KR20200096957A - 서바이빈을 표적으로 하는 암 백신 및 이의 용도 - Google Patents

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Abstract

본 명세서에는 합성 공통 서바이빈 항원을 암호화하는 하나 이상의 핵산 서열을 포함하는 핵산 분자가 개시된다. 합성 공통 서바이빈 항원을 암호화하는 하나 이상의 핵산 서열을 포함하는 벡터, 조성물 및 백신이 개시된다. 서바이빈-발현 종양을 갖는 대상체의 치료 방법 및 서바이빈-발현 종양의 예방 방법이 개시된다. 합성 공통 서바이빈 항원이 개시된다.

Description

서바이빈을 표적으로 하는 암 백신 및 이의 용도
관련 출원에 대한 상호 참조
본 출원은 미국 가출원 제62/598,267호(출원일: 2017년 12월 13일)에 대한 우선권 및 이의 이익을 주장하며, 이 기초출원은 그 전문이 본 명세서에 참조에 의해 원용된다.
서열 목록
본 출원은 ASCII 포맷으로 전자적으로 제출되고, 전문이 본 명세서에 참조에 의해서 포함되는 서열 목록을 포함한다. 2018년 12월 13일에 생성된 상기 ASCII 카피는 파일명이 104409_000448_sequence_listing.txt이고, 크기가 8,797바이트이다.
기술 분야
본 발명은 서바이빈(Survivin) 항원 및 이를 암호화하는 핵산 분자에 관한 것이다. 본 발명은 또한 이러한 서바이빈 항원 및/또는 핵산 분자를 포함하는 백신에 관한 것이다. 본 발명은 추가로 면역 반응을 유도하기 위해서 백신을 사용하는 방법 및 서바이빈을 발현하는 암 세포 및 종양을 갖는 대상체를 예방 및/또는 치료하는 방법에 관한 것이다.
암은 전세계에서 선두적인 사망 원인 중 하나이다. 미국에서, 암은 두 번째로 가장 흔한 일반적인 사망 원인이고, 4명의 사망자 중 거의 1명을 차지한다. 암은 정상 세포에서 암성 세포로 형질전환된 단일 세포로부터 일어난다. 이러한 형질전환은 보통 전암성 병변으로부터 악성 종양으로 진행하는, 다단계 과정이다. 노화, 유전자 기여 및 외부 작용제, 예컨대, 물리적 발암물질(예를 들어, 자외선 및 이온화 방사선), 화학적 발암물질(예를 들어, 석면, 담배 연기 성분 등) 및 생물학적 발암물질(예를 들어, 특정 바이러스, 박테리아, 기생충)에 대한 노출을 비롯한 다양한 인자가 이러한 과정에 기여한다.
암의 예방, 진단 및 치료는 다수의 상이한 형태를 가질 수 있다. 예방은 사전 배치 인자(예를 들어, 특정 유전자 변이체)에 대한 스크리닝, 행동 변화(예를 들어, 흡연, 다이어트 및 신체 활동) 및 바이러스(예를 들어, 인간 유두종 바이러스 B형 간염 바이러스)에 대한 백신접종(백신접종)을 포함할 수 있다. 치료는 화학요법, 방사선 요법 및 종양 또는 암조직의 수술적 제거를 포함할 수 있다. 다수의 예방 및 치료 방법의 사용 가능성에도 불구하고, 이러한 방법은 보통 암을 효과적으로 예방 및/또는 치료하는데 있어서 제한된 성공을 갖는다.
아포토시스 반복부-함유 5의 바쿨로바이러스 저해제(baculoviral inhibitor of apoptosis repeat-containing 5: BIRC5)라고도 공지된 서바이빈은 카스파제 기능을 차단함으로써 세포 예정사를 방지하는 아포토시스 저해제이다. 아포토시스에서의 역할에 더하여, 서바이빈은 유사분열에서 본질적이고, 진화론적으로 보존된 역할을 명백히 갖는다(Li, F. et al. Control of apoptosis and mitotic spindle checkpoint by Survivin. Nature 396, 580-584, doi:10.1038/25141 (1998)). 서바이빈의 과발현은 종양 세포 증식, 진행, 혈관생성, 치료 내성 및 불량한 예후와 연관된다. 건강한 세포 및 조직에서, 서바이빈 발현은 존재하지 않거나 낮은 수준으로 존재한다. 그러나, 서바이빈은 아포토시스 단백질의 저해제(inhibitor of apoptosis protein: IAP) 패밀리의 구성원이고, IAP 유전자는 다양한 암 세포 및 원발성 종양 생검에서 고도로 발현된다. IAP 중에서, 서바이빈은 종양 및 태아 조직에서 가장 극적인 과발현을 나타낸다. 난소 암종의 다수의 연구에서, 서바이빈 발현에 대해서 양성인 환자 샘플 시험의 수는 74 내지 92% 범위였다(문헌[Cohen, C., Lohmann, C. M., Cotsonis, G., Lawson, D. & Santoianni, R. Survivin expression in ovarian carcinoma: correlation with apoptotic markers and prognosis. Modern pathology : an official journal of the United States and Canadian Academy of Pathology, Inc 16, 574-583, doi:10.1097/01.MP.0000073868.31297.B0 (2003); Felisiak-Golabek, A. et al. Nuclear Survivin expression is a positive prognostic factor in taxane-platinum-treated ovarian cancer patients. Journal of ovarian research 4, 20, doi:10.1186/1757-2215-4-20 (2011)] 참고). 다양한 종양에서의 발현 및 과발현의 제한된 패턴과 조합된, 종양발생에 대한 서바이빈의 기여는, 서바이빈을 암 면역요법에 대한 매력적인 표적으로 만든다.
서바이빈은 IAP 패밀리의 가장 작은 구성원이다. 그것은 142개의 아미노산으로 이루어진 16.3kD 단백질이고, 단일 BIR 반복부의 존재를 특징으로 한다. 그것은 또한 단백질 구조 내에 카복실 말단 RING 핑거 도메인이 결여되어 있다(Chen, X., Duan, N., Zhang, C. & Zhang, W. Survivin and Tumorigenesis: Molecular Mechanisms and Therapeutic Strategies. Journal of Cancer 7, 314-323, doi:10.7150/jca.13332 (2016)). 몇몇 서바이빈 아이소폼이 식별되었으며, 서바이빈 아이소폼 1이 우세한 전사체이다. 서바이빈은 태아 발달 동안 발현되지만, 완전히 분화된 조직에서는 발현되지 않는다. 그러나, 그것은 다수의 암 세포에서 고도로 발현된다. 따라서, 서바이빈은 암의 치료를 위한 잠재적인 표적 항원이다.
암 및 특히 상피 난소암(epithelial ovarian cancer: EOC)의 치료 및 예방을 위한 백신이 관심대상이다. 그러나, 종양 세포 항원을 표적으로 하는 기존의 백신은 생체내에서 불량한 항원 발현에 의해서 제한된다. 따라서, 안전하고 효과적인 백신 및 암을 예방 및/또는 치료하기 위해서 그리고 암을 앓고 있는 대상체에서 사망률을 감소시키기 위해서 이를 사용하는 방법이 당업계에 필요하다.
본 명세서에는 하기가 제공된다:
핵산 분자로서, (a) 서열번호 2의 아미노산 19 내지 159를 암호화하는 핵산 서열; (b) 서열번호 4의 아미노산 19 내지 210을 암호화하는 핵산 서열; (c) 서열번호 8의 아미노산 19 내지 232를 암호화하는 핵산 서열; (d) 서열번호 2의 아미노산 19 내지 159의 전체 길이의 적어도 90%를 포함하는 단편을 암호화하는 핵산 서열; (e) 서열번호 4의 아미노산 19 내지 210의 전체 길이의 적어도 90%를 포함하는 단편을 암호화하는 핵산 서열; (f) 서열번호 8의 아미노산 19 내지 232의 전체 길이의 적어도 90%를 포함하는 단편을 암호화하는 핵산 서열; (g) 서열번호 2의 아미노산 19 내지 159와 적어도 95% 동일한 단백질을 암호화하는 핵산 서열; (h) 서열번호 4의 아미노산 19 내지 210과 적어도 95% 동일한 단백질을 암호화하는 핵산 서열; (i) 서열번호 8의 아미노산 19 내지 232와 적어도 95% 동일한 단백질을 암호화하는 핵산 서열; (j) 서열번호 2의 아미노산 19 내지 159와 적어도 95% 동일한 단백질의 전체 길이의 적어도 90%를 포함하는 단편을 암호화하는 핵산 서열; (k) 서열번호 4의 아미노산 19 내지 210과 적어도 95% 동일한 단백질의 전체 길이의 적어도 90%를 포함하는 단편을 암호화하는 핵산 서열; 및 (l) 서열번호 8의 아미노산 19 내지 232와 적어도 95% 동일한 단백질의 전체 길이의 적어도 90%를 포함하는 단편을 암호화하는 핵산 서열로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 핵산 서열을 포함하는, 핵산 분자.
핵산 분자로서, (a) 서열번호 1의 뉴클레오타이드 55 내지 423; (b) 서열번호 3의 뉴클레오타이드 55 내지 636; (c) 서열번호 1의 55 내지 423의 전체 길이의 적어도 90%를 포함하는 단편; (d) 서열번호 3의 뉴클레오타이드 55 내지 636의 전체 길이의 적어도 90%를 포함하는 단편; (e) 서열번호 1의 뉴클레오타이드 55 내지 423과 적어도 95% 동일한 단편; (f) 서열번호 3의 뉴클레오타이드 55 내지 636과 적어도 95% 동일한 단편; (g) 서열번호 1의 뉴클레오타이드 55 내지 423과 적어도 95% 동일한 핵산 서열의 적어도 90%를 포함하는 단편; 및 (h) 서열번호 3의 뉴클레오타이드 55 내지 636과 적어도 95% 동일한 핵산 서열의 적어도 90%를 포함하는 단편으로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 핵산 서열을 포함하는, 핵산 분자.
핵산 분자로서, (a) 서열번호 2를 암호화하는 핵산 서열; (b) 서열번호 4를 암호화하는 핵산 서열; (c) 서열번호 8을 암호화하는 핵산 서열; (d) 서열번호 2의 전체 길이의 적어도 90%를 포함하는 단편을 암호화하는 핵산 서열; (e) 서열번호 4의 전체 길이의 적어도 90%를 포함하는 단편을 암호화하는 핵산 서열; (f) 서열번호 8의 전체 길이의 적어도 90%를 포함하는 단편을 암호화하는 핵산 서열; (g) 서열번호 2와 적어도 95% 동일한 단백질을 암호화하는 핵산 서열; (h) 서열번호 4와 적어도 95% 동일한 단백질을 암호화하는 핵산 서열; (i) 서열번호 8과 적어도 95% 동일한 단백질을 암호화하는 핵산 서열; (j) 서열번호 2와 적어도 95% 동일한 단백질의 전체 길이의 적어도 90%를 포함하는 단편을 암호화하는 핵산 서열; (k) 서열번호 4와 적어도 95% 동일한 단백질의 전체 길이의 적어도 90%를 포함하는 단편을 암호화하는 핵산 서열; 및 (l) 서열번호 8과 적어도 95% 동일한 단백질의 전체 길이의 적어도 90%를 포함하는 단편을 암호화하는 핵산 서열로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 핵산 서열을 포함하는, 핵산 분자.
핵산 분자로서, (a) 서열번호 1; (b) 서열번호 3; (c) 서열번호 1의 전체 길이의 적어도 90%를 포함하는 단편; (d) 서열번호 3의 전체 길이의 적어도 90%를 포함하는 단편; (e) 서열번호 1과 적어도 95% 동일한 단편; (f) 서열번호 3과 적어도 95% 동일한 단편; (g) 서열번호 1과 적어도 95% 동일한 핵산 서열의 전체 길이의 적어도 90%를 포함하는 단편; 및 (h) 서열번호 3과 적어도 95% 동일한 핵산 서열의 전체 길이의 적어도 90%를 포함하는 단편으로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 핵산 서열을 포함하는, 핵산 분자.
서열번호 1에 제시된 핵산 서열을 포함하는, 핵산 분자.
서열번호 3에 제시된 핵산 서열을 포함하는, 핵산 분자.
의약으로서 사용하기 위한, 본 명세서에 기재된 바와 같은 핵산 분자.
암의 치료에서 의약으로서 사용하기 위한, 본 명세서에 기재된 바와 같은 핵산 분자.
의약의 제조에 사용하기 위한, 본 명세서에 기재된 바와 같은 핵산 분자.
암의 치료를 위한 의약의 제조에 사용하기 위한, 본 명세서에 기재된 바와 같은 핵산 분자.
본 명세서에 기재된 바와 같은 핵산 분자를 포함하는, 백신.
플라스미드 또는 바이러스 벡터를 포함하는, 벡터.
본 명세서에 기재된 바와 같은 1종 이상의 핵산 분자를 포함하는, 조성물.
약제학적으로 허용 가능한 담체를 포함하는 본 명세서에 기재된 바와 같은 조성물.
본 명세서에 기재된 바와 같은 1종 이상의 벡터를 포함하는 본 명세서에 기재된 바와 같은 조성물.
단백질로서, (a) 서열번호 2의 아미노산 19 내지 159; (b) 서열번호 4의 아미노산 19 내지 210; (c) 서열번호 8의 아미노산 19 내지 232; (d) 서열번호 2의 아미노산 19 내지 159의 전체 길이의 적어도 90%를 포함하는 단편; (e) 서열번호 4의 아미노산 19 내지 210의 전체 길이의 적어도 90%를 포함하는 단편; (f) 서열번호 8의 아미노산 19 내지 232의 전체 길이의 적어도 90%를 포함하는 단편; (g) 서열번호 2의 아미노산 19 내지 159와 적어도 95% 동일한 아미노산 서열; (h) 서열번호 4의 아미노산 19 내지 210과 적어도 95% 동일한 아미노산 서열; (i) 서열번호 8의 아미노산 19 내지 232와 적어도 95% 동일한 아미노산 서열; (j) 서열번호 2의 아미노산 19 내지 159와 적어도 95% 동일한 아미노산 서열의 전체 길이의 적어도 90%를 포함하는 단편; (k) 서열번호 4의 아미노산 19 내지 210와 적어도 95% 동일한 아미노산 서열의 전체 길이의 적어도 90%를 포함하는 단편; 및 (l) 서열번호 8의 아미노산 19 내지 232와 적어도 95% 동일한 아미노산 서열의 전체 길이의 적어도 90%를 포함하는 단편으로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는, 단백질.
단백질로서, (a) 서열번호 2; (b) 서열번호 4; (c) 서열번호 8; (d) 서열번호 2의 전체 길이의 적어도 90%를 포함하는 단편; (e) 서열번호 4의 전체 길이의 적어도 90%를 포함하는 단편; (f) 서열번호 8의 전체 길이의 적어도 90%를 포함하는 단편; (g) 서열번호 2와 적어도 95% 동일한 아미노산 서열; (h) 서열번호 4와 적어도 95% 동일한 아미노산 서열; (i) 서열번호 8과 적어도 95% 동일한 아미노산 서열; (j) 서열번호 2와 적어도 95% 동일한 아미노산 서열의 전체 길이의 적어도 90%를 포함하는 단편; (k) 서열번호 4와 적어도 95% 동일한 아미노산 서열의 전체 길이의 적어도 90%를 포함하는 단편; 및 (l) 서열번호 8과 적어도 95% 동일한 아미노산 서열의 전체 길이의 적어도 90%를 포함하는 단편으로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는, 단백질.
서열번호 2에 제시된 아미노산 서열을 포함하는, 단백질.
서열번호 4에 제시된 아미노산 서열을 포함하는, 단백질.
서열번호 8에 제시된 아미노산 서열을 포함하는, 단백질.
본 명세서에 기재된 바와 같은 핵산 분자를 포함하는, 백신.
본 명세서에 기재된 바와 같은 벡터를 포함하는, 백신.
약제학적으로 허용 가능한 부형제를 더 포함하는, 본 명세서에 기재된 바와 같은 백신.
아주반트를 더 포함하는, 본 명세서에 기재된 바와 같은 백신.
아주반트는 IL-12, IL-15, IL-28 또는 RANTES인, 본 명세서에 기재된 바와 같은 백신.
서바이빈-발현 암성 세포를 갖는 대상체의 치료 방법으로서, 치료적 유효량의 본 명세서에 기재된 바와 같은 백신을 투여하는 단계를 포함하는, 치료 방법.
투여는 전기천공 단계를 포함하는, 본 명세서에 기재된 바와 같은 방법.
투여는 대상체 상의 하나 이상의 부위에서 일어나는, 본 명세서에 기재된 바와 같은 방법.
체액 면역 반응 또는 세포 면역 반응을 유도하기에 효과적인 양의 본 명세서에 기재된 바와 같은 백신을 투여하는 단계를 포함하는, 서바이빈-발현 암성 세포에 대해서 대상체를 백신접종(vaccinating)하는 방법.
개요, 뿐만 아니라 하기 상세한 설명은 첨부된 도면과 함께 읽을 때 추가로 이해된다. 본 발명을 예시하려는 목적으로, 도면에서 본 발명의 예시적인 실시형태가 도시되지만; 본 발명은 개시된 구체적인 방법, 조성물 및 장치에 제한되지 않는다. 도면에서,
도 1은 합성 공통 서바이빈 항원 아이소폼 1의 개략도를 도시한 도면. 별표는 항-아포토시스 활성을 폐지하는데 필수적인 돌연변이를 나타낸다.
도 2는 합성 공통 서바이빈 항원 아이소폼 1 단량체 A(좌측) 및 단량체 B(우측)의 전체 구조를 도시한 도면. 네이티브 서바이빈에 대한 변화를 구체로 표시한다.
도 3은 합성 공통 서바이빈 항원 아이소폼 1T3의 개략도를 도시한 도면. 별표는 항-아포토시스 활성을 폐지하는데 필수적인 돌연변이를 나타낸다. 우측 상의 암회색 영역(3')은 절두된 서바이빈 아이소폼 3(T3) 영역을 나타낸다.
도 4는 합성 공통 서바이빈 항원 아이소폼 1을 포함하는, pGX1428의 작제를 도시한 도면.
도 5는 합성 공통 서바이빈 항원 아이소폼 1T3을 포함하는, pGX1429의 작제를 도시한 도면.
도 6은 각각, 면역블로팅에 의한, pGX1428 및 pGX1429이 형질주입된 인간 횡문근육종(rhabdomyosarcoma: RD) 세포에서 합성 공통 서바이빈 항원 1 및 합성 공통 서바이빈 항원 1T3 단백질의 발현을 도시한 도면. pGX1428(17.5kD) 및 pGX1429(25.3kD)에 대해서 예측된 분자량의 단백질 밴드가 검출되었다. β-액틴을 로딩 대조군으로 사용하였다.
도 7A 내지 도 7H는 합성 공통 서바이빈 항원 1 및 합성 공통 서바이빈 항원 1T3의 면역원성을 도시한 도면. 암컷 CB6F1을 제시된 용량의 서바이빈 1(pGX1428)(도 7A 내지 도7D), 서바이빈 1T3 pGX1429(E-H)(n=8/군) 또는 pGX0001(빈 벡터)(n=4)을 사용하여 3주 간격으로 3회 면역화시켰다. 도 7A: pGX1428의 제시된 용량에서 ELISpot에 의한 서바이빈 1 특이적 IFNγ 반응. 도 7B: 서바이빈 1 특이적 CD4+ T 세포 반응. 도 7C: 서바이빈 1 특이적 CD8+ T 세포 반응. 도 7D: pGX1429의 제시된 용량에서 ELISpot에 의한 서바이빈 1T3 특이적 IFNγ 반응. 도 7E: 서바이빈 1T3 특이적 CD4+ T 세포 반응. 도 7F: 서바이빈 1T3 특이적 CD8+ T 세포 반응. 도 7G: 서바이빈 1 특이적 CD4+ T 세포 반응 및 CD8+ T 세포 반응의 사이토카인 프로파일. 도 7H: 서바이빈 1T3 특이적 CD4+ T 세포 반응 및 CD8+ T 세포 반응의 사이토카인 프로파일.
도 8은 유세포 분석법 게이팅 전략을 도시한 도면.
도 9는 CD4+ T 세포 및 CD8+ T 세포의 상대적 빈도를 도시한 도면. pGX1428 및 pGX1429에 의해서 유도된 세포 면역 반응은 CD8+ T 세포 구획(T cell compartment)에 비해서 CD4+ T 세포 구획에서 우세하였다.
도 10A 내지 10F는 서바이빈 특이적 T 세포의 세포용해 가능성을 도시한 도면. 서바이빈 1 및 서바이빈 1T3에 의해서 유도된 항원 특이적 T 세포의 세포용해 가능성. 도 10A: 서바이빈 1 특이적 CD4+CD107a+ T 세포의 빈도. 도 10B: 서바이빈 1T3 특이적 CD4+CD107a+ T 세포의 빈도. 도 10C: CD4+CD107a+ T 세포의 사이토카인 프로파일. 도 10D: 서바이빈 1 특이적 CD8+CD107a+ T 세포. 도 10E: 서바이빈 1T3 특이적 CD8+CD107a+ T 세포. 도 10F: CD4+CD107a+ T 세포의 사이토카인 프로파일.
도 11A 내지 도 11D는 서바이빈 IFN-감마 반응의 에피토프 매핑(epitope mapping). 서바이빈 1 및 서바이빈 1T3에 의해서 유도된 IFNγ 반응의 폭. 도 11A: 50㎍의 pGX1428, pGX1429 또는 pGX0001로의 처리 후 서바이빈 1 펩타이드 풀. 도 11B: 50㎍의 pGX1429 또는 pGX0001로의 처리 후 서바이빈 T3 펩타이드 풀. 매트릭스 풀의 위치와 함께 pGX1428과 pGX1429의 서열 비교를 점선 박스에 나타내었다. 도 11C: pGX1428와 pGX1429의 서열 비교 적색 텍스트의 아미노산은 매트릭스 매핑에 의해서 식별된 에피토프를 나타낸다. 밑줄 텍스트는 합성 공통 서바이빈 항원에 첨가된 서열 부분을 나타내고: N-말단은 IgELS 및 RGRKRRS 푸린(furin) 절단 부위를 나타낸다. 도 11D: 서바이빈 1 및 서바이빈 T3 매트릭스 설계. 반응을 도출한 펩타이드를 점선 박스로 나타낸다.
도 12는 합성 공통 서바이빈 1T3을 포함하는 본 개시내용의 실시형태를 사용하여 면역화된 개별 비-인간 영장류로부터의 서바이빈-특이적 IFNγ SFU/106 PBMC를 나타낸, 도면.
도 13은 저용량의 IL-12(0.04㎎)와 함께 합성 공통 서바이빈 1T3을 포함하는 본 개시내용의 실시형태를 사용하여 면역화된 개별 비-인간 영장류로부터의 서바이빈-특이적 IFNγ SFU/106 PBMC를 나타낸, 도면.
도 14는 고용량의 IL-12(0.20㎎)와 함께 합성 공통 서바이빈 1T3을 포함하는 본 개시내용의 실시형태를 사용하여 면역화된 개별 비-인간 영장류로부터의 서바이빈-특이적 IFNγ SFU/106 PBMC를 나타낸, 도면.
도 15A 내지 도 15C는 NHP 연구의 개별 동물 결과 및 또한 합성 공통 서바이빈 1 작제물로의 면역화와 합성 공통 서바이빈 1T3 작제물로의 면역화 간의 비교를 나타낸, 도면. 도 15A는 군 1 동물 결과를 나타내고; 도 15B는 군 2 동물 결과를 나타내고; 도 15C는 군 3 동물 결과를 나타낸다.
본 발명은 합성 공통 서바이빈 항원을 포함하는 백신에 관한 것이다. 서바이빈은 다수의 종양에서 발현된다. 따라서, 백신은 서바이빈을 발현하는 암 또는 암-기반 종양을 위한 치료를 제공한다.
합성 공통 서바이빈 항원은 상이한 종으로부터 또는 종 내의 상이한 아이소폼으로부터의 서바이빈의 서열로부터 유래된 공통 서바이빈 항원일 수 있기 때문에, 합성 공통 서바이빈 항원은 비-네이티브이다. 공통 서바이빈 항원은 공통 서열 내에 하나 이상의 돌연변이를 도입함으로써 추가로 변형되어 합성 공통 서바이빈 서열을 생성시킬 수 있다. 돌연변이는 네이티브 서바이빈 서열의 특정 기능성 도메인을 중단시키거나 변형시킴으로써, 기능성 도메인의 구조 또는 기능을 방해하거나 향상시킬 수 있다. 일부 실시형태에서, 추가 서열을 합성 공통 서바이빈 항원 서열에 부가하여 새로운 구조 또는 기능을 도입한다. 예를 들어, 합성 공통 서바이빈 항원 서열은 푸린 절단 부위를 가질 수 있다. 합성 공통 서바이빈 항원 서열은 추가 국지화 신호를 포함하여 최종 단백질 생성물의 세포외 수송을 향상시킬 수 있다. 추가 국지화 서열은 IgELS 또는 다른 세포 수송 서열일 수 있다.
합성 공통 서바이빈 항원은 항원-특이적 T 세포 및/또는 고역가 항체 반응을 유도할 수 있기 때문에, 상기 항원을 발현하는 암 또는 종양에 대해서 지향되거나 반응성인 면역 반응을 유도 또는 도출할 수 있다. 일부 실시형태에서, 유도되거나 도출된 면역 반응은 세포 면역 반응, 체액 면역 반응 또는 세포 면역 반응 및 체액 면역 반응 둘 다일 수 있다. 일부 실시형태에서, 유도되거나 도출된 세포 면역 반응은 인터페론-감마(IFN-γ) 및/또는 종양 괴사 인자 알파(TNF-α) 및/또는 인터류킨 2(IL-2)의 유도 또는 분비를 포함할 수 있다. 다른 실시형태에서, 유도되거나 도출된 면역 반응은 항원을 발현하는 종양 또는 암의 성장을 촉진시키는 1종 이상의 면역 억제 인자, 예를 들어, 비제한적으로 MHC 제시를 하향조절하는 인자, 항원-특이적 조절 T 세포(Treg)를 상향조절하는 인자, PD-L1, FasL, 사이토카인, 예컨대, IL-10 및 TFG-β, 종양 연관 대식세포, 종양 연관 섬유모세포, 면역 억제 세포에 의해서 생산되는 가용성 인자, CTLA-4, PD-1, MDSC, MCP-1 및 면역 관문 분자를 감소시키거나 저해할 수 있다.
본 발명의 백신은 치료를 필요로 하는 대상체의 암의 특정 예방 또는 치료를 위한 특정 암 항원의 임의의 조합물을 제공할 수 있다.
재조합 암 항원의 핵산 및 이의 암호화된 아미노산 서열을 설계하기 위한 하나의 방식은 네이티브 암 항원의 전체 아미노산 서열에 특정 아미노산을 변화시킨 돌연변이를 도입하는 것이다. 돌연변이의 도입은 포유동물 대상체, 바람직하게는 인간 또는 개 대상체 전체에 보편적으로 적용될 수 없을 정도로 암 항원을 너무 많이 변경시키지는 않지만, 그것은, 생성된 아미노산 서열이 면역 반응을 생성시키기 위해서 내성(tolerance)을 파괴하거나 외부 항원으로 간주되기에 충분하게 암 항원을 변화시킨다. 또 다른 방식은 상응하는 네이티브 암 항원에 비해서 적어도 85% 내지 99% 이하의 아미노산 서열 동일성; 바람직하게는 적어도 90% 내지 98% 이하의 서열 동일성; 보다 바람직하게는 적어도 93% 내지 98% 이하의 서열 동일성; 또는 보다 더 바람직하게는 적어도 95% 내지 98% 이하의 서열 동일성을 갖는 공통 재조합 암 항원을 생성시킬 수 있다. 일부 예에서 재조합 암 항원은 이의 상응하는 네이티브 암 항원에 비해서 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99%의 아미노산 서열 동일성을 갖는다. 네이티브 암 항원은 특정 암 또는 암 종양과 일반적으로 연관된 항원이다. 암 항원에 따라서, 암 항원의 공통 서열은 포유동물 종 전체에 또는 종의 아형 내에 또는 바이러스 균주 또는 혈청형 전체에 존재할 수 있다. 일부 암 항원은 암 항원의 야생형 아미노산 서열로부터 상당히 달라지는 것은 아니다. 일부 암 항원은 공통 서열이 생성될 수 없는, 종 전체에서 매우 벗어난 핵산/아미노산 서열을 갖는다. 이들 예에서, 상응하는 네이티브 암 항원에 비해서 적어도 85% 내지 99% 이하의 아미노산 서열 동일성; 바람직하게는 적어도 90% 내지 98% 이하의 서열 동일성; 보다 바람직하게는 적어도 93% 내지 98% 이하의 서열 동일성; 또는 보다 더 바람직하게는 적어도 95% 내지 98% 이하의 서열 동일성을 갖는, 내성을 파괴하고, 면역 반응을 생성시킬 재조합 암 항원이 생성된다. 일부 예에서 재조합 암 항원은 이의 상응하는 네이티브 암 항원에 비해서 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99%의 아미노산 서열 동일성을 갖는다. 최종 재조합 암 항원이 상기에 논의된 바와 같은 네이티브 암 항원 아미노산 서열에 대해서 유사성 백분율을 갖도록 상기에 언급된 접근법을 조합할 수 있다.
백신은 면역관문 저해제, 예컨대, PD-1 및 PDL-1에 대한 항체와 추가로 조합되어 세포 면역 반응 및 체액 면역 반응 둘 다의 자극을 증가시킬 수 있다. 항-PD-1 또는 항-PDL-1 항체를 사용하여 PD-1 또는 PDL-1이 T-세포 및/또는 B-세포 반응을 억제하는 것을 예방한다. 종합적으로, 면역계에 의해서 인식될 암 항원을 설계함으로써 종양 세포에 의한 다른 형태의 면역 억제를 극복하는데 도움을 주며, 이들 백신은 백신을 억제 또는 저해 요법(예컨대, 항-PD-1 및 항-PDL-1 항체 요법)과 조합하여 사용하여 T-세포 및/또는 B-세포 반응을 추가로 증가시킬 수 있다.
백신은 무종양 생존을 30%, 31%, 32%, 33%, 34%, 35%, 36%, 37%, 38%, 39%, 40%, 41%, 42%, 43%, 44% 및 45% 증가시킬 수 있다. 백신은 면역화 후 종양 질량을 30%, 31%, 32%, 33%, 34%, 35%, 36%, 37%, 38%, 39%, 40%, 41%, 42%, 43%, 44%, 45%, 46%, 47%, 48%, 49%, 50%, 51%, 52%, 53%, 54%, 55%, 56%, 57%, 58%, 59% 및 60% 감소시킬 수 있다. 백신은 골수 유래된 억제인자 세포에 의해서 분비되는 사이토카인인 단핵구 화학유인물질 단백질 1(monocyte chemoattractant protein 1: MCP-1)의 증가를 예방하고, 차단할 수 있다. 백신은 종양 생존을 30%, 31%, 32%, 33%, 34%, 35%, 36%, 37%, 38%, 39%, 40%, 41%, 42%, 43%, 44%, 45%, 46%, 47%, 48%, 49%, 50%, 51%, 52%, 53%, 54%, 55%, 56%, 57%, 58%, 59% 및 60% 증가시킬 수 있다.
백신은 백신이 투여되지 않은 대상체에서의 세포 면역 반응과 비교할 때, 백신이 투여된 대상체에서의 세포 면역 반응을 약 50배 내지 약 6000배, 약 50배 내지 약 5500배, 약 50배 내지 약 5000배, 약 50배 내지 약 4500배, 약 100배 내지 약 6000배, 약 150배 내지 약 6000배, 약 200배 내지 약 6000배, 약 250배 내지 약 6000배 또는 약 300배 내지 약 6000배 증가시킬 수 있다. 일부 실시형태에서 백신은 백신이 투여되지 않은 대상체에서의 세포 면역 반응과 비교할 때, 백신이 투여된 대상체에서의 세포 면역 반응을 약 50배, 100배, 150배, 200배, 250배, 300배, 350배, 400배, 450배, 500배, 550배, 600배, 650배, 700배, 750배, 800배, 850배, 900배, 950배, 1000배, 1100배, 1200배, 1300배, 1400배, 1500배, 1600배, 1700배, 1800배, 1900배, 2000배, 2100배, 2200배, 2300배, 2400배, 2500배, 2600배, 2700배, 2800배, 2900배, 3000배, 3100배, 3200배, 3300배, 3400배, 3500배, 3600배, 3700배, 3800배, 3900배, 4000배, 4100배, 4200배, 4300배, 4400배, 4500배, 4600배, 4700배, 4800배, 4900배, 5000배, 5100배, 5200배, 5300배, 5400배, 5500배, 5600배, 5700배, 5800배, 5900배, 또는 6000배 증가시킬 수 있다.
백신은 백신이 투여되지 않은 대상체에서의 인터페론 감마(IFN-γ) 수준과 비교할 때, 백신이 투여된 대상체에서의 인터페론 감마 (IFN-γ) 수준을 약 50배 내지 약 6000배, 약 50배 내지 약 5500배, 약 50배 내지 약 5000배, 약 50배 내지 약 4500배, 약 100배 내지 약 6000배, 약 150배 내지 약 6000배, 약 200배 내지 약 6000배, 약 250배 내지 약 6000배 또는 약 300배 내지 약 6000배 증가시킬 수 있다. 일부 실시형태에서 백신은 백신이 투여되지 않은 대상체에서의 인터페론 감마(IFN-γ) 수준과 비교할 때, 백신이 투여된 대상체에서의 인터페론 감마(IFN-γ) 수준을 약 50배, 100배, 150배, 200배, 250배, 300배, 350배, 400배, 450배, 500배, 550배, 600배, 650배, 700배, 750배, 800배, 850배, 900배, 950배, 1000배, 1100배, 1200배, 1300배, 1400배, 1500배, 1600배, 1700배, 1800배, 1900배, 2000배, 2100배, 2200배, 2300배, 2400배, 2500배, 2600배, 2700배, 2800배, 2900배, 3000배, 3100배, 3200배, 3300배, 3400배, 3500배, 3600배, 3700배, 3800배, 3900배, 4000배, 4100배, 4200배, 4300배, 4400배, 4500배, 4600배, 4700배, 4800배, 4900배, 5000배, 5100배, 5200배, 5300배, 5400배, 5500배, 5600배, 5700배, 5800배, 5900배, 또는 6000배 증가시킬 수 있다.
하기에 보다 상세히 기재된 바와 같이, 백신은 1종 이상의 면역 면역관문 분자의 1종 이상의 저해제(즉, 면역 면역관문 저해제)를 추가로 포함할 수 있다. 면역 관문 분자는 하기에 보다 상세하게 기재된다. 면역 면역관문 저해제는 면역계에서 임의의 성분의 억제, 예컨대, MHC 클래스 제시, T 세포 제시 및/또는 분화, B 세포 제시 및/또는 분화, 임의의 사이토카인, 케모카인 또는 면역 세포 증식 및/또는 분화를 위한 신호전달을 예방하는 임의의 핵산 또는 단백질이다. 보다 상세하게 하기에 또한 기재된 바와 같이, 백신은 면역관문 저해제, 예컨대, PD-1 및 PDL-1에 대한 항체와 추가로 조합되어 세포 면역 반응 및 체액 면역 반응 둘 다의 자극을 증가시킬 수 있다. 항-PD-1 또는 항-PDL-1 항체를 사용하여 PD-1 또는 PDL-1이 T-세포 및/또는 B-세포 반응을 억제하는 것을 예방한다.
정의
달리 정의되지 않는 한, 본 명세서에서 사용된 모든 기술 및 과학 용어는 당업자에 의해 통상적으로 이해되는 바와 동일한 의미를 갖는다. 상충되는 경우, 정의를 포함하는, 본 문서가 우선시될 것이다. 본 명세서에 기재된 것과 유사하거나 동등한 방법 및 물질이 본 발명의 실시 또는 시험에서 사용될 수 있더라도, 바람직한 방법 및 물질은 하기에 기재된다. 본 명세서에 언급된 모든 간행물, 특허 출원, 특허 및 다른 참조 문헌은 전문이 참조에 의해 포함된다. 본 명세서에 개시된 물질, 방법 및 예는 단지 예시이며, 제한이도록 의도되지 않는다. 본 명세서에 사용된 용어는 특정 실시형태만을 설명하려는 목적이며, 제한이도록 의도되지 않는다.
용어 "포함한다", "포함하다", "갖는", "갖는다", "할 수 있다", "함유한다", 및 이의 변형은 본 명세서에서 사용된 바와 같이, 추가의 행위 또는 구조의 가능성을 배제하지 않는 개방형의 이행 어구, 용어, 또는 단어인 것으로 의도된다. 단수 형태는 문맥이 분명히 달리 지시하지 않는 한 복수의 대상을 포함한다. 본 개시내용은 또한, 명백하게 제시되든 아니든, 본 명세서에서 제시된 실시형태 또는 요소를 "포함하는", "이들로 이루어진", 및 "이들로 본질적으로 이루어진" 다른 실시형태를 고려한다.
본 명세서에서 수치 범위의 언급의 경우, 언급된 범위 최소값 및 최대값과 동일한 정확성을 갖는 각각의 사이 값이 명백하게 고려된다. 예를 들어, 6 내지 9의 범위의 경우, 6 및 9 이외에 수치 7 및 8이 고려되고, 6.0 내지 7.0의 범위의 경우, 수치 6.0, 6.1, 6.2, 6.3, 6.4, 6.5, 6.6, 6.7, 6.8, 6.9 및 7.0이 명백하게 고려된다.
"아주반트"는 본 명세서에 사용된 바와 같이 항원의 면역원성을 향상시키기 위해서 본 명세서에 기재된 백신에 첨가되는 임의의 분자를 의미한다.
"항체"는 본 명세서에 사용된 바와 같이 클래스 IgG, IgM, IgA, IgD 또는 IgE 또는 이의 단편 또는 유도체(Fab, F(ab')2, Fd 및 단일 쇄 항체, 다이아바디, 이중특이적 항체, 2작용성 항체 및 이의 유도체 포함)의 항체를 의미한다. 항체는 목적하는 에피토프 또는 이로부터 유래된 서열에 충분한 결합 특이성을 나타내는 포유동물의 혈청 샘플로부터 단리된 항체, 다클론성 항체, 친화성 정제된 항체 또는 이들의 임의의 혼합물일 수 있다.
"항원"은 (a) 서열번호 2의 아미노산 19 내지 159; (b) 서열번호 4의 아미노산 19 내지 210; (c) 서열번호 8의 아미노산 19 내지 232; (d) 서열번호 2의 아미노산 19 내지 159의 적어도 90%를 포함하는 단편; (e) 서열번호 4의 아미노산 19 내지 210의 적어도 90%를 포함하는 단편; (f) 서열번호 8의 아미노산 19 내지 232의 적어도 90%를 포함하는 단편; (g) 서열번호 2의 아미노산 19 내지 159와 적어도 95% 동일한 단백질; (h) 서열번호 4의 아미노산 19 내지 210과 적어도 95% 동일한 단백질; (i) 서열번호 8의 아미노산 19 내지 232와 적어도 95% 동일한 단백질; (j) 서열번호 2의 아미노산 19 내지 159와 적어도 95% 동일한 단백질의 적어도 90%를 포함하는 단편; (k) 서열번호 4의 아미노산 19 내지 210과 적어도 95% 동일한 단백질의 적어도 90%를 포함하는 단편; 및 (l) 서열번호 8의 아미노산 19 내지 232와 적어도 95% 동일한 단백질의 적어도 90%를 포함하는 단편을 포함하는 합성 공통 서바이빈 항원 아미노산 서열을 갖는 단백질을 지칭한다. "항원"은 또한 (a) 서열번호 2; (b) 서열번호 4; (c) 서열번호 8; (d) 서열번호 2의 전체 길이의 적어도 90%를 포함하는 단편; (e) 서열번호 4의 전체 길이의 적어도 90%를 포함하는 단편; (f) 서열번호 8의 전체 길이의 적어도 90%를 포함하는 단편; (g) 서열번호 2와 적어도 95% 동일한 단백질; (h) 서열번호 4와 적어도 95% 동일한 단백질; (i) 서열번호 8과 적어도 95% 동일한 단백질; (j) 서열번호 2의 전체 길이와 적어도 95% 동일한 단백질의 적어도 90%를 포함하는 단편; (k) 서열번호 4와 적어도 95% 동일한 단백질의 전체 길이의 적어도 90%를 포함하는 단편; 및 (l) 서열번호 8과 적어도 95% 동일한 단백질의 전체 길이의 적어도 90%를 포함하는 단편을 포함하는 합성 공통 서바이빈 항원 아미노산 서열을 갖는 단백질을 지칭한다. 항원은 신호 펩타이드 예컨대, 다른 단백질로부터의 것을 선택적으로 포함할 수 있다.
"암호 서열" 또는 "암호화 핵산"은 본 명세서에 사용된 바와 같이 단백질을 암호화하는 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 핵산(RNA 또는 DNA 분자)을 의미한다. 암호 서열은 핵산이 투여된 대상체 또는 포유동물의 세포에서 발현을 지시할 수 있는 프로모터 및 폴리아데닐화 신호를 포함하는 조절 요소에 작동 가능하게 연결된 시작 신호 및 종결 신호를 추가로 포함할 수 있다.
핵산과 관련하여 본 명세서에 사용된 바와 같이 "상보체" 또는 "상보성"은 핵산 분자의 뉴클레오타이드 또는 뉴클레오타이드 유사체 간의 왓슨-크릭(예를 들어, A-T/U 및 C-G) 또는 후그스틴 염기 짝지움을 의미할 수 있다.
"공통" 또는 "공통 서열"은 본 명세서에 사용된 바와 같이 상이한 유기체로부터 또는 유기체 내의 상이한 아이소폼으로부터의 동일한 유전자에 대한 다수의 서열의 정렬의 분석에 기초한 폴리펩타이드 서열을 의미한다. 공통 폴리펩타이드 서열을 암호화하는 핵산 서열이 제조될 수 있다.
"정전류"는 본 명세서에 사용된 바와 같이 동일한 조직에 전달되는 전기 펄스의 기간에 걸쳐서, 조직 또는 상기 조직을 한정하는 세포에 의해서 제공받거나 경험되는 전류를 기술한다. 전기 펄스는 본 명세서에 기재된 전기천공 장치로부터 전달된다. 이러한 전류는 전기 펄스의 수명에 걸쳐서 상기 조직 내에서 정전 전류량(constant amperage)으로 유지되는데, 그 이유는 본 명세에 제공된 전기천공 장치는 바람직하게는 즉각적인 피드백을 갖는 피드백 부재를 갖기 때문이다. 피드백 부재는 펄스 기간 전체에서 조직(또는 세포)의 저항을 측정하고, 전기천공 장치가 전기 에너지 출력을 변경하도록 (예를 들어, 전압을 증가시키도록) 할 수 있어서 동일한 조직 내의 전류가 전기 펄스 전체에서 그리고 펄스 대 펄스에서 (마이크로초 정도)로 일정하게 유지된다. 일부 실시형태에서, 피드백 부재는 제어기를 포함한다.
"전류 피드팩" 또는 "피드백"은 본 명세서에 사용된 바와 같이 상호 교환 가능하게 사용될 수 있고, 이것은 제공된 전기천공 장치의 활성 반응을 의미할 수 있는데, 이것은 전극 사이의 조직에서의 전류를 측정하고, 따라서 일정한 수준으로 전류를 유지시키기 위해서 EP 장치에 의해서 전달되는 에너지 출력을 변경시키는 것을 포함한다. 이러한 일정한 수준은 펄스 순서 또는 전기 처리의 시작 이전에 사용자에 의해서 사전 설정된다. 피드백은 예를 들어, 전기천공 장치의 전기천공 성분, 예를 들어, 제어기에 의해서 달성될 수 있는데, 그 이유는 내부의 전기 회로가 전극 사이의 조직 내의 전류를 연속적으로 모니터링하여, 모니터링된 전류(또는 조직 내의 전류)를 사전 설정된 전류와 비교하고, 에너지 출력을 연속적으로 조정하여 모니터링된 전류를 사전 설정된 수준으로 유지시킬 수 있기 때문이다. 피드백 루프가 예시일 수 있는데, 그 이유는 그것이 폐쇄 루프 피드백이기 때문이다.
"분산 전류(decentralized current)"는 본 명세서에 사용된 바와 같이 본 명세서에 기재된 전기천공 장치의 다양한 바늘 전극 어레이로부터 전달된 전류의 패턴을 의미할 수 있는데, 여기서 패턴은 최소화되거나, 바람직하게는 제거되고, 임의의 조직 면적 상의 전기천공법 관련 열 스트레스의 발생이 전기천공이다.
본 명세서에서 상호 교환 가능하게 사용되는 바와 같은 "전기천공법", "전기-투과", 또는 "동전기적 향상(electro-kinetic enhancement)"("EP")은 생물 막에서 미시적 경로(기공)를 유도하기 위한 막관통 전기장 펄스를 의미하며; 이의 존재는 생체분자, 예컨대, 플라스미드, 올리고뉴클레오타이드, siRNA, 약물, 이온 및 물이 세포막의 한 면으로부터 다른 면으로 통과하는 것을 허용한다.
"단편"은 핵산 서열과 관련하여 본 명세서에 사용된 바와 같이 본 명세서에 개시된 항원과 교차 반응하는 포유동물에서 면역 반응을 도출할 수 있는 폴리펩타이드를 암호화하는 핵산 서열 또는 이의 부분을 의미한다. 단편은 하기에 제시된 단백질 단편을 암호화하는 다양한 뉴클레오타이드 서열 중 적어도 하나로부터 선택된 DNA 단편일 수 있다. 단편은 첨가된 이종 신호 펩타이드를 제외하고, 하기에 제시된 핵산 서열 중 하나 이상을 적어도 10%, 적어도 20%, 적어도 30%, 적어도 40%, 적어도 50%, 적어도 60%, 적어도 70%, 적어도 80%, 적어도 90%, 또는 적어도 95% 포함할 수 있다. 단편은 하기에 제시된 핵산 서열 중 하나 이상을 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 또는 적어도 99% 포함할 수 있고, 서열 동일성을 계산할 때 포함될 필요가 없는 이종 신호 펩타이드를 암호화하는 서열을 추가로 선택적으로 포함한다. 단편은 신호 펩타이드, 예컨대, 면역글로불린 신호 펩타이드, 예를 들어, IgE 또는 IgG 신호 펩타이드에 대한 암호 서열을 추가로 포함할 수 있다. N 말단 메티오닌 및/또는 신호 펩타이드를 암호화하는 암호 서열은 암호 서열의 단편에 연결될 수 있다.
일부 실시형태에서, 단편은 하기에 제시된 핵산 서열 중 적어도 하나의 적어도 20개 이상의 뉴클레오타이드, 적어도 30개 이상의 뉴클레오타이드, 적어도 40개 이상의 뉴클레오타이드, 적어도 50개 이상의 뉴클레오타이드, 적어도 60개 이상의 뉴클레오타이드, 적어도 70개 이상의 뉴클레오타이드, 적어도 80개 이상의 뉴클레오타이드, 적어도 90개 이상의 뉴클레오타이드, 적어도 100개 이상의 뉴클레오타이드, 적어도 150개 이상의 뉴클레오타이드, 적어도 200개 이상의 뉴클레오타이드, 적어도 250개 이상의 뉴클레오타이드, 적어도 300개 이상의 뉴클레오타이드, 적어도 350개 이상의 뉴클레오타이드, 적어도 400개 이상의 뉴클레오타이드, 적어도 450개 이상의 뉴클레오타이드, 적어도 500개 이상의 뉴클레오타이드, 적어도 550개 이상의 뉴클레오타이드, 적어도 600개 이상의 뉴클레오타이드 또는 적어도 650개 이상의 뉴클레오타이드의 뉴클레오타이드를 포함할 수 있다.
폴리펩타이드 서열과 관련하여 "단편" 또는 "면역원성 단편"은 본 명세서에 개시된 항원과 교차 반응하는 포유동물에서 면역 반응을 도출할 수 있는 폴리펩타이드를 의미한다. 단편은 하기 다양한 아미노산 서열 중 적어도 하나로부터 선택된 폴리펩타이드 단편일 수 있다. 공통 단백질의 단편은 첨가된 임의의 이종 신호 펩타이드를 제외하고, 공통 단백질의 적어도 10%, 적어도 20%, 적어도 30%, 적어도 40%, 적어도 50%, 적어도 60%, 적어도 70%, 적어도 80%, 적어도 90% 또는 적어도 95%를 포함할 수 있다. 단편은 하기에 제시된 아미노산 서열 중 하나 이상을 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 또는 적어도 99% 포함할 수 있고, 서열 동일성을 계산할 때 포함될 필요가 없는 이종 신호 펩타이드를 추가로 선택적으로 포함한다. 단편은 신호 펩타이드, 예컨대, 면역글로불린 신호 펩타이드, 예를 들어, IgE 또는 IgG 신호 펩타이드를 추가로 포함할 수 있다.
일부 실시형태에서, 공통 단백질의 단편은 본 명세서에 개시된 단백질 서열의 적어도 20개 이상의 아미노산, 적어도 30개 이상의 아미노산, 적어도 40개 이상의 아미노산, 적어도 50개 이상의 아미노산, 적어도 60개 이상의 아미노산, 적어도 70개 이상의 아미노산, 적어도 80개 이상의 아미노산, 적어도 90개 이상의 아미노산, 적어도 100개 이상의 아미노산, 적어도 110개 이상의 아미노산, 적어도 120개 이상의 아미노산, 적어도 130개 이상의 아미노산, 적어도 140개 이상의 아미노산, 적어도 150개 이상의 아미노산, 적어도 160개 이상의 아미노산, 적어도 170개 이상의 아미노산, 적어도 180개 이상의 아미노산, 적어도 200개 이상의 아미노산, 또는 적어도 220개 이상의 아미노산을 포함할 수 있다.
본 명세서에 사용된 바와 같이, 용어 "유전자 작제물"은 단백질을 암호화하는 뉴클레오타이드를 포함하는 DNA 또는 RNA 분자를 지칭한다. 암호 서열은 핵산 분자가 투여된 대상체의 세포에서 발현을 지시할 수 있는 프로모터 및 폴리아데닐화 신호를 포함하는 조절 요소에 작동 가능하게 연결된 시작 신호 및 종결 신호를 포함한다. 본 명세서에 사용된 바와 같이, 용어 "발현 가능한 형태"는 단백질을 암호화하는 암호 서열에 작동 가능하게 연결된 필요한 조절 요소를 함유하여, 대상체의 세포에 존재하는 경우, 암호 서열이 발현될 유전자 작제물을 지칭한다.
용어 "상동성"은 본 명세서에 사용된 바와 같이, 상보성 정도를 지칭한다. 부분적 상동성 또는 완전 상동성(즉, 동일성)이 존재할 수 있다. 완전 상보성 서열이 표적 핵산에 혼성화하는 것을 적어도 부분적으로 저해하는 부분 상보성 서열은 기능성 용어 "실질적으로 상동성"을 사용하여 지칭된다. 이중 가닥 핵산 서열, 예컨대, cDNA 또는 게놈 클론에 대한 언급에서 사용되는 경우, 용어 "실질적으로 상동성"은 본 명세서에 사용된 바와 같이, 저엄격성 조건 하에서 이중 가닥 핵산 서열의 가닥에 혼성화될 수 있는 프로브를 지칭한다. 단일 가닥 핵산 서열에 대한 언급에서 사용되는 경우, 용어 "실질적으로 상동성"은 본 명세서에 사용된 바와 같이, 저엄격성 조건 하에서 단일 가닥 핵산 주형에 혼성화될 수 있는(즉, 상보체인) 프로브를 지칭한다.
2종 이상의 핵산 또는 폴리펩타이드 서열과 관련하여 "동일한" 또는 "동일성"은, 서열이 본 명세서에 사용된 바와 같이 명시된 영역에 걸쳐서 동일한 잔기의 명시된 백분율을 갖는다는 것을 의미한다. 백분율은 두 서열을 최적으로 정렬하고, 명시된 영역에 걸쳐서 두 서열을 비교하고, 두 서열에서 동일한 잔기가 발생하는 위치의 수를 결정하여 매칭된 위치의 수를 산출하고, 매칭된 위치의 수를 명시된 영역 내의 위치의 총 수로 나누고, 결과에 100을 곱하여 서열 동일성의 백분율을 산출함으로써 계산될 수 있다. 두 서열이 상이한 길이이거나 정렬이 하나 이상의 어긋난(staggered) 단부를 생성하고, 비교된 명시된 영역이 단일 서열만을 포함하는 경우, 단일 서열의 잔기는 계산의 분모에 포함되지만 분자에 포함되지 않는다. DNA 및 RNA를 비교할 때, 티민(T) 및 우라실(U)은 동등한 것으로 간주될 수 있다. 동일성은 수동으로 또는 BLAST 또는 BLAST 2.0과 같은 컴퓨터 서열 알고리즘을 사용하여 수행될 수 있다.
본 명세서에서 사용되는 바와 같이 "임피던스"는 피드백 기전을 논의할 때 사용될 수 있고, 옴의 법칙에 따라 전류값으로 변환되어 사전 설정된 전류와의 비교를 가능하게 할 수 있다.
본 명세서에서 사용된 바와 같이 "면역 반응"은 항원의 도입에 반응하여, 숙주의 면역계의 활성화, 예를 들어, 포유동물의 면역계의 활성화를 의미한다. 면역 반응은 세포 반응 또는 체액 반응, 또는 둘 다의 형태일 수 있다.
본 명세서에 사용된 바와 같이 "핵산" 또는 "올리고뉴클레오타이드" 또는 "폴리뉴클레오타이드"는 함께 공유 결합된 적어도 2개의 뉴클레오타이드를 의미한다. 단일 가닥의 묘사는 또한 상보적 가닥의 서열을 정의한다. 따라서, 핵산은 또한 묘사된 단일 가닥의 상보적 가닥을 포괄한다. 핵산의 많은 변이체가 주어진 핵산과 동일한 목적을 위해 사용될 수 있다. 따라서, 핵산은 또한 실질적으로 동일한 핵산 및 이의 상보체를 포괄한다. 단일 가닥은 엄격한 혼성화 조건 하에서 표적 서열에 혼성화할 수 있는 프로브를 제공한다. 따라서, 핵산은 또한 엄격한 혼성화 조건 하에서 혼성화하는 프로브를 포괄한다.
핵산은 단일가닥 또는 이중가닥일 수 있거나, 이중가닥 및 단일가닥 서열 둘 다의 부분을 함유할 수 있다. 핵산은 DNA, 게놈 및 cDNA 둘 다, RNA 또는 혼성체일 수 있으며, 여기서 핵산은 데옥시리보- 및 리보-뉴클레오타이드의 조합, 및 우라실, 아데닌, 티민, 사이토신, 구아닌, 이노신, 잔틴 하이포잔틴, 아이소사이토신 및 아이소구아닌을 포함하는 염기의 조합물을 함유할 수 있다. 핵산은 화학적 합성 방법에 의해 또는 재조합 방법에 의해 획득될 수 있다.
본 명세서에서 사용된 바와 같이 "작동 가능하게 연결된"은 유전자의 발현이 이것이 공간적으로 연결된 프로모터의 제어 하에 있음을 의미한다. 프로모터는 그의 제어 하에서 유전자의 5'(상류) 또는 3'(하류)에 배치될 수 있다. 프로모터와 유전자 간의 거리는 프로모터가 유래된 유전자 내에서 그것이 제어하는 프로모터와 유전자 간의 거리와 대략 동일할 수 있다. 당업계에 공지된 바와 같이, 이러한 거리의 변화는 프로모터 기능의 손실 없이 수용될 수 있다.
본 명세서에서 사용되는 바와 같이 "펩타이드", "단백질", 또는 "폴리펩타이드"는 아미노산의 연결된 서열을 의미할 수 있고, 천연, 합성, 또는 천연 및 합성의 변형 또는 조합일 수 있다.
본 명세서에서 사용된 바와 같이 "프로모터"는 세포에서 핵산의 발현을 부여, 활성화, 또는 향상시킬 수 있는 합성 또는 자연-유래된 분자를 의미한다. 프로모터는 발현을 추가로 향상시키고/시키거나 세포에서 핵산의 공간적 발현 및/또는 시간적 발현을 변경시키기 위해서 하나 이상의 특이적 전사 조절 서열을 포함할 수 있다. 프로모터는 또한 원위 인핸서 또는 리프레서 요소를 포함할 수 있고, 이는 전사의 출발 부위로부터 많게는 수 천 개의 염기쌍으로서 위치될 수 있다. 프로모터는 바이러스, 박테리아, 진균, 식물, 곤충 및 동물을 비롯한 공급원으로부터 유래될 수 있다. 프로모터는 발현이 발생하는 세포, 조직 또는 기관에 대해서 또는 발현이 발생하는 발달기에 대해서, 또는 외부 자극, 예컨대, 생리학적 스트레스, 병원체, 금속 이온, 또는 유도제에 반응하여 유전자 성분의 발현을 구성적으로 또는 차별적으로 조절할 수 있다. 프로모터의 대표적인 예는 박테리오파지 T7 프로모터, 박테리오파지 T3 프로모터, SP6 프로모터, lac 오퍼레이터-프로모터, tac 프로모터, SV40 후기 프로모터, SV40 초기 프로모터, RSV-LTR 프로모터, CMV IE 프로모터, SV40 초기 프로모터 또는 SV40 후기 프로모터 및 CMV IE 프로모터를 포함한다.
"신호 펩타이드" 및 "리더 서열"은 본 명세서에서 상호 교환적으로 사용되며, 본 명세서에 제시된 단백질의 아미노 말단에 연결될 수 있는 아미노산 서열을 지칭한다. 신호 펩타이드/리더 서열은 전형적으로 단백질의 국지화를 지시한다. 본 명세서에 사용된 신호 펩타이드/리더 서열은 바람직하게는 이것이 생산되는 세포로부터 단백질의 분비를 촉진한다. 신호 펩타이드/리더 서열은 세포로부터의 분비 시, 종종 성숙 단백질로 불리는 단백질의 나머지로부터 절단된다. 신호 펩타이드/리더 서열은 단백질의 아미노 말단(즉, N 말단)에 연결된다.
본 명세서에서 사용되는 바와 같이 "엄격한 혼성화 조건"은 제1 핵산 서열(예를 들어, 프로브)이 제2 핵산 서열(예를 들어, 표적)에, 예를 들어, 핵산의 복합 혼합물로 혼성화할 조건을 의미한다. 엄격한 조건은 서열 의존적이며, 상이한 상황에서 상이할 것이다. 엄격한 조건은 정의된 이온 강도 pH에서 특정 서열에 대한 열 용융점(Tm)보다 약 5 내지 10℃ 더 낮게 선택될 수 있다. Tm은 표적에 상보적인 프로브의 50%가 평형 시(표적 서열이 과량으로 존재하므로, Tm에서, 프로브의 50%가 평형 시 점유됨) 표적 서열에 혼성화하는 (정의된 이온 강도, pH 및 핵산 농도 하의) 온도일 수 있다. 엄격한 조건은 염 농도가 약 1.0M 나트륨 이온 미만, 예를 들어, pH 7.0 내지 8.3에서 약 0.01 내지 1.0M 나트륨 이온 농도(또는 다른 염)이고 온도가 짧은 프로브(예컨대, 약 10 내지 50개 뉴클레오타이드)에 대해 적어도 약 30℃이고 긴 프로브(예컨대, 약 50개 초과 뉴클레오타이드)에 대해 적어도 약 60℃인 것일 수 있다. 엄격한 조건은 또한 탈안정화제, 예를 들어, 폼아마이드의 첨가로 달성될 수 있다. 선택적 또는 특이적 혼성화를 위해, 양성 신호는 배경 혼성화의 적어도 2 내지 10배일 수 있다. 예시적인 엄격한 혼성화 조건에는 하기가 포함된다: 50% 폼아마이드, 5×SSC, 및 1% SDS, 42℃에서 인큐베이션, 또는 5×SSC, 1% SDS, 65℃에서 인큐베이션, 65℃에서 0.2×SSC, 및 0.1% SDS 중에 세척.
본 명세서에서 사용된 바와 같이 "대상체"는 본 명세서에 기재된 백신으로 면역화되기를 원하거나 면역화될 필요가 있는 포유동물을 의미할 수 있다. 포유동물은 인간, 침팬지, 개, 고양이, 말, 소, 마우스 또는 래트일 수 있다.
본 명세서에서 사용되는 바와 같이 "실질적으로 상보적인"은 제1 서열이 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 100, 180, 270, 360, 450, 540개 또는 그 초과의 뉴클레오타이드 또는 아미노산 영역에 걸쳐 제2 서열의 상보체에 적어도 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일함을, 또는 두 서열이 엄격한 혼성화 조건 하에 혼성화함을 의미할 수 있다.
본 명세서에서 사용되는 바와 같이 "실질적으로 동일한"은 제1 서열이 제2 서열의 상보체에 실질적으로 상보적인 경우, 제1 서열 및 제2 서열이 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 100, 180, 270, 360, 450, 540개 또는 그 초과의 뉴클레오타이드 또는 아미노산 영역에 걸쳐 또는 핵산에 대해 적어도 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99%임을 의미할 수 있다.
본 명세서에서 사용되는 바와 같이 "치료" 또는 "치료하는"은 질환의 예방, 억제, 진압 또는 완전 제거 수단을 통한 대상체의 질환으로부터의 보호를 의미할 수 있다. 질환의 예방은 질환의 개시 전에 대상체에게 본 발명의 백신을 투여하는 것을 포함한다. 질환의 억제는 질환의 유도 후 그러나 임상적 출현 전에 동물에 대한 본 발명의 백신을 투여하는 것을 포함한다. 질환의 진압은 질환의 임상적 출현 후에 동물에게 본 발명의 백신을 투여하는 것을 포함한다.
핵산과 관련하여 본 명세서에서 사용되는 바와 같이 "변이체"는 (i) 참조된 뉴클레오타이드 서열의 일부 또는 단편; (ii) 참조된 뉴클레오타이드 서열 또는 이의 일부의 상보체; (iii) 참조된 핵산 또는 이의 상보체와 실질적으로 동일한 핵산; 또는 (iv) 참조된 핵산, 이의 상보체, 또는 이와 실질적으로 동일한 서열에 엄격한 조건 하에서 혼성화하는 핵산을 의미할 수 있다.
펩타이드 또는 폴리펩타이드와 관련하여 "변이체"는 아미노산의 삽입, 결실, 또는 보존적 치환에 의해 아미노산 서열이 상이하지만 적어도 하나의 생물학적 활성을 보유하는 펩타이드 또는 폴리펩타이드를 의미한다. 변이체는 또한 적어도 하나의 생물학적 활성을 보유하는 아미노산 서열을 갖는 참조된 단백질과 실질적으로 동일한 아미노산 서열을 갖는 단백질을 의미할 수 있다. 아미노산의 보존적 치환, 즉 유사한 특성(예를 들어, 친수성, 하전된 영역의 정도 및 분포)의 상이한 아미노산을 사용한 아미노산 대체는 당업계에서 전형적으로 작은 변화에 관여하는 것으로 인지된다. 이러한 작은 변화는, 부분적으로 당업계에서 이해되는 바와 같이 아미노산의 수치 지수를 고려하여 식별될 수 있다(Kyte et al., J. Mol. Biol. 157:105-132(1982). 아미노산의 수치 지수는 그 소수성 및 전하의 고려 사항에 기초한다. 유사한 수치 지수의 아미노산이 치환되고 여전히 단백질 기능을 보유할 수 있음이 당업계에 공지되어 있다. 일 양상에서, ±2의 수치 지수를 갖는 아미노산이 치환된다. 아미노산의 친수성은 또한 생물학적 기능을 보유하는 단백질을 생성할 치환을 드러내기 위해 사용될 수 있다. 펩타이드의 맥락에서 아미노산의 친수성 고려 사항은 항원성 및 면역원성과 잘 연관되는 것으로 보고된 유용한 척도인 펩타이드의 가장 큰 국소 평균 친수성 계산을 허용한다(본 명세서 전문이 참고로 포함된 미국 특허 제4,554,101호). 당업계에서 이해되는 바와 같은, 유사한 친수성 값을 갖는 아미노산의 치환은 생물학적 활성, 예를 들어 면역원성을 보유하는 펩타이드를 생성할 수 있다. 치환은 서로 ±2 내의 친수성 값을 갖는 아미노산으로 수행될 수 있다. 아미노산의 소수성 지수 및 친수성 값은 모두 아미노산의 특정 측쇄에 의해 영향을 받는다. 관찰과 일치하게, 생물학적 기능과 상용성인 아미노산 치환은 아미노산의 상대적 유사성, 특히 소수성, 친수성, 전하, 크기 및 다른 특성으로 드러나는 바와 같은 이들 아미노산의 측쇄에 근거하는 것으로 이해된다.
변이체는 전체 유전자 서열의 전장 또는 이의 단편에 걸쳐 실질적으로 동일한 핵산 서열일 수 있다. 핵산 서열은 유전자 서열의 전장 또는 이의 단편에 걸쳐 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 동일할 수 있다. 변이체는 아미노산 서열의 전장 또는 이의 단편에 걸쳐 실질적으로 동일한 아미노산 서열일 수 있다. 아미노산 서열은 아미노산 서열의 전장 또는 이의 단편에 걸쳐 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 동일할 수 있다.
본 명세서에서 사용되는 바와 "벡터"는 복제 기원을 함유하는 핵산 서열을 의미한다. 벡터는 플라스미드, 박테리오파지, 박테리아 인공 염색체 또는 효모 인공 염색체일 수 있다. 벡터는 DNA 또는 RNA 벡터일 수 있다. 벡터는 자가-복제 염색체외 벡터일 수 있고, 바람직하게는 DNA 플라스미드이다. 벡터는 1종 이상의 이종 핵산 서열을 함유하거나 포함할 수 있다.
백신
본 명세서에는 본 명세서에 개시된 바와 같은 합성 공통 서바이빈 항원, 항원을 암호화하는 핵산 분자, 항원의 단편을 암호화하는 핵산 분자, 항원의 변이체를 암호화하는 핵산 분자 또는 이들의 조합물을 암호화하는 핵산 분자를 포함하는 백신이 제공된다. 백신은 대상체에서 항원에 대한 면역 반응을 생성시킬 수 있다. 면역 반응은 치료적 또는 예방적 면역 반응일 수 있다. 백신은 하기에 상세하게 기재된 바와 같은 벡터 또는 복수의 벡터를 포함할 수 있다.
일부 실시형태에서, 백신은 핵산 분자를 포함한다. 일부 실시형태에서, 핵산 분자는 합성 공통 서바이빈 항원을 암호화한다. 일부 실시형태에서, 핵산 분자는 서열번호 3을 암호화하는 핵산 서열; 서열번호 3의 길이의 적어도 90%를 포함하는 단편을 암호화하는 핵산 서열; 서열번호 3과 적어도 95% 동일한 단백질을 암호화하는 핵산 서열; 또는 서열번호 3과 적어도 95% 동일한 단백질의 전체 길이의 적어도 90%를 포함하는 단편을 암호화하는 핵산 서열을 포함한다. 일부 실시형태에서, 핵산 분자는 서열번호 1; 서열번호 1의 전체 길이의 적어도 90%를 포함하는 단편; 서열번호 1과 적어도 95% 동일한 단편; 또는 서열번호 1과 적어도 95% 동일한 핵산 서열의 전체 길이의 적어도 90%를 포함하는 단편을 포함한다.
일부 실시형태에서, 핵산 분자는 서열번호 4를 암호화하는 핵산 서열; 서열번호 4의 길이의 적어도 90%를 포함하는 단편을 암호화하는 핵산 서열; 서열번호 4와 적어도 95% 동일한 단백질을 암호화하는 핵산 서열; 또는 서열번호 4와 적어도 95% 동일한 단백질의 전체 길이의 적어도 90%를 포함하는 단편을 암호화하는 핵산 서열을 포함한다. 일부 실시형태에서, 핵산 분자는 서열번호 2; 서열번호 2의 전체 길이의 적어도 90%를 포함하는 단편; 서열번호 2와 적어도 95% 동일한 단편; 또는 서열번호 2와 적어도 95% 동일한 핵산 서열의 전체 길이의 적어도 90%를 포함하는 단편을 포함한다.
일부 실시형태에서, 백신은 합성 공통 서바이빈 항원을 포함하며, 여기서 항원은 서열번호 3; 서열번호 3의 길이의 적어도 90%를 포함하는 단편; 서열번호 3과 적어도 95% 동일한 아미노산 서열; 또는 서열번호 3과 적어도 95% 동일한 단백질의 전체 길이의 적어도 90%를 포함하는 단편을 포함한다.
일부 실시형태에서, 백신은 합성 공통 서바이빈 항원을 포함하며, 여기서 항원은 서열번호 4; 서열번호 4의 길이의 적어도 90%를 포함하는 단편; 서열번호 4와 적어도 95% 동일한 아미노산 서열; 또는 서열번호 4와 적어도 95% 동일한 단백질의 전체 길이의 적어도 90%를 포함하는 단편을 포함한다.
백신을 사용하여 암, 예를 들어, 서바이빈을 발현하는 암 또는 종양에 대해서 보호할 수 있다. 백신을 사용하여 이를 필요로 하는 대상체에서 서바이빈을 발현하는 종양을 예방 및/또는 치료할 수 있다. 백신은 서바이빈에 대해서 그리고 서바이빈을 발현하는 종양에 대해서 세포 및/또는 항체 반응을 유도할 수 있다.
일 실시형태에서, 백신을 사용하여 서바이빈을 발현하는 난소암 세포, 구체적으로, 서바이빈을 발현하는 상피 난소암 세포, 보다 구체적으로 서바이빈을 발현하는 장액성 난소암(serous ovarian cancer) 세포에 대해서 보호하고/하거나 이를 예방하고/하거나 이를 치료하거나, 또는 이에 대해서 세포 및/또는 항체 반응을 유도할 수 있다.
본 명세서에 기재된 바와 같은 암 백신의 개발은 면역계에 의해서 인식되지 않고, 종양-연관된("암/고환", "C/T") 항원인 암 항원, 예를 들어, 서바이빈을 식별하는 단계를 포함한다. 식별된 암 항원은 면역계에 의해서 인식되기 위해서 자가 항원으로부터 외부 항원으로 변화된다. 자가 항원으로부터의 외부 항원으로의 재조합 암 항원의 핵산 및 아미노산 서열의 재설계는 면역계에 의한 항원의 내성을 파괴한다. 내성을 파괴하기 위해서, 몇몇 재설계 조치를 하기에 기재된 바와 같은 암 항원에 적용할 수 있다.
백신의 재조합 암 항원은 자가로서 인식되지 않기 때문에, 내성을 파괴한다. 내성의 파괴는 항원-특이적 T 세포 및/또는 고역가 항체 반응을 유도할 수 있기 때문에, 상기 항원을 발현하는 암 또는 종양에 대해서 지향되거나 반응성인 면역 반응을 유도 또는 도출할 수 있다. 일부 실시형태에서, 유도되거나 도출된 면역 반응은 세포 면역 반응, 체액 면역 반응 또는 세포 면역 반응 및 체액 면역 반응 둘 다일 수 있다. 일부 실시형태에서, 유도되거나 도출된 세포 면역 반응은 인터페론-감마(IFN-γ) 및/또는 종양 괴사 인자 알파(TNF-α) 및/또는 인터류킨 2(IL-2)의 유도 또는 분비를 포함할 수 있다. 다른 실시형태에서, 유도되거나 도출된 면역 반응은 항원을 발현하는 종양 또는 암의 성장을 촉진시키는 1종 이상의 면역 억제 인자, 예를 들어, 비제한적으로 MHC 제시를 하향조절하는 인자, 항원-특이적 조절 T 세포(Treg)를 상향조절하는 인자, PD-L1, FasL, 사이토카인, 예컨대, IL-10 및 TFG-β, 종양 연관 대식세포, 종양 연관 섬유모세포, 면역 억제 세포에 의해서 생산되는 가용성 인자, CTLA-4, PD-1, MDSC, MCP-1 및 면역 관문 분자를 감소시키거나 저해할 수 있다.
특정 실시형태에서, 백신은 (1) 세포독성 T 림프구, 예컨대, CD8+(CTL) 및/또는 CD107a+를 증가시켜 종양 세포를 공격하고, 사멸시킴으로써; (2) T 헬퍼 세포 반응을 증가시킴으로써; 그리고/또는 (3) IFN-γ, IL-2 및 TFN-α를 통해서 염증 반응을 증가시킴으로써, 바람직하게는 상기에 언급된 것 모두에 의해서 종양 세포의 제거를 매개하거나 종양 세포의 성장을 예방할 수 있다.
백신은 DNA 백신일 수 있다. DNA 백신은 참조에 의해 전문이 본 명세서에 포함된 미국 특허 제5,593,972호, 제5,739,118호, 제5,817,637호, 제5,830,876호, 제5,962,428호, 제5,981,505호, 제5,580,859호, 제5,703,055호, 및 제5,676,594호에 개시되어 있다. DNA 백신은 염색체 내로의 통합을 저해하는 요소 또는 시약을 추가로 포함할 수 있다.
백신은 암 항원을 암호화하는 RNA를 포함할 수 있다. RNA 백신은 세포 내로 도입될 수 있다.
백신은 항원, 소단위 백신 및 당단백질 백신, 예를 들어, 비제한적으로 각각 참조에 의해 본 명세서에 포함된 미국 특허 제4,510,245호; 제4,797,368호; 제4,722,848호; 제4,790,987호; 제4,920,209호; 제5,017,487호; 제5,077,044호; 제5,110,587호; 제5,112,749호; 제5,174,993호; 제5,223,424호; 제5,225,336호; 제5,240,703호; 제5,242,829호; 제5,294,441호; 제5,294,548호; 제5,310,668호; 제5,387,744호; 제5,389,368호; 제5,424,065호; 제5,451,499호; 제5,453,364호; 제5,462,734호; 제5,470,734호; 제5,474,935호; 제5,482,713호; 제5,591,439호; 제5,643,579호; 제5,650,309호; 제5,698,202호; 제5,955,088호; 제6,034,298호; 제6,042,836호; 제6,156,319호 및 제6,589,529호에 기재된 백신을 전달하기 위해서 재조합 벡터를 사용하는 백신인 약독화 생백신(attenuated live vaccine)일 수 있다
일부 실시형태에서, 핵산 백신은 분자 아주반트를 위한 암호 서열을 추가로 포함할 수 있고, 일부 경우에, 분자 아주반트는 IL-12, IL-15, IL-28, IL-31, IL-33 및/또는 RANTES일 수 있고, 일부 경우에, 분자 아주반트는 항-세포독성 T-림프구 항원 4(CTLA-4), 항-예정사 수용체-1(PD-1) 및 항-림프구-활성화 유전자(LAG-3)이다. IL-12, IL-15, IL-28, IL-31, IL-33 및/또는 RANTES를 위한 암호 서열은 1종 이상의 항원에 대한 암호 서열을 포함하는 1종 이상의 핵산 분자 상에 포함될 수 있다. IL-12, IL-15, IL-28, IL-31, IL-33 및/또는 RANTES를 위한 암호 서열은 1종 이상의 별개의 핵산 분자, 예컨대, 1종 이상의 별개의 플라스미드 또는 벡터 상에 포함될 수 있고, 핵산 백신과 조합하여 투여될 수 있다.
본 발명의 백신은, 백신 자체가 병 또는 사망을 유도하지 않으므로 안전하고; 병에 대해 보호적이고; 항체 중화를 유도하고; 보호 T 세포를 유도하고; 투여 용이성, 적은 부작용, 생물학적 안정성 및 용량 당 낮은 비용을 제공하는 것과 같은, 효율적인 백신에 요구되는 특징을 가질 수 있다. 백신은 하기에 논의되는 바와 같은 암 항원을 암호화하는 핵산 분자(들)를 함유함으로써 이러한 특징 중 일부 또는 모두를 달성할 수 있다.
면역 관문 저해제와 조합된 백신
백신은 1종 이상의 면역 면역관문 분자의 1종 이상의 저해제(즉, 면역 면역관문 저해제)를 추가로 포함할 수 있다. 면역 관문 분자는 하기에 보다 상세하게 기재된다. 면역 면역관문 저해제는 면역계에서 임의의 성분의 억제, 예컨대, MHC 클래스 제시, T 세포 제시 및/또는 분화, B 세포 제시 및/또는 분화, 임의의 사이토카인, 케모카인 또는 면역 세포 증식 및/또는 분화를 위한 신호전달을 예방하는 임의의 핵산 또는 단백질이다.
이러한 저해제는 핵산 서열, 아미노산 서열, 소분자 또는 이들의 조합물일 수 있다. 핵산 서열은 DNA, RNA, cDNA, 이의 변이체, 이의 단편, 또는 이들의 조합물일 수 있다. 핵산은 또한 펩타이드 결합에 의해서 면역 관문 저해제에 연결된 링커 또는 태그 서열을 암호화하는 추가 서열을 포함할 수 있다. 소분자는 단백질 또는 핵산, 또는 생물학적 과정의 조절인자에 의해서 결합된 효소 기질, 리간드(또는 이의 유사체)로서 작용할 수 있는 저분자량, 예를 들어, 800달톤 미만의 유기 또는 무기 화합물일 수 있다. 아미노산 서열은 단백질, 펩타이드, 이의 변이체, 이의 단편, 또는 이들의 조합물일 수 있다.
일부 실시형태에서, 면역 관문 저해제는 항체, 이의 변이체, 이의 단편, 또는 이들의 조합물을 암호화하는 1종 이상의 핵산 서열일 수 있다. 다른 실시형태에서, 면역 관문 저해제는 항체, 이의 변이체, 이의 단편, 또는 이들의 조합물일 수 있다.
면역 관문 분자
면역 관문 분자는 핵산 서열, 아미노산 서열, 소분자, 또는 이들의 조합물일 수 있다. 핵산 서열은 DNA, RNA, cDNA, 이의 변이체, 이의 단편, 또는 이들의 조합물일 수 있다. 핵산은 또한 펩타이드 결합에 의해서 면역 관문 저해제에 연결된 링커 또는 태그 서열을 암호화하는 추가 서열을 포함할 수 있다. 소분자는 단백질 또는 핵산, 또는 생물학적 과정의 조절인자에 의해서 결합된 효소 기질, 리간드(또는 이의 유사체)로서 작용할 수 있는 저분자량, 예를 들어, 800달톤 미만의 유기 또는 무기 화합물일 수 있다. 아미노산 서열은 단백질, 펩타이드, 이의 변이체, 이의 단편, 또는 이들의 조합물일 수 있다.
PD-1 및 PD-L1
면역 관문 분자는 세포 예정사 단백질 1(PD-1), 세포 예정사 리간드 1(PD-L1), 이의 단편, 이의 변이체, 또는 이들의 조합물일 수 있다. PD-1은 PDCD1 유전자에 의해서 암호화된 세포 표면 단백질이다. PD-1은 면역글로불린 슈퍼패밀리의 구성원이고, T 세포 및 프로-B 세포 상에서 발현되기 때문에, 이들 세포의 운명 및/분화에 기여한다. 특히, PD-1은 T 세포 조절인자의 CD28/CTLA-4 패밀리의 타입 1 막 단백질이고, T 세포 수용체(TCR) 신호를 조절함으로써 면역 반응을 부정적으로 조절한다. PD-1은 CD8+ T 세포 반응을 부정적으로 조절함으로써, CD8-매개된 세포독성을 저해하고, 종양 성장을 향상시킬 수 있다.
PD-1은 2개의 리간드, PD-L1 및 PD-L2를 갖는데, 이것은 B7 패밀리의 구성원이다. PD-L1은 LPS 및 GM-CSF 처리에 반응하여 대식 세포 및 수지상 세포(DC) 상에서 그리고 TCR 및 B 세포 수용체 신호전달 시에 T 세포 및 B 세포 상에서 상향조절된다. PD-L1은 골수종, 비만세포종 및 흑색종을 비롯한 다수의 종양 세포주에서 발현된다.
항-면역 관문 분자 항체
상기에 기재된 바와 같이, 면역 관문 저해제는 항체일 수 있다. 항체는 항원(즉, 상기에 기재된 면역 관문 분자)와 결합하거나 반응할 수 있다. 따라서, 항체는 항-면역 관문 분자 항체 또는 면역 관문 분자 항체로 간주될 수 있다. 항체는 함유된 핵산 서열에 의해서 암호화될 수 있다.
항체는 중쇄 폴리펩타이드 및 경쇄 폴리펩타이드를 포함할 수 있다. 중쇄 폴리펩타이드는 가변 중쇄(VH) 영역 및/또는 적어도 하나의 불변 중쇄(CH) 영역을 포함할 수 있다. 적어도 하나의 불변 중쇄 영역은 불변 중쇄 영역 1(CH1), 불변 중쇄 영역 2(CH2), 및 불변 중쇄 영역 3(CH3), 및/또는 힌지 영역을 포함할 수 있다.
일부 실시형태에서, 중쇄 폴리펩타이드는 VH 영역 및 CH1 영역을 포함할 수 있다. 다른 실시형태에서, 중쇄 폴리펩타이드는 VH 영역, CH1 영역, 힌지 영역, CH2 영역 및 CH3 영역을 포함할 수 있다.
중쇄 폴리펩타이드는 상보성 결정 영역("CDR") 세트를 포함할 수 있다. CDR 세트는 VH 영역의 3개의 초가변 영역을 함유할 수 있다. 중쇄 폴리펩타이드의 N-말단에서 시작하여, 이들 CDR은 각각 "CDR1", "CDR2", 및 "CDR3"으로 표시된다. 중쇄 폴리펩타이드의 CDR1, CDR2, 및 CDR3은 항원의 결합 또는 인식에 기여할 수 있다.
경쇄 폴리펩타이드는 가변 경쇄 (VL) 영역 및/또는 불변 경쇄(CL) 영역을 포함할 수 있다. 경쇄 폴리펩타이드는 상보성 결정 영역("CDR") 세트를 포함할 수 있다. CDR 세트는 VL 영역의 3개의 초가변 영역을 함유할 수 있다. 경쇄 폴리펩타이드의 N-말단에서 시작하여, 이들 CDR은 각각 "CDR1", "CDR2", 및 "CDR3"으로 표시된다. 경쇄 폴리펩타이드의 CDR1, CDR2, 및 CDR3은 항원의 결합 또는 인식에 기여할 수 있다.
항체는 각각, CDR을 지지하고, 서로에 대해서 CDR의 공간적 관계를 정의하는 중쇄 프레임워크("FR") 및 경쇄 프레임워크 세트 사이에 배치된 중쇄 및 경쇄 상보성 결정 영역("CDR") 세트를 포함할 수 있다. CDR 세트는 중쇄 또는 경쇄 V 영역의 3개의 초가면 영역을 함유할 수 있다. 중쇄 또는 경쇄의 N-말단에서 시작하여, 이들 영역은 각각 "CDR1", "CDR2", 및 "CDR3"으로 표시된다. 따라서, 항원-결합 부위는 각각 중쇄 V 영역 및 경쇄 V 영역으로부터의 CDR 세트를 포함하는 6개의 CDR을 포함할 수 있다.
항체는 면역글로불린(Ig)일 수 있다. Ig는 예를 들어, IgA, IgM, IgD, IgE 및 IgG일 수 있다. 면역글로불린은 중쇄 폴리펩타이드 및 경쇄 폴리펩타이드를 포함할 수 있다. 면역글로불린의 중쇄 폴리펩타이드는 VH 영역, CH1 영역, 힌지 영역, CH2 영역 및 CH3 영역을 포함할 수 있다. 면역글로불린의 경쇄 폴리펩타이드는 VL 영역 및 CL 영역을 포함할 수 있다.
추가로, 단백질 분해 효소 파파인은 IgG 분자를 우선적으로 절단하여 몇몇 단편을 산출하는데, 이들 중 2개(F(ab) 단편)는 각각 무손상 항원-결합 부위를 포함하는 공유 이종이량체를 포함한다. 효소 펩신은 IgG 분자를 절단하여 항원-결합 부위 모두를 포함하는, F(ab')2 단편을 비롯한, 몇몇 단편을 제공할 수 있다. 따라서, 항체는 Fab 또는 F(ab')2일 수 있다. Fab는 중쇄 폴리펩타이드 및 경쇄 폴리펩타이드를 포함할 수 있다. Fab의 중쇄 폴리펩타이드는 VH 영역 및 CH1 영역을 포함할 수 있다. Fab의 경쇄는 VL 영역 및 CL 영역을 포함할 수 있다.
항체는 다클론성 항체 또는 단클론성 항체일 수 있다. 항체는 키메라 항체, 단일 쇄 항체, 친화도 성숙 항체, 인간 항체, 인간화 항체, 또는 완전 인간 항체일 수 있다. 인간화된 항체는 비인간 종으로부터의 하나 이상의 상보성 결정 영역(CDR) 및 인간 면역글로불린 분자로부터의 프레임워크 영역을 갖는 목적하는 항원에 결합하는 비인간 종으로부터의 항체일 수 있다.
PD-1 항체
항-면역 관문 분자 항체는 항-PD-1 항체(본 명세서에서 "PD-1 항체"라고도 지칭됨), 이의 변이체, 이의 단편, 또는 이들의 조합물일 수 있다. PD-1 항체는 니볼루맙일 수 있다. 항-PD-1 항체는 PD-1 활성을 저해함으로써, 종양 또는 암에 대한 면역 반응을 유도, 도출 또는 증가시키고, 종양 성장을 감소시킬 수 있다.
PD-L1 항체
항-면역 관문 분자 항체는 항-PD-L1 항체(본 명세서에서 "PD-L1 항체"라고도 지칭됨), 이의 변이체, 이의 단편, 또는 이들의 조합물일 수 있다. 항-PD-L1 항체는 PD-L1 활성을 저해함으로써, 종양 또는 암에 대한 면역 반응을 유도, 도출 또는 증가시키고, 종양 성장을 감소시킬 수 있다.
항원
상기에 기재된 바와 같이, 백신은 항원 또는 항원을 암호화하는 핵산을 포함할 수 있다. 항원은 서바이빈, 이의 단편, 이의 변이체 또는 이의 단편과 변이체의 조합물일 수 있다.
따라서, 백신은 서바이빈을 발현하는 암 또는 종양을 앓고 있는 대상체의 치료를 위해서 사용될 수 있다. 일부 실시형태에서, 암은 난소암이다. 일부 실시형태에서, 난소암은 상피 난소암이다. 난소암은 장액성 상피 난소암일 수 있다. 백신은 또한 서바이빈을 발현하는 암 또는 종양을 갖는 대상체를 치료하기 위해서 또는 대상체에서 이러한 종양의 발달을 예방하기 위해서 사용될 수 있다. 합성 공통 서바이빈 항원은 네이티브 서바이빈 유전자와 상이할 수 있고, 따라서 합성 공통 서바이빈 항원-발현 종양에 대한 요법 또는 예방을 제공한다. 따라서, 네이티브 서바이빈 유전자(즉, 변이된 또는 합성 서바이빈 유전자 또는 서열)와 상이한 합성 공통 서바이빈 항원 서열이 본 명세에 제공된다.
네이티브 서바이빈 유전자의 전사체는 다양한 mRNA로 가공된다. 특정 서바이빈 mRNA 아이소폼은 예를 들어, 암 세포에서의 발현에 기초하여 선택될 수 있다. 특정 실시형태에서, 서바이빈 아이소폼은 난소암 세포에서의 발현에 기초하여 선택된다. 본 명세서에 기재된 합성 공통 서바이빈 항원 서열은 대안적인 가공을 회피하고, 하나의 전장 전사체를 생산하여 효과기 T 및 B 세포 반응의 더 강한 유도를 야기한다.
상기에 기재된 이종 서열을 포함하는 단리된 핵산 분자가 제공된다. 상기에 기재된 이종 서열로 이루어진 단리된 핵산 분자가 제공된다. 상기에 기재된 이종 서열을 포함하는 단리된 핵산 분자는 하기에 기재된 바와 같은 벡터, 예컨대, 플라스미드, 바이러스 벡터 및 핵산 분자의 다른 형태 내에 혼입될 수 있다. 본 명세서에는 합성 공통 서바이빈 항원을 암호화하는 핵산 서열이 제공된다. 합성 공통 서바이빈 항원을 암호화하는 암호 서열은 상기에 기재된 바와 같은 서열을 갖는다.
상기에 기재된 이종 아미노산 서열을 포함하는 단백질 분자가 제공된다. 상기에 기재된 이종 아미노산 서열로 이루어진 단백질 분자가 제공된다. 본 명세에는 상기에 기재된 서열을 갖는 단백질 및 폴리펩타이드가 제공된다. 단백질 및 폴리펩타이드는 합성 공통 서바이빈 항원 및 서바이빈 면역원으로서 지칭될 수 있다. 합성 공통 서바이빈 항원은 서바이빈을 발현하는 종양에 대해서 면역 반응을 도출할 수 있다.
일 양상에서, 하기 중 하나 이상을 갖는 것을 비롯하여 합성 공통 서바이빈 항원은 개선된 전사 및 번역을 제공하는 것이 바람직하다: 전사; mRNA 안정성 및 코돈 최적화를 증가시키기 위한 낮은 GC 함량 리더 서열; 및 가능한 정도까지, 시스-작용 서열 모티프(즉, 내부 TATA-박스)의 감소.
합성 공통 서바이빈 항원은 둘 이상의 종, 아이소폼 또는 변이체로부터 유래된 공통 항원(또는 면역원) 서열일 수 있다. 일 실시형태에서, 공통 서열은 상이한 종의 서바이빈 아이소폼으로부터 생성된다. 공통 서열은 젠뱅크사(GenBank) 또는 다른 유사한 DNA 또는 단백질 서열 데이터베이스로부터 수집된 서바이빈 서열로부터 유래된다. 일부 실시형태에서, 공통 항원은 제2 아이소폼의 일부와 조합된 제1 아이소폼의 일부를 포함할 수 있으며, 예를 들어, 제2 아이소폼의 일부는 제1 아이소폼의 임의의 부분과 비-상동성일 수 있다. 합성 공통 서바이빈 항원 항원은 증가된 발현을 위해서 공통 서열 및/또는 변형(들)을 포함할 수 있다. 변형은 코돈 최적화, RNA 최적화, 증가된 번역 개시를 위한 코작 서열(예를 들어, GCC ACC)의 첨가 및/또는 합성 공통 서바이빈 항원의 면역원성을 증가시키기 위한 면역글로불린 리더 서열의 첨가를 포함할 수 있다. 합성 공통 서바이빈 항원은 신호 펩타이드, 예컨대, 면역글로불린 신호 펩타이드, 예를 들어, 비제한적으로 면역글로불린 E(IgE) 또는 면역글로불린 G(IgG) 신호 펩타이드를 포함할 수 있다. 일부 실시형태에서, 합성 공통 서바이빈 항원은 국지화 신호 서열, 예를 들어, 번역 시 핵 국지화를 방해하기 위한 핵 국지화 신호에 대한 돌연변이 또는 결실을 포함할 수 있다. 일부 실시형태에서, 서바이빈 공통 항원은 혈구응집소(hemagglutinin: HA) 태그를 포함할 수 있다. 서바이빈 공통 항원은 상응하는 비-코돈 최적화된 서바이빈 항원보다 더 강하고, 더 넓은 세포 및/또는 체액 면역 반응을 도출하도록 설계될 수 있다.
공통 서바이빈 서열을 돌연변이시켜 네이티브 서바이빈의 특정 구조 및/또는 기능을 방해 및/또는 향상시켜 합성 공통 서바이빈 항원 서열을 생성시킬 수 있다. 일 실시형태에서, 돌연변이를 도입하여 서바이빈의 항-아포토시스 활성을 폐지할 수 있다. 특정 실시형태에서, T34A, T48A 및 C84A 돌연변이를 공통 서바이빈 아이소폼 1 서열 내에 도입하여 항-아포토시스 기능을 폐지한다(문헌[Muchmore, S. W. et al. Crystal structure and mutagenic analysis of the inhibitor-of-apoptosis protein Survivin. Molecular cell 6, 173-182 (2000); O'Connor, D. S. et al. Regulation of apoptosis at cell division by p34cdc2 phosphorylation of Survivin. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America 97, 13103-13107, doi:10.1073/pnas.240390697 (2000); Barrett, R. M., Colnaghi, R. & Wheatley, S. P. Threonine 48 in the BIR domain of Survivin is critical to its mitotic and anti-apoptotic activities and can be phosphorylated by CK2 in vitro. Cell cycle (Georgetown, Tex.) 10, 538-548 (2011)] 참고).
일부 실시형태에서, 합성 공통 서바이빈 항원 서열은 하나의 아이소폼, 예를 들어, 우세한 서바이빈 아이소폼으로부터 생성될 수 있거나, 또는 공통 서열은 제1 아이소폼의 일부와 제2 아이소폼의 일부, 또는 제2 아이소폼의 절두된 부분의 조합물을 포함할 수 있다. 일 실시형태에서, 합성 공통 서열은 서바이빈 아이소폼 1(서바이빈 1)으로부터 유래된다. 또 다른 실시형태에서, 합성 공통 서열은 서바이빈 아이소폼 3(서바이빈 3)으로부터 유래된다. 일 실시형태에서, 합성 공통 서바이빈 항원 3 서열은 서바이빈 3(서바이빈 3T)의 절두된 부분이다. 일 실시형태에서, 합성 공통 서열은 서바이빈 1과 서바이빈 T3 또는 서바이빈 1T3의 조합물이다.
바람직한 실시형태에서, 합성 공통 서바이빈 항원 서열은 서열번호 1 또는 서열번호 3과 95.0% 이상의 동일성을 공유한다. 이러한 실시형태에서, 서열번호 1 또는 서열번호 3의 핵산 서열은 각각 서열번호 2 또는 서열번호 8의 아미노산 서열을 암호화한다. 다른 실시형태에서, 합성 공통 서바이빈 항원 서열은 서열번호 1 또는 서열번호 3과 95.0% 이상의 동일성, 95.2% 이상의 동일성, 95.4% 이상의 동일성, 95.6% 이상의 동일성, 95.8% 이상의 동일성, 96.0% 이상의 동일성, 96.2% 이상의 동일성, 96.4% 이상의 동일성, 96.6% 이상의 동일성, 96.8% 이상의 동일성, 97.0% 이상의 동일성, 97.2% 이상의 동일성, 97.4% 이상의 동일성, 97.6% 이상의 동일성, 97.8% 이상의 동일성, 98.0% 이상의 동일성, 98.2% 이상의 동일성, 98.4% 이상의 동일성 또는 98.6% 이상의 동일성, 98.8% 이상의 동일성, 99.0% 이상의 동일성, 99.2% 이상의 동일성, 99.4% 이상의 동일성, 99.6% 이상의 동일성, 99.8% 이상의 동일성, 또는 100%의 동일성을 공유한다.
벡터
백신은 합성 공통 서바이빈 항원을 암호화하는 이종 핵산을 포함하는 1종 이상의 벡터를 포함할 수 있다. 1종 이상의 벡터는 포유동물에서 면역 반응을 도출하기에 효과적인 양으로 항원을 발현할 수 있다. 백터는 항원을 암호화하는 이종 핵산을 포함할 수 있다. 벡터는 복제 기원을 함유하는 핵산 서열을 가질 수 있다. 벡터는 플라스미드, 박테리오파지, 박테리아 인공 염색체 또는 효모 인공 염색체일 수 있다. 벡터는 자가 복제 염색체외 벡터, 또는 숙주 게놈 내로 통합되는 벡터일 수 있다.
하나 이상의 벡터는 발현 작제물일 수 있고, 이는 일반적으로 표적 세포 내로 특정 유전자를 도입하기 위해 사용되는 플라스미드이다. 일단 발현 벡터가 세포 내에 존재하면, 유전자에 의해 암호화된 단백질이 세포성-전사 및 번역 기전 리보솜 복합체에 의해서 생산된다. 플라스미드는 종종 인핸서 및 프로모터 영역으로 작용하고 발현 벡터 상에 보유된 유전자의 효율적인 전사로 이어지는 조절 서열을 함유하도록 조작된다. 본 발명의 벡터는 다량의 안정적인 메신저 RNA, 및 이에 따른 단백질을 발현한다.
벡터는 발현 신호, 예컨대, 강한 프로모터, 강한 종결 코돈, 프로모터와 클로닝된 유전자 사이의 거리 조정, 및 전자 종결 서열 및 PTIS(이동가능한 번역 개시 서열)의 삽입을 가질 수 있다.
벡터는 원형 플라스미드 또는 선형 핵산일 수 있다. 원형 플라스미드 및 선형 핵산은 적절한 대상체 세포에서 특정 뉴클레오타이드 서열의 발현을 지시할 수 있다. 벡터는 종결 신호와 작동 가능하게 연결될 수 있는, 항원-암호화 뉴클레오타이드 서열에 작동 가능하게 연결된 프로모터를 가질 수 있다. 벡터는 뉴클레오타이드 서열의 적절한 번역을 위해서 요구되는 서열뿐만 아니라 벡터 및 이의 단편의 클로닝 및 서브클로닝을 위한 서열을 또한 함유할 수 있다. 관심대상 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 벡터는 키메라일 수 있으며, 이는 그 성분 중 적어도 하나가 다른 성분의 적어도 하나에 대해 이종성이라는 것을 의미한다. 발현 카세트 내의 뉴클레오타이드 서열의 발현은 구성적 프로모터 또는 숙주 세포가 일부 특정 외부 자극에 노출되는 경우에만 전사를 개시하는 유도성 프로모터의 제어 하에 있을 수 있다. 다세포 유기체의 경우, 프로모터는 또한 특정 조직 또는 기관 또는 발달 단계에 특이적일 수 있다. 바람직한 실시형태에서, 플라스미드 벡터는 서열번호 1의 핵산 서열을 추가로 포함하는, 본 명세서에 기재된 pGX1428; 또는 서열번호 3의 핵산 서열을 추가로 포함하는, 본 명세서에 기재된 pGX1429이다.
벡터는 플라스미드일 수 있다. 플라스미드는 세포에 항원을 암호화하는 핵산을 형질주입시키는데 유용할 수 있다. 형질주입된 숙주 세포는 항원의 발현이 일어나는 조건 하에서 배양되고 유지될 수 있다.
플라스미드는, 항원, 이러한 단백질의 단편, 이러한 단백질의 변이체, 변이체의 단편, 또는 공통 단백질 및/또는 공통 단백질의 단편 및/또는 공통 단백질의 변이체 및/또는 공통 단백질의 변이체의 단편의 조합물로 구성된 융합 단백질에 대해 면역 반응을 도출할 수 있는 합성, 공통 항원을 암호화하는 암호 서열을 비롯한 상기에 개시된 다양한 항원 중 하나 이상을 암호화하는 핵산 서열을 포함할 수 있다.
단일 플라스미드는 단일 항원에 대한 암호 서열, 2개 항원에 대한 암호 서열, 3개 항원에 대한 암호 서열, 또는 4개 항원에 대한 암호 서열을 함유할 수 있다.
일부 실시형태에서, 플라스미드는 CCR20 단독 또는 이러한 플라스미드의 부분으로서 암호화하는 암호 서열을 추가로 포함할 수 있다. 유사하게, 플라스미드는 IL-12, IL-15 및/또는 IL-28에 대한 암호 서열을 추가로 포함할 수 있다.
플라스미드는 암호 서열의 상류에 있을 수 있는 개시 코돈, 및 암호 서열의 하류에 있을 수 있는 정지 코돈을 추가로 포함할 수 있다. 상기 개시 및 종결 코돈은 암호 서열과 인프레임일 수 있다.
플라스미드는 암호 서열과 작동 가능하게 연결된 프로모터를 또한 포함할 수 있다. 암호 서열에 작동 가능하게 연결된 프로모터는 원숭이 바이러스 40(SV40)으로부터의 프로모터, 마우스 유방 종양 바이러스(MMTV) 프로모터, 인간 면역결핍 바이러스(HIV) 프로모터, 예컨대, 소 면역결핍 바이러스(BIV) 긴 말단 반복서열(LTR) 프로모터, 몰로니 바이러스 프로모터, 조류 백혈증 바이러스(ALV) 프로모터, 사이토메갈로바이러스(CMV) 프로모터, 예컨대 CMV 극초기 프로모터, 엡스타인 바(Epstein Barr) 바이러스(EBV) 프로모터, 또는 라우스(Rous) 육종 바이러스(RSV) 프로모터일 수 있다. 프로모터는 인간 유전자, 예컨대, 인간 액틴, 인간 미오신, 인간 헤모글로빈, 인간 근육 크레아틴 또는 인간 메탈로티오네인(metallothionein)으로부터의 프로모터일 수 있다. 프로모터는 또한 천연 또는 합성의 조직 특이적 프로모터, 예컨대 근육 또는 피부 특이적 프로모터일 수 있다. 그러한 프로모터의 예는 미국 특허 출원 공개 제US20040175727호에 기재되며, 그 내용은 전문이 본 명세서에 포함된다.
플라스미드는 또한 암호 서열의 하류에 존재할 수 있는 폴리아데닐화 신호를 포함할 수 있다. 폴리아데닐화 신호는 SV40 폴리아데닐화 신호, LTR 폴리아데닐화 신호, 소 성장 호르몬(bGH) 폴리아데닐화 신호, 인간 성장 호르몬(hGH) 폴리아데닐화 신호 또는 인간 β-글로빈 폴리아데닐화 신호일 수 있다. SV40 폴리아데닐화 신호는 pCEP4 플라스미드(인비트로젠사(Invitrogen), 미국 캘리포니아주 샌디에이고주 소재)로부터의 폴리아데닐화 신호일 수 있다.
플라스미드는 또한 암호 서열의 상류에 인핸서를 포함할 수 있다. 인핸서는 인간 액틴, 인간 미오신, 인간 헤모글로빈, 인간 근육 크레아틴 또는 바이러스 인핸서, 예컨대, CMV, FMDV, RSV 또는 EBV로부터의 인핸서일 수 있다. 폴리뉴클레오타이드 기능 인핸서는 미국 특허 제5,593,972호; 제5,962,428호; 및 국제 특허 제W094/016737호에 기술되며, 이들 각각의 내용은 전체가 참조에 의해 본 명세서에 포함된다.
플라스미드는 또한 염색체외로 플라스미드를 유지하고 세포에서 복수의 플라스미드 카피를 생산하기 위해서 포유동물 복제 기원을 포함할 수 있다. 플라스미드는 인비트로젠사(미국 캘리포니아주 샌디에이고주 소재)로부터의 pVAXI, pCEP4 또는 pREP4일 수 있고, 이것은 엡스타인 바 바이러스 복제 기원 및 핵 항원 EBNA-1 암호 영역을 포함할 수 있고, 이는 통합 없이 고카피 에피솜 복제물을 생산할 수 있다. 플라스미드의 골격은 pA V0242일 수 있다. 플라스미드는 복제 결함 아데노바이러스 유형 5(Ad5) 플라스미드일 수 있다.
플라스미드는 또한 조절 서열을 포함할 수 있고, 이는 플라스미드가 투여되는 세포에서 유전자 발현에 매우 적합할 수 있다. 암호 서열은 숙주 세포에서 암호 서열의 보다 효율적인 전사를 가능하게 할 수 있는 코돈을 포함할 수 있다.
암호 서열은 또한 Ig 리더 서열을 포함할 수 있다. 리더 서열은 암호 서열의 5'일 수 있다. 이 서열에 의해 암호화된 공통 항원은 N-말단 Ig 리더, 그 다음 공통 항원 단백질을 포함할 수 있다. N-말단 Ig 리더는 IgE 또는 IgG일 수 있다.
플라스미드는 pSE420(인비트로젠사, 미국 캘리포니아주 샌디에이고 소재)일 수 있고, 이는 에쉐리키아 콜라이(Escherichia coli: E. coli)에서 단백질 생산을 위해 사용될 수 있다. 플라스미드는 또한 p YES2(인비트로젠사, 미국 캘리포니아주 샌디에이고 소재)일 수 있으며, 이는 효모의 사카로마이세스 세레비시애(Saccharomyces cerevisiae) 균주에서 단백질 생산을 위해 사용될 수 있다. 플라스미드는 또한 MAXBAC(상표명) 완전 바쿨로바이러스 발현 시스템(인비트로젠사, 미국 캘리포니아주 샌디에이고 소재)일 수 있고, 이는 곤충 세포에서 단백질 생산을 위해 사용될 수 있다. 플라스미드는 또한 pcDNA I 또는 pcDNA3(인비트로젠사, 미국 캘리포니아주 샌디에이고 소재)일 수 있고, 이는 포유동물 세포, 예컨대, 중국 햄스터 난소(CHO) 세포에서 단백질 생산을 위해서 사용될 수 있다.
벡터는 원형 플라스미드일 수 있고, 이는 세포 게놈 내로의 통합에 의해 표적 세포를 형질전환시키거나 염색체외(예를 들어, 복제 기원이 있는 자가 복제 플라스미드)로 존재할 수 있다.
벡터는 pVAX, pcDNA3.0 또는 provax 또는 항원을 암호화하는 DNA를 발현할 수 있고, 세포가 면역계에 의하여 인식된 항원에 대한 서열을 번역하게 하는 임의의 다른 발현 벡터일 수 있다.
또한 선형 핵산 백신 또는 선형 발현 카세트("LEC")가 본 명세서에 제공되며, 이는 전기천공을 통해 대상체에 효율적으로 전달될 수 있고, 하나 이상의 목적하는 항원을 발현할 수 있다. LEC는 임의의 포스페이트 골격이 없는 임의의 선형 DNA일 수 있다. DNA는 하나 이상의 항원을 암호화할 수 있다. LEC는 프로모터, 인트론, 정지 코돈 및/또는 폴리아데닐화 신호를 함유할 수 있다. 항원의 발현은 프로모터에 의해서 제어될 수 있다. LEC는 임의의 항생제 내성 유전자 및/또는 포스페이트 골격을 함유하지 않을 수 있다. LEC는 목적하는 항원 발현에 관련되지 않은 다른 핵산 서열을 함유하지 않을 수 있다.
LEC는 선형화될 수 있는 임의의 플라스미드로부터 유래될 수 있다. 플라스미드는 항원을 발현할 수 있다. 플라스미드는 pNP(푸에르토리코/34) 또는 pM2(뉴칼레도니아/99)일 수 있다. 플라스미드는 WLV009, pVAX, pcDNA3.0, 또는 provax 또는 항원을 암호화하는 DNA를 발현할 수 있고, 세포가 면역계에 의해서 인식된 항원에 대한 서열을 번역하게 하는 임의의 다른 발현 벡터일 수 있다.
LEC는 pcrM2일 수 있다. LEC는 pcrNP일 수 있다. pcrNP 및 pcrMR은 각각 pNP(푸에르토리코/34) 및 pM2(뉴칼레도니아/99)로부터 유래될 수 있다.
벡터는 프로모터를 가질 수 있다. 프로모터는 유전자 발현을 구동할 수 있고, 단리된 핵산의 발현을 조절할 수 있는 임의의 프로모터일 수 있다. 이러한 프로모터는 DNA 의존적 RNA 폴리머라아제를 통해 본 명세서에 기술된 항원 서열을 전사하는 전사에 요구되는 시스-작용 서열 요소이다. 이종 핵산의 직접적인 발현에 사용되는 프로모터의 선택은 특정 적용에 따라 달라진다. 프로모터는 이것이 그 자연 설정에서 전사 시작 부위로부터 유래되기 때문에, 벡터에서 전사 시작으로부터 대략 동일한 거리에 배치될 수 있다. 그러나 이러한 거리의 변화가 프로모터의 기능의 손실 없이 수용될 수 있다.
프로모터는 항원 및 전사물, 리보솜 결합 부위 및 번역 종결의 효과적인 폴리아데닐화를 위해서 요구되는 신호를 암호화하는 핵산 서열에 작동 가능하게 연결될 수 있다.
프로모터는 CMV 프로모터, SV40 초기 프로모터, SV40 후기 프로모터, 메탈로티오네인 프로모터, 뮤린 유방 종양 바이러스 프로모터, 라우스 육종 바이러스 프로모터, 폴리헤드린 프로모터, 또는 진핵 세포에서의 발현에 효과적인 것으로 나타난 또 다른 프로모터일 수 있다.
벡터는 인핸서 및 기능적 스플라이스 공여체 및 수용체 부위를 갖는 인트론을 포함할 수 있다. 벡터는 효율적인 종결을 제공하기 위해서 구조적 유전자의 하류에 전사 종결 영역을 함유할 수 있다. 종결 영역은 프로모터 서열과 동일한 유전자로부터 수득될 수 있거나, 상이한 유전자로부터 수득될 수 있다.
벡터의 제조 방법
본 명세서에는 본 명세서에 논의된 합성 공통 서바이빈 항원-암호화 핵산 분자를 포함하는 벡터의 제조 방법이 제공된다. 벡터는, 최종 서브클로닝 단계 후, 당업계에 공지된 방법을 사용하여, 대규모 발효 탱크 내에서 세포 배양물을 접종시키는데 사용될 수 있다.
하기에 보다 자세하게 기재된 EP 장치와 함께 사용하기 위한 벡터는 공지된 장치 및 기술의 조합을 사용하여 제형화되거나 제조될 수 있지만, 바람직하게는 이들은 미국 가출원 제60/939,792호(출원일 2007년 5월 23일)에 기재된 최적화된 플라스미드 제조 기술을 사용하여 제조된다(예를 들어, 미국 특허 공개 제20090004716호 참고). 일부 예에서, 이들 연구에 사용된 DNA 벡터는 10㎎/㎖ 이상의 농도로 제형화될 수 있다. 제조 기술은 또한 미국 시리얼 번호 60/939792에 기재된 것에 더하여, 2007년 7월 3일자로 등록된 미국 특허 제7,238,522호에 기재된 것을 포함하는 당업자에게 일반적으로 공지된 다양한 장치 및 프로토콜을 포함하거나 혼입한다. 상기에 참조된 출원 및 특허, 미국 시리얼 번호 60/939,792 및 미국 특허 제7,238,522호는 각각 전문이 본 명세서에 포함된다.
백신의 부형제 및 다른 성분
백신은 약제학적으로 허용 가능한 부형제를 추가로 포함할 수 있다. 약제학적으로 허용 가능한 부형제는 기능성 분자, 예컨대, 비히클, 담체 또는 희석제일 수 있다. 약제학적으로 허용 가능한 부형제는 형질주입 촉진제일 수 있고, 이는 표면 활성제, 예컨대 면역-자극 복합체(ISCOMS), 프로인트 불완전 아주반트(Freunds incomplete adjuvant), 모노포스포릴 지질 A, 무라밀 펩타이드, 퀴논 유사체, 소포체, 예컨대, 스쿠알렌 및 스쿠알렌, 히알루론산, 지질, 리포솜, 칼슘 이온, 바이러스 단백질, 다음이온, 다양이온 또는 나노입자를 포함하는 LPS 유사체, 또는 다른 공지된 형질주입 촉진제를 포함할 수 있다.
형질주입 촉진제는 폴리-L-글루타메이트(LGS) 또는 지질을 포함하는, 다음이온, 다양이온이다. 형질주입 촉진제는 폴리-L-글루타메이트이고, 폴리-L-글루타메이트는 6㎎/㎖ 미만의 농도로 백신에 존재할 수 있다. 형질주입 촉진제는 또한 표면 활성제, 예컨대, 면역-자극 복합체(ISCOMS), 프로인트 불완전 아주반트, LPS 유사체, 예컨대, 모노포스포릴 지질 A, 뮤라밀 펩타이드, 퀴논 유사체 및 소포, 예컨대, 스쿠알렌을 포함할 수 있고, 스쿠알렌 및 히알루론산이 또한 유전자 작제물과 함께 투여될 수 있다. DNA 벡터 백신은 또한 형질주입 촉진제, 예컨대, 지질, 리포솜, 예컨대, 레시틴 리포솜 또는 DNA-리포솜 혼합물(예를 들어, W09324640 참고)로서 당업계에 공지된 리포솜, 칼슘 이온, 바이러스 단백질, 다음이온, 다양이온 또는 나노입자 또는 다른 공지된 형질주입촉진제를 포함할 수 있다. 형질주입 촉진제는 폴리-L-글루타메이트(LGS) 또는 지질을 포함하는, 다음이온, 다양이온이다. 백신에서 형질주입제의 농도는 4㎎/㎖ 미만, 2㎎/㎖ 미만, 1㎎/㎖ 미만, 0.750㎎/㎖ 미만, 0.500㎎/㎖ 미만, 0.250㎎/㎖ 미만, 0.100㎎/㎖ 미만, 0.050㎎/㎖ 미만, 또는 0.010㎎/㎖ 미만이다.
약제학적으로 허용 가능한 부형제는 1종 이상의 아주반트일 수 있다. 아주반트는 대안적인 벡터에서 발현되거나, 백신 내의 벡터와 조합된 단백질로서 전달되는 다른 유전자일 수 있다. 1종 이상의 아주반트는 하기로 이루어진 군으로 선택될 수 있다: CCL20, α-인터페론(IFN-α), β-인터페론(IFN-β), γ-인터페론, 혈소판 유래된 성장 인자(PDGF), TNFα, TNFβ, GM-CSF, 표피 성장 인자(EGF), 피부 T 세포-유인 케모카인(CTACK), 상피 흉선-발현된 케모카인(TECK), 점막-연관된 상피 케모카인(MEC), IL-12, IL-15, IL-28, MHC, CD80, CD86, IL-l, IL-2, IL-4, IL-5, IL-6, IL-10, IL-18, IL-33, MCP-1, MIP-la, MIP-1~, IL-8, L-셀렉틴, P-셀렉틴, E-셀렉틴, CD34, GlyCAM-1, MadCAM-1, LFA-1, VLA-1, Mac-1, pl50.95, PECAM, ICAM-1, ICAM-2, ICAM-3, CD2, LFA-3, M-CSF, G-CSF, IL-18의 돌연변이 형태, CD40, CD40L, 혈관 성장 인자, 섬유모세포 성장 인자, IL-7, 신경 성장 인자, 혈관 내피 성장 인자, Fas, TNF 수용체, Flt, Apo-1, p55, WSL-1, DR3, TRAMP, Apo-3, AIR, LARD, NGRF, DR4, DRS, KILLER, TRAIL-R2, TRICK2, DR6, 카파제 ICE, Fos, c-jun, Sp-1, Ap-1, Ap-2, p38, p65Rel, MyD88, IRAK, TRAF6, IkB, 비활성 NIK, SAP K, SAP-I, JNK, 인터페론 반응 유전자, NFkB, Bax, TRAIL, TRAILrec, TRAILrecDRC5, TRAIL-R3, TRAIL-R4, RANK, RANK LIGAND, Ox40, Ox40 LIGAND, NKG2D, MICA, MICB, NKG2A, NKG2B, NKG2C, NKG2E, NKG2F, TAPI, TAP2, 신호 서열 또는 상이한 신호 펩타이드, 예컨대, IgE로부터의 것이 결실되거나 선택적으로 이를 포함하는 신호 서열을 암호화하는 암호 서열 또는 상이한 신호 펩타이드, 예컨대, gE로부터의 것을 암호화하는 암호 서열을 갖는 IL-15, 및 이의 기능성 단편 또는 이들의 조합물. 아주반트는 IL-12, IL-15, IL-28, CTACK, TECK, 혈소판 유래 성장 인자(PDGF), TNFα, TNFβ, GM-CSF, 표피 성장 인자(EGF), IL-1, IL-2, IL-4, IL-5, IL-6, IL-10, IL-12, IL-18, 또는 이들의 조합물일 수 있다.
일부 실시형태에서 아주반트는 CCL-20, IL-12, IL-15, IL-28, CTACK, TECK, MEC 또는 RANTES로 이루어진 군으로부터 선택된 단백질을 암호화하는 1종 이상의 핵산 분자일 수 있다. IL-12 작제물 및 서열의 예는 PCT 출원 제PCT/US1997/019502호 및 대응 미국 출원 시리얼 번호 08/956,865, 및 미국 가출원 제61/569600호(출원일 2011년 12월 12일)에 개시되어 있고, 이들 각각은 본 명세서에 참조에 의해 포함된다. IL-15 작제물 및 서열의 예는 PCT 출원 제PCT/US04/18962호 및 대응 미국 출원 제10/560,650호 및 PCT 출원 제PCT/US07/00886호 및 대응 미국 출원 제12/160,766호 및 PCT 출원 제PCT/US10/048827호에 개시되어 있고, 이들 각각은 본 명세서에 참조에 의해 포함된다. IL-28 작제물 및 서열의 예는 PCT 출원 제PCT/US09/039648호 및 대응 미국 출원 제12/936,192호에 개시되어 있고, 이들 각각은 본 명세서에 참조에 의해 포함된다. RANTES 및 다른 작제물 및 서열의 예는 PCT 출원 제PCT/US1999/004332호 및 대응 출원 제09/622452호에 개시되어 있고, 이들 각각은 본 명세서에 참조에 의해 포함된다. RANTES 작제물 및 서열의 다른 예는 PCT 출원 제PCT/US11/024098호에 개시되어 있고, 이들 각각은 본 명세서에 참조에 의해 포함된다. RANTES 및 다른 작제물 및 서열의 예는 PCT 출원 제PCT/US1999/004332호 및 대응 출원 제09/622452호에 개시되어 있고, 이들 각각은 본 명세서에 참조에 의해 포함된다. RANTES 작제물 및 서열의 다른 예는 PCT 출원 제PCT/US11/024098호에 개시되어 있고, 이들 각각은 본 명세서에 참조에 의해 포함된다. 케모카인 CTACK, TECK 및 MEC 작제물 및 서열의 예는 PCT 출원 제PCT/US2005/042231호 및 대응 출원 제11/719,646호에 개시되어 있고, 이들 각각은 본 명세서에 참조에 의해 포함된다. OX40 및 면역조절제의 예는 미국 출원 제10/560,653호에 개시되어 있고, 이들 각각은 본 명세서에 참조에 의해 포함된다. DR5 및 면역조절제의 예는 미국 출원 제09/622452호에 개시되어 있고, 이들 각각은 본 명세서에 참조에 의해 포함된다.
아주반트로 유용할 수 있는 다른 유전자는 하기를 암호화하는 것을 포함한다: MCP-1, MIP-la, MIP-1p, IL-8, RANTES, L-셀렉틴, P-셀렉틴, E-셀렉틴, CD34, GlyCAM-1, MadCAM-1, LFA-1, VLA-1, Mac-1, pl50.95, PECAM, ICAM-1, ICAM-2, ICAM-3, CD2, LFA-3, M-CSF, G-CSF, IL-4, IL-18, CD40, CD40L, 혈관 성장 인자의 돌연변이 형태, 섬유모세포 성장 인자, IL-7, IL-22, 신경 성장 인자, 혈관 내피 성장 인자, Fas, TNF 수용체, Flt, Apo-1, p55, WSL-1, DR3, TRAMP, Apo-3, AIR, LARD, NGRF, DR4, DR5, KILLER, TRAIL-R2, TRICK2, DR6, 카파제 ICE, Fos, c-jun, Sp-1, Ap-1, Ap-2, p38, p65Rel, MyD88, IRAK, TRAF6, IkB, 비활성 NIK, SAP K, SAP-1, JNK, 인터페론 반응 유전자, NFkB, Bax, TRAIL, TRAILrec, TRAILrecDRC5, TRAIL-R3, TRAIL-R4, RANK, RANK LIGAND, Ox40, Ox40 LIGAND, NKG2D, MICA, MICB, NKG2A, NKG2B, NKG2C, NKG2E, NKG2F, TAP1, TAP2 및 이의 기능성 단편.
백신은 참조에 의해 완전히 포함된 미국 출원 제021,579호(출원일 1994년 4월 1일)에 기재된 바와 같은 유전자 백신 촉진인자 작용제(genetic vaccine facilitator agent)를 추가로 포함할 수 있다.
백신은 플라스미드를 약 1나노그램 내지 100밀리그램; 약 1마이크로그램 내지 약 10밀리그램; 내지 바람직하게는 약 0.1마이크로그램 내지 약 10밀리그램; 또는 보다 바람직하게는 약 1밀리그램 내지 약 2밀리그램의 양으로 포함할 수 있다. 일부 바람직한 실시형태에서, 본 발명에 따른 백신은 약 5나노그램 내지 약 1000마이크로그램의 DNA를 포함한다. 일부 바람직한 실시형태에서, 백신은 약 10나노그램 내지 약 800마이크로그램의 DNA를 함유할 수 있다. 일부 바람직한 실시형태에서, 백신은 약 0.1나노그램 내지 약 500마이크로그램의 DNA를 함유할 수 있다. 일부 바람직한 실시형태에서, 백신은 약 1나노그램 내지 약 350마이크로그램의 DNA를 함유할 수 있다. 일부 바람직한 실시형태에서, 백신은 약 25 내지 약 250마이크로그램, 약 100 내지 약 200마이크로그램, 약 1나노그램 내지 100밀리그램; 약 1마이크로그램내지 약 10밀리그램; 약 0.1마이크로그램 내지 약 10밀리그램; 약 1밀리그램 내지 약 2밀리그램, 약 5나노그램 내지 약 1000마이크로그램, 약 10나노그램 내지 약 800마이크로그램, 약 0.1 내지 약 500마이크로그램, 약 1 내지 약 350마이크로그램, 약 25 내지 약 250마이크로그램, 약 100 내지 약 200마이크로그램의 항원 또는 이를 암호화하는 플라스미드를 함유할 수 있다.
백신은 사용될 투여 모드에 따라서 제형화될 수 있다. 주사 가능한 백신 약제학적 조성물은 멸균, 무발열원 및 무미립자일 수 있다. 등장성 제형 또는 용액이 사용될 수 있다. 등장성을 위한 첨가제는 염화나트륨, 덱스트로스, 만니톨, 솔비톨 및 락토스를 포함할 수 있다. 백신은 혈관수축제를 포함할 수 있다. 등장성 용액은 인산염 완충 염수를 포함할 수 있다. 백신은 젤라틴 및 알부민을 비롯한 안정화제를 추가로 포함할 수 있다. LGS 또는 다양이온 또는 다음이온을 비롯한, 안정화제는 제형이 연장된 시간 기간 동안 실온 또는 주변 온도에서 안정적이도록 할 수 있다.
백신의 약제학적 조성물
백신은 약제학적 조성물의 형태로 존재할 수 있다. 약제학적 조성물은 백신을 포함할 수 있다. 약제학적 조성물은 약 5나노그램(ng) 내지 약 10밀리그램(㎎)의 백신의 핵산 분자(들)를 포함할 수 있다. 일부 실시형태에서, 본 발명에 따른 약제학적 조성물은 약 25ng 내지 약 5㎎의 백신의 핵산 분자(들)를 포함한다. 일부 실시형태에서, 약제학적 조성물은 약 50ng 내지 약 1㎎의 백신의 핵산 분자(들)를 함유한다. 일부 실시형태에서, 약제학적 조성물은 약 0.1 내지 약 500마이크로그램의 백신의 핵산 분자(들)를 함유한다. 일부 실시형태에서, 약제학적 조성물은 약 1 내지 약 350마이크로그램의 백신의 핵산 분자(들)를 함유한다. 일부 실시형태에서, 약제학적 조성물은 약 5 내지 약 250마이크로그램의 백신의 핵산 분자(들)를 함유한다. 일부 실시형태에서, 약제학적 조성물은 약 10 내지 약 200마이크로그램의 백신의 핵산 분자(들)를 함유한다. 일부 실시형태에서, 약제학적 조성물은 약 15 내지 약 150마이크로그램의 백신의 핵산 분자(들)를 함유한다. 일부 실시형태에서, 약제학적 조성물은 약 20 내지 약 100마이크로그램의 백신의 핵산 분자(들)를 함유한다. 일부 실시형태에서, 약제학적 조성물은 약 25 내지 약 75마이크로그램의 백신의 핵산 분자(들)를 함유한다. 일부 실시형태에서, 약제학적 조성물은 약 30 내지 약 50마이크로그램의 백신의 핵산 분자(들)를 함유한다. 일부 실시형태에서, 약제학적 조성물은 약 35 내지 약 40마이크로그램의 백신의 핵산 분자(들)를 함유한다. 일부 실시형태에서, 약제학적 조성물은 약 100 내지 약 200마이크로그램의 백신의 핵산 분자(들)를 함유한다. 일부 실시형태에서, 약제학적 조성물은 약 10마이크로그램 내지 약 100마이크로그램의 백신의 핵산 분자(들)를 포함한다. 일부 실시형태에서, 약제학적 조성물은 약 20마이크로그램 내지 약 80마이크로그램의 백신의 핵산 분자(들)를 포함한다. 일부 실시형태에서, 약제학적 조성물은 약 25마이크로그램 내지 약 60마이크로그램의 백신의 핵산 분자(들)를 포함한다. 일부 실시형태에서, 약제학적 조성물은 약 30ng 내지 약 50마이크로그램의 백신의 핵산 분자(들)를 포함한다. 일부 실시형태에서, 약제학적 조성물은 약 35ng 내지 약 45마이크로그램의 백신의 핵산 분자(들)를 포함한다. 일부 바람직한 실시형태에서, 약제학적 조성물은 약 0.1 내지 약 500마이크로그램의 백신의 핵산 분자(들)를 함유한다. 일부 바람직한 실시형태에서, 약제학적 조성물은 약 1 내지 약 350마이크로그램의 백신의 핵산 분자(들)를 함유한다. 일부 바람직한 실시형태에서, 약제학적 조성물은 약 25 내지 약 250마이크로그램의 백신의 핵산 분자(들)를 함유한다. 일부 바람직한 실시형태에서, 약제학적 조성물은 약 100 내지 약 200마이크로그램의 백신의 핵산 분자(들)를 함유한다.
일부 실시형태에서, 본 발명에 따른 약제학적 조성물은 적어도 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95 또는 100ng의 백신의 핵산 분자(들)를 포함한다. 일부 실시형태에서, 약제학적 조성물은 적어도 1, 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95,100, 105, 110, 115, 120, 125, 130, 135, 140, 145, 150, 155, 160, 165, 170, 175, 180, 185, 190, 195, 200, 205, 210, 215, 220, 225, 230, 235, 240, 245, 250, 255, 260, 265, 270, 275, 280, 285, 290, 295, 300, 305, 310, 315, 320, 325, 330, 335, 340, 345, 350, 355, 360, 365, 370, 375, 380, 385, 390, 395, 400, 405, 410, 415, 420, 425, 430, 435, 440, 445, 450, 455, 460, 465, 470, 475, 480, 485, 490, 495, 500, 605, 610, 615, 620, 625, 630, 635, 640, 645, 650, 655, 660, 665, 670, 675, 680, 685, 690, 695, 700, 705, 710, 715, 720, 725, 730, 735, 740, 745, 750, 755, 760, 765, 770, 775, 780, 785, 790, 795, 800, 805, 810, 815, 820, 825, 830, 835, 840, 845, 850, 855, 860, 865, 870, 875, 880, 885, 890, 895. 900, 905, 910, 915, 920, 925, 930, 935, 940, 945, 950, 955, 960, 965, 970, 975, 980, 985, 990, 995 또는 1000마이크로그램의 백신의 핵산 분자(들)를 포함할 수 있다. 일부 실시형태에서, 약제학적 조성물은 적어도 1.5, 2, 2.5, 3, 3.5, 4, 4.5, 5, 5.5, 6, 6.5, 7, 7.5, 8, 8.5, 9, 9.5 또는 10㎎ 이상의 백신의 핵산 분자(들)를 포함할 수 있다.
다른 실시형태에서, 약제학적 조성물은 최대 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95 또는 100ng(이들 값 포함)의 백신의 핵산 분자(들)를 포함할 수 있다. 일부 실시형태에서, 약제학적 조성물은 최대 1, 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95,100, 105, 110, 115, 120, 125, 130, 135, 140, 145, 150, 155, 160, 165, 170, 175, 180, 185, 190, 195, 200, 205, 210, 215, 220, 225, 230, 235, 240, 245, 250, 255, 260, 265, 270, 275, 280, 285, 290, 295, 300, 305, 310, 315, 320, 325, 330, 335, 340, 345, 350, 355, 360, 365, 370, 375, 380, 385, 390, 395, 400, 405, 410, 415, 420, 425, 430, 435, 440, 445, 450, 455, 460, 465, 470, 475, 480, 485, 490, 495, 500, 605, 610, 615, 620, 625, 630, 635, 640, 645, 650, 655, 660, 665, 670, 675, 680, 685, 690, 695, 700, 705, 710, 715, 720, 725, 730, 735, 740, 745, 750, 755, 760, 765, 770, 775, 780, 785, 790, 795, 800, 805, 810, 815, 820, 825, 830, 835, 840, 845, 850, 855, 860, 865, 870, 875, 880, 885, 890, 895. 900, 905, 910, 915, 920, 925, 930, 935, 940, 945, 950, 955, 960, 965, 970, 975, 980, 985, 990, 995 또는 1000마이크로그램(이들 값 포함)의 백신의 핵산 분자(들)를 포함할 수 있다. 일부 약제학적 조성물은 최대 1.5, 2, 2.5, 3, 3.5, 4, 4.5, 5, 5.5, 6, 6.5, 7, 7.5, 8, 8.5, 9, 9.5 또는 10㎎(이들 값 포함)의 실시형태에서, 백신의 핵산 분자(들)를 포함할 수 있다.
약제학적 조성물은 사용될 투여 모드에 따른 제형 목적을 위해서 다른 작용제를 추가로 포함할 수 있다. 약제학적 조성물이 주사 가능한 약제학적 조성물인 경우, 이것은 멸균, 무발열원 무미립자이다. 등장성 제형이 바람직하게 사용된다. 일반적으로, 등장성을 위한 첨가제는 염화나트륨, 덱스트로스, 만니톨, 솔비톨 및 락토스를 포함할 수 있다. 일부 경우에, 등장성 용액, 예컨대, 인산염 완충 염수가 바람직하다. 안정화제는 젤라틴 및 알부민을 포함한다. 일부 실시형태에서, 혈관수축제가 제형에 첨가된다.
약제학적 조성물은 섹션 2에 상기에 제공된 바와 같은 약제학적으로 허용 가능한 부형제를 추가로 포함할 수 있다. 예를 들어, 약제학적으로 허용 가능한 부형제는 섹션 2에 제공된 바와 같은 기능성 분자, 비히클, 아주반트, 담체, 희석제 또는 형질주입 촉진제를 포함할 수 있다.
적응증
본 명세서에 제공된 백신 및 백신을 포함하는 약제학적 조성물은 서바이빈을 발현하는 암 세포 및 암-기반 종양의 치료 또는 예방에 사용될 수 있다. 특히, 본 명세서에 제공된 백신 및 백신을 포함하는 약제학적 조성물은 난소암, 보다 특별하게는 상피 난소암, 가장 특별하게는 장액성 난소암의 치료 또는 예방에 사용될 수 있다.
백신접종 방법
본 명세에는 상기에 기재된 약제학적 제형을 사용하여 암을 치료 및/또는 예방하는 방법이 제공된다. 또한 본 명세서에는 대상체에서 암의 치료 및/또는 예방에서 상기에 기재된 약제학적 제형을 사용하는 방법이 기재된다. 또한 본 명세서에는 대상체를 백신접종시키는 방법이 기재된다. 또한 본 명세서에는 하기를 필요로 하는 대상체에게 본 명세서에 기재된 약제학적 제형을 투여하는 방법이 기재된다. 본 명세서에 기재된 약제학적 제형을 사용하는 치료 방법으로서 총괄적으로 지칭되는 본 명세서에 기재된 방법은 이를 필요로 하는 대상체에게 본 명세서에 기재된 바와 같은 1종 이상의 백신을 투여하여 치료 및/또는 예방 면역 반응을 유도하는 단계를 포함할 수 있다. 백신은 대상체의 면역계의 활성을 조절하고, 면역 반응을 향상시키기 위해서 대상체에게 투여될 수 있다. 백신의 투여는 면역계가 세포, 체액 또는 세포 및 체액 반응을 인식하고, 유도할 때, 세포에서 발현되고, 세포의 표면에 전달되는 핵산 분자로서 본 명세서에 개시된 바와 같은 암 항원의 형질주입일 수 있다. 백신의 투여를 사용하여 대상체에게 본 명세서에 논의된 바와 같은 백신을 투여함으로써 대상체에서 본 명세서에 개시된 바와 같은 암 항원 중 1종 이상에 대해서 면역 반응을 유도 또는 도출할 수 있다.
백신을 대상체에게 투여하여 대상체의 면역계의 활성을 조절함으로써, 면역 반응을 향상시킬 수 있다. 일부 실시형태에서, 대상체는 포유동물이다. 포유동물에게 백신을 투여함으로써 포유동물의 세포에 벡터를 도입할 때, 형질주입된 세포는 본 명세서에 개시된 바와 같은 암 항원 중 1종 이상을 발현 및 분비할 것이다. 이들 분비된 단백질 또는 합성 항원은 1종 이상의 암 항원에 대해서 제조된 항체 및 구체적으로 1종 이상의 암 항원에 대한 T-세포 반응을 포함할 수 있는 면역 반응을 가질, 면역계에 의해서 외부물질로서 인식될 것이다. 일부 예에서, 본 명세서에 논의된 백신으로 백신접종된 포유동물은 프라이밍된 면역계를 가질 것이고, 본 명세서에 개시된 바와 같은 1종 이상의 암 항원으로 시험감염되는 경우, 프라이밍된 면역계는, 체액 면역 반응이든 또는 세포 면역 반응이든 또는 세포 면역 반응과 체액 면역 반응 둘 이든 간에, 본 명세서에 논의된 바와 같은 후속 암 항원의 신속한 제거를 허용할 것이다.
백신의 DNA를 투여하는 방법은 미국 특허 제4,945,050호 및 제5,036,006호에 기재되어 있고, 이들 둘 다는 전문이 참조에 의해 본 명세서에 포함된다.
백신은 포유동물에게 투여되어 포유동물에서 면역 반응을 도출할 수 있다. 포유동물은 인간, 비인간 영장류, 소, 돼지, 양, 염소, 영양, 들소, 물소, 들소, 소과, 사슴, 고슴도치, 코끼리, 라마, 알파카, 마우스, 래트, 바람직하게는 인간, 소 또는 돼지일 수 있다. 백신은 마찬가지로 비-포유동물 대상체, 예를 들어, 닭에게 투여되어 면역 반응을 도출할 수 있다.
백신 용량은 시간당 체중 킬로그램(㎏)당 활성 성분 1마이크로그램 내지 10㎎(성분/㎏ 체중/시간)일 수 있고, 20마이크로그램 내지 10㎎ 성분/㎏ 체중/시간일 수 있다. 백신은 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30 또는 31일마다 투여될 수 있다. 효과적인 치료를 위한 백신 용량의 횟수는 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10회 이상의 용량일 수 있다.
백신을 사용하여 면역 반응을 생성시키는 방법
백신은 포유동물 또는 비-포유동물 대상체에서 치료 또는 예방 면역 반응을 비롯한, 면역 반응을 생성시키기 위해서 사용될 수 있다. 면역 반응은 본 명세서에 개시된 바와 같은 1종 이상의 암 항원에 지향되는 항체를 생성시키고/시키거나 T 세포를 사멸시킬 수 있다. 이러한 항체 및 T 세포는 단리될 수 있다.
일부 실시형태는 본 명세서에 개시된 바와 같은 암 항원 중 1종 이상에 대해서 면역 반응을 생성시키는 방법을 제공하며, 이 실시형태는 백신을 대상체에게 투여하는 단계를 포함한다. 일부 실시형태는 상기에 기재된 바와 같은 암 항원 중 1종 이상을 발현하는 암 또는 종양에 대해서 대상체를 예방적으로 백신접종시키는 방법을 제공하며, 이 실시형태는 백신을 투여하는 단계를 포함한다. 일부 실시형태는 암 항원 중 1종 이상을 발현하는 암 또는 종양을 앓고 있는 대상체를 치료적으로 백신접종시키는 방법을 제공하며, 이 실시형태는 백신을 투여하는 단계를 포함한다. 백신의 투여 전에 본 명세서에 개시된 바와 같은 1종 이상의 암 항원을 발현하는 암 또는 종양의 진단은 일상적으로 수행될 수 있다.
백신을 사용하여 암을 치료하는 방법
백신을 필요로 하는 포유동물 또는 대상체의 서바이빈-발현 암 또는 종양(예를 들어, 난소암)에 반응성이거나 이에 지향되는 백신을 사용하여 포유동물에서 면역 반응을 생성시키거나 도출할 수 있다. 도출된 면역 반응은 암 또는 종양 성장을 예방할 수 있다.
도출된 면역 반응은 암성 또는 종양 세포의 전이를 예방 및/또는 감소시킬 수 있다. 따라서, 백신은 백신이 투여되는 포유동물 또는 대상체에서 암 또는 종양을 치료 및/또는 예방하는 방법에 사용될 수 있다.
투여 경로
백신 또는 약제학적 조성물은, 경구, 비경구, 설하, 경피, 직장, 경점막, 국소, 흡입을 통해서, 협측 투여를 통해서, 흉막내, 정맥내, 동맥내, 복강내, 피하, 근육내, 비강내, 척추강내 및/또는 관절내 또는 이들의 조합에 의해서 투여될 수 있다. 수의과 용도를 위해서, 조성물은 일반적인 수의과 실시에 따라서 적합하게 허용 가능한 제형으로서 투여될 수 있다. 수의사는 특정 동물에 대해서 가장 적절한 투여 요법 및 투여 경로를 쉽게 결정할 수 있다. 백신은 전통적 주사기, 무침 주사 장치, "미세투사 충격 유전자 총(microprojectile bombardment gene gun)" 또는 전기천공("EP"), "유체역학적 방법", 또는 초음파에 의해서 투여될 수 있다.
백신은 생체내 전기천공을 사용 및 사용하지 않은 DNA 주사(또한 DNA 백신이라고도 불림), 리포솜 매개된 형질주입, 나노입자 촉진된 형질주입 및 재조합 벡터, 예컨대, 재조합 아데노바이러스, 재조합 아데노바이러스 연관된 바이러스 및 재조합 백시니아를 포함하는 널리 알려진 몇몇 기술에 의해 포유동물에게 투여될 수 있다. 백신의 1종 이상의 암 항원은 생체내 전기천공과 함께 DNA 주사를 통해서 투여될 수 있다.
백신 또는 백신을 포함하는 약제학적 조성물은 전기천공에 의해서 투여될 수 있다. 전기천공을 통한 백신의 투여는 가역적 기공이 세포막에 형성되게 하는데 효과적인 에너지의 펄스를 포유동물의 목적하는 조직에 전달하도록 구성될 수 있는 전기천공 장치를 이용하여 달성될 수 있고, 바람직하게는 에너지의 펄스는 사용자에 의한 사전 설정된 전류 입력값과 유사한 정전류이다. 전기천공 장치는 전기천공 성분 및 전극 어셈블리 또는 핸들 어셈블리를 포함할 수 있다. 전기천공 성분은 컨트롤러, 전류 파형 생성기, 임피던스 시험기, 파형 로거(logger), 입력 요소, 상태 보고 요소, 통신 포트, 메모리 성분, 전원 및 전력 스위치를 포함하는 전기천공 장치의 다양한 요소 중 하나 또는 그 이상을 포함 및 혼입할 수 있다. 전기천공은 생체내 전기천공 장치, 예를 들어, CELLECTRA(등록상표) EP 시스템(이노비오 파마슈티컬즈사(Inovio Pharmaceuticals, Inc.), 미국 펜실베이니아주 블루 벨 소재) 또는 Elgen 전기천공기(이노비오 파마슈티컬즈사)를 사용하여 달성되어 벡터에 의한 세포의 형질주입을 촉진시킬 수 있다.
본 발명의 DNA 백신의 투여를 촉진할 수 있는 전기천공 장치 및 전기천공 방법의 예시는, 미국 특허 제7,245,963호(Draghia-Akli 등), 미국 특허 공개 제2005/0052630호(Smith 등)에 기재된 것을 포함하며, 이들의 내용은 전문이 참조에 의해 본 명세서에 포함된다. DNA 백신의 투여를 촉진시키는 데 사용될 수 있는 다른 전기천공 장치 및 전기천공 방법은, 미국 가출원 제60/852,149호(2006년 출원일 10월 17일) 및 제60/978,982호(2007넌 10월 10일)에 대한 35 USC 119(e) 하의 이익을 주장하는, 공동 계류 중이고, 공동 소유인 미국 출원 제11/874072호(출원일 2007년 10월 17일)에 제공된 것을 포함하며, 이들 모두는 전문이 포함된다.
미국 특허 제7,245,963호(Draghia-Akli 등)는 신체 또는 식물에서 선택된 조직의 세포 내로의 생체분자의 도입을 용이하게 하기 위한 모듈식 전극 시스템 및 이의 용도를 기재한다. 모듈식 전극 시스템은 복수의 니들 전극; 피하 니들; 프로그래밍 가능한 정전류 펄스 컨트롤러로부터 복수의 니들 전극까지 전도성 링크를 제공하는 전기 커넥터; 및 전원을 포함할 수 있다. 작동자는 지지 구조 상에 장착된 복수의 니들 전극을 붙잡아 신체 또는 식물에서 선택된 조직 내로 이들을 단단하게 삽입할 수 있다. 이어서 생체분자는 선택된 조직 내로의 피하 니들을 통해 투여된다. 프로그래밍 가능한 정전류 펄스 컨트롤러가 활성화되고, 정전류 전기 펄스가 복수의 니들 전극에 적용된다. 적용된 정전류 전기 펄스는 복수의 전극 사이에 있는 세포 내로 생체분자의 도입을 촉진한다. 미국 특허 제7,245,963호의 전체 내용은 본 명세서에 참조에 의해 포함된다.
미국 특허 공개 제2005/0052630호(Smith 등에 의해서 제출됨)는 신체 또는 식물에서 선택된 조직의 세포 내로의 생체분자의 도입을 효과적으로 촉진하는데 사용될 수 있는 전기천공 장치를 기술한다. 전기천공 장치는 작업이 소프트웨어 또는 펌웨어에 의해 명시되는 전기-동력학 장치("EKD 장치")를 포함한다. EKD 장치는 사용자 제어 및 펄스 파라미터의 입력에 기초한 어레이 내의 전극 사이에 일련의 프로그래밍 가능한 정전류 펄스 패턴을 생성하고, 전류 파형 데이터의 저장 및 획득을 허용한다. 전기천공 장치는 또한 니들 전극, 주사 니들용 중앙 주사 채널 및 제거 가능한 가이드 디스크의 어레이를 갖는 교체 가능한 전극 디스크를 포함한다. 미국 특허 공개 제2005/0052630호의 전체 내용은 본 명세서에 참조에 의해 완전히 포함된다.
미국 특허 제7,245,963호 및 미국 공개 제2005/0052630호에 기재된 전극 어레이 및 방법은 근육과 같은 조직뿐만 아니라 다른 조직 또는 기관 내로 깊이 침투하기 위하여 조정될 수 있다. 전극 어레이의 구성으로 인해서, 주사 니들은 또한 표적 기관 내로 완전히 삽입되며, 주사는 전극에 의해 미리 열거된 영역 내에서, 표적 조직에 수직으로 투여된다. 미국 특허 제7,245,963호 및 미국 공개 제2005/005263호에 기재된 전극은 바람직하게는 20㎜ 길이 및 21게이지이다.
추가로, 전기천공 장치 및 이의 용도를 포함하는 일부 실시형태에서, 하기 특허에 기재된 것인 전기천공 장치가 존재한다고 고려된다: 미국 특허 제5,273,525호(등록일 1993년 12월 28일); 미국 특허 제6,110,161호(등록일 2000년 8월 29일); 제6,261,281호(등록일 2001년 7월 17일); 제6,958,060호(등록일 2005년 10월 25일); 및 미국 특허 제6,939,862호(등록일 2005년 9월 6일). 추가로, 다양한 장치 중 임의의 것을 사용한 DNA의 투여에 관한 미국 특허 제6,697,669호(등록일 2004년 2월 24일) 및 DNA의 주사 방법이 도시된 미국 특허 제7,328,064호(등록일 2008년 2월 5일)에 제공된 주제를 포괄하는 특허가 본 명세서에서 고려된다. 상기 특허는 이들의 전문이 참조에 의해 포함된다.
본 명세서에는 본 명세서에 논의된 합성 공통 서바이빈 항원을 암호화하는 핵산 분자(들)를 포함하는 벡터의 제조 방법이 제공된다. 벡터는, 포유동물 발현 플라스미드 내로의 최종 서브클로닝 단계 후, 당업계에 공지된 방법을 사용하여, 대규모 발효 탱크 내에서 세포 배양물을 접종시키는데 사용될 수 있다.
본 발명의 EP 장치와 함께 사용하기 위한 DNA 벡터는 공지된 장치 및 기술의 조합을 사용하여 제형화 또는 제조될 수 있지만, 바람직하게는 이것은 미국 출원 공개 제20090004716호(출원일 2007년 5월 23일)에 기재된 최적화된 제조 기술을 사용하여 제조된다. 일부 예에서, 이들 연구에 사용된 DNA 벡터는 10㎎/㎖ 이상의 농도로 제형화될 수 있다. 제조 기술은 또한 미국 시리얼 번호 60/939792에 기재된 것에 더하여, 2007년 7월 3일자로 등록된 미국 특허 제7,238,522호에 기재된 것을 포함하는 당업자에게 일반적으로 공지된 다양한 장치 및 프로토콜을 포함하거나 혼입한다. 상기에 참조된 출원 및 특허, 미국 시리얼 번호 60/939,792 및 미국 특허 제7,238,522호는 각각 전문이 본 명세서에 포함된다.
실시예
본 발명을 하기 실시예에서 추가로 설명한다. 이들 실시예는, 본 발명의 바람직한 실시형태를 제시하면서, 단지 예시의 방식으로 제공된다. 상기 논의 및 이들 실시예로부터, 당업자는 본 발명의 본질적인 특징을 확인할 수 있고, 이의 사상 및 범주로부터 벗어나지 않고, 그것을 다양한 용법 및 조건에 대해서 개작시키기 위해서 본 발명을 다양하게 변화 및 변형시킬 수 있다. 따라서, 본 명세서에 나타내고 기재된 것에 더하여 본 발명의 다양한 개질이 상기 기재로부터 당업자에게 자명할 것이다. 이러한 개질은 또한 첨부된 청구범위의 범위 내에 포함되도록 의도된다.
실시예 1 - 공통 서바이빈 아이소폼 1의 생성
29개의 서바이빈 아이소폼 1 서열을 젠뱅크사로부터 수집하였다 (www.ncbi.nlm.nih.gov/genbank/). 선택된 서바이빈 아이소폼 1 서열에 대한 젠뱅크사 수탁 번호는 하기와 같다: NP_001125727.1, 3UIG, 1F3H, BAC22748.2, NP_001159.2, CAG46540.1, BAD97148.1, XP_002748841.1, XP_003818322.1, NP_001253110.1, XP_011810718.1, XP_011832690.1, XP_001083183.1, XP_003786134.1, XP_012516801.1, XP_007957800.1, XP_001915435.1, XP_008523102.1, AAT37504.1, XP_004432883.1, XP_003417277.1, XP_004374167.1, NP_999306.1, XP_002918421.1, NP_001003348.1, NP_001009280.1, XP_004748859.1, NP_001001855.2 및 AAU89275.1.
DNASTAR(등록상표) 레이저진(Lasergene) 소프트웨어 패키지(버전 13.0.0.357)를 사용하여 공통 서열을 생성시켰다. 상기에 열거된 29개의 서열을 MegAlign에 임포팅하여, ClustalW 다중 서열 정렬 프로그램을 사용하여 정렬하였다. 생성된 공통 서바이빈 아이소폼 1 서열은 네이티브 인간 서바이빈 아이소폼 1과 97.2 내지 97.9%의 상동성을 공유한다. 생성된 공통 서바이빈 아이소폼 1 단백질의 잠재적인 생물학적 기능을 폐지하기 위해서, 3개의 돌연변이를 도입하여 서바이빈의 항-아포토시스 활성을 폐지하였다. 3개의 돌연변이는 T34A, T48A 및 C84A이다. 추가로, 더 높은 발현 수준을 갖기 위해서, 상류 코작 서열 및 IgE 리더 서열을 N-말단에 부가하였다. 추가로, 이러한 유전자의 코돈 사용을 호모 사피엔스 유전자의 코돈 편향에 대해 개작하였다(Andre, S. et al. Increased immune response elicited by DNA vaccination with a synthetic gp120 sequence with optimized codon usage. Journal of virology 72, 1497-1503 (1998); Deml, L. et al. Multiple effects of codon usage optimization on expression and immunogenicity of DNA candidate vaccines encoding the human immunodeficiency virus type 1 Gag protein. Journal of virology 75, 10991-11001, doi:10.1128/JVI.75.22.10991-11001.2001 (2001)). 추가로, RNA 최적화를 또한 수행하였다: 매우 높은(80% 초과) 또는 매우 낮은(30% 미만) GC 함량의 영역 및 시스-작용 서열 모티프, 예컨대, 내부 TATA 박스, 카이-부위 및 리보솜 유입 부위가 회피되었다. 그 결과, 합성 공통 서바이빈 항원 아이소폼 1 단백질은 인간 네이티브 서바이빈 아이소폼 1 단백질과 95.1 내지 95.8% 동일성을 공유한다. 합성 공통 서바이빈 항원 아이소폼 1의 뉴클레오타이드 서열을 서열번호 1에 제시한다. 합성 공통 서바이빈 항원 아이소폼 1T3의 아미노산 서열을 서열번호 2에 제시한다.
합성 공통 서바이빈 항원 아이소폼 1을 BamHI 및 XhoI로 소화시켰고, 사이토메갈로바이러스 극-초기 프로모터의 전사 제어 하에 배치된 발현 카세트와 함께 등록 상표의 발현 벡터 pGX0001 내에 클로닝하였다. 생성된 플라스미드를 pGX1428이라고 지정하였다. 전장 서열결정을 수행하고, 이어서 분석하였고, 올바른 것으로 확인되었다. 합성 공통 서바이빈 항원 아이소폼 1 작제물의 개략도를 도 1에 도시한다. 합성 공통 서바이빈 항원 아이소폼 1의 전체 구조를 도 2에 도시한다.
Figure pct00001
Figure pct00002
실시예 2 - 공통 서바이빈 아이소폼 1T3의 생성
인간 공통 서바이빈 아이소폼 3, 8개의 서바이빈 아이소폼 3 서열을 젠뱅크사로부터 수집하였다(www.ncbi.nlm.nih.gov/genbank/). 선택된 서바이빈 아이소폼 3 서열에 대한 젠뱅크사 수탁 번호는 하기와 같다: NP_001012270.1, XP_008969790.1, XP_008011275.1, XP_009189614.1, XP_011897653.1, XP_011810642.1, XP_011844315.1, 및 XP_011718355.1.
DNASTAR(등록상표) 레이저진 소프트웨어 패키지(버전 13.0.0.357)를 사용하여 공통 서열을 생성시켰다. 상기에 열거된 8개의 서열을 MegAlign에 임포팅하여, ClustalW 다중 서열 정렬 프로그램을 사용하여 정렬하였다. 하등 동물로부터의 이들 서열 중 6개는 인간 서열에 존재하지 않는 C-말단 단부에 추가의 11개 아미노산 잔기를 함유하였다. 인간에서 오프-타깃 면역 반응 도출을 회피하기 위해서 공통 인간 서바이빈 아이소폼 3을 생성시킬 때 이러한 추가 잔기를 누락시켰다. 인간 공통 서바이빈 아이소폼 3을 생성시킨 후, 서바이빈 아이소폼 1과 3 간의 동일한 아미노산 서열을 공통 서바이빈 아이소폼 3으로부터 제거하였다. 절두된 공통 서바이빈 아이소폼 3 서열(서바이빈 항원 T3)은 네이티브 인간 서바이빈 아이소폼 T3 서열과 96.8%의 서열 상동성을 공유한다. 서바이빈 항원 1(상기에 기재됨)과 서바이빈 항원 T3 사이에 푸린 절단 부위를 첨가함으로써 서바이빈 항원 아이소폼 1T3 면역원을 생성시켰다.
공통 합성 공통 서바이빈 항원 아이소폼 1T3 DNA 서열이 수득되면, 더 높은 발현 수준을 갖기 위해서, 상류 코작 서열 및 IgE 리더 서열을 N-말단에 부가하였다(Yang, J. S. et al. Induction of potent Th1-type immune responses from a novel DNA vaccine for West Nile virus New York isolate (WNV-NY1999). The Journal of infectious diseases 184, 809-816, doi:10.1086/323395 (2001)). 추가로, 이러한 유전자의 코돈 사용을 호모 사피엔스 유전자의 코돈 편향에 대해 개작하였다(Andre, S. et al. Increased immune response elicited by DNA vaccination with a synthetic gp120 sequence with optimized codon usage. Journal of virology 72, 1497-1503 (1998); Deml, L. et al. Multiple effects of codon usage optimization on expression and immunogenicity of DNA candidate vaccines encoding the human immunodeficiency virus type 1 Gag protein. Journal of virology 75, 10991-11001, doi:10.1128/JVI.75.22.10991-11001.2001 (2001)). 추가로, RNA 최적화를 또한 수행하였다: 매우 높은(80% 초과) 또는 매우 낮은(30% 미만) GC 함량의 영역 및 시스-작용 서열 모티프, 예컨대, 내부 TATA 박스, 카이-부위 및 리보솜 유입 부위 11,12가 회피되었다. 합성 공통 서바이빈 항원 아이소폼 1T3을 BamHI 및 XhoI로 소화시켰고, 사이토메갈로바이러스 극-초기 프로모터의 전사 제어 하에 배치된 발현 카세트와 함께 발현 벡터 pGX0001 내에 클로닝하였다. 생성된 플라스미드를 pGX1429라고 지정하였다. 전장 서열결정을 수행하고, 이어서 분석하였고, 올바른 것으로 확인되었다. 합성 공통 서바이빈 항원 아이소폼 1T3의 뉴클레오타이드 서열을 표 1에 나타낸 바와 같이, 서열번호 3에 제시한다. 합성 공통 서바이빈 항원 아이소폼 1T3의 아미노산 서열을 표 1에 나타낸 바와 같이, 서열번호 8에 제시한다. 합성 공통 서바이빈 항원 아이소폼 1T3 작제물의 개략도를 도 3에 도시한다. 합성 공통 서바이빈 항원 아이소폼 1T3 작제물의 특징을 하기 표 3에 제공한다.
Figure pct00003
실시예 3 - pGX 서바이빈 발현 벡터의 작제
인간 사이토메갈로바이러스 극초기 프로모터(hCMV 프로모터)의 제어 하의 pGX0001(변형된 pVAX1 발현 벡터)을 골격 벡터로 사용하였다. 본래 pVAX1을 써모 피셔 사이언티픽사(Thermo Fisher Scientific)로부터 입수하였다.
pVAX1 내에 변형을 도입하여 pGX0001을 생성시켰는데, 이것은 써모피셔 사이언티픽사로부터 입수 가능한 pVAX1의 보고된 서열을 기초로 식별된다. 이러한 변형을 하기에 열거하며, 플라스미드 증폭 및 항원 전사 및 번역에 관련해서는 어떠한 문제도 검출되지 않았다. 골격으로서 pGX0001을 사용하는 플랫폼에서 플라스미드 생성물 중 어느 것에서도 지금까지 pGX0001의 서열에서 어떠한 추가 변화도 관찰되지 않았다.
변형 염기쌍 설명
C>G 241 CMV 프로모터에서
C>T 1158 골격, 소 성장 호르몬 폴리아데닐화 신 호(bGH polyA)의 하류
A> - 2092 골격, 카나마이신 내성 유전자의 하류
C>T 2493 pUC 복제 기원(pUC ori)에서
G>C 2969 RNASeH 부위의 상류에서 pUC Ori의 가장 단 부에서
염기쌍 2, 3 및 4를 CMV 프로모터의 상류에서, 골격 내에서 ACT에서 CTG로 변경한다.
pGX1428은 합성 공통 서바이빈 항원 아이소폼 1(서바이빈 항원 1) 단백질을 암호화하는 DNA 플라스미드이다. 관련 mRNA 생산은 인간 CMV 프로모터(hCMV 프로모터)에 의해서 유도되고, 소 성장 호르몬 3'-단부 폴리-아데닐화 신호(bGH polyA)에 의해서 종결된다. pGX0001 골격은 생산 목적을 위해서 카나마이신 내성 유전자(KanR) 및 플라스미드 복제 기원(pUC ori)을 포함한다. 이러한 요소는 진핵생물 세포에서는 기능성이 아니다. 도 4에 도시된 바와 같이, BamHI 및 XhoI 부위에서 합성 공통 서바이빈 항원 아이소폼 1(서바이빈 항원 1) DNA 서열을 pGX0001 내에 클로닝함으로써 pGX1428을 제조하였다.
pGX1429는 합성 공통 서바이빈 항원 1T3(서바이빈 항원 1T3) 단백질을 암호화하는 DNA 플라스미드이다. 관련 mRNA 생산은 인간 CMV 프로모터(hCMV 프로모터)에 의해서 유도되고, 소 성장 호르몬 3'-단부 폴리-아데닐화 신호(bGH polyA)에 의해서 종결된다. pGX0001 골격은 생산 목적을 위해서 카나마이신 내성 유전자(KanR) 및 플라스미드 복제 기원(pUC ori)을 포함한다. 이러한 요소는 진핵생물 세포에서는 기능성이 아니다. 도 5에 도시된 바와 같이, BamHI 및 XhoI 부위에서 합성 공통 서바이빈 항원 아이소폼 1T3(서바이빈 항원 1T3) DNA 서열을 pGX0001 내에 클로닝함으로써 pGX1429을 제조하였다.
실시예 4 - 합성 공통 서바이빈 항원 작제물의 면역원성
인간 서바이빈을 표적으로 하도록 설계된 백신 작제물인 합성 공통 서바이빈 항원 1(pGX1428) 및 합성 공통 서바이빈 항원 1T3(pGX1429)의 면역원성을 마우스에서 평가하였다. 각각의 작제물에 의한 항원 단백질의 발현을 또한 웨스턴 블로팅에 의해서 시험관내에서 평가하였다.
물질 및 방법
플라스미드
합성 공통 서바이빈 항원 1(pGX1428) 및 합성 공통 서바이빈 항원 1T3(pGX1429)을 본 명세서에 기재된 바와 같이 설계하였다. 시험관내 및 생체내 연구를 위해서, 플라스미드(10㎎)를 pGX1428(로트 번호 786114S-1/G52238) 및 pGX1429(로트 번호 786114S-2/G52239) 둘 다를 위해서 진스크립트사(GenScript)로부터 주문하였다. 10㎎ 플라스미드 스톡의 항원 서열을 생어 서열결정에 의해서 확인하였다.
시험관내 항원 발현
pGX1428 및 pGX1429에 의한 항원 단백질의 발현을 웨스턴 블로팅에 의해서 확인하였다. 도 6에 도시된 바와 같이, 10% FBS(써모피셔사)를 함유한 DMEM 배지 중에서 유지시킨 인간 횡문근육종(RD) 세포(ATCC, CCL-136)를 Turbofectin 8(오리진사(Origene))을 사용하여 pGX1428, pGX1429 또는 pGX0001(6㎍/10cm2 접시)로 형질주입하였다. 형질주입 48시간 후, 세포를 RIPA 세포 용해 완충액(써모피셔사)을 사용하여 용해시키고, 세포 용해물을 수집하였다. 총 단백질 농도를 결정하기 위한 BCA 검정(써모피셔사) 후, 15㎍의 세포 용해물을 4 내지 12% SDS-PAGE 겔(써모피셔사) 상에서 전기영동시켰다. 인간 서바이빈의 아미노산 1 내지 142에 대한 단클론성 항체(산타 크루즈 바이오테크사(Santa Cruz Biotech), 클론 D8, sc-17779)를 사용하여 검출을 수행하고, 이어서 ECL 웨스턴 블롯 분석 시스템(지이 아머샴사(GE Amersham))을 사용하여 호스래디쉬 퍼옥시다제(HRP) 접합된 염소 항-마우스 IgG(산타 크루즈 바이오테크사, sc-2005)를 사용하여 가시화하였다. 로딩 대조군으로서, 블롯을 항-β-액틴 단클론성 항체(산타 크루즈 바이오테크사, 클론, C4, sc-47778 HRP)를 사용하여 액틴 발현에 대해서 재프로빙하였다.
동물 및 면역화
암컷 8주령의 CB6F1 마우스를 잭슨 래보러토리즈사(Jackson Laboratories)로부터 구입하였다. 모든 동물을 BTS 리서치사(미국 캘리포니아주 샌디에이고주 소재)에서 온도 제어된 광-사이클 설비에 두었다. 동물 관리는 미국 국립 보건원(National Institutes of Health) 및 동물 관리 및 사용 지침(Animal Care and Use Proposal: ACUP)(BTS ACUP #15-091)에 따라서 수행하였다. 마우스를 표 4에 상술된 바와 같이 9개의 군으로 나누었다.
Figure pct00004
면역화된 군의 마우스를 SOP R20-003147 CELLECTRA(등록상표) 3P 마우스 처리에 따라서 제시된 용량의 pGX0001, pGX1428 또는 pGX1429으로 백신접종하였다. 간략하면, 플라스미드를 주사용 멸균수(VetOne) 중에 제형화하여 전경 골근(tibialis anterior) 근육 내의 근육내 주사에 의해서 30μL 주사 부피로 제시된 용량을 전달하였다. 각각의 근육내 주사 직후에 3P 어레이(이노비오 파마슈티컬즈사)를 사용하여 CELLECTRA(등록상표) 2000 어댑티브 정전류 전기천공 장치(Adaptive Constant Current Electroporation Device)를 사용한 전기천공(EP)을 수행하였다. 1초 지연으로 이격된 52ms 펄스 폭의 2개의 0.1 Amp 펄스를 전달하도록 장치를 구성하였다. 마우스에게 3주 간격으로 3회 면역화를 제공하였다. 마우스를 마지막 면역화 1주일 후에 희생시키고, 비장을 세포 면역 판독을 위해서 수거하였다. 다른 조직은 수집하지 않았다.
비장 림프구 단리
비장세포를 무균 단리시키고, 5㎖의 R10 배지(10% 우태아 혈청 및 1% 항생제-항진균제가 보충된 로즈웰 파크 메모리얼 인스티튜트 배지 1640)에 넣었다. 스토머커 기계(Stomacher machine)(세워드 래보러토리 시스템즈사(Seward Laboratory Systems Inc.))를 사용하여 비장을 기계적으로 파괴함으로써 비장세포를 단리시키고, 생성된 생성물을 40-㎛ 세포 스트레이너(strainer)(비디 팔콘사(BD Falcon))를 사용하여 여과시켰다. 생성된 생성물을 원심분리시키고, 펠릿을 RBC의 용해를 위해서 5분 동안 ACK 용해 완충제(론자사(Lonza))로 처리하였다. 이어서 비장세포를 원심분리시키고, PBS 중에서 세척하고, 이어서 R10 배지 중에 재현탁시키고, 추가 분석을 위해서 즉시 사용하였다.
IFNγ ELISpot
맵테크사(MabTech)(맵테크, #3321-4APW-10)로부터의 키트를 사용하여 마우스 IFNγ ELISpot 검정을 수행하여 항원-특이적 세포 반응을 평가하였다. 간략하면, 항-마우스 IFNγ 항체(mAb AN18)로 사전 코팅된 96웰 플레이트를 PBS 중에서 세척하고, 2시간 동안 실온에서 완전 배양 배지 매질(10% FBS 및 항생제가 보충된 RPMI 1640)로 차단하였다. 비장 림프구를 R10 배지 중에 재현탁시키고, 이어서 웰당 2Х105개 세포의 투입 세포수로 3회 반복물에 첨가하였다. 펩타이드 세트를 합성하였는데(진스크립트사), 각각은 전체 합성 공통 서바이빈 항원 1 및 합성 공통 서바이빈 항원 1T3 단백질 서열을 나타내는 11개 아미노산이 중첩된 15개 아미노산 잔기를 함유한다. 이들 펩타이드 세트를 DMSO(시그마사(Sigma)) 중에 재현탁시키고, 약 2㎍/㎖ 펩타이드의 농도로 2개의 펩타이드 풀로 풀링시켰다. 하나의 펩타이드 풀은 합성 공통 서바이빈 항원 1 항원 단백질에 상응하는 펩타이드를 함유하였고, 두 번째 펩타이드 풀은 합성 공통 서바이빈 항원 1T3 항원 단백질에 상응하는 펩타이드를 함유하였다. 5㎍/㎖의 콘카발린 A(시그마사)를 양성 대조군으로 사용하였고, 완전 배양 배지를 음성 대조군으로 사용하였다. 플레이트를 18시간 동안 37℃에서, 5% CO2 분위기 인큐베이터에서 인큐베이션시켰다. 이어서, 바이오틴일화된 항-마우스 IFNγ 검출 항체(맵테크 mAb R4-6A2)를 첨가하고, 플레이트를 실온에서 2시간 동안 인큐베이션시켰다. 플레이트를 세척하고, 스트렙타비딘-ALP(맵테크사)를 첨가하고, 플레이트를 실온에서 1시간 동안 인큐베이션시켰다. 키트 제조사 설명서(맵테크사)에 따라서 BCIP/NBT 기질을 사용하여 스팟 검출을 완결하였다. 플레이트 상의 스팟을 자동 ELISPOT 판독기(셀룰러 테크놀로지사(Cellular Technology))를 사용하여 계수하였다. 스팟 형성 단위(Spot Forming Unit: SFU)를 데이터 디스플레이를 위해서 1×106개 비장세포로 조정하였다.
도 7A 내지 도 7H에서, IFNγ ELISpot에 의한 항원 특이적 반응을 배지 단독 대조군에서의 1x106개 비장세포당 IFNγ 스팟 형성 단위(SFU)보다 큰 SFU의 수로 보고한다.
유세포 분석법
합성 공통 서바이빈 항원 1 및 합성 공통 서바이빈 항원 1T3에 의해서 유도된 세포 면역 반응을 유세포 분석법에 의해서 추가로 특징규명하였다. 간략하면, 백신접종된 마우스 및 미경험 마우스로부터의 2×106개 비장세포를 단리 이후에 즉시, 각각의 군에 대해서 적절한 경우, Brefeldin A(비디 바이오사이언시스사(BD Biosciences)), Monensin(비디 바이오사이언시스사), 및 FITC 항-마우스 CD107a 항체(비디 바이오사이언시스사, 클론 1D4B)의 존재 하에서 합성 공통 서바이빈 항원 1 및 서바이빈 1T3 펩타이드로 6시간 동안 자극하였다. 펩타이드로의 자극 후, 비장세포를 마우스 BD Fc Block(비디 바이오사이언시스사) 용액의 웰당 20㎕ 중에 재현탁시켰다 Fc 블록을 PBS 중에 1:40의 초기 희석도로 사용하고, 4℃에서 5분 동안 인큐베이션시킨다. 인큐베이션 후, (PBS 중의) 남아있는 세포외 항체를 웰당 30㎕로 첨가하고, 4℃에서 30분 동안 인큐베이션시킨다. 세포외 염색제의 첨가 후, 각각의 웰의 최종 부피는 50㎕인데, 이것은 1:100의 최종 희석도의 Fc 브록 및 적절한 작업 희석도의 세포외 항체로 이루어진다. 이어서, 세포를 생존능 염료(viability dye)(Vivid V450, 써모-피셔사) 및 하기 세포외 항체: PerCP-Cy5.5 항-마우스 CD4(비디 바이오사이언시스사, 클론 RM4-5) 및 APC 항-마우스 CD8a(비디 바이오사이언시스사, 클론 63-6.7)로 염색하였다. 세포를 고정시키고, 20분 동안 4℃에서 투과시켰다(비디 바이오사이언시스사, #554714). 그 다음 세포내 염색을 하기 항체와 함께 완결하였다: APC-Cy7 항-마우스 CD3e (비디 바이오사이언시스사, 클론 145-2C11) BV605 항-마우스 IFNγ 비디 바이오사이언시스사, 클론 XMG1.2), APC-R700 항-마우스 IL-2(비디 바이오사이언시스사, 클론 JEs6-5H4) 및 PE 항-마우스 TNF-α(비디 바이오사이언시스사, 클론 MP6-XT22). ICS 데이터를 10-컬러 FACS CANTO(비디 바이오사이언시스사)에서 수집하고, FlowJo 소프트웨어를 사용하여 분석을 완결하였다. 유세포 분석법 게이팅 전략을 도 8에 도시한다.
유세포 분석법에 의해서 항원 특이적이라고 지칭될 세포의 경우, 보고된 파라미터의 빈도는 배지-단독 대조군의 빈도를 초과해야 한다. 항원 특이적 CD107a를 생산하는 것으로서 식별될 세포의 경우, 그 세포는 불린 게이팅(Boolean gating)에 의해서 식별되는 경우 IFNγ 및/또는 IL-2 및/또는 TNFα의 항원 특이적 생산에 대해서 양성으로 식별되어야 한다.
통계학적 분석
IBM SPSS Statistics 22(아이비엠사(IBM Corporation))를 사용하여 통계학적 분석을 완결하였다. 다중 비교를 조정하기 위해서 사후(post-hoc) 터키 어니스트 유의성 차이(Tukey's Honest Significant Difference: HSD)와 함께 ANOVA를 사용하여 군 간의 분석을 수행하였다. 다중 비교 이전에 F 통계를 사용하여 변량 동질성(homogeneity of variance)을 확인하였다. 모든 통계 분석에 대해서, 0.050의 p-값은 유의한 것으로 간주되었다.
결과
합성 공통 서바이빈 항원 단백질의 발현
인간 서바이빈을 표적으로 하도록 2개의 작제물, 합성 공통 서바이빈 항원 1(pGX1428) 및 합성 공통 서바이빈 항원 1T3(pGX1429)을 설계하였다. 각각 pGX1428 및 pGX1429에 의한 합성 공통 서바이빈 항원 1 및 합성 공통 서바이빈 항원 1T3 항원 단백질의 발현을 웨스턴 블로팅에 의해서 확인하였다. 간략하면, 인간 횡문근육종(RD) 세포에 pGX1428, pGX1429 또는 pGX0001(빈 벡터, 음성 대조군) 플라스미드를 형질주입하였다. 세포 용해물을 항-인간 서바이빈 항체(BIRC5)를 사용하여 합성 공통 서바이빈 항원 단백질의 발현에 대해서 프로빙하였다. 합성 공통 서바이빈 항원 1(17.5kD) 및 합성 공통 서바이빈 항원 1T3(25.3kD)에 대한 예측된 분자량의 밴드가 검출되었다(도 6). 음성 대조군(pGX0001)에서 희미한 밴드가 검출되었는데, 이것은 RD 세포주에서의 낮은 수준의 내인성 서바이빈 단백질 발현으로 인한 것일 것이다. 유사한 강도의 항-β-액틴 밴드가 검출되었는데, 이것은 동일한 양의 단백질이 각각의 레인에 로딩되었다는 것을 나타낸다. 요약하면, pGX1428 및 pGX1429는 이의 각각의 항원 단백질을 발현하는 것을 발견하였다.
합성 공통 서바이빈 항원 백신 작제물의 면역원성
IFNγ ELISpot
IFNγ ELISpot 및 유세포 분석법(n=8/군)에 의해서 4가지 용량(10㎍, 20㎍, 30㎍ 및 50㎍)에서 2개의 합성 공통 서바이빈 항원 작제물의 면역원성을 평가하였다. 마우스를 음성 대조군으로서 빈 벡터 골격(pGX0001)으로 면역화시켰다(n=4/군). 합성 공통 서바이빈 항원 1으로의 백신접종은 음성 대조군 백신접종된 마우스에 비해서 유의미한 IFNγ 반응을 야기하였다. 그러나, 합성 공통 서바이빈 항원 1에 의해서 유도된 IFNγ 생산의 용량 의존적인 증가에 대해서 최소한의 증가가 존재하였는데(도 10A), 이는 최대 반응이 최저 용량에서 달성되었다는 것을 시사한다. 구체적으로, 합성 공통 서바이빈 항원 1 IFNγ SFU는 10㎍, 20㎍, 30㎍ 및 50㎍에서 각각 1,082±574, 1,186±747, 1,135±647, 및 848±350이었다. 합성 공통 서바이빈 항원 1 IFNγ 반응은 pGX1428 10㎍(p=0.031), 20㎍(p=0.015) 및 30㎍(p=0.021) 용량에서는 미경험(2± 3)보다 상당히 더 컸지만, 50㎍ 용량(p=0.134)에서는 크지 않았다. 합성 공통 서바이빈 항원 1T3으로의 백신접종은 유의미한 IFNγ 반응을 야기하였고, 용량 수준 증가에 따른 용량 의존적인 증가에 대해서 어느 정도의 증거가 있었다(도 10D). 서바이빈 1T3 IFNγ SFU는 10㎍, 20㎍, 30㎍ 및 50㎍에서 각각 516±156, 812±534, 1,016±654 및 818±339였다. 합성 공통 서바이빈 항원 1T3 IFNγ 반응은 pGX1429 20㎍(p=0.039), 30㎍(p=0.006) 및 50㎍(p=0.037) 용량에서는 미경험(5± 6)보다 상당히 더 컸지만, 10㎍ 용량(p=0.337)에서는 크지 않았다. IFNγ 반응을 하기 표 5에 요약한다.
Figure pct00005
유세포 분석법
합성 공통 서바이빈 항원 1 및 합성 공통 서바이빈 항원 1T3 둘 다는, CD8+ T 세포 구획에서의 반응에 비해서, CD4+ T 세포 구획에서 보다 강력한 반응을 도출하였다(도 9). 합성 공통 서바이빈 항원 1은 20㎍(1.08%±0.65%)(p=0.024) 및 50㎍(1.21%±0.73%)(p=0.009) 용량군에서 미경험(0.03%±0.05%)보다 상당히 더 강력한 항원 특이적 CD4+ T 세포 반응의 빈도를 유도하였지만, 10㎍(0.86%±0.31%)(p=0.105) 또는 30㎍(0.82%±0.46%)(p=0.134) 용량군에서는 그렇지 않았다(도 7B). 합성 공통 서바이빈 항원 1T3은 20㎍(1.02%±0.59%)(p=0.010), 30㎍(1.08%±0.47%)(p=0.006) 및 50㎍(1.13%±0.44%)(p=0.004) 용량군에서 미경험(0.05%±0.05%)보다 상당히 더 강력한 항원 특이적 CD4+ T 세포 반응을 유도하였지만, 10㎍(0.62%±0.35%)(p=0.248) 용량군에서는 그렇지 않았다(도 7E). 합성 공통 서바이빈 항원 특이적 CD4+ T 세포의 사이토카인 프로파일은 용량군 전체에서 두 작제물에 대해서 유사하였고, 이는 IFNγ+IL-2+TNFα+, IFNγ+IL-2-TNFα+ 또는 IFNγ+IL-2-TNFα- 세포로 주로 구성되었다(도 7G, 도 7H). 항원 특이적 CD4+ T 세포의 빈도를 하기 표 6에 추가로 상술한다.
Figure pct00006
합성 공통 서바이빈 항원 1(p=0.117)에 의해서 유도된 항원 특이적 CD8+ T 세포의 빈도에는 유의한 차이가 없었다(도 7C). 서바이빈 1T3은 용량군들 사이에서 항원 특이적 CD8+ T 세포의 상당히 더 큰 빈도를 유도하였다(p=0.043). 10㎍(0.15%±0.09%)(p=0.919), 20㎍(0.27%±0.21%)(p=0.274) 또는 30㎍(0.25%±0.14%)(p=0.377)의 pGX1429로 면역화된 군에서 항원 특이적 CD8+ T 반응의 빈도는 미경험(0.07%±0.01%)에 비해서 통계학적 유의성에 접근하지 않았다. 서바이빈 1T3 특이적 CD8+ T 세포의 빈도는 50㎍의 pGX1429로 면역화된 군에서 통계학적 유의성에 접근하였다(0.36%±0.21%)(p=0.051)(도 7F). 합성 공통 서바이빈 항원 1 및 합성 공통 서바이빈 항원 1T3 둘 다는 규모 및 표현형이 유사한 CD8+ T 세포 반응을 유도하였다. 항원 특이적 CD8+ T 세포는 주로 IFNγ+IL-2-TNFα-, IFNγ+IL-2-TNFα+였다(도 7G, 도 7H). 항원 특이적 CD8+ T 세포의 빈도를 하기 표 7에 추가로 상술한다.
Figure pct00007
합성 공통 서바이빈 항원 1(도 10A) 및 합성 공통 서바이빈 항원 1T3(도 10B)에 의해서 유도된 사이토카인 양성 CD4+ T 세포의 대략 25%가 또한 CD107a에 대해서 양성이었는데, 이는, CD4+ T 세포 매개된 세포용해 기능에 대한 일부 가능성을 나타낸다. 모든 용량의 합성 공통 서바이빈 항원 1은 미경험(0.01%± 0.01%)보다 CD4+CD107a+ T 세포의 빈도를 상당히 더 크게 유도하였다. 구체적으로, 항원 특이적 CD4+CD107a+ T 세포의 빈도는 10㎍(p=0.013), 20㎍(p<0.001), 30㎍(p=0.050) 및 50㎍(p<0.001) 용량군에서 각각 0.25%±0.08%, 0.36%±0.11%, 0.21%±0.15% 및 0.38%±0.13%였다(도 10A). 합성 공통 서바이빈 항원 1T3은, 10㎍ 용량군(0.18%±0.09%)(p=0.147)을 제외한 모든 군에서 미경험(0.01±0.01)보다 상당히 더 큰 CD4+CD107a+ T 세포의 빈도를 유도하였다. 항원 특이적 CD4+CD107a+ T 세포의 빈도는 20㎍(p=0.030), 30㎍(p=0.010) 및 50㎍(p=0.004) 용량군에서 각각 0.24%±0.12%, 0.27%±0.12% 및 0.29%±0.16%였다(도 10B). 세포용해 가능성을 갖는 항원 특이적 CD4+ T 세포의 빈도를 하기 표 8에 추가로 상술한다.
Figure pct00008
항원 특이적 CD8 + T 세포의 규모와 유사하게, 합성 공통 서바이빈 항원 1은 모든 군에서 CD8+CD107a+ T 세포의 빈도에서 유의미한 변화를 유도하지 않았다(p=0.101)(도 10C). 합성 공통 서바이빈 항원 1T3은 모든 용량군 사이에서 CD8+CD107a+ T 세포의 빈도에서 유의미한 변화를 유도하였다(p=0.034) (도 10D). 항원 특이적 CD8+CD107a+ T 세포의 빈도는 50㎍의 pGX1429로 면역화된 군(0.28%± 0.22%)(p=0.026)에서는 미경험(0.03±0.01)을 초과하게 상당히 증가하였지만, 10㎍(0.11%±0.08%)(p=0.813), 20㎍(0.16%±0.11%)(p=0.450), 30㎍(0.16%±0.07%)(p=0.424)의 합성 공통 서바이빈 항원 1T3으로 면역화된 군에서는 증가하지 않았다. 합성 공통 서바이빈 항원 특이적 CD8+CD107a+ T 세포의 사이토카인 프로파일은 용량군에 전체에서 두 작제물에 대해서 유사하였고, 이는 주로 IFNγ+IL-2-TNFα+, IFNγ+IL-2-TNFα- 세포로 구성되었다(도 10E, 도 10F). 세포용해 가능성을 갖는 항원 특이적 CD8+ T 세포의 빈도를 하기 표 9에 추가로 상술한다.
Figure pct00009
합성 공통 서바이빈 항원 작제물에 의해서 유도된 IFNγ 반응의 폭
pGX1428 및 pGX1429에 의해서 유도된 서바이빈에 대한 IFNγ 반응의 폭을 펩타이드 매트릭스 풀 접근법을 사용한 에피토프 매핑에 의해서 조사하였다(도 11A 내지 도 11D). 최고 용량의 pGX1428(n=8)(도 11A) 또는 pGX1429(n=8)(도 11B)로 면역화된 마우스로부터의 풀링된 비장 림프구를 조사하였다.
하기 합성 공통 서바이빈 항원 1 에피토프가 pGX1428 및 pGX1429 둘 다에 존재하였다:
LPPAWQLFLKDHRISTFKN(서열번호 5)(매트릭스 풀 1, 2, 3, 4 및 7)
LKLDRERAKNKIAKETNNK(서열번호 6)(매트릭스 풀 1, 2, 3, 4 및 11)
pGX1429에 존재하는 합성 공통 서바이빈 항원 T3 에피토프:
EWLHHFQGLFP(서열번호 7)(매트릭스 풀 3, 4 및 7)
합성 공통 서바이빈 항원 1 및 합성 공통 서바이빈 항원 1T3에 의해서 유도된 세포 면역 반응의 총 규모는 유사하였지만, 합성 공통 서바이빈 항원 1T3의 합성 공통 서바이빈 항원 1(pGX1428) 영역에 대해서 합성 공통 서바이빈 항원 1T3(pGX1429)에 의해서 유도된 반응은 합성 공통 서바이빈 항원 1 작제물(pGX1428)에 의해서 유도된 것의 규모의 대략 절반이었다. 매트릭스 접근법을 사용한 IFNγ ELISpot에 의한 에피토프 매핑은, 합성 공통 서바이빈 항원 작제물 둘 다가 합성 공통 서바이빈 항원 1 항원에서 동일한 에피토프에 대한 반응을 생성시키지만, 이들 에피토프에 대해서 합성 공통 서바이빈 항원 1T3에 의해서 유도된 반응은 규모가 더 낮음을 나타내었다. 합성 공통 서바이빈 항원 1T3 항원의 T3 영역에 고유한 에피토프가 존재함이 또한 결정되었다.
합성 공통 서바이빈 항원 1(pGX1428) 및 합성 공통 서바이빈 항원 1T3(pGX1429)에 의해서 유도된 세포 면역 반응의 총 규모는 유사하였지만, 합성 공통 서바이빈 항원 1T3 항원의 합성 공통 서바이빈 항원 1 영역에 대해서 합성 공통 서바이빈 항원 1T3(pGX1429)에 의해서 유도된 반응은 합성 공통 서바이빈 항원 1 작제물(pGX1428)에 의해서 유도된 것의 규모의 대략 절반이었다. 매트릭스 접근법을 사용한 IFNγ ELISpot에 의한 에피토프 매핑은, 합성 공통 서바이빈 항원 작제물 둘 다가 합성 공통 서바이빈 항원 1 항원에서 동일한 에피토프에 대한 반응을 생성시키지만, 이들 에피토프에 대해서 합성 공통 서바이빈 항원 1T3에 의해서 유도된 반응은 규모가 더 낮음을 나타내었다. 이러한 접근법을 사용하여 합성 공통 서바이빈 항원 1T3 항원의 T3 영역에 고유한 에피토프가 존재함이 또한 결정되었다. 합성 공통 서바이빈 항원 1T3은 또한, 미경험에 비해서, 항원 특이적 CD8+ 및 CD8+CD107a+ T 세포의 빈도를 상당히 증가시켰지만, 합성 공통 서바이빈 항원 1은 마우스에서 항원 특이적 CD8+ T 세포를 상당히 증가시키지는 않았다. 합성 공통 서바이빈 항원 1T3(pGX1429)을 선택하여, 마우스에서 pGX1428과 비교할 때 서바이빈에 대한 세포 면역 반응의 폭을 추가로 향상시키는 가능성에 기초하여 1가 비-인간 영장류 연구로 이동시켰다.
실시예 5 - 합성 공통 서바이빈 항원 1T3(pGX1429)을 사용한 비-인간 영장류 연구
합성 공통 서바이빈 1T3 단독 및 저용량 및 고용량의 IL-12와 조합된 합성 공통 서바이빈 1T3의 가능성을 조사하기 위해서, 각각 고유한 NHP ID 번호에 의해서 식별된 18마리의 성인 레서스 원숭이를 6마리의 3개의 군으로 나누고, 하기와 같이 pGX1429로 면역화시켰다. 6마리의 동물을 1.0㎖ 주사 부피로 SSC 중에서 제형화된 3.0㎎의 pGX1429로 면역화시키고, 6마리를 3.0㎎의 pGX1429 + 0.04㎎의 pGX6006(opt rh IL-12)(아주반트로서)으로 면역화시키고, 6마리를 3.0㎎의 pGX1429 + 0.20㎎의 pGX6006(opt rh IL-12)(아주반트로서)으로 면역화시켰다. 면역화 주사를 0, 4, 8 및 12주에 주사하였다. 따라서 모든 면역화는 CELLECTRA(등록상표) 2000 5P-IM EP 장치를 사용하여 멸균 WFI 중에 제형화된 1㎖ 주사 부피로 교대로 대측 사지(contralateral limb)에 근육내로 수행하였다. EP 조건은 하기와 같았다: OpBlock 0070 - IM, 0.5Amp, 3 펄스, 52msec, 펄스 사이에 0.2초. 서바이빈 면역원성을 2, 6, 10 및 14주에 평가하였다. 서바이빈-특이적 IFN-감마 반응을 도 12 및 도 13에 도시한다. 네이티브 레서스 서바이빈과 pGX1429 간의 상동성을 표 10에 제공한다. 도 13 및 도 14에 도시된 바와 같이, 합성 공통 서바이빈 항원 1T3 + 0.20㎎의 IL-12(아주반트로서)로 면역화된 동물에서 증가된 서바이빈-특이적 반응이 관찰되었다.
PBMC 단리
비-인간 영장류 전혈을, 항응고제 및 겔 장벽을 함유한 시트르산나트륨 세포 제조 튜브(CPT CPT 비디 바이오사이언시스사)에 수집하였다. 밤새 정치 이전에, PMBC를 분리하고 농축시키기 위해서 수집 직후에 전혈을 스피닝시켰다(2시간 이내). 적혈구 및 호중구는 튜브의 바닥에 펠릿화되며, 겔 장벽에 의해서 제자리에 고정된다. 혈장 및 림프구는 겔 장벽 위에 남아있다. 각각의 CPT는 약 8㎖의 혈액을 보유할 수 있고, 실온에 정치시킨다. 스피닝된 CPT 튜브를 PBMC 단리를 위해서 가공하였다. 암모늄-클로라이드-칼륨(ACK) 완충제를 사용한 적혈구 용해 후, 살아있는 세포를 Invitrogen Countess(상표명) 자동 세포 계수기를 사용하여 계수하고, 완전 배양 배지(10% FBS, 항생제 및 β 머캅토에탄올이 보충된 RPMI 1640) 중에 재현탁시켰다. 본 명세서에 기재된 바와 같은 검정을 완결한 후, 남아있는 PBMC를 냉동바이알(cryovial) 내에서 동결 배지(세라디즘사(Seradigm)로부터의 90% FBS 중의 시그마사(Sigma)로부터의 10% DMSO) 중에 동결시키고, 액체 질소 중에 장기간 저장하였다.
IFNγ ELISpot
백신 유도된 항원-특이적 세포 반응을 평가하기 위해서, 키트(맵테크 IFNγ ELISpotPro, #3421M-2APW-10)를 사용하여 단리된 PMBC 상에서 각각의 시간 지점에서 원숭이 IFNγ ELISpot 검정을 수행하였다. 간략하면, 항-원숭이 IFNγ 항체(mAb MT126L)로 사전 코팅된 96웰 플레이트를 PBS 중에서 세척하고, 2시간 동안 실온에서 완전 배양 배지(10% FBS, 항생제 및 β 머캅토에탄올이 보충된 RPMI 1640)로 차단하였다. NHP PBMC를 R10 배지 중에 재현탁시키고, 이어서 웰당 2×105개 세포의 투입 세포수로 3회 반복물에 첨가하였다. 펩타이드 세트를 합성하였는데(진스크립트사), 각각은 전체 합성 공통 단백질 서열을 나타내는 11개 아미노산이 중첩된 15개 아미노산 잔기를 함유한다. 이들 펩타이드 세트를 DMSO(시그마사) 중에 재현탁시키고, 각각 각자의 펩타이드 대략 2㎍/㎖의 농도로 풀로 풀링시켰다. 모든 항원 특이적 풀링된 펩타이드를 1:100 희석비로 사용하였는데, 이것은 PBMC와 조합되는 경우, 각각의 웰에서 1:200의 최종 희석비를 야기하였다. 각각의 항원 단백질의 크기 변화는 서바이빈에 대해서 2개의 펩타이드 풀을 야기하였다.
이오노마이신(Ionomycin)(시그마사)를 갖는 항-CD3(mAb CD-2 맵테크) 및/또는 PMA(시그마사)를 양성 대조군으로서 사용하였다. 완전 R10 배양 배지를 음성 대조군으로서 사용하였다. 플레이트를 대략 18시간 동안 37℃에서, 5% CO2 분위기 인큐베이터에서 인큐베이션시켰다. 세포 제거 및 ALP 접합된 항-원숭이 IFNγ 검출 항체(맵테크 Ab 7-B6-1-ALP)의 첨가 후, 플레이트를 실온에서 2시간 동안 인큐베이션시켰다. 이어서 키트 제조사 설명서(맵테크사)에 따라서 BCIP/NBT 기질 용액을 사용하여 샌드위치 면역-효소 검정을 현상하였다. 암청색 침전물이 스팟으로서 형성되고 이것은 각각의 개별 IFNγ 생산 세포를 나타낸다. 이어서, 이러한 스팟을 CTL ImmunoSpot(등록상표) 및 소프트웨어(셀룰러 테크놀로지사(Cellular Technology)에 의해서 스캐닝 및 계수하고, 숙련된 작동자에 의해서 품질을 제어하였다. 배지 단독 대조군 중에서의 1×106개 PBMC에 대한 스팟 형성 단위(SFU)보다 더 큰 SFU로서 IFNγ 반응을 보고한다.
Figure pct00010
Figure pct00011
군 1, 2 및 3은 하기를 제공받았다:
Figure pct00012
군 1 - 3.0㎎ pGX1429(합성 공통 서바이빈 1T3). SSC 중에 제형화됨, 1.0㎖ 주사 부피, IM.
Figure pct00013
군 2 - 3.0㎎ pGX1429(합성 공통 서바이빈 1T3) + 0.04 pGX6006(opt. rIL-12). SSC 중에 제형화됨, 1.0㎖ 주사 부피, IM.
Figure pct00014
군 3 - 3.0㎎ pGX1429(합성 공통 서바이빈 1T3) + 0.20 pGX6006(opt. rIL-12). SSC 중에 제형화됨, 1.0㎖ 주사 부피, IM.
모든 군을 하기 스케줄에 따라서 면역화시켰다:
Figure pct00015
면역화 1(0주)
Figure pct00016
면역화 2(4주)
Figure pct00017
면역화 3(8주)
Figure pct00018
면역화 4(12주)
Figure pct00019
면역화 5(임의적임)
결과
서바이빈 특이적 IFNγ 반응을 군 1 내지 군 3에 대해서 각각 도 12 내지 도 14에 도시한다. 결과는 투여 2주 후에 각각의 시간 지점에서의 반응을 나타낸다. 종합하면, 모든 군 및 개별 동물은 기준 사전채혈에 비해서, 투여 4, 2주 후에 연구 마지막에 반응이 증가되었다. 더 높은 용량의 L-12(0.2㎎)의 첨가는 서바이빈 단독 또는 서바이빈 + 0.04㎎의 IL-12에 비해서 각각의 시간 지점에서 더 크고 더 일관된 반응을 야기하였다. PD2만큼 초기에 더 높은 반응이 서바이빈 + IL-12 0.2㎎에 대해서 주목되었다.
표 12 내지 표 14에 제시된 바와 같은 면역화로 인해서 측정된 생리학적 파라미터 중 임의의 것에서 차이가 존재하지 않았다. RBC, HCT, 호중구, 림프구, 단핵구, 호산구에 대해서 유의미한 차이가 주목되지 않았다(결과 나타내지 않음). 이들 값은 유사한 실험 절차를 경험한 이러한 종, 성별 및 연령의 동물에 대해서 예측된 범위 이내였다. 언급된 정상 범위로부터의 임의의 변화는 산발적 특성으로, 하나의 성별에만 존재하며 용량 수준 또는 시기와 관련이 없다.
Figure pct00020
Figure pct00021
Figure pct00022
모든 군의 경우, 연구 기간에 걸쳐서 중량 변화는 유의미하지 않았다(데이터 나타내지 않음).
종합하면, 결과는, 단독으로 투여된 합성 공통 서바이빈은 NHP의 100%에서 면역 반응을 유도할 수 있다는 것을 나타낸다. IL-12 아주반트의 첨가는 합성 공통 서바이빈에 대해서 주목된 반응을 개선시켜서, 훨씬 신속하고, 강한 반응 PD2를 야기하였지만, 고용량의 IL-12의 사용에서만 가능하였다.
상기 상세한 설명 및 첨부된 실시예는 단지 예시이며, 첨부된 청구범위 및 이의 등가물에 의해서만 정의되는 본 발명의 범주에 대한 제한으로서 간주되지 않아야 함이 이해된다.
개시된 실시형태에 대한 다양한 변화 및 개질은 당업자에게 자명할 것이다. 본 발명의 화학적 구조, 치환체, 유도체, 중간체, 합성법, 조성물, 제형 또는 사용 방법에 관련된 것을 포함하지만 이들로 제한되지 않는 개시된 실시형태에 대한 이러한 변경 및 개질은 이의 사상 및 범주를 벗어나지 않으면서 수행될 수 있다.
SEQUENCE LISTING <110> INOVIO PHARMACEUTICALS, INC <120> CANCER VACCINES TARGETING SURVIVIN AND USES THEREOF <130> WO/2019/118766 <140> PCT/US2018/065529 <141> 2018-12-13 <150> US 62/598,267 <151> 2017-12-13 <160> 8 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 483 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Consensus Survivin isoform 1 DNA Coding Sequence pGX1428 <400> 1 atggattgga cctggattct gttcctggtg gcagcagcaa cccgggtgca ctccggagcc 60 cccacactgc cccctgcctg gcagctgttt ctgaaggacc acaggatctc tacattcaag 120 aactggccct ttctggaggg atgcgcatgt gcacctgaga ggatggcaga ggcaggcttc 180 atccactgcc ctgccgagaa tgagccagat ctggcccagt gcttcttttg ttttaaggag 240 ctggagggct gggagccaga cgatgacccc atcgaggagc acaagaagca cagctccggc 300 gccgccttcc tgtctgtgaa gaagcagttt gaggagctga ccctgagcga gttcctgaag 360 ctggatcggg agagagccaa gaacaagatc gccaaggaga ccaacaacaa gaagaaggag 420 tttgaggaga cagccaagaa ggtgaggtgt gccatcgagc agctggccgc catggactga 480 taa 483 <210> 2 <211> 159 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Consensus Survivin isoform 1 Protein Coding Sequence pGX1428 <400> 2 Met Asp Trp Thr Trp Ile Leu Phe Leu Val Ala Ala Ala Thr Arg Val 1 5 10 15 His Ser Gly Ala Pro Thr Leu Pro Pro Ala Trp Gln Leu Phe Leu Lys 20 25 30 Asp His Arg Ile Ser Thr Phe Lys Asn Trp Pro Phe Leu Glu Gly Cys 35 40 45 Ala Cys Ala Pro Glu Arg Met Ala Glu Ala Gly Phe Ile His Cys Pro 50 55 60 Ala Glu Asn Glu Pro Asp Leu Ala Gln Cys Phe Phe Cys Phe Lys Glu 65 70 75 80 Leu Glu Gly Trp Glu Pro Asp Asp Asp Pro Ile Glu Glu His Lys Lys 85 90 95 His Ser Ser Gly Ala Ala Phe Leu Ser Val Lys Lys Gln Phe Glu Glu 100 105 110 Leu Thr Leu Ser Glu Phe Leu Lys Leu Asp Arg Glu Arg Ala Lys Asn 115 120 125 Lys Ile Ala Lys Glu Thr Asn Asn Lys Lys Lys Glu Phe Glu Glu Thr 130 135 140 Ala Lys Lys Val Arg Cys Ala Ile Glu Gln Leu Ala Ala Met Asp 145 150 155 <210> 3 <211> 696 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Consensus Survivin isoform 1 + isoform 3 truncated DNA Coding Sequence pGX1429 <400> 3 atggattgga catggattct gttcctggtg gcagcagcaa ccagggtgca ctctggagca 60 ccaacactgc cccctgcatg gcagctgttt ctgaaggacc accggatcag caccttcaag 120 aactggcctt ttctggaggg ctgcgcctgt gccccagaga gaatggcaga ggcaggcttc 180 atccactgcc cagccgagaa tgagcctgat ctggcccagt gcttcttttg ttttaaggag 240 ctggagggct gggagcctga cgatgaccca atcgaggagc acaagaagca cagctccgga 300 gcagccttcc tgagcgtgaa gaagcagttt gaggagctga cactgtccga gttcctgaag 360 ctggataggg agcgcgccaa gaacaagatc gccaaggaga ccaacaacaa gaagaaggag 420 tttgaggaga cagccaagaa ggtgcggtgt gcaatcgagc agctggcagc aatggacagg 480 ggaagaaagc ggagatccat gcagaggaag cctaccatca ggcgcaagaa tctgcgcaag 540 ctgcggagaa agtgcgccgt gccatctagc tcctggctgc cctggacaga ggcctctggc 600 tggagctgtc tggtgcccga gtggctgcac cacttccagg gactgtttcc tggagccacc 660 tccctgccag tgggaccact ggccatgtct tgataa 696 <210> 4 <211> 210 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Consensus Survivin isoform 1 + isoform 3 truncated Protein Coding Sequence pGX1429 <400> 4 Met Asp Trp Thr Trp Ile Leu Phe Leu Val Ala Ala Ala Thr Arg Val 1 5 10 15 His Ser Gly Ala Pro Thr Leu Pro Pro Ala Trp Gln Leu Phe Leu Lys 20 25 30 Asp His Arg Ile Ser Thr Phe Lys Asn Trp Pro Phe Leu Glu Gly Cys 35 40 45 Ala Cys Ala Pro Glu Arg Met Ala Glu Ala Gly Phe Ile His Cys Pro 50 55 60 Ala Glu Asn Glu Pro Asp Leu Ala Gln Cys Phe Phe Cys Phe Lys Glu 65 70 75 80 Leu Glu Gly Trp Glu Pro Asp Asp Asp Pro Ile Glu Glu His Lys Lys 85 90 95 His Ser Ser Gly Ala Ala Phe Leu Ser Val Lys Lys Gln Phe Glu Glu 100 105 110 Leu Thr Leu Ser Glu Phe Leu Lys Leu Asp Arg Glu Arg Ala Lys Asn 115 120 125 Lys Ile Ala Lys Glu Thr Asn Asn Lys Lys Lys Glu Phe Glu Glu Thr 130 135 140 Ala Lys Lys Val Arg Cys Ala Ile Glu Gln Leu Ala Ala Met Asp Arg 145 150 155 160 Gly Arg Lys Arg Arg Ser Met Gln Arg Lys Pro Thr Ile Arg Arg Lys 165 170 175 Asn Leu Arg Lys Leu Arg Arg Lys Cys Ala Val Pro Ser Ser Ser Trp 180 185 190 Leu Pro Trp Thr Glu Ala Ser Gly Trp Ser Cys Leu Val Pro Glu Trp 195 200 205 Leu His 210 <210> 5 <211> 19 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> matrix pools 1, 2, 3, 4, and 7 <400> 5 Leu Pro Pro Ala Trp Gln Leu Phe Leu Lys Asp His Arg Ile Ser Thr 1 5 10 15 Phe Lys Asn <210> 6 <211> 19 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> matrix pools 1, 2, 3, 4 and 11 <400> 6 Leu Lys Leu Asp Arg Glu Arg Ala Lys Asn Lys Ile Ala Lys Glu Thr 1 5 10 15 Asn Asn Lys <210> 7 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> matrix pools 3, 4 and 7 <400> 7 Glu Trp Leu His His Phe Gln Gly Leu Phe Pro 1 5 10 <210> 8 <211> 232 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Consensus Survivin isoform 1 + isoform 3 truncated Protein Coding Sequence pGX1429 Full Length <400> 8 Met Asp Trp Thr Trp Ile Leu Phe Leu Val Ala Ala Ala Thr Arg Val 1 5 10 15 His Ser Gly Ala Pro Thr Leu Pro Pro Ala Trp Gln Leu Phe Leu Lys 20 25 30 Asp His Arg Ile Ser Thr Phe Lys Asn Trp Pro Phe Leu Glu Gly Cys 35 40 45 Ala Cys Ala Pro Glu Arg Met Ala Glu Ala Gly Phe Ile His Cys Pro 50 55 60 Ala Glu Asn Glu Pro Asp Leu Ala Gln Cys Phe Phe Cys Phe Lys Glu 65 70 75 80 Leu Glu Gly Trp Glu Pro Asp Asp Asp Pro Ile Glu Glu His Lys Lys 85 90 95 His Ser Ser Gly Ala Ala Phe Leu Ser Val Lys Lys Gln Phe Glu Glu 100 105 110 Leu Thr Leu Ser Glu Phe Leu Lys Leu Asp Arg Glu Arg Ala Lys Asn 115 120 125 Lys Ile Ala Lys Glu Thr Asn Asn Lys Lys Lys Glu Phe Glu Glu Thr 130 135 140 Ala Lys Lys Val Arg Cys Ala Ile Glu Gln Leu Ala Ala Met Asp Arg 145 150 155 160 Gly Arg Lys Arg Arg Ser Met Gln Arg Lys Pro Thr Ile Arg Arg Lys 165 170 175 Asn Leu Arg Lys Leu Arg Arg Lys Cys Ala Val Pro Ser Ser Ser Trp 180 185 190 Leu Pro Trp Thr Glu Ala Ser Gly Trp Ser Cys Leu Val Pro Glu Trp 195 200 205 Leu His His Phe Gln Gly Leu Phe Pro Gly Ala Thr Ser Leu Pro Val 210 215 220 Gly Pro Leu Ala Met Glu Thr Ser 225 230

Claims (29)

  1. 핵산 분자로서,
    (a) 서열번호 2의 아미노산 19 내지 159를 암호화하는 핵산 서열;
    (b) 서열번호 4의 아미노산 19 내지 210을 암호화하는 핵산 서열;
    (c) 서열번호 8의 아미노산 19 내지 232를 암호화하는 핵산 서열;
    (d) 서열번호 2의 아미노산 19 내지 159의 전체 길이의 적어도 90%를 포함하는 단편을 암호화하는 핵산 서열;
    (e) 서열번호 4의 아미노산 19 내지 210의 전체 길이의 적어도 90%를 포함하는 단편을 암호화하는 핵산 서열;
    (f) 서열번호 8의 아미노산 19 내지 232의 전체 길이의 적어도 90%를 포함하는 단편을 암호화하는 핵산 서열;
    (g) 서열번호 2의 아미노산 19 내지 159와 적어도 95% 동일한 단백질을 암호화하는 핵산 서열;
    (h) 서열번호 4의 아미노산 19 내지 210과 적어도 95% 동일한 단백질을 암호화하는 핵산 서열;
    (i) 서열번호 8의 아미노산 19 내지 232와 적어도 95% 동일한 단백질을 암호화하는 핵산 서열;
    (j) 서열번호 2의 아미노산 19 내지 159와 적어도 95% 동일한 단백질의 전체 길이의 적어도 90%를 포함하는 단편을 암호화하는 핵산 서열;
    (k) 서열번호 4의 아미노산 19 내지 210과 적어도 95% 동일한 단백질의 전체 길이의 적어도 90%를 포함하는 단편을 암호화하는 핵산 서열; 및
    (l) 서열번호 8의 아미노산 19 내지 232와 적어도 95% 동일한 단백질의 전체 길이의 적어도 90%를 포함하는 단편을 암호화하는 핵산 서열
    로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 핵산 서열을 포함하는, 핵산 분자.
  2. 핵산 분자로서,
    (a) 서열번호 1의 뉴클레오타이드 55 내지 423;
    (b) 서열번호 3의 뉴클레오타이드 55 내지 636;
    (c) 서열번호 1의 55 내지 423의 전체 길이의 적어도 90%를 포함하는 단편;
    (d) 서열번호 3의 뉴클레오타이드 55 내지 636의 전체 길이의 적어도 90%를 포함하는 단편;
    (e) 서열번호 1의 뉴클레오타이드 55 내지 423과 적어도 95% 동일한 단편;
    (f) 서열번호 3의 뉴클레오타이드 55 내지 636과 적어도 95% 동일한 단편;
    (g) 서열번호 1의 뉴클레오타이드 55 내지 423과 적어도 95% 동일한 핵산 서열의 적어도 90%를 포함하는 단편; 및
    (h) 서열번호 3의 뉴클레오타이드 55 내지 636과 적어도 95% 동일한 핵산 서열의 적어도 90%를 포함하는 단편
    으로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 핵산 서열을 포함하는, 핵산 분자.
  3. 핵산 분자로서,
    (a) 서열번호 2를 암호화하는 핵산 서열;
    (b) 서열번호 4를 암호화하는 핵산 서열;
    (c) 서열번호 8을 암호화하는 핵산 서열;
    (d) 서열번호 2의 전체 길이의 적어도 90%를 포함하는 단편을 암호화하는 핵산 서열;
    (e) 서열번호 4의 전체 길이의 적어도 90%를 포함하는 단편을 암호화하는 핵산 서열;
    (f) 서열번호 8의 전체 길이의 적어도 90%를 포함하는 단편을 암호화하는 핵산 서열;
    (g) 서열번호 2와 적어도 95% 동일한 단백질을 암호화하는 핵산 서열;
    (h) 서열번호 4와 적어도 95% 동일한 단백질을 암호화하는 핵산 서열;
    (i) 서열번호 8과 적어도 95% 동일한 단백질을 암호화하는 핵산 서열;
    (j) 서열번호 2와 적어도 95% 동일한 단백질의 전체 길이의 적어도 90%를 포함하는 단편을 암호화하는 핵산 서열;
    (k) 서열번호 4와 적어도 95% 동일한 단백질의 전체 길이의 적어도 90%를 포함하는 단편을 암호화하는 핵산 서열; 및
    (l) 서열번호 8과 적어도 95% 동일한 단백질의 전체 길이의 적어도 90%를 포함하는 단편을 암호화하는 핵산 서열
    로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 핵산 서열을 포함하는, 핵산 분자.
  4. 핵산 분자로서,
    (a) 서열번호 1;
    (b) 서열번호 3;
    (c) 서열번호 1의 전체 길이의 적어도 90%를 포함하는 단편;
    (d) 서열번호 3의 전체 길이의 적어도 90%를 포함하는 단편;
    (e) 서열번호 1과 적어도 95% 동일한 단편;
    (f) 서열번호 3과 적어도 95% 동일한 단편;
    (g) 서열번호 1과 적어도 95% 동일한 핵산 서열의 전체 길이의 적어도 90%를 포함하는 단편; 및
    (h) 서열번호 3과 적어도 95% 동일한 핵산 서열의 전체 길이의 적어도 90%를 포함하는 단편
    으로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 핵산 서열을 포함하는, 핵산 분자.
  5. 서열번호 1에 제시된 핵산 서열을 포함하는, 핵산 분자.
  6. 서열번호 3에 제시된 핵산 서열을 포함하는, 핵산 분자.
  7. 의약으로서 사용하기 위한, 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항의 핵산 분자.
  8. 암의 치료에서 의약으로서 사용하기 위한, 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항의 핵산 분자.
  9. 의약의 제조에 사용하기 위한, 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항의 핵산 분자.
  10. 암의 치료를 위한 의약의 제조에 사용하기 위한, 제1항 내지 제6항 및 제9항 중 어느 한 항의 핵산 분자.
  11. 제1항 내지 제10항 중 어느 한 항의 핵산 분자를 포함하는, 벡터.
  12. 제11항에 있어서, 플라스미드 또는 바이러스 벡터를 포함하는, 벡터.
  13. 제1항 내지 제10항 중 어느 한 항에 제시된 바와 같은 1종 이상의 핵산 분자를 포함하는, 조성물.
  14. 제13항에 있어서, 약제학적으로 허용 가능한 담체를 포함하는, 조성물.
  15. 제11항 또는 제12항에 제시된 바와 같은 1종 이상의 벡터를 포함하는, 조성물.
  16. 단백질로서,
    (a) 서열번호 2의 아미노산 19 내지 159;
    (b) 서열번호 4의 아미노산 19 내지 210;
    (c) 서열번호 8의 아미노산 19 내지 232;
    (d) 서열번호 2의 아미노산 19 내지 159의 전체 길이의 적어도 90%를 포함하는 단편;
    (e) 서열번호 4의 아미노산 19 내지 210의 전체 길이의 적어도 90%를 포함하는 단편;
    (f) 서열번호 8의 아미노산 19 내지 232의 전체 길이의 적어도 90%를 포함하는 단편;
    (g) 서열번호 2의 아미노산 19 내지 159와 적어도 95% 동일한 아미노산 서열;
    (h) 서열번호 4의 아미노산 19 내지 210과 적어도 95% 동일한 아미노산 서열;
    (i) 서열번호 8의 아미노산 19 내지 232와 적어도 95% 동일한 아미노산 서열;
    (j) 서열번호 2의 아미노산 19 내지 159와 적어도 95% 동일한 아미노산 서열의 전체 길이의 적어도 90%를 포함하는 단편;
    (k) 서열번호 4의 아미노산 19 내지 210와 적어도 95% 동일한 아미노산 서열의 전체 길이의 적어도 90%를 포함하는 단편;
    (l) 서열번호 8의 아미노산 19 내지 232와 적어도 95% 동일한 아미노산 서열의 전체 길이의 적어도 90%를 포함하는 단편
    으로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는, 단백질.
  17. 단백질로서,
    (a) 서열번호 2;
    (b) 서열번호 4;
    (c) 서열번호 8;
    (d) 서열번호 2의 전체 길이의 적어도 90%를 포함하는 단편;
    (e) 서열번호 4의 전체 길이의 적어도 90%를 포함하는 단편;
    (f) 서열번호 8의 전체 길이의 적어도 90%를 포함하는 단편;
    (g) 서열번호 2와 적어도 95% 동일한 아미노산 서열;
    (h) 서열번호 4와 적어도 95% 동일한 아미노산 서열;
    (i) 서열번호 8과 적어도 95% 동일한 아미노산 서열;
    (j) 서열번호 2와 적어도 95% 동일한 아미노산 서열의 전체 길이의 적어도 90%를 포함하는 단편;
    (k) 서열번호 4와 적어도 95% 동일한 아미노산 서열의 전체 길이의 적어도 90%를 포함하는 단편; 및
    (l) 서열번호 8과 적어도 95% 동일한 아미노산 서열의 전체 길이의 적어도 90%를 포함하는 단편
    으로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는, 단백질.
  18. 서열번호 2에 제시된 아미노산 서열을 포함하는, 단백질.
  19. 서열번호 4에 제시된 아미노산 서열을 포함하는, 단백질.
  20. 서열번호 8에 제시된 아미노산 서열을 포함하는, 단백질.
  21. 제1항 내지 제10항 중 어느 한 항의 핵산 분자를 포함하는, 백신.
  22. 제11항 또는 제12항 중 어느 한 항의 벡터를 포함하는, 백신.
  23. 제18항 내지 제20항 중 어느 한 항에 있어서, 약제학적으로 허용 가능한 부형제를 더 포함하는, 백신.
  24. 제21항 내지 제23항 중 어느 한 항에 있어서, 아주반트를 더 포함하는, 백신.
  25. 제24항에 있어서, 상기 아주반트는 IL-12, IL-15, IL-28 또는 RANTES인, 백신.
  26. 서바이빈(Survivin)-발현 암성 세포를 갖는 대상체의 치료 방법으로서, 치료적 유효량의 제20항 내지 제25항 중 어느 한 항의 백신을 투여하는 단계를 포함하는, 치료 방법.
  27. 제26항에 있어서, 투여는 전기천공 단계를 포함하는, 치료 방법.
  28. 제26항 또는 제27항 중 어느 한 항에 있어서, 투여는 상기 대상체 상의 하나 이상의 부위에서 일어나는, 치료 방법.
  29. 서바이빈-발현 암성 세포에 대해서 대상체를 백신접종(vaccinating)하는 방법으로서, 체액 면역 반응 또는 세포 면역 반응을 유도하기에 효과적인 양의 제20항 내지 제25항 중 어느 한 항의 백신을 투여하는 단계를 포함하는, 백신접종하는 방법.
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