种或多种免疫抑制因子，例如，但不限于下调MHC呈递的因子、上调抗原特异性调节性T细胞(Treg)的因子、PD-L1、FasL、细胞因子诸如IL-10和TFG-β、肿瘤相关巨噬细胞、肿瘤相关成纤维细胞、由免疫抑制细胞产生的可溶性因子、CTLA-4、PD-1、MDSC、MCP-1和免疫检查点分子。
可将疫苗进一步与针对检查点抑制剂诸如PD-1和PDL-1的抗体组合以增强对细胞和体液免疫应答的刺激。使用抗-PD-1或抗-PDL-1抗体防止PD-1或PDL-1抑制T细胞和/或B细胞应答。总体上，通过设计待被免疫系统识别的癌抗原，可帮助克服其它形式的由肿瘤细胞产生的免疫抑制，并且可将这些疫苗与压抑或抑制疗法(诸如抗-PD-1和抗-PDL-1抗体疗法)组合使用以进一步增强T细胞和/或B细胞应答。
1.定义
除非另有定义，否则本文使用的所有技术和科学术语具有与本领域普通技术人员理解的含义相同的含义。在冲突的情况下，以本文件(包括定义)为准。下文中描述了优选的方法和材料，尽管可在本发明的实施或测试中使用与本文中描述的那些方法和材料类似或等同的方法和材料。本文中提及的所有出版物、专利申请、专利和其它参考文献通过引用整体并入。本文中公开的材料、方法以及实施例仅仅是说明性的并非意在限制。本文中使用的术语仅为了描述特定实施方案，并非意在限制。
如本文中所用，术语“包含/包括”、“包括”、“具有”、“有”、“可以”、“含有”及其变型意欲为不排除另外的行为或结构的可能性的开放式过渡短语、术语或词语。除非上下文另有明确说明，否则单数形式“一个(a)”、“和(and)”以及“该(the)”包括复数参考物。本公开还涵盖“包含/包括”本文中提出的实施方案或组件、“由所述实施方案或组件组成”和“基本上由所述实施方案或组件组成”的其它实施方案，无论是否明确地显示。
对于本文中数值范围的引述，明确地以相同的精度包括其间的每一个中介数。例如，对于6-9的范围，除了6和9外还包括数值7和8，而对于范围6.0-7.0，明确地包括数值6.0、6.1、6.2、6.3、6.4、6.5、6.6、6.7、6.8、6.9和7.0。
如本文中所用，“佐剂”意指添加至本文中描述的DNA质粒疫苗以增强由DNA质粒和下文中描述的编码核酸序列编码的抗原的免疫原性的任何分子。
如本文中所用，“抗体”意指种类IgG、IgM、IgA、IgD或IgE或片段的抗体、其片段或其衍生物，包括Fab、F(ab')2、Fd和单链抗体、双抗体、双特异性抗体、双功能抗体及其衍生物。抗体可以是从哺乳动物的血清样品分离的抗体、多克隆抗体、亲和纯化的抗体或其混合物，所述抗体展现足够的对期望的表位或来源于其的序列的结合特异性。
如本文中所用，“编码序列”或“编码核酸”意指包含编码蛋白质的核苷酸序列的核酸(RNA或DNA分子)。编码序列还可包括有效地连接于能够在施用了核酸的个体或哺乳动物的细胞中指导表达的调控元件(包括启动子和多聚腺苷酸化信号)的起始和终止信号。
如本文中所用，“互补”或“互补的”意指可核酸，可意指核酸分子的核苷酸或核苷酸类似物之间的沃森-克里克(Watson-Crick)(例如，A-T/U和C-G)或Hoogsteen碱基配对。
如本文中所用，“共有”或“共有序列”意指基于来自不同生物体的相同基因的多个序列的比对的分析的多肽序列。可制备编码共有多肽序列的核酸序列。包含含有共有序列的蛋白和/或编码此类蛋白的核酸的疫苗可用于诱发针对抗原的广泛免疫。
如本文中可互换使用的“电穿孔”、“电-透化”或“电动增强”(“EP”)意指使用跨膜电场脉冲来诱发生物膜中的微观通路(孔)；它们的存在允许生物分子诸如质粒、寡核苷酸、siRNA、药物、离子和水从细胞膜的一侧通过进入另一侧。
如本文中针对核酸序列所使用的，“片段”意指编码能够引发哺乳动物的免疫应答的多肽的核酸序列或其部分，所述免疫应答与本文中公开的抗原交叉反应。所述片段可以是选自编码下文中所示的蛋白质片段的各种核苷酸序列的至少一个的DNA片段。片段可包含下文中所示的核酸序列的至少10％、至少20％、至少30％、至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％或至少95％或更多。在一些实施方案中，片段可包含下文中所示的核酸序列的至少一个的至少20个核苷酸或更多、至少30个核苷酸或更多、至少40个核苷酸或更多、至少50个核苷酸或更多、至少60个核苷酸或更多、至少70个核苷酸或更多、至少80个核苷酸或更多、至少90个核苷酸或更多、至少100个核苷酸或更多、至少150个核苷酸或更多、至少200个核苷酸或更多、至少250个核苷酸或更多、至少300个核苷酸或更多、至少350个核苷酸或更多、至少400个核苷酸或更多、至少450个核苷酸或更多、至少500个核苷酸或更多、至少550个核苷酸或更多、至少600个核苷酸或更多、至少650个核苷酸或更多、至少700个核苷酸或更多、至少750个核苷酸或更多、至少800个核苷酸或更多、至少850个核苷酸或更多、至少900个核苷酸或更多、至少950个核苷酸或更多或至少1000个核苷酸或更多个核苷酸。
对于多肽序列，“片段”或“免疫原性片段”意指能够引发哺乳动物的免疫应答的多肽，所述免疫应答与本文中公开的抗原交叉反应。片段可以是选自下文中的各种氨基酸序列的至少一个的多肽片段。共有蛋白的片段可包含共有蛋白的至少10％、至少20％、至少30％、至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％或至少95％。在一些实施方案中，共有蛋白的片段可包含本文中公开的蛋白质序列的至少20个氨基酸或更多、至少30个氨基酸或更多、至少40个氨基酸或更多、至少50个氨基酸或更多、至少60个氨基酸或更多、至少70个氨基酸或更多、至少80个氨基酸或更多、至少90个氨基酸或更多、至少100个氨基酸或更多、至少110个氨基酸或更多、至少120个氨基酸或更多、至少130个氨基酸或更多、至少140个氨基酸或更多、至少150个氨基酸或更多、至少160个氨基酸或更多、至少170个氨基酸或更多、至少180个氨基酸或更多个氨基酸。
如本文中所用，“遗传构建体”是指包含编码蛋白质的核苷酸序列的DNA或RNA分子。所述编码序列包括有效地连接于能够在施用了核酸分子的个体的细胞中指导表达的调控元件(包括启动子和多聚腺苷酸化信号)的起始和终止信号。如本文中所用，术语“可表达的形式”是指基因构建体，所述基因构建体含有有效地连接于编码蛋白质的编码序列的必需调控元件，以便当存在于个体的细胞中时，所述编码序列将被表达。
如本文中所用，术语“同源性”是指互补性的程度。可存在部分同源性或完全同源性(即，相同)。至少部分抑制完全互补的序列与靶序列杂交的部分互补序列是指使用功能性术语"基本上同源的"。当用于指双链核酸序列诸如cDNA或基因组克隆时，如本文中所用，术语"基本上同源的"是指可在低严格度的条件下与双链核酸序列的链杂交的探针。当用于指单链核酸序列时，如本文中所用，术语"基本上同源的"是指可在低严格度条件下与单链核酸模板序列杂交(即，与其互补)的探针。
如在本文中在两个或更多个核酸或多肽序列的上下文中所用，“相同的”或“同一性”意指序列具有指定百分比的在指定区域上相同的残基。可通过如下步骤计算百分比：将两条序列最佳地比对，在指定的区域上比较两条序列，测定在两条序列中存在相同残基的位置的数目以得到匹配位置的数目，将匹配位置的数目除以指定区域中的位置总数，及将结果乘以100来得到序列同一性的百分比。在两条序列具有不同长度或比对产生一个或多个交错末端以及指定的比较区域仅包括单条序列的情况下，将单条序列的残基包括在计算的分母而非分子中。当比较DNA和RNA时，可将胸腺嘧啶(T)和尿嘧啶(U)认为是等同的。人工或通过使用计算机序列算法诸如BLAST或BLAST2.0来获得同一性。
如本文中所用，“免疫应答”意指宿主的免疫系统，例如哺乳动物的免疫系统，响应抗原的引入的激活。免疫应答可以以细胞应答或体液应答的形式或这两种形式存在。
如本文中所用的“核酸”或“寡核苷酸”或“多核苷酸”意指共价连接在一起的至少两个核苷酸。单链的描述也限定了互补链的序列。因此，核酸还包括描述的单链的互补链。核酸的许多变体可出于相同的目的作为给定的核酸使用。因此，核酸还包括基本上相同的核酸和其补体。单链提供可在严格杂交条件下与靶序列杂交的探针。因此，核酸还包括在严格杂交条件下杂交的探针。
核酸可以是单链或双链的，或可含有双链和单链序列的部分。核酸可以是DNA(基因组DNA和cDNA)、RNA或杂交体，其中核酸可含有脱氧核糖核苷酸和核糖核苷酸的组合，及碱基(包括尿嘧啶、腺嘌呤、胸腺嘧啶、胞嘧啶、鸟嘌呤、肌苷、黄嘌呤次黄嘌呤、异胞嘧啶和异鸟嘌呤)的组合。核酸可以通过化学合成法或通过重组法获得。
如本文中所用，“有效连接的”意指基因的表达在与其空间上连接的启动子的控制下。启动子可位于在其控制下的基因的5'(上游)或3'(下游)。启动子与基因之间的距离可与在所述启动子来源自的基因中该启动子与其控制的基因之间的距离大致相同。如在本领域中是已知的，在不丧失启动子功能的情况下，可接受该距离的变化。
如本文中所用，“肽”、“蛋白质”或“多肽”可意指氨基酸的连接的序列，并且可以是天然的、合成的或者经修饰的或者天然和合成的组合。
如本文中所用，“启动子”意指能够赋予、激活或增强核酸在细胞中的表达的合成或天然来源的分子。启动子可包含一个或多个特定的转录调控序列以进一步增强所述序列的表达和/或改变其的空间表达和/或时间表达。启动子还可包含与转录起始位点相距多达数千碱基对的远端增强子或阻遏子元件。启动子可源自包括病毒、细菌、真菌、植物、昆虫和动物的来源。启动子可针对表达发生的细胞、组织或器官或针对表达发生所处的发育阶段，或响应外部刺激(诸如生理应激、病原体、金属离子或诱导剂)而组成型地，或差异地调控基因组分的表达。启动子的代表性实例包括噬菌体T7启动子、噬菌体T3启动子、SP6启动子、lac操纵子-启动子、tac启动子、SV40晚期启动子、SV40早期启动子、RSV-LTR启动子、CMV IE启动子、SV40早期启动子或SV 40晚期启动子和CMV IE启动子。
“信号肽”和“前导序列”在本文中可互换使用，并且是指可被连接在本文中所示的蛋白质的氨基末端上的氨基酸序列。信号肽/前导序列通常指导蛋白质的定位。本文中使用的信号肽/前导序列优选促进蛋白质从产生其的细胞分泌。在从细胞分泌后，通常从蛋白质的其余部分(通常称为成熟蛋白质)切割信号肽/前导序列。信号肽/前导序列连接在蛋白质的氨基末端(即，N末端)上。
如本文中所用，“严格杂交条件”意指第一核酸序列(例如，探针)将与第二核酸序列(例如，靶)(诸如在核酸的复杂混合物中)杂交的条件。严格条件是序列依赖性的，并且在不同的情况下是不同的。可选择比特定序列在限定的离子强度、pH下的热熔点(Tm)低约5-10℃作为严格条件。Tm可以是50％的与靶互补的探针在平衡(由于靶序列过量存在，因此在Tm下，50％的探针在平衡时被占据)时与靶序列杂交时的温度(在限定的离子强度、pH和核酸浓度下)。严格条件可以是在pH 7.0至8.3下盐浓度低于约1.0M钠离子，诸如约0.01-1.0M的钠离子浓度(或其它盐)以及温度为至少约30℃(对于短探针(例如，约10-50个核苷酸))和至少约60℃(对于长探针(例如，大于约50个核苷酸)的那些条件。严格条件还可通过添加去稳定剂诸如甲酰胺来实现。对于选择性或特异性杂交，阳性信号可以为至少2至10倍本底杂交。示例性严格杂交条件包括下列条件：50％甲酰胺、5x SSC和1％SDS在42℃下孵育，或者5x SSC、1％SDS在65℃下孵育，在65℃于0.2xSSC和0.1％SDS中洗涤。
如本文中所用，“受试者”可意指想要或需要利用本文中描述的疫苗免疫的哺乳动物。所述哺乳动物可以是人、黑猩猩、狗、猫、马、牛、小鼠或大鼠。
如本文中所用，“基本上互补的”意指第一序列与第二序列的补体在8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100、180、270、360、450、540或更多个核苷酸或氨基酸的区域上具有至少60％、65％、70％、75％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％的同一性，或两条序列在严格杂交条件下杂交。
如本文中所用的“基本上相同的”意指如果第一序列与第二序列的补体基本上互补的话则第一与第二序列在8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100、180、270、360、450、540或更多个核苷酸或氨基酸的区域上或就核酸而言至少60％、65％、70％、75％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％相同。
如本文中所用，“治疗”或“处理”可意指通过预防、抑制、压制或完全消除疾病的方式来保护动物免受疾病侵害。预防疾病包括在疾病发作之前向动物施用本发明的疫苗。抑制疾病包括在疾病引发后但在其临床表现之前向动物施用本发明的疫苗。压制疾病包括在疾病临床表现后向动物施用本发明的疫苗。
本文中针对核酸所用的“变体”意指(i)参考的核苷酸序列的部分或片段；(ii)参考的核苷酸序列或其部分的补体；(iii)与参考核酸或其互补序列基本上相同的核酸；或(iv)在严格条件下与参考核酸、其补体或与其基本上相同的序列杂交的核酸。
对于肽或多肽，“变体”是指通过氨基酸的插入、缺失或保守取代而在氨基酸序列上相异的，但保留至少一种生物活性的肽或多肽。变体还可意指具有与具有保留至少一种生物活性的氨基酸序列的参考蛋白质基本上相同的氨基酸序列的的蛋白质。氨基酸的保守取代，即利用具有相似性质(例如，疏水性、带电区域的程度和分布)的不同氨基酸替代氨基酸，在本领域中被认为通常包括较小变化。如本领域中所理解的，这些较小变化可部分通过考虑氨基酸的亲疏水性指数(hydropathic index)来鉴定。Kyte等人，J.Mol.Biol.157:105-132(1982)。氨基酸的亲疏水性指数基于对其疏水性和电荷的考虑。在本领域中已知具有相似亲疏水性指数的氨基酸可被取代并且仍然保留蛋白质功能。在一个方面，具有±2的亲疏水性指数的氨基酸被取代。氨基酸的亲水性还可用于显示可导致保留生物功能的蛋白质的取代。在肽的背景中考虑氨基酸的亲水性允许计算该肽的最大局部平均亲水性，这是一种已被报导与抗原性和免疫原性密切相关的有用的度量。美国专利No.4,554,101，通过引用完全并入本文。如本领域中所理解的，具有相似亲水性值的氨基酸的取代可导致保留生物活性例如免疫原性的肽。可利用彼此亲水性值在±2以内的氨基酸进行取代。氨基酸的疏水性指数和亲水性值受该氨基酸的特定侧链影响。与该观察一致，与生物功能相容的氨基酸取代被认为取决于氨基酸，并且具体地那些氨基酸的侧链的相对相似性，如通过疏水性、亲水性、电荷、大小和其它性质显示的。
变体可以是在全长的全基因序列或其片段上基本上相同的核酸序列。核酸序列可在全长的基因序列或其片段上具有80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的同一性。变体可以是在全长的氨基酸序列或其片段上基本上相同的氨基酸序列。氨基酸序列可在全长的所述氨基酸序列或其片段上具有80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的同一性。
如本文中所用，“载体”意指含有复制起始点的核酸序列。载体可以是病毒载体、噬菌体、细菌人工染色体或酵母人工染色体。载体可以是DNA或RNA载体。载体可以是自主复制的染色体外载体，并且优选地，是DNA质粒。所述载体可含有或包括一种或多种异源核酸序列。
2.疫苗
本发明涉及抗-癌疫苗。疫苗可包含一种或多种癌抗原。疫苗可阻止肿瘤生长。疫苗可减少肿瘤生长。疫苗可阻止肿瘤细胞的转移。取决于癌抗原，疫苗可被靶向治疗肝癌、前列腺癌、黑色素瘤、血癌、头颈癌、成胶质细胞瘤、复发性呼吸道乳头状瘤病、肛门癌、子宫颈癌和脑癌。
疫苗开发中的第一步骤是鉴定不被免疫系统识别并且是自身抗原的癌抗原。将鉴定的癌抗原从自身抗原改变成外源抗原以被免疫系统识别。从自身抗原至外源抗原的重组癌抗原的核酸和氨基酸序列的重新设计打破免疫系统对抗原的耐受性。为了打破耐受性，可将几个重新设计措施应用于如下文中描述的癌抗原。
疫苗的重组癌抗原不被识别为自身的，因此打破耐受性。耐受性的打破可诱导抗原特异性T细胞和/或高滴度抗体应答，从而诱导或引发针对表达该抗原的癌症或肿瘤或与所述癌症或肿瘤反应的免疫应答。在一些实施方案中，诱导或引发的免疫应答可以是细胞免疫应答、体液免疫应答或细胞和体液免疫应答。在一些实施方案中，诱导或引发的细胞免疫应答可包括干扰素-γ(IFN-γ)和/或肿瘤坏死因子α(TNF-α)的诱导或分泌。在其它实施方案中，诱导或引发的免疫应答可减少或抑制促进表达该抗原的肿瘤或癌症的生长的一种或多种免疫抑制因子，例如，但不限于下调MHC呈递的因子、上调抗原特异性调节性T细胞(Treg)的因子、PD-L1、FasL、细胞因子诸如IL-10和TFG-β、肿瘤相关巨噬细胞、肿瘤相关成纤维细胞、由免疫抑制细胞产生的可溶性因子、CTLA-4、PD-1、MDSC、MCP-1和免疫检查点分子。
在特定实施方案中，疫苗可通过诱导如下应答来介导肿瘤细胞的清除或阻止其生长：(1)经由B细胞应答(以产生阻断单核细胞趋化蛋白-1(MCP-1)产生，从而延缓髓源抑制性细胞(MDSC)和抑制肿瘤生长的抗体)的体液免疫；(2)增加细胞毒性T淋巴细胞诸如CD8+(CTL)以攻击和杀死肿瘤细胞；(3)增加T辅助细胞应答；和(4)增加经由IFN-γ和TFN-α的炎症应答或优选地所有上述应答。疫苗可使无肿瘤存活率增加30％、31％、32％、33％、34％、35％、36％、37％、38％、39％、40％、41％、42％、43％、44％和45％。在免疫后疫苗可使肿瘤质量减少30％、31％、32％、33％、34％、35％、36％、37％、38％、39％、40％、41％、42％、43％、44％、45％、46％、47％、48％、49％、50％、51％、52％、53％、54％、55％、56％、57％、58％、59％和60％。疫苗可防止和阻止单核细胞趋化蛋白1(MCP-1)(一种由髓源抑制性细胞分泌的细胞因子)的增加。疫苗可使肿瘤存活率增加30％、31％、32％、33％、34％、35％、36％、37％、38％、39％、40％、41％、42％、43％、44％、45％、46％、47％、48％、49％、50％、51％、52％、53％、54％、55％、56％、57％、58％、59％和60％。
疫苗可使被施予所述疫苗的受试者的细胞免疫应答相较于未被施予所述疫苗的受试者的细胞免疫应答增强约50倍至约6000倍、约50倍至约5500倍、约50倍至约5000倍、约50倍至约4500倍、约100倍至约6000倍、约150倍至约6000倍、约200倍至约6000倍、约250倍至约6000倍或约300倍至约6000倍。在一些实施方案中，疫苗可使被施予所述疫苗的受试者的细胞免疫应答相较于未被施予所述疫苗的受试者的细胞免疫应答增强约50倍、100倍、150倍、200倍、250倍、300倍、350倍、400倍、450倍、500倍、550倍、600倍、650倍、700倍、750倍、800倍、850倍、900倍、950倍、1000倍、1100倍、1200倍、1300倍、1400倍、1500倍、1600倍、1700倍、1800倍、1900倍、2000倍、2100倍、2200倍、2300倍、2400倍、2500倍、2600倍、2700倍、2800倍、2900倍、3000倍、3100倍、3200倍、3300倍、3400倍、3500倍、3600倍、3700倍、3800倍、3900倍、4000倍、4100倍、4200倍、4300倍、4400倍、4500倍、4600倍、4700倍、4800倍、4900倍、5000倍、5100倍、5200倍、5300倍、5400倍、5500倍、5600倍、5700倍、5800倍、5900倍或6000倍。
疫苗可使被施予所述疫苗的受试者的干扰素γ(IFN-γ)水平相较于未被施予所述疫苗的受试者的IFN-γ水平升高约50倍至约6000倍、约50倍至约5500倍、约50倍至约5000倍、约50倍至约4500倍、约100倍至约6000倍、约150倍至约6000倍、约200倍至约6000倍、约250倍至约6000倍或约300倍至约6000倍。在一些实施方案中，疫苗可使被施予所述疫苗的受试者的IFN-γ水平相较于未被施予所述疫苗的受试者的IFN-γ水平升高约50倍、100倍、150倍、200倍、250倍、300倍、350倍、400倍、450倍、500倍、550倍、600倍、650倍、700倍、750倍、800倍、850倍、900倍、950倍、1000倍、1100倍、1200倍、1300倍、1400倍、1500倍、1600倍、1700倍、1800倍、1900倍、2000倍、2100倍、2200倍、2300倍、2400倍、2500倍、2600倍、2700倍、2800倍、2900倍、3000倍、3100倍、3200倍、3300倍、3400倍、3500倍、3600倍、3700倍、3800倍、3900倍、4000倍、4100倍、4200倍、4300倍、4400倍、4500倍、4600倍、4700倍、4800倍、4900倍、5000倍、5100倍、5200倍、5300倍、5400倍、5500倍、5600倍、5700倍、5800倍、5900倍或6000倍。
疫苗可以是DNA疫苗。在美国专利No.5,593,972、5,739,118、5,817,637、5,830,876、5,962,428、5,981,505、5,580,859、5,703,055和5,676,594(所述美国专利通过引用完整并入本文)中公开了DNA疫苗。DNA疫苗还可包含抑制其整合进染色体的元件或试剂。
疫苗可以是一种或多种癌抗原的RNA。可将所述RNA疫苗引入细胞。
疫苗可以是减毒活疫苗、使用重组载体递送抗原的疫苗、亚单位疫苗和糖蛋白疫苗，例如但不限于美国专利No.：4,510,245、4,797,368、4,722,848、4,790,987、4,920,209、5,017,487、5,077,044、5,110,587、5,112,749、5,174,993、5,223,424、5,225,336、5,240,703、5,242,829、5,294,441、5,294,548、5,310,668、5,387,744、5,389,368、5,424,065、5,451,499、5,453,364、5,462,734、5,470,734、5,474,935、5,482,713、5,591,439、5,643,579、5,650,309、5,698,202、5,955,088、6,034,298、6,042,836、6,156,319和6,589,529(其各自通过引用并入本文)中描述的疫苗。
本发明的疫苗可具有有效疫苗所需的特性(诸如安全)，以使得所述疫苗本身不引起疾病或死亡；具有抵御疾病的保护作用；诱导中和抗体；诱导保护性T细胞应答；以及提供施用的容易性、几乎无副作用、生物稳定性和每剂量的低成本。疫苗可通过含有如下论述的癌抗原来实现这些特性的某些或所有特性。
如在下文中更详细地描述的，疫苗还可包含一种或多种免疫检查点分子的一种或多种抑制剂(即，免疫检查点抑制剂)。在下文中更详细地描述免疫检查点分子。免疫检查点抑制剂是阻止免疫系统中的任何组分诸如MHC类呈递、T细胞内呈递和/或分化、B细胞呈递和/或分化、用于免疫细胞增殖和/或分化的任何细胞因子、趋化因子或信号转导的抑制的任何核酸或蛋白质。如也在下文中更详细描述的，可将疫苗与针对检查点抑制剂诸如PD-1和PDL-1的抗体进一步组合，以增强细胞和体液免疫应答的刺激。使用抗-PD-1或抗-PDL-1抗体阻止PD-1或PDL-1抑制T细胞和/或B细胞应答。
a.癌抗原
疫苗可包含一种或多种癌抗原。癌抗原可以是核酸序列、氨基酸序列或其组合。所述核酸序列可以是DNA、RNA、cDNA、其变体、其片段或其组合。所述核酸序列还可包括编码通过肽键连接于癌抗原的接头或标签序列的另外的序列。所述氨基酸序列可以是蛋白质、肽、其变体、其片段或其组合。癌抗原可以是重组癌抗原。
设计重组癌抗原的核酸和其编码的氨基酸序列的一个方式是通过引入改变天然癌抗原的完整氨基酸序列中的特定氨基酸的突变。突变的引入不会太多地改变癌抗原(以至其不能被普遍地跨哺乳动物受试者(优选地人或狗受试者)施用)，但使其改变得足以使所得氨基酸序列打破耐受性或被当作外源抗原以产生免疫应答。另一方式可以是生成与其相应的天然癌抗原具有至少85％和高达99％的氨基酸序列同一性、优选至少90％和高达98％的序列同一性、更优选至少93％和高达98％的序列同一性或甚至更优选至少95％和高达98％的序列同一性的共有重组癌抗原。在某些情况下，所述重组癌抗原与其相应的天然癌抗原具有95％、96％、97％、98％或99％的氨基酸序列同一性。所述天然癌抗原是通常与特定癌症或癌症肿瘤相关的抗原。取决于癌抗原，癌抗原的共有序列可跨哺乳动物物种或在种的亚型内或跨病毒株或血清型。一些癌抗原不会与癌抗原的野生型氨基酸序列变化很大。一些癌抗原具有在种间具有如此大的差异以致不能产生共有序列的核酸/氨基酸序列。在这些情况下，产生可打破耐受性和产生免疫应答的重组癌抗原，所述重组癌抗原与其相应的天然癌抗原具有至少85％和高达99％的氨基酸序列同一性、优选至少90％和高达98％的序列同一性、更优选至少93％和高达98％的序列同一性或甚至更优选至少95％和高达98％的序列同一性。在某些情况下，所述重组癌抗原与其相应的天然癌抗原具有95％、96％、97％、98％或99％的氨基酸序列同一性。可组合前述方法，以使得最终的重组癌抗原具有如上论述的与天然癌抗原氨基酸序列的百分比相似性。
癌抗原可以是下列抗原中的一种或多种：酪氨酸酶(Tyr)、酪氨酸酶-相关蛋白1(TYRP1)、酪氨酸酶-相关蛋白2(TYRP2)、黑色素瘤-相关抗原4蛋白(MAGEA4)、生长激素释放激素(GHRH)的氨基酸序列、MART-1/melan-A抗原(MART-1/Melan-A)的氨基酸序列、癌睾丸抗原(NY-ESO-1)、癌睾丸抗原II(NY-ESO-1)和PRAME。疫苗可以是包含编码酪氨酸酶(Tyr)、酪氨酸酶-相关蛋白1(TYRP1)、酪氨酸酶-相关蛋白2(TYRP2)、黑色素瘤-相关抗原4蛋白(MAGEA4)、生长激素释放激素(GHRH)的氨基酸序列、MART-1/melan-A抗原(MART-1/Melan-A)的氨基酸序列、癌睾丸抗原(NY-ESO-1)、癌睾丸抗原II(NY-ESO-1)、PRAME、病毒抗原或其组合的多核苷酸序列的DNA疫苗。病毒抗原可以是来自下列病毒的一种或多种抗原：乙型肝炎病毒(例如，核心蛋白和表面蛋白)、丙型肝炎病毒(例如，非结构蛋白(NS)34A(NS34A)、NS5A、NS5B、NS4B)和人乳头状瘤病毒(HPV)6、HPV 11、HPV 16和HPV 18。
(1)酪氨酸酶(Tyr)
本发明的疫苗可包含癌抗原酪氨酸酶(Tyr)、其片段或其变体。酪氨酸酶是具有酪氨酸羟化酶和多巴氧化酶催化活性的含铜酶，其可在微生物以及植物和动物组织中被发现。具体地，酪氨酸酶通过酚类诸如酪氨酸的氧化催化黑色素和其它色素的产生。TYR基因中的突变导致哺乳动物的眼皮肤白化病并且TYR基因的非病理多态性促成皮肤色素沉着的变化。
此外，在癌症或肿瘤诸如黑色素瘤中，酪氨酸酶可变得失调，从而导致增加的黑色素合成。因此，酪氨酸酶可以是与黑色素瘤相关的癌抗原。在罹患黑色素瘤的受试者中，酪氨酸酶可以是细胞毒性T细胞识别的靶。然而，在某些情况下，针对癌症或肿瘤(包括黑色素瘤)的免疫应答可被抑制，从而导致支持肿瘤形成和/或生长并从而疾病进展的微环境。
免疫抑制可通过髓源抑制性细胞(MDSC)来促进，所述细胞是未成熟巨噬细胞、粒细胞、树突细胞和髓系细胞的混合群体。所述髓系细胞可以骨髓祖代细胞和未成熟髓系细胞(IMC)的异质性群体。MDSC的标志物可包括Gr-1和CD11b的表达(即，Gr-1+和CD11b+细胞)。
MDSC的循环可因慢性感染而增加，并且MDSC群体的扩张可与自身免疫和炎症相关联。特别地，MDSC扩张(或在肿瘤或癌组织中的存在)可促进肿瘤生长和逃避免疫检测和/或调控，因此，MDSC可影响针对抗癌疫苗的免疫应答。
MDSC可受G-蛋白信号2(Rgs2)的调节剂调节，并且Rgs2可在源自肿瘤的MDSC中高度表达。Rgs2还可在多种细胞例如髓系细胞中广泛表达。源自荷瘤小鼠的MDSC可与源自非荷瘤小鼠的MDSC发挥不同的功能。一个这样的差异可以由MDSC分泌的趋化因子MCP-1的产生的上调。MCP-1可通过经由CCR2(在单核细胞、内皮细胞和T细胞上发现的G蛋白偶联受体(GPCR))的信号转导促进细胞迁移。因此、MCP-1可引起内皮细胞的迁移，从而促进血管形成。经由中和抗体阻断MCP-1可抑制血管生成，因此，可导致减少的肿瘤转移和增加的存活。因此、MCP-1可被当作血管生成因子。除了分泌MCP-1以外，MDSC还可分泌生长因子，从而进一步促进肿瘤生长。
所述Tyr抗原可诱导抗原特异性T细胞和/或高滴度抗体应答，从而诱导或引发针对表达该抗原的癌症或肿瘤或与所述癌症或肿瘤反应的免疫应答。在一些实施方案中，诱导或引发的免疫应答可以是细胞、体液或细胞和体液免疫应答。在一些实施方案中，诱导或引发的细胞免疫应答可包括干扰素-γ(IFN-γ)和/或肿瘤坏死因子α(TNF-α)的诱导或分泌。在其它实施方案中，诱导或引发的免疫应答可减少或抑制促进表达该抗原的肿瘤或癌症的生长的一种或多种免疫抑制因子，例如，但不限于下调MHC呈递的因子、上调抗原特异性调节性T细胞(Treg)的因子、PD-L1、FasL、细胞因子诸如IL-10和TFG-β、肿瘤相关巨噬细胞、肿瘤相关成纤维细胞、由免疫抑制细胞产生的可溶性因子、CTLA-4、PD-1、MDSC、MCP-1和免疫检查点分子，在下文中更详细地描述所述因子。
如本文中所表明的，Tyr抗原诱导抗原特异性T细胞和高滴度的针对癌细胞或肿瘤细胞(例如，黑色素瘤细胞)的抗体应答。特别地，Tyr抗原是通过诱导如下应答产生的免疫介导的清除的重要靶：(1)经由B细胞应答(以产生阻断单核细胞趋化蛋白-1(MCP-1)产生，从而延缓髓源抑制性细胞(MDSC)和抑制肿瘤生长的抗体)的体液免疫；(2)增加细胞毒性T淋巴细胞诸如CD8+(CTL)以攻击和杀死肿瘤细胞；(3)增加T辅助细胞应答；和(4)增加经由IFN-γ和TFN-α的炎症应答或优选地所有上述应答。因此，包含Tyr抗原(例如，共有Tyr抗原，在下文中将对其进行更详细描述)的疫苗提供了针对肿瘤形成和肿瘤生长的保护性免疫应答，因为这些疫苗通过减少在癌性组织或肿瘤组织中发现的MDSC的群体阻止免疫抑制并且通过减少MCP-1的产生或分泌来阻断癌性或肿瘤组织的血管形成。因此，任何用户可设计包括Tyr抗原的本发明的疫苗来提供针对肿瘤形成、肿瘤转移和肿瘤生长的广泛免疫。
Tyr抗原可包含使它们特别有效地作为可诱导针对其的抗-Tyr免疫应答的免疫原的蛋白质表位。Tyr抗原可包含全长翻译产物、其变体、其片段或其组合。Tyr抗原可包含共有蛋白。
可针对密码子使用和相应的RNA转录物优化编码共有Tyr抗原的核酸序列。编码共有Tyr抗原的核酸可以是针对表达而被优化的密码子和RNA。在一些实施方案中，编码共有Tyr抗原的核酸序列可包括Kozak序列(例如，GCC ACC)以增强翻译的效率。编码共有Tyr抗原的核酸可包括多个终止密码子(例如，TGATGA)以增强翻译终止的效率。
编码共有Tyr抗原的核酸还可编码免疫球蛋白E(IgE)前导序列。编码共有Tyr抗原的核酸可进一步编码IgE前导序列以使得IgE前导序列的氨基酸序列通过肽键连接于共有Tyr抗原的氨基酸序列。编码共有Tyr抗原的核酸还可包括编码IgE前导序列的核苷酸序列。在一些实施方案中，编码共有Tyr抗原的核酸不含或不含有编码IgE前导序列的核苷酸序列。
共有Tyr抗原可以是核酸序列SEQ ID NO:1，其编码氨基酸序列SEQ ID NO:2。SEQID NO:1编码连接于IgE前导序列的共有Tyr蛋白。可将共有Tyr蛋白连接于IgE前导序列和HA标签。在其它实施方案中，共有Tyr蛋白可以不含或不连接于IgE前导序列和/或HA标签。
在一些实施方案中，共有Tyr抗原可以是在SEQ ID NO:1中所示的核酸序列的完整长度上具有至少约80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的同一性的核酸序列。在其它实施方案中，共有Tyr抗原可以是编码在SEQ ID NO:2中所示的氨基酸序列的完整长度上具有至少约80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的同一性的氨基酸序列的核酸序列。共有Tyr抗原可以是在SEQ ID NO:2中所示的氨基酸序列的完整长度上具有至少约80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的同一性的氨基酸序列。
一些实施方案涉及编码与Tyr共有蛋白同源的蛋白、Tyr共有蛋白的免疫原性片段和同源蛋白的免疫原性片段的核酸序列。可提供编码与共有序列具有高达95％的同源性、与共有序列具有高达96％的同源性、与共有序列具有高达97％的同源性、与共有序列具有高达98％的同源性和与共有序列具有高达99％的同源性的免疫原性蛋白的此类核酸分子。同样地，还提供了编码本文中所示的免疫原性片段和与本文中所示的蛋白质同源的蛋白质的免疫原性片段的核酸序列。
一些实施方案涉及与本文中的核酸编码序列具有95％的同源性的编码免疫原性蛋白的核酸分子。一些实施方案涉及与本文中的核酸编码序列具有96％的同源性的编码免疫原性蛋白的核酸分子。一些实施方案涉及与本文中的核酸编码序列具有97％的同源性的编码免疫原性蛋白的核酸分子。一些实施方案涉及与本文中的核酸编码序列具有98％的同源性的编码免疫原性蛋白的核酸分子。一些实施方案涉及与本文中的核酸编码序列具有99％的同源性的编码免疫原性蛋白的核酸分子。在一些实施方案中，具有与本文中公开的共有蛋白的编码序列同源的本文中公开的编码序列的核酸分子包括连接于编码本文中公开的同源蛋白序列的编码序列的5'末端的编码IgE前导序列的序列。
一些实施方案涉及编码与全长Tyr共有蛋白具特定百分比同一性的蛋白质、Tyr共有蛋白的免疫原性片段和与Tyr共有蛋白具有同一性的蛋白质的免疫原性片段的核酸序列。可提供编码与全长Tyr共有序列具有高达80％的同一性、与全长共有序列具有高达85％的同一性、与全长Tyr共有序列具有高达90％的同一性、与全长Tyr共有序列具有高达91％的同一性、与全长Tyr共有序列具有高达92％的同一性、与全长Tyr共有序列具有高达93％的同一性、与全长Tyr共有序列具有高达94％的同一性、与全长Tyr共有序列具有高达95％的同一性、与全长Tyr共有序列具有高达96％的同一性、与全长Tyr共有序列具有高达97％的同一性、与全长Tyr共有序列具有高达98％的同一性、与全长Tyr共有序列具有高达99％的同一性的免疫原性蛋白的此类核酸分子。同样地，还提供了编码本文中所示的免疫原性片段和与本文中所示的Tyr蛋白具有如上指定的相似百分比同一性的蛋白质的免疫原性片段的核酸序列。
在一些实施方案中，核酸序列不含编码前导序列的编码序列。在一些实施方案中，核酸序列不含编码IgE前导序列的编码序列。
一些实施方案涉及SEQ ID NO:1的片段。片段可以是SEQ ID NO:1的至少10％、至少15％、至少20％、至少25％、至少30％、至少35％、至少40％、至少45％、至少50％、至少55％至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％。片段可与SEQ ID NO:1的片段具有至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％的同源性。片段可与SEQ ID NO:1的片段具有至少80％、至少85％、至少90％至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％的同一性。在一些实施方案中，片段包括编码前导序列，诸如例如，免疫球蛋白前导序列，诸如IgE前导序列的序列。在一些实施方案中，片段不含编码前导序列的编码序列。在一些实施方案中，片段不含编码前导序列，诸如例如，IgE前导序列的编码序列。
此外，共有Tyr蛋白的氨基酸序列为SEQ ID NO:2。连接于IgE前导序列的共有Tyr蛋白的氨基酸序为SEQ ID NO:2。连接于IgE前导序列的共有Tyr蛋白的氨基酸序列可连接于HA标签。
一些实施方案涉及与SEQ ID NO:2同源的蛋白质。一些实施方案涉及与SEQ IDNO:2中所示的共有蛋白序列具有95％的同源性的免疫原性蛋白。一些实施方案涉及与SEQID NO:2中所示的共有蛋白序列具有96％的同源性的免疫原性蛋白。一些实施方案涉及与SEQ ID NO:2中所示的共有蛋白序列具有97％的同源性的免疫原性蛋白。一些实施方案涉及与SEQ ID NO:2中所示的共有蛋白序列具有98％的同源性的免疫原性蛋白。一些实施方案涉及与SEQ ID NO:2中所示的共有蛋白序列具有99％的同源性的免疫原性蛋白。
一些实施方案涉及与SEQ ID NO:2相同的蛋白质。一些实施方案涉及具有与如SEQID NO:2中所示的全长共有氨基酸序列具有80％的同一性的氨基酸序列的免疫原性蛋白。一些实施方案涉及具有与如SEQ ID NO:2中所示的全长共有氨基酸序列具有85％的同一性的氨基酸序列的免疫原性蛋白。一些实施方案涉及具有与如SEQ ID NO:2中所示的全长共有氨基酸序列具有90％的同一性的氨基酸序列的免疫原性蛋白。一些实施方案涉及具有与如SEQ ID NO:2中所示的全长共有氨基酸序列具有91％的同一性的氨基酸序列的免疫原性蛋白。一些实施方案涉及具有与如SEQ ID NO:2中所示的全长共有氨基酸序列具有92％的同一性的氨基酸序列的免疫原性蛋白。一些实施方案涉及具有与如SEQ ID NO:2中所示的全长共有氨基酸序列具有93％的同一性的氨基酸序列的免疫原性蛋白。一些实施方案涉及具有与如SEQ ID NO:2中所示的全长共有氨基酸序列具有94％的同一性的氨基酸序列的免疫原性蛋白。一些实施方案涉及具有与如SEQ ID NO:2中所示的全长共有氨基酸序列具有95％的同一性的氨基酸序列的免疫原性蛋白。一些实施方案涉及具有与如SEQ ID NO:2中所示的全长共有氨基酸序列具有96％的同一性的氨基酸序列的免疫原性蛋白。一些实施方案涉及具有与如SEQ ID NO:2中所示的全长共有氨基酸序列具有97％的同一性的氨基酸序列的免疫原性蛋白。一些实施方案涉及具有与如SEQ ID NO:2中所示的全长共有氨基酸序列具有98％的同一性的氨基酸序列的免疫原性蛋白。一些实施方案涉及具有与如SEQ IDNO:2中所示的全长共有氨基酸序列具有99％的同一性的氨基酸序列的免疫原性蛋白。
在一些实施方案中，蛋白质不含前导序列。在一些实施方案中，蛋白质不含IgE前导序列。共有蛋白的片段可包含共有蛋白的至少10％、至少15％、至少20％、至少25％、至少30％、至少35％、至少40％、至少45％、至少50％、至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％。可提供SEQ ID NO:2的免疫原性片段。免疫原性片段可包含SEQ ID NO:2的至少10％、至少15％、至少20％、至少25％、至少30％、至少35％、至少40％、至少45％、至少50％、至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％。在一些实施方案中，片段包括前导序列，诸如例如，免疫球蛋白前导序列，诸如IgE前导序列。在一些实施方案中，片段不含前导序列。在一些实施方案中，片段不含前导序列，诸如例如，IgE前导序列。
可提供具有与SEQ ID NO:2的免疫原性片段同源的氨基酸序列的蛋白质的免疫原性片段。此类免疫原性片段可包含与SEQ ID NO:2具有95％或更大的同源性的蛋白质的至少10％、至少15％、至少20％、至少25％、至少30％、至少35％、至少40％、至少45％、至少50％、至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％。一些实施方案涉及与本文中的共有蛋白序列的免疫原性片段具有96％的同源性的免疫原性片段。一些实施方案涉及与本文中的共有蛋白序列的免疫原性片段具有97％的同源性的免疫原性片段。一些实施方案涉及与本文中的共有蛋白序列的免疫原性片段具有98％的同源性的免疫原性片段。一些实施方案涉及与本文中的共有蛋白序列的免疫原性片段具有99％的同源性的免疫原性片段。在一些实施方案中，片段包括前导序列，诸如例如，免疫球蛋白前导序列，诸如IgE前导序列。在一些实施方案中，片段不含前导序列。在一些实施方案中，片段不含前导序列，诸如例如，IgE前导序列。
可提供具有与SEQ ID NO:2的免疫原性片段相同的氨基酸序列的蛋白质的免疫原性片段。此类免疫原性片段可包含与SEQ ID NO:2中所示的氨基酸序列具有80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％的同一性的蛋白质的至少10％、至少15％、至少20％、至少25％、至少30％、至少35％、至少40％、至少45％、至少50％、至少55％至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％。在一些实施方案中，片段包括前导序列，诸如例如，免疫球蛋白前导序列，诸如IgE前导序列。在一些实施方案中，片段不含前导序列。在一些实施方案中，片段不含前导序列，诸如例如，IgE前导序列。
如本文中针对将信号肽或前导序列连接于蛋白质的N末端所指出的，信号肽/前导序列替代蛋白质的N末端甲硫氨酸，所述N末端甲硫氨酸由编码无信号肽编码序列的编码所述蛋白质的核酸序列的起始密码子编码。
(2)酪氨酸酶-相关蛋白1(TYRP1)
本发明的疫苗可包含癌抗原酪氨酸酶-相关蛋白1(TYRP1)、其片段或其变体。由TYRP1基因编码的TYRP1为75kDa跨膜糖蛋白并且在正常和恶性黑素细胞及黑色素瘤细胞中表达。与酪氨酸酶一样，TYRP1含有可结合小眼症转录因子(MITF)的经修饰的(被称为)M盒，其在黑素细胞内在激活色素沉着、细胞增殖和分化中起中心作用。TYRP1可帮助稳定酪氨酸酶并且可形成异二聚体，其可通过减弱酪氨酸酶-介导的细胞毒性来阻止黑素细胞的成熟前死亡。
如上文中针对酪氨酸酶所描述的，酪氨酸酶-相关蛋白1(TYRP-1)还可参与黑素细胞的黑色素和色素机器的合成，并且可被患有黑色素瘤的受试者的免疫系统识别。因此，TYRP-1可以是与黑色素瘤相关的抗原。
TRYP-1抗原可诱导抗原特异性T细胞和/或高滴度抗体应答，从而诱导或引发对表达该抗原的癌症或肿瘤或与所述癌症或肿瘤反应的免疫应答。在一些实施方案中，诱导或引发的免疫应答可以是细胞免疫应答、体液免疫应答或细胞和体液免疫应答。在一些实施方案中，诱导或引发的细胞免疫应答可包括干扰素-γ(IFN-γ)和/或肿瘤坏死因子α(TNF-α)的诱导或分泌。在其它实施方案中，诱导或引发的免疫应答可减少或抑制促进表达该抗原的肿瘤或癌症的生长的一种或多种免疫抑制因子，例如，但不限于下调MHC呈递的因子、上调抗原特异性调节性T细胞(Treg)的因子、PD-L1、FasL、细胞因子诸如IL-10和TFG-β、肿瘤相关巨噬细胞、肿瘤相关成纤维细胞、由免疫抑制细胞产生的可溶性因子、CTLA-4、PD-1、MDSC、MCP-1和免疫检查点分子，在下文中更详细地描述所述因子。
TYRP-1抗原可包含使它们特别有效地作为可诱导针对其的抗-TYRP-1免疫应答的免疫原的蛋白质表位。TYRP-1抗原可包含全长翻译产物、其变体、其片段或其组合。TYRP-1抗原可包含共有蛋白。
可针对密码子使用和相应的RNA转录物优化编码共有TYRP-1抗原的核酸序列。编码共有TYRP-1抗原的核酸可以是针对表达而被优化的密码子和RNA。在一些实施方案中，编码共有TYRP-1抗原的核酸序列可包括Kozak序列(例如，GCC ACC)以增强翻译的效率。编码共有TYRP-1抗原的核酸可包括多个终止密码子(例如，TGA TGA)以增强翻译终止的效率。
编码共有TYRP-1抗原的核酸还可编码免疫球蛋白E(IgE)前导序列。编码共有TYRP-1抗原的核酸可进一步编码IgE前导序列以使得IgE前导序列的氨基酸序列通过肽键连接于共有TYRP-1抗原的氨基酸序列。编码共有TYRP-1抗原的核酸还可包括编码IgE前导序列的核苷酸序列。在一些实施方案中，编码共有TYRP-1抗原的核酸不含或不含有编码IgE前导序列的核苷酸序列。
共有TYRP-1抗原可以是核酸序列SEQ ID NO:3，其编码氨基酸序列SEQ ID NO:4。SEQ ID NO:3编码连接于IgE前导序列的共有TYRP-1蛋白。可将共有TYRP-1蛋白连接于IgE前导序列和HA标签。在其它实施方案中，共有TYRP-1蛋白可以不含或不连接于IgE前导序列和/或HA标签。
在一些实施方案中，共有TYRP-1抗原可以是在SEQ ID NO:3中所示的核酸序列的完整长度上具有至少约80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的同一性的核酸序列。在其它实施方案中，共有TYRP-1抗原可以是编码在SEQ ID NO:4中所示的氨基酸序列的完整长度上具有至少约80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的同一性的氨基酸序列的核酸序列。共有TYRP-1抗原可以是在SEQ ID NO:4中所示的氨基酸序列的完整长度上具有至少约80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的同一性的氨基酸序列。
一些实施方案涉及编码与TYRP-1共有蛋白同源的蛋白、TYRP-1共有蛋白的免疫原性片段和同源蛋白的免疫原性片段的核酸序列。可提供编码与共有序列具有高达95％的同源性、与共有序列具有高达96％的同源性、与共有序列具有高达97％的同源性、与共有序列具有高达98％的同源性和与共有序列具有高达99％的同源性的免疫原性蛋白的此类核酸分子。同样地，还提供了编码本文中所示的免疫原性片段和与本文中所示的蛋白质同源的蛋白质的免疫原性片段的核酸序列。
一些实施方案涉及与本文中的核酸编码序列具有95％的同源性的编码免疫原性蛋白的核酸分子。一些实施方案涉及与本文中的核酸编码序列具有96％的同源性的编码免疫原性蛋白的核酸分子。一些实施方案涉及与本文中的核酸编码序列具有97％的同源性的编码免疫原性蛋白的核酸分子。一些实施方案涉及与本文中的核酸编码序列具有98％的同源性的编码免疫原性蛋白的核酸分子。一些实施方案涉及与本文中的核酸编码序列具有99％的同源性的编码免疫原性蛋白的核酸分子。在一些实施方案中，具有与本文中公开的共有蛋白的编码序列同源的本文中公开的编码序列的核酸分子包括连接于编码本文中公开的同源蛋白序列的编码序列的5'末端的编码IgE前导序列的序列。
一些实施方案涉及编码与全长TYRP-1共有蛋白具有特定百分比同一性的蛋白质、TYRP-1共有蛋白的免疫原性片段和与TYRP-1共有蛋白具有同一性的蛋白质的免疫原性片段的核酸序列。可提供编码与全长TYRP-1共有序列具有高达80％的同一性、与全长TYRP-1共有序列具有高达85％的同一性、与全长TYRP-1共有序列具有高达90％的同一性、与全长TYRP-1共有序列具有高达91％的同一性、与全长TYRP-1共有序列具有高达92％的同一性、与全长TYRP-1共有序列具有高达93％的同一性、与全长TYRP-1共有序列具有高达94％的同一性、与全长TYRP-1共有序列具有高达95％的同一性、与全长TYRP-1共有序列具有高达96％的同一性、与全长TYRP-1共有序列具有高达97％的同一性、与全长TYRP-1共有序列具有高达98％的同一性和与全长TYRP-1共有序列具有高达99％的同一性的免疫原性蛋白的此类核酸分子。同样地，还提供了编码本文中所示的免疫原性片段和与本文中所示的TYRP-1蛋白具有如上指定的相似百分比同一性的蛋白质的免疫原性片段的。
在一些实施方案中，核酸序列不含编码前导序列的编码序列。在一些实施方案中，核酸序列不含编码IgE前导序列的编码序列。
一些实施方案涉及SEQ ID NO:3的片段。片段可以是SEQ ID NO:3的至少10％、至少15％、至少20％、至少25％、至少30％、至少35％、至少40％、至少45％、至少50％、至少55％至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％。片段可与SEQ ID NO:3的片段具有至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％的同源性。片段可与SEQ ID NO:3的片段具有至少80％、至少85％、至少90％至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％的同一性。在一些实施方案中，片段包括编码前导序列，诸如例如，免疫球蛋白前导序列，诸如IgE前导序列的序列。在一些实施方案中，片段不含编码前导序列的编码序列。在一些实施方案中，片段不含编码前导序列，诸如例如，IgE前导序列的编码序列。
此外，共有TYRP-1蛋白的氨基酸序列为SEQ ID NO:4。连接于IgE前导序列的共有TYRP-1蛋白的氨基酸序为SEQ ID NO:4。连接于IgE前导序列的共有TYRP-1蛋白的氨基酸序列可连接于HA标签。
一些实施方案涉及与SEQ ID NO:4同源的蛋白质。一些实施方案涉及与SEQ IDNO:4中所示的共有蛋白序列具有95％的同源性的免疫原性蛋白。一些实施方案涉及与SEQID NO:4中所示的共有蛋白序列具有96％的同源性的免疫原性蛋白。一些实施方案涉及与SEQ ID NO:4中所示的共有蛋白序列具有97％的同源性的免疫原性蛋白。一些实施方案涉及与SEQ ID NO:4中所示的共有蛋白序列具有98％的同源性的免疫原性蛋白。一些实施方案涉及与SEQ ID NO:4中所示的共有蛋白序列具有99％的同源性的免疫原性蛋白。
一些实施方案涉及与SEQ ID NO:4相同的蛋白质。一些实施方案涉及具有与如SEQID NO:4中所示的全长共有氨基酸序列具有80％的同一性的氨基酸序列的免疫原性蛋白。一些实施方案涉及具有与如SEQ ID NO:4中所示的全长共有氨基酸序列具有85％的同一性的氨基酸序列的免疫原性蛋白。一些实施方案涉及具有与如SEQ ID NO:4中所示的全长共有氨基酸序列具有90％的同一性的氨基酸序列的免疫原性蛋白。一些实施方案涉及具有与如SEQ ID NO:4中所示的全长共有氨基酸序列具有91％的同一性的氨基酸序列的免疫原性蛋白。一些实施方案涉及具有与如SEQ ID NO:4中所示的全长共有氨基酸序列具有92％的同一性的氨基酸序列的免疫原性蛋白。一些实施方案涉及具有与如SEQ ID NO:4中所示的全长共有氨基酸序列具有93％的同一性的氨基酸序列的免疫原性蛋白。一些实施方案涉及具有与如SEQ ID NO:4中所示的全长共有氨基酸序列具有94％的同一性的氨基酸序列的免疫原性蛋白。一些实施方案涉及具有与如SEQ ID NO:4中所示的全长共有氨基酸序列具有95％的同一性的氨基酸序列的免疫原性蛋白。一些实施方案涉及具有与如SEQ ID NO:4中所示的全长共有氨基酸序列具有96％的同一性的氨基酸序列的免疫原性蛋白。一些实施方案涉及具有与如SEQ ID NO:4中所示的全长共有氨基酸序列具有97％的同一性的氨基酸序列的免疫原性蛋白。一些实施方案涉及具有与如SEQ ID NO:4中所示的全长共有氨基酸序列具有98％的同一性的氨基酸序列的免疫原性蛋白。一些实施方案涉及具有与如SEQ IDNO:4中所示的全长共有氨基酸序列具有99％的同一性的氨基酸序列的免疫原性蛋白。
在一些实施方案中，蛋白质不含前导序列。在一些实施方案中，蛋白质不含IgE前导序列。共有蛋白的片段可包含共有TYRP-1蛋白的至少10％、至少15％、至少20％、至少25％、至少30％、至少35％、至少40％、至少45％、至少50％、至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％。可提供SEQ ID NO:4的免疫原性片段。免疫原性片段可包含SEQ ID NO:4的至少10％、至少15％、至少20％、至少25％、至少30％、至少35％、至少40％、至少45％、至少50％、至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％。在一些实施方案中，片段包括前导序列，诸如例如，免疫球蛋白前导序列，诸如IgE前导序列。在一些实施方案中，片段不含前导序列。在一些实施方案中，片段不含前导序列，诸如例如，IgE前导序列。
可提供具有与SEQ ID NO:4的免疫原性片段同源的氨基酸序列的蛋白质的免疫原性片段。此类免疫原性片段可包含与SEQ ID NO:4具有95％或更大的同源性的蛋白质的至少10％、至少15％、至少20％、至少25％、至少30％、至少35％、至少40％、至少45％、至少50％、至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％。一些实施方案涉及与本文中的共有蛋白序列的免疫原性片段具有96％的同源性的免疫原性片段。一些实施方案涉及与本文中的共有蛋白序列的免疫原性片段具有97％的同源性的免疫原性片段。一些实施方案涉及与本文中的共有蛋白序列的免疫原性片段具有98％的同源性的免疫原性片段。一些实施方案涉及与本文中的共有蛋白序列的免疫原性片段具有99％的同源性的免疫原性片段。在一些实施方案中，片段包括前导序列，诸如例如，免疫球蛋白前导序列，诸如IgE前导序列。在一些实施方案中，片段不含前导序列。在一些实施方案中，片段不含前导序列，诸如例如，IgE前导序列。
可提供具有与SEQ ID NO:4的免疫原性片段相同的氨基酸序列的蛋白质的免疫原性片段。此类免疫原性片段可包含与SEQ ID NO:4中所示的氨基酸序列具有80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％的同一性的蛋白质的至少10％、至少15％、至少20％、至少25％、至少30％、至少35％、至少40％、至少45％、至少50％、至少55％至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％。在一些实施方案中，片段包括前导序列，诸如例如，免疫球蛋白前导序列，诸如IgE前导序列。在一些实施方案中，片段不含前导序列。在一些实施方案中，片段不含前导序列，诸如例如，IgE前导序列。
如本文中针对将信号肽或前导序列连接于蛋白质的N末端所指出的，信号肽/前导序列替代蛋白质的N末端甲硫氨酸，所述N末端甲硫氨酸由编码无信号肽编码序列的编码所述蛋白质的核酸序列的起始密码子编码。
(3)酪氨酸酶-相关蛋白2(TYRP2)
本发明的疫苗可包含癌抗原酪氨酸酶-相关蛋白2(TYRP2；也称为多巴色素互变异构酶(DCT))、其片段或其变体。由TYRP2/DCT基因编码的TYRP2/DCT为由519个氨基酸组成的蛋白并且在正常和恶性黑素细胞及黑色素瘤细胞中表达。TYRP2/DCT是良好表征的黑素细胞特异性酶，其在黑素细胞中与酪氨酸酶和TYRP1结合，在L-酪氨酸至黑色素的转化中起作用。DCT特异性催化黑色素前体L-多巴色素至5,6-二氢吲哚-2-羧酸(DHICA)的互变异构化，所述5,6-二氢吲哚-2-羧酸随后被TYRP1(如上所论述)氧化以形成真黑色素。研究已显示TYRP2/DCT可以是黑色素瘤细胞中耐药性的介导者，具有对于DNA损伤剂的特异性。由于经常报导TYRP2/DCT在黑色素瘤中高度表达，因此该黑素细胞特异性酶起着促成黑色素瘤的针对各种抗癌DNA损伤药物的固有耐药性表型的重要作用。
如上文中针对酪氨酸酶所描述的，酪氨酸酶-相关蛋白2(TYRP-2)还可参与黑色素的合成，并且可被患有黑色素瘤的受试者的免疫系统识别。此外，TYRP-2可介导黑色素瘤细胞的耐药性。因此，TYRP-2可以是与黑色素瘤相关的抗原。
TRYP-2抗原可诱导抗原特异性T细胞和/或高滴度抗体应答，从而诱导或引发对表达该抗原的癌症或肿瘤或与所述癌症或肿瘤反应的免疫应答。在一些实施方案中，诱导或引发的免疫应答可以是细胞免疫应答、体液免疫应答或细胞和体液免疫应答。在一些实施方案中，诱导或引发的细胞免疫应答可包括干扰素-γ(IFN-γ)和/或肿瘤坏死因子α(TNF-α)的诱导或分泌。在其它实施方案中，诱导或引发的免疫应答可减少或抑制促进表达该抗原的肿瘤或癌症的生长的一种或多种免疫抑制因子，例如，但不限于下调MHC呈递的因子、上调抗原特异性调节性T细胞(Treg)的因子、PD-L1、FasL、细胞因子诸如IL-10和TFG-β、肿瘤相关巨噬细胞、肿瘤相关成纤维细胞、由免疫抑制细胞产生的可溶性因子、CTLA-4、PD-1、MDSC、MCP-1和免疫检查点分子，在下文中更详细地描述所述因子。
TYRP2抗原可包含使它们特别有效地作为可诱导针对其的抗-TYRP2免疫应答的免疫原的蛋白质表位。TYRP2抗原可包含全长翻译产物、其变体、其片段或其组合。TYRP2抗原可包含共有蛋白。
可针对密码子使用和相应的RNA转录物优化编码共有TYRP2抗原的核酸序列。编码共有TYRP2抗原的核酸可以是针对表达而被优化的密码子和RNA。在一些实施方案中，编码共有TYRP2抗原的核酸序列可包括Kozak序列(例如，GCC ACC)以增强翻译的效率。编码共有TYRP2抗原的核酸可包括多个终止密码子(例如，TGATGA)以增强翻译终止的效率。
编码共有TYRP2抗原的核酸还可编码免疫球蛋白E(IgE)前导序列。编码共有TYRP2抗原的核酸可进一步编码IgE前导序列以使得IgE前导序列的氨基酸序列通过肽键连接于共有TYRP2抗原的氨基酸序列。编码共有TYRP2抗原的核酸还可包括编码IgE前导序列的核苷酸序列。在一些实施方案中，编码共有TYRP2抗原的核酸不含或不含有编码IgE前导序列的核苷酸序列。
共有TYRP2抗原可以是核酸序列SEQ ID NO:5，其编码氨基酸序列SEQ ID NO:6。SEQ ID NO:5编码连接于IgE前导序列的共有TYRP2蛋白。可将共有TYRP2蛋白连接于IgE前导序列和HA标签。在其它实施方案中，共有TYRP2蛋白可以不含或不连接于IgE前导序列和/或HA标签。
在一些实施方案中，共有TYRP2抗原可以是在SEQ ID NO:5中所示的核酸序列的完整长度上具有至少约80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的同一性的核酸序列。在其它实施方案中，共有TYRP2抗原可以是编码在SEQ ID NO:6中所示的氨基酸序列的完整长度上具有至少约80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的同一性的氨基酸序列的核酸序列。共有TYRP2抗原可以是在SEQ ID NO:6中所示的氨基酸序列的完整长度上具有至少约80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的同一性的氨基酸序列。
一些实施方案涉及编码与TYRP2共有蛋白同源的蛋白、TYRP2共有蛋白的免疫原性片段和同源蛋白的免疫原性片段的核酸序列。可提供编码与共有序列具有高达95％的同源性、与共有序列具有高达96％的同源性、与共有序列具有高达97％的同源性、与共有序列具有高达98％的同源性和与共有序列具有高达99％的同源性的免疫原性蛋白的此类核酸分子。同样地，还提供了编码本文中所示的免疫原性片段和与本文中所示的蛋白质同源的蛋白质的免疫原性片段的核酸序列。
一些实施方案涉及与本文中的核酸编码序列具有95％的同源性的编码免疫原性蛋白的核酸分子。一些实施方案涉及与本文中的核酸编码序列具有96％的同源性的编码免疫原性蛋白的核酸分子。一些实施方案涉及与本文中的核酸编码序列具有97％的同源性的编码免疫原性蛋白的核酸分子。一些实施方案涉及与本文中的核酸编码序列具有98％的同源性的编码免疫原性蛋白的核酸分子。一些实施方案涉及与本文中的核酸编码序列具有99％的同源性的编码免疫原性蛋白的核酸分子。在一些实施方案中，具有与本文中公开的共有蛋白的编码序列同源的本文中公开的编码序列的核酸分子包括连接于编码本文中公开的同源蛋白序列的编码序列的5'末端的编码IgE前导序列的序列。
一些实施方案涉及编码与全长TYRP2共有蛋白具特定百分比同一性的蛋白质、TYRP2共有蛋白的免疫原性片段和与TYRP2共有蛋白具有同一性的蛋白质的免疫原性片段的核酸序列。可提供编码与全长TYRP2共有序列具有高达80％的同一性、与全长共有序列具有高达85％的同一性、与全长TYRP2共有序列具有高达90％的同一性、与全长TYRP2共有序列具有高达91％的同一性、与全长TYRP2共有序列具有高达92％的同一性、与全长TYRP2共有序列具有高达93％的同一性、与全长TYRP2共有序列具有高达94％的同一性、与全长TYRP2共有序列具有高达95％的同一性、与全长TYRP2共有序列具有高达96％的同一性、与全长TYRP2共有序列具有高达97％的同一性、与全长TYRP2共有序列具有高达98％的同一性和与全长TYRP2共有序列具有高达99％的同一性的免疫原性蛋白的此类核酸分子。同样地，还提供了编码本文中所示的免疫原性片段和与本文中所示的TYRP2蛋白具有如上指定的相似百分比同一性的蛋白质的免疫原性片段的核酸序列。
在一些实施方案中，核酸序列不含编码前导序列的编码序列。在一些实施方案中，核酸序列不含编码IgE前导序列的编码序列。
一些实施方案涉及SEQ ID NO:5的片段。片段可以是SEQ ID NO:5的至少10％、至少15％、至少20％、至少25％、至少30％、至少35％、至少40％、至少45％、至少50％、至少55％至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％。片段可与SEQ ID NO:5的片段具有至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％的同源性。片段可与SEQ ID NO:5的片段具有至少80％、至少85％、至少90％至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％的同一性。在一些实施方案中，片段包括编码前导序列，诸如例如，免疫球蛋白前导序列，诸如IgE前导序列的序列。在一些实施方案中，片段不含编码前导序列的编码序列。在一些实施方案中，片段不含编码前导序列，诸如例如，IgE前导序列的编码序列。
此外，共有TYRP2蛋白的氨基酸序列为SEQ ID NO:6。连接于IgE前导序列的共有TYRP2蛋白的氨基酸序为SEQ ID NO:6。连接于IgE前导序列的共有TYRP2蛋白的氨基酸序列可连接于HA标签。
一些实施方案涉及与SEQ ID NO:2同源的蛋白质。一些实施方案涉及与SEQ IDNO:6中所示的共有蛋白序列具有95％的同源性的免疫原性蛋白。一些实施方案涉及与SEQID NO:6中所示的共有蛋白序列具有96％的同源性的免疫原性蛋白。一些实施方案涉及与SEQ ID NO:6中所示的共有蛋白序列具有97％的同源性的免疫原性蛋白。一些实施方案涉及与SEQ ID NO:6中所示的共有蛋白序列具有98％的同源性的免疫原性蛋白。一些实施方案涉及与SEQ ID NO:6中所示的共有蛋白序列具有99％的同源性的免疫原性蛋白。
一些实施方案涉及与SEQ ID NO:6相同的蛋白质。一些实施方案涉及具有与如SEQID NO:6中所示的全长共有氨基酸序列具有80％的同一性的氨基酸序列的免疫原性蛋白。一些实施方案涉及具有与如SEQ ID NO:6中所示的全长共有氨基酸序列具有85％的同一性的氨基酸序列的免疫原性蛋白。一些实施方案涉及具有与如SEQ ID NO:6中所示的全长共有氨基酸序列具有90％的同一性的氨基酸序列的免疫原性蛋白。一些实施方案涉及具有与如SEQ ID NO:6中所示的全长共有氨基酸序列具有91％的同一性的氨基酸序列的免疫原性蛋白。一些实施方案涉及具有与如SEQ ID NO:6中所示的全长共有氨基酸序列具有92％的同一性的氨基酸序列的免疫原性蛋白。一些实施方案涉及具有与如SEQ ID NO:6中所示的全长共有氨基酸序列具有93％的同一性的氨基酸序列的免疫原性蛋白。一些实施方案涉及具有与如SEQ ID NO:6中所示的全长共有氨基酸序列具有94％的同一性的氨基酸序列的免疫原性蛋白。一些实施方案涉及具有与如SEQ ID NO:6中所示的全长共有氨基酸序列具有95％的同一性的氨基酸序列的免疫原性蛋白。一些实施方案涉及具有与如SEQ ID NO:6中所示的全长共有氨基酸序列具有96％的同一性的氨基酸序列的免疫原性蛋白。一些实施方案涉及具有与如SEQ ID NO:6中所示的全长共有氨基酸序列具有97％的同一性的氨基酸序列的免疫原性蛋白。一些实施方案涉及具有与如SEQ ID NO:6中所示的全长共有氨基酸序列具有98％的同一性的氨基酸序列的免疫原性蛋白。一些实施方案涉及具有与如SEQ IDNO:6中所示的全长共有氨基酸序列具有99％的同一性的氨基酸序列的免疫原性蛋白。
在一些实施方案中，蛋白质不含前导序列。在一些实施方案中，蛋白质不含IgE前导序列。共有蛋白的片段可包含共有蛋白的至少10％、至少15％、至少20％、至少25％、至少30％、至少35％、至少40％、至少45％、至少50％、至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％。可提供SEQ ID NO:6的免疫原性片段。免疫原性片段可包含SEQ ID NO:6的至少10％、至少15％、至少20％、至少25％、至少30％、至少35％、至少40％、至少45％、至少50％、至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％。在一些实施方案中，片段包括前导序列，诸如例如，免疫球蛋白前导序列，诸如IgE前导序列。在一些实施方案中，片段不含前导序列。在一些实施方案中，片段不含前导序列，诸如例如，IgE前导序列。
可提供具有与SEQ ID NO:6的免疫原性片段同源的氨基酸序列的蛋白质的免疫原性片段。此类免疫原性片段可包含与SEQ ID NO:6具有95％或更大的同源性的蛋白质的至少10％、至少15％、至少20％、至少25％、至少30％、至少35％、至少40％、至少45％、至少50％、至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％。一些实施方案涉及与本文中的共有蛋白序列的免疫原性片段具有96％的同源性的免疫原性片段。一些实施方案涉及与本文中的共有蛋白序列的免疫原性片段具有97％的同源性的免疫原性片段。一些实施方案涉及与本文中的共有蛋白序列的免疫原性片段具有98％的同源性的免疫原性片段。一些实施方案涉及与本文中的共有蛋白序列的免疫原性片段具有99％的同源性的免疫原性片段。在一些实施方案中，片段包括前导序列，诸如例如，免疫球蛋白前导序列，诸如IgE前导序列。在一些实施方案中，片段不含前导序列。在一些实施方案中，片段不含前导序列，诸如例如，IgE前导序列。
可提供具有与SEQ ID NO:6的免疫原性片段相同的氨基酸序列的蛋白质的免疫原性片段。此类免疫原性片段可包含与SEQ ID NO:6中所示的氨基酸序列具有80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％的同一性的蛋白质的至少10％、至少15％、至少20％、至少25％、至少30％、至少35％、至少40％、至少45％、至少50％、至少55％至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％。在一些实施方案中，片段包括前导序列，诸如例如，免疫球蛋白前导序列，诸如IgE前导序列。在一些实施方案中，片段不含前导序列。在一些实施方案中，片段不含前导序列，诸如例如，IgE前导序列。
如本文中针对将信号肽或前导序列连接于蛋白质的N末端所指出的，信号肽/前导序列替代蛋白质的N末端甲硫氨酸，所述N末端甲硫氨酸由编码无信号肽编码序列的编码所述蛋白质的核酸序列的起始密码子编码。
(4)黑色素瘤-相关抗原4(MAGEA4)
本发明的疫苗可包含癌抗原黑色素瘤-相关抗原4(MAGEA4)、其片段或其变体。由MAGE-A4基因编码的MAGE-A4是由317个氨基酸组成的蛋白质，并且在雄性生殖细胞和不同组织学类型诸如胃肠癌、食管癌和肺癌的肿瘤细胞中表达。MAGE-A4结合癌蛋白Gankyrin。该MAGE-A4特异性结合由其C-末端介导。研究已显示外源性MAGE-A4可在体外部分抑制过表达Gankyrin的细胞的不依赖于贴壁的生长，并且在裸鼠中抑制从这些细胞形成迁移的肿瘤。该抑制依赖于MAGE-A4与Gankyrin之间的结合，从而表明Gankyrin与MAGE-A4之间的相互作用抑制Gankyrin-介导的癌发生。肿瘤组织中的MAGE表达可能不是原因，而是肿瘤发生的结果，并且MAGE基因参与通过靶向早期肿瘤细胞(以进行破坏)的免疫过程。
黑色素瘤-相关抗原4蛋白(MAGEA4)可参与胚胎发育以及肿瘤转化和/或进展。MAGEA4通常在睾丸和胎盘中表达。然而，MAGEA4可在许多不同类型的肿瘤例如黑色素瘤、头颈鳞状细胞癌、肺癌和乳腺癌中表达。因此，MAGEA4可以是与多种肿瘤相关的抗原。
MAGEA4抗原可诱导抗原特异性T细胞和/或高滴度抗体应答，从而诱导或引发对表达该抗原的癌症或肿瘤或与所述癌症或肿瘤反应的免疫应答。在一些实施方案中，诱导或引发的免疫应答可以是细胞免疫应答、体液免疫应答或细胞和体液免疫应答。在一些实施方案中，诱导或引发的细胞免疫应答可包括干扰素-γ(IFN-γ)和/或肿瘤坏死因子α(TNF-α)的诱导或分泌。在其它实施方案中，诱导或引发的免疫应答可减少或抑制促进表达该抗原的肿瘤或癌症的生长的一种或多种免疫抑制因子，例如，但不限于下调MHC呈递的因子、上调抗原特异性调节性T细胞(Treg)的因子、PD-L1、FasL、细胞因子诸如IL-10和TFG-β、肿瘤相关巨噬细胞、肿瘤相关成纤维细胞、由免疫抑制细胞产生的可溶性因子、CTLA-4、PD-1、MDSC、MCP-1和免疫检查点分子，在下文中更详细地描述所述因子。
MAGEA4抗原可包含使它们特别有效地作为可诱导针对其的抗-MAGEA4免疫应答的免疫原的蛋白质表位。MAGEA4抗原可包含全长翻译产物、其变体、其片段或其组合。MAGEA4抗原可包含共有蛋白。
可针对密码子使用和相应的RNA转录物优化编码共有MAGEA4抗原的核酸序列。编码共有MAGEA4抗原的核酸可以是针对表达而被优化的密码子和RNA。在一些实施方案中，编码共有MAGEA4抗原的核酸序列可包括Kozak序列(例如，GCC ACC)以增强翻译的效率。编码共有MAGEA4抗原的核酸可包括多个终止密码子(例如，TGA TGA)以增强翻译终止的效率。
编码共有MAGEA4抗原的核酸还可编码免疫球蛋白E(IgE)前导序列。编码共有Tyr抗原的核酸可进一步编码IgE前导序列以使得IgE前导序列的氨基酸序列通过肽键连接于共有MAGEA4抗原的氨基酸序列。编码共有MAGEA4抗原的核酸还可包括编码IgE前导序列的核苷酸序列。在一些实施方案中，编码共有MAGEA4抗原的核酸不含或不含有编码IgE前导序列的核苷酸序列。
共有MAGEA4抗原可以是核酸序列SEQ ID NO:7，其编码氨基酸序列SEQ ID NO:8。SEQ ID NO:7编码连接于IgE前导序列的共有MAGEA4蛋白。可将共有MAGEA4蛋白连接于IgE前导序列和HA标签。在其它实施方案中，共有MAGEA4蛋白可以不含或不连接于IgE前导序列和/或HA标签。
在一些实施方案中，共有MAGEA4抗原可以是在SEQ ID NO:7中所示的核酸序列的完整长度上具有至少约80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的同一性的核酸序列。在其它实施方案中，共有MAGEA4抗原可以是编码在SEQ ID NO:8中所示的氨基酸序列的完整长度上具有至少约80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的同一性的氨基酸序列的核酸序列。共有MAGEA4抗原可以是在SEQ ID NO:8中所示的氨基酸序列的完整长度上具有至少约80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的同一性的氨基酸序列。
一些实施方案涉及编码与MAGEA4共有蛋白同源的蛋白、MAGEA4共有蛋白的免疫原性片段和同源蛋白的免疫原性片段的核酸序列。可提供编码与共有序列具有高达95％的同源性、与共有序列具有高达96％的同源性、与共有序列具有高达97％的同源性、与共有序列具有高达98％的同源性和与共有序列具有高达99％的同源性的免疫原性蛋白的此类核酸分子。同样地，还提供了编码本文中所示的免疫原性片段和与本文中所示的蛋白质同源的蛋白质的免疫原性片段的核酸序列。
一些实施方案涉及与本文中的核酸编码序列具有95％的同源性的编码免疫原性蛋白的核酸分子。一些实施方案涉及与本文中的核酸编码序列具有96％的同源性的编码免疫原性蛋白的核酸分子。一些实施方案涉及与本文中的核酸编码序列具有97％的同源性的编码免疫原性蛋白的核酸分子。一些实施方案涉及与本文中的核酸编码序列具有98％的同源性的编码免疫原性蛋白的核酸分子。一些实施方案涉及与本文中的核酸编码序列具有99％的同源性的编码免疫原性蛋白的核酸分子。在一些实施方案中，具有与本文中公开的共有蛋白的编码序列同源的本文中公开的编码序列的核酸分子包括连接于编码本文中公开的同源蛋白序列的编码序列的5'末端的编码IgE前导序列的序列。
一些实施方案涉及编码与全长MAGEA4共有蛋白具特定百分比同一性的蛋白质、MAGEA4共有蛋白的免疫原性片段和与MAGEA4共有蛋白具有同一性的蛋白质的免疫原性片段的核酸序列。可提供编码与全长MAGEA4共有序列具有高达80％的同一性、与全长共有序列具有高达85％的同一性、与全长MAGEA4共有序列具有高达90％的同一性、与全长MAGEA4共有序列具有高达91％的同一性、与全长MAGEA4共有序列具有高达92％的同一性、与全长MAGEA4共有序列具有高达93％的同一性、与全长MAGEA4共有序列具有高达94％的同一性、与全长MAGEA4共有序列具有高达95％的同一性、与全长MAGEA4共有序列具有高达96％的同一性、与全长MAGEA4共有序列具有高达97％的同一性、与全长MAGEA4共有序列具有高达98％的同一性和与全长MAGEA4共有序列具有高达99％的同一性的免疫原性蛋白的此类核酸分子。同样地，还提供了编码本文中所示的免疫原性片段和与本文中所示的MAGEA4蛋白具有如上指定的相似百分比同一性的蛋白质的免疫原性片段的核酸序列。
在一些实施方案中，核酸序列不含编码前导序列的编码序列。在一些实施方案中，核酸序列不含编码IgE前导序列的编码序列。
一些实施方案涉及SEQ ID NO:7的片段。片段可以是SEQ ID NO:7的至少10％、至少15％、至少20％、至少25％、至少30％、至少35％、至少40％、至少45％、至少50％、至少55％至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％。片段可与SEQ ID NO:7的片段具有至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％的同源性。片段可与SEQ ID NO:7的片段具有至少80％、至少85％、至少90％至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％的同一性。在一些实施方案中，片段包括编码前导序列，诸如例如，免疫球蛋白前导序列，诸如IgE前导序列的序列。在一些实施方案中，片段不含编码前导序列的编码序列。在一些实施方案中，片段不含编码前导序列，诸如例如，IgE前导序列的编码序列。
此外，共有MAGEA4蛋白的氨基酸序列为SEQ ID NO:8。连接于IgE前导序列的共有MAGEA4蛋白的氨基酸序为SEQ ID NO:8。连接于IgE前导序列的共有MAGEA4蛋白的氨基酸序列可连接于HA标签。
一些实施方案涉及与SEQ ID NO:8同源的蛋白质。一些实施方案涉及与SEQ IDNO:8中所示的共有蛋白序列具有95％的同源性的免疫原性蛋白。一些实施方案涉及与SEQID NO:8中所示的共有蛋白序列具有96％的同源性的免疫原性蛋白。一些实施方案涉及与SEQ ID NO:8中所示的共有蛋白序列具有97％的同源性的免疫原性蛋白。一些实施方案涉及与SEQ ID NO:8中所示的共有蛋白序列具有98％的同源性的免疫原性蛋白。一些实施方案涉及与SEQ ID NO:8中所示的共有蛋白序列具有99％的同源性的免疫原性蛋白。
一些实施方案涉及与SEQ ID NO:8相同的蛋白质。一些实施方案涉及具有与如SEQID NO:8中所示的全长共有氨基酸序列具有80％的同一性的氨基酸序列的免疫原性蛋白。一些实施方案涉及具有与如SEQ ID NO:8中所示的全长共有氨基酸序列具有85％的同一性的氨基酸序列的免疫原性蛋白。一些实施方案涉及具有与如SEQ ID NO:8中所示的全长共有氨基酸序列具有90％的同一性的氨基酸序列的免疫原性蛋白。一些实施方案涉及具有与如SEQ ID NO:8中所示的全长共有氨基酸序列具有91％的同一性的氨基酸序列的免疫原性蛋白。一些实施方案涉及具有与如SEQ ID NO:8中所示的全长共有氨基酸序列具有92％的同一性的氨基酸序列的免疫原性蛋白。一些实施方案涉及具有与如SEQ ID NO:8中所示的全长共有氨基酸序列具有93％的同一性的氨基酸序列的免疫原性蛋白。一些实施方案涉及具有与如SEQ ID NO:8中所示的全长共有氨基酸序列具有94％的同一性的氨基酸序列的免疫原性蛋白。一些实施方案涉及具有与如SEQ ID NO:8中所示的全长共有氨基酸序列具有95％的同一性的氨基酸序列的免疫原性蛋白。一些实施方案涉及具有与如SEQ ID NO:8中所示的全长共有氨基酸序列具有96％的同一性的氨基酸序列的免疫原性蛋白。一些实施方案涉及具有与如SEQ ID NO:8中所示的全长共有氨基酸序列具有97％的同一性的氨基酸序列的免疫原性蛋白。一些实施方案涉及具有与如SEQ ID NO:8中所示的全长共有氨基酸序列具有98％的同一性的氨基酸序列的免疫原性蛋白。一些实施方案涉及具有与如SEQ IDNO:8中所示的全长共有氨基酸序列具有99％的同一性的氨基酸序列的免疫原性蛋白。
在一些实施方案中，蛋白质不含前导序列。在一些实施方案中，蛋白质不含IgE前导序列。共有蛋白的片段可包含共有蛋白的至少10％、至少15％、至少20％、至少25％、至少30％、至少35％、至少40％、至少45％、至少50％、至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％。可提供SEQ ID NO:8的免疫原性片段。免疫原性片段可包含SEQ ID NO:8的至少10％、至少15％、至少20％、至少25％、至少30％、至少35％、至少40％、至少45％、至少50％、至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％。在一些实施方案中，片段包括前导序列，诸如例如，免疫球蛋白前导序列，诸如IgE前导序列。在一些实施方案中，片段不含前导序列。在一些实施方案中，片段不含前导序列，诸如例如，IgE前导序列。
可提供具有与SEQ ID NO:8的免疫原性片段同源的氨基酸序列的蛋白质的免疫原性片段。此类免疫原性片段可包含与SEQ ID NO:8具有95％或更大的同源性的蛋白质的至少10％、至少15％、至少20％、至少25％、至少30％、至少35％、至少40％、至少45％、至少50％、至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％。一些实施方案涉及与本文中的共有蛋白序列的免疫原性片段具有96％的同源性的免疫原性片段。一些实施方案涉及与本文中的共有蛋白序列的免疫原性片段具有97％的同源性的免疫原性片段。一些实施方案涉及与本文中的共有蛋白序列的免疫原性片段具有98％的同源性的免疫原性片段。一些实施方案涉及与本文中的共有蛋白序列的免疫原性片段具有99％的同源性的免疫原性片段。在一些实施方案中，片段包括前导序列，诸如例如，免疫球蛋白前导序列，诸如IgE前导序列。在一些实施方案中，片段不含前导序列。在一些实施方案中，片段不含前导序列，诸如例如，IgE前导序列。
可提供具有与SEQ ID NO:8的免疫原性片段相同的氨基酸序列的蛋白质的免疫原性片段。此类免疫原性片段可包含与SEQ ID NO:8中所示的氨基酸序列具有80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％的同一性的蛋白质的至少10％、至少15％、至少20％、至少25％、至少30％、至少35％、至少40％、至少45％、至少50％、至少55％至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％。在一些实施方案中，片段包括前导序列，诸如例如，免疫球蛋白前导序列，诸如IgE前导序列。在一些实施方案中，片段不含前导序列。在一些实施方案中，片段不含前导序列，诸如例如，IgE前导序列。
如本文中针对将信号肽或前导序列连接于蛋白质的N末端所指出的，信号肽/前导序列替代蛋白质的N末端甲硫氨酸，所述N末端甲硫氨酸由编码无信号肽编码序列的编码所述蛋白质的核酸序列的起始密码子编码。
(5)生长激素释放激素(GHRH)
本发明的疫苗可包含癌抗原生长激素释放激素(GHRH；也称为生长-激素-释放因子(GRF或GHRF)或生长激泌素)、其片段或其变体。GHRH是在下丘脑的弓状核中产生的44个氨基酸的肽激素。GHRH由下丘脑分泌并且刺激生长激素、生长、代谢和身体结构的调节剂从脑下垂体的释放。GHRH还刺激生长激素的产生。GHRH的拮抗剂可抑制多种癌症例如骨肉瘤、成胶质细胞瘤、前列腺癌、肾癌、胰腺癌、结直肠癌和乳腺癌的生长。因此，GHRH可以是与多种肿瘤相关的抗原。
GHRH抗原可诱导抗原特异性T细胞和/或高滴度抗体应答，从而诱导或引发对表达该抗原的癌症或肿瘤或与所述癌症或肿瘤反应的免疫应答。在一些实施方案中，诱导或引发的免疫应答可以是细胞免疫应答、体液免疫应答或细胞和体液免疫应答。在一些实施方案中，诱导或引发的细胞免疫应答可包括干扰素-γ(IFN-γ)和/或肿瘤坏死因子α(TNF-α)的诱导或分泌。在其它实施方案中，诱导或引发的免疫应答可减少或抑制促进表达该抗原的肿瘤或癌症的生长的一种或多种免疫抑制因子，例如，但不限于下调MHC呈递的因子、上调抗原特异性调节性T细胞(Treg)的因子、PD-L1、FasL、细胞因子诸如IL-10和TFG-β、肿瘤相关巨噬细胞、肿瘤相关成纤维细胞、由免疫抑制细胞产生的可溶性因子、CTLA-4、PD-1、MDSC、MCP-1和免疫检查点分子，在下文中更详细地描述所述因子。
GHRH抗原可包含使它们特别有效地作为可诱导针对其的抗-GHRH免疫应答的免疫原的蛋白质表位。GHRH抗原可包含全长翻译产物、其变体、其片段或其组合。GHRH抗原可包含共有蛋白。
可针对密码子使用和相应的RNA转录物优化编码共有GHRH抗原的核酸序列。编码共有GHRH抗原的核酸可以是针对表达而被优化的密码子和RNA。在一些实施方案中，编码共有GHRH抗原的核酸序列可包括Kozak序列(例如，GCC ACC)以增强翻译的效率。编码共有GHRH抗原的核酸可包括多个终止密码子(例如，TGATGA)以增强翻译终止的效率。
编码共有GHRH抗原的核酸还可编码免疫球蛋白E(IgE)前导序列。编码共有GHRH抗原的核酸可进一步编码IgE前导序列以使得IgE前导序列的氨基酸序列通过肽键连接于共有GHRH抗原的氨基酸序列。编码共有GHRH抗原的核酸还可包括编码IgE前导序列的核苷酸序列。在一些实施方案中，编码共有GHRH抗原的核酸不含或不含有编码IgE前导序列的核苷酸序列。
共有GHRH抗原可以是核酸序列SEQ ID NO:9，其编码氨基酸序列SEQ ID NO:10。SEQ ID NO:9编码连接于IgE前导序列的共有GHRH蛋白。可将共有GHRH蛋白连接于IgE前导序列和HA标签。在其它实施方案中，共有GHRH蛋白可以不含或不连接于IgE前导序列和/或HA标签。
在一些实施方案中，共有GHRH抗原可以是在SEQ ID NO:9中所示的核酸序列的完整长度上具有至少约80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的同一性的核酸序列。在其它实施方案中，共有GHRH抗原可以是编码在SEQ ID NO:10中所示的氨基酸序列的完整长度上具有至少约80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的同一性的氨基酸序列的核酸序列。共有GHRH抗原可以是在SEQ ID NO:10中所示的氨基酸序列的完整长度上具有至少约80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的同一性的氨基酸序列。
一些实施方案涉及编码与GHRH共有蛋白同源的蛋白、GHRH共有蛋白的免疫原性片段和同源蛋白的免疫原性片段的核酸序列。可提供编码与共有序列具有高达95％的同源性、与共有序列具有高达96％的同源性、与共有序列具有高达97％的同源性、与共有序列具有高达98％的同源性和与共有序列具有高达99％的同源性的免疫原性蛋白的此类核酸分子。同样地，还提供了编码本文中所示的免疫原性片段和与本文中所示的蛋白质同源的蛋白质的免疫原性片段的核酸序列。
一些实施方案涉及与本文中的核酸编码序列具有95％的同源性的编码免疫原性蛋白的核酸分子。一些实施方案涉及与本文中的核酸编码序列具有96％的同源性的编码免疫原性蛋白的核酸分子。一些实施方案涉及与本文中的核酸编码序列具有97％的同源性的编码免疫原性蛋白的核酸分子。一些实施方案涉及与本文中的核酸编码序列具有98％的同源性的编码免疫原性蛋白的核酸分子。一些实施方案涉及与本文中的核酸编码序列具有99％的同源性的编码免疫原性蛋白的核酸分子。在一些实施方案中，具有与本文中公开的共有蛋白的编码序列同源的本文中公开的编码序列的核酸分子包括连接于编码本文中公开的同源蛋白序列的编码序列的5'末端的编码IgE前导序列的序列。
一些实施方案涉及编码与全长GHRH共有蛋白具特定百分比同一性的蛋白质、GHRH共有蛋白的免疫原性片段和与GHRH共有蛋白具有同一性的蛋白质的免疫原性片段的核酸序列。可提供编码与全长GHRH共有序列具有高达80％的同一性、与全长共有序列具有高达85％的同一性、与全长GHRH共有序列具有高达90％的同一性、与全长GHRH共有序列具有高达91％的同一性、与全长GHRH共有序列具有高达92％的同一性、与全长GHRH共有序列具有高达93％的同一性、与全长GHRH共有序列具有高达94％的同一性、与全长GHRH共有序列具有高达95％的同一性、与全长GHRH共有序列具有高达96％的同一性、与全长GHRH共有序列具有高达97％的同一性、与全长GHRH共有序列具有高达98％的同一性和与全长GHRH共有序列具有高达99％的同一性的免疫原性蛋白的此类核酸分子。同样地，还提供了编码本文中所示的免疫原性片段和与本文中所示的GHRH蛋白具有如上指定的相似百分比同一性的蛋白质的免疫原性片段的核酸序列。
在一些实施方案中，核酸序列不含编码前导序列的编码序列。在一些实施方案中，核酸序列不含编码IgE前导序列的编码序列。
一些实施方案涉及SEQ ID NO:9的片段。片段可以是SEQ ID NO:9的至少10％、至少15％、至少20％、至少25％、至少30％、至少35％、至少40％、至少45％、至少50％、至少55％至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％。片段可与SEQ ID NO:9的片段具有至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％的同源性。片段可与SEQ ID NO:9的片段具有至少80％、至少85％、至少90％至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％的同一性。在一些实施方案中，片段包括编码前导序列，诸如例如，免疫球蛋白前导序列，诸如IgE前导序列的序列。在一些实施方案中，片段不含编码前导序列的编码序列。在一些实施方案中，片段不含编码前导序列，诸如例如，IgE前导序列的编码序列。
此外，共有GHRH蛋白的氨基酸序列为SEQ ID NO:10。连接于IgE前导序列的共有GHRH蛋白的氨基酸序为SEQ ID NO:10。连接于IgE前导序列的共有GHRH蛋白的氨基酸序列可连接于HA标签。
一些实施方案涉及与SEQ ID NO:10同源的蛋白质。一些实施方案涉及与SEQ IDNO:10中所示的共有蛋白序列具有95％的同源性的免疫原性蛋白。一些实施方案涉及与SEQID NO:10中所示的共有蛋白序列具有96％的同源性的免疫原性蛋白。一些实施方案涉及与SEQ ID NO:10中所示的共有蛋白序列具有97％的同源性的免疫原性蛋白。一些实施方案涉及与SEQ ID NO:10中所示的共有蛋白序列具有98％的同源性的免疫原性蛋白。一些实施方案涉及与SEQ ID NO:10中所示的共有蛋白序列具有99％的同源性的免疫原性蛋白。
一些实施方案涉及与SEQ ID NO:10相同的蛋白质。一些实施方案涉及具有与如SEQ ID NO:10中所示的全长共有氨基酸序列具有80％的同一性的氨基酸序列的免疫原性蛋白。一些实施方案涉及具有与如SEQ ID NO:10中所示的全长共有氨基酸序列具有85％的同一性的氨基酸序列的免疫原性蛋白。一些实施方案涉及具有与如SEQ ID NO:10中所示的全长共有氨基酸序列具有90％的同一性的氨基酸序列的免疫原性蛋白。一些实施方案涉及具有与如SEQ ID NO:10中所示的全长共有氨基酸序列具有91％的同一性的氨基酸序列的免疫原性蛋白。一些实施方案涉及具有与如SEQ ID NO:10中所示的全长共有氨基酸序列具有92％的同一性的氨基酸序列的免疫原性蛋白。一些实施方案涉及具有与如SEQ ID NO:10中所示的全长共有氨基酸序列具有93％的同一性的氨基酸序列的免疫原性蛋白。一些实施方案涉及具有与如SEQ ID NO:10中所示的全长共有氨基酸序列具有94％的同一性的氨基酸序列的免疫原性蛋白。一些实施方案涉及具有与如SEQ ID NO:10中所示的全长共有氨基酸序列具有95％的同一性的氨基酸序列的免疫原性蛋白。一些实施方案涉及具有与如SEQID NO:10中所示的全长共有氨基酸序列具有96％的同一性的氨基酸序列的免疫原性蛋白。一些实施方案涉及具有与如SEQ ID NO:10中所示的全长共有氨基酸序列具有97％的同一性的氨基酸序列的免疫原性蛋白。一些实施方案涉及具有与如SEQ ID NO:10中所示的全长共有氨基酸序列具有98％的同一性的氨基酸序列的免疫原性蛋白。一些实施方案涉及具有与如SEQ ID NO:10中所示的全长共有氨基酸序列具有99％的同一性的氨基酸序列的免疫原性蛋白。
在一些实施方案中，蛋白质不含前导序列。在一些实施方案中，蛋白质不含IgE前导序列。共有蛋白的片段可包含共有蛋白的至少10％、至少15％、至少20％、至少25％、至少30％、至少35％、至少40％、至少45％、至少50％、至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％。可提供SEQ ID NO:10的免疫原性片段。免疫原性片段可包含SEQ ID NO:10的至少10％、至少15％、至少20％、至少25％、至少30％、至少35％、至少40％、至少45％、至少50％、至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％。在一些实施方案中，片段包括前导序列，诸如例如，免疫球蛋白前导序列，诸如IgE前导序列。在一些实施方案中，片段不含前导序列。在一些实施方案中，片段不含前导序列，诸如例如，IgE前导序列。
可提供具有与SEQ ID NO:10的免疫原性片段同源的氨基酸序列的蛋白质的免疫原性片段。此类免疫原性片段可包含与SEQ ID NO:10具有95％或更大的同源性的蛋白质的至少10％、至少15％、至少20％、至少25％、至少30％、至少35％、至少40％、至少45％、至少50％、至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％。一些实施方案涉及与本文中的共有蛋白序列的免疫原性片段具有96％的同源性的免疫原性片段。一些实施方案涉及与本文中的共有蛋白序列的免疫原性片段具有97％的同源性的免疫原性片段。一些实施方案涉及与本文中的共有蛋白序列的免疫原性片段具有98％的同源性的免疫原性片段。一些实施方案涉及与本文中的共有蛋白序列的免疫原性片段具有99％的同源性的免疫原性片段。在一些实施方案中，片段包括前导序列，诸如例如，免疫球蛋白前导序列，诸如IgE前导序列。在一些实施方案中，片段不含前导序列。
在一些实施方案中，片段不含前导序列，诸如例如，IgE前导序列。
可提供具有与SEQ ID NO:10的免疫原性片段相同的氨基酸序列的蛋白质的免疫原性片段。此类免疫原性片段可包含与SEQ ID NO:10中所示的氨基酸序列具有80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％的同一性的蛋白质的至少10％、至少15％、至少20％、至少25％、至少30％、至少35％、至少40％、至少45％、至少50％、至少55％至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％。在一些实施方案中，片段包括前导序列，诸如例如，免疫球蛋白前导序列，诸如IgE前导序列。在一些实施方案中，片段不含前导序列。在一些实施方案中，片段不含前导序列，诸如例如，IgE前导序列。
如本文中针对将信号肽或前导序列连接于蛋白质的N末端所指出的，信号肽/前导序列替代蛋白质的N末端甲硫氨酸，所述N末端甲硫氨酸由编码无信号肽编码序列的编码所述蛋白质的核酸序列的起始密码子编码。
(6)MART-1/Melan-A
本发明的疫苗可包含癌抗原MART-1(也称为Melan-A)，其片段或其变体。由MLANA基因编码的MART-1为含有单个跨膜结构域的118个氨基酸的蛋白质并且在大多数黑色素瘤细胞中表达。MART-1与结构蛋白形成复合物并且影响其表达、稳定性、黑色素小体结构和成熟所需要运输和加工。因此，MART-1是调控哺乳动物的色素沉着所必需的。黑色素小体成熟中的缺陷与对癌症的易感性相关。MART-1可在许多种癌症(包括但不限于黑色素瘤)中表达。
Melan-A，也称为被T细胞识别的黑色素瘤抗原(MART-1)，是黑素细胞分化抗原并且可见于正常皮肤、视网膜和黑素细胞中。Melan-a可与内质网和黑色素小体相关。Melan-A可被细胞毒性T细胞识别为黑色素瘤细胞上的抗原，但还可与具有黑色素细胞来源或分化(即，细胞具有黑色素小体)的其它肿瘤例如透明细胞肉瘤和黑色素型神经纤维瘤相关。因此，Melan-A可以是与多种源自具有黑色素小体的细胞的肿瘤相关的抗原。
Melan-A抗原可诱导抗原特异性T细胞和/或高滴度抗体应答，从而诱导或引发对表达该抗原的癌症或肿瘤或与所述癌症或肿瘤反应的免疫应答。在一些实施方案中，诱导或引发的免疫应答可以是细胞免疫应答、体液免疫应答或细胞和体液免疫应答。在一些实施方案中，诱导或引发的细胞免疫应答可包括干扰素-γ(IFN-γ)和/或肿瘤坏死因子α(TNF-α)的诱导或分泌。在其它实施方案中，诱导或引发的免疫应答可减少或抑制促进表达该抗原的肿瘤或癌症的生长的一种或多种免疫抑制因子，例如，但不限于下调MHC呈递的因子、上调抗原特异性调节性T细胞(Treg)的因子、PD-L1、FasL、细胞因子诸如IL-10和TFG-β、肿瘤相关巨噬细胞、肿瘤相关成纤维细胞、由免疫抑制细胞产生的可溶性因子、CTLA-4、PD-1、MDSC、MCP-1和免疫检查点分子，在下文中更详细地描述所述因子。
Melan-A抗原可包含使它们特别有效地作为可诱导针对其的抗-Melan-A免疫应答的免疫原的蛋白质表位。Melan-A抗原可包含全长翻译产物、其变体、其片段或其组合。Melan-A抗原可包含共有蛋白。
可针对密码子使用和相应的RNA转录物优化编码共有Melan-A抗原的核酸序列。编码共有Melan-A抗原的核酸可以是针对表达而被优化的密码子和RNA。在一些实施方案中，编码共有Melan-A抗原的核酸序列可包括Kozak序列(例如，GCC ACC)以增强翻译的效率。编码共有Melan-A抗原的核酸可包括多个终止密码子(例如，TGA TGA)以增强翻译终止的效率。
编码共有Melan-A抗原的核酸还可编码免疫球蛋白E(IgE)前导序列。编码共有Melan-A抗原的核酸可进一步编码IgE前导序列以使得IgE前导序列的氨基酸序列通过肽键连接于共有Melan-A抗原的氨基酸序列。编码共有Melan-A抗原的核酸还可包括编码IgE前导序列的核苷酸序列。在一些实施方案中，编码共有Melan-A抗原的核酸不含或不含有编码IgE前导序列的核苷酸序列。
共有Melan-A抗原可以是核酸序列SEQ ID NO:11，其编码氨基酸序列SEQ ID NO:12。SEQ ID NO:11编码连接于IgE前导序列的共有MELAN-A蛋白。可将共有Melan-A蛋白连接于IgE前导序列和HA标签。在其它实施方案中，共有Melan-A蛋白可以不含或不连接于IgE前导序列和/或HA标签。
在一些实施方案中，共有Melan-A抗原可以是在SEQ ID NO:11中所示的核酸序列的完整长度上具有至少约80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的同一性的核酸序列。在其它实施方案中，共有Melan-A抗原可以是编码在SEQ ID NO:12中所示的氨基酸序列的完整长度上具有至少约80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的同一性的氨基酸序列的核酸序列。共有Melan-A抗原可以是在SEQ ID NO:12中所示的氨基酸序列的完整长度上具有至少约80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的同一性的氨基酸序列。
一些实施方案涉及编码与Melan-A共有蛋白同源的蛋白、Melan-A共有蛋白的免疫原性片段和同源蛋白的免疫原性片段的核酸序列。可提供编码与共有序列具有高达95％的同源性、与共有序列具有高达96％的同源性、与共有序列具有高达97％的同源性、与共有序列具有高达98％的同源性和与共有序列具有高达99％的同源性的免疫原性蛋白的此类核酸分子。同样地，还提供了编码本文中所示的免疫原性片段和与本文中所示的蛋白质同源的蛋白质的免疫原性片段的核酸序列。
一些实施方案涉及与本文中的核酸编码序列具有95％的同源性的编码免疫原性蛋白的核酸分子。一些实施方案涉及与本文中的核酸编码序列具有96％的同源性的编码免疫原性蛋白的核酸分子。一些实施方案涉及与本文中的核酸编码序列具有97％的同源性的编码免疫原性蛋白的核酸分子。一些实施方案涉及与本文中的核酸编码序列具有98％的同源性的编码免疫原性蛋白的核酸分子。一些实施方案涉及与本文中的核酸编码序列具有99％的同源性的编码免疫原性蛋白的核酸分子。在一些实施方案中，具有与本文中公开的共有蛋白的编码序列同源的本文中公开的编码序列的核酸分子包括连接于编码本文中公开的同源蛋白序列的编码序列的5'末端的编码IgE前导序列的序列。
一些实施方案涉及编码与全长Melan-A共有蛋白具特定百分比同一性的蛋白质、Melan-A共有蛋白的免疫原性片段和与Melan-A共有蛋白具有同一性的蛋白质的免疫原性片段的核酸序列。可提供编码与全长Melan-A共有序列具有高达80％的同一性、与全长Melan-A共有序列具有高达85％的同一性、与全长Melan-A共有序列具有高达90％的同一性、与全长Melan-A共有序列具有高达91％的同一性、与全长Melan-A共有序列具有高达92％的同一性、与全长Melan-A共有序列具有高达93％的同一性、与全长Melan-A共有序列具有高达94％的同一性、与全长Melan-A共有序列具有高达95％的同一性、与全长Melan-A共有序列具有高达96％的同一性、与全长Melan-A共有序列具有高达97％的同一性、与全长Melan-A共有序列具有高达98％的同一性和与全长Melan-A共有序列具有高达99％的同一性的免疫原性蛋白的此类核酸分子。同样地，还提供了编码本文中所示的免疫原性片段和与本文中所示的Melan-A蛋白具有如上指定的相似百分比同一性的蛋白质的免疫原性片段的核酸序列。
在一些实施方案中，核酸序列不含编码前导序列的编码序列。在一些实施方案中，核酸序列不含编码IgE前导序列的编码序列。
一些实施方案涉及SEQ ID NO:11的片段。片段可以是SEQ ID NO:11的至少10％、至少15％、至少20％、至少25％、至少30％、至少35％、至少40％、至少45％、至少50％、至少55％至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％。片段可与SEQ ID NO:11的片段具有至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％的同源性。片段可与SEQ ID NO:11的片段具有至少80％、至少85％、至少90％至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％的同一性。在一些实施方案中，片段包括编码前导序列，诸如例如，免疫球蛋白前导序列，诸如IgE前导序列的序列。在一些实施方案中，片段不含编码前导序列的编码序列。在一些实施方案中，片段不含编码前导序列，诸如例如，IgE前导序列的编码序列。
此外，共有Melan-A蛋白的氨基酸序列为SEQ ID NO:12。连接于IgE前导序列的共有Melan-A蛋白的氨基酸序为SEQ ID NO:12。连接于IgE前导序列的共有Melan-A蛋白的氨基酸序列可连接于HA标签。
一些实施方案涉及与SEQ ID NO:12同源的蛋白质。一些实施方案涉及与SEQ IDNO:12中所示的共有蛋白序列具有95％的同源性的免疫原性蛋白。一些实施方案涉及与SEQID NO:12中所示的共有蛋白序列具有96％的同源性的免疫原性蛋白。一些实施方案涉及与SEQ ID NO:12中所示的共有蛋白序列具有97％的同源性的免疫原性蛋白。一些实施方案涉及与SEQ ID NO:12中所示的共有蛋白序列具有98％的同源性的免疫原性蛋白。一些实施方案涉及与SEQ ID NO:12中所示的共有蛋白序列具有99％的同源性的免疫原性蛋白。
一些实施方案涉及与SEQ ID NO:12相同的蛋白质。一些实施方案涉及具有与如SEQ ID NO:12中所示的全长共有氨基酸序列具有80％的同一性的氨基酸序列的免疫原性蛋白。一些实施方案涉及具有与如SEQ ID NO:12中所示的全长共有氨基酸序列具有85％的同一性的氨基酸序列的免疫原性蛋白。一些实施方案涉及具有与如SEQ ID NO:12中所示的全长共有氨基酸序列具有90％的同一性的氨基酸序列的免疫原性蛋白。一些实施方案涉及具有与如SEQ ID NO:12中所示的全长共有氨基酸序列具有91％的同一性的氨基酸序列的免疫原性蛋白。一些实施方案涉及具有与如SEQ ID NO:12中所示的全长共有氨基酸序列具有92％的同一性的氨基酸序列的免疫原性蛋白。一些实施方案涉及具有与如SEQ ID NO:12中所示的全长共有氨基酸序列具有93％的同一性的氨基酸序列的免疫原性蛋白。一些实施方案涉及具有与如SEQ ID NO:12中所示的全长共有氨基酸序列具有94％的同一性的氨基酸序列的免疫原性蛋白。一些实施方案涉及具有与如SEQ ID NO:12中所示的全长共有氨基酸序列具有95％的同一性的氨基酸序列的免疫原性蛋白。一些实施方案涉及具有与如SEQID NO:12中所示的全长共有氨基酸序列具有96％的同一性的氨基酸序列的免疫原性蛋白。一些实施方案涉及具有与如SEQ ID NO:12中所示的全长共有氨基酸序列具有97％的同一性的氨基酸序列的免疫原性蛋白。一些实施方案涉及具有与如SEQ ID NO:12中所示的全长共有氨基酸序列具有98％的同一性的氨基酸序列的免疫原性蛋白。一些实施方案涉及具有与如SEQ ID NO:12中所示的全长共有氨基酸序列具有99％的同一性的氨基酸序列的免疫原性蛋白。
在一些实施方案中，蛋白质不含前导序列。在一些实施方案中，蛋白质不含IgE前导序列。共有蛋白的片段可包含共有蛋白的至少10％、至少15％、至少20％、至少25％、至少30％、至少35％、至少40％、至少45％、至少50％、至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％。可提供SEQ ID NO:12的免疫原性片段。免疫原性片段可包含SEQ ID NO:12的至少10％、至少15％、至少20％、至少25％、至少30％、至少35％、至少40％、至少45％、至少50％、至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％。在一些实施方案中，片段包括前导序列，诸如例如，免疫球蛋白前导序列，诸如IgE前导序列。在一些实施方案中，片段不含前导序列。在一些实施方案中，片段不含前导序列，诸如例如，IgE前导序列。
可提供具有与SEQ ID NO:12的免疫原性片段同源的氨基酸序列的蛋白质的免疫原性片段。此类免疫原性片段可包含与SEQ ID NO:12具有95％或更大的同源性的蛋白质的至少10％、至少15％、至少20％、至少25％、至少30％、至少35％、至少40％、至少45％、至少50％、至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％。一些实施方案涉及与本文中的共有蛋白序列的免疫原性片段具有96％的同源性的免疫原性片段。一些实施方案涉及与本文中的共有蛋白序列的免疫原性片段具有97％的同源性的免疫原性片段。一些实施方案涉及与本文中的共有蛋白序列的免疫原性片段具有98％的同源性的免疫原性片段。一些实施方案涉及与本文中的共有蛋白序列的免疫原性片段具有99％的同源性的免疫原性片段。在一些实施方案中，片段包括前导序列，诸如例如，免疫球蛋白前导序列，诸如IgE前导序列。在一些实施方案中，片段不含前导序列。在一些实施方案中，片段不含前导序列，诸如例如，IgE前导序列。
可提供具有与SEQ ID NO:12的免疫原性片段相同的氨基酸序列的蛋白质的免疫原性片段。此类免疫原性片段可包含与SEQ ID NO:12中所示的氨基酸序列具有80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％的同一性的蛋白质的至少10％、至少15％、至少20％、至少25％、至少30％、至少35％、至少40％、至少45％、至少50％、至少55％至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％。在一些实施方案中，片段包括前导序列，诸如例如，免疫球蛋白前导序列，诸如IgE前导序列。在一些实施方案中，片段不含前导序列。在一些实施方案中，片段不含前导序列，诸如例如，IgE前导序列。
如本文中针对将信号肽或前导序列连接于蛋白质的N末端所指出的，信号肽/前导序列替代蛋白质的N末端甲硫氨酸，所述N末端甲硫氨酸由编码无信号肽编码序列的编码所述蛋白质的核酸序列的起始密码子编码。
(7)NY-ESO-1
本发明的疫苗可包含癌抗原纽约食管癌-1(NY-ESO-1；也称为CTAG1)、其片段或其变体。由CTAG1B基因编码的NY-ESO-1为180个氨基酸长的蛋白质，具有富含甘氨酸的N端区和极端疏水的C端区。NY-ESO-1在正常组织中具有有限的表达但频繁出现在癌症中。NY-ESO-1可在许多种癌症包括但不限于膀胱、结直肠、食管癌、胃癌、肝癌、头颈癌、黑色素瘤、非小细胞肺癌、卵巢癌、胰腺癌、滑液癌和前列腺癌中表达。
癌-睾丸抗原(NY-ESO-1)可在睾丸和卵巢中表达。NY-ESO-1可与多种癌症相关并且可诱导体液免疫应答。患有癌症或肿瘤的受试者可产生针对NY-ESO-1的免疫原性。因此、NY-ESO-1可以是与多种肿瘤相关的抗原。
NY-ESO-1抗原可诱导抗原特异性T细胞和/或高滴度抗体应答，从而诱导或引发对表达该抗原的癌症或肿瘤或与所述癌症或肿瘤反应的免疫应答。在一些实施方案中，诱导或引发的免疫应答可以是细胞免疫应答、体液免疫应答或细胞和体液免疫应答。在一些实施方案中，诱导或引发的细胞免疫应答可包括干扰素-γ(IFN-γ)和/或肿瘤坏死因子α(TNF-α)的诱导或分泌。在其它实施方案中，诱导或引发的免疫应答可减少或抑制促进表达该抗原的肿瘤或癌症的生长的一种或多种免疫抑制因子，例如，但不限于下调MHC呈递的因子、上调抗原特异性调节性T细胞(Treg)的因子、PD-L1、FasL、细胞因子诸如IL-10和TFG-β、肿瘤相关巨噬细胞、肿瘤相关成纤维细胞、由免疫抑制细胞产生的可溶性因子、CTLA-4、PD-1、MDSC、MCP-1和免疫检查点分子，在下文中更详细地描述所述因子。
NY-ESO-1抗原可使被施予NY-ESO-1抗原的受试者的细胞免疫应答相较于未被施予NY-ESO-1抗原的受试者的细胞免疫应答增强约50倍至约6000倍、约50倍至约5500倍、约50倍至约5000倍、约50倍至约4500倍、约100倍至约6000倍、约150倍至约6000倍、约200倍至约6000倍、约250倍至约6000倍或约300倍至约6000倍。在一些实施方案中，NY-ESO-1抗原可使被施予NY-ESO-1的受试者的细胞免疫应答相较于未被施予NY-ESO-1抗原的受试者的细胞免疫应答增强约50倍、100倍、150倍、200倍、250倍、300倍、350倍、400倍、450倍、500倍、550倍、600倍、650倍、700倍、750倍、800倍、850倍、900倍、950倍、1000倍、1100倍、1200倍、1300倍、1400倍、1500倍、1600倍、1700倍、1800倍、1900倍、2000倍、2100倍、2200倍、2300倍、2400倍、2500倍、2600倍、2700倍、2800倍、2900倍、3000倍、3100倍、3200倍、3300倍、3400倍、3500倍、3600倍、3700倍、3800倍、3900倍、4000倍、4100倍、4200倍、4300倍、4400倍、4500倍、4600倍、4700倍、4800倍、4900倍、5000倍、5100倍、5200倍、5300倍、5400倍、5500倍、5600倍、5700倍、5800倍、5900倍或6000倍。
NY-ESO-1抗原可使被施予NY-ESO-1抗原的受试者的干扰素γ(IFN-γ)水平相较于未被施予NY-ESO-1抗原的受试者的IFN-γ水平升高约50倍至约6000倍、约50倍至约5500倍、约50倍至约5000倍、约50倍至约4500倍、约100倍至约6000倍、约150倍至约6000倍、约200倍至约6000倍、约250倍至约6000倍或约300倍至约6000倍。在一些实施方案中，NY-ESO-1抗原可使被施予NY-ESO-1抗原的受试者的IFN-γ水平相较于未被施予NY-ESO-1抗原的受试者的IFN-γ水平升高约50倍、100倍、150倍、200倍、250倍、300倍、350倍、400倍、450倍、500倍、550倍、600倍、650倍、700倍、750倍、800倍、850倍、900倍、950倍、1000倍、1100倍、1200倍、1300倍、1400倍、1500倍、1600倍、1700倍、1800倍、1900倍、2000倍、2100倍、2200倍、2300倍、2400倍、2500倍、2600倍、2700倍、2800倍、2900倍、3000倍、3100倍、3200倍、3300倍、3400倍、3500倍、3600倍、3700倍、3800倍、3900倍、4000倍、4100倍、4200倍、4300倍、4400倍、4500倍、4600倍、4700倍、4800倍、4900倍、5000倍、5100倍、5200倍、5300倍、5400倍、5500倍、5600倍、5700倍、5800倍、5900倍或6000倍。
NY-ESO-1抗原可包含使它们特别有效地作为可诱导针对其的抗-NY-ESO-1免疫应答的免疫原的蛋白质表位。NY-ESO-1抗原可包含全长翻译产物、其变体、其片段或其组合。NY-ESO-1抗原可包含共有蛋白。
可针对密码子使用和相应的RNA转录物优化编码共有NY-ESO-1抗原的核酸序列。编码共有NY-ESO-1抗原的核酸可以是针对表达而被优化的密码子和RNA。在一些实施方案中，编码共有NY-ESO-1抗原的核酸序列可包括Kozak序列(例如，GCC ACC)以增强翻译的效率。编码共有NY-ESO-1抗原的核酸可包括多个终止密码子(例如，TGATGA)以增强翻译终止的效率。
编码共有NY-ESO-1抗原的核酸还可编码免疫球蛋白E(IgE)前导序列。编码共有NY-ESO-1抗原的核酸可进一步编码IgE前导序列以使得IgE前导序列的氨基酸序列通过肽键连接于共有NY-ESO-1抗原的氨基酸序列。编码共有NY-ESO-1抗原的核酸还可包括编码IgE前导序列的核苷酸序列。在一些实施方案中，编码共有NY-ESO-1抗原的核酸不含或不含有编码IgE前导序列的核苷酸序列。
共有NY-ESO-1抗原可以是核酸序列SEQ ID NO:13，其编码氨基酸序列SEQ ID NO:14。SEQ ID NO:13编码连接于IgE前导序列的共有NY-ESO-1蛋白。可将共有NY-ESO-1蛋白连接于IgE前导序列和HA标签。在其它实施方案中，共有NY-ESO-1蛋白可以不含或不连接于IgE前导序列和/或HA标签。
在一些实施方案中，共有NY-ESO-1抗原可以是在SEQ ID NO:13中所示的核酸序列的完整长度上具有至少约80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的同一性的核酸序列。在其它实施方案中，共有NY-ESO-1抗原可以是编码在SEQ ID NO:14中所示的氨基酸序列的完整长度上具有至少约80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的同一性的氨基酸序列的核酸序列。共有NY-ESO-1抗原可以是在SEQ ID NO:14中所示的氨基酸序列的完整长度上具有至少约80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的同一性的氨基酸序列。
一些实施方案涉及编码与NY-ESO-1共有蛋白同源的蛋白、NY-ESO-1共有蛋白的免疫原性片段和同源蛋白的免疫原性片段的核酸序列。可提供编码与共有序列具有高达95％的同源性、与共有序列具有高达96％的同源性、与共有序列具有高达97％的同源性、与共有序列具有高达98％的同源性和与共有序列具有高达99％的同源性的免疫原性蛋白的此类核酸分子。同样地，还提供了编码本文中所示的免疫原性片段和与本文中所示的蛋白质同源的蛋白质的免疫原性片段的核酸序列。
一些实施方案涉及与本文中的核酸编码序列具有95％的同源性的编码免疫原性蛋白的核酸分子。一些实施方案涉及与本文中的核酸编码序列具有96％的同源性的编码免疫原性蛋白的核酸分子。一些实施方案涉及与本文中的核酸编码序列具有97％的同源性的编码免疫原性蛋白的核酸分子。一些实施方案涉及与本文中的核酸编码序列具有98％的同源性的编码免疫原性蛋白的核酸分子。一些实施方案涉及与本文中的核酸编码序列具有99％的同源性的编码免疫原性蛋白的核酸分子。在一些实施方案中，具有与本文中公开的共有蛋白的编码序列同源的本文中公开的编码序列的核酸分子包括连接于编码本文中公开的同源蛋白序列的编码序列的5'末端的编码IgE前导序列的序列。
一些实施方案涉及编码与全长NY-ESO-1共有蛋白具特定百分比同一性的蛋白质、NY-ESO-1共有蛋白的免疫原性片段和与NY-ESO-1共有蛋白具有同一性的蛋白质的免疫原性片段的核酸序列。可提供编码与全长NY-ESO-1共有序列具有高达80％的同一性、与全长共有序列具有高达85％的同一性、与全长NY-ESO-1共有序列具有高达90％的同一性、与全长NY-ESO-1共有序列具有高达91％的同一性、与全长NY-ESO-1共有序列具有高达92％的同一性、与全长NY-ESO-1共有序列具有高达93％的同一性、与全长NY-ESO-1共有序列具有高达94％的同一性、与全长NY-ESO-1共有序列具有高达95％的同一性、与全长NY-ESO-1共有序列具有高达96％的同一性、与全长NY-ESO-1共有序列具有高达97％的同一性、与全长NY-ESO-1共有序列具有高达98％的同一性和与全长NY-ESO-1共有序列具有高达99％的同一性的免疫原性蛋白的此类核酸分子。同样地，还提供了编码本文中所示的免疫原性片段和与本文中所示的NY-ESO-1蛋白具有如上指定的相似百分比同一性的蛋白质的免疫原性片段的核酸序列。
在一些实施方案中，核酸序列不含编码前导序列的编码序列。在一些实施方案中，核酸序列不含编码IgE前导序列的编码序列。
一些实施方案涉及SEQ ID NO:13的片段。片段可以是SEQ ID NO:13的至少10％、至少15％、至少20％、至少25％、至少30％、至少35％、至少40％、至少45％、至少50％、至少55％至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％。片段可与SEQ ID NO:13的片段具有至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％的同源性。片段可与SEQ ID NO:13的片段具有至少80％、至少85％、至少90％至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％的同一性。在一些实施方案中，片段包括编码前导序列，诸如例如，免疫球蛋白前导序列，诸如IgE前导序列的序列。在一些实施方案中，片段不含编码前导序列的编码序列。在一些实施方案中，片段不含编码前导序列，诸如例如，IgE前导序列的编码序列。
此外，共有NY-ESO-1蛋白的氨基酸序列为SEQ ID NO:14。连接于IgE前导序列的共有NY-ESO-1蛋白的氨基酸序为SEQ ID NO:14。连接于IgE前导序列的共有NY-ESO-1蛋白的氨基酸序列可连接于HA标签。
一些实施方案涉及与SEQ ID NO:14同源的蛋白质。一些实施方案涉及与SEQ IDNO:14中所示的共有蛋白序列具有95％的同源性的免疫原性蛋白。一些实施方案涉及与SEQID NO:14中所示的共有蛋白序列具有96％的同源性的免疫原性蛋白。一些实施方案涉及与SEQ ID NO:14中所示的共有蛋白序列具有97％的同源性的免疫原性蛋白。一些实施方案涉及与SEQ ID NO:14中所示的共有蛋白序列具有98％的同源性的免疫原性蛋白。一些实施方案涉及与SEQ ID NO:14中所示的共有蛋白序列具有99％的同源性的免疫原性蛋白。
一些实施方案涉及与SEQ ID NO:14相同的蛋白质。一些实施方案涉及具有与如SEQ ID NO:14中所示的全长共有氨基酸序列具有80％的同一性的氨基酸序列的免疫原性蛋白。一些实施方案涉及具有与如SEQ ID NO:14中所示的全长共有氨基酸序列具有85％的同一性的氨基酸序列的免疫原性蛋白。一些实施方案涉及具有与如SEQ ID NO:14中所示的全长共有氨基酸序列具有90％的同一性的氨基酸序列的免疫原性蛋白。一些实施方案涉及具有与如SEQ ID NO:14中所示的全长共有氨基酸序列具有91％的同一性的氨基酸序列的免疫原性蛋白。一些实施方案涉及具有与如SEQ ID NO:14中所示的全长共有氨基酸序列具有92％的同一性的氨基酸序列的免疫原性蛋白。一些实施方案涉及具有与如SEQ ID NO:14中所示的全长共有氨基酸序列具有93％的同一性的氨基酸序列的免疫原性蛋白。一些实施方案涉及具有与如SEQ ID NO:14中所示的全长共有氨基酸序列具有94％的同一性的氨基酸序列的免疫原性蛋白。一些实施方案涉及具有与如SEQ ID NO:14中所示的全长共有氨基酸序列具有95％的同一性的氨基酸序列的免疫原性蛋白。一些实施方案涉及具有与如SEQID NO:14中所示的全长共有氨基酸序列具有96％的同一性的氨基酸序列的免疫原性蛋白。一些实施方案涉及具有与如SEQ ID NO:14中所示的全长共有氨基酸序列具有97％的同一性的氨基酸序列的免疫原性蛋白。一些实施方案涉及具有与如SEQ ID NO:14中所示的全长共有氨基酸序列具有98％的同一性的氨基酸序列的免疫原性蛋白。一些实施方案涉及具有与如SEQ ID NO:14中所示的全长共有氨基酸序列具有99％的同一性的氨基酸序列的免疫原性蛋白。
在一些实施方案中，蛋白质不含前导序列。在一些实施方案中，蛋白质不含IgE前导序列。共有蛋白的片段可包含共有蛋白的至少10％、至少15％、至少20％、至少25％、至少30％、至少35％、至少40％、至少45％、至少50％、至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％。可提供SEQ ID NO:14的免疫原性片段。免疫原性片段可包含SEQ ID NO:14的至少10％、至少15％、至少20％、至少25％、至少30％、至少35％、至少40％、至少45％、至少50％、至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％。在一些实施方案中，片段包括前导序列，诸如例如，免疫球蛋白前导序列，诸如IgE前导序列。在一些实施方案中，片段不含前导序列。在一些实施方案中，片段不含前导序列，诸如例如，IgE前导序列。
可提供具有与SEQ ID NO:14的免疫原性片段同源的氨基酸序列的蛋白质的免疫原性片段。此类免疫原性片段可包含与SEQ ID NO:14具有95％或更大的同源性的蛋白质的至少10％、至少15％、至少20％、至少25％、至少30％、至少35％、至少40％、至少45％、至少50％、至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％。一些实施方案涉及与本文中的共有蛋白序列的免疫原性片段具有96％的同源性的免疫原性片段。一些实施方案涉及与本文中的共有蛋白序列的免疫原性片段具有97％的同源性的免疫原性片段。一些实施方案涉及与本文中的共有蛋白序列的免疫原性片段具有98％的同源性的免疫原性片段。一些实施方案涉及与本文中的共有蛋白序列的免疫原性片段具有99％的同源性的免疫原性片段。在一些实施方案中，片段包括前导序列，诸如例如，免疫球蛋白前导序列，诸如IgE前导序列。在一些实施方案中，片段不含前导序列。在一些实施方案中，片段不含前导序列，诸如例如，IgE前导序列。
可提供具有与SEQ ID NO:14的免疫原性片段相同的氨基酸序列的蛋白质的免疫原性片段。此类免疫原性片段可包含与SEQ ID NO:14中所示的氨基酸序列具有80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％的同一性的蛋白质的至少10％、至少15％、至少20％、至少25％、至少30％、至少35％、至少40％、至少45％、至少50％、至少55％至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％。在一些实施方案中，片段包括前导序列，诸如例如，免疫球蛋白前导序列，诸如IgE前导序列。在一些实施方案中，片段不含前导序列。在一些实施方案中，片段不含前导序列，诸如例如，IgE前导序列。
如本文中针对将信号肽或前导序列连接于蛋白质的N末端所指出的，信号肽/前导序列替代蛋白质的N末端甲硫氨酸，所述N末端甲硫氨酸由编码无信号肽编码序列的编码所述蛋白质的核酸序列的起始密码子编码。
(8)NY-ESO-2
本发明的疫苗可包含癌抗原纽约食管癌-2(NY-ESO-2；也称为癌症/睾丸抗原2、ESO2和LAGE1)、其片段或其变体。NY-ESO-2是属于癌-睾丸抗原的ESO/LAGE家族的自身免疫原性肿瘤抗原。NY-ESO-2可在多种癌症(包括黑色素瘤、乳腺癌、膀胱癌和前列腺癌)中表达，并且通常在睾丸组织中表达。此外、NY-ESO-2可在黑色素瘤、非小细胞肺癌、膀胱、前列腺和头颈癌的25-50％的肿瘤样品中被观察到。编码NY-ESO-2的基因还含有称为CAMEL的蛋白(一种被黑色素瘤特异性细胞毒性T-淋巴细胞识别的肿瘤抗原)的替代开放阅读框架。
与NY-ESO-1类似，NY-ESO-2可在睾丸和卵巢中表达。NY-ESO-2还可与多种癌症和患有癌症或肿瘤的受试者中的免疫原性相关。因此，NY-ESO-2可以是与许多肿瘤相关的抗原。
NY-ESO-2抗原可诱导抗原特异性T细胞和/或高滴度抗体应答，从而诱导或引发对表达该抗原的癌症或肿瘤或与所述癌症或肿瘤反应的免疫应答。在一些实施方案中，诱导或引发的免疫应答可以是细胞免疫应答、体液免疫应答或细胞和体液免疫应答。在一些实施方案中，诱导或引发的细胞免疫应答可包括干扰素-γ(IFN-γ)和/或肿瘤坏死因子α(TNF-α)的诱导或分泌。在其它实施方案中，诱导或引发的免疫应答可减少或抑制促进表达该抗原的肿瘤或癌症的生长的一种或多种免疫抑制因子，例如，但不限于下调MHC呈递的因子、上调抗原特异性调节性T细胞(Treg)的因子、PD-L1、FasL、细胞因子诸如IL-10和TFG-β、肿瘤相关巨噬细胞、肿瘤相关成纤维细胞、由免疫抑制细胞产生的可溶性因子、CTLA-4、PD-1、MDSC、MCP-1和免疫检查点分子，在下文中更详细地描述所述因子。
NY-ESO-2抗原可使被施予NY-ESO-2抗原的受试者的细胞免疫应答相较于未被施予NY-ESO-2抗原的受试者的细胞免疫应答增强约50倍至约6000倍、约50倍至约5500倍、约50倍至约5000倍、约50倍至约4500倍、约100倍至约6000倍、约150倍至约6000倍、约200倍至约6000倍、约250倍至约6000倍或约300倍至约6000倍。在一些实施方案中，NY-ESO-2抗原可使被施予NY-ESO-2抗原的受试者的细胞免疫应答相较于未被施予NY-ESO-2抗原的受试者的细胞免疫应答增强约50倍、100倍、150倍、200倍、250倍、300倍、350倍、400倍、450倍、500倍、550倍、600倍、650倍、700倍、750倍、800倍、850倍、900倍、950倍、1000倍、1100倍、1200倍、1300倍、1400倍、1500倍、1600倍、1700倍、1800倍、1900倍、2000倍、2100倍、2200倍、2300倍、2400倍、2500倍、2600倍、2700倍、2800倍、2900倍、3000倍、3100倍、3200倍、3300倍、3400倍、3500倍、3600倍、3700倍、3800倍、3900倍、4000倍、4100倍、4200倍、4300倍、4400倍、4500倍、4600倍、4700倍、4800倍、4900倍、5000倍、5100倍、5200倍、5300倍、5400倍、5500倍、5600倍、5700倍、5800倍、5900倍或6000倍。
NY-ESO-2抗原可使被施予NY-ESO-2抗原的受试者的干扰素γ(IFN-γ)水平相较于未被施予NY-ESO-2抗原的受试者的IFN-γ水平升高约50倍至约6000倍、约50倍至约5500倍、约50倍至约5000倍、约50倍至约4500倍、约100倍至约6000倍、约150倍至约6000倍、约200倍至约6000倍、约250倍至约6000倍或约300倍至约6000倍。在一些实施方案中，NY-ESO-2抗原可使被施予NY-ESO-2抗原的受试者的IFN-γ水平相较于未被施予NY-ESO-2抗原的受试者的IFN-γ水平升高约50倍、100倍、150倍、200倍、250倍、300倍、350倍、400倍、450倍、500倍、550倍、600倍、650倍、700倍、750倍、800倍、850倍、900倍、950倍、1000倍、1100倍、1200倍、1300倍、1400倍、1500倍、1600倍、1700倍、1800倍、1900倍、2000倍、2100倍、2200倍、2300倍、2400倍、2500倍、2600倍、2700倍、2800倍、2900倍、3000倍、3100倍、3200倍、3300倍、3400倍、3500倍、3600倍、3700倍、3800倍、3900倍、4000倍、4100倍、4200倍、4300倍、4400倍、4500倍、4600倍、4700倍、4800倍、4900倍、5000倍、5100倍、5200倍、5300倍、5400倍、5500倍、5600倍、5700倍、5800倍、5900倍或6000倍。
NY-ESO-2抗原可包含使它们特别有效地作为可诱导针对其的抗-NY-ESO-2免疫应答的免疫原的蛋白质表位。NY-ESO-2抗原可包含全长翻译产物、其变体、其片段或其组合。NY-ESO-2抗原可包含共有蛋白。
可针对密码子使用和相应的RNA转录物优化编码共有NY-ESO-2抗原的核酸序列。编码共有NY-ESO-2抗原的核酸可以是针对表达而被优化的密码子和RNA。在一些实施方案中，编码共有NY-ESO-2抗原的核酸序列可包括Kozak序列(例如，GCC ACC)以增强翻译的效率。编码共有NY-ESO-2抗原的核酸可包括多个终止密码子(例如，TGATGA)以增强翻译终止的效率。
编码共有NY-ESO-2抗原的核酸还可编码免疫球蛋白E(IgE)前导序列。编码共有NY-ESO-2抗原的核酸可进一步编码IgE前导序列以使得IgE前导序列的氨基酸序列通过肽键连接于共有NY-ESO-2抗原的氨基酸序列。编码共有NY-ESO-2抗原的核酸还可包括编码IgE前导序列的核苷酸序列。在一些实施方案中，编码共有NY-ESO-2抗原的核酸不含或不含有编码IgE前导序列的核苷酸序列。
共有NY-ESO-2抗原可以是核酸序列SEQ ID NO:15，其编码氨基酸序列SEQ ID NO:16。SEQ ID NO:1编码连接于IgE前导序列的共有NY-ESO-2蛋白。可将共有NY-ESO-2蛋白连接于IgE前导序列和HA标签。在其它实施方案中，共有NY-ESO-2蛋白可以不含或不连接于IgE前导序列和/或HA标签。
在一些实施方案中，共有NY-ESO-2抗原可以是在SEQ ID NO:15中所示的核酸序列的完整长度上具有至少约80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的同一性的核酸序列。在其它实施方案中，共有NY-ESO-2抗原可以是编码在SEQ ID NO:16中所示的氨基酸序列的完整长度上具有至少约80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的同一性的氨基酸序列的核酸序列。共有NY-ESO-2抗原可以是在SEQ ID NO:16中所示的氨基酸序列的完整长度上具有至少约80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的同一性的氨基酸序列。
一些实施方案涉及编码与NY-ESO-2共有蛋白同源的蛋白、NY-ESO-2共有蛋白的免疫原性片段和同源蛋白的免疫原性片段的核酸序列。可提供编码与共有序列具有高达95％的同源性、与共有序列具有高达96％的同源性、与共有序列具有高达97％的同源性、与共有序列具有高达98％的同源性和与共有序列具有高达99％的同源性的免疫原性蛋白的此类核酸分子。同样地，还提供了编码本文中所示的免疫原性片段和与本文中所示的蛋白质同源的蛋白质的免疫原性片段的核酸序列。
一些实施方案涉及与本文中的核酸编码序列具有95％的同源性的编码免疫原性蛋白的核酸分子。一些实施方案涉及与本文中的核酸编码序列具有96％的同源性的编码免疫原性蛋白的核酸分子。一些实施方案涉及与本文中的核酸编码序列具有97％的同源性的编码免疫原性蛋白的核酸分子。一些实施方案涉及与本文中的核酸编码序列具有98％的同源性的编码免疫原性蛋白的核酸分子。一些实施方案涉及与本文中的核酸编码序列具有99％的同源性的编码免疫原性蛋白的核酸分子。在一些实施方案中，具有与本文中公开的共有蛋白的编码序列同源的本文中公开的编码序列的核酸分子包括连接于编码本文中公开的同源蛋白序列的编码序列的5'末端的编码IgE前导序列的序列。
一些实施方案涉及编码与全长NY-ESO-2共有蛋白具特定百分比同一性的蛋白质、NY-ESO-2共有蛋白的免疫原性片段和与NY-ESO-2共有蛋白具有同一性的蛋白质的免疫原性片段的核酸序列。可提供编码与全长NY-ESO-2共有序列具有高达80％的同一性、与全长共有序列具有高达85％的同一性、与全长NY-ESO-2共有序列具有高达90％的同一性、与全长NY-ESO-2共有序列具有高达91％的同一性、与全长NY-ESO-2共有序列具有高达92％的同一性、与全长NY-ESO-2共有序列具有高达93％的同一性、与全长NY-ESO-2共有序列具有高达94％的同一性、与全长NY-ESO-2共有序列具有高达95％的同一性、与全长NY-ESO-2共有序列具有高达96％的同一性、与全长NY-ESO-2共有序列具有高达97％的同一性、与全长NY-ESO-2共有序列具有高达98％的同一性和与全长NY-ESO-2共有序列具有高达99％的同一性的免疫原性蛋白的此类核酸分子。同样地，还提供了编码本文中所示的免疫原性片段和与本文中所示的NY-ESO-2蛋白具有如上指定的相似百分比同一性的蛋白质的免疫原性片段的核酸序列。
在一些实施方案中，核酸序列不含编码前导序列的编码序列。在一些实施方案中，核酸序列不含编码IgE前导序列的编码序列。
一些实施方案涉及SEQ ID NO:15的片段。片段可以是SEQ ID NO:15的至少10％、至少15％、至少20％、至少25％、至少30％、至少35％、至少40％、至少45％、至少50％、至少55％至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％。片段可与SEQ ID NO:15的片段具有至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％的同源性。片段可与SEQ ID NO:15的片段具有至少80％、至少85％、至少90％至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％的同一性。在一些实施方案中，片段包括编码前导序列，诸如例如，免疫球蛋白前导序列，诸如IgE前导序列的序列。在一些实施方案中，片段不含编码前导序列的编码序列。在一些实施方案中，片段不含编码前导序列，诸如例如，IgE前导序列的编码序列。
此外，共有NY-ESO-2蛋白的氨基酸序列为SEQ ID NO:16。连接于IgE前导序列的共有NY-ESO-2蛋白的氨基酸序为SEQ ID NO:16。连接于IgE前导序列的共有NY-ESO-2蛋白的氨基酸序列可连接于HA标签。
一些实施方案涉及与SEQ ID NO:16同源的蛋白质。一些实施方案涉及与SEQ IDNO:16中所示的共有蛋白序列具有95％的同源性的免疫原性蛋白。一些实施方案涉及与SEQID NO:16中所示的共有蛋白序列具有96％的同源性的免疫原性蛋白。一些实施方案涉及与SEQ ID NO:16中所示的共有蛋白序列具有97％的同源性的免疫原性蛋白。一些实施方案涉及与SEQ ID NO:16中所示的共有蛋白序列具有98％的同源性的免疫原性蛋白。一些实施方案涉及与SEQ ID NO:16中所示的共有蛋白序列具有99％的同源性的免疫原性蛋白。
一些实施方案涉及与SEQ ID NO:16相同的蛋白质。一些实施方案涉及具有与如SEQ ID NO:16中所示的全长共有氨基酸序列具有80％的同一性的氨基酸序列的免疫原性蛋白。一些实施方案涉及具有与如SEQ ID NO:16中所示的全长共有氨基酸序列具有85％的同一性的氨基酸序列的免疫原性蛋白。一些实施方案涉及具有与如SEQ ID NO:16中所示的全长共有氨基酸序列具有90％的同一性的氨基酸序列的免疫原性蛋白。一些实施方案涉及具有与如SEQ ID NO:16中所示的全长共有氨基酸序列具有91％的同一性的氨基酸序列的免疫原性蛋白。一些实施方案涉及具有与如SEQ ID NO:16中所示的全长共有氨基酸序列具有92％的同一性的氨基酸序列的免疫原性蛋白。一些实施方案涉及具有与如SEQ ID NO:16中所示的全长共有氨基酸序列具有93％的同一性的氨基酸序列的免疫原性蛋白。一些实施方案涉及具有与如SEQ ID NO:16中所示的全长共有氨基酸序列具有94％的同一性的氨基酸序列的免疫原性蛋白。一些实施方案涉及具有与如SEQ ID NO:16中所示的全长共有氨基酸序列具有95％的同一性的氨基酸序列的免疫原性蛋白。一些实施方案涉及具有与如SEQID NO:16中所示的全长共有氨基酸序列具有96％的同一性的氨基酸序列的免疫原性蛋白。一些实施方案涉及具有与如SEQ ID NO:16中所示的全长共有氨基酸序列具有97％的同一性的氨基酸序列的免疫原性蛋白。一些实施方案涉及具有与如SEQ ID NO:16中所示的全长共有氨基酸序列具有98％的同一性的氨基酸序列的免疫原性蛋白。一些实施方案涉及具有与如SEQ ID NO:16中所示的全长共有氨基酸序列具有99％的同一性的氨基酸序列的免疫原性蛋白。
在一些实施方案中，蛋白质不含前导序列。在一些实施方案中，蛋白质不含IgE前导序列。共有蛋白的片段可包含共有蛋白的至少10％、至少15％、至少20％、至少25％、至少30％、至少35％、至少40％、至少45％、至少50％、至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％。可提供SEQ ID NO:16的免疫原性片段。免疫原性片段可包含SEQ ID NO:16的至少10％、至少15％、至少20％、至少25％、至少30％、至少35％、至少40％、至少45％、至少50％、至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％。在一些实施方案中，片段包括前导序列，诸如例如，免疫球蛋白前导序列，诸如IgE前导序列。在一些实施方案中，片段不含前导序列。在一些实施方案中，片段不含前导序列，诸如例如，IgE前导序列。
可提供具有与SEQ ID NO:16的免疫原性片段同源的氨基酸序列的蛋白质的免疫原性片段。此类免疫原性片段可包含与SEQ ID NO:16具有95％或更大的同源性的蛋白质的至少10％、至少15％、至少20％、至少25％、至少30％、至少35％、至少40％、至少45％、至少50％、至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％。一些实施方案涉及与本文中的共有蛋白序列的免疫原性片段具有96％的同源性的免疫原性片段。一些实施方案涉及与本文中的共有蛋白序列的免疫原性片段具有97％的同源性的免疫原性片段。一些实施方案涉及与本文中的共有蛋白序列的免疫原性片段具有98％的同源性的免疫原性片段。一些实施方案涉及与本文中的共有蛋白序列的免疫原性片段具有99％的同源性的免疫原性片段。在一些实施方案中，片段包括前导序列，诸如例如，免疫球蛋白前导序列，诸如IgE前导序列。在一些实施方案中，片段不含前导序列。在一些实施方案中，片段不含前导序列，诸如例如，IgE前导序列。
可提供具有与SEQ ID NO:16的免疫原性片段相同的氨基酸序列的蛋白质的免疫原性片段。此类免疫原性片段可包含与SEQ ID NO:16中所示的氨基酸序列具有80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％的同一性的蛋白质的至少10％、至少15％、至少20％、至少25％、至少30％、至少35％、至少40％、至少45％、至少50％、至少55％至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％。在一些实施方案中，片段包括前导序列，诸如例如，免疫球蛋白前导序列，诸如IgE前导序列。在一些实施方案中，片段不含前导序列。在一些实施方案中，片段不含前导序列，诸如例如，IgE前导序列。
如本文中针对将信号肽或前导序列连接于蛋白质的N末端所指出的，信号肽/前导序列替代蛋白质的N末端甲硫氨酸，所述N末端甲硫氨酸由编码无信号肽编码序列的编码所述蛋白质的核酸序列的起始密码子编码。
(9)PRAME
本发明的疫苗可包含癌抗原PRAME、其片段或其变体。由PRAME基因编码的PRAME是由509个氨基酸组成的蛋白并且在睾丸、胎盘、子宫内膜、卵巢、肾上腺中以及在源自黑色素瘤、肺癌、肾癌和头颈癌的组织中表达。PRAME也在成人和小儿急性白血病以及多发性骨髓瘤中表达。PRAME含有当由HLA-A24呈递时能够引发细胞毒性应答的免疫原性九肽。研究显示PRAME在培养细胞中的过表达诱导造成成更慢的增殖速率的不依赖于胱天蛋白酶的细胞死亡。其它研究表明PRAME的过表达还通过拮抗视黄酸受体(RAR)信号转导来赋予生长或存活有利方面，并且有原因地参与肿瘤发生过程。RAR信号转导的干扰导致调控细胞增殖、发育和分化的丧失。
PRAME可具有与癌-睾丸抗原MAGE、BAGE和GAGE类似的表达模式，即在睾丸中的表达。然而，PRAME可在人黑色素瘤和急性白血病中表达。PRAME可被细胞毒性T淋巴细胞识别。因此，PRAME可以是与黑色素瘤和白血病相关。
PRAME抗原可诱导抗原特异性T细胞和/或高滴度抗体应答，从而诱导或引发对表达该抗原的癌症或肿瘤或与所述癌症或肿瘤反应的免疫应答。在一些实施方案中，诱导或引发的免疫应答可以是细胞免疫应答、体液免疫应答或细胞和体液免疫应答。在一些实施方案中，诱导或引发的细胞免疫应答可包括干扰素-γ(IFN-γ)和/或肿瘤坏死因子α(TNF-α)的诱导或分泌。在其它实施方案中，诱导或引发的免疫应答可减少或抑制促进表达该抗原的肿瘤或癌症的生长的一种或多种免疫抑制因子，例如，但不限于下调MHC呈递的因子、上调抗原特异性调节性T细胞(Treg)的因子、PD-L1、FasL、细胞因子诸如IL-10和TFG-β、肿瘤相关巨噬细胞、肿瘤相关成纤维细胞、由免疫抑制细胞产生的可溶性因子、CTLA-4、PD-1、MDSC、MCP-1和免疫检查点分子，在下文中更详细地描述所述因子。
PRAME抗原可使被施予PRAME抗原的受试者的细胞免疫应答相较于未被施予PRAME抗原的受试者的细胞免疫应答增强约50倍至约6000倍、约50倍至约5500倍、约50倍至约5000倍、约50倍至约4500倍、约100倍至约6000倍、约150倍至约6000倍、约200倍至约6000倍、约250倍至约6000倍或约300倍至约6000倍。在一些实施方案中，PRAME抗原可使被施予PRAME抗原的受试者的细胞免疫应答相较于未被施予PRAME抗原的受试者的细胞免疫应答增强约50倍、100倍、150倍、200倍、250倍、300倍、350倍、400倍、450倍、500倍、550倍、600倍、650倍、700倍、750倍、800倍、850倍、900倍、950倍、1000倍、1100倍、1200倍、1300倍、1400倍、1500倍、1600倍、1700倍、1800倍、1900倍、2000倍、2100倍、2200倍、2300倍、2400倍、2500倍、2600倍、2700倍、2800倍、2900倍、3000倍、3100倍、3200倍、3300倍、3400倍、3500倍、3600倍、3700倍、3800倍、3900倍、4000倍、4100倍、4200倍、4300倍、4400倍、4500倍、4600倍、4700倍、4800倍、4900倍、5000倍、5100倍、5200倍、5300倍、5400倍、5500倍、5600倍、5700倍、5800倍、5900倍或6000倍。
PRAME抗原可使被施予PRAME抗原的受试者的干扰素γ(IFN-γ)水平相较于未被施予PRAME抗原的受试者的IFN-γ水平升高约50倍至约6000倍、约50倍至约5500倍、约50倍至约5000倍、约50倍至约4500倍、约100倍至约6000倍、约150倍至约6000倍、约200倍至约6000倍、约250倍至约6000倍或约300倍至约6000倍。在一些实施方案中，PRAME抗原可使被施予PRAME抗原的受试者的IFN-γ水平相较于未被施予PRAME抗原的受试者的IFN-γ水平升高约50倍、100倍、150倍、200倍、250倍、300倍、350倍、400倍、450倍、500倍、550倍、600倍、650倍、700倍、750倍、800倍、850倍、900倍、950倍、1000倍、1100倍、1200倍、1300倍、1400倍、1500倍、1600倍、1700倍、1800倍、1900倍、2000倍、2100倍、2200倍、2300倍、2400倍、2500倍、2600倍、2700倍、2800倍、2900倍、3000倍、3100倍、3200倍、3300倍、3400倍、3500倍、3600倍、3700倍、3800倍、3900倍、4000倍、4100倍、4200倍、4300倍、4400倍、4500倍、4600倍、4700倍、4800倍、4900倍、5000倍、5100倍、5200倍、5300倍、5400倍、5500倍、5600倍、5700倍、5800倍、5900倍或6000倍。
PRAME抗原可包含使它们特别有效地作为可诱导针对其的抗-PRAME免疫应答的免疫原的蛋白质表位。PRAME抗原可包含全长翻译产物、其变体、其片段或其组合。PRAME抗原可包含共有蛋白。
可针对密码子使用和相应的RNA转录物优化编码共有PRAME抗原的核酸序列。编码共有PRAME抗原的核酸可以是针对表达而被优化的密码子和RNA。在一些实施方案中，编码共有PRAME抗原的核酸序列可包括Kozak序列(例如，GCC ACC)以增强翻译的效率。编码共有PRAME抗原的核酸可包括多个终止密码子(例如，TGA TGA)以增强翻译终止的效率。
编码共有PRAME抗原的核酸还可编码免疫球蛋白E(IgE)前导序列。编码共有PRAME抗原的核酸可进一步编码IgE前导序列以使得IgE前导序列的氨基酸序列通过肽键连接于共有PRAME抗原的氨基酸序列。编码共有PRAME抗原的核酸还可包括编码IgE前导序列的核苷酸序列。在一些实施方案中，编码共有PRAME抗原的核酸不含或不含有编码IgE前导序列的核苷酸序列。
共有PRAME抗原可以是核酸序列SEQ ID NO:17，其编码氨基酸序列SEQ ID NO:18。SEQ ID NO:17编码连接于IgE前导序列的共有PRAME蛋白。可将共有PRAME蛋白连接于IgE前导序列和HA标签。在其它实施方案中，共有PRAME蛋白可以不含或不连接于IgE前导序列和/或HA标签。
在一些实施方案中，共有PRAME抗原可以是在SEQ ID NO:17中所示的核酸序列的完整长度上具有至少约80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的同一性的核酸序列。在其它实施方案中，共有PRAME抗原可以是编码在SEQ ID NO:18中所示的氨基酸序列的完整长度上具有至少约80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的同一性的氨基酸序列的核酸序列。共有PRAME抗原可以是在SEQ ID NO:18中所示的氨基酸序列的完整长度上具有至少约80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的同一性的氨基酸序列。
一些实施方案涉及编码与PRAME共有蛋白同源的蛋白、PRAME共有蛋白的免疫原性片段和同源蛋白的免疫原性片段的核酸序列。可提供编码与共有序列具有高达95％的同源性、与共有序列具有高达96％的同源性、与共有序列具有高达97％的同源性、与共有序列具有高达98％的同源性和与共有序列具有高达99％的同源性的免疫原性蛋白的此类核酸分子。同样地，还提供了编码本文中所示的免疫原性片段和与本文中所示的蛋白质同源的蛋白质的免疫原性片段的核酸序列。
一些实施方案涉及与本文中的核酸编码序列具有95％的同源性的编码免疫原性蛋白的核酸分子。一些实施方案涉及与本文中的核酸编码序列具有96％的同源性的编码免疫原性蛋白的核酸分子。一些实施方案涉及与本文中的核酸编码序列具有97％的同源性的编码免疫原性蛋白的核酸分子。一些实施方案涉及与本文中的核酸编码序列具有98％的同源性的编码免疫原性蛋白的核酸分子。一些实施方案涉及与本文中的核酸编码序列具有99％的同源性的编码免疫原性蛋白的核酸分子。在一些实施方案中，具有与本文中公开的共有蛋白的编码序列同源的本文中公开的编码序列的核酸分子包括连接于编码本文中公开的同源蛋白序列的编码序列的5'末端的编码IgE前导序列的序列。
一些实施方案涉及编码与全长PRAME共有蛋白具特定百分比同一性的蛋白质、PRAME共有蛋白的免疫原性片段和与PRAME共有蛋白具有同一性的蛋白质的免疫原性片段的核酸序列。可提供编码与全长PRAME共有序列具有高达80％的同一性、与全长共有序列具有高达85％的同一性、与全长PRAME共有序列具有高达90％的同一性、与全长PRAME共有序列具有高达91％的同一性、与全长PRAME共有序列具有高达92％的同一性、与全长PRAME共有序列具有高达93％的同一性、与全长PRAME共有序列具有高达94％的同一性、与全长PRAME共有序列具有高达95％的同一性、与全长PRAME共有序列具有高达96％的同一性、与全长PRAME共有序列具有高达97％的同一性、与全长PRAME共有序列具有高达98％的同一性和与全长PRAME共有序列具有高达99％的同一性的免疫原性蛋白的此类核酸分子。同样地，还提供了编码本文中所示的免疫原性片段和与本文中所示的PRAME蛋白具有如上指定的相似百分比同一性的蛋白质的免疫原性片段的核酸序列。
在一些实施方案中，核酸序列不含编码前导序列的编码序列。在一些实施方案中，核酸序列不含编码IgE前导序列的编码序列。
一些实施方案涉及SEQ ID NO:17的片段。片段可以是SEQ ID NO:17的至少10％、至少15％、至少20％、至少25％、至少30％、至少35％、至少40％、至少45％、至少50％、至少55％至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％。片段可与SEQ ID NO:17的片段具有至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％的同源性。片段可与SEQ ID NO:17的片段具有至少80％、至少85％、至少90％至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％的同一性。在一些实施方案中，片段包括编码前导序列，诸如例如，免疫球蛋白前导序列，诸如IgE前导序列的序列。在一些实施方案中，片段不含编码前导序列的编码序列。在一些实施方案中，片段不含编码前导序列，诸如例如，IgE前导序列的编码序列。
此外，共有PRAME蛋白的氨基酸序列为SEQ ID NO:18。连接于IgE前导序列的共有PRAME蛋白的氨基酸序为SEQ ID NO:18。连接于IgE前导序列的共有PRAME蛋白的氨基酸序列可连接于HA标签。
一些实施方案涉及与SEQ ID NO:18同源的蛋白质。一些实施方案涉及与SEQ IDNO:18中所示的共有蛋白序列具有95％的同源性的免疫原性蛋白。一些实施方案涉及与SEQID NO:18中所示的共有蛋白序列具有96％的同源性的免疫原性蛋白。一些实施方案涉及与SEQ ID NO:18中所示的共有蛋白序列具有97％的同源性的免疫原性蛋白。一些实施方案涉及与SEQ ID NO:18中所示的共有蛋白序列具有98％的同源性的免疫原性蛋白。一些实施方案涉及与SEQ ID NO:18中所示的共有蛋白序列具有99％的同源性的免疫原性蛋白。
一些实施方案涉及与SEQ ID NO:18相同的蛋白质。一些实施方案涉及具有与如SEQ ID NO:18中所示的全长共有氨基酸序列具有80％的同一性的氨基酸序列的免疫原性蛋白。一些实施方案涉及具有与如SEQ ID NO:18中所示的全长共有氨基酸序列具有85％的同一性的氨基酸序列的免疫原性蛋白。一些实施方案涉及具有与如SEQ ID NO:18中所示的全长共有氨基酸序列具有90％的同一性的氨基酸序列的免疫原性蛋白。一些实施方案涉及具有与如SEQ ID NO:18中所示的全长共有氨基酸序列具有91％的同一性的氨基酸序列的免疫原性蛋白。一些实施方案涉及具有与如SEQ ID NO:18中所示的全长共有氨基酸序列具有92％的同一性的氨基酸序列的免疫原性蛋白。一些实施方案涉及具有与如SEQ ID NO:18中所示的全长共有氨基酸序列具有93％的同一性的氨基酸序列的免疫原性蛋白。一些实施方案涉及具有与如SEQ ID NO:18中所示的全长共有氨基酸序列具有94％的同一性的氨基酸序列的免疫原性蛋白。一些实施方案涉及具有与如SEQ ID NO:18中所示的全长共有氨基酸序列具有95％的同一性的氨基酸序列的免疫原性蛋白。一些实施方案涉及具有与如SEQID NO:18中所示的全长共有氨基酸序列具有96％的同一性的氨基酸序列的免疫原性蛋白。一些实施方案涉及具有与如SEQ ID NO:18中所示的全长共有氨基酸序列具有97％的同一性的氨基酸序列的免疫原性蛋白。一些实施方案涉及具有与如SEQ ID NO:18中所示的全长共有氨基酸序列具有98％的同一性的氨基酸序列的免疫原性蛋白。一些实施方案涉及具有与如SEQ ID NO:18中所示的全长共有氨基酸序列具有99％的同一性的氨基酸序列的免疫原性蛋白。
在一些实施方案中，蛋白质不含前导序列。在一些实施方案中，蛋白质不含IgE前导序列。共有蛋白的片段可包含共有蛋白的至少10％、至少15％、至少20％、至少25％、至少30％、至少35％、至少40％、至少45％、至少50％、至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％。可提供SEQ ID NO:18的免疫原性片段。免疫原性片段可包含SEQ ID NO:18的至少10％、至少15％、至少20％、至少25％、至少30％、至少35％、至少40％、至少45％、至少50％、至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％。在一些实施方案中，片段包括前导序列，诸如例如，免疫球蛋白前导序列，诸如IgE前导序列。在一些实施方案中，片段不含前导序列。在一些实施方案中，片段不含前导序列，诸如例如，IgE前导序列。
可提供具有与SEQ ID NO:18的免疫原性片段同源的氨基酸序列的蛋白质的免疫原性片段。此类免疫原性片段可包含与SEQ ID NO:18具有95％或更大的同源性的蛋白质的至少10％、至少15％、至少20％、至少25％、至少30％、至少35％、至少40％、至少45％、至少50％、至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％。一些实施方案涉及与本文中的共有蛋白序列的免疫原性片段具有96％的同源性的免疫原性片段。一些实施方案涉及与本文中的共有蛋白序列的免疫原性片段具有97％的同源性的免疫原性片段。一些实施方案涉及与本文中的共有蛋白序列的免疫原性片段具有98％的同源性的免疫原性片段。一些实施方案涉及与本文中的共有蛋白序列的免疫原性片段具有99％的同源性的免疫原性片段。在一些实施方案中，片段包括前导序列，诸如例如，免疫球蛋白前导序列，诸如IgE前导序列。在一些实施方案中，片段不含前导序列。在一些实施方案中，片段不含前导序列，诸如例如，IgE前导序列。
可提供具有与SEQ ID NO:18的免疫原性片段相同的氨基酸序列的蛋白质的免疫原性片段。此类免疫原性片段可包含与SEQ ID NO:18中所示的氨基酸序列具有80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％的同一性的蛋白质的至少10％、至少15％、至少20％、至少25％、至少30％、至少35％、至少40％、至少45％、至少50％、至少55％至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％。在一些实施方案中，片段包括前导序列，诸如例如，免疫球蛋白前导序列，诸如IgE前导序列。在一些实施方案中，片段不含前导序列。在一些实施方案中，片段不含前导序列，诸如例如，IgE前导序列。
如本文中针对将信号肽或前导序列连接于蛋白质的N末端所指出的，信号肽/前导序列替代蛋白质的N末端甲硫氨酸，所述N末端甲硫氨酸由编码无信号肽编码序列的编码所述蛋白质的核酸序列的起始密码子编码。
(10)PSA
本发明的疫苗可包含癌抗原前列腺特异性抗原(PSA；也称为γ-精浆或激肽释放酶-3(KLK3))、其片段或其变体。PSA是由前列腺上皮细胞和前列腺细胞产生并由KLK3基因编码的雄激素-调控的丝氨酸蛋白酶。PSA通常用作前列腺癌的血清标志物。PSA是组织激肽释放酶家族的成员，并且在切割酶原被切割以释放活性酶后切割精液凝固物中的精液凝固蛋白，从而液化精液以使精子能够自由游动。此外，PSA酶活性受锌浓度调控，即高锌浓度抑制PSA的酶活性。
PSA抗原可诱导抗原特异性T细胞和/或高滴度抗体应答，从而诱导或引发对表达该抗原的癌症或肿瘤或与所述癌症或肿瘤反应的免疫应答。在一些实施方案中，诱导或引发的免疫应答可以是细胞免疫应答、体液免疫应答或细胞和体液免疫应答。在一些实施方案中，诱导或引发的细胞免疫应答可包括干扰素-γ(IFN-γ)和/或肿瘤坏死因子α(TNF-α)的诱导或分泌。在其它实施方案中，诱导或引发的免疫应答可减少或抑制促进表达该抗原的肿瘤或癌症的生长的一种或多种免疫抑制因子，例如，但不限于下调MHC呈递的因子、上调抗原特异性调节性T细胞(Treg)的因子、PD-L1、FasL、细胞因子诸如IL-10和TFG-β、肿瘤相关巨噬细胞、肿瘤相关成纤维细胞、由免疫抑制细胞产生的可溶性因子、CTLA-4、PD-1、MDSC、MCP-1和免疫检查点分子，在下文中更详细地描述所述因子。
PSA抗原可包含使它们特别有效地作为可诱导针对其的抗-PSA免疫应答的免疫原的蛋白质表位。PSA抗原可包含全长翻译产物、其变体、其片段或其组合。PSA抗原可包含共有蛋白。
可针对密码子使用和相应的RNA转录物优化编码共有PSA抗原的核酸序列。编码共有PSA抗原的核酸可以是针对表达而被优化的密码子和RNA。在一些实施方案中，编码共有PSA抗原的核酸序列可包括Kozak序列(例如，GCC ACC)以增强翻译的效率。编码共有PSA抗原的核酸可包括多个终止密码子(例如，TGA TGA)以增强翻译终止的效率。
编码共有PSA抗原的核酸还可编码免疫球蛋白E(IgE)前导序列。编码共有PSA抗原的核酸可进一步编码IgE前导序列以使得IgE前导序列的氨基酸序列通过肽键连接于共有PSAP抗原的氨基酸序列。编码共有PSA抗原的核酸还可包括编码IgE前导序列的核苷酸序列。在一些实施方案中，编码共有PSA抗原的核酸不含或不含有编码IgE前导序列的核苷酸序列。
在一些实施方案中，核酸编码共有PSA抗原可以是异源核酸序列和/或含有一个或多个异源核酸序列。
(11)PSMA
本发明的疫苗可包含癌抗原前列腺特异性膜抗原(PSMA；也称为谷氨酸羧肽酶II(GCPII)、N-乙酰基-L-天冬氨酰-L-谷氨酸肽酶I(NAALAD酶I)和NAAG肽酶)、其片段或其变体。PSMA由叶酸水解酶1(FOLH1)基因编码。PSMA为在膜和胞外空间中发现的锌金属酶。PSMA在人前列腺中高度表达并且在前列腺癌中被上调。PSMA也被发现在其它癌症诸如肾、乳腺和结肠的实体瘤中过表达。
PSMA抗原可诱导抗原特异性T细胞和/或高滴度抗体应答，从而诱导或引发对表达该抗原的癌症或肿瘤或与所述癌症或肿瘤反应的免疫应答。在一些实施方案中，诱导或引发的免疫应答可以是细胞免疫应答、体液免疫应答或细胞和体液免疫应答。在一些实施方案中，诱导或引发的细胞免疫应答可包括干扰素-γ(IFN-γ)和/或肿瘤坏死因子α(TNF-α)的诱导或分泌。在其它实施方案中，诱导或引发的免疫应答可减少或抑制促进表达该抗原的肿瘤或癌症的生长的一种或多种免疫抑制因子，例如，但不限于下调MHC呈递的因子、上调抗原特异性调节性T细胞(Treg)的因子、PD-L1、FasL、细胞因子诸如IL-10和TFG-β、肿瘤相关巨噬细胞、肿瘤相关成纤维细胞、由免疫抑制细胞产生的可溶性因子、CTLA-4、PD-1、MDSC、MCP-1和免疫检查点分子，在下文中更详细地描述所述因子。
PSMA抗原可包含使它们特别有效地作为可诱导针对其的抗-PSMA免疫应答的免疫原的蛋白质表位。PSMA抗原可包含全长翻译产物、其变体、其片段或其组合。PSMA抗原可包含共有蛋白。
可针对密码子使用和相应的RNA转录物优化编码共有PSMA抗原的核酸序列。编码共有PSMA抗原的核酸可以是针对表达而被优化的密码子和RNA。在一些实施方案中，编码共有PSMA抗原的核酸序列可包括Kozak序列(例如，GCC ACC)以增强翻译的效率。编码共有PSMA抗原的核酸可包括多个终止密码子(例如，TGATGA)以增强翻译终止的效率。
编码共有PSMA抗原的核酸还可编码免疫球蛋白E(IgE)前导序列。编码共有PSMA抗原的核酸可进一步编码IgE前导序列以使得IgE前导序列的氨基酸序列通过肽键连接于共有PSMAP抗原的氨基酸序列。编码共有PSMA抗原的核酸还可包括编码IgE前导序列的核苷酸序列。在一些实施方案中，编码共有PSMA抗原的核酸不含或不含有编码IgE前导序列的核苷酸序列。
在一些实施方案中，核酸编码共有PSMA抗原可以是异源核酸序列和/或含有一个或多个异源核酸序列。
(12)STEAP
本发明的疫苗可包含癌抗原前列腺抗原的六次跨膜上皮抗原(STEAP)、其片段或其变体。STEAP为由STEAP1基因编码的金属还原酶。STEAP主要在前列腺组织中表达并且在癌细胞中被上调。STEAP经预测为六次跨膜蛋白并且为在细胞间连接中发现的细胞表面抗原。
STEAP抗原可诱导抗原特异性T细胞和/或高滴度抗体应答，从而诱导或引发对表达该抗原的癌症或肿瘤或与所述癌症或肿瘤反应的免疫应答。在一些实施方案中，诱导或引发的免疫应答可以是细胞免疫应答、体液免疫应答或细胞和体液免疫应答。在一些实施方案中，诱导或引发的细胞免疫应答可包括干扰素-γ(IFN-γ)和/或肿瘤坏死因子α(TNF-α)的诱导或分泌。在其它实施方案中，诱导或引发的免疫应答可减少或抑制促进表达该抗原的肿瘤或癌症的生长的一种或多种免疫抑制因子，例如，但不限于下调MHC呈递的因子、上调抗原特异性调节性T细胞(Treg)的因子、PD-L1、FasL、细胞因子诸如IL-10和TFG-β、肿瘤相关巨噬细胞、肿瘤相关成纤维细胞、由免疫抑制细胞产生的可溶性因子、CTLA-4、PD-1、MDSC、MCP-1和免疫检查点分子，在下文中更详细地描述所述因子。
STEAP抗原可包含使它们特别有效地作为可诱导针对其的抗-STEAP免疫应答的免疫原的蛋白质表位。STEAP抗原可包含全长翻译产物、其变体、其片段或其组合。STEAP抗原可包含共有蛋白。
可针对密码子使用和相应的RNA转录物优化编码共有STEAP抗原的核酸序列。编码共有STEAP抗原的核酸可以是针对表达而被优化的密码子和RNA。在一些实施方案中，编码共有STEAP抗原的核酸序列可包括Kozak序列(例如，GCC ACC)以增强翻译的效率。编码共有STEAP抗原的核酸可包括多个终止密码子(例如，TGATGA)以增强翻译终止的效率。
编码共有STEAP抗原的核酸还可编码免疫球蛋白E(IgE)前导序列。编码共有STEAP抗原的核酸可进一步编码IgE前导序列以使得IgE前导序列的氨基酸序列通过肽键连接于共有STEAP抗原的氨基酸序列。编码共有STEAP抗原的核酸还可包括编码IgE前导序列的核苷酸序列。在一些实施方案中，编码共有STEAP抗原的核酸不含或不含有编码IgE前导序列的核苷酸序列。
在一些实施方案中，核酸编码共有STEAP抗原可以是异源核酸序列和/或含有一个或多个异源核酸序列。
(13)PSCA
本发明的疫苗可包含癌抗原前列腺特异性干细胞抗原(PSCA)、其片段或其变体。PSCA为糖基磷脂酰肌醇(GPI)-锚定的细胞表面蛋白并且由雄激素应答基因编码。PSCA为GPI-锚定的细胞表面抗原的Thy-1/Ly-6家族的成员。PSCA在许多种癌症(包括前列腺癌、膀胱和胰腺癌)中被上调。
PSCA抗原可诱导抗原特异性T细胞和/或高滴度抗体应答，从而诱导或引发对表达该抗原的癌症或肿瘤或与所述癌症或肿瘤反应的免疫应答。在一些实施方案中，诱导或引发的免疫应答可以是细胞免疫应答、体液免疫应答或细胞和体液免疫应答。在一些实施方案中，诱导或引发的细胞免疫应答可包括干扰素-γ(IFN-γ)和/或肿瘤坏死因子α(TNF-α)的诱导或分泌。在其它实施方案中，诱导或引发的免疫应答可减少或抑制促进表达该抗原的肿瘤或癌症的生长的一种或多种免疫抑制因子，例如，但不限于下调MHC呈递的因子、上调抗原特异性调节性T细胞(Treg)的因子、PD-L1、FasL、细胞因子诸如IL-10和TFG-β、肿瘤相关巨噬细胞、肿瘤相关成纤维细胞、由免疫抑制细胞产生的可溶性因子、CTLA-4、PD-1、MDSC、MCP-1和免疫检查点分子，在下文中更详细地描述所述因子。
PSCA抗原可包含使它们特别有效地作为可诱导针对其的抗-PSCA免疫应答的免疫原的蛋白质表位。PSCA抗原可包含全长翻译产物、其变体、其片段或其组合。PSCA抗原可包含共有蛋白。
可针对密码子使用和相应的RNA转录物优化编码共有PSCA抗原的核酸序列。编码共有PSCA抗原的核酸可以是针对表达而被优化的密码子和RNA。在一些实施方案中，编码共有PSCA抗原的核酸序列可包括Kozak序列(例如，GCC ACC)以增强翻译的效率。编码共有PSCA抗原的核酸可包括多个终止密码子(例如，TGATGA)以增强翻译终止的效率。
编码共有PSCA抗原的核酸还可编码免疫球蛋白E(IgE)前导序列。编码共有PSCA抗原的核酸可进一步编码IgE前导序列以使得IgE前导序列的氨基酸序列通过肽键连接于共有PSCA抗原的氨基酸序列。编码共有PSCA抗原的核酸还可包括编码IgE前导序列的核苷酸序列。在一些实施方案中，编码共有PSCA抗原的核酸不含或不含有编码IgE前导序列的核苷酸序列。
在一些实施方案中，核酸编码共有PSCA抗原可以是异源核酸序列和/或含有一个或多个异源核酸序列。
(14)hTERT
本发明的疫苗可包含癌抗原hTERT、其片段或其变体。hTERT为在端粒酶的末端上合成TTAGGG标签以阻止因染色体的缩短而导致的细胞死亡的人端粒酶逆转录酶。过度增殖性细胞可具有异常高的hTERT表达。hTERT的异常表达还可在被HCV和HPV感染的过度增殖性细胞中发生。因此，HPV和HCV的免疫疗法可通过靶向以异常水平表达hTERT的细胞来增强。HPV和HCV抗原在下文中进行了更详细论述。hTERT癌抗原可进一步由2013年12月23日提交的美国专利申请No.14/139,660(其通过引用以其整体并入)来定义。
此外，用hTERT基因转染的树突细胞中的hTERT在可诱导CD8+细胞毒性T细胞并且以抗原特异性方式引发CD4+T细胞。因此，使用抗原呈递细胞(APC)中的hTERT表达来延迟衰老和支持它们呈递选择的抗原的能力可用于免疫治疗法诸如用于本文中所述的方法。
hTERT抗原可与许多种癌症(包括，但不限于黑色素瘤、前列腺癌、肝癌、子宫颈癌、复发性呼吸道乳头状瘤病(RRP)、肛门癌、头颈癌和血癌)相关或在所述癌症中表达。因此，当包括本文中所述的hTERT抗原时，疫苗可用于治疗患有许多种癌症(包括，但不限于黑色素瘤、前列腺癌、肝癌、子宫颈癌、复发性呼吸道乳头状瘤病(RRP)、肛门癌、头颈癌和血癌)的受试者。
nTERT抗原可诱导抗原特异性T细胞和/或高滴度抗体应答，从而诱导或引发对表达该抗原的癌症或肿瘤或与所述癌症或肿瘤反应的免疫应答。在一些实施方案中，诱导或引发的免疫应答可以是细胞免疫应答、体液免疫应答或细胞和体液免疫应答。在一些实施方案中，诱导或引发的细胞免疫应答可包括干扰素-γ(IFN-γ)和/或肿瘤坏死因子α(TNF-α)的诱导或分泌。在其它实施方案中，诱导或引发的免疫应答可减少或抑制促进表达该抗原的肿瘤或癌症的生长的一种或多种免疫抑制因子，例如，但不限于下调MHC呈递的因子、上调抗原特异性调节性T细胞(Treg)的因子、PD-L1、FasL、细胞因子诸如IL-10和TFG-β、肿瘤相关巨噬细胞、肿瘤相关成纤维细胞、由免疫抑制细胞产生的可溶性因子、CTLA-4、PD-1、MDSC、MCP-1和免疫检查点分子，在下文中更详细地描述所述因子。
hTERT抗原可包含使它们特别有效地作为可诱导针对其的抗-hTERT免疫应答的免疫原的蛋白质表位。hTERT抗原可包含全长翻译产物、其变体、其片段或其组合。hTERT抗原可包含共有蛋白。
可针对密码子使用和相应的RNA转录物优化编码hTERT抗原或共有hTERT抗原的核酸序列。编码hTERT抗原或共有hTERT抗原的核酸可以是针对表达而被优化的密码子和RNA。在一些实施方案中，编码hTERT抗原或共有hTERT抗原的核酸序列可包括Kozak序列(例如，GCC ACC)以增强翻译的效率。编码hTERT抗原或共有hTERT抗原的核酸可包括多个终止密码子(例如，TGA TGA)以增强翻译终止的效率。
编码hTERT抗原或共有hTERT抗原的核酸还可编码免疫球蛋白E(IgE)前导序列。编码hTERT抗原或共有hTERT抗原的核酸可进一步编码IgE前导序列以使得IgE前导序列的氨基酸序列分别通过肽键连接于hTERT抗原或共有hTERT抗原的氨基酸序列。编码hTERT抗原或共有hTERT抗原的核酸还可包括编码IgE前导序列的核苷酸序列。在一些实施方案中，编码hTERT抗原或共有HTERT抗原的核酸不含或不含有编码IgE前导序列的核苷酸序列。
在一些实施方案中，编码hTERT抗原或共有hTERT抗原的核酸可以是异源核酸序列和/或含有一个或多个异源核酸序列。可相对野生型hTERT抗原突变编码hTERT抗原或共有hTERT抗原的核酸，以使得hTERT抗原或共有hTERT抗原的氨基酸序列中的一个或多个氨基酸或残基分别被另一种氨基酸或残基替代或取代。可相对野生型hTERT抗原突变编码hTERT抗原或共有hTERT抗原的核酸，以使得hTERT抗原或共有hTERT抗原的氨基酸序列中的一个或多个残基分别被另一种残基替代或取代，从而使被施予编码hTERT抗原或共有hTERT抗原的核酸、hTERT抗原或共有hTERT抗原或其组合的哺乳动物的免疫系统不再耐受hTERT。相对于野生型hTERT抗原突变编码hTERT抗原或共有hTERT抗原的核酸，以使得hTERT抗原或共有hTERT抗原的氨基酸序列中的精氨酸589、天冬氨酸盐1005或精氨酸589和天冬氨酸盐1005被酪氨酸残基替代或取代。
hTERT抗原可以是核酸序列SEQ ID NO:23，其编码氨基酸序列SEQ ID NO:24。SEQID NO:23编码连接于IgE前导序列的hTERT蛋白。可将hTERT蛋白连接于IgE前导序列和HA标签。在其它实施方案中，hTERT蛋白可以不含或不连接于IgE前导序列和/或HA标签。
在一些实施方案中，hTERT抗原可以是在SEQ ID NO:23中所示的核酸序列的完整长度上具有至少约80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的同一性的核酸序列。在其它实施方案中，hTERT抗原可以是编码在SEQ ID NO:24所示的氨基酸序列的完整长度上具有至少约80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的同一性的氨基酸序列的核酸序列。hTERT抗原可以是在SEQ ID NO:24中所示的氨基酸序列的完整长度上具有至少约80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的同一性的氨基酸序列。
一些实施方案涉及编码与hTERT蛋白同源的蛋白、hTERT蛋白的免疫原性片段和同源蛋白的免疫原性片段的核酸序列。可提供编码与序列具有高达95％的同源性、与序列具有高达96％的同源性、与序列具有高达97％的同源性、与序列具有高达98％的同源性、与序列具有高达99％的同源性的免疫原性蛋白的此类核酸分子。同样地，还提供编码本文中所示的免疫原性片段和与本文中所示的蛋白质同源的蛋白质的免疫原性片段的核酸序列。
一些实施方案涉及与本文中的核酸编码序列具有95％的同源性的编码免疫原性蛋白的核酸分子。一些实施方案涉及与本文中的核酸编码序列具有96％的同源性的编码免疫原性蛋白的核酸分子。一些实施方案涉及与本文中的核酸编码序列具有97％的同源性的编码免疫原性蛋白的核酸分子。一些实施方案涉及与本文中的核酸编码序列具有98％的同源性的编码免疫原性蛋白的核酸分子。一些实施方案涉及与本文中的核酸编码序列具有99％的同源性的编码免疫原性蛋白的核酸分子。在一些实施方案中，具有与本文中公开的共有蛋白的编码序列同源的本文中公开的编码序列的核酸分子包括连接于编码本文中公开的同源蛋白序列的编码序列的5'末端的编码IgE前导序列的序列。
一些实施方案涉及编码与全长hTERT共有蛋白具特定百分比同一性的蛋白质、hTERT共有蛋白的免疫原性片段和与hTERT共有蛋白具有同一性的蛋白质的免疫原性片段的核酸序列。可提供编码与全长hTERT共有序列具有高达80％的同一性、与全长共有序列具有高达85％的同一性、与全长hTERT共有序列具有高达90％的同一性、与全长hTERT共有序列具有高达91％的同一性、与全长hTERT共有序列具有高达92％的同一性、与全长hTERT共有序列具有高达93％的同一性、与全长hTERT共有序列具有高达94％的同一性、与全长hTERT共有序列具有高达95％的同一性、与全长hTERT共有序列具有高达96％的同一性、与全长hTERT共有序列具有高达97％的同一性、与全长hTERT共有序列具有高达98％的同一性和与全长hTERT共有序列具有高达99％的同一性的免疫原性蛋白的此类核酸分子。同样地，还提供了编码本文中所示的免疫原性片段和与本文中所示的hTERT蛋白具有如上指定的相似百分比同一性的蛋白质的免疫原性片段的核酸序列。
在一些实施方案中，核酸序列不含编码前导序列的编码序列。在一些实施方案中，核酸序列不含编码IgE前导序列的编码序列。
一些实施方案涉及SEQ ID NO:23的片段。片段可以是SEQ ID NO:23的至少10％、至少15％、至少20％、至少25％、至少30％、至少35％、至少40％、至少45％、至少50％、至少55％至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％。片段可与SEQ ID NO:23的片段具有至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％的同源性。片段可与SEQ ID NO:23的片段具有至少80％、至少85％、至少90％至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％的同一性。在一些实施方案中，片段包括编码前导序列，诸如例如，免疫球蛋白前导序列，诸如IgE前导序列的序列。在一些实施方案中，片段不含编码前导序列的编码序列。在一些实施方案中，片段不含编码前导序列，诸如例如，IgE前导序列的编码序列。
此外，hTERT蛋白的氨基酸序列为SEQ ID NO:24。连接于IgE前导序列的hTERT蛋白的氨基酸序为SEQ ID NO:24。连接于IgE前导序列的hTERT蛋白的氨基酸序列可连接于HA标签。
一些实施方案涉及与SEQ ID NO:24同源的蛋白质。一些实施方案涉及与SEQ IDNO:24中所示的共有蛋白序列具有95％的同源性的免疫原性蛋白。一些实施方案涉及与SEQID NO:24中所示的共有蛋白序列具有96％的同源性的免疫原性蛋白。一些实施方案涉及与SEQ ID NO:24中所示的共有蛋白序列具有97％的同源性的免疫原性蛋白。一些实施方案涉及与SEQ ID NO:24中所示的共有蛋白序列具有98％的同源性的免疫原性蛋白。一些实施方案涉及与SEQ ID NO:24中所示的共有蛋白序列具有99％的同源性的免疫原性蛋白。
一些实施方案涉及与SEQ ID NO:24相同的蛋白质。一些实施方案涉及具有与如SEQ ID NO:24中所示的全长氨基酸序列具有80％的同一性的氨基酸序列的免疫原性蛋白。一些实施方案涉及具有与如SEQ ID NO:24中所示的全长氨基酸序列具有85％的同一性的氨基酸序列的免疫原性蛋白。一些实施方案涉及具有与如SEQ ID NO:24中所示的全长氨基酸序列具有90％的同一性的氨基酸序列的免疫原性蛋白。一些实施方案涉及具有与如SEQID NO:24中所示的全长氨基酸序列具有91％的同一性的氨基酸序列的免疫原性蛋白。一些实施方案涉及具有与如SEQ ID NO:24中所示的全长氨基酸序列具有92％的同一性的氨基酸序列的免疫原性蛋白。一些实施方案涉及具有与如SEQ ID NO:24中所示的全长氨基酸序列具有93％的同一性的氨基酸序列的免疫原性蛋白。一些实施方案涉及具有与如SEQ IDNO:24中所示的全长氨基酸序列具有94％的同一性的氨基酸序列的免疫原性蛋白。一些实施方案涉及具有与如SEQ ID NO:24中所示的全长氨基酸序列具有95％的同一性的氨基酸序列的免疫原性蛋白。一些实施方案涉及具有与如SEQ ID NO:24中所示的全长氨基酸序列具有96％的同一性的氨基酸序列的免疫原性蛋白。一些实施方案涉及具有与如SEQ ID NO:24中所示的全长氨基酸序列具有97％的同一性的氨基酸序列的免疫原性蛋白。一些实施方案涉及具有与如SEQ ID NO:24中所示的全长氨基酸序列具有98％的同一性的氨基酸序列的免疫原性蛋白。一些实施方案涉及具有与如SEQ ID NO:24中所示的全长氨基酸序列具有99％的同一性的氨基酸序列的免疫原性蛋白。
在一些实施方案中，蛋白质不含前导序列。在一些实施方案中，蛋白质不含IgE前导序列。蛋白的片段可包含蛋白的至少10％、至少15％、至少20％、至少25％、至少30％、至少35％、至少40％、至少45％、至少50％、至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％。可提供SEQ ID NO:24的免疫原性片段。免疫原性片段可包含SEQ ID NO:24的至少10％、至少15％、至少20％、至少25％、至少30％、至少35％、至少40％、至少45％、至少50％、至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％。在一些实施方案中，片段包括前导序列，诸如例如，免疫球蛋白前导序列，诸如IgE前导序列。在一些实施方案中，片段不含前导序列。在一些实施方案中，片段不含前导序列，诸如例如，IgE前导序列。
可提供具有与SEQ ID NO:24的免疫原性片段同源的氨基酸序列的蛋白质的免疫原性片段。此类免疫原性片段可包含与SEQ ID NO:18具有95％或更大的同源性的蛋白质的至少10％、至少15％、至少20％、至少25％、至少30％、至少35％、至少40％、至少45％、至少50％、至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％。一些实施方案涉及与本文中的蛋白序列的免疫原性片段具有96％的同源性的免疫原性片段。一些实施方案涉及与本文中的蛋白序列的免疫原性片段具有97％的同源性的免疫原性片段。一些实施方案涉及与本文中的蛋白序列的免疫原性片段具有98％的同源性的免疫原性片段。一些实施方案涉及与本文中的蛋白序列的免疫原性片段具有99％的同源性的免疫原性片段。在一些实施方案中，片段包括前导序列，诸如例如，免疫球蛋白前导序列，诸如IgE前导序列。在一些实施方案中，片段不含前导序列。在一些实施方案中，片段不含前导序列，诸如例如，IgE前导序列。
可提供具有与SEQ ID NO:24的免疫原性片段相同的氨基酸序列的蛋白质的免疫原性片段。此类免疫原性片段可包含与SEQ ID NO:24中所示的氨基酸序列具有80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％的同一性的蛋白质的至少10％、至少15％、至少20％、至少25％、至少30％、至少35％、至少40％、至少45％、至少50％、至少55％至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％。在一些实施方案中，片段包括前导序列，诸如例如，免疫球蛋白前导序列，诸如IgE前导序列。在一些实施方案中，片段不含前导序列。在一些实施方案中，片段不含前导序列，诸如例如，IgE前导序列。
如本文中针对将信号肽或前导序列连接于蛋白质的N末端所指出的，信号肽/前导序列替代蛋白质的N末端甲硫氨酸，所述N末端甲硫氨酸由编码无信号肽编码序列的编码所述蛋白质的核酸序列的起始密码子编码。
SEQ ID NO:23的片段可包含30个或更多个核苷酸，包括编码免疫显性表位的优选序列。在一些实施方案中，SEQ ID NO:23的片段可包含45或更多个核苷酸，包括编码免疫显性表位的优选序列。在一些实施方案中，SEQ ID NO:23的片段可包含60个或更多个核苷酸，包括编码免疫显性表位的优选序列。在一些实施方案中，SEQ ID NO:23的片段可包含75或更多个核苷酸，包括编码免疫显性表位的优选序列。在一些实施方案中，SEQ ID NO:23的片段可包含90个或更多个核苷酸，包括编码免疫显性表位的优选序列。在一些实施方案中，SEQ ID NO:23的片段可包含120个或更多个核苷酸，包括编码免疫显性表位的优选序列。在一些实施方案中，SEQ ID NO:23的片段可包含150个或更多个核苷酸，包括编码免疫显性表位的优选序列。在一些实施方案中，SEQ ID NO:23的片段可包含180个或更多个核苷酸，包括编码免疫显性表位的优选序列。在一些实施方案中，SEQ ID NO:23的片段可包含210个或更多个核苷酸，包括编码免疫显性表位的优选序列。在一些实施方案中，SEQ ID NO:23的片段可包含240个或更多个核苷酸，包括编码免疫显性表位的优选序列。在一些实施方案中，SEQ ID NO:23的片段可包含270个或更多个核苷酸，包括编码免疫显性表位的优选序列。在一些实施方案中，SEQ ID NO:23的片段可包含300个或更多个核苷酸，包括编码免疫显性表位的优选序列。在一些实施方案中，SEQ ID NO:23的片段可包含360个或更多个核苷酸，包括编码免疫显性表位的优选序列。在一些实施方案中，SEQ ID NO:23的片段可包含420个或更多个核苷酸，包括编码免疫显性表位的优选序列。在一些实施方案中，SEQ ID NO:23的片段可包含480个或更多个核苷酸，包括编码免疫显性表位的优选序列。在一些实施方案中，SEQ ID NO:23的片段可包含540个或更多个核苷酸，包括编码免疫显性表位的优选序列。在一些实施方案中，SEQ ID NO:23的片段可包含600个或更多个核苷酸，包括编码免疫显性表位的优选序列。在一些实施方案中，SEQ ID NO:23的片段可包含300个或更多个核苷酸，包括编码免疫显性表位的优选序列。在一些实施方案中，SEQ ID NO:23的片段可包含660个或更多个核苷酸，包括编码免疫显性表位的优选序列。在一些实施方案中，SEQ ID NO:23的片段可包含720个或更多个核苷酸，包括编码免疫显性表位的优选序列。在一些实施方案中，SEQ ID NO:23的片段可包含780或更更多个核苷酸，包括编码免疫显性表位的优选序列。在一些实施方案中，SEQ ID NO:23的片段可包含840个或更多个核苷酸，包括编码免疫显性表位的优选序列。在一些实施方案中，SEQ ID NO:23的片段可包含900或更更多个核苷酸，包括编码免疫显性表位的优选序列。在一些实施方案中，SEQ ID NO:23的片段可包含960或更更多个核苷酸，包括编码免疫显性表位的优选序列。在一些实施方案中，SEQ ID NO:23的片段可包含1020或更更多个核苷酸，包括编码免疫显性表位的优选序列。在一些实施方案中，SEQ ID NO:23的片段可包含1080个或更多个核苷酸，包括编码免疫显性表位的优选序列。在一些实施方案中，SEQ ID NO:23的片段可包含1140或更更多个核苷酸，包括编码免疫显性表位的优选序列。在一些实施方案中，SEQ ID NO:23的片段可包含1200个或更多个核苷酸，包括编码免疫显性表位的优选序列。在一些实施方案中，SEQ ID NO:23的片段可包含1260个或更多个核苷酸，包括编码免疫显性表位的优选序列。在一些实施方案中，SEQ IDNO:23的片段可包含1320或更更多个核苷酸，包括编码免疫显性表位的优选序列。在一些实施方案中，SEQ ID NO:23的片段可包含1380或更更多个核苷酸，包括编码免疫显性表位的优选序列。在一些实施方案中，SEQ ID NO:23的片段可包含1440或更更多个核苷酸，包括编码免疫显性表位的优选序列。在一些实施方案中，SEQ ID NO:23的片段可包含1500或更更多个核苷酸，包括编码免疫显性表位的优选序列。在一些实施方案中，SEQ ID NO:23的片段可包含1560个或更多个核苷酸，包括编码免疫显性表位的优选序列。在一些实施方案中，SEQ ID NO:23的片段可包含1620个或更多个核苷酸，包括编码免疫显性表位的优选序列。在一些实施方案中，SEQ ID NO:23的片段可包含1680个或更多个核苷酸，包括编码免疫显性表位的优选序列。在一些实施方案中，SEQ ID NO:23的片段可包含1740个或更多个核苷酸，包括编码免疫显性表位的优选序列。在一些实施方案中，SEQ ID NO:23的片段可包含1800个或更多个核苷酸，包括编码免疫显性表位的优选序列。在一些实施方案中，SEQ IDNO:23的片段可包含1860个或更多个核苷酸，包括编码免疫显性表位的优选序列。在一些实施方案中，SEQ ID NO:23的片段可包含1920个或更多个核苷酸，包括编码免疫显性表位的优选序列。在一些实施方案中，SEQ ID NO:34的片段可包含1980个或更多个核苷酸，包括编码免疫显性表位的优选序列。在一些实施方案中，SEQ ID NO:23的片段可包含2040个或更多个核苷酸，包括编码免疫显性表位的优选序列。在一些实施方案中，SEQ ID NO:23的片段可包含2100个或更多个核苷酸，包括编码免疫显性表位的优选序列。在一些实施方案中，SEQ ID NO:23的片段可包含2160个或更多个核苷酸，包括编码免疫显性表位的优选序列。在一些实施方案中，SEQ ID NO:23的片段可包含2220个或更多个核苷酸，包括编码免疫显性表位的优选序列。在一些实施方案中，SEQ ID NO:23的片段可包含2280个或更多个核苷酸，包括编码免疫显性表位的优选序列。在一些实施方案中，SEQ ID NO:23的片段可包含2340个或更多个核苷酸，包括编码免疫显性表位的优选序列。在一些实施方案中，SEQ IDNO:23的片段可包含2400个或更多个核苷酸，包括编码免疫显性表位的优选序列。在一些实施方案中，SEQ ID NO:23的片段可包含2460个或更多个核苷酸，包括编码免疫显性表位的优选序列。在一些实施方案中，SEQ ID NO:23的片段可包含2520个或更多个核苷酸，包括编码免疫显性表位的优选序列。在一些实施方案中，SEQ ID NO:23的片段可包含2580个或更多个核苷酸，包括编码免疫显性表位的优选序列。在一些实施方案中，SEQ ID NO:23的片段可包含2640个或更多个核苷酸，包括编码免疫显性表位的优选序列。在一些实施方案中，SEQ ID NO:23的片段可包含2700个或更多个核苷酸，包括编码免疫显性表位的优选序列。在一些实施方案中，SEQ ID NO:23的片段可包含2760个或更多个核苷酸，包括编码免疫显性表位的优选序列。在一些实施方案中，SEQ ID NO:23的片段可包含2820个或更多个核苷酸，包括编码免疫显性表位的优选序列。在一些实施方案中，SEQ ID NO:23的片段可包含2880个或更多个核苷酸，包括编码免疫显性表位的优选序列。在一些实施方案中，SEQ IDNO:23的片段可包含2940个或更多个核苷酸，包括编码免疫显性表位的优选序列。在一些实施方案中，SEQ ID NO:23的片段可包含3000个或更多个核苷酸，包括编码免疫显性表位的优选序列。在一些实施方案中，SEQ ID NO:23的片段可包含3060个或更多个核苷酸，包括编码免疫显性表位的优选序列。在一些实施方案中，SEQ ID NO:23的片段可包含3120个或更多个核苷酸，包括编码免疫显性表位的优选序列。在一些实施方案中，SEQ ID NO:23的片段可包含3180个或更多个核苷酸，包括编码免疫显性表位的优选序列。在一些实施方案中，SEQ ID NO:23的片段可包含3240个或更多个核苷酸，包括编码免疫显性表位的优选序列。在一些实施方案中，SEQ ID NO:23的片段可包含3300个或更多个核苷酸，包括编码免疫显性表位的优选序列。在一些实施方案中，SEQ ID NO:23的片段可包含3360个或更多个核苷酸，包括编码免疫显性表位的优选序列。在一些实施方案中，SEQ ID NO:23的片段可包含3420个或更多个核苷酸，包括编码免疫显性表位的优选序列。在一些实施方案中，SEQ IDNO:23的片段可包含3480个或更多个核苷酸，包括编码免疫显性表位的优选序列。在一些实施方案中，SEQ ID NO:23的片段可包含IgE前导序列的编码序列。在一些实施方案中，SEQID NO:23的片段不包含IgE前导序列的编码序列。
片段可包含少于60个核苷酸，在一些实施方案中少于75个核苷酸，在一些实施方案中少于90个核苷酸，在一些实施方案中少于120个核苷酸，在一些实施方案中少于150个核苷酸，在一些实施方案中少于180个核苷酸，在一些实施方案中少于210个核苷酸，在一些实施方案中少于240个核苷酸，在一些实施方案中少于270个核苷酸，在一些实施方案中少于300个核苷酸，在一些实施方案中少于360个核苷酸，在一些实施方案中少于420个核苷酸，在一些实施方案中少于480个核苷酸，在一些实施方案中少于540个核苷酸，在一些实施方案中少于600个核苷酸，在一些实施方案中少于660个核苷酸，在一些实施方案中少于720个核苷酸，在一些实施方案中少于780个核苷酸，在一些实施方案中少于840个核苷酸，在一些实施方案中少于900个核苷酸，在一些实施方案中少于960个核苷酸，在一些实施方案中少于1020个核苷酸，在一些实施方案中少于1080个核苷酸，在一些实施方案中少于1140个核苷酸，在一些实施方案中少于1200个核苷酸，在一些实施方案中少于1260个核苷酸，在一些实施方案中少于1320个核苷酸，在一些实施方案中少于1380个核苷酸，在一些实施方案中少于1440个核苷酸，在一些实施方案中少于1500个核苷酸，在一些实施方案中少于1560个核苷酸，在一些实施方案中少于1620个核苷酸，在一些实施方案中少于1680个核苷酸，在一些实施方案中少于1740个核苷酸，在一些实施方案中少于1800个核苷酸，在一些实施方案中少于1860个核苷酸，在一些实施方案中少于1920个核苷酸，在一些实施方案中少于1980个核苷酸，在一些实施方案中少于2040个核苷酸，在一些实施方案中少于2100个核苷酸，在一些实施方案中少于2160个核苷酸，在一些实施方案中少于2220个核苷酸，在一些实施方案中少于2280个核苷酸，在一些实施方案中少于2340个核苷酸，在一些实施方案中少于2400个核苷酸，在一些实施方案中少于2460个核苷酸，在一些实施方案中少于2520个核苷酸，在一些实施方案中少于2580个核苷酸，在一些实施方案中少于2640个核苷酸，在一些实施方案中少于2700个核苷酸，在一些实施方案中少于2760个核苷酸，在一些实施方案中少于2820个核苷酸，在一些实施方案中少于2860个核苷酸，在一些实施方案中少于2940个核苷酸，在一些实施方案中少于3000个核苷酸，在一些实施方案中少于3060个核苷酸，在一些实施方案中少于3120个核苷酸，在一些实施方案中少于3180个核苷酸，在一些实施方案中少于3240个核苷酸，在一些实施方案中少于3300个核苷酸，在一些实施方案中少于3360个核苷酸，在一些实施方案中少于3420个核苷酸，在一些实施方案中少于3480个核苷酸以及在一些实施方案中少于3510个核苷酸。
SEQ ID NO:24的片段可包含15个或更多个氨基酸，包括编码免疫显性表位的优选序列。在一些实施方案中，SEQ ID NO:24的片段可包含18个或更多个氨基酸，包括编码免疫显性表位的优选序列。在一些实施方案中，SEQ ID NO:24的片段可包含21个或更多个氨基酸，包括编码免疫显性表位的优选序列。在一些实施方案中，SEQ ID NO:24的片段可包含24个或更多个氨基酸，包括编码免疫显性表位的优选序列。在一些实施方案中，SEQ ID NO:24的片段可包含30个或更多个氨基酸，包括编码免疫显性表位的优选序列。在一些实施方案中，SEQ ID NO:24的片段可包含36个或更多个氨基酸，包括编码免疫显性表位的优选序列。在一些实施方案中，SEQ ID NO:24的片段可包含42个或更多个氨基酸，包括编码免疫显性表位的优选序列。在一些实施方案中，SEQ ID NO:24的片段可包含48个或更多个氨基酸，包括编码免疫显性表位的优选序列。在一些实施方案中，SEQ ID NO:24的片段可包含54个或更多个氨基酸，包括编码免疫显性表位的优选序列。在一些实施方案中，SEQ ID NO:24的片段可包含60个或更多个氨基酸，包括编码免疫显性表位的优选序列。在一些实施方案中，SEQ ID NO:24的片段可包含66个或更多个氨基酸，包括编码免疫显性表位的优选序列。在一些实施方案中，SEQ ID NO:24的片段可包含72个或更多个氨基酸，包括编码免疫显性表位的优选序列。在一些实施方案中，SEQ ID NO:24的片段可包含90个或更多个氨基酸，包括编码免疫显性表位的优选序列。在一些实施方案中，SEQ ID NO:24的片段可包含120个或更多个氨基酸，包括编码免疫显性表位的优选序列。在一些实施方案中，SEQ ID NO:24的片段可包含150个或更多个氨基酸，包括编码免疫显性表位的优选序列。在一些实施方案中，SEQID NO:24的片段可包含180个或更多个氨基酸，包括编码免疫显性表位的优选序列。在一些实施方案中，SEQ ID NO:24的片段可包含210个或更多个氨基酸，包括编码免疫显性表位的优选序列。在一些实施方案中，SEQ ID NO:24的片段可包含240个或更多个氨基酸，包括编码免疫显性表位的优选序列。在一些实施方案中，SEQ ID NO:24的片段可包含270个或更多个氨基酸，包括编码免疫显性表位的优选序列。在一些实施方案中，SEQ ID NO:24的片段可包含300个或更多个氨基酸，包括编码免疫显性表位的优选序列。在一些实施方案中，SEQID NO:24的片段可包含330个或更多个氨基酸，包括编码免疫显性表位的优选序列。在一些实施方案中，SEQ ID NO:24的片段可包含360个或更多个氨基酸，包括编码免疫显性表位的优选序列。在一些实施方案中，SEQ ID NO:24的片段可包含390个或更多个氨基酸，包括编码免疫显性表位的优选序列。在一些实施方案中，SEQ ID NO:24的片段可包含420个或更多个氨基酸，包括编码免疫显性表位的优选序列。在一些实施方案中，SEQ ID NO:24的片段可包含450个或更多个氨基酸，包括编码免疫显性表位的优选序列。在一些实施方案中，SEQID NO:24的片段可包含480个或更多个氨基酸，包括编码免疫显性表位的优选序列。在一些实施方案中，SEQ ID NO:24的片段可包含510个或更多个氨基酸，包括编码免疫显性表位的优选序列。在一些实施方案中，SEQ ID NO:24的片段可包含540个或更多个氨基酸，包括编码免疫显性表位的优选序列。在一些实施方案中，SEQ ID NO:24的片段可包含570个或更多个氨基酸，包括编码免疫显性表位的优选序列。在一些实施方案中，SEQ ID NO:24的片段可包含600个或更多个氨基酸，包括编码免疫显性表位的优选序列。在一些实施方案中，SEQID NO:24的片段可包含630个或更多个氨基酸，包括编码免疫显性表位的优选序列。在一些实施方案中，SEQ ID NO:24的片段可包含660个或更多个氨基酸，包括编码免疫显性表位的优选序列。在一些实施方案中，SEQ ID NO:24的片段可包含690个或更多个氨基酸，包括编码免疫显性表位的优选序列。在一些实施方案中，SEQ ID NO:24的片段可包含720个或更多个氨基酸，包括编码免疫显性表位的优选序列。在一些实施方案中，SEQ ID NO:24的片段可包含750个或更多个氨基酸，包括编码免疫显性表位的优选序列。在一些实施方案中，SEQID NO:24的片段可包含780个或更多个氨基酸，包括编码免疫显性表位的优选序列。在一些实施方案中，SEQ ID NO:24的片段可包含810个或更多个氨基酸，包括编码免疫显性表位的优选序列。在一些实施方案中，SEQ ID NO:24的片段可包含840个或更多个氨基酸，包括编码免疫显性表位的优选序列。在一些实施方案中，SEQ ID NO:24的片段可包含870个或更多个氨基酸，包括编码免疫显性表位的优选序列。在一些实施方案中，SEQ ID NO:24的片段可包含900个或更多个氨基酸，包括编码免疫显性表位的优选序列。在一些实施方案中，SEQID NO:24的片段可包含930个或更多个氨基酸，包括编码免疫显性表位的优选序列。在一些实施方案中，SEQ ID NO:24的片段可包含960个或更多个氨基酸，包括编码免疫显性表位的优选序列。在一些实施方案中，SEQ ID NO:24的片段可包含990个或更多个氨基酸，包括编码免疫显性表位的优选序列。在一些实施方案中，SEQ ID NO:24的片段可包含1020个或更多个氨基酸，包括编码免疫显性表位的优选序列。在一些实施方案中，SEQ ID NO:24的片段可包含1050个或更多个氨基酸，包括编码免疫显性表位的优选序列。在一些实施方案中，SEQ ID NO:24的片段可包含1080个或更多个氨基酸，包括编码免疫显性表位的优选序列。在一些实施方案中，SEQ ID NO:24的片段可包含1110个或更多个氨基酸，包括编码免疫显性表位的优选序列。在一些实施方案中，SEQ ID NO:24的片段可包含1140个或更多个氨基酸，包括编码免疫显性表位的优选序列。在一些实施方案中，SEQ ID NO:24的片段可包含1170个或更多个氨基酸，包括编码免疫显性表位的优选序列。在一些实施方案中，SEQ IDNO:24的片段可包含1200个或更多个氨基酸，包括编码免疫显性表位的优选序列。在一些实施方案中，SEQ ID NO:24的片段可包含1230个或更多个氨基酸，包括编码免疫显性表位的优选序列。在一些实施方案中，SEQ ID NO:24的片段可包含1260个或更多个氨基酸，包括编码免疫显性表位的优选序列。在一些实施方案中，SEQ ID NO:24的片段可包含1290个或更多个氨基酸，包括编码免疫显性表位的优选序列。在一些实施方案中，SEQ ID NO:24的片段可包含1320个或更多个氨基酸，包括编码免疫显性表位的优选序列。在一些实施方案中，SEQ ID NO:24的片段可包含1350个或更多个氨基酸，包括编码免疫显性表位的优选序列。在一些实施方案中，SEQ ID NO:24的片段可包含1380个或更多个氨基酸，包括编码免疫显性表位的优选序列。在一些实施方案中，SEQ ID NO:24的片段可包含1410个或更多个氨基酸，包括编码免疫显性表位的优选序列。在一些实施方案中，SEQ ID NO:24的片段可包含1440个或更多个氨基酸，包括编码免疫显性表位的优选序列。在一些实施方案中，SEQ IDNO:24的片段可包含1470个或更多个氨基酸，包括编码免疫显性表位的优选序列。在一些实施方案中，SEQ ID NO:24的片段可包含1500个或更多个氨基酸，包括编码免疫显性表位的优选序列。在一些实施方案中，SEQ ID NO:24的片段可包含IgE前导序列的编码序列。在一些实施方案中，SEQ ID NO:24的片段不含IgE前导序列的编码序列。
片段可包含少于24个氨基酸，在一些实施方案中少于30个氨基酸，在一些实施方案中少于36个氨基酸，在一些实施方案中少于42个氨基酸，在一些实施方案中少于48个氨基酸，在一些实施方案中少于54个氨基酸，在一些实施方案中少于60个氨基酸，在一些实施方案中少于72个氨基酸，在一些实施方案中少于90个氨基酸，在一些实施方案中少于120个氨基酸，在一些实施方案中少于150个氨基酸，在一些实施方案中少于180个氨基酸，在一些实施方案中少于210个氨基酸在一些实施方案中少于240个氨基酸，在一些实施方案中少于260个氨基酸，在一些实施方案中少于290个氨基酸，在一些实施方案中少于320个氨基酸，在一些实施方案中少于350个氨基酸，在一些实施方案中少于380个氨基酸，在一些实施方案中少于410个氨基酸在一些实施方案中少于440个氨基酸，在一些实施方案中少于470个氨基酸在一些实施方案中少于500个氨基酸，在一些实施方案中少于530个氨基酸在一些实施方案中少于560个氨基酸，在一些实施方案中少于590个氨基酸，在一些实施方案中少于620个氨基酸，在一些实施方案中少于650个氨基酸，在一些实施方案中少于680个氨基酸，在一些实施方案中少于710个氨基酸，在一些实施方案中少于740个氨基酸，在一些实施方案中少于770个氨基酸，在一些实施方案中少于800个氨基酸，在一些实施方案中少于830个氨基酸，在一些实施方案中少于860个氨基酸，在一些实施方案中少于890个氨基酸，在一些实施方案中少于920个氨基酸，在一些实施方案中少于950个氨基酸，在一些实施方案中少于980个氨基酸，在一些实施方案中少于1010个氨基酸，在一些实施方案中少于1040个氨基酸，在一些实施方案中少于1070个氨基酸，在一些实施方案中少于1200个氨基酸，在一些实施方案中少于1230个氨基酸，在一些实施方案中少于1260个氨基酸，在一些实施方案中少于1290个氨基酸，在一些实施方案中少于1320个氨基酸，在一些实施方案中少于1350个氨基酸，在一些实施方案中少于1380个氨基酸，在一些实施方案中少于1410个氨基酸，在一些实施方案中少于1440个氨基酸，在一些实施方案中少于1470个氨基酸以及在一些实施方案中少于1500个氨基酸。
(15)MAGE A1
本发明的疫苗可包含癌抗原黑色素瘤-相关抗原1(MAGE A1)、其片段或其变体。由MAGEA1基因编码的MAGE A1为280个氨基酸的蛋白质，并且被发现仅由肿瘤细胞和精细胞表达。MAGE A1正常躯体组织中的表达依赖于DNA甲基化。这些基因在全基因组去甲基化过程的过程中在许多类型的肿瘤中被激活，所述全基因组去甲基化过程通常伴随肿瘤发生。具体地，在致瘤性转化中，这些基因被激活，表达，并且可成为被免疫系统识别和攻击的抗原性靶。因此，MAGE基因通过靶向一些早期肿瘤细胞以进行免疫破坏来参与免疫过程。MAGEA1可在许多种癌症(包括，但不限于黑色素瘤、肺癌和食管鳞状细胞癌)中表达。
MAGE A1抗原可诱导抗原特异性T细胞和/或高滴度抗体应答，从而诱导或引发对表达该抗原的癌症或肿瘤或与所述癌症或肿瘤反应的免疫应答。在一些实施方案中，诱导或引发的免疫应答可以是细胞免疫应答、体液免疫应答或细胞和体液免疫应答。在一些实施方案中，诱导或引发的细胞免疫应答可包括干扰素-γ(IFN-γ)和/或肿瘤坏死因子α(TNF-α)的诱导或分泌。在其它实施方案中，诱导或引发的免疫应答可减少或抑制促进表达该抗原的肿瘤或癌症的生长的一种或多种免疫抑制因子，例如，但不限于下调MHC呈递的因子、上调抗原特异性调节性T细胞(Treg)的因子、PD-L1、FasL、细胞因子诸如IL-10和TFG-β、肿瘤相关巨噬细胞、肿瘤相关成纤维细胞、由免疫抑制细胞产生的可溶性因子、CTLA-4、PD-1、MDSC、MCP-1和免疫检查点分子，在下文中更详细地描述所述因子。
(16)WT1
本发明的疫苗可包含癌抗原维尔姆斯肿瘤1(WT1)、其片段或其变体。WT1是在N末端上含有富含脯氨酸/谷氨酰胺的DNA结合结构域和在C末端上含有4个锌指基序的转录因子。WT1在泌尿生殖系统的正常发育中起着作用，并且与许多因子例如，p53(一种已知的肿瘤抑制子)和丝氨酸蛋白酶HtrA2(其可在用细胞毒性药物处理后在多个位点上切割WT1)相互作用。
WT1的突变可导致肿瘤或癌症例如维尔姆斯肿瘤或表达WT1的肿瘤的形成。维尔姆斯肿瘤通常在转移至其它组织例如但不限于肝组织、尿道系统组织、淋巴组织和肺组织之前在一个或两个肾中形成。因此，维尔姆斯肿瘤可被认为是转移性肿瘤。维尔姆斯肿瘤通常发生在年幼儿童(例如，小于5岁)中并以散发性和遗传性形式发生。WT1癌抗原可进一步由2013年12月23日提交的PCT/US13/75141(其在此通过引用以其整体并入)定义。
WT-1抗原可诱导抗原特异性T细胞和/或高滴度抗体应答，从而诱导或引发对表达该抗原的癌症或肿瘤或与所述癌症或肿瘤反应的免疫应答。在一些实施方案中，诱导或引发的免疫应答可以是细胞免疫应答、体液免疫应答或细胞和体液免疫应答。在一些实施方案中，诱导或引发的细胞免疫应答可包括干扰素-γ(IFN-γ)和/或肿瘤坏死因子α(TNF-α)的诱导或分泌。在其它实施方案中，诱导或引发的免疫应答可减少或抑制促进表达该抗原的肿瘤或癌症的生长的一种或多种免疫抑制因子，例如，但不限于下调MHC呈递的因子、上调抗原特异性调节性T细胞(Treg)的因子、PD-L1、FasL、细胞因子诸如IL-10和TFG-β、肿瘤相关巨噬细胞、肿瘤相关成纤维细胞、由免疫抑制细胞产生的可溶性因子、CTLA-4、PD-1、MDSC、MCP-1和免疫检查点分子，在下文中更详细地描述所述因子。
因此，所述疫苗可用于治疗患有维尔姆斯肿瘤的受试者。所述疫苗可用于治疗患有许多种癌症(包括但不限于黑色素瘤、前列腺癌、肝癌、子宫颈癌、复发性呼吸道乳头状瘤病(RRP)、肛门癌、头颈癌和血癌)的受试者。所述疫苗还可用于治疗具有表达WT1的癌症或肿瘤的受试者以预防此类肿瘤在受试者中发展。WT1抗原可与天然的“正常”WT1基因不同，从而提供针对表达WT1抗原的肿瘤的治疗或预防。因此，本文中提供了与天然WT1基因不同的WT1抗原序列(即，突变的WT1基因或序列)。
可将天然WT1基因的转录物加工成多种mRNA，并且所得的蛋白质对诱发免疫应答不是完全等值的。本文中描述的突变的WT1基因避免选择性加工，从而产生一种完全长度转录物并且导致对效应T细胞和B细胞应答更强的诱发。第一突变的WTI序列被称为具有经修饰的锌指或ConWT1-L的CON WT1。SEQ ID NO:19为编码具有经修饰的锌指的WT1抗原CONWT1的核酸序列。SEQ ID NO:20为具有经修饰的锌指的WT1抗原CON WT1的氨基酸序列。第二突变的WT1序列被称为不具有锌指或ConWT1-S的CON WT1。SEQ ID NO:21为编码不具有锌指的WTI抗原CON WT1的核酸序列。SEQ ID NO:22为不具有经修饰的锌指的WT1抗原CON WT1的氨基酸序列。
WT1抗原可以是来源于两个或更多个物种的共有抗原(或免疫原)序列。WT1抗原可包含用于提高的表达的共有序列和/或修饰。修饰可包括密码子优化、RNA优化、kozak序列(例如，GCC ACC)的添加(以增加翻译起始)和/或免疫球蛋白前导序列的添加(以增加WT1抗原的免疫原性)。WT1抗原可包含信号肽诸如免疫球蛋白信号肽，例如但不限于免疫球蛋白E(IgE)或免疫球蛋白G(IgG)信号肽。在一些实施方案中，WT1共有抗原可包含血凝素(HA)标签。WT1共有抗原可被设计来引发比对应的密码子优化的WT1抗原更强和更广的细胞和/或体液免疫应答。
WT1共有抗原在一个或多个锌指中可包含一个或多个突变，从而引发比对应的密码子优化的WT1抗原更强和更广的细胞和/或体液免疫应答。一个或多个突变可以是在一个或多个锌指中配位锌离子的一个或多个氨基酸的取代。配位锌离子的一个或多个氨基酸可以是CCHH基序。因此，在一些实施方案中，所述一个或多个突变可替代CCHH基序的1、2、3或所有4个氨基酸。
在其它实施方案中，所述一个或多个突变是SEQ ID NO:20的残基312、317、342和347是除半胱氨酸(C)外的任何残基以及SEQ ID NO:20的残基330、334、360和364是除组氨酸(H)外的任何残基的突变。具体地，所述一个或多个突变是SEQ ID NO:20的残基312、317、330、334、342、347、360和364为甘氨酸(G)的突变。
在其它实施方案中，可从WT1共有抗原去除一个或多个锌指。可从WT1共有抗原除去1、2、3或所有4个锌指。
WT1共有抗原可以是编码SEQ ID NO:20的核酸SEQ ID NO:19。在一些实施方案中，WT1共有抗原可以是在SEQ ID NO:19中所示的核酸序列的完整长度上具有至少约80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％的同一性的核酸序列。在其它实施方案中，WT1共有抗原可以是编码在SEQ ID NO:20中所示的氨基酸序列的完整长度上具有至少约80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％的同一性的氨基酸序列的核酸序列。
在其它实施方案中，WT1共有抗原可以是编码在SEQ ID NO:20中所示的氨基酸序列的完整长度上具有至少约80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％的同一性的氨基酸序列的核酸序列，只要SEQ ID NO:20的残基312、317、342和347是除半胱氨酸(C)外的任何残基以及SEQID NO:20的残基330、334、360和364是除组氨酸(H)外的任何残基。在其它实施方案中，WT1共有抗原可以是编码在SEQ ID NO:20中所示的氨基酸序列的完整长度上具有至少约80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％的同一性的氨基酸序列的核酸序列，只要SEQ ID NO:20的残基312、317、330、334、342、347、360和364为甘氨酸(G)。
WT1共有抗原可以是氨基酸序列SEQ ID NO:20。在一些实施方案中，WT1共有抗原可以是在SEQ ID NO:20中所示的氨基酸序列的完整长度上具有至少约80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％的同一性的氨基酸序列。所述WT1共有抗原可以是在SEQ ID NO:20中所示的氨基酸序列的完整长度上具有至少约80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％的同一性的氨基酸序列，只要SEQ ID NO:20的残基312、317、342和347是除半胱氨酸(C)外的任何残基以及SEQ IDNO:20的残基330、334、360和364是除组氨酸(H)外的任何残基。在一些实施方案中，WT1共有序列可以是在SEQ ID NO:20中所示的氨基酸序列的完整长度上具有至少约80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％的同一性的氨基酸序列，只要SEQ ID NO:20的残基312、317、330、334、342、347、360和364是甘氨酸(G)。
WT1共有抗原可以是核酸SEQ ID NO:21，其编码SEQ ID NO:22。在一些实施方案中，WT1共有抗原可以是在SEQ ID NO:21中所示的核酸序列的完整长度上具有至少约80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％的同一性的核酸序列。在其它实施方案中，WT1共有抗原可以是编码在SEQ ID NO:22中所示的氨基酸序列的完整长度上具有至少约80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％的同一性的氨基酸序列的核酸序列。
WT1共有抗原可以是氨基酸序列SEQ ID NO:22。在一些实施方案中，WT1共有抗原可以是在SEQ ID NO:22中所示的氨基酸序列的完整长度上具有至少约80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％的同一性的氨基酸序列。
可以提供SEQ ID NO:20和SEQ ID NO:22的免疫原性片段。免疫原性片段可包含SEQ ID NO:20和/或SEQ ID NO:22的至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％。在一些实施方案中，免疫原性片段可包含SEQ ID NO:20的至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％，只要如果SEQ ID NO:20的残基312、317、342和347存在于免疫原性片段中，则这些残基是除半胱氨酸(C)外的任何残基，以及只要如果SEQ ID NO:20的残基330、334、360和364存在于免疫原性片段中，则这些残基是除组氨酸(H)外的任何残基。在其它实施方案中，免疫原性片段可包含SEQ ID NO:20的至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％，只要如果SEQ ID NO:20的残基312、317、330、334、342、347、360和364存在于免疫原性片段中，则这些残基是甘氨酸(G)。
在一些实施方案中，免疫原性片段包括前导序列，例如，免疫球蛋白前导序列，诸如免疫球蛋白E(IgE)前导序列。在一些实施方案中，免疫原性片段不含前导序列。
可提供含与SEQ ID NO:20和22的免疫原性片段具有同一性的氨基酸序列的蛋白质的免疫原性片段。此类片段可包含与SEQ ID NO:20和/或SEQ ID NO:22具有95％或更大的同一性的蛋白质的至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％。一些实施方案涉及与本文中的WT1蛋白质序列的免疫原性片段具有96％或更大的同一性的免疫原性片段。一些实施方案涉及与本文中的WT1蛋白质序列的免疫原性片段具有97％或更大的同一性的免疫原性片段。一些实施方案涉及与本文中的WT1蛋白质序列的免疫原性片段具有98％或更大的同一性的免疫原性片段。一些实施方案涉及与本文中的WT1蛋白质序列的免疫原性片段具有99％或更大的同一性的免疫原性片段。在一些实施方案中，免疫原性片段包含前导序列，例如免疫球蛋白前导序列诸如IgE前导序列。在一些实施方案中，所述免疫源性片段不含前导序列。
一些实施方案涉及SEQ ID NO:19和SEQ ID NO:21的免疫源性片段。免疫源性片段可包含SEQ ID NO:19和/或SEQ ID NO:21的至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％。在一些实施方案中，免疫原性片段包含编码前导序列例如免疫球蛋白的前导序列诸如IgE前导序列的序列。在一些实施方案中，免疫原性片段不含编码前导序列的编码序列。
可提供具有与SEQ ID NO:19和SEQ ID NO:21的免疫原性片段具有同一性的核苷酸序列的核酸的免疫原性片段。此类片段可包含与SEQ ID NO:19和/或SEQ ID NO:21具有95％或更高同一性的核酸的至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％。一些实施方案涉及与本文中的WT1核酸序列的免疫原性片段具有96％或更高同一性的免疫原性片段。一些实施方案涉及与本文中的WT1核酸序列的免疫原性片段具有97％或更高同一性的免疫原性片段。一些实施方案涉及与本文中的WT1核酸序列的免疫原性片段具有98％或更高同一性的免疫原性片段。一些实施方案涉及与本文中的WT1核酸序列的免疫原性片段具有99％或更高同一性的免疫原性片段。在一些实施方案中，免疫原性片段包含编码前导序列，例如免疫球蛋白前导序列诸如IgE前导序列的序列。在一些实施方案中，免疫原性片段不含编码前导序列的编码序列。
(17)gp100
本发明的疫苗可包含癌抗原糖蛋白100(gp100；也称为Trp2和前黑素小体蛋白(PMEL))、其片段或其变体。gp100由PMEL基因编码。其为由661个氨基酸组成的70kDa 1型跨膜糖蛋白，其在黑色素小体的生物发生中起着重要作用，因为其参与黑色素小体从I期至II期的成熟。gp100驱动条纹从多泡体内形成，并且直接参与前黑素小体的生物发生。相对于成熟黑素小体，gp100被富集在前黑素小体中，但由增殖性新生黑素细胞在肿瘤生长过程中过表达。gp100蛋白包括被来自黑色素瘤患者的外周血和来自肿瘤浸润淋巴细胞的细胞毒性T淋巴细胞识别的多种免疫原性表位。
gp100抗原可诱导抗原特异性T细胞和/或高滴度抗体应答，从而诱导或引发对表达该抗原的癌症或肿瘤或与所述癌症或肿瘤反应的免疫应答。在一些实施方案中，诱导或引发的免疫应答可以是细胞免疫应答、体液免疫应答或细胞和体液免疫应答。在一些实施方案中，诱导或引发的细胞免疫应答可包括干扰素-γ(IFN-γ)和/或肿瘤坏死因子α(TNF-α)的诱导或分泌。在其它实施方案中，诱导或引发的免疫应答可减少或抑制促进表达该抗原的肿瘤或癌症的生长的一种或多种免疫抑制因子，例如，但不限于下调MHC呈递的因子、上调抗原特异性调节性T细胞(Treg)的因子、PD-L1、FasL、细胞因子诸如IL-10和TFG-β、肿瘤相关巨噬细胞、肿瘤相关成纤维细胞、由免疫抑制细胞产生的可溶性因子、CTLA-4、PD-1、MDSC、MCP-1和免疫检查点分子，在下文中更详细地描述所述因子。
(18)病毒抗原
癌抗原可以是病毒抗原、其片段或其变体。病毒抗原可以是来自乙型肝炎病毒、丙型肝炎病毒或人乳头状瘤病毒(HPV)的抗原。HPV可以是如下论述的HPV 6、HPV 11、HPV 16或HPV 18。
病毒抗原可诱导抗原特异性T细胞和/或高滴度抗体应答，从而诱导或引发对表达该抗原的癌症或肿瘤或与所述癌症或肿瘤反应的免疫应答。在一些实施方案中，诱导或引发的免疫应答可以是细胞免疫应答、体液免疫应答或细胞和体液免疫应答。在一些实施方案中，诱导或引发的细胞免疫应答可包括干扰素-γ(IFN-γ)和/或肿瘤坏死因子α(TNF-α)的诱导或分泌。在其它实施方案中，诱导或引发的免疫应答可减少或抑制促进表达该抗原的肿瘤或癌症的生长的一种或多种免疫抑制因子，例如，但不限于下调MHC呈递的因子、上调抗原特异性调节性T细胞(Treg)的因子、PD-L1、FasL、细胞因子诸如IL-10和TFG-β、肿瘤相关巨噬细胞、肿瘤相关成纤维细胞、由免疫抑制细胞产生的可溶性因子、CTLA-4、PD-1、MDSC、MCP-1和免疫检查点分子，在下文中更详细地描述所述因子。
(a)乙型肝炎病毒抗原
病毒抗原可以是来自乙型肝炎病毒(HBV)的抗原、其片段或其变体。HBV抗原可与肝癌相关或引起肝癌。在一些实施方案中，HBV抗原可以是编码一种或多种来自HBV的抗原的异源核酸分子，诸如质粒。HBV抗原可以是全长蛋白的全长或免疫原性片段。
HBV抗原可包含共有序列和/或一个或多个修饰以改善表达。遗传修饰(包括密码子最优化、RNA最优化和高效免疫球蛋白前导序列的添加(以增强构建体的免疫原性))可被包含在经修饰的共有序列中。共有HBV抗原可包含信号肽，诸如免疫球蛋白信号肽，诸如IgE或IgG信号肽，和在一些实施方案中，可包含HA标签。免疫原可被设计来引发比相应的密码子最优化的免疫原更强和更广的细胞免疫应答。
HBV抗原可以是HBV核心蛋白、HBV表面蛋白、HBV DNA聚合酶、由基因X编码的HBV蛋白、其片段、其变体或其组合。HBV抗原可以是HBV基因型A核心蛋白、HBV基因型B核心蛋白、HBV基因型C核心蛋白、HBV基因型D核心蛋白、HBV基因型E核心蛋白、HBV基因型F核心蛋白、HBV基因型G核心蛋白、HBV基因型H核心蛋白、HBV基因型A表面蛋白、HBV基因型B表面蛋白、HBV基因型C表面蛋白、HBV基因型D表面蛋白、HBV基因型E表面蛋白、HBV基因型F表面蛋白、HBV基因型G表面蛋白、HBV基因型H表面蛋白、其片段、其变体或其组合。HBV抗原可以是共有HBV核心蛋白或共有HBV表面蛋白。
在一些实施方案中，HBV抗原可以是HBV基因型A共有核心DNA序列构建体、连接于HBV基因型A核心蛋白的共有序列的IgE前导序列或HBV基因型A共有核心蛋白序列。
在其它实施方案中，HBV抗原可以是HBV基因型B共有核心DNA序列构建体、连接于HBV基因型B核心蛋白的共有序列的IgE前导序列或HBV基因型B共有核心蛋白序列。
在其它实施方案中，HBV抗原可以是HBV基因型C共有核心DNA序列构建体、连接于HBV基因型C核心蛋白的共有序列的IgE前导序列或HBV基因型C共有核心蛋白序列。
在一些实施方案中，HBV抗原可以是HBV基因型D共有核心DNA序列构建体、连接于HBV基因型D核心蛋白的共有序列的IgE前导序列或HBV基因型D共有核心蛋白序列。
在其它实施方案中，HBV抗原可以是HBV基因型E共有核心DNA序列构建体、连接于HBV基因型E核心蛋白的共有序列的IgE前导序列或HBV基因型E共有核心蛋白序列。
在一些实施方案中，HBV抗原可以是HBV基因型F共有核心DNA序列构建体、连接于HBV基因型F核心蛋白的共有序列的IgE前导序列或HBV基因型F共有核心蛋白序列。
在其它实施方案中，HBV抗原可以是HBV基因型G共有核心DNA序列构建体、连接于HBV基因型G核心蛋白的共有序列的IgE前导序列或HBV基因型G共有核心蛋白序列。
在一些实施方案中，HBV抗原可以是HBV基因型H共有核心DNA序列构建体、连接于HBV基因型H核心蛋白的共有序列的IgE前导序列或HBV基因型H共有核心蛋白序列。
在其它实施方案中，HBV抗原可以是HBV基因型A共有表面DNA序列构建体、连接于HBV基因型A表面蛋白的共有序列的IgE前导序列或HBV基因型A共有表面蛋白序列。
在一些实施方案中，HBV抗原可以是HBV基因型B共有表面DNA序列构建体、连接于HBV基因型B表面蛋白的共有序列的IgE前导序列或HBV基因型B共有表面蛋白序列。
在其它实施方案中，HBV抗原可以是HBV基因型C共有表面DNA序列构建体、连接于HBV基因型C表面蛋白的共有序列的IgE前导序列或HBV基因型C共有表面蛋白序列。
在其它实施方案中，HBV抗原可以是HBV基因型D共有表面DNA序列构建体、连接于HBV基因型D表面蛋白的共有序列的IgE前导序列或HBV基因型D共有表面蛋白序列。
在一些实施方案中，HBV抗原可以是HBV基因型E共有表面DNA序列构建体、连接于HBV基因型E表面蛋白的共有序列的IgE前导序列或HBV基因型E共有表面蛋白序列。
在其它实施方案中，HBV抗原可以是HBV基因型F共有表面DNA序列构建体,、连接于HBV基因型F表面蛋白的共有序列的IgE前导序列或HBV基因型F共有表面蛋白序列。
在其它实施方案中，HBV抗原可以是HBV基因型G共有表面DNA序列构建体、连接于HBV基因型G表面蛋白的共有序列的IgE前导序列或HBV基因型G共有表面蛋白序列。
在其它实施方案中，HBV抗原可以是HBV基因型H共有表面DNA序列构建体、连接于HBV基因型H表面蛋白的共有序列的IgE前导序列或HBV基因型H共有表面蛋白序列。
(b)丙型肝炎病毒抗原
病毒抗原可以是来自丙型肝炎病毒(HCV)的抗原、其片段或其变体。HCV抗原可与肝癌相关或引起肝癌。在一些实施方案中，HCV抗原可以是编码一个或多个来自HCV的抗原的异源核酸分子，诸如质粒。HCV抗原可以是全长蛋白的全长或免疫原性片段。
HCV抗原可包含共有序列和/或一个或多个修饰以改善表达。遗传修饰(包括密码子最优化、RNA最优化和高效免疫球蛋白前导序列的添加(以增强构建体的免疫原性))可被包含在经修饰的共有序列中。共有HCV抗原可包含信号肽，诸如免疫球蛋白信号肽，诸如IgE或IgG信号肽，和在一些实施方案中，可包含HA标签。免疫原可被设计来引发比相应的密码子最优化的免疫原更强和更广的细胞免疫应答。
HCV抗原可以是HCV核衣壳蛋白(即，核心蛋白)、HCV包膜蛋白(例如，E1和E2)、HCV非结构蛋白(例如，NS1、NS2、NS3、NS4a、NS4b、NS5a和NS5b)、其片段、其变体或其组合。
(c)人乳头状瘤病毒
病毒抗原可以是来自HPV的抗原、其片段或其变体。HPV抗原可来自HPV 16、18、31、33、35、45、52和58型，其可引起子宫颈癌、直肠癌和/或其它癌症。HPV抗原可来自HPV 6型和/或11型，其引起生殖器疣，并且已知是头颈癌的病因。HPV抗原可来自HPV 16和/或18型，其引起子宫颈癌。HPV抗原可来自HPV 6、11和/或16型，其引起RRP和肛门癌。HPV癌抗原可由2007年7月30日提交的美国专利No.8,168,769、2010年1月21日提交的美国专利No.8,389,706、2011年10月21日提交的美国专利申请No.13/271,576和2013年3月12日提交的美国专利申请No.61/777,198(所述每一个申请通过引用以其整体并入)定进一步义。
HPV抗原可以是来自每一个HPV型的HPV E6或E7结构域。例如，对HPV 16型(HPV16)，HPV16抗原可包括HPV16 E6抗原、HPV16 E7抗原、其片段、变体或组合。类似地，HPV抗原可以是HPV 6E6和/或E7、HPV 11E6和/或E7、HPV 16E6和/或E7、HPV18E6和/或E7、HPV31E6和/或E7、HPV 33E6和/或E7、HPV 52E6和/或E7或HPV 58E6和/或E7、其片段、变体或组合。
(d)疱疹病毒
病毒抗原可以是疱疹病毒抗原。疱疹病毒抗原可以是选自由以下组成的组的抗原：CMV、HSV1、HSV2、VZV、CeHV1、EBV、玫瑰疹病毒属、卡波西氏肉瘤相关疱疹病毒或MuHV，和优选地CMV、HSV1、HSV2、CeHV1和VZV。
共有蛋白HCMV-gB(SEQ ID NO:26)、共有蛋白HCMV-gM(SEQ ID NO:28)、共有蛋白HCMV-gN(SEQ ID NO:30)、共有蛋白HCMV-gH(SEQ ID NO:32)、共有蛋白HCMV-gL(SEQ IDNO:34)、共有蛋白HCMV-gO(SEQ ID NO:36)、共有蛋白HCMV-UL128(SEQ ID NO:38)、共有蛋白HCMV-UL130(SEQ ID NO:40)、共有蛋白HCMV-UL-131A(SEQ ID NO:42)、共有蛋白HCMV-UL-83(pp65)(SEQ ID NO:44)。
核酸序列包括编码SEQ ID NO:26、SEQ ID NO:28、SEQ ID NO:30、SEQ ID NO:32、SEQ ID NO:34、SEQ ID NO:36、SEQ ID NO:38、SEQ ID NO:40、SEQ ID NO:42或SEQ ID NO:44的序列。产生编码共有氨基酸序列的核酸分子。疫苗可包含一种或多种核酸序列，所述核酸序列编码选自该组的被产生来优化在人中的稳定性和表达的序列的免疫原性蛋白的一个或多个共有形式。编码共有蛋白HCMV-gB的核酸序列(SEQ ID NO:25)、编码共有蛋白HCMV-gM的核酸序列(SEQ ID NO:27)、编码共有蛋白HCMV-gN的核酸序列(SEQ ID NO:29)、编码共有蛋白HCMV-gH的核酸序列(SEQ ID NO:31)、编码共有蛋白HCMV-gL的核酸序列(SEQID NO:33)、编码共有蛋白HCMV-gO的核酸序列(SEQ ID NO:35)、编码共有蛋白HCMV-UL128的核酸序列(SEQ ID NO:37)、编码共有蛋白的核酸序列HCMV-UL130(SEQ ID NO:39)、编码共有蛋白HCMV-UL-131A的核酸序列(SEQ ID NO:41)、编码共有蛋白HCMV-UL-83(pp65)的核酸序列(SEQ ID NO:43)。核酸序列可额外地具有连接于5’末端的IgE前导序列。
鉴于与临床分离株的进化趋异和流行循环人株系间的广泛遗传差异，已产生了每一种免疫原性蛋白的共有氨基酸序列。gB、gM、gH、gL、gE、gI、gK、gC、gD、UL128、UL130、UL-131A和UL-83(pp65)的共有氨基酸序列基于来自人临床分离株的序列。由于gN蛋白的巨大进化趋异，从代表最血清流行(gN-4)的7个血清型中的仅一个(gN-4c)产生共有序列。类似地，在gO的情况下，从8个血清型的一个(gO-5)(因该特定血清型据报导与gN-4c血清型相关)产生共有氨基酸序列。
如上所述，疱疹病毒抗原可以是共有疱疹病毒。共有疱疹病毒抗原可被提供以信号肽。在一些实施方案中，IgE前导序列连接于N末端。如本文中所述，当指连接于共有序列的N末端的信号肽时，意欲明确地包括其中共有序列的N末端Xaa残基被信号肽替代的实施方案。即，如本文中所用，Xaa意欲指任意氨基酸或无氨基酸。包含本文中SEQ ID NO:26、28、30、32、34、36、38、40、42、44所示的共有序列的蛋白质可包含不含N末端Xaa的那些序列。
产生在每一个特定情况下在疱疹病毒免疫原性蛋白的共有序列的N末端包含IgE前导序列的氨基酸序列。在一些实施方案中，提供了其中两个或更多个疱疹病毒抗原被表达为彼此通过蛋白水解切割位点连接的融合蛋白的核酸构建体。弗林蛋白酶蛋白水解切割位点是可在通过构建体表达的融合蛋白中连接疱疹病毒抗原的蛋白水解切割位点的实例。疱疹家族的病毒癌抗原还可以是美国专利申请No.13/982,457(其内容通过引用以其整体并入)中公开的任何抗原。
3.与免疫检查点抑制剂组合的疫苗
疫苗还可包含一种或多种免疫检查点分子的一种或多种抑制剂(即，免疫检查点抑制剂)。免疫检查点分子在下文中进行了更详细地描述。免疫检查点抑制剂是阻止免疫系统中的任何组分诸如MHC类呈递、T细胞内呈递和/或分化、B细胞呈递和/或分化、用于免疫细胞增殖和/或分化的任何细胞因子、趋化因子或信号转导的抑制的任何核酸或蛋白。
此类抑制剂可以是核酸序列、氨基酸序列、小分子或其组合。核酸序列可以是DNA、RNA、cDNA、其变体、其片段或其组合。核酸还可包括编码通过肽键连接于免疫检查点抑制剂的接头或标签序列的另外序列。小分子可低分子量，例如少于800道尔顿的有机或无机化合物，其可用作酶底物、被蛋白质或核酸结合的配体(其类似物)受或生物过程的调节剂。所述氨基酸序列可以是蛋白质、肽、其变体、其片段或其组合。
在一些实施方案中，免疫检查点抑制剂可以是一个或多个编码抗体、其变体、其片段或其组合的核酸序列。在其它实施方案中，免疫检查点抑制剂可以是抗体、其变体、其片段或其组合。
a.免疫检查点分子
免疫检查点分子可以是核酸序列、氨基酸序列、小分子或其组合。核酸序列可以是DNA、RNA、cDNA、其变体、其片段或其组合。核酸还可包括编码通过肽键连接于免疫检查点抑制剂的接头或标签序列的另外序列。小分子可低分子量，例如少于800道尔顿的有机或无机化合物，其可用作酶底物、被蛋白质或核酸结合的配体(其类似物)受或生物过程的调节剂。所述氨基酸序列可以是蛋白质、肽、其变体、其片段或其组合。
(1)PD-1和PD-L1
免疫检查点分子可以是程序化细胞死亡蛋白1(PD-1)、程序化细胞死亡配体1(PD-L1)、其片段、其变体或其组合。PD-1是由PDCD1基因编码的细胞表面蛋白。PD-1是免疫球蛋白超家族的成员，并且在T细胞和原B细胞上表达，并因此促成这些细胞的命运和/或分化。特别地，PD-1是T细胞调节剂的CD28/CTLA-4家族的1型膜蛋白和负调节T细胞受体(TCR)信号，从而负调节免疫应答。PD-1可负调节CD8+T细胞应答，并从而抑制CD8-介导的细胞毒性和增强肿瘤生长。
PD-1具有两个配体PD-L1和PD-L2，所述配体为B7家族的成员。PD-L1在响应LPS和GM-CSF处理的巨噬细胞和树突细胞(DC)上被上调以及在TCR和B细胞受体信号转导时在T细胞和B细胞上被上调。PD-L1由许多肿瘤细胞系，包括骨髓瘤、肥大细胞瘤和黑色素瘤表达。
b.抗-免疫检查点分子抗体
如上所述，免疫检查点抑制剂可以是抗体。所述抗体可结合抗原(即，上文所述的免疫检查点分子)或与其反应。因此，所述抗体可被认为是抗-免疫检查点分子抗体或免疫检查点分子抗体。抗体可由中包含的核酸序列编码
抗体可包括重链多肽和轻链多肽。重链多肽可包括可变重链(VH)区和/或至少一个恒定重链(CH)区。至少一个恒定重链区可包括恒定重链区1(CH1)、恒定重链区2(CH2)和恒定重链区3(CH3)和/或铰链区。
在一些实施方案中，重链多肽可包括VH区和CH1区。在其它实施方案中，重链多肽可包括VH区、CH1区、铰链区、CH2区和CH3区。
重链多肽可包括互补决定区(“CDR”)组。CDR组可含有VH区的3个高变区。从重链多肽的N末端开始，这些CDR分别被指定为“CDR1”、“CDR2”和“CDR3”。重链多肽的CDR1、CDR2和CDR3可促成抗原的结合或识别。
轻链多肽可包括可变轻链(VL)区和/或恒定轻链(CL)区。轻链多肽可包括互补决定区(“CDR”)组。CDR组可含有VL区的3个高变区。从轻链多肽的N末端开始，这些CDR分别被指定为“CDR1”、“CDR2”和“CDR3”。轻链多肽的CDR1、CDR2和CDR3可促成抗原的结合或识别。
抗体可包含分别间插在重链与轻链框架(“FR”)组之间的重链和轻链互补决定区(“CDR”)组，所述框架组为CDR提供支持并界定CDR彼此之间的空间关系。CDR组可含有重链或轻链V区的3个高变区。从重链或轻链的N末端开始，这些区域分别被指定为“CDR1”、“CDR2”和“CDR3”。抗原-结合位点从而可包括6个CDR，包含来自重链和轻链V区的每一个的CDR组。
抗体可以是免疫球蛋白(Ig)。Ig可以是例如IgA、IgM、IgD、IgE和IgG。免疫球蛋白可包括重链多肽和轻链多肽。免疫球蛋白的重链多肽可包括VH区、CH1区、铰链区、CH2区和CH3区。免疫球蛋白的轻链多肽可包括VL区和CL区。
此外，蛋白水解酶木瓜蛋白酶优先切割IgG分子以产生几个片段，所述片段中的两个片段(F(ab)片段)各自包含包括完整抗原结合位点的共价异二聚体。胃蛋白酶能够切割IgG分子以提供几个片段，包括F(ab’)2片段，所述片段包含两个抗原-结合位点。因此，所述抗体可以是Fab或F(ab’)2。Fab可包括重链多肽和轻链多肽。Fab的重链多肽可包括VH区和CH1区。Fab的轻链可包括VL区和CL区。
抗体可以是多克隆或单克隆抗体。抗体可以是嵌合抗体、单链抗体、亲合力成熟抗体、人抗体、人源化抗体或完全人抗体。人源化抗体可以是来自非人物种的抗体，其结合具有一个或多个来自非人物种的互补决定区(CDR)和来自人免疫球蛋白分子的框架区的期望的抗原。
(1)PD-1抗体
抗-免疫检查点分子抗体可以是抗-PD-1抗体(在本文中也称为“PD-1抗体”)、其变体、其片段或其组合。PD-1抗体可以是纳武单抗(Nivolumab)。抗-PD-1抗体可抑制PD-1活性，从而诱导、引发或增强针对肿瘤或癌症的免疫应答和减少肿瘤生长。
(2)PD-L1抗体
抗-免疫检查点分子抗体可以是抗-PD-L1抗体(在本文中也称为“PD-L1抗体”)、其变体、其片段或其组合。抗-PD-L1抗体可抑制PD-L1活性，从而诱导、引发或增强针对肿瘤或癌症的免疫应答或减少肿瘤生长。
4.疫苗构建体和质粒
疫苗可包含编码上述抗原和/或抗体的核酸构建体或质粒。核酸构建体或质粒可包括或含有一个或多个异源核酸序列。本文提供了可包含编码上述抗原和/或抗体的核酸序列的遗传构建体。遗传构建体可作为功能性染色体外分子存在于细胞中。遗传构建体可以是包括着丝粒、端粒的线性微型染色体或质粒或粘粒。遗传构建体可包括或含有一个或多个异源核酸序列。
遗传构建体可以呈以任意次序表达上述抗原和/或抗体的质粒的形式。
遗传构建体还可以是重组病毒载体(包括重组腺病毒、重组腺病毒相关病毒和重组牛痘)的基因组的部分。遗传构建体可以是减毒活微生物或生活在细胞中的重组微生物载体中的遗传物质的部分。
遗传构建体可包含用于核酸的编码序列的基因表达的调控元件。调控元件可以是启动子、增强子、起始密码子、终止密码子或多腺苷酸化信号。
核酸序列可组成可以是载体的遗传构建体。载体可以能够以有效地引发哺乳动物的免疫应答的量在哺乳动物的细胞中表达上述抗原和/或抗体。载体可以是重组体。载体可包含编码上述抗原和/或抗体的异源核酸。载体可以是质粒。载体可用于利用编码上述抗原和/或抗体的核酸转染细胞，将所述转化的细胞培养和维持在其中上述抗原和/或抗体的表达可发生的条件下。
可针对表达的稳定性和高水平优化编码序列。在某些情况下，密码子被选择来减少RNA的二级结构诸如因分子内键合而形成的二级结构的形成。
载体可包含编码上述抗原和/或抗体的异源核酸编码并且可还可包含起始密码子(其可在一个或多个癌抗原编码序列的上游)和终止密码子(其可在上述抗原和/或抗体的编码序列的下游)。所述起始和终止密码子可与上述抗原和/或抗体的编码序列在框内。载体还可包含有效地连接于上述的抗原和/或抗体的编码序列的启动子。有效地连接于上述抗原和/或抗体的启动子可以是来自猿猴病毒40(SV40)的启动子、小鼠乳房肿瘤病毒(MMTV)启动子、人免疫缺陷病毒(HIV)启动子诸如牛免疫缺陷病毒(BIV)长末端重复(LTR)启动子、莫洛尼病毒启动子、禽造白细胞组织增生病毒(ALV)启动子、巨细胞病毒(CMV)启动子诸如CMV立即早期启动子、埃-巴二氏病毒(EBV)启动子或劳斯肉瘤病毒(RSV)启动子。启动子还可以是来自人基因诸如诸如人肌动蛋白、人肌球蛋白、人血红蛋白、人肌肉肌酸或人金属硫蛋白的启动子。启动子还可以是组织特异性启动子，诸如肌肉或皮肤特异性启动子(天然或合成的)。此类启动子的实例在美国专利申请公布no.US20040175727(其内容以其整体并入本文)中进行了描述。
载体还可包含多腺苷酸化信号，其可在上述抗原和/或抗体的编码序列的下游。多腺苷酸化信号可以是SV40多腺苷酸化信号、LTR多腺苷酸化信号、牛生长激素(bGH)多腺苷酸化信号、人生长激素(hGH)多腺苷酸化信号或人β-珠蛋白多腺苷酸化信号。SV40多腺苷酸化信号可以是来自pCEP4载体(Invitrogen,San Diego,CA)的多腺苷酸化信号。
载体还可在上述抗原和/或抗体的上游包含增强子。增强子可以是DNA表达所必需的。增强子可以是人肌动蛋白、人肌球蛋白、人血红蛋白、人肌肉肌酸或病毒增强子，诸如来自CMV、HA、RSV或EBV的增强子。多核苷酸功能增强子描述于美国专利No.5,593,972、5,962,428和WO94/016737中，其各自的内容通过引用完全并入。
载体还可包含哺乳动物的复制起始点，以在染色体外维持载体和在细胞中产生多个拷贝的载体。载体可以是来自Invitrogen(San Diego,CA)的pVAX1、pCEP4或pREP4，所述载体可包含埃-巴二氏病毒复制起始点和和细胞核抗原EBNA-1编码区，其可产生高拷贝附加型复制而无需整合。载体可以是pVAX1或具有改变的pVax1变体诸如本文中所述的变体质粒。变体pVax1质粒是主链载体质粒pVAX1(Invitrogen,Carlsbad CA)的2998个碱基对的变体。CMV启动子位于碱基137-724。T7启动子/引发位点位于碱基664-683。多克隆位点位于碱基696-811。牛GH多腺苷酸化信号位于碱基829-1053。卡那霉素抗性基因位于碱基1226-2020。pUC复制起始点位于碱基2320-2993。
基于可获自Invitrogen的pVAX1的序列，在用作本文中所示的质粒1-6的主链的pVAX1的序列中发现下列突变：
C>G241在CMV启动子中
C>T 1942主链，牛生长激素多腺苷酸化信号(bGHpolyA)的下游
A>-2876主链，卡那霉素基因的下游
C>T 3277在pUC复制起始点(Ori)高拷贝数突变(参见Nucleic Acid Research1985)
G>C 3753在RNASeH位点的pUC Ori上游的每一个末端
将主链中位于CMV启动子的上游的碱基对2、3和4从ACT改变成CTG。
载体的主链可以是pAV0242。载体可以是复制缺陷型腺病毒5型(Ad5)载体。
载体还可包含调控序列，其可以非常适合用于在施用了所述载体的哺乳动物或人细胞中进行基因表达。一个或多个本文中公开的癌抗原序列可包含可允许编码序列在宿主细胞中更高效转录的密码子。
载体可以是pSE420(Invitrogen,San Diego,Calif.)，其可用于在大肠杆菌(E.coli)中产生蛋白质。载体还可以是pYES2(Invitrogen,San Diego,Calif.)，其可用于在酵母的酿酒酵母菌株中产生蛋白质。载体还可具有MAXBACTM完全杆状病毒表达系统(Invitrogen,San Diego,Calif.)，其可用于在昆虫细胞中产生蛋白质。载体还可以是pcDNAI或pcDNA3(Invitrogen,San Diego,Calif.)，其可用于在哺乳动物细胞诸如中国仓鼠卵巢(CHO)细胞中产生蛋白质。载体可以是通过常规技术和可容易获得的起始材料(包括Sambrook等，Molecular Cloning and Laboratory Manual，第2版，Cold Spring Harbor(1989)，其通过引用完整并入)产生蛋白质的表达载体或系统，。
在一些实施方案中，载体可包含SEQ ID NO:1、3、5、7、9、11、13、15和/或17的核酸序列的一个或多个。
5.疫苗的药物组合物
疫苗可以呈药物组合物的形式。药物组合物可包含疫苗。药物组合物可包含约5纳克至约10mg的疫苗的DNA。在一些实施方案中，根据本发明的药物组合物包含约25纳克至约5mg的疫苗的DNA。在一些实施方案中，药物组合物含有约50纳克至约1mg的疫苗的DNA。在一些实施方案中，药物组合物含有约0.1至约500微克的疫苗的DNA。在一些实施方案中，药物组合物含有约1至约350微克的疫苗的DNA。在一些实施方案中，药物组合物含有约5至约250微克的疫苗的DNA。在一些实施方案中，药物组合物含有约10至约200微克的疫苗的DNA。在一些实施方案中，药物组合物含有约15至约150微克的疫苗的DNA。在一些实施方案中，药物组合物含有约20至约100微克的疫苗的DNA。在一些实施方案中，药物组合物含有约25至约75微克的疫苗的DNA。在一些实施方案中，药物组合物含有约30至约50微克的疫苗的DNA。在一些实施方案中，药物组合物含有约35至约40微克的疫苗的DNA。在一些实施方案中，药物组合物含有约100至约200微克疫苗的DNA。在一些实施方案中，药物组合物包含约10微克至约100微克的疫苗的DNA。在一些实施方案中，药物组合物包含约20微克至约80微克的疫苗的DNA。在一些实施方案中，药物组合物包含约25微克至约60微克的疫苗的DNA。在一些实施方案中，药物组合物包含约30纳克至约50微克的疫苗的DNA。在一些实施方案中，药物组合物包含约35纳克至约45微克的疫苗的DNA。在一些优选的实施方案中，药物组合物含有约0.1至约500微克的疫苗的DNA。在一些优选的实施方案中，药物组合物含有约1至约350微克的疫苗的DNA。在一些优选的实施方案中，药物组合物含有约25至约250微克的疫苗的DNA。在一些优选的实施方案中，药物组合物含有约100至约200微克疫苗的DNA。
在一些实施方案中，根据本发明的药物组合物包含至少10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95或100纳克的疫苗的DNA。在一些实施方案中，药物组合物可包含至少1、5、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95,100、105、110、115、120、125、130、135、140、145、150、155、160、165、170、175、180、185、190、195、200、205、210、215、220、225、230、235、240、245、250、255、260、265、270、275、280、285、290、295、300、305、310、315、320、325、330、335、340、345、350、355、360、365、370、375、380、385、390、395、400、405、410、415、420、425、430、435、440、445、450、455、460、465、470、475、480、485、490、495、500、605、610、615、620、625、630、635、640、645、650、655、660、665、670、675、680、685、690、695、700、705、710、715、720、725、730、735、740、745、750、755、760、765、770、775、780、785、790、795、800、805、810、815、820、825、830、835、840、845、850、855、860、865、870、875、880、885、890、895.900、905、910、915、920、925、930、935、940、945、950、955、960、965、970、975、980、985、990、995或1000微克的疫苗的DNA。在一些实施方案中，药物组合物可包含至少1.5、2、2.5、3、3.5、4、4.5、5、5.5、6、6.5、7、7.5、8、8.5、9、9.5或10mg或更多的疫苗的DNA。
在其它实施方案中，药物组合物可包含高达(并且包括)15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95或100纳克的疫苗的DNA。在一些实施方案中，药物组合物可包含高达(并且包括)1、5、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95,100、105、110、115、120、125、130、135、140、145、150、155、160、165、170、175、180、185、190、195、200、205、210、215、220、225、230、235、240、245、250、255、260、265、270、275、280、285、290、295、300、305、310、315、320、325、330、335、340、345、350、355、360、365、370、375、380、385、390、395、400、405、410、415、420、425、430、435、440、445、450、455、460、465、470、475、480、485、490、495、500、605、610、615、620、625、630、635、640、645、650、655、660、665、670、675、680、685、690、695、700、705、710、715、720、725、730、735、740、745、750、755、760、765、770、775、780、785、790、795、800、805、810、815、820、825、830、835、840、845、850、855、860、865、870、875、880、885、890、895、900、905、910、915、920、925、930、935、940、945、950、955、960、965、970、975、980、985、990、995或1000微克的疫苗的DNA。在一些实施方案中，药物组合物可包含高达(并且包括)1.5、2、2.5、3、3.5、4、4.5、5、5.5、6、6.5、7、7.5、8、8.5、9、9.5或10mg的疫苗的DNA。
药物组合物还可包含其它试剂用于待使用的施用模式的配制目的。在其中药物组合物是可注射药物组合物的情况下，它们是无菌、无热源和无颗粒的。优选使用等渗制剂。一般地，用于等渗性的添加剂可包括氯化钠、葡萄糖、甘露醇、山梨糖醇和乳糖。在一些情况下，等渗溶液诸如磷酸盐缓冲盐水是优选的。稳定剂包括明胶和白蛋白。在一些实施方案中，将血管收缩剂添加至制剂中。
疫苗还可包含药学上可接受的赋形剂。所述药学上可接受的赋形剂可以是作为媒介物、佐剂、载体或稀释剂的功能性分子。所述药学上可接受的赋形剂可以是转染促进剂，其可包括表面活性剂，诸如免疫-刺激复合物(ISCOMS)、弗氏不完全佐剂、LPS类似物，包括单磷酰脂质A、胞壁酰肽、醌类似物、小囊泡诸如角鲨烯和角鲨烯、透明质酸、脂质、脂质体、钙离子、病毒蛋白、聚阴离子、聚阳离子或纳米颗粒或其它已知的转染促进剂。
所述转染促进剂是聚阴离子、聚阳离子，包括聚-L-谷氨酸(LGS)或脂质。所述转染促进剂是多聚-L-谷氨酸，更优选地，聚-L-谷氨酸以低于6mg/ml的浓度存在于疫苗中。所述转染促进剂还可包括表面活性剂诸如免疫-刺激复合物(ISCOMS)、弗氏不完全佐剂、LPS类似物，包括单磷酰脂质A、胞壁酰肽、醌类似物以及小囊泡诸如角鲨烯和角鲨烯，并且还可将透明质酸与遗传构建体结合施用。在一些实施方案中，所述DNA载体疫苗还可包括转染促进剂(诸如脂质、脂质体,包括卵磷脂脂质体或本领域中已知的其它脂质体),作为DNA-脂质体混合物(参见例如W09324640))、钙离子、病毒蛋白质、聚阴离子、聚阳离子或纳米颗粒，或其它已知的转染促进剂。优选地，所述转染促进剂是聚阴离子、聚阳离子，包括聚-L-谷氨酸盐(LGS)或脂质。疫苗中的转染剂的浓度低于4mg/ml、低于2mg/ml、低于1mg/ml、低于0.750mg/ml、低于0.500mg/ml、低于0.250mg/ml、低于0.100mg/ml、低于0.050mg/ml或低于0.010mg/ml。
所述药学上可接受的赋形剂可以是佐剂。所述佐剂可以是在可选择的质粒中表达的其它基因或作为疫苗中与上述质粒组合的蛋白质被递送。所述佐剂可选自由以下组成的组的物质：α-干扰素(IFN-α)、β-干扰素(IFN-β)、γ-干扰素、血小板衍生生长因子(PDGF)、TNFα、TNFβ、GM-CSF、表皮生长因子(EGF)、皮肤T细胞虏获趋化因子(CTACK)、胸腺上皮细胞表达趋化因子(TECK)、粘膜相关上皮趋化因子(MEC)、IL-12、IL-15、MHC、CD80、CD86，包括IL-15(缺失信号序列和任选地包含来自IgE的信号肽)。所述佐剂可以是IL-12、IL-15、IL-28、CTACK、TECK、血小板衍生生长因子(PDGF)、TNFα、TNFβ、GM-CSF、表皮生长因子(EGF)、IL-1、IL-2、IL-4、IL-5、IL-6、IL-10、IL-12、IL-18或其组合。在示例性实施方案，所述佐剂是IL-12。
可以是有用的佐剂的其它基因包括编码以下物质的那些基因：MCP-1、MIP-la、MIP-1p、IL-8、RANTES、L-选择素、P-选择素、E-选择素、CD34、GlyCAM-1、MadCAM-1、LFA-1、VLA-1、Mac-1、pl50.95、PECAM、ICAM-1、ICAM-2、ICAM-3、CD2、LFA-3、M-CSF、G-CSF、IL-4、IL-18的突变体形式、CD40、CD40L、血管生长因子、成纤维细胞生长因子、IL-7、神经生长因子、血管内皮生长因子、Fas、TNF受体、Flt、Apo-1、p55、WSL-1、DR3、TRAMP、Apo-3、AIR、LARD、NGRF、DR4、DR5、KILLER、TRAIL-R2、TRICK2、DR6、胱天蛋白ICE、Fos、c-jun、Sp-1、Ap-1、Ap-2、p38、p65Rel、MyD88、IRAK、TRAF6、IkB、无活性NIK、SAP K、SAP-1、JNK、干扰素应答基因、NFkB、Bax、TRAIL、TRAILrec、TRAILrecDRC5、TRAIL-R3、TRAIL-R4、RANK、RANK LIGAND、Ox40、Ox40LIGAND、NKG2D、MICA、MICB、NKG2A、NKG2B、NKG2C、NKG2E、NKG2F、TAP1、TAP2及其功能片段。
6.用于治疗特定癌症的组合疫苗
疫苗可呈如上所述癌抗原的各种组合的形式以治疗癌症或肿瘤。取决于一种或多种癌抗原的组合，可用疫苗靶向各种癌症或其它肿瘤类型。这些癌症可包括黑色素瘤、血癌(例如，白血病、淋巴瘤、骨髓瘤)、肺癌、食管鳞状细胞癌、膀胱癌、结直肠癌、食管癌、胃癌、肝癌、头颈癌、脑癌、肛门癌、非小细胞肺癌、胰腺癌、滑液癌、前列腺癌、睾丸癌、肝癌、子宫颈癌、复发性呼吸道乳头状瘤病、皮肤癌和胃癌。图15提供可用于治疗特定癌症的抗原的特定组合的实例。
a.黑色素瘤
疫苗可组合一种或多种癌抗原诸如酪氨酸酶、PRAME或GP100-Trp2以治疗或预防黑色素瘤(参见图15)。疫苗可进一步将一种或多种癌抗原酪氨酸酶、PRAME或GP100-Trp2与任意一种或多种癌抗原hTERT、NY-ESO-1、MAGE-A1或WTI组合以治疗或预防黑色素瘤。还可将癌抗原的其它组合用于治疗或预防黑色素瘤。
b.头颈癌
疫苗可包含癌抗原HPV 16E6/E7以治疗或预防头颈癌(参见图15)。疫苗可进一步将癌抗原HPV 16E6/E7与任意一种或多种癌抗原hTERT、NY-ESO-1、MAGE-A1或WTI组合以用于治疗或预防头颈癌。还可将癌抗原的其它组合用于治疗或预防头颈癌。
c.复发性呼吸道乳头状瘤病/肛门癌
疫苗可组合一种或多种癌抗原诸如HPV 6、HPV11或HPV 16以治疗或预防复发性呼吸道乳头状瘤病或肛门癌(参见图15)。疫苗可进一步将一种或多种癌抗原HPV 6、HPV11或HPV16与一种或多种癌抗原hTERT、NY-ESO-1、MAGE-A1或WTI组合以治疗或预防复发性呼吸道乳头状瘤病或肛门癌。还可将癌抗原的其它组合用于治疗或预防复发性呼吸道乳头状瘤病或肛门癌。
d.子宫颈癌
疫苗可组合一种或多种癌抗原诸如HPV 16E6/E7或HPV 18E6/E7以治疗或预防子宫颈癌(参见图15)。疫苗可进一步将一种或多种癌抗原HPV 16E6/E7或HPV 18E6/E7与一种或多种癌抗原hTERT、NY-ESO-1、MAGE-A1或WTI组合以治疗或预防子宫颈癌。还可将癌抗原的其它组合用于治疗或预防子宫颈癌。
e.肝癌
疫苗可组合一种或多种癌抗原诸如HBV核心抗原、HBV表面抗原、HCVNS34A、HCVNS5A、HCV NS5B或HCVNS4B以治疗或预防肝癌(参见图15)。疫苗可进一步将一种或多种癌抗原HBV核心抗原、HBV表面抗原、HCVNS34A、HCVNS5A、HCV NS5B或HCVNS4B与一种或多种癌抗原hTERT、NY-ESO-1、MAGE-A1或WTI组合以治疗或预防肝癌。还可将癌抗原的其它组合用于治疗或预防肝癌。
f.成胶质细胞瘤
疫苗可包含CMV以治疗或预防成胶质细胞瘤(参见图15)。疫苗可进一步将CMV与癌抗原hTERT、NY-ESO-1、MAGE-A1或WTI的一种或多种组合以用于治疗或预防成胶质细胞瘤。还可将癌抗原的其它组合用于治疗或预防成胶质细胞瘤。
g.前列腺
疫苗可组合一种或多种癌抗原诸如PSA、PSMA或STEAP以治疗或预防前列腺癌(参见图15)。疫苗可进一步将一种或多种癌抗原PSA、PSMA或STEAP与癌抗原hTERT、NY-ESO-1、MAGE-A1或WTI的一种或多种组合以治疗或预防前列腺癌。还可将癌抗原的其它组合用于治疗或预防前列腺癌。
h.血癌(例如，白血病、淋巴瘤、骨髓瘤)
疫苗可组合一种或多种癌抗原诸如PRAME、WT-1、hTERT以治疗或预防血癌诸如白血病、淋巴瘤和骨髓瘤(参见图15)。疫苗可进一步将一种或多种癌抗原PRAME、WT-1、hTERT与癌抗原NY-ESO-1或MAGE-A1的一种或多种组合以治疗或预防血癌诸如白血病、淋巴瘤和骨髓瘤。还可将癌抗原的其它组合用于治疗或预防血癌诸如白血病、淋巴瘤和骨髓瘤。
7.接种的方法
本文中提供了使用药物制剂(以提供如上所述的一种或多种癌抗原的遗传构建体和蛋白质)治疗或预防癌症的方法，所述抗原包含使得它们成为特别有效的可针对其诱发针对一种或多种癌抗原的免疫应答的免疫原的表位。可提供施用疫苗或接种的方法以诱导治疗性和/或预防性免疫应答。接种方法可在哺乳动物中产生针对如上所述的癌抗原的一种或多种的免疫应答。可向个体施用所述疫苗以调节哺乳动物的免疫系统的活性和增强免疫应答。疫苗的施用可以是将如本文中公开的一种或多种癌抗原作为在细胞中表达并从而被递送至细胞表面上的核酸分子进行的转染，免疫系统识别细胞表面上的所述抗原并诱发细胞应答、体液应答或细胞和体液应答。疫苗的施用可用于通过向哺乳动物施用如本文中所述的疫苗来诱导或引发哺乳动物的针对如本文中所述的癌抗原的一种或多种癌抗原的免疫应答。
当向哺乳动物施用疫苗并因此面将载体施用至哺乳动物的细胞中时，所述转染的细胞将表达并分泌如本文中公开的癌抗原的一种或多种癌抗原。这些分泌的蛋白或合成抗原将被免疫系统识别为外来物，其将激发可包括如下应答的免疫应答：针对所述一种或多种癌抗原产生的抗体，和特异性针对所述一种或多种癌抗原的T细胞应答。在一些实例中，利用本文中论述的疫苗接种的哺乳动物将具有激活的免疫系统，并且当用一种或多种如本文中公开的癌抗原攻击时，所述激活的免疫系统将允许快速清除随后的如本文中公开的癌抗原，无论是通过体液免疫应答、细胞免疫应答还是通过细胞和体液免疫应答。可向个体施用疫苗以调节个体的免疫系统的活性，从而增强免疫应答。
施用疫苗的DNA的方法在美国专利No.4,945,050和5,036,006(所述两个专利通过引用以其整体并入本文)中进行了描述。
可向哺乳动物施用所述疫苗以引发哺乳动物的免疫应答。所述哺乳动物可以是人、非人灵长类动物、母牛、猪、绵羊、山羊、羚羊、野牛、水牛、牛科动物、鹿、刺猬、大象、骆驼、羊驼、小鼠、大鼠或鸡，并且优选地是人、母牛、猪或鸡。
疫苗剂量可为1μg至10mg活性组分/kg体重/时间，并且可为20μg至10mg组分/kg体重/时间。可每1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30或31天施用疫苗一次。用于有效治疗的疫苗的剂量数可以为1、2、3、4、5、6、7、8、9、10或更多个剂量。
a.利用疫苗产生免疫应答的方法
疫苗可用于产生哺乳动物的免疫应答，包括治疗性或防治性免疫应答。免疫应答可产生针对如本文中公开的一种或多种癌抗原的抗体和/或杀伤T细胞。可分离此类抗体和T细胞。
一些实施方案提供产生针对本文中公开的癌抗原的一种或多种的免疫应答的方法，所述方法包括向个体施用疫苗。一些实施方案提供预防性地接种个体以抗表达如上所述的癌抗原的一种或多种的癌症或肿瘤方法，所述方法包括施用疫苗。一些实施方案提供治疗性地接种患有表达所述癌抗原的一种或多种的癌症或肿瘤的个体的方法，所述方法包括包括施用疫苗。在施用疫苗之前，可常规地进行表达本文中公开的一种或多种癌抗原的癌症或肿瘤的诊断。
b.利用疫苗的癌症治疗的方法
疫苗可用于产生或引发哺乳动物的免疫应答，所述免疫应答与有此需要的哺乳动物或受试者的癌症或肿瘤(例如，黑色素瘤、头颈癌、子宫颈癌、肝癌、前列腺癌、血癌、食管磷状细胞癌、胃癌)反应或针对所述癌症或肿瘤。引发的免疫应答可阻止癌症或肿瘤生长。
引发的免疫应答可阻止和/或减少癌细胞或肿瘤细胞的转移。因此，疫苗可用于治疗和/或预防被施予疫苗的哺乳动物或受试者的癌症或肿瘤。取决于疫苗中使用的抗原，基于被治疗的癌症或肿瘤的生长可以是任何类型的癌症诸如，但不限于黑色素瘤、血癌(例如，白血病、淋巴瘤、骨髓瘤)、肺癌、食管鳞状细胞癌、膀胱癌、结直肠癌、食管癌、胃癌、肝癌、头颈癌、脑癌、肛门癌、非小细胞肺癌、胰腺癌、滑液癌、前列腺癌、睾丸癌、肝癌、子宫颈癌、复发性呼吸道乳头状瘤病、皮肤癌和胃癌。
在一些实施方案中，施用疫苗可通过诱导如下应答来介导肿瘤细胞的清除或阻止其生长：(1)经由B细胞应答(以产生阻断单核细胞趋化蛋白-1(MCP-1)产生，从而延缓髓源抑制性细胞(MDSC)和抑制肿瘤生长的抗体)的体液免疫；(2)增加细胞毒性T淋巴细胞诸如CD8+(CTL)以攻击和杀死肿瘤细胞；(3)增强T辅助细胞应答；(4)和增强经由IFN-γ和TFN-α的炎症应答或优选所有前述应答。
在一些实施方案中，免疫应答可产生对被施以疫苗的受试者的各种组织或系统(例如，脑或神经系统等)不造成损伤或不引起所述组织或系统的炎症的体液免疫应答和/或抗原特异性细胞毒性T淋巴细胞(CTL)应答。
在一些实施方案中，施用疫苗可增加受试者的无肿瘤存活率、减小肿瘤质量、增加肿瘤存活率或其组合。施用疫苗可使受试者的无肿瘤存活率增加20％、21％、22％、23％、24％、25％、26％、27％、28％、29％、30％、31％、32％、33％、34％、35％、36％、37％、38％、39％、40％、41％、42％、43％、44％、45％、46％、47％、48％、49％、50％、51％、52％、53％、54％、55％、56％、57％、58％、59％和60％。施用疫苗可使免疫后受试者的肿瘤质量减少20％、21％、22％、23％、24％、25％、26％、27％、28％、29％、30％、31％、32％、33％、34％、35％、36％、37％、38％、39％、40％、41％、42％、43％、44％、45％、46％、47％、48％、49％、50％、51％、52％、53％、54％、55％、56％、57％、58％、59％、60％、61％、62％、63％、64％、65％、66％、67％、68％、69％和70％。施用疫苗可防止和阻止受试者的单核细胞趋化蛋白1(MCP-1)(一种由髓源抑制性细胞分泌的细胞因子)的增加。在一些实施方案中，施用疫苗可防止和阻止受试者的癌组织或肿瘤组织中的MCP-1的增加，从而减少受试者的癌组织或肿瘤组织的血管形成。
施用疫苗可使受试者的肿瘤存活率增加20％、21％、22％、23％、24％、25％、26％、27％、28％、29％、30％、31％、32％、33％、34％、35％、36％、37％、38％、39％、40％、41％、42％、43％、44％、45％、46％、47％、48％、49％、50％、51％、52％、53％、54％、55％、56％、57％、58％、59％、60％、61％、62％、63％、64％、65％、66％、67％、68％、69％和70％。在一些实施方案中，可向外周(如在下文中更详细地描述的)施用疫苗以建立靶向癌性或肿瘤细胞或组织以清除或消除表达一种或多种癌抗原的癌症或肿瘤而不损伤或引起被施予所述疫苗的受试者的疾病或死亡的抗原特异性免疫应答。
施用疫苗可使受试者的细胞免疫应答增强约50倍至约6000倍、约50倍至约5500倍、约50倍至约5000倍、约50倍至约4500倍、约100倍至约6000倍、约150倍至约6000倍、约200倍至约6000倍、约250倍至约6000倍或约300倍至约6000倍。在一些实施方案中，施用疫苗可使受试者的细胞免疫应答增强约50倍、100倍、150倍、200倍、250倍、300倍、350倍、400倍、450倍、500倍、550倍、600倍、650倍、700倍、750倍、800倍、850倍、900倍、950倍、1000倍、1100倍、1200倍、1300倍、1400倍、1500倍、1600倍、1700倍、1800倍、1900倍、2000倍、2100倍、2200倍、2300倍、2400倍、2500倍、2600倍、2700倍、2800倍、2900倍、3000倍、3100倍、3200倍、3300倍、3400倍、3500倍、3600倍、3700倍、3800倍、3900倍、4000倍、4100倍、4200倍、4300倍、4400倍、4500倍、4600倍、4700倍、4800倍、4900倍、5000倍、5100倍、5200倍、5300倍、5400倍、5500倍、5600倍、5700倍、5800倍、5900倍或6000倍。
施用疫苗可使受试者的干扰素γ(IFN-γ)水平升高约50倍至约6000倍、约50倍至约5500倍、约50倍至约5000倍、约50倍至约4500倍、约100倍至约6000倍、约150倍至约6000倍、约200倍至约6000倍、约250倍至约6000倍或约300倍至约6000倍。在一些实施方案中，施用疫苗可使受试者的IFN-γ水平升高约50倍、100倍、150倍、200倍、250倍、300倍、350倍、400倍、450倍、500倍、550倍、600倍、650倍、700倍、750倍、800倍、850倍、900倍、950倍、1000倍、1100倍、1200倍、1300倍、1400倍、1500倍、1600倍、1700倍、1800倍、1900倍、2000倍、2100倍、2200倍、2300倍、2400倍、2500倍、2600倍、2700倍、2800倍、2900倍、3000倍、3100倍、3200倍、3300倍、3400倍、3500倍、3600倍、3700倍、3800倍、3900倍、4000倍、4100倍、4200倍、4300倍、4400倍、4500倍、4600倍、4700倍、4800倍、4900倍、5000倍、5100倍、5200倍、5300倍、5400倍、5500倍、5600倍、5700倍、5800倍、5900倍或6000倍。
疫苗剂量可以为1μg至10mg活性组分/kg体重/时间并且可以为20μg至10mg组分/kg体重/时间。可每1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30或31天施用疫苗一次。用于有效治疗的疫苗的剂量数可以为1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个剂量。
(1)利用PD-1和/或PD-L1抗体的联合治疗
本发明还涉及使用如上所述的疫苗增强哺乳动物的免疫应答的方法。如上所述的疫苗可包含如上所述的癌抗原和PD1抗体和/或PDL1抗体。组合可存在于单一制剂中或可被分开并依次施用(首先癌抗原，随后PD1抗体或PDL1抗体，或首先PD1抗体或PDL1抗体，随后癌抗原)。在一些实施方案中，在向所述受试者施用PD-1抗体或PD-L1抗体之前约30秒、1分钟、2分钟、3分钟、4分钟、5分钟、10分钟、15分钟、20分钟、25分钟、30分钟、35分钟、40分钟、45分钟、50分钟、55分钟、60分钟、0.25小时、0.5小时、0.75小时、1小时、2小时、3小时、4小时、5小时、6小时、7小时、8小时、9小时、10小时、11小时、12小时、13小时、14小时、15小时、16小时、17小时、18小时、19小时、20小时、21小时、22小时、23小时、24小时、36小时、48小时、60小时、72小时、84小时、96小时、1天、2天、3天、4天、5天、6天、7天、8天、9天、10天、11天、12天、13天、14天、15天、16天、17天、18天、19天、20天、21天、22天、23天、24天、25天、26天、27天、28天、29天、30天、31天、1周、2周、3周、4周、5周、6周、7周或8周，可向所述受试者施用癌抗原。在其它实施方案中，在向受试者施用癌抗原之前约30秒、1分钟、2分钟、3分钟、4分钟、5分钟、10分钟、15分钟、20分钟、25分钟、30分钟、35分钟、40分钟、45分钟、50分钟、55分钟、60分钟、0.25小时、0.5小时、0.75小时、1小时、2小时、3小时、4小时、5小时、6小时、7小时、8小时、9小时、10小时、11小时、12小时、13小时、14小时、15小时、16小时、17小时、18小时、19小时、20小时、21小时、22小时、23小时、24小时、36小时、48小时、60小时、72小时、84小时、96小时、1天、2天、3天、4天、5天、6天、7天、8天、9天、10天、11天、12天、13天、14天、15天、16天、17天、18天、19天、20天、21天、22天、23天、24天、25天、26天、27天、28天、29天、30天、31天、1周、2周、3周、4周、5周、6周、7周或8周，可向所述受试者施用PD-1抗体或PD-L1抗体。
癌抗原与PD1抗体或PDL1抗体的组合比包含单独的癌抗原的疫苗更高效地诱导免疫系统。该更高效的免疫应答在特定癌症的治疗和/或预防中提供增强的效率。取决于与PDL1抗体或PD1抗体组合的疫苗中使用的抗原，基于被治疗的癌症或肿瘤的生长可以是任何类型的癌症诸如，但不限于黑色素瘤、血癌(例如，白血病、淋巴瘤、骨髓瘤)、肺癌、食管鳞状细胞癌、膀胱癌、结直肠癌、食管癌、胃癌、肝癌、头颈癌、脑癌、肛门癌、非小细胞肺癌、胰腺癌、滑液癌、前列腺癌、睾丸癌、肝癌、子宫颈癌、复发性呼吸道乳头状瘤病、皮肤癌和胃癌。
在一些实施方案中，免疫应答可被增强约0.5倍至约15倍、约0.5倍至约10倍或约0.5倍至约8倍。可选地，被施予疫苗的受试者的免疫应答可被增强至少约0.5倍、至少约1.0倍、至少约1.5倍、至少约2.0倍、至少约2.5倍、至少约3.0倍、至少约3.5倍、至少约4.0倍、至少约4.5倍、至少约5.0倍、至少约5.5倍、至少约6.0倍、至少约6.5倍、至少约7.0倍、至少约7.5倍、至少约8.0倍、至少约8.5倍、至少约9.0倍、至少约9.5倍、至少约10.0倍、至少约10.5倍、至少约11.0倍、至少约11.5倍、至少约12.0倍、至少约12.5倍、至少约13.0倍、至少约13.5倍、至少约14.0倍、至少约14.5倍或至少约15.0倍。
在其它替代实施方案中，被施予疫苗的受试者的免疫应答可被增强约50％至约1500％、约50％至约1000％或约50％至约800％。在其它实施方案中，被施予疫苗的受试者的免疫应答可被增强至少约50％、至少约100％、至少约150％、至少约200％、至少约250％、至少约300％、至少约350％、至少约400％、至少约450％、至少约500％、至少约550％、至少约600％、至少约650％、至少约700％、至少约750％、至少约800％、至少约850％、至少约900％、至少约950％、至少约1000％、至少约1050％、至少约1100％、至少约1150％、至少约1200％、至少约1250％、至少约1300％、至少约1350％、至少约1450％或至少约1500％。
疫苗剂量可以为1μg至10mg活性组分/kg体重/时间并且可以为20μg至10mg组分/kg体重/时间。可每1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30或31天施用疫苗一次。用于有效治疗的疫苗的剂量数可以为1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个剂量。
(2)黑色素瘤
疫苗可用于产生或引发哺乳动物的免疫应答，所述免疫应答与有此需要的哺乳动物或受试者的黑色素瘤反应或针对所述黑色素瘤。引发的免疫应答可阻止黑色素瘤生长。引发的免疫应答可减缓黑色素瘤生长。引发的免疫应答可预防和/或减少癌细胞或肿瘤细胞从黑色素瘤的转移。因此，疫苗可用于治疗和/或预防被施予所述疫苗的哺乳动物或受试者的黑色素瘤的方法。
在一些实施方案中，施用疫苗可通过诱导如下应答来介导黑色素瘤细胞的清除或阻止其生长：(1)经由B细胞应答(以产生阻断单核细胞趋化蛋白-1(MCP-1)产生，从而延缓髓源抑制性细胞(MDSC)和抑制肿瘤生长的抗体)的体液免疫；(2)增加细胞毒性T淋巴细胞诸如CD8+(CTL)以攻击和杀死黑色素瘤细胞；(3)增强T辅助细胞应答；(4)和增强经由IFN-γ和TFN-α的炎症应答或优选所有前述应答。
在一些实施方案中，施用疫苗可增加受试者的无黑色素瘤存活率，减少黑色素瘤质量，增加黑色素瘤存活率或其组合。施用疫苗可使受试者的无黑色素瘤存活率增加30％、31％、32％、33％、34％、35％、36％、37％、38％、39％、40％、41％、42％、43％、44％和45％。施用疫苗可使免疫后受试者的黑色素瘤质量减少30％、31％、32％、33％、34％、35％、36％、37％、38％、39％、40％、41％、42％、43％、44％、45％、46％、47％、48％、49％、50％、51％、52％、53％、54％、55％、56％、57％、58％、59％和60％。施用疫苗可预防和阻止受试者的单核细胞趋化蛋白1(MCP-1)(由髓源抑制性细胞分泌的细胞因子)的增加。在一些实施方案中，施用疫苗可防止或阻止受试者的黑色素瘤内的MCP-1增加，从而减少受试者的黑色素瘤组织的血管形成。施用疫苗可使受试者的黑色素瘤存活率增加30％、31％、32％、33％、34％、35％、36％、37％、38％、39％、40％、41％、42％、43％、44％、45％、46％、47％、48％、49％、50％、51％、52％、53％、54％、55％、56％、57％、58％、59％和60％。
8.施用途径
疫苗或药物组合物可以通过不同的途径(包括口服、胃肠外、舌下、经皮、经直肠、经粘膜、局部、经由吸入、经颊施用、胸膜内、静脉内、动脉内、腹膜内、皮下、肌内、鼻内鞘内和关节内或其组合)施用。对于兽医学用途，可按照正常兽医实践作为适当地可接受的制剂施用组合物。兽医可以容易地确定最适合于特定动物的给药方案和施用途径。疫苗可通过常规注射器、无针注射装置、“微粒轰击基因枪”或其它物理方法诸如电穿孔(“EP”)、“流体动力法”或超声波进行施用。
可利用几种公知的技术将疫苗的载体施用至哺乳动物，所述技术包括利用和不利用体内电穿孔的DNA注射(也称为DNA接种)、脂质体介导的、纳米颗粒促进的重组载体诸如重组腺病毒、重组腺病毒相关病毒和重组痘苗病毒。可经由DNA注射并连同体内电穿孔施用本发明的疫苗的一种或多种癌抗原。
a.电穿孔
可通过电穿孔施用疫苗或药物组合物。可使用电穿孔装置来实现经由本发明的质粒的电穿孔的疫苗的施用，所述电穿孔装置被构造来向哺乳动物的期望的组织递送有效地在细胞膜中引起可逆孔形成的能量的脉冲，并且优选的能量脉冲是与由用户预设的电流输入相似的恒定电流。电穿孔装置可包括电穿孔组件和电极部件或操作部件。电穿孔组件可包括和包含电穿孔装置的各种元件的一个或多个，包括：控制器、电流波形发生器、阻抗测试器、波形记录器、输入元件、状态报告元件、通信端口、记忆组件、电源和电源开关。可使用例如体内电穿孔装置例如
EP系统(Inovio Pharmaceuticals,Inc.,BlueBell,PA)或Elgen电穿孔器(Inovio Pharmaceuticals,Inc.)促进质粒对细胞的转染来实现电穿孔。
可促进本发明的DNA疫苗的施用的电穿孔装置和电穿孔方法的实例包括在Draghia-Akli等人的美国专利No.7,245,963、Smith等人提交的美国专利公开2005/0052630(其内容在此通过引用整体并入)中描述的那些电穿孔装置和方法。可用于促进DNA疫苗的施用的其它电穿孔装置和电穿孔方法包括2007年10月17日提交的共同未决和共同拥有的美国专利申请序列No.11/874072中提供的那些电穿孔装置和方法，所述专利申请序列根据35USC 119(e)要求2006年10月17日提交的美国临时申请序列No.60/852,149和2007年10月10日提交的60/978,982(其全都在此整体并入)的权益。
Draghia-Akli等人的美国专利No.7,245,963描述了标准电极系统及它们用于促进将生物分子引入至身体或植物的选择的组织的细胞中的用途。标准电极系统可包含多种针电极；皮下针头；提供从可编程恒定电流脉冲控制器至多个针电极的导电连接的电连接器；和电源。操作者可抓住多个安装在支持结构上的针电极，并将它们牢固地插入身体或植物的选择的组织中。随后经由皮下针头将生物分子施用至选择的组织。激活可编程恒定电流脉冲控制器，并将恒定电流电极脉冲施加于多个针电极。施加的恒定电流电脉冲促进将生物分子引入至多个电极之间的细胞中。美国专利No.7,245,963的整个内容在此通过引用以其整体并入。
由Smith等人提交的美国专利公开2005/0052630描述了可用于有效地促进将生物分子引入至身体或植物的选择的组织的细胞中的电穿孔装置。所述电穿孔装置包括其操作通过软件或固件来指定的电动力学装置("EKD装置")。EKD装置基于脉冲参数的用户控制和输入在阵列中的电极之间产生一系列可编程的恒定电流脉冲波形，并且允许存储和获取电流波形数据。电穿孔装置还包含具有一个阵列的针电极的可替换电极盘、用于注射针的中央注射通道和可移去的引导盘。美国专利公开2005/0052630的整个内容在此通过引用完全并入。
美国专利No.7,245,963和美国专利公开2005/0052630中描述的电极阵列和方法可适用于不仅至组织诸如肌肉，而且还至其它组织或器官内的深度穿透。由于电极阵列的配置，还可将注射针(以deneurological系统选择的生物分子)完全插入靶器官中，并且在利用电极预先描绘的区域中垂直于靶组织施用注射剂。美国专利No.7,245,963和美国专利公开2005/005263中描述的电极优选为20mm长和21规格。
此外，在一些包括电穿孔装置及其用途的实施方案中，设想存在电穿孔装置，其为在下列专利：1993年12月28日授予的美国专利5,273,525、2000年8月29日授予的美国专利6,110,161、2001年7月17日授予的6,261,281和2005年10月25日授予的6,958,060，以及2005年9月6日授予的美国专利6,939,862中描述的那些电穿孔装置。此外，本文设想了针对注射DNA的方法设计的涵盖2004年2月24日授予的美国专利6,697,669(其涉及使用各种装置的任一种施用DNA)和2008年2月5日授予的美国专利7,328,064中提供的主题的专利。上述专利通过引用整体并入。
9.制备疫苗的方法
本文提供了用于制备包含本文中论述的疫苗的DNA质粒的方法。所述DNA质粒，在通过最终的亚克隆步骤克隆进哺乳动物的表达质粒后，可使用本领域已知的方法将所述载体用在大规模发酵罐中接种细胞培养物。
可使用已知的装置和技术的组合配制或制造与本发明的EP装置一起使用的DNA质粒，但优选使用2007年5月23日提交的美国公开申请no.20090004716中描述的优化的质粒制造技术来制造它们。在一些实例中，可以大于或等于10mg/mL的浓度配制用于这些研究的DNA质粒。所述制造技术除了美国序列No.60/939792中描述的那些装置和方案(包括2007年7月3日授予的批准的专利、美国专利No.7,238,522中描述的那些装置和方案)之外，还包括或包含对于本领域普通技术人员来说是公知的各种装置和方案。以上提及的申请和专利(分别为美国序列No.60/939,792和美国专利No.7,238,522)在此整体并入。
本发明具有多个方面，通过下列非限定性实例来举例说明。
10.实施例
实施例1
pTyr的构建
如图1-A和9中显示的，可在许多不同的生物体中发现酪氨酸酶(Tyr)。因此，通过比对对应于来自图1-A中显示的生物体的Tyr的序列，和选择共有Tyr的最常见的氨基酸和/或核苷酸来产生共有Tyr。每一个生物体的对应的Tyr序列获自GenBank(NCBI)。因此，共有Tyr反映跨物种的Tyr序列的保守元件。
编码共有Tyr的核酸序列可被改造来包括IgE前导序列。具体地，将IgE前导序列在框内融合于共有Tyr核酸序列的上游(图1-B)。随后将所得的序列插入pVax1表达载体中以产生酪氨酸酶构建或质粒(pTyr)，从而使得Kozak序列存在于编码IgE前导序列和共有Tyr的核苷酸序列之前。
共有Tyr核酸序列至pVax1的插入通过限制酶分析来确认。如图1-C中显示的，在DNA琼脂糖凝胶上将共有Tyr核酸序列与pVax1质粒分离(即，标记有BamH1/Xho1的泳道)，从而确认pVax1载体含有共有Tyr核酸序列。
共有Tyr的表达通过用pTyr转染HeLa细胞来确认。利用人抗-Tyr抗体的免疫印迹确认了共有Tyr蛋白在HeLa细胞中的表达(图1-D)。GPF染色进一步显示共有Tyr蛋白在转染的HeLa细胞中的表达(图1-E)。在免疫印迹和染色实验中。
实施例2
利用pTyr的接种诱导细胞介导的免疫应答
上述pTyr用于接种小鼠以评价细胞免疫应答是否由pTyr诱导。使用图2-A中显示的免疫策略免疫C57/B6小鼠。一些小鼠用pVax1进行免疫，而其它小鼠用pTyr进行免疫。将用pTyr免疫的小鼠进一步分成下列组：(1)5μg剂量的pTyr；(2)20μg剂量的pTyr；(3)30μg剂量的pTyr；和(4)60μg剂量的pTyr。
在免疫策略的第35天，从C57B/6小鼠分离脾细胞，并通过IFN-γELISpot分析评价其的干扰素-γ(IFN-γ)的诱导。如图2-B中显示的，20μg剂量的pTyr诱导最高水平的IFN-γ。
在被免疫的Balb/c和C57B/6小鼠中进一步评价至pTyr的细胞免疫应答。用pVax1或pTyr免疫小鼠。第三免疫后2周分离脾细胞，并用共有Tyr肽进行刺激。刺激后，将分泌IFN-γ的脾细胞计算为一式三份刺激孔中的点的平均数目。该测定表明C57/B6小鼠适用于pTyr接种(数据未显示)。
实施例3
pTyr接种增加细胞因子IFN-γ和TNF-α
检查利用pTyr和pVax1免疫的小鼠的细胞因子产生。使用图2-A中显示的策略免疫小鼠。在免疫策略的第35天，用Tyr肽刺激从免疫的小鼠分离的细胞，进行过夜。刺激后，通过FACS测量多功能应答的分析。具体地，分析检查CD8+和CD4+T细胞。FACS允许鉴定对于细胞因子IL-2、TNF-α和IFN-γ是阳性的T细胞。在CD44 hi细胞中，显著百分比的CD8+T细胞在用pTyr免疫的小鼠中相较于用pVax1免疫的小鼠产生IFN-γ(图3)。
实施例4
响应pTyr接种产生Tyr特异性抗体
检查用pTyr接种的小鼠的体液免疫应答。具体地，用pTyr或pVax1以2周的间隔免疫C57BI/6小鼠(n＝4)3次。每一次免疫由20μg/肌内注射和随后利用MID-EP的电穿孔组成。在第三免疫(即，第35天)后，从小鼠采集血清，使用总的IgG特异性HRP标记的二抗通过ELISA测量抗体。如图4-A中所指示的稀释血清。如图4-A中显示的，针对Tyr的特异性抗体由用pTyr免疫的小鼠产生。用pTyr免疫的小鼠在图4-A中用实心圆表示，而用pVax1免疫的小鼠在图4-A中用空心三角形表示。
此外，以1:20、1:40、1:80、1:160、1:320和1:640系列稀释来自免疫的小鼠的血清。以一式三份向含有Tyr肽的单个孔(50μl/孔)中添加每一种血清稀释物。在第90和120再核对日检查所有免疫组的小鼠相较于免疫前血清的Tyr特异性滴度的峰值增加。每一个系列稀释点上的3个独立实验的代表性结果示于图4-B中。这些数据进一步表明利用pTyr的免疫诱导利用pTyr免疫的小鼠的Tyr特异性抗体的产生。
实施例5
利用pTyr接种的小鼠对肿瘤攻击具有增加的存活率
进一步分析pTry以确定pTyr接种是否可提供免受肿瘤的保护作用。具体地，用pTyr或pVax1以2周的间隔免疫C57BI/6小鼠(10/组)。每一次免疫由20μg/肌内注射和随后利用MID-EP的电穿孔组成。第三免疫后1周(即，第35天)，利用B16黑色素瘤皮内攻击免疫的小鼠直至肿瘤直径超过200mm2。
随后，在小鼠的免疫组中评价无肿瘤存活率和肿瘤体积。如图5-A(卡普兰-迈耶存活曲线)中显示的，利用pTyr免疫的小鼠相较于用pVax1接种的小鼠无肿瘤存活率得到提供(即，在第40天并且在肿瘤攻击后40％)(p＝0.05)，所述用pVax1接种的小鼠在肿瘤攻击后第20天全部死亡。利用pTyr免疫的小鼠相较于利用pVax1免疫的小鼠也具有减小的肿瘤体积(即，约50％)(图5-B)。对于图5-A和5-B，用pVax1免疫的小鼠用实心方块来表示，而用pTyr免疫的小鼠用实心圆形来表示。因此，这些数据显示pTyr接种提供抗黑色素瘤的保护作，即增加的无肿瘤存活率和肿瘤体积的减小。
实施例6
MDSC群体在来自用pTyr接种的小鼠的肿瘤中减少
检查用pTyr免疫的小鼠和未免疫的小鼠的MDSC群体，以检查利用pTyr的接种是否改变来自各组的小鼠的肿瘤的MDSC的水平。具体地，检查免疫的和未免疫的小鼠的Gr-1+和CD11b+细胞的百分比。
如图6和7中显示的，MDSC水平在来自用pTyr免疫的小鼠的肿瘤内相较于未免疫的小鼠显著降低(p＝0.0004)。未免疫的小鼠中的MDSC群体的百分比为40.00±4.826。用pTyr免疫的小鼠的MDSC群体的百分比为5.103±0.7718。因此，这些数据显示利用pTyr的免疫减少用pTyr接种的小鼠的肿瘤内的MDSC群体。
实施例7
pTyr接种降低MCP-1水平
MDSC可分泌细胞因子MCP-1，所述细胞因子通过内皮细胞的迁移促进血管生成或血管形成。鉴于pTyr接种对肿瘤中的MDSC水平的上述作用，在用pTyr接种后检查MCP-1水平。
如图8-A中显示的，B16黑色素瘤内的MDSC可分泌MCP-1。因此，用B16黑色素瘤攻击用pTyr免疫的小鼠和用pVax1免疫的小鼠以检查pTyr免疫是否改变MCP-1水平。首次接触实验的小鼠被包括作为另外的对照。攻击后，直接从肿瘤组织分离MDSC，并通过ELISA分析MCP-1细胞因子水平。以一式三份进行实验，并重复2次。
如图8-B中显示的，B16黑色素瘤或肿瘤组织内的MDSC显著地分泌MCP-1(参见pVax1免疫的小鼠)。然而，用pTyr免疫的小鼠不具有MCP-1水平的显著升高。相反地，用pTyr免疫的小鼠中的MCP-1水平约为用pVax1免疫的小鼠的约1/3。因此，这些数据显示pTyr接种降低由用pTyr免疫的小鼠的肿瘤内的MDSC分泌的MCP-1的水平。
实施例8
pPRAME的构建
产生PRAME的共有序列，并将编码共有PRAME抗原的核苷酸序列插入表达载体或质粒pVAX(在本文中也称为pVAX1)的BamHI和XhoI限制酶位点以产生pGX1411(在本文中也称为pPRAME)(参见图10-A)。
为了确认pPRAME导致共有PRAME抗原的表达，将pVAX和pPRAME转染进RD细胞和293T细胞。DAPI用于对细胞核染色，共有PRAME抗原也被荧光染色。该染色连同DAPI与共有PRAME抗原染色的合并一起示于图10-B中。这些染色表明PRAME共有抗原从pPRAME表达并且在用pVAX(即，阴性对照)转染的细胞中未检测到共有PRAME抗原。
此外，来自转染的细胞的裂解物的免疫印迹分析用于确认共有PRAME抗原在转染的细胞中的表达(图10-C)。非转染细胞和用pVAX转染的细胞用作阴性对照(参见图10-C中分别标记有“对照”和“pVAX”的泳道)。在图10-C中，β-肌动蛋白检测用作上样对照。总之，转染的细胞的染色和来自转染的细胞的裂解物的免疫印迹表明载体pPRAME在细胞内提供共有PRAME抗原的表达。
实施例9
针对利用pPRAME的接种的干扰素γ应答
上述pPRAME用于接种小鼠以评价细胞免疫应答是否被pPRAME诱导。将C57BL/6小鼠分组。第一组是首次接触实验的并且不接受pPRAME。第2、第3、第4、第5和第6组小鼠分别接受5μg、10μg、15μg、25μg和50μg的pPRAME。
免疫后，从C57BL/6小鼠分离脾细胞，并通过IFN-γELISpot分析评价干扰素γ(IFN-γ)的诱导。如图11-A和11-B中所示，每一个剂量的pPRAME诱导与阴性对照首次接触实验的小鼠不同的IFN-γ的产生或分泌。特别地，IFN-γ水平在接种的小鼠中相较于未接种的小鼠被增加约3000倍至约4500倍。因此，这些数据表明利用编码共有PRAME抗原的pPRAME的接种诱导细胞免疫应答，如相较于未接种升高的IFN-γ水平证明的。
实施例10
pNY-ESO-1的构建
产生NY-ESO-1的共有序列，并将编码共有NY-ESO-1抗原的核苷酸序列插入表达载体或质粒pVAX(在本文中也称为pVAX1)的BamHI和XhoI限制酶位点，以产生pGX1409(在本文中也称为pNY-ESO-1)(参见图12-A)。
为了确认pNY-ESO-1导致共有NY-ESO-1抗原的表达，将pVAX和pNY-ESO-1转染进细胞中。DAPI用于对细胞核染色，共有NY-ESO-1抗原也被荧光染色。该染色连同DAPI与共有NY-ESO-1抗原染色的合并一起示于图12-B中。这些染色表明NY-ESO-1共有抗原从pNY-ESO-1表达并且在用pVAX(即，阴性对照)转染的细胞中未检测到共有NY-ESO-1抗原。
此外，来自293T和RD转染的细胞的裂解物的免疫印迹分析用于确认共有NY-ESO-1抗原在转染的细胞中的表达(图12-C)。非转染细胞和用pVAX转染的细胞用作阴性对照(参见图12-C中分别标记有“对照”和“pVAX”的泳道)。在图12-C中，α-肌动蛋白检测用作上样对照。总之，转染的细胞的染色和来自转染的细胞的裂解物的免疫印迹表明载体pNY-ESO-1在细胞内提供共有NY-ESO-1抗原的表达。
实施例11
针对利用pNY-ESO-1的接种的干扰素γ应答
上述pNY-ESO-1用于接种小鼠以评价细胞免疫应答是否由pNY-ESO-1诱导。将C57BL/6小鼠分组。第一组是首次接触实验的并且不接受pNY-ESO-1。第2和第3组的小鼠分别接受25μg和50μg的pNY-ESO-1。
免疫后，从C57BL/6小鼠分离脾细胞，并通过IFN-γELISpot分析评价干扰素γ(IFN-γ)的诱导。如图13中所示，每一个剂量的pPRAME诱导与阴性对照首次接触实验的小鼠不同的IFN-γ的产生或分泌。特别地，IFN-γ水平在接种的小鼠中相较于未接种的小鼠被增加约700倍至约1100倍。因此，这些数据表明利用编码共有NY-ESO-1抗原的pNY-ESO-1的接种诱导细胞免疫应答，如相较于未接种升高的IFN-γ水平证明的。
实施例12
针对利用pNY-ESO-2的接种的干扰素γ应答
产生NY-ESO-2的共有序列，并将编码共有NY-ESO-2抗原的核苷酸序列插入表达载体或质粒pVAX(在本文中也称为pVAX1)的多克隆位点，以产生pNY-ESO-2。
将该pNY-ESO-2用于接种小鼠以评价细胞免疫应答是否由pNY-ESO-2诱导。将C57BL/6小鼠分成组。第一组是首次接触实验的并且不接受pNY-ESO-2。第2和第3组小鼠分别接受25μg和50μg的pNY-ESO-2。
免疫后，从C57BL/6小鼠分离脾细胞，通过IFN-γELISpot分析评价干扰素γ(IFN-γ)的诱导。如图14中显示的，每一个剂量的pNY-ESO-2诱导与阴性对照首次接触实验的小鼠不同的IFN-γ的产生或分泌。特别地，IFN-γ水平在接种的小鼠中相较于未接种的小鼠被增加约400倍至约500倍。因此，这些数据表明利用编码共有NY-ESO-2抗原的pNY-ESO-2的接种诱导细胞免疫应答，如通过相较于未接种升高的IFN-γ水平所证明的。
应理解，前文详述和所附实施例仅是例举性的并且无意被视为对本发明的范围的限制，所述范围仅由所附权利要求和它们的等同物确定。
对公开的实施方案的各种改变和改进对于本领域技术人员来说是显而易见的。可在不背离其精神和范围的情况下进行这样的改变和改进，包括但不限于与本发明的化学结构、取代基、衍生物、中间体、合成、组合物、制剂或使用方法相关的那些改变和改进。
序列表
<110> 宾夕法尼亚大学理事会（THE TRUSTEES OF THE UNIVERSITY OFPENNSYLVANIA）
大卫·韦纳（WEINER, David）
卡鲁皮亚·穆苏马尼（MUTHUMANI, Karuppiah）
朱厄尔·沃尔特斯（WALTERS, Jewell）
严健（YAN, Jian）
<120> 癌疫苗及使用其的治疗方法
<130> UPVG0049 WO
<150> 61799952
<151> 2013-03-15
<160> 44
<170> PatentIn 3.5版
<210> 1
<211> 1608
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 共有酪氨酸酶
<400> 1
atggattgga cttggatctt atttttagtt gctgctgcta ctagagttca ttctgactgg 60
acttggattc tgttcctggt cgccgccgct acccgagtgc attccgaaaa agagtgttgc 120
ccaccttggt ctggagatcg aagcccatgc ggacagctga gtgggcgggg atcatgtcag 180
aacatcctgc tgagcaatgc ccccctggga cctcagttcc ccttcaccgg cgtggacgat 240
agagagtctt ggcccagtgt cttttacaac aggacttgcc agtgtagcgg gaatttcatg 300
ggcttcaact gcggcaattg taagttcggc ttttgggggc caaactgcac cgagcggaga 360
ctgctggtga ggcgcaatat cttcgatctg tccgcccccg aaaaggacaa attctttgcc 420
tatctgaccc tggctaagca cacaattagc tccgattatg tcatccccat tggaacatac 480
ggccagatga aaaacggcag cactcctatg tttaacgata tcaatatcta cgacctgttc 540
gtgtggatgc attactatgt ctccatggac gctctgctgg gcgggtctga gatctggcgg 600
gacattgatt tcgcacacga agctccagca tttctgccct ggcataggct gttcctgctg 660
cgctgggagc aggaaatcca gaagctgact ggggacgaga actttaccat tccctattgg 720
gattggcggg acgccgagaa atgcgatatc tgtactgacg aatacatggg aggccagcac 780
cccaccaacc ctaatctgct gtcacctgcc agcttctttt ctagttggca gatcgtgtgc 840
agccggctgg aggaatacaa ctcccaccag agcctgtgca atgggactcc agagggacca 900
ctgcgacgaa accctggaaa tcatgataag agccgaaccc ctcgactgcc atcaagcgcc 960
gacgtggagt tttgcctgtc cctgacacag tatgaaagcg gcagcatgga taaagccgct 1020
aacttctctt ttaggaatac cctggaaggg ttcgcaagtc cactgacagg aatcgccgac 1080
gcttcacagt cctctatgca caacgctctg catatctaca tgaatggcac aatgtcacag 1140
gtgcagggga gcgcaaacga tcctatcttc ctgctgcacc atgccttcgt ggactccatt 1200
tttgagcagt ggctgagaag gcaccgccca ctgcaggagg tgtatcctga agcaaacgcc 1260
ccaatcggcc ataatcgcga atcttatatg gtccccttta tccctctgta ccgaaacgga 1320
gatttcttta ttagttcaaa ggatctgggc tacgactata gttacctgca ggacagcgat 1380
cctgactcct tccaggacta tatcaaatct tacctggagc aggcctctag aatttggagt 1440
tggctgctgg gagcagcaat ggtgggagct gtcctgaccg ctctgctggc aggactggtg 1500
tccctgctgt gccggcacaa gagaaaacag ctgcccgagg aaaagcagcc actgctgatg 1560
gaaaaagaag actaccactc actgctgtac cagacccacc tgtgataa 1608
<210> 2
<211> 517
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 共有酪氨酸酶
<400> 2
Met Asp Trp Thr Trp Ile Leu Phe Leu Val Ala Ala Ala Thr Arg Val
1 5 10 15
His Ser Glu Lys Glu Cys Cys Pro Pro Trp Ser Gly Asp Arg Ser Pro
20 25 30
Cys Gly Gln Leu Ser Gly Arg Gly Ser Cys Gln Asn Ile Leu Leu Ser
35 40 45
Asn Ala Pro Leu Gly Pro Gln Phe Pro Phe Thr Gly Val Asp Asp Arg
50 55 60
Glu Ser Trp Pro Ser Val Phe Tyr Asn Arg Thr Cys Gln Cys Ser Gly
65 70 75 80
Asn Phe Met Gly Phe Asn Cys Gly Asn Cys Lys Phe Gly Phe Trp Gly
85 90 95
Pro Asn Cys Thr Glu Arg Arg Leu Leu Val Arg Arg Asn Ile Phe Asp
100 105 110
Leu Ser Ala Pro Glu Lys Asp Lys Phe Phe Ala Tyr Leu Thr Leu Ala
115 120 125
Lys His Thr Ile Ser Ser Asp Tyr Val Ile Pro Ile Gly Thr Tyr Gly
130 135 140
Gln Met Lys Asn Gly Ser Thr Pro Met Phe Asn Asp Ile Asn Ile Tyr
145 150 155 160
Asp Leu Phe Val Trp Met His Tyr Tyr Val Ser Met Asp Ala Leu Leu
165 170 175
Gly Gly Ser Glu Ile Trp Arg Asp Ile Asp Phe Ala His Glu Ala Pro
180 185 190
Ala Phe Leu Pro Trp His Arg Leu Phe Leu Leu Arg Trp Glu Gln Glu
195 200 205
Ile Gln Lys Leu Thr Gly Asp Glu Asn Phe Thr Ile Pro Tyr Trp Asp
210 215 220
Trp Arg Asp Ala Glu Lys Cys Asp Ile Cys Thr Asp Glu Tyr Met Gly
225 230 235 240
Gly Gln His Pro Thr Asn Pro Asn Leu Leu Ser Pro Ala Ser Phe Phe
245 250 255
Ser Ser Trp Gln Ile Val Cys Ser Arg Leu Glu Glu Tyr Asn Ser His
260 265 270
Gln Ser Leu Cys Asn Gly Thr Pro Glu Gly Pro Leu Arg Arg Asn Pro
275 280 285
Gly Asn His Asp Lys Ser Arg Thr Pro Arg Leu Pro Ser Ser Ala Asp
290 295 300
Val Glu Phe Cys Leu Ser Leu Thr Gln Tyr Glu Ser Gly Ser Met Asp
305 310 315 320
Lys Ala Ala Asn Phe Ser Phe Arg Asn Thr Leu Glu Gly Phe Ala Ser
325 330 335
Pro Leu Thr Gly Ile Ala Asp Ala Ser Gln Ser Ser Met His Asn Ala
340 345 350
Leu His Ile Tyr Met Asn Gly Thr Met Ser Gln Val Gln Gly Ser Ala
355 360 365
Asn Asp Pro Ile Phe Leu Leu His His Ala Phe Val Asp Ser Ile Phe
370 375 380
Glu Gln Trp Leu Arg Arg His Arg Pro Leu Gln Glu Val Tyr Pro Glu
385 390 395 400
Ala Asn Ala Pro Ile Gly His Asn Arg Glu Ser Tyr Met Val Pro Phe
405 410 415
Ile Pro Leu Tyr Arg Asn Gly Asp Phe Phe Ile Ser Ser Lys Asp Leu
420 425 430
Gly Tyr Asp Tyr Ser Tyr Leu Gln Asp Ser Asp Pro Asp Ser Phe Gln
435 440 445
Asp Tyr Ile Lys Ser Tyr Leu Glu Gln Ala Ser Arg Ile Trp Ser Trp
450 455 460
Leu Leu Gly Ala Ala Met Val Gly Ala Val Leu Thr Ala Leu Leu Ala
465 470 475 480
Gly Leu Val Ser Leu Leu Cys Arg His Lys Arg Lys Gln Leu Pro Glu
485 490 495
Glu Lys Gln Pro Leu Leu Met Glu Lys Glu Asp Tyr His Ser Leu Leu
500 505 510
Tyr Gln Thr His Leu
515
<210> 3
<211> 1668
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 共有酪氨酸酶-相关蛋白1
<400> 3
atggactgga cctggattct gttcctggtc gccgccgcaa cccgcgtgca ttcctctgcc 60
ccaaaactgc tgtctctggg atgtatcttc tttccactgc tgctgttcca gcaggcacgc 120
gcccagtttc cacgacagtg cgcaaccgtc gaggccctga ggagcgggat gtgctgtcca 180
gacctgtcac ccgtgagcgg acctggcaca gatcgctgcg gaagctcctc tgggcgggga 240
agatgtgagg ccgtgactgc tgactcacgg ccccacagcc ctcagtaccc acatgatggc 300
agggacgatc gcgaagtgtg gcccctgcga ttctttaacc ggacttgcca ctgtaacggc 360
aatttctccg ggcataattg cggaacctgt agacctggat ggaggggcgc cgcttgtgac 420
cagcgcgtgc tgatcgtccg gagaaacctg ctggatctgt ctaaggagga gaagaaccac 480
ttcgtccgag ctctggacat ggcaaagaga accacacatc ctctgtttgt gatcgccacc 540
aggcgcagcg aggaaattct ggggccagat ggaaacacac cccagttcga gaacatctca 600
atctacaatt atttcgtgtg gacccactac tatagcgtca agaaaacatt cctgggcgtg 660
gggcaggaga gtttcggaga agtggacttt tcacatgagg gccccgcttt tctgacatgg 720
caccggtacc atctgctgag actggaaaag gatatgcagg agatgctgca ggaacctagt 780
ttctcactgc catattggaa ctttgcaaca ggaaaaaacg tgtgcgacat ctgtactgac 840
gatctgatgg gcagcagatc caacttcgat tctacactga tttccccaaa tagcgtgttc 900
agccagtgga gggtggtctg cgactccctg gaggactacg ataccctggg caccctgtgc 960
aattctactg aagatgggcc catccgacgg aaccctgccg gaaatgtggc taggccaatg 1020
gtccagcgcc tgcctgagcc acaggacgtg gcccagtgcc tggaagtcgg cctgttcgat 1080
actccccctt tttattctaa cagtacaaac tctttccgca acactgtcga gggctacagt 1140
gaccctaccg ggaaatatga tccagccgtg cggagtctgc acaacctggc tcatctgttc 1200
ctgaatggaa ctggcgggca gacccacctg tccccaaatg accctatttt tgtcctgctg 1260
catactttca ccgacgccgt gtttgatgag tggctgagaa ggtacaacgc agatatcagc 1320
acctttccac tggaaaatgc ccccattggc cacaaccggc agtataatat ggtgcctttc 1380
tggccacccg tcacaaacac tgagatgttt gtgactgctc cagacaatct ggggtacacc 1440
tatgaaatcc agtggccctc cagagagttc tctgtgcctg aaatcattgc tattgcagtg 1500
gtcggcgcac tgctgctggt ggccctgatc tttgggaccg ctagctacct gattagggca 1560
cgccgatcca tggacgaggc caaccagccc ctgctgacag atcagtacca gtgctatgcc 1620
gaagagtatg aaaagctgca gaaccctaac cagtccgtcg tgtgataa 1668
<210> 4
<211> 554
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 共有酪氨酸酶-相关蛋白1
<400> 4
Met Asp Trp Thr Trp Ile Leu Phe Leu Val Ala Ala Ala Thr Arg Val
1 5 10 15
His Ser Ser Ala Pro Lys Leu Leu Ser Leu Gly Cys Ile Phe Phe Pro
20 25 30
Leu Leu Leu Phe Gln Gln Ala Arg Ala Gln Phe Pro Arg Gln Cys Ala
35 40 45
Thr Val Glu Ala Leu Arg Ser Gly Met Cys Cys Pro Asp Leu Ser Pro
50 55 60
Val Ser Gly Pro Gly Thr Asp Arg Cys Gly Ser Ser Ser Gly Arg Gly
65 70 75 80
Arg Cys Glu Ala Val Thr Ala Asp Ser Arg Pro His Ser Pro Gln Tyr
85 90 95
Pro His Asp Gly Arg Asp Asp Arg Glu Val Trp Pro Leu Arg Phe Phe
100 105 110
Asn Arg Thr Cys His Cys Asn Gly Asn Phe Ser Gly His Asn Cys Gly
115 120 125
Thr Cys Arg Pro Gly Trp Arg Gly Ala Ala Cys Asp Gln Arg Val Leu
130 135 140
Ile Val Arg Arg Asn Leu Leu Asp Leu Ser Lys Glu Glu Lys Asn His
145 150 155 160
Phe Val Arg Ala Leu Asp Met Ala Lys Arg Thr Thr His Pro Leu Phe
165 170 175
Val Ile Ala Thr Arg Arg Ser Glu Glu Ile Leu Gly Pro Asp Gly Asn
180 185 190
Thr Pro Gln Phe Glu Asn Ile Ser Ile Tyr Asn Tyr Phe Val Trp Thr
195 200 205
His Tyr Tyr Ser Val Lys Lys Thr Phe Leu Gly Val Gly Gln Glu Ser
210 215 220
Phe Gly Glu Val Asp Phe Ser His Glu Gly Pro Ala Phe Leu Thr Trp
225 230 235 240
His Arg Tyr His Leu Leu Arg Leu Glu Lys Asp Met Gln Glu Met Leu
245 250 255
Gln Glu Pro Ser Phe Ser Leu Pro Tyr Trp Asn Phe Ala Thr Gly Lys
260 265 270
Asn Val Cys Asp Ile Cys Thr Asp Asp Leu Met Gly Ser Arg Ser Asn
275 280 285
Phe Asp Ser Thr Leu Ile Ser Pro Asn Ser Val Phe Ser Gln Trp Arg
290 295 300
Val Val Cys Asp Ser Leu Glu Asp Tyr Asp Thr Leu Gly Thr Leu Cys
305 310 315 320
Asn Ser Thr Glu Asp Gly Pro Ile Arg Arg Asn Pro Ala Gly Asn Val
325 330 335
Ala Arg Pro Met Val Gln Arg Leu Pro Glu Pro Gln Asp Val Ala Gln
340 345 350
Cys Leu Glu Val Gly Leu Phe Asp Thr Pro Pro Phe Tyr Ser Asn Ser
355 360 365
Thr Asn Ser Phe Arg Asn Thr Val Glu Gly Tyr Ser Asp Pro Thr Gly
370 375 380
Lys Tyr Asp Pro Ala Val Arg Ser Leu His Asn Leu Ala His Leu Phe
385 390 395 400
Leu Asn Gly Thr Gly Gly Gln Thr His Leu Ser Pro Asn Asp Pro Ile
405 410 415
Phe Val Leu Leu His Thr Phe Thr Asp Ala Val Phe Asp Glu Trp Leu
420 425 430
Arg Arg Tyr Asn Ala Asp Ile Ser Thr Phe Pro Leu Glu Asn Ala Pro
435 440 445
Ile Gly His Asn Arg Gln Tyr Asn Met Val Pro Phe Trp Pro Pro Val
450 455 460
Thr Asn Thr Glu Met Phe Val Thr Ala Pro Asp Asn Leu Gly Tyr Thr
465 470 475 480
Tyr Glu Ile Gln Trp Pro Ser Arg Glu Phe Ser Val Pro Glu Ile Ile
485 490 495
Ala Ile Ala Val Val Gly Ala Leu Leu Leu Val Ala Leu Ile Phe Gly
500 505 510
Thr Ala Ser Tyr Leu Ile Arg Ala Arg Arg Ser Met Asp Glu Ala Asn
515 520 525
Gln Pro Leu Leu Thr Asp Gln Tyr Gln Cys Tyr Ala Glu Glu Tyr Glu
530 535 540
Lys Leu Gln Asn Pro Asn Gln Ser Val Val
545 550
<210> 5
<211> 1614
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 共有酪氨酸酶-相关蛋白2
<400> 5
atggactgga cctggattct gttcctggtc gccgctgcta cccgcgtgca ttcatctcct 60
ctgtggtggg gatttctgct gtcttgcctg ggatgcaaga tcctgccagg agcacaggga 120
cagttccccc gggtgtgcat gaccgtcgac tctctggtga acaaagagtg ctgtcctagg 180
ctgggagccg aaagcgccaa cgtgtgcggc tcccagcagg gacgaggaca gtgtactgag 240
gtgcgcgcag atacccgacc atggagtgga ccctacattc tgaggaacca ggacgatcgc 300
gaactgtggc cccgaaagtt ctttcaccgg acatgcaaat gtactggaaa cttcgccggc 360
tataattgcg gggactgtaa gtttggctgg accgggccca actgcgagag aaagaaaccc 420
cctgtgatca ggcagaatat tcattctctg agtcctcagg agcgggaaca gttcctgggc 480
gcactggacc tggccaagaa aagagtccac ccagattacg tgatcaccac acagcattgg 540
ctgggactgc tgggccctaa cgggacacag ccacagtttg ccaattgctc cgtctatgac 600
ttcttcgtgt ggctgcacta ctattctgtg cgggatacac tgctgggacc aggccgaccc 660
taccgagcaa tcgacttcag ccatcaggga ccagcctttg tgacttggca cagatatcat 720
ctgctgtgcc tggagcggga tctgcagaga ctgattggca acgaatcctt cgctctgccc 780
tactggaact ttgcaaccgg gcggaatgag tgcgacgtgt gcacagatca gctgttcgga 840
gccgctagac ctgacgatcc aactctgatc tcaagaaata gcaggtttag ctcctgggag 900
accgtctgcg actctctgga cgattacaac cacctggtga ccctgtgcaa tggaacatat 960
gaaggcctgc tgcggagaaa ccagatgggc cgcaatagta tgaagctgcc caccctgaaa 1020
gacattcgag attgtctgtc actgcagaag ttcgacaacc cacccttctt tcagaattcc 1080
accttctctt ttaggaacgc cctggagggg tttgacaaag ctgatggaac actggatagt 1140
caggtcatgt cactgcacaa cctggtgcat tcattcctga acgggactaa tgccctgcct 1200
cacagcgcag ccaatgaccc aatctttgtg gtcctgcata gcttcaccga cgctattttt 1260
gatgagtgga tgaagaggtt caaccctcca gctgatgcat ggccccagga actggcacct 1320
atcggacaca accgcatgta caatatggtc cccttctttc cccctgtgac aaatgaggaa 1380
ctgtttctga cttctgacca gctgggctac agttatgcta ttgatctgcc cgtgagcgtc 1440
gaggaaacac ccgggtggcc tactaccctg ctggtggtca tgggcactct ggtggctctg 1500
gtcgggctgt tcgtgctgct ggcatttctg cagtataggc gcctgcgcaa aggatacacc 1560
ccactgatgg aaacccacct gtcctccaag agatacaccg aagaagcatg ataa 1614
<210> 6
<211> 536
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 共有酪氨酸酶-相关蛋白2
<400> 6
Met Asp Trp Thr Trp Ile Leu Phe Leu Val Ala Ala Ala Thr Arg Val
1 5 10 15
His Ser Ser Pro Leu Trp Trp Gly Phe Leu Leu Ser Cys Leu Gly Cys
20 25 30
Lys Ile Leu Pro Gly Ala Gln Gly Gln Phe Pro Arg Val Cys Met Thr
35 40 45
Val Asp Ser Leu Val Asn Lys Glu Cys Cys Pro Arg Leu Gly Ala Glu
50 55 60
Ser Ala Asn Val Cys Gly Ser Gln Gln Gly Arg Gly Gln Cys Thr Glu
65 70 75 80
Val Arg Ala Asp Thr Arg Pro Trp Ser Gly Pro Tyr Ile Leu Arg Asn
85 90 95
Gln Asp Asp Arg Glu Leu Trp Pro Arg Lys Phe Phe His Arg Thr Cys
100 105 110
Lys Cys Thr Gly Asn Phe Ala Gly Tyr Asn Cys Gly Asp Cys Lys Phe
115 120 125
Gly Trp Thr Gly Pro Asn Cys Glu Arg Lys Lys Pro Pro Val Ile Arg
130 135 140
Gln Asn Ile His Ser Leu Ser Pro Gln Glu Arg Glu Gln Phe Leu Gly
145 150 155 160
Ala Leu Asp Leu Ala Lys Lys Arg Val His Pro Asp Tyr Val Ile Thr
165 170 175
Thr Gln His Trp Leu Gly Leu Leu Gly Pro Asn Gly Thr Gln Pro Gln
180 185 190
Phe Ala Asn Cys Ser Val Tyr Asp Phe Phe Val Trp Leu His Tyr Tyr
195 200 205
Ser Val Arg Asp Thr Leu Leu Gly Pro Gly Arg Pro Tyr Arg Ala Ile
210 215 220
Asp Phe Ser His Gln Gly Pro Ala Phe Val Thr Trp His Arg Tyr His
225 230 235 240
Leu Leu Cys Leu Glu Arg Asp Leu Gln Arg Leu Ile Gly Asn Glu Ser
245 250 255
Phe Ala Leu Pro Tyr Trp Asn Phe Ala Thr Gly Arg Asn Glu Cys Asp
260 265 270
Val Cys Thr Asp Gln Leu Phe Gly Ala Ala Arg Pro Asp Asp Pro Thr
275 280 285
Leu Ile Ser Arg Asn Ser Arg Phe Ser Ser Trp Glu Thr Val Cys Asp
290 295 300
Ser Leu Asp Asp Tyr Asn His Leu Val Thr Leu Cys Asn Gly Thr Tyr
305 310 315 320
Glu Gly Leu Leu Arg Arg Asn Gln Met Gly Arg Asn Ser Met Lys Leu
325 330 335
Pro Thr Leu Lys Asp Ile Arg Asp Cys Leu Ser Leu Gln Lys Phe Asp
340 345 350
Asn Pro Pro Phe Phe Gln Asn Ser Thr Phe Ser Phe Arg Asn Ala Leu
355 360 365
Glu Gly Phe Asp Lys Ala Asp Gly Thr Leu Asp Ser Gln Val Met Ser
370 375 380
Leu His Asn Leu Val His Ser Phe Leu Asn Gly Thr Asn Ala Leu Pro
385 390 395 400
His Ser Ala Ala Asn Asp Pro Ile Phe Val Val Leu His Ser Phe Thr
405 410 415
Asp Ala Ile Phe Asp Glu Trp Met Lys Arg Phe Asn Pro Pro Ala Asp
420 425 430
Ala Trp Pro Gln Glu Leu Ala Pro Ile Gly His Asn Arg Met Tyr Asn
435 440 445
Met Val Pro Phe Phe Pro Pro Val Thr Asn Glu Glu Leu Phe Leu Thr
450 455 460
Ser Asp Gln Leu Gly Tyr Ser Tyr Ala Ile Asp Leu Pro Val Ser Val
465 470 475 480
Glu Glu Thr Pro Gly Trp Pro Thr Thr Leu Leu Val Val Met Gly Thr
485 490 495
Leu Val Ala Leu Val Gly Leu Phe Val Leu Leu Ala Phe Leu Gln Tyr
500 505 510
Arg Arg Leu Arg Lys Gly Tyr Thr Pro Leu Met Glu Thr His Leu Ser
515 520 525
Ser Lys Arg Tyr Thr Glu Glu Ala
530 535
<210> 7
<211> 1008
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 共有黑色素瘤相关抗原4
<400> 7
atggattgga catggattct gttcctggtc gccgccgcaa ctagagtgca ttcatcatca 60
gagcagaagt cacagcattg taaacctgag gaaggcgtcg aggctcagga ggaagcactg 120
ggactggtgg gagctcaggc accaaccaca gaggaacagg aggccgctgt gagctcctct 180
agtccactgg tccccggcac tctggaggaa gtgcctgcag cagagagcgc cggaccccct 240
cagagtccac agggagcctc agctctgccc actaccatca gcttcacatg ctggaggcag 300
cctaacgagg gctcaagctc ccaggaggaa gaggggcctt ctactagtcc agacgcagag 360
agcctgttcc gggaagccct gtccaataag gtggatgagc tggcccactt tctgctgcgg 420
aagtacagag ctaaagaact ggtcaccaaa gcagagatgc tggaacgagt gatcaagaac 480
tataaacggt gcttccctgt gatttttgga aaggcctcag agagcctgaa aatgatcttc 540
ggcattgacg tgaaggaagt cgatccagct tctaatacat acactctggt gacatgtctg 600
ggcctgagtt atgacggact gctgggcaac aatcagattt ttcccaaaac cgggctgctg 660
atcattgtgc tgggcacaat cgccatggag ggggattccg cttctgaaga ggaaatttgg 720
gaggaactgg gcgtgatggg agtctacgac gggcgcgagc acaccgtgta cggagaacca 780
cgaaagctgc tgacccagga ttgggtccag gagaactacc tggaatatcg gcaggtgccc 840
gggtccaatc ctgcaagata cgagtttctg tggggaccca gggcactggc cgagacatct 900
tatgtgaaag tcctggaaca tgtggtcagg gtgaacgctc gcgtgcgaat tgcctaccca 960
agcctgcgcg aagccgctct gctggaagaa gaggaaggag tgtgataa 1008
<210> 8
<211> 334
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 共有黑色素瘤相关抗原4
<400> 8
Met Asp Trp Thr Trp Ile Leu Phe Leu Val Ala Ala Ala Thr Arg Val
1 5 10 15
His Ser Ser Ser Glu Gln Lys Ser Gln His Cys Lys Pro Glu Glu Gly
20 25 30
Val Glu Ala Gln Glu Glu Ala Leu Gly Leu Val Gly Ala Gln Ala Pro
35 40 45
Thr Thr Glu Glu Gln Glu Ala Ala Val Ser Ser Ser Ser Pro Leu Val
50 55 60
Pro Gly Thr Leu Glu Glu Val Pro Ala Ala Glu Ser Ala Gly Pro Pro
65 70 75 80
Gln Ser Pro Gln Gly Ala Ser Ala Leu Pro Thr Thr Ile Ser Phe Thr
85 90 95
Cys Trp Arg Gln Pro Asn Glu Gly Ser Ser Ser Gln Glu Glu Glu Gly
100 105 110
Pro Ser Thr Ser Pro Asp Ala Glu Ser Leu Phe Arg Glu Ala Leu Ser
115 120 125
Asn Lys Val Asp Glu Leu Ala His Phe Leu Leu Arg Lys Tyr Arg Ala
130 135 140
Lys Glu Leu Val Thr Lys Ala Glu Met Leu Glu Arg Val Ile Lys Asn
145 150 155 160
Tyr Lys Arg Cys Phe Pro Val Ile Phe Gly Lys Ala Ser Glu Ser Leu
165 170 175
Lys Met Ile Phe Gly Ile Asp Val Lys Glu Val Asp Pro Ala Ser Asn
180 185 190
Thr Tyr Thr Leu Val Thr Cys Leu Gly Leu Ser Tyr Asp Gly Leu Leu
195 200 205
Gly Asn Asn Gln Ile Phe Pro Lys Thr Gly Leu Leu Ile Ile Val Leu
210 215 220
Gly Thr Ile Ala Met Glu Gly Asp Ser Ala Ser Glu Glu Glu Ile Trp
225 230 235 240
Glu Glu Leu Gly Val Met Gly Val Tyr Asp Gly Arg Glu His Thr Val
245 250 255
Tyr Gly Glu Pro Arg Lys Leu Leu Thr Gln Asp Trp Val Gln Glu Asn
260 265 270
Tyr Leu Glu Tyr Arg Gln Val Pro Gly Ser Asn Pro Ala Arg Tyr Glu
275 280 285
Phe Leu Trp Gly Pro Arg Ala Leu Ala Glu Thr Ser Tyr Val Lys Val
290 295 300
Leu Glu His Val Val Arg Val Asn Ala Arg Val Arg Ile Ala Tyr Pro
305 310 315 320
Ser Leu Arg Glu Ala Ala Leu Leu Glu Glu Glu Glu Gly Val
325 330
<210> 9
<211> 381
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 共有生长激素释放激素
<400> 9
atggactgga cctggattct gttcctggtg gctgccgcaa ctcgcgtgca ttctcctctg 60
tgggtgttct tctttgtgat tctgactctg tctaacagct cccactgcag tccccctcca 120
cccctgaccc tgcgaatgcg gagatacgcc gacgctatct tcacaaattc ctatagaaag 180
gtgctgggac agctgtctgc taggaaactg ctgcaggata ttatgtcacg ccagcagggc 240
gagagcaacc aggaacgagg cgcaagggcc cgactggggc ggcaggtcga cagcatgtgg 300
gccgagcaga agcagatgga actggaaagc atcctggtcg cactgctgca gaaacatagc 360
cgaaatagcc agggatgata a 381
<210> 10
<211> 125
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 共有生长激素释放激素
<400> 10
Met Asp Trp Thr Trp Ile Leu Phe Leu Val Ala Ala Ala Thr Arg Val
1 5 10 15
His Ser Pro Leu Trp Val Phe Phe Phe Val Ile Leu Thr Leu Ser Asn
20 25 30
Ser Ser His Cys Ser Pro Pro Pro Pro Leu Thr Leu Arg Met Arg Arg
35 40 45
Tyr Ala Asp Ala Ile Phe Thr Asn Ser Tyr Arg Lys Val Leu Gly Gln
50 55 60
Leu Ser Ala Arg Lys Leu Leu Gln Asp Ile Met Ser Arg Gln Gln Gly
65 70 75 80
Glu Ser Asn Gln Glu Arg Gly Ala Arg Ala Arg Leu Gly Arg Gln Val
85 90 95
Asp Ser Met Trp Ala Glu Gln Lys Gln Met Glu Leu Glu Ser Ile Leu
100 105 110
Val Ala Leu Leu Gln Lys His Ser Arg Asn Ser Gln Gly
115 120 125
<210> 11
<211> 411
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 共有Melan-A
<400> 11
atggactgga catggattct gttcctggtc gctgctgcta caagggtgca ttccccacgg 60
gaggacgccc acttcatcta tggataccca aagaaaggcc acgggcattc ttacaccaca 120
gctgaggaag ccgctggaat cggcattctg acagtgatcc tgggggtcct gctgctgatt 180
ggatgctggt actgtcggag aaggaacggc tatagagcac tgatggacaa gagcctgcac 240
gtgggaactc agtgcgcact gacccgccga tgtccacagg agggattcga ccatcgggat 300
agcaaggtct ccctgcagga gaaaaattgc gaacccgtgg tccctaatgc cccacccgct 360
tacgaaaaac tgtccgcaga gcagagccca ccaccttatt caccttgata a 411
<210> 12
<211> 135
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 共有Melan-A
<400> 12
Met Asp Trp Thr Trp Ile Leu Phe Leu Val Ala Ala Ala Thr Arg Val
1 5 10 15
His Ser Pro Arg Glu Asp Ala His Phe Ile Tyr Gly Tyr Pro Lys Lys
20 25 30
Gly His Gly His Ser Tyr Thr Thr Ala Glu Glu Ala Ala Gly Ile Gly
35 40 45
Ile Leu Thr Val Ile Leu Gly Val Leu Leu Leu Ile Gly Cys Trp Tyr
50 55 60
Cys Arg Arg Arg Asn Gly Tyr Arg Ala Leu Met Asp Lys Ser Leu His
65 70 75 80
Val Gly Thr Gln Cys Ala Leu Thr Arg Arg Cys Pro Gln Glu Gly Phe
85 90 95
Asp His Arg Asp Ser Lys Val Ser Leu Gln Glu Lys Asn Cys Glu Pro
100 105 110
Val Val Pro Asn Ala Pro Pro Ala Tyr Glu Lys Leu Ser Ala Glu Gln
115 120 125
Ser Pro Pro Pro Tyr Ser Pro
130 135
<210> 13
<211> 597
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 共有NY-ESO-1
<400> 13
atggactgga catggattct gtttctggtg gctgccgcaa ctagagtgca ttcacaggcc 60
gctggacagg gaactggagg ctcaaccgga gacgcagatg gccctggcgg gccaggggtg 120
cccgacggac ctggaggcaa cgctggggga cccggggagg ccggagctac aggcggggga 180
ggccctcagg gagccggcgc cgccagagcc agcggacccc ggggcggggc accccggggg 240
cctcacggcg gggcagcatc aggcctgaat ggatgctgtc gatgcggagc acggagacct 300
gagagcaggc tgctggaatt ctacctgact atgccttttg ccaccccaat ggaggcagaa 360
ctggcaaggc gctccctggc tcgggacgca ccccctctgc cagtgcccgg cgtcctgctg 420
aaggaattca ccgtctctgg caacatcctg accattaggc tgacagctgc agatcatcgc 480
cagctgcagc tgtctatcag ctcctgtctg cagcagctga gtctgctgat gtggattacc 540
cagtgctttc tgcccgtctt cctggctcag cctccttccg gacagcgccg atgataa 597
<210> 14
<211> 197
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 共有NY-ESO-1
<400> 14
Met Asp Trp Thr Trp Ile Leu Phe Leu Val Ala Ala Ala Thr Arg Val
1 5 10 15
His Ser Gln Ala Ala Gly Gln Gly Thr Gly Gly Ser Thr Gly Asp Ala
20 25 30
Asp Gly Pro Gly Gly Pro Gly Val Pro Asp Gly Pro Gly Gly Asn Ala
35 40 45
Gly Gly Pro Gly Glu Ala Gly Ala Thr Gly Gly Gly Gly Pro Gln Gly
50 55 60
Ala Gly Ala Ala Arg Ala Ser Gly Pro Arg Gly Gly Ala Pro Arg Gly
65 70 75 80
Pro His Gly Gly Ala Ala Ser Gly Leu Asn Gly Cys Cys Arg Cys Gly
85 90 95
Ala Arg Arg Pro Glu Ser Arg Leu Leu Glu Phe Tyr Leu Thr Met Pro
100 105 110
Phe Ala Thr Pro Met Glu Ala Glu Leu Ala Arg Arg Ser Leu Ala Arg
115 120 125
Asp Ala Pro Pro Leu Pro Val Pro Gly Val Leu Leu Lys Glu Phe Thr
130 135 140
Val Ser Gly Asn Ile Leu Thr Ile Arg Leu Thr Ala Ala Asp His Arg
145 150 155 160
Gln Leu Gln Leu Ser Ile Ser Ser Cys Leu Gln Gln Leu Ser Leu Leu
165 170 175
Met Trp Ile Thr Gln Cys Phe Leu Pro Val Phe Leu Ala Gln Pro Pro
180 185 190
Ser Gly Gln Arg Arg
195
<210> 15
<211> 687
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 共有NY-ESO-2
<400> 15
atggactgga catggattct gtttctggtc gccgccgcaa cacgggtgca ttctcaggcc 60
gaggggcagg gaactggagg ctcaaccgga gacgcagatg gacctggcgg gccaggcatc 120
cccgacggac ctggaggcaa cgccggggga cctggggagg ccggagctac aggcgggaga 180
ggcccaaggg gcgcaggggc cgctagggcc agtggacccc gcggaggcgc cccacgaggc 240
ccacacgggg gagcagcctc cgcccaggac ggcagatgcc catgtggagc tcggagaccc 300
gattctaggc tgctgcagct gcatatcact atgcccttca gctcccctat ggaggctgaa 360
ctggtgaggc gcattctgtc ccgcgacgct gcacctctgc cacgaccagg ggccgtgctg 420
aaggatttca ccgtctcagg caatctgctg tttatgagcg tccgggacca ggatagagag 480
ggagcaggac gaatgcgagt ggtcggatgg ggactgggct ctgctagtcc tgaaggccag 540
aaagcacgcg atctgcgaac ccccaagcac aaagtgagcg agcagcgccc tggcacacca 600
gggccccctc cacccgaagg cgcccaggga gacggatgta gaggagtcgc cttcaatgtc 660
atgtttagtg caccccatat ttgataa 687
<210> 16
<211> 227
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 共有NY-ESO-2
<400> 16
Met Asp Trp Thr Trp Ile Leu Phe Leu Val Ala Ala Ala Thr Arg Val
1 5 10 15
His Ser Gln Ala Glu Gly Gln Gly Thr Gly Gly Ser Thr Gly Asp Ala
20 25 30
Asp Gly Pro Gly Gly Pro Gly Ile Pro Asp Gly Pro Gly Gly Asn Ala
35 40 45
Gly Gly Pro Gly Glu Ala Gly Ala Thr Gly Gly Arg Gly Pro Arg Gly
50 55 60
Ala Gly Ala Ala Arg Ala Ser Gly Pro Arg Gly Gly Ala Pro Arg Gly
65 70 75 80
Pro His Gly Gly Ala Ala Ser Ala Gln Asp Gly Arg Cys Pro Cys Gly
85 90 95
Ala Arg Arg Pro Asp Ser Arg Leu Leu Gln Leu His Ile Thr Met Pro
100 105 110
Phe Ser Ser Pro Met Glu Ala Glu Leu Val Arg Arg Ile Leu Ser Arg
115 120 125
Asp Ala Ala Pro Leu Pro Arg Pro Gly Ala Val Leu Lys Asp Phe Thr
130 135 140
Val Ser Gly Asn Leu Leu Phe Met Ser Val Arg Asp Gln Asp Arg Glu
145 150 155 160
Gly Ala Gly Arg Met Arg Val Val Gly Trp Gly Leu Gly Ser Ala Ser
165 170 175
Pro Glu Gly Gln Lys Ala Arg Asp Leu Arg Thr Pro Lys His Lys Val
180 185 190
Ser Glu Gln Arg Pro Gly Thr Pro Gly Pro Pro Pro Pro Glu Gly Ala
195 200 205
Gln Gly Asp Gly Cys Arg Gly Val Ala Phe Asn Val Met Phe Ser Ala
210 215 220
Pro His Ile
225
<210> 17
<211> 1584
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 共有PRAME
<400> 17
atggactgga catggattct gttcctggtc gctgctgcta cacgggtgca ttcagagaga 60
cgaagactgc ggggctcaat tcagagtagg tacatcagta tgtcagtctg gacctcacca 120
cggagactgg tggaactggc cgggcagagc ctgctgaagg atgaggccct ggctattgcc 180
gctctggaac tgctgccccg agagctgttc cctcccctgt tcatggcagc cttcgacgga 240
cgccacagcc agactctgaa ggctatggtc caggcatggc cctttacctg cctgcctctg 300
ggcgtgctga tgaaggggca gcagctgcat ctggagactt tcaaagcagt gctggatggc 360
ctggacgtgc tgctggccca ggaagtgagg cctaggcgct ggaagctgga ggtcctggat 420
ctgcgcaaaa acagccacca ggacttttgg accgtgtggt ccgggaatcg ggccagtctg 480
tactcattcc cagaacccga ggctgcacag ccaatgcgga agaaaagaaa ggtggatgga 540
ctgtccaccg aagctgagca gccttttaca ccaatcgaag tgctggtcga tctgtccctg 600
aaagaaggcg catgcgacga gctgttctct tatctgatgg agaaggtcaa aagacagaag 660
aacgtgctgc acctgtgctg taagaaactg aaaatctttg ctatgcccat gcaggacatc 720
aagatgattc tgaaaatggt ccagctggat tccattgaag acctggaggt cacttgtacc 780
tggaagctgc caacactggc caaattctct ccctacctgg gacagatgat caatctgcga 840
cggctgctgc tgtctcacat ccatgctagc tcctctatta gtcctgagaa ggaggaagag 900
tacattgcac agtttacttc tcagttcctg agtctgcagt gcctgcaggc cctgtatgtg 960
gatagcctgt tctttctgag aggcaggctg gaccagctgc tgcgacacgt catgaacccc 1020
ctggaaacac tgagtgtgac taattgtaga ctgtcagagg gcgatgtgat gcatctgagc 1080
cagtccccta acgtgagcca gctgtccgtc ctgtctctga gtggcgtgat gctgacagac 1140
gtgagccctg aaccactgca ggccctgctg gagcgagcat ctgccactct gcaggacctg 1200
gattttgacg agtgtgggat catggacgat cagctgctgg tgctgctgcc ttcactgagc 1260
cactgctccc agctgaccac actgtctttc tgtgggaacc caatctccat ttctgtgctg 1320
cagaatctgc tgcaccatct gattggactg agcaacctga cccatgtgct gtaccccgtc 1380
cctctggaaa gctatgagga tgtgcacgga acactgcatc tgggcaggct ggcctatctg 1440
cacgctcgcc tgcgagaact gctgtgcgag ctgggcagac cctcaatggt gtggctgagc 1500
gccaatccat gtccccattg cggcgaccgg acattctacg accccgaacc tattctgtgc 1560
ccctgcttca tgcctaactg ataa 1584
<210> 18
<211> 526
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 共有PRAME
<400> 18
Met Asp Trp Thr Trp Ile Leu Phe Leu Val Ala Ala Ala Thr Arg Val
1 5 10 15
His Ser Glu Arg Arg Arg Leu Arg Gly Ser Ile Gln Ser Arg Tyr Ile
20 25 30
Ser Met Ser Val Trp Thr Ser Pro Arg Arg Leu Val Glu Leu Ala Gly
35 40 45
Gln Ser Leu Leu Lys Asp Glu Ala Leu Ala Ile Ala Ala Leu Glu Leu
50 55 60
Leu Pro Arg Glu Leu Phe Pro Pro Leu Phe Met Ala Ala Phe Asp Gly
65 70 75 80
Arg His Ser Gln Thr Leu Lys Ala Met Val Gln Ala Trp Pro Phe Thr
85 90 95
Cys Leu Pro Leu Gly Val Leu Met Lys Gly Gln Gln Leu His Leu Glu
100 105 110
Thr Phe Lys Ala Val Leu Asp Gly Leu Asp Val Leu Leu Ala Gln Glu
115 120 125
Val Arg Pro Arg Arg Trp Lys Leu Glu Val Leu Asp Leu Arg Lys Asn
130 135 140
Ser His Gln Asp Phe Trp Thr Val Trp Ser Gly Asn Arg Ala Ser Leu
145 150 155 160
Tyr Ser Phe Pro Glu Pro Glu Ala Ala Gln Pro Met Arg Lys Lys Arg
165 170 175
Lys Val Asp Gly Leu Ser Thr Glu Ala Glu Gln Pro Phe Thr Pro Ile
180 185 190
Glu Val Leu Val Asp Leu Ser Leu Lys Glu Gly Ala Cys Asp Glu Leu
195 200 205
Phe Ser Tyr Leu Met Glu Lys Val Lys Arg Gln Lys Asn Val Leu His
210 215 220
Leu Cys Cys Lys Lys Leu Lys Ile Phe Ala Met Pro Met Gln Asp Ile
225 230 235 240
Lys Met Ile Leu Lys Met Val Gln Leu Asp Ser Ile Glu Asp Leu Glu
245 250 255
Val Thr Cys Thr Trp Lys Leu Pro Thr Leu Ala Lys Phe Ser Pro Tyr
260 265 270
Leu Gly Gln Met Ile Asn Leu Arg Arg Leu Leu Leu Ser His Ile His
275 280 285
Ala Ser Ser Ser Ile Ser Pro Glu Lys Glu Glu Glu Tyr Ile Ala Gln
290 295 300
Phe Thr Ser Gln Phe Leu Ser Leu Gln Cys Leu Gln Ala Leu Tyr Val
305 310 315 320
Asp Ser Leu Phe Phe Leu Arg Gly Arg Leu Asp Gln Leu Leu Arg His
325 330 335
Val Met Asn Pro Leu Glu Thr Leu Ser Val Thr Asn Cys Arg Leu Ser
340 345 350
Glu Gly Asp Val Met His Leu Ser Gln Ser Pro Asn Val Ser Gln Leu
355 360 365
Ser Val Leu Ser Leu Ser Gly Val Met Leu Thr Asp Val Ser Pro Glu
370 375 380
Pro Leu Gln Ala Leu Leu Glu Arg Ala Ser Ala Thr Leu Gln Asp Leu
385 390 395 400
Asp Phe Asp Glu Cys Gly Ile Met Asp Asp Gln Leu Leu Val Leu Leu
405 410 415
Pro Ser Leu Ser His Cys Ser Gln Leu Thr Thr Leu Ser Phe Cys Gly
420 425 430
Asn Pro Ile Ser Ile Ser Val Leu Gln Asn Leu Leu His His Leu Ile
435 440 445
Gly Leu Ser Asn Leu Thr His Val Leu Tyr Pro Val Pro Leu Glu Ser
450 455 460
Tyr Glu Asp Val His Gly Thr Leu His Leu Gly Arg Leu Ala Tyr Leu
465 470 475 480
His Ala Arg Leu Arg Glu Leu Leu Cys Glu Leu Gly Arg Pro Ser Met
485 490 495
Val Trp Leu Ser Ala Asn Pro Cys Pro His Cys Gly Asp Arg Thr Phe
500 505 510
Tyr Asp Pro Glu Pro Ile Leu Cys Pro Cys Phe Met Pro Asn
515 520 525
<210> 19
<211> 1332
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 具有经修饰的锌指核酸序列的Con WT1-L
<400> 19
ggatccgcca ccatggactg gacctggatt ctgttcctgg tcgccgccgc aacacgggtg 60
catagtggga gtgatgtgag agacctgaac gccctgctgc cagcagtgcc atccctgcct 120
ggcgggggag gctgcgctct gccagtctct ggagcagctc agtgggctcc cgtgctggac 180
tttgcacccc ctgcagcccc ttacggaagt ctgggcggcc cacactcatt catcaaacag 240
gagccaagct ggggcggggc agatcctcat gaggaacagt gcctgtcagc cttcacagtc 300
cactttagcg ggcagttcac tggaaccgca ggagcttgta gatacggacc ctttggagca 360
ccaccccctt cccaggcacc ttctggacag gcacgcatgt tcccaaacgc tccctatctg 420
cctaattgtc tggaaagcca gcccgctatt aggaaccagg gctactccac agtggcattt 480
gacgggactc ctagctatgg acatacccca tcccaccatg ctgcacagtt tcctaatcac 540
tccttcaagc atgaggaccc catgggacag caggggtccc tgggagaaca gcagtactct 600
gtgccccctc ccgtgtacgg atgccacaca ccaactgaca gttgtacagg ctcacaggcc 660
ctgctgctgc gaactccata caacagtgat aatctgtatc agatgacctc acagctggag 720
tgcatgacat ggaaccagat gaatctgggc agcacactga aaggccatgc cactgggtac 780
gaatctgaca accacaccac acctatgctg tacagttgtg gagcccagta tagaatccac 840
actcatggag tcttcagagg cattcaggat gtgcggagag tcccaggagt ggcaccaact 900
atcgtgcgga gcgcctccga gaccaacgaa aagcgcccct ttatgggcgc ctaccctgga 960
ggcaataagc ggtatttcaa actgtctcac ctgcagatgg ggagtagaaa ggggaccgga 1020
gagaaacctt atcagggcga ctttaaagat ggggaaaggc gcttctctcg cagtgaccag 1080
ctgaagcgag gacagcgacg aggaaccggg gtgaagccat ttcagtgcaa aacatgtcag 1140
agaaagttct caaggagcga tcacctgaag acccatacaa gaactcacac cggcaagacc 1200
agcgagaaac cattttcctg ccgatggccc tcttgtcaga agaaattcgc ccgctccgac 1260
gaactggtcc gacaccacaa tatgcatcag agaaatatga caaaactgca gctggctctg 1320
tgataactcg ag 1332
<210> 20
<211> 436
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 具有经修饰的锌指蛋白序列的Con WT1-L
<400> 20
Met Asp Trp Thr Trp Ile Leu Phe Leu Val Ala Ala Ala Thr Arg Val
1 5 10 15
His Ser Gly Ser Asp Val Arg Asp Leu Asn Ala Leu Leu Pro Ala Val
20 25 30
Pro Ser Leu Pro Gly Gly Gly Gly Cys Ala Leu Pro Val Ser Gly Ala
35 40 45
Ala Gln Trp Ala Pro Val Leu Asp Phe Ala Pro Pro Ala Ala Pro Tyr
50 55 60
Gly Ser Leu Gly Gly Pro His Ser Phe Ile Lys Gln Glu Pro Ser Trp
65 70 75 80
Gly Gly Ala Asp Pro His Glu Glu Gln Cys Leu Ser Ala Phe Thr Val
85 90 95
His Phe Ser Gly Gln Phe Thr Gly Thr Ala Gly Ala Cys Arg Tyr Gly
100 105 110
Pro Phe Gly Ala Pro Pro Pro Ser Gln Ala Pro Ser Gly Gln Ala Arg
115 120 125
Met Phe Pro Asn Ala Pro Tyr Leu Pro Asn Cys Leu Glu Ser Gln Pro
130 135 140
Ala Ile Arg Asn Gln Gly Tyr Ser Thr Val Ala Phe Asp Gly Thr Pro
145 150 155 160
Ser Tyr Gly His Thr Pro Ser His His Ala Ala Gln Phe Pro Asn His
165 170 175
Ser Phe Lys His Glu Asp Pro Met Gly Gln Gln Gly Ser Leu Gly Glu
180 185 190
Gln Gln Tyr Ser Val Pro Pro Pro Val Tyr Gly Cys His Thr Pro Thr
195 200 205
Asp Ser Cys Thr Gly Ser Gln Ala Leu Leu Leu Arg Thr Pro Tyr Asn
210 215 220
Ser Asp Asn Leu Tyr Gln Met Thr Ser Gln Leu Glu Cys Met Thr Trp
225 230 235 240
Asn Gln Met Asn Leu Gly Ser Thr Leu Lys Gly His Ala Thr Gly Tyr
245 250 255
Glu Ser Asp Asn His Thr Thr Pro Met Leu Tyr Ser Cys Gly Ala Gln
260 265 270
Tyr Arg Ile His Thr His Gly Val Phe Arg Gly Ile Gln Asp Val Arg
275 280 285
Arg Val Pro Gly Val Ala Pro Thr Ile Val Arg Ser Ala Ser Glu Thr
290 295 300
Asn Glu Lys Arg Pro Phe Met Gly Ala Tyr Pro Gly Gly Asn Lys Arg
305 310 315 320
Tyr Phe Lys Leu Ser His Leu Gln Met Gly Ser Arg Lys Gly Thr Gly
325 330 335
Glu Lys Pro Tyr Gln Gly Asp Phe Lys Asp Gly Glu Arg Arg Phe Ser
340 345 350
Arg Ser Asp Gln Leu Lys Arg Gly Gln Arg Arg Gly Thr Gly Val Lys
355 360 365
Pro Phe Gln Cys Lys Thr Cys Gln Arg Lys Phe Ser Arg Ser Asp His
370 375 380
Leu Lys Thr His Thr Arg Thr His Thr Gly Lys Thr Ser Glu Lys Pro
385 390 395 400
Phe Ser Cys Arg Trp Pro Ser Cys Gln Lys Lys Phe Ala Arg Ser Asp
405 410 415
Glu Leu Val Arg His His Asn Met His Gln Arg Asn Met Thr Lys Leu
420 425 430
Gln Leu Ala Leu
435
<210> 21
<211> 954
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 无锌指核酸序列的Con WT1-S
<400> 21
ggatccgcca ccatggactg gacctggatt ctgtttctgg tggctgctgc tacacgggtg 60
cattctggga gcgatgtgag agacctgaac gccctgctgc cagctgtgcc aagtctgcct 120
ggcgggggag gctgcgcact gccagtgagc ggagcagctc agtgggctcc cgtcctggac 180
tttgcacccc ctgcagcacc ttacggctca ctgggcggcc cacacagctt catcaagcag 240
gagccatctt ggggcggggc cgatcctcac gaggaacagt gcctgagtgc tttcacagtg 300
catttttcag gccagttcac tggaaccgca ggagcttgtc gatacggacc ctttggagcc 360
ccacccccta gccaggcacc ttccggacag gccagaatgt tcccaaacgc tccctatctg 420
cctaattgtc tggaatcaca gcctgcaatt cggaaccagg gctacagcac cgtcgccttt 480
gacgggacac catcctatgg acacactccc tctcaccatg ctgcacagtt tcctaatcac 540
agcttcaagc atgaggaccc catgggacag caggggagcc tgggagaaca gcagtactcc 600
gtgccacccc ctgtctatgg ctgccataca ccaactgact cttgtacagg gagtcaggcc 660
ctgctgctgc gaactccata caactctgat aatctgtatc agatgactag tcagctggag 720
tgcatgacct ggaaccagat gaatctgggg tccaccctga aaggccacgc cacagggtat 780
gaatccgaca accataccac acccatgctg tactcttgtg gcgcccagta tagaatccac 840
acccatggag tgttccgcgg cattcaggat gtgcggagag tcccaggagt cgctcccacc 900
atcgtgagat ccgccagtga gaccaatgaa aagagaccct tctgataact cgag 954
<210> 22
<211> 310
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 无锌指蛋白序列的Con WT1-S
<400> 22
Met Asp Trp Thr Trp Ile Leu Phe Leu Val Ala Ala Ala Thr Arg Val
1 5 10 15
His Ser Gly Ser Asp Val Arg Asp Leu Asn Ala Leu Leu Pro Ala Val
20 25 30
Pro Ser Leu Pro Gly Gly Gly Gly Cys Ala Leu Pro Val Ser Gly Ala
35 40 45
Ala Gln Trp Ala Pro Val Leu Asp Phe Ala Pro Pro Ala Ala Pro Tyr
50 55 60
Gly Ser Leu Gly Gly Pro His Ser Phe Ile Lys Gln Glu Pro Ser Trp
65 70 75 80
Gly Gly Ala Asp Pro His Glu Glu Gln Cys Leu Ser Ala Phe Thr Val
85 90 95
His Phe Ser Gly Gln Phe Thr Gly Thr Ala Gly Ala Cys Arg Tyr Gly
100 105 110
Pro Phe Gly Ala Pro Pro Pro Ser Gln Ala Pro Ser Gly Gln Ala Arg
115 120 125
Met Phe Pro Asn Ala Pro Tyr Leu Pro Asn Cys Leu Glu Ser Gln Pro
130 135 140
Ala Ile Arg Asn Gln Gly Tyr Ser Thr Val Ala Phe Asp Gly Thr Pro
145 150 155 160
Ser Tyr Gly His Thr Pro Ser His His Ala Ala Gln Phe Pro Asn His
165 170 175
Ser Phe Lys His Glu Asp Pro Met Gly Gln Gln Gly Ser Leu Gly Glu
180 185 190
Gln Gln Tyr Ser Val Pro Pro Pro Val Tyr Gly Cys His Thr Pro Thr
195 200 205
Asp Ser Cys Thr Gly Ser Gln Ala Leu Leu Leu Arg Thr Pro Tyr Asn
210 215 220
Ser Asp Asn Leu Tyr Gln Met Thr Ser Gln Leu Glu Cys Met Thr Trp
225 230 235 240
Asn Gln Met Asn Leu Gly Ser Thr Leu Lys Gly His Ala Thr Gly Tyr
245 250 255
Glu Ser Asp Asn His Thr Thr Pro Met Leu Tyr Ser Cys Gly Ala Gln
260 265 270
Tyr Arg Ile His Thr His Gly Val Phe Arg Gly Ile Gln Asp Val Arg
275 280 285
Arg Val Pro Gly Val Ala Pro Thr Ile Val Arg Ser Ala Ser Glu Thr
290 295 300
Asn Glu Lys Arg Pro Phe
305 310
<210> 23
<211> 3512
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> hTERT
<400> 23
ggtaccgaat tcgccaccat ggactggacc tggatcctgt tcctggtggc cgctgccaca 60
agagtgcaca gccccagggc ccccaggtgc agagccgtgc ggagcctgct gcggagccac 120
taccgggagg tgctgcccct ggccaccttc gtgcggaggc tgggccctca ggggtggcgg 180
ctggtgcaga gaggcgaccc tgccgccttc agagccctgg tggcccagtg cctggtgtgc 240
gtgccctggg acgccagacc tccccctgcc gcccctagct tccggcaggt gtcctgcctg 300
aaagaactgg tggcccgggt gctgcagcgg ctgtgcgaga ggggcgccaa gaacgtgctg 360
gccttcggct tcgccctgct ggacggcgcc agaggcggcc ctcccgaggc cttcaccacc 420
tccgtgagaa gctacctgcc caacaccgtg accgacgccc tgagaggcag cggcgcttgg 480
ggcctgctgc tgcgcagagt gggcgacgac gtgctggtgc acctgctggc cagatgcgcc 540
ctgttcgtgc tggtcgcccc cagctgcgcc taccaggtgt gcggcccacc cctgtaccag 600
ctgggagccg ccacccaggc cagaccccct cctcacgcct ccggccccag gcggagactg 660
ggctgcgagc gggcctggaa ccacagcgtg cgggaggccg gcgtgcccct gggcctgcca 720
gcccctggcg ccagaagaag gggcggcagc gccagcagaa gcctgcccct gcccaagcgg 780
cccagacgcg gagccgcccc tgagcccgag agaacccccg tgggccaggg ctcttgggcc 840
caccctggcc ggaccagagg ccccagcgac cggggcttct gcgtggtgtc ccccgccaga 900
cccgccgagg aagccacctc cctggaaggc gccctgagcg gcaccaggca cagccacccc 960
agcgtgggcc gccagcacca cgccggaccc cccagcacct ccaggccccc caggccctgg 1020
gacacccctt gcccccctgt gtacgccgag accaagcact tcctgtacag cagcggcgac 1080
aaagagcagc tgcggcccag cttcctgctg tccagcctga ggccctccct gaccggcgct 1140
aggcgcctgg tggagaccat ctttctgggc agccggccct ggatgcccgg cacccccagg 1200
cggctgccca ggctgcccca gcggtactgg cagatgaggc ctctgttcct ggaactgctg 1260
ggcaaccacg cccagtgccc ctacggcgtg ctgctgaaaa cccactgccc cctgagagcc 1320
gccgtgaccc cagccgccgg agtgtgcgcc agagagaagc ctcagggcag cgtggccgct 1380
cccgaggaag aggacaccga ccccagacgc ctggtgcagc tgctgcggca gcacagcagc 1440
ccttggcagg tgtacggctt cgtgcgggcc tgcctgagaa ggctggtgcc ccctggcctg 1500
tggggcagca ggcacaacga gcggcggttt ctgcggaaca ccaagaagtt catcagcctg 1560
gggaagcacg ccaagctgtc cctgcaggaa ctgacctgga agatgagcgt gcggggctgc 1620
gcctggctga gaagatcccc tggcgtgggc tgcgtgcctg ccgccgagca ccggctgcgg 1680
gaggaaatcc tggccaagtt cctgcactgg ctgatgagcg tgtacgtggt ggagctgctg 1740
agatccttct tctacgtgac cgagaccacc ttccagaaga actacctgtt cttctaccgg 1800
aagagcgtgt ggagcaagct gcagagcatc ggcatccggc agcacctgaa gcgggtgcag 1860
ctgagagagc tgtccgaggc cgaagtgagg cagcaccggg aggccagacc tgccctgctg 1920
accagccggc tgcggttcat ccccaagccc gacggcctgc ggcccatcgt gaacatggac 1980
tacgtggtgg gcgccaggac cttccggcgg gagaagcggg ccgagcggct gacctcgagg 2040
gtgaaggccc tgttcagcgt gctgaactac gagcgggcca ggcggccagg cctgctgggc 2100
gccagcgtgc tgggcctgga cgacatccac cgggcctggc ggaccttcgt gctgagagtg 2160
cgggcccagg acccccctcc cgagctgtac ttcgtgaagg tggacgtgac aggcgcctac 2220
gacaccatcc cccaggaccg gctgaccgag gtgatcgcca gcatcatcaa gccccagaac 2280
acctactgcg tgcggagata cgccgtggtg cagaaggccg cccacggcca cgtgcggaag 2340
gccttcaaga gccacgtgag caccctgacc gacctgcagc cctacatgcg gcagttcgtg 2400
gcccacctgc aggaaaccag ccccctgcgg gatgccgtgg tgatcgagca gagcagcagc 2460
ctgaacgagg ccagcagcgg cctgttcgac gtgttcctga gattcatgtg ccaccacgcc 2520
gtgcggatcc ggggcaagag ctacgtgcag tgccagggca tcccacaggg cagcatcctg 2580
tccaccctgc tgtgctccct gtgctacggc gacatggaaa acaagctgtt cgccggcatc 2640
aggcgggacg gactgctgct gagactggtg gacgacttcc tgctggtgac cccccacctg 2700
acccacgcca agacctttct gcggaccctg gtgcgcggcg tgcccgagta cggctgcgtg 2760
gtgaacctga gaaagaccgt ggtgaacttc cccgtggagg acgaggccct gggcggcaca 2820
gccttcgtgc agatgcctgc ccatggactg ttcccttggt gcgggctgct gctggacacc 2880
cggaccctgg aagtgcagag cgactacagc agctacgccc ggaccagcat ccgggcctcc 2940
ctgaccttca acaggggctt caaggccggc aggaacatgc ggcggaagct gtttggcgtg 3000
ctgcggctga agtgccacag cctgtttctg tacctgcagg tgaacagcct gcagaccgtg 3060
tgcaccaaca tctacaagat cctgctgctg caggcctacc ggttccacgc ctgcgtgctg 3120
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gccaagggag ccgccggacc tctgcccagc gaggccgtgc agtggctgtg ccaccaggcc 3300
tttctgctga agctgacccg gcaccgggtg acctacgtgc ccctgctggg cagcctgcgg 3360
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gccgccaacc ccgccctgcc ctccgacttc aagaccatcc tggactaccc ctacgacgtg 3480
cccgactacg cctgatgagc ggccgcgagc tc 3512
<210> 24
<211> 1158
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> hTERT
<400> 24
Met Asp Trp Thr Trp Ile Leu Phe Leu Val Ala Ala Ala Thr Arg Val
1 5 10 15
His Ser Pro Arg Ala Pro Arg Cys Arg Ala Val Arg Ser Leu Leu Arg
20 25 30
Ser His Tyr Arg Glu Val Leu Pro Leu Ala Thr Phe Val Arg Arg Leu
35 40 45
Gly Pro Gln Gly Trp Arg Leu Val Gln Arg Gly Asp Pro Ala Ala Phe
50 55 60
Arg Ala Leu Val Ala Gln Cys Leu Val Cys Val Pro Trp Asp Ala Arg
65 70 75 80
Pro Pro Pro Ala Ala Pro Ser Phe Arg Gln Val Ser Cys Leu Lys Glu
85 90 95
Leu Val Ala Arg Val Leu Gln Arg Leu Cys Glu Arg Gly Ala Lys Asn
100 105 110
Val Leu Ala Phe Gly Phe Ala Leu Leu Asp Gly Ala Arg Gly Gly Pro
115 120 125
Pro Glu Ala Phe Thr Thr Ser Val Arg Ser Tyr Leu Pro Asn Thr Val
130 135 140
Thr Asp Ala Leu Arg Gly Ser Gly Ala Trp Gly Leu Leu Leu Arg Arg
145 150 155 160
Val Gly Asp Asp Val Leu Val His Leu Leu Ala Arg Cys Ala Leu Phe
165 170 175
Val Leu Val Ala Pro Ser Cys Ala Tyr Gln Val Cys Gly Pro Pro Leu
180 185 190
Tyr Gln Leu Gly Ala Ala Thr Gln Ala Arg Pro Pro Pro His Ala Ser
195 200 205
Gly Pro Arg Arg Arg Leu Gly Cys Glu Arg Ala Trp Asn His Ser Val
210 215 220
Arg Glu Ala Gly Val Pro Leu Gly Leu Pro Ala Pro Gly Ala Arg Arg
225 230 235 240
Arg Gly Gly Ser Ala Ser Arg Ser Leu Pro Leu Pro Lys Arg Pro Arg
245 250 255
Arg Gly Ala Ala Pro Glu Pro Glu Arg Thr Pro Val Gly Gln Gly Ser
260 265 270
Trp Ala His Pro Gly Arg Thr Arg Gly Pro Ser Asp Arg Gly Phe Cys
275 280 285
Val Val Ser Pro Ala Arg Pro Ala Glu Glu Ala Thr Ser Leu Glu Gly
290 295 300
Ala Leu Ser Gly Thr Arg His Ser His Pro Ser Val Gly Arg Gln His
305 310 315 320
His Ala Gly Pro Pro Ser Thr Ser Arg Pro Pro Arg Pro Trp Asp Thr
325 330 335
Pro Cys Pro Pro Val Tyr Ala Glu Thr Lys His Phe Leu Tyr Ser Ser
340 345 350
Gly Asp Lys Glu Gln Leu Arg Pro Ser Phe Leu Leu Ser Ser Leu Arg
355 360 365
Pro Ser Leu Thr Gly Ala Arg Arg Leu Val Glu Thr Ile Phe Leu Gly
370 375 380
Ser Arg Pro Trp Met Pro Gly Thr Pro Arg Arg Leu Pro Arg Leu Pro
385 390 395 400
Gln Arg Tyr Trp Gln Met Arg Pro Leu Phe Leu Glu Leu Leu Gly Asn
405 410 415
His Ala Gln Cys Pro Tyr Gly Val Leu Leu Lys Thr His Cys Pro Leu
420 425 430
Arg Ala Ala Val Thr Pro Ala Ala Gly Val Cys Ala Arg Glu Lys Pro
435 440 445
Gln Gly Ser Val Ala Ala Pro Glu Glu Glu Asp Thr Asp Pro Arg Arg
450 455 460
Leu Val Gln Leu Leu Arg Gln His Ser Ser Pro Trp Gln Val Tyr Gly
465 470 475 480
Phe Val Arg Ala Cys Leu Arg Arg Leu Val Pro Pro Gly Leu Trp Gly
485 490 495
Ser Arg His Asn Glu Arg Arg Phe Leu Arg Asn Thr Lys Lys Phe Ile
500 505 510
Ser Leu Gly Lys His Ala Lys Leu Ser Leu Gln Glu Leu Thr Trp Lys
515 520 525
Met Ser Val Arg Gly Cys Ala Trp Leu Arg Arg Ser Pro Gly Val Gly
530 535 540
Cys Val Pro Ala Ala Glu His Arg Leu Arg Glu Glu Ile Leu Ala Lys
545 550 555 560
Phe Leu His Trp Leu Met Ser Val Tyr Val Val Glu Leu Leu Arg Ser
565 570 575
Phe Phe Tyr Val Thr Glu Thr Thr Phe Gln Lys Asn Tyr Leu Phe Phe
580 585 590
Tyr Arg Lys Ser Val Trp Ser Lys Leu Gln Ser Ile Gly Ile Arg Gln
595 600 605
His Leu Lys Arg Val Gln Leu Arg Glu Leu Ser Glu Ala Glu Val Arg
610 615 620
Gln His Arg Glu Ala Arg Pro Ala Leu Leu Thr Ser Arg Leu Arg Phe
625 630 635 640
Ile Pro Lys Pro Asp Gly Leu Arg Pro Ile Val Asn Met Asp Tyr Val
645 650 655
Val Gly Ala Arg Thr Phe Arg Arg Glu Lys Arg Ala Glu Arg Leu Thr
660 665 670
Ser Arg Val Lys Ala Leu Phe Ser Val Leu Asn Tyr Glu Arg Ala Arg
675 680 685
Arg Pro Gly Leu Leu Gly Ala Ser Val Leu Gly Leu Asp Asp Ile His
690 695 700
Arg Ala Trp Arg Thr Phe Val Leu Arg Val Arg Ala Gln Asp Pro Pro
705 710 715 720
Pro Glu Leu Tyr Phe Val Lys Val Asp Val Thr Gly Ala Tyr Asp Thr
725 730 735
Ile Pro Gln Asp Arg Leu Thr Glu Val Ile Ala Ser Ile Ile Lys Pro
740 745 750
Gln Asn Thr Tyr Cys Val Arg Arg Tyr Ala Val Val Gln Lys Ala Ala
755 760 765
His Gly His Val Arg Lys Ala Phe Lys Ser His Val Ser Thr Leu Thr
770 775 780
Asp Leu Gln Pro Tyr Met Arg Gln Phe Val Ala His Leu Gln Glu Thr
785 790 795 800
Ser Pro Leu Arg Asp Ala Val Val Ile Glu Gln Ser Ser Ser Leu Asn
805 810 815
Glu Ala Ser Ser Gly Leu Phe Asp Val Phe Leu Arg Phe Met Cys His
820 825 830
His Ala Val Arg Ile Arg Gly Lys Ser Tyr Val Gln Cys Gln Gly Ile
835 840 845
Pro Gln Gly Ser Ile Leu Ser Thr Leu Leu Cys Ser Leu Cys Tyr Gly
850 855 860
Asp Met Glu Asn Lys Leu Phe Ala Gly Ile Arg Arg Asp Gly Leu Leu
865 870 875 880
Leu Arg Leu Val Asp Asp Phe Leu Leu Val Thr Pro His Leu Thr His
885 890 895
Ala Lys Thr Phe Leu Arg Thr Leu Val Arg Gly Val Pro Glu Tyr Gly
900 905 910
Cys Val Val Asn Leu Arg Lys Thr Val Val Asn Phe Pro Val Glu Asp
915 920 925
Glu Ala Leu Gly Gly Thr Ala Phe Val Gln Met Pro Ala His Gly Leu
930 935 940
Phe Pro Trp Cys Gly Leu Leu Leu Asp Thr Arg Thr Leu Glu Val Gln
945 950 955 960
Ser Asp Tyr Ser Ser Tyr Ala Arg Thr Ser Ile Arg Ala Ser Leu Thr
965 970 975
Phe Asn Arg Gly Phe Lys Ala Gly Arg Asn Met Arg Arg Lys Leu Phe
980 985 990
Gly Val Leu Arg Leu Lys Cys His Ser Leu Phe Leu Tyr Leu Gln Val
995 1000 1005
Asn Ser Leu Gln Thr Val Cys Thr Asn Ile Tyr Lys Ile Leu Leu
1010 1015 1020
Leu Gln Ala Tyr Arg Phe His Ala Cys Val Leu Gln Leu Pro Phe
1025 1030 1035
His Gln Gln Val Trp Lys Asn Pro Thr Phe Phe Leu Arg Val Ile
1040 1045 1050
Ser Asp Thr Ala Ser Leu Cys Tyr Ser Ile Leu Lys Ala Lys Asn
1055 1060 1065
Ala Gly Met Ser Leu Gly Ala Lys Gly Ala Ala Gly Pro Leu Pro
1070 1075 1080
Ser Glu Ala Val Gln Trp Leu Cys His Gln Ala Phe Leu Leu Lys
1085 1090 1095
Leu Thr Arg His Arg Val Thr Tyr Val Pro Leu Leu Gly Ser Leu
1100 1105 1110
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Leu Thr Ala Leu Glu Ala Ala Ala Asn Pro Ala Leu Pro Ser Asp
1130 1135 1140
Phe Lys Thr Ile Leu Asp Tyr Pro Tyr Asp Val Pro Asp Tyr Ala
1145 1150 1155
<210> 25
<211> 2724
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> gB 共有核酸序列
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(3)
<223> n为a、c、g或t
<400> 25
nnngagagca gaatctggtg cctggtcgtg tgcgtgaacc tgtgcatcgt gtgcctggga 60
gccgccgtgt ccagcagcag cacccggggc acaagcgcca cacacagcca ccacagcagc 120
cacaccacca gcgccgccca cagccggagc ggaagcgtga gcagccagcg ggtgaccagc 180
agcgaggccg tgtcccaccg ggccaacgag acaatctaca acaccaccct gaagtacggc 240
gacgtcgtgg gagtgaacac caccaagtac ccctacagag tgtgcagcat ggcccagggc 300
accgacctga tcagattcga gcggaacatc gtgtgtacca gcatgaagcc catcaacgag 360
gacctggacg agggcatcat ggtggtgtac aagagaaaca tcgtggccca caccttcaaa 420
gtgcgggtgt accagaaggt gctgaccttc cggcggagct acgcctacat ccacaccacc 480
tacctgctgg gcagcaacac cgagtacgtg gcccctccca tgtgggagat ccaccacatc 540
aacagccaca gccagtgcta cagcagctac agccgcgtga tcgccggcac cgtgttcgtg 600
gcctaccacc gggacagcta cgagaacaag accatgcagc tgatgcccga cgactacagc 660
aacacccaca gcaccagata cgtgaccgtg aaggaccagt ggcacagccg gggaagcacc 720
tggctgtaca gagagacatg caacctgaac tgcatggtca ccatcaccac cgccagaagc 780
aagtaccctt accacttctt cgccaccagc accggcgacg tggtggacat cagccccttc 840
tacaacggca ccaaccggaa cgccagctac ttcggcgaga acgccgacaa gttcttcatc 900
ttccccaact acaccatcgt gtccgacttc ggcagaccca acagcgcccc tgagacacac 960
cggctggtgg cctttctgga acgggccgac agcgtgatca gctgggacat ccaggacgag 1020
aagaacgtga cctgccagct gaccttctgg gaggctagcg agcggaccat cagaagcgag 1080
gccgaggaca gctaccactt cagcagcgcc aagatgaccg ccaccttcct gagcaagaaa 1140
caggaagtga acatgagcga cagcgccctg gactgcgtgc gggatgaggc catcaacaag 1200
ctgcagcaga tcttcaacac cagctacaac cagacctacg agaagtatgg caacgtgtcc 1260
gtgttcgaga caacaggcgg cctggtggtg ttctggcagg gcatcaagca gaagtccctg 1320
gtcgagctgg aacggctggc caacagaagc agcctgaacc tgacccaccg gaccaagcgg 1380
agcaccgacg gcaacaatac cacccacctg agcaacatgg aaagcgtcca caacctggtg 1440
tacgcccagc tgcagttcac ctacgacacc ctgcggggct acatcaaccg ggccctggcc 1500
cagatcgccg aggcttggtg tgtggaccag cggcggaccc tggaagtgtt caaagagctg 1560
agcaagatca accccagcgc catcctgagc gccatctaca acaagcctat cgccgccaga 1620
ttcatgggcg acgtgctggg cctggccagc tgcgtgacca tcaaccagac cagcgtgaag 1680
gtgctgcggg acatgaacgt gaaagaaagc cccggcagat gctactccag acccgtggtc 1740
atcttcaact tcgccaacag ctcctacgtg cagtacggcc agctgggcga ggacaacgag 1800
atcctgctgg gaaaccaccg gaccgaggaa tgccagctgc ccagcctgaa gatctttatc 1860
gccggcaaca gcgcctacga gtatgtggac tacctgttca agcggatgat cgacctgagc 1920
agcatcagca ccgtggacag catgatcgcc ctggacatcg accccctgga aaacaccgac 1980
ttccgggtgc tggaactgta cagccagaaa gagctgcgga gcagcaacgt gttcgacctg 2040
gaagagatca tgcgcgagtt caacagctac aagcagcgcg tgaaatacgt cgaggacaag 2100
gtggtggacc ccctgccccc ctacctgaag ggcctggacg acctgatgag cggcctggga 2160
gctgctggca aggccgtggg agtggccatt ggagctgtgg gcggagccgt ggccagcgtg 2220
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agcgacgaag aggaaaacgt gtga 2724
<210> 26
<211> 907
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> gB 共有氨基酸序列
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (1)..(1)
<223> Xaa可以是任意天然存在的氨基酸
<400> 26
Xaa Glu Ser Arg Ile Trp Cys Leu Val Val Cys Val Asn Leu Cys Ile
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Val Cys Leu Gly Ala Ala Val Ser Ser Ser Ser Thr Arg Gly Thr Ser
20 25 30
Ala Thr His Ser His His Ser Ser His Thr Thr Ser Ala Ala His Ser
35 40 45
Arg Ser Gly Ser Val Ser Ser Gln Arg Val Thr Ser Ser Glu Ala Val
50 55 60
Ser His Arg Ala Asn Glu Thr Ile Tyr Asn Thr Thr Leu Lys Tyr Gly
65 70 75 80
Asp Val Val Gly Val Asn Thr Thr Lys Tyr Pro Tyr Arg Val Cys Ser
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100 105 110
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115 120 125
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130 135 140
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Tyr Leu Leu Gly Ser Asn Thr Glu Tyr Val Ala Pro Pro Met Trp Glu
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180 185 190
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195 200 205
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210 215 220
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225 230 235 240
Trp Leu Tyr Arg Glu Thr Cys Asn Leu Asn Cys Met Val Thr Ile Thr
245 250 255
Thr Ala Arg Ser Lys Tyr Pro Tyr His Phe Phe Ala Thr Ser Thr Gly
260 265 270
Asp Val Val Asp Ile Ser Pro Phe Tyr Asn Gly Thr Asn Arg Asn Ala
275 280 285
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Arg Leu Val Ala Phe Leu Glu Arg Ala Asp Ser Val Ile Ser Trp Asp
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Ile Gln Asp Glu Lys Asn Val Thr Cys Gln Leu Thr Phe Trp Glu Ala
340 345 350
Ser Glu Arg Thr Ile Arg Ser Glu Ala Glu Asp Ser Tyr His Phe Ser
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Ser Ala Lys Met Thr Ala Thr Phe Leu Ser Lys Lys Gln Glu Val Asn
370 375 380
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Gly Asn Val Ser Val Phe Glu Thr Thr Gly Gly Leu Val Val Phe Trp
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Gln Gly Ile Lys Gln Lys Ser Leu Val Glu Leu Glu Arg Leu Ala Asn
435 440 445
Arg Ser Ser Leu Asn Leu Thr His Arg Thr Lys Arg Ser Thr Asp Gly
450 455 460
Asn Asn Thr Thr His Leu Ser Asn Met Glu Ser Val His Asn Leu Val
465 470 475 480
Tyr Ala Gln Leu Gln Phe Thr Tyr Asp Thr Leu Arg Gly Tyr Ile Asn
485 490 495
Arg Ala Leu Ala Gln Ile Ala Glu Ala Trp Cys Val Asp Gln Arg Arg
500 505 510
Thr Leu Glu Val Phe Lys Glu Leu Ser Lys Ile Asn Pro Ser Ala Ile
515 520 525
Leu Ser Ala Ile Tyr Asn Lys Pro Ile Ala Ala Arg Phe Met Gly Asp
530 535 540
Val Leu Gly Leu Ala Ser Cys Val Thr Ile Asn Gln Thr Ser Val Lys
545 550 555 560
Val Leu Arg Asp Met Asn Val Lys Glu Ser Pro Gly Arg Cys Tyr Ser
565 570 575
Arg Pro Val Val Ile Phe Asn Phe Ala Asn Ser Ser Tyr Val Gln Tyr
580 585 590
Gly Gln Leu Gly Glu Asp Asn Glu Ile Leu Leu Gly Asn His Arg Thr
595 600 605
Glu Glu Cys Gln Leu Pro Ser Leu Lys Ile Phe Ile Ala Gly Asn Ser
610 615 620
Ala Tyr Glu Tyr Val Asp Tyr Leu Phe Lys Arg Met Ile Asp Leu Ser
625 630 635 640
Ser Ile Ser Thr Val Asp Ser Met Ile Ala Leu Asp Ile Asp Pro Leu
645 650 655
Glu Asn Thr Asp Phe Arg Val Leu Glu Leu Tyr Ser Gln Lys Glu Leu
660 665 670
Arg Ser Ser Asn Val Phe Asp Leu Glu Glu Ile Met Arg Glu Phe Asn
675 680 685
Ser Tyr Lys Gln Arg Val Lys Tyr Val Glu Asp Lys Val Val Asp Pro
690 695 700
Leu Pro Pro Tyr Leu Lys Gly Leu Asp Asp Leu Met Ser Gly Leu Gly
705 710 715 720
Ala Ala Gly Lys Ala Val Gly Val Ala Ile Gly Ala Val Gly Gly Ala
725 730 735
Val Ala Ser Val Val Glu Gly Val Ala Thr Phe Leu Lys Asn Pro Phe
740 745 750
Gly Ala Phe Thr Ile Ile Leu Val Ala Ile Ala Val Val Ile Ile Thr
755 760 765
Tyr Leu Ile Tyr Thr Arg Gln Arg Arg Leu Cys Thr Gln Pro Leu Gln
770 775 780
Asn Leu Phe Pro Tyr Leu Val Ser Ala Asp Gly Thr Thr Val Thr Ser
785 790 795 800
Gly Ser Thr Lys Asp Thr Ser Leu Gln Ala Pro Pro Ser Tyr Glu Glu
805 810 815
Ser Val Tyr Asn Ser Gly Arg Lys Gly Pro Gly Pro Pro Ser Ser Asp
820 825 830
Ala Ser Thr Ala Ala Pro Pro Tyr Thr Asn Glu Gln Ala Tyr Gln Met
835 840 845
Leu Leu Ala Leu Ala Arg Leu Asp Ala Glu Gln Arg Ala Gln Gln Asn
850 855 860
Gly Thr Asp Ser Leu Asp Gly Gln Thr Gly Thr Gln Asp Lys Gly Gln
865 870 875 880
Lys Pro Asn Leu Leu Asp Arg Leu Arg His Arg Lys Asn Gly Tyr Arg
885 890 895
His Leu Lys Asp Ser Asp Glu Glu Glu Asn Val
900 905
<210> 27
<211> 1119
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> gM 共有核酸序列
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(3)
<223> n为a、c、g或t
<400> 27
nnngcaccca gccacgtgga caaagtgaac acccggactt ggagcgccag catcgtgttc 60
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<210> 28
<211> 372
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> gM 共有氨基酸序列
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (1)..(1)
<223> Xaa可以是任意天然存在的氨基酸
<400> 28
Xaa Ala Pro Ser His Val Asp Lys Val Asn Thr Arg Thr Trp Ser Ala
1 5 10 15
Ser Ile Val Phe Met Val Leu Thr Phe Val Asn Val Ser Val His Leu
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Val Leu Ser Asn Phe Pro His Leu Gly Tyr Pro Cys Val Tyr Tyr His
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Val Val Asp Phe Glu Arg Leu Asn Met Ser Ala Tyr Asn Val Met His
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Leu His Thr Pro Met Leu Phe Leu Asp Ser Val Gln Leu Val Cys Tyr
65 70 75 80
Ala Val Phe Met Gln Leu Val Phe Leu Ala Val Thr Ile Tyr Tyr Leu
85 90 95
Val Cys Trp Ile Lys Ile Ser Met Arg Lys Asp Lys Gly Met Ser Leu
100 105 110
Asn Gln Ser Thr Arg Asp Ile Ser Tyr Met Gly Asp Ser Leu Thr Ala
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Phe Leu Phe Ile Leu Ser Met Asp Thr Phe Gln Leu Phe Thr Leu Thr
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Met Ser Phe Arg Leu Pro Ser Met Ile Ala Phe Met Ala Ala Val His
145 150 155 160
Phe Phe Cys Leu Thr Ile Phe Asn Val Ser Met Val Thr Gln Tyr Arg
165 170 175
Ser Tyr Lys Arg Ser Leu Phe Phe Phe Ser Arg Leu His Pro Lys Leu
180 185 190
Lys Gly Thr Val Gln Phe Arg Thr Leu Ile Val Asn Leu Val Glu Val
195 200 205
Ala Leu Gly Phe Asn Thr Thr Val Val Ala Met Ala Leu Cys Tyr Gly
210 215 220
Phe Gly Asn Asn Phe Phe Val Arg Thr Gly His Met Val Leu Ala Val
225 230 235 240
Phe Val Val Tyr Ala Ile Ile Ser Ile Ile Tyr Phe Leu Leu Ile Glu
245 250 255
Ala Val Phe Phe Gln Tyr Val Lys Val Gln Phe Gly Tyr His Leu Gly
260 265 270
Ala Phe Phe Gly Leu Cys Gly Leu Ile Tyr Pro Ile Val Gln Tyr Asp
275 280 285
Thr Phe Leu Ser Asn Glu Tyr Arg Thr Gly Ile Ser Trp Ser Phe Gly
290 295 300
Met Leu Phe Phe Ile Trp Ala Met Phe Thr Thr Cys Arg Ala Val Arg
305 310 315 320
Tyr Phe Arg Gly Arg Gly Ser Gly Ser Val Lys Tyr Gln Ala Leu Ala
325 330 335
Thr Ala Ser Gly Glu Glu Val Ala Ala Leu Ser His His Asp Ser Leu
340 345 350
Glu Ser Arg Arg Leu Arg Glu Glu Glu Asp Asp Asp Asp Asp Glu Asp
355 360 365
Phe Glu Asp Ala
370
<210> 29
<211> 411
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> gN 共有核酸序列
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(3)
<223> n为a、c、g或t
<400> 29
nnngagtgga acaccctggt gctgggtctg ctggtgctgt ctgtggccgc cagcagcaac 60
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<210> 30
<211> 136
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> N 共有氨基酸序列
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (1)..(1)
<223> Xaa可以是任意天然存在的氨基酸
<400> 30
Xaa Glu Trp Asn Thr Leu Val Leu Gly Leu Leu Val Leu Ser Val Ala
1 5 10 15
Ala Ser Ser Asn Asn Thr Ser Thr Ala Ser Thr Pro Ser Pro Ser Ser
20 25 30
Ser Thr His Thr Ser Thr Thr Val Lys Ala Thr Thr Thr Ala Thr Thr
35 40 45
Ser Thr Thr Thr Ala Thr Ser Thr Thr Ser Ser Thr Thr Ser Thr Lys
50 55 60
Pro Gly Ser Thr Thr His Asp Pro Asn Val Met Arg Pro His Ala His
65 70 75 80
Asn Asp Phe Tyr Lys Ala His Cys Thr Ser His Met Tyr Glu Leu Ser
85 90 95
Leu Ser Ser Phe Ala Ala Trp Trp Thr Met Leu Asn Ala Leu Ile Leu
100 105 110
Met Gly Ala Phe Cys Ile Val Leu Arg His Cys Cys Phe Gln Asn Phe
115 120 125
Thr Ala Thr Thr Thr Lys Gly Tyr
130 135
<210> 31
<211> 2232
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> gH 共有核酸序列
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(3)
<223> n为a、c、g或t
<400> 31
nnncgacccg gcctgcccag ctacctgacc gtgttcgccg tgtacctgct gagccatctg 60
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atgatcacct gtctgagcca gaccccccct cggaccaccc tgctgctgta ccctaccgcc 1200
gtggatctgg ccaagcgggc cctgtggacc cccaaccaga tcaccgacat cacaagcctc 1260
gtgcggctgg tgtacatcct gagcaagcag aaccagcagc acctgatccc ccagtgggcc 1320
ctgagacaga tcgccgactt cgccctgaag ctgcacaaga cccacctggc tagctttctg 1380
agcgccttcg ctaggcagga actgtacctg atgggcagcc tggtgcactc catgctggtg 1440
cacaccaccg agaggcggga aatcttcatc gtggaaaccg gcctgtgcag cctggccgag 1500
ctgagccact tcacccagct gctggcccac ccccaccacg agtacctgag cgacctgtac 1560
accccctgca gctctagcgg cagacgggat cacagcctgg aacggctgac ccggctgttc 1620
cccgatgcca cagtgcctgc cactgtgcca gccgccctgt ccatcctgtc caccatgcag 1680
cccagcaccc tggaaacctt ccccgacctg ttctgcctgc ccctgggcga gagcttcagc 1740
gccctgacag tgtccgagca cgtgtcctac gtggtcacca accagtacct gatcaagggc 1800
atcagctacc ccgtgtccac caccgtcgtg ggccagagcc tgatcatcac ccagaccgac 1860
agccagacca agtgcgagct gacccggaac atgcacacca cacacagcat cactgccgcc 1920
ctgaacatca gcctggaaaa ctgcgccttc tgccagtctg ccctgctgga atacgacgat 1980
acccagggcg tgatcaacat catgtacatg cacgacagcg acgacgtgct gttcgccctg 2040
gacccctaca acgaggtggt ggtgtccagc ccccggaccc actacctgat gctgctgaag 2100
aacggcaccg tgctggaagt gaccgacgtg gtggtggacg ccaccgacag cagactgctg 2160
atgatgagcg tgtacgccct gagcgccatc atcggcatct acctgctgta ccggatgctg 2220
aaaacctgct ga 2232
<210> 32
<211> 743
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> gH 共有氨基酸序列
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (1)..(1)
<223> Xaa可以是任意天然存在的氨基酸
<400> 32
Xaa Arg Pro Gly Leu Pro Ser Tyr Leu Thr Val Phe Ala Val Tyr Leu
1 5 10 15
Leu Ser His Leu Pro Ser Gln Arg Tyr Gly Ala Asp Ala Ala Ser Glu
20 25 30
Ala Leu Asp Pro His Ala Phe His Leu Leu Leu Asn Thr Tyr Gly Arg
35 40 45
Pro Ile Arg Phe Leu Arg Glu Asn Thr Thr Gln Cys Thr Tyr Asn Ser
50 55 60
Ser Leu Arg Asn Ser Thr Val Val Arg Glu Asn Ala Ile Ser Phe Asn
65 70 75 80
Phe Phe Gln Ser Tyr Asn Gln Tyr Tyr Val Phe His Met Pro Arg Cys
85 90 95
Leu Phe Ala Gly Pro Leu Ala Glu Gln Phe Leu Asn Gln Val Asp Leu
100 105 110
Thr Glu Thr Leu Glu Arg Tyr Gln Gln Arg Leu Asn Thr Tyr Ala Leu
115 120 125
Val Ser Lys Asp Leu Ala Ser Tyr Arg Ser Phe Ser Gln Gln Leu Lys
130 135 140
Ala Gln Asp Ser Leu Gly Glu Gln Pro Thr Thr Val Pro Pro Pro Ile
145 150 155 160
Asp Leu Ser Ile Pro His Val Trp Met Pro Pro Gln Thr Thr Pro His
165 170 175
Gly Trp Lys Glu Ser His Thr Thr Ser Gly Leu His Arg Pro His Phe
180 185 190
Asn Gln Thr Cys Ile Leu Phe Asp Gly His Asp Leu Leu Phe Ser Thr
195 200 205
Val Thr Pro Cys Leu His Gln Gly Phe Tyr Leu Ile Asp Glu Leu Arg
210 215 220
Tyr Val Lys Ile Thr Leu Thr Glu Asp Phe Phe Val Val Thr Val Ser
225 230 235 240
Ile Asp Asp Asp Thr Pro Met Leu Leu Ile Phe Gly His Leu Pro Arg
245 250 255
Val Leu Phe Lys Ala Pro Tyr Gln Arg Asp Asn Phe Ile Leu Arg Gln
260 265 270
Thr Glu Lys His Glu Leu Leu Val Leu Val Lys Lys Asp Gln Leu Asn
275 280 285
Arg His Ser Tyr Leu Lys Asp Pro Asp Phe Leu Asp Ala Ala Leu Asp
290 295 300
Phe Asn Tyr Leu Asp Leu Ser Ala Leu Leu Arg Asn Ser Phe His Arg
305 310 315 320
Tyr Ala Val Asp Val Leu Lys Ser Gly Arg Cys Gln Met Leu Asp Arg
325 330 335
Arg Thr Val Glu Met Ala Phe Ala Tyr Ala Leu Ala Leu Phe Ala Ala
340 345 350
Ala Arg Gln Glu Glu Ala Gly Ala Glu Val Ser Val Pro Arg Ala Leu
355 360 365
Asp Arg Gln Ala Ala Leu Leu Gln Ile Gln Glu Phe Met Ile Thr Cys
370 375 380
Leu Ser Gln Thr Pro Pro Arg Thr Thr Leu Leu Leu Tyr Pro Thr Ala
385 390 395 400
Val Asp Leu Ala Lys Arg Ala Leu Trp Thr Pro Asn Gln Ile Thr Asp
405 410 415
Ile Thr Ser Leu Val Arg Leu Val Tyr Ile Leu Ser Lys Gln Asn Gln
420 425 430
Gln His Leu Ile Pro Gln Trp Ala Leu Arg Gln Ile Ala Asp Phe Ala
435 440 445
Leu Lys Leu His Lys Thr His Leu Ala Ser Phe Leu Ser Ala Phe Ala
450 455 460
Arg Gln Glu Leu Tyr Leu Met Gly Ser Leu Val His Ser Met Leu Val
465 470 475 480
His Thr Thr Glu Arg Arg Glu Ile Phe Ile Val Glu Thr Gly Leu Cys
485 490 495
Ser Leu Ala Glu Leu Ser His Phe Thr Gln Leu Leu Ala His Pro His
500 505 510
His Glu Tyr Leu Ser Asp Leu Tyr Thr Pro Cys Ser Ser Ser Gly Arg
515 520 525
Arg Asp His Ser Leu Glu Arg Leu Thr Arg Leu Phe Pro Asp Ala Thr
530 535 540
Val Pro Ala Thr Val Pro Ala Ala Leu Ser Ile Leu Ser Thr Met Gln
545 550 555 560
Pro Ser Thr Leu Glu Thr Phe Pro Asp Leu Phe Cys Leu Pro Leu Gly
565 570 575
Glu Ser Phe Ser Ala Leu Thr Val Ser Glu His Val Ser Tyr Val Val
580 585 590
Thr Asn Gln Tyr Leu Ile Lys Gly Ile Ser Tyr Pro Val Ser Thr Thr
595 600 605
Val Val Gly Gln Ser Leu Ile Ile Thr Gln Thr Asp Ser Gln Thr Lys
610 615 620
Cys Glu Leu Thr Arg Asn Met His Thr Thr His Ser Ile Thr Ala Ala
625 630 635 640
Leu Asn Ile Ser Leu Glu Asn Cys Ala Phe Cys Gln Ser Ala Leu Leu
645 650 655
Glu Tyr Asp Asp Thr Gln Gly Val Ile Asn Ile Met Tyr Met His Asp
660 665 670
Ser Asp Asp Val Leu Phe Ala Leu Asp Pro Tyr Asn Glu Val Val Val
675 680 685
Ser Ser Pro Arg Thr His Tyr Leu Met Leu Leu Lys Asn Gly Thr Val
690 695 700
Leu Glu Val Thr Asp Val Val Val Asp Ala Thr Asp Ser Arg Leu Leu
705 710 715 720
Met Met Ser Val Tyr Ala Leu Ser Ala Ile Ile Gly Ile Tyr Leu Leu
725 730 735
Tyr Arg Met Leu Lys Thr Cys
740
<210> 33
<211> 837
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> gL 共有核酸序列
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(3)
<223> n为a、c、g或t
<400> 33
nnntgcaggc ggcccgactg cggcttcagc ttcagccctg gccccgtgat cctgctgtgg 60
tgctgcctgc tgctgcccat cgtgtcctct gccgccgtgt ctgtggcccc tacagccgcc 120
gagaaggtgc cagccgagtg ccctgagctg accagacggt gtctgctggg cgaggtgttc 180
cagggcgata agtacgagag ctggctgcgg cccctggtca acgtgaccgg cagagatggc 240
cccctgagcc agctgatccg gtacagaccc gtgacccctg aggccgccaa cagcgtgctg 300
ctggacgaag cctttctgga cacactggcc ctgctgtaca acaaccccga ccagctgcgg 360
gccctgctga cactgctgag cagcgatacc gcccccagat ggatgaccgt gatgcggggc 420
tacagcgagt gcggcgacgg atctcccgcc gtgtacacct gtgtggacga cctgtgccgg 480
ggctacgacc tgaccagact gagctacggc cggtccatct tcacagagca cgtgctgggc 540
ttcgagctgg tgccccccag cctgttcaat gtggtggtgg ccatccggaa cgaggccacc 600
cggaccaaca gagcagtgcg gctgcctgtg tccaccgctg ctgctccaga gggcatcacc 660
ctgttctacg gcctgtacaa cgccgtgaaa gagttctgcc tgagacacca gctggacccc 720
cccctgctgc ggcacctgga caagtactac gccggcctgc ctcccgagct gaagcagacc 780
agagtgaacc tgcccgccca cagcagatac ggccctcagg ccgtggacgc cagatga 837
<210> 34
<211> 278
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> gL 共有氨基酸序列
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (1)..(1)
<223> Xaa可以是任意天然存在的氨基酸
<400> 34
Xaa Cys Arg Arg Pro Asp Cys Gly Phe Ser Phe Ser Pro Gly Pro Val
1 5 10 15
Ile Leu Leu Trp Cys Cys Leu Leu Leu Pro Ile Val Ser Ser Ala Ala
20 25 30
Val Ser Val Ala Pro Thr Ala Ala Glu Lys Val Pro Ala Glu Cys Pro
35 40 45
Glu Leu Thr Arg Arg Cys Leu Leu Gly Glu Val Phe Gln Gly Asp Lys
50 55 60
Tyr Glu Ser Trp Leu Arg Pro Leu Val Asn Val Thr Gly Arg Asp Gly
65 70 75 80
Pro Leu Ser Gln Leu Ile Arg Tyr Arg Pro Val Thr Pro Glu Ala Ala
85 90 95
Asn Ser Val Leu Leu Asp Glu Ala Phe Leu Asp Thr Leu Ala Leu Leu
100 105 110
Tyr Asn Asn Pro Asp Gln Leu Arg Ala Leu Leu Thr Leu Leu Ser Ser
115 120 125
Asp Thr Ala Pro Arg Trp Met Thr Val Met Arg Gly Tyr Ser Glu Cys
130 135 140
Gly Asp Gly Ser Pro Ala Val Tyr Thr Cys Val Asp Asp Leu Cys Arg
145 150 155 160
Gly Tyr Asp Leu Thr Arg Leu Ser Tyr Gly Arg Ser Ile Phe Thr Glu
165 170 175
His Val Leu Gly Phe Glu Leu Val Pro Pro Ser Leu Phe Asn Val Val
180 185 190
Val Ala Ile Arg Asn Glu Ala Thr Arg Thr Asn Arg Ala Val Arg Leu
195 200 205
Pro Val Ser Thr Ala Ala Ala Pro Glu Gly Ile Thr Leu Phe Tyr Gly
210 215 220
Leu Tyr Asn Ala Val Lys Glu Phe Cys Leu Arg His Gln Leu Asp Pro
225 230 235 240
Pro Leu Leu Arg His Leu Asp Lys Tyr Tyr Ala Gly Leu Pro Pro Glu
245 250 255
Leu Lys Gln Thr Arg Val Asn Leu Pro Ala His Ser Arg Tyr Gly Pro
260 265 270
Gln Ala Val Asp Ala Arg
275
<210> 35
<211> 1419
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> gO 共有核酸序列
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(3)
<223> n为a、c、g或t
<400> 35
nnnggcaaga aagaaatgat catggtcaag ggcatcccca agatcatgct gctgatcagc 60
atcacctttc tgctgctgag cctgatcaac tgcaacgtgc tggtcaacag caagggcaca 120
cggcggagct ggccctacac cgtgctgagc taccggggca aagagatcct gaagaagcag 180
aaagaggaca tcctgaagcg gctgatgagc accagcagcg acggctaccg gttcctgatg 240
taccccagcc agcagaaatt ccacgccatc gtgatcagca tggacaagtt cccccaggac 300
tacatcctgg ccggacccat ccggaacgac agcatcaccc acatgtggtt cgacttctac 360
agcacccagc tgcggaagcc cgccaaatac gtgtacagcg agtacaacca caccgcccac 420
aagatcaccc tgcggcctcc cccttgcggc accgtgccca gcatgaactg cctgagcgag 480
atgctgaacg tgtccaagcg gaacgacacc ggcgagaagg gctgcggcaa cttcaccacc 540
ttcaacccca tgttcttcaa cgtgccccgg tggaacacca agctgtacat cggcagcaac 600
aaagtgaacg tggacagcca gaccatctac tttctgggcc tgaccgccct gctgctgcgc 660
tacgcccaga gaaactgcac ccggtccttc tacctggtca acgccatgag ccggaacctg 720
ttccgggtgc ccaagtacat caacggcacc aagctgaaga acaccatgcg gaagctgaag 780
cggaagcagg ccctggtcaa agagcagccc cagaagaaga acaagaagtc ccagagcacc 840
accaccccct acctgagcta caccaccagc accgccttca acgtgaccac caacgtgacc 900
tacagcgcca cagccgccgt gaccagagtg gccacctcca ccaccggcta ccggcccgac 960
agcaacttca tgaagtccat catggccacc cagctgaggg acctggccac ctgggtgtac 1020
accaccctgc ggtacagaaa cgagcccttc tgcaagcccg accggaacag aaccgccgtg 1080
tccgagttca tgaagaatac ccacgtgctg atccgcaacg agacacccta caccatctac 1140
ggcaccctgg acatgagcag cctgtactac aacgagacaa tgagcgtcga gaacgagaca 1200
gccagcgaca acaacgaaac cacccccacc agccccagca cccggttcca gcggaccttc 1260
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ctgagcaccc tgaacagcct gtggtggtgg ctgcagtga 1419
<210> 36
<211> 472
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> gO 共有氨基酸序列
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (1)..(1)
<223> Xaa可以是任意天然存在的氨基酸
<400> 36
Xaa Gly Lys Lys Glu Met Ile Met Val Lys Gly Ile Pro Lys Ile Met
1 5 10 15
Leu Leu Ile Ser Ile Thr Phe Leu Leu Leu Ser Leu Ile Asn Cys Asn
20 25 30
Val Leu Val Asn Ser Lys Gly Thr Arg Arg Ser Trp Pro Tyr Thr Val
35 40 45
Leu Ser Tyr Arg Gly Lys Glu Ile Leu Lys Lys Gln Lys Glu Asp Ile
50 55 60
Leu Lys Arg Leu Met Ser Thr Ser Ser Asp Gly Tyr Arg Phe Leu Met
65 70 75 80
Tyr Pro Ser Gln Gln Lys Phe His Ala Ile Val Ile Ser Met Asp Lys
85 90 95
Phe Pro Gln Asp Tyr Ile Leu Ala Gly Pro Ile Arg Asn Asp Ser Ile
100 105 110
Thr His Met Trp Phe Asp Phe Tyr Ser Thr Gln Leu Arg Lys Pro Ala
115 120 125
Lys Tyr Val Tyr Ser Glu Tyr Asn His Thr Ala His Lys Ile Thr Leu
130 135 140
Arg Pro Pro Pro Cys Gly Thr Val Pro Ser Met Asn Cys Leu Ser Glu
145 150 155 160
Met Leu Asn Val Ser Lys Arg Asn Asp Thr Gly Glu Lys Gly Cys Gly
165 170 175
Asn Phe Thr Thr Phe Asn Pro Met Phe Phe Asn Val Pro Arg Trp Asn
180 185 190
Thr Lys Leu Tyr Ile Gly Ser Asn Lys Val Asn Val Asp Ser Gln Thr
195 200 205
Ile Tyr Phe Leu Gly Leu Thr Ala Leu Leu Leu Arg Tyr Ala Gln Arg
210 215 220
Asn Cys Thr Arg Ser Phe Tyr Leu Val Asn Ala Met Ser Arg Asn Leu
225 230 235 240
Phe Arg Val Pro Lys Tyr Ile Asn Gly Thr Lys Leu Lys Asn Thr Met
245 250 255
Arg Lys Leu Lys Arg Lys Gln Ala Leu Val Lys Glu Gln Pro Gln Lys
260 265 270
Lys Asn Lys Lys Ser Gln Ser Thr Thr Thr Pro Tyr Leu Ser Tyr Thr
275 280 285
Thr Ser Thr Ala Phe Asn Val Thr Thr Asn Val Thr Tyr Ser Ala Thr
290 295 300
Ala Ala Val Thr Arg Val Ala Thr Ser Thr Thr Gly Tyr Arg Pro Asp
305 310 315 320
Ser Asn Phe Met Lys Ser Ile Met Ala Thr Gln Leu Arg Asp Leu Ala
325 330 335
Thr Trp Val Tyr Thr Thr Leu Arg Tyr Arg Asn Glu Pro Phe Cys Lys
340 345 350
Pro Asp Arg Asn Arg Thr Ala Val Ser Glu Phe Met Lys Asn Thr His
355 360 365
Val Leu Ile Arg Asn Glu Thr Pro Tyr Thr Ile Tyr Gly Thr Leu Asp
370 375 380
Met Ser Ser Leu Tyr Tyr Asn Glu Thr Met Ser Val Glu Asn Glu Thr
385 390 395 400
Ala Ser Asp Asn Asn Glu Thr Thr Pro Thr Ser Pro Ser Thr Arg Phe
405 410 415
Gln Arg Thr Phe Ile Asp Pro Leu Trp Asp Tyr Leu Asp Ser Leu Leu
420 425 430
Phe Leu Asp Lys Ile Arg Asn Phe Ser Leu Gln Leu Pro Ala Tyr Gly
435 440 445
Asn Leu Thr Pro Pro Glu His Arg Arg Ala Ala Asn Leu Ser Thr Leu
450 455 460
Asn Ser Leu Trp Trp Trp Leu Gln
465 470
<210> 37
<211> 516
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> UL128 共有核酸序列
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(3)
<223> n为a、c、g或t
<400> 37
nnnagcccca aggatctgac ccctttcctg accgccctgt ggctgctcct gggccacagc 60
agagtgccta gagtgcgggc cgaggaatgc tgcgagttca tcaacgtgaa ccaccccccc 120
gagcggtgct acgacttcaa gatgtgcaac cggttcaccg tggctctgag atgccccgac 180
ggcgaagtgt gctacagccc cgagaaaacc gccgagatcc ggggcatcgt gaccaccatg 240
acccacagcc tgaccagaca ggtggtgcat aacaagctga ccagttgcaa ctacaacccc 300
ctgtacctgg aagccgacgg ccggatcaga tgcggcaaag tgaacgacaa ggcccagtac 360
ctgctgggcg ctgcaggcag tgtgccctac agatggatca acctggaata cgacaagatc 420
acccggatcg tgggcctgga ccagtacctg gaaagcgtga agaagcacaa gcggctggac 480
gtgtgccggg ccaagatggg ctacatgctg cagtga 516
<210> 38
<211> 171
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> UL128 共有氨基酸序列
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (1)..(1)
<223> Xaa可以是任意天然存在的氨基酸
<400> 38
Xaa Ser Pro Lys Asp Leu Thr Pro Phe Leu Thr Ala Leu Trp Leu Leu
1 5 10 15
Leu Gly His Ser Arg Val Pro Arg Val Arg Ala Glu Glu Cys Cys Glu
20 25 30
Phe Ile Asn Val Asn His Pro Pro Glu Arg Cys Tyr Asp Phe Lys Met
35 40 45
Cys Asn Arg Phe Thr Val Ala Leu Arg Cys Pro Asp Gly Glu Val Cys
50 55 60
Tyr Ser Pro Glu Lys Thr Ala Glu Ile Arg Gly Ile Val Thr Thr Met
65 70 75 80
Thr His Ser Leu Thr Arg Gln Val Val His Asn Lys Leu Thr Ser Cys
85 90 95
Asn Tyr Asn Pro Leu Tyr Leu Glu Ala Asp Gly Arg Ile Arg Cys Gly
100 105 110
Lys Val Asn Asp Lys Ala Gln Tyr Leu Leu Gly Ala Ala Gly Ser Val
115 120 125
Pro Tyr Arg Trp Ile Asn Leu Glu Tyr Asp Lys Ile Thr Arg Ile Val
130 135 140
Gly Leu Asp Gln Tyr Leu Glu Ser Val Lys Lys His Lys Arg Leu Asp
145 150 155 160
Val Cys Arg Ala Lys Met Gly Tyr Met Leu Gln
165 170
<210> 39
<211> 646
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> UL130 共有氨基酸序列
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(3)
<223> n为a、c、g或t
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(3)
<223> n为a、c、g或t
<400> 39
nnngctgcgg ctgctgctgc ggcaccactt ccactgcctg ctgctgtgtg ccgtgtgggc 60
caccccttgt ctggccagcc cttggagcac cctgaccgcc aaccagaacc ctagcccccc 120
ctggtccaag ctgacctaca gcaagcccca cgacgccgct accttctact gcccattcct 180
gtaccccagc cctcccagaa gccccctgca gttcagcggc ttccagcggg tgtccaccgg 240
ccctgagtgc cggaacgaga cactgtacct gctgtacaac cgcgagggcc agaccctggt 300
ggaacggtct agcacctggg tcaagaaagt gatctggtat ctgagcggcc ggaaccagac 360
catcctgcag cggatgcctc ggaccgccag caagcctagc gacggcaacg tgcagatcag 420
cgtggaagat gccaaaatct tcggcgccca catggtgccc aagcagacca agctgctgag 480
attcgtggtc aacgacggca ccagatacca gatgtgcgtg atgaagctgg aaagctgggc 540
ccacgtgttc cgggactaca gcgtgtcatt ccaggtccga ctgaccttca ccgaggccaa 600
caaccagacc tacaccttct gcacccaccc caacctgatc gtctga 646
<210> 40
<211> 214
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> UL130 共有氨基酸序列
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (1)..(1)
<223> Xaa可以是任意天然存在的氨基酸
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (1)..(1)
<223> Xaa可以是任意天然存在的氨基酸
<400> 40
Xaa Leu Arg Leu Leu Leu Arg His His Phe His Cys Leu Leu Leu Cys
1 5 10 15
Ala Val Trp Ala Thr Pro Cys Leu Ala Ser Pro Trp Ser Thr Leu Thr
20 25 30
Ala Asn Gln Asn Pro Ser Pro Pro Trp Ser Lys Leu Thr Tyr Ser Lys
35 40 45
Pro His Asp Ala Ala Thr Phe Tyr Cys Pro Phe Leu Tyr Pro Ser Pro
50 55 60
Pro Arg Ser Pro Leu Gln Phe Ser Gly Phe Gln Arg Val Ser Thr Gly
65 70 75 80
Pro Glu Cys Arg Asn Glu Thr Leu Tyr Leu Leu Tyr Asn Arg Glu Gly
85 90 95
Gln Thr Leu Val Glu Arg Ser Ser Thr Trp Val Lys Lys Val Ile Trp
100 105 110
Tyr Leu Ser Gly Arg Asn Gln Thr Ile Leu Gln Arg Met Pro Arg Thr
115 120 125
Ala Ser Lys Pro Ser Asp Gly Asn Val Gln Ile Ser Val Glu Asp Ala
130 135 140
Lys Ile Phe Gly Ala His Met Val Pro Lys Gln Thr Lys Leu Leu Arg
145 150 155 160
Phe Val Val Asn Asp Gly Thr Arg Tyr Gln Met Cys Val Met Lys Leu
165 170 175
Glu Ser Trp Ala His Val Phe Arg Asp Tyr Ser Val Ser Phe Gln Val
180 185 190
Arg Leu Thr Phe Thr Glu Ala Asn Asn Gln Thr Tyr Thr Phe Cys Thr
195 200 205
His Pro Asn Leu Ile Val
210
<210> 41
<211> 390
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> UL131a 共有核酸序列
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(3)
<223> n为a、c、g或t
<400> 41
nnnagactgt gcagagtgtg gctgagcgtg tgcctgtgcg ccgtggtgct gggccagtgc 60
cagagagaga cagccgagaa gaacgactac taccgggtgc cccactactg ggacgcctgc 120
tctagagccc tgcccgacca gacccggtac aaatacgtgg aacagctggt ggacctgacc 180
ctgaactacc actacgacgc cagccacggc ctggacaact tcgacgtgct gaagcggatc 240
aacgtgaccg aggtgtccct gctgatcagc gacttccggc ggcagaacag aagaggcggc 300
accaacaagc ggactacctt caacgccgct ggcagcctgg cccctcacgc cagatccctg 360
gaattcagcg tgcggctgtt cgccaactga 390
<210> 42
<211> 129
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> UL131a 共有氨基酸序列
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (1)..(1)
<223> Xaa可以是任意天然存在的氨基酸
<400> 42
Xaa Arg Leu Cys Arg Val Trp Leu Ser Val Cys Leu Cys Ala Val Val
1 5 10 15
Leu Gly Gln Cys Gln Arg Glu Thr Ala Glu Lys Asn Asp Tyr Tyr Arg
20 25 30
Val Pro His Tyr Trp Asp Ala Cys Ser Arg Ala Leu Pro Asp Gln Thr
35 40 45
Arg Tyr Lys Tyr Val Glu Gln Leu Val Asp Leu Thr Leu Asn Tyr His
50 55 60
Tyr Asp Ala Ser His Gly Leu Asp Asn Phe Asp Val Leu Lys Arg Ile
65 70 75 80
Asn Val Thr Glu Val Ser Leu Leu Ile Ser Asp Phe Arg Arg Gln Asn
85 90 95
Arg Arg Gly Gly Thr Asn Lys Arg Thr Thr Phe Asn Ala Ala Gly Ser
100 105 110
Leu Ala Pro His Ala Arg Ser Leu Glu Phe Ser Val Arg Leu Phe Ala
115 120 125
Asn
<210> 43
<211> 1687
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> UL83 共有核酸序列
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(3)
<223> n为a、c、g或t
<400> 43
nnntgagagt cgcgggcgga gatgccctga aatgatcagc gtgctgggcc caatttccgg 60
gcatgtgctg aaggccgtct tctcccgcgg agacaccccc gtgctgcctc acgagacaag 120
actgctgcag actggcatcc atgtgagggt ctcccagcca tctctgattc tggtgtctca 180
gtacacccca gatagtacac cctgccacag aggggacaac cagctgcagg tgcagcatac 240
ctacttcacc ggatcagagg tcgaaaatgt gagcgtcaac gtgcacaatc ccacaggcag 300
gagtatctgt ccttcacagg agccaatgag catctacgtg tacgccctgc ccctgaaaat 360
gctgaacatc cctagcatta atgtgcacca ttacccctcc gccgctgaac gaaagcaccg 420
gcatctgcct gtggcagatg ccgtcatcca tgcttcaggc aaacagatgt ggcaggcacg 480
actgaccgtg agcggactgg catggacacg acagcagaac cagtggaagg agccagacgt 540
gtactatact agcgccttcg tgttccccac caaagacgtg gccctgcgac acgtggtctg 600
cgcacatgag ctggtgtgct ctatggaaaa tactcgggcc accaagatgc aggtcattgg 660
cgatcagtac gtcaaagtgt atctggagtc cttttgtgaa gacgtgccct ctgggaagct 720
gttcatgcac gtgaccctgg gaagcgatgt cgaggaagac ctgactatga cccggaaccc 780
acagcccttt atgagacctc acgagaggaa cggcttcact gtgctgtgcc caaagaatat 840
gatcattaag cccgggaaaa tctctcatat tatgctggat gtggccttta caagtcacga 900
gcatttcgga ctgctgtgcc ccaaaagcat ccctgggctg tcaattagcg gaaacctgct 960
gatgaatggc cagcagatct ttctggaagt gcaggccatt cgagagaccg tcgaactgcg 1020
acagtacgac ccagtggcag ccctgttctt tttcgatatc gacctgctgc tgcagagagg 1080
ccctcagtat agtgagcacc caacattcac ttcacagtac aggattcagg ggaagctgga 1140
gtatcggcac acttgggata gacatgacga aggagctgca cagggcgacg atgacgtgtg 1200
gacctccggc tctgatagtg acgaggaact ggtgaccaca gagcgaaaaa ctccccgggt 1260
gaccggagga ggagctatgg caggagcatc aaccagcgcc ggacgaaaga gaaaaagcgc 1320
cagcagcgcc acagcatgca ctgcaggcgt gatgacaagg gggcgcctga aggcagaatc 1380
cacagtcgcc cctgaggaag atactgacga ggattctgac aacgaaatcc acaatccagc 1440
cgtgttcacc tggccacctt ggcaggcagg aattctggct cgcaatctgg tccctatggt 1500
ggccactgtc cagggacaga acctgaagta ccaggagttt ttctgggatg ctaatgacat 1560
ctatcggatt ttcgcagagc tggaaggcgt gtggcagcca gcagctcagc caaaaaggcg 1620
ccgacacaga caggacgcac tgcctggacc atgtatcgcc tccaccccaa agaaacatag 1680
gggctga 1687
<210> 44
<211> 561
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> UL83 共有氨基酸序列
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (1)..(1)
<223> Xaa可以是任意天然存在的氨基酸
<400> 44
Xaa Glu Ser Arg Gly Arg Arg Cys Pro Glu Met Ile Ser Val Leu Gly
1 5 10 15
Pro Ile Ser Gly His Val Leu Lys Ala Val Phe Ser Arg Gly Asp Thr
20 25 30
Pro Val Leu Pro His Glu Thr Arg Leu Leu Gln Thr Gly Ile His Val
35 40 45
Arg Val Ser Gln Pro Ser Leu Ile Leu Val Ser Gln Tyr Thr Pro Asp
50 55 60
Ser Thr Pro Cys His Arg Gly Asp Asn Gln Leu Gln Val Gln His Thr
65 70 75 80
Tyr Phe Thr Gly Ser Glu Val Glu Asn Val Ser Val Asn Val His Asn
85 90 95
Pro Thr Gly Arg Ser Ile Cys Pro Ser Gln Glu Pro Met Ser Ile Tyr
100 105 110
Val Tyr Ala Leu Pro Leu Lys Met Leu Asn Ile Pro Ser Ile Asn Val
115 120 125
His His Tyr Pro Ser Ala Ala Glu Arg Lys His Arg His Leu Pro Val
130 135 140
Ala Asp Ala Val Ile His Ala Ser Gly Lys Gln Met Trp Gln Ala Arg
145 150 155 160
Leu Thr Val Ser Gly Leu Ala Trp Thr Arg Gln Gln Asn Gln Trp Lys
165 170 175
Glu Pro Asp Val Tyr Tyr Thr Ser Ala Phe Val Phe Pro Thr Lys Asp
180 185 190
Val Ala Leu Arg His Val Val Cys Ala His Glu Leu Val Cys Ser Met
195 200 205
Glu Asn Thr Arg Ala Thr Lys Met Gln Val Ile Gly Asp Gln Tyr Val
210 215 220
Lys Val Tyr Leu Glu Ser Phe Cys Glu Asp Val Pro Ser Gly Lys Leu
225 230 235 240
Phe Met His Val Thr Leu Gly Ser Asp Val Glu Glu Asp Leu Thr Met
245 250 255
Thr Arg Asn Pro Gln Pro Phe Met Arg Pro His Glu Arg Asn Gly Phe
260 265 270
Thr Val Leu Cys Pro Lys Asn Met Ile Ile Lys Pro Gly Lys Ile Ser
275 280 285
His Ile Met Leu Asp Val Ala Phe Thr Ser His Glu His Phe Gly Leu
290 295 300
Leu Cys Pro Lys Ser Ile Pro Gly Leu Ser Ile Ser Gly Asn Leu Leu
305 310 315 320
Met Asn Gly Gln Gln Ile Phe Leu Glu Val Gln Ala Ile Arg Glu Thr
325 330 335
Val Glu Leu Arg Gln Tyr Asp Pro Val Ala Ala Leu Phe Phe Phe Asp
340 345 350
Ile Asp Leu Leu Leu Gln Arg Gly Pro Gln Tyr Ser Glu His Pro Thr
355 360 365
Phe Thr Ser Gln Tyr Arg Ile Gln Gly Lys Leu Glu Tyr Arg His Thr
370 375 380
Trp Asp Arg His Asp Glu Gly Ala Ala Gln Gly Asp Asp Asp Val Trp
385 390 395 400
Thr Ser Gly Ser Asp Ser Asp Glu Glu Leu Val Thr Thr Glu Arg Lys
405 410 415
Thr Pro Arg Val Thr Gly Gly Gly Ala Met Ala Gly Ala Ser Thr Ser
420 425 430
Ala Gly Arg Lys Arg Lys Ser Ala Ser Ser Ala Thr Ala Cys Thr Ala
435 440 445
Gly Val Met Thr Arg Gly Arg Leu Lys Ala Glu Ser Thr Val Ala Pro
450 455 460
Glu Glu Asp Thr Asp Glu Asp Ser Asp Asn Glu Ile His Asn Pro Ala
465 470 475 480
Val Phe Thr Trp Pro Pro Trp Gln Ala Gly Ile Leu Ala Arg Asn Leu
485 490 495
Val Pro Met Val Ala Thr Val Gln Gly Gln Asn Leu Lys Tyr Gln Glu
500 505 510
Phe Phe Trp Asp Ala Asn Asp Ile Tyr Arg Ile Phe Ala Glu Leu Glu
515 520 525
Gly Val Trp Gln Pro Ala Ala Gln Pro Lys Arg Arg Arg His Arg Gln
530 535 540
Asp Ala Leu Pro Gly Pro Cys Ile Ala Ser Thr Pro Lys Lys His Arg
545 550 555 560
Gly
Claims (24)
1.一种疫苗，其包含
(a)编码一种或多种选自由以下组成的组的氨基酸序列的核酸：
(i)酪氨酸酶(Tyr)的氨基酸序列(SEQ ID NO:2)；
(ii)酪氨酸酶-相关蛋白1(TYRP1)的氨基酸序列(SEQ ID NO:4)；
(iii)酪氨酸酶-相关蛋白2(TYRP2)的氨基酸序列(SEQ ID NO:6)；
(iv)黑色素瘤-相关抗原4蛋白(MAGEA4)的氨基酸序列(SEQ ID NO:8)；
(v)生长激素释放激素(GHRH)的氨基酸序列(SEQ ID NO:10)；
(vi)MART-1/melan-A抗原(MART-1/Melan-A)的氨基酸序列(SEQ ID NO:12)；
(vii)癌睾丸抗原(NY-ESO-1)的氨基酸序列(SEQ ID NO:14)；
(viii)癌睾丸抗原II(NY-ESO-2)的氨基酸序列(SEQ ID NO:16)；
(ix)WT1的氨基酸序列(SEQ ID NO:20)；
(x)WTI的氨基酸序列(SEQ ID NO:22)；和
(xi)hTERT的氨基酸序列(SEQ ID NO:24)；
(b)编码一种或多种选自由以下组成的组的氨基酸序列的核酸：
(i)与酪氨酸酶(Tyr)的氨基酸序列(SEQ ID NO:2)具有95％或更大的同一性的氨基酸序列；
(ii)与酪氨酸酶-相关蛋白1(TYRP1)的氨基酸序列(SEQ ID NO:4)具有95％或更大的同一性的氨基酸序列；
(iii)与酪氨酸酶-相关蛋白2(TYRP2)的氨基酸序列(SEQ ID NO:6)具有95％或更大的同一性的氨基酸序列；
(iv)与黑色素瘤-相关抗原4蛋白(MAGEA4)的氨基酸序列(SEQ ID NO:8)具有95％或更大的同一性的氨基酸序列；
(v)与生长激素释放激素(GHRH)的氨基酸序列(SEQ ID NO:10)具有95％或更大的同一性的氨基酸序列；
(vi)与MART-1/melan-A抗原(MART-1/Melan-A)的氨基酸序列(SEQ ID NO:12)具有95％或更大的同一性的氨基酸序列；
(vii)与癌睾丸抗原(NY-ESO-1)的氨基酸序列(SEQ ID NO:14)具有95％或更大的同一性的氨基酸序列；
(viii)与癌睾丸抗原II(NY-ESO-2)的氨基酸序列(SEQ ID NO:16)具有95％或更大的同一性的氨基酸序列；
(ix)与WT1的氨基酸序列(SEQ ID NO:20)具有95％或更大的同一性的氨基酸序列；
(x)与WT1的氨基酸序列(SEQ ID NO:22)具有95％或更大的同一性的氨基酸序列；和
(xi)与hTERT的氨基酸序列(SEQ ID NO:24)具有95％或更大的同一性的氨基酸序列；或
(c)(a)和(b)的组合。
2.根据权利要求1所述的疫苗，还包含编码一种或多种选自由以下组成的组的抗原的核酸：PSA、PSMA、STEAP、PSCA、MAGE A1、gp100、病毒抗原及其组合。
3.根据权利要求2所述的疫苗，其中所述病毒抗原是来自乙型肝炎病毒(HBV)、丙型肝炎病毒(HCV)或人乳头状瘤病毒(HPV)的抗原。
4.根据权利要求3所述的疫苗，其中所述HBV抗原是HBV核心抗原或HBV表面抗原或其组合。
5.根据权利要求3所述的疫苗，其中所述HCV抗原是HCV NS34A抗原、HCV NS5A抗原、HCVNS5B抗原、HCV NS4B抗原或其组合。
6.根据权利要求3所述的疫苗，其中所述HPV抗原是HPV 6型E6抗原、HPV 6型E7抗原、HPV 11型E6抗原、HPV 11型E7抗原、HPV 16型E6抗原、HPV 16型E7抗原、HPV 18型E6抗原、HPV 18型E7抗原或其组合。
7.根据权利要求1所述的疫苗，还包含选自由以下组成的组的免疫检查点抑制剂：抗-PD-1抗体、抗-PD-L1抗体及其组合。
8.根据权利要求1所述的疫苗，其中所述核酸分子包含一个或多个选自由以下组成的组的核苷酸序列中示出的核苷酸序列：SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:5、SEQ IDNO:7、SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:11、SEQ ID NO:13、SEQ ID NO:15、SEQ ID NO:17、SEQ IDNO:19、SEQ ID NO:21和SEQ ID NO:23。
9.根据权利要求1所述的疫苗，其中所述核酸是质粒。
10.根据权利要求1所述的疫苗，其中所述核酸是一个或多个质粒。
11.根据权利要求1所述的疫苗，还包含佐剂。
12.根据权利要求11所述的疫苗，其中所述佐剂是IL-12、IL-15、IL-28或RANTES。
13.一种治疗有此需要的受试者的癌症的方法，所述方法包括向所述受试者施用根据权利要求1所述的疫苗。
14.根据权利要求13所述的方法，其中施用包括电穿孔步骤。
15.根据权利要求13所述的方法，还包括向所述受试者施用免疫检查点抑制剂。
16.根据权利要求15所述的方法，其中所述免疫检查点抑制剂选自由以下组成的组：抗-PD-1抗体、抗-PD-L1抗体及其组合。
17.根据权利要求15所述的方法，其中以单一制剂向所述受试者施用所述疫苗和免疫检查点抑制剂。
18.根据权利要求15所述的方法，其中分别向所述受试者施用所述疫苗和免疫检查点抑制剂。
19.根据权利要求13所述的方法，其中所述癌症选自由以下组成的组：黑色素瘤、头颈癌、前列腺癌、肝癌、子宫颈癌、复发性呼吸道乳头状瘤病(RRP)、肛门癌、血癌及其组合。
20.一种核酸分子，其包含一个或多个选自由以下组成的组的核苷酸序列：SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:11、SEQ ID NO:13、SEQ ID NO:15、SEQ ID NO:17和SEQ ID NO:19、SEQ ID NO:21、SEQ ID NO:23、与SEQ IDNO:1具有95％或更大的同一性的核苷酸序列、与SEQ ID NO:3具有95％或更大的同一性的核苷酸序列、与SEQ ID NO:5具有95％或更大的同一性的核苷酸序列、与SEQ ID NO:7具有95％或更大的同一性的核苷酸序列、与SEQ ID NO:9具有95％或更大的同一性的核苷酸序列、与SEQ ID NO:11具有95％或更大的同一性的核苷酸序列、与SEQ ID NO:13具有95％或更大的同一性的核苷酸序列、与SEQ ID NO:15具有95％或更大的同一性的核苷酸序列、与SEQ ID NO:17具有95％或更大的同一性的核苷酸序列、与SEQ ID NO:19具有95％或更大的同一性的核苷酸序列、与SEQ ID NO:21具有95％或更大的同一性的核苷酸序列、与SEQ IDNO:23具有95％或更大的同一性的核苷酸序列及其组合。
21.根据权利要求20所述的核酸分子，其中所述核苷酸序列是质粒。
22.根据权利要求21所述的核酸分子，其中所述核苷酸序列是一个或多个质粒。
23.一种氨基酸分子，其包含一个或多个选自由以下组成的组的氨基酸序列：SEQ IDNO:2、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:12、SEQ ID NO:14、SEQ ID NO:16、SEQ ID NO:18和SEQ ID NO:20、SEQ ID NO:22、SEQ ID NO:24、与SEQ IDNO:2具有95％或更大的同一性的氨基酸序列、与SEQ ID NO:4具有95％或更大的同一性的氨基酸序列、与SEQ ID NO:6具有95％或更大的同一性的氨基酸序列、与SEQ ID NO:8具有95％或更大的同一性的氨基酸序列、与SEQ ID NO:10具有95％或更大的同一性的氨基酸序列、与SEQ ID NO:12具有95％或更大的同一性的氨基酸序列、与SEQ ID NO:14具有95％或更大的同一性的氨基酸序列、与SEQ ID NO:16具有95％或更大的同一性的氨基酸序列、与SEQ ID NO:18具有95％或更大的同一性的氨基酸序列、与SEQ ID NO:20具有95％或更大的同一性的氨基酸序列、与SEQ ID NO:22具有95％或更大的同一性的氨基酸序列、与SEQ IDNO:24具有95％或更大的同一性的氨基酸序列、及其组合。
24.一种用于预防或治疗有此需要的受试者的癌症的方法，所述方法包括：
(a)向有此需要的受试者施用包含CMV癌抗原的疫苗以治疗或预防成胶质细胞瘤或向有此需要的受试者施用包含与癌抗原hTERT、NY-ESO-1、MAGE-A1或WT1中的任一种或多种组合的CMV癌抗原的疫苗；
(b)向有此需要的受试者施用包含一种或多种癌抗原PSA、PSMA或STEAP的疫苗以治疗或预防前列腺癌或向有此需要的受试者施用包含与癌抗原hTERT、NY-ESO-1、MAGE-A1或WT1中的任一种或多种组合的PSA、PSMA或STEAP的疫苗以治疗或预防前列腺癌；
(c)向有此需要的受试者施用包含一种或多种癌抗原酪氨酸酶或GP-100的疫苗以治疗或预防黑色素瘤或向有此需要的受试者施用包含与癌抗原hTERT、NY-ESO-1、MAGE-A1或WT1中的任一种或多种组合的酪氨酸酶或GP-100的疫苗以治疗或预防黑色素瘤；
(d)向有此需要的受试者施用包含一种或多种癌抗原HPV 16E6或HPV 16E7的疫苗以治疗或预防头颈癌或向有此需要的受试者施用包含与癌抗原hTERT、NY-ESO-1、MAGE-A1或WT1中的任一种或多种组合的HPV 16E6或HPV 16E7的疫苗以治疗或预防头颈癌；
(e)向有此需要的受试者施用包含与选自由抗-PD-1抗体、抗-PD-L1抗体及其组合所组成的组的免疫检查点抑制剂组合的一种或多种癌抗原酪氨酸酶或GP-100的疫苗以治疗或预防黑色素瘤或向有此需要的受试者施用包含与选自由抗-PD-1抗体、抗-PD-L1抗体及其组合所组成的组的免疫检查点抑制剂组合、并且进一步与癌抗原hTERT、NY-ESO-1、MAGE-A1或WT1中的任一种或多种组合的酪氨酸酶或GP-100的疫苗以治疗或预防黑色素瘤；
(f)向有此需要的受试者施用包含一种或多种癌抗原HPV 6、HPV 11或HPV 16的疫苗以治疗或预防肛门癌或向有此需要的受试者施用包含与癌抗原hTERT、NY-ESO-1、MAGE-A1或WT1中的任一种或多种组合的HPV 6、HPV 11或HPV 16的疫苗以治疗或预防肛门癌；
(g)向有此需要的受试者施用包含一种或多种癌抗原HBV核心抗原、HBV表面抗原、HCVNS34A、HCV NS5A、HCV NS5B或HCV NS4B的疫苗以治疗或预防肝癌或向有此需要的受试者施用包含与癌抗原hTERT、NY-ESO-1、MAGE-A1或WT1中的任一种或多种组合的HBV核心抗原、HBV表面抗原、HCV NS34A、HCV NS5A、HCV NS5B或HCV NS4B的疫苗以治疗或预防肝癌；
(h)向有此需要的受试者施用包含一种或多种癌抗原HPV 16E6/E7或HPV 18E6/E7的疫苗以治疗或预防子宫颈癌或向有此需要的受试者施用包含与癌抗原hTERT、NY-ESO-1、MAGE-A1或WT1中的任一种或多种组合的HPV 16E6/E7或HPV 18E6/E7的疫苗以治疗或预防子宫颈癌；或
(i)向有此需要的受试者施用包含一种或多种癌抗原WT-1或hTERT的疫苗以治疗或预防血癌或向有此需要的受试者施用包含与癌抗原NY-ESO-1或MAGE-A1中的任一种或多种组合的WT-1或hTERT的疫苗以治疗或预防血癌，
其中所述方法可进一步包括将(a)-(i)的施用步骤与选自由抗-PD-1抗体、抗-PD-L1抗体及其组合组成的组的免疫检查点抑制剂组合。
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