CN111479583A - 靶向存活素的癌症疫苗和其用途 - Google Patents

Abstract

本文公开包含一个或多个编码合成共有存活素抗原的核酸序列的核酸分子。公开了包含一个或多个编码合成共有存活素抗原的核酸序列的载体、组合物以及疫苗。公开了治疗患有表达存活素的肿瘤的个体的方法，和预防表达存活素的肿瘤的方法。公开了合成共有存活素抗原。

Description

靶向存活素的癌症疫苗和其用途

相关申请的交叉引用

本申请要求2017年12月13日提交的美国临时专利申请第62/598,267号的优先权和权益，所述美国临时专利申请的公开内容以全文引用的方式并入本文中。

序列表

本申请含有序列表，所述序列表已以ASCII格式以电子方式提交并且以全文引用的方式并入本文中。所述ASCII副本创建于2018年12月13日，命名为104409_000448_sequence_listing.txt并且大小为8,797个字节。

技术领域

本发明涉及存活素(Survivin)抗原和编码其的核酸分子。本发明还涉及包括此类存活素抗原和/或核酸分子的疫苗。本发明进一步涉及使用疫苗来诱导免疫反应和预防和/或治疗患有表达存活素的癌细胞和/或肿瘤的个体的方法。

背景技术

癌症是世界范围内的主要死因之一。在美国，癌症是第二大最常见的死因，死亡的人中几乎每4个就有1个是死于癌症。癌症由从正常细胞转化成癌细胞的单一细胞引起。此类转化通常是多阶段过程，从癌前病变进展到恶性肿瘤。多种因素促成这一进展，包括衰老、遗传贡献和暴露于外部作用物，如物理致癌物(例如，紫外光和电离辐射)、化学致癌物(例如，石棉、香烟烟雾组分等)以及生物致癌物(例如，某些病毒、细菌和寄生虫)。

癌症的预防、诊断以及治疗可以采取许多不同形式。预防可以包括筛查易感因素(pre-disposing factor)(例如，特定遗传变异体)、改变行为(例如，吸烟、饮食以及身体活动量)以及接种抗病毒(例如，人类乳头瘤病毒、乙型肝炎病毒)疫苗。治疗可以包括化疗、放疗以及手术去除肿瘤或癌组织。尽管有大量预防和治疗方法可供使用，但此类方法通常在有效预防和/或治疗癌症方面取得有限成功。

存活素也被称作杆状病毒凋亡抑制重复序列包含蛋白5(baculoviral inhibitorof apoptosis repeat-containing 5；BIRC5)，是阻断半胱氨酸蛋白酶功能并且从而阻止程序性细胞死亡的凋亡抑制子。除其在凋亡中的作用以外，存活素在有丝分裂中明确地具有必需的进化上保守的作用。(Li,F.等人《存活素对凋亡和有丝分裂纺锤体检查点的控制(Control of apoptosis and mitotic spindle checkpoint by Survivin)》.《自然(Nature)》396,580-584,doi:10.1038/25141(1998)。)存活素过表达与肿瘤细胞增殖、进展、血管生成、治疗抗性以及不良预后相关。在健康细胞和组织中，存活素表达缺乏或以低水平存在。然而，存活素是凋亡抑制蛋白(IAP)家族成员，并且IAP基因在不同癌细胞和原发肿瘤活检体中高表达。在IAP中，存活素展现肿瘤和胚胎组织中最显著的过表达。在多项卵巢癌研究中，测试存活素表达阳性的患者样品的数目范围是74％到92％。(参见Cohen,C.,Lohmann,C.M.,Cotsonis,G.,Lawson,D.和Santoianni,R.《卵巢癌中的存活素表达：与凋亡标记物和预后的相关性(Survivin expression in ovarian carcinoma:correlationwith apoptotic markers and prognosis)》.《现代病理学：美国和加拿大病理学会官方杂志(Modern pathology:an official journal of the United States and CanadianAcademy of Pathology,Inc)》16,574-583,doi:10.1097/01.MP.0000073868.31297.B0(2003)；Felisiak-Golabek,A.等人《核存活素表达是经紫杉烷-铂治疗的卵巢癌患者中的阳性预后因子(Nuclear Survivin expression is a positive prognostic factor intaxane-platinum-treated ovarian cancer patients)》.《卵巢研究杂志(Journal ofovarian research)》4,20,doi:10.1186/1757-2215-4-20(2011)。)存活素对瘤形成的贡献结合其在各种肿瘤中的限制性表达和过表达模式，使其成为癌症免疫疗法的有吸引力的靶标。

存活素是IAP家族的最小成员。其为16.3kD的蛋白质，由142个氨基酸组成并且特征为存在单一BIR重复序列。其还在其蛋白质结构中缺少羧基端RING指域。(Chen,X.,Duan,N.,Zhang,C.和Zhang,W.《存活素和肿瘤形成：分子机制与治疗策略(Survivin andTumorigenesis:Molecular Mechanisms and Therapeutic Strategies)》.《癌症杂志(Journal of Cancer)》7,314-323,doi:10.7150/jca.13332(2016)。)已鉴别出数种存活素同工型，并且存活素同工型1是显性转录物。存活素在胎儿发育期间表达，但在完全分化组织中不表达。然而，其在许多癌细胞中高表达。因此，存活素是癌症治疗的潜在靶抗原。

用于治疗和预防癌症，并且尤其上皮卵巢癌(EOC)的疫苗受到关注。然而，靶向肿瘤细胞抗原的现有疫苗受到体内不良抗原表达的限制。因此，所属领域中仍需要用于预防和/或治疗癌症和降低罹患癌症的个体的死亡率的安全且有效的疫苗和其使用方法。

发明内容

本文提供：

包含一种或多种选自由以下组成的组的核酸序列的核酸分子：(a)编码SEQ IDNO:2的氨基酸19-159的核酸序列；(b)编码SEQ ID NO:4的氨基酸19-210的核酸序列；(c)编码SEQ ID NO:8的氨基酸19-232的核酸序列；(d)编码包含SEQ ID NO:2的氨基酸19-159的全长的至少90％的片段的核酸序列；(e)编码包含SEQ ID NO:4的氨基酸19-210的全长的至少90％的片段的核酸序列；(f)编码包含SEQ ID NO:8的氨基酸19-232的全长的至少90％的片段的核酸序列；(g)编码与SEQ ID NO:2的氨基酸19-159具有至少95％一致性的蛋白质的核酸序列；(h)编码与SEQ ID NO:4的氨基酸19-210具有至少95％一致性的蛋白质的核酸序列；(i)编码与SEQ ID NO:8的氨基酸19-232具有至少95％一致性的蛋白质的核酸序列；(j)编码包含与SEQ ID NO:2的氨基酸19-159具有至少95％一致性的蛋白质的全长的至少90％的片段的核酸序列；(k)编码包含与SEQ ID NO:4的氨基酸19-210具有至少95％一致性的蛋白质的全长的至少90％的片段的核酸序列；以及(l)编码包含与SEQ ID NO:8的氨基酸19-232具有至少95％一致性的蛋白质的全长的至少90％的片段的核酸序列。

包含一种或多种选自由以下组成的组的核酸序列的核酸分子：(a)SEQ ID NO:1的核苷酸55-423；(b)SEQ ID NO:3的核苷酸55-636；(c)包含SEQ ID NO:1的核苷酸55-423的全长的至少90％的片段；(d)包含SEQ ID NO:3的核苷酸55-636的全长的至少90％的片段；(e)与SEQ ID NO:1的核苷酸55-423具有至少95％一致性的片段；(f)与SEQ ID NO:3的核苷酸55-636具有至少95％一致性的片段；(g)包含与SEQ ID NO:1的核苷酸55-423具有至少95％一致性的核酸序列的至少90％的片段；以及(h)包含与SEQ ID NO:3的核苷酸55-636具有至少95％一致性的核酸序列的至少90％的片段。

包含一种或多种选自由以下组成的组的核酸序列的核酸分子：(a)编码SEQ IDNO:2的核酸序列；(b)编码SEQ ID NO:4的核酸序列；(c)编码SEQ ID NO:8的核酸序列；(d)编码包含SEQ ID NO:2的全长的至少90％的片段的核酸序列；(e)编码包含SEQ ID NO:4的全长的至少90％的片段的核酸序列；(f)编码包含SEQ ID NO:8的全长的至少90％的片段的核酸序列；(g)编码与SEQ ID NO:2具有至少95％一致性的蛋白质的核酸序列；(h)编码与SEQ ID NO:4具有至少95％一致性的蛋白质的核酸序列；(i)编码与SEQ ID NO:8具有至少95％一致性的蛋白质的核酸序列；(j)编码包含与SEQ ID NO:2具有至少95％一致性的蛋白质的全长的至少90％的片段的核酸序列；(k)编码包含与SEQ ID NO:4具有至少95％一致性的蛋白质的全长的至少90％的片段的核酸序列；以及(l)编码包含与SEQ ID NO:8具有至少95％一致性的蛋白质的全长的至少90％的片段的核酸序列。

包含一种或多种选自由以下组成的组的核酸序列的核酸分子：(a)SEQ ID NO:1；(b)SEQ ID NO:3；(c)包含SEQ ID NO:1的全长的至少90％的片段；(d)包含SEQ ID NO:3的全长的至少90％的片段；(e)与SEQ ID NO:1具有至少95％一致性的片段；(f)与SEQ ID NO:3具有至少95％一致性的片段；(g)包含与SEQ ID NO:1具有至少95％一致性的核酸序列的全长的至少90％的片段；以及(h)包含与SEQ ID NO:3具有至少95％一致性的核酸序列的全长的至少90％的片段。

包含SEQ ID NO:1中所列的核酸序列的核酸分子。

包含SEQ ID NO:3中所列的核酸序列的核酸分子。

如本文所描述的核酸分子，其用作药剂。

如本文所描述的核酸分子，其用作用于治疗癌症的药剂。

如本文所描述的核酸分子，其用于制备药剂。

如本文所描述的核酸分子，其用于制备用于治疗癌症的药剂。

包含如本文所描述的核酸分子的载体。

包含质粒或病毒载体的载体。

包含一种或多种如本文所描述的核酸分子的组合物。

如本文所描述的组合物，其包含医药学上可接受的载剂。

如本文所描述的组合物，其包含一种或多种如本文所描述的载体。

包含选自由以下组成的组的氨基酸序列的蛋白质：(a)SEQ ID NO:2的氨基酸19-159；(b)SEQ ID NO:4的氨基酸19-210；(c)SEQ ID NO:8的氨基酸19-232；(d)包含SEQ IDNO:2的氨基酸19-159的全长的至少90％的片段；(e)包含SEQ ID NO:4的氨基酸19-210的全长的至少90％的片段；(f)包含SEQ ID NO:8的氨基酸19-232的全长的至少90％的片段；(g)与SEQ ID NO:2的氨基酸19-159具有至少95％一致性的氨基酸序列；(h)与SEQ ID NO:4的氨基酸19-210具有至少95％一致性的氨基酸序列；(i)与SEQ ID NO:8的氨基酸19-232具有至少95％一致性的氨基酸序列；(j)包含与SEQ ID NO:2的氨基酸19-159具有至少95％一致性的氨基酸序列的全长的至少90％的片段；(k)包含与SEQ ID NO:4的氨基酸19-210具有至少95％一致性的氨基酸序列的全长的至少90％的片段；以及(l)包含与SEQ ID NO:8的氨基酸19-232具有至少95％一致性的氨基酸序列的全长的至少90％的片段。

包含选自由以下组成的组的氨基酸序列的蛋白质：(a)SEQ ID NO:2；(b)SEQ IDNO:4；(c)SEQ ID NO:8；(d)包含SEQ ID NO:2的全长的至少90％的片段；(e)包含SEQ IDNO:4的全长的至少90％的片段；(f)包含SEQ ID NO:8的全长的至少90％的片段；(g)与SEQID NO:2具有至少95％一致性的氨基酸序列；(h)与SEQ ID NO:4具有至少95％一致性的氨基酸序列；(i)与SEQ ID NO:8具有至少95％一致性的氨基酸序列；(j)包含与SEQ ID NO:2具有至少95％一致性的氨基酸序列的全长的至少90％的片段；(k)包含与SEQ ID NO:4具有至少95％一致性的氨基酸序列的全长的至少90％的片段；以及(l)包含与SEQ ID NO:8具有至少95％一致性的氨基酸序列的全长的至少90％的片段。

包含SEQ ID NO:2中所列的氨基酸序列的蛋白质。

包含SEQ ID NO:4中所列的氨基酸序列的蛋白质。

包含SEQ ID NO:8中所列的氨基酸序列的蛋白质。

包含如本文所描述的核酸分子的疫苗。

包含如本文所描述的载体的疫苗。

如本文所描述的疫苗，其进一步包含医药学上可接受的赋形剂。

如本文所描述的疫苗，其进一步包含佐剂。

如本文所描述的疫苗，其中佐剂是IL-12、IL-15、IL-28或RANTES。

治疗具有表达存活素的癌细胞的个体的方法，其包含施用治疗有效量的如本文所描述的疫苗。

如本文所描述的方法，其中施用包括电穿孔步骤。

如本文所描述的方法，其中施用在个体上的一个或多个部位处进行。

针对表达存活素的癌细胞对个体进行疫苗接种的方法，其包含施用可有效诱导体液或细胞免疫反应的量的如本文所描述的疫苗。

附图说明

当结合附图阅读时，将进一步理解发明内容以及以下具体实施方式。出于说明本发明的目的，在附图中示出本发明的示例性实施例；然而，本发明不限于所公开的具体方法、组成和装置。在附图中：

图1显示合成共有存活素抗原同工型1的示意图。星号表示消除抗凋亡活性所必需的突变。

图2显示合成共有存活素抗原同工型1单体A(左侧)和单体B(右侧)的整体结构。相对于原生存活素的变化标示为球体。

图3显示合成共有存活素抗原同工型1T3的示意图。星号表示消除抗凋亡活性所必需的突变。右侧(3')深灰色区表示截短存活素同工型3(T3)区。

图4显示包括合成共有存活素抗原同工型1的pGX1428的构建。

图5显示包括合成共有存活素抗原同工型1T3的pGX1429的构建。

图6显示通过免疫印迹法测定，分别经pGX1428和pGX1429转染的人类横纹肌肉瘤(RD)细胞中合成共有存活素抗原1和合成共有存活素抗原1T3蛋白的表达。针对pGX1428(17.5kD)和pGX1429(25.3kD)检测到预期分子量的蛋白带。β-肌动蛋白用作内参照。

图7A到7H显示合成共有存活素抗原1和合成共有存活素抗原1T3的免疫原性。雌性CB6F1相隔3周用指定剂量的合成共有存活素1(pGX1428)(图7A-7D)、存活素1T3 pGX1429(E-H)(n＝8/组)或pGX0001(空载体)(n＝4)免疫接种3次。图7A：指定剂量的pGX1428下通过ELISpot测定的存活素1特异性IFNγ反应。图7B：存活素1特异性CD4+T细胞反应。图7C.存活素1特异性CD8+T细胞反应。图7D：指定剂量的pGX1429下通过ELISpot测定的存活素1T3特异性IFNγ反应。图7E：存活素1T3特异性CD4+T细胞反应。图7F：存活素1T3特异性CD8+T细胞反应。图7G：存活素1特异性CD4+T细胞和CD8+T细胞反应的细胞因子概况。图7H：存活素1T3特异性CD4+T细胞和CD8+T细胞反应的细胞因子概况。

图8显示流式细胞术设门策略。

图9显示CD4+和CD8+T细胞的相对频率。由pGX1428和pGX1429诱导的细胞免疫反应相对于CD8+T细胞隔室，主要在CD4+T细胞隔室中。

图10A到10F显示存活素特异性T细胞的细胞溶解潜能。抗原特异性T细胞的细胞溶解潜能由存活素1和存活素1T3诱导。图10A：存活素1特异性CD4+CD107a+T细胞的频率。图10B：存活素1T3特异性CD4+CD107a+T细胞的频率。图10C：CD4+CD107a+T细胞的细胞因子概况。图10D：存活素1特异性CD8+CD107a+T细胞的频率。图10E：存活素1T3特异性CD8+CD107a+T细胞的频率。图10F：CD4+CD107a+T细胞的细胞因子概况。

图11A到11D显示存活素IFN-γ反应的表位作图。IFNγ反应的宽度由存活素1和存活素1T3诱导。图11A：用50μg pGX1428、pGX1429或pGX0001处理之后的存活素1肽池。图11B：用50μg pGX1429或pGX0001处理之后的存活素T3肽池。pGX1428与pGX1429的序列比较，矩阵池的位置由虚线框指示。图11C：pGX1428与pGX1429的序列比较。红色文字的氨基酸指示由矩阵作图鉴别的表位。加下划线的文字表示添加到合成共有存活素抗原中的序列部分：N端指示IgELS个RGRKRRS弗林蛋白酶(furin)裂解位点。图11D：存活素1和存活素T3矩阵设计。诱发反应的肽由虚线框指示。

图12显示来自使用包含合成共有存活素1T3的本公开实施例免疫接种的各个非人类灵长类动物的存活素特异性IFNγSFU/10⁶个PBMC。

图13显示来自使用包含合成共有存活素1T3以及低剂量IL-12(0.04mg)的本公开实施例免疫接种的各个非人类灵长类动物的存活素特异性IFNγSFU/10⁶个PBMC。

图14显示来自使用包含合成共有存活素1T3以及高剂量IL-12(0.20mg)的本公开实施例免疫接种的各个非人类灵长类动物的存活素特异性IFNγSFU/10⁶个PBMC。

图15A到15C显示NHP研究的各个动物结果，并且还显示用合成共有存活素1构建体和合成共有存活素1T3构建体免疫接种之间的比较。图15A显示第1组动物结果；图15B显示第2组动物结果；并且图15C显示第3组动物结果。

具体实施方式

本发明涉及包含合成共有存活素抗原的疫苗。存活素在许多肿瘤中表达。因此，疫苗提供针对表达BORIS的癌症或基于癌症的肿瘤的治疗。

合成共有存活素抗原可以是来源于来自不同物种或来自物种内的不同同工型的存活素的序列的共有存活素抗原，并且因此合成共有存活素抗原是非原生的。共有存活素抗原可以通过将一个或多个突变引入到共有序列中以产生合成共有序列来进一步修饰。突变可以中断或修饰原生存活素序列的特定功能域，从而干扰或增强功能域的结构或功能。在一些实施例中，将额外序列添加到合成共有存活素抗原序列中以引入新结构或功能。举例来说，合成共有存活素抗原序列可以具有弗林蛋白酶裂解位点。合成共有存活素抗原序列可以包括额外定位信号以增强最终蛋白质产物的细胞外转运。额外定位信号可以是IgELS或其它细胞转运序列。

合成共有存活素抗原可以诱导抗原特异性T细胞和/或高滴度抗体反应，从而诱导或诱发针对表达所述抗原的癌症或肿瘤或对表达所述抗原的癌症或肿瘤具有反应性的免疫反应。在一些实施例中，诱导或诱发的免疫反应可以是细胞、体液免疫反应，或细胞与体液免疫反应两者。在一些实施例中，诱导或诱发的细胞免疫反应可以包括诱导或分泌干扰素-γ(IFN-γ)和/或肿瘤坏死因子α(TNF-α)和/或白介素2(IL-2)。在其它实施例中，诱导或诱发的免疫反应可以减少或抑制一种或多种促进表达所述抗原的肿瘤或癌症生长的免疫遏制因子，例如(但不限于)下调MHC呈递的因子、上调抗原特异性调控T细胞(Treg)的因子、PD-L1、FasL、细胞因子(如IL-10和TFG-β)、肿瘤相关巨噬细胞、肿瘤相关成纤维细胞、由免疫遏制细胞产生的可溶因子、CTLA-4、PD-1、MDSC、MCP-1以及免疫检查点分子。

本发明的疫苗可以针对需要治疗的个体的癌症的特定预防或治疗来提供特定癌症抗原的任何组合。

一种用于设计重组癌症抗原的核酸和其编码的氨基酸序列的方式是引入突变，所述突变改变原生癌症抗原的整体氨基酸序列中的特定氨基酸。突变的引入不是使癌症抗原发生太多的改变以致其无法普遍地在哺乳动物个体(并且优选人类或犬个体)中施加，而是其变化足以使得所得氨基酸序列破坏耐受性或被视为外来抗原以便产生免疫反应。另一种方式可以是产生一种共有重组癌症抗原，其相比于其对应的原生癌症抗原具有至少85％并且至多99％氨基酸序列一致性；优选至少90％并且至多98％序列一致性；更优选至少93％并且至多98％序列一致性；或甚至更优选至少95％并且至多98％序列一致性。在一些情况下，重组癌症抗原相比于其对应的原生癌症抗原具有95％、96％、97％、98％或99％氨基酸序列一致性。原生癌症抗原是通常与特定癌症或癌症肿瘤相关的抗原。视癌症抗原而定，癌症抗原的共有序列可以是跨哺乳动物物种的或属于物种亚型内或是跨病毒株或血清型的。一些癌症抗原相对于癌症抗原的野生型氨基酸序列并无太大变化。一些癌症抗原的核酸/氨基酸序列跨物种如此趋异，以致无法产生共有序列。在这些情况下，产生了将破坏耐受性并且产生免疫反应的重组癌症抗原，所述重组癌症抗原相比于其对应的原生癌症抗原具有至少85％并且至多99％氨基酸序列一致性；优选至少90％并且至多98％序列一致性；更优选至少93％并且至多98％序列一致性；或甚至更优选至少95％并且至多98％序列一致性。在一些情况下，重组癌症抗原相比于其对应的原生癌症抗原具有95％、96％、97％、98％或99％氨基酸序列一致性。前述方法可以组合，使得最终重组癌症抗原与原生癌症抗原氨基酸序列具有一定百分比的相似性，如上文所论述。

疫苗可以进一步与检查点抑制(如PD-1和PDL-1)抗体组合，以增加对细胞与体液免疫反应两者的刺激。使用抗PD-1或抗PDL-1抗体阻止PD-1或PDL-1遏制T细胞和/或B细胞反应。总的来说，设计被免疫系统识别的癌症抗原有助于克服肿瘤细胞的其它免疫遏制形式，并且这些疫苗可以与遏制或抑制疗法(如抗PD-1和抗PDL-1抗体疗法)组合使用以进一步增加T细胞和/或B细胞反应。

疫苗可以使无肿瘤生存率提高30％、31％、32％、33％、34％、35％、36％、37％、38％、39％、40％、41％、42％、43％、44％以及45％。在免疫接种之后，疫苗可以使肿瘤质量减少30％、31％、32％、33％、34％、35％、36％、37％、38％、39％、40％、41％、42％、43％、44％、45％、46％、47％、48％、49％、50％、51％、52％、53％、54％、55％、56％、57％、58％、59％以及60％。疫苗可以阻止并且阻断单核细胞趋化蛋白1(MCP-1)的增加，所述蛋白为由骨髓来源的遏制细胞分泌的细胞因子。疫苗可以使肿瘤生存率提高30％、31％、32％、33％、34％、35％、36％、37％、38％、39％、40％、41％、42％、43％、44％、45％、46％、47％、48％、49％、50％、51％、52％、53％、54％、55％、56％、57％、58％、59％以及60％。

相比于未施用疫苗的个体的细胞免疫反应，疫苗可以使施用疫苗的个体的细胞免疫反应提高约50倍到约6000倍、约50倍到约5500倍、约50倍到约5000倍、约50倍到约4500倍、约100倍到约6000倍、约150倍到约6000倍、约200倍到约6000倍、约250倍到约6000倍，或约300倍到约6000倍。在一些实施例中，相比于未施用疫苗的个体的细胞免疫反应，疫苗可以使施用疫苗的个体的细胞免疫反应提高约50倍、100倍、150倍、200倍、250倍、300倍、350倍、400倍、450倍、500倍、550倍、600倍、650倍、700倍、750倍、800倍、850倍、900倍、950倍、1000倍、1100倍、1200倍、1300倍、1400倍、1500倍、1600倍、1700倍、1800倍、1900倍、2000倍、2100倍、2200倍、2300倍、2400倍、2500倍、2600倍、2700倍、2800倍、2900倍、3000倍、3100倍、3200倍、3300倍、3400倍、3500倍、3600倍、3700倍、3800倍、3900倍、4000倍、4100倍、4200倍、4300倍、4400倍、4500倍、4600倍、4700倍、4800倍、4900倍、5000倍、5100倍、5200倍、5300倍、5400倍、5500倍、5600倍、5700倍、5800倍、5900倍或6000倍。

相比于未施用疫苗的个体的干扰素γ(IFN-γ)水平，疫苗可以使施用疫苗的个体的IFN-γ水平提高约50倍到约6000倍、约50倍到约5500倍、约50倍到约5000倍、约50倍到约4500倍、约100倍到约6000倍、约150倍到约6000倍、约200倍到约6000倍、约250倍到约6000倍，或约300倍到约6000倍。在一些实施例中，相比于未施用疫苗的个体的IFN-γ水平，疫苗可以使施用疫苗的个体的IFN-γ水平提高约50倍、100倍、150倍、200倍、250倍、300倍、350倍、400倍、450倍、500倍、550倍、600倍、650倍、700倍、750倍、800倍、850倍、900倍、950倍、1000倍、1100倍、1200倍、1300倍、1400倍、1500倍、1600倍、1700倍、1800倍、1900倍、2000倍、2100倍、2200倍、2300倍、2400倍、2500倍、2600倍、2700倍、2800倍、2900倍、3000倍、3100倍、3200倍、3300倍、3400倍、3500倍、3600倍、3700倍、3800倍、3900倍、4000倍、4100倍、4200倍、4300倍、4400倍、4500倍、4600倍、4700倍、4800倍、4900倍、5000倍、5100倍、5200倍、5300倍、5400倍、5500倍、5600倍、5700倍、5800倍、5900倍或6000倍。

如下文更详细地描述，疫苗可以进一步包含一种或多种免疫检查点分子的一种或多种抑制剂(即，免疫检查点抑制剂)。免疫检查点分子更详细地描述于下文。免疫检查点抑制剂是阻止免疫系统中的任何组分(如MHC类呈递、T细胞呈递和/或分化、B细胞呈递和/或分化、任何细胞因子、趋化因子或用于免疫细胞增殖和/或分化的信号传导)被遏制的任何核酸或蛋白质。还如下文更详细地描述，疫苗可以进一步与检查点抑制(如PD-1和PDL-1)抗体组合，以增加对细胞与体液免疫反应两者的刺激。使用抗PD-1或抗PDL-1抗体阻止PD-1或PDL-1遏制T细胞和/或B细胞反应。

定义

除非另外定义，否则本文中所用的所有技术和科学术语具有与所属领域普通技术人员通常所理解相同的含义。在有冲突的情况下，将以本文档(包括定义)为准。下文描述优选方法和材料，但与本文所描述的那些类似或等效的方法和材料可用于实施或测试本发明。本文所提及的所有公开、专利申请、专利和其它参考文献以全文引用的方式并入。本文所公开的材料、方法和实例仅为说明性的且不意图为限制性的。本文所用的术语仅出于描述特定实施例的目的，并且不意图为限制性的。

如本文所用，术语“包含”、“包括”、“具有(having/has)”、“可以”、“含有”以及其变化形式意图是开放性过渡短语、术语或措辞，其不排除额外动作或结构的可能性。除非上下文另外明确规定，否则单数形式“一”、“和”以及“所述”包括多个参考物。本公开还涵盖“包含本文提出的实施例或要素”、“由本文提出的实施例或要素组成”和“大体上由本文提出的实施例或要素组成”的其它实施例，而不管是否明确阐述。

本文中叙述数值范围时，明确涵盖每个中间值，所述中间值的精确度与所述范围最小值和最大值相同。举例来说，对于范围6-9，除了6和9之外涵盖数字7和8，并且对于范围6.0-7.0，明确涵盖数字6.0、6.1、6.2、6.3、6.4、6.5、6.6、6.7、6.8、6.9以及7.0。

如本文所用，“佐剂”意指添加到本文所描述的疫苗中以增强抗原的免疫原性的任何分子。

如本文所用，“抗体”意指如下类别的抗体：IgG、IgM、IgA、IgD或IgE，或其片段，或衍生物，包括Fab、F(ab')₂、Fd和单链抗体、双链抗体、双特异性抗体、双功能抗体以及其衍生物。抗体可以是从哺乳动物血清样品中分离的抗体、多克隆抗体、亲和纯化抗体，或其任何混合物，其对所期望的表位或由所述表位衍生的序列展现充分的结合特异性。

“抗原”是指具有包括以下的合成共有存活素抗原氨基酸序列的蛋白质：(a)SEQID NO:2的氨基酸19-159；(b)SEQ ID NO:4的氨基酸19-210；(c)SEQ ID NO:8的氨基酸19-232；(d)包含SEQ ID NO:2的氨基酸19-159的至少90％的片段；(e)包含SEQ ID NO:4的氨基酸19-210的至少90％的片段；(f)包含SEQ ID NO:8的氨基酸19-232的至少90％的片段；(g)与SEQ ID NO:2的氨基酸19-159具有至少95％一致性的蛋白质；(h)与SEQ ID NO:4的氨基酸19-210具有至少95％一致性的蛋白质；(i)与SEQ ID NO:8的氨基酸19-232具有至少95％一致性的蛋白质；(j)包含与SEQ ID NO:2的氨基酸19-159具有至少95％一致性的蛋白质的至少90％的片段；(k)包含与SEQ ID NO:4的氨基酸19-210具有至少95％一致性的蛋白质的至少90％的片段；以及(l)包含与SEQ ID NO:8的氨基酸19-232具有至少95％一致性的蛋白质的至少90％的片段。“抗原”还指具有包括以下的合成共有存活素抗原氨基酸序列的蛋白质：(a)SEQ ID NO:2；(b)SEQ ID NO:4；(c)SEQ ID NO:8；(d)包含SEQ ID NO:2的全长至少90％的片段；(e)包含SEQ ID NO:4的全长的至少90％的片段；(f)包含SEQ ID NO:8的全长的至少90％的片段；(g)与SEQ ID NO:2具有至少95％一致性的蛋白质；(h)与SEQ ID NO:4具有至少95％一致性的蛋白质；(i)与SEQ ID NO:8具有至少95％一致性的蛋白质；(j)包含与SEQ ID NO:2具有至少95％一致性的蛋白质的全长的至少90％的片段；(k)包含与SEQ IDNO:4具有至少95％一致性的蛋白质的全长的至少90％的片段；以及(l)包含与SEQ ID NO:8具有至少95％一致性的蛋白质的全长的至少90％的片段。抗原可以任选地包括信号肽，如来自其它蛋白质的那些肽。

如本文所用，“编码序列”或“编码核酸”意指包含编码蛋白质的核苷酸序列的核酸(RNA或DNA分子)。编码序列可以进一步包括可操作地连接到调控元件的起始和终止信号，所述调控元件包括启动子和聚腺苷酸化信号，能够引导核酸所施用的个体或哺乳动物的细胞中的表达。

如本文关于核酸所用的“互补序列(Complement)”或“互补(complementary)”可以意指核酸分子的核苷酸或核苷酸类似物之间的沃森-克里克(Watson-Crick)碱基配对(例如，A-T/U和C-G)或胡斯坦(Hoogsteen)碱基配对。

如本文所用，“共有”或“共有序列”意指一种多肽序列，其基于来自不同生物体或来自生物体内的不同同工型的相同基因的多个序列的比对分析。可以制备编码共有多肽序列的核酸序列。

如本文所用，“恒定电流”描述组织或界定所述组织的细胞在电脉冲持续递送到相同组织期间所接收或经历的电流。电脉冲是从本文所描述的电穿孔装置中递送。由于本文提供的电穿孔装置具有反馈元件(优选具有瞬时反馈)，因此这种电流在所述组织中以恒定安培数在电脉冲的寿命期保持。反馈元件可以测量在整个脉冲持续时间中组织(或细胞)的电阻并且使电穿孔装置改变其电能输出(例如，提高电压)，因此相同组织中的电流在整个电脉冲(约几微秒)中和脉冲与脉冲之间保持恒定。在一些实施例中，反馈元件包含控制器。

如本文所用，“电流反馈”或“反馈”可互换使用并且可以意指所提供的电穿孔装置的主动响应，包含测量电极之间的组织中的电流和相应地改变EP装置所递送的能量输出以便将电流维持在恒定水平。这种恒定水平是由用户在起始脉冲序列或电处理之前预设。反馈可以通过电穿孔装置的电穿孔组件(例如，控制器)实现，因为其中的电路能够连续地监测电极之间的组织中的电流并且将监测到的那个电流(或组织内的电流)与预设电流进行比较，并且连续地进行能量输出调节以将所监测的电流维持在预设水平。反馈环路因其是模拟闭环反馈而可以是瞬时的。

如本文所用，“分散电流”可以意指本文所描述的电穿孔装置的多个针电极阵列所递送的电流模式，其中所述模式使正被电穿孔的组织的任何区域上的电穿孔相关热应激的发生最小化或优选消除。

如本文中可互换使用的“电穿孔”、“电渗透”或“电动力学增强”(“EP”)意指使用跨膜电场脉冲诱导生物膜中产生微观路径(孔隙)；其存在允许生物分子(如质粒、寡核苷酸、siRNA、药物、离子以及水)从细胞膜的一侧通过到达另一侧。

如本文关于核酸序列所用的“片段”意指编码多肽的核酸序列或其一部分，所述多肽能够在哺乳动物中诱发与本文所公开的抗原交叉反应的免疫反应。片段可以是DNA片段，其选自以下所列编码蛋白质片段的多种核苷酸序列中的至少一种。片段可以包含以下所列核酸序列中的一种或多种的至少10％、至少20％、至少30％、至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％或至少95％，不包括所添加的异源信号肽。片段可以包含以下所列核酸序列中的一种或多种的至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％并且另外任选地包含编码异源信号肽的序列，当计算一致性百分比时，编码异源信号肽的序列不必包括在内。片段可以进一步包含信号肽(如免疫球蛋白信号肽，例如IgE或IgG信号肽)的编码序列。编码N端甲硫氨酸和/或信号肽的编码序列可以连接到编码序列的片段。

在一些实施例中，片段可以包含以下所列核酸序列中的至少一种的至少20个核苷酸或更多、至少30个核苷酸或更多、至少40个核苷酸或更多、至少50个核苷酸或更多、至少60个核苷酸或更多、至少70个核苷酸或更多、至少80个核苷酸或更多、至少90个核苷酸或更多、至少100个核苷酸或更多、至少150个核苷酸或更多、至少200个核苷酸或更多、至少250个核苷酸或更多、至少300个核苷酸或更多、至少350个核苷酸或更多、至少400个核苷酸或更多、至少450个核苷酸或更多、至少500个核苷酸或更多、至少550个核苷酸或更多、至少600个核苷酸或更多或至少650个核苷酸或更多。

关于多肽序列的“片段”或“免疫原性片段”意指一种多肽，其能够在哺乳动物中诱发与本文所公开的抗原交叉反应的免疫反应。片段可以是选自以下多种氨基酸序列中的至少一种的多肽片段。共有蛋白质的片段可以包含共有蛋白质的至少10％、至少20％、至少30％、至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％或至少95％，不包括所添加的任何异源信号肽。片段可以包含以下所列氨基序列中的一种或多种的至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％并且另外任选地包含异源信号肽，当计算一致性百分比时，异源信号肽不必包括在内。片段可以进一步包含信号肽，如免疫球蛋白信号肽，例如IgE或IgG信号肽。

在一些实施例中，共有蛋白质的片段可以包含本文所公开的蛋白质序列的至少20个氨基酸或更多、至少30个氨基酸或更多、至少40个氨基酸或更多、至少50个氨基酸或更多、至少60个氨基酸或更多、至少70个氨基酸或更多、至少80个氨基酸或更多、至少90个氨基酸或更多、至少100个氨基酸或更多、至少110个氨基酸或更多、至少120个氨基酸或更多、至少130个氨基酸或更多、至少140个氨基酸或更多、至少150个氨基酸或更多、至少160个氨基酸或更多、至少170个氨基酸或更多、至少180个氨基酸或更多、至少200个氨基酸或更多或至少220个氨基酸或更多。

如本文所用，术语“基因构建体”是指包含编码蛋白质的核苷酸序列的DNA或RNA分子。编码序列包括可操作地连接到调控元件的起始和终止信号，所述调控元件包括启动子和聚腺苷酸化信号，能够引导核酸分子所施用的个体的细胞中的表达。如本文所用，术语“可表达形式”是指一种基因构建体，其含有可操作地连接到编码蛋白质的编码序列的必需调控元件，使得当存在于个体的细胞时，编码序列将被表达。

如本文所用，术语“同源性”是指互补程度。可以存在部分同源性或完全同源性(即，一致性)。使用功能术语“大体上同源”提及部分互补序列，其至少部分地抑制完全互补序列与靶核酸杂交。在关于双链核酸序列(如cDNA或基因组克隆)使用时，如本文所用的术语“大体上同源”是指能够与双链核酸序列的链在低严格度的条件下杂交的探针。在关于单链核酸序列使用时，如本文所用的术语“大体上同源”是指能够与单链核酸模板序列在低严格度的条件下杂交(即，是单链核酸模板序列的互补序列)的探针。

如本文在两种或更多种核酸或多肽序列的情形下所用，“一致(Identical)”或“一致性(identity)”是指序列的指定区域内指定百分比的残基相同。百分比可以如下计算：将两个序列最优地比对，在指定区域内比较两个序列，测定两个序列中存在相同残基的位置数以产生匹配位置数，将匹配位置数除以指定区域中的位置总数，并且将结果乘以100产生序列一致性百分比。在两个序列具有不同长度或比对产生一个或多个交错端并且指定比较区域仅包括单个序列的情况下，单个序列的残基包括于计算的分母而非分子中。当比较DNA和RNA时，胸腺嘧啶(T)与尿嘧啶(U)可以视为等效的。一致性可以人工方式或通过使用计算机序列算法(如BLAST或BLAST 2.0)执行。

当论述反馈机理时，可以使用如本文所用的“阻抗”并且其可以根据欧姆定律(Ohm's law)换算成电流值，从而能够与预设电流比较。

如本文所用，“免疫反应”意指宿主免疫系统(例如，哺乳动物的免疫系统)响应于抗原的引入而激活。免疫反应可以呈细胞反应或体液反应的形式，或两者。

如本文所用，“核酸”或“寡核苷酸”或“聚核苷酸”意指共价连接在一起的至少两个核苷酸。单链的描绘还定义了互补链的序列。因此，核酸还涵盖所描绘单链的互补链。核酸的许多变异体可以用于与给定核酸相同的目的。因此，核酸还涵盖大体上一致的核酸和其互补序列。单链提供了可以与靶序列在严格杂交条件下杂交的探针。因此，核酸还涵盖在严格杂交条件下杂交的探针。

核酸可以是单链或双链的，或可以含有双链和单链序列的部分。核酸可以是DNA(基因组和cDNA两者)、RNA或杂合体，在杂合体中核酸可以含有脱氧核糖核苷酸和核糖核苷酸的组合以及碱基的组合，所述碱基包括尿嘧啶、腺嘌呤、胸腺嘧啶、胞嘧啶、鸟嘌呤、肌苷、黄嘌呤、次黄嘌呤、异胞嘧啶以及异鸟嘌呤。核酸可以通过化学合成方法或重组方法获得。

如本文所用，“可操作地连接”意指基因在与其空间连接的启动子控制下表达。启动子可以位于处于其控制下的基因的5'(上游)或3'(下游)。启动子和基因之间的距离可以与产生启动子的基因中所述启动子和其控制的基因之间的距离大致相同。如所属领域中已知，可以适应这一距离的变化而不损失启动子功能。

如本文所用，“肽”、“蛋白质”或“多肽”可以意指所连接的氨基酸序列并且可以是天然的、合成的，或天然的与合成的修改或组合。

如本文所用，“启动子”意指一种合成或天然来源的分子，其能够赋予、激活或增强细胞中的核酸表达。启动子可以包含一个或多个特定转录调控序列以进一步增强表达和/或改变核酸在细胞中的空间表达和/或时间表达。启动子还可以包含远端增强或阻遏元件，其可以位于离转录起始位点多达数千个碱基对处。启动子可以来源于包括病毒、细菌、真菌、植物、昆虫以及动物的源。启动子可以组成性调控基因组件的表达，或根据发生表达的细胞、组织或器官，或根据发生表达的发育阶段，或响应于外部刺激(如生理应激、病原体、金属离子或诱导剂)差异性调控基因组件的表达。启动子的代表性实例包括细菌噬菌体T7启动子、细菌噬菌体T3启动子、SP6启动子、lac操纵子-启动子、tac启动子、SV40晚期启动子、SV40早期启动子、RSV-LTR启动子、CMV IE启动子、SV40早期启动子或SV40晚期启动子以及CMV IE启动子。

“信号肽”和“前导序列”在本文中可互换使用并且是指能够在本文所列蛋白质的氨基端连接的氨基酸序列。信号肽/前导序列典型地引导蛋白质定位。本文所用的信号肽/前导序列优选促进蛋白质从产生其的细胞中分泌出来。从细胞中分泌出来后，信号肽/前导序列通常从蛋白质的其余部分(通常称为成熟蛋白质)裂解。信号肽/前导序列连接于蛋白质的氨基端(即，N端)。

如本文所用，“严格杂交条件”意指如在核酸的复杂混合物中，第一核酸序列(例如，探针)将与第二核酸序列(例如，靶标)杂交的条件。严格条件是序列相关的并且会随情况不同而不同。可以选择严格条件比特定序列在所限定的离子强度pH下的热熔点(Tm)低约5-10℃。Tm可以是50％的与靶标互补的探针与靶序列在平衡(由于靶序列过量存在，在Tm下，在平衡下占据50％探针)下杂交的温度(在限定的离子强度、pH和核浓度下)。严格条件可以是在pH 7.0到8.3下盐浓度低于约1.0M钠离子，如约0.01-1.0M钠离子浓度(或其它盐)，并且对于短探针(例如，约10-50个核苷酸)温度至少约30℃且对于长探针(例如，超过约50个核苷酸)温度至少约60℃的条件。严格条件也可以通过添加去稳定化剂(如甲酰胺)来实现。对于选择性或特异性杂交，正信号可以是背景杂交的至少2到10倍。示例性严格杂交条件包括以下：50％甲酰胺、5×SSC和1％SDS，在42℃下培育，或5×SSC、1％SDS，在65℃下培育，在0.2×SSC和0.1％SDS中在65℃下洗涤。

如本文所用，“个体”可以意指想要或需要用本文所描述的疫苗免疫接种的哺乳动物。哺乳动物可以是人类、黑猩猩、犬、猫、马、奶牛、小鼠或大鼠。

如本文所用，“大体上互补”意指在8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100、180、270、360、450、540个或更多核苷酸或氨基酸的区域内，第一序列与第二序列的互补序列至少60％、65％、70％、75％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％一致，或两个序列在严格杂交条件下杂交。

如本文所用，“大体上一致”意指在8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100、180、270、360、450、540个或更多核苷酸或氨基酸的区域内，第一序列与第二序列至少60％、65％、70％、75％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％一致，或就核酸来说，第一序列与第二序列的互补序列大体上互补的情况。

如本文所用，“治疗(treat/treatment/treating)”可以意指通过预防、遏制、阻遏或完全消除疾病的方式保护动物以免患病。预防疾病涉及在疾病发作之前向动物施用本发明的疫苗。遏制疾病涉及在诱导疾病之后但在其临床表现之前向动物施用本发明的疫苗。阻遏疾病涉及在疾病存在临床表现后向动物施用本发明的疫苗。

如本文关于核酸使用的“变异体”意指(i)参考核苷酸序列的一部分或片段；(ii)参考核苷酸序列或其一部分的互补序列；(iii)与参考核酸或其互补序列大体上一致的核酸；或(iv)在严格条件下与参考核酸、其互补序列或与其大体上一致的序列杂交的核酸。

如本文关于肽或多肽所用的“变异体”意指氨基酸序列因氨基酸的插入、缺失或保守取代而不同、但保留至少一种生物活性的肽或多肽。变异体也可以意指氨基酸序列与参考蛋白质大体上一致并且氨基酸序列保留至少一种生物活性的蛋白质。氨基酸的保守取代，即，用具有相似特性(例如，亲水性、带电区域的程度和分布)的不同氨基酸替代氨基酸在所属领域中被认为是典型地涉及次要改变。这些次要改变可以如所属领域中所理解通过考虑氨基酸的亲水指数来部分地鉴别。Kyte等人,《分子生物学杂志(J.Mol.Biol.)》157:105-132(1982)。氨基酸的亲水指数是基于对其疏水性和电荷的考虑。所属领域中已知具有相似亲水指数的氨基酸可以被取代并且仍保留蛋白质功能。在一个方面，亲水指数为±2的氨基酸被取代。氨基酸的亲水性也可以用于揭示使蛋白质保留生物功能的取代。在肽的情形下考虑氨基酸的亲水性可以计算所述肽的最大局部平均亲水性，这是一种有用的量度，据报道与抗原性和免疫原性很好地相关。美国专利4,554,101，以引用的方式完全并入本文中。如所属领域所理解，具有相似亲水性值的氨基酸的取代可以使肽保留生物活性，例如免疫原性。取代可以用亲水性值在彼此±2内的氨基酸进行。氨基酸的疏水性指数和亲水性值都受所述氨基酸的特定侧链影响。与观察结果一致，与生物功能相容的氨基酸取代应理解为依赖于氨基酸，并且尤其那些氨基酸的侧链的相对相似性，如由疏水性、亲水性、电荷、尺寸和其它特性所揭示。

变异体可以是在全基因序列或其片段的全长上大体上一致的核酸序列。核酸序列在基因序列或其片段的全长上可以80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％一致。变异体可以是在氨基酸序列或其片段的全长上大体上一致的氨基酸序列。氨基酸序列在氨基酸序列或其片段的全长上可以80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％一致。

如本文所用，“载体”意指含有复制起点的核酸序列。载体可以是病毒载体、细菌噬菌体、细菌人工染色体或酵母人工染色体。载体可以是DNA或RNA载体。载体可以是自复制染色体外载体，并且优选DNA质粒。载体可以含有或包括一种或多种异源核酸序列。

疫苗

本文提供了包含如本文所公开的合成共有存活素抗原的疫苗、编码抗原的核酸分子、编码抗原的片段的核酸分子、编码抗原的变异体的核酸分子或编码其组合的核酸分子。疫苗可能能够在个体中产生针对抗原的免疫反应。免疫反应可以是治疗性或预防性免疫反应。如下文更详细地描述，疫苗可包含载体或多种载体。

在一些实施例中，疫苗包含核酸分子。在一些实施例中，核酸分子编码合成共有存活素抗原。在一些实施例中，核酸分子包含编码SEQ ID NO:3的核酸序列；编码包含SEQ IDNO 3的长度的至少90％的片段的核酸序列；编码与SEQ ID NO:3具有至少95％一致性的蛋白质的核酸序列；或编码包含与SEQ ID NO:3具有至少95％一致性的蛋白质的全长的至少90％的片段的核酸序列。在一些实施例中，核酸分子包含SEQ ID NO:1；包含SEQ ID NO:1的全长的至少90％的片段；与SEQ ID NO:1具有至少95％一致性的片段；或包含与SEQ ID NO:1具有至少95％一致性的核酸序列的全长的至少90％的片段。

在一些实施例中，核酸分子包含编码SEQ ID NO:4的核酸序列；编码包含SEQ IDNO 4的长度的至少90％的片段的核酸序列；编码与SEQ ID NO:4具有至少95％一致性的蛋白质的核酸序列；或编码包含与SEQ ID NO:4具有至少95％一致性的蛋白质的全长的至少90％的片段的核酸序列。在一些实施例中，核酸分子包含SEQ ID NO:2；包含SEQ ID NO:2的全长的至少90％的片段；与SEQ ID NO:2具有至少95％一致性的片段；或包含与SEQ ID NO:2具有至少95％一致性的核酸序列的全长的至少90％的片段。

在一些实施例中，疫苗包含合成共有存活素抗原，其中抗原包含SEQ ID NO:3；包含SEQ ID NO 3的长度的至少90％的片段；与SEQ ID NO:3具有至少95％一致性的氨基酸序列；或包含与SEQ ID NO:3具有至少95％一致性的蛋白质的全长的至少90％的片段。

在一些实施例中，疫苗包含合成共有存活素抗原，其中抗原包含SEQ ID NO:4；包含SEQ ID NO 4的长度的至少90％的片段；与SEQ ID NO:4具有至少95％一致性的氨基酸序列；或包含与SEQ ID NO:4具有至少95％一致性的蛋白质的全长的至少90％的片段。

疫苗可以用于防止癌症，例如表达存活素的癌症或肿瘤。疫苗可以用于预防和/或治疗有需要的个体的表达存活素的肿瘤。疫苗可以诱导针对存活素和针对表达存活素的肿瘤的细胞和/或抗体反应。

在一个实施例中，疫苗可以用于防止、预防和/或治疗表达存活素的卵巢癌细胞，具体地说表达存活素的上皮卵巢癌细胞，并且更具体地说表达存活素的浆液性卵巢癌细胞，和/或诱导针对所述细胞的细胞和/或抗体反应。

如本文所描述的癌症疫苗的开发包含鉴别未由免疫系统识别并且是肿瘤相关(“癌症/睾丸”、“C/T”)抗原的癌症抗原，例如存活素。为了被免疫系统识别，将所鉴别的癌症抗原从自身抗原变为外来抗原。将重组癌症抗原的核酸和氨基酸序列从自身抗原再设计为外来抗原破坏了免疫系统对抗原的耐受性。为了破坏耐受性，可以将数种再设计措施施加到癌症抗原，如下文所描述。

疫苗中的重组癌症抗原不被识别为自身抗原，从而破坏耐受性。破坏耐受性可以诱导抗原特异性T细胞和/或高滴度抗体反应，从而诱导或诱发针对表达抗原的癌症或肿瘤或对表达抗原的癌症或肿瘤具有反应性的免疫反应。在一些实施例中，诱导或诱发的免疫反应可以是细胞、体液免疫反应，或细胞与体液免疫反应两者。在一些实施例中，诱导或诱发的细胞免疫反应可以包括诱导或分泌干扰素-γ(IFN-γ)和/或肿瘤坏死因子α(TNF-α)和/或白介素2(IL-2)。在其它实施例中，诱导或诱发的免疫反应可以减少或抑制一种或多种促进表达所述抗原的肿瘤或癌症生长的免疫遏制因子，例如(但不限于)下调MHC呈递的因子、上调抗原特异性调控T细胞(Treg)的因子、PD-L1、FasL、细胞因子(如IL-10和TFG-β)、肿瘤相关巨噬细胞、肿瘤相关成纤维细胞、由免疫遏制细胞产生的可溶因子、CTLA-4、PD-1、MDSC、MCP-1以及免疫检查点分子。

在一特定实施例中，疫苗可以通过以下介导肿瘤细胞的清除或阻止肿瘤细胞生长：(1)增加细胞毒性T淋巴细胞，如CD8+和/或CD107a+(CTL)以攻击并且杀死肿瘤细胞；(2)增加T辅助细胞反应；和/或(3)通过IFN-γ、IL-2和TFN-α增加炎性反应，或优选所有前述内容。

疫苗可以是DNA疫苗。DNA疫苗公开于美国专利第5,593,972号、第5,739,118号、第5,817,637号、第5,830,876号、第5,962,428号、第5,981,505号、第5,580,859号、第5,703,055号以及第5,676,594号中，所述美国专利以引用的方式完全并入本文中。DNA疫苗可以进一步包含抑制其整合到染色体中的元件或试剂。

疫苗可以包括编码癌症抗原的RNA。RNA疫苗可以引入到细胞中。

疫苗可以是减毒活疫苗、使用重组载体递送抗原的疫苗、亚单位疫苗以及糖蛋白疫苗，例如(但不限于)以下美国专利中所描述的疫苗：第4,510,245号；第4,797,368号；第4,722,848号；第4,790,987号；第4,920,209号；第5,017,487号；第5,077,044号；第5,110,587号；第5,112,749号；第5,174,993号；第5,223,424号；第5,225,336号；第5,240,703号；第5,242,829号；第5,294,441号；第5,294,548号；第5,310,668号；第5,387,744号；第5,389,368号；第5,424,065号；第5,451,499号；第5,453,3 64号；第5,462,734号；第5,470,734号；第5,474,935号；第5,482,713号；第5,591,439号；第5,643,579号；第5,650,309号；第5,698,202号；第5,955,088号；第6,034,298号；第6,042,836号；第6,156,319号以及第6,589,529号，所述美国专利各自以引用的方式并入本文中。

在一些实施例中，核酸疫苗可以进一步包含分子佐剂的编码序列，在一些情况下，分子佐剂可以是IL-12、IL-15、IL-28、IL-31、IL-33和/或RANTES，并且在一些情况下，分子佐剂是检查点抑制剂，包括抗细胞毒性T淋巴细胞抗原4(CTLA-4)、抗程序性死亡受体-1(PD-1)以及抗淋巴细胞激活基因(LAG-3)。IL-12、IL-15、IL-28、IL-31、IL-33和/或RANTES的编码序列可以包括于包含一种或多种抗原的编码序列的一种或多种核酸分子上。IL-12、IL-15、IL-28、IL-31、IL-33和/或RANTES的编码序列可以包括于一种或多种单独的核酸分子(如一种或多种单独的质粒或载体)上，并且与核酸疫苗组合施用。

本发明的疫苗可以具有有效疫苗所需的特征，如安全，使得疫苗自身不引起疾病或死亡；防止疾病；诱导中和抗体；诱导保护性T细胞反应；以及易施用、几乎没有副作用、生物学稳定性和每剂量成本低。疫苗通过含有如下文所论述的编码癌症抗原的核酸分子而可以实现这些特征中的一些或全部。

疫苗与免疫检查点抑制剂的组合

疫苗可以进一步包含一种或多种免疫检查点分子的一种或多种抑制剂(即，免疫检查点抑制剂)。免疫检查点分子更详细地描述于下文。免疫检查点抑制剂是阻止免疫系统中的任何组分(如MHC类呈递、T细胞呈递和/或分化、B细胞呈递和/或分化、任何细胞因子、趋化因子或用于免疫细胞增殖和/或分化的信号传导)被遏制的任何核酸或蛋白质。

此类抑制剂可以是核酸序列、氨基酸序列、小分子或其组合。核酸序列可以是DNA、RNA、cDNA、其变异体、其片段或其组合。核酸还可以包括编码接头或标签序列的额外序列，所述接头或标签序列通过肽键连接到免疫检查点抑制剂。小分子可以是低分子量(例如小于800道尔顿)有机或无机化合物，其可以充当酶底物、蛋白质或核酸所结合的配体(或其类似物)，或生物过程的调控子。氨基酸序列可以是蛋白质、肽、其变异体、其片段或其组合。

在一些实施例中，免疫检查点抑制剂可以是一种或多种核酸序列，其编码抗体、其变异体、其片段或其组合。在其它实施例中，免疫检查点抑制剂可以是抗体、其变异体、其片段或其组合。

免疫检查点分子

免疫检查点分子可以是核酸序列、氨基酸序列、小分子或其组合。核酸序列可以是DNA、RNA、cDNA、其变异体、其片段或其组合。核酸还可以包括编码接头或标签序列的额外序列，所述接头或标签序列通过肽键连接到免疫检查点抑制剂。小分子可以是低分子量(例如小于800道尔顿)有机或无机化合物，其可以充当酶底物、蛋白质或核酸所结合的配体(或其类似物)，或生物过程的调控子。氨基酸序列可以是蛋白质、肽、其变异体、其片段或其组合。

PD-1和PD-L1

免疫检查点分子可以程序性细胞死亡蛋白1(PD-1)、程序性细胞死亡配体1(PD-L1)、其片段、其变异体或其组合。PD-1是由PDCD1基因编码的细胞表面蛋白。PD-1是免疫球蛋白超家族的成员并且在T细胞和原B细胞(pro-B cell)上表达，并且因此影响这些细胞的命运和/或分化。确切地说，PD-1是T细胞调控子CD28/CTLA-4家族的1型膜蛋白并且负向调控T细胞受体(TCR)信号，从而负向调控免疫反应。PD-1可以负向调控CD8+T细胞反应，并且因此抑制CD8介导的细胞毒性且增强肿瘤生长。

PD-1具有两种配体：PD-L1和PD-L2，其是B7家族成员。PD-L1响应于LPS和GM-CSF处理，在巨噬细胞和树突状细胞(DC)上得到上调，并且在TCR和B细胞受体信号传导后，在T细胞和B细胞上得到上调。PD-L1由许多肿瘤细胞系表达，包括骨髓瘤、肥大细胞瘤以及黑色素瘤。

抗免疫检查点分子抗体

如上文所描述，免疫检查点抑制剂可以是抗体。抗体可以结合抗原(即，上文所描述的免疫检查点分子)或与抗原反应。因此，抗体可以被视为抗免疫检查点分子抗体或免疫检查点分子抗体。抗体可以由所含的核酸序列编码。

抗体可以包括重链多肽和轻链多肽。重链多肽可以包括重链可变(VH)区和/或至少一个重链恒定(CH)区。至少一个重链恒定区可以包括重链恒定区1(CH1)、重链恒定区2(CH2)和重链恒定区3(CH3)和/或铰链区。

在一些实施例中，重链多肽可以包括VH区和CH1区。在其它实施例中，重链多肽可以包括VH区、CH1区、铰链区、CH2区以及CH3区。

重链多肽可以包括互补决定区(“CDR”)集合。CDR集合可以含有VH区的三个高变区。从重链多肽的N端开始，这些CDR分别表示为“CDR1”、“CDR2”和“CDR3”。重链多肽的CDR1、CDR2和CDR3可以促成抗原的结合或识别。

轻链多肽可以包括轻链可变(VL)区和/或轻链恒定(CL)区。轻链多肽可以包括互补决定区(“CDR”)集合。CDR集合可以含有VL区的三个高变区。从轻链多肽的N端开始，这些CDR分别表示为“CDR1”、“CDR2”和“CDR3”。轻链多肽的CDR1、CDR2和CDR3可以促成抗原的结合或识别。

抗体可以包含分别插入于重链与轻链框架(“FR”)集合之间的重链和轻链互补决定区(“CDR”)集合，所述框架集合为CDR提供支撑并且限定CDR相对于彼此的空间关系。CDR集合可以含有重链或轻链V区的三个高变区。从重链或轻链的N端开始，这些区分别表示为“CDR1”、“CDR2”和“CDR3”。因此，抗原结合位点可以包括六个CDR，包含来自重链和轻链V区中的每一个的CDR集合。

抗体可以是免疫球蛋白(Ig)。Ig可以是例如IgA、IgM、IgD、IgE以及IgG。免疫球蛋白可以包括重链多肽和轻链多肽。免疫球蛋白的重链多肽可以包括VH区、CH1区、铰链区、CH2区以及CH3区。免疫球蛋白的轻链多肽可以包括VL区和CL区。

另外，蛋白水解酶木瓜蛋白酶优先使IgG分子裂解以产生数个片段，其中两者(F(ab)片段)各自包含包括完整抗原结合位点的共价异二聚体。酶胃蛋白酶能够使IgG分子裂解以提供数个片段，包括F(ab')₂片段，其包含两个抗原结合位点。因此，抗体可以是Fab或F(ab')₂。Fab可以包括重链多肽和轻链多肽。Fab的重链多肽可以包括VH区和CH1区。Fab的轻链可以包括VL区和CL区。

抗体可以是多克隆或单克隆抗体。抗体可以是嵌合抗体、单链抗体、亲和力成熟抗体、人类抗体、人源化抗体或完全人类抗体。人源化抗体可以是来自非人类物种的抗体，其结合所期望抗原，具有来自非人类物种的一个或多个互补决定区(CDR)和来自人类免疫球蛋白分子的框架区。

PD-1抗体

抗免疫检查点分子抗体可以是抗PD-1抗体(在本文中也称为“PD-1抗体”)、其变异体、其片段或其组合。PD-1抗体可以是纳武单抗(Nivolumab)。抗PD-1抗体可以抑制PD-1活性，从而诱导、诱发或增加针对肿瘤或癌症的免疫反应并且减少肿瘤生长。

PD-L1抗体

抗免疫检查点分子抗体可以是抗PD-L1抗体(在本文中也称为“PD-L1抗体”)、其变异体、其片段或其组合。抗PD-L1抗体可以抑制PD-L1活性，从而诱导、诱发或增加针对肿瘤或癌症的免疫反应并且减少肿瘤生长。

抗原

如上文所描述，疫苗可以包含抗原或编码抗原的核酸分子。抗原可以是存活素、其片段、其变异体或其片段与变异体的组合。

因此，疫苗可以用于治疗罹患表达存活素的癌症或肿瘤的个体。在一些实施例中，癌瘤是卵巢癌。在一些实施例中，卵巢癌是上皮卵巢癌。卵巢癌可以是浆液性上皮卵巢癌。疫苗还可以用于治疗患有表达存活素的癌症或肿瘤的个体，用于预防个体中此类肿瘤的发展。合成共有存活素抗原可以不同于原生存活素基因，并且因此提供针对表达合成共有存活素抗原的肿瘤的疗法或预防。相应地，本文提供了不同于原生存活素基因的合成共有存活素抗原序列(即，突变或合成存活素基因或序列)。

将原生存活素基因的转录物加工成多种mRNA。特定存活素mRNA同工型可以基于例如其在癌细胞中的表达而选择。在特定实施例中，存活素同工型基于其在卵巢癌细胞中的表达而选择。本文所描述的合成共有存活素抗原序列避免选择性加工(alternativeprocessing)，产生一个全长转录物并且引起对效应T细胞和B细胞反应的更强诱导。

提供了经分离的核酸分子，其包含上述异源序列。提供了经分离的核酸分子，其由上述异源序列组成。可以将包含上述异源序列的经分离的核酸分子并入到载体中，如质粒、病毒载体和如下文所描述的其它形式的核酸分子中。本文提供了编码合成共有存活素抗原的核酸序列。编码合成共有存活素抗原的编码序列具有如上文所描述的序列。

提供了包含上述异源氨基酸序列的蛋白质分子。提供了由上述异源氨基酸序列组成的蛋白质分子。本文提供了具有上述序列的蛋白质和多肽。蛋白质和多肽可以被称为合成共有存活素抗原和存活素免疫原。合成共有存活素抗原能够诱发针对表达存活素的肿瘤的免疫反应。

在一个方面，期望合成共有存活素抗原提供改良的转录与翻译，包括具有以下中的一种或多种：低GC含量前导序列以增加转录；mRNA稳定性和密码子优化；以及尽可能地消除顺式作用序列基元(即，内部TATA盒)。

合成共有存活素抗原可以是来源于两种或更多种物种、同工型或变异体的共有抗原(或免疫原)序列。在一个实施例中，共有序列由不同物种的存活素同工型产生。共有序列来源于从基因库(GenBank)或其它类似DNA或蛋白质序列数据库收集的存活素序列。在一些实施例中，共有抗原可以包含第一同工型的一部分与第二同工型的一部分的组合，第二同工型的部分例如与第一同工型的任何部分非同源。合成共有存活素抗原可以包含用于改良表达的共有序列和/或修饰。修饰可以包括密码子优化、RNA优化、添加克扎克序列(例如，GCC ACC)以便增加翻译起始，和/或添加免疫球蛋白前导序列以提高合成共有存活素抗原的免疫原性。合成共有存活素抗原可以包含信号肽，如免疫球蛋白信号肽，例如(但不限于)免疫球蛋白E(IgE)或免疫球蛋白G(IgG)信号肽。在一些实施例中，合成共有存活素抗原可以包括定位信号序列(例如，核定位信号)的突变或缺失，例如以干扰翻译后的核定位。在一些实施例中，存活素共有抗原可以包含血凝素(HA)标签。存活素共有抗原可以设计成与对应未经密码子优化的存活素抗原相比，诱发更强并且更广泛的细胞和/或体液免疫反应。

可以使共有存活素序列突变以干扰和/或增强原生存活素的特定结构和/或功能，产生合成共有存活素抗原序列。在一个实施例中，引入突变以消除存活素的抗凋亡活性。在一特定实施例中，将T34A、T48A和C84A突变引入到共有存活素同工型1序列中以消除抗凋亡功能。(参见Muchmore,S.W.等人《凋亡抑制蛋白存活素的晶体结构和诱变分析(Crystalstructure and mutagenic analysis of the inhibitor-of-apoptosis proteinSurvivin)》.《分子细胞(Molecular cell)》6,173-182(2000)；O'Connor,D.S.等人《存活素的p34cdc2磷酸化在细胞分裂时对凋亡的调控(Regulation of apoptosis at celldivision by p34cdc2 phosphorylation of Survivin)》.《美国国家科学院院刊(Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States ofAmerica)》97,13103-13107,doi:10.1073/pnas.240390697(2000)；Barrett,R.M.,Colnaghi,R.和Wheatley,S.P.《存活素的BIR域中的苏氨酸48对其有丝分裂和抗凋亡活性至关重要并且可以通过CK2体外磷酸化(Threonine 48in the BIR domain of Survivinis critical to its mitotic and anti-apoptotic activities and can bephosphorylated by CK2 in vitro)》.《细胞周期(Cell cycle)》(得克萨斯州乔治敦(Georgetown,Tex.))10,538-548(2011)。)

在一些实施例中，合成共有存活素抗原序列可以由一种同工型(例如显性存活素同工型)产生，或共有序列可以包含第一同工型的一部分与第二同工型的一部分，或第二同工型的一截短部分的组合。在一个实施例中，合成共有序列来源于存活素同工型1(存活素1)。在另一实施例中，合成共有序列来源于存活素同工型3(存活素3)。在一个实施例中，合成共有存活素抗原3序列是存活素3的一截短部分(存活素3T)。在一个实施例中，合成共有序列是存活素1与存活素T3的组合，或存活素1T3。

在一优选实施例中，合成共有存活素抗原序列与SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:3具有95.0％或更高一致性。在这个实施例中，SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:3的核酸序列分别编码SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:8的氨基酸序列。在其它实施例中，合成共有存活素抗原序列与SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:3具有95.0％或更高一致性、95.2％或更高一致性、95.4％或更高一致性、95.6％或更高一致性、95.8％或更高一致性、96.0％或更高一致性、96.2％或更高一致性、96.4％或更高一致性、96.6％或更高一致性、96.8％或更高一致性、97.0％或更高一致性、97.2％或更高一致性、97.4％或更高一致性、97.6％或更高一致性、97.8％或更高一致性、98.0％或更高一致性、98.2％或更高一致性、98.4％或更高一致性或98.6％或更高一致性、98.8％或更高一致性、99.0％或更高一致性、99.2％或更高一致性、99.4％或更高一致性、99.6％或更高一致性、99.8％或更高一致性或100％一致性。

载体

疫苗可以包含一种或多种包括编码合成共有存活素抗原的异源核酸的载体。一种或多种载体可能能够以可有效诱发哺乳动物的免疫反应的数量表达抗原。载体可以包含编码抗原的异源核酸。载体可以具有含有复制起点的核酸序列。载体可以是质粒、细菌噬菌体、细菌人工染色体或酵母人工染色体。载体可以是自复制染色体外载体，或整合到宿主基因组中的载体。

一种或多种载体可以是表达构建体，其一般是用于将特定基因引入到靶细胞中的质粒。一旦表达载体到达细胞内部，则通过细胞转录与翻译机构核糖体复合物产生由基因编码的蛋白质。质粒常常被工程改造以含有调控序列，所述调控序列充当增强子和启动子区并且使表达载体上所携带的基因有效转录。本发明的载体表达大量的稳定信使RNA，并且因此表达大量的蛋白质。

载体可以具有表达信号，如强启动子、强终止密码子，启动子与克隆基因之间的距离调整，以及插入转录终止序列和PTIS(便携式翻译起始序列)。

载体可以是环状质粒或线性核酸。环状质粒或线性核酸能够引导特定核苷酸序列在适当的个体细胞中的表达。载体可以具有可操作地连接到编码抗原的核苷酸序列的启动子，所述核苷酸序列可以可操作地连接到终止信号。载体还可以含有核苷酸序列正确翻译所需的序列以及用于克隆和亚克隆载体和其片段的序列。包含所关注核苷酸序列的载体可以是嵌合的，这意味着载体组分中的至少一种相对于载体其它组分中的至少一种是异源的。核苷酸序列在表达盒中的表达可以处于组成型启动子或诱导型启动子的控制下，诱导型启动子仅当宿主细胞暴露于某一特定外部刺激时才起始转录。在多细胞生物体的情况下，启动子还可以对特定组织或器官或发育阶段具有特异性。在一优选实施例中，质粒载体是本文所描述的pGX1428，其进一步包含SEQ ID NO:1的核酸序列；或本文所描述的pGX1429，其进一步包含SEQ ID NO:3的核酸序列。

载体可以是质粒。质粒可以适用于用编码抗原的核酸转染细胞。转化宿主细胞可以在发生抗原表达的条件下培养并且维持。

质粒可以包含编码上文所公开的各种抗原中的一种或多种的核酸序列，包括编码能够诱发针对抗原的免疫反应的合成共有抗原、此类蛋白质的片段、此类蛋白质的变异体、变异体片段或融合蛋白的编码序列，所述融合蛋白由共有蛋白和/或共有蛋白的片段和/或共有蛋白的变异体和/或共有蛋白的变异体的片段的组合构成。

单一质粒可以含有单一抗原的编码序列、两种抗原的编码序列、三种抗原的编码序列或四种抗原的编码序列。

在一些实施例中，质粒可以进一步包含单独或作为这些质粒之一的一部分的编码CCR20的编码序列。类似地，质粒可以进一步包含IL-12、IL-15和/或IL-28的编码序列。

质粒可以进一步包含可以位于编码序列上游的起始密码子，和可以位于编码序列下游的终止密码子。起始和终止密码子可以与编码序列同框。

质粒还可以包含可操作地连接到编码序列的启动子。可操作地连接到编码序列的启动子可以是猴病毒40(SV40)启动子、小鼠乳腺肿瘤病毒(MMTV)启动子、人类免疫缺陷病毒(HIV)启动子(如牛免疫缺陷病毒(BIV)长末端重复序列(LTR)启动子)、莫洛尼病毒(Moloney virus)启动子、禽白血病病毒(ALV)启动子、巨细胞病毒(CMV)启动子(如CMV即刻早期启动子)、埃-巴二氏病毒(Epstein Barr virus；EBV)启动子，或劳氏肉瘤病毒(Roussarcoma virus；RSV)启动子。启动子还可以是来自人类基因(如人类肌动蛋白、人类肌球蛋白、人类血红蛋白、人类肌肉肌酸或人类金属硫蛋白)的启动子。启动子还可以是天然或合成的组织特异性启动子，如肌肉或皮肤特异性启动子。此类启动子的实例描述于美国专利申请公开第US20040175727号中，其内容全文并入本文中。

质粒还可以包含可以位于编码序列下游的聚腺苷酸化信号。聚腺苷酸化信号可以是SV40聚腺苷酸化信号、LTR聚腺苷酸化信号、牛生长激素(bGH)聚腺苷酸化信号、人类生长激素(hGH)聚腺苷酸化信号，或人类β-球蛋白聚腺苷酸化信号。SV40聚腺苷酸化信号可以是来自pCEP4质粒(加利福尼亚州圣迭戈英杰公司(Invitrogen,San Diego,CA))的聚腺苷酸化信号。

质粒还可以包含编码序列上游的增强子。增强子可以是人类肌动蛋白、人类肌球蛋白、人类血红蛋白、人类肌肉肌酸或病毒增强子，如来自CMV、FMDV、RSV或EBV的增强子。聚核苷酸功能增强子描述于美国专利第5,593,972号、第5,962,428号和W094/016737中，其各自的内容以引用的方式完全并入。

质粒还可以包含哺乳动物复制起点，以便在染色体外维持质粒并且在细胞中产生质粒的多个拷贝。质粒可以是来自英杰公司(加利福尼亚州圣迭戈)的pVAXI、pCEP4或pREP4，所述质粒可以包含埃-巴二氏病毒复制起点和核抗原EBNA-1编码区，其可在不整合的情况下产生高拷贝游离型复制。质粒的骨架可以是pA V0242。质粒可以是复制缺陷型腺病毒5型(Ad5)质粒。

质粒还可以包含调控序列，其可能较适合于在其中施用质粒的细胞中的基因表达。编码序列可以包含可以使得编码序列在宿主细胞中更有效转录的密码子。

编码序列还可以包含Ig前导序列。前导序列可以位于编码序列的5'。由这个序列编码的共有抗原可以包含N端Ig前导序列，继之为共有抗原蛋白。N端Ig前导序列可以是IgE或IgG。

质粒可以是pSE420(加利福尼亚州圣迭戈英杰公司)，其可以用于在大肠杆菌(Escherichia coli；E.coli)中产生蛋白质。质粒还可以是p YES2(加利福尼亚州圣迭戈英杰公司)，其可以用于在酵母的酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)菌株中产生蛋白质。质粒还可以是MAXBACTM完整杆状病毒表达系统(加利福尼亚州圣迭戈英杰公司)的质粒，其可以用于在昆虫细胞中产生蛋白质。质粒还可以是pcDNA I或pcDNA3(加利福尼亚州圣迭戈英杰公司)，其可以用于在哺乳动物细胞(如中国仓鼠卵巢(Chinese hamster ovary；CHO)细胞)中产生蛋白质。

载体可以是环状质粒，其可以通过整合到细胞基因组中来转化靶细胞或在染色体外存在(例如，具有复制起点的自主复制质粒)。

载体可以是pVAX、pcDNA3.0或provax，或能够表达编码抗原的DNA并且使细胞能够将序列翻译成免疫系统识别的抗原的任何其它表达载体。

本文还提供了一种线性核酸疫苗或线性表达盒(“LEC”)，其能够通过电穿孔有效递送到个体中并且表达一种或多种所期望抗原。LEC可以是不含任何磷酸骨架的任何线性DNA。DNA可以编码一种或多种抗原。LEC可以含有启动子、内含子、终止密码子和/或聚腺苷酸化信号。抗原表达可以通过启动子控制。LEC可以不含任何抗生素抗性基因和/或磷酸骨架。LEC可以不含有与所期望的抗原基因表达无关的其它核酸序列。

LEC可以来源于能够线性化的任何质粒。质粒可能能够表达抗原。质粒可以是pNP(波多黎各(Puerto Rico)/34)或pM2(新喀里多尼亚(New Caledonia)/99)。质粒可以是WLV009、pVAX、pcDNA3.0或provax，或能够表达编码抗原的DNA并且使细胞能够将序列翻译成免疫系统识别的抗原的任何其它表达载体。

LEC可以是pcrM2。LEC可以是pcrNP。pcrNP和pcrMR可以分别来源于pNP(波多黎各/34)或pM2(新喀里多尼亚/99)。

载体可以具有启动子。启动子可以是能够驱动基因表达和调控分离的核酸表达的任何启动子。此类启动子是通过DNA依赖性RNA聚合酶进行转录所需的顺式作用序列元件，所述RNA聚合酶转录本文所描述的抗原序列。用于引导异源核酸表达的启动子的选择视具体应用而定。启动子在载体中的位置距转录起始的距离可以与其在自然环境中距转录起始位点的距离大致相同。然而，可以适应这一距离的变化而不损失启动子功能。

启动子可以可操作地连接到编码抗原的核酸序列以及转录物有效聚腺苷酸化、核糖体结合位点和翻译终止所需的信号。

启动子可以是CMV启动子、SV40早期启动子、SV40晚期启动子、金属硫蛋白启动子、鼠乳腺肿瘤病毒启动子、劳氏肉瘤病毒启动子、多角体蛋白启动子，或显示对真核细胞中的表达有效的另一启动子。

载体可以包括增强子和具有功能剪接供体和受体位点的内含子。载体可以含有结构基因下游的转录终止区以实现有效终止。终止区可以获自与启动子序列相同的基因或可以获自不同基因。

制备载体的方法

本文提供了制备载体的方法，所述载体包含本文所论述的合成共有存活素抗原编码核酸分子。可以使用所属领域中已知的方法，使用最终亚克隆步骤之后的载体接种大型发酵罐中的细胞培养物。

供与下文更详细地描述的EP装置一起使用的载体可以使用已知装置和技术的组合配制或制造，但其优选使用优化质粒制造技术制造，所述技术描述于2007年5月23日提交的美国临时申请U.S.第60/939,792号中(参见美国专利公开第20090004716号)。在一些实例中，这些研究中所使用的DNA载体可以大于或等于10mg/mL的浓度配制。除U.S.第60/939792号中所描述的装置和方案以外，制造技术还包括或并入有所属领域的技术人员通常已知的各种装置和方案，包括2007年7月3日颁发的美国专利第7,238,522号中所描述的装置和方案。以上提及的申请和专利、US第60/939,792号以及美国专利第7,238,522号分别全文并入本文中。

疫苗的赋形剂和其它组分

疫苗可以进一步包含医药学上可接受的赋形剂。医药学上可接受的赋形剂可以是功能分子，如媒剂、载剂或稀释剂。医药学上可接受的赋形剂可以是转染促进剂，其可以包括表面活性剂，如免疫刺激复合物(ISCOMS)、弗氏不完全佐剂(Freunds incompleteadjuvant)、LPS类似物(包括单磷酰脂质A、胞壁酰基肽)、醌类似物、囊泡(如角鲨烯和角鲨烯)、透明质酸、脂质、脂质体、钙离子、病毒蛋白、聚阴离子、聚阳离子或纳米粒子，或其它已知的转染促进剂。

转染促进剂是聚阴离子、聚阳离子(包括聚-L-谷氨酸盐(LGS))或脂质。转染促进剂是聚-L-谷氨酸盐，并且所述聚-L-谷氨酸盐可以小于6mg/ml的浓度存在于疫苗中。转染促进剂还可以包括表面活性剂，如免疫刺激复合物(ISCOMS)、弗氏不完全佐剂、LPS类似物(包括单磷酰脂质A、胞壁酰基肽)、醌类似物以及囊泡(如角鲨烯和角鲨烯)，并且透明质酸也可以结合基因构建体施用。DNA载体疫苗还可以包括转染促进剂，如脂质、脂质体，包括卵磷脂脂质体或所属领域中已知的其它脂质体作为DNA-脂质体混合物(参见例如W09324640)；钙离子、病毒蛋白、聚阴离子、聚阳离子或纳米粒子，或其它已知的转染促进剂。转染促进剂是聚阴离子、聚阳离子(包括聚-L-谷氨酸盐(LGS))或脂质。转染剂在疫苗中的浓度小于4mg/ml、小于2mg/ml、小于1mg/ml、小于0.750mg/ml、小于0.500mg/ml、小于0.250mg/ml、小于0.100mg/ml、小于0.050mg/ml或小于0.010mg/ml。

医药学上可接受的赋形剂可以是一种或多种佐剂。佐剂可以是替代载体中表达或作为蛋白质与上述载体的组合在疫苗中递送的其它基因。一种或多种佐剂可以选自由以下组成的组：CCL20、α-干扰素(IFN-α)、β-干扰素(IFN-β)、γ-干扰素、血小板源生长因子(PDGF)、TNFα、TNFβ、GM-CSF、表皮生长因子(EGF)、皮肤T细胞吸引趋化因子(CTACK)、胸腺上皮表达的趋化因子(TECK)、粘膜相关上皮趋化因子(MEC)、MHC、CD80、CD86、IL-l、IL-2、IL-4、IL-5、IL-6、IL-10、IL-12、IL-15、IL-18、IL-28、IL-33、MCP-1、MIP-la、MIP-1～、IL-8、L-选择素、P-选择素、E-选择素、CD34、GlyCAM-1、MadCAM-1、LFA-1、VLA-1、Mac-1、pl50.95、PECAM、ICAM-1、ICAM-2、ICAM-3、CD2、LFA-3、M-CSF、G-CSF、IL-18的突变形式、CD40、CD40L、血管生长因子、成纤维细胞生长因子、IL-7、神经生长因子、血管内皮生长因子、Fas、TNF受体、Flt、Apo-1、p55、WSL-1、DR3、TRAMP、Apo-3、AIR、LARD、NGRF、DR4、DRS、KILLER、TRAIL-R2、TRICK2、DR6、半胱氨酸蛋白酶ICE、Fos、c-jun、Sp-1、Ap-1、Ap-2、p38、p65Rel、MyD88、IRAK、TRAF6、IkB、非活性NIK、SAP K、SAP-I、JNK、干扰素响应基因、NFkB、Bax、TRAIL、TRAILrec、TRAILrecDRC5、TRAIL-R3、TRAIL-R4、RANK、RANK配体、Ox40、Ox40配体、NKG2D、MICA、MICB、NKG2A、NKG2B、NKG2C、NKG2E、NKG2F、TAPI、TAP2、IL-15，其已缺失信号序列或编码信号序列的编码序列并且任选地包括不同信号肽(如来自IgE的信号肽)，或编码不同信号肽(如来自IgE的信号肽)的编码序列，和其功能片段，或其组合。佐剂可以是IL-12、IL-15、IL-28、CTACK、TECK、血小板源生长因子(PDGF)、TNFα、TNFβ、GM-CSF、表皮生长因子(EGF)、IL-1、IL-2、IL-4、IL-5、IL-6、IL-10、IL-12、IL-18或其组合。

在一些实施例中，佐剂可以是一种或多种编码蛋白质的核酸分子，所述蛋白质选自由以下组成的组：CCL-20、IL-12、IL-15、IL-28、CTACK、TECK、MEC或RANTES。IL-12构建体和序列的实例公开于PCT申请第PCT/US1997/019502号和对应的美国申请第08/956,865号和2011年12月12日提交的美国临时申请第61/569600号中，所述申请各自以引用的方式并入本文中。IL-15构建体和序列的实例公开于PCT申请第PCT/US04/18962号和对应的美国申请第10/560,650号，以及PCT申请第PCT/US07/00886号和对应的美国申请第12/160,766号，以及PCT申请第PCT/USI0/048827号中，所述申请各自以引用的方式并入本文中。IL-28构建体和序列的实例公开于PCT申请第PCT/US09/039648号和对应的美国申请第12/936,192号中，所述申请各自以引用的方式并入本文中。RANTES和其它构建体和序列的实例公开于PCT申请第PCT/US1999/004332和对应的美国申请第09/622452号中，所述申请各自以引用的方式并入本文中。RANTES构建体和序列的其它实例公开于PCT申请第PCT/US11/024098号中，所述申请以引用的方式并入本文中。RANTES和其它构建体和序列的实例公开于PCT申请第PCT/US1999/004332和对应的美国申请第09/622452号中，所述申请各自以引用的方式并入本文中。RANTES构建体和序列的其它实例公开于PCT申请第PCT/US11/024098号中，所述申请以引用的方式并入本文中。趋化因子CTACK、TECK和MEC构建体和序列的实例公开于PCT申请第PCT/US2005/042231号和对应的美国申请第11/719,646号中，所述申请各自以引用的方式并入本文中。OX40和其它免疫调节剂的实例公开于美国申请第10/560,653号中，所述申请以引用的方式并入本文中。DR5和其它免疫调节剂的实例公开于美国申请第09/622452号中，所述申请以引用的方式并入本文中。

可以适用作佐剂的其它基因包括编码以下的基因：MCP-1、MIP-la、MIP-1p、IL-8、RANTES、L-选择素、P-选择素、E-选择素、CD34、GlyCAM-1、MadCAM-1、LFA-1、VLA-1、Mac-1、pl50.95、PECAM、ICAM-1、ICAM-2、ICAM-3、CD2、LFA-3、M-CSF、G-CSF、IL-4、IL-18的突变形式、CD40、CD40L、血管生长因子、成纤维细胞生长因子、IL-7、IL-22、神经生长因子、血管内皮生长因子、Fas、TNF受体、Flt、Apo-1、p55、WSL-1、DR3、TRAMP、Apo-3、AIR、LARD、NGRF、DR4、DR5、KILLER、TRAIL-R2、TRICK2、DR6、半胱氨酸蛋白酶ICE、Fos、c-jun、Sp-1、Ap-1、Ap-2、p38、p65Rel、MyD88、IRAK、TRAF6、IkB、非活性NIK、SAP K、SAP-1、JNK、干扰素响应基因、NFkB、Bax、TRAIL、TRAILrec、TRAILrecDRC5、TRAIL-R3、TRAIL-R4、RANK、RANK配体、Ox40、Ox40配体、NKG2D、MICA、MICB、NKG2A、NKG2B、NKG2C、NKG2E、NKG2F、TAP1、TAP2以及其功能片段。

疫苗可以进一步包含如1994年4月1日提交的U.S.第021,579号中所描述的基因疫苗促进剂，所述文献以引用的方式完全并入。

疫苗可以约1纳克到100毫克；约1微克到约10毫克；或优选约0.1微克到约10毫克；或更优选约1毫克到约2毫克的数量包含质粒。在一些优选实施例中，根据本发明的疫苗包含约5纳克到约1000微克DNA。在一些优选实施例中，疫苗可以含有约10纳克到约800微克DNA。在一些优选实施例中，疫苗可以含有约0.1微克到约500微克DNA。在一些优选实施例中，疫苗可以含有约1微克到约350微克DNA。在一些优选实施例中，疫苗可以含有约25微克到约250微克、约100微克到约200微克、约1纳克到100毫克；约1微克到约10毫克；约0.1微克到约10毫克；约1毫克到约2毫克、约5纳克到约1000微克、约10纳克到约800微克、约0.1微克到约500微克、约1微克到约350微克、约25微克到约250微克、约100微克到约200微克的抗原或编码其的质粒。

疫苗可以根据待使用的施用模式配制。可注射的疫苗医药组合物可以是无菌的、不含热原质的以及不含微粒的。可以使用等渗配制物或溶液。等渗性添加剂可以包括氯化钠、右旋糖、甘露糖醇、山梨糖醇以及乳糖。疫苗可以包含血管收缩剂。等渗溶液可以包括磷酸盐缓冲盐水。疫苗可以进一步包含稳定剂，包括明胶和白蛋白。稳定剂可以使配制物在室温或环境温度下稳定延长的时间段，包括LGS或聚阳离子或聚阴离子。

疫苗的医药组合物

疫苗可以呈医药组合物的形式。医药组合物可以包含疫苗。医药组合物可以包含约5纳克(ng)到约10毫克(mg)的疫苗核酸分子。在一些实施例中，根据本发明的医药组合物包含约25ng到约5mg的疫苗核酸分子。在一些实施例中，医药组合物含有约50ng到约1mg的疫苗核酸分子。在一些实施例中，医药组合物含有约0.1微克到约500微克的疫苗核酸分子。在一些实施例中，医药组合物含有约1微克到约350微克的疫苗核酸分子。在一些实施例中，医药组合物含有约5微克到约250微克的疫苗核酸分子。在一些实施例中，医药组合物含有约10微克到约200微克的疫苗核酸分子。在一些实施例中，医药组合物含有约15微克到约150微克的疫苗核酸分子。在一些实施例中，医药组合物含有约20微克到约100微克的疫苗核酸分子。在一些实施例中，医药组合物含有约25微克到约75微克的疫苗核酸分子。在一些实施例中，医药组合物含有约30微克到约50微克的疫苗核酸分子。在一些实施例中，医药组合物含有约35微克到约40微克的疫苗核酸分子。在一些实施例中，医药组合物含有约100微克到约200微克的疫苗核酸分子。在一些实施例中，医药组合物包含约10微克到约100微克的疫苗核酸分子。在一些实施例中，医药组合物包含约20微克到约80微克的疫苗核酸分子。在一些实施例中，医药组合物包含约25微克到约60微克的疫苗核酸分子。在一些实施例中，医药组合物包含约30ng到约50微克的疫苗核酸分子。在一些实施例中，医药组合物包含约35ng到约45微克的疫苗核酸分子。在一些优选实施例中，医药组合物含有约0.1微克到约500微克的疫苗核酸分子。在一些优选实施例中，医药组合物含有约1微克到约350微克的疫苗核酸分子。在一些优选实施例中，医药组合物含有约25微克到约250微克的疫苗核酸分子。在一些优选实施例中，医药组合物含有约100微克到约200微克的疫苗核酸分子。

在一些实施例中，根据本发明的医药组合物包含至少10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95或100ng的疫苗核酸分子。在一些实施例中，医药组合物可以包含至少1、5、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100、105、110、115、120、125、130、135、140、145、150、155、160、165、170、175、180、185、190、195、200、205、210、215、220、225、230、235、240、245、250、255、260、265、270、275、280、285、290、295、300、305、310、315、320、325、330、335、340、345、350、355、360、365、370、375、380、385、390、395、400、405、410、415、420、425、430、435、440、445、450、455、460、465、470、475、480、485、490、495、500、605、610、615、620、625、630、635、640、645、650、655、660、665、670、675、680、685、690、695、700、705、710、715、720、725、730、735、740、745、750、755、760、765、770、775、780、785、790、795、800、805、810、815、820、825、830、835、840、845、850、855、860、865、870、875、880、885、890、895、900、905、910、915、920、925、930、935、940、945、950、955、960、965、970、975、980、985、990、995或1000微克的疫苗核酸分子。在一些实施例中，医药组合物可以包含至少1.5、2、2.5、3、3.5、4、4.5、5、5.5、6、6.5、7、7.5、8、8.5、9、9.5或10mg或更多的疫苗核酸分子。

在其它实施例中，医药组合物可以包含至多并且包括15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95或100ng的疫苗核酸分子。在一些实施例中，医药组合物可以包含至多并且包括1、5、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100、105、110、115、120、125、130、135、140、145、150、155、160、165、170、175、180、185、190、195、200、205、210、215、220、225、230、235、240、245、250、255、260、265、270、275、280、285、290、295、300、305、310、315、320、325、330、335、340、345、350、355、360、365、370、375、380、385、390、395、400、405、410、415、420、425、430、435、440、445、450、455、460、465、470、475、480、485、490、495、500、605、610、615、620、625、630、635、640、645、650、655、660、665、670、675、680、685、690、695、700、705、710、715、720、725、730、735、740、745、750、755、760、765、770、775、780、785、790、795、800、805、810、815、820、825、830、835、840、845、850、855、860、865、870、875、880、885、890、895、900、905、910、915、920、925、930、935、940、945、950、955、960、965、970、975、980、985、990、995或1000微克的疫苗核酸分子。在一些实施例中，医药组合物可以包含至多并且包括1.5、2、2.5、3、3.5、4、4.5、5、5.5、6、6.5、7、7.5、8、8.5、9、9.5或10mg的疫苗核酸分子。

根据待使用的施用模式，医药组合物可以进一步包含用于配制目的的其它试剂。在医药组合物是可注射医药组合物的情况下，其为无菌的、不含热原质的以及不含微粒的。优选使用等渗配制物。一般来说，等渗性添加剂可以包括氯化钠、右旋糖、甘露糖醇、山梨糖醇以及乳糖。在一些情况下，优选等渗溶液，如磷酸盐缓冲盐水。稳定剂包括明胶和白蛋白。在一些实施例中，将血管收缩剂添加到配制物中。

医药组合物可以进一步包含如上文在章节2中所提供的医药学上可接受的赋形剂。举例来说，医药学上可接受的赋形剂可以包含功能分子、媒剂、佐剂、载剂、稀释剂或转染促进剂，如章节2中所提供。

适应症

本文所提供的疫苗和包含疫苗的医药组合物可以用于治疗或预防表达存活素的癌细胞和基于癌症的肿瘤。特定来说，本文所提供的疫苗和包含疫苗的医药组合物可以用于治疗或预防卵巢癌，更特定地上皮卵巢癌，最特定地浆液性卵巢癌。

疫苗接种的方法

本文提供了使用上文所描述的医药配制物治疗和/或预防癌症的方法。本文还描述了使用上文所描述的医药配制物治疗和/或预防个体的癌症的方法。本文还描述了对个体进行接种疫苗的方法。本文还描述了向有需要的个体施用本文所描述的医药配制物的方法。本文所描述的方法(统称为使用本文所描述的医药配制物治疗的方法)可以包含向有需要的个体施用一种或多种如本文所描述的疫苗以诱导治疗性和/或预防性免疫反应。可以向个体施用疫苗以调节个体的免疫系统的活性并且增强免疫反应。疫苗的施用可以是将如本文所公开的癌症抗原以核酸分子的形式转染，所述核酸分子在细胞中表达并且递送到细胞表面，随即免疫系统识别并且诱导细胞、体液反应或细胞与体液反应。疫苗的施用通过向个体施用如本文所论述的疫苗而可以用于诱导或诱发个体产生针对如本文所公开的癌症抗原中的一种或多种的免疫反应。

可以向个体施用疫苗以调节个体的免疫系统的活性，从而增强免疫反应。在一些实施例中，个体是哺乳动物。向哺乳动物施用疫苗并且从而将载体引入到哺乳动物细胞中之后，经转染的细胞将表达并且分泌如本文所公开的癌症抗原中的一种或多种。这些分泌蛋白或合成抗原将被免疫系统识别为外来物质，这将建立免疫反应，其可以包括：针对一种或多种癌症抗原产生的抗体，和特异性针对一种或多种癌症抗原的T细胞反应。在一些实例中，接种本文所论述的疫苗的哺乳动物将具有预致敏的免疫系统并且当用一种或多种如本文所公开的癌症抗原攻击时，预致敏的免疫系统将使得可快速清除后续的如本文所公开的癌症抗原，不论通过体液、细胞免疫反应，还是细胞与体液免疫反应两者。

施用疫苗的DNA的方法描述于美国专利第4,945,050号和第5,036,006号中，所述专利均以全文引用的方式并入本文中。

可以向哺乳动物施用疫苗以诱发哺乳动物的免疫反应。哺乳动物可以是人类、非类人灵长类动物、奶牛、猪、绵羊、山羊、羚羊、野牛、水牛、牛科动物、鹿、刺猬、象、大羊驼(llama)、羊驼(alpaca)、小鼠、大鼠，并且优选人类、奶牛或猪。可以同样地向非哺乳动物个体(例如，鸡)施用疫苗，以诱发免疫反应。

疫苗剂量可以在1微克与10mg活性组分/千克(kg)体重/时间(组分/kg体重/时间)之间，并且可以是20微克到10mg组分/kg体重/时间。可以每1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30或31天施用疫苗。用于有效治疗的疫苗剂量数可以是1、2、3、4、5、6、7、8、9、10或更多次剂量。

利用疫苗产生免疫反应的方法

疫苗可以用于在哺乳动物或非哺乳动物个体中产生免疫反应，包括治疗性或预防性免疫反应。免疫反应可以产生针对一种或多种如本文所公开的癌症抗原的抗体和/或杀手T细胞。此类抗体和T细胞可以经分离。

一些实施例提供了产生针对如本文所公开的癌症抗原中的一种或多种的免疫反应的方法，所述实施例包含向个体施用疫苗。一些实施例提供了向个体预防性接种针对癌症或肿瘤的疫苗的方法，所述癌症或肿瘤表达如上文所描述的癌症抗原中的一种或多种，所述实施例包含施用疫苗。一些实施例提供了在向个体治疗性接种疫苗的方法，所述个体已罹患表达癌症抗原中的一种或多种的癌症或肿瘤，所述实施例包含施用疫苗。在施用疫苗之前，可以常规地诊断表达一种或多种如本文所公开的癌症抗原的癌症或肿瘤。

利用疫苗进行癌症治疗的方法

疫苗可以用于在哺乳动物中产生或诱发免疫反应，所述免疫反应对有需要的哺乳动物或个体的表达存活素的癌症或肿瘤(例如，卵巢癌)具有反应性，或针对所述癌症或肿瘤。所诱发的免疫反应可以阻止癌症或肿瘤生长。

所诱发的免疫反应可以阻止和/或减少癌细胞或肿瘤细胞转移。因此，疫苗可以用于治疗和/或预防施用疫苗的哺乳动物或个体的癌症或肿瘤的方法。

施用途径

疫苗或医药组合物可以通过不同途径施用，包括口服、肠胃外、舌下、透皮、直肠、经粘膜、体表、经由吸入、经由颊内施用、胸膜内、静脉内、动脉内、腹膜内、皮下、肌肉内、鼻内、鞘内和/或关节内，或其组合。对于兽用，组合物可以根据普通兽医学实践作为可合适接受的配制物施用。兽医可容易地确定最适于特定动物的给药方案和施用途径。可以通过传统注射器、无针注射装置、“微弹轰击基因枪(microprojectile bombardment gene gun)”或其它物理方法(如电穿孔(“EP”)、“流体动力学方法”或超声波)施用疫苗。

疫苗的载体可以通过数种众所周知的技术向哺乳动物施用，包括DNA注射(也称为DNA疫苗接种)伴随和不伴随体内电穿孔、脂质体介导的转染、纳米粒子促进的转染，以及使用重组载体，如重组腺病毒、重组腺病毒相关病毒和重组牛痘。疫苗的一种或多种癌症抗原可以通过DNA注射连同体内电穿孔施用。

疫苗或包含疫苗的医药组合物可以通过电穿孔施用。通过电穿孔施用疫苗可以使用电穿孔装置实现，所述电穿孔装置可以被配置成向所期望的哺乳动物组织递送可在细胞膜中有效引起可逆孔隙形成的能量脉冲，并且优选地，所述能量脉冲是类似于用户输入的预设电流的恒定电流。电穿孔装置可以包含电穿孔组件和电极组合件或手柄组合件。电穿孔组件可以包括并且并入有电穿孔装置的多个元件中的一个或多个，包括：控制器、电流波形发生器、阻抗测试仪、波形记录仪、输入元件、状态报告元件、通信端口、存储器组件、电源以及电源开关。电穿孔可以使用体内电穿孔装置实现，例如

EP系统(宾夕法尼亚州蓝铃市(Blue Bell,PA)Inovio制药公司(Inovio Pharmaceuticals,Inc.))或Elgen电穿孔器(Inovio制药公司)，以促进载体转染细胞。

可以使本发明的DNA疫苗的施用便利的电穿孔装置和电穿孔方法的实例包括Draghia-Akli等人的美国专利第7,245,963号、Smith等人提交的美国专利公开2005/0052630中所描述的那些，所述文献的内容以全文引用的方式并入本文中。可以用于使DNA疫苗的施用便利的其它电穿孔装置和电穿孔方法包括以下中所提供的那些：2007年10月17日提交的同在申请中且共同拥有的美国专利申请第11/874072号，所述专利申请根据35USC119(e)要求2006年10月17日提交的美国临时申请第60/852,149号和2007年10月10日提交的第60/978,982号的权益，所述申请均全文并入本文中。

Draghia-Akli等人的美国专利第7,245,963号描述模块化电极系统和其用途，其用于使得便于将生物分子引入到身体或植物中选定组织的细胞中。模块化电极系统可以包含多个针电极；皮下注射针；电连接器，其提供从可编程恒流脉冲控制器到多个针电极的导电连接；以及电源。操作人员可以握住安装在支撑结构上的多个针电极并且将其牢固地插入身体或植物中的选定组织中。随后通过皮下注射针将生物分子施用于选定组织中。将可编程恒流脉冲控制器激活并且将恒流电脉冲施加到多个针电极。施加的恒流电脉冲便于将生物分子引入到多个电极之间的细胞中。美国专利第7,245,963号的完整内容以全文引用的方式并入本文中。

Smith等人提交的美国专利公开2005/0052630描述电穿孔装置，其可以用于有效便于将生物分子引入到身体或植物中选定组织的细胞中。所述电穿孔装置包含电动装置(“EKD装置”)，其操作通过软件或固件来指定。所述EKD装置基于用户控制和脉冲参数的输入，在阵列中的电极之间产生一系列可编程恒流脉冲图案，并且使得能够存储和获取电流波形数据。电穿孔装置还包含具有针电极阵列的可更换电极盘、用于注射针的中心注射通道，以及可拆卸式导引盘。美国专利公开2005/0052630的完整内容以引用的方式完全并入本文中。

美国专利第7,245,963号和美国专利公开2005/0052630中所描述的电极阵列和方法可以适用于不仅深穿透到如肌肉的组织中，而且深穿透到其它组织或器官中。归因于电极阵列的配置，注射针还完全插入到靶器官中，并且在由电极预先划定的区域中，注射垂直于靶对象施用。美国专利第7,245,963号和美国专利公开2005/005263中所描述的电极优选是20mm长和21号规格。

另外，并入有电穿孔装置和其用途的一些实施例中涵盖电穿孔装置，其为以下专利中所描述的电穿孔装置：1993年12月28日颁发的美国专利5,273,525、2000年8月29日颁发的美国专利6,110,161、2001年7月17日颁发的美国专利6,261,281和2005年10月25日颁发的美国专利6,958,060，以及2005年9月6日颁发的美国专利6,939,862。此外，本文所涵盖的专利涵盖2004年2月24日颁发的美国专利6,697,669中所提供的主题，其涉及使用多种装置中的任一种施用DNA；和2008年2月5日颁发的美国专利7,328,064，其涉及注射DNA的方法。以上专利以全文引用的方式并入。

本文提供了制备载体的方法，所述载体包含编码本文所论述的合成共有存活素抗原的核酸分子。可以使用所属领域中已知的方法，使用最终亚克隆到哺乳动物表达质粒的步骤之后的载体接种大型发酵罐中的细胞培养物。

供与本发明的EP装置一起使用的DNA载体可以使用已知装置和技术的组合配制或制造，但其优选使用优化制造技术制造，所述技术描述于2007年5月23日提交的美国公开申请第20090004716号中。在一些实例中，这些研究中所使用的DNA载体可以大于或等于10mg/mL的浓度配制。除U.S.第60/939792号中所描述的装置和方案以外，制造技术还包括或并入有所属领域的技术人员通常已知的各种装置和方案，包括2007年7月3日颁发的美国专利第7,238,522号中所描述的装置和方案。以上提及的申请和专利、US第60/939,792号以及美国专利第7,238,522号分别全文并入本文中。

实例

本发明在以下实例中进一步说明。应理解，这些实例虽然指示本发明的优选实施例，但仅为了说明而给出。根据以上论述和这些实例，所属领域的技术人员可以确定本发明的基本特征，并且在不脱离其精神和范围的情况下，可对本发明进行各种改变和修改以使其适于各种用途和条件。因此，所属领域的技术人员根据前文描述将显而易知除本文所示和所描述之外的本发明的各种修改。此类修改也意图在所附权利要求书的范围内。

实例1-共有存活素同工型1的产生

从基因库(www.ncbi.nlm.nih.gov/genbank/)中收集二十九种存活素同工型1序列。选定存活素同工型1序列的基因库登录号是：NP_001125727.1、3UIG、1F3H、BAC22748.2、NP_001159.2、CAG46540.1、BAD97148.1、XP_002748841.1、XP_003818322.1、NP_001253110.1、XP_011810718.1、XP_011832690.1、XP_001083183.1、XP_003786134.1、XP_012516801.1、XP_007957800.1、XP_001915435.1、XP_008523102.1、AAT37504.1、XP_004432883.1、XP_003417277.1、XP_004374167.1、NP_999306.1、XP_002918421.1、NP_001003348.1、NP_001009280.1、XP_004748859.1、NP_001001855.2以及AAU89275.1。

共有序列使用

Lasergene软件包(13.0.0.357版)产生。将上文所列的二十九种序列导入MegAlign并且使用ClustalW多序列比对程序比对。所得共有存活素同工型1序列与原生人类存活素同工型1具有97.2-97.9％同源性。为了消除所得共有存活素同工型1蛋白的潜在生物功能，引入三个突变以消除存活素的抗凋亡活性。三个突变是T34A、T48A以及C84A。此外，为了具有较高表达水平，将上游克扎克序列和IgE前导序列添加到N端。另外，这种基因的密码子使用适于智人基因的密码子偏倚(codon bias)。(Andre,S.等人《利用具有优化密码子使用的合成gp120序列进行DNA疫苗接种诱发提高的免疫反应(Increased immune response elicited by DNA vaccination with a synthetic gp120sequence with optimized codon usage)》.《病毒学杂志(Journal of virology)》72,1497-1503(1998)；Deml,L.等人《密码子使用优化对编码人类免疫缺陷病毒1型Gag蛋白的DNA候选疫苗的表达和免疫原性的多种影响(Multiple effects of codon usageoptimization on expression and immunogenicity of DNA candidate vaccinesencoding the human immunodeficiency virus type 1Gag protein)》.《病毒学杂志》75,10991-11001,doi:10.1128/JVI.75.22.10991-11001.2001(2001))。另外，进行RNA优化：避开具有极高(>80％)或极低(<30％)GC含量的区，和顺式作用序列基元，如内部TATA盒、chi位点以及核糖体进入位点。结果，合成共有存活素抗原同工型1蛋白与人类原生存活素同工型1蛋白具有95.1-95.8％一致性。合成共有存活素抗原同工型1的核苷酸序列列于SEQ IDNO:1中。合成共有存活素抗原同工型1T3的氨基酸序列列于SEQ ID NO:2中。

将合成共有存活素抗原同工型1用BamHI和XhoI消化，并且克隆到所有权表达载体pGX0001中，其中表达盒置于巨细胞病毒即刻早期启动子的转录控制下。所得质粒被命名为pGX1428。进行全长测序并且随后分析且确认为正确。合成共有存活素抗原同工型1构建体的示意图显示于图1中。合成共有存活素抗原同工型1的整体结构显示于图2中。

表1.

表2.合成共有存活素抗原同工型1的特征

特征	合成共有存活素抗原同工型1
		与原生人类存活素的一致性	95.1％到95.8％
与原生恒河猴存活素的一致性	95.8％
		与原生小鼠存活素的一致性	70.0％到83.6％
氨基酸突变的数目(相对于原生人类)	6
		插入突变的数目(非共有序列来源的)	3
分子量	161aa(18KDa)
		编码序列的长度(bp)	483

实例2-共有存活素同工型1T3的产生

为了产生人类共有存活素同工型3，从基因库(www.ncbi.nlm.nih.gov/genbank/)中收集8种存活素同工型3序列。选定存活素同工型3序列的基因库登录号是：NP_001012270.1、XP_008969790.1、XP_008011275.1、XP_009189614.1、XP_011897653.1、XP_011810642.1、XP_011844315.1以及XP_011718355.1。

共有序列使用

Lasergene软件包(13.0.0.357版)产生。将上文所列的八种序列导入MegAlign并且使用ClustalW多序列比对程序比对。来自低等动物的这些序列中的六种在其C末端含有额外的11个氨基酸的残基，所述残基在人类序列中不存在。当产生共有人类存活素同工型3时，省略这些额外残基以避免在人体内诱发脱靶免疫反应。产生人类共有存活素同工型3之后，从共有存活素同工型3中去除存活素同工型1与同工型3之间一致的氨基酸序列。截短共有存活素同工型3序列(存活素抗原T3)与原生人类存活素同工型T3序列具有96.8％序列同源性。通过在存活素抗原1(上文所描述)与存活素抗原T3之间添加弗林蛋白酶裂解位点产生存活素抗原同工型1T3免疫原。

一旦获得共有合成共有存活素抗原同工型1T3 DNA序列，则为了具有较高表达水平，将上游克扎克序列和IgE前导序列添加到N端。(Yang,J.S.等人《来自西尼罗病毒纽约分离株(WNV-NY1999)的新颖DNA疫苗对强效Th1型免疫反应的诱导(Induction of potentTh1-type immune responses from a novel DNA vaccine for West Nile virus NewYork isolate(WNV-NY1999))》.《感染性疾病杂志(The Journal of infectiousdiseases)》184,809-816,doi:10.1086/323395(2001))。另外，这种基因的密码子使用适于智人基因的密码子偏倚(Andre,S.等人《利用具有优化密码子使用的合成gp120序列进行DNA疫苗接种诱发提高的免疫反应》.《病毒学杂志》72,1497-1503(1998)；Deml,L.等人《密码子使用优化对编码人类免疫缺陷病毒1型Gag蛋白的DNA候选疫苗的表达和免疫原性的多种影响》.《病毒学杂志》75,10991-11001,doi:10.1128/JVI.75.22.10991-11001.2001(2001))。另外，还进行RNA优化：避开具有极高(>80％)或极低(<30％)GC含量的区，和顺式作用序列基元，如内部TATA盒、chi位点以及核糖体进入位点11,12。将合成共有存活素抗原同工型1T3用BamHI和XhoI消化，并且克隆到表达载体pGX0001中，其中表达盒置于巨细胞病毒即刻早期启动子的转录控制下。所得质粒被命名为pGX1429。进行全长测序并且随后分析且确认为正确。合成共有存活素抗原同工型1T3的核苷酸序列列于SEQ ID NO:3中，如表1中所显示。合成共有存活素抗原同工型1T3的氨基酸序列列于SEQ ID NO:8中，如表1中所显示。合成共有存活素抗原同工型1T3构建体的示意图显示于图3中。合成共有存活素抗原同工型1T3构建体的特征提供于表3中。

表3.合成共有存活素抗原同工型1T3的特征

实例3-pGX存活素表达载体的构建

处于人类巨细胞病毒即刻早期启动子(hCMV启动子)控制下的pGX0001(经修饰的pVAX1表达载体)用作骨架载体。初始pVAX1获自赛默飞世尔科学(Thermo FisherScientific)。

将修饰引入到pVAX1中以建立pGX0001并且基于可获自赛默飞世尔科学的pVAX1的所报道序列进行鉴别。这些修饰列于以下，并且未检测到关于质粒扩增和抗原转录与翻译的问题。迄今为止，在使用pGX0001作为骨架的平台中的质粒产品中的任一个中未观察到pGX0001序列中的进一步变化。

在CMV启动子上游的骨架中，碱基对2、3和4从ACT改变为CTG。

pGX1428是编码合成共有存活素抗原同工型1(存活素抗原1)蛋白的DNA质粒。相关mRNA产生由人类CMV启动子(hCMV启动子)驱动并且通过牛生长激素3'端聚腺苷酸化信号(bGH polyA)终止。出于生产目的，pGX0001骨架包括卡那霉素抗性基因(KanR)和质粒复制起点(pUC ori)。那些元件在真核细胞中不具有功能。如图4中所说明，通过在BamHI和XhoI位点处将合成共有存活素抗原同工型1(存活素抗原1)DNA序列克隆到pGX0001中制得pGX1428。

pGX1429是编码合成共有存活素抗原1T3(存活素抗原1T3)蛋白的DNA质粒。相关mRNA产生由人类CMV启动子(hCMV启动子)驱动并且通过牛生长激素3'端聚腺苷酸化信号(bGH polyA)终止。出于生产目的，pGX0001骨架包括卡那霉素抗性基因(KanR)和质粒复制起点(pUC ori)。那些元件在真核细胞中不具有功能。如图5中所说明，通过在BamHI和XhoI位点处将合成共有存活素抗原同工型1T3(存活素抗原1T3)DNA序列克隆到pGX0001中制得pGX1429。

实例4-合成共有存活素抗原构建体的免疫原性

在小鼠中评估设计成靶向人类存活素的疫苗构建体合成共有存活素抗原1(pGX1428)和合成共有存活素抗原1T3(pGX1429)的免疫原性。还通过蛋白质印迹法体外评估抗原蛋白由每种构建体的表达。

材料和方法

质粒

合成共有存活素抗原1(pGX1428)和合成共有存活素抗原1T3(pGX1429)如本文所描述设计。对于体外和体内研究，从金斯瑞(GenScript)订购pGX1428(批号786114S-1/G52238)和pGX1429(批号786114S-2/G52239)两者的质粒(10mg)。10mg质粒储备的抗原序列通过桑格测序(Sanger sequencing)确认。

体外抗原表达

通过蛋白质印迹法确认抗原蛋白由pGX1428和pGX1429的表达。如图6所示，将维持于含10％FBS的DMEM培养基(赛默飞世尔)中的人类横纹肌肉瘤(RD)细胞(ATCC，CCL-136)使用Turbofectin 8(傲锐基因(Origene))用pGX1428、pGX1429或pGX0001(6μg/10cm2盘)转染。转染之后的四十八小时，使用RIPA细胞溶解缓冲液(赛默飞世尔)溶解细胞并且收集细胞溶解物。BCA分析(赛默飞世尔)测定总蛋白质浓度之后，使15μg细胞溶解物在4-12％SDS-PAGE凝胶(赛默飞世尔)上电泳。用针对人类存活素的氨基酸1-142的单克隆抗体(圣克鲁兹生物技术(Santa Cruz Biotech)，克隆D8，sc-17779)执行检测，随后使用ECL蛋白质印迹分析系统(GE Amersham)，用辣根过氧化酶(HRP)缀合的山羊抗小鼠IgG(圣克鲁兹生物技术，sc-2005)可视化。作为内参照，使用抗β-肌动蛋白单克隆抗体(圣克鲁兹生物技术，克隆C4，sc-47778HRP)再探测印迹中的肌动蛋白表达。

动物和免疫接种

8周龄雌性CB6F1小鼠购自杰克逊实验室(Jackson Laboratories)。所有动物圈养于BTS研究所(加利福尼亚州圣迭戈)的温度可控的光循环机构中。根据美国国家卫生研究院(National Institutes of Health)指导原则和动物照护和使用提案(ACUP)(BTS ACUP#15-091)进行动物照护。将小鼠分成九组，如表4中详述。

表4.研究组

组	n	构建体	构建体剂量(μg)	注射体积(μL)
					1	4	pGX0001	30	30
2	8	pGX1428	10	30
					3	8	pGX1428	20	30
4	8	pGX1428	30	30
					5	8	pGX1428	50	30
6	8	pGX1429	10	30
					7	8	pGX1429	20	30
8	8	pGX1429	30	30
					9	8	pGX1429	50	30

根据SOP R20-003147

3P小鼠处理，将经免疫接种组中的小鼠用pGX0001、pGX1428或pGX1429指定剂量进行疫苗接种。简单来说，在无菌注射用水(VetOne)中配制质粒，以便以30μL注射体积通过肌肉内注射将指定的剂量递送到胫骨前肌中。每次肌肉内注射之后立即使用具有3P阵列的

2000适应性恒定电流电穿孔装置(Inovio制药)进行电穿孔(EP)。装置被配置成递送两个0.1Amp脉冲，52ms脉冲宽度，间隔1秒延迟。小鼠隔3周接收3次免疫接种。最后一次免疫接种之后的一周处死小鼠并且收获脾脏用于细胞免疫读数。未收集其它组织。

脾脏淋巴细胞分离

以无菌方式分离出脾细胞并且置于5mL R10培养基(补充有10％胎牛血清和1％抗生素-抗霉菌素的罗斯韦尔帕克纪念研究所(Rosewell Park Memorial Institute)培养基1640)中。通过使用Stomacher机器(苏华德实验室系统公司(Seward Laboratory SystemsInc.))机械破碎脾脏来分离脾细胞，并且使用40μm细胞过滤器(BD Falcon)过滤所得产物。将所得产物离心并且集结粒用ACK溶解缓冲液(龙沙(Lonza))处理5分钟以便溶解RBC。随后将脾细胞离心，用PBS洗涤，并且随后再悬浮于R10培养基中且立即用于进一步分析。

IFNγELISpot

使用来自MabTech的试剂盒(MabTech，#3321-4APW-10)执行小鼠IFNγELISpot分析以评估抗原特异性细胞反应。简单来说，经抗小鼠IFNγ抗体(mAb AN18)预涂布的96孔板用PBS洗涤并且在室温下用完全培养基(补充有10％FBS和抗生素的RPMI1640)阻断2小时。将脾脏淋巴细胞再悬浮于R10培养基中并且随后以每孔2×105个细胞的输入细胞数目添加，一式三份。合成一组肽(金斯瑞)，每种肽含有15个氨基酸残基，有11个氨基酸重叠，代表完整的合成共有存活素抗原1和合成共有存活素抗原1T3蛋白序列。将这些肽组再悬浮于DMSO(西格玛(Sigma))中并且以约2μg/ml肽的浓度合并到两个肽池中。一个肽池含有对应于合成共有存活素抗原1抗原蛋白的肽，并且第二肽池含有对应合成共有存活素抗原1T3抗原蛋白的肽。5μg/ml的刀豆蛋白A(Concavalin A)(西格玛)用作阳性对照并且完全培养基用作阴性对照。培养板在5％CO2气氛的培育箱中、在37℃下培育18小时。随后，添加生物素化抗小鼠IFNγ检测抗体(MabTech mAb R4-6A2)，并且培养板在室温下培育2小时。洗涤培养板，并且添加链霉亲和素-ALP(MabTech)并且培养板在室温下培育1小时。根据试剂盒制造商的说明书(MabTech)，使用BCIP/NBT底物完成斑点检测。培养板上的斑点使用自动化ELISPOT读取器(细胞技术(Cellular Technology))计数。将斑点形成单位(SFU)的平均数调整到1×10⁶个脾细胞用于数据显示。

在图7A-7H中，IFNγELISpot的抗原特异性反应按每1×10⁶个脾细胞的IFNγ斑点形成单位(SFU)的数目报道，其大于单独培养基对照中的SFU。

流式细胞术

由合成共有存活素抗原1和合成共有存活素抗原1T3诱导的细胞免疫反应通过流式细胞术进一步表征。简单来说，对于每个组在适当时，来自经疫苗接种和未经处理小鼠的2×10⁶个脾细胞在分离之后，立即在布雷菲德菌素A(Brefeldin A)(BD生物科学(BDBiosciences))、莫能菌素(Monensin)(BD生物科学)以及FITC抗小鼠CD107a抗体(BD生物科学，克隆1D4B)的存在下用合成共有存活素抗原1和存活素1T3肽刺激6小时。用肽刺激之后，将脾细胞离心并且再悬浮于每孔20μL的小鼠BD Fc阻断(BD生物科学)溶液中。Fc阻断溶液在PBS中以1:40的初始稀释度使用并且在4℃下培育5分钟。培育之后，每孔添加30μL剩余细胞外抗体(在PBS中)并且在4℃下培育30分钟。添加细胞外染色剂之后，每个孔中的最终体积是50μL，由最终稀释度为1:100的Fc阻断溶液和处于适当工作稀释度的细胞外抗体组成。细胞随后用活力染料(Vivid V450，赛默飞世尔)和以下细胞外抗体染色：PerCP-Cy5.5抗小鼠CD4(BD生物科学，克隆RM4-5)和APC抗小鼠CD8a(BD生物科学，克隆63-6.7)。将细胞固定且在4℃下渗透(BD生物科学，#554714)20分钟。细胞内染色随后使用以下抗体完成：APC-Cy7抗小鼠CD3e(BD生物科学，克隆145-2C11)、BV605抗小鼠IFNγBD生物科学，克隆XMG1.2)、APC-R700抗小鼠IL-2(BD生物科学，克隆JEs6-5H4)以及PE抗小鼠TNF-α(BD生物科学，克隆MP6-XT22)。在10色FACS CANTO(BD生物科学)上收集ICS数据并且使用FlowJo软件完成分析。流式细胞术设门策略显示在图8中。

对于根据流式细胞术称为抗原特异性的细胞来说，所报道参数的频率必须超过单独培养基对照的频率。对于被鉴别为产生抗原特异性CD107a的细胞来说，必须还鉴别出细胞对IFNγ和/或IL-2和/或TNFα的抗原特异性产生呈阳性，如通过布尔设门(Booleangating)所鉴别。

统计分析

使用IBM SPSS Statistics 22(IBM公司(IBM Corporation))完成统计分析。使用ANOVA联合事后图基诚实显著差异(post-hoc Tukey's Honest Significant Difference(HSD))执行组之间的分析，以针对多重比较进行调整。多重比较之前，使用F统计证实方差齐性。对于所有统计分析，0.050的p值被视为显著。

结果

合成共有存活素抗原蛋白的表达

两种构建体设计成靶向人类存活素合成共有存活素抗原1(pGX1428)和合成共有存活素抗原1T3(pGX1429)。通过蛋白质印迹法确认合成共有存活素抗原1和合成共有存活素抗原1T3抗原蛋白分别由pGX1428和pGX1429的表达。简单来说，用pGX1428、pGX1429或pGX0001(空载体，阴性对照)质粒转染人类横纹肌肉瘤(RD)细胞。用抗人类存活素抗体(BIRC5)探测细胞溶解物中的合成共有存活素抗原蛋白表达。检测到合成共有存活素抗原1的预期分子量(17.5kD)和合成共有存活素抗原1T3的预期分子量(25.3kD)的蛋白带(图6)。在阴性对照(pGX0001)中检测到微弱的带，其最可能因RD细胞系中低水平内源性存活素蛋白表达所致。检测到抗β-肌动蛋白带的强度相似，表明每个泳道中装载的蛋白质的量相等。综上所述，发现pGX1428和pGX1429表达其对应抗原蛋白。

合成共有存活素抗原疫苗构建体的免疫原性

IFNγELISpot

通过IFNγELISpot和流式细胞术(n＝8/组)评估两种合成共有存活素抗原构建体在四种剂量(10μg、20μg、30μg以及50μg)下的免疫原性。用空载体骨架(pGX0001)作为阴性对照(n＝4/组)免疫接种小鼠。与经阴性对照疫苗接种的小鼠相比，用合成共有存活素抗原1进行疫苗接种引起显著IFNγ反应。然而，由合成共有存活素抗原1诱导的IFNγ产生存在剂量依赖性增加的证据极少(图10A)，表明在最低剂量下达成最大反应。具体来说，在10μg、20μg、30μg以及50μg下，合成共有存活素抗原1IFNγSFU分别是1,082±574、1,186±747、1,135±647以及848±350。在10μg(p＝0.031)、20μg(p＝0.015)和30μg(p＝0.021)剂量pGX1428下，而非在50μg剂量(p＝0.134)下，合成共有存活素抗原1IFNγ反应显著大于未经处理(2±3)。用合成共有存活素抗原1T3进行疫苗接种引起显著IFNγ反应，有一些证据表明随剂量水平提高的剂量依赖性增加(图10D)。在10μg、20μg、30μg以及50μg下，存活素1T3IFNγSFU分别是516±156、812±534、1,016±654以及818±339。在20μg(p＝0.039)、30μg(p＝0.006)和50μg(p＝0.037)剂量pGX1429下，而非在10μg剂量(p＝0.337)下，合成共有存活素抗原1T3 IFNγ反应显著大于未经处理(5±6)。IFNγ反应概述于表5中。

表5.由合成共有存活素抗原1和合成共有存活素抗原1T3诱导的IFN-γ反应。

所报道的p值是相对于未经处理(经pGX0001免疫接种的小鼠)

流式细胞术

相对于CD8+T细胞隔室中的反应，合成共有存活素抗原1和合成共有存活素抗原1T3都诱发CD4+T细胞隔室中更稳健的反应(图9)。与未经处理(0.03％±0.05％)相比，在20μg(1.08％±0.65％)(p＝0.024)和50μg(1.21％±0.73％)(p＝0.009)剂量组中，而非在10μg(0.86％±0.31％)(p＝0.105)或30μg(0.82％±0.46％)(p＝0.134)剂量组中，合成共有存活素抗原1诱导的抗原特异性CD4+T细胞反应显著更稳健(图7B)。与未经处理(0.05％±0.05％)相比，在20μg(1.02％±0.59％)(p＝0.010)、30μg(1.08％±0.47％)(p＝0.006)和50μg(1.13％±0.44％)(p＝0.004)剂量组中，而非在10μg(0.62％±0.35％)(p＝0.248)剂量组中，合成共有存活素抗原1T3诱导的抗原特异性CD4+T细胞反应显著更稳健(图7E)。合成共有存活素抗原特异性CD4+T细胞的细胞因子概况对于两种构建体跨剂量组类似，并且主要包含IFNγ+IL-2+TNFα+、IFNγ+IL-2-TNFα+或IFNγ+IL-2-TNFα-细胞(图7G、图7H)。抗原特异性CD4+T细胞的频率进一步详述于表6中。

表6.由合成共有存活素抗原1和合成共有存活素抗原1T3诱导的CD4⁺T细胞反应。

所报道的p值是相对于未经处理(经pGX0001免疫接种的小鼠)

由合成共有存活素抗原1诱导的抗原特异性CD8+T细胞的频率不存在显著差异(p＝0.117)(图7C)。在各组剂量组之间，存活素1T3确实诱导显著更高频率的抗原特异性CD8+T细胞(p＝0.043)。与未经处理(0.07％±0.01％)相比，用10μg(0.15％±0.09％)(p＝0.919)、20μg(0.27％±0.21％)(p＝0.274)或30μg(0.25％±0.14％)(p＝0.377)pGX1429免疫接种的组中的抗原特异性CD8+T反应未接近统计显著。在用50μg pGX1429免疫接种的组中，存活素1T3特异性CD8+T细胞的频率接近统计显著(0.36％±0.21％)(p＝0.051)(图7F)。合成共有存活素抗原1和合成共有存活素抗原1T3两者诱导在量值和表型上类似的CD8+T细胞反应。抗原特异性CD8+T细胞主要是IFNγ+IL-2-TNFα-、IFNγ+IL-2-TNFα+(图7G、图7H)。抗原特异性CD8+T细胞的频率进一步详述于表7中。

表7.由合成共有存活素抗原1和合成共有存活素抗原1T3诱导的CD8⁺T细胞反应

所报道的p值是相对于未经处理(经pGX0001免疫接种的小鼠)

由合成共有存活素抗原1(图10A)和合成共有存活素抗原1T3(图10B)诱导的细胞因子阳性CD4+T细胞的大致25％还对CD107a呈阳性，表明CD4+T细胞介导的细胞溶解功能的一些潜能。与未经处理(0.01％±0.01％)相比，所有剂量的合成共有存活素抗原1诱导显著更高的CD4+CD107a+T细胞频率。具体来说，在10μg(p＝0.013)、20μg(p<0.001)、30μg(p＝0.050)以及50μg(p<0.001)剂量组中，抗原特异性CD4+CD107a+T细胞的频率分别是0.25％±0.08％、0.36％±0.11％、0.21％±0.15％以及0.38％±0.13％(图10A)。与未经处理(0.01±0.01)相比，在除10μg剂量组(0.18％±.0.09％)(p＝0.147)的所有组中，合成共有存活素抗原1T3诱导显著更高的CD4+CD107a+T细胞频率。在20μg(p＝0.030)、30μg(p＝0.010)以及50μg(p＝0.004)剂量组中，抗原特异性CD4+CD107a+T细胞的频率分别是0.24％±0.12％、0.27％±0.12％以及0.29％±0.16％(图10B)。具有细胞溶解潜能的抗原特异性CD4+T细胞的频率进一步详述于表8中。

表8.由合成共有存活素抗原1和合成共有存活素抗原1T3诱导的抗原特异性CD4+T细胞的细胞溶解潜能。

所报道的p值是相对于未经处理(经pGX0001免疫接种的小鼠)

类似于抗原特异性CD8+T细胞的量值，合成共有存活素抗原1在所有组中不诱导CD8+CD107a+T细胞的频率的显著变化(p＝0.101)(图10C)。合成共有存活素抗原1T3确实诱导CD8+CD107a+T细胞的频率在所有剂量组之间的显著变化(p＝0.034)(图10D)。在用50μgpGX1429(0.28％±0.22％)(p＝0.026)免疫接种的组中，而非用10μg(0.11％±0.08％)(p＝0.813)、20μg(0.16％±0.11％)(p＝0.450)、30μg(0.16％±0.07％)(p＝0.424)合成共有存活素抗原1T3免疫接种的组中，抗原特异性CD8+CD107a+T细胞的频率在未经处理的频率(0.03±0.01)之上显著提高。合成共有存活素抗原特异性CD8+CD107a+T细胞的细胞因子概况对于两种构建体跨剂量组类似，并且主要包含IFNγ+IL-2-TNFα+、IFNγ+IL-2-TNFα-细胞(图10E、图10F)。具有细胞溶解潜能的抗原特异性CD8+T细胞的频率进一步详述于表9中。

表9.由合成共有存活素抗原1和合成共有存活素抗原1T3诱导的抗原特异性CD8+T细胞的细胞溶解潜能

所报道的p值是相对于未经处理(经pGX0001免疫接种的小鼠)

由合成共有存活素抗原构建体诱导的IFNγ反应的宽度

使用肽矩阵池方法通过表位作图检查由pGX1428和pGX1429诱导的对存活素的IFNγ反应的宽度(图11A-11D)。检查来自用最高剂量pGX1428(n＝8)(图11A)或pGX1429(n＝8)(图11B)免疫接种的小鼠的合并脾脏淋巴细胞。

pGX1428和pGX1429两者中存在以下合成共有存活素抗原1表位：

LPPAWQLFLKDHRISTFKN(SEQ ID NO:5)(矩阵池1、2、3、4以及7)

LKLDRERAKNKIAKETNNK(SEQ ID NO:6)(矩阵池1、2、3、4以及11)

pGX1429中存在的合成共有存活素抗原T3表位：

EWLHHFQGLFP(SEQ ID NO:7)(矩阵池3、4以及7)

尽管由合成共有存活素抗原1诱导的细胞免疫反应与由合成共有存活素抗原1T3诱导的细胞免疫反应的总量值类似，但由合成共有存活素抗原1T3(pGX1429)诱导的针对合成共有存活素抗原1T3的合成共有存活素抗原1(pGX1428)区的反应的量值是由合成共有存活素抗原1构建体(pGX1428)诱导的反应的量值的大致一半。使用矩阵方法通过IFNγELISpot进行表位作图展现两种合成共有存活素抗原构建体产生对合成共有存活素抗原1抗原中相同表位的反应，但由合成共有存活素抗原1T3驱动的针对这些表位的反应的量值较低。还确定了合成共有存活素抗原1T3抗原的T3区中存在独特表位。

尽管由合成共有存活素抗原1(pGX1428)诱导的细胞免疫反应与由合成共有存活素抗原1T3(pGX1429)诱导的细胞免疫反应的总量值类似，但由合成共有存活素抗原1T3(pGX1429)诱导的针对合成共有存活素抗原1T3抗原的合成共有存活素抗原1区的反应的量值是由合成共有存活素抗原1构建体(pGX1428)诱导的反应的量值的大致一半。使用矩阵方法通过IFNγELISpot进行表位作图展现两种合成共有存活素抗原构建体产生对与合成共有存活素抗原1抗原相同表位的反应，但由合成共有存活素抗原1T3驱动的针对这些表位的反应的量值较低。还使用这种方法确定了合成共有存活素抗原1T3抗原的T3区中存在独特表位。与未经处理相比，合成共有存活素抗原1T3还显著提高抗原特异性CD8+和CD8+CD107a+T细胞的频率，而合成共有存活素抗原1不显著增加小鼠中的抗原特异性CD8+T细胞。基于合成共有存活素抗原1T3(pGX1429)相比于pGX1428进一步增加小鼠中对存活素的细胞免疫反应宽度的潜能，选择所述抗原前进到单价非人类灵长类动物研究中。

实例5-使用合成共有存活素抗原1T3(pGX1429)进行的非人类灵长类动物研究

为了研究单独和与低剂量和高剂量IL-12组合的合成共有存活素1T3的潜能，将各自由独特NHP ID号标识的十八只成年恒河猴分成3组，每组6只，并且如下用pGX1429免疫接种。六只动物用3.0mg pGX1429免疫接种，六只动物用3.0mg pGX1429外加作为佐剂的0.04mg pGX6006(opt rh IL-12)免疫接种，并且六只动物用3.0mg pGX1429外加作为佐剂的0.20mg pGX6006(opt rh IL-12)免疫接种，所述药剂以1.0mL注射体积在SSC中配制。在第0、4、8以及12周时施用免疫接种注射。所有免疫接种利用

2000 5P-IM EP装置以在无菌WFI中配制的1ml注射体积在相应交替对侧肢体中进行。EP条件如下：OpBlock0070-IM，0.5Amp，3个脉冲，52毫秒，脉冲之间0.2秒。在第2、6、10以及14周时评定存活素免疫原性。存活素特异性IFN-γ反应显示于图12和13中。原生恒河猴存活素与pGX1429之间的同源性在表10中给出。如图13和14所示，在用合成共有存活素抗原1T3外加作为佐剂的0.20mg IL-12免疫接种的动物中观察到提高的存活素特异性反应。

PBMC分离

在含有抗凝血剂和凝胶屏障的柠檬酸钠细胞制备管(CPT CPT，BD生物科学)中收集非人类灵长类动物全血。将全血在收集之后不久(2小时内)离心，以便分离并且浓缩PMBC，随后隔夜装运。红细胞和中性粒细胞沉淀到管底部，并且由凝胶屏障保持在适当位置。血浆和淋巴细胞保持在凝胶屏障上方。每个CPT可以容纳约8mL血液，并且在室温下装运。离心的CPT管加工用于PBMC分离。在用氯化铵-钾(ACK)缓冲液溶解红细胞之后，活细胞使用英杰CountessTM自动化细胞计数器计数，并且再悬浮于完全培养基(补充有10％FBS、抗生素以及β巯基乙醇的RPMI 1640)中。在完成如本文所描述的分析后，将其余的PBMC在冷冻管中的冷冻培养基(10％来自西格玛的DMSO/90％来自Seradigm的FBS)中冷冻，并且在液氮中长期储存。

IFNγELISpot

为了评估疫苗诱导的抗原特异性细胞反应，在每一时间点使用试剂盒(MabTechIFNγELISpotPro，#3421M-2APW-10)对分离的PMBC进行猴IFNγELISpot分析。简单来说，经抗猴IFNγ抗体(mAb MT126L)预涂布的96孔板用PBS洗涤并且在室温下用完全培养基(补充有10％FBS、抗生素和β巯基乙醇的RPMI 1640)阻断2小时。将NHP PBMC再悬浮于R10培养基中并且随后以每孔2×10⁵个细胞的输入细胞数目添加，一式三份。合成一组肽(金斯瑞)，每种肽含有15个氨基酸残基，有11个氨基酸重叠，代表完整的合成共有蛋白序列。将这些肽组再悬浮于DMSO(西格玛)中并且以大致2μg/mL各个对应肽的浓度合并到池中。所有抗原特异性合并肽以1:100稀释度使用，在与PBMC组合时，这引起每个孔中1:200的最终稀释度。每种抗原蛋白的尺寸的变化产生2种存活素的肽池。

抗CD3(mAb CD-2Mabtech)和/或PMA(西格玛)以及离子霉素(Ionomycin)(西格玛)用作阳性对照。完全R10培养基用作阴性对照。培养板在5％CO₂气氛的培育箱中、在37℃下培育大致18小时。进行细胞去除，并且添加ALP缀合抗猴IFNγ检测抗体(MabTech Ab 7-B6-1-ALP)之后，将培养板在室温下培育2小时。随后根据试剂盒制造商的说明书(MabTech)使用BCIP/NBT底物溶液使夹心式免疫-酶分析显色。蓝黑色沉淀物以斑点形式形成，展现各个产生IFNγ的细胞。斑点随后通过CTL

分析器和软件(细胞技术)扫描并计数，并且由经过训练的操作员进行质量控制。IFNγ反应以1×10⁶个PBMC的斑点形成单位(SFU)为单位报道，超过仅培养基对照中的SFU。

表10.与原生恒河猴存活素相比，合成共有存活素抗原1T3的特征。

	区	原生恒河猴
			pGX1429	全长	95.8％(NP_001253110.1)
pGX1429	同工型1区	95.9％(NP_001253110.1)
			pGX1429	T3区	9.4％(NP_001253110.1)

表11.构建体、抗原、剂量

第1组、第2组和第3组接受以下：

·第1组-3.0mg pGX1429(合成共有存活素1T3)。在SSC中配制，1.0mL注射体积，IM。

·第2组-3.0mg pGX1429(合成共有存活素1T3)+0.04pGX6006(opt.rIL-12)。在SSC中配制，1.0mL注射体积，IM。

·第3组-3.0mg pGX1429(合成共有存活素1T3)+0.20pGX6006(opt.rIL-12)。在SSC中配制，1.0mL注射体积，IM。

所有组根据以下时程免疫接种：

·免疫接种1(第0周)

·免疫接种2(第4周)

·免疫接种3(第8周)

·免疫接种4(第12周)

·免疫接种5(任选的)

结果

对于第1-3组，存活素特异性IFNγ反应分别显示于图12-14中。结果显示每个剂量后2周时间点处的反应。总的来说，与基线采血前相比，截至剂量4后2周研究终止，所有组和个别动物的反应提高。与单独的存活素或存活素外加0.04mg IL-12相比，添加较高剂量的IL-12(0.2mg)引起每一时间点处更大并且更一致的反应。对于存活素外加IL-12 0.2mg，还记下早在PD2的更高反应。

如表12-14中所显示，不存在因免疫接种所致的测量的生理参数中的任一个的差异。对于RBC、HCT、中性粒细胞、淋巴细胞、单核细胞、嗜酸性粒细胞，未记下显著差异(结果未显示)。这些值在经历类似实验程序的这一物种、性别和年龄的动物的预期范围内。所述正常范围的任何变化具有偶发性质、仅在一种性别中存在并且与剂量水平或时间选择不相关。

表12.第1组中生理参数的评定

注意：超出正常范围*

表13.第2组中生理参数的评定

注意：超出正常范围*

表14.第3组中生理参数的评定

注意：超出正常范围*

对于所有组，在研究过程中不存在重量的显著变化(数据未显示)。

总的来说，结果表明单独施用的合成共有存活素能够在100％NHP中诱导免疫反应。添加IL-12佐剂提高记下的合成共有存活素的反应，但仅在较高剂量IL-12的情况下引起更早、更大的PD2反应。

应理解，前述具体实施方式和随附实例仅仅是说明性的并且不认为是限制本发明的范围，本发明的范围仅由随附权利要求书以及其等效物限定。

对所公开实施例的各种变更和修改对于所属领域的技术人员来说将是显而易见的。可以在不脱离本发明的精神和范围的情况下对所公开的实施例进行此类变更和修改，包括(但不限于)与本发明的化学结构、取代基、衍生物、中间体、合成、组合物、配制物或使用方法有关的那些变更和修改。

序列表

<110> 艾诺奥医药品有限公司

严健

安娜·斯莱格

布拉德利·加曼

尼尔·库奇

<120> 靶向存活素的癌症疫苗和其用途

<130> 104409.000448 / INO-1004 WO

<150> US 62/598,267

<151> 2017-12-13

<160> 7

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 483

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成共有存活素同工型1 DNA编码序列pGX1428

<400> 1

atggattgga cctggattct gttcctggtg gcagcagcaa cccgggtgca ctccggagcc 60

cccacactgc cccctgcctg gcagctgttt ctgaaggacc acaggatctc tacattcaag 120

aactggccct ttctggaggg atgcgcatgt gcacctgaga ggatggcaga ggcaggcttc 180

atccactgcc ctgccgagaa tgagccagat ctggcccagt gcttcttttg ttttaaggag 240

ctggagggct gggagccaga cgatgacccc atcgaggagc acaagaagca cagctccggc 300

gccgccttcc tgtctgtgaa gaagcagttt gaggagctga ccctgagcga gttcctgaag 360

ctggatcggg agagagccaa gaacaagatc gccaaggaga ccaacaacaa gaagaaggag 420

tttgaggaga cagccaagaa ggtgaggtgt gccatcgagc agctggccgc catggactga 480

taa 483

<210> 2

<211> 159

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成共有存活素同工型1蛋白编码序列pGX1428

<400> 2

Met Asp Trp Thr Trp Ile Leu Phe Leu Val Ala Ala Ala Thr Arg Val

1 5 10 15

His Ser Gly Ala Pro Thr Leu Pro Pro Ala Trp Gln Leu Phe Leu Lys

20 25 30

Asp His Arg Ile Ser Thr Phe Lys Asn Trp Pro Phe Leu Glu Gly Cys

35 40 45

Ala Cys Ala Pro Glu Arg Met Ala Glu Ala Gly Phe Ile His Cys Pro

50 55 60

Ala Glu Asn Glu Pro Asp Leu Ala Gln Cys Phe Phe Cys Phe Lys Glu

65 70 75 80

Leu Glu Gly Trp Glu Pro Asp Asp Asp Pro Ile Glu Glu His Lys Lys

85 90 95

His Ser Ser Gly Ala Ala Phe Leu Ser Val Lys Lys Gln Phe Glu Glu

100 105 110

Leu Thr Leu Ser Glu Phe Leu Lys Leu Asp Arg Glu Arg Ala Lys Asn

115 120 125

Lys Ile Ala Lys Glu Thr Asn Asn Lys Lys Lys Glu Phe Glu Glu Thr

130 135 140

Ala Lys Lys Val Arg Cys Ala Ile Glu Gln Leu Ala Ala Met Asp

145 150 155

<210> 3

<211> 696

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> Sequence pGX1429 合成共有存活素同工型1+截短同工型3 DNA编码序列pGX1429

<400> 3

atggattgga catggattct gttcctggtg gcagcagcaa ccagggtgca ctctggagca 60

ccaacactgc cccctgcatg gcagctgttt ctgaaggacc accggatcag caccttcaag 120

aactggcctt ttctggaggg ctgcgcctgt gccccagaga gaatggcaga ggcaggcttc 180

atccactgcc cagccgagaa tgagcctgat ctggcccagt gcttcttttg ttttaaggag 240

ctggagggct gggagcctga cgatgaccca atcgaggagc acaagaagca cagctccgga 300

gcagccttcc tgagcgtgaa gaagcagttt gaggagctga cactgtccga gttcctgaag 360

ctggataggg agcgcgccaa gaacaagatc gccaaggaga ccaacaacaa gaagaaggag 420

tttgaggaga cagccaagaa ggtgcggtgt gcaatcgagc agctggcagc aatggacagg 480

ggaagaaagc ggagatccat gcagaggaag cctaccatca ggcgcaagaa tctgcgcaag 540

ctgcggagaa agtgcgccgt gccatctagc tcctggctgc cctggacaga ggcctctggc 600

tggagctgtc tggtgcccga gtggctgcac cacttccagg gactgtttcc tggagccacc 660

tccctgccag tgggaccact ggccatgtct tgataa 696

<210> 4

<211> 210

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> Sequence pGX1429 合成共有存活素同工型1+截短同工型3蛋白编码序列pGX1429

<400> 4

Met Asp Trp Thr Trp Ile Leu Phe Leu Val Ala Ala Ala Thr Arg Val

1 5 10 15

His Ser Gly Ala Pro Thr Leu Pro Pro Ala Trp Gln Leu Phe Leu Lys

20 25 30

Asp His Arg Ile Ser Thr Phe Lys Asn Trp Pro Phe Leu Glu Gly Cys

35 40 45

Ala Cys Ala Pro Glu Arg Met Ala Glu Ala Gly Phe Ile His Cys Pro

50 55 60

Ala Glu Asn Glu Pro Asp Leu Ala Gln Cys Phe Phe Cys Phe Lys Glu

65 70 75 80

Leu Glu Gly Trp Glu Pro Asp Asp Asp Pro Ile Glu Glu His Lys Lys

85 90 95

His Ser Ser Gly Ala Ala Phe Leu Ser Val Lys Lys Gln Phe Glu Glu

100 105 110

Leu Thr Leu Ser Glu Phe Leu Lys Leu Asp Arg Glu Arg Ala Lys Asn

115 120 125

Lys Ile Ala Lys Glu Thr Asn Asn Lys Lys Lys Glu Phe Glu Glu Thr

130 135 140

Ala Lys Lys Val Arg Cys Ala Ile Glu Gln Leu Ala Ala Met Asp Arg

145 150 155 160

Gly Arg Lys Arg Arg Ser Met Gln Arg Lys Pro Thr Ile Arg Arg Lys

165 170 175

Asn Leu Arg Lys Leu Arg Arg Lys Cys Ala Val Pro Ser Ser Ser Trp

180 185 190

Leu Pro Trp Thr Glu Ala Ser Gly Trp Ser Cys Leu Val Pro Glu Trp

195 200 205

Leu His

210

<210> 5

<211> 19

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 矩阵池1、2、3、4以及7

<400> 5

Leu Pro Pro Ala Trp Gln Leu Phe Leu Lys Asp His Arg Ile Ser Thr

1 5 10 15

Phe Lys Asn

<210> 6

<211> 19

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 矩阵池1、2、3、4以及11

<400> 6

Leu Lys Leu Asp Arg Glu Arg Ala Lys Asn Lys Ile Ala Lys Glu Thr

1 5 10 15

Asn Asn Lys

<210> 7

<211> 11

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 矩阵池3、4以及7

<400> 7

Glu Trp Leu His His Phe Gln Gly Leu Phe Pro

1 5 10

<210> 8

<211> 232

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成共有存活素同工型1+截短同工型3蛋白编码序列pGX1429全长

<400> 8

Met Asp Trp Thr Trp Ile Leu Phe Leu Val Ala Ala Ala Thr Arg Val

1 5 10 15

His Ser Gly Ala Pro Thr Leu Pro Pro Ala Trp Gln Leu Phe Leu Lys

20 25 30

Asp His Arg Ile Ser Thr Phe Lys Asn Trp Pro Phe Leu Glu Gly Cys

35 40 45

Ala Cys Ala Pro Glu Arg Met Ala Glu Ala Gly Phe Ile His Cys Pro

50 55 60

Ala Glu Asn Glu Pro Asp Leu Ala Gln Cys Phe Phe Cys Phe Lys Glu

65 70 75 80

Leu Glu Gly Trp Glu Pro Asp Asp Asp Pro Ile Glu Glu His Lys Lys

85 90 95

His Ser Ser Gly Ala Ala Phe Leu Ser Val Lys Lys Gln Phe Glu Glu

100 105 110

Leu Thr Leu Ser Glu Phe Leu Lys Leu Asp Arg Glu Arg Ala Lys Asn

115 120 125

Lys Ile Ala Lys Glu Thr Asn Asn Lys Lys Lys Glu Phe Glu Glu Thr

130 135 140

Ala Lys Lys Val Arg Cys Ala Ile Glu Gln Leu Ala Ala Met Asp Arg

145 150 155 160

Gly Arg Lys Arg Arg Ser Met Gln Arg Lys Pro Thr Ile Arg Arg Lys

165 170 175

Asn Leu Arg Lys Leu Arg Arg Lys Cys Ala Val Pro Ser Ser Ser Trp

180 185 190

Leu Pro Trp Thr Glu Ala Ser Gly Trp Ser Cys Leu Val Pro Glu Trp

195 200 205

Leu His His Phe Gln Gly Leu Phe Pro Gly Ala Thr Ser Leu Pro Val

210 215 220

Gly Pro Leu Ala Met Glu Thr Ser

225 230

Claims (29)

1.一种核酸分子，其包含一种或多种选自由以下组成的组的核酸序列：

(a)编码SEQ ID NO:2的氨基酸19-159的核酸序列；

(b)编码SEQ ID NO:4的氨基酸19-210的核酸序列；

(c)编码SEQ ID NO:8的氨基酸19-232的核酸序列；

(d)编码包含SEQ ID NO:2的氨基酸19-159的全长的至少90％的片段的核酸序列；

(e)编码包含SEQ ID NO:4的氨基酸19-210的全长的至少90％的片段的核酸序列；

(f)编码包含SEQ ID NO:8的氨基酸19-232的全长的至少90％的片段的核酸序列；

(g)编码与SEQ ID NO:2的氨基酸19-159至少95％一致的蛋白质的核酸序列；

(h)编码与SEQ ID NO:4的氨基酸19-210至少95％一致的蛋白质的核酸序列；(i)编码与SEQ ID NO:8的氨基酸19-232至少95％一致的蛋白质的核酸序列；

(j)编码包含与SEQ ID NO:2的氨基酸19-159至少95％一致的蛋白质的全长的至少90％的片段的核酸序列；

(k)编码包含与SEQ ID NO:4的氨基酸19-210至少95％一致的蛋白质的全长的至少90％的片段的核酸序列；以及

(l)编码包含与SEQ ID NO:8的氨基酸19-232至少95％一致的蛋白质的全长的至少90％的片段的核酸序列。

2.一种核酸分子，其包含一种或多种选自由以下组成的组的核酸序列：

(a)SEQ ID NO:1的核苷酸55-423；

(b)SEQ ID NO:3的核苷酸55-636；

(c)包含SEQ ID NO:1的核苷酸55-423的全长的至少90％的片段；

(d)包含SEQ ID NO:3的核苷酸55-636的全长的至少90％的片段；

(e)与SEQ ID NO:1的核苷酸55-423至少95％一致的片段；

(f)与SEQ ID NO:3的核苷酸55-636至少95％一致的片段；

(g)包含与SEQ ID NO:1的核苷酸55-423至少95％一致的核酸序列的至少90％的片段；以及

(h)包含与SEQ ID NO:3的核苷酸55-636至少95％一致的核酸序列的至少90％的片段。

3.一种核酸分子，其包含一种或多种选自由以下组成的组的核酸序列：

(a)编码SEQ ID NO:2的核酸序列；

(b)编码SEQ ID NO:4的核酸序列；

(c)编码SEQ ID NO:8的核酸序列；

(d)编码包含SEQ ID NO:2的全长的至少90％的片段的核酸序列；

(e)编码包含SEQ ID NO:4的全长的至少90％的片段的核酸序列；

(f)编码包含SEQ ID NO:8的全长的至少90％的片段的核酸序列；

(g)编码与SEQ ID NO:2至少95％一致的蛋白质的核酸序列；

(h)编码与SEQ ID NO:4至少95％一致的蛋白质的核酸序列；

(i)编码与SEQ ID NO:8至少95％一致的蛋白质的核酸序列；

(j)编码包含与SEQ ID NO:2至少95％一致的蛋白质的全长的至少90％的片段的核酸序列；

(k)编码包含与SEQ ID NO:4至少95％一致的蛋白质的全长的至少90％的片段的核酸序列；以及

(l)编码包含与SEQ ID NO:8至少95％一致的蛋白质的全长的至少90％的片段的核酸序列。

4.一种核酸分子，其包含一种或多种选自由以下组成的组的核酸序列：

(a)SEQ ID NO:1；

(b)SEQ ID NO:3；

(c)包含SEQ ID NO:1的全长的至少90％的片段；

(d)包含SEQ ID NO:3的全长的至少90％的片段；

(e)与SEQ ID NO:1至少95％一致的片段；

(f)与SEQ ID NO:3至少95％一致的片段；

(g)包含与SEQ ID NO:1至少95％一致的核酸序列的全长的至少90％的片段；以及

(h)包含与SEQ ID NO:3至少95％一致的核酸序列的全长的至少90％的片段。

5.一种核酸分子，其包含SEQ ID NO:1中所列的核酸序列。

6.一种核酸分子，其包含SEQ ID NO:3中所列的核酸序列。

7.根据权利要求1至6中任一项所述的核酸分子，用作药剂。

8.根据权利要求1至7中任一项所述的核酸分子，用作治疗癌症的药剂。

9.根据权利要求1至6中任一项所述的核酸分子，用于制备药剂。

10.根据权利要求1至6和9中任一项所述的核酸分子，用于制备用于治疗癌症的药剂。

11.一种载体，其包含根据权利要求1至10中任一项所述的核酸分子。

12.根据权利要求11所述的载体，其包括质粒或病毒载体。

13.一种组合物，其包含一种或多种权利要求1至10中任一项所述的核酸分子。

14.根据权利要求13所述的组合物，其包含医药学上可接受的载剂。

15.一种组合物，其包含一种或多种根据权利要求11或12所述的载体。

16.一种蛋白质，其包含选自由以下组成的组的氨基酸序列：

(a)SEQ ID NO:2的氨基酸19-159；

(b)SEQ ID NO:4的氨基酸19-210；

(c)SEQ ID NO:8的氨基酸19-232；

(d)包含SEQ ID NO:2的氨基酸19-159的全长的至少90％的片段；

(e)包含SEQ ID NO:4的氨基酸19-210的全长的至少90％的片段；

(f)包含SEQ ID NO:8的氨基酸19-232的全长的至少90％的片段；

(g)与SEQ ID NO:2的氨基酸19-159至少95％一致的氨基酸序列；

(h)与SEQ ID NO:4的氨基酸19-210至少95％一致的氨基酸序列；

(i)与SEQ ID NO:8的氨基酸19-232至少95％一致的氨基酸序列；

(j)包含与SEQ ID NO:2的氨基酸19-159至少95％一致的氨基酸序列的全长的至少90％的片段；

(k)包含与SEQ ID NO:4的氨基酸19-210至少95％一致的氨基酸序列的全长的至少90％的片段；以及

(l)包含与SEQ ID NO:8的氨基酸19-232至少95％一致的氨基酸序列的全长的至少90％的片段。

17.一种蛋白质，其包含选自由以下组成的组的氨基酸序列：

(a)SEQ ID NO:2；

(b)SEQ ID NO:4；

(c)SEQ ID NO:8；

(d)包含SEQ ID NO:2的全长的至少90％的片段；

(e)包含SEQ ID NO:4的全长的至少90％的片段；

(f)包含SEQ ID NO:8的全长的至少90％的片段；

(g)与SEQ ID NO:2至少95％一致的氨基酸序列；

(h)与SEQ ID NO:4至少95％一致的氨基酸序列；

(i)与SEQ ID NO:8至少95％一致的氨基酸序列；

(j)包含与SEQ ID NO:2至少95％一致的氨基酸序列的全长的至少90％的片段；

(k)包含与SEQ ID NO:4至少95％一致的氨基酸序列的全长的至少90％的片段；以及

(l)包含与SEQ ID NO:8至少95％一致的氨基酸序列的全长的至少90％的片段。

18.一种蛋白质，其包含SEQ ID NO:2中所列的氨基酸序列。

19.一种蛋白质，其包含SEQ ID NO:4中所列的氨基酸序列。

20.一种蛋白质，其包含SEQ ID NO:8中所列的氨基酸序列。

21.一种疫苗，其包含权利要求1至10中任一项所述的核酸分子。

22.一种疫苗，其包含权利要求11或12所述的载体。

23.根据权利要求18至20中任一项所述的疫苗，其进一步包含医药学上可接受的赋形剂。

24.根据权利要求21至23中任一项所述的疫苗，其进一步包含佐剂。

25.根据权利要求24所述的疫苗，其中所述佐剂是IL-12、IL-15、IL-28或RANTES。

26.一种治疗具有表达存活素的癌细胞的个体的方法，其包含施用治疗有效量的权利要求20至25中任一项所述的疫苗。

27.根据权利要求26所述的方法，其中施用包括电穿孔步骤。

28.根据权利要求26或27所述的方法，其中施用在所述个体上的一个或多个部位处进行。

29.一种针对表达存活素的癌细胞对个体进行疫苗接种的方法，其包含施用有效诱导体液或细胞免疫反应的量的权利要求20至25中任一项所述的疫苗。

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