BR112020011820A2

BR112020011820A2 - moléculas de ácido nucleico e seus usos, vetor, composições, proteínas e vacinas

Info

Publication number: BR112020011820A2
Application number: BR112020011820-6A
Authority: BR
Inventors: Jian Yan; Anna SLAGER; Bradley GARMAN; Neil COOCH
Original assignee: Inovio Pharmaceuticals, Inc.
Priority date: 2017-12-13
Filing date: 2018-12-13
Publication date: 2020-11-17
Also published as: US20190175707A1; CN111479583A; RU2021117812A; WO2019118766A3; JP2021506265A; JP2023155245A; AU2018383664A1; KR20240038139A; JP7385569B2; RU2751253C1; MX2020006285A; CA3083534A1; EP3723793A4; RU2021117812A3; KR102648079B1; KR20200096957A; WO2019118766A2; EP3723793A2

Abstract

A presente invenção refere-se a moléculas de ácido nucleico compreendendo uma ou mais sequências de ácido nucleico que codificam um antígeno de Survivina de consenso sintético. São divulgados vetores, composições e vacinas compreendendo uma ou mais sequências de ácidos nucleicos que codificam um antígeno de Survivina de consenso sintético. São divulgados métodos para tratar um sujeito com um tumor que expressa Survivina e métodos para prevenir um tumor que expressa Survivina. São divulgados antígenos de Survivina de consenso sintético.

Description

Relatório Descritivo da Patente de Invenção para “MOLÉ- CULAS DE ÁCIDO NUCLEICO E SEUS USOS, VETOR, COMPOSI- ÇÕES, PROTEÍNAS E VACINAS”.

REFERÊNCIA CRUZADA A PEDIDOS RELACIONADOS

[0001] Este pedido reivindica prioridade e o benefício do Pedido de Patente Provisório dos Estados Unidos 62/598.267, depositado em 13 de dezembro de 2017, cuja divulgação é incorporada aqui por referência na sua totalidade.

LISTAGEM DE SEQUÊNCIAS

[0002] Este pedido contém uma Listagem de sequências, que foi submetida eletronicamente no formato ASCII e está incorporada por meio deste a título de referência em sua totalidade. A cópia ASCII, cri- ada em 13 de dezembro de 2018, é nomeada 104409_000448_se- quence_listing.txt e tem 8.797 bytes de tamanho.

CAMPO TÉCNICO

[0003] A presente invenção refere-se a antígenos de Survivina e moléculas de ácido nucleico que codificam os mesmos. A presente in- venção também se refere a vacinas, incluindo tais antígenos de Survi- vina e/ou moléculas de ácido nucleico. A presente invenção refere-se ainda a métodos de uso de vacinas para indução de respostas imunes e prevenção e/ou tratamento de sujeitos com células cancerígenas e/ou tumores que expressam Survivina.

FUNDAMENTO

[0004] O câncer está entre as principais causas de morte no mundo. Nos Estados Unidos, o câncer é a segunda causa mais comum de morte, sendo responsável por quase 1 em cada 4 mortes. O câncer surge de uma única célula que se transformou de uma célula normal em uma célula cancerígena. Tal transformação é frequentemente um pro- cesso de múltiplos estágios, progredindo de uma lesão pré-cancerígena para tumores malignos. Múltiplos fatores contribuem para essa progres- são, incluindo envelhecimento, contribuições genéticas e exposição a agentes externos como carcinógenos físicos (por exemplo, radiação ul- travioleta e ionizante), carcinógenos químicos (por exemplo, amianto, componentes do fumo do tabaco, etc.) e carcinógenos biológicos (por exemplo, certos vírus, bactérias e parasitas).

[0005] A prevenção, o diagnóstico e o tratamento do câncer podem assumir muitas formas diferentes. A prevenção pode incluir a triagem de fatores predisponentes (por exemplo, variantes genéticas específi- cas), alteração do comportamento (por exemplo, tabagismo, dieta e quantidade de atividade física) e vacinação contra vírus (por exemplo, vírus do papiloma vírus da hepatite B humana). O tratamento pode in- cluir quimioterapia, radioterapia e remoção cirúrgica de um tumor ou te- cido cancerígeno. Apesar da disponibilidade de numerosos métodos de prevenção e tratamento, tais métodos frequentemente encontram um sucesso limitado na prevenção e/ou tratamento eficaz do câncer.

[0006] A survivina, também conhecida como inibidor baculoviral da apoptose contendo repetição 5 (BIRC5), é um inibidor da apoptose que bloqueia a função da caspase e, assim, previne a morte celular progra- mada. Além de seu papel na apoptose, a Survivina tem inequivoca- mente um papel essencial e evolutivamente conservado na mitose. (Li, F. et al. Control of apoptosis and mitotic spindle checkpoint by Survivin. Nature 396, 580-584, doi:10.1038/25141 (1998).) A superexpressão de Survivina está associada à proliferação de células tumorais, progressão, angiogênese, resistência terapêutica e mau prognóstico. Nas células e tecidos saudáveis, a expressão de Survivina está ausente ou presente em níveis baixos. No entanto, a Survivina é um membro da família inibi- dora da proteína de apoptose (IAP), e os genes da IAP são altamente expressos em diferentes células cancerígenas e biópsias de tumores primários. Entre as IAPs, a Survivina exibe a superexpressão mais dra- mática em tumores e tecidos fetais. Em vários estudos de carcinoma ovariano, o número de amostras de pacientes com teste positivo para a expressão de Survivina variou de 74 a 92%. (Veja Cohen, C., Lohmann, C. M., Cotsonis, G., Lawson, D. & Santoianni, R. Survivin expression in ovarian carcinoma: correlation with apoptotic markers and prognosis. Modern pathology : an official journal of the United States and Canadian Academy of Pathology, Inc 16, 574-583, doi:10.1097/01.MP.0000073868.31297.B0 (2003); Felisiak-Golabek, A. et al. A expressão de Survivina nuclear é um fator prognóstico positivo em pacientes com câncer de ovário tratados com taxano-platina. Jour- nal of ovarian research 4, 20, doi:10.1186/1757-2215-4-20 (2011).) A contribuição da Survivina para a oncogênese, combinada com seu pa- drão restrito de expressão e superexpressão em vários tumores, a torna um alvo atraente para a imunoterapia contra o câncer.

[0007] Survivina é o menor membro da família IAP. É uma proteína de 16,3 kD composta por 142 aminoácidos e é caracterizada pela pre- sença de uma única repetição de BIR. Também não possui um domínio de dedo RING do terminal carboxil em sua estrutura proteica. (Chen, X., Duan, N., Zhang, C. & Zhang, W. Survivin and Tumorigenesis: Molecular Mechanisms and Therapeutic Strategies. Journal of Cancer 7, 314-323, doi:10.7150/jca.13332 (2016).) Várias isoformas de Survivina foram identificadas, e a isoforma Survivina 1 é a transcrição dominante. A Sur- vivina é expressa durante o desenvolvimento fetal, mas não é expressa em tecidos totalmente diferenciados. No entanto, é altamente expressa em muitas células cancerígenas. Assim, a Survivina é um antígeno alvo potencial para o tratamento de cânceres.

[0008] As vacinas para o tratamento e prevenção do câncer, e o câncer epitelial de ovário (EOC), em particular, são interessantes. No entanto, as vacinas existentes direcionadas a antígenos de células tu- morais são limitadas por expressão de antígeno deficiente in vivo. Por conseguinte, permanece uma necessidade na técnica de vacinas segu- ras e eficazes e métodos de seu uso para prevenir e/ou tratar o câncer e reduzir a mortalidade em sujeitos que sofrem de câncer.

SUMÁRIO DA INVENÇÃO

[0009] São fornecidos aqui:

[0010] Moléculas de ácido nucleico compreendendo uma ou mais sequências de ácido nucleico selecionadas do grupo que consiste em: (a) uma sequência de ácido nucleico que codifica os aminoácidos 19- 159 da SEQ ID NO:2; (b) uma sequência de ácido nucleico que codifica os aminoácidos 19-210 da SEQ ID NO:4; (c) uma sequência de ácido nucleico que codifica os aminoácidos 19-232 da SEQ ID NO:8; (d) uma sequência de ácido nucleico que codifica um fragmento compreendendo pelo menos 90% de um comprimento inteiro dos aminoácidos 19-159 da SEQ ID NO:2; (e) uma sequência de ácido nucleico que codifica um fragmento compreendendo pelo menos 90% de um comprimento inteiro dos aminoácidos 19-210 da SEQ ID NO:4; (f) uma sequência de ácido nucleico que codifica um fragmento compreendendo pelo menos 90% de um comprimento inteiro dos aminoácidos 19-232 da SEQ ID NO:8; (g) uma sequência de ácido nucleico que codifica uma proteína que é pelo menos 95% idêntica aos aminoácidos 19-159 da SEQ ID NO:2; (h) uma sequência de ácido nucleico que codifica uma proteína que é pelo menos 95% idêntica aos aminoácidos 19-210 da SEQ ID NO:4; (i) uma sequência de ácido nucleico que codifica uma proteína que é pelo me- nos 95% idêntica aos aminoácidos 19-232 da SEQ ID NO:8; (j) uma se- quência de ácido nucleico que codifica um fragmento compreendendo pelo menos 90% de um comprimento inteiro de uma proteína que é pelo menos 95% idêntica aos aminoácidos 19-159 da SEQ ID NO:2; (k) uma sequência de ácido nucleico que codifica um fragmento compreendendo pelo menos 90% de um comprimento inteiro de uma proteína que é pelo menos 95% idêntica aos aminoácidos 19-210 da SEQ ID NO:4; e (l) uma sequência de ácido nucleico que codifica um fragmento compreendendo pelo menos 90% de um comprimento inteiro de uma proteína que é pelo menos 95% idêntica aos aminoácidos 19-232 da SEQ ID NO:8.

[0011] Moléculas de ácido nucleico compreendendo uma ou mais sequências de ácidos nucleicos selecionadas do grupo que consiste em: (a) nucleotídeos 55-423 da SEQ ID NO:1; (b) nucleotídeos 55-636 da SEQ ID NO:3; (c) um fragmento compreendendo pelo menos 90% de um comprimento inteiro dos nucleotídeos 55-423 da SEQ ID NO:1; (d) um fragmento compreendendo pelo menos 90% de um comprimento in- teiro dos nucleotídeos 55-636 da SEQ ID NO:3; (e) um fragmento que seja pelo menos 95% idêntico aos nucleotídeos 55-423 da SEQ ID NO:1; (f) um fragmento que é pelo menos 95% idêntico aos nucleotídeos 55-636 da SEQ ID NO:3; (g) um fragmento compreendendo pelo menos 90% de uma sequência de ácido nucleico que é pelo menos 95% idên- tica aos nucleotídeos 55-423 da SEQ ID NO:1; e (h) um fragmento com- preendendo pelo menos 90% de uma sequência de ácido nucleico que é pelo menos 95% idêntica aos nucleotídeos 55-636 da SEQ ID NO:3.

[0012] Moléculas de ácido nucleico compreendendo uma ou mais sequências de ácido nucleico selecionadas do grupo que consiste em: (a) uma sequência de ácido nucleico que codifica a SEQ ID NO:2; (b) uma sequência de ácido nucleico que codifica a SEQ ID NO:4; (c) uma sequência de ácido nucleico que codifica a SEQ ID NO:8; (d) uma se- quência de ácido nucleico que codifica um fragmento compreendendo pelo menos 90% de um comprimento inteiro da SEQ ID NO:2; (e) uma sequência de ácido nucleico que codifica um fragmento compreendendo pelo menos 90% de um comprimento inteiro da SEQ ID NO:4; (f) uma sequência de ácido nucleico que codifica um fragmento compreendendo pelo menos 90% de um comprimento inteiro da SEQ ID NO:8; (g) uma sequência de ácido nucleico que codifica uma proteína que é pelo me- nos 95% idêntica à SEQ ID NO:2; (h) uma sequência de ácido nucleico que codifica uma proteína que é pelo menos 95% idêntica à SEQ ID NO:4; (i) uma sequência de ácido nucleico que codifica uma proteína que é pelo menos 95% idêntica à SEQ ID NO:8; (j) uma sequência de ácido nucleico que codifica um fragmento compreendendo pelo menos 90% de um comprimento inteiro de uma proteína que é pelo menos 95% idêntica à SEQ ID NO:2; (k) uma sequência de ácido nucleico que codi- fica um fragmento compreendendo pelo menos 90% de um compri- mento inteiro de uma proteína que é pelo menos 95% idêntica à SEQ ID NO:4; e (l) uma sequência de ácido nucleico que codifica um frag- mento compreendendo pelo menos 90% de um comprimento inteiro de uma proteína que é pelo menos 95% idêntica à SEQ ID NO:8.

[0013] Moléculas de ácido nucleico compreendendo uma ou mais sequências de ácidos nucleicos selecionadas do grupo que consiste em: (a) SEQ ID NO:1; (b) SEQ ID NO:3; (c) um fragmento compreendendo pelo menos 90% de um comprimento inteiro da SEQ ID NO:1; (d) um fragmento compreendendo pelo menos 90% de um comprimento inteiro da SEQ ID NO:3; (e) um fragmento que é pelo menos 95% idêntico à SEQ ID NO:1; (f) um fragmento que é pelo menos 95% idêntico à SEQ ID NO:3; (g) um fragmento compreendendo pelo menos 90% de um comprimento inteiro de uma sequência de ácido nucleico que é pelo me- nos 95% idêntica à SEQ ID NO:1; e (h) um fragmento compreendendo pelo menos 90% de um comprimento inteiro de uma sequência de ácido nucleico que é pelo menos 95% idêntica à SEQ ID NO:3.

[0014] Moléculas de ácido compreendendo a sequência de ácido nucleico estabelecida em SEQ ID NO:1.

[0015] Moléculas de ácido compreendendo a sequência de ácido nucleico estabelecida em SEQ ID NO:3.

[0016] Moléculas de ácido nucleico como aqui descritas para uso como um medicamento.

[0017] Moléculas de ácido nucleico como aqui descritas para uso como um medicamento no tratamento de câncer.

[0018] Moléculas de ácido nucleico como aqui descritas para uso na preparação de um medicamento.

[0019] Moléculas de ácido nucleico como aqui descritas para uso na preparação de um medicamento para o tratamento de câncer.

[0020] Vetores compreendendo a molécula de ácido nucleico como aqui descrita.

[0021] Vetores compreendendo um plasmídeo ou um vetor viral.

[0022] Composições compreendendo uma ou mais moléculas de ácido nucleico como aqui descrito.

[0023] Composições como aqui descritas compreendendo um transportador farmaceuticamente aceitável.

[0024] Composições como aqui descritas compreendendo um ou mais vetores como aqui descritos.

[0025] Proteínas compreendendo a sequência de aminoácidos se- lecionada do grupo que consiste em: (a) aminoácidos 19-159 da SEQ ID NO:2; (b) aminoácidos 19-210 da SEQ ID NO:4; (c) aminoácidos 19- 232 da SEQ ID NO:8; (d) um fragmento compreendendo pelo menos 90% de um comprimento inteiro dos aminoácidos 19-159 da SEQ ID NO:2; (e) um fragmento compreendendo pelo menos 90% de um com- primento inteiro dos aminoácidos 19-210 da SEQ ID NO:4; (f) um frag- mento compreendendo pelo menos 90% de um comprimento inteiro dos aminoácidos 19-232 da SEQ ID NO:8; (g) uma sequência de aminoáci- dos que é pelo menos 95% idêntica aos aminoácidos 19-159 da SEQ ID NO:2; (h) uma sequência de aminoácidos que é pelo menos 95% idêntica aos aminoácidos 19-210 da SEQ ID NO:4; (i) uma sequência de aminoácidos que é pelo menos 95% idêntica aos aminoácidos 19- 232 da SEQ ID NO:8; (j) um fragmento compreendendo pelo menos

90% de um comprimento inteiro de uma sequência de aminoácidos que é pelo menos 95% idêntica aos aminoácidos 19-159 da SEQ ID NO:2; (k) um fragmento compreendendo pelo menos 90% de um comprimento inteiro de uma sequência de aminoácidos que é pelo menos 95% idên- tica aos aminoácidos 19-210 da SEQ ID NO:4; e (l) um fragmento com- preendendo pelo menos 90% de um comprimento inteiro de uma se- quência de aminoácidos que é pelo menos 95% idêntica aos aminoáci- dos 19-232 da SEQ ID NO:8.

[0026] Proteínas compreendendo a sequência de aminoácidos se- lecionada do grupo que consiste em: (a) SEQ ID NO:2; (b) SEQ ID NO:4; (c) SEQ ID NO:8; (d) um fragmento compreendendo pelo menos 90% de um comprimento inteiro da SEQ ID NO:2; (e) um fragmento compre- endendo pelo menos 90% de um comprimento inteiro da SEQ ID NO:4; (f) um fragmento compreendendo pelo menos 90% de um comprimento inteiro da SEQ ID NO:8; (g) uma sequência de aminoácidos que é pelo menos 95% idêntica à SEQ ID NO:2; (h) uma sequência de aminoácidos que é pelo menos 95% idêntica à SEQ ID NO:4; (i) uma sequência de aminoácidos que é pelo menos 95% idêntica à SEQ ID NO:8; (j) um fragmento compreendendo pelo menos 90% de um comprimento inteiro de uma sequência de aminoácidos que é pelo menos 95% idêntica à SEQ ID NO:2; (k) um fragmento compreendendo pelo menos 90% de um comprimento inteiro de uma sequência de aminoácidos que é pelo menos 95% idêntica à SEQ ID NO:4; e (l) um fragmento compreendendo pelo menos 90% de um comprimento inteiro de uma sequência de ami- noácidos que é pelo menos 95% idêntica à SEQ ID NO:8.

[0027] Proteínas compreendendo a sequência de aminoácidos es- tabelecida na SEQ ID NO:2.

[0028] Proteínas compreendendo a sequência de aminoácidos es- tabelecida na SEQ ID NO:4.

[0029] Proteínas compreendendo a sequência de aminoácidos es- tabelecida na SEQ ID NO:8.

[0030] Vacinas compreendendo as moléculas de ácido nucleico como aqui descritas.

[0031] Vacinas compreendendo o vetor como aqui descrito.

[0032] Vacinas como aqui descrito, compreendendo ainda um exci- piente farmaceuticamente aceitável.

[0033] Vacinas como aqui descrito, compreendendo ainda um adju- vante.

[0034] Vacinas como aqui descrito, em que o adjuvante é IL-12, IL- 15, IL-28 ou RANTES.

[0035] Métodos de tratamento de um sujeito com uma célula can- cerígena que expressa a Survivina compreendendo administrar uma quantidade terapeuticamente eficaz de uma vacina, conforme descrito aqui.

[0036] Métodos como aqui descrito, em que a administração inclui uma etapa de eletroporação.

[0037] Métodos como aqui descrito, em que a administração ocorre em um ou mais sítios no sujeito.

[0038] Métodos de vacinação de um sujeito contra uma célula can- cerígena que expressa Survivina, compreendendo administrar uma quantidade de uma vacina, conforme descrito aqui, eficaz para induzir uma resposta imune humoral ou celular.

BREVE DESCRIÇÃO DOS DESENHOS

[0039] O sumário, bem como a descrição detalhada a seguir, é mais bem entendido quando lido em conjunto com os desenhos anexos. Com o objetivo de ilustrar a invenção, são mostrados nos desenhos modali- dades exemplificativos da invenção; no entanto, a invenção não está limitada aos métodos, composições e dispositivos específicos divulga- dos. Nos desenhos:

[0040] A Fig. 1 mostra uma representação esquemática da iso- forma 1 do antígeno de Survivina de consenso sintético. Asteriscos de- notam mutações essenciais para abolir a atividade antiapoptótica.

[0041] A Fig. 2 mostra a estrutura geral do monômero A (à es- querda) e monômero B (à direita) da isoforma 1 do antígeno de Survi- vina de consenso sintético. As alterações relativas à Survivina nativa são designadas por esferas.

[0042] A Fig. 3 mostra uma representação esquemática da iso- forma 1T3 do antígeno de Survivina de consenso sintético. Asteriscos denotam mutações essenciais para abolir a atividade antiapoptótica. A região cinza escura à direita (3') representa a região truncada da Iso- forma 3 (T3) da Survivina.

[0043] A Fig. 4 mostra a construção de pGX1428, incluindo a iso- forma 1 do antígeno de Survivina de consenso sintético.

[0044] A Fig. 5 mostra a construção de pGX1429, incluindo a iso- forma 1T3 do antígeno de Survivina de consenso sintético.

[0045] A Fig. 6 mostra a expressão de proteínas do antígeno de Survivina 1 de consenso sintético e do antígeno de Survivina 1T3 de consenso sintético em células de rabdomiossarcoma humano (RD) transfectadas com pGX1428 e pGX1429, respectivamente, por imuno- transferência. As bandas proteicas dos pesos moleculares esperados foram detectadas para pGX1428 (17,5 kD) e pGX1429 (25,3 kD). A β- actina foi usada como controle de carregamento.

[0046] As Figs. 7A a 7H mostram imunogenicidade do antígeno de Survivina 1 de consenso sintético e antígeno e Survivina 1T3 de con- senso sintético. CB6F1 fêmeas foram imunizadas 3 vezes, com 3 sema- nas de intervalo com as quantidades de dose indicadas de Survivina 1 (pGX1428) (Figs. 7A-7D), Survivina 1T3 pGX1429 (EH) (n = 8/grupo) ou pGX0001 (vetor vazio) (n = 4). Fig. 7A: Respostas de IFNγ específi- cas de Survivina 1 pelo ELISpot nas quantidades de doses indicadas de pGX1428. Fig. 7B: Respostas de células T CD4+ específicas de Survi- vina 1. Fig. 7C. Respostas de células T CD8+ específicas de Survivina

1. Fig. 7D: Respostas de IFNγ específicas de Survivina 1T3 por ELISpot nas quantidades de doses indicadas de pGX1429. Fig. 7E: Respostas de células T CD4+ específicas de Survivina 1T3. Fig. 7F: Respostas de células T CD8+ específicas de Survivina 1T3. Fig. 7G: Perfil de citocinas das respostas de células T CD4+ e de células T CD8+ específicas de Survivina 1. Fig. 7H: Perfil de citocinas das respostas de células T CD4+ e de células T CD8+ específicas de Survivina 1T3.

[0047] A Fig. 8 mostra a estratégia de bloqueio da citometria de fluxo.

[0048] A Fig. 9 mostra a frequência relativa de células T CD4+ e CD8+. As respostas imunes celulares induzidas por pGX1428 e pGX1429 estavam predominantemente no compartimento de células T CD4+ em relação ao compartimento de células T CD8+.

[0049] As Figs. 10A a 10F mostram potencial citolítico de células T específicas de Survivina. Potencial citolítico de células T específicas de antígeno induzidas por Survivina 1 e Survivina 1T3. Fig. 10A: Frequên- cia de células T CD4+CD107a+ específicas de Survivina 1. Fig. 10B: Frequência de células T CD4+CD107a+ específicas de Survivina 1T3. Fig. 10C: Perfil de citocina de células T CD4+CD107a+. Fig. 10D: Fre- quência de células T CD8+CD107a+ específicas de Survivina 1. Fig. 10E: Frequência de células T CD8+CD107a+ específicas de Survivina 1T3. Fig. 10F: Perfil de citocina de células T CD4+CD107a+.

[0050] As Figs. 11A a 11D mostram o mapeamento de epítopos das respostas de IFN-gama de Survivina. Amplitude de respostas de IFNγ induzidas por Survivina 1 e Survivina 1T3. Fig. 11A: Conjuntos de peptídeos de Survivina 1 após tratamento com 50 µg de pGX1428, pGX1429 ou pGX0001. Fig. 11B: Conjuntos de peptídeos de Survivina T3 após tratamento com 50 µg de pGX1429 ou pGX0001. Comparação de sequências de pGX1428 e pGX1429 com a posição dos conjuntos de matrizes indicada em caixas de linhas tracejadas. Fig. 11C: Compa- ração de sequência de pGX1428 e pGX1429. Os aminoácidos no texto em vermelho indicam epítopos identificados pelo mapeamento da ma- triz. O texto sublinhado representa porções da sequência que são adici- onadas ao antígeno de Survivina de consenso sintético: o terminal N indica o sítio de clivagem de furina IgELS e RGRKRRS. Fig. 11D: Pro- jeto da matriz de Survivina 1 e Survivina T3. Os peptídeos que provoca- ram uma resposta são indicados por caixas de linhas tracejadas.

[0051] A Fig. 12 mostra IFNγ de SFU/106 PBMCs específicas de Survivina de primatas não humanos individuais imunizados usando uma modalidade da divulgação compreendendo Survivina 1T3 de consenso sintético.

[0052] A Fig. 13 mostra IFNγ de SFU/106 PBMCs específicas de Survivina de primatas não humanos individuais imunizados usando uma modalidade da divulgação compreendendo Survivina 1T3 de consenso sintético com uma dose baixa de IL-12 (0,04 mg).

[0053] A Fig. 14 mostra IFNγ de SFU/106 PBMCs específicas de Survivina de primatas não humanos individuais imunizados usando uma modalidade da divulgação compreendendo Survivina 1T3 de consenso sintético com uma alta dose de IL-12 (0,20 mg).

[0054] As Figs. 15A a 15C mostram resultados individuais em ani- mais do estudo NHP e também mostram uma comparação entre a imu- nização com um construto de Survivina 1 de consenso sintético e um construto de Survivina 1T3 de consenso sintético. A Fig. 15A mostra os resultados dos animais do Grupo 1; A Fig. 15B mostra os resultados dos animais do Grupo 2; e a Fig. 15C mostra os resultados dos animais do Grupo 3.

DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO

[0055] A presente invenção refere-se a vacinas compreendendo um antígeno de Survivina de consenso sintético. A Survivina é expressa em muitos tumores. Consequentemente, a vacina fornece tratamento para um câncer ou tumores baseados em câncer que expressam Survivina.

[0056] O antígeno de Survivina de consenso sintético pode ser um antígeno de Survivina de consenso derivado das sequências de Survi- vina de diferentes espécies ou de diferentes isoformas dentro de uma espécie e, portanto, o antígeno de Survivina de consenso sintético não é nativo. O antígeno de Survivina de consenso pode ser modificado ainda mais introduzindo uma ou mais mutações na sequência de con- senso para gerar uma sequência de consenso sintético. As mutações podem interromper ou modificar domínios funcionais específicos da se- quência de Survivina nativa, interrompendo ou intensificando assim a estrutura ou função dos domínios funcionais. Em algumas modalidades, sequências adicionais são adicionadas à sequência de antígeno de Sur- vivina de consenso sintético para introduzir novas estruturas ou funções. Por exemplo, a sequência de antígeno de Survivina de consenso sinté- tico pode ter um sítio de clivagem de furina. A sequência de antígeno de Survivina de consenso sintético pode incluir um sinal de localização adi- cional para melhorar o transporte extracelular do produto proteico final. O sinal de localização adicional pode ser um IgELS ou outra sequência de transporte celular.

[0057] O antígeno de Survivina de consenso sintético pode induzir respostas de anticorpos de células T específicas de antígeno e/ou de altos níveis, induzindo ou provocando assim uma resposta imune que é direcionada ou reativa contra o câncer ou tumor que expressa o antí- geno. Em algumas modalidades, a resposta imune induzida ou provo- cada pode ser uma resposta imune celular, humoral ou tanto celular quanto humoral. Em algumas modalidades, a resposta imune celular in- duzida ou provocada pode incluir indução ou secreção de interferon gama (IFN-γ) e/ou fator de necrose tumoral alfa (TNF-α) e/ou interleu- cina 2 (IL-2). Em outras modalidades, a resposta imune induzida ou pro- vocada pode reduzir ou inibir um ou mais fatores de imunossupressão que promovem o crescimento do tumor ou câncer que expressa o antí- geno, por exemplo, mas não limitados a fatores que suprarregulam a apresentação de MHC, fatores que suprarregulam as células T regula- doras específicas de antígeno (Tregs), PD-L1, FasL,citocinas, como IL- 10 e TFG-β, macrófagos associados a tumores, fibroblastos associados a tumores, fatores solúveis produzidos por células imunossupressoras, CTLA-4, PD-1, MDSCs, MCP-1 e uma molécula de ponto de verificação imune.

[0058] A vacina da invenção pode proporcionar qualquer combina- ção de antígenos de câncer particulares para a prevenção ou tratamento particular do câncer de um sujeito que necessite de tratamento.

[0059] Uma maneira de projetar o ácido nucleico e sua sequência de aminoácidos codificada do antígeno de câncer recombinante é atra- vés da introdução de mutações que alteram aminoácidos particulares na sequência geral de aminoácidos do antígeno de câncer nativo. A in- trodução de mutações não altera tanto o antígeno do câncer que ele não possa ser universalmente aplicado em um mamífero e, de preferência, em humanos ou cães, mas altera o suficiente para que a sequência de aminoácidos resultante quebre a tolerância ou seja considerada um an- tígeno estranho para gerar uma resposta imune. Outra maneira pode ser criar um antígeno de câncer recombinante de consenso que tenha pelo menos 85% e até 99% de identidade de sequência de aminoácidos em comparação ao seu antígeno de câncer nativo correspondente; pre- ferencialmente pelo menos 90% e até 98% de identidade de sequência; mais preferencialmente pelo menos 93% e até 98% de identidade de sequência; ou ainda mais preferencialmente pelo menos 95% e até 98% de identidade de sequência. Em alguns casos, o antígeno de câncer recombinante tem identidade de sequência de aminoácidos de 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% em comparação com seu antígeno de câncer nativo correspondente. O antígeno de câncer nativo é o antígeno nor- malmente associado ao tumor específico de câncer ou câncer. Depen- dendo do antígeno de câncer, a sequência de consenso do antígeno de câncer pode ser através de espécies de mamíferos ou dentro de subti- pos de uma espécie ou através de cepas virais ou sorotipos. Alguns antígenos de câncer não variam muito da sequência de aminoácidos do tipo selvagem do antígeno de câncer. Alguns antígenos de câncer têm sequências de ácidos nucleicos/aminoácidos que são tão divergentes entre as espécies, que uma sequência de consenso não pode ser ge- rada. Nesses casos, é gerado um antígeno recombinante do câncer que rompe a tolerância e gera uma resposta imune que possui pelo menos 85% e até 99% de identidade de sequência de aminoácidos em compa- ração com seu antígeno de câncer nativo correspondente; preferencial- mente pelo menos 90% e até 98% de identidade de sequência; mais preferencialmente pelo menos 93% e até 98% de identidade de sequên- cia; ou ainda mais preferencialmente pelo menos 95% e até 98% de identidade de sequência. Em alguns casos, o antígeno de câncer re- combinante tem identidade de sequência de aminoácidos de 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% em comparação com seu antígeno de câncer nativo correspondente. As abordagens acima mencionadas podem ser combi- nadas de modo a que o antígeno de câncer recombinante final tenha uma porcentagem de similaridade com a sequência de aminoácidos de antígeno de câncer nativo, como discutido acima.

[0060] A vacina pode ser combinada ainda mais com anticorpos para inibidores do ponto de verificação, como PD-1 e PDL-1, para au- mentar a estimulação das respostas imunes celular e humoral. O uso de anticorpos anti-PD-1 ou anti-PDL-1 impede que PD-1 ou PDL-1 su- primam as respostas das células T e/ou das células B. Em geral, ao projetar os antígenos do câncer a serem reconhecidos pelo sistema imu- nológico, ajuda a superar outras formas de supressão imunológica pelas células tumorais, e essas vacinas podem ser usadas em combinação com terapias de supressão ou inibição (como terapias de anticorpo anti- PD-1 e anti-PDL-1) para aumentar ainda mais as respostas das células T e/ou das células B.

[0061] A vacina pode aumentar a sobrevida livre de tumor em 30%, 31%, 32%, 33%, 34%, 35%, 36%, 37%, 38%, 39%, 40%, 41%, 42%, 43%, 44% e 45%. A vacina pode reduzir a massa tumoral em 30%, 31%, 32%, 33%, 34%, 35%, 36%, 37%, 38%, 39%, 40%, 41%, 42%, 43%, 44 %, 45%, 46%, 47%, 48%, 49%, 50%, 51%, 52%, 53%, 54%, 55%, 56%, 57%, 58%, 59% e 60% após a imunização. A vacina pode prevenir e bloquear o aumento da proteína quimioatraente de monócitos 1 (MCP- 1), uma citocina secretada por células supressoras mieloides. A vacina pode aumentar a sobrevida do tumor em 30%, 31%, 32%, 33%, 34%, 35%, 36%, 37%, 38%, 39%, 40%, 41%, 42%, 43%, 44 %, 45%, 46%, 47%, 48%, 49%, 50%, 51%, 52%, 53%, 54%, 55%, 56%, 57%, 58%, 59% e 60% .

[0062] A vacina pode aumentar uma resposta imune celular num sujeito administrado com a vacina em cerca de 50 vezes a cerca de 6000 vezes, cerca de 50 vezes a cerca de 5500 vezes, cerca de 50 vezes a cerca de 5000 vezes, cerca de 50 vezes cerca de 4500 vezes, cerca de 100 vezes a cerca de 6000 vezes, cerca de 150 vezes a cerca de 6000 vezes, cerca de 200 vezes a cerca de 6000 vezes, cerca de 250 vezes a cerca de 6000 vezes, ou cerca de 300 vezes a cerca de 6000 vezes, em comparação com uma resposta imune celular num su- jeito não administrado com a vacina. Em algumas modalidades, a vacina pode aumentar a resposta imune celular no sujeito administrado com a vacina em cerca de 50 vezes, 100 vezes, 150 vezes, 200 vezes, 250 vezes, 300 vezes, 350 vezes, 400 vezes, 450 vezes, 500 vezes, 550 vezes, 600 vezes, 650 vezes, 700 vezes, 750 vezes, 800 vezes, 850 vezes, 900 vezes, 950 vezes, 1000 vezes, 1100 vezes, 1200 vezes, 1300 vezes, 1400 vezes, 1500 vezes, 1600 vezes, 1700 vezes, 1800 vezes, 1900 vezes, 2000 vezes, 2100 vezes, 2200 vezes, 2300 vezes, 2400 vezes, 2500 vezes, 2600 vezes, 2700 vezes, 2800 vezes, 2900 vezes, 3000 vezes, 3100 vezes, 3200 vezes, 3300 vezes, 3400 vezes, 3500 vezes, 3600 vezes, 3700 vezes, 3800 vezes, 3900 vezes, 4000 vezes, 4100 vezes, 4200 vezes, 4300 vezes, 4400 vezes, 4500 vezes, 4600 vezes, 4700 vezes, 4800 vezes, 4900 vezes, 5000 vezes, 5100 vezes, 5200 vezes, 5300 vezes, 5400 vezes, 5500 vezes, 5600 vezes, 5700 vezes, 5800 vezes, 5900 vezes ou 6000 vezes em comparação com a resposta imune celular no sujeito não administrado com a vacina.

[0063] A vacina pode aumentar os níveis de interferon gama (IFN- γ) num sujeito administrado com a vacina em cerca de 50 vezes a cerca de 6000 vezes, cerca de 50 vezes a cerca de 5500 vezes, cerca de 50 vezes a cerca de 5000 vezes 50 vezes cerca de 4500 vezes, cerca de 100 vezes a cerca de 6000 vezes, cerca de 150 vezes a cerca de 6000 vezes, cerca de 200 vezes a cerca de 6000 vezes, cerca de 250 vezes a cerca de 6000 vezes, ou cerca de 300 vezes a cerca de 6000 vezes, em comparação com os níveis de IFN-γ em um sujeito não administrado com a vacina. Em algumas modalidades, a vacina pode aumentar os níveis de IFN-γ no sujeito administrado com a vacina em cerca de 50 vezes, 100 vezes, 150 vezes, 200 vezes, 250 vezes, 300 vezes, 350 vezes, 400 vezes, 450 vezes, 500 vezes, 550 vezes, 600 vezes, 650 vezes, 700 vezes, 750 vezes, 800 vezes, 850 vezes, 900 vezes, 950 vezes, 1000 vezes, 1100 vezes, 1200 vezes, 1300 vezes, 1400 vezes, 1500 vezes, 1600 vezes, 1700 vezes, 1800 vezes, 1900 vezes, 2000 vezes, 2100 vezes, 2200 vezes, 2300 vezes, 2400 vezes, 2500 vezes, 2600 vezes, 2700 vezes, 2800 vezes, 2900 vezes, 3000 vezes, 3100 vezes, 3200 vezes, 3300 vezes, 3400 vezes, 3500 vezes, 3600 vezes,

3700 vezes, 3800 vezes, 3900 vezes, 4000 vezes, 4100 vezes, 4200 vezes, 4300 vezes, 4400 vezes, 4500 vezes, 4600 vezes, 4700 vezes, 4800 vezes, 4900 vezes, 5000 vezes, 5100 vezes, 5200 vezes, 5300 vezes 5400 vezes, 5500 vezes, 5600 vezes, 5700 vezes, 5800 vezes, 5900 vezes ou 6000 vezes em comparação com os níveis de IFN-γ em um sujeito não administrado com a vacina.

[0064] Conforme descrito em mais detalhes abaixo, a vacina pode ainda compreender um ou mais inibidores de uma ou mais moléculas de ponto de verificação imune (isto é, um inibidor de ponto de verificação imune). As moléculas do ponto de verificação imune são descritas abaixo em mais detalhes. O inibidor de ponto de verificação imune é qualquer ácido nucleico ou proteína que impeça a supressão de qual- quer componente no sistema imunológico, tais como apresentação de classe de MHC, apresentação e/ou diferenciação de células T, apresen- tação e/ou diferenciação de células B e citocina, quimiocina ou sinaliza- ção para proliferação e/ou diferenciação de células imunes. Como tam- bém descrito abaixo em mais detalhes, a vacina pode ser combinada ainda mais com anticorpos para inibidores do ponto de verificação, como PD-1 e PDL-1, para aumentar a estimulação das respostas imu- nes celulares e humorais. O uso de anticorpos anti-PD-1 ou anti-PDL-1 impede que PD-1 ou PDL-1 suprimam as respostas das células T e/ou das células B. Definições

[0065] A menos que definido de outra forma, todos os termos técni- cos e científicos usados aqui têm o mesmo significado compreendido comumente por versados na técnica. Em caso de conflito, o presente documento, incluindo as definições, controlará. Métodos e materiais preferidos são descritos a seguir, embora métodos e materiais seme- lhantes ou equivalentes aos descritos neste documento possam ser usados na prática ou no teste da presente invenção. Todas as publica- ções, pedidos de patentes, patentes e outras referências mencionadas neste documento estão incorporadas por referência em suas totalida- des. Os materiais, métodos e exemplos descritos neste documento são ilustrativos apenas e não se destinam a ser um fator limitante. A termi- nologia usada neste documento tem a finalidade de descrever modali- dades particulares apenas e não se destina a ser limitante da invenção.

[0066] Os termos "compreende(m)", "inclui(em)", "ter", "tem", "pode", "contém(êm)", e as variantes destes, conforme usado neste do- cumento, destinam-se a ser frases de transição em aberto, termos ou palavras que não excluem a possibilidade de atos ou estruturas adicio- nais. As formas singulares "uma", "um" e "a/o" incluem referências no plural, a menos que o contexto claramente indique de outra forma. A presente divulgação também contempla outras modalidades "compre- endendo", "consistindo em" e "consistindo essencialmente em" modali- dades ou elementos apresentados neste documento, se explicitamente estabelecido ou não.

[0067] Para a recitação de faixas numéricas neste documento, cada valor intermediário tendo o mesmo grau de precisão que a faixa recitada mínima e máxima é explicitamente contemplado. Por exemplo, para a faixa de 6-9, os números 7 e 8 são contemplados além de 6 e 9, e para a faixa de 6,0-7,0, os números 6,0, 6,1, 6,2, 6,3, 6,4, 6,5, 6,6, 6,7, 6,8, 6,9, e 7,0 são contemplados explicitamente.

[0068] "Adjuvante", como usado aqui, significa qualquer molécula adicionada às vacinas aqui descritas para aumentar a imunogenicidade do antígeno.

[0069] "Anticorpo", tal como aqui utilizado, significa um anticorpo de classe IgG, IgM, IgA, IgD ou IgE, ou fragmento ou derivado dos mes- mos, includindo Fab, F(ab’)2, Fd, e anticorpos de cadeia única, bivalen-

tes, anticorpos biespecíficos, anticorpos bifuncionais e respectivos deri- vativos. O anticorpo pode ser um anticorpo isolado da amostra de soro de um mamífero, um anticorpo policlonal, um anticorpo purificado de afinidade ou qualquer mistura dos mesmos, que apresenta especifici- dade suficiente de ligação a um epítopo desejado ou a uma sequência derivada destes.

[0070] "Antígeno" refere-se a proteínas com sequências de amino- ácidos de antígeno de Survivina de consenso sintético, incluindo: (a) aminoácidos 19-159 da SEQ ID NO:2; (b) aminoácidos 19-210 da SEQ ID NO:4; (c) aminoácidos 19-232 da SEQ ID NO:8; (d) fragmentos com- preendendo pelo menos 90% dos aminoácidos 19-159 da SEQ ID NO:2; (e) fragmentos compreendendo pelo menos 90% dos aminoácidos 19- 210 da SEQ ID NO:4; (f) fragmentos compreendendo pelo menos 90% dos aminoácidos 19-232 da SEQ ID NO:8; (g) proteínas que são pelo menos 95% idênticas aos aminoácidos 19-159 da SEQ ID NO:2; (h) pro- teínas que são pelo menos 95% idênticas aos aminoácidos 19-210 da SEQ ID NO:4; (i) proteínas que são pelo menos 95% idênticas aos ami- noácidos 19-232 da SEQ ID NO:8; (j) fragmentos compreendendo pelo menos 90% de uma proteína que é pelo menos 95% idêntica aos ami- noácidos 19-159 da SEQ ID NO:2; (k) fragmentos compreendendo pelo menos 90% de uma proteína que é pelo menos 95% idêntica aos ami- noácidos 19-210 da SEQ ID NO:4; e (l) fragmentos compreendendo pelo menos 90% de uma proteína que é pelo menos 95% idêntica aos ami- noácidos 19-232 da SEQ ID NO:8. "Antígeno" também se refere a pro- teínas com sequências de aminoácidos de antígeno de Survivina de consenso sintético incluindo (a) SEQ ID NO:2; (b) SEQ ID NO:4; (c) SEQ ID NO:8; (d) fragmentos compreendendo pelo menos 90% de um com- primento inteiro da SEQ ID NO:2; (e) fragmentos compreendendo pelo menos 90% de um comprimento inteiro da SEQ ID NO:4; (f) fragmentos compreendendo pelo menos 90% de um comprimento inteiro da SEQ

ID NO:8; (g) proteínas que são pelo menos 95% idênticas à SEQ ID NO:2; (h) proteínas que são pelo menos 95% idênticas à SEQ ID NO:4; (i) proteínas que são pelo menos 95% idênticas à SEQ ID NO:8; (j) fra- gmentos compreendendo pelo menos 90% de um comprimento inteiro de uma proteína que é pelo menos 95% idêntica à SEQ ID NO:2; (k) fragmentos compreendendo pelo menos 90% de um comprimento in- teiro de uma proteína que é pelo menos 95% idêntica à SEQ ID NO:4; e (l) fragmentos compreendendo pelo menos 90% de um comprimento inteiro de uma proteína que é pelo menos 95% idêntica à SEQ ID NO:8. Os antígenos podem opcionalmente incluir peptídeos de sinal, como os de outras proteínas.

[0071] "Sequência codificante" ou "ácido nucleico codificador", como usado aqui, significa os ácidos nucleicos (molécula de RNA ou de DNA) que compreendem uma sequência de nucleotídeos que codifica uma proteína. A sequência codificante pode ainda incluir sinais de inici- ação e terminação operacionalmente ligados a elementos regulatórios, incluindo um promotor e um sinal de poliadenilação capaz de direcionar a expressão nas células de um sujeito ou mamífero ao qual o ácido nu- cleico é administrado.

[0072] "Complemento" ou "complementar", como usado aqui em re- lação um ácido nucleico pode significar uma base de Watson-Crick (por exemplo, A-T/U e C-G) ou de Hoogsteen pareando entre os nucleotí- deos ou análogos de nucleotídeos das moléculas de ácido nucleico.

[0073] "Consenso" ou "sequência de consenso", conforme aqui uti- lizado, significa uma sequência de polipeptídeo com base na análise de um alinhamento de múltiplas sequências para o mesmo gene de dife- rentes organismos ou de diferentes isoformas dentro de um organismo. As sequências de ácidos nucleicos que codificam uma sequência con- senso polipeptídica podem ser preparadas.

[0074] "Corrente constante", como aqui utilizado descreve uma cor- rente que é recebida ou experimentada por um tecido, ou células que definem o referido tecido, durante a duração de um pulso elétrico admi- nistrado ao mesmo tecido. O pulso elétrico é administrado a partir dos dispositivos de eletroporação aqui descritos. Esta corrente permanece com uma amperagem constante no referido tecido durante a vida de um pulso elétrico, porque o dispositivo de eletroporação aqui fornecido pos- sui um elemento de realimentação, preferivelmente tendo realimentação instantânea. O elemento de feedback pode medir a resistência do tecido (ou células) durante toda a duração do pulso e fazer com que o disposi- tivo de eletroporação altere sua produção de energia elétrica (por exem- plo, aumente a tensão), de modo que a corrente no mesmo tecido per- maneça constante durante todo o pulso elétrico (ligado a ordem dos mi- crossegundos) e de pulso para pulso. Em algumas modalidades, o ele- mento de feedback compreende um controlador.

[0075] "Feedback de corrente" ou "feedback", conforme usado neste documento, pode ser usado de forma intercambiável e pode sig- nificar a resposta ativa dos dispositivos de eletroporação fornecidos, que compreendem medir a corrente no tecido entre os eletrodos e alterar a saída de energia fornecida pelo dispositivo EP de acordo, para manter a corrente em um nível constante. Esse nível constante é predefinido pelo usuário antes do início de uma sequência de pulsos ou tratamento elétrico. O feedback pode ser realizado pelo componente de eletropora- ção, por exemplo, controlador, do dispositivo de eletroporação, pois o circuito elétrico nele é capaz de monitorar continuamente a corrente no tecido entre os eletrodos e comparar essa corrente monitorada (ou cor- rente no tecido) com uma corrente predefinida e continuamente faz ajus- tes na produção de energia para manter a corrente monitorada em ní- veis predefinidos. O loop de feedback pode ser instantâneo, pois é um feedback de loop fechado analógico.

[0076] "Corrente descentralizada", conforme utilizado neste docu- mento, pode significar o padrão de correntes elétricas entregues dos vários arranjos de eletrodos de agulha dos dispositivos de eletroporação aqui descritos, em que os padrões minimizam, ou preferivelmente elimi- nam, a ocorrência de estresse térmico relacionado à eletroporação em qualquer área do tecido eletroporado.

[0077] "Eletroporação", "eletropermeabilização," ou "potenciamento eletrocinético" ("EP"), tal como utilizado permutavelmente aqui, significa a utilização de um pulso de campo elétrico transmembrana para induzir caminhos microscópicos (poros) em uma biomembrana; sua presença permite que biomoléculas como plasmídeos, oligonucleotídeos, siRNA, drogas, íons e água passem de um lado da membrana celular para o outro.

[0078] "Fragmento", tal como aqui utilizado com relação às sequên- cias de ácidos nucleicos, significa uma sequência de ácido nucleico ou uma porção do mesmo, que codifica um polipeptídeo capaz de provocar uma resposta imune em um mamífero que reage cruzadamente com um antígeno divulgado aqui. Os fragmentos podem ser fragmentos de DNA selecionados de, pelo menos, uma das diversas sequências de nucleo- tídeos que codificam os fragmentos de proteína definidos abaixo. Os fragmentos podem compreender pelo menos 10%, pelo menos 20%, pelo menos 30%, pelo menos 40%, pelo menos 50%, pelo menos 60%, pelo menos 70%, pelo menos 80%, pelo menos 90%, ou pelo menos 95% de uma ou mais das sequências de ácido nucleico apresentadas abaixo, excluindo um peptídeo sinal heterólogo adicionado. O fragmento pode compreender pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98% ou pelo menos 99% de uma ou mais das sequên- cias de ácido nucleico estabelecidas abaixo e adicionalmente opcional- mente compreendem sequência que codifica um peptídeo sinal heteró- logo que não é incluído quando se calcula a porcentagem de identidade.

Os fragmentos podem ainda compreender sequências de codificação para um peptídeo sinal, como um peptídeo sinal de imunoglobulina, por exemplo, um peptídeo sinal IgE ou IgG. A sequência de codificação que codifica uma metionina e/ou peptídeo de sinal do terminal N pode ser ligada a um fragmento da sequência de codificação.

[0079] Em algumas modalidades, os fragmentos podem compreen- der pelo menos 20 nucleotídeos ou mais, pelo menos 30 nucleotídeos ou mais, pelo menos 40 nucleotídeos ou mais, pelo menos 50 nucleotí- deos ou mais, pelo menos 60 nucleotídeos ou mais, pelo menos 70 nu- cleotídeos ou mais, em pelo menos 80 nucleotídeos ou mais, pelo me- nos 90 nucleotídeos ou mais, pelo menos 100 nucleotídeos ou mais, pelo menos 150 nucleotídeos ou mais, pelo menos 200 nucleotídeos ou mais, pelo menos 250 nucleotídeos ou mais, pelo menos 300 nucleotí- deos ou mais, pelo menos 350 nucleotídeos ou mais, pelo menos 400 nucleotídeos ou mais, pelo menos 450 nucleotídeos ou mais, pelo me- nos 500 nucleotídeos ou mais, pelo menos 550 nucleotídeos ou mais, pelo menos 600 nucleotídeos ou mais, ou pelo menos 650 nucleotídeos ou mais de pelo menos uma das sequências de ácidos nucleicos esta- belecidas abaixo.

[0080] "Fragmento" ou "fragmento imunogênico" com relação às se- quências polipeptídicas significa um polipeptídeo capaz de provocar uma resposta imune em um mamífero que reage cruzadamente com um antígeno divulgado aqui. Os fragmentos podem ser fragmentos polipep- tídicos selecionados de pelo menos uma das várias sequências de ami- noácidos. Os fragmentos de proteínas consenso podem compreender pelo menos 10%, pelo menos 20%, pelo menos 30%, pelo menos 40%, pelo menos 50%, pelo menos 60%, pelo menos 70%, pelo menos 80%, pelo menos 90% ou pelo menos 95% de uma proteína consenso, exclu- indo qualquer peptídeo sinal heterólogo adicionado. O fragmento pode compreender pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98% ou pelo menos 99% de uma ou mais das sequências amino estabelecidas abaixo e adicionalmente opcionalmente compreendem um peptídeo sinal heterólogo que não precisa ser incluído quando se calcula a porcentagem de identidade. Os fragmentos podem ainda com- preender um peptídeo sinal, como um peptídeo sinal de imunoglobulina, por exemplo, um peptídeo sinal IgE ou IgG.

[0081] Em algumas modalidades, fragmentos de proteínas de con- senso podem compreender pelo menos 20 aminoácidos ou mais, pelo menos 30 aminoácidos ou mais, pelo menos 40 aminoácidos ou mais, pelo menos 50 aminoácidos ou mais, pelo menos 60 aminoácidos ou mais, pelo menos 70 aminoácidos ou mais, pelo menos 80 aminoácidos ou mais, pelo menos 90 aminoácidos ou mais, pelo menos 100 amino- ácidos ou mais, pelo menos 110 aminoácidos ou mais, pelo menos 120 aminoácidos ou mais, pelo menos 130 aminoácidos ou mais, pelo me- nos 140 aminoácidos ou mais, pelo menos 150 aminoácidos ou mais, pelo menos 160 aminoácidos ou mais, pelo menos 170 aminoácidos ou mais, pelo menos 180 aminoácidos ou mais, pelo menos 200 aminoáci- dos ou mais, ou pelo menos 220 aminoácidos ou mais de uma sequên- cia de proteínas aqui divulgada.

[0082] Como utilizado neste documento, o termo "construto gené- tico" refere-se às moléculas de DNA ou RNA que compreendem uma sequência de nucleotídeos que codificam uma proteína. A sequência de codificação inclui sinais de iniciação e de terminação ligados de forma operável a elementos regulatórios, incluindo um promotor e um sinal de poliadenilação capaz de direcionar a expressão nas células do sujeito ao qual a molécula de ácido nucleico é administrada. Como utilizado neste documento, o termo "forma expressável" se refere a um construto de gene que contêm os elementos regulatórios necessários operavel- mente ligados a uma sequência de codificação que codifica uma prote-

ína, de tal modo que quando presente na célula de um sujeito, a se- quência de codificação será expressa.

[0083] O termo "homólogo", como utilizado neste documento, re- fere-se ao grau de complementaridade. Pode haver uma homologia par- cial ou uma homologia completa (i.e., identidade). Uma sequência par- cialmente complementar que pelo menos parcialmente inibe uma se- quência completamente complementar da hibridação com um ácido nu- cleico alvo é referida usando o termo funcional "substancialmente ho- mólogo.” Quando usado em referência a uma sequência de ácido nu- cleico de fita dupla, como um cDNA ou clone genômico, o termo "subs- tancialmente homólogo"" como utilizado neste documento, refere-se a uma sonda que pode hibridar com uma fita da sequência de ácido nu- cleico de fita dupla sob condições de baixa estringência. Quando usado em referência a uma sequência de ácidos nucleicos de fita única, o termo "substancialmente homólogo,”, tal como aqui utilizado, refere-se a uma sonda que pode hibridizar para (i.e., é o complemento de) uma sequência modelo de ácido nucleico de fita simples sob condições de baixa estringência.

[0084] "Idêntico" ou "identidade", tal como aqui utilizado no contexto de dois ou mais ácidos nucleicos ou sequências polipeptídicas, podem significar que as sequências têm uma porcentagem especificada de re- síduos que são as mesmas ao longo de uma região especificada. A por- centagem pode ser calculada por alinhamento ótimo das duas sequên- cias, comparando as duas sequências sobre a região especificada, de- terminando o número de posições em que o resíduo idêntico ocorre em ambas as sequências para produzir o número de posições correspon- dentes, dividindo o número de posições correspondentes pelo número total de posições na região especificada, e multiplicando o resultado por 100 para produzir a porcentagem de identidade da sequência. Em casos em que as duas sequências são de comprimentos diferentes ou em que o alinhamento produz uma ou mais extremidades espaçadas e a região especificada de comparação inclui apenas uma única sequência, os re- síduos da sequência única são incluídos no denominador, mas não no numerador do cálculo. Ao comparar o DNA e o RNA, timina (T) e uracil (U) podem ser considerados equivalentes. A identidade pode ser exe- cutada manualmente ou usando um algoritmo de sequência de compu- tador, como o BLAST ou BLAST 2.0.

[0085] A "impedância", conforme usada neste documento, pode ser usada ao discutir o mecanismo de feedback e pode ser convertida em um valor atual de acordo com a lei de Ohm, permitindo comparações com a corrente predefinida.

[0086] "Resposta imune", tal como aqui utilizado, significa a ativa- ção de um sistema imunológico do hospedeiro, por exemplo, o de um mamífero, em resposta à introdução de antígeno. A resposta imune pode estar na forma de uma resposta celular ou humoral, ou ambas.

[0087] "Ácido nucleico" ou "oligonucleotídeo" ou "polinucleotídeo", como usado neste documento, significa pelo menos dois nucleotídeos covalentemente ligados entre si. A representação de uma fita simples também define a sequência da fita complementar. Assim, um ácido nu- cleico também engloba a fita complementar de uma fita simples repre- sentada. Muitas variantes de um ácido nucleico podem ser usadas para a mesma finalidade que um determinado ácido nucleico. Assim, um ácido nucleico também engloba substancialmente ácidos nucleicos idênticos e complementos dos mesmos. Uma fita única fornece uma sonda que pode hibridizar a uma sequência-alvo sob condições restriti- vas de hibridização. Assim, um ácido nucleico também engloba uma sonda que se hibridiza sob condições de hibridização rigorosas.

[0088] Os ácidos nucleicos podem ser de fita única ou de fita dupla, ou podem conter porções das sequências de fita dupla ou de fita única.

O ácido nucleico pode ser o DNA, genômico e cDNA, RNA ou um hí- brido, onde o ácido nucleico pode conter combinações de deoxirribo- e ribo-nucleotídeos e combinações de bases incluindo uracila, adenina, timina, citosina, guanina, inosina, xantina hipoxantina, isocitosina e iso- guanina. Os ácidos nucleicos podem ser obtidos por métodos de síntese química ou por métodos recombinantes.

[0089] "Operacionalmente ligado", como usado aqui, significa que a expressão de um gene está sob o controle de um promotor com o qual ele está espacialmente conectado. Um promotor pode ser posicionado 5' (a montante) ou 3' (a jusante) de um gene sob seu controle. A distân- cia entre o promotor e um gene pode ser aproximadamente a mesma que a distância entre aquele promotor e o gene que ele controla no gene do qual o promotor é derivado. Como é conhecido na técnica, a variação desta distância pode ser ajustada sem perda da função do promotor.

[0090] Um "peptídeo", uma "proteína" ou um "polipeptídeo", con- forme usado neste documento, pode significar uma sequência de ami- noácidos ligados e pode ser natural, sintético ou uma modificação ou combinação de natural e sintético.

[0091] "Promotor", tal como aqui utilizado, significa uma molécula sintética ou naturalmente derivada que é capaz de conferir, ativar ou potencializar a expressão de um ácido nucleico em uma célula. Um pro- motor pode compreender uma ou mais sequências regulatórias transcri- cionais específicas para potencializar ainda mais a expressão e/ou para alterar a expressão espacial e/ou expressão temporal de um ácido nu- cleico em uma célula. Um promotor também pode compreender elemen- tos acentuadores distais ou repressores, que podem ser localizados, tanto quanto milhares de pares de base, a partir do sítio de início da transcrição. Um promotor pode ser derivado de fontes que incluem ví- rus, bactérias, fungos, plantas, insetos e animais. Um promotor pode regular a expressão de um componente de gene constitutivamente, ou diferencialmente em relação à célula, ao tecido ou ao órgão em que a expressão ocorre ou, em relação ao estágio de desenvolvimento em que a expressão ocorre, ou em resposta a estímulos externos, tais como estresses fisiológicos, patogênicos, íons metálicos, ou agentes de indu- ção. Exemplos representativos de promotores incluem o promotor do bacteriófago T7, promotor do bacteriófago T3, promotor SP6, promotor operador lac, promotor tac, promotor SV40 tardio, promotor SV40 pre- coce, promotor RSV-LTR, promotor IE de CMV, promotor SV40 precoce ou promotor SV40 tardio e promotor IE de CMV.

[0092] "Peptídeo sinal" e "sequência líder" são usados de forma in- tercambiável neste documento e se referem a uma sequência de ami- noácido que pode ser ligada no amino terminal de uma proteína estabe- lecida neste documento. Peptídeos sinal/sequências líderes normal- mente direcionam a localização de uma proteína. Peptídeos sinal/se- quências principais usados neste documento preferencialmente facili- tam a secreção da proteína a partir da célula em que são produzidos. Peptídeos sinal/sequências líderes são frequentemente clivados do res- tante da proteína, frequentemente referidos como a proteína madura, mediante a secreção da célula. Os peptídeos sinal/sequências líderes estão ligados no terminal amino (isto é, terminal N) da proteína.

[0093] "Condições estritas de hibridização", tal como aqui utilizado, significa que as condições sob as quais uma primeira sequência de ácido nucleico (por exemplo, sonda) irá hibridizar para uma segunda sequência de ácido nucleico (por exemplo, alvo), tal como em uma mis- tura complexa de ácidos nucleicos. Condições restritivas são dependen- tes da sequência e serão diferentes em diferentes circunstâncias. As condições restritivas podem ser selecionadas para ser de cerca de 5 a 10°C menor que o ponto de fusão térmica (Tm) para a sequência espe- cífica a um pH de força iônica definido. A Tm pode ser a temperatura (força iônica, pH e concentração nucleica definidos) à qual 50% das sondas complementares ao alvo hibridizam para a sequência alvo em equilíbrio (como as sequências alvo estão presentes em excesso, a Tm, 50% das sondas estão ocupadas em equilíbrio). Condições restritivas podem ser aquelas em que a concentração de sal é inferior a cerca de 1,0 M de íon de sódio, tal como uma concentração de aproximadamente 0,01-1,0 M de íons de sódio (ou outros sais) a um pH de 7,0 a 8,3, e a temperatura é pelo menos cerca de 30°C para sondas curtas (por exem- plo, aproximadamente 10-50 nucleotídeos) e pelo menos cerca de 60°C para sondas longas (por exemplo, maior do que cerca de 50 nucleotí- deos). As condições restritivas também podem ser alcançadas com a adição de agentes desestabilizantes, como a formamida. Para a hibridi- zação seletiva ou específica, um sinal positivo pode ser hibridização de fundo pelo menos de 2 a 10 vezes. Exemplos de condições restritivas de hibridização incluem o seguinte: formamida a 50%, SSC 5x e SDS a 1%, incubando a 42°C, ou SSC 5x, SDS a 1%, incubando a 65°C, com lavagem em SSC 0,2x e 0,1 % De SDS a 65°C.

[0094] "Sujeito", tal como aqui utilizado pode significar um mamífero que deseja ou que possui necessidade de ser imunizado com a vacina descrita aqui. O mamífero pode ser um humano, chipanzé, cachorro, gato, cavalo, vaca, camundongo ou rato.

[0095] "Substancialmente complementar", tal como aqui utilizado, pode significar que a primeira sequência é pelo menos 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%,94%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% idêntica ao com- plemento de uma segunda sequência ao longo de uma região de 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 100, 180, 270, 360, 450, 540 ou mais nucleotídeos ou aminoácidos, ou que as duas sequências hibri- dizam sob condições de hibridação estritas.

[0096] "Substancialmente idêntico(a)", tal como aqui utilizado, sig- nifica que a primeira e a segunda sequências são pelo menos 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% idênti- cas a uma região de 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 100, 180, 270, 360, 450, 540, ou mais nucleotídeos ou aminoácidos, ou em relação a ácidos nucleicos, se a primeira sequência for substancial- mente complementar ao complemento da segunda sequência.

[0097] "Tratar", "tratamento" ou "tratamento", como utilizado neste documento, pode significar proteger um animal de uma doença através de meios de prevenir, suprimir, reprimir ou eliminar completamente a doença. Prevenir a doença envolve administrar uma vacina da presente invenção a um animal antes da aparição da doença. Suprimir a doença envolve administrar uma vacina da presente invenção a um sujeito após a indução da doença, mas antes de seu aparecimento clínico. Reprimir a doença envolve administrar uma vacina da presente invenção a um animal após aparecimento clínico da doença.

[0098] "Variante", como utilizado neste documento com relação a um ácido nucleico, significa (i) uma porção ou fragmento de uma se- quência de nucleotídeos referenciada; (ii) o complemento de uma se- quência de nucleotídeos referenciada ou parte da mesma; (iii) um ácido nucleico que é substancialmente idêntico a um ácido nucleico referenci- ado ou ao complemento deste; ou (iv) um ácido nucleico que hibridiza sob condições restritivas para o ácido nucleico referenciado, seu com- plemento ou uma sequência substancialmente idêntica ao mesmo.

[0099] "Variante", como utilizado neste documento em relação a um peptídeo ou polipeptídeo, significa um peptídeo ou polipeptídeo que di- fere na sequência de aminoácidos pela inserção, exclusão ou substitui-

ção conservadora de aminoácidos, mas retém pelo menos uma ativi- dade biológica.

Variante também pode significar uma proteína com uma sequência de aminoácidos que é substancialmente idêntica a uma pro- teína referenciada com uma sequência de aminoácidos que retém pelo menos uma atividade biológica.

Uma substituição conservativa de um aminoácido, isto é, a substituição de um aminoácido por um aminoácido diferente de propriedades semelhantes (por exemplo, hidrofilicidade, grau e distribuição das regiões carregadas) é reconhecida na técnica como normalmente envolvendo uma pequena alteração.

Estas peque- nas alterações podem ser identificadas, em parte, considerando o índice hidropático de aminoácidos, como entendido na técnica.

Kyte et al., J.

Mol.

Biol. 157:105-132 (1982). O índice hidropático de um aminoácido é baseado em uma consideração de sua hidrofobicidade e carga.

É co- nhecido na técnica que os aminoácidos de índices hidropáticos seme- lhantes podem ser substituídos e ainda manter a função proteica.

Em um aspecto, os aminoácidos tendo índices hidropáticos de ±2 são subs- tituídos.

A hidrofilia dos aminoácidos também pode ser usada para re- velar substituições que resultariam em proteínas que mantêm a função biológica.

Uma consideração da hidrofilia dos aminoácidos no contexto de um peptídeo permite o cálculo da maior hidrofilia média local desse peptídeo, uma medida útil que foi relatada por se correlacionar bem com a antigenicidade e imunogenicidade.

Patente U.S. 4.554.101, incorpo- rada aqui integralmente por referência.

A substituição de aminoácidos com valores de hidrofilicidade semelhantes pode resultar em peptídeos que retêm a atividade biológica, por exemplo, imunogenicidade, como é entendido na técnica.

As substituições podem ser realizadas com ami- noácidos com valores de hidrofilicidade dentro de ± 2 um do outro.

O índice de hidrofobicidade e o valor de hidrofilicidade dos aminoácidos são influenciados pela cadeia lateral particular desse aminoácido.

Con- sistente com essa observação, as substituições de aminoácidos que são compatíveis com a função biológica são compreendidas como depen- dentes da semelhança relativa dos aminoácidos e, particularmente, das cadeias laterais desses aminoácidos, conforme revelado pela hidrofobi- cidade, hidrofilicidade, carga, tamanho e outras propriedades.

[00100] Uma variante pode ser uma sequência de ácido nucleico que é substancialmente idêntica ao longo do comprimento total da sequên- cia de gene total ou um fragmento do mesmo. A sequência de ácido nucleico pode ser de 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% idêntica ao longo do comprimento total da sequência de gene ou um fragmento do mesmo. Uma variante pode ser uma sequência de amino- ácido que é substancialmente idêntica ao longo do comprimento total da sequência de aminoácido ou um fragmento do mesmo. A sequência de ácidos nucleicos pode ser de 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% idêntica ao longo do comprimento total da sequência de aminoácido ou um fragmento do mesmo.

[00101] "Vetor", tal como aqui utilizado, significa uma sequência de ácido nucleico, que contém uma origem de replicação. Um vetor pode ser um vetor viral, bacteriófago, cromossomo artificial bacteriano ou cro- mossomo artificial de levedura. Um vetor pode ser um vetor de DNA ou RNA. Um vetor pode ser um vetor extracromossômico autorreplicante e, de preferência, é um plasmídeo de DNA. O vetor pode conter ou incluir uma ou mais sequências de ácido nucleico heterólogas. Vacinas

[00102] São fornecidas aqui vacinas que compreendem um antígeno de Survivina de consenso sintético, conforme divulgado neste docu- mento, uma molécula de ácido nucleico que codifica um antígeno, uma molécula de ácido nucleico que codifica um fragmento de um antígeno,

uma molécula de ácido nucleico que codifica uma variante de um antí- geno ou combinações que codificam moléculas de ácido nucleico dos mesmos. As vacinas podem ser capazes de gerar em um sujeito uma resposta imune contra o antígeno. A resposta imune pode ser uma res- posta imune terapêutica ou profilática. As vacinas podem compreender um vetor ou uma pluralidade de vetores como descrito em mais detalhes abaixo.

[00103] Em algumas modalidades, a vacina compreende uma molé- cula de ácido nucleico. Em algumas modalidades, a molécula de ácido nucleico codifica um antígeno de Survivina de consenso sintético. Em algumas modalidades, a molécula de ácido nucleico compreende uma sequência de ácido nucleico que codifica SEQ ID NO:3; uma sequência de ácido nucleico que codifica um fragmento compreendendo pelo me- nos 90% do comprimento da SEQ ID NO 3; uma sequência de ácido nucleico que codifica uma proteína que é pelo menos 95% idêntica à SEQ ID NO:3; ou uma sequência de ácido nucleico que codifica um fra- gmento compreendendo pelo menos 90% de um comprimento inteiro de uma proteína que é pelo menos 95% idêntica à SEQ ID NO:3. Em algu- mas modalidades, a molécula de ácido nucleico compreende a SEQ ID NO:1; um fragmento compreendendo pelo menos 90% de todo o com- primento da SEQ ID NO:1; um fragmento que é pelo menos 95% idên- tico à SEQ ID NO:1; ou um fragmento compreendendo pelo menos 90% de todo o comprimento de uma sequência de ácido nucleico que é pelo menos 95% idêntica à SEQ ID NO:1.

[00104] Em algumas modalidades, a molécula de ácido nucleico compreende uma sequência de ácido nucleico que codifica SEQ ID NO:4; uma sequência de ácido nucleico que codifica um fragmento com- preendendo pelo menos 90% do comprimento da SEQ ID NO 4; uma sequência de ácido nucleico que codifica uma proteína que é pelo me- nos 95% idêntica à SEQ ID NO:4; ou uma sequência de ácido nucleico que codifica um fragmento compreendendo pelo menos 90% de um comprimento inteiro de uma proteína que é pelo menos 95% idêntica à SEQ ID NO:4. Em algumas modalidades, a molécula de ácido nucleico compreende a SEQ ID NO:2; um fragmento compreendendo pelo me- nos 90% de todo o comprimento da SEQ ID NO:2; um fragmento que é pelo menos 95% idêntico à SEQ ID NO:2; ou um fragmento compreen- dendo pelo menos 90% de todo o comprimento de uma sequência de ácido nucleico que é pelo menos 95% idêntica à SEQ ID NO:2.

[00105] Em algumas modalidades, a vacina compreende um antí- geno de Survivina de consenso sintético, em que o antígeno compre- ende a SEQ ID NO:3; um fragmento compreendendo pelo menos 90% do comprimento da SEQ ID NO 3; uma sequência de aminoácidos que é pelo menos 95% idêntica à SEQ ID NO:3; ou um fragmento compre- endendo pelo menos 90% de um comprimento inteiro de uma proteína que é pelo menos 95% idêntica à SEQ ID NO:3.

[00106] Em algumas modalidades, a vacina compreende um antí- geno de Survivina de consenso sintético, em que o antígeno compre- ende a SEQ ID NO:4; um fragmento compreendendo pelo menos 90% do comprimento da SEQ ID NO 4; uma sequência de aminoácidos que é pelo menos 95% idêntica à SEQ ID NO:4; ou um fragmento compre- endendo pelo menos 90% de um comprimento inteiro de uma proteína que é pelo menos 95% idêntica à SEQ ID NO:4.

[00107] As vacinas podem ser usadas para proteger contra o câncer, por exemplo, um câncer ou tumor expressando Survivina. As vacinas podem ser usadas para prevenir e/ou tratar um tumor que expressa Sur- vivina em um sujeito em necessidade do mesmo. As vacinas podem induzir respostas celulares e/ou anticorpos contra Survivina e contra tu- mores que expressam Survivina.

[00108] Em uma modalidade, as vacinas podem ser usadas para pro- teger, prevenir e/ou tratar ou induzir uma resposta celular e/ou anticorpo contra células cancerígenas do ovário que expressam Survivina, espe- cificamente células epiteliais de câncer de ovário que expressam Survi- vina, mais especificamente células de câncer de ovário seroso que ex- pressam Survivina.

[00109] O desenvolvimento de uma vacina contra o câncer, conforme descrito aqui, compreende identificar um antígeno do câncer, por exem- plo, Survivina, que não é reconhecido pelo sistema imunológico e é um antígeno associado ao tumor ("câncer/testículo", "C/T"). O antígeno de câncer é alterado de um autoantígeno para um antígeno estrangeiro, a fim de ser reconhecido pelo sistema imunológico. O redesenho do ácido nucleico e da sequência de aminoácidos do antígeno de câncer recom- binante de um antígeno para um antígeno estrangeiro, quebra a tolerân- cia do antígeno pelo sistema imunológico. Para quebrar a tolerância, várias medidas de redesenho podem ser aplicadas ao antígeno de cân- cer como descrito abaixo.

[00110] O antígeno de câncer recombinante da vacina não é reco- nhecido como auto, quebrando, portanto, a tolerância. A quebra da to- lerância pode induzir respostas de anticorpos de células T específicas de antígeno e/ou de altos níveis, induzindo ou provocando assim uma resposta imune que é dirigida ou reativa contra o câncer ou tumor que expressa o antígeno. Em algumas modalidades, a resposta imune indu- zida ou provocada pode ser uma resposta imune celular, humoral ou tanto celular quanto humoral. Em algumas modalidades, a resposta imune celular induzida ou provocada pode incluir indução ou secreção de interferon gama (IFN-γ) e/ou fator de necrose tumoral alfa (TNF-α) e/ou interleucina 2 (IL-2). Em outras modalidades, a resposta imune in- duzida ou provocada pode reduzir ou inibir um ou mais fatores de imu- nossupressão que promovem o crescimento do tumor ou câncer que expressa o antígeno, por exemplo, mas não limitados a fatores que su-

prarregulam a apresentação de MHC, fatores que suprarregulam as cé- lulas T reguladoras específicas de antígeno (Tregs), PD-L1, FasL,cito- cinas, como IL-10 e TFG-β, macrófagos associados a tumores, fi- broblastos associados a tumores, fatores solúveis produzidos por célu- las imunossupressoras, CTLA-4, PD-1, MDSCs, MCP-1 e uma molécula de ponto de verificação imune.

[00111] Numa modalidade particular, a vacina pode mediar a depu- ração ou impedir o crescimento de células tumorais (1) aumentando o linfócito T citotóxico, como CD8+ e/ou CD107a+ (CTL), para atacar e matar células tumorais; (2) aumentando as respostas das células T au- xiliares; e/ou (3) aumentando as respostas inflamatórias via IFN-γ, IL-2, TFN-α, ou preferencialmente todos os itens acima mencionados.

[00112] A vacina pode ser uma vacina de DNA. As vacinas de DNA são divulgadas nas Patentes U.S. 5.593.972, 5.739.118, 5.817.637,

5.830.876, 5.962.428, 5.981.505, 5.580.859, 5.703.055 e 5.676.594, que são aqui incorporadas totalmente por referência. A vacina de DNA pode compreender adicionalmente elementos ou reagentes que a ini- bem de integrar o cromossomo.

[00113] A vacina pode incluir um RNA que codifica o antígeno do câncer. A vacina de RNA pode ser introduzida na célula.

[00114] A vacina pode ser uma vacina viva atenuada, uma vacina que usa vetores recombinantes para administrar vacinas de antígeno, subunidades e glicoproteínas, por exemplo, mas não limitadas, às vaci- nas descritas nas Patentes U.S.: 4.510.245; 4.797.368; 4.722.848;

4.790.987; 4.920.209; 5.017.487; 5.077.044; 5.110.587; 5.112.749;

5.174.993; 5.223.424; 5.225.336; 5.240.703; 5.242.829; 5.294.441;

5.294.548; 5.310.668; 5.387.744; 5.389.368; 5.424.065; 5.451.499;

5.453.364; 5.462.734; 5,470,734; 5.474.935; 5.482.713; 5.591.439;

5.643.579; 5.650.309; 5.698.202; 5.955.088; 6.034.298; 6.042.836;

6.156.319 e 6.589.529, que são aqui incorporadas por referência.

[00115] Em algumas modalidades, a vacina de ácido nucleico pode ainda compreender a sequência de codificação para um adjuvante mo- lecular, em alguns casos o adjuvante molecular pode ser IL-12, IL-15, IL-28, IL-31, IL-33 e/ou RANTES e, em alguns casos, o adjuvante mo- lecular é um inibidor do ponto de verificação, incluindo o antígeno linfo- citário T anti-citotóxico 4 (CTLA-4), o receptor de morte anti-progra- mado-1 (PD-1) e o gene de ativação anti-linfócito (LAG-3). A sequência de codificação para IL-12, IL-15, IL-28, IL-31, IL-33 e/ou RANTES pode ser incluída em uma ou mais moléculas de ácido nucleico que compre- endem a sequência de codificação para um ou mais antígenos. A se- quência de codificação para IL-12, IL-15, IL-28, IL-31, IL-33 e/ou RAN- TES pode ser incluída em uma ou mais moléculas de ácido nucleico separadas, como um ou mais plasmídeos ou vetores separados, e ad- ministrada em combinação com a vacina de ácido nucleico.

[00116] As vacinas da presente invenção podem ter características requeridas das vacinas eficazes, tais como sendo seguras, de forma que a própria vacina não causa doença ou morte; sendo protetora contra doença; induzindo o anticorpo de neutralização; induzindo respostas de célula T de proteção; e fornecendo facilitação da administração, poucos efeitos colaterais, estabilidade biológica e baixo custo por dose. A va- cina pode realizar algumas ou todas essas características, contendo a(s) molécula(s) de ácido nucleico que codifica o antígeno do câncer, conforme discutido abaixo. Vacina Combinada com o Inibidor do Ponto de Verificação Imune

[00117] A vacina pode ainda compreender um ou mais inibidores de uma ou mais moléculas de ponto de verificação imune (isto é, um inibi- dor de ponto de verificação imune). As moléculas do ponto de verifica- ção imune são descritas abaixo em mais detalhes. O inibidor de ponto de verificação imune é qualquer ácido nucleico ou proteína que impeça a supressão de qualquer componente no sistema imunológico, tais como apresentação de classe de MHC, apresentação e/ou diferencia- ção de células T, apresentação e/ou diferenciação de células B e cito- cina, quimiocina ou sinalização para proliferação e/ou diferenciação de células imunes.

[00118] Um tal inibidor pode ser uma sequência de ácido nucleico, uma sequência de aminoácidos, uma molécula pequena ou uma com- binação das mesmas. A sequência de ácido nucleico pode ser DNA, RNA, cDNA, uma variante dos mesmos, um fragmento dos mesmos ou uma combinação dos mesmos. O ácido nucleico também pode incluir sequências adicionais que codificam sequências de ligantes ou de eti- quetas que estão ligadas ao inibidor do ponto de verificação imune por uma ligação peptídica. A molécula pequena pode ter um baixo peso mo- lecular, por exemplo, menos de 800 Daltons, composto orgânico ou inor- gânico que pode servir como substrato enzimático, ligando (ou análogo do mesmo) ligado por uma proteína ou ácido nucleico, ou regulador de um processo biológico. A sequência de aminoácido pode ser uma pro- teína, um peptídeo, uma variante dos mesmos, um fragmento dos mes- mos ou uma combinação dos mesmos.

[00119] Em algumas modalidades, o inibidor do ponto de verificação imune pode ser uma ou mais sequências de ácido nucleico que codifi- cam um anticorpo, uma variante dos mesmos, um fragmento dos mes- mos ou uma combinação dos mesmos. Em outras modalidades, o inibi- dor de ponto de verificação imune pode ser um anticorpo, uma variante dos mesmos, um fragmento dos mesmos ou uma combinação dos mes- mos. Molécula do Ponto de Verificação Imune

[00120] O inibidor de uma molécula de ponto de verificação imune pode ser uma sequência de ácido nucleico, uma sequência de aminoá- cidos, uma molécula pequena ou uma combinação dos mesmos. A se- quência de ácido nucleico pode ser DNA, RNA, cDNA, uma variante dos mesmos, um fragmento dos mesmos ou uma combinação dos mesmos. O ácido nucleico também pode incluir sequências adicionais que codifi- cam sequências de ligantes ou de etiquetas que estão ligadas ao inibi- dor do ponto de verificação imune por uma ligação peptídica. A molécula pequena pode ter um baixo peso molecular, por exemplo, menos de 800 Daltons, composto orgânico ou inorgânico que pode servir como subs- trato enzimático, ligando (ou análogo do mesmo) ligado por uma prote- ína ou ácido nucleico, ou regulador de um processo biológico. A sequên- cia de aminoácido pode ser uma proteína, um peptídeo, uma variante dos mesmos, um fragmento dos mesmos ou uma combinação dos mes- mos. a. PD-1 e PD-L1

[00121] A molécula do ponto de verificação imune pode programar a proteína de morte celular 1 (PD-1), ligando de morte celular programada 1 (PD-L1), um fragmento do mesmo, uma variante do mesmo ou uma combinação dos mesmos. PD-1 é uma proteína de superfície celular codificada pelo gene PDCD1. PD-1 é um membro da superfamília da imunoglobulina e é expressa em células T e células pró-B e, portanto, contribui para o destino e/ou diferenciação dessas células. Em particu- lar, PD-1 é uma proteína de membrana tipo 1 da família de reguladores de células T CD28/CTLA-4 e regula negativamente os sinais do receptor de células T (TCR), regulando negativamente as respostas imunes. PD- 1 pode regular negativamente as respostas das células T CD8+ e, as- sim, inibir a citotoxicidade mediada por CD8 e aumentar o crescimento do tumor.

[00122] PD-1 tem dois ligandos, PD-L1 e PD-L2, que são membros da família B7. PD-L1 é regulada em excesso em macrófagos e células dendríticas (DCs) em resposta ao tratamento com LPS e GM-CSF e em células T e células B mediante sinalização de receptores de células B e

TCR. PD-L1 é expressa por muitas linhagens de células tumorais, inclu- indo mielomas, mastocitomas e melanomas. Anticorpo da Molécula do Ponto de Verificação Anti-Imune

[00123] Como descrito acima, o inibidor do ponto de verificação imune pode ser um anticorpo. O anticorpo pode se ligar ou reagir com um antígeno (isto é, a molécula do ponto de verificação imune descrita acima). Por conseguinte, o anticorpo pode ser considerado um anticorpo da molécula de ponto de verificação anti-imune ou um anticorpo da mo- lécula de ponto de verificação imune. O anticorpo pode ser codificado por uma sequência de ácido nucleico contida nele.

[00124] O anticorpo pode incluir um polipeptídeo de cadeia pesada e um polipeptídeo de cadeia leve. O polipeptídeo de cadeia pesada pode incluir uma região variável de cadeia pesada (VH) e/ou pelo menos uma região constante de cadeia pesada (CH). A pelo menos uma região constante da cadeia pesada pode incluir uma região constante da ca- deia pesada 1 (CH1), uma região constante da cadeia pesada 2 (CH2) e uma região constante da cadeia pesada 3 (CH3) e/ou uma região de dobradiça.

[00125] Em algumas modalidades, o polipeptídeo de cadeia pesada pode incluir uma região VH e uma região CH1. Em outras modalidades, o polipeptídeo de cadeia pesada pode incluir uma região VH, uma região CH1, uma região de dobradiça, uma região CH2 e uma região CH3.

[00126] O polipeptídeo de cadeia pesada pode incluir um conjunto de regiões determinantes de complementaridade ("CDR"). O conjunto de CDR pode conter três regiões hipervariáveis da região VH. Procedendo do terminal N do polipeptídeo da cadeia pesada, essas CDRs são de- notadas "CDR1", "CDR2" e "CDR3", respectivamente. CDR1, CDR2 e CDR3 do polipeptídeo da cadeia pesada podem contribuir para a ligação ou reconhecimento do antígeno.

[00127] O polipeptídeo de cadeia leve pode incluir uma região de ca- deia leve variável (VL) e/ou uma região de cadeia leve constante (CL). O polipeptídeo de cadeia leve pode incluir um conjunto de regiões de- terminantes de complementaridade ("CDR"). O conjunto de CDR pode conter três regiões hipervariáveis da região VL. Continuando do terminal N do polipeptídeo da cadeia leve, essas CDRs são denotadas "CDR1", "CDR2" e "CDR3", respectivamente. CDR1, CDR2 e CDR3 do polipep- tídeo da cadeia leve podem contribuir para a ligação ou reconhecimento do antígeno.

[00128] O anticorpo pode compreender um conjunto de regiões de- terminantes de complementaridade de cadeia pesada e cadeia leve ("CDR"), interposto respectivamente entre um conjunto de cadeia pe- sada e uma estrutura de cadeia leve ("FR") que fornece suporte às CDRs e define a relação espacial das CDRs uma em relação à outra. O conjunto de CDR pode conter três regiões hipervariáveis de uma região V de cadeia pesada ou leve. Continuando do terminal N de uma cadeia pesada ou leve, essas regiões são indicadas como "CDR1", "CDR2" e "CDR3", respectivamente. Um sítio de ligação ao antígeno, portanto, pode incluir seis CDRs, compreendendo o conjunto de CDR de cada região V de cadeia pesada e leve.

[00129] O anticorpo pode ser uma imunoglobulina (Ig). A Ig pode ser, por exemplo, IgA, IgM, IgD, IgE e IgG. A imunoglobulina pode incluir o polipeptídeo de cadeia pesada e o polipeptídeo de cadeia leve. O poli- peptídeo de cadeia pesada da imunoglobulina pode incluir uma região VH, uma região CH1, uma região de dobradiça, uma região CH2 e uma região CH3. O polipeptídeo de cadeia leve da imunoglobulina pode in- cluir uma região VL e uma região CL.

[00130] Adicionalmente, a enzima proteolítica papaína cliva preferi- velmente as moléculas de IgG para produzir vários fragmentos, dois dos quais (os fragmentos F (ab)) compreendem cada um heterodímero co- valente que inclui um sítio de ligação ao antígeno intacto. A enzima pep- sina é capaz de clivar moléculas de IgG para fornecer vários fragmen- tos, incluindo o fragmento F (ab')2, que compreende os dois sítios de ligação ao antígeno. Por conseguinte, o anticorpo pode ser o Fab ou F(ab’)2. O Fab pode incluir o polipeptídeo de cadeia pesada e o polipep- tídeo de cadeia leve. O polipeptídeo de cadeia pesada do Fab pode in- cluir a região VH e a região CH1. A cadeia leve do Fab pode incluir a região VL e a região CL.

[00131] O anticorpo pode ser um anticorpo policlonal ou monoclonal. O anticorpo pode ser um anticorpo quimérico, um anticorpo de cadeia única, um anticorpo amadurecido por afinidade, um anticorpo humano, um anticorpo humanizado ou um anticorpo totalmente humano. O anti- corpo humanizado pode ser um anticorpo de uma espécie não humana que se liga ao antígeno desejado com uma ou mais regiões determinan- tes de complementaridade (CDRs) da espécie não humana e regiões estruturais de uma molécula de imunoglobulina humana. Anticorpo PD-1

[00132] O anticorpo da molécula de ponto de verificação anti-imune pode ser um anticorpo anti-PD-1 (também aqui referido como "anticorpo PD-1"), uma variante do mesmo, um fragmento do mesmo ou uma com- binação dos mesmos. O anticorpo PD-1 pode ser o Nivolumabe. O an- ticorpo anti-PD-1 pode inibir a atividade de PD-1, induzindo, provocando ou aumentando uma resposta imune contra um tumor ou câncer e dimi- nuindo o crescimento do tumor. Anticorpo PD-L1

[00133] O anticorpo da molécula de ponto de verificação anti-imune pode ser um anticorpo anti-PD-L1 (também aqui referido como "anti- corpo PD-L1"), uma variante do mesmo, um fragmento do mesmo ou uma combinação dos mesmos. O anticorpo anti-PD-L1 pode inibir a ati- vidade de PD-L1, induzindo, provocando ou aumentando uma resposta imune contra um tumor ou câncer e diminuindo o crescimento do tumor. Antígenos

[00134] Como descrito acima, a vacina pode compreender um antí- geno ou um ácido nucleico que codifica um antígeno. O antígeno pode ser Survivina, um fragmento do mesmo, uma variante do mesmo ou uma combinação de um fragmento e uma variante do mesmo.

[00135] Consequentemente, a vacina pode ser usada para tratar su- jeitos que sofrem de cânceres ou tumores que expressam Survivina. Em algumas modalidades, o câncer é câncer de ovário. Em algumas moda- lidades, o câncer de ovário é câncer de ovário epitelial. O câncer de ovário pode ser um câncer de ovário epitelial seroso. A vacina também pode ser usada para tratar indivíduos com câncer ou tumores que ex- pressam Survivina para impedir o desenvolvimento de tais tumores em indivíduos. O antígeno de Survivina de consenso sintético pode diferir do gene de Survivina nativo e, portanto, fornecer terapia ou profilaxia contra um tumor que expressa antígeno de Survivina de consenso sin- tético. Por conseguinte, são fornecidas aqui sequências de antígeno de Survivina de consenso sintético que diferem do gene de Survivina nativo (isto é, genes ou sequências de Survivina mutadas ou sintéticas).

[00136] Os transcritos do gene de Survivina nativo são processados em uma variedade de mRNAs. As isoformas de mRNA de Survivina es- pecíficas podem ser selecionadas com base, por exemplo, na sua ex- pressão em células cancerígenas. Em modalidades particulares, a iso- forma de Survivina é selecionada com base em sua expressão em cé- lulas de câncer de ovário. As sequências de antígeno de Survivina de consenso sintético aqui descritas evitam processamento alternativo, produzindo um transcrito completo e resultando em indução mais forte de respostas efetoras das células T e B.

[00137] Moléculas de ácido nucleico isoladas compreendendo as se- quências heterólogas descritas acima são fornecidas. São fornecidas moléculas de ácido nucleico isoladas que consistem nas sequências he- terólogas descritas acima. Moléculas de ácido nucleico isoladas com- preendendo as sequências heterólogas descritas acima podem ser in- corporadas em vetores como plasmídeos, vetores virais e outras formas de moléculas de ácido nucleico, como descrito abaixo. São fornecidas aqui sequências de ácidos nucleicos que codificam antígenos de Survi- vina de consenso sintético. As sequências de codificação que codificam antígenos de Survivina de consenso sintético têm as sequências como descrito acima.

[00138] Moléculas de proteína compreendendo as sequências de aminoácidos heterólogos descritas acima são fornecidas. São forneci- das moléculas de proteína que consistem nas sequências de aminoáci- dos heterólogos descritas acima. São aqui fornecidas proteínas e poli- peptídeos que possuem as sequências descritas acima. As proteínas e o polipeptídeo podem ser referidos como antígenos de Survivina de con- senso sintético e imunógenos de Survivina. Os antígenos de Survivina de consenso sintético são capazes de provocar uma resposta imune contra tumores que expressam Survivina.

[00139] Em um aspecto, é desejável que o antígeno de Survivina de consenso sintético forneça transcrição e tradução aprimoradas, inclu- indo um ou mais dos seguintes itens: sequência líder de baixo teor de GC para aumentar a transcrição; estabilidade do mRNA e otimização do códon; e, na medida do possível, eliminação dos motivos de sequência de ação cis (isto é, caixas-TATA internas).

[00140] O antígeno de consenso de Survivina sintético pode ser uma sequência de antígeno de consenso (ou imunógeno) derivada de duas ou mais espécies, isoformas ou variantes. Numa modalidade, uma se-

quência de consenso é gerada a partir de isoformas Survivina de dife- rentes espécies. A sequência de consenso é derivada das sequências de Survivina coletadas do GenBank ou outro banco de dados seme- lhante de sequência de DNA ou proteína. Em algumas modalidades, o antígeno de consenso pode compreender uma porção de uma primeira isoforma combinada com uma porção de uma segunda isoforma, a por- ção da segunda isoforma, por exemplo, sendo não homóloga com qual- quer porção da primeira isoforma. O antígeno de Survivina de consenso sintético pode compreender uma sequência de consenso e/ou modifica- ção(ões) para melhorar a expressão. A modificação pode incluir otimi- zação de códon, otimização de RNA, adição de uma sequência kozak (por exemplo, GCC ACC) para aumentar a iniciação da tradução e/ou a adição de uma sequência líder de imunoglobulina para aumentar a imu- nogenicidade do antígeno de Survivina de consenso sintético. O antí- geno de Survivina de consenso sintético pode compreender um peptí- deo sinal, como um peptídeo sinal de imunoglobulina, por exemplo, mas não limitado a, um peptídeo sinal imunoglobulina E (IgE) ou imunoglo- bulina G (IgG). Em algumas modalidades, o antígeno de Survivina de consenso sintético pode incluir mutações ou deleções nas sequências de sinais de localização, por exemplo, um sinal de localização nuclear, por exemplo, para interromper a localização nuclear na tradução. Em algumas modalidades, o antígeno de consenso de Survivina pode com- preender uma etiqueta de hemaglutinina (HA). O antígeno de consenso de Survivina pode ser projetado para obter respostas imunes celulares e/ou humorais mais fortes e mais amplas do que um antígeno de Survi- vina otimizado por não códon correspondente.

[00141] A sequência de consenso de Survivina pode ser mutada para interromper e/ou aprimorar estruturas e/ou funções particulares de Sur- vivina nativo para produzir uma sequência de antígeno de Survivina de consenso sintético. Numa modalidade, são introduzidas mutações para abolir a atividade antiapoptótica de Survivina. Numa modalidade espe- cífica, as mutações T34A, T48A e C84A são introduzidas na sequência de consenso da isoforma 1 da Survivina para abolir a função antiapop- tótica. (Ver Muchmore, S. W. et al. Crystal structure and mutagenic anal- ysis of the inhibitor-of-apoptosis protein Survivin. Molecular cell 6, 173- 182 (2000); O'Connor, D. S. et al. Regulation of apoptosis at cell division by p34cdc2 phosphorylation of Survivin. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America 97, 13103-13107, doi:10.1073/pnas.240390697 (2000); Barrett, R. M., Colnaghi, R. & Wheatley, S. P. Threonine 48 in the BIR domain of Survivin is critical to its mitotic and anti-apoptotic activities and can be phosphorylated by CK2 in vitro. Cell cycle (Georgetown, Tex.) 10, 538-548 (2011).)

[00142] Em algumas modalidades, a sequência de antígeno de Sur- vivina de consenso sintético pode ser gerada a partir de uma isoforma, por exemplo, a isoforma de Survivina dominante, ou a sequência de consenso pode compreender uma combinação de uma porção de uma primeira isoforma e uma porção de uma segunda isoforma, ou uma por- ção truncada de uma segunda isoforma. Numa modalidade, a sequên- cia de consenso sintético é derivada da isoforma 1 de Survivina (Survi- vina 1). Numa outra modalidade, a sequência de consenso sintético é derivada da isoforma 3 de Survivina (Survivina 3). Numa modalidade, a sequência do antígeno de Survivina 3 de consenso sintético é uma por- ção truncada da Survivina 3 (Survivina 3T). Numa modalidade, a se- quência de consenso sintético é uma combinação de Survivina 1 e Sur- vivina T3, ou Survivina 1T3.

[00143] Numa modalidade preferida, a sequência de antígeno de Survivina de consenso sintético compartilha 95,0% ou mais de identi- dade com a SEQ ID NO:1 ou SEQ ID NO:3. Nesta modalidade, a se- quência de ácido nucleico da SEQ ID NO:1 ou SEQ ID NO:3 codifica uma sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:2 ou SEQ ID NO:8, res- pectivamente. Em outras modalidades, a sequência de antígeno de Sur- vivina de consenso sintético compartilha 95,0% ou mais de identidade, 95,2% ou mais de identidade, 95,4% ou mais de identidade, 95,6% ou mais de identidade, 95,8% ou mais de identidade, 96,0% ou mais de identidade, 96,2% ou mais de identidade mais identidade, 96,4% ou mais identidade, 96,6% ou mais identidade, 96,8% ou mais identidade, 97,0% ou mais identidade, 97,2% ou mais identidade, 97,4% ou mais identidade, 97,6% ou mais identidade, 97,8% ou mais identidade, 98,0% ou mais de identidade, 98,2% ou mais de identidade, 98,4% ou mais de identidade, ou 98,6% ou mais de identidade, 98,8% ou mais de identi- dade, 99,0% ou mais de identidade, 99,2% ou mais de identidade, 99,4% ou mais de identidade, 99,6% ou mais de identidade, 99,8% ou mais de identidade ou 100% de identidade com a SEQ ID NO:1 ou SEQ ID NO:3. Vetores

[00144] A vacina pode compreender um ou mais vetores que incluem um ácido nucleico heterólogo que codifica o antígeno de Survivina de consenso sintético. Os um ou mais vetores podem ser capazes de ex- pressar o antígeno em uma quantidade eficaz para provocar uma res- posta imune no mamífero. O vetor pode compreender ácido nucleico heterólogo que codifica o antígeno. O vetor pode ter uma sequência de ácido nucleico contendo uma origem de replicação. O vetor pode ser um plasmídeo, bacteriófago, cromossomo artificial bacteriano ou cromos- somo artificial de levedura. O vetor pode ser um vetor cromossômico extra de autorreplicação ou um vetor que se integra ao genoma do hos- pedeiro.

[00145] Os um ou mais vetores podem ser um construto de expres- são, que geralmente é um plasmídeo usado para introduzir um gene específico em uma célula alvo. Uma vez que o vetor de expressão esteja dentro da célula, a proteína que é codificada pelos complexos ribossô- micos de máquina de transcrição e tradução celular. O plasmídeo é fre- quentemente engenheirado para conter sequências reguladoras que atuam como regiões intensificadoras e promotoras e levam à transcrição eficiente do gene transportado no vetor de expressão. Os vetores da presente invenção expressam grandes quantidades de RNA mensa- geiro estável e, portanto, proteínas.

[00146] Os vetores podem ter sinais de expressão como um promo- tor forte, um códon de terminação forte, ajuste da distância entre o pro- motor e o gene clonado e a inserção de uma sequência de terminação de transcrição e uma PTIS (sequência de iniciação de tradução portátil).

[00147] O vetor pode ser um plasmídeo circular ou um ácido nucleico linear. O plasmídeo circular e o ácido nucleico linear são capazes de direcionar a expressão de uma sequência nucleotídica específica em uma célula em questão apropriada. O vetor pode ter um promotor ope- racionalmente ligado à sequência nucleotídica que codifica o antígeno, que pode estar operacionalmente ligada aos sinais de terminação. O vetor também pode conter sequências necessárias para a tradução ade- quada da sequência nucleotídica, bem como sequências para clonar e subclonar o vetor e fragmentos dos mesmos. O vetor compreendendo a sequência nucleotídica de interesse pode ser quimérico, significando que pelo menos um de seus componentes é heterólogo em relação a pelo menos um de seus outros componentes. A expressão da sequência nucleotídica na cassete de expressão pode estar sob o controle de um promotor constitutivo ou de um promotor induzível, que inicia a transcri- ção apenas quando a célula hospedeira é exposta a algum estímulo ex- terno específico. No caso de um organismo multicelular, o promotor tam- bém pode ser específico para um tecido ou órgão ou estágio de desen- volvimento específico. Numa modalidade preferida, o vetor de plasmí- deo é pGX1428 aqui descrito, compreendendo ainda a sequência de ácido nucleico da SEQ ID NO:1; ou pGX1429 aqui descrito, compreen- dendo ainda a sequência de ácido nucleico da SEQ ID NO:3.

[00148] O vetor pode ser um plasmídeo. O plasmídeo pode ser útil para transfectar células com ácido nucleico que codifica o antígeno. As células hospedeiras transformadas podem ser cultivadas e mantidas sob condições em que a expressão do antígeno ocorre.

[00149] O plasmídeo pode compreender uma sequência de ácido nu- cleico que codifica um ou mais dos vários antígenos divulgados acima, incluindo sequências de codificação que codificam antígeno de con- senso sintético capaz de provocar uma resposta imune contra um antí- geno, fragmentos dessas proteínas, variantes dessas proteínas, frag- mentos de variantes ou proteínas de fusão que são constituídos por combinações de proteínas de consenso e/ou fragmentos de proteína de consenso e/ou variantes de proteína de consenso e/ou fragmentos de proteínas de consenso de variantes.

[00150] Um único plasmídeo pode conter sequência de codificação para um único antígeno, sequência de codificação para dois antígenos, sequência de codificação para três antígenos ou sequência de codifica- ção para quatro antígenos.

[00151] Em algumas modalidades, um plasmídeo pode ainda com- preender a sequência de codificação que codifica o CCR20 sozinho ou como parte de um desses plasmídeos. Da mesma forma, os plasmídeos podem ainda compreender sequências de codificação para IL-12, IL-15 e/ou IL-28.

[00152] O plasmídeo pode ainda compreender um códon de inicia- ção, que pode estar a montante da sequência de codificação, e um có- don de parada, que pode estar a jusante da sequência de codificação. O códon de iniciação e terminação pode estar in frame com a sequência de codificação.

[00153] O plasmídeo também pode compreender um promotor que está operacionalmente ligado à sequência de codificação. O promotor operacionalmente ligado à sequência de codificação pode ser um pro- motor do vírus símio 40 (SV40), um promotor do vírus do tumor mamário do camundongo (MMTV), um vírus da imunodeficiência humana (HIV ), como o promotor de repetição terminal longa (LTR) do vírus da imuno- deficiência bovina (BIV), um promotor do vírus Moloney, um promotor do vírus da leucose aviária (ALV), um promotor do citomegalovírus (CMV), como o promotor imediato do CMV, vírus Epstein Barr (EBV) ou um promotor do vírus do sarcoma de Rous (RSV). O promotor também pode ser um promotor de um gene humano, como actina humana, mio- sina humana, hemoglobina humana, creatina muscular humana ou me- talotioneína humana. O promotor também pode ser um promotor espe- cífico de tecido, tal como um promotor específico de músculo ou pele, natural ou sintético. Exemplos de tais promotores são descritos na pu- blicação do pedido de patente dos EUA nº US20040175727, cujo con- teúdo é aqui incorporado na sua totalidade.

[00154] O plasmídeo também pode compreender um sinal de polia- denilação, que pode estar a jusante da sequência de codificação. O si- nal de poliadenilação pode ser um sinal de poliadenilação SV40, sinal de poliadenilação LTR, sinal de poliadenilação de hormônio de cresci- mento bovino (bGH), sinal de poliadenilação do hormônio do cresci- mento humano (hGH) ou sinal de poliadenilação de β-globina humana. O sinal de poliadenilação SV40 pode ser um sinal de poliadenilação de um plasmídeo pCEP4 (Invitrogen, San Diego, CA).

[00155] O plasmídeo também pode compreender um potenciador a montante da sequência de codificação. O intensificador pode ser actina humana, miosina humana, hemoglobina humana, creatina muscular hu- mana ou um intensificador viral como um de CMV, FMDV, RSV ou EBV. Os intensificadores da função de polinucleotídeo são descritos nas Pa- tentes U.S. 5.593.972, 5.962.428 e WO94/016737, cujos conteúdos está totalmente incorporado por referência.

[00156] O plasmídeo também pode compreender uma origem de re- plicação em mamíferos, a fim de manter o plasmídeo extracromossô- mica e produzir várias cópias do plasmídeo em uma célula. O plasmídeo pode ser pVAXI, pCEP4 ou pREP4 da Invitrogen (San Diego, CA), que pode compreender a origem de replicação do vírus Epstein-Barr e da região de codificação EBNA-1 do antígeno nuclear, que pode produzir replicação epissômica de alta cópia sem integração. A espinha dorsal do plasmídeo pode ser pA V0242. O plasmídeo pode ser um plasmídeo de adenovírus do tipo 5 (Ad5) com defeito de replicação.

[00157] O plasmídeo também pode compreender uma sequência re- guladora, que pode ser bem adequada para a expressão genética em uma célula na qual o plasmídeo é administrado. A sequência de codifi- cação pode compreender um códon que pode permitir a transcrição mais eficiente da sequência de codificação na célula hospedeira.

[00158] A sequência de codificação também pode compreender uma sequência líder de Ig. A sequência líder pode estar 5' da sequência de codificação. Os antígenos de consenso codificados por esta sequência podem compreender um líder de Ig do terminal N seguido por uma pro- teína de antígeno de consenso. O líder de Ig do terminal N pode ser IgE ou IgG.

[00159] O plasmídeo pode ser pSE420 (Invitrogen, San Diego, Cali- fórnia), que pode ser usado para a produção de proteína em Escherichia coli (E.coli). O plasmídeo também pode ser p YES2 (Invitrogen, San Di- ego, Calif.), que pode ser utilizado para produção de proteínas em cepas de levedura de Saccharomyces cerevisiae. O plasmídeo também pode ser o sistema de expressão baculovírus completo MAXBAC™ (Invitro- gen, San Diego, Califórnia), que pode ser usado para a produção de proteína em células de insetos. O plasmídeo também pode ser pcDNA I ou pcDNA3 (Invitrogen, San Diego, Califórnia), que pode ser usado para a produção de proteína em células de mamíferos, tais como células de ovário de hamster chinês (CHO).

[00160] O vetor pode ser circular, o que pode transformar uma célula alvo por integração no genoma celular ou existir extracromossômica (por exemplo, plasmídeo replicador autônomo com origem de replica- ção).

[00161] O vetor pode ser pVAX, pcDNA3.0 ou provax ou qualquer outro vetor de expressão capaz de expressar DNA que codifica o antí- geno e permitir que uma célula traduza a sequência em um antígeno que seja reconhecido pelo sistema imunológico.

[00162] Também é aqui fornecida uma vacina linear de ácido nu- cleico, ou cassete de expressão linear ("LEC"), que é capaz de ser dis- tribuída de maneira eficiente a um sujeito por eletroporação e expressar um ou mais antígenos desejados. O LEC pode ser qualquer DNA linear desprovido de qualquer espinha dorsal de fosfato. O DNA pode codificar um ou mais antígenos. O LEC pode conter um promotor, um íntron, um códon de parada e/ou um sinal de poliadenilação. A expressão do antí- geno pode ser controlada pelo promotor. O LEC não pode conter ne- nhum gene de resistência a antibióticos e/ou um espinha dorsal de fos- fato. O LEC pode não conter outras sequências de ácidos nucleicos não relacionadas à expressão genética de antígeno desejada.

[00163] O LEC pode ser derivado de qualquer plasmídeo capaz de ser linearizado. O plasmídeo pode ser capaz de expressar o antígeno. O plasmídeo pode ser pNP (Puerto Rico/34) ou pM2 (New Caledo- nia/99). O plasmídeo pode ser WLV009, pVAX, pcDNA3.0 ou provax ou qualquer outro vetor de expressão capaz de expressar DNA que codifica o antígeno e permitir que uma célula traduza a sequência em um antí- geno que seja reconhecido pelo sistema imunológico.

[00164] O LEC pode ser pcrM2. O LEC pode ser pcrNP. O pcrNP e o pcrMR podem ser derivados de pNP (Puerto Rico/34) e pM2 (New

Caledonia/99), respectivamente.

[00165] O vetor pode ter um promotor. Um promotor pode ser qual- quer promotor que seja capaz de dirigir a expressão genética e regular a expressão do ácido nucleico isolado. Esse promotor é um elemento de sequência de ação cis necessário para a transcrição via RNA poli- merase dependente de DNA, que transcreve a sequência de antígeno aqui descrita. A seleção do promotor usado para direcionar a expressão de um ácido nucleico heterólogo depende da aplicação particular. O pro- motor pode ser posicionado aproximadamente na mesma distância do início da transcrição no vetor, uma vez que é a partir do local de início da transcrição em seu cenário natural. No entanto, a variação nessa distância pode ser acomodada sem perda da função do promotor.

[00166] O promotor pode ser operacionalmente ligado à sequência de ácido nucleico que codifica o antígeno e os sinais necessários para a poliadenilação eficiente do transcrito, dos sítios de ligação ao ribos- somo e da terminação da tradução.

[00167] O promotor pode ser um promotor de CMV, promotor pre- coce de SV40, promotor posterior de SV40, promotor de metalotioneína, promotor de vírus de tumor mamário murino, promotor de vírus de sar- coma Rous, promotor de poliedrina ou outro promotor mostrado eficaz para expressão em células eucarióticas.

[00168] O vetor pode incluir um intensificador e um íntron com sítios funcionais de doador e aceitador de emenda. O vetor pode conter uma região de terminação de transcrição a jusante do gene estrutural para proporcionar uma terminação eficiente. A região de terminação pode ser obtida do mesmo gene que a sequência do promotor ou pode ser obtida de genes diferentes. Métodos de preparação do vetor

[00169] São aqui fornecidos métodos para preparar o vetor que com- preende as moléculas de ácido nucleico que codificam o antígeno de

Survivina de consenso sintético discutidas aqui. O vetor, após a etapa final de subclonagem, podem ser usados para inocular uma cultura de células em um tanque de fermentação em grande escala, usando mé- todos conhecidos na técnica.

[00170] O vetor para uso com os dispositivos EP, que são descritos abaixo em mais detalhes, pode ser formulado ou fabricado usando uma combinação de dispositivos e técnicas conhecidas, mas de preferência eles são fabricados usando uma técnica otimizada de fabricação de plasmídeo, descrita em uma pedido provisório U.S. licenciado U.S. 60/939.792, depositado em 23 de maio de 2007 (ver Pub. Pat. U.S. 20090004716). Em alguns exemplos, os vetores de DNA usados nestes estudos podem ser formulados em concentrações maiores ou iguais a 10 mg/mL. As técnicas de fabricação também incluem ou incorporam vários dispositivos e protocolos que são comumente conhecidos pelos versados na técnica, além dos descritos em U.S. 60/939792, incluindo os descritos em uma Patente U.S. 7.238.522, emitida em 3 de julho de

2007. O pedido e a patente mencionados anteriormente, U.S. 60/939.792 e a Patente U.S. 7.238.522, respectivamente, são incorpo- rados na sua totalidade. Excipientes e outros componentes da vacina

[00171] A vacina pode ainda compreender um excipiente farmaceu- ticamente aceitável. O excipiente farmaceuticamente aceitável pode ser uma molécula funcional, como um veículo, transportador ou diluente. O excipiente farmaceuticamente aceitável pode ser um agente facilitador de transfecção, que pode incluir agentes ativos de superfície, tais como complexos imunoestimulantes (ISCOMS), adjuvante incompleto de Freund, análogo de LPS incluindo lipídeo A de monofosforil, peptídeos muramil, análogos de quinona, vesículas, tais como esqualeno e esqua- leno, ácido hialurônico, lipídeos, lipossomas, íons de cálcio, proteínas virais, poliânions, policátions, ou nanopartículas, ou outros agentes fa- cilitadores de transfecção conhecidos.

[00172] O agente facilitador de transfecção é um poliânion, policá- tion, incluindo poli-L-glutamato (LGS) ou lipídeo. O agente facilitador da transfecção é o poli-L-glutamato, e o poli-L-glutamato pode estar pre- sente na vacina a uma concentração inferior a 6 mg/ml. O agente facili- tador de transfecção também pode incluir agentes ativos de superfície, tais como os complexos imunoestimulantes (ISCOMS), adjuvante in- completo de Freunds, análogos de LPS incluindo o lipídeo A de mono- fosforil, peptídeos muramil, análogos da quinona e vesículas, tais como esqualeno e esqualeno, e o ácido hialurônico pode ser administrado em conjunto com o construto genético. As vacinas de vetor de DNA também pode incluir um agente facilitador da transfecção, como lipídios, liposso- mos, incluindo lipossomos de lecitina ou outros lipossomos conhecidos na técnica, como uma mistura DNA-lipossomo (ver, por exemplo, W09324640), íons cálcio, proteínas virais, poliânions, policátions ou na- nopartículas ou outros agentes facilitadores da transfecção conhecidos. O agente facilitador de transfecção é um poliânion, policátion, incluindo poli-L-glutamato (LGS) ou lipídeo. A concentração do agente de trans- fecção na vacina é de menos de 4 mg/ml, menos de 2 mg/ml, menos de 1 mg/ml, menos de 0,750 mg/ml, menos de 0,500 mg/ml, menos de 0,250 mg/ml, menos de 0,100 mg/ml, menos de 0,050 mg/ml, ou menos de 0,010 mg/ml.

[00173] O excipiente farmaceuticamente aceitável pode ser um ou mais adjuvantes. Os adjuvantes podem ser outros genes que são ex- pressos em um vetor alternativo ou são distribuídos como proteínas em combinação com o vetor acima na vacina. Os um ou mais adjuvantes podem ser selecionados do grupo que consiste em: CCL20, interferon- α (IFN-α), interferon-β (IFN-β), interferon γ, fator de crescimento deri- vado de plaquetas (PDGF), TNFα, TNFβ, GM-CSF, fator de crescimento epidérmico (EGF), quimiocina cutânea que atrai células T (CTACK), qui- miocina epitelial expressa em timo (TECK), quimiocina epitelial associ- ada a mucosas (MEC), IL-12, IL-15, IL-28, MHC, CD80, CD86, IL-l, IL- 2, IL-4, IL-5, IL-6, IL-10, IL-18, IL-33, MCP-1, MIP-la, MIP-1~, IL-8, L- selectina, P-selectina, E-selectina, CD34, GlyCAM-1, MadCAM-1, LFA- 1, VLA-1, Mac-1, pl50.95, PECAM, ICAM-1, ICAM-2, ICAM-3, CD2, LFA-3, M-CSF, G-CSF, formas mutantes de IL-18, CD40, CD40L, fator de crescimento vascular, fator de crescimento de fibroblastos, IL-7, fator de crescimento de nervos, fator de crescimento endotelial vascular, Fas, receptor de TNF, Flt, Apo-1, p55, WSL-1, DR3, TRAMP, Apo-3, AIR, LARD, NGRF, DR4, DRS, KILLER, TRAIL-R2, TRICK2, DR6, Caspase ICE, Fos, c-jun, Sp-1, Ap-1, Ap-2, p38, p65Rel, MyD88, IRAK, TRAF6, IkB, NIK inativo, SAP K, SAP-I, JNK, genes de resposta a interferon, NFkB, Bax, TRAIL, TRAILrec, TRAILrecDRC5, TRAIL-R3, TRAIL-R4, RANK, RANK LIGAND, Ox40, Ox40 LIGAND, NKG2D, MICA, MICB, NKG2A, NKG2B, NKG2C, NKG2E, NKG2F, TAPI, TAP2, IL-15 tendo a sequência sinal ou sequência de codificação que codifica a sequência sinal excluída e, opcionalmente, incluindo um peptídeo de sinal dife- rente, como aquele de IgE, ou a sequência de codificação que codifica um peptídeo de sinal diferente, como aquele de IgE, e fragmentos fun- cionais dos mesmos, ou uma combinação dos mesmos. O adjuvante pode ser IL-12, IL-15, IL-28, CTACK, TECK, fator de crescimento deri- vado de plaquetas (PDGF), TNF, TNF, GM-CSF, fator de crescimento epidérmico (EGF), IL-1, IL-2, IL-4, IL-5, IL-6, IL-10, IL-12, IL-18 ou uma combinação dos mesmos.

[00174] Em algumas modalidades, o adjuvante pode ser uma ou mais moléculas de ácido nucleico que codificam proteínas selecionadas do grupo que consiste em: CCL-20, IL-12, IL-15, IL-28, CTACK, TECK, MEC ou RANTES. Exemplos de construtos e sequências de IL-12 são divulgados no pedido PCT no. PCT/US 1997/019502 e Pedido US

08/956.865, e Pedido Provisório U.S. 61/569600 depositado em 12 de dezembro de 2011, cada um aqui incorporado por referência. Exemplos de construtos e sequências de IL-15 são divulgados no pedido PCT PCT/US04/18962 e Pedido U.S. correspondente 10/560.650 e no pe- dido PCT PCT/US07/00886 e Pedido U.S. correspondente 12/160.766, e no pedido PCT PCT/US10/048827, que são cada um aqui incorpora- dos por referência. Exemplos de construtos e sequências de IL-28 são divulgados no pedido PCT PCT/US09/039648 e Pedido U.S. correspon- dente 12/936.192, que são aqui incorporados por referência. Exemplos de RANTES e outros construtos e sequências são divulgados no pedido PCT No. PCT/US1999/004332 e Pedido U.S. correspondente 09/622.452, que são aqui incorporados por referência. Outros exemplos de construtos e sequências RANTES são divulgados no pedido PCT PCT/US11/024098, que é aqui incorporado por referência. Exemplos de RANTES e outros construtos e sequências são divulgados no pedido PCT No. PCT/US1999/004332 e Pedido U.S. correspondente 09/622.452, que são aqui incorporados por referência. Outros exemplos de construtos e sequências RANTES são divulgados no pedido PCT PCT/US11/024098, que é aqui incorporado por referência. Exemplos de quimiocinas construtos e sequências CTACK, TECK e MEC são divul- gados no pedido PCT PCT/US2005/042231 e Pedido U.S. correspon- dente 11/719.646, que são aqui incorporados por referência. Exemplos de OX40 e outros imunomoduladores são divulgados no Pedido U.S. 10/560.653, que é aqui incorporado por referência. Exemplos de DR5 e outros imunomoduladores são divulgados no Pedido U.S. 09/622.452, que é aqui incorporado por referência.

[00175] Outros genes que podem ser úteis como adjuvantes incluem os que codificam: MCP-1, MIP-la, MIP-1p, IL-8, RANTES, L-selectina, P-selectina, E-selectina, CD34, GlyCAM-1, MadCAM-1, LFA-1, VLA-1, Mac-1, pl50.95, PECAM, ICAM-1, ICAM-2, ICAM-3, CD2, LFA-3, M-

CSF, G-CSF, IL-4, formas mutantes de IL-18, CD40, CD40L, fator de crescimento vascular, fator de crescimento do fibroblasto, IL- 7, IL-22, fator de crescimento do nervo, fator de crescimento endotelial vascular, Fas, receptor do TNF, Flt, Apo-1, p55, WSL-1, DR3, TRAMP, Apo-3, AIR, LARD, NGRF, DR4, DR5, KILLER, TRAIL-R2, TRICK2, DR6, Cas- pase ICE, Fos, c-jun, Sp-1, Ap-1, Ap-2, p38, p65Rel, MyD88, IRAK, TRAF6, IkB, NIK inativa, SAP K, SAP-1, JNK, genes de resposta a in- terferon, NFkB, Bax, TRAIL, TRAILrec, TRAILrecDRC5, TRAIL-R3, TRAIL-R4, RANK, RANK LIGAND, Ox40, Ox40 LIGAND, NKG2D, MICA, MICB, NKG2A, NKG2B, NKG2C, NKG2E, NKG2F, TAP1, TAP2 e fragmentos funcionais dos mesmos.

[00176] A vacina pode ainda compreender um agente facilitador de vacina genético como descrito em U.S. 021.579 depositado em 1 de abril de 1994, o qual é totalmente incorporado por referência.

[00177] A vacina pode compreender os plasmídeos em quantidades de cerca de 1 nanograma a 100 miligramas; cerca de 1 micrograma a cerca de 10 miligramas; ou preferivelmente cerca de 0,1 micrograma a cerca de 10 miligramas; ou mais preferivelmente cerca de 1 miligrama a cerca de 2 miligramas. Em algumas modalidades preferidas, a vacina de acordo com a presente invenção compreende cerca de 5 nanogra- mas a cerca de 1.000 microgramas de DNA. Em algumas modalidades preferidas, a vacina pode conter cerca de 10 nanogramas a cerca de 800 microgramas de DNA. Em algumas modalidades preferidas, a va- cina pode conter cerca de 0,1 a cerca de 500 microgramas de DNA. Em algumas modalidades preferidas, a vacina pode conter cerca de 1 a cerca de 350 microgramas de DNA. Em algumas modalidades preferi- das, a vacina pode conter cerca de 25 a cerca de 250 microgramas, de cerca de 100 a cerca de 200 microgramas, de cerca de 1 nanograma a 100 miligramas; de cerca de 1 micrograma a cerca de 10 miligramas; de cerca de 0,1 micrograma a cerca de 10 miligramas; de cerca de 1 mili- grama a 2 miligramas, de cerca de 5 nanogramas a cerca de 1.000 mi- crogramas, de cerca de 10 nanogramas a cerca de 800 microgramas, de cerca de 0,1 a cerca de 500 microgramas, de cerca de 1 a 350 mi- crogramas, de 25 a 250 microgramas, de cerca de 100 a cerca de 200 microgramas do antígeno ou plasmídeo que codifica os mesmos.

[00178] A vacina pode ser formulada de acordo com o modo de ad- ministração a ser utilizado. Uma vacina injetável pode ser estéril, livre de pirogênio e livre de partículas. Uma formulação ou solução isotônica pode ser usada. Os aditivos para isotonicidade podem incluir cloreto de sódio, dextrose, manitol, sorbitol e lactose. A vacina pode compreender um agente de vasoconstrição. As soluções isotônicas podem incluir so- lução salina tamponada com fosfato. A vacina pode ainda compreender estabilizantes, incluindo gelatina e albumina. Os estabilizantes podem permitir que a formulação seja estável à temperatura da sala ou ambi- ente por longos períodos de tempo, incluindo LGS ou policátions ou po- liânions. Composições farmacêuticas da vacina

[00179] A vacina pode estar na forma de uma composição farmacêu- tica. A composição farmacêutica pode compreender a vacina. As com- posições farmacêuticas podem compreender cerca de 5 nanogramas (ng) até cerca de 10 miligramas (mg) da(s) molécula(s) de ácido nu- cleico da vacina. Em algumas modalidades, composições farmacêuticas de acordo com a presente invenção compreendem cerca de 25 ng a cerca de 5 mg da(s) molécula(s) de ácido nucleico da vacina. Em algu- mas modalidades, as composições farmacêuticas contêm cerca de 50 ng para cerca de 1 mg da(s) molécula(s) de ácido nucleico da vacina. Em algumas modalidades, as composições farmacêuticas contêm cerca de 0,1 a cerca de 500 microgramas da(s) molécula(s) de ácido nucleico da vacina. Em algumas modalidades, as composições farmacêuticas contêm cerca de 1 a cerca de 350 microgramas da(s) molécula(s) de ácido nucleico da vacina.

Em algumas modalidades, as composições farmacêuticas contêm cerca de 5 a cerca de 250 microgramas da(s) molécula(s) de ácido nucleico da vacina.

Em algumas modalidades, as composições farmacêuticas contêm cerca de 10 a cerca de 200 micro- gramas da(s) molécula(s) de ácido nucleico da vacina.

Em algumas mo- dalidades, as composições farmacêuticas contêm cerca de 15 a cerca de 150 microgramas da(s) molécula(s) de ácido nucleico da vacina.

Em algumas modalidades, as composições farmacêuticas contêm cerca de 20 a cerca de 100 microgramas da(s) molécula(s) de ácido nucleico da vacina.

Em algumas modalidades, as composições farmacêuticas con- têm cerca de 25 a cerca de 75 microgramas da(s) molécula(s) de ácido nucleico da vacina.

Em algumas modalidades, as composições farma- cêuticas contêm cerca de 30 a cerca de 50 microgramas da(s) molé- cula(s) de ácido nucleico da vacina.

Em algumas modalidades, as com- posições farmacêuticas contêm cerca de 35 a cerca de 40 microgramas da(s) molécula(s) de ácido nucleico da vacina.

Em algumas modalida- des, as composições farmacêuticas contêm cerca de 100 a cerca de 200 microgramas da(s) molécula(s) de ácido nucleico da vacina.

Em al- gumas modalidades, as composições farmacêuticas compreendem cerca de 10 microgramas a cerca de 100 microgramas de DNA da(s) molécula(s) de ácido nucleico da vacina.

Em algumas modalidades, as composições farmacêuticas compreendem cerca de 20 microgramas a cerca de 80 microgramas da(s) molécula(s) de ácido nucleico da vacina.

Em algumas modalidades, as composições farmacêuticas compreen- dem cerca de 25 microgramas a cerca de 60 microgramas de DNA da(s) molécula(s) de ácido nucleico da vacina.

Em algumas modalidades, as composições farmacêuticas compreendem cerca de 30 ng a cerca de 50 microgramas da(s) molécula(s) de ácido nucleico da vacina.

Em al- gumas modalidades, as composições farmacêuticas compreendem cerca de 35 ng a cerca de 45 microgramas da(s) molécula(s) de ácido nucleico da vacina. Em algumas modalidades preferidas, as composi- ções farmacêuticas contêm cerca de 0,1 a cerca de 500 microgramas da(s) molécula(s) de ácido nucleico da vacina. Em algumas modalida- des preferidas, as composições farmacêuticas contêm cerca de 1 a cerca de 350 microgramas da(s) molécula(s) de ácido nucleico da va- cina. Em algumas modalidades preferidas, as composições farmacêuti- cas contêm cerca de 25 a cerca de 250 microgramas da(s) molécula(s) de ácido nucleico da vacina. Em algumas modalidades preferidas, as composições farmacêuticas contêm cerca de 100 a cerca de 200 micro- gramas da(s) molécula(s) de ácido nucleico da vacina.

[00180] Em algumas modalidades, as composições farmacêuticas de acordo com a presente invenção compreendem pelo menos 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95 ou 100 ng de DNA da(s) molécula(s) de ácido nucleico da vacina. Em algumas moda- lidades, as composições farmacêuticas podem compreender pelo me- nos 1, 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95,100, 105, 110, 115, 120, 125, 130, 135, 140, 145, 150, 155, 160, 165, 170, 175, 180, 185, 190, 195, 200, 205, 210, 215, 220, 225, 230, 235, 240, 245, 250, 255, 260, 265, 270, 275, 280, 285, 290, 295, 300, 305, 310, 315, 320, 325, 330, 335, 340, 345, 350, 355, 360, 365, 370, 375, 380, 385, 390, 395, 400, 405, 410, 415, 420, 425, 430, 435, 440, 445, 450, 455, 460, 465, 470, 475, 480, 485, 490, 495, 500, 605, 610, 615, 620, 625, 630, 635, 640, 645, 650, 655, 660, 665, 670, 675, 680, 685, 690, 695, 700, 705, 710, 715, 720, 725, 730, 735, 740, 745, 750, 755, 760, 765, 770, 775, 780, 785, 790, 795, 800, 805, 810, 815, 820, 825, 830, 835, 840, 845, 850, 855, 860, 865, 870, 875, 880, 885, 890, 895. 900, 905, 910, 915, 920, 925, 930, 935, 940, 945, 950, 955, 960, 965, 970, 975, 980, 985, 990, 995 ou 1.000 microgramas da(s) molécula(s) de ácido nucleico da vacina. Em algumas modalidades, a composição farmacêutica pode compreender pelo menos 1,5, 2, 2,5, 3, 3,5, 4, 4,5, 5, 5,5, 6, 6,5, 7, 7,5, 8, 8,5, 9, 9,5 ou 10 mg ou mais da(s) molécula(s) de ácido nucleico da vacina.

[00181] Em outras modalidades, a composição farmacêutica pode compreender até e incluindo 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95 ou 100 ng da(s) molécula(s) de ácido nucleico da vacina. Em algumas modalidades, a composição farmacêutica pode compreender até e incluindo 1, 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95,100, 105, 110, 115, 120, 125, 130, 135, 140, 145, 150, 155, 160, 165, 170, 175, 180, 185, 190, 195, 200, 205, 210, 215, 220, 225, 230, 235, 240, 245, 250, 255, 260, 265, 270, 275, 280, 285, 290, 295, 300, 305, 310, 315, 320, 325, 330, 335, 340, 345, 350, 355, 360, 365, 370, 375, 380, 385, 390, 395, 400, 405, 410, 415, 420, 425, 430, 435, 440, 445, 450, 455, 460, 465, 470, 475, 480, 485, 490, 495, 500, 605, 610, 615, 620, 625, 630, 635, 640, 645, 650, 655, 660, 665, 670, 675, 680, 685, 690, 695, 700, 705, 710, 715, 720, 725, 730, 735, 740, 745, 750, 755, 760, 765, 770, 775, 780, 785, 790, 795, 800, 805, 810, 815, 820, 825, 830, 835, 840, 845, 850, 855, 860, 865, 870, 875, 880, 885, 890, 895. 900, 905, 910, 915, 920, 925, 930, 935, 940, 945, 950, 955, 960, 965, 970, 975, 980, 985, 990, 995 ou 1.000 microgramas da(s) molécula(s) de ácido nucleico da vacina. Em algu- mas modalidades, a composição farmacêutica pode compreender até e incluindo 1,5, 2, 2,5, 3, 3,5, 4, 4,5, 5, 5,5, 6, 6,5, 7, 7,5, 8, 8,5, 9, 9,5 ou 10 mg da(s) molécula(s) de ácido nucleico da vacina.

[00182] A composição farmacêutica pode compreender adicional- mente outros agentes para fins de formulação, de acordo com o modo de administração a ser usado. Nos casos em que composições farma- cêuticas são composições farmacêuticas injetáveis, elas são estéreis, livres de pirogênio e livres de material particulado. Uma formulação iso- tônica é preferencialmente usada. Em geral, aditivos para isotonicidade podem incluir cloreto de sódio, dextrose, manitol, sorbitol e lactose. Em alguns casos, soluções isotônicas, tal como tampão fosfato-salino, são preferenciais. Estabilizadores incluem gelatina e albumina. Em algumas modalidades, um agente de vasoconstrição é adicionado à formulação.

[00183] A composição farmacêutica pode ainda compreender um ex- cipiente farmaceuticamente aceitável, conforme fornecido acima na Se- ção 2. Por exemplo, o excipiente farmaceuticamente aceitável pode compreender as moléculas funcionais, veículos, adjuvantes, transporta- dores, diluentes ou agentes facilitadores da transfecção, conforme for- necido na Seção 2. Indicações

[00184] As vacinas e as composições farmacêuticas compreendendo as vacinas aqui fornecidas podem ser usadas no tratamento ou preven- ção de células cancerígenas e tumores baseados em câncer que ex- pressam Survivina. Em particular, as vacinas e as composições farma- cêuticas compreendendo as vacinas aqui fornecidas podem ser usadas no tratamento ou prevenção de câncer de ovário, mais particularmente câncer epitelial de ovário, mais particularmente câncer seroso de ovário. Métodos de Vacinação

[00185] São aqui fornecidos métodos para o tratamento e/ou preven- ção do câncer usando as formulações farmacêuticas descritas acima. Também aqui descritos são métodos de utilização das formulações far- macêuticas descritas acima no tratamento e/ou prevenção de câncer em um sujeito. Também são aqui descritos métodos de vacinar um su- jeito. Também são aqui descritos métodos de administração das formu- lações farmacêuticas aqui descritas a um sujeito em necessidade das mesmas. Os métodos aqui descritos coletivamente referidos como mé- todos de tratamento utilizando as formulações farmacêuticas aqui des- critas podem compreender administrar uma ou mais vacinas como aqui descritas a um sujeito em necessidade das mesmas para induzir uma resposta imune terapêutica e/ou profilática. A vacina pode ser adminis- trada a um sujeito para modular a atividade do sistema imune do sujeito e intensificar a resposta imune. A administração da vacina pode ser a transfecção dos antígenos de câncer como divulgado aqui como uma molécula de ácido nucleico que é expressa na célula e distribuída à su- perfície da célula, em que o sistema imunológico reconhece e induz uma resposta celular, humoral, ou celular e humoral. A administração da va- cina pode ser usada para induzir ou desencadear uma resposta imune em sujeitos contra um ou mais dos antígenos de câncer como divulga- dos aqui por administração aos sujeitos da vacina tal como aqui discu- tida.

[00186] A vacina pode ser administrada a um sujeito para modular a atividade do sistema imunológico do sujeito, aumentando assim a res- posta imune. Em algumas modalidades, o sujeito é um mamífero. Após a administração da vacina ao mamífero e, portanto, a introdução do ve- tor para as células do mamífero, as células transfectadas expressam e segregam um ou mais dos antígenos de câncer como aqui divulgados. Estas proteínas secretadas, ou antígenos sintéticos, serão reconheci- dos como estrangeiros pelo sistema imune, que ajustarão uma resposta imune que pode incluir: anticorpos produzidos contra um ou mais antí- genos de câncer e uma resposta de célula T especificamente contra um ou mais antígenos de câncer. Em alguns exemplos, um mamífero vaci- nado com as vacinas aqui discutidas terá um sistema imunológico inici- ado e quando desafiado com um ou mais antígenos de câncer como divulgado aqui, o sistema imunológico imunizado permitirá a limpeza rá- pida de antígenos de câncer subsequentes, conforme divulgado aqui, seja através das respostas imunes humoral, celular, ou ambas celular e humoral.

[00187] Os métodos de administração do DNA de uma vacina são descritos nas Patentes U.S. 4.945.050 e 5.036.006, ambas as quais são aqui incorporadas na sua totalidade por referência.

[00188] A vacina pode ser administrada a um mamífero para provo- car uma resposta imune em um mamífero. O mamífero pode ser hu- mano, primata não humano, vaca, porco, ovelha, cabra, antílope, bi- sonte, búfalo de água, bovídeos, veados, ouriços, elefantes, lhama, al- paca, camundongos, ratos e, de preferência humano, vaca ou porco. A vacina também pode ser administrada a um sujeito não mamífero, por exemplo, um frango, para provocar uma resposta imune.

[00189] A dose da vacina pode estar entre 1 micrograma e 10 mg de componente ativo por quilograma (kg) de peso corporal ao longo do tempo (componente/kg de peso corporal/tempo) e pode ser de 20 mi- crogramas a 10 mg de componente/kg de peso corporal/tempo. A vacina pode ser administrada a cada 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, ou 31 dias. O número de doses da vacina para tratamento eficaz pode ser 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 ou mais doses. Método de Geração de uma Resposta Imune com a Vacina

[00190] A vacina fornecida pode ser usada para gerar uma resposta imune em um sujeito mamífero ou não mamífero, incluindo respostas imunes terapêuticas e profiláticas. A resposta imune pode gerar anticor- pos e/ou células T assassinas que são dirigidas para um ou mais antí- genos de câncer, como aqui divulgado. Esses anticorpos e as células T podem ser isolados.

[00191] Algumas modalidades fornecem métodos para gerar respos- tas imunes contra um ou mais dos antígenos do câncer, conforme divul- gado neste documento, modalidades que compreendem administrar a vacina a um sujeito. Algumas modalidades proporcionam métodos de vacinação profilática de um sujeito contra um câncer ou tumor expres- sando um ou mais dos antígenos de câncer, como descrito acima, cujas modalidades compreendem administrar a vacina. Algumas modalidades proporcionam métodos de vacinação terapêutica de um sujeito que vem sofrendo de câncer ou tumor expressando um ou mais dos antígenos de câncer, cujas modalidades compreendem administrar a vacina. O di- agnóstico do câncer ou tumor que expressa um ou mais antígenos do câncer, como divulgado aqui antes da administração da vacina, pode ser feito rotineiramente. Métodos de Tratamento do Câncer com a Vacina

[00192] A vacina pode ser usada para gerar ou desencadear uma resposta imune em um mamífero que é reativo ou direcionado a um câncer ou tumor que expressa Survivina (por exemplo, câncer de ovário) do mamífero ou sujeito em necessidade do mesmo. A resposta imune provocada pode prevenir o câncer ou o crescimento do tumor.

[00193] A resposta imune provocada pode prevenir e/ou reduzir a metástase de células cancerígenas ou tumorais. Por conseguinte, a va- cina pode ser utilizada num método que trata e/ou previne o câncer ou tumores no mamífero ou sujeito administrado com a vacina. Vias de administração

[00194] A vacina ou composição farmacêutica pode ser administrada por diferentes vias, incluindo via oral, parenteral, sublingual, transdér- mica, retal, transmucosa, tópica, via inalação, via administração bucal, intrapleural, intravenosa, intra-arterial, intraperitoneal, subcutânea, in- tramuscular, intranasal intratecal e/ou intra-articularmente, ou combina- ções dos mesmos. Para uso veterinário, a composição pode ser admi- nistrada como uma formulação devidamente aceitável em conformidade com a prática veterinária normal. O veterinário pode prontamente deter- minar o regime de dosagem e a via de administração que é a mais apro- priada para um animal particular. A vacina pode ser administrada por seringas tradicionais, dispositivos de injeção sem agulha, biobalística ("microprojectile bombardment gene guns") ou outros métodos físicos, tal como eletroporação ("EP"), "método hidrodinâmico", ou ultrassom.

[00195] O vetor da vacina pode ser administrado ao mamífero por várias tecnologias conhecidas, incluindo injeção de DNA (também co- nhecida como vacinação de DNA) com e sem eletroporação in vivo, transfecção mediada por lipossomas, transfecção facilitada por nano- partículas e uso de vetores recombinantes, como adenovírus recombi- nantes, vírus associado a adenovírus recombinante e vaccinia recombi- nante. O um ou mais antígenos de câncer da vacina podem ser admi- nistrados via injeção de DNA junto com eletroporação in vivo.

[00196] A vacina ou composição farmacêutica compreendendo a va- cina pode ser administrada por eletroporação. A administração da va- cina através de eletroporação pode ser realizada usando os dispositivos de eletroporação que podem ser configurados para distribuir a um tecido desejado de um mamífero um pulso de energia eficaz para fazer com que poros reversíveis se tornem em membranas de célula, e preferivel- mente o pulso de energia é um similar atual constante a uma entrada corrente predeterminada por um usuário. O aparelho de eletroporação pode compreender um componente de eletroporação e um conjunto de eletrodo ou conjunto de manuseio. O componente de eletroporação pode incluir e incorporar um ou mais dos diversos elementos dos dispo- sitivos de eletroporação, incluindo: controlador, gerador de forma de onda de corrente, testador de impedância, registrador de forma de onda, elemento de entrada, elemento de relatório de status, porta de comuni- cação, componente de memória, fonte de energia e interruptor. A ele- troporação pode ser realizada usando um dispositivo de eletroporação in vivo, por exemplo, sistema CELLECTRA® EP (Inovio Pharmaceuti- cals, Inc., Blue Bell, PA) ou eletroporador Elgen (Inovio Pharmaceuti- cals, Inc.) para facilitar a transfecção de células pelo vetor.

[00197] Exemplos de dispositivos de eletroporação e métodos de eletroporação que podem facilitar a administração das vacinas de DNA da presente invenção incluem aqueles descritos na Patente U.S.

7.245.963 por Draghia-Akli, et al, Pub. de Patente U.S. 2005/0052630 apresentado por Smith, et al., cujos conteúdos estão aqui incorporados por referência na sua totalidade. Outros dispositivos de eletroporação e métodos de eletroporação que podem ser utilizados para facilitar a ad- ministração das vacinas de DNA incluem os fornecidos no Pedido de Patente U.S. copendente e coproprietário, 11/874072, depositado em 17 de outubro de 2007, que reivindica o benefício em 35 USC 119 (e) a Pedidos Provisórios U.S. 60/852.149, depositado em 17 de outubro de 2006, e 60/978.982, depositado em 10 de outubro de 2007, todos incor- porados neste documento em sua totalidade.

[00198] A Patente U.S. 7.245.963 de Draghia-Akli, et al. descreve sistemas de eletrodo modulares e seu uso para facilitar a introdução de uma biomolécula em células de um tecido selecionado em um corpo ou uma planta. Os sistemas de eletrodo modular podem compreender uma pluralidade de eletrodos de agulha; uma agulha hipodérmica; um conec- tor elétrico que fornece uma ligação condutora de um controlador de pulso de corrente constante programável para a pluralidade de eletro- dos de agulha; e uma fonte de energia. Um operador pode segurar a pluralidade de eletrodos de agulha que são montados em uma estrutura de suporte e firmemente inseri-los no tecido selecionado em um corpo ou uma planta. Em seguida, as biomoléculas são administradas por meio de agulha hipodérmica no tecido selecionado. O controlador de pulso de corrente constante programável é ativado e pulso elétrico de corrente constante é aplicada à pluralidade de eletrodos de agulha. O pulso elétrico de corrente constante aplicado facilita a introdução da bi- omolécula na célula, entre a pluralidade de eletrodos. Todo o conteúdo da Patente U.S. 7.245.963 é aqui incorporado por referência em sua totalidade.

[00199] Pub. Patente U.S. 2005/0052630 apresentada por Smith, et al. descreve um dispositivo de eletroporação que pode ser usado para facilitar efetivamente a introdução de uma biomolécula nas células de um tecido selecionado em um corpo ou planta. O aparelho de eletropo- ração compreende um dispositivo eletro-cinético ("dispositivo EKD"), cuja operação é especificada pelo software ou firmware. O dispositivo EKD produz uma série de padrões de pulso de corrente constante pro- gramáveis entre eletrodos em uma disposição com base no controle de usuário e na entrada dos parâmetros de pulso e permite o armazena- mento e a aquisição de dados de forma de onda corrente. O aparelho de eletroporação também compreende um disco de eletrodo substituível tendo uma disposição de eletrodos de agulha, um canal de injeção cen- tral para uma agulha de injeção e um disco de guia removível. Todo o conteúdo da Pub. de Patente U.S. 2005/0052630 é totalmente aqui in- corporado por referência.

[00200] Os arranjos e métodos de eletrodo descritos na Patente dos EUA nº 7.245.963 e Pedido de patente dos EUA 2005/0052630 podem ser adaptados para penetração profunda não apenas nos tecidos tal como o músculo, mas também outros tecidos ou órgãos. Por causa da configuração da matriz de eletrodo, a agulha de injeção é também inse- rida completamente no órgão-alvo e a injeção é administrada perpendi- cular ao fator alvo, na área que é previamente delineada por eletrodos. Os eletrodos descritos na Patente U.S. 7.245.963 e Pub. de Patente U.S. 2005/005263 têm preferivelmente 20 mm de comprimento e calibre

21.

[00201] Além disso, contemplado em algumas modalidades, que in- corporam dispositivos de eletroporação e seus usos, existem dispositi- vos de eletroporação que são os descritos nas seguintes patentes: Pa- tente dos EUA 5.273.525, emitida em 28 de dezembro de 1993, Paten- tes dos EUA 6.110.161, emitida em 29 de agosto de 2000, 6.261.281, emitida em 17 de julho, 2001 e 6.958.060, emitida em 25 de outubro de 2005 e patente dos EUA 6.939.862, emitida em 6 de setembro de 2005.

Além disso, as patentes que cobrem o assunto em questão fornecido na patente U.S. 6.697.669, emitida em 24 de fevereiro de 2004, que diz respeito à administração de DNA usando qualquer um de uma varie- dade de dispositivos, e a Patente U.S. 7.328.064, emitida em 5 de feve- reiro de 2008, desenhada para o método de injeção de DNA, são con- templadas aqui. As patentes anteriores são incorporadas por referência na sua totalidade.

[00202] São aqui fornecidos métodos para preparar os vetores que compreendem a(s) molécula(s) de ácido nucleico que codificam o antí- geno de Survivina de consenso sintético discutido aqui. Os vetores, após a etapa final de subclonagem no plasmídeo de expressão de ma- míferos, podem ser usados para inocular uma cultura de células em um tanque de fermentação em larga escala, usando os métodos conheci- dos na técnica.

[00203] Os vetores de DNA para uso com os dispositivos EP da pre- sente invenção podem ser formulados ou fabricados usando uma com- binação de dispositivos e técnicas conhecidas, mas preferencialmente são fabricados usando uma técnica de fabricação otimizada descrita em um pedido publicado U.S. 20090004716, depositado em 23 de maio de

2007. Em alguns exemplos, os vetores de DNA usados nestes estudos podem ser formulados em concentrações maiores ou iguais a 10 mg/mL. As técnicas de fabricação também incluem ou incorporam vários dispositivos e protocolos que são comumente conhecidos pelos versa- dos na técnica, além dos descritos em U.S. 60/939792, incluindo os des- critos em uma Patente U.S. 7.238.522, emitida em 3 de julho de 2007. O pedido e a patente mencionados anteriormente, U.S. 60/939.792 e a Patente U.S. 7.238.522, respectivamente, são incorporados na sua to- talidade. Exemplos

[00204] A presente invenção é ilustrada adicionalmente pelos se- guintes exemplos. Deve ser entendido que estes exemplos, enquanto indicando modalidades preferenciais da invenção, são providos a título de ilustração apenas. A partir da discussão anterior e nestes exemplos, um versado na técnica pode avaliar as características essenciais da pre- sente invenção e, sem fugir de seu espírito e escopo, pode fazer várias alterações e modificações da invenção para adaptá-la para vários usos e condições. Assim, várias modificações da invenção, além das mostra- das e descritas no presente documento, serão evidentes para os versa- dos na técnica a partir da descrição anteriormente mencionada. Tais modificações pretendem ser abrangidas pelo escopo das reivindicações anexas. Exemplo 1 - Geração de Isoforma 1 de Survivina de Consenso

[00205] Vinte e nove sequências da isoforma 1 da Survivina foram coletadas do GenBank (www.ncbi.nlm.nih.gov/genbank/). Os números de acessão do GenBank para as sequências selecionadas da isoforma 1 da Survivina são: NP_001125727.1, 3UIG, 1F3H, BAC22748.2, NP_001159.2, CAG46540.1, BAD97148.1, XP_002748841.1, XP_003818322.1, NP_001253110.1, XP_011810718.1, XP_011832690.1, XP_001083183.1, XP_003786134.1, XP_012516801.1, XP_007957800.1, XP_001915435.1, XP_008523102.1, AAT37504.1, XP_004432883.1, XP_003417277.1, XP_004374167.1, NP_999306.1, XP_002918421.1, NP_001003348.1, NP_001009280.1, XP_004748859.1, NP_001001855.2, e AAU89275.1.

[00206] Uma sequência de consenso foi gerada usando o pacote de software DNASTAR® Lasergene (versão 13.0.0.357). As vinte e nove sequências listadas acima foram importadas para o MegAlign e alinha- das usando o programa de alinhamento de múltiplas sequências Clus- talW. A sequência da isoforma 1 de Survivina de consenso resultante compartilha 97,2-97,9% de homologia com a isoforma 1 de Survivina humana nativa. Para abolir a função biológica potencial da proteína de isoforma 1 de Survivina de consenso resultante, foram introduzidas três mutações para abolir a atividade antiapoptótica de Survivina. As três mutações são T34A, T48A e C84A. Além disso, para ter um nível de expressão mais alto, uma sequência Kozak a montante e uma sequên- cia líder de IgE foram adicionadas ao terminal N. Além disso, o uso de códons desse gene foi adaptado ao viés de códons dos genes do Homo sapiens. (Andre, S. et al. Increased immune response elicited by DNA vaccination with a synthetic gp120 sequence with optimized codon us- age. Journal of virology 72, 1497-1503 (1998); Deml, L. et al. Multiple effects of codon usage optimization on expression and immunogenicity of DNA candidate vaccines encoding the human immunodeficiency virus type 1 Gag protein. Journal of virology 75, 10991-11001, doi:10.1128/JVI.75.22.10991-11001.2001 (2001)). Além disso, a otimi- zação do RNA também foi realizada: regiões com teor de GC muito alto (> 80%) ou muito baixo (<30%) e os motivos de sequência de ação cis como caixas TATA internas, sítios chi e sítios de entrada ribossômicos foram evitadas. Como resultado, a proteína de isoforma 1 do antígeno de Survivina de consenso sintético compartilha 95,1-95,8% de identi- dade com a proteína de isoforma 1 de Survivina nativa humana. A se- quência nucleotídica da isoforma 1 do antígeno de Survivina de con- senso sintético é estabelecida na SEQ ID NO:1. A sequência de amino- ácidos da isoforma 1T3 do antígeno de Survivina de consenso sintético é estabelecida na SEQ ID NO:2.

[00207] A isoforma 1 do antígeno de Survivina de consenso sintético foi digerido com BamHI e XhoI e clonado no vetor de expressão propri- etário pGX0001 com a cassete de expressão colocada sob o controle de transcrição do promotor imediato-precoce do citomegalovírus. O plasmídeo resultante foi designado pGX1428. O sequenciamento de comprimento completo foi realizado e, em seguida, analisado e confir- mado como correto. Uma representação esquemática da isoforma 1 do antígeno de Survivina de consenso sintético é mostrada na Fig. 1. A estrutura geral da isoforma 1 do antígeno de Survivina de consenso sin- tético é mostrada na Fig. 2. Tabela 1. Recursos da SEQ ID NO:3 Recurso Posição de aminoácido Sequência líder IgE 1-18 Sequência de codificação de Survivina 19-159 Mutações para abolir a atividade antiapoptótica T51A T65A C101A Recursos da SEQ ID NO:8 Recurso Posição de aminoácido Sequência líder IgE 1-18 Sequência de codificação da isoforma 1 de Survivina 19-161 Mutações para abolir a atividade antiapoptótica T51A T65A C101A Sítio de clivagem de Furina 160-166 Sequência de codificação de isoforma 3 de Survivina truncada 167-232 Tabela 2. Características da isoforma 1 do antígeno de Survivina de consenso sintético Características Isoforma 1 do antígeno de Sur- vivina de consenso sintético Identidade com Survivina humana nativa 95,1% a 95,8% Identidade com a Survivina rhesus nativa 95,8% Identidade com a Survivina de camundongo nativa 70,0% a 83,6% Número de mutações de aminoácidos (vs humano nativo) 6 Número de mutações inseridas (não derivadas de consenso) 3 Peso molecular 161 aa (18 KDa) Comprimento da sequência de codificação (bp) 483 Exemplo 2 - Geração de Isoforma 1T3 de Survivina de Consenso

[00208] Para gerar uma isoforma 3 de Survivina de consenso hu- mana, 8 sequências da isoforma de Survivina 3 foram coletadas do Gen- Bank (www.ncbi.nlm.nih.gov/genbank/). Os números de acessão do GenBank para as sequências selecionadas da isoforma 3 da Survivina são: NP_001012270.1, XP_008969790.1, XP_008011275.1, XP_009189614.1, XP_011897653.1, XP_011810642.1, XP_011844315.1, e XP_011718355.1.

[00209] Uma sequência de consenso foi gerada usando o pacote de software DNASTAR® Lasergene (versão 13.0.0.357). As oito sequên- cias listadas acima foram importadas para o MegAlign e alinhadas usando o programa de alinhamento de múltiplas sequências ClustalW. Seis destas sequências de animais inferiores continham 11 resíduos de aminoácidos adicionais na extremidade C-terminal que não estão pre- sentes nas sequências humanas. Esses resíduos extras foram omitidos ao gerar a isoforma 3 de Survivina humana de consenso para evitar provocar uma resposta imune fora do alvo em humanos. Após gerar a isoforma 3 de Survivina humana de consenso, a sequência de aminoá- cidos idêntica entre a isoforma de Survivina 1 e 3 foi removida da iso- forma 3 de Survivina de consenso. A sequência de a isoforma 3 de Sur- vivina de consenso truncada (antígeno de Survivina T3), compartilha 96,8% de homologia de sequência com a sequência de isoforma T3 de Survivina humana nativa. O imunógeno da isoforma 1T3 do antígeno de Survivina foi gerado pela adição de um sítio de clivagem de furina entre o antígeno de Survivina 1 (descrito acima) e o antígeno de Survivina T3.

[00210] Uma vez obtida a sequência de DNA de isoforma 1T3 de an- tígeno de Survivina de consenso sintético, a fim de obter um nível de expressão mais alto, uma sequência de Kozak a montante e a sequên- cia líder de IgE foram adicionados ao terminal N. (Yang, J. S. et al. In- duction of potent Th1-type immune responses from a novel DNA vaccine for West Nile virus New York isolate (WNV-NY1999). The Journal of in- fectious diseases 184, 809-816, doi:10.1086/323395 (2001)). Além disso, o uso de códons desse gene foi adaptado ao viés de códons dos genes do Homo sapiens (Andre, S. et al. Increased immune response elicited by DNA vaccination with a synthetic gp120 sequence with opti- mized codon usage.

Journal of virology 72, 1497-1503 (1998); Deml, L. et al.

Multiple effects of codon usage optimization on expression and immunogenicity of DNA candidate vaccines encoding the human immu- nodeficiency virus type 1 Gag protein.

Journal of virology 75, 10991- 11001, doi:10.1128/JVI.75.22.10991-11001.2001 (2001)). Além disso, a otimização do RNA também foi realizada: regiões com teor de GC muito alto (> 80%) ou muito baixo (<30%) e os motivos de sequência de ação cis como caixas TATA internas, sítios chi e sítios de entrada ribossômi- cos foram evitadas11,12. A isoforma 1T3 do antígeno de Survivina de consenso sintético foi digerido com BamHI e XhoI e clonado no vetor de expressão pGX0001 com a cassete de expressão colocada sob o con- trole de transcrição do promotor imediato-precoce do citomegalovírus.

O plasmídeo resultante foi designado pGX1429. O sequenciamento de comprimento completo foi realizado e, em seguida, analisado e confir- mado como correto.

A sequência nucleotídica da isoforma 1T3 do antí- geno de Survivina de consenso sintético é estabelecida na SEQ ID NO:3, como mostrado na Tabela 1. A sequência de aminoácidos da iso- forma 1T3 do antígeno de Survivina de consenso sintético é estabele- cida na SEQ ID NO:8, como mostrado na Tabela 1. Uma representação esquemática da isoforma 1T3 do antígeno de Survivina de consenso sintético é mostrada na Fig. 3. As características do construto da iso- forma 1T3 do antígeno de Survivina de consenso sintético são forneci- das na Tabela 3. Tabela 3. Características da isoforma 1T3 do antígeno de Survivina de consenso sintético Características Isoforma 1T3 do antígeno de Survivina de consenso sinté- tico Identidade com Survivina humana nativa 95,1% a 95,8% (região iso 1); 96,8% (região T3) Identidade com a Survivina rhesus nativa 95,9% (região iso 1); 9,4% (região T3) Identidade com a Survivina de camundongo nativa 70,0% a 84,9% (região iso 1); 10,9% a 13,0% (região T3) Número de mutações de aminoácidos (vs humano 6 (região iso 1); 2 (região T3) nativo)

Número de mutações inseridas (não derivadas de 3 (região iso 1); 0 (região T3) consenso) Peso molecular 232 aa (26 Kda) Comprimento da sequência de codificação (bp) 696 Exemplo 3 - Construção de vetores de expressão de Survivina de pGX

[00211] O pGX0001 (um vetor de expressão pVAX1 modificado) sob o controle do promotor imediato-precoce do citomegalovírus humano (promotor hCMV) foi usado como vetor de espinha dorsal. O pVAX1 ori- ginal foi obtido da Thermo Fisher Scientific.

[00212] Foram introduzidas modificações no pVAX1 para criar o pGX0001 e são identificadas com base na sequência relatada do pVAX1 disponível na ThermoFisher Scientific. Essas modificações estão lista- das abaixo e não foram detectados problemas com relação à amplifica- ção do plasmídeo e à transcrição e tradução do antígeno. Não foram observadas mais alterações na sequência de pGX0001 até à data em qualquer um dos produtos plasmídicos na plataforma utilizando pGX0001 como espinha dorsal. Modificação Par de Base Descrição C>G 241 no promotor CMV C>T 1158 espinha dorsal, a jusante do sinal de poliade- nilação do hormônio de crescimento bovino (bGH poliA) A> - 2092 espinha dorsal, a jusante do gene de resistên- cia à canamicina C>T 2493 na origem de replicação da pUC (pUC ori) G>C 2969 no final de pUC Ori a montante do sítio RNASeH Os pares de base 2, 3 e 4 foram alterados de ACT para CTG na estru- tura principal, a montante do promotor de CMV.

[00213] O pGX1428 é um plasmídeo de DNA que codifica a proteína da isoforma 1 do antígeno de Survivina (antígeno 1 de Survivina) de consenso sintético. A produção de mRNA relacionada é conduzida por um promotor de CMV humano (promotor de hCMV) e terminada pelo sinal de poli-adenilação da extremidade 3' do hormônio de crescimento bovino (bGH polyA). A espinha dorsal pGX0001 inclui o gene de resis- tência à canamicina (KanR) e a origem da replicação do plasmídeo (pUC ori) para fins de produção. Esses elementos não são funcionais nas células eucarióticas. O pGX1428 foi produzido pela clonagem da sequência de DNA da isoforma 1 do antígeno de Survivina 1 de con- senso sintético (antígeno de Survivina 1) no pGX0001 nos sítios BamHI e XhoI, como ilustrado na Fig. 4.

[00214] O pGX1429 é um plasmídeo de DNA que codifica a proteína 1T3 de antígeno de Survivina 1T3 de consenso sintético (antígeno de Survivina 1T3). A produção de mRNA relacionada é conduzida por um promotor de CMV humano (promotor de hCMV) e terminada pelo sinal de poli-adenilação da extremidade 3' do hormônio de crescimento bo- vino (bGH polyA). A espinha dorsal pGX0001 inclui o gene de resistên- cia à canamicina (KanR) e a origem da replicação do plasmídeo (pUC ori) para fins de produção. Esses elementos não são funcionais nas cé- lulas eucarióticas. O pGX1429 foi produzido pela clonagem da sequên- cia de DNA da isoforma 1T3 do antígeno de Survivina 1 de consenso sintético (antígeno de Survivina 1T3) no pGX0001 nos sítios BamHI e XhoI, como ilustrado na Fig. 5. Exemplo 4 - Imunogenicidade dos construtos de antígeno de Sur- vivina de consenso sintético

[00215] A imunogenicidade dos construtos de vacina projetados para direcionar avivina humana, o antígeno de Survivina 1 de consenso sin- tético (pGX1428) e o antígeno de Survivina 1T3 de consenso sintético (pGX1429) foi avaliada em camundongos. A expressão da proteína an- tigênica por cada construto também foi avaliada in vitro por Western blo- tting. Materiais e métodos

Plasmídeos

[00216] O antígeno de Survivina 1 de consenso sintético (pGX1428) e o antígeno de Survivina 1T3 de consenso sintético (pGX1429) foram projetados como aqui descritos. Para estudos in vitro e in vivo, os plas- mídeos (10 mg) foram solicitados à GenScript para ambos pGX1428 (lote # 786114S-1/G52238) e pGX1429 (lote # 786114S-2/G52239). As sequências de antígenos dos estoques de plasmídeos de 10 mg foram confirmadas por sequenciamento de Sanger. Expressão de antígeno in vitro

[00217] A expressão das proteínas antigênicas por pGX1428 e pGX1429 foi confirmada por western blotting. Como mostrado na Fig. 6, as células de rabdomiossarcoma humano (RD) (ATCC, CCL-136) man- tidas em meio DMEM com 10% de FBS (ThermoFisher) foram transfec- tadas com pGX1428, pGX1429 ou pGX0001 (prato de 6 µg/10cm2) usando Turbofectina 8 (Origene). Quarenta e oito horas após a trans- fecção, as células foram lisadas usando tampão de lise celular RIPA (ThermoFisher) e o lisado celular foi coletado. Após um ensaio de BCA (ThermoFisher) para determinar a concentração total de proteína, 15 µg de lisado celular foram submetidos a eletroforese em um gel de 4-12% de SDS-PAGE (ThermoFisher). A detecção foi realizada com um anti- corpo monoclonal contra os aminoácidos 1-142 da Survivina humana (Santa Cruz Biotech, clone D8, sc-17779) e depois visualizada com IgG anti-camundongo de cabra conjugada com peroxidase de rábano silves- tre (HRP) (Santa Cruz Biotech, sc-2005 ), utilizando um sistema de aná- lise Western Blot da ECL (GE Amersham). Como controle de carrega- mento, as transferências foram novamente sondadas quanto à expres- são de actina usando um anticorpo monoclonal anti-β-actina (Santa Cruz Biotech, clone, C4, sc-47778 HRP). Animais e imunizações

[00218] Camundongos fêmeas CB6F1 de 8 semanas de idade foram comprados da Jackson Laboratories. Todos os animais foram alojados em uma instalação com ciclo de luz e temperatura controlada na BTS Research (San Diego, CA). O cuidado com os animais foi realizado de acordo com as diretrizes dos Institutos Nacionais de Saúde e a Proposta de Cuidado e Uso de Animais (ACUP) (BTS ACUP # 15-091). Os ca- mundongos foram divididos em nove grupos, conforme detalhado na Tabela 4. Tabela 4. Grupos de Estudo Dose de construto Volume de inje- Grupo n Construto (μg) ção (µL) 1 4 pGX0001 30 30 2 8 pGX1428 10 30 3 8 pGX1428 20 30 4 8 pGX1428 30 30 5 8 pGX1428 50 30 6 8 pGX1429 10 30 7 8 pGX1429 20 30 8 8 pGX1429 30 30 9 8 pGX1429 50 30

[00219] Os camundongos nos grupos imunizados foram vacinados com as doses indicadas de pGX0001, pGX1428 ou pGX1429 de acordo com o tratamento com camundongo SOP R20-003147 CELLECTRA® 3P. Resumidamente, os plasmídeos foram formulados em água estéril para injeção (VetOne) de modo que a quantidade de dose indicada foi distribuída por injeção intramuscular no músculo tibial anterior em um volume de injeção de 30 µL. Cada injeção intramuscular foi imediata- mente seguida por eletroporação (EP) usando o dispositivo de eletropo- ração por corrente constante adaptativa CELLECTRA® 2000 com uma matriz 3P (Inovio Pharmaceuticals). O dispositivo foi configurado para distribuir dois pulsos de 0,1 Amp de 52 ms de largura de pulso espaça- dos por um 1 segundo de atraso. Os camundongos receberam 3 imuni- zações, com 3 semanas de intervalo. Os camundongos foram sacrifica- dos uma semana após a última imunização e os baços colhidos para leituras imunes celulares. Nenhum outro tecido foi coletado.

Isolamento esplênico de linfócitos

[00220] Os esplenócitos foram isolados assepticamente e colocados em 5 mL de meio R10 (meio 1640 do Rosewell Park Memorial Institute suplementado com soro fetal bovino a 10% e antibiótico-antimicótico a 1%). Os esplenócitos foram isolados por interrupção mecânica do baço usando uma máquina Stomacher (Seward Laboratory Systems Inc.), e o produto resultante foi filtrado usando um filtro de células de 40-μm (BD Falcon). O produto resultante foi centrifugado e o sedimento foi tratado por 5 min com tampão de lise ACK (Lonza) para lise de hemácias. Os esplenócitos foram então centrifugados, lavados em PBS e depois res- suspensos em meio R10 e imediatamente usados para análises poste- riores. IFNγ ELISpot

[00221] O ensaio IFNγ ELISpot de camundongo foi realizado usando um kit da MabTech (MabTech, #3321-4APW-10) para avaliar as respos- tas celulares específicas do antígeno. Resumidamente, placas de 96 poços pré-revestidas com anticorpo IFNγ anti-camundongo (mAb AN18) foram lavadas em PBS e bloqueadas por 2 horas à temperatura ambi- ente com meio de cultura completo (RPMI 1640 suplementado com 10% de FBS e antibióticos). Os linfócitos esplênicos foram ressuspensos em meio R10 (e depois adicionados em triplicados a um número de células de entrada de 2 × 105 células por poço. Um conjunto de peptídeos foi sintetizado (GenScript), cada um contendo 15 resíduos de aminoácidos sobrepostos por 11 aminoácidos representando todas as sequências de proteína de antígeno de Survivina 1 de consenso sintético e antígeno de Survivina 1T3 de consenso sintético. Estes conjuntos de peptídeos foram ressuspensos em DMSO (Sigma) e reunidos a uma concentração de ~ 2 μg/ml de peptídeo em dois conjuntos de peptídeo. Um grupo de peptídeo continha os peptídeos correspondentes à proteína de antígeno de de antígeno de Survivina 1 de consenso sintético e o segundo grupo de peptídeos continha os peptídeos correspondentes à proteína de an- tígeno de antígeno de Survivina 1T3 de consenso sintético. A concava- lina A (Sigma) a 5μg/ml foi utilizada como controle positivo e o meio de cultura completo foi usado como controle negativo. As placas foram in- cubadas por 18 horas a 37 ° C, em uma incubadora de atmosfera de 5% de CO2. Em seguida, foi adicionado um anticorpo biotinilado de detec- ção de IFNγ anti-camundongo (MabTech mAb R4-6A2) e as placas fo- ram incubadas por 2 horas em temperatura ambiente. As placas foram lavadas e Streptavidin-ALP (MabTech) foi adicionado e as placas incu- badas por 1 hora em temperatura ambiente. A detecção do ponto foi concluída usando o substrato BCIP/NBT de acordo com as instruções do fabricante do kit (MabTech). As manchas nas placas foram contadas usando um leitor ELISPOT automatizado (Cellular Technology). O nú- mero médio de unidades formadoras de pontos (SFU) foi ajustado para 1 x 106 esplenócitos para exibição de dados.

[00222] Nas Figs. 7A-7H, as respostas específicas ao antígeno pelo IFNγ ELISpot são relatadas como o número de unidades formadoras de ponto IFNγ (SFU) por 1 x 106 esplenócitos maiores que o SFU no con- trole apenas de meio. Citometria de fluxo

[00223] As respostas imunes celulares induzidas por antígeno de Survivina 1 de consenso sintético e antígeno de Survivina 1T3 de con- senso sintético foram ainda caracterizadas por citometria de fluxo. Re- sumidamente, 2 x 106 esplenócitos de camundongos vacinados e ingê- nuos foram imediatamente estimulados após o isolamento com o antí- geno de Survivina 1 de consenso sintético e os peptídeos de Survivina 1T3, como apropriado para cada grupo, por 6 horas na presença de Brefeldin A (BD Biosciences), Monensina (BD Biosciences) e anticorpo CD107a anti-camundongo FITC (BD Biosciences, clone 1D4B). Após estimulação com peptídeos, os esplenócitos foram centrifugados e res- suspensos em 20 μL por poço da solução de BD Fc Block (BD Biosci- ences) de camundongo. O bloco Fc é utilizado a uma diluição inicial de 1:40 em PBS e incubado a 4°C por 5 minutos. Após a incubação, os anticorpos extracelulares restantes (em PBS) são adicionados a 30 μL por poço e deixados a incubar a 4°C por 30 minutos. Após a adição da mancha extracelular, o volume final em cada poço é de 50 μL, consis- tindo em Bloco Fc na diluição final de 1:100 e os anticorpos extracelula- res nas suas diluições de trabalho apropriadas. As células foram então coradas com corante de viabilidade (Vivid V450, Thermo-Fisher) e os seguintes anticorpos extracelulares: CD4 anticamundongo PerCP- Cy5.5 (BD Biosciences, clone RM4-5) e CD8a anticamundongo APC (BD Biosciences, clone 63-67). As células foram fixadas e permeabiliza- das (BD Biosciences, # 554714) por 20 minutos a 4°C. A coloração in- tracelular foi subsequentemente concluída com os seguintes anticorpos: CD3e anti-APC-Cy7 anti-camundongo (BD Biosciences, clone 145- 2C11) IFNγ BV605 anti-camundongo IFNγ BD Biosciences, clone XMG1.2), IL-2 anti-camundongo APC-R700 (BD Biosciences, clone JEs6-5H4) e PE anti-camundongo TNF-α (BD Biosciences, clone MP6- XT22). Os dados do ICS foram coletados no FACS CANTO de 10 cores (BD Biosciences) e a análise foi concluída usando o software FlowJo. A estratégia de bloqueio da citometria de fluxo é mostrada na Fig. 8.

[00224] Para que uma célula seja chamada de antígeno específico por citometria de fluxo, a frequência do parâmetro relatado deve exceder a do controle somente de meio. Para que uma célula seja identificada como produtora de CD107a específico de antígeno, a célula também deve ser identificada como positiva para a produção específica de antí- geno de IFNγ e/ou IL-2 e/ou TNFα, conforme identificado pela porta bo- oleana. Análise estatística

[00225] A análise estatística foi concluída usando o IBM SPSS Sta- tistics 22 (IBM Corporation). A análise entre os grupos foi realizada usando uma ANOVA com Diferença Significativa Honesta post-hoc de Tukey (HSD) para ajustar as comparações múltiplas. A homogeneidade da variância foi confirmada usando a estatística F antes de compara- ções múltiplas. Para todas as análises estatísticas, um valor de p de 0,050 foi considerado significativo. Resultados Expressão das proteínas do antígeno de Survivina de consenso sintético

[00226] Dois construtos foram projetados para direcionar avivina hu- mana, o antígeno de Survivina 1 de consenso sintético (pGX1428) e o antígeno de Survivina 1T3 de consenso sintético (pGX1429). A expres- são das proteínas do antígeno de Survivina 1 de consenso sintético e do antígeno de Survivina 1T3 de consenso sintético por pGX1428 e pGX1429, respectivamente, foi confirmada por western blotting. Resu- midamente, as células de rabdomiossarcoma humano (RD) foram trans- fectadas com os plasmídeos pGX1428, pGX1429 ou pGX0001 (vetor vazio, controle negativo). Os lisados celulares foram sondados quanto à expressão das proteínas do antígeno de Survivina de consenso sinté- tico com um anticorpo de Survivina anti-humano (BIRC5). Foram detec- tadas bandas de proteína dos pesos moleculares esperados para o an- tígeno de Survivina 1 de consenso sintético (17,5 kD) e para o antígeno de Survivina 1T3 de consenso sintético (25,3 kD) (Fig. 6). Uma banda fraca foi detectada no controle negativo (pGX0001) que é provavel- mente devido à expressão da proteína Survivina endógena de baixo ní- vel na linhagem celular RD. As bandas anti-β-actina foram detectadas com intensidades semelhantes, indicando que quantidades iguais de proteína foram carregadas em cada faixa. Em resumo, verificou-se que pGX1428 e pGX1429 expressam suas respectivas proteínas antigêni- cas. Imunogenicidade dos construtos da vacina de antígeno de Survi- vina de consenso sintético IFNγ ELISpot

[00227] A imunogenicidade dos dois construtos do antígeno de Sur- vivina de consenso sintético foi avaliada em quatro quantidades de dose (10 μg, 20 μg, 30 μg e 50 μg) por IFNγ ELISpot e citometria de fluxo (n = 8/grupo). Os camundongos foram imunizados com a espinha dorsal vazia do vetor (pGX0001) como controle negativo (n = 4/grupo). A vaci- nação com antígeno de Survivina 1 de consenso sintético resultou em respostas significativas ao IFNγ em comparação aos camundongos va- cinados com controle negativo. No entanto, havia evidências mínimas para um aumento dependente da dose na produção de IFNγ induzida pelo antígeno de Survivina 1 de consenso sintético (Fig. 10A) sugerindo que a resposta máxima foi alcançada na dose mais baixa. Especifica- mente, o antígeno de Survivina de consenso sintético 1 IFNγ SFU foram

1.082 ± 574, 1.186 ± 747, 1,135 ± 647 e 848 ± 350 nas doses de 10 μg, 20 μg, 30 μg e 50 μg, respectivamente. As respostas de IFNγ de antí- geno de Survivina de consenso sintético foram significativamente maio- res do que naïve (2 ± 3) nas doses de 10 μg (p = 0,031), 20 μg (p = 0,015) e 30 μg (p = 0,021) de pGX1428, mas não na dose de 50 μg (p = 0,134). A vacinação com antígeno de Survivina 1T3 de consenso sin- tético resultou em respostas de IFNγ significativas com algumas evidên- cias de um aumento dependente da dose com o aumento dos níveis de dose (Fig. 10D). A SFU de IFNγ de Survivina 1T3 foram 516 ± 156, 812 ± 534, 1.016 ± 654 e 818 ± 339 nas doses de 10 μg, 20 μg, 30 μg e 50 μg, respectivamente. As respostas de IFNγ de antígeno de Survivina 1T3 de consenso sintético foram significativamente maiores que naïve (5 ± 6) nas doses de 20 μg (p = 0,039), 30 μg (p = 0,006) e 50 μg (p =

0,037) de pGX1429, mas não na dose de 10 μg (p = 0,337). As respos- tas de IFNγ estão resumidas na Tabela 5. Tabela 5. Respostas de IFN-gama induzidas pelo antígeno de Survivina 1 de consenso sintético e antígeno de Survivina 1T3 de consenso sin- tético Antígeno de Survivina 1 de consenso sintético Antígeno de Survivina 1T3 de consenso sinté- (pGX1428) tico (pGX1429) Quanti- SFU média Quanti- SFU média Construto dade de ± Desvio valor-p Construto dade de ± Desvio valor-p dose Padrão dose Padrão pGX0001 30 µg 2±3 n/a pGX0001 30 µg 5±6 n/a pGX1428 10 µg 1,082 ± 574 p = 0,031 pGX1429 10 µg 516 ± 156 p = 0,337 20 µg 1,186 ± 747 p = 0,015 20 µg 812 ± 534 p = 0,039 30 µg 1,135 ± 647 p = 0,021 30 µg 1,016 ± 654 p = 0,006 50 µg 848 ± 350 p = 0,134 50 µg 818 ± 339 p = 0,037 Os valores de p relatados são relativos a naïve (camundongos imuni- zados com pGX0001) Citometria de fluxo

[00228] O antígeno de Survivina 1 de consenso sintético e o antígeno de Survivina 1T3 de consenso sintético suscitaram respostas mais ro- bustas no compartimento de células T CD4+, em relação às respostas no compartimento de células T CD8+ (Fig. 9). O antígeno de Survivina 1 de consenso sintético induziu frequências de respostas de células T CD4+ específicas de antígeno que foram significativamente mais robus- tas do que naïve (0,03% ± 0,05%) nos grupos de quantidade de dose de 20 μg (1,08% ± 0,65%) (p = 0,024) e 50 μg (1,21% ± 0,73%) (p = 0,009), mas não nos grupos de quantidade de dose de 10 μg (0,86% ± 0,31%) (p = 0,105) ou 30 μg (0,82% ± 0,46%) (p = 0,134) (Fig. 7B). antígeno de Survivina 1T3 de consenso sintético induziu respostas de células T CD4+ específicas de antígeno que foram significativamente mais robustas do que naïve (0,05% ± 0,05%) nos grupos de quantidade de dose de 20 μg (1,02% ± 0,59%) (p = 0,010), 30 μg (1,08% ± 0,47) %) (p = 0,006) e 50 μg (1,13% ± 0,44%) (p = 0,004), mas não no grupo de quantidade de dose de 10 μg (0,62% ± 0,35%) (p = 0,248) (Fig. 7E).O perfil de citocinas das células T CD4+ específicas para o antígeno de Survivina de consenso sintético foi semelhante para ambas os constru- tos, entre os grupos de quantidade de dose, e foi composto principal- mente por células IFNγ+IL-2+TNFα+, IFNγ+IL-2-TNFα+, ou IFNγ+IL-2- TNFα- (Fig. 7G, Fig. 7H). A frequência de células T CD4+ específicas de antígeno é mais detalhada na Tabela 6. Tabela 6. Respostas de células T CD4+ induzidas pelo antígeno de Survivina 1 de consenso sintético e antígeno de Survivina 1T3 de consenso sintético. Antígeno de Survivina 1 de consenso sintético Antígeno de Survivina 1T3 de consenso sinté- tico + Quanti- % CD4 ± Quanti- % CD4+ ± Construto dade de Desvio Pa- valor-p Construto dade de Desvio Pa- valor-p dose drão dose drão pGX0001 30 µg 0,03 ± 0,05 n/a pGX0001 30 µg 0,05 ± 0,05 n/a 10 µg 0,86 ± 0,31 p = 0,105 10 µg 0,62 ± 0,35 p = 0,248 20 µg 1,08 ± 0,65 p = 0,024 20 µg 1,02 ± 0,59 p = 0,010 pGX1428 pGX1429 30 µg 0,82 ± 0,46 p = 0,134 30 µg 1,08 ± 0,47 p = 0,006 50 µg 1,21 ± 0,73 p = 0,009 50 µg 1,13 ± 0,44 p = 0,004 Os valores de p relatados são relativos a naïve (camundongos imuni- zados com pGX0001)

[00229] Não houve diferença significativa na frequência de células T CD8+ específicas de antígeno induzida por antígeno de Survivina 1 de consenso sintético (p = 0,117) (Fig. 7C). A Survivina 1T3 induziu uma frequência significativamente maior de células T CD8+ específicas de antígeno entre os grupos de quantidade de dose (p = 0,043). A frequên- cia de respostas T CD8+ específicas de antígeno nos grupos imuniza- dos com 10 μg (0,15% ± 0,09%) (p = 0,919), 20 μg (0,27% ± 0,21%) (p = 0,274) ou 30 μg (0,25% ± 0,14%) (p = 0,377) do pGX1429 não alcan- çou significância estatística em comparação com naïve (0,07% ± 0,01%). A frequência de células T CD8+ específicas de Survivina 1T3 alcançou significância estatística (0,36% ± 0,21%) (p = 0,051) no grupo imunizado com 50 μg de pGX1429 (Fig. 7F). Tanto o antígeno de Sur- vivina 1 de consenso sintético quanto o antígeno de Survivina 1T3 de consenso sintético induziram respostas de células T CD8+ semelhantes em magnitude e fenótipo. As células T CD8+ específicas de antígeno eram principalmente IFNγ+IL-2-TNFα-, IFNγ+IL-2-TNFα+ (Fig. 7G, Fig. 7H). A frequência de células T CD8+ específicas de antígeno é mais detalhada na Tabela 7. Tabela 7. Respostas de células T CD8+ induzidas pelo antígeno de Survivina 1 de consenso sintético e antígeno de Survivina 1T3 de consenso sintético Antígeno de Survivina 1 de consenso sintético Antígeno de Survivina 1T3 de consenso sintético + Quanti- % CD8 ± Quanti- % CD8+ ± Construto dade de Desvio Pa- valor-p Construto dade de Desvio Pa- valor-p dose drão dose drão pGX0001 30 µg 0,03 ± 0,01 pGX0001 30 µg 0,07 ± 0,01 n/a 10 µg 0,21 ± 0,11 n/a 10 µg 0,15 ± 0,09 p = 0,919 20 µg 0,35 ± 0,31 entre os 20 µg 0,27 ± 0,21 p=0,274 pGX1428 pGX1429 30 µg 0,25 ± 0,12 grupos p = 30 µg 0,25 ± 0,14 p=0,377 50 µg 0,24 ± 0,15 0,117 50 µg 0,36 ± 0,21 p=0,051 Os valores de p relatados são relativos a naïve (camundongos imuni- zados com pGX0001)

[00230] Aproximadamente 25% das células T CD4+ positivas para citocinas induzidas por antígeno de Survivina 1 de consenso sintético (Fig. 10A) e antígeno de Survivina 1T3 de consenso sintético (Fig. 10B) também foram positivas para CD107a, indicando algum potencial para a função citolítica mediada por células T CD4+. Todas as quantidades de doses do antígeno de Survivina 1 de consenso sintético induziram uma frequência de células T CD4+CD107a+ significativamente maior que naïve (0,01% ± 0,01%). Especificamente, a frequência de células T CD4+CD107a+ específicas de antígeno foi de 0,25% ± 0,08%, 0,36% ± 0,11%, 0,21% ± 0,15% e 0,38% ± 0,13% nos grupos de quantidade de dose de 10 µg (p=0,013), 20 µg (p<0,001), 30 μg (p=0,050) e 50 μg (p0,001), respectivamente (Fig. 10A). O antígeno de Survivina 1T3 de consenso sintético induziu uma frequência de células T CD4+CD107a+ significativamente maior que naïve (0,01 ± 0,01) em todos os grupos, exceto no grupo de quantidade de dose de 10 μg (0,18% ±.0,09%) (p =

0,147). A frequência de células T CD4+CD107a+ específicas de antí- geno foi de 0,24% ± 0,12%, 0,27% ± 0,12% e 0,29% ± 0,16% nos grupos de quantidade de dose de 20 μg (p = 0,030), 30 μg (p = 0,010) e 50 μg (p = 0,004), respectivamente (Fig. 10B). A frequência de células T CD4+ específicas de antígeno com potencial citolítico é mais detalhada na Ta- bela 8. Tabela 8. Potencial citolítico de células T CD4+ específicas de antí- geno induzidas por antígeno de Survivina 1 de consenso sintético e antígeno de Survivina 1T3 de consenso sintético. Antígeno de Survivina 1 de consenso sintético Antígeno de Survivina 1T3 de consenso sintético % Quanti- % Quanti- Cons- Cons- CD4+CD107a+ dade de CD4+CD107a+ ± valor-p dade de valor-p truto truto ± Desvio Pa- dose Desvio Padrão dose drão pGX0001 30 µg 0,01, 0,01 n/a pGX0001 30 µg 0,01, 0,01 n/a 10 µg 0,25 ± 0,08 p = 0,013 10 µg 0,18 ±.0,09 p = 0,147 20 µg 0,36 ± 0,11 p<0,001 20 µg 0,24 ± 0,12 p = 0,030 pGX1428 pGX1429 30 µg 0,21 ± 0,15 p = 0,050 30 µg 0,27 ± 0,12 p = 0,010 50 µg 0,38 ± 0,13 p<0,001 50 µg 0,29 ± 0,16 p = 0,004 Os valores de p relatados são relativos a naïve (camundongos imuniza- dos com pGX0001)

[00231] Semelhante à magnitude das células T CD8+ específicas do antígeno, o antígeno de Survivina 1 de consenso sintético não induziu uma alteração significativa na frequência das células T CD8+CD107a+ entre todos os grupos (p = 0,101) (Fig. 10C). O antígeno de Survivina 1T3 de consenso sintético induziu uma mudança significativa na fre- quência de células T CD8+CD107a+ entre todos os grupos de doses (p = 0,034) (Fig. 10D). A frequência de células T CD8+CD107a+ específi- cas de antígeno aumentou significativamente acima da naïve (0,03 ± 0,01) no grupo imunizado com 50 μg de pGX1429 (0,28% ± 0,22%) (p = 0,026), mas não nos grupos imunizados com 10 μg (0,11% ± 0,08%) (p = 0,813), 20 µg (0,16% ± 0,11%) (p = 0,450), 30 µg (0,16% ± 0,07%) (p = 0,424) do antígeno de Survivina 1T3 de consenso sintético. O perfil de citocinas das células T CD8+CD107a+ específicas para o antígeno de Survivina de consenso sintético foi semelhante para ambas os cons- trutos, entre os grupos de quantidade de dose, e foi composto principal- mente por células IFNγ+IL-2-TNFα+, IFNγ+IL-2-TNFα- cells (Fig. 7G, Fig. 7H). A frequência de células T CD8+ específicas de antígeno com potencial citolítico é mais detalhada na Tabela 9. Tabela 9. Potencial citolítico de células T CD8+ específicas de antí- geno induzidas por antígeno de Survivina 1 de consenso sintético e antígeno de Survivina 1T3 de consenso sintético. Antígeno de Survivina 1 de consenso sintético Antígeno de Survivina 1T3 de consenso sintético Quanti- % de Quanti- % de Cons- Cons- valor- dade de CD8+CD107a+ ± valor-p dade de CD8+CD107a+ ± truto truto p dose Desvio Padrão dose Desvio Padrão pGX0001 30 µg 0,01, 0,01 pGX0001 30 µg 0,03 ± 0,01 n/a 0,11 ± 0,08 p = 10 µg 0,18 ± 0,10 10 µg 0,813 n/a 0,16 ± 0,11 p = 20 µg 0,31 ± 0,28 20 µg 0,450 pGX1428 pGX1429 entre 0,16 ± 0,07 p = 30 µg 0,21 ± 0,10 os gru- 30 µg 0,424 pos p = 0,28 ± 0,22 p= 50 µg 0,21 ± 0,16 0,101 50 µg 0,026 Os valores de p relatados são relativos a naïve (camundongos imuni- zados com pGX0001) Amplitude das respostas de IFNγ induzidas pelos Construtos de antígeno de Survivina de consenso sintético

[00232] A amplitude das respostas de IFNy à Survivina induzida por pGX1428 e pGX1429 foi examinada por mapeamento de epítopos usando uma abordagem de grupo de matriz peptídica (Fig. 11A - 11D). Foram examinados linfócitos esplênicos agrupados de camundongos imunizados com a maior dose de pGX1428 (n = 8) (Fig. 11A) ou pGX1429 (n = 8) (Fig. 11B).

[00233] Os seguintes epítopos de antígeno 1 de Survivina de con- senso sintético estavam presentes no pGX1428 e no pGX1429: LPPAWQLFLKDHRISTFKN (SEQ ID NO:5) (conjuntos de matrizes 1, 2, 3, 4 e 7)

LKLDRERAKNKIAKETNNK (SEQ ID NO:6) (conjuntos de matrizes 1, 2, 3, 4 e 11) Epítopos do antígeno de Survivina T3 de consenso sintético presentes em pGX1429: EWLHHFQGLFP (SEQ ID NO:7) (conjuntos de matrizes 3, 4 e 7)

[00234] Enquanto a magnitude total das respostas imunes celulares induzidas pelo antígeno de Survivina 1 de consenso sintético e antígeno de Survivina 1T3 de consenso sintético foi semelhante, as respostas induzidas pelo antígeno de Survivina 1T3 de consenso sintético (pGX1429) contra a região do antígeno de Survivina 1 de consenso sin- tético (pGX1428) do antígeno de Survivina 1T3 de consenso sintético foi aproximadamente metade da magnitude daquelas induzidas pelo construto do antígeno de Survivina 1 de consenso sintético (pGX1428). O mapeamento de epítopos por IFNγ ELISpot usando uma abordagem matricial revelou que ambos os construtos de antígeno de Survivina de consenso sintético geram respostas para os mesmos epítopos no antí- geno de antígeno de Survivina 1 de consenso sintético, mas as respos- tas conduzidas pelo antígeno de Survivina 1T3 de consenso sintético contra esses epítopos são de menor magnitude. Também foi determi- nado que existe um epítopo único na região T3 do antígeno de antígeno de Survivina 1T3 de consenso sintético.

[00235] Enquanto a magnitude total das respostas imunes celulares induzidas pelo antígeno de Survivina 1 de consenso sintético (pGX1428) e antígeno de Survivina 1T3 de consenso sintético (pGX1429) foram semelhantes, as respostas induzidas pelo antígeno de Survivina 1T3 de consenso sintético (pGX1429) contra a região do antígeno de Survivina 1 de consenso sintético do antígeno de antígeno Survivina 1T3 de con- senso sintético foi aproximadamente metade da magnitude daquelas in- duzidas pelo construto do antígeno de Survivina 1 de consenso sintético (pGX1428). O mapeamento de epítopos por IFNγ ELISpot usando uma abordagem matricial revelou que ambos os construtos de antígeno de Survivina de consenso sintético geram respostas para os mesmos epí- topos do antígeno de antígeno de Survivina 1 de consenso sintético, mas as respostas conduzidas pelo antígeno de Survivina 1T3 de con- senso sintético contra esses epítopos são de menor magnitude. Tam- bém foi determinado que existe um epítopo único na região T3 do antí- geno de antígeno de Survivina 1T3 de consenso sintético utilizando essa abordagem. O antígeno de Survivina 1T3 de consenso sintético também aumentou significativamente a frequência das células T CD8+ e CD8+CD107a+ específicas de antígeno, em comparação com naïve, enquanto o antígeno de Survivina 1 de consenso sintético não aumen- tou significativamente as células T CD8+ específicas de antígeno em camundongos. O antígeno de Survivina 1T3 de consenso sintético (pGX1429) foi selecionado para avançar para um estudo monovalente de primatas não humanos com base em seu potencial para intensificar ainda mais a amplitude das respostas imunes celulares à Survivina em comparação com o pGX1428 em camundongos. Exemplo 5 - Estudos de primatas não humanos usando antígeno de Survivina 1T3 de consenso sintético (pGX1429)

[00236] Para investigar o potencial do Survivina 1T3 de Consenso Sintético sozinho e em combinação com uma dose alta e baixa de IL- 12, dezoito macacos rhesus adultos, cada um identificado por um nú- mero único de identificação do NHP, foram divididos em 3 grupos de 6 e imunizados com pGX1429 como segue. Seis animais foram imuniza- dos com 3,0 mg de pGX1429, seis com 3,0 mg de pGX1429 mais 0,04 mg de pGX6006 (opt rh IL-12) como um adjuvante e seis com 3,0 mg de pGX1429 mais 0,20 mg de pGX6006 (opt rh IL-12) como um adju- vante, foi formulado em SSC em 1,0 mL de volume de injeção. As inje- ções de imunização foram administradas nas semanas 0, 4, 8 e 12. To-

das as imunizações foram realizadas por via intramuscular com o dis- positivo CELLECTRA® 2000 5P-IM EP em um volume de injeção de 1 ml formulado em WFI estéril em membros contralaterais alternados de acordo. As condições de EP foram as seguintes: OpBlock 0070 - IM, 0,5 Amp, 3 pulsos, 52 ms, 0,2 s entre pulsos. A imunogenicidade da Survi- vina foi avaliada nas semanas 2, 6, 10 e 14. As respostas de IFN-gama específicas da Survivina são mostradas nas Figs. 12 e 13. A homologia entre a Survivina rhesus nativa e o pGX1429 é apresentada na Tabela

10. Como mostrado nas Figs. 13 e 14, foram observados aumentos nas respostas específicas de Survivina em animais imunizados com antí- geno de Survivina 1T3 de consenso sintético mais 0,20 mg de IL-12 como adjuvante. Isolamento de PBMC

[00237] O sangue total de primata não humano foi coletado em tubos de preparação de células de citrato de sódio (BD Biosciences da CPT CPT) contendo um anticoagulante e uma barreira de gel. Antes do envio durante a noite, o sangue total é girado logo após a coleta (dentro de 2 horas) para separar e concentrar a PMBC. Os glóbulos vermelhos e os neutrófilos aglomeram-se no fundo dos tubos e são mantidos no lugar por uma barreira de gel. O plasma e os linfócitos permanecem acima da barreira do gel. Cada CPT pode conter ~ 8mL de sangue e é enviado à temperatura ambiente. Os tubos de CPT girados foram processados para isolamento de PBMC. Após a lise dos glóbulos vermelhos com tam- pão de amônio-cloreto-potássio (ACK), as células viáveis foram conta- das usando o contador automático de células Invitrogen CountessTM e ressuspensas em meio de cultura completo (RPMI 1640 suplementado com 10% de FBS, antibióticos e β-mercaptoetanol). Após a conclusão dos ensaios aqui descritos, as PBMCs restantes foram congeladas em meio de congelamento (10% DMSO da Sigma em 90% FBS da Sera-

digm) em frascos criogênicos e armazenados a longo prazo em nitrogê- nio líquido. IFNγ ELISpot

[00238] Para avaliar as respostas celulares específicas do antígeno induzidas pela vacina, um ensaio de IFNγ ELISpot de Macaco foi reali- zado a cada momento em PMBCs isolados usando um kit (MabTech IFNγ ELISpotPro, # 3421M-2APW-10). Em resumo, as placas de 96 po- ços pré-revestidas com anticorpo IFNγ anti-Macaco (mAb MT126L) fo- ram lavadas em PBS e bloqueadas por 2 horas em temperatura ambi- ente com meio de cultura completo (RPMI 1640 suplementado com 10% de FBS, antibióticos e β-mercaptoetanol). NHP PBMC foram ressuspen- sos em meio R10 (e depois adicionados em triplicados a um número de células de entrada de 2×105 células por poço. Um conjunto de peptídeos foi sintetizado (GenScript), cada um contendo 15 resíduos de aminoáci- dos sobrepostos por 11 aminoácidos representando toda a sequência de proteínas de consenso sintético. Esses conjuntos de peptídeos foram ressuspensos em DMSO (Sigma) e reunidos em uma concentração de aproximadamente 2 µg/mL de cada peptídeo respectivo, em conjuntos. Todos os peptídeos combinados específicos para o antígeno são utili- zados na diluição de 1:100, o que resulta em uma diluição final de 1:200 em cada poço, quando combinados com PBMC. A variação no tamanho de cada proteína antigênica resultou em 2 conjuntos de peptídeos para a Survivina.

[00239] Anti-CD3 (mAb CD-2 Mabtech) e/ou PMA (Sigma) com Iono- micina (Sigma) foram utilizados como controle positivo. O meio de cul- tura R10 completo foi usado como controle negativo. As placas foram incubadas por aproximadamente 18 horas a 37°C, em uma incubadora de atmosfera de 5% de CO2. Após remoção das células e adição de um anticorpo de detecção de IFNγ anti-macaco conjugado com ALP (Mab-

Tech Ab 7-B6-1-ALP), as placas foram incubadas por 2 horas à tempe- ratura ambiente. O ensaio imunoenzimático em sanduíche é então de- senvolvido usando a solução de substrato BCIP/NBT de acordo com as instruções do fabricante do kit (MabTech). Um precipitado de cor azul- preto se forma como manchas para revelar cada célula produtora de IFNγ individual. Os pontos são escaneados e contados pelo analisador e software CTL ImmunoSpot® (Cellular Technology), e a qualidade é controlada por um operador treinado. As respostas IFNγ são relatadas como Unidades Formadoras de Pontos (SFU) para 1x106 PBMC maio- res que a SFU no controle apenas de meio. Tabela 10. Características do antígeno de Survivina 1T3 de con- senso sintético comparado com Survivina rhesus nativa. Região Rhesus nativa pGX1429 Comprimento total 95,8% (NP_001253110.1) pGX1429 Região da isoforma 1 95,9% (NP_001253110.1) pGX1429 Região T3 9,4% (NP_001253110.1) Tabela 11. Construto, Antígeno, Dose ID de Construto Antígeno Dose (mg) pGX1429 Survivina 1T3 de consenso sintético 3 pGX6006 opt rIL-12 0,04 ou 0,2

[00240] Os grupos 1, 2 e 3 receberam o seguinte:  Grupo 1 - 3,0 mg de pGX1429 (Survivina 1T3 de consenso sintético). Formulado em SSC, 1,0 mL de volume de injeção, IM.  Grupo 2 - 3,0 mg de pGX1429 (Survivina 1T3 de Consenso Sintético) + 0,04 pGX6006 (opcional rIL-12). Formulado em SSC, 1,0 mL de volume de injeção, IM.  Grupo 3 - 3,0 mg de pGX1429 (Survivina 1T3 de Consenso Sintético) + 0,20 pGX6006 (opt. RIL-12). Formulado em SSC, 1,0 mL de volume de injeção, IM.

[00241] Todos os grupos foram imunizados de acordo com o se- guinte esquema:  Imunização 1 (Semana 0)  Imunização 2 (Semana 4)  Imunização 3 (Semana 8)

 Imunização 4 (Semana 12)  Imunização 5 (Opcional) Resultados

[00242] As respostas IFNγ específicas de Survivina são mostradas nas Figs. 12-14 para os Grupos 1-3, respectivamente. Os resultados mostram a resposta em cada momento 2 semanas após a dose. No ge- ral, todos os grupos e animais individuais tiveram um aumento na res- posta até o final do estudo 2 semanas após a dose 4 em comparação com o pré-sangramento de linha de base. A adição da dose mais alta de IL-12 (0,2 mg) resultou em respostas maiores e mais consistentes em cada momento, em comparação com a Survivina sozinha ou a Sur- vivina mais 0,04 mg de IL-12. Respostas mais altas já em PD2 também foram observadas para Survivina mais IL-12 0,2 mg.

[00243] Não houve diferenças em nenhum dos parâmetros fisiológi- cos medidos devido à imunização, como mostrado nas Tabelas 12-14. Não foram observadas diferenças significativas para glóbulos verme- lhos, HCTs, neutrófilos, linfócitos, monócitos e eosinófilos (resultados não mostrados). Esses valores estão dentro das faixas esperadas para animais dessa espécie, gênero e idade submetidos a procedimentos ex- perimentais semelhantes. Quaisquer variações das faixas normais de- claradas são de natureza esporádica, presentes em apenas um gênero e não estão relacionadas a níveis de dose ou tempo. Tabela 12. Avaliação de parâmetros fisiológicos no Grupo 1 Pré-vacinação Pós-vacinação Grupo 1 Faixa Normal Semana 2 Semana 6 Semana 14 Contagem de leucócitos (#/103/ml) 7,8-14,3 4,8-9,6 4,9-11,2 4,0-15,0 Creatinina (mg/dL) 0,4 - 0,8 0,4-0,7 0,4 - 0,8 0,3-1,4 BUN (mg/dL) 11-17 13-18 13-18 9-29 ALK P (U/L) 232-491 184-491 212-505 65-641 17*-24 10*-24 20*-36 AST (U/L) 23-175 (#6867, 6859, 6892, 6873) (#6867, 6859, 6892, 6873, 6879) (#6859) ALT (U/L) 20-40 17-38 12-31 18-204 TBIL (mg/dL) 0,1-0,2 0,1-0,2 0,1-0,2 0,1-0,6

Nota: Fora da faixa normal* Tabela 13. Avaliação de parâmetros fisiológicos no Grupo 2 Pré-vacinação Pós-vacinação Grupo 2 Faixa Normal Semana 2 Semana 6 Semana 14 Contagem de leucócitos (#/103/ml) 6,3-10,8 5,7-8,5 6,2-12,1 4,0-15,0 Creatinina (mg/dL) 0,6-0,7 0,5-0,6 0,5 - 0,7 0,3-1,4 BUN (mg/dL) 10 -19 12-21 10-23 9-29 ALK P (U/L) 269-508 279-521 295-455 65-641 15*-32 12*-26 21*-38 AST (U/L) 23-175 (#6868, 6874, 6880, 6887, 6893) (#6874, 6868, 6861) (#6893) 16*-28 ALT (U/L) 19-33 19-30 18-204 (#6861) TBIL (mg/dL) 0,1-0,2 0,2 0,1-0,2 0,1-0,6 Nota: Fora da faixa normal* Tabela 14. Avaliação de parâmetros fisiológicos no Grupo 3 Pré-vacinação Pós-vacinação Grupo 3 Faixa Normal Semana 2 Semana 6 Semana 14 Contagem de leucócitos (#/103/ml) 6,0-12,8 5,6-9,2 5,8-9,8 4,0-15,0 Creatinina (mg/dL) 0,5 - 0,7 0,4-0,7 0,5 - 0,7 0,3-1,4 BUN (mg/dL) 10-16 14-18 9-20 9-29 ALK P (U/L) 186-345 156-406 198-476 65-641 12*-47 12*-68 AST (U/L) 23-43 23-175 (#6894, 6869) (#6894, 6869) 16*-56 15*-55 ALT (U/L) 20-44 18-204 (#6863) (#6894) TBIL (mg/dL) 0,1-0,2 0,2-0,4 0,1-0,2 0,1-0,6 Nota: Fora da faixa normal*

[00244] Para todos os grupos, não houve alteração significativa no peso ao longo do estudo (dados não mostrados).

[00245] No geral, os resultados indicam que a Survivina de Con- senso Sintético administrada isoladamente é capaz de induzir uma res- posta imune em 100% dos NHPs. A adição de adjuvante de IL-12 me- lhorou a resposta observada para Survivina de Consenso Sintético, re- sultando em uma resposta PD2 muito mais precoce, mas apenas com a dose mais alta de IL-12.

[00246] Entende-se que a descrição detalhada citada acima e exem- plos anexos são meramente ilustrativos e não devem ser considerados como limitações sobre o escopo da invenção, que é exclusivamente de- finida pelas reivindicações anexas e seus equivalentes.

[00247] Várias mudanças e modificações nas modalidades divulga- das serão evidentes para os especialistas na técnica. Tais alterações e modificações nas modalidades divulgadas, incluindo, sem limitação, aquelas relacionadas às estruturas químicas, substituintes, derivados, intermediários, sínteses, composições, formulações ou métodos de uso da invenção, podem ser feitas sem se afastar do espírito e escopo da mesma.

Claims

REIVINDICAÇÕES

1. Molécula de ácido nucleico, caracterizada pelo fato de que compreende uma ou mais sequências de ácidos nucleicos selecionadas do grupo que consiste em: (a) uma sequência de ácido nucleico que codifica os aminoácidos 19-159 de SEQ ID NO:2; (b) uma sequência de ácido nucleico que codifica os aminoácidos 19-210 de SEQ ID NO:4; (c) uma sequência de ácido nucleico que codifica os aminoácidos 19-232 de SEQ ID NO:8; (d) uma sequência de ácido nucleico que codifica um fragmento compreendendo pelo menos 90% de um comprimento inteiro de amino- ácidos 19-159 de SEQ ID NO:2; (e) uma sequência de ácido nucleico que codifica um fragmento compreendendo pelo menos 90% de um comprimento inteiro de amino- ácidos 19-210 de SEQ ID NO:4; (f) uma sequência de ácido nucleico que codifica um fragmento compreendendo pelo menos 90% de um comprimento inteiro de amino- ácidos 19-232 de SEQ ID NO:8; (g) uma sequência de ácido nucleico que codifica uma proteína que é pelo menos 95% idêntica aos aminoácidos 19-159 de SEQ ID NO:2; (h) uma sequência de ácido nucleico que codifica uma proteína que é pelo menos 95% idêntica aos aminoácidos 19-210 de SEQ ID NO:4; (i) uma sequência de ácido nucleico que codifica uma proteína que é pelo menos 95% idêntica aos aminoácidos 19-232 de SEQ ID NO:8; (j) uma sequência de ácido nucleico que codifica um fragmento compreendendo pelo menos 90% de um comprimento inteiro de uma proteína que é pelo menos 95% idêntica aos aminoácidos 19-159 de SEQ ID NO:2; (k) uma sequência de ácido nucleico que codifica um fragmento compreendendo pelo menos 90% de um comprimento inteiro de uma proteína que é pelo menos 95% idêntica aos aminoácidos 19-210 de SEQ ID NO:4, e (l) uma sequência de ácido nucleico que codifica um fragmento compreendendo pelo menos 90% de um comprimento inteiro de uma proteína que é pelo menos 95% idêntica aos aminoácidos 19-232 de SEQ ID NO:8.

2. Molécula de ácido nucleico, caracterizada pelo fato de que compreende uma ou mais sequências de ácidos nucleicos selecionadas do grupo que consiste em: (a) nucleotídeos 55-423 de SEQ ID NO:1; (b) nucleotídeos 55-636 de SEQ ID NO:3; (c) um fragmento compreendendo pelo menos 90% de um com- primento inteiro de nucleotídeos 55-423 da SEQ ID NO:1; (d) um fragmento compreendendo pelo menos 90% de um com- primento inteiro de nucleotídeos 55-636 da SEQ ID NO:3; (e) um fragmento que é pelo menos 95% idêntico aos nucleotí- deos 55-423 de SEQ ID NO:1; (f) um fragmento que é pelo menos 95% idêntico aos nucleotídeos 55-636 de SEQ ID NO:3; (g) um fragmento compreendendo pelo menos 90% de uma se- quência de ácido nucleico que é pelo menos 95% idêntica aos nucleotí- deos 55-423 da SEQ ID NO:1; e (h) um fragmento compreendendo pelo menos 90% de uma se- quência de ácido nucleico que é pelo menos 95% idêntica aos nucleotí- deos 55-636 de SEQ ID NO:3.

3. Molécula de ácido nucleico, caracterizada pelo fato de que compreende uma ou mais sequências de ácidos nucleicos selecionadas do grupo que consiste em: (a) uma sequência de ácido nucleico que codifica SEQ ID NO:2; (b) uma sequência de ácido nucleico que codifica SEQ ID NO:4; (c) uma sequência de ácido nucleico que codifica SEQ ID NO:8; (d) uma sequência de ácido nucleico que codifica um fragmento compreendendo pelo menos 90% de um comprimento inteiro de SEQ ID NO:2; (e) uma sequência de ácido nucleico que codifica um fragmento compreendendo pelo menos 90% de um comprimento inteiro de SEQ ID NO:4; (f) uma sequência de ácido nucleico que codifica um fragmento compreendendo pelo menos 90% de um comprimento inteiro de SEQ ID NO:8; (g) uma sequência de ácido nucleico que codifica uma proteína que é pelo menos 95% idêntica à SEQ ID NO:2; (h) uma sequência de ácido nucleico que codifica uma proteína que é pelo menos 95% idêntica à SEQ ID NO:4 (i) uma sequência de ácido nucleico que codifica uma proteína que é pelo menos 95% idêntica à SEQ ID NO:8; (j) uma sequência de ácido nucleico que codifica um fragmento compreendendo pelo menos 90% de um comprimento inteiro de uma proteína que é pelo menos 95% idêntica à SEQ ID NO:2; (k) uma sequência de ácido nucleico que codifica um fragmento compreendendo pelo menos 90% de um comprimento inteiro de uma proteína que é pelo menos 95% idêntica à SEQ ID NO:4; e (l) uma sequência de ácido nucleico que codifica um fragmento compreendendo pelo menos 90% de um comprimento inteiro de uma proteína que é pelo menos 95% idêntica à SEQ ID NO:8.

4. Molécula de ácido nucleico, caracterizada pelo fato de que compreende uma ou mais sequências de ácidos nucleicos selecionadas do grupo que consiste em: (a) SEQ ID NO:1; (b) SEQ ID NO:3; (c) um fragmento compreendendo pelo menos 90% de um com- primento inteiro de SEQ ID NO:1; (d) um fragmento compreendendo pelo menos 90% de um com- primento inteiro de SEQ ID NO:3; (e) um fragmento que é pelo menos 95% idêntico à SEQ ID NO:1; (f) um fragmento que é pelo menos 95% idêntico à SEQ ID NO:3; (g) um fragmento compreendendo pelo menos 90% de um com- primento inteiro de uma sequência de ácido nucleico que é pelo menos 95% idêntica à SEQ ID NO:1; e (h) um fragmento compreendendo pelo menos 90% de um com- primento inteiro de uma sequência de ácido nucleico que é pelo menos 95% idêntica à SEQ ID NO:3.

5. Molécula de ácido nucleico, caracterizada pelo fato de que compreende a sequência de ácido nucleico estabelecida em SEQ ID NO:1.

6. Molécula de ácido nucleico, caracterizada pelo fato de que compreende a sequência de ácido nucleico estabelecida em SEQ ID NO:3.

7. Vetor, caracterizado pelo fato de que compreende a mo- lécula de ácido nucleico, como definida em qualquer uma das reivindi- cações 1 a 6.

8. Vetor, de acordo com a reivindicação 7, caracterizado pelo fato de que compreende um plasmídeo ou um vetor viral.

9. Composição, caracterizada pelo fato de que compreende uma ou mais moléculas de ácido nucleico, como definidas em qualquer uma das reivindicações 1 a 6.

10. Composição, de acordo com a reivindicação 9, caracteri- zada pelo fato de que compreende ainda um veículo farmaceuticamente aceitável.

11. Composição, caracterizada pelo fato de que compreende um ou mais vetores, como definidos na reivindicação 7 ou 8.

12. Proteína, caracterizada pelo fato de que compreende a sequência de aminoácido selecionada do grupo que consiste em: (a) aminoácidos 19-159 de SEQ ID NO:2; (b) aminoácidos 19-210 da SEQ ID NO:4; (c) aminoácidos 19-232 da SEQ ID NO:8; (d) um fragmento compreendendo pelo menos 90% de um com- primento inteiro de aminoácidos 19-159 de SEQ ID NO:2; (e) um fragmento compreendendo pelo menos 90% de um com- primento inteiro de aminoácidos 19-210 de SEQ ID NO:4; (f) um fragmento compreendendo pelo menos 90% de um com- primento inteiro de aminoácidos 19-232 de SEQ ID NO:8; (g) uma sequência de aminoácidos que é pelo menos 95% idên- tica aos aminoácidos 19-159 da SEQ ID NO:2; (h) uma sequência de aminoácidos que é pelo menos 95% idên- tica aos aminoácidos 19-210 da SEQ ID NO:4; (i) uma sequência de aminoácidos que é pelo menos 95% idêntica aos aminoácidos 19-232 da SEQ ID NO:8; (j) um fragmento compreendendo pelo menos 90% de um com- primento inteiro de uma sequência de aminoácido que é pelo menos 95% idêntica aos aminoácidos 19-159 da SEQ ID NO:2; (k) um fragmento compreendendo pelo menos 90% de um com- primento inteiro de uma sequência de aminoácido que é pelo menos 95% idêntica aos aminoácidos 19-210 da SEQ ID NO:4; (l) um fragmento compreendendo pelo menos 90% de um com- primento inteiro de uma sequência de aminoácido que é pelo menos

95% idêntica aos aminoácidos 19-232 de SEQ ID NO:8.

13. Proteína, caracterizada pelo fato de que compreende a sequência de aminoácido selecionada do grupo que consiste em: (a) SEQ ID NO:2; (b) SEQ ID NO:4; (c) SEQ ID NO:8; (d) um fragmento compreendendo pelo menos 90% de um com- primento inteiro de SEQ ID NO:2; (e) um fragmento compreendendo pelo menos 90% de um com- primento inteiro de SEQ ID NO:4; (f) um fragmento compreendendo pelo menos 90% de um com- primento inteiro de SEQ ID NO:8; (g) uma sequência de aminoácido que é pelo menos 95% idêntica à SEQ ID NO:2; (h) uma sequência de aminoácido que é pelo menos 95% idêntica à SEQ ID NO:4; (i) uma sequência de aminoácido que é pelo menos 95% idêntica à SEQ ID NO:8; (j) um fragmento compreendendo pelo menos 90% de um com- primento inteiro de uma sequência de aminoácido que é pelo menos 95% idêntica à SEQ ID NO:2; (k) um fragmento compreendendo pelo menos 90% de um com- primento inteiro de uma sequência de aminoácido que é pelo menos 95% idêntica à SEQ ID NO:4; e (l) um fragmento compreendendo pelo menos 90% de um com- primento inteiro de uma sequência de aminoácido que é pelo menos 95% idêntica à SEQ ID NO:8.

14. Proteína, caracterizada pelo fato de que compreende a sequência de aminoácido estabelecida na SEQ ID NO:2.

15. Proteína, caracterizada pelo fato de que compreende a sequência de aminoácido estabelecida na SEQ ID NO:4.

16. Proteína, caracterizada pelo fato de que compreende a sequência de aminoácido estabelecida na SEQ ID NO:8.

17. Vacina, caracterizada pelo fato de que compreende a molécula de ácido nucleico, como definida em qualquer uma das reivin- dicações 1 a 6.

18. Vacina, caracterizada pelo fato de que compreende o ve- tor, como definido na reivindicação 7 ou 8.

19. Vacina, de acordo com a reivindicação 17 ou 18, carac- terizada pelo fato de que compreende ainda um excipiente farmaceuti- camente aceitável.

20. Vacina, de acordo com qualquer uma das reivindicações 17 a 19, caracterizada pelo fato de que compreende ainda um adju- vante.

21. Vacina, de acordo com a reivindicação 20, caracterizada pelo fato de que adjuvante é IL-12, IL-15, IL-28, ou RANTES.

22. Uso da molécula de ácido nucleico como definida em qualquer uma das reivindicações 1 a 6, caracterizado pelo fato de que é para a fabricação de um medicamento para tratar um indivíduo com uma célula cancerígena que expressa Survivina.

23. Uso, de acordo com a reivindicação 22, caracterizado pelo fato de que o medicamento é preparado para a administração por eletroporação.

24. Uso, de acordo com a reivindicação 23, caracterizado pelo fato de que o medicamento é preparado para a administração em um ou mais locais no indivíduo.

25. Uso da molécula de ácido nucleico como definida em qualquer uma das reivindicações 1 a 6, caracterizado pelo fato de que é na fabricação de uma vacina contra uma célula cancerígena que ex- pressa Survivina, em que a vacina é para ser administrada ao indivíduo em uma quantidade eficaz para induzir uma resposta imune humoral ou celular.

26. Uso, de acordo com a reivindicação 25, caracterizado pelo fato de que a vacina é preparada para administração por eletropo- ração.

27. Uso, de acordo com a reivindicação 26, caracterizado pelo fato de que a vacina é preparada para administração em um ou mais locais no indivíduo.

28. Invenção, caracterizada em quaisquer formas de suas concretizações ou em qualquer categoria aplicável de reivindicação, por exemplo, de produto ou de processo ou uso ou qualquer outro tipo de reivindicação englobada pela matéria inicialmente descrita, revelada ou ilustrada no pedido de patente.