CN104284674A - 前列腺相关抗原及基于疫苗的免疫治疗疗法 - Google Patents

前列腺相关抗原及基于疫苗的免疫治疗疗法 Download PDF

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Abstract

本发明提供(a)分离的免疫原性PAA多肽；(b)编码免疫原性PAA多肽之分离的核酸分子；(c)包含免疫原性PAA多肽或编码免疫原性PAA多肽之分离的核酸分子的疫苗组合物；(d)与使用多肽、核酸分子及组合物相关之方法；及(e)基于疫苗之免疫治疗疗法，其包括共同施用疫苗与免疫抑制细胞抑制剂及免疫效应细胞增强剂之组合。

Description

前列腺相关抗原及基于疫苗的免疫治疗疗法
对相关申请之参考
本申请要求2012年5月4日申请之美国临时申请第61/642,844号之权益，该申请以全文引用的方式并入本文中。
对序列表之参考
本申请正与呈电子格式之序列表一起提交。序列表以名称为“PC71854A SEQ LISTING_ST25.TXT”之.txt格式文档提供，其创建于2013年4月4日且大小为257KB。该.txt文档中所含之序列表为本说明书之一部分且以全文引用的方式并入本文中。
技术领域
本发明大体上涉及免疫治疗且具体而言，涉及治疗或预防赘生性病症之疫苗及方法。
现有技术
在世界范围内，癌症为死亡之一个主要诱因。传统癌症管理疗法已成功地管理循环癌症及实体癌症之选择性群组。然而，许多肿瘤对传统方法具有抗性。近年来，已研究治疗癌症之免疫疗法，该方法包括通过在远离肿瘤之部位施用疫苗组合物来产生宿主源全身性肿瘤特异性主动免疫反应。已提出多种类型疫苗，包括含有分离之肿瘤相关抗原的疫苗。
在全世界发达国家中，前列腺癌为第二最常诊断出之癌症且为人类之癌症相关死亡之第四主要诱因。已证明与正常对应物相比，前列腺癌细胞过度表达各种前列腺相关抗原(PAA)，诸如前列腺特异性抗原(PSA)、前列腺特异性膜抗原(PSMA)及前列腺干细胞抗原(PSCA)。因此，此等抗原代表经由使用基于疫苗之免疫疗法诱导针对表达所述抗原之癌症之特异性免疫反应的可能标靶。(参看例如Marrari,A.,M.Iero等人,(2007).“Vaccination therapy in prostate cancer”.Cancer ImmunolImmunother 56(4):429-45。)
PSCA为123个氨基酸之膜蛋白。全长人类PSCA之氨基酸序列由SEQ ID NO:21之氨基酸4-123组成。PSCA具有高度组织特异性且表达于超过85％前列腺癌样本上，其中表达量随着格里森分数(Gleason score)提高及雄激素非依赖性增强而增加。其表达于80-100％前列腺癌骨转移患者中。
PSA为激肽释放酶样丝氨酸蛋白酶，其完全由前列腺之腺泡及导管衬层中之柱状上皮细胞产生。PSA mRNA翻译为具有261个氨基酸之非活性前原PSA前体。前原PSA具有24个额外残基，所述残基构成前区(信号多肽)及原多肽。原多肽之释放产生具有237个氨基酸之成熟细胞外形式，该形式具有酶活性。人类全长PSA之氨基酸序列提供于SEQ IDNO:15中。PSA具有器官特异性，且因此，其由良性前列腺增生(BPH)组织、原发性前列腺癌组织及转移性前列腺癌组织之上皮细胞产生。
PSMA，亦称为叶酸水解酶1(FOLH1)，由750个氨基酸组成。人类全长PSMA之氨基酸序列提供于SEQ ID NO:1中。PSMA包括细胞质域(氨基酸1-19)、跨膜域(氨基酸20-43)及细胞外域(氨基酸44-750)。PSMA为表达于前列腺癌细胞表面上及新生血管上之II型二聚跨膜蛋白。其亦表达于正常前列腺细胞、脑、唾液腺及胆道系统上。然而，在前列腺癌细胞中，发现其表达量为正常组织的1000倍。其充分表达于诸如结肠癌、乳癌、肝癌、膀胱癌、胰腺癌、肺癌、肾癌以及黑素瘤及肉瘤之多种其它实体肿瘤之新生血管上。因此，PSMA不仅被视为前列腺癌细胞特异性标靶，而且为其它癌症之全癌标靶。PSMA之表达似乎为前列腺癌之通用特征且其增强之表达与肿瘤侵袭有关。PSMA表达在高等级肿瘤、转移性病变及雄激素非依赖性疾病中最高。
虽然已鉴别许多肿瘤相关抗原且已研究许多此等抗原作为基于蛋白质或基于DNA之疫苗用于治疗或预防癌症，但迄今大部分临床试验未能产生治疗性产品。开发癌症疫苗之挑战之一在于癌症抗原通常来源于自身且因此具有不良免疫原性，此系因为免疫系统经自身调节而不识别自身蛋白质。因此，需要一种可增强癌症疫苗之免疫原性或治疗效应的方法。
已研究许多方法以便增强免疫原性或增强癌症疫苗之抗肿瘤效力。此种方法之一包括使用各种免疫调节剂，诸如TLR激动剂、TNFR激动剂、CTLA-4抑制剂及蛋白激酶抑制剂。
Toll样受体(TLR)为表达于造血细胞及非造血细胞上之1型膜受体。在TLR家族中，已鉴别至少11个成员。此等受体之特征在于其能够识别病原性生物体所表达之病原体相关分子模式(PAMP)。已发现触发TLR将通过增强细胞因子产生、趋化因子受体表达(CCR2、CCR5及CCR7)及协同刺激分子表达而引起深远炎症反应。因而，此等受体在先天免疫系统中对随之而来之后天免疫反应的极性发挥控制作用。在TLR中，已广泛研究TLR9在免疫反应中之功能。刺激TLR9受体通过增加促炎性细胞因子之产生及协同刺激分子对T细胞之呈递而将抗原呈递细胞(APC)导向激活强效TH1主导型T细胞反应。发现CpG寡核苷酸，即TLR9配体，为一类强效免疫刺激因子。已针对多种肿瘤模型在小鼠中测试CpG疗法，且一致显示促进肿瘤抑制或消退。
细胞毒性T淋巴细胞抗原4(CTLA-4)为免疫球蛋白超家族之成员且表达于辅助T细胞表面上。CTLA-4为CD28依赖性T细胞活化之负调节剂，且充当适应性免疫反应之抑制检查点。类似于T细胞协同刺激蛋白质CD28，CTLA-4结合抗原呈递细胞上之CD80及CD86。CTLA-4向T细胞传递抑制信号，而CD28传递刺激信号。针对人类CTLA-4之人类抗体已描述为许多疾病病状中之免疫刺激调节剂，诸如治疗或预防病毒性及细菌性感染以及用于治疗癌症(WO 01/14424及WO 00/37504)。各种临床前研究已显示单克隆抗体所致之CTLA-4阻断可增强针对免疫原性肿瘤之宿主免疫反应且甚至可排斥已确立之肿瘤。已在治疗各种类型实体肿瘤之临床试验中研究两种完全人类抗人类CTLA-4单克隆抗体(mAb)，即伊匹单抗(ipilimumab，MDX-010)及曲美目单抗(Tremelimumab，亦称为CP-675206)。
肿瘤坏死因子(TNF)超家族为接合特定同源细胞表面受体TNF受体(TNFR)超家族之一组细胞因子。肿瘤坏死因子超家族之成员通过配体介导之三聚合而起作用，从而募集若干个细胞内接附子以活化多个信号转导路径，诸如细胞凋亡、NF-kB路径、JNK路径，以及免疫及炎症反应。TNF超家族之实例包括CD40配体、OX40配体、4-1BB配体、CD27、CD30配体(CD153)、TNF-α、TNF-β、RANK配体、LT-α、LT-β、GITR配体及LIGHT。TNFR超家族包括例如CD40、OX40、4-1BB、CD70(CD27配体)、CD30、TNFR2、RANK、LT-βR、HVEM、GITR、TROY及RELT。在B淋巴细胞、树突状细胞、滤泡树突状细胞、造血祖细胞、上皮细胞及癌之表面上发现CD40。CD40结合配体(CD40-L)，该配体为糖蛋白且表达于活化T细胞(主要为CD4+以及一些CD8+)以及嗜碱细胞/肥大细胞上。由于CD40在先天性及适应性免疫反应中之作用，因此已研究CD40激动剂，包括各种CD40促效抗体，诸如完全人类激动剂CD40单克隆抗体CP870893，作为疫苗佐剂及用于治疗之用途。
蛋白激酶为催化蛋白质中之特定残基磷酸化的酶家族。蛋白激酶为信号转导路径中的关键元件，其负责将细胞外信号(包括细胞因子对其受体之作用)转导至细胞核，从而触发各种生物事件。蛋白激酶在标准细胞生理学中之许多作用包括细胞周期控制及细胞生长、分化、细胞凋亡、细胞迁移及有丝分裂。诸如c-Src、c-Abl、有丝分裂原活化蛋白质(MAP)激酶、磷脂酰肌醇-3-激酶(PI3K)AKT及表皮生长因子(EGF)受体之激酶通常在癌细胞中活化且已知有助于肿瘤形成。逻辑上，目前正开发许多激酶抑制剂用于抗癌症治疗，详言之酪氨酸激酶抑制剂(TKI)、细胞周期素依赖性激酶抑制剂、极光(aurora)激酶抑制剂、细胞周期检查点抑制剂、表皮生长因子受体(EGFR)抑制剂、FMS样酪氨酸激酶抑制剂、来源于血小板之生长因子受体(PDGFR)抑制剂、激酶插入域抑制剂、靶向PI3K/Akt/mTOR路径之抑制剂、靶向Ras-Raf-MEK-ERK(ERK)路径之抑制剂、血管内皮生长因子受体(VEGFR)激酶抑制剂、c-kit抑制剂及丝氨酸/苏氨酸激酶抑制剂。临床研究中已研究用于抗癌症疗法之许多激酶抑制剂，包括例如MK0457、VX-680、ZD6474、MLN8054、AZD2171、SNS-032、PTK787/ZK222584、索拉非尼(Sorafenib；BAY43-9006)、SU5416、SU6668AMG706、扎克替玛(Zactima；ZD6474)、MP-412、达沙替尼(Dasatinib)、CEP-701(来他替尼(Lestaurtinib))、XL647、XL999、泰克泊(Tykerb)(拉帕替尼(Lapatinib))、MLN518(先前称为CT53518)、PKC412、ST1571、AMN107、AEE 788、OSI-930、OSI-817、苹果酸舒尼替尼(Sunitinib malate)(索坦(Sutent))；SU11248)、瓦他拉尼(Vatalanib；PTK787/ZK 222584)、SNS-032、SNS-314及阿西替尼(Axitinib；AG-013736)。吉非替尼(Gefitinib)及埃罗替尼(Erlotinib)为两种经口可利用之EGFR-TKI。
已研究之免疫调节剂通常全身性施用于患者，例如通过经口施用、静脉内注射或输注、或肌肉内注射。限制一些免疫调节剂之有效使用的一个主要因素为高度全身性暴露于所施用之药剂所致的毒性。举例而言，相对于CD40激动剂，已报导对于所例示之促效性CD40抗体，0.3mg/kg为最大耐受剂量且更高剂量可引发副作用，包括静脉血栓栓塞、3级头痛、导致毒性效应(诸如冷战及其类似效应)之细胞因子释放及暂时性肝中毒。(Vanderheide等人,J Clin.Oncol.25(7):876-8833(2007年3月)。在患有转移性肾细胞癌之患者中研究静脉内曲美目单抗(一种抗CTLA-4抗体)加经口舒尼替尼之组合的临床试验中，观察到肾衰竭快速发作且因此，不推荐以每日高于6mg/kg曲美目单抗加37.5mg舒尼替尼之剂量进行进一步研究。参看：Brian I.Rini等人:Phase 1Dose-Escalation Trial of Tremelimumab Plus Sunitinib in Patients With MetastaticRenal Cell Carcinoma.Cancer 117(4):758-767(2011)]。因此，需要基于疫苗之免疫治疗疗法，其中以不会引发严重不良副作用(诸如肝中毒或肾衰竭)之有效剂量施用免疫调节剂。
发明内容
在一些方面中，本发明提供分离的免疫原性PSMA多肽及免疫原性PSA多肽，所述多肽适用于例如引发活体内(例如在动物中，包括人类)或活体外免疫反应、产生抗体、或用作治疗癌症(包括前列腺癌)之疫苗中的组分。在一个方面中，本发明提供分离的免疫原性PSMA多肽，其与SEQ ID NO:1之人类PSMA的氨基酸15-750具有至少90％相同性且在相应位置包含人类PSMA的至少10、11、12、13、14、15、16、17、18或19个保守T细胞表位之氨基酸。
在其它方面中，本发明提供编码免疫原性PAA多肽之核酸分子。在一些实施方式中，本发明提供分离的核酸分子或其简并变体，其包含编码本发明所提供之免疫原性PSMA多肽或该多肽之功能变体的核苷酸序列。
在一些其它方面中，本发明提供多抗原核酸构建体，所述构建体各自编码两个或两个以上免疫原性PAA多肽。
本发明亦提供含有一或多种本发明核酸分子之载体。载体适用于克隆或表达由所述核酸分子编码之免疫原性PAA多肽，或用于向宿主细胞或宿主动物(诸如人类)递送呈组合物(诸如疫苗)形式之核酸分子。
在一些其它方面中，本发明提供组合物，其包含一或多个免疫原性PAA多肽、编码免疫原性PAA多肽之分离的核酸分子、或含有编码免疫原性PAA多肽之核酸分子之载体或质粒。在一些实施方式中，该组合物为适用于在诸如小鼠、狗、猴或人类之哺乳动物中引发针对PAA之免疫反应的免疫原性组合物。在一些实施方式中，该组合物为疫苗组合物，其适用于对诸如人类之哺乳动物进行免疫、用于抑制异常细胞增殖、用于防止癌症发展(用作预防剂)或用于治疗与PAA过度表达相关之病症(诸如癌症，尤其是前列腺癌)(用作治疗剂)。
在再其它方面中，本发明提供使用免疫原性PAA多肽、分离的核酸分子及包含上文所述之免疫原性PAA多肽或分离的核酸分子之组合物的方法。在一些实施方式中，本发明提供在哺乳动物，尤其是人类中引发针对PAA之免疫反应的方法，该方法包含向该哺乳动物施用有效量之本发明所提供针对标靶PAA具有免疫原性之多肽、有效量之编码此种免疫原性多肽之分离的核酸分子、或包含此种免疫原性PAA多肽或编码此种免疫原性PAA多肽之分离的核酸分子的组合物。多肽或核酸疫苗可与一或多种佐剂一起使用。
在又其它方面中，本发明提供基于疫苗之免疫治疗疗法(或“VBIR”)，其包括将递送各种肿瘤相关抗原(TAA)来诱导TAA特异性免疫反应以治疗多种癌症的疫苗与至少一种免疫抑制细胞抑制剂及至少一种免疫效应细胞增强剂的组合共同施用。具体而言，在一些方面中，本发明提供一种增强疫苗之免疫原性或治疗效应以便治疗哺乳动物之赘生性病症的方法，该方法包含向接受该疫苗之该哺乳动物施用有效量之至少一种免疫抑制细胞抑制剂及至少一种免疫效应细胞增强剂。在另一方面中，本发明提供一种治疗哺乳动物之赘生性病症的方法，该方法包含向该哺乳动物施用疫苗、至少一种免疫抑制细胞抑制剂及至少一种免疫效应细胞增强剂。
附图说明
图1.PJV7563载体之示意性说明。
图2.5个病毒2A盒之氨基酸比对。跳过之甘氨酸-脯氨酸键由星号指示。
图3.优选EMCV IRES之序列。翻译起始位点由星号指示。极少IRES元件不包括EMCV L蛋白质之加下划线之前5个密码子。
图4.点图，其显示经修饰之人类PSMA抗原(氨基酸15-750)及全长人类PSCA在经双抗原疫苗构建体转染之HEK293细胞表面上之表达，通过流式细胞术测量。
图5.蛋白质印迹法影像，其显示经修饰之人类PSMA抗原(氨基酸15-750)及全长人类PSCA在经双抗原疫苗构建体转染之HEK293细胞中之表达，通过蛋白质印迹法用PSMA及PSCA特异性单克隆抗体测量。
图6.蛋白质印迹法影像，其显示人类PSA胞溶质抗原(氨基酸25-261)在经双抗原疫苗构建体转染之HEK293细胞中之表达，通过蛋白质印迹法用PSA特异性单克隆抗体测量。泳道5300展现比PSA高出约2kD之模糊条带，与2A肽之C末端融合一致。
图7A、7B.点图，其显示经修饰之人类PSMA抗原(氨基酸15-750)及全长人类PSCA在经三抗原疫苗构建体转染之HEK293细胞表面上之表达，通过流式细胞术测量。(图7A.单抗原对照及单启动子三抗原构建体。图7B.双启动子三抗原构建体。)
图8A、8B.蛋白质印迹法影像，其显示人类PSA在经三抗原疫苗构建体转染之HEK293细胞中之表达，通过蛋白质印迹法用PSA特异性单克隆抗体测量。泳道5297中之条带溢入泳道5259及456中。虽然在所扫描之凝胶中不可见，但泳道456、457及458展现比PSA高出约2kD之条带，与2A肽之C末端融合一致。(图8A.单启动子三抗原构建体。图8B.双启动子三抗原构建体。)
图9A至9D.描绘通过IFN-γELISPOT分析评估三抗原疫苗之免疫原性的代表性研究之结果的图表。
图10A至10D.描绘通过IFN-γELISPOT分析评估三抗原疫苗之免疫原性的代表性研究之结果的图表。
图11.描绘通过抗PSMA抗体效价评估三抗原疫苗之免疫原性的代表性研究之结果的图表。
图12.描绘通过抗PSCA抗体效价评估三抗原疫苗之免疫原性的代表性研究之结果的图表。
图13.描绘通过抗PSMA抗体细胞表面结合评估三抗原疫苗之免疫原性的代表性研究之结果的图表。
图14.描绘通过抗PSCA抗体细胞表面结合评估三抗原疫苗之免疫原性的代表性研究之结果的图表。
图15A至15C.描绘通过IFN-γELISPOT分析评估双抗原疫苗之免疫原性的代表性研究之结果的图表。
图16A至16C.描绘通过IFN-γELISPOT分析评估双抗原疫苗之免疫原性的代表性研究之结果的图表。
图17.描绘通过抗PSMA抗体效价评估双抗原疫苗之免疫原性的代表性研究之结果的图表。
图18.描绘通过抗PSCA抗体效价评估双抗原疫苗之免疫原性的代表性研究之结果的图表。
图19.描绘通过抗PSMA抗体细胞表面结合评估双抗原疫苗之免疫原性的代表性研究之结果的图表。
图20.描绘通过抗PSCA抗体细胞表面结合评估双抗原疫苗之免疫原性的代表性研究之结果的图表。
图21A至21D.描绘通过IFN-γELISPOT分析评估双抗原疫苗之免疫原性的代表性研究之结果的图表。
图22.描绘通过抗PSMA抗体效价评估双抗原疫苗之免疫原性的代表性研究之结果的图表。
图23.描绘通过抗PSCA抗体效价评估双抗原疫苗之免疫原性的代表性研究之结果的图表。
图24.描绘通过抗PSMA抗体细胞表面结合评估双抗原疫苗之免疫原性的代表性研究之结果的图表。
图25.描绘通过抗PSCA抗体细胞表面结合评估双抗原疫苗之免疫原性的代表性研究之结果的图表。
图26.描绘代表性研究之结果的图表，此研究系评估经修饰之人类PSMA抗原(aa 15-750)相对于全长人类PSMA(aa 1-750)在C57BL/6小鼠中引发之T细胞免疫反应。
图27A、27B.描绘代表性研究之结果的图表，此研究系通过IFN-γELISPOT分析来评估经修饰之人类PSMA抗原(aa 15-750)相对于全长人类PSMA抗原(aa 1-750)在巴斯德(Pasteur)(HLA-A2/DR1)转基因小鼠中之T细胞免疫反应。
图28.描绘通过抗PSMA抗体效价评估经修饰之人类PSMA及全长PSMA疫苗之免疫原性的代表性研究之结果的图表。
图29.描绘通过抗PSMA抗体细胞表面结合评估经修饰之人类PSMA及全长PSMA疫苗之免疫原性的代表性研究之结果的图表。
图30.描绘代表性研究之结果的图表，此研究系评估经10mg/kg抗CTLA-4(CP-675,206)注射之印度恒河猴(Rhesus macaques)中之血液抗CTLA-4单克隆抗体含量(通过竞争性ELISA加以量测)。
图31A及31B.描绘代表性研究之结果的图表，此研究系通过细胞内细胞因子染色分析、根据疫苗诱导之免疫反应之质量来评估抗鼠类CTLA-4单克隆抗体(克隆9H10)之免疫调节活性。
图32.描绘代表性研究之结果的图表，此研究系在用苹果酸舒尼替尼(索坦(Sutent))作为单一疗法或与对照物(对照)或癌症疫苗(rHER2)组合治疗后评估并比较皮下肿瘤生长速率。
图33A至33D.显示代表性研究之小鼠个别肿瘤生长速率的图表，此研究系评估并比较20mg/kg苹果酸舒尼替尼(索坦(Sutent))与对照物(对照)或癌症疫苗(rHER2)之抗肿瘤效力。
图34.显示图33所述研究中之小鼠群组之卡普兰-麦尔存活曲线(Kaplan-Meier survival curve)的图表，该研究系评估苹果酸舒尼替尼(索坦(Sutent))与对照物(对照)或癌症疫苗(癌症)在经苹果酸舒尼替尼(索坦(Sutent))与对照物(对照)或癌症疫苗(rHER2)处理之小鼠中之抗肿瘤效力。
图35A、35B.显示图33中之经处理小鼠之周边血液中之骨髓源抑制细胞(Gr1+CD11b+)及含Treg之CD25+CD4+细胞之变化的图表。
图36A至36C.显示自小鼠肿瘤中分离之骨髓源抑制细胞(Gr1+CD11b+)、Tregs(CD4+CD25+Foxp3+)及PD-1+CD8T细胞之总数变化的图表。
图37.显示代表性研究中之小鼠群组之卡普兰-麦尔存活曲线的图表，此研究系评估苹果酸舒尼替尼(索坦(Sutent))及抗鼠类CTLA-4单克隆抗体(克隆9D9)与对照物(对照)或癌症疫苗(疫苗)之组合在携带皮下TUBO肿瘤之BALB/neuT小鼠中之抗肿瘤效力。
图38.显示具有皮下TUBO肿瘤之BALB/neuT小鼠之血液舒尼替尼含量之动力学的图表。
图39.显示代表性研究中之小鼠群组之卡普兰-麦尔存活曲线的图表，此研究系评估苹果酸舒尼替尼(索坦(Sutent))及对照物或癌症疫苗给药对具有皮下TUBO肿瘤之BALB/neuT小鼠之抗肿瘤效力。
图40.描绘代表性研究中之小鼠群组之IFNγELISPOT结果的图表，此研究系评估rHER2疫苗与免疫调节剂一起给药时所诱导之抗原特异性T细胞反应之量值。
图41A、41B.描绘代表性研究之结果的图表，此研究系通过细胞内细胞因子染色分析、根据疫苗诱导之免疫反应之质量来评估CpG7909(PF-03512676)之免疫调节活性。
图42A、42B.描绘代表性研究之结果的图表，此研究系通过细胞内细胞因子染色分析、根据疫苗诱导之免疫反应之质量来评估促效性抗鼠类CD40单克隆抗体之免疫调节活性。
图43.显示代表性研究中之小鼠群组之卡普兰-麦尔存活曲线的图表，此研究系评估低剂量苹果酸舒尼替尼(索坦(Sutent))及对照物或癌症疫苗在携带自发性乳腺肿瘤之BALB/neuT小鼠中之抗肿瘤效力。
发明详述
A.定义
术语“佐剂”系指当与疫苗免疫原一起给药时能够增强、加速或延长免疫反应的物质。
术语“激动剂”系指促进(诱导、引起、增强或增加)另一分子或受体之活性的物质。术语激动剂涵盖结合受体的物质(例如抗体、来自另一物种之天然配体之同源物)及促进受体功能而不与其结合(例如通过活化相关蛋白质)的物质。
术语“拮抗剂”或“抑制剂”系指部分或完全阻断、抑制或中和另一分子或受体之生物活性的物质。
术语“共同施用”系指在治疗周期中向同一个体施用两种或两种以上药剂。该两种或两种以上药剂可涵盖在单一配制品中且因此同时施用。或者，该两种或两种以上药剂可处于各别物理配制品中且分别(依序或同时)施用于该个体。术语“同时施用”或“同时施用”指的是施用第一药剂及施用第二药剂在时间上彼此重叠，而术语“依序施用”或“依序施用”指的是施用第一药剂及施用第二药剂在时间上彼此不重叠。
术语“保守T细胞表位”系指如SEQ ID NO.1中所述之人类PSMA蛋白之以下氨基酸序列之一：
氨基酸168-176(GMPEGDLVY)；
氨基酸347-356(HSTNGVTRIY)；
氨基酸557-566(ETYELVEKFY)；
氨基酸207-215(KVFRGNKVK)；
氨基酸431-440(STEWAEENSR)；
氨基酸4-12(LLHETDSAV)；
氨基酸27-35(VLAGGFFLL)；
氨基酸168-177(GMPEGDLVYV)；
氨基酸441-450(LLQERGVAYI)；
氨基酸469-477(LMYSLVHNL)；
氨基酸711-719(ALFDIESKV)；
氨基酸663-671(MNDQVMFL)；
氨基酸178-186(NYARTEDFF)；
氨基酸227-235(LYSDPADYF)；
氨基酸624-632(TYSVSFDSL)；
氨基酸334-348(TGNFSTQKVKMHIHS)；
氨基酸459-473(NYTLRVDCTPLMYSL)；
氨基酸687-701(YRHVIYAPSSHNKYA)；及
氨基酸730-744(RQIYVAAFTVQAAAE)。
术语“胞溶质”指的是在宿主细胞表达编码特定多肽之核苷酸序列之后，所表达之多肽保留在宿主细胞内。
术语“简并变体”系指具有碱基取代、但编码相同多肽的DNA序列。
术语“有效量”系指施用哺乳动物之足以在哺乳动物中引起所要作用的量。
术语指定多肽之“片段”系指比该指定多肽短且与该指定多肽之序列具有100％相同性的多肽。
术语“一致”或“相同性”百分比在两个或两个以上核酸或多肽序列的情况下系指当根据最大相同性比较且比对时，两个或两个以上序列或子序列相同或具有规定百分比之相同氨基酸残基或核苷酸。
术语“免疫效应细胞增强剂”或“IEC增强剂”系指能够增加或增强哺乳动物中一或多种类型免疫效应细胞之数目、质量或功能的物质。免疫效应细胞之实例包括细胞溶解CD8T细胞、CD40T细胞、NK细胞及B细胞。
术语“免疫调节剂”系指能够改变(例如抑制、降低、增加、增强或刺激)哺乳动物之先天性体液或细胞免疫系统之任何组分之工作的物质。因此，术语“免疫调节剂”涵盖如本文所定义之“免疫效应细胞增强剂”及如本文所定义之“免疫抑制细胞抑制剂”以及影响哺乳动物之免疫系统之其它组分的物质。
术语“免疫反应”系指宿主脊椎动物之免疫系统对特定物质(诸如抗原或免疫原)之任何可侦测反应，包括(但不限于)先天性免疫反应(例如Toll受体信号传导级联活化)、细胞介导之免疫反应(例如由T细胞(诸如抗原特异性T细胞及免疫系统之非特异性细胞)介导之反应)及体液免疫反应(例如由B细胞介导之反应，诸如产生抗体并分泌至血浆、淋巴及/或组织液中)。免疫反应之实例包括Toll样受体活化、淋巴介质(例如细胞因子(例如Th1、Th2或Th17型细胞因子)或趋化因子)表达或分泌、巨噬细胞活化、树突状细胞活化、T细胞(例如CD4+或CD8+T细胞)活化、NK细胞活化、B细胞活化(例如抗体产生及/或分泌)、免疫原(例如抗原(例如免疫原性聚多肽))与MHC分子结合、诱导细胞毒性T淋巴细胞(“CTL”)反应、诱导B细胞反应(例如抗体产生)及免疫系统细胞(例如T细胞及B细胞)之扩增(例如细胞群体之生长)有所变化，及抗原呈递细胞对抗原之处理及呈递有所增加。术语“免疫反应”亦涵盖脊椎动物免疫系统之一或多种组分在活体外对特定物质(诸如抗原或免疫原)之任何可侦测反应。
术语“免疫原性”系指物质(不论单独或与载剂连接时)在佐剂存在或不存在下能够引起、引发、刺激或诱导针对特定抗原之免疫反应、或者改良、增强、增加或延长针对特定抗原之预先存在之免疫反应。
术语“免疫原性PSA多肽”系指针对人类PSA蛋白或针对表达人类PSA蛋白之细胞具有免疫原性的多肽。
术语“免疫原性PSCA多肽”系指针对人类PSCA蛋白或针对表达人类PSCA蛋白之细胞具有免疫原性的多肽。
术语“免疫原性PSMA多肽”系指针对人类PSMA蛋白或针对表达人类PSMA蛋白之细胞具有免疫原性的多肽。
术语“免疫原性PAA多肽”系指如上文所定义之“免疫原性PSA多肽”、“免疫原性PSCA多肽”或“免疫原性PSMA多肽”。
术语“免疫原性PSA核酸分子”系指编码如本文所定义之免疫原性PSA多肽的核酸分子。
术语“免疫原性PSCA核酸分子”系指编码如本文所定义之“免疫原性PSCA多肽”的核酸分子。
术语“免疫原性PSMA核酸分子”系指编码如本文所定义之“免疫原性PSMA多肽”的核酸分子。
术语“免疫原性PAA核酸分子”系指编码如上文所定义之“免疫原性PSA多肽”、“免疫原性PSCA多肽”或“免疫原性PSMA多肽”的核酸分子。
术语“免疫抑制细胞抑制剂”或“ISC抑制剂”系指能够减少或抑制哺乳动物之免疫抑制细胞之数目或功能的物质。免疫抑制细胞之实例包括调节T细胞(“T regs”)、骨髓源抑制细胞及肿瘤相关巨噬细胞。
术语“皮内施用”或“皮内施用”在向哺乳动物(包括人类)施用诸如治疗剂或免疫调节剂之物质的情况下系指将该物质递送至该哺乳动物之皮肤之真皮层中。哺乳动物之皮肤由三层组成，即表皮层、真皮层及皮下层。表皮为皮肤之相对较薄之坚韧外层。表皮中之大部分细胞为角质细胞。真皮，即皮肤之下一层，为纤维及弹性组织(主要由胶原蛋白、弹性蛋白及肌原纤维蛋白组成)之较厚层，其赋予皮肤可挠性及强度。真皮含有神经末梢、汗腺及油(皮脂)腺、毛囊及血管。真皮之厚度视皮肤之位置而不同。在人类中，其在眼睑上为约0.3mm且在背上为约3.0mm。皮下层由容纳较大血管及神经之脂肪及结缔组织组成。此层之厚度在整个身体及人与人之间不同。术语“皮内施用”系指将物质递送至真皮层内部。相比之下，“皮下施用”系指将物质施用于皮下层中且“表面施用”系指将物质施用于皮肤表面上。
术语“局部施用”或“局部施用”涵盖各自如上文所定义之“表面施用”、“皮内施用”及“皮下施用”。此术语亦涵盖“肿瘤内施用”，其系指将物质施用肿瘤内部。局部施用意欲允许施用部位周围之较高局部浓度持续一段时间直至所施用之物质已达成全身性生物分布，而“全身性施用”意欲使所施用之物质被吸收至血液中且由循环系统分布至整个身体之器官或组织而快速获得全身性暴露。
术语“哺乳动物”系指属于哺乳纲之任何动物物种。哺乳动物之实例包括：人类；非人类灵长类动物，诸如猴；实验室动物，诸如大鼠、小鼠、豚鼠；家畜，诸如猫、狗、兔、牛、绵羊、山羊、马及猪；及捕获之野生动物，诸如狮、虎、象及其类似物。
术语“膜结合”指的是在宿主细胞表达编码特定多肽之核苷酸序列之后，所表达之多肽结合、连接或以其它方式缔合细胞膜。
术语“赘生性病症”系指细胞以异常高且不受控制之速率增殖的病状，该速率超过周围正常组织且与周围正常组织之速率不协调。其通常产生称为“肿瘤”之实体病变或结块。此术语涵盖良性及恶性赘生性病症。在本发明中可与术语“癌症”互换使用之术语“恶性赘生性病症”系指以肿瘤细胞能够扩散至身体内之其它位置(称为“转移”)为特征的赘生性病症。术语“良性赘生性病症”系指肿瘤细胞缺乏转移能力的赘生性病症。
术语“可操作地连接”系指如此所述之组分处于允许其以预定方式起作用之关系中的并接(juxtaposition)。“可操作地连接”于转基因的控制序列以在与控制序列兼容之条件下达成转基因之表达的方式接合。
术语“直系同源物”系指彼此相似且起源于共同祖先之不同物种中的基因。
术语“药用可接受之赋形剂”系指免疫原性或疫苗组合物中除活性成分(例如抗原、抗原编码核酸、免疫调节剂或佐剂)以外的物质，其与活性成分兼容且不会在施用其之个体中引起显著副作用。
术语“肽”、“多肽”及“蛋白质”在本文中可互换使用且系指任何长度之氨基酸之多聚形式，其可包括编码及非编码氨基酸、经化学或生物化学修饰或衍生化之氨基酸及具有经修饰之多肽骨架的多肽。
术语“预防”系指(a)防止病症发生或(b)延迟病症发作或病症之症状发作。
术语“前列腺相关抗原”(或PAA)系指特异性表达于前列腺肿瘤细胞上或由肿瘤细胞以高于相同组织类型之非肿瘤细胞的频率或密度加以表达的TAA(如本文所定义)。PAA之实例包括PSA、PSCA及PSMA。
术语“分泌”在多肽的情况下指的是在宿主细胞表达编码该多肽之核苷酸序列之后，将所表达之多肽分泌至宿主细胞外部。
术语“次最佳剂量”在用于描述诸如蛋白激酶抑制剂之免疫调节剂之量时系指当免疫调节剂单独施用于患者时，免疫调节剂剂量低于对所治疗之疾病产生所要治疗效应所需之最小量。
术语“治疗”系指消除病症、降低病症之严重程度、或降低病症之症状的严重程度或发生频率。
术语“肿瘤相关抗原”或“TAA”系指由肿瘤细胞特异性表达或由肿瘤细胞以高于相同组织类型之非肿瘤细胞之频率或密度表达的抗原。肿瘤相关抗原可为宿主非正常表达之抗原；其可经突变、截短、异常折叠，或宿主正常表达之分子之其它异常显现形式；其可与正常表达、但表达量异常高之分子相同；或其可表达于异常情况或环境中。肿瘤相关抗原可为例如蛋白质或蛋白质片段、复杂碳水化合物、神经节苷脂、半抗原、核酸，或此等或其它生物分子之任何组合。
术语“疫苗”系指供施用于哺乳动物以引发针对特定抗原之免疫反应的免疫原性组合物。
术语指定多肽之“变体”系指与该指定多肽之氨基酸序列具有小于100％但大于80％之相同性且展现该指定多肽之至少一些免疫原性活性的多肽。
术语“载体”系指能够输送或转移外来核酸分子的核酸分子。该术语涵盖表达载体及转录载体。术语“表达载体”系指能够表达标靶细胞中之插入物的载体，且一般含有驱动该插入物表达的控制序列，诸如增强子、启动子及终止子序列。术语“转录载体”系指能够转录但不翻译之载体。转录载体系用于扩增其插入物。外来核酸分子称为“插入物”或“转基因”。载体一般由插入物及充当载体骨架之较大序列组成。基于载体之结构或来源，主要载体类型包括质粒载体、粘粒载体、噬菌体载体(诸如λ噬菌体)、病毒载体(诸如腺病毒(Ad)载体)及人工染色体。
B.免疫原性前列腺相关抗原(PAA)多肽
在一些方面中，本发明提供分离的免疫原性PSA多肽及免疫原性PSMA多肽，所述多肽适用于例如引发活体内(例如在动物中，包括人类)或活体外免疫反应、活化效应T细胞，或分别产生PSA及PSMA特异性抗体，或用作治疗癌症(尤其是前列腺癌)之疫苗中的组分。此等多肽可通过此项技术中已知的方法根据本发明来制备。可在活体外分析或活体内分析中量测多肽引发免疫反应之能力。用于测定多肽或DNA构建体引发免疫反应之能力的活体外分析在此项技术中为已知的。此种活体外分析之一个实例为量测多肽或表达多肽之核酸刺激T细胞反应的能力，如美国专利7,387,882中所述，该专利之揭示内容并入本申请中。该分析方法包含以下步骤：(1)使培养之抗原呈递细胞与抗原接触，由此可由所述抗原呈递细胞吸收并处理该抗原，从而产生一或多种经处理抗原；(2)在足以使T细胞对一或多个经处理抗原有反应的条件下使所述抗原呈递细胞与T细胞接触；(3)测定T细胞对一或多个所述经处理抗原是否有反应。所使用之T细胞可为CD8+T细胞或CD4+T细胞。可通过量测一或多种细胞因子(诸如干扰素-γ及介白素-2)之释放、抗原呈递细胞(肿瘤细胞)之溶解及B细胞之抗体产生来测定T细胞反应。
B-1.免疫原性PSMA多肽
在一个方面中，本发明提供分离的免疫原性PSMA多肽，其与SEQID NO:1之人类PSMA的氨基酸15-750具有至少90％相同性且在相应位置包含人类PSMA的至少10、11、12、13、14、15、16、17、18或19个保守T细胞表位之氨基酸。
在一些实施方式中，所述免疫原性PSMA多肽包含人类PSMA的至少15、16、17、18或19个保守T细胞表位。
在一些实施方式中，本发明提供一种由SEQ ID NO:9之氨基酸序列组成的免疫原性PSMA多肽或与SEQ ID NO:9之氨基酸序列具有93％至99％、94％至98％或94％至97％相同性的免疫原性PSMA多肽。
一些特定免疫原性PSMA多肽之实例包括：
1)由SEQ ID NO:1之氨基酸15-750组成的多肽；
2)包含SEQ ID NO:3之氨基酸4-739的多肽；
3)包含SEQ ID NO:5之氨基酸4-739的多肽；
4)包含SEQ ID NO:7之氨基酸4-739的多肽；
2)包含SEQ ID NO:3之氨基酸序列的多肽；
3)包含SEQ ID NO:5之氨基酸序列的多肽；及
4)包含SEQ ID NO:7之氨基酸序列的多肽。
在其它实施方式中，本发明提供一种选自如下一组的免疫原性PSMA多肽：
1)由SEQ ID NO:11之氨基酸序列组成的多肽；
2)由SEQ ID NO:13之氨基酸序列组成的多肽；及
3)包含SEQ ID NO:13之氨基酸序列的多肽。
在一些其它实施方式中，本发明提供分离的免疫原性PSMA多肽，其为以下多肽中之任一者的变体：
2)包含SEQ ID NO:3之氨基酸4-739的多肽；
3)包含SEQ ID NO:5之氨基酸4-739的多肽；及
4)包含SEQ ID NO:7之氨基酸4-739的多肽，
其中该变体之氨基酸序列与SEQ ID NO:1之序列具有93％至99％相同性且与SEQ ID NO:3、5或7之氨基酸序列具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％或至少99％相同性。
指定PAA多肽之变体可通过缺失、插入或取代亲本免疫原性PAA多肽中之一或多个氨基酸来获得。用于产生此种变体之一个实例为多肽中个别氨基酸之保守取代，亦即，通过将一个氨基酸取代为具有相似性质之另一氨基酸。
本发明之免疫原性PSMA多肽可如下构建：保留SEQ ID NO:1之人类PSMA的一些或所有保守T细胞表位，同时在相应位置用人类PSMA的一或多种直系同源物中所发现之氨基酸来取代人类PSMA的其余区域中之某些氨基酸。可用于制造免疫原性PSMA多肽之各种PSMA直系同源物之序列可得自GeneBank数据库。此等直系同源物以及其NCBI ID编号提供于表18中。用来自一或多种直系同源物之氨基酸取代人类PSMA的氨基酸可为保守取代或非保守取代或两者，且可基于此项技术中已知的许多因素加以选择，包括需要达成之分异度(divergence)、MHC结合、取代位点处存在直系同源物氨基酸、表面暴露及维持蛋白质之3-D结构以供进行最佳处理及呈递。
B-2.免疫原性PSA多肽
在另一方面中，本发明提供分离的免疫原性PSA多肽。在一个实施方式中，分离的免疫原性PSA多肽为由SEQ ID NO:15之氨基酸序列或SEQ ID NO:15之氨基酸4-263组成的多肽或其变体。在另一实施方式中，分离的免疫原性PSA多肽为由SEQ ID NO:17之氨基酸序列或SEQ IDNO:17之氨基酸4-240组成的多肽或其变体。在另一实施方式中，分离的免疫原性PSA多肽为由SEQ ID NO:19之氨基酸序列或SEQ ID NO:19之氨基酸4-281组成的多肽或其变体。
C.编码免疫原性PAA多肽之核酸分子
在一些方面中，本发明提供编码免疫原性PAA多肽之核酸分子。核酸分子可为脱氧核糖核苷酸(DNA)或核糖核苷酸(RNA)。因此，核酸分子可包含本文所揭示之核苷酸序列，其中胸苷(T)亦可为尿嘧啶(U)，其体现DNA及RNA之化学结构之间的差异。核酸分子可为修饰形式、单链或双链形式、或线性或环状形式。核酸分子可使用此项技术中已知的方法根据本发明来制备。
C-1.编码免疫原性PSMA多肽之核酸分子
在一个方面中，本发明提供分离的核酸分子或其简并变体，其包含编码免疫原性PSMA多肽(包括本发明所提供之免疫原性PSMA多肽)或其功能变体的核苷酸序列。
在一些实施方式中，该核苷酸序列编码膜结合免疫原性PSMA多肽。在一些特定实施方式中，该分离的核酸分子包含选自如下一组的核苷酸序列或其简并变体：
1)编码SEQ ID NO:9之氨基酸序列的核苷酸序列；
2)编码SEQ ID NO:3之氨基酸4-739的核苷酸序列；
3)编码SEQ ID NO:5之氨基酸4-739的核苷酸序列；及
4)编码SEQ ID NO:7之氨基酸4-739的核苷酸序列。
在一些其它特定实施方式中，该核苷酸序列编码SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:7或SEQ ID NO:9之免疫原性PSMA多肽之变体，其中该变体具有(a)与SEQ ID NO:1之氨基酸序列具有93％至99％相同性且(b)与SEQ ID NO:3、5或7之氨基酸序列具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％或至少99％相同性的氨基酸序列。
在再一些其它特定实施方式中，该分离的核酸分子包含选自如下一组的核苷酸序列或其简并变体：
1)包含SEQ ID NO:4之核苷酸10-2217的核苷酸序列；
2)包含SEQ ID NO:6之核苷酸10-2217的核苷酸序列；
3)包含SEQ ID NO:8之核苷酸10-2217的核苷酸序列；及
4)包含SEQ ID NO:10之核苷酸10-2217的核苷酸序列。
C-2.编码免疫原性PSA多肽之核酸分子
在另一方面中，本发明提供分离的核酸分子或其简并变体，其编码免疫原性PSA多肽，包括本发明所提供之免疫原性PSA多肽。
在一些实施方式中，该分离的核酸分子包含编码胞溶质免疫原性PSA多肽之核苷酸序列或由其组成。在一个实施方式中，该核苷酸序列编码由SEQ ID NO:17之连续氨基酸残基4-240组成的胞溶质免疫原性PSA多肽。在另一实施方式中，该核苷酸序列编码包含SEQ ID NO:17之氨基酸序列的胞溶质免疫原性PSA多肽。在再另一实施方式中，该核苷酸序列编码由SEQ ID NO:17之氨基酸序列组成的胞溶质免疫原性PSA多肽。在又另一实施方式中，该核苷酸序列编码上文所提供之所述胞溶质免疫原性多肽中之任一者的功能变体。
在一些其它实施方式中，该分离的核酸分子包含编码膜结合免疫原性PSA多肽之核苷酸序列。在一个实施方式中，该核苷酸序列编码包含SEQ ID NO:19之连续氨基酸残基4-281的膜结合免疫原性PSA多肽。在另一实施方式中，该核苷酸序列编码包含SEQ ID NO:19之氨基酸序列的膜结合免疫原性PSA多肽。在再另一实施方式中，该核苷酸序列编码由SEQ ID NO:19之氨基酸序列组成的膜结合免疫原性PSA多肽。在又其它实施方式中，该核苷酸序列编码上文所提供之所述膜结合免疫原性PSA多肽中之任一者的功能变体。
本发明所提供之特定核酸分子之实例包括：
1)由SEQ ID NO:18之核苷酸序列组成的核酸分子；
2)包含SEQ ID NO:18之核苷酸序列的核酸分子；
3)由SEQ ID NO:20之核苷酸序列组成的核酸分子；
4)包含SEQ ID NO:20之核苷酸序列的核酸分子；及
5)以上核酸分子1)-4)中之任一者的简并变体。
C-3.编码两种或两种以上免疫原性PAA多肽之核酸分子
在另一方面中，本发明提供一种核酸分子，其编码超过一种免疫原性PAA多肽，例如至少两种、至少三种或至少四种免疫原性PAA多肽。此种核酸分子在本发明中亦称为“多抗原构建体”、“多抗原疫苗”、“多抗原质粒”及其类似物。因此，在一些方面中，一个核酸分子携带两个编码核苷酸序列，其中每一个编码核苷酸序列表达个别免疫原性PAA多肽。此种核酸分子在本发明中亦称为“双抗原构建体”、“双抗原疫苗”或“双抗原质粒”等。在一些其它方面中，一个核酸分子携带三个编码核苷酸序列，其中每一个编码核苷酸序列表达个别免疫原性PAA多肽。此种核酸分子在本发明中亦称为“三抗原构建体”、“三抗原疫苗”或“三抗原质粒”。多抗原构建体所编码之个别PAA多肽可具有针对相同抗原(诸如PSMA、PSA或PSCA)的免疫原性。多抗原构建体所编码之个别PAA多肽可具有针对不同抗原的免疫原性，例如一种PAA多肽为PSMA多肽而另一种为PSA多肽。具体而言，一种多抗原构建体可编码以下组合中之任一者中的两种或两种以上免疫原性PAA多肽：
1)至少一种免疫原性PSMA多肽及至少一种免疫原性PSA多肽；
2)至少一种免疫原性PSMA多肽及至少一种PSCA多肽；
3)至少一种免疫原性PSA多肽及至少一种PSCA多肽；及
4)至少一种免疫原性PSMA多肽、至少一种免疫原性PSA多肽及至少一种PSCA多肽。
多抗原构建体所编码之免疫原性PSMA多肽可为胞溶质型、分泌型或膜结合型，但优选为膜结合型。类似地，多抗原构建体所编码之免疫原性PSA多肽可为胞溶质型、分泌型或膜结合型，但优选为胞溶质型。
在一些实施方式中，本发明提供一种多抗原构建体，其编码至少一种膜结合免疫原性PSMA多肽及至少一种膜结合PSA多肽。
在一些其它实施方式中，本发明提供一种多抗原构建体，其编码至少一种膜结合免疫原性PSMA多肽、至少一种胞溶质PSA多肽及至少一种PSCA多肽，其中该至少一种胞溶质PSA多肽包含SEQ ID NO:17之氨基酸4-240且其中该至少一种免疫原性PSMA多肽系选自如下一组：
1)包含SEQ ID NO:1之氨基酸15-750的多肽；
2)包含SEQ ID NO:3之氨基酸序列的多肽；
3)包含SEQ ID NO:5之氨基酸序列的多肽；
4)包含SEQ ID NO:7之氨基酸序列的多肽；
5)包含SEQ ID NO:9之氨基酸4-739的多肽；
6)包含SEQ ID NO:3之氨基酸4-739的多肽；
7)包含SEQ ID NO:5之氨基酸4-739的多肽；
8)包含SEQ ID NO:7之氨基酸4-739的多肽；及
9)包含SEQ ID NO:9之氨基酸序列的多肽。
在一些特定实施方式中，本发明提供一种多抗原构建体，其包含至少一个编码免疫原性PSMA多肽之核苷酸序列、至少一个编码免疫原性PSA多肽之核苷酸序列及至少一个编码人类PSCA多肽之核苷酸序列，其中该核苷酸序列编码SEQ ID NO:17或SEQ ID NO:17之氨基酸4-240之免疫原性PSA多肽，且其中编码该免疫原性PSMA多肽之核苷酸序列系选自如下一组：
1)SEQ ID NO:2之核苷酸序列；
2)SEQ ID NO:4之核苷酸序列；
3)SEQ ID NO:6之核苷酸序列；
4)SEQ ID NO:8之核苷酸序列；
5)SEQ ID NO:10之核苷酸序列；
6)包含SEQ ID NO:4之核苷酸10-2217的核苷酸序列；
7)包含SEQ ID NO:6之核苷酸10-2217的核苷酸序列；
8)包含SEQ ID NO:8之核苷酸10-2217的核苷酸序列；及
9)包含SEQ ID NO:10之核苷酸10-2217的核苷酸序列。
本发明所提供之特定多抗原构建体之实例包括包含SEQ ID NO:23-36中所述之核苷酸序列的核酸分子。
本发明所提供之多抗原构建体可使用此项技术中已知的各种技术根据本发明来制备。举例而言，可通过在单一质粒中并入多个独立启动子来构建多抗原构建体(Huang,Y.,Z.Chen,等人(2008).“Design,construction,and characterization of a dual-promoter multigenic DNAvaccine directed against an HIV-1 subtype C/B'recombinant”.J AcquirImmune Defic Syndr 47(4):403-411；Xu,K.,Z.Y.Ling等人(2011).“Broad humoral and cellular immunity elicited by a bivalent DNA vaccineencoding HA and NP genes from an H5N1 virus”.Viral Immunol 24(1):45-56)。质粒可经工程改造以运载多个表达盒，各表达盒由以下组成：a)在增强子元件存在或不存在下用于起始RNA聚合酶依赖性转录之真核启动子；b)编码标靶抗原之基因；及c)转录终止序列。质粒递送至经转染之细胞核中时，各启动子起始转录，从而产生各别mRNA，各mRNA编码标靶抗原之一。mRNA经独立地翻译，由此产生所要抗原。
本发明所提供之多抗原构建体亦可使用单一载体通过使用病毒2A样多肽来构建(Szymczak,A.L.及D.A.Vignali(2005).“Development of 2Apeptide-based strategies in the design of multicistronic vectors”.Expert OpinBiol Ther 5(5):627-638；de Felipe,P.,G.A.Luke等人(2006).“E unumpluribus:multiple proteins from a self-processing polyprotein”.TrendsBiotechnol 24(2):68-75；Luke,G.A.,P.de Felipe等人(2008).“Occurrence,function and evolutionary origins of‘2A-like’sequences invirus genomes”.J Gen Virol 89(Pt 4):1036-1042；Ibrahimi,A.,G.VandeVelde等人(2009).“Highly efficient multicistronic lentiviral vectors withpeptide 2A sequences”.Hum Gene Ther 20(8):845-860；Kim,J.H.,S.R.Lee等人(2011).“High cleavage efficiency of a 2A peptide derived fromporcine teschovirus-1 in human cell lines,zebrafish and mice”.PLoS One6(4):e18556)。此等多肽，亦称为裂解盒或CHYSEL(顺式作用水解酶元件)，约20个氨基酸长且具有高度保守羧基末端D-V/I-EXNPGP基序(图2)。所述盒在自然界中非常稀有，最常发现于病毒中，诸如口蹄疫病毒(Foot-and-mouth disease virus，FMDV)、马鼻炎A病毒(ERAV)、脑心肌炎病毒(EMCV)、猪捷申病毒(Porcine teschovirus，PTV)及明脉扁刺蛾病毒(Thosea asigna virus，TAV)(Luke,G.A.,P.de Felipe等人(2008).“Occurrence,function and evolutionary origins of‘2A-like’sequences invirus genomes”.J Gen Virol 89(Pt 4):1036-1042)。利用基于2A之多抗原表达策略，可将编码多个标靶抗原之基因一起连接在单一开放阅读框中，用2A盒隔开。可将整个开放阅读框克隆于具有单一激活子及终止子之载体中。构建体递送至宿主细胞时，编码多个抗原之mRNA转录并翻译为单一聚合蛋白。在翻译2A盒期间，核糖体跳过C末端甘氨酸与脯氨酸之间的键。核糖体跳过之作用类似于在下游蛋白质之上游释放的共翻译自动催化“裂解”。2A盒并入两个蛋白质抗原之间引起约20个氨基酸添加至上游多肽之C末端上且1个氨基酸(脯氨酸)添加至下游蛋白质之N末端。在此方法之改适方案中，可在2A盒之N末端并入蛋白酶裂解位点，使得普遍存在的蛋白酶使盒自上游蛋白质裂解(Fang,J.,S.Yi等人(2007).“An antibody delivery system for regulated expression oftherapeutic levels of monoclonal antibodies in vivo”.Mol Ther 15(6):1153-1159)。
用于构建本发明所提供之多抗原构建体之另一策略包括使用内部核糖体进入位点或IRES。内部核糖体进入位点为在某些RNA分子之5'未翻译区域中发现的RNA元件(图3)(Bonnal,S.,C.Boutonnet等人(2003).“IRESdb:the Internal Ribosome Entry Site database”.Nucleic Acids Res31(1):427-428)。其将真核核糖体吸引至RNA以促进下游开放阅读框之翻译。不同于正常细胞7-甲基鸟苷帽依赖性翻译，IRES介导之翻译可在RNA分子内较远处之AUG密码子处起始。可利用高效方法以便用于多顺反子表达载体(Bochkov,Y.A.及A.C.Palmenberg(2006).“Translationalefficiency of EMCV IRES in bicistronic vectors is dependent upon IRESsequence and gene location”.Biotechniques 41(3):283-284,286,288)。通常，两个转基因以经IRES分隔之两个各别开放阅读框形式插入启动子与转录终止子之间的载体中。构建体递送至宿主细胞时，转录编码两个转基因之单一长转录物。第一个ORF将以传统帽依赖性方式翻译，在IRES上游之终止密码子处终止。第二个ORF将以帽非依赖性方式使用IRES翻译。以此方式，可由自具有单一表达盒之载体转录之单一mRNA产生两种独立的蛋白质。
虽然此处在DNA疫苗构建体的情况下描述多抗原表达策略，但所述原理类似地适用于病毒载体基因疫苗的情况。
D.含有编码免疫原性PAA多肽之核酸分子的载体
本发明之另一方面涉及含有一或多种本发明之核酸分子的载体。所述载体适用于克隆或表达由所述核酸分子编码之免疫原性PAA多肽，或用于向宿主细胞或宿主动物(诸如人类)递送呈组合物(诸如疫苗)形式之核酸分子。可制备含有并表达本发明之核酸分子的多种载体，诸如质粒载体、粘粒载体、噬菌体载体及病毒载体。
在一些实施方式中，本发明提供一种基于质粒之载体，其含有本发明之核酸分子。适合质粒载体之代表性实例包括pBR325、pUC18、pSKF、pET23D及pGB-2。质粒载体以及构建此种载体之方法的其它代表性实例描述于美国专利第5,580,859号、第5,589,466号、第5,688,688号、第5,814,482号及第5,580,859号中。
在其它实施方式中，本发明提供由诸如反转录病毒、α病毒、腺病毒之病毒构建之载体。反转录病毒载体之代表性实例更详细描述于以下文献中：EP 0,415,731；PCT公开文本第WO 90/07936号、第WO 91/0285号、第WO 9311230号、第WO 9310218号、第WO 9403622号、第WO9325698号、第WO 9325234号；及美国专利第5,219,740号、第5,716,613号、第5,851,529号、第5,591,624号、第5,716,826号、第5,716,832号及第5,817,491号。可由α病毒产生之载体的代表性实例描述于美国专利第5,091,309号及第5,217,879号、第5,843,723号及第5,789,245号中。在一些特定实施方式中，本发明提供来源于非人类灵长类动物腺病毒(诸如猿腺病毒)之腺病毒载体。此种腺病毒载体之实例以及其制备描述于PCT申请公开文本WO 2005/071093及WO 2010/086189中，且包括非复制载体，诸如ChAd3、ChAd4、ChAd5、ChAd7、ChAd8、ChAd9、ChAd10、ChAd11、ChAd16、ChAd17、ChAd19、ChAd20、ChAd22、ChAd24、ChAd26、ChAd30、ChAd31、ChAd37、ChAd38、ChAd44、ChAd63、ChAd68、ChAd82、ChAd55、ChAd73、ChAd83、ChAd146、ChAd147、PanAd1、Pan Ad2及Pan Ad3，及复制型载体，诸如Ad4及Ad7载体。在由猿腺病毒构建腺病毒载体时，优选使来自病毒基因组区域之一或多个选自E1A、E1B、E2A、E2B、E3及E4之早期基因缺失，或通过缺失或突变使其不具功能。在一个特定实施方式中，该载体系由ChAd3或ChAd68构建。适合载体亦可由其它病毒产生，诸如：痘病毒，诸如金丝雀痘病毒或痘苗病毒(Fisher-Hoch等人,PNAS 86:317-321,1989；Flexner等人,Ann.N.Y.Acad.Sci.569:86-103,1989；Flexner等人,Vaccine 8:17-21,1990；美国专利第4,603,112号、第4,769,330号及第5,017,487；WO 89/01973)；腺相关载体(参看例如美国专利第5,872,005号)；SV40(Mulligan等人,Nature 277:108-114,1979)；疱疹(Kit,Adv.Exp.Med.Biol.215:219-236,1989；美国专利第5,288,641号)；及慢病毒，诸如HIV(Poznansky,J.Virol.65:532-536,1991)。
构建载体之方法在此项技术中已熟知。表达载体通常包括一或多个可操作地连接于欲表达之核酸序列的控制元件。术语“控制元件”总体系指启动子区域、聚腺苷酸化信号、转录终止序列、上游调控域、复制起点、内部核糖体进入位点(“IRES”)、增强子及其类似物，其总体提供编码序列在受者细胞中之复制、转录及翻译。并非所有此等控制元件均需要始终存在，只要所选编码序列能够在适当宿主细胞中复制、转录并翻译即可。基于熟习此项技术者已知的许多因素选择控制元件，诸如特定宿主细胞及其它载体元件之来源或结构。为增强免疫原性PAA多肽之表达，可在编码免疫原性PAA多肽之序列上游提供Kozak序列。对于脊椎动物，已知Kozak序列为(GCC)NCCATGG，其中N为A或G且GCC之保守程度较低。可使用之例示性Kozak序列包括ACCAUGG及ACCATGG。
E.包含免疫原性PAA多肽之组合物(多肽组合物)
在另一方面中，本发明提供包含本发明所提供之一或多种分离的免疫原性PAA多肽的组合物(“多肽组合物”)。在一些实施方式中，该多肽组合物为适用于在诸如小鼠、狗、非人类灵长类动物或人类之哺乳动物中引发针对PAA蛋白之免疫反应的免疫原性组合物。在一些其它实施方式中，该多肽组合物为疫苗组合物，其适用于对诸如人类之哺乳动物进行免疫、用于抑制异常细胞增殖、用于防止癌症发展(用作预防剂)或用于治疗与PAA过度表达相关之病症(诸如癌症，尤其是前列腺癌)(用作治疗剂)。
本发明所提供之多肽组合物可含有单一类型之免疫原性PAA多肽，诸如免疫原性PSMA多肽、免疫原性PSA多肽或免疫原性PSCA多肽。组合物亦可含有两种或两种以上不同类型之免疫原性PAA多肽之组合。举例而言，多肽组合物可含有以下组合中之任一者中的免疫原性PAA多肽：
1)免疫原性PSMA多肽及免疫原性PSA多肽；
2)免疫原性PSMA多肽及PSCA多肽；或
3)免疫原性PSMA多肽、免疫原性PSA多肽及PSCA多肽。
本发明所提供之免疫原性组合物或疫苗组合物可进一步包含药用可接受之赋形剂。用于免疫原性组合物或疫苗组合物之药用可接受之赋形剂在此项技术中为已知的。适合赋形剂之实例包括生物兼容性油类，诸如菜籽油、葵花油、花生油、棉籽油、荷荷芭油、角鲨烷、角鲨烯、生理盐水溶液、防腐剂及渗透压控制剂、运载气体、pH值控制剂、有机溶剂、疏水性药剂、酶抑制剂、吸水聚合物、界面活性剂、吸附引发剂、pH值调节剂及抗氧化剂。
组合物，尤其是免疫原性组合物或疫苗组合物中之免疫原性PAA多肽可连接于、结合于或以其它方式并入载剂中以供施用接受者。术语“载剂”系指免疫原性多肽可连接或以其它方式缔合以便向接受者(例如患者)递送免疫原性多肽的物质或结构。载剂自身可具有免疫原性。载剂之实例包括免疫原性多肽、免疫CpG岛、螺血蓝蛋白(KLH)、破伤风类毒素(TT)、霍乱毒素亚单位B(CTB)、细菌或细菌残骸、脂质体、甲壳素酶体(chitosome)、病毒体、微球体、树突状细胞或其类似物。一或多种免疫原性PAA多肽分子可连接于单一载体分子。用于将免疫原性多肽连接于载体之方法在此项技术中为已知的。
本发明所提供之疫苗组合物或免疫原性组合物可与一或多种免疫调节剂或佐剂结合使用。免疫调节剂或佐剂可与疫苗组合物分别调配，或其可为同一疫苗组合物配制品之一部分。因此，在一个实施方式中，疫苗组合物进一步包含一或多种免疫调节剂或佐剂。下文提供免疫调节剂及佐剂之实例。
多肽组合物，包括免疫原性组合物及疫苗组合物，可用任何适合剂型，诸如液体形式(例如溶液、悬浮液或乳液)及固体形式(例如胶囊剂、锭剂或粉剂)且通过熟习此项技术者已知的方法来制备。
F.包含免疫原性PAA核酸分子之组合物(核酸组合物)
本发明亦提供一种包含本发明所提供之分离的核酸分子或载体的组合物(本文之“核酸组合物”)。核酸组合物适用于在哺乳动物(包括人类)中活体外或活体内引发针对PAA蛋白之免疫反应。
在一些特定实施方式中，该核酸组合物为施用于人类以抑制异常细胞增殖、防止癌症发展(用作预防剂)或用于治疗与PAA过度表达相关之癌症(用作治疗剂)或引发对特定人类PAA(诸如PSMA、PSA及PSCA)之免疫反应的DNA疫苗组合物。组合物中之核酸分子可为“裸”核酸分子，亦即，简单地呈不含促进转染或表达之元件的分离之DNA形式。或者，组合物中之核酸分子可并入载体中。
本发明所提供之核酸组合物可包含个别之分离核酸分子，所述核酸分子各自仅编码一种类型免疫原性PAA多肽，诸如免疫原性PSMA多肽、免疫原性PSA多肽或免疫原性PSCA多肽。
核酸组合物可包含本发明所提供之编码两种或两种以上类型免疫原性PAA多肽之多抗原构建体。多抗原构建体可编码以下组合中之任一者中的两种或两种以上免疫原性PAA多肽：
1)免疫原性PSMA多肽及免疫原性PSA多肽；
2)免疫原性PSMA多肽及免疫原性PSCA多肽；
3)免疫原性PSA多肽及免疫原性PSCA多肽；及
4)免疫原性PSMA多肽、免疫原性PSA多肽及免疫原性PSCA多肽。
核酸组合物，包括DNA疫苗组合物，可进一步包含药用可接受之赋形剂。适用于核酸组合物(包括DNA疫苗组合物)之药用可接受之赋形剂的实例为熟习此项技术者所熟知的且包括糖类等。此种赋形剂可为水性或非水性溶液、悬浮液及乳液。非水性赋形剂之实例包括丙二醇、聚乙二醇、诸如橄榄油之植物油及诸如油酸乙酯之可注射有机酯。水性赋形剂之实例包括水、醇/水溶液、乳液或悬浮液，包括生理盐水及缓冲介质。适合赋形剂亦包括帮助细胞吸收聚核苷酸分子之药剂。此种药剂之实例为(i)调节细胞通透性之化合物，诸如布比卡因(bupivacaine)；(ii)用于囊封聚核苷酸之脂质体或病毒粒子；或(iii)自身与聚核苷酸缔合之阳离子脂质或二氧化硅、金或钨微粒。阴离子及中性脂质体在此项技术中为熟知的(关于制造脂质体之方法的详细描述，参看例如Liposomes:APractical Approach,RPC New编,IRL出版社(1990))且适用于递送较大范围之产物，包括聚核苷酸。阳离子脂质在此项技术中亦为已知的且常用于基因递送。此种脂质包括LipofectinTM，亦称为DOTMA(N-[1-(2,3-二油氧基)丙基]-N,N,N-三甲基氯化铵)、DOTAP(1,2-双(油氧基)-3-(三甲铵基)丙烷)、DDAB(二甲基二(十八烷)溴化铵)、DOGS(二(十八烷)酰胺基甘胺酰基精胺)及胆固醇衍生物，诸如DCChol(3β-(N-(N',N'-二甲基氨基甲烷)-胺甲酰基)胆固醇)。此等阳离子脂质之描述可见于EP 187,702、WO90/11092、美国专利第5,283,185号、WO 91/15501、WO 95/26356及美国专利第5,527,928号中。可用于本发明所提供之核酸疫苗的特定适用阳离子脂质配制品为VAXFECTIN，其为阳离子脂质(GAP-DMORIE)与中性磷脂(DPyPE)之混合物，当合并在水性运载体中时，其自组装以形成脂质体。
用于基因递送之阳离子脂质优选与诸如DOPE(二油基磷脂酰乙醇胺)之中性脂质结合使用，如WO 90/11092中作为一个实例所描述。另外，DNA疫苗亦可与诸如CRL1005之非离子嵌段共聚物一起调配。
G.免疫原性PAA多肽、核酸分子及组合物之用途
在其它方面中，本发明提供使用免疫原性PAA多肽、分离的核酸分子及包含上述免疫原性PAA多肽或分离的核酸分子之组合物的方法。
在一个方面中，本发明提供一种在哺乳动物，尤其是人类中引发针对PAA之免疫反应的方法，该方法包含向该哺乳动物施用有效量之(1)本发明所提供之针对标靶PAA具有免疫原性之免疫原性PAA多肽；(2)编码此种免疫原性PAA多肽之分离的核酸分子；(3)包含此种免疫原性PAA多肽之组合物；或(4)包含编码此种免疫原性PAA多肽之分离的核酸分子的组合物。
在一些实施方式中，本发明提供一种在人类中引发针对PSMA之免疫反应的方法，该方法包含向人类施用有效量之本发明所提供之免疫原性PSMA组合物，其中该免疫原性PSMA组合物系选自：(1)免疫原性PSMA多肽；(2)编码免疫原性PSMA多肽之分离的核酸分子；(3)包含免疫原性PSMA多肽之组合物；或(4)包含编码免疫原性PSMA多肽之分离的核酸分子的组合物。
在一些其它实施方式中，本发明提供一种在人类中引发针对PSA之免疫反应的方法，该方法包含向人类施用有效量之本发明所提供之免疫原性PSA组合物，其中该免疫原性PSA组合物系选自：(1)免疫原性PSA多肽；(2)编码免疫原性PSA多肽之分离的核酸分子；(3)包含免疫原性PSA多肽之组合物；或(4)包含编码免疫原性PSA多肽之分离的核酸分子的组合物。
在另一方面中，本发明提供一种抑制人类中之异常细胞增殖的方法，其中该异常细胞增殖与PAA之过度表达相关。该方法包含向人类施用有效量之本发明所提供之针对PAA过度表达具有免疫原性的免疫原性PAA组合物。免疫原性PAA组合物可为(1)免疫原性PAA多肽；(2)编码一或多种免疫原性PAA多肽之分离的核酸分子；(3)包含免疫原性PAA多肽之组合物；或(4)包含编码一或多种免疫原性PAA多肽之分离的核酸分子的组合物。在一些实施方式中，该方法系用于抑制人类前列腺中之异常细胞增殖。在一个特定实施方式中，本发明提供一种抑制过度表达PSMA之前列腺中之异常细胞增殖的方法，该方法包含向该人类施用有效量之(1)免疫原性PSMA多肽；(2)编码一或多种免疫原性PSMA多肽之分离的核酸分子；(3)包含免疫原性PSMA多肽之组合物；或(4)包含编码一或多种免疫原性PSMA多肽之分离的核酸分子的组合物。
在另一方面中，本发明提供一种治疗人类之癌症的方法，其中癌症与PAA之过度表达相关。该方法包含向人类施用有效量之能够引发针对过度表达之PAA之免疫反应的免疫原性PAA组合物。免疫原性PAA组合物可为(1)免疫原性PAA多肽；(2)编码一或多种免疫原性PAA多肽之分离的核酸分子；(3)包含免疫原性PAA多肽之组合物；或(4)包含编码一或多种免疫原性PAA多肽之分离的核酸分子的组合物。可用该方法治疗之癌症的实例包括乳癌、胃癌、卵巢癌、肺癌、膀胱癌、结肠直肠癌、肾癌、胰腺癌及前列腺癌。
在一些实施方式中，本发明提供一种治疗人类之前列腺癌的方法，该方法包含向人类施用有效量之上文所提供之核酸组合物。组合物中之核酸可仅编码一种特定免疫原性PAA多肽，诸如免疫原性PSMA多肽、免疫原性PSA多肽或免疫原性PSCA多肽。组合物中之核酸亦可编码两种或两种以上不同的免疫原性PAA多肽，诸如：(1)免疫原性PSMA多肽及免疫原性PSA多肽；(2)免疫原性PSMA多肽及免疫原性PSCA多肽；(3)免疫原性PSA多肽及免疫原性PSCA多肽；(4)免疫原性PSMA多肽、免疫原性PSA多肽及免疫原性PSCA多肽。组合物中之各个别核酸分子可仅编码一种特定免疫原性PAA多肽，诸如PSMA多肽、PSA多肽或PSCA多肽。或者，组合物中之个别核酸分子可为编码两种不同类型免疫原性PAA多肽之多抗原构建体，诸如：(1)免疫原性PSMA多肽及免疫原性PSA多肽；(2)免疫原性PSMA多肽及免疫原性PSCA多肽；(3)免疫原性PSCA多肽及免疫原性PSA多肽；或(4)免疫原性PSMA多肽、免疫原性PSA多肽及免疫原性PSCA多肽。在一些特定实施方式中，该核酸组合物包含至少编码(4)免疫原性PSMA多肽、免疫原性PSA多肽及免疫原性PSCA多肽的多抗原构建体。疫苗组合物中所含有或用于治疗人类前列腺癌之疫苗组合物中之核酸所表达之免疫原性PSCA多肽优选为人类全长PSCA蛋白。
多肽及核酸组合物可通过此项技术中已知的许多方法施用于动物，包括人类。适合方法之实例包括：(1)肌肉内、皮内、表皮内、静脉内、动脉内、皮下或腹膜内施用；(2)经口施用；及(3)表面施用(诸如眼部、鼻内及阴道内施用)。皮内或表皮内施用可使用之核酸疫苗组合物的一种特定方法为使用PowderMed销售之粒子介导表皮递送(Particle MediatedEpidermal Delivery，PMEDTM)疫苗递送装置进行的基因枪递送。PMED为向动物或人类施用疫苗之无针方法。PMED系统包括使DNA沈淀于微观金粒子上，接着通过氦气推入表皮中。经DNA涂布之金粒子递送至表皮之APC及角质细胞，且一旦进入此等细胞之核内，DNA即自金溶离且变得具有转录活性，从而产生编码蛋白质。此蛋白质接着由APC呈递至淋巴细胞以诱导T细胞介导之免疫反应。用于肌肉内施用本发明所提供之核酸疫苗的另一特定方法为电穿孔。电穿孔使用受控制之电脉冲在细胞膜中暂时产生孔隙，由此促进细胞吸收注入肌肉中之核酸疫苗。在CpG与核酸疫苗组合使用的情况下，CpG及核酸疫苗优选共同调配于一种配制品中且通过电穿孔经肌肉内施用该配制品。
依本发明所提供之指定方法施用之组合物中之免疫原性PAA多肽或编码免疫原性PAA多肽之核酸的有效量可容易由熟习此项技术者确定且将视许多因素而定。在治疗癌症(诸如前列腺癌)之方法中，确定免疫原性PAA多肽或核酸之有效量时可能考虑的因素包括(但不限于)：(1)欲治疗之个体，包括个体之免疫状态及健康状况；(2)欲治疗之癌症的严重程度或阶段；(3)所使用或表达之特定免疫原性PAA多肽；(4)所要预防或治疗程度；(5)施用方法及时程；及(6)所使用之其它治疗剂(诸如佐剂或免疫调节剂)。在核酸疫苗组合物(包括多抗原疫苗组合物)的情况下，调配及递送方法为确定引发有效免疫反应所需之核酸剂量之关键因素之一。举例而言，当核酸疫苗组合物调配为水溶液且通过皮下注射针注射或气动注射施用时，核酸之有效量可在2微克/剂量至10毫克/剂量之范围内，而当核酸制备为经涂布之金珠粒且使用基因枪技术递送时，可能仅需要16奈克/剂量至16微克/剂量。通过电穿孔之核酸疫苗之剂量范围一般在0.5至10毫克/剂量范围内。在核酸疫苗与CpG一起通过电穿孔以共同配制品形式施用的情况下，核酸疫苗之剂量可在0.5至5毫克/剂量范围内，且CpG之剂量通常在0.05毫克至5毫克/剂量范围内，诸如每人0.05、0.2、0.6或1.2毫克/剂量。
本发明之核酸或多肽疫苗组合物可依初始免疫-增强免疫策略使用以诱导稳固且长期的免疫反应。基于重复注射相同免疫原性构建体的初始免疫及增强免疫接种方案为熟知的。一般而言，第一剂量可能不产生保护性免疫，而是仅使免疫系统“初始免疫”。在第二或第三剂量(“增强免疫”)之后产生保护性免疫反应。增强免疫系根据习知技术进行，且在施用时程、施用途径、佐剂选择、剂量及与另一疫苗一起施用时之可能顺序上可凭经验进一步优化。在一个实施方式中，本发明之核酸或多肽疫苗系依习知的同质疫苗初始免疫-增强免疫策略使用，其中相同疫苗以多次剂量施用动物。在另一实施方式中，核酸或多肽疫苗组合物系以异质疫苗初始免疫-增强免疫接种法使用，其中以预定时间间隔施用含有相同抗原之不同类型疫苗。举例而言，核酸构建体可以质粒形式施用初始剂量(“初始免疫”)且作为载体之一部分施用随后剂量(增强免疫)，或反之亦然。
治疗前列腺癌时，本发明之多肽或核酸疫苗可与基于其它抗原(诸如基于前列腺酸性磷酸酶之抗原及雄激素受体)之前列腺癌疫苗一起使用。
本发明之多肽或核酸疫苗组合物可与一或多种佐剂一起使用。适合佐剂之实例包括：(1)水包油乳液配制品(存在或不存在其它特定免疫刺激剂，诸如胞壁酰多肽或细菌细胞壁组分)，诸如(a)MF59TM(PCT公开文本第90/14837号；Vaccine design:the subunit and adjuvant approach,Powell及Newman编,Plenum Press 1995中的第10章)，其含有5％角鲨烯、0.5％Tween 80(聚氧乙烯脱水山梨醇单油酸酯)及0.5％Span 85(脱水山梨醇三油酸酯)，使用微流体化床调配成亚微米粒子；(b)SAF，其含有10％角鲨烯、0.4％Tween 80、5％普洛尼克(pluronic)嵌段聚合物L121及thr-MDP，经微流体化床处理成亚微米乳液或涡旋产生较大粒径之乳液；及(c)RIBITM佐剂系统(RAS)(Ribi Immunochem,Hamilton,MT)，其含有2％角鲨烯、0.2％Tween 80及一或多种细菌细胞壁组分，诸如单磷酰脂质A(MPL)、海藻糖二霉菌酸酯(TDM)及细胞壁骨架(CWS)；(2)皂素佐剂，诸如QS21、STIMULONTM(Cambridge Bioscience,Worcester,MA)、(Isconova,Sweden)或(Commonwealth SerumLaboratories,Australia)；(3)完全弗氏佐剂(Complete Freund's Adjuvant，CFA)及不完全弗氏佐剂(IFA)；(4)细胞因子，诸如介白素(例如IL-1、IL-2、IL-4、IL-5、IL-6、IL-7、IL-12等(PCT公开文本第WO 99/44636号))、干扰素(例如γ干扰素)、巨噬细胞群落刺激因子(M-CSF)、肿瘤坏死因子(TNF)等；(5)单磷酰脂质A(MPL)或3-O-脱酰基化MPL(3dMPL)，当与肺炎球菌醣类一起使用时，视情况实质上不存在明矾(例如GB-2220221、EP-A-0689454、WO 00/56358)；(6)3dMPL与例如QS21及/或水包油乳液之组合(例如EP-A-0835318、EP-A-0735898、EP-A-0761231)；(7)包含CpG基序，亦即，含有至少一个CG二核苷酸之寡核苷酸，其中胞嘧啶未经甲基化(例如Krieg,Vaccine(2000)19:618-622；CurrOpin Mol Ther(2001)3:15-24；WO 98/40100、WO 98/55495、WO98/37919及WO 98/52581)；(8)聚氧乙烯醚或聚氧乙烯酯(例如WO99/52549)；(9)聚氧乙烯脱水山梨醇酯界面活性剂与辛苯聚醇之组合(例如WO 01/21207)或聚氧化乙烯烷基醚或酯界面活性剂与至少一种其它非离子界面活性剂(诸如辛苯聚醇)之组合(例如WO 01/21152)；(10)皂素及免疫刺激寡核苷酸(例如CpG寡核苷酸)(例如WO 00/62800)；(11)金属盐，包括铝盐(诸如明矾、磷酸铝、氢氧化铝)；(12)皂素及水包油乳液(例如WO 99/11241)；(13)皂素(例如QS21)+3dMPL+IM2(视情况+固醇)(例如WO 98/57659)；(14)充当可增强组合物之效力之免疫刺激剂的其它物质，诸如胞壁酰多肽，包括N-乙酰基-胞壁酰基-L-苏胺酰基-D-异麸酰氨酸(thr-MDP)、N-25乙酰基-降胞壁酰-L-丙胺酰基-D-异麸酰氨酸(nor-MDP)、N-乙酰基胞壁酰-L-丙胺酰基-D-异麸酰胺酰基-L-丙氨酸-2-(1'-2'-二软脂酰基-sn-甘油-3-羟基磷酰氧基)-乙胺(MTP-PE)；(15)toll样受体(TLR)之天然或合成配体(例如Kanzler等人,Nature Med.13:1552-1559(2007))，包括TLR3配体，诸如polyl:C及类似化合物，诸如喜通诺(Hiltonol)及阿普林津(Ampligen)。
本发明之多肽或核酸疫苗组合物可与一或多种免疫调节剂一起使用。适合免疫调节剂之实例包括蛋白质酪氨酸激酶抑制剂(诸如阿法替尼(afatinib)、阿西替尼、西地尼布、埃罗替尼、吉非替尼、葛兰丁宁(grandinin)、拉帕替尼、来他替尼、奈拉替尼(neratinib)、帕唑帕尼、奎扎替尼(quizartinib)、瑞格非尼(regorafenib)、司马沙尼、索拉非尼、舒尼替尼、替沃扎尼(tivozanib)、托西拉尼(toceranib)、博索替尼及凡德他尼)、CD40激动剂(诸如CD40激动剂抗体)、OX40激动剂(诸如OX40激动剂抗体)、CTLA-4抑制剂(诸如抗CTLA-4抗体伊匹单抗及曲美目单抗)、TLR激动剂、4-1BB激动剂、Tim-1拮抗剂、LAGE-3拮抗剂及PD-L1与PD-1拮抗剂。
H.基于疫苗之免疫治疗疗法(VBIR)
在另一方面中，本发明提供一种增强用于治疗哺乳动物(尤其是人类)之赘生性病症之疫苗之免疫原性或治疗效应的方法。该方法包含向接受用于治疗赘生性病症之疫苗的哺乳动物施用(1)有效量之至少一种免疫抑制细胞抑制剂(ISC抑制剂)及(2)有效量之至少一种免疫效应细胞增强剂(IEC增强剂)。该方法可与呈任何形式之疫苗或配制品组合使用，例如亚单位疫苗、基于蛋白质之疫苗、基于肽之疫苗或基于核酸之疫苗，诸如基于DNA之疫苗、基于RNA之疫苗、基于质粒之疫苗或基于载体之疫苗。另外，该方法不限于任何特定类型疫苗或任何特定类型癌症。相反，该方法可与意欲用于治疗赘生性病症(包括良性、前恶性及恶性赘生性病症)之任何疫苗组合使用。举例而言，该方法可与意欲用于治疗以下赘生性病症中之任一者的疫苗组合使用：癌，包括膀胱癌(包括加速性及转移性膀胱癌)、乳癌、结肠癌(包括结肠直肠癌)、肾癌、肝癌、肺癌(包括小细胞肺癌及非小细胞肺癌及肺腺癌)、卵巢癌、前列腺癌、睪丸癌、生殖泌尿道癌、淋巴系统癌瘤、直肠癌、喉癌、胰腺癌(包括外分泌胰腺癌)、食道癌、胃癌、胆囊癌、子宫颈癌、甲状腺癌及皮肤癌(包括鳞状细胞癌)；淋巴造血系肿瘤，包括白血病、急性淋巴细胞性白血病、急性淋巴母细胞白血病、B细胞淋巴瘤、T细胞淋巴瘤、霍奇金氏淋巴瘤(Hodgkins lymphoma)、非霍奇金氏淋巴瘤、毛细胞淋巴瘤、组织细胞淋巴瘤及柏克特氏淋巴瘤(Burketts lymphoma)；骨髓造血系肿瘤，包括急性及慢性骨髓性白血病、骨髓发育不良症候群、骨髓白血病及前髓细胞性白血病；中枢及周边神经系统肿瘤，包括星形细胞瘤、神经母细胞瘤、神经胶质瘤及神经鞘瘤；起源于间质之肿瘤，包括纤维肉瘤、横纹肌肉瘤及骨肉瘤；其它肿瘤，包括黑素瘤、着色性干皮病(xenodermapigmentosum)、角化棘皮瘤、精原细胞瘤、甲状腺滤泡癌及畸胎癌；黑素瘤、不可切除之III期或IV期恶性黑素瘤、鳞状细胞癌、小细胞肺癌、非小细胞肺癌、神经胶质瘤、胃肠癌、肾癌、卵巢癌、肝癌、结肠直肠癌、子宫内膜癌、肾癌、前列腺癌、甲状腺癌、神经母细胞瘤、胰腺癌、多形性胶质母细胞瘤、子宫颈癌、胃癌、膀胱癌、肝癌、乳癌、结肠癌及头颈癌、胃癌、生殖细胞肿瘤、骨癌、骨肿瘤、成人骨恶性纤维组织细胞瘤；儿童期骨恶性纤维组织细胞瘤、肉瘤、儿科肉瘤、鼻窦天然杀手、赘瘤、血浆细胞赘瘤；骨髓发育不良症候群；神经母细胞瘤；睪丸生殖细胞肿瘤、眼内黑素瘤、骨髓发育不良症候群；骨髓发育不良/脊髓增生病、滑膜肉瘤、慢性骨髓白血病、急性淋巴母细胞白血病、费城染色体阳性急性淋巴母细胞白血病(Ph+ALL)、多发性骨髓瘤、急性骨髓性白血病、慢性淋巴细胞白血病及肥大细胞增多症。
在一些实施方式中，本发明提供一种增强用于治疗人类前列腺癌之疫苗之免疫原性或治疗效应的方法。所施用之疫苗能够引发针对任何人类PAA(诸如PSMA、PSA或PSCA)之免疫反应。在一些特定实施方式中，所施用之疫苗包含编码能够引发针对人类PAA(诸如PSMA、PSA或PSCA)之免疫原性之抗原的核酸分子。疫苗中可含有之特定核酸分子的实例包括本发明所提供之以下各物：
1)编码免疫原性PSMA多肽、免疫原性PSA多肽或免疫原性PSCA多肽之核酸分子；
2)编码本发明所提供之两种免疫原性PAA多肽的核酸分子，诸如a)免疫原性PSMA多肽及免疫原性PSA多肽；b)免疫原性PSMA多肽及免疫原性PSCA多肽；或c)免疫原性PSA多肽及免疫原性PSCA多肽；及
3)编码三种免疫原性PAA多肽之核酸分子，该三种免疫原性PAA多肽为免疫原性PSMA多肽、免疫原性PSA多肽及免疫原性PSCA多肽。
在另一方面中，本发明提供一种治疗哺乳动物(尤其是人类)之赘生性病症的方法。该方法包含向该哺乳动物施用(1)有效量之能够引发针对与该赘生性病症相关之TAA之免疫反应的疫苗；(2)有效量之至少一种免疫抑制细胞抑制剂(ISC抑制剂)；及(3)有效量之至少一种免疫效应细胞增强剂(IEC增强剂)。能够引发针对特定TAA之免疫反应的任何疫苗均可用于该方法中。许多TAA在此项技术中为已知的。除前列腺相关抗原以外，以下为此项技术中已知的TAA实例：针对结肠直肠癌之CEA、MUC-1、Ep-CAM、5T4、hCG-b、K-ras及TERT；针对卵巢癌之CEA、Muc-1、p53、间皮素(mesothelin)、存活素及NY-ESO-1；针对非小细胞肺癌之Muc-1、5T4、WT-1、TERT、CEA、EGF-R及MAGE-A3；针对肾细胞癌之5T4；及针对胰腺癌之Muc-1、间皮素、K-Ras、磷脂结合蛋白A2、TERT及CEA。新TAA持续得到鉴别。能够引发针对任何已知或新TAA之免疫反应的疫苗均可用于该方法中。另外，所施用之疫苗可呈任何形式或配制品，例如亚单位疫苗、基于蛋白质之疫苗、基于肽之疫苗或基于核酸之疫苗，诸如基于DNA之疫苗、基于RNA之疫苗、基于质粒之疫苗或基于载体之疫苗。
在一些实施方式中，本发明提供一种治疗人类前列腺癌之方法，该方法包含向人类施用能够引发针对任何人类PAA(诸如PSMA、PSA或PSCA)之免疫反应的疫苗。在一些特定实施方式中，所施用之疫苗包含编码能够引发针对人类PAA(诸如PSMA、PSA或PSCA)之免疫原性之抗原的核酸分子。疫苗中可含有之特定核酸分子的实例包括本发明所提供之以下各物：
1)编码免疫原性PSMA多肽、免疫原性PSA多肽或免疫原性PSCA多肽之核酸分子；
2)编码本发明所提供之两种免疫原性PAA多肽的核酸分子，诸如a)免疫原性PSMA多肽及免疫原性PSA多肽；b)免疫原性PSMA多肽及免疫原性PSCA多肽；或c)免疫原性PSA多肽及免疫原性PSCA多肽；及
3)编码三种免疫原性PAA多肽之核酸分子，该三种免疫原性PAA多肽为免疫原性PSMA多肽、免疫原性PSA多肽及免疫原性PSMA多肽。
上文所述之治疗哺乳动物之赘生性病症的方法及增强用于治疗哺乳动物之赘生性病症之疫苗之免疫原性或治疗效应的方法替代地称为“基于疫苗之免疫治疗疗法”(或“VBIR”)。
在基于疫苗之免疫治疗疗法中，可通过任何适合方法及途径施用IEC增强剂及ISC抑制剂，包括(1)全身性施用，诸如静脉内、肌肉内或经口施用；及(2)局部施用，诸如皮内及皮下施用。在适当或适合的情况下，与全身性施用相比，局部施用一般更佳。局部施用任何IEC增强剂及ISC抑制剂可在适合局部施用医药剂之哺乳动物身体的任何位置进行；然而，更佳在紧邻疫苗引流淋巴结处局部施用此等免疫调节剂。
选自单一类别IEC增强剂之两种或两种以上特定IEC增强剂(例如两种CTLA激动剂)可与ISC抑制剂组合施用。另外，选自两种或两种以上不同类别IEC增强剂之两种或两种以上特定IEC增强剂(例如，一种CTLA-4拮抗剂及一种TLR激动剂)可一起施用。类似地，选自单一类别ISC抑制剂之两种或两种以上特定ISC抑制剂(例如，两种或两种以上蛋白激酶抑制剂)可与IEC增强剂组合施用。另外，选自两种或两种以上不同类别ISC抑制剂之两种或两种以上特定ISC抑制剂(例如，一种蛋白激酶抑制剂及一种COX-2抑制剂)可一起施用。
在基于疫苗之免疫治疗疗法中，疫苗可与所使用之任何或所有免疫调节剂(亦即，ISC抑制剂及IEC增强剂)同时或依序施用。类似地，当使用两种或两种以上免疫调节剂时，其可相对于彼此同时或依序施用。在一些实施方式中，疫苗相对于一种免疫调节剂同时施用(例如，于混合物中)，但相对于一或多种其它免疫调节剂依序施用。在基于疫苗之免疫治疗疗法中共同施用疫苗及免疫调节剂可包括以下情况：施用疫苗及至少一种免疫调节剂以使得每一者同时存在于施用部位(诸如疫苗引流淋巴结)处，纵使抗原及免疫调节剂并非同时施用。共同施用疫苗及免疫调节剂亦可包括以下情况：疫苗或免疫调节剂自施用部位清除，但至少在一或多种其它免疫调节剂施用施用部位之前，所清除之疫苗或免疫调节剂之至少一种细胞性作用持续存在于施用部位(诸如疫苗引流淋巴结)。在核酸疫苗与CpG之组合施用的情况下，疫苗及CpG可包含于单一配制品中且通过任何适合方法一起施用。在一些实施方式中，共同配制品(混合物)中之核酸疫苗及CpG系通过肌肉内注射与电穿孔之组合来施用。
任何ISC抑制剂均可用于基于疫苗之免疫治疗疗法。SIC抑制剂类别之实例包括蛋白激酶抑制剂、环加氧酶-2(COX-2)抑制剂、磷酸二酯酶5型(PDE5)抑制剂及DNA交联剂。COX-2抑制剂之实例包括塞内昔布(celecoxib)及罗非昔布(rofecoxib)。PDE5抑制剂之实例包括阿伐那非(avanafil)、罗地那非(lodenafil)、米罗那非(mirodenafil)、西地那非(sildenafil)、他达那非(tadalafil)、伐地那非(vardenafil)、优地那非(udenafil)及扎普司特(zaprinast)。DNA交联剂之实例为环磷酰胺。下文详细描述特定蛋白激酶抑制剂之实例。
术语“蛋白激酶抑制剂”系指充当蛋白激酶之选择性或非选择性抑制剂之任何物质。术语“蛋白激酶”系指催化三磷酸腺苷之末端磷酸根转移至蛋白质受质之酪氨酸、丝氨酸或苏氨酸残基的酶。蛋白激酶包括受体酪氨酸激酶及非受体酪氨酸激酶。受体酪氨酸激酶之实例包括EGFR(例如EGFR/HER1/ErbB1、HER2/Neu/ErbB2、HER3/ErbB3、HER4/ErbB4)、INSR(胰岛素受体)、IGF-IR、IGF-II1R、IRR(胰岛素受体相关受体)、PDGFR(例如PDGFRA、PDGFRB)、c-KIT/SCFR、VEGFR-1/FLT-1、VEGFR-2/FLK-1/KDR、VEGFR-3/FLT-4、FLT-3/FLK-2、CSF-1R、FGFR 1-4、CCK4、TRK A-C、MET、RON、EPHA 1-8、EPHB 1-6、AXL、MER、TYRO3、TIE、TEK、RYK、DDR 1-2、RET、c-ROS、LTK(白血球酪氨酸激酶)、ALK(多形性淋巴瘤激酶)、ROR 1-2、MUSK、AATYK 1-3及RTK 106。非受体酪氨酸激酶之实例包括BCR-ABL、Src、Frk、Btk、Csk、Abl、Zap70、Fes/Fps、Fak、Jak、Ack及LIMK。在本发明所提供之基于疫苗之免疫治疗疗法中，蛋白激酶抑制剂系以次最佳剂量施用于哺乳动物。术语“次最佳剂量”系指以标靶赘生性病症之单一疗法施用酪氨酸激酶抑制剂(亦即，其中单独施用蛋白激酶抑制剂而不施用任何其它治疗剂)时低于最小有效剂量的剂量。
适用于基于疫苗之免疫治疗疗法的特定蛋白激酶抑制剂之实例包括拉帕替尼(Lapatinib)、AZD 2171、ET18OCH 3、靛玉红-3'-肟(Indirubin-3'-oxime)、NSC-154020、PD 169316、槲皮素(Quercetin)、罗斯维汀(Roscovitine)、曲西立滨(Triciribine)、ZD 1839、5-碘杀结核菌素(5-Iodotubercidin)、阿达福斯汀(Adaphostin)、阿洛辛(Aloisine)、阿尔斯特隆(Alsterpaullone)、氨基染料木黄酮(Aminogenistein)、API-2、芹菜素(Apigenin)、牛蒡子苷元(Arctigenin)、ARRY-334543、阿西替尼(AG-013736)、AY-22989、AZD 2171、双吲哚基顺丁烯二酰亚胺IX、CCl-779、白屈菜红碱(Chelerythrine)、DMPQ、DRB、依地福新(Edelfosine)、ENMD-981693、三羟异黄酮类似物、埃罗替尼(Erlotinib)、法舒地尔(Fasudil)、吉非替尼(ZD1839)、H-7、H-8、H-89、HA-100、HA-1004、HA-1077、HA-1100、羟基法舒地尔(Hydroxyfasudil)、肯泡隆(Kenpaullone)、KN-62、KY12420、LFM-A13、四羟黄酮(Luteolin)、LY294002、LY-294002、楸毒素(Mallotoxin)、ML-9、MLN608、NSC-226080、NSC-231634、NSC-664704、NSC-680410、NU6102、奥罗莫星(Olomoucine)、羟吲哚I、PD153035、PD 98059、根皮酯(Phloridzin)、白皮杉醇(Piceatannol)、苦鬼臼脂素(Picropodophyllin)、PKI、PP1、PP2、PTK787/ZK222584、PTK787/ZK-222584、珀伐拉诺A(Purvalanol A)、雷帕慕恩(Rapamune)、雷帕霉素(Rapamycin)、Ro 31-8220、粗糠柴霉素(Rottlerin)、SB202190、SB203580、西罗莫司、SL327、SP600125、星形孢菌素(Staurosporine)、STI-571、SU1498、SU4312、SU5416、SU5416(司马沙尼(Semaxanib))、SU6656、SU6668、syk抑制剂、TBB、TCN、替伏汀(Tyrphostin)AG 1024、替伏汀AG 490、替伏汀AG 825、替伏汀AG957、U0126、W-7、渥曼青霉素(Wortmannin)、Y-27632、扎克替玛(Zactima)(ZD6474)、ZM 252868、吉非替尼(Iressa.RTM.)、苹果酸舒尼替尼(Sutent.RTM.；SU11248)、埃罗替尼(Tarceva.RTM.；OSI-1774)、拉帕替尼(GW572016；GW2016)、卡拉替尼(canertinib)(CI 1033)、塞玛昔布(semaxinib)(SU5416)、瓦他拉尼(vatalanib)(PTK787/ZK222584)、索拉非尼(sorafenib)(BAY 43-9006)、伊马替尼(imatinib)(Gleevec.RTM.；STI571)、达沙替尼(dasatinib)(BMS-354825)、来氟米特(leflunomide)(SU101)、凡德他尼(vandetanib)(Zactima.RTM.；ZD6474)及尼勒替尼(nilotinib)。适用于本发明中之其它蛋白激酶抑制剂描述于例如美国专利第5,618,829号、第5,639,757号、第5,728,868号、第5,804,396号、第6,100,254号、第6,127,374号、第6,245,759号、第6,306,874号、第6,313,138号、第6,316,444号、第6,329,380号、第6,344,459号、第6,420,382号、第6,479,512号、第6,498,165号、第6,544,988号、第6,562,818号、第6,586,423号、第6,586,424号、第6,740,665号、第6,794,393号、第6,875,767号、第6,927,293号及第6,958,340号。
在一些实施方式中，蛋白激酶抑制剂为多激酶抑制剂，其为作用于超过一种特定激酶之抑制剂。多激酶抑制剂之实例包括伊马替尼、索拉非尼、拉帕替尼、BIRB-796及AZD-1152、AMG706、扎克替玛(ZD6474)、MP-412、索拉非尼(BAY 43-9006)、达沙替尼、CEP-701(来他替尼)、XL647、XL999、Tykerb(拉帕替尼)、MLN518(先前称为CT53518)、PKC412、ST1571、AEE 788、OSI-930、OSI-817、苹果酸舒尼替尼(索坦(Sutent))、阿西替尼(AG-013736)、埃罗替尼、吉非替尼、阿西替尼、博索替尼、坦罗莫司及尼勒替尼(AMN107)。在一些特定实施方式中，酪氨酸激酶抑制剂为舒尼替尼、索拉非尼或者舒尼替尼或索拉非尼之药用可接受之盐或衍生物(诸如苹果酸盐或甲苯磺酸盐)。
Pfizer Inc.以商标SUTENT(索坦)销售之苹果酸舒尼替尼在化学上描述为(2S)-羟基-丁二酸N-[2-(二乙基氨基)乙基]-5-[(Z)-(5-氟-1,2-二氢-2-侧氧基-3H-吲哚-3-次基)甲基]-2,4-二甲基-1H-吡咯-3-甲酰胺化合物(1:1)。该化合物、其合成及特定多晶型物描述于美国专利第6,573,293号、美国专利公开文本第2003-0229229号、第2003-0069298号及第2005-0059824号中及J.M.Manley,M.J.Kalman,B.G.Conway,C.C.Ball,J.L Havens及R.Vaidyanathan,“Early Amidation Approach to 3-[(4-amido)pyrrol-2-yl]-2-indolinones”,J.Org.Chew.68,6447-6450(2003)中。舒尼替尼配制品及其L-苹果酸盐描述于PCT公开文本第WO 2004/024127号中。苹果酸舒尼替尼在美国已被批准用于治疗患有局部不可切除之晚期或转移性疾病之患者的胃肠基质肿瘤、晚期肾细胞癌及进行性良好分化型胰脏神经内分泌肿瘤。用于人类胃肠基质肿瘤(GIST)及晚期肾细胞癌(RCC)之苹果酸舒尼替尼之推荐剂量为50mg，每日口服一次，按照治疗4周随后停药2周之时程(时程4/2)。用于胰脏神经内分泌肿瘤(pNET)之苹果酸舒尼替尼之推荐剂量为37.5mg，每日口服一次。
在基于疫苗之免疫治疗疗法中，苹果酸舒尼替尼可以单剂量或多剂量经口施用。通常，苹果酸舒尼替尼递送两个、三个、四个或四个以上连续周剂量，随后为约1或2周或多于2周之不递送苹果酸舒尼替尼之“停止”期。在一个实施方式中，递送剂量约4周，停止2周。在另一实施方式中，递送苹果酸舒尼替尼两周，停止1周。然而，亦可递送整个治疗期而无“停止”期。在基于疫苗之免疫治疗疗法中经口施用于人类之苹果酸舒尼替尼之有效量通常低于40毫克/人/剂量。举例而言，可经口施用37.5、31.25、25、18.75、12.5、6.25毫克/人/天。在一些实施方式中，经口施用1至25毫克/人/剂量范围内之苹果酸舒尼替尼。在一些其它实施方式中，经口施用6.25、12.5或18.75毫克/人/剂量范围内之苹果酸舒尼替尼。其它给药方案及变化为可预见的，且将根据医师指导来确定。
以商标NEXAVAR销售之甲苯磺酸索拉非尼亦为多激酶抑制剂。其化学名称为4-(4-{3-[4-氯-3-(三氟甲基)苯基]脲基}苯氧基)-N-甲基吡啶-2-甲酰胺。其在美国中已被批准用于治疗原发性肾癌(晚期肾细胞癌)及晚期原发性肝癌(肝细胞癌)。推荐日剂量为400毫克，每日口服两次。在本发明所提供之基于疫苗之免疫治疗疗法中，经口施用之甲苯磺酸索拉非尼之有效量通常低于400毫克/人/天。在一些实施方式中，经口施用之甲苯磺酸索拉非尼之有效量在10至300毫克/人/天范围内。在一些其它实施方式中，经口施用之甲苯磺酸索拉非尼之有效量为10至200毫克/人/天，诸如10、20、60、80、100、120、140、160、180或200毫克/人/天。
以商标INLYTA销售之阿西替尼为VEGF受体1、2及3之选择性抑制剂。其化学名称为(N-甲基-2-[3-((E)-2-吡啶-2-基-乙烯基)-1H-吲唑-6-基硫基]-苯甲酰胺。其已被批准用于在一种先前全身性治疗失败后治疗晚期肾细胞癌。起始剂量为5mg，每日口服两次。可基于个体安全性及耐受性进行剂量调节。在本发明所提供之基于疫苗之免疫治疗疗法中，经口施用之阿西替尼之有效量通常低于5mg，每日两次。在一些其它实施方式中，经口施用之阿西替尼之有效量为1-5mg，每日两次。在一些其它实施方式中，经口施用之阿西替尼之有效量为1、2、3、4或5mg，每日两次。
在基于疫苗之免疫治疗疗法中，可使用任何IEC增强剂。其可为小分子或大分子(诸如蛋白质、多肽、DNA、RNA及抗体)。可使用之IEC增强剂之实例包括TNFR激动剂、CTLA-4拮抗剂、TLR激动剂、渐进式细胞死亡蛋白1(PD-1)拮抗剂(诸如BMS-936558)、抗PD-1抗体(CT-011)及渐进式细胞死亡蛋白1配体1(PD-L1)拮抗剂(诸如BMS-936559)、淋巴细胞活化基因3(LAG3)拮抗剂及含T细胞免疫球蛋白及黏蛋白结构域之分子3(TIM-3)拮抗剂。下文详细提供特定TNFR激动剂、CTLA-4拮抗剂及TLR激动剂之实例。
TNFR激动剂
TNFR激动剂之实例包括OX40、4-1BB(诸如BMS-663513)、GITR(诸如TRX518)及CD40之激动剂。下文详细描述特定CD40激动剂之实例。
CD40激动剂为结合细胞上之CD40受体且能够增加一或多种CD40或CD40L相关活性的物质。因此，CD40“激动剂”涵盖CD40“配体”。
CD40激动剂之实例包括CD40促效抗体、CD40促效抗体之片段、CD40配体(CD40L)及CD40L之片段及衍生物，诸如寡聚物CD40L(例如二价三聚CD40L)、含有其及其变体之融合蛋白质。
用于本发明中之CD40配体包括任何肽、多肽或蛋白质或编码肽、多肽或蛋白质之核酸，其可结合并活化细胞上之一或多种CD40受体。适合CD40配体描述于例如美国专利第6,482,411号、第6,410,711号、美国专利第6,391,637号及美国专利第5,981,724号中，所有所述专利及申请及其中所揭示之CD40L序列系以全文引用的方式并入本文中。虽然人类CD40配体优选用于人类治疗，但来自任何物种之CD40配体均可用于本发明。用于其它动物物种时，诸如用于兽医学实施方式中，与欲治疗之动物相匹配之CD40配体种类优选。在某些实施方式中，CD40配体为gp39肽或蛋白质寡聚物，包括天然形成之gp39肽、多肽或蛋白质寡聚物以及包含寡聚序列之gp39肽、多肽、蛋白质(及编码核酸)。虽然诸如二聚物、三聚物及四聚物之寡聚物在本发明之某些方面中优选，但在本发明之其它方面中涵盖使用较大寡聚结构，只要寡聚结构保留结合并活化一或多种CD40受体之能力即可。
在某些其它实施方式中，CD40激动剂为抗CD40抗体或其抗原结合片段。抗体可为人类、人类化或部分人类嵌合抗CD40抗体。特定抗CD40单克隆抗体之实例包括G28-5、mAb89、EA-5或S2C6单克隆抗体及CP870893。在一个特定实施方式中，抗CD40激动剂抗体为CP870893或达西珠单抗(dacetuzumab)(SGN-40)。
CP-870,893为临床上已作为抗肿瘤疗法之完全人类促效CD40单克隆抗体(mAb)。CP870,893之结构及制备揭示于WO2003041070中(其中识别该抗体之内部识别码为“21.4.1”)。CP-870,893之重链及轻链之氨基酸序列分别阐述于SEQ ID NO:40及SEQ ID NO:41中。在临床试验中，CP870,893通过静脉内输注施用之剂量一般在每次输注0.05至0.25mg/kg范围内。在I期临床研究中，CP-870893之最大耐受剂量(MTD)估计为0.2mg/kg且剂量限制毒性包括3级CRS及3级荨麻疹。[Jens Ruter等人:Immune modulation with weekly dosing of an agonist CD40antibody in aphase I study of patients with advanced solid tumors.Cancer Biology&Therapy 10:10,983-993；2010年11月15日。]在本发明所提供之基于疫苗之免疫治疗疗法中，CP-870,893可经皮内、皮下或经皮施用。优选为经皮内施用。该疗法中欲施用之CP870893之有效量一般低于0.2mg/kg，通常在0.01mg/kg至0.15mg/kg或0.05至0.1mg/kg范围内。
达西珠单抗(亦称为SGN-40或huS2C6；CAS编号88-486-59-9)为已在顽固性淋巴瘤、弥漫性大B细胞淋巴瘤及多发性骨髓瘤之临床试验中研究之另一种抗CD40激动剂抗体。在临床试验中，以2mg/kg至16mg/kg范围内之周剂量经静脉内施用达西珠单抗。在本发明所提供之基于疫苗之免疫治疗疗法中，可经皮内、皮下或经皮施用达西珠单抗。优选为经皮内施用。该基于疫苗之免疫治疗疗法中欲施用之达西珠单抗之有效量一般低于16mg/kg，通常在0.2mg/kg至14mg/kg或0.5至8mg/kg或1至5mg/kg范围内。
CTLA-4抑制剂
适用于本发明所提供之基于疫苗之免疫治疗疗法中的抗CTLA-4拮抗剂包括(而不限于)抗CTLA-4抗体(诸如人类抗CTLA-4抗体、小鼠抗CTLA-4抗体、哺乳动物抗CTLA-4抗体、人类化抗CTLA-4抗体、单克隆抗CTLA-4抗体、多株抗CTLA-4抗体、嵌合抗CTLA-4抗体、抗CTLA-4结构域抗体)、抗CTLA-4抗体片段(诸如单链抗CTLA-4片段、重链抗CTLA-4片段及轻链抗CTLA-4片段)及促进协同刺激路径之CTLA-4抑制剂。在一些实施方式中，CTLA-4抑制剂为伊匹单抗或曲美目单抗。
作为YERVOY销售之伊匹单抗(亦称为MEX-010或MDX-101)为人类抗人类CTLA-4抗体。伊匹单抗亦可用其CAS登记号477202-00-9提及，且在PCT公开文本第WO 01/14424号中揭示为抗体10DI，该公开文本以全文引用的方式并入本文中用于达成所有目的。PCT公开文本第WO2007/67959号中提供包含伊匹单抗之医药组合物的实例。伊匹单抗在美国已被批准用于治疗不可切除性或转移性黑素瘤。作为单一疗法之伊匹单抗之推荐剂量为每3周静脉内施用3mg/kg，总计4次剂量。在本发明所提供之方法中，伊匹单抗系局部，尤其是皮内或皮下施用。局部施用之伊匹单抗之有效量通常在5至200毫克/剂量/人范围内。在一些实施方式中，伊匹单抗之有效量在10至150毫克/剂量/人/剂量范围内。在一些特定实施方式中，伊匹单抗之有效量为约10、25、50、75、100、125、150、175或200毫克/剂量/人。
曲美目单抗(亦称为CP-675,206)为完全人类IgG2单克隆抗体且CAS编号为745013-59-6。曲美目单抗在美国专利第6,682,736号中揭示为抗体11.2.1，该专利以全文引用的方式并入本文中用于达成所有目的。曲美目单抗之重链及轻链之氨基酸序列分别阐述于SEQ ID NO:42及SEQ IDNO:43中。已在用于治疗各种肿瘤(包括黑素瘤及乳癌)之临床试验中研究曲美目单抗，其中曲美目单抗以单次剂量或多次剂量每4或12周以0.01至15mg/kg之剂量范围静脉内施用。在本发明所提供之疗法中，曲美目单抗系局部，尤其是皮内或皮下施用。皮内或皮下施用之曲美目单抗之有效量通常在5至200毫克/剂量/人范围内。在一些实施方式中，曲美目单抗之有效量在10至150毫克/剂量/人/剂量范围内。在一些特定实施方式中，曲美目单抗之有效量为约10、25、50、75、100、125、150、175或200毫克/剂量/人。
Toll样受体(TLR)激动剂
术语“toll样受体激动剂”或“TLR激动剂”系指充当toll样受体(TLR)之激动剂的化合物。此激动剂包括TLR1、TLR2、TLR3、TLR4、TLR5、TLR6、TLR7、TLR8、TLR9、TLR10及TLR11或其组合之激动剂。除非另外指示，否则提及TLR激动剂化合物可包括呈任何药用可接受之形式的化合物，包括任何异构体(例如非对映异构体或对映异构体)、盐、溶剂合物、多晶型物及其类似物。详言之，若化合物具有光学活性，则提及该化合物可包括该化合物之各对映异构体以及所述对映异构体外消旋混合物。此外，化合物可鉴别为一或多种特定TLR之激动剂(例如TLR7激动剂、TLR8激动剂或TLR7/8激动剂)。
可用此项技术中已知的任何适合方式来评估特定化合物之TLR促效作用。不考虑所采用之特定分析法，若用化合物进行分析引起特定TLR所介导之一些生物活性之至少一个临限值增加，则化合物可鉴别为特定TLR之激动剂。反之，若用于执行为侦测特定TLR介导之生物活性所设计的分析时，化合物未能引发生物活性之临限值增加，则可鉴别该化合物不充当特定TLR之激动剂。除非另外指示，否则生物活性增加系指同一生物活性与在适当对照中所观察到之结果相比有所增加。分析法可能或可能不结合适当对照进行。熟习此项技术者可凭经验充分熟悉特定分析(例如在适当对照中在特定分析条件下所观察到之值范围)，因此并非总是需要进行对照来确定化合物在特定分析中之TLR促效作用。
与诸如蛋白质、肽及其类似物之大生物分子相反，适用于本发明方法之某些TLR激动剂为小有机分子。小分子TLR激动剂之实例包括以下专利中所揭示者，例如：美国专利第4,689,338号、第4,929,624号、第4,988,815号、第5,037,986号、第5,175,296号、第5,238,944号、第5,266,575号、第5,268,376号、第5,346,905号、第5,352,784号、第5,367,076号、第5,389,640号、第5,395,937号、第5,446,153号、第5,482,936号、第5,693,811号、第5,741,908号、第5,756,747号、第5,939,090号、第6,039,969号、第6,083,505号、第6,110,929号、第6,194,425号、第6,245,776号、第6,331,539号、第6,376,669号、第6,451,810号、第6,525,064号、第6,545,016号、第6,545,017号、第6,558,951号及第6,573,273号。适用于本发明所提供之方法的特定小分子TLR激动剂之实例包括4-氨基-α,α,2-三甲基-1H-咪唑并[4,5-c]喹啉-1-乙醇、N-(2-{2-[4-氨基-2-(2-甲氧基乙基)-1H-咪唑并[4,5-c]喹啉-1-基]乙氧基-}乙基)-N-甲基吗啉-4-甲酰胺、1-(2-氨基-2-甲基丙基)-2-(乙氧基甲基-)-1H-咪唑并[4,5-c]喹啉-4-胺、N-[4-(4-氨基-2-乙基-1H-咪唑并[4,5-c]喹啉-1-基)丁基]甲磺酰胺、N-[4-(4-氨基-2-丙基-1H-咪唑并[4,5-c]喹啉-1-基)丁基]甲磺酰胺及咪喹莫特(imiquimod)。尤其适用于本发明所提供之方法或疗法的一些TLR激动剂论述于以下评述论文中：FolkertSteinhagen等人,TLR-based immune adjuvants.Vaccine 29(2011):3341-3355。
在一些实施方式中，TLR激动剂为TLR9激动剂，尤其是CpG寡核苷酸(或CpG.ODN)。CpG寡核苷酸为依序含有经磷酸酯键连接之胞嘧啶及鸟嘌呤之短核酸分子，其中胞嘧啶之嘧啶环未经甲基化。CpG基序为包括未甲基化中心CpG的碱基模式，此中心CpG被至少一个侧接于中心CpG(3'及5'侧)之碱基围绕。CpG寡核苷酸包括D及K寡核苷酸。整个CpG寡核苷酸可未经甲基化，或部分可未经甲基化。适用于本发明所提供之方法的CpG寡核苷酸之实例包括美国专利第6194388号、第6207646号、第6214806号、第628371号、第6239116号及第6339068号中所揭示者。
与天然RNA及DNA相比，CpG寡核苷酸可涵盖各种化学修饰及取代，包括磷酸二酯核苷间桥连、β-D-核糖(脱氧核糖)单元及/或天然核苷碱基(腺嘌呤、鸟嘌呤、胞嘧啶、胸嘧啶、尿嘧啶)。化学修饰之实例为熟习此项技术者已知的且描述于例如以下文献中：Uhlmann E.等人,(1990),Chem.Rev.90:543；“Protocols for Oligonucleotides and Analogs”,Synthesis and Properties and Synthesis and Analytical Techniques,S.Agrawal编,Humana Press,Totowa,USA 1993；Crooke,ST.等人,(1996)Annu.Rev.Pharmacol.Toxicol.36:107-129；及Hunziker J.等人,(1995),Mod.Synth.Methods 7:331-417。具体而言，CpG寡核苷酸可含有经修饰之胞嘧啶。经修饰之胞嘧啶为胞嘧啶之天然存在或非天然存在之嘧啶碱基类似物，其可置换此碱基而不损害寡核苷酸之免疫刺激活性。经修饰之胞嘧啶包括(但不限于)5-经取代之胞嘧啶(例如5-甲基胞嘧啶、5-氟胞嘧啶、5-氯胞嘧啶、5-溴胞嘧啶、5-碘胞嘧啶、5-羟基胞嘧啶、5-羟甲基胞嘧啶、5-二氟甲基胞嘧啶及未经取代或经取代之5-炔基胞嘧啶)、6-经取代之胞嘧啶、N4-经取代之胞嘧啶(例如N4-乙基胞嘧啶)、5-氮杂-胞嘧啶、2-巯基胞嘧啶、异胞嘧啶、假异胞嘧啶、具有缩合环系统之胞嘧啶类似物(例如N,N'-伸丙基胞嘧啶或啡恶嗪)以及尿嘧啶及其衍生物(例如5-氟尿嘧啶、5-溴尿嘧啶、5-溴乙烯基尿嘧啶、4-硫尿嘧啶、5-羟基尿嘧啶、5-丙炔基尿嘧啶)。一些优选胞嘧啶包括5-甲基胞嘧啶、5-氟胞嘧啶、5-羟基胞嘧啶、5-羟甲基胞嘧啶及N4-乙基胞嘧啶。
CpG寡核苷酸亦可含有经修饰之鸟嘌呤。经修饰之鸟嘌呤为鸟嘌呤之天然存在或非天然存在之嘌呤碱基类似物，其可置换此碱基而不损害寡核苷酸之免疫刺激活性。经修饰之鸟嘌呤(包括但不限于)7-脱氮鸟嘌呤、7-脱氮-7-经取代之鸟嘌呤、次黄嘌呤、N2-经取代之鸟嘌呤(例如N2-甲基鸟嘌呤)、5-氨基-3-甲基-3H,6H-噻唑并[4,5-d]嘧啶-2,7-二酮、2,6-二氨基嘌呤、2-氨基嘌呤、嘌呤、吲哚、腺嘌呤、经取代之腺嘌呤(例如N6-甲基腺嘌呤、8-侧氧基腺嘌呤)、8-经取代之鸟嘌呤(例如8-羟基鸟嘌呤及8-溴鸟嘌呤)及6-硫鸟嘌呤。在本发明之一些实施方式中，鸟嘌呤碱基经通用碱基(例如4-甲基吲哚、5-硝基吲哚及K-碱基)、芳环系统(例如苯并咪唑或二氯苯并咪唑、1-甲基-1H-[1,2,4]三唑-3-甲酸酰胺)或氢原子取代。
在某些方面中，CpG寡核苷酸包括经修饰之骨架。已证明当活体内施用时，核酸骨架之修饰可增强核酸之活性。二级结构，诸如茎环，可稳定核酸以防降解。或者，核酸稳定可经由磷酸骨架修饰来实现。优选稳定核酸具有至少一个部分硫代磷酸酯修饰骨架。硫代磷酸酯可使用自动化技术、采用氨基磷酸酯或H-膦酸酯化合物来合成。例如，可如美国专利第4,469,863号中所述制造芳基膦酸酯及烷基膦酸酯；且可通过自动化固相合成、使用市售试剂来制备烷基磷酸三酯(其中带电含氧部分如美国专利第5,023,243号及欧洲专利第092,574号中所述经烷基化)。已描述用于制造其它DNA骨架修饰及取代之方法(Uhlmann,E.及Peyman,A.(1990)Chem.Rev.90:544；Goodchild,J.(1990)Bioconjugate Chem.1:165)。具有CpG基序之2'-O-甲基核酸亦引起免疫活化，如同经乙氧基修饰之CpG核酸。实际上，已发现无骨架修饰完全消除CpG效应，但通过5-甲基C置换C已将其大大降低。具有硫代磷酸酯键联之构建体提供最大活性且防止核酸因细胞内之外切核酸酶及内切核酸酶而降解。其它经修饰之寡核苷酸包括经磷酸二酯修饰之寡核苷酸、磷酸二酯与硫代磷酸酯寡核苷酸之组合、甲基膦酸酯、甲基硫代磷酸酯、二硫代磷酸酯、对乙氧基及其组合。相对于CpG核酸，此等组合中之每一者及其对免疫细胞之特定作用更详细论述于PCT公开文本第WO 96/02555号及第WO98/18810号及美国专利第6,194,388号及第6,239,116号中。
CpG寡核苷酸可具有一或两个可及5'端。可产生具有两个此种5'端之经修饰寡核苷酸，例如使两个寡核苷酸经由3'-3'键联连接以产生具有一或两个可及5'端之寡核苷酸。3'-3'键联可为磷酸二酯、硫代磷酸酯或任何其它经修饰之核苷间桥连。用于实现所述键联之方法在此项技术中为已知的。举例而言，所述键联已描述于以下文献中：Seliger,H.等人,Oligonucleotide analogs with terminal 3'-3'-and 5'-5'-internucleotidiclinkages as antisense inhibitors of viral gene expression,Nucleosides andNucleotides(1991),10(1 -3),469-77；及Jiang等人,Pseudo-cyclicoligonucleotides:in vitro and in vivo properties,Bioorganic and MedicinalChemistry(1999),7(12),2727-2735。
另外，可使用其它间隔基(诸如三乙二醇或四乙二醇磷酸酯部分)来制备3'-3'连接之寡核苷酸，其中3'端核苷间键联不为磷酸二酯、硫代磷酸酯或其它经修饰桥连(Durand,M.等人,Triple-helix formation by anoligonucleotide containing one(dA)12and two(dT)12sequences bridged bytwo hexaethylene glycol chains,Biochemistry(1992),31(38),9197-204；美国专利第5,658,738号及第5,668,265号)。或者，可使用标准氨基磷酸酯化学反应、由乙二醇、丙二醇或由无碱基脱氧核糖(dSpacer)单元获得非核苷酸连接子(Fontanel,Marie Laurence等人,Nucleic Acids Research(1994),22(11),2022-7)。非核苷酸连接子可并入一次或多次，或彼此组合，从而允许两个欲连接之寡核苷酸之3'端之间存在任何理想距离。
位于核苷之3'及/或5'端之磷酸二酯核苷间桥连可由经修饰之核苷间桥连置换，其中该经修饰之核苷间桥连系选自例如硫代磷酸酯、二硫代磷酸酯、NR1R2-氨基磷酸酯、硼烷磷酸酯、膦酸α-羟基苯甲基酯、磷酸-(C1-C21)-O-烷基酯、磷酸-[(C6-C21)芳基-(C1-C21)-O-烷基酯、(C1-C8)烷基磷酸酯及/或(C6-C12)芳基磷酸酯桥连、(C7-C12)-α-羟甲基-芳基(例如揭示于PCT公开文本第WO 95/01363号中)，其中(C6-C12)芳基、(C6-C20)芳基及(C6-C14)芳基视情况经卤素、烷基、烷氧基、硝基、氰基取代，且其中R1及R2彼此独立地为氢、(C1-C18)烷基、(C6-C20)芳基、(C6-C14)芳基、(C1-C8)烷基，优选为氢、(C1-C8)烷基，优选为(C1-C4)烷基及/或甲氧基乙基，或R1及R2与携带其之氮原子一起形成5至6员杂环，该杂环可另外含有选自O、S及N之群的另一杂原子。
通过脱磷酸桥连置换位于核苷之3'及/或5'端之磷酸二酯桥连(脱磷酸桥连描述于例如Uhlmann E.及Peyman A.,“Methods in MolecularBiology”,第20卷,“Protocols for Oligonucleotides and Analogs”,S.Agrawal编,Humana Press,Totowa 1993,第16章,第355页及下文中)，其中脱磷酸桥连系选自例如以下脱磷酸桥连：甲缩醛、3'-硫甲缩醛、甲基羟胺、肟、亚甲基二甲基伸肼基、二亚甲砜及/或硅烷基。
用于本发明所提供之方法或疗法中的CpG寡核苷酸可视情况具有嵌合骨架。嵌合骨架为包含超过一种类型键联之骨架。在一个实施方式中，嵌合骨架可由下式表示：5'Y1 N1ZN2Y2 3'。Y1及Y2为具有1至10个核苷酸之核酸分子。Y1及Y2各自包括至少一个经修饰之核苷酸间键联。因为嵌合寡核苷酸之至少2个核苷酸包括骨架修饰，因此，此等核酸为一种类型“稳定免疫刺激核酸”之一个实例。
相对于嵌合寡核苷酸，Y1及Y2被视为彼此无关。这意味着Y1及Y2各自可能或可能不在同一分子中具有彼此不同的序列及不同的骨架键联。在一些实施方式中，Y1及/或Y2具有3至8个核苷酸。N1及N2为具有0至5个核苷酸之核酸分子，只要N1ZN2具有总计至少6个核苷酸即可。N1ZN2之核苷酸具有磷酸二酯骨架且不包括具有经修饰骨架之核酸。Z为免疫刺激核酸基序，优选系选自本文中所述者。
式Y1 N1ZN2Y2之中心核苷酸(N1ZN2)具有磷酸二酯核苷酸间键联且Y1及Y2具有至少一个但可具有超过一个或甚至可具有所有经修饰之核苷酸间键联。在优选实施方式中，Y1及/或Y2具有至少2个或2至5个经修饰之核苷酸间键联，或Y1具有5个经修饰之核苷酸间键联且Y2具有2个经修饰之核苷酸间键联。在一些实施方式中，经修饰之核苷酸间键联为经硫代磷酸酯修饰之键联、二硫代磷酸酯键联或经对乙氧基修饰之键联。
适用于本发明所提供之方法之特定CpG寡核苷酸之实例包括：
5'TCGTCGTTTTGTCGTTTTGTCGTT3'(CpG 7909)；
5'TCGTCGTTTTTCGGTGCTTTT3'(CpG 24555)；及
5'TCGTCGTTTTTCGGTCGTTTT3'(CpG 10103)。
已广泛研究合成的单链24聚体CpG7909作为单一疗法及与化学治疗剂组合用于治疗癌症以及作为佐剂用于针对癌症及传染病之疫苗。据报导，静脉内单一剂量之CpG 7909具良好耐受性而无临床效应且无显著毒性直至高达1.05mg/kg，而皮下单一剂量CpG 7909具有0.45mg/kg之最大耐受剂量(MTD)且具有肌痛之剂量限制毒性及体质性效应。[参看Zent,Clive S等人,Phase I clinical trial of CpG oligonucleotide 7909(PF-03512676)in patients with previously treated chronic lymphocytic leukemia.Leukemia and Lymphoma,53(2):211-217(7)(2012)]。在本发明所提供之疗法中，可通过注射至肌肉中或任何其它适合方法来施用CpG7909。优选在邻近疫苗引流淋巴结处局部施用，尤其是通过皮内或皮下施用。为与诸如DNA疫苗之核酸疫苗一起使用，优选可将CpG与疫苗共同调配于单一配制品中且通过肌肉内注射联合电穿孔来施用。通过肌肉内、皮内或皮下施用之CpG7909之有效量通常在10微克/剂量至10毫克/剂量范围内。在一些实施方式中，CpG7909之有效量在0.05毫克至14毫克/剂量范围内。在一些特定实施方式中，CpG7909之有效量为约0.05、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5或1毫克/剂量。其它CpG寡核苷酸，包括CpG 24555及CpG10103，可用类似方式及剂量施用。
在一些特定实施方式中，本发明提供一种增强用于治疗人类赘生性病症之疫苗之免疫原性或治疗效应的方法，该方法包含向该人类施用(1)有效量之至少一种ISC抑制剂及(2)有效量之至少一种IEC增强剂，其中该至少一种ISC抑制剂为选自甲苯磺酸索拉非尼、苹果酸舒尼替尼、阿西替尼、埃罗替尼、吉非替尼、阿西替尼、博索替尼、坦罗莫司或尼勒替尼之蛋白激酶抑制剂，且其中该至少一种IEC增强剂系选自CTLA-4抑制剂、TLR激动剂或CD40激动剂。在一些优选实施方式中，疗法包含向人类施用(1)有效量之至少一种ISC抑制剂及(2)有效量之至少一种IEC增强剂，其中该至少一种ISC抑制剂为选自阿西替尼、甲苯磺酸索拉非尼或苹果酸舒尼替尼之蛋白激酶抑制剂，且其中该至少一种IEC增强剂为选自伊匹单抗或曲美目单抗之CTLA-4抑制剂。在一些其它优选实施方式中，该疗法包含向人类施用(1)有效量之至少一种ISC抑制剂及(2)有效量之至少两种IEC增强剂，其中该至少一种ISC抑制剂为选自舒尼替尼或阿西替尼之蛋白激酶抑制剂，且其中该至少两种IEC增强剂为曲美目单抗及选自CpG7909、CpG2455或CpG10103之TLR激动剂。
在一些其它实施方式中，本发明提供一种治疗人类前列腺癌之方法，该方法包含向人类施用(1)有效量之能够引发针对人类PAA之免疫反应的疫苗；(2)有效量之至少一种ISC抑制剂；及(3)有效量之至少一种IEC增强剂，其中该至少一种ISC抑制剂为选自甲苯磺酸索拉非尼、苹果酸舒尼替尼、阿西替尼、埃罗替尼、吉非替尼、阿西替尼、博索替尼、坦罗莫司或尼勒替尼之蛋白激酶抑制剂，且其中该至少一种IEC增强剂系选自CTLA-4抑制剂、TLR激动剂或CD40激动剂。在一些优选实施方式中，该方法包含向人类施用(1)有效量之能够引发针对人类PAA之免疫反应的疫苗；(2)有效量之至少一种ISC抑制剂；及(3)有效量之至少一种IEC增强剂，其中该至少一种ISC抑制剂为选自甲苯磺酸索拉非尼、苹果酸舒尼替尼或阿西替尼之蛋白激酶抑制剂，且其中该至少一种IEC增强剂为选自伊匹单抗或曲美目单抗之CTLA-4抑制剂。
在一些其它特定实施方式中，该方法包含向人类施用(1)有效量之至少一种ISC抑制剂及(2)有效量之至少两种IEC增强剂，其中该至少一种ISC抑制剂为选自舒尼替尼或阿西替尼之蛋白激酶抑制剂，且其中该至少两种IEC增强剂为曲美目单抗及选自CpG7909、CpG2455或CpG10103之TLR激动剂。
其它治疗剂
本发明所提供之基于疫苗之免疫治疗疗法可进一步包含其它治疗剂。可使用多种癌症治疗剂，包括化学治疗剂及激素治疗剂。一般熟习此项技术者应认识到可存在及开发用于本发明所提供之VBIR的其它癌症疗法，且不应局限于本文所述之彼等治疗形式。
术语“化学治疗剂”系指可引起癌细胞死亡或干扰癌细胞生长、分裂、修复及/或发挥功能的化学或生物学物质。化学治疗剂之实例包括WO2006/088639、WO2006/129163及US 20060153808中所揭示者，各案之揭示内容系以引用的方式并入本文中。特定化学治疗剂之实例包括：(1)烷基化剂，诸如苯丁酸氮芥(LEUKERAN)、环磷酰胺(CYTOXAN)、异环磷酰胺(IFEX)、氮芥盐酸盐(MUSTARGEN)、塞替派(thiotepa)(THIOPLEX)、链脲佐菌素(streptozotocin)(ZANOSAR)、卡莫司汀(carmustine)(BICNU、GLIADEL WAFER)、洛莫司汀(CEENU)及达卡巴嗪(DTIC-DOME)；(2)生物碱或植物长春生物碱，包括细胞毒性抗生素，诸如小红莓(doxorubicin)(ADRIAMYCIN)、表阿比星(epirubicin)(ELLENCE、PHARMORUBICIN)、道诺霉素(daunorubicin)(CERUBIDINE、DAUNOXOME)、奈莫柔比星(nemorubicin)、伊达比星(idarubicin)(IDAMYCIN PFS、ZAVEDOS)、米托蒽醌(mitoxantrone)(DHAD、NOVANTRONE)、更生霉素(dactinomycin)(放线菌素D、COSMEGEN)、普卡霉素(plicamycin)(MITHRACIN)、丝裂霉素(mitomycin)(MUTAMYCIN)及博来霉素(bleomycin)(BLENOXANE)、酒石酸长春瑞滨(vinorelbine tartrate)(NAVELBINE)、长春碱(vinblastine)(VELBAN)、长春新碱(vincristine)(ONCOVIN)及长春地辛(vindesine)(ELDISINE)；(3)抗代谢物，诸如卡培他滨(capecitabine)(XELODA)、阿糖胞苷(cytarabine)(CYTOSAR-U)、氟达拉滨(fludarabine)(FLUDARA)、吉西他滨(gemcitabine)(GEMZAR)、羟基脲(HYDRA)、甲胺喋呤(FOLEX、MEXATE、TREXALL)、奈拉滨(nelarabine)(ARRANON)、三甲曲沙(trimetrexate)(NEUTREXIN)及培美曲塞(pemetrexed)(ALIMTA)；(4)嘧啶拮抗剂，诸如5-氟尿嘧啶(5-FU)、卡培他滨(XELODA)、雷替曲赛(raltitrexed)(TOMUDEX)、喃氟啶尿嘧啶(tegafur-uracil)(UFTORAL)及吉西他滨(GEMZAR)；(5)紫杉烷，诸如欧洲紫杉醇(docetaxel)(TAXOTERE)、太平洋紫杉醇(paclitaxel)(TAXOL)；(6)铂药物，诸如顺铂(cisplatin)(PLATINOL)及卡铂(carboplatin)(PARAPLATIN)及奥克赛铂(oxaliplatin)(ELOXATIN)；(7)拓扑异构酶抑制剂，诸如伊立替康(irinotecan)(CAMPTOSAR)、拓扑替康(topotecan)(HYCAMTIN)、依托泊苷(etoposide)(ETOPOPHOS、VEPESSID、TOPOSAR)及替尼泊苷(teniposide)(VUMON)；(8)表鬼臼霉素(epipodophyllotoxins)(鬼臼霉素衍生物)，诸如依托泊苷(etoposide)(ETOPOPHOS、VEPESSID、TOPOSAR)；(9)叶酸衍生物，诸如亚叶酸(WELLCOVORIN)；(10)亚硝基脲，诸如卡莫司汀(carmustine)(BiCNU)、洛莫司汀(lomustine)(CeeNU)；(11)受体酪氨酸激酶，包括表皮生长因子受体(EGFR)、血管内皮生长因子(VEGF)、胰岛素受体、胰岛素样生长因子受体(IGFR)、肝细胞生长因子受体(HGFR)及来源于血小板之生长因子受体(PDGFR)之抑制剂，诸如吉非替尼(IRESSA)、埃罗替尼(TARCEVA)、硼替佐米(VELCADE)、甲磺酸伊马替尼(GLEEVEC)、吉非替尼、拉帕替尼、索拉非尼、沙立度胺(thalidomide)、舒尼替尼(索坦(SUTENT))、阿西替尼、利妥昔单抗(RITUXAN、MABTHERA)、曲妥珠单抗(trastuzumab)(HERCEPTIN)、西妥昔单抗(cetuximab)(ERBITUX)、贝伐单抗(bevacizumab)(AVASTIN)及兰尼单抗(ranibizumab)(LUCENTIS)、lym-1(ONCOLYM)、WO2002/053596中所揭示之针对胰岛素样生长因子-1受体(IGF-1R)之抗体；(12)血管生成抑制剂，诸如贝伐单抗(AVASTIN)、苏拉明(suramin)(GERMANIN)、血管生长抑素、SU5416、沙立度胺及基质金属蛋白酶抑制剂(诸如巴马司他(batimastat)及马立马斯他(marimastat))及WO2002055106中所揭示者；及(13)蛋白酶体抑制剂，诸如硼替佐米(VELCADE)。
术语“激素治疗剂”系指抑制或消除激素之产生、或者抑制或抵消激素对癌细胞生长及/或存活之作用的化学或生物学物质。适用于VBIR之所述药剂之实例包括US20070117809中所揭示者。特定激素治疗剂之实例包括他莫昔芬(tamoxifen)(NOLVADEX)、托瑞米芬(toremifene)(Fareston)、氟维司群(fulvestrant)(FASLODEX)、阿那曲唑(anastrozole)(ARIMIDEX)、依西美坦(exemestane)(AROMASIN)、雷曲唑(letrozole)(FEMARA)、乙酸甲地孕酮(megestrol acetate)(MEGACE)、戈舍瑞林(goserelin)(ZOLADEX)、亮丙立德(leuprolide)(LUPRON)、阿比特龙(abiraterone)及MDV3100。
本发明所提供之VBIR亦可与其它疗法组合使用，包括(1)移除所有或部分参与激素产生之器官或腺体(诸如卵巢、睪丸、肾上腺及垂体腺)的手术法；及(2)辐射处理，其中使患者之器官或腺体经历足以抑制或消除靶向激素产生之量的辐射。
I.实施例
提供以下实施例以说明本发明之某些实施方式。其应视为不以任何方式限制本发明之范畴。根据以上论述及此等实施例，熟习此项技术者可确定本发明之基本特征，且在不背离其精神及范畴的情况下，可对本发明进行各种变化及修改以使其适应各种用途及条件。
实施例1.来源于人类PSMA蛋白之呈胞溶质、分泌及膜结合形式之抗原
实施例1说明分别称为“人类PSMA胞溶质抗原”、“人类PSMA分泌抗原”及“人类PSMA膜结合抗原”之三种免疫原性PSMA多肽的构建及此等多肽之生物学性质。
1A.免疫原性PSMA多肽之设计
基于天然人类PSMA蛋白序列构建编码呈胞溶质、分泌及修饰形式之免疫原性PSMA多肽的DNA构建体且测试其诱导抗肿瘤效应子免疫反应之能力。各人类PSMA抗原形式之结构及制备提供如下。
1A1.人类PSMA胞溶质抗原。呈胞溶质形式之免疫原性PSMA多肽设计成当免疫原性多肽一经表达即保留在细胞内。移除人类PSMA的细胞质域(氨基酸1-19)及跨膜域(氨基酸20-43)，产生由SEQ ID NO:1之人类PSMA的氨基酸44-750(细胞外域或ECD)组成的胞溶质PSMA多肽。可将最佳Kozak序列“MAS”添加至多肽之N末端以增强表达。
1A2.人类PSMA分泌抗原。呈分泌形式之免疫原性PSMA多肽设计成当多肽一经表达即分泌至细胞外。分泌多肽具有SEQ ID NO:1之人类PSMA的氨基酸44-750(ECD)及具有氨基酸序列ETDTLLLWVLLLWVPGSTGD之Igκ分泌元件及处于N末端之双氨基酸连接子(AA)，以便PSMA抗原一经表达即使PSMA抗原之分泌最大化。
1A3.人类PSM膜结合抗原。免疫原性PSMA膜结合多肽设计成使细胞表面上之多肽稳定。移除人类PSMA蛋白之前14个氨基酸，且所得免疫原性多肽由SEQ ID NO:1之人类PSMA蛋白之氨基酸15-750组成。由SEQ ID NO:1之天然人类PSMA蛋白之氨基酸15-750组成且与天然人类PSMA蛋白具有100％序列相同性的免疫原性多肽在本发明中亦称为“经修饰之人类PSMA”、“经修饰之hPSMA”或“hPSMAmod”抗原。
1B.制备DNA质粒以供表达PSMA抗原
将编码PSMA胞溶质抗原、PSMA分泌抗原及PSMA修饰抗原之DNA构建体个别地克隆至适用于动物活体内测试之PJV7563载体中(图1)。将PJV7563载体中之DNA之两链测序以确定设计完整性。
由序列经确定之克隆制造大规模质粒DNA制剂(Qiagen/CsCl)。质粒DNA之品质由高260/280比率、高超螺旋/切口DNA比率、低内毒素含量(<10U/mg DNA)及负生物负荷确定。
1C.PSMA构建体在哺乳动物细胞中之表达
通过FACS测定PSMA胞溶质抗原、分泌抗原及修饰抗原之表达。用编码各种免疫原性PSMA多肽之PJV7563PMED载体转染哺乳动物之293个细胞。三天后，用小鼠抗PSMA抗体，随后用荧光结合(FITC)之大鼠抗小鼠二级抗体将293个细胞染色。相对于阴性对照以平均荧光强度(MFI)报导的以下资料确定经修饰之人类PSMA抗原表达于细胞表面上。
样品 平均荧光强度
未经转染之293个细胞 231
经全长人类PSMA(SEQ ID NO:1)转染之293个细胞 6425
经修饰之人类PSMA抗原(SEQ ID NO:9)转染之293个细胞 12270
1D.PSMA质粒于金粒子上之配制品(用于ND10/X15)
粒子介导之表皮递送技术(PMED)为向动物或患者施用疫苗之无针法。PMED系统包括使DNA沈淀于微观金粒子上，接着通过氦气推入表皮中。单次使用装置ND10使用来自内部气缸之加压氦气来递送金粒子，且循环递送装置X15使用经由高压软管连接至X15之外部氦气瓶来递送金粒子。此两种装置在研究中均用于递送PSMA DNA质粒。金粒子之直径通常为1-3μm，且粒子经调配以含有2μg PSMA质粒/1mg金粒子。(Sharpe,M.等人:P.Protection of mice from H5N1influenza challengeby prophylactic DNA vaccination using particle mediated epidermal delivery.Vaccine,2007,25(34):6392-98；Roberts LK等人:Clinical safety andefficacy of a powdered Hepatitis B nucleic acid vaccine delivered to theepidermis by a commercial prototype device.Vaccine,2005；23(40):4867-78)。
1E.用于活体内研究之转基因小鼠
使用两种人类HLA转基因小鼠模型来评估不同HLA对各种PSMA抗原之呈递，且使用人类PSMA转基因小鼠模型来评估针对人类PSMA的免疫耐受性之破坏。第一个HLA转基因小鼠模型利用HLA A2/DR1小鼠(得自the Pasteur Institute,Paris,France；亦称为“巴斯德小鼠”)。巴斯德小鼠被剔除鼠类β-2微球蛋白，且不表达功能H-2b分子；因此，据信此模型表示抗原于人类HLA A2及DR1情况下之呈递(Pajot,A.,M.-L.Michel,N.Faxilleau,V.Pancre,C.Auriault,D.M.Ojcius,F.A.Lemonnier,及Y.-C.Lone.A mouse model of human adaptive immune functions:HLA-A2.1-/HLA-DR1-transgenic H-2 class I-/class II-knockout mice.Eur.J.Immunol.2004,34:3060-69)。第二种HLA转基因小鼠模型使用在H2bk基因座嵌有人类HLA A24与人类β-2微球蛋白共价键联之小鼠。此等小鼠缺乏鼠类β-2微球蛋白且不表达功能H-2b分子。此模型允许评估人类HLA A24情况下之抗原呈递。
1F.呈胞溶质、分泌及修饰形式之人类PSMA蛋白之免疫原性
研究设计。使用PMED法，在初始免疫/增强免疫/增强免疫疗法(每次接种相隔两周)中用各种PSMA DNA构建体将8至10周龄转基因小鼠免疫。或者，通过肌肉内注射用编码PSMA抗原之腺病毒载体以含于50μl(PBS)中之1×109个病毒粒子对小鼠进行初始免疫。腺病毒载体(得自Stratagene之pShuttle-CMV载体)经修饰而在多个克隆位点内含有NheI及BglII限制位点。接着用NheI及BglII对编码经修饰之人类PSMA的DNA进行限制消化，接合至此载体中且确定序列。接着将pShuttle人类PSMA经修饰载体与pAdEasy-1载体重组，且根据AdEasy系统(Stratagene)扩增病毒。20天后，如上文所述，其用PMED增强免疫。在所使用之各疗法中，在干扰素-γ(IFNγ)ELISPOT分析中之最后一次免疫之后7天量测抗原特异性T细胞反应。ELISPOT分析类似于夹心酶联免疫吸附分析法(ELISA)。简言之，在微量培养盘中，在4℃下将IFNγ特异性捕捉抗体(BD Bioscience，#51-2525kc)涂布于聚偏二氟乙烯(PVDF)膜上隔夜。用血清/蛋白质阻断培养盘以防止与抗体之非特异性结合。阻断之后，将效应细胞(诸如自经PSMA免疫之小鼠中分离之脾细胞)及标靶(诸如来自肽文库之PSMA肽，经肽脉冲之标靶细胞或表达相关抗原之肿瘤细胞)或有丝分裂原(其将刺激脾细胞非特异性产生IFNγ)添加至孔中且在37℃下在5％CO2培育箱中培育隔夜。通过PVDF膜表面上之涂布抗体来捕捉效应细胞所分泌之细胞因子。在移除细胞及培养基之后，将100μl经生物素标记之多株抗小鼠IFNγ抗体(0.5mg/ml，BD Bioscience，#51-1818kz)添加至各孔以供侦测。通过添加抗生蛋白链菌素-辣根过氧化酶(HRP，BDBioscience，#557630)及沈淀受质3-氨基-9-乙基咔唑以产生红色斑点来显现斑点。各斑点代表产生单一细胞因子之T细胞。一般而言，在此处揭示之研究中，ELISpot分析设置如下：(1)在来源于由15个氨基酸之肽(11个氨基酸重叠)制得之PSMA肽文库(参看表16)之PSMA特异性肽存在下，(2)与已知HLA A2.1限制性PSMA特异性肽一起，或(3)与肿瘤细胞一起培养来自PSMA免疫小鼠之5×105个脾细胞。为量测内源性抗原呈递之识别，将脾细胞与天然表达PSMA之人类HLA A2前列腺癌细胞(亦即LNCaP，获自ATCC)一起培养，或与经编码且因此表达经修饰之人类PSMA抗原之腺病毒转导之HLA A2肿瘤细胞一起培养。另外，将人类PSMA ECD蛋白添加至ELISpot分析以量测特异性产生CD4 IFNγ之细胞。作为对照，在IFNγELISpot分析中，适当时使用HLA A2限制性HER-2特异性肽p168-175或者不表达PSMA或无关蛋白(诸如BSA)之肿瘤细胞作为阴性对照。资料结果系以1×106个脾细胞中分泌IFNγ之斑点形成细胞(SFC)数以归一化格式提供。对所测试之各PSMA抗原肽进行至少三次研究。
结果。利用巴斯德小鼠脾细胞与来源于PSMA肽文库之肽一起培养之ELISpot分析之数据呈现于表1中。阳性反应定义为具有SFC>100。如表1中所示，用以上实施例1A中所述之所有三种抗原形式(人类PSMA胞溶质、分泌及经修饰抗原)制得之免疫原性PMSA多肽能够诱导T细胞反应。经修饰之人类PSMA抗原形式诱导具有最佳宽度及量值之T细胞反应。
表1.巴斯德小鼠中由人类PSMA胞溶质、分泌及经修饰抗原诱导之T细胞反应
()＝标准差
对巴斯德小鼠中由各种PSMA疫苗形式(其识别HLA A2.1限制性PSMA肽脉冲标靶细胞以及PSMA+HLA A2.1 LNCaP肿瘤细胞)诱导之T细胞反应进行之ELISpot分析之数据呈现于表2中。此处使用不表达PSMA之人类前列腺癌细胞株PC3作为阴性对照。阳性反应定义为具有SFC>50。如表2中所示，所测试之各种PSMA构建体能够诱导T细胞识别已知HLA A2限制性PSMA表位以及PSMA蛋白及人类前列腺癌细胞LNCaP。然而，经修饰之PSMA构建体显示可诱导具有最佳宽度及量值之T细胞反应。
表2.巴斯德小鼠中由识别HLA A2.1限制性PSMA肽脉冲标靶细胞以及PSMA+HLA A2.1 LNCaP肿瘤细胞之人类PSMA胞溶质抗原、分泌抗原及经修饰抗原诱导之T细胞反应
()＝标准差
1G.在巴斯德小鼠或非人类灵长类动物中所量测之体液免疫反应
1G1.夹心ELISA分析法。使用自动化Biotek系统进行标准夹心ELISA分析。25μl天然PSMA蛋白于PBS中以1.0μg/ml涂布培养盘隔夜，洗涤培养盘且每孔用35μl 5％FBS 1×PBS-T 0.05％阻断，且在室温下在振荡器上以600RPM培育1小时。倾析阻断培养基且连续稀释经接种之小鼠血清，其中在5％FBS 1×PBS-T 0.05％中以1:100或1:500开始制造半对数稀释液，且将25μl经稀释血清样品添加至96孔培养盘之各孔中并在室温下在振荡器上以600RPM培育1小时。使用Biotek ELx405，用75微升/孔1×PBS-T 0.05％中将培养盘洗涤三次，且将25微升/孔之1:30,000经稀释抗小鼠IgG HRP(AbCam目录号ab20043)二级抗体(于1×PBS-T 0.05％中稀释)添加至96孔培养盘之各孔且在室温下在振荡器上以600RPM培育1小时。使用Biotek Elx405，用75微升/孔1×PBS-T 0.05％将培养盘洗涤5次。将TMB受质以1:10稀释，且将25μl添加至各孔中并在室温下培育30分钟。通过每孔添加12.5μl 1M H2SO4来停止反应。使用Spectramax Plus在450nm波长下对读盘。数据系以效价报导且此等数据可以第一阳性(平均值及两个值超过5％FBS PBS+3倍标准差)及/或以OD 0.5或1.0下之计算效价报导。使用来自无关接种小鼠之血清作为阴性对照。
表3.人类PSMA抗原诱导抗PSMA抗体反应(如通过ELISA分析所量测)
结果。表3中所呈现之数据显示，在所有小鼠中，人类PSMA胞溶质抗原不诱导任何抗PSMA反应，而经修饰之人类PSMA抗原始终诱导良好抗PSMA抗体反应。
表5中呈现之数据显示，人类PSMA抗原诱导之抗体与PSMA文库中之多个肽表位反应。将各组中之个别小鼠的血清等量汇集且在ELISA分析中在1:500稀释度下进行测试。并行测试接种抗白喉(CRM)类毒素之小鼠阴性对照组。用0.03μg来源于PSMA肽文库之单一15aa肽涂布96孔ELISA培养盘之各孔。OD值高于0.10被视为阳性。
1G2.FACS细胞结合分析。此分析使用各种前列腺癌细胞株。使用LNCaP(ATCC)作为表达PSMA之人类前列腺癌细胞且使用PC3(ATCC)作为不表达PSMA之阴性人类前列腺癌细胞。在一些分析中，细胞结合分析使用经工程改造以稳定表达人类天然全长PSMA之TRAMP-C2细胞株及不表达PSMA之亲本TRAMP-C2细胞株(阴性对照)。如下进行细胞结合分析：LNCaP及PC3细胞(或TRAMP-C2PSMA及TRAMP C2)以2×105个细胞/孔(50μL)涂于96孔培养盘中之各别孔中。如1f中所述得自接种PSMA之小鼠的血清用FACS缓冲液(PBS pH 7.4，1％FBS，25mM HEPES及1mM EDTA)1:50稀释。将50μL经稀释之J591-A抗体(小鼠抗人类PSMA抗体克隆J591-A，得自ATCC)添加至经稀释之测试血清或FACS缓冲液(未经染色之样品)中以便在染色培养盘中达成适当细胞数目/孔。通过吸移混合所有物质，接着在冰上保持20分钟。用FACS缓冲液将细胞洗涤两次；每次洗涤通过在5℃下以1200RPM离心5分钟来进行。将含经PE标记之山羊抗小鼠Ig之1:200稀释液(Sigma，目录号P9670-5)及0.25μlLive/Dead Aqua染色剂(Invitrogen，目录号L34957)的50μL第二染色溶液添加至含细胞之各孔中且在冰上保持20分钟。如先前所述将细胞洗涤两次。使经洗涤之细胞集结粒再悬浮于125μL FACS缓冲液中，接着向各孔中添加75μL 4％三聚甲醛溶液以固定细胞。将样品保持在冰上且避光保存至少15分钟。在FACS Canto II上运作样品。记录各样品之10,000个活细胞事件。各细胞类型之对照样品为1)未经染色之细胞；2)仅具有二级抗体之细胞；3)具有J591加二级抗体之细胞；及4)具有未处理血清加二级抗体之细胞。数据系以相对于阴性对照之平均荧光强度(MFI)报导。
FACS细胞结合分析之结果。表4显示所分泌与经修饰之人类PSMA抗原所诱导之抗体能够结合人类PSMA阳性前列腺癌细胞(LNCaP)而不结合PSMA阴性前列腺癌细胞(PC3)。经修饰之PSMA抗原在所有小鼠中始终诱导良好抗PSMA抗体反应。
表4.抗PSMA抗体与人类前列腺癌细胞之结合(如通过FACS所量测)
表5.与PSMA文库中之多种肽反应之PSMA疫苗诱导的抗体。基于此结果，鉴别PSMA之4个B细胞表位，1：aa 138-147，2：aa 119-123，3：aa103-106，4：aa 649-659。
1G3.抗体依赖性细胞介导之细胞毒性(ADCC)分析
研究设计。用通过腺病毒递送(1e11V.P.，肌肉内注射)之编码经修饰人类PSMA抗原之核酸将印度恒河猴免疫，随后分别以8周及6周间隔进行2次PMED免疫(每次免疫8次致动，下腹部右侧及左侧各4次致动)。动物在第二次PMED免疫时亦在邻近各腹股沟引流淋巴结处接受皮内注射3mg CpG(PF-03512676)。由在任何免疫之前(免疫前血浆)及最后一次PMED免疫之后8天(免疫血浆)自血液收集之血浆来测定抗体依赖性细胞介导之细胞毒性。
抗体依赖性细胞介导之细胞毒性分析。使用标准铬51释放分析来测定抗体依赖性细胞介导之细胞毒性。使用人类前列腺癌细胞株LNCaP及PC3作为标靶细胞。使用新近分离之人类PBMC细胞作为效应细胞。效应子:标靶细胞设定为30:1。简言之，对于一个标记反应，将200μl中之1.5×106个标靶细胞与200μCi 51Cr一起培育(37℃，5％CO2，1小时)。将细胞洗涤3次且将细胞浓度调节至2×105个细胞/毫升。以2×浓度制造对照单克隆抗体(mAb)或测试血浆(1:50)，且将175μl各(视分析大小而定)mAb/血浆稀释液添加至175μl标靶细胞中。在Eppendorf管中在4℃下将混合物培育30分钟。将细胞洗涤一次以释放未结合之抗体。此时，将100μl新近分离之效应细胞与100μl结合单克隆抗体或测试血浆之标靶细胞一起添加至96孔培养盘之各孔中且在37℃及5％CO2下培育4小时。以一式两份测试样品。将100μl 2N HCl添加至目标孔中以便达成最大释放，且将100μl培养基添加至目标孔中以便达成自发性释放。如下计算特异性溶解：释放百分比＝(ER-SR)/(MR-SR)×100，其中ER(效应子+标靶细胞释放)为实验释放，SR(单独标靶细胞用培养基培育)为自发性释放，且MR(单独标靶细胞用2N HCl培育)为最大释放。通过自抗原特异性标靶(LNCaP)释放中减去无关标靶(PC3)释放来计算特异性溶解百分比。
表6.在接种经修饰之人类PSMA的动物之血浆中所量测的抗体依赖性细胞毒性活性
结果。来自抗体依赖性细胞毒性分析之数据呈现于表6中。经来源于hPSMA免疫动物之免疫血浆涂布之人类前列腺PSMA+癌细胞株LNCaP被效应细胞溶解，而经相同免疫血清涂布之人类前列腺PSMA-癌细胞株PC3未被效应细胞溶解。类似地，经免疫前血浆涂布之LNCaP未被效应细胞溶解。使用针对HER-2之单克隆抗体赫赛汀作为阳性对照，因为已知LNCaP细胞表达HER-2(Li,Cozzi等人2004)。使用针对B细胞抗原(CD20)之单克隆抗体美罗华(Rituxan)作为阴性对照抗体，因为LNCaP细胞不表达CD20。据报导，两种单克隆抗体均具有ADCC活性(Dall'Ozzo,Tartas等人,2004；Collins,O'Donovan等人,2011)。
实施例2.构建改组之PSMA抗原
此实施例说明作为如实施例1中所述之经修饰人类PSMA抗原(SEQID NO:9)之变体的各种免疫原性PSMA多肽之构建及某些生物学性质。
2A.设计改组之PSMA抗原
设计作为如实施例1所述之经修饰人类PSMA抗原(SEQ ID NO:9)之变体的各种免疫原性PSMA多肽。此等变体系通过向经修饰之人类PSMA抗原序列中引入选自人类PSMA直系同源物之突变而产生。此等变体在本发明中可互换称为“改组之PSMA抗原”或“改组且修饰之PSMA抗原”。以下提供用于产生此等变体之原理及程序。
编写计算算法以选择针对改组变体之点突变。首先，使用NCBI之PSI-BLAST组装PSMA及12种直系同源物(附录2a)之多序列比对。来自PSI-BLAST之输出包括直系同源物中各残基在各PSMA位置之倾向。接着，perl程序代码使用此等倾向来如下选择点突变：
1)在所有位置中，选择最常观察到之残基，该残基与天然人类PSMA中之相同性不匹配。
2)验证此突变位置与所鉴别之I或II类人类PSMA表位不重叠以确保点突变不在如上文所定义之保守T细胞表位内(表19)。
3)经由BLOSUM62矩阵计算人类残基突变之相似性以验证残基取代之BLOSUM62相似性分数在0至1(包括)范围内。
按照此迭代程序直至相对于人类PSMA达到某一序列相同性百分比(低于100)。
为充当此算法之输入，组装PSMA直系同源物以使用得自NCBI之PSI-BLAST构建位置特异性机率矩阵。另外，将所鉴别之PSMA表位区列于文档中，从而亦提供给改组算法。非改组区域亦延伸至蛋白质之胞溶质区及跨膜区以避免膜结合功能问题。直系同源PSMA蛋白序列、BLOSUM62矩阵及PSI-BLAST程序系自NCBI网站下载。
接着使用此等输入数据运作改组程序代码，且产生与原始人类PSMA具有94％序列相同性之人类PSMA变体。另外，三个改良HLA-A2结合之突变基于其在Epitoptimizer算法(Houghton,Engelhorn等人2007)中之效能而引入。此等突变为M664L(表位：663-671)、I676V(表位：668-676)及N76L(表位：75-83)。所得抗原称为“经改组且修饰之PSMA抗原1”、“经改组且修饰之PSMA 1”或“经改组之PSMA抗原1”。
基于表位之共同序列分级<1％且神经网之IC50(单一最佳法)<500之结果显示，自HLA A2.1、HLA A3、HLA A11、HLA A24及HLA B7预测之表位在此改组抗原中高度保守。设计实施例1中所述之经修饰人类PSMA抗原之两种其它变体，该两种变体具有较高序列相同性及更具限制性之BLOSUM分数截止值(1)以移除所有非保守取代。此两种变体分别亦称为“经改组且修饰之PSMA抗原2”及“经改组且修饰之PSMA抗原3”。经改组且修饰之PSMA抗原1至3相对于经修饰之人类PSMA构建体(例如人类PSMA的氨基酸15-750)之相同性百分比分别约为93.6％、94.9％及96.4％。
经改组且修饰之PSMA抗原1具有SEQ ID NO:3之氨基酸序列且相对于经修饰之人类PSMA抗原具有以下突变：
N47S、T53S、K55Q、M58V、L65M、N76L、S98A、Q99E、K122E、N132D、V154I、I157V、F161Y、D191E、M192L、V201L、V225I、I258V、G282E、I283L、R320K、L362I、S380A、E408K、L417I、H475Y、K482Q、M509V、S513N、E542K、M583L、N589D、R598Q、S613N、I614L、S615A、Q620E、M622L、S647N、E648Q、S656N、I659L、V660L、L661V、M664L、I676V。
经改组且修饰之PSMA抗原2具有SEQ ID NO:5之氨基酸序列且相对于经修饰之人类PSMA抗原具有以下突变：
突变：
N47S、K55Q、M58V、Q91E、S98A、A111S、K122E、N132D、V154I、I157V、F161Y、V201L、V225I、I258V、S312A、R320K、K324Q、R363K、S380A、E408K、H475Y、K482Q、Y494F、E495D、K499E、M509L、N540D、E542K、N544S、M583I、I591V、R598Q、R605K、S613N、S647N、E648Q、S656N、V660L。
经改组且修饰之PSMA抗原3具有SEQ ID NO:7之氨基酸序列且相对于经修饰之人类PSMA抗原具有以下突变：
突变：
T339A、V342L、M344L、T349N、N350T、E351K、S401T、E408K、M470L、Y471H、H475Y、F506L、M509L、A531S、N540D、E542K、N544S、G548S、V555I、E563V、V603A、R605K、K606N、Y607H、D609E、K610N、I611L。
2B.接种后在巴斯德小鼠中量测之免疫反应
研究设计。如实施例1F中所述，使用PMED法在初始免疫/增强免疫/增强免疫疗法(每次接种相隔两周)中用表达经改组且修饰之PSMA抗原之各种质粒DNA将8至10周龄巴斯德小鼠免疫。分别在干扰素-γ(IFNγ)ELISPOT分析及夹心ELISA中之最后一次免疫之后7天量测抗原特异性T及B细胞反应。
表7.由针对PSMA肽文库中之肽集合的各种经改组且修饰之PSMA抗原所诱导之T细胞反应
结果。表7中呈现之ELISpot数据显示，所有经改组且修饰之PSMA抗原能够诱导在宽度及量值方面与经修饰之人类PSMA抗原极为相似之T细胞反应。SFC>100被视为阳性。“*”符号表示过多而无法准确计数。
表8.由针对HLA A2标靶及PSMA蛋白之经改组且修饰之PSMA抗原诱导之T细胞反应
如表8中所示，所有改组PSMA抗原均能够诱导识别已知HLA A2限制性PSMA表位之T细胞以及经携带PSMA转基因之腺病毒转导以表达PSMA之人类HLA A2肿瘤细胞。不表达PSMA之肿瘤细胞充当阴性对照且未被识别。SFC>50被视为阳性。
表9.对CD4T细胞具特异性之经改组且修饰之PSMA抗原所诱导之T细胞反应
表9中所示之ELISpot资料系用耗乏CD8之脾细胞获得；因此，数据代表对CD4T细胞具特异性之T细胞反应。数据显示由经改组且修饰之PSMA抗原2引发之CD4反应与经修饰之人类PSMA抗原所诱导之CD4反应极为相似。SFC>50被视为阳性。
表10.如通过ELISA分析量测之抗PSMA抗体反应之诱导
抗原 ELISA(OD＝0.5) 阳性数目
经修饰之人类PSMA抗原 1159(802) 7/7
经改组且修饰之PSMA抗原1 899(1016) 4/7
经改组且修饰之PSMA抗原2 4898(3636) 6/6
经改组且修饰之PSMA抗原3 1482(3092) 1/5
表10中之数据显示，所有经改组且修饰之PSMA抗原均能够诱导抗人类PSMA抗体反应。经改组且修饰之PSMA抗原2及经修饰之人类PSMA抗原在所有小鼠中诱导一致抗体反应。
表11.HLA A24小鼠中由经修饰之人类PSMA抗原及经改组且修饰之PSMA抗原2诱导之T细胞反应
表11中之ELISpot数据显示，HLA A24小鼠中由经改组且修饰之PSMA抗原2诱导之总体T细胞反应在宽度及量值方面与经修饰之人类PSMA抗原极为相似。SFC>100视为阳性。
2C.经改组且修饰之PSMA抗原破坏针对人类PSMA的免疫耐受性
研究设计。人类PSMA转基因小鼠模型所使用之小鼠系利用驱动PSMA特异性表达于前列腺中之最少大鼠前列腺碱性蛋白(probasin)启动子制得(Zhang,Thomas等人,2000Endocrinology 141(12):4698-4710)。此等小鼠在C57BL/6背景下制得。RT-PCR及免疫组织化学染色数据确定此等PSMA转基因小鼠中之前列腺腹侧及背外侧根部中的PSMA表达。预期人类PSMA蛋白在此等小鼠中之内源性表达可产生免疫耐受性。
结果。如表12中所示，仅20％PSMA转基因小鼠能够使用经修饰之人类PSMA抗原建立对人类PSMA的T细胞反应。然而，67％PSMA转基因小鼠能够使用经改组且修饰之PSMA抗原2建立PSMA特异性T细胞反应。数据表明，经改组且修饰之PSMA抗原2中包括非自身氨基酸序列可改良针对自身人类PSMA抗原之耐受性破坏。SFC>50被视为阳性。
表12.人类PSMA转基因小鼠中针对已知PSMA表位(PADYFAPGVKSYPDG；Durso RJ,Clin Cancer Res.2007年7月1日；13(13):3999-400)之T细胞反应
实施例3.各种免疫原性PSA多肽之设计
实施例3说明呈胞溶质、分泌及膜结合形式之免疫原性PSA多肽之构建及某些生物学性质。
3A.各种PSA抗原形式之构建
类似于实施例1中关于三种不同的免疫原性PSMA多肽形式(例如胞溶质、膜结合及分泌形式)所述，亦基于人类PSA序列设计呈三种形式之免疫原性PSA多肽。由天然人类PSA之氨基酸25-261组成之呈胞溶质形式之免疫原性PSA多肽系通过缺失分泌信号及原结构域(氨基酸1-24)而构建。此胞溶质免疫原性PSA多肽之氨基酸序列提供于SEQ ID NO:17中。PSA多肽之分泌形式为天然全长人类PSA(氨基酸1-261)。呈膜结合形式之免疫原性PSA多肽系通过将免疫原性PSA多肽胞溶质形式(天然人类PSA之氨基酸25-261)连接于人类PSMA跨膜域(人类PSMA的氨基酸15-54)而构建。
3B.巴斯德及HLA A24小鼠中之免疫反应
研究设计。如实施例1中所述，使用实施例3A中所提供之PMED在初始免疫/增强免疫/增强免疫疗法(每次接种相隔两周)中用表达各种PSA抗原之DNA将8至10周龄HLA A2巴斯德小鼠或HLA A24小鼠免疫。在干扰素-γ(IFNγ)ELISPOT分析及夹心ELISA中之最后一次免疫之后7天量测抗原特异性T及B细胞反应。
表13.在接种PSA多肽之巴斯德小鼠及HLA A24小鼠中诱导T细胞反应
结果。表13显示来源于自HLA A2巴斯德小鼠或HLA A24小鼠分离之脾细胞(与来源于PSA肽文库之肽一起培养)的ELISpot数据。可在HLA A2及HLA A24小鼠中侦测到T细胞反应。SFC>100被视为阳性。
表14.PSA抗原在巴斯德小鼠中诱导针对PSA+HLA A2.1+SKmel5人类癌细胞之T细胞反应
表14中所示之ELISpot数据指示呈胞溶质及膜结合形式之免疫原性PSA多肽能够诱导T细胞识别经腺病毒转导以表达胞溶质PSA抗原(SKmel5-Ad-PSA)之人类肿瘤细胞而不识别经腺病毒转导以表达eGFP(SKmel5-Ad-eGFP)之细胞。此两种抗原亦引发针对PSA蛋白之反应。分泌型PSA抗原未能诱导T细胞针对SKmel5-Ad-PSA或PSA蛋白。SFC>50被视为阳性。
表15.诱导抗PSA抗体反应(如通过夹心ELISA分析所量测)
表15中之数据显示，呈分泌及膜结合形式之免疫原性PSA多肽能够诱导抗PSA抗体反应。
表16.人类PSMA肽文库肽集合及相应氨基酸序列
表17.人类PSA肽文库
表18.PSMA直系同源物
PSMA物种 NCBI ID 与人类之相同性％
人类 2897946 100
黑猩猩 114639743 99
猕猴 109108238 97
狗 73987958 93
马 149719573 92
猪 47523822 90
牛 156120365 89
大鼠 149069047 84
小鼠 20138153 84
负鼠(opossum) 126327828 80
鸡 118085215 78
鸭嘴兽 149635150 76
斑马鱼 41053648 69
表19.如SEQ ID NO:1中所述之人类PSMA中之保守T细胞表位
起始氨基酸 终末氨基酸 序列
168 176 GMPEGDLVY
347 356 HSTNGVTRIY
557 566 ETYELVEKFY
207 215 KVFRGNKVK
431 440 STEWAEENSR
4 12 LLHETDSAV
27 35 VLAGGFFLL
168 177 GMPEGDLVYV
441 450 LLQERGVAYI
469 477 LMYSLVHNL
711 719 ALFDIESKV
663 671 MNDQVMFL
178 186 NYARTEDFF
227 235 LYSDPADYF
624 632 TYSVSFDSL
334 348 TGNFSTQKVKMHIHS
459 473 NYTLRVDCTPLMYSL
687 701 YRHVIYAPSSHNKYA
730 744 RQIYVAAFTVQAAAE
实施例4.多抗原疫苗构建体之构建
在此实施例中，描述用于表达来自单组分DNA疫苗构建体之多种抗原的若干策略。此等多抗原DNA疫苗构建体具有与pPJV7563相同的通用质粒骨架。虽然此处在DNA疫苗的情况下描述多抗原表达策略，但所述原理类似地适用于病毒载体基因疫苗(诸如腺病毒载体)的情况。除非另外规定，否则多抗原构建体中包括之基因编码如上文之实施例中所述之经修饰之人类PSMA抗原(指定为PSMA)、全长人类PSCA(指定为PSCA)及人类PSA胞溶质抗原(指定为PSA)。
实施例4A.双抗原构建体
4A1.利用多个启动子构建双抗原构建体
通用策略。用于产生多价核酸疫苗构建体之一种策略为将多个独立启动子并入单一质粒中(Huang,Y.,Z.Chen等人,(2008).“Design,construction,and characterization of a dual-promoter multigenic DNAvaccine directed against an HIV-1 subtype C/B'recombinant”.J AcquirImmune Defic Syndr 47(4):403-411；Xu,K.,Z.Y.Ling等人,(2011).“Broad humoral and cellular immunity elicited by a bivalent DNA vaccineencoding HA and NP genes from an H5N1 virus”.Viral Immunol 24(1):45-56)。质粒可经工程改造以运载多个表达盒，各表达盒由以下组成：a)在增强子元件存在或不存在下起始RNA聚合酶依赖性转录之真核启动子；b)编码标靶抗原之基因；及c)转录终止序列。质粒递送至经转染之细胞核中时，各启动子起始转录，从而产生各别mRNA，各mRNA编码标靶抗原之一。mRNA将独立地经翻译，由此产生所要抗原。
质粒460(PSMA/PSCA双启动子)。使用定点突变诱发、PCR及限制片段插入技术来构建质粒460。首先，使用定点突变诱发利用MD5及MD6引物根据制造商方案(Quickchange试剂盒,Agilent Technologies,Santa Clara,CA)将Kpn I限制位点引入质粒5259中之CMV启动子上游。其次，通过PCR使用携带Kpn I限制位点之引物(MD7及MD8)自质粒5166扩增由最少的CMV启动子、人类PSMA及兔B球蛋白转录终止子组成之表达盒。用Kpn I消化PCR扩增子且插入经小牛肠道碱性磷酸酶(CIP)处理之质粒5259的新引入之Kpn I位点中。
4A2.利用2A肽构建双抗原构建体
通用策略。多种蛋白质抗原亦可通过使用病毒2A样肽而由单一载体表达(Szymczak,A.L.及D.A.Vignali(2005).“Development of 2A peptide-based strategies in the design of multicistronic vectors”.Expert Opin BiolTher 5(5):627-638；de Felipe,P.,G.A.Luke等人,(2006).“E unumpluribus:multiple proteins from a self-processing polyprotein”.TrendsBiotechnol 24(2):68-75；Luke,G.A.,P.de Felipe等人,(2008).“Occurrence,function and evolutionary origins of『2A-like』sequencesin virus genomes”.J Gen Virol 89(Pt 4):1036-1042；Ibrahimi,A.,G.VandeVelde等人,(2009).“Highly efficient multicistronic lentiviral vectors withpeptide 2A sequences”.Hum Gene Ther 20(8):845-860；Kim,J.H.,S.R.Lee等人,(2011).“High cleavage efficiency of a 2A peptide derived fromporcine teschovirus-1in human cell lines,zebrafish and mice”.PLoS One6(4):e18556)。此等肽，亦称为裂解盒或CHYSEL(顺式作用水解酶元件)，为约20个氨基酸长且具有高度保守羧基末端D-V/I-EXNPGP基序(图2)。所述盒在自然界中非常稀有，最常发现于病毒中，诸如口蹄疫病毒(FMDV)、马鼻炎A病毒(ERAV)、脑心肌炎病毒(EMCV)、猪捷申病毒(PTV)及明脉扁刺蛾病毒病毒(TAV)(Luke,G.A.,P.de Felipe等人,(2008).“Occurrence,function and evolutionary origins of‘2A-like’sequences invirus genomes”.J Gen Virol 89(Pt 4):1036-1042)。在基于2A之多抗原表达策略下，可将编码多个标靶抗原之基因一起连接在单一开放阅读框中，用2A盒隔开。可将整个开放阅读框克隆于具有单一激活子及终止子之载体中。基因疫苗递送至细胞时，编码多个抗原之mRNA转录并翻译为单一聚合蛋白。在翻译2A盒期间，核糖体跳过C末端甘氨酸与脯氨酸之间的键。核糖体跳过之作用类似于在下游蛋白质之上游释放之共翻译自动催化“裂解”。在两个蛋白质抗原之间并入2A盒引起约20个氨基酸添加至上游多肽之C末端上且1个氨基酸(脯氨酸)添加至下游蛋白质之N末端。在此方法之改适方案中，可在2A盒之N末端并入蛋白酶裂解位点，使得普存蛋白酶使盒自上游蛋白质裂解(Fang,J.,S.Yi等人(2007).“An antibody delivery system for regulated expression of therapeutic levelsof monoclonal antibodies in vivo”.Mol Ther 15(6):1153-1159)。
质粒451(PSMA-T2A-PSCA)。使用重叠PCR及限制片段交换技术构建质粒451。首先，通过PCR使用质粒5166作为模板利用引物119及117来扩增编码人类PSMA氨基酸15-750之基因。通过PCR使用质粒5259作为模板利用引物118及120来扩增编码全长人类PSCA之基因。PCR使得重叠TAV 2A(T2A)序列添加在PSMA之3'端及PSCA之5'端。将扩增子混合在一起且通过PCR利用引物119及120加以扩增。用Nhe I及Bgl II消化PSMA-T2A-PSCA扩增子且插入经类似方式消化之质粒5166中。甘氨酸-丝氨酸连接子包括在PSMA与T2A盒之间以促进高裂解效率。
质粒454(PSCA-F2A-PSMA)。使用PCR及限制片段交换技术制造质粒454。首先，通过PCR使用质粒5259作为模板利用引物42及132来扩增编码全长人类PSCA之基因。用BamH I消化扩增子且插入经类似方式消化之经CIP处理之质粒5300中。甘氨酸-丝氨酸连接子包括在PSCA与FMDV 2A(F2A)盒之间以促进高裂解效率。
质粒5300(PSA-F2A-PSMA)。使用重叠PCR及限制片段交换技术来构建质粒5300。首先，通过PCR利用引物MD1及MD2自质粒5297扩增编码PSA氨基酸25-261之基因。通过PCR利用引物MD3及MD4自质粒5166扩增编码人类PSMA氨基酸15-750之基因。PCR使得重叠F2A序列添加在PSA之3'端及PSMA之5'端。将扩增子混合在一起且通过PCR加以延伸。用Nhe I及Bgl II消化PSA-F2A-PSMA扩增子且插入经类似方式消化之质粒pPJV7563中。
4A3.利用内部核糖体进入位点之双抗原构建体
通用策略：自单一质粒或载体表达多种蛋白质抗原之第三种策略包括使用内部核糖体进入位点或IRES。内部核糖体进入位点为在某些RNA分子之5'未翻译区域中发现的RNA元件(图3)(Bonnal,S.,C.Boutonnet等人,(2003).“IRESdb:the Internal Ribosome Entry Site database”.NucleicAcids Res 31(1):427-428)。其将真核核糖体吸引至RNA以促进下游开放阅读框之翻译。不同于正常细胞7-甲基鸟苷帽依赖性翻译，IRES介导之翻译可在RNA分子内较远处之AUG密码子处起始。可利用高效方法以便用于多顺反子表达载体(Bochkov,Y.A.及A.C.Palmenberg(2006).“Translational efficiency of EMCV IRES in bicistronic vectors is dependentupon IRES sequence and gene location”.Biotechniques 41(3):283-284,286,288)。通常，将两个转基因作为由IRES隔开之两个各别开放阅读框插入启动子与转录终止子之间的载体中。基因疫苗递送至细胞时，转录编码两个转基因之单一长转录物。第一个ORF将以传统帽依赖性方式翻译，在IRES上游之终止密码子处终止。第二个ORF将以帽非依赖性方式使用IRES翻译。以此方式，可由自具有单一表达盒之载体转录之单一mRNA产生两种独立的蛋白质。
质粒449(PSMA-mIRES-PSCA)。使用重叠PCR及限制片段交换技术来构建质粒449。首先，通过PCR利用引物124及123自质粒5259扩增编码全长人类PSCA之基因。通过PCR利用引物101及125自pShuttle-IRES扩增极少EMCV IRES。将重叠扩增子混合在一起且通过PCR利用引物101及123加以扩增。用Bgl II及BamH I消化IRES-PSCA扩增子且插入经BglII消化之经CIP处理之质粒5166中。为固定IRES内之自发性突变，用来自pShuttle-IRES之等效片段置换含Avr II至Kpn I序列之IRES。
质粒603(PSCA-pIRES-PSMA)。使用PCR及无缝克隆技术来构建质粒603。通过PCR利用引物SD546及SD547自质粒455扩增3'端连接于优选EMCV IRES之编码全长人类PSCA之基因。通过PCR使用引物SD548及SD550自质粒5166扩增编码人类PSMA氨基酸15-750之基因。通过无缝克隆根据制造商说明书(Invitrogen,Carlsbad,CA)将两个重叠PCR扩增子插入经Nhe I及Bgl II消化之pPJV7563中。
质粒455(PSCA-mIRES-PSA)。使用重叠PCR及限制片段交换技术来构建质粒455。首先，通过PCR利用引物115及114自质粒5297扩增编码人类PSA氨基酸25-261之基因。通过PCR利用引物101及116自pShuttle-IRES扩增极少EMCV IRES。将重叠扩增子混合在一起且通过PCR利用引物101及114加以扩增。用Bgl II及BamH I消化IRES-PSA扩增子且插入经BglII消化之经CIP处理之质粒5259中。为固定此克隆内之自发性突变，用来自新鲜重叠PCR反应之等效片段置换Bgl II至BstE II序列。
实施例4B.三抗原DNA构建体
通用策略。表征双抗原表达载体引导PSMA、PSCA及/或PSA在经转染之HEK293细胞中表达的能力(图4-6)。选择许多双抗原表达盒，包括PSA-F2A-PSMA、PSMA-mIRES-PSCA、PSMA-T2A-PSCA、PSA-T2A-PSCA、PSCA-F2A-PSMA、PSCA-pIRES-PSMA及PSMA-mIRES-PSA，以便以各种组合形式并入三抗原表达载体中。在所有情况下，载体系基于亲本pPJV7563质粒骨架。四种载体(质粒456、457、458及459)利用具有兔B球蛋白转录终止子之单一完全CMV启动子来驱动所有三种抗原之表达。两种其它载体(质粒846及850)并入双启动子策略与IRES或2A之组合以驱动三种抗原之表达。具有多个2A盒之载体经工程改造以运载不同盒，从而将第一盒与第二盒之间在质粒/载体扩增期间的重组可能性减至最小。通过流式细胞术(图7)及蛋白质印迹法(图8)来显示抗原表达。
质粒456(PSA-F2A-PSMA-mIRES-PSCA)。通过限制片段交换来构建质粒456。用Nhe I及Hpa I消化质粒5300且将约1.8kb之插入物接合至经类似方式消化之质粒449。
质粒457(PSA-F2A-PSMA-T2A-PSCA)。通过限制片段交换来构建质粒457。用Nhe I及Hpa I消化质粒5300且将约1.8kb之插入物接合至经类似方式消化之质粒451。
质粒458(PSA-T2A-PSCA-F2A-PSMA)。使用PCR及限制片段交换技术来构建质粒458。通过PCR利用引物119及139自质粒5297扩增编码人类PSA氨基酸25-261之基因，从而将T2A序列及Nhe I限制位点添加于3'端。用Nhe I消化扩增子且插入经类似方式消化之质粒454中。
质粒459(PSCA-F2A-PSMA-mIRES-PSA)。通过限制片段交换来构建质粒459。用Nhe I及Bgl II消化质粒454且将含PSCA-F2A-PSMA之插入物接合至经类似方式消化之质粒455。
质粒846(CBA-PSA,CMV-PSCA-pIRES-PSMA)。使用PCR及无缝克隆技术来构建质粒846。首先，合成由以下组成之表达盒：1)鸡β肌动蛋白(CBA)基因之启动子及5'未翻译区；2)混合鸡β肌动蛋白/兔β血球蛋白内含子；3)编码人类PSA氨基酸25-261之基因；及4)牛生长激素终止子。通过PCR利用引物3SalICBA及5SalIBGH自质粒796扩增此PSA表达盒。使用GeneArt无缝克隆及成套试剂盒(Invitrogen,Carlsbad,CA)将扩增子克隆于质粒603之SalI位点中。此质粒递送至细胞中时，CBA启动子将驱使PSA停止表达，而CMV启动子将驱使PSCA及PSMA停止表达。
质粒850(CBA-PSA,CMV-PSCA-F2A-PSMA)。使用PCR及无缝克隆技术来构建质粒850。首先，通过PCR利用引物3SalICBA及5SalIBGH自质粒796扩增CBA启动子驱动之PSA表达盒。使用GeneArt无缝克隆术将扩增子克隆于质粒454之SalI位点中。此质粒递送至细胞中时，CBA启动子将驱使PSA停止表达，而CMV启动子将驱使PSCA及PSMA停止表达。
表20.表达多种抗原之质粒的清单
第一抗体 表达策略 第二抗原 表达策略 第三抗原 质粒ID#
PSMA 5166
PSCA 5259
PSA 5297
PSMA 2个启动子 PSCA 460
PSMA T2A PSCA 451
PSCA F2A PSMA 454
PSA F2A PSMA 5300
PSMA IRES PSCA 449
PSCA IRES PSMA 603
PSCA IRES PSA 455
PSA F2A PSMA mIRES PSCA 456
PSA F2A PSMA T2A PSCA 457
PSA T2A PSCA F2A PSMA 458
PSCA F2A PSMA mIRES PSA 459
PSA 2个启动子 PSCA pIRES PSMA 796
PSA 2个启动子 PSCA pIRES PSMA 846
PSA 2个启动子 PSCA F2A PSMA 850
表21.用于构建多抗原质粒之引物的清单
实施例4C.三抗原腺病毒构建体
通用策略。如同DNA质粒，病毒疫苗载体可经工程改造以递送多种前列腺癌抗原。将上文关于DNA疫苗所述之三种多抗原表达策略，即双启动子、2A肽及内部核糖体入口位点，以各种组合并入以产生三抗原腺病毒载体。简言之，将多抗原表达盒克隆于经修饰以运载四环素操纵序列(TetO2)之两个复本的pShuttle-CMV质粒中。使用AdEasy载体系统根据制造商方案(Agilent Technologies,Inc.,Santa Clara,CA)产生重组腺病毒血清型5载体。病毒于HEK293细胞中扩增且通过双氯化铯条带根据标准方案加以纯化。在活体内研究之前，根据病毒粒子浓度、传染性效价、无菌度、内毒素、基因组及转基因完整性、转基因相同性及表达充分表征病毒储备物。
腺病毒-733(PSA-F2A-PSMA-T2A-PSCA)。Ad-733为质粒457之病毒等效物。具有四环素操纵子之单一CMV启动子驱使三种抗原停止表达以便在大规模生产期间抑制转基因在表达Tet抑制因子之HEK293细胞株中的表达。多抗原表达策略包括两种不同的2A序列。
腺病毒-734(PSA-T2A-PSCA-F2A-PSMA)。Ad-734为质粒458之病毒等效物。具有四环素操纵子之单一CMV启动子驱使三种抗原停止表达以便在大规模生产期间抑制转基因在表达Tet抑制因子之HEK293细胞株中的表达。多抗原表达策略包括两种不同的2A序列。
腺病毒-735(PSCA-F2A-PSMA-mIRES-PSA)。Ad-735为质粒459之病毒等效物。具有四环素操纵子之单一CMV启动子驱使三种抗原停止表达以便在大规模生产期间抑制转基因在表达Tet抑制因子之HEK293细胞株中的表达。多抗原表达策略包括2A序列及IRES。
腺病毒-796(CBA-PSA,CMV-PSCA-pIRES-PSMA)。Ad-796为质粒846之病毒等效物。鸡β肌动蛋白启动子驱使PSA停止表达，而CMV-TetO2启动子驱使PSCA及PSMA停止表达。多抗原表达策略包括两个启动子及IRES。
腺病毒-809(CBA-PSA,CMV-PSCA-F2A-PSMA)。Ad-809为质粒850之病毒等效物。鸡β肌动蛋白启动子驱使PSA停止表达，而CMV-TetO2启动子驱使PSCA及PSMA停止表达。多抗原表达策略包括两个启动子及2A序列。
实施例5.三抗原DNA疫苗之免疫原性
实施例5说明表达PSMA、PSCA及PSA之三抗原核酸疫苗构建体引发针对所有三种经编码之前列腺抗原之抗原特异性T及B细胞反应的能力。
细胞免疫反应研究。根据下述程序研究如实施例5中所述之含有PSMA、PSCA及PSA之三抗原构建体在C57BL/6小鼠中的免疫原性。
通过PMED施用、用编码人类PSMA、PSCA及PSA抗原之DNA疫苗构建体、在第0天对雌性C57BL/6小鼠进行初始免疫且在第14天、第28天及第49天增强免疫。评估总计四种不同的三抗原接种策略，所述策略包括三种共同表达标靶蛋白质之DNA疫苗及一种共同调配方法。对于共同表达而言，使用如下编码经2A肽或内部核糖体进入位点(IRES)连接之所有三种前列腺抗原之单一DNA质粒：PSA-F2A-PSMA-T2A-PSCA(质粒ID#457)、PSA-T2A-PSCA-F2A-PSMA(质粒ID#458)及PSCA-F2A-PSMA-IRES-PSA(质粒ID#459)。对于共同调配方法，将三种不同的DNA质粒(各自个别地编码PSMA、PSCA或PSA)共同调配于单一金粒子上以供PMED递送。除共同调配以外，控制共同表达(2A及IRES)之DNA元件在长度、转基因表达效率及连接于标靶转基因之外来遗传物质之存在方面不同。作为对照，C57BL/6小鼠接种表达单一前列腺抗原(PSMA、PSCA或PSA)之DNA。对于共同表达之三抗原或单抗原DNA疫苗，经PMED施用给予剂量2μg之DNA疫苗质粒，而经PMED施用给予1μg经共同调配之各三抗原DNA疫苗(总计3μg)。通过在第56天，即最终PMED接种后7天自各动物收集脾脏来量测针对三抗原及单抗原疫苗之细胞免疫反应。分离脾细胞且进行IFN-γELISPOT分析以量测PSMA、PSCA及PSA特异性T细胞反应。简言之，将来自个别动物之2×105个脾细胞与每孔5×104个稳定表达单一人类前列腺抗原或一起表达PSMA、PSCA及PSA之TRAMP-C2(转基因腺癌小鼠前列腺)细胞一起，或与10μg/ml个别人类PSMA、PSCA及PSA特异性肽或肽集合(关于肽及肽集合组成，参看表22)或作为对照之单独培养基一起涂于每孔。各条件以一式三份进行。在37℃及5％CO2下将培养盘培育20小时，洗涤且在培育之后根据制造商说明书显色。通过Cellular Technology Ltd.(CTL)读数器对IFN-γ斑点形成细胞(SFC)数目进行计数。结果呈现于图9及10中，所述图显示每组五只小鼠之相对于1×106个脾细胞归一化之PSMA、PSCA或PSA特异性SFC平均数+/-标准差。
表22.ELISPOT分析中所测试之15聚体PSMA、PSCA及PSA肽。指示各肽之N及C末端之氨基酸位置。
抗体反应研究。通过在第56天，即最终PMED接种后7天自各动物收集血清来量测针对三抗原及单抗原疫苗之抗体反应。对血清进行酶联免疫吸附分析法(ELISA)以测定抗PSMA及抗PSCA抗体效价。简言之，用1μg/ml人类PSMA或PSCA涂布ELISA培养盘且在4℃下培育隔夜。接着阻断培养盘且在室温下与1％牛血清白蛋白(BSA)一起培育1小时。各血清样品一式两份以1:100稀释度开始连续稀释，且在室温下培育1小时。洗涤后，将辣根过氧化酶(HRP)结合之山羊抗小鼠多株IgG抗体在室温下培育1小时。洗涤后，在室温下将TMB过氧化酶EIA受质培育30分钟。通过添加1N硫酸停止比色反应，接着在450nm下读取吸光度。绘制各血清样品之滴定曲线(样品稀释度相对于吸光度)。接着获取在高于侦测下限(LLOD；背景加3倍标准差)之光学密度(OD)值下所测试之最稀血清样品或经计算以达成1.0之OD值的血清稀释液的血清效价(随后转化成效价倒数)。结果呈现于图11及12中，所述图显示每组五只小鼠之平均效价+/-标准差。
亦对血清进行荧光活化细胞分选(FACS)分析以量测抗体与适当细胞株之细胞表面上所表达之人类PSMA或PSCA的结合，从而确定多抗原疫苗所产生之抗体是否能够分别识别天然PSMA及PSCA构形。利用LNCaP(人类前列腺腺癌)细胞来量测抗体与天然PSMA之结合。PC3(人类前列腺癌)细胞充当FACS分析中之对照，因为此等细胞不表达人类PSMA。利用经表达人类PSCA之腺病毒(Ad-PSCA)转导之MIA-PaCa-2(人类胰腺癌)细胞来量测抗体与天然PSCA之结合。未经转导之MIA-PaCa-2细胞充当对照。简言之，为量测抗PSMA抗体结合，在4℃下将2×105个LNCaP或PC3细胞与小鼠血清之1:100稀释液或15μg/ml对照小鼠抗人类PSMA单克隆抗体(mAb)(克隆J591-A)一起培育20分钟。为量测抗PSCA抗体结合，在4℃下将2×105个经Ad-PSCA转导及未经转导之MIA-PaCa-2细胞与小鼠血清之1:30稀释液或4μg/ml对照小鼠抗人类PSCA mAb(克隆7F5)一起培育20分钟。随后，洗涤细胞且在4℃下与结合第二藻红素(PE)之山羊抗小鼠IgG抗体及活/死染料一起再培育20分钟。培育后，洗涤细胞且再悬浮于1.5％三聚甲醛中，且在FACS Canto II上获取10,000个活细胞。结果呈现于图13及14中，所述图显示每组五只小鼠之小鼠血清相对于单独第二抗小鼠抗体之平均荧光强度(MFI)平均变化倍数+/-标准差。未量测抗体效价，此系因为PSA以细胞质蛋白形式由此研究中所研究之多抗原疫苗表达。
结果：
图9A-9D显示通过IFN-γELISPOT分析法评估三抗原疫苗之细胞免疫反应之代表性研究之结果。简言之，利用PMED在第0天对每组5只小鼠进行初始免疫，且在第14天、第28天及第49天进行增强免疫。在第56天，即最后一次PMED接种后7天，通过IFN-γELISPOT分析法检查对(A)TRAMP C2-PSMA、(B)TRAMP C2-PSCA、(C)TRAMP C2-PSA及(D)TRAMP C2-PSMA-PSA-PSCA细胞之T细胞反应，评估内源性前列腺抗原之识别。以TRAMP C2细胞作为分析法之背景对照。对于针对内源性PSMA之IFN-γT细胞反应，在单独接种PSMA PMED后观察到对TRAMPC2-PSMA之显著反应，此与其它研究中所见之反应一致。在接种三抗原后，对TRAMP C2-PSMA侦测到类似之PSMA特异性IFN-γT细胞反应。相比之下，接种共同调配之PSMA、PSCA及PSA后观察到反应完全消除(*指示p<0.05，双向ANOVA)。对于针对内源性PSCA之IFN-γT细胞反应，当将单一PSCA疫苗与四种不同的三抗原疫苗比较时，未观察到针对TRAMP C2-PSCA细胞之反应存在显著差异。对于针对内源性PSA之IFN-γT细胞之反应，当将单一PSA疫苗与PSCA-F2A-PSMA-IRES-PSA(***指示p<0.001，双向ANOVA)或共同调配疫苗(*指示p<0.05，双向ANOVA)之免疫原性比较时，侦测到对TRAMP C2-PSA之反应量值显著降低。当检查针对TRAMP C2-PSMA-PSCA-PSA之反应时，在PSA-F2A-PSMA-T2A-PSCA疫苗后观察到最高量值IFN-γT细胞反应。总而言之，此等数据显示使用共同表达DNA接种策略，尤其是利用PSA-F2A-PSMA-T2A-PSCA疫苗构建体，可识别内源性PSMA、PSCA及PSA以及对所有三种前列腺抗原产生抗原特异性T细胞反应。然而，共同调配之DNA接种策略却会损失对PSMA及PSA之抗原特异性IFN-γT细胞反应。
图10A至10D显示通过IFN-γELISPOT分析法评估三抗原疫苗之免疫原性的代表性研究之结果。简言之，利用PMED在第0天对每组5只小鼠进行初始免疫，且在第14天、第28天及第49天进行增强免疫。在第56天，通过IFN-γELISPOT分析法评估针对(A)PSMA肽、(B)PSMA肽集合、(C)PSCA肽及(D)PSA肽之T细胞反应(参看表22)。以单独培养基作为分析法之背景对照。对于针对个别PSMA肽及PSMA肽集合之IFN-γT细胞反应，与单一PSMA疫苗相比，在施用PSA-F2A-PSMA-T2A-PSCA三抗原疫苗后观察到最高量值反应。类似地，在施用PSA-F2A-PSMA-T2A-PSCA疫苗后，侦测到对PSCA及PSA特异性肽之最高量值IFN-γT细胞反应。共同调配之PSMA、PSCA及PSA疫苗对PSMA特异性肽产生低T细胞反应至无T细胞反应，且对PSCA及PSA特异性肽产生低量值反应。此等数据显示，当自同一疫苗构建体共同表达时，会对PSMA、PSCA及PSA产生T细胞反应。接种在PSA-F2A-PSMA-T2A-PSCA之后，对所有三种前列腺抗原存在一致且稳固之IFN-γT细胞反应，且在接种PSA-T2A-PSCA-F2A-PSMA、PSMA-F2A-PSMA-IRES-PSA及共同调配之PSMA、PSCA及PSA之后，对前列腺抗原之IFN-γT细胞反应之量值显著降低。
图11显示通过抗PSMA抗体效价评估三抗原疫苗之免疫原性的代表性研究之结果。简言之，利用PMED在第0天对每组5只小鼠进行初始免疫，且在第14天、第28天及第49天进行增强免疫。在第56天，通过ELISA评估血清抗PSMA抗体效价。接种PSMA之所有动物均产生显著抗PSMA抗体效价。效价之间无显著差异，但与接种PSMA之其它组相比，接种PSA-F2A-PSMA-T2A-PSCA产生的效价稍低。此等数据显示使用共同表达及共同调配疫苗策略在三抗原接种后产生抗PSMA特异性抗体。
图12显示通过抗PSCA抗体效价评估三抗原疫苗之免疫原性的代表性研究之结果。简言之，利用PMED在第0天对每组5只小鼠进行初始免疫，且在第14天、第28天及第49天进行增强免疫。在第56天，通过ELISA评估血清抗PSCA抗体效价。在接种单独PSCA以及共同调配之PSMA、PSCA及PSA的小鼠中侦测抗体效价。此等结果指示，与共同表达之DNA接种策略相比，共同调配PSMA、PSCA及PSA引发可侦测之抗PSCA抗体效价。
图13显示通过抗PSMA抗体细胞表面结合来评估三抗原疫苗之免疫原性的代表性研究之结果。简言之，利用PMED在第0天对每组5只小鼠进行初始免疫，且在第14天、第28天及第49天进行增强免疫。在第56天，通过LNCaP及PC3细胞之血清抗体结合来评估细胞表面天然PSMA之识别。PC3细胞充当分析之背景对照。与接种PSA-T2A-PSCA-F2A-PSMA及单独PSMA之小鼠相比，接种PSA-F2A-PSMA-T2A-PSCA产生与LNCaP细胞之结合能力显著较低之抗PSMA抗体(*指示p值<0.05，单向ANOVA)。所有其它PSMA接种组均显示在抗PSMA抗体结合方面无显著差异。J591-A mAb相对于单独二级抗体之变化倍数为45.3(数据未显示)。总体而言，此等数据显示使用共同表达及共同调配DNA接种策略在三抗原接种后产生识别天然PSMA之抗PSMA特异性抗体。
图14显示通过抗PSCA抗体细胞表面结合来评估三抗原疫苗之免疫原性的代表性研究之结果。简言之，利用PMED在第0天对每组5只小鼠进行初始免疫，且在第14天、第28天及第49天进行增强免疫。在第56天，通过经Ad-PSCA转导及未经转导之MIA-PaCa-2细胞之血清抗体结合来评估细胞表面天然PSCA之识别。未经转导之亲本细胞充当分析之背景对照。除单一PSMA及单一PSA细胞疫苗以外，与亲本细胞相比，利用PSCA之所有疫苗疗法均对经Ad-PSCA转导之MIA-PaCa-2细胞产生显著抗PSCA抗体结合。接种PSCA之群组之间在对经Ad-PSCA转导之MIA-PaCa-2细胞之抗PSCA抗体结合方面无显著差异(单向ANOVA，p值>0.05)。7F5mAb相对于单独二级抗体之变化倍数为18.7(数据未显示)。总体而言，此等数据显示使用共同表达及共同调配DNA接种策略在三抗原接种后产生识别天然PSCA之抗PSCA特异性抗体。
实施例6.双抗原疫苗之免疫原性
提供以下实施例以说明表达两种前列腺抗原之双抗原疫苗引发针对两种经编码之前列腺抗原之抗原特异性T及B细胞反应的能力。
6A.含PSMA及PSCA之双抗原疫苗在C57BL/6中之免疫原性：
研究程序。
细胞免疫反应研究。通过PMED表皮注射利用人类PSMA及PSCA表达DNA在第0天对雌性C57BL/6小鼠进行初始免疫且在第14天、第28天、第42天及第70天进行增强免疫。评估总计5种不同的双抗原DNA接种策略，所述策略包括4种共同表达抗原之DNA疫苗及一种共同调配方法。对于共同表达而言，施用单一DNA疫苗质粒，其编码经双启动子、2A肽或IRES连接之两种前列腺抗原PSMA及PSCA。此等质粒包括PSMA-PSCA双启动子(质粒ID#460)、PSMA-T2A-PSCA(质粒ID#451)、PSCA-F2A-PSMA(质粒ID#454)及PSCA-IRES-PSMA(质粒ID#603)。对于共同调配而言，将两种不同的DNA质粒(各自个别地编码PSMA及PSCA)共同调配于单一金粒子上以供PMED递送。除共同调配以外，控制共同表达之DNA元件(双启动子2A及IRES)在长度、转基因表达效率及连接于标靶转基因之外来遗传物质之存在方面不同。作为对照，C57BL/6小鼠接种表达单一前列腺抗原(PSMA或PSCA)之DNA。对于共同表达之双抗原或单抗原DNA疫苗，根据PMED施用给予总剂量2μg之DNA疫苗，而对于共同调配，施用2μg各DNA疫苗质粒(每次施用总计4μg DNA)。通过在第77天，即最终PMED接种后7天自各动物收集脾脏来量测双抗原及单抗原疫苗之细胞免疫反应。分离脾细胞且进行IFN-γELISPOT分析以量测PSMA及PSCA特异性T细胞反应。简言之，将来自个别动物之2×105个脾细胞与具有5×104个/孔之表达单一内源性人类前列腺抗原或一起表达PSMA、PSCA及PSA之TRAMP-C2细胞一起，或与10μg/ml个别人类PSMA及PSCA特异性肽或肽集合(关于肽及肽集合组成，参看表22)或作为对照之单独培养基一起涂于每孔。各条件以一式三份进行。在37℃及5％CO2下将培养盘培育20小时，洗涤且在培育之后根据制造商说明书显色。通过CTL读数器对IFN-γSFC数目进行计数。结果呈现于图15及16中，所述图显示每组五只小鼠之相对于1×106个脾细胞归一化之PSMA或PSCA特异性SFC平均数+/-标准差。
抗体反应研究。通过在第77天，即最终PMED接种后7天自各动物收集血清来量测针对双抗原及单抗原疫苗之抗体反应。使用ELISA如实施例5中所述来测定血清中之抗PSMA及抗PSCA抗体效价。结果呈现于图17及18中，所述图显示每组五只小鼠之平均效价+/-标准差。
亦对血清进行FACS分析以量测抗体与适当细胞株之细胞表面上所表达之人类PSMA或PSCA的结合，从而确定多抗原疫苗所产生之抗体是否能够分别识别天然PSMA及PSCA构形。未量测抗体与细胞表面天然PSA之结合，此系因为PSA以细胞质蛋白形式由此研究中所研究之多抗原疫苗表达。根据如实施例5中所述之程序进行FACS分析。结果呈现于图19及20中，所述图显示每组五只小鼠之小鼠血清相对于单独第二抗小鼠抗体之MFI平均变化倍数+/-标准差。未量测抗体效价及与细胞表面天然PSA之结合，此系因为PSA以细胞质蛋白形式由此研究中所研究之多抗原疫苗表达。
结果。
图15A至15C显示通过IFN-γELISPOT分析评估双抗原疫苗之免疫原性的代表性研究之结果。简言之，利用PMED在第0天对每组5只小鼠进行初始免疫，且在第14天、第28天、第42天及第70天进行增强免疫。在第77天，通过IFN-γELISPOT分析通过研究针对(A)TRAMP C2-PSMA、(B)TRAMP C2-PSCA及(C)TRAMP C2-PSMA-PSA-PSCA细胞之T细胞反应来评估内源性PSMA及PSCA之识别。TRAMP C2细胞充当分析之背景对照。对于针对内源性PSMA之IFN-γT细胞反应，在接种PSMA-PSCA双启动子、PSMA-T2A-PSCA、PSCA-IRES-PSMA及共同调配之PSMA、PSCA之后，与接种单独PSMA相比，TRAMP C2-PSMA之反应量值显著降低(**及***分别指示p值<0.01及<0.001，双向ANOVA)。然而，PSCA-F2A-PSMA疫苗构建体引发针对TRAMP C2-PSMA细胞之IFN-γT细胞反应的量值与单一PSMA疫苗类似。对于针对内源性PSCA之IFN-γT细胞反应，在接种若干种双抗原疫苗(包括PSMA-PSCA双启动子、PSCA-F2A-PSMA、PSCA-IRES-PSMA及共同调配之PSMA PSCA)之后，与单独PSCA疫苗相比，观察到显著增加之反应(*、**及***分别指示p值<0.05、0.01及0.001，双向ANOVA)。PSCA-T2A-PSMA疫苗构建体引发针对TRAMP C2-PSCA细胞之IFN-γT细胞反应的量值与单一PSCA疫苗类似。比较针对TRAMP C2-PSMA-PSA-PSCA之IFN-γT细胞反应，接种不同双抗原疫苗的群组之间无显著差异。总而言之，此等数据显示使用共同表达及共同调配DNA接种策略在双抗原接种后产生PSMA及PSCA特异性T细胞反应。
图16A至16C显示通过IFN-γELISPOT分析评估双抗原疫苗之免疫原性的代表性研究之结果。简言之，利用PMED在第0天对每组5只小鼠进行初始免疫，且在第14天、第28天、第42天及第70天进行增强免疫。在第77天，通过IFN-γELISPOT分析评估针对(A)PSMA肽、(B)PSMA肽集合及(C)PSCA肽之T细胞反应(参看表22)。单独培养基充当分析之背景对照。对于针对个别PSMA肽及肽集合之IFN-γT细胞反应，在PSMA-T2A-PSCA及PSCA-F2A-PSMA双抗原接种之后观察到与单一PSMA疫苗相比之最高量值反应。在接种PSMA-PSCA双启动子、PSCA-IRES-PSMA及共同调配之PSMA PSCA之后观察到针对个别PSMA肽之IFN-γT细胞反应显著降低。接种不同双抗原疫苗之群组之间的针对PSCA特异性肽之IFN-γT细胞反应类似。此等数据亦显示当共同表达于相同DNA疫苗构建体上或作为共同配制品递送时产生针对PSMA及PSCA两者之T细胞反应。
图17显示通过抗PSMA抗体效价评估双抗原疫苗之免疫原性的代表性研究之结果。简言之，利用PMED在第0天对每组5只小鼠进行初始免疫，且在第14天、第28天、第42天及第70天进行增强免疫。在第77天，通过ELISA评估血清抗PSMA抗体效价。接种PSMA之所有动物均产生显著抗PSMA抗体效价。与接种PSMA之所有其它小鼠群组相比，接种双疫苗构建体PSCA-F2A-PSMA及单一PSMA疫苗之小鼠产生显著较高之抗体效价(单向ANOVA，p值<0.05)。与接受PSMA-T2A-PSCA疫苗之小鼠相比，接种PSMA-PSCA双启动子及共同调配之PSMA及PSCA产生较高抗体效价。总而言之，此等数据显示使用共同表达及共同调配接种策略在利用PSMA及PSCA进行双抗原DNA接种后产生抗PSMA特异性抗体。
图18显示通过抗PSCA抗体效价评估双抗原疫苗之免疫原性的代表性研究之结果。简言之，利用PMED在第0天对每组5只小鼠进行初始免疫，且在第14天、第28天、第42天及第70天进行增强免疫。在第77天，通过ELISA评估血清抗PSCA抗体效价。与接种PSCA之所有其它小鼠群组相比，接种共同调配之PSMA及PSCA及单一PSCA疫苗之小鼠产生显著较高之抗体效价(单向ANOVA)。与接种PSMA-T2A-PSCA、PSCA-F2A-PSMA及PSCA-IRES-PSMA相比，接种PSMA-PSCA双启动子产生较高抗体效价。此等结果指示PSMA及PSCA之共同表达或共同调配引发抗PSCA抗体。
图19显示通过抗PSMA抗体细胞表面结合评估双抗原疫苗之免疫原性的代表性研究之结果。简言之，利用PMED在第0天对每组5只小鼠进行初始免疫，且在第14天、第28天、第42天及第70天进行增强免疫。在第77天，通过LNCaP及PC3细胞之血清抗体结合来评估细胞表面天然PSMA之识别。PC3细胞充当分析之背景对照。除单一PSCA疫苗以外，与对照PC3细胞相比，利用PSMA之所有疫苗疗法均产生针对LNCaP细胞之显著抗PSMA抗体结合。接种PSMA之群组之间在针对LNCaP细胞之抗PSMA抗体结合方面无显著差异(单向ANOVA，p值>0.05)。J591-AmAb相对于单独二级抗体之变化倍数为45.3(数据未显示)。此等数据显示使用共同表达及共同调配接种策略在双抗原DNA接种后产生可识别天然PSMA之抗PSMA特异性抗体。
图20显示通过抗PSCA抗体细胞表面结合来评估双抗原疫苗之免疫原性的代表性研究之结果。简言之，利用PMED在第0天对每组5只小鼠进行初始免疫，且在第14天、第28天、第42天及第70天进行增强免疫。在第77天，通过经Ad-PSCA转导及未经转导之MIA-PaCa-2细胞之血清抗体结合来评估细胞表面天然PSCA之识别。未经转导之亲本细胞充当分析之背景对照。除单一PSMA疫苗以外，与对照细胞相比，利用PSCA之所有疫苗疗法均产生针对经Ad-PSCA转导之MIA-PaCa-2细胞之显著抗PSCA抗体结合。接种PSCA之群组之间在针对经Ad-PSCA转导之MIA-PaCa-2细胞之抗PSCA抗体结合方面无显著差异(单向ANOVA，p值>0.05)。7F5mAb相对于单独二级抗体之变化倍数为18.7(数据未显示)。总体而言，此等数据显示使用共同表达及共同调配接种策略在双抗原DNA接种后产生可识别天然PSCA之抗PSCA特异性抗体。
6B.含PSMA及PSA或PSCA及PSA之双抗原疫苗在C57BL/6中之免疫原性：
研究程序。
细胞免疫反应研究。通过PMED表皮注射利用人类PSMA、PSCA及PSA表达DNA在第0天对雌性C57BL/6小鼠进行初始免疫且在第14天及第28天进行增强免疫。评估总计4种不同的双抗原疫苗策略，所述策略包括两种共同表达方法及两种共同调配策略。对于共同表达而言，施用单一DNA质粒，其编码两种前列腺抗原，即由2A肽连接之PSMA及PSA(质粒ID#5300)或由IRES连接之PSCA及PSA(质粒ID#455)。对于共同调配而言，将个别地编码PSMA、PSCA或PSA之质粒共同调配于单一金粒子上以供PMED递送。具体而言，此等质粒包括共同调配之PSMA及PSA以及共同调配之PSCA及PSA。作为对照，C57BL/6小鼠接种表达单一前列腺抗原PSMA、PSCA或PSA之DNA。对于共同表达之双抗原或单抗原疫苗而言，根据PMED施用给予剂量2μg之DNA，而对于共同调配而言，施用2μg各DNA疫苗质粒(每次施用总计4μg DNA)。通过在第35天自各动物收集脾脏来量测双抗原及单抗原疫苗之细胞免疫反应。分离脾细胞且进行IFN-γELISPOT分析以量测PSMA、PSCA及PSA特异性T细胞反应。简言之，将来自个别动物之2×105个脾细胞与5×104个/孔之稳定表达单一内源性人类前列腺抗原或一起表达PSMA、PSCA及PSA之TRAMP-C2细胞一起，或与10μg/ml个别人类PSMA、PSCA及PSA特异性肽或肽集合(关于肽及肽集合组成，参看表22)或作为对照之单独培养基一起涂于每孔。各条件以一式三份进行。在37℃及5％CO2下将培养盘培育20小时，洗涤且在培育之后根据制造商说明书显色。通过CTL读数器对IFN-γSFC数目进行计数。结果呈现于图21及22中，所述图显示每组五只小鼠之相对于1×106个脾细胞归一化之PSMA、PSCA及PSA特异性SFC平均数+/-标准差。
抗体反应研究。通过PMED利用人类PSMA、PSCA及PSA表达DNA在第0天对雌性C57BL/6小鼠进行初始免疫且在第14天、第28天及第49天进行增强免疫。通过在第56天，即最终PMED接种后7天自各动物收集血清来量测针对双抗原及单抗原疫苗之抗体反应。使用ELISA分析如实施例5中所述来测定血清中之抗PSMA及抗PSCA抗体效价。结果呈现于图23及24中，所述图显示每组五只小鼠之平均效价+/-标准差。
亦对血清进行FACS分析以量测抗体与适当细胞株之细胞表面上所表达之人类PSMA或PSCA的结合，从而确定多抗原疫苗所产生之抗体是否能够分别识别天然PSMA及PSCA构形。未量测抗体与细胞表面天然PSA之结合，此系因为PSA以细胞质蛋白形式由此研究中所研究之多抗原疫苗表达。根据如实施例5中所述之程序进行FACS分析。结果呈现于图25及26中，所述图显示每组五只小鼠之小鼠血清相对于单独第二抗小鼠抗体之MFI平均倍数变化+/-标准差。未量测抗体效价及与细胞表面天然PSA之结合，此系因为PSA以细胞质蛋白形式由此研究中所研究之多抗原疫苗表达。
结果。
图21A至21D显示通过IFN-γELISPOT分析评估双抗原疫苗之免疫原性的代表性研究之结果。简言之，利用PMED在第0天对每组5只小鼠进行初始免疫，且在第14天及第28天进行增强免疫。在第35天，通过IFN-γELISPOT分析通过研究对(A)TRAMP C2-PSMA、(B)TRAMP C2-PSCA、(C)TRAMP C2-PSA及(D)TRAMP C2-PSMA-PSA-PSCA细胞之T细胞反应来评估内源性PSMA、PSCA及PSA之识别。TRAMP C2细胞充当分析之背景对照。对于针对细胞上内源性表达之PSMA的IFN-γT细胞反应，在接种含PSMA之双抗原(PSA-F2A-PSMA及共同调配之PSMA及PSA)及单独PSMA之后，未观察到针对TRAMP C2-PSMA之反应之间存在显著差异。同样，对于针对内源性PSCA之IFN-γT细胞反应，与单一PSCA疫苗相比，在双PSCA-IRES-PSA与共同调配之PSCA及PSA疫苗之间未观察到针对TRAMP C2-PSCA之反应量值存在差异。对于针对内源性PSA之IFN-γT细胞反应，当将单一PSA疫苗之免疫原性与PSA-F2A-PSMA(***指示p<0.001，双向ANOVA)及共同调配之PSMA及PSA(**指示p<0.01，双向ANOVA)比较时，侦测到针对TRAMP C2-PSA之反应量值显著增加。当将接受双PSCA及PSA疫苗之动物与接受单一PSA疫苗之动物比较时，在针对TRAMP C2-PSA之反应量值方面未观察到差异。当研究针对TRAMP C2-PSMA-PSA-PSCA之IFN-γT细胞反应时，在接种不同双抗原疫苗之群组之间在反应方面无显著差异。总而言之，此等数据显示使用共同表达及共同调配疫苗策略在双抗原DNA接种后产生PSMA及PSA特异性T细胞反应以及PSCA及PSA特异性T细胞反应。
图22显示通过抗PSMA抗体效价评估双抗原疫苗之免疫原性的代表性研究之结果。简言之，利用PMED在第0天对每组5只小鼠进行初始免疫，且在第14天、第28天及第49天进行增强免疫。在第56天，通过ELISA评估血清抗PSMA抗体效价。接种PSMA之所有动物均产生显著抗PSMA抗体效价。在接种PSA-F2A-PSMA、共同调配之PSMA及PSA以及单独PSMA之小鼠之间在抗体效价方面无显著差异(单向ANOVA，p值>0.05)。总而言之，此等数据显示使用共同表达及共同调配疫苗策略在利用PSMA及PSA进行双抗原DNA接种后产生抗PSMA特异性抗体。
图23显示通过抗PSCA抗体效价评估双抗原疫苗之免疫原性的代表性研究之结果。简言之，利用PMED在第0天对每组5只小鼠进行初始免疫，且在第14天、第28天及第49天进行增强免疫。在第56天，通过ELISA评估血清抗PSCA抗体效价。接种PSCA之所有动物均产生显著抗PSCA抗体效价。接种PSCA-IRES-PSA、共同调配之PSCA及PSA与单独PSCA之小鼠之间在抗体效价方面无显著差异(单向ANOVA，p值>0.05)，但PSCA-IRES-PSA接种后产生之抗体效价倾向于低于接种PSCA之其它群组。此等结果指示PSCA及PSA之共同表达或共同调配引发抗PSCA抗体。
图24显示通过抗PSMA抗体细胞表面结合来评估双抗原疫苗之免疫原性的代表性研究之结果。简言之，利用PMED在第0天对每组5只小鼠进行初始免疫，且在第14天、第28天及第49天进行增强免疫。在第56天，通过LNCaP及PC3细胞之血清抗体结合来评估细胞表面天然PSMA之识别。PC3细胞充当分析之背景对照。接种PSMA之群组之间在针对LNCaP细胞之抗PSMA抗体结合方面无显著差异(单向ANOVA，p值>0.05)。J591-A mAb相对于单独二级抗体之变化倍数为45.3(数据未显示)。总体而言，此等数据显示使用共同表达及共同调配疫苗策略在双抗原接种后产生可识别天然PSMA之抗PSMA特异性抗体。
图25显示通过抗PSCA抗体细胞表面结合来评估双抗原疫苗之免疫原性的代表性研究之结果。简言之，利用PMED在第0天对每组5只小鼠进行初始免疫，且在第14天、第28天及第49天进行增强免疫。在第56天，通过经Ad-PSCA转导及未经转导之MIA-PaCa-2细胞之血清抗体结合来评估细胞表面天然PSCA之识别。未经转导之亲本细胞充当分析之背景对照。接种PSCA之所有小鼠群组对经Ad-PSCA转导之MIA-PaCa-2细胞显示极低抗PSCA抗体结合。与接种单独PSCA之小鼠相比，PSCA-IRES-PSA接种显著降低对经Ad-PSCA转导之MIA-PaCa-2细胞之结合(*指示p<0.05，单向ANOVA)。总而言之，此等数据显示PSCA及PSA之共同表达或共同调配使得抗PSCA特异性抗体极少识别天然PSCA。
实施例7.经修饰之人类PSMA抗原之免疫原性
研究设计。对使用编码由SEQ ID NO:1之天然人类PSMA蛋白之15-750个氨基酸(aa)组成之免疫原性PSMA多肽(“经修饰之人类PSMA抗原”或“经修饰hPSMA”)之构建体进行DNA接种所诱导之免疫反应与天然人类全长PSMA蛋白(全长hPSMA)所诱导之免疫反应进行比较。利用PMED施用2μg剂量之编码全长hPSMA或经修饰hPSMA之DNA疫苗在第0天对雌性C57BL/6小鼠或雌性巴斯德(HLA-A2/DR1)转基因小鼠群组进行初始免疫且在第14天、第28天进行增强免疫。对小鼠取血且在第35天(第三次接种之后7天)处死，且通过IFN-γELISPOT分析在脾细胞中测定针对hPSMA全长蛋白之T细胞免疫反应。对于C57BL/6小鼠，将来自个别动物之5×105个脾细胞之单一细胞悬浮液与10μg经纯化hPSMA蛋白、5×104个单独TRAMP-C2细胞或表达hPSMA或PSMA-PSA-PSCA融合蛋白之TRAMP-C2细胞一起涂于每孔。对于巴斯德(HLA-A2/DR1)转基因小鼠，将来自个别动物之5×105个脾细胞之单一细胞悬浮液与5×104个经来源于人类PSMA蛋白序列之已知HLA-A2限制性CD8+T细胞表位脉冲之表达人类HLA-A2之K562细胞一起涂于每孔(表23)。亦使用10μg/ml经纯化PSMA蛋白或5×104个已经表达对照蛋白质(Ad-eGFP)或全长人类PSMA蛋白(Ad-hPSMA)之腺病毒载体转导之SK-Mel5细胞来测定巴斯德小鼠中之反应。各条件以一式三份进行。在37℃及5％CO2下将培养盘培育20小时，洗涤且在培育之后根据制造商说明书显色。通过CTL读数器对IFN-γSFC数目进行计数。结果呈现于图19及20中，所述图显示每组之PSMA特异性SFC平均数/百万脾细胞+/-标准差。
ELISA分析。在第35天在自各动物收集之血清中量测经修饰及全长PSMA疫苗诱导之抗体反应。对血清进行ELISA以便使用如实施例5中所述之ELISA分析测定血清中之抗PSMA抗体效价。结果呈现于图26中，该图显示每组小鼠数目之平均效价+/-标准差。
FACS分析。亦对血清进行FACS分析以量测抗体与适当细胞株之细胞表面上所表达之人类PSMA的结合，从而确定经修饰及全长PSMA疫苗所产生之抗体是否能够识别天然PSMA构形。根据如实施例5中所述之程序进行FACS分析。结果呈现于图29中，该图显示每组小鼠数目之小鼠血清相对于单独第二抗小鼠抗体之MFI平均变化倍数+/-标准差。
表23.针对巴斯德(HLA-A2/DR1)转基因小鼠进行的分析中所测试的HLA-A2限制性肽表位。肽在10μg/ml之浓度下个别地测试。指示各肽之N及C末端之氨基酸位置。
前列腺抗原 肽 目的
hHer2 106-114 来源于人类Her2蛋白之HLA-A2限制性对照肽
PSMA 168-177 HLA-A2限制性PSMA测试肽
PSMA 663-671 HLA-A2限制性PSMA测试肽
PSMA 275-289 HLA-A2限制性PSMA测试肽
结果。图26显示代表性研究之结果，此研究系评估经修饰之人类PSMA(aa 15-750)相对于全长人类PSMA(aa 1-750)在C57BL/6小鼠中引发之T细胞免疫反应，通过IFN-γELISPOT分析所测定。利用PMED以表达经修饰之hPSMA或hPSMA全长蛋白之DNA疫苗在第0天对每组五(5)只小鼠进行初始免疫且在第14天及第28天进行增强免疫。在第35天，通过IFNγELISPOT分析测定针对TRAMP C2-PSMA或经纯化人类PSMA ECD蛋白(参考图26中之经纯化hPSMA蛋白)之T细胞反应来比较所引发之针对hPSMA全长蛋白之反应。TRAMP C2细胞充当分析之背景对照。所引发之针对TRAMP C2-PSMA或经纯化hPSMA蛋白之IFN-γT细胞反应的量值在各群组之间无显著差异(双向ANOVA，p值>0.05)。此等结果指示表达经修饰之hPSMA及hPSMA全长蛋白之DNA疫苗在C57BL/6小鼠中引发等效T细胞免疫反应。
图27A及27B显示通过IFN-γELISPOT分析评估经修饰之人类PSMA抗原(aa 15-750)相对于全长人类PSMA抗原(aa 1-750)在巴斯德(HLA-A2/DR1)转基因小鼠中之T细胞免疫反应的代表性研究之结果。利用PMED以编码经修饰hPSMA或hPSMA全长蛋白之DNA疫苗在第0天对每组十(10)只小鼠进行初始免疫且在第14天及第28天进行增强免疫。在第35天，通过IFN-γELISPOT分析使用(A)代表已知CD8+表位之来源于PSMA之HLA-A2限制性肽及(B)经Ad-hPSMA或经纯化hPSMA全长蛋白转导之SK-Mel5细胞来测定所引发之针对hPSMA全长蛋白之T细胞反应。hHER2106肽及SK-Mel5Ad-eGFP在分析中充当阴性对照。经修饰之hPSMA疫苗引发最高量值之针对HLA-A2限制性CD8+T细胞表位之IFN-γT细胞免疫反应，但群组之间的差异不显著(双向ANOVA，p值>0.05)。类似地，经修饰之hPSMA疫苗引发最高量值之针对经Ad-hPSMA转导之SK-Mel5细胞之免疫反应及显著(双向ANOVA，p值>0.05)较高频率之针对经纯化hPSMA蛋白之IFN-γSFC。此等结果显示在巴斯德(HLA-A2/DR1)转基因小鼠中，表达经修饰之hPSMA蛋白之DNA疫苗在诱导针对hPSMA蛋白之T细胞反应方面比hPSMA全长蛋白更有效。
图28显示通过抗PSMA抗体效价评估经修饰之人类PSMA疫苗及全长PSMA疫苗之免疫原性的代表性研究之结果。简言之，利用PMED在第0天对小鼠进行初始免疫，且在第14天及第28天进行增强免疫。9只巴斯德小鼠接种经修饰PSMA，10只巴斯德小鼠接种全长PSMA，且每组5只C57BL/6小鼠接种经修饰或全长PSMA。在第35天，通过ELISA评估血清抗PSMA抗体效价。不出所料，与巴斯德小鼠相比，C57BL/6小鼠产生显著更大之抗PSMA抗体效价(单向ANOVA)。比较相同品系之小鼠之间的抗体效价，接种经修饰及全长PSMA之小鼠之间在抗体效价方面无显著差异(单向ANOVA，p值>0.05)。总体而言，此等结果显示，与经修饰之人类PSMA疫苗相比，接种人类PSMA的全长型式产生等效抗PSMA抗体效价。
图29显示通过抗PSMA抗体细胞表面结合来评估经修饰之人类PSMA疫苗及全长PSMA疫苗之免疫原性的代表性研究之结果。简言之，利用PMED在第0天对每组5只C57BL/6小鼠进行初始免疫，且在第14天及第28天进行增强免疫。在第35天，通过LNCaP及PC3细胞之血清抗体结合来评估细胞表面天然PSMA之识别。PC3细胞充当分析之背景对照。接种经修饰或全长PSMA之小鼠之间在针对LNCaP细胞之抗PSMA抗体结合方面无显著差异(单向ANOVA，p值>0.05)。J591-A mAb相对于单独二级抗体之变化倍数为14.3(数据未显示)。总体而言，此等数据显示在经修饰或全长PSMA接种之后可产生可识别天然PSMA之抗PSMA特异性抗体。
实施例8.抗CTLA-4抗体对疫苗诱导之免疫反应的影响
在猴研究中研究局部施用抗CTLA-4单克隆抗体(CP-675,206)对本发明所提供之人类PSMA核酸分子所诱导之免疫反应之影响，其中通过使用IFNγELISPOT分析量测PSMA特异性T细胞反应来评估免疫反应。
动物处理及样品收集。用经腺病毒(肌肉内注射之1e11V.P.)递送之编码经修饰之人类PSMA抗原(SEQ ID NO:9)之核酸(SEQ ID NO:10)将三组、每测试组5至6只(1至5或6号)雄性印度恒河猴免疫，随后分别以6及9周间隔通过PMED进行2次DNA免疫(每次免疫8次致动，下腹部右侧及左侧各4次致动)。第2组及第3组中之动物在PMED免疫之后随后在邻近各腹股沟引流淋巴结处另外接受双侧皮内注射3mg CpG(PF-03512676)。在第二次PMED免疫时，在邻近各左及右腹股沟疫苗引流淋巴结处，第2组亦接受静脉内注射10mg/kg抗CTLA-4单克隆抗体(CP-675,206)，且第3组接受皮内注射5mg/kg抗CTLA-4单克隆抗体(CP-675,206)。
在最后一次PMED免疫之后16天自各动物收集周边血液样品。自样品中分离周边血液单核细胞(PBMC)且进行IFNγELISPOT分析以量测PSMA特异性T细胞反应。简言之，将来自个别动物之4e5PBMC与各2μg/ml之PSMA特异性肽集合、10μg/ml之hPSMA ECD蛋白、10μg/ml之恒河猴PSMA ECD蛋白或各2μg/ml之非特异性对照肽(人类HER2肽集合)一起涂于IFNγELISPOT培养盘中之每孔。各PSMA特异性肽集合之组成提供于表24A中。在37℃及5％CO2下将培养盘培育16小时，且洗涤且在培育之后根据制造商说明书显色。通过CTL读数器对IFNγ斑点形成细胞(SFC)之数目进行计数。各条件以一式两份进行。结果呈现于表24B中，该表显示得自三重复实验之PSMA特异性SFC平均数减去相对于1e6PBMC归一化之非特异性对照肽之SFC平均数。^指示计数不准确，因为斑点数过多以致无法计数。
IFNγELISPOT分析程序。在4℃下将IFNγ特异性捕捉抗体(BDBioscience，#51-2525kc)涂布于微量培养盘中之聚偏二氟乙烯(PVDF)膜上隔夜。用血清/蛋白质阻断培养盘以防止抗体之非特异性结合。在阻断之后，将效应细胞(诸如自免疫小鼠分离之脾细胞或自恒河猴分离之PBMC)及标靶(诸如来自肽文库之PSMA肽、经抗原特异性肽脉冲之标靶细胞或表达相关抗原之肿瘤细胞)添加至孔中且在37℃下在5％CO2培育箱中培育隔夜。通过PVDF膜表面上之涂布抗体来捕捉效应细胞所分泌之细胞因子。在移除细胞及培养基之后，向各孔中添加100μl经生物素标记之多株抗人类IFNγ抗体以供侦测。通过根据制造商(Mabtech)方案添加抗生蛋白链菌素-辣根过氧化酶及沈淀受质3-氨基-9-乙基咔唑(AEC)以产生红色斑点来显现斑点。各斑点代表产生单一细胞因子之T细胞。
结果。表24B.显示代表性IFNγELISPOT分析之结果，此分析系评估并比较通过静脉内注射全身性给予(第2组)或通过在邻近疫苗引流淋巴结处皮内注射局部给予(第3组)之疫苗在抗CTLA-4单克隆抗体(CP-675,206)不存在(第1组)或存在下所诱导之T细胞反应。如表1B中所示，PSMA疫苗在CpG(PF-03512676)及抗CTLA-4单克隆抗体(CP-675,206)不存在下诱导针对多种PSMA特异性肽及蛋白质之可量测IFNγT细胞反应。通过添加CpG(PF-03512676)及全身性递送抗CTLA-4抗体(CP-675,206；第2组)来适当增强反应。然而，当通过在邻近疫苗引流淋巴结处皮内注射来局部递送抗CTLA-4单克隆抗体(CP-675,206)(第3组)时观察到针对多种PSMA肽及PSMA蛋白之反应更有效且显著增强。
表24A.PSMA肽集合：各肽集合(即P1、P2、P3、H1、H2、R1及R2)由来自人类PSMA蛋白(hPMSA蛋白)或恒河猴PSMA蛋白(rPMSA蛋白)序列之15聚体肽组成，如下文所示。指示各肽之N及C末端之氨基酸位置。
表24B.通过静脉内注射(第2组)或局部皮内注射(第3组)全身性给予之疫苗在抗CTLA-4抗体曲美目单抗(CP-675,206)不存在(第1组)或存在下诱导之T细胞反应
实施例9.CTLA-4抗体在施用于猕猴之后的全身性暴露
通过皮内或静脉内注射施用抗CTLA-4抗体曲美目单抗(CP675206)之后，研究该抗体在在印度恒河猴中之血液含量。
动物处理及样品收集。将每组三只动物注射10mg/kg抗CTLA-4抗体曲美目单抗，单次静脉内注射至隐静脉中或多次0.2ml皮内双侧注射于邻近腹股沟引流淋巴结处之大腿中。在注射后0、1、2、4、8、12、24及48小时将血液样品收集于含肝素锂作为抗凝血剂之2.0ml真空采血管中。在4℃下在1500×g下离心10分钟后自真空采血管中之上层清液中收集血浆。通过定量ELISA分析根据下文所提供之程序来量测血浆中之曲美目单抗含量。
曲美目单抗定量ELISA分析程序。将384孔高度结合分析培养盘(VWR-Greiner Bio-Bio-One，目录号82051-264)每孔涂布25μl CD-152(CTLA-4；Ancell Immunology Research Products，目录号501-020)(1.0μg/ml，于100mM碳酸盐-碳酸氢盐涂布缓冲液中)且在4℃下培育隔夜。用1×PBS-Tween(0.01M PBS pH 7.4/0.05％Tween 20)将培养盘洗涤6次，且每孔使用40μL 5％FBS/1×PBS-Tween阻断，且在室温下以600rpm振荡培育1小时。通过制造以下曲美目单抗稀释液来制备标准物：200、67、22、7.4、2.5、0.82、0.27、0.09及0.03ng/mL。将样品稀释至1:100、1:1,000及1:10,000。稀释剂由1％未处理猕猴血清及含5％FBS之1×PBS-Tween(0.01M PBS pH 7.4/0.05％Tween 20)组成。将25μL/孔之各标准物、样品及稀释剂对照物一式两份转移至培养盘中且在室温下以600rpm振荡培育1小时。在用1×PBS-Tween洗涤6次之后，添加25μL/孔之用1×PBS-Tween以1:5,000稀释之二级抗体(山羊抗人类IgG HRP，Southern Biotech，目录号9042-05)，接着在室温下以600rpm振荡培育1小时。在用1×PBS-Tween洗涤6次之后，添加25μL/孔之TMB过氧化酶EIA受质(溶液A+B)(Bio-Rad，目录号172-1067)且在室温下将培养盘培育4分钟。通过添加12.5μL/孔之1N硫酸来停止比色反应，接着在450nm下读取吸光度。使用标准曲线对各样品中之曲美目单抗之量进行定量，其中使用0.27至67ng/mL作为定量范围。
结果。得自代表性研究之血浆抗CTLA-4含量呈现于图30中。如所示，与静脉内注射(AUC0-24＝7.2×106ng·h/ml)相比，皮内注射抗CTLA-4抗体曲美目单抗显示血液中之抗体之较缓慢释放动力学及较低全身暴露(AUC0-24＝4.9×106ng·h/ml)分布。
实施例10.抗CTLA-4抗体对疫苗诱导小鼠之免疫反应的影响
研究程序。通过PMED利用表达rHer-2之DNA对每组6只雌性BALB/c小鼠进行初始免疫，且隔4周进行增强免疫。如图式中所指示，在PMED致动当天施用150μg对小鼠CTLA-4具特异性之单克隆抗体(克隆9H10，Bioxcell或#BE0131)或同型对照单克隆抗体(Bioxcell#BE0091)且在PMED之后各天通过局部皮内或全身腹膜内注射施用100μg。在最后一次PMED免疫之后7天通过ICS分析量测自个别小鼠分离之脾细胞中的多功能(多细胞因子阳性)T细胞免疫反应。在用10μg/ml疫苗特异性表位肽(rHer-2特异性抗原特异性CD8(p66)、CD4(p169)表位或无关肽HBV(核心抗原p87))刺激5小时之后，首先针对CD4、CD3及CD8将脾细胞染色，随后穿透并针对IFNα、TNFα及IL-2表达(通过流式细胞术加以分析)进行染色。通过自疫苗特异性反应减去针对无关肽HBV之反应来计算各动物之抗原特异性单、双或三重细胞因子阳性T细胞总数/总脾脏且通过每个脾脏分离之脾细胞总数归一化。
结果。图31A及31B显示通过细胞内细胞因子染色分析针对疫苗诱导之免疫反应之质量来评估抗CTLA-4单克隆抗体(克隆9H10)之免疫调节活性的代表性研究之结果。在最后一次PMED之后7天，观察到通过局部皮内递送抗CTLA-4所致之抗原特异性单一及双重细胞因子阳性CD8T细胞反应及通过全身性递送所致之双重及三重细胞因子阳性CD8T细胞反应显著增加。另外，观察到通过皮内递送所致之抗原特异性单一细胞因子阳性CD4T细胞及通过全身性递送抗CTLA-4所致之双重细胞因子阳性细胞显著增加(*指示P<0.05，Stutent’s T检验法(Student's T-test)。
实施例11.舒尼替尼与抗癌症疫苗组合的协同效应
研究程序。研究苹果酸舒尼替尼与抗癌症DNA疫苗组合在BALB/neuT转基因雌性小鼠中的抗肿瘤效力。
将表达大鼠Her-2(rHer-2)肿瘤相关抗原之异型接合BALB/neuT转基因雌性小鼠皮下植入表达rHer-2之1e6TUBO细胞中，所述细胞来源于BALB/neuT小鼠之自发性乳腺肿瘤。在肿瘤细胞植入后7天之后，每天一次以如图式中所指示之剂量向小鼠经口给予运载体或苹果酸舒尼替尼。在起始苹果酸舒尼替尼疗法之后3天，用包含以下之疗法使小鼠免疫：(a)表达不表达于肿瘤或小鼠中之抗原的对照疫苗；或(b)表达SEQID NO:54之大鼠Her-2抗原(rHER2)的DNA癌症疫苗构建体，该抗原表达于肿瘤及小鼠中。通过每周两次量测皮下TUBO肿瘤之长直径(a)及短直径(b)且根据a×b2×0.5mm3计算体积来分析肿瘤生长速度。得自各处理组10小鼠的肿瘤体积之平均值及平均值之标准误差针对肿瘤植入后天数作图。
结果。图32显示评估并比较苹果酸舒尼替尼作为单一疗法或与DNA癌症疫苗组合处理后之皮下肿瘤生长速率的代表性研究之结果。虽然接受DNA癌症疫苗(rHER2：肌肉内注射1e9V.P.、表达rHer-2之腺病毒，随后为每两周两次通过PMED致动施用表达rHer-2之DNA)之小鼠的肿瘤继续快速生长，但接受20mg/kg或40mg/kg剂量之苹果酸舒尼替尼与对照疫苗(对照：肌肉内注射1e9V.P.、表达eGFP之腺病毒，随后为每两周两次通过PMED致动施用表达HBV核心抗原之DNA)之小鼠肿瘤的肿瘤生长速率显著降低，其中与40mg/kg剂量相比，20mg/kg显示次最佳效力。然而当癌症疫苗与20mg/kg之次最佳剂量之苹果酸舒尼替尼共同施用时，肿瘤生长的生长速率比经相同剂量之苹果酸舒尼替尼与对照疫苗共同施用于所处理之小鼠慢得多且与经较高剂量之苹果酸舒尼替尼处理之小鼠类似。癌症疫苗使接受次最佳剂量之苹果酸舒尼替尼的小鼠得到额外治疗效益。
图33A至33D显示代表性研究之小鼠个别肿瘤生长速率，此研究系评估并比较20mg/kg苹果酸舒尼替尼与对照物(对照)或DNA癌症疫苗(rHER2)之抗肿瘤效力。简言之，在肿瘤细胞植入后7天之后，每处理组之十只小鼠每日经口给予运载体或20mg/kg苹果酸舒尼替尼(索坦(Sutent))，持续34天。在起始索坦(Sutent)给药之后3天，起始一系列免疫(通过腺病毒初始免疫，随后通过PMED)，该系列免疫在中止索坦(Sutent)疗法之后继续。具体而言，小鼠用对照疫苗免疫，包含肌肉内注射1e9V.P.、表达eGFP之腺病毒，随后为每两周两次(两次9天)及每周四次通过PMED致动施用表达HBV核心及表面抗原之DNA；或用改为包含表达rHer-2之腺病毒及DNA之癌症疫苗免疫。接受运载体与对照疫苗之动物的肿瘤在第7天左右变得可量测且继续生长，在肿瘤植入50天之后达到2000mm3。接受索坦(Sutent)与对照疫苗之动物的肿瘤生长显著削弱，直至中止索坦(Sutent)疗法为止。肿瘤在中止索坦(Sutent)之后即刻显示快速生长速率，大多数在肿瘤植入50天之后达到2000mm3。仅接受癌症疫苗接种之动物的肿瘤生长速率适当慢于未接受癌症疫苗或索坦(Sutent)之动物。癌症疫苗与索坦(Sutent)之组合不仅在索坦(Sutent)治疗期间抑制肿瘤生长(图33)，而且在中止索坦(Sutent)治疗之后在60％动物中显著削弱肿瘤进展。
图34显示图2B中所述研究之小鼠群组之卡普兰-麦尔存活曲线，此研究系评估索坦(Sutent)与对照物(对照)或癌症疫苗(rHER2)之抗肿瘤效力。当肿瘤体积达到2000mm3时，根据IAUCUC准则将小鼠处死。与经运载体及对照疫苗处理、在无索坦(Sutent)的情况下经癌症疫苗处理或在无癌症疫苗的情况下经索坦(Sutent)处理之小鼠相比，仅经索坦(Sutent)(20mg/kg)及癌症疫苗处理之小鼠显示显著延长之存活时间(*P<0.01，对数排序检验(Log-rank Test))。图35A至35D显示图2B中之经处理小鼠的周边血液中骨髓源抑制细胞(Gr1+CD11b+)及含Treg之CD25+CD4+细胞之百分比。简言之，将PBMC染色且通过流式细胞术分析各组五只小鼠在第27天(索坦(Sutent)或运载体处理起始后20天)之下颌下血液中的Gr1、CD11b、CD3、CD4及CD25之表达。显示各处理组之平均值及平均值之标准误差。与未接受索坦(Sutent)、亦未接受癌症疫苗(运载体+对照物)之小鼠相比，在通过索坦(Sutent)与对照或癌症疫苗处理之小鼠中观察到骨髓源抑制细胞％存在统计上显著之降低。然而，与在无索坦(Sutent)之情况下经癌症疫苗处理(运载体+rHER2)或在无癌症疫苗之情况下经索坦(Sutent)处理(索坦(Sutent)+对照物)之小鼠相比，在经索坦(Sutent)与癌症疫苗组合(索坦(Sutent)+rHER2)处理之小鼠中观察到显著较低之骨髓源抑制细胞。观察到索坦(Sutent)与癌症疫苗使CD4群体中之含Treg之CD25+CD4+T细胞出现统计上显著之减少。与在无索坦(Sutent)之情况下经癌症疫苗处理或在无癌症疫苗之情况下经索坦(Sutent)处理之小鼠相比，此等小鼠血液中之CD4群体中含Treg之CD25+CD4+T细胞之％显著较低。*指示P<0.05(通过Stutent’s T检验法)。
图36A至36C显示自小鼠肿瘤中分离的骨髓源抑制细胞(Gr1+CD11b+)、Tregs(CD4+CD25+Foxp3+)及PD-1+CD8T细胞之总数。简言之，在植入TUBO细胞之后3天以20mg/kg向小鼠施用单一每日经口剂量之运载体或索坦(Sutent)，持续28天。相同小鼠用对照疫苗免疫，包含肌肉内注射1e9V.P.、表达eGFP之腺病毒，随后为每两周两次施用通过PMED递送之表达HBV核心抗原之DNA；或用包含表达rHer-2之腺病毒及DNA之癌症疫苗免疫。在邻近右侧腹股沟引流淋巴结处利用PMED施用皮内注射50μg CpG(PF-03512676)。在第二次PMED及CpG施用之后7天，自每处理组之6只小鼠中分离个别肿瘤。由分离之皮下肿瘤制备之单一细胞悬浮液通过Gr1、Cd11b、CD3、CD8、CD25、FoxP3及PD-1特异性抗体染色且通过流式细胞术加以分析。对每μg各处理组肿瘤中的如图所示之特定细胞总数之平均值及平均值之标准误差作图。(*指示P<0.05，Stutent’s T检验法)。虽然向小鼠给予癌症疫苗(A及B)时与接受对照疫苗之小鼠(A及B)相比在肿瘤中发现之免疫抑制Treg或MDSC之频率无显著差异，但用索坦(Sutent)处理小鼠(A及B)时与仅接受癌症疫苗之小鼠相比观察到显著降低。与接受癌症疫苗之小鼠(C)相比，在经索坦(Sutent)处理之小鼠(C)中亦观察到PD-1+CD8T细胞减少。总而言之，此等数据显示减少Treg、MDSC或CD8+PD-1+T细胞之药剂与疫苗之组合有利于降低携带肿瘤之动物的肿瘤负荷。
实施例12.疫苗与舒尼替尼及抗CTLA-4抗体之组合的抗癌症效力
研究癌症疫苗与舒尼替尼及抗CTLA-4单克隆抗体(克隆9D9)之组合在携带皮下TUBO肿瘤之BALB/neuT小鼠中的抗肿瘤效力。
研究程序。简言之，每日以20mg/kg向各组十只小鼠经口给予运载体或苹果酸舒尼替尼，在肿瘤植入后第10天开始直至第64天为止。在第13天起始接种不编码抗原(对照疫苗)或SEQ ID NO:54之大鼠Her-2抗原(癌症疫苗)的DNA构建体作为腺病毒载体，随后利用DNA进行各别抗原(HBV抗原或rHer-2)之每周两次免疫、每两周两次免疫及每周七次免疫。在PMED注射后第20、27、41、55、62、69、76、83、90及97天将经抗鼠类CTLA-4单克隆抗体处理之小鼠群组(实心圆及空心三角形)经腹膜内注射250μg抗体。
结果。图37显示代表性研究之小鼠群组的卡普兰-麦尔存活曲线，此研究系评估舒尼替尼及抗鼠类CTLA-4单克隆抗体(克隆9D9)与癌症疫苗之组合的抗肿瘤效力。在经索坦(Sutent)与对照疫苗(空心圆)、抗鼠类CTLA-4单克隆抗体(空心三角形)或癌症疫苗(实心三角形)处理之小鼠中观察到存活时间延长。在经索坦(Sutent)及癌症疫苗与抗鼠类CTLA-4之组合处理之小鼠(实心圆)中观察到存活时间进一步延长。通过对数排序检验来计算P值。
实施例13.舒尼替尼之全身性暴露及抗癌症疫苗与低剂量舒尼替尼之组合的抗癌症效力
舒尼替尼全身性暴露研究。
研究舒尼替尼在具有皮下TUBO肿瘤之BALB/neuT小鼠中的血液动力学。简言之，在肿瘤植入之后6天每天一次(SID)以20mg/kg或以6小时间隔每天两次(BID)以10mg/kg向各处理组之20只小鼠经口施用索坦(Sutent)。在索坦(Sutent)给予之后在如所指示之若干个时间点(0、2、4、6、8、10、12及24小时)将来自2至3只小鼠之下颌下血液收集于肝素锂管中。在×1000g下离心15分钟之后自管中回收血浆上层清液，且通过LC/MS/MS量测血浆样品之舒尼替尼含量。将各组在各时间点之平均值及平均值之标准误差作图。
结果呈现于图38中。将各组在各时间点之平均值及平均值之标准误差作图。水平点划线标记单一治法中有效抑制肿瘤生长所必需之最小舒尼替尼血液含量50ng/ml(Mendel,D.等人,“In vivo antitumor activity ofSU11248,a novel tyrosine kinase inhibitor targeting vascular endothelialgrowth factor and platelet-derived growth factor receptors:determination of apharmacokinetic/pharmacodynamic relationship”.Clinical Cancer Research,203,9:327-337)。如所示，接受20mg/kg SID或10mg/kg BID之小鼠的血液舒尼替尼含量仅在24小时内短暂维持50ng/ml之可有效抑制肿瘤生长之目标有效剂量。20mg/kg SID群组之血液含量在2小时达到高于50ng/ml之峰值，在6小时下降至50ng/ml且在索坦(Sutent)给予后12小时自血液中清除。接受10mg/kg BID之群组中的含量在2小时时达到高于50ng/ml之峰值，但在4小时时快速下降至低于50ng/ml，在第二剂量后2小时再次达到峰值。在4小时时含量快速下降至50ng/ml，且在第二剂量之后18小时自血液中清除。尽管利用每日两次给药疗法，但接受10mg/kg之动物仍显示比20mg/kg单一每日给药疗法更短的目标浓度下暴露持续时间。
抗肿瘤效力研究。
研究长期施用低剂量舒尼替尼与抗癌症疫苗之组合在具有皮下TUBO肿瘤之BALB/neuT小鼠中的抗肿瘤效力。简言之，小鼠以20mg/kg SID持续31天或以10mg/kg BID持续104天给予苹果酸舒尼替尼(索坦(Sutent))，且接受对照疫苗或癌症疫苗。不递送抗原之对照疫苗及递送SEQ ID NO:54之大鼠her-2抗原(rHer-2)之癌症疫苗在第9天通过腺病毒给予，随后为每两周五次通过PMED施用分别递送HBV抗原或rHer-2之DNA。
结果呈现于图39中。虽然癌症疫苗改良施用20mg/kg索坦(Sutent)之小鼠的存活时间，但施用10mg/kg索坦(Sutent)之小鼠的存活时间甚至存在显著改良(*P＝0.05，对数排序检验)。
实施例14.CPG或CD40激动剂对癌症疫苗诱导之免疫反应的影响
BALB/c小鼠之免疫原性研究
在BALB/c小鼠中研究局部施用免疫调节剂对癌症诱导之抗原特异性免疫反应之量值及质量的影响，其中通过使用IFNγELISPOT分析或细胞内细胞因子染色分析量测rHER2特异性T细胞反应来评估免疫反应。简言之，利用编码rHER2抗原序列(SEQ ID NO:54)之DNA质粒表达构建体通过PMED递送系统使如所指示之每组4至6只雌性BALB/c小鼠免疫。通过在PMED刺激之后随后在邻近疫苗引流腹股沟淋巴结处皮内注射而局部施用免疫调节剂CpG7909(PF-03512676)及抗CD40单克隆促效抗体。通过IFNγELISPOT或细胞内细胞因子染色分析根据下文所述之程序来量测抗原特异性T细胞反应。
细胞内细胞因子染色(ICS)分析
通过ICS分析量测自个别动物分离之脾细胞或PBMC的rHer-2特异性多功能(多细胞因子阳性)T细胞免疫反应。通常，将1e6脾细胞与1μg/ml布雷菲德菌素A(Brefeldin A)及10μg/ml肽刺激剂(rHer-2特异性CD8p66、rHer-2特异性CD4p169或无关HBV p87)一起在37℃下在5％CO2培育箱中培育5小时。在刺激之后，洗涤脾细胞且在4℃下用Fcγ阻断剂(抗小鼠CD16/CD32)阻断10分钟，随后用Live/dead aqua染色剂抗小鼠CD3ePE-Cy7、抗小鼠CD8a太平洋蓝(Pacific blue)及抗小鼠CD45R/B220PerCP-Cy5.5染色20分钟。洗涤细胞，在4℃下用4％三聚甲醛固定隔夜，在室温下用BD固定/渗透溶液渗透30分钟且与抗小鼠IFNγAPC、抗小鼠TNFαAlexa488及抗小鼠IL-2PE一起在室温下培育30分钟。洗涤细胞且获取20,000个CD4或CD8T细胞以供通过流式细胞术加以分析。通过自疫苗特异性反应中减去对无关肽HBV之rHer-2特异性反应来计算各动物之抗原特异性单、双或三重细胞因子阳性T细胞总数/总脾脏，且相对于对自脾脏分离之脾细胞总数归一化。
IFNγELISPOT分析结果
图40显示代表性研究之小鼠群组的IFNγELISPOT结果，此研究系评估rHER2疫苗与所示免疫调节剂一起施用时所诱导之抗原特异性T细胞反应之量值。简言之，通过PMED利用编码rHER2抗原序列(SEQ IDNO:54)之DNA质粒表达构建体将每处理组之各小鼠(n＝4)免疫，随后即刻如所指示施用100μg对照大鼠IgG单克隆抗体(Bioxcell#BE0089：对照mAb)或50μg CpG7909或100μg抗CD40单克隆抗体(Bioxcell#BE0016-2：a-CD40mAb)。在PMED致动之后7天通过对以10μg/ml浓度与对照或rHer-2特异性p66肽混合的5e5脾细胞之IFNγELISPOT分析来量测抗原特异性免疫反应。根据个别动物之ELISPOT结果计算含1e5CD8T细胞之脾细胞的总IFNγ分泌细胞数目，且将脾细胞中之CD8T细胞之％及各组之平均值及标准平均值误差作图。如所示，与接受对照抗体之小鼠相比，CpG7909及抗CD40单克隆抗体均显著增强rHer-2DNA所诱导之抗原特异性免疫反应之量值。
细胞内细胞因子染色(ICS)分析结果。图41A及41B显示通过细胞内细胞因子染色分析针对疫苗诱导之免疫反应之质量评估CpG 7909之免疫调节活性的代表性研究之结果。简言之，以4周间隔利用通过PMED递送之编码rHER2抗原序列(SEQ ID NO:54)之DNA质粒表达构建体将各动物免疫两次。在通过PMED进行两次DNA免疫之后即刻在邻近右侧疫苗引流腹股沟淋巴结处将各组小鼠(n＝5)皮内注射PBS(PMED组)或50μg CpG7909(PMED+CpG组)。在通过PMED进行最后一次免疫之后7天，对自各个别小鼠分离之脾细胞进行ICS分析以侦测分泌IFNγ、TNFα及/或IL-2之抗原特异性多功能CD8或CD4T细胞。与PBS相比，侦测到经局部递送CpG 7909处理之小鼠中的rHer-2特异性多细胞因子阳性CD8及CD4T细胞反应显著增加。与PBS相比，在接受局部递送之CpG7909施用的动物中观察到单一细胞因子阳性CD8群体增加(*指示P<0.05，Stutent’s T检验法)。
图42A及42B显示通过细胞内细胞因子染色分析、针对疫苗诱导之免疫反应之质量来评估促效抗CD40单克隆抗体之免疫调节活性的代表性研究之结果。简言之，以4周间隔利用通过PMED递送之编码rHER2抗原序列(SEQ ID NO:54)之DNA质粒表达构建体将各动物免疫两次。在通过PMED施用第一次免疫之后1天，在邻近右侧疫苗引流腹股沟淋巴结处将各组小鼠(n＝6)皮内注射100μg同型IgG对照(PMED与IgG)或抗CD40单克隆抗体(PMED与aCD40)。在最后一次PMED之后7天，对自各个别小鼠分离之脾细胞进行ICS分析以侦测分泌IFNγ、TNFα及/或IL-2之rHer-2特异性多功能CD8或CD4T细胞。与同型IgG对照相比，在经局部递送之抗CD40单克隆抗体处理之小鼠中侦测到rHer-2特异性三重细胞因子阳性CD8及CD4T细胞反应显著增加。局部施用抗CD40单克隆抗体亦显著增加rHer-2特异性单一及双重细胞因子阳性CD4T细胞(*指示P<0.05，Stutent’s T检验法)。
实施例15.癌症疫苗与低剂量舒尼替尼之组合的抗癌症效力
研究抗癌症疫苗与低剂量舒尼替尼之组合在具有自发性乳腺垫肿瘤之BALB/neuT小鼠中的抗肿瘤效力。
动物处理。简言之，每天两次向13至14周龄雌性小鼠经口施用5mg/kg苹果酸舒尼替尼(索坦(Sutent))，持续112天。在第3天通过腺病毒注射施用不递送抗原之对照疫苗及递送SEQ ID NO:54之大鼠Her-2抗原(rHer-2)之癌症疫苗作为初始免疫，随后每两周7次通过PMED施用分别递送HBV抗原(对照疫苗)或rHer-2(癌症疫苗)之DNA。当所有10个乳腺垫均变成肿瘤阳性时或当任何乳腺肿瘤之体积达到2000mm3时测定存活终点。结果呈现于图43中。
结果。与先前公开之索坦(Sutent)药物动力学分布(Mendel,D.,Laird,D.等人,“In vivo antitumor activity of SU11248,a novel tyrosine kinaseinhibitor targeting vascular endothelial growth factor and platelet-derivedgrowth factor receptors:determination of a pharmacokinetic/pharmacodynamic relationship”.Clinical Cancer Research,203,9:327-337)及先前资料(图38)相比，预期每天两次给予5mg/kg索坦(Sutent)之小鼠中的索坦(Sutent)之CMax显著低于在小鼠及人类中达成有效抗肿瘤效力所必需之最小血液含量。数据显示经低剂量索坦(Sutent)单一疗法处理之小鼠之存活率出现快速而短暂之改良。然而，当与癌症疫苗一起施用时，观察到存活率之更持续且显著之改良(P<0.0001，对数排序检验)。
实施例16.通过局部施用CPG来增强疫苗诱导之免疫反应
在猴研究中研究局部施用CpG(PF-03512676)对本发明所提供之人类PSMA核酸诱导之免疫反应的免疫增强作用，其中通过使用IFNγELISPOT分析量测PSMA特异性T细胞反应来评估免疫反应。
动物处理及样品收集。利用通过电穿孔递送之编码经修饰之人类PSMA抗原之质粒DNA(SEQ ID NO:1之氨基酸15-750)将6组、每测试组6只(1至6号)中国食蟹猴免疫。简言之，所有动物均在第0天接受双侧肌肉内注射5mg质粒DNA，随后电穿孔(DNA EP)。随后，刚好在电穿孔之后，第2组在邻近DNA注射部位处接受双侧肌肉内注射与1mg矾混合之2mg CpG。第3组及第4组分别在第0天或第3天接受在无矾之情况下在邻近DNA注射部位处递送之2mg CpG之双侧肌肉内注射。第5组在第3天接受在邻近疫苗引流腹股沟淋巴结处递送之2mg双侧皮内注射CpG。第6组在第0天接受与共同电穿孔于肌肉中之DNA溶液混合之200μg CpG之双侧注射。
IFNγELISPOT分析程序。在DNA免疫之后15天自各动物收集周边血液样品。自血液样品分离周边血液单核细胞(PBMC)且进行IFNγELISPOT分析以量测PSMA特异性T细胞反应。简言之，将来自个别动物之4e5PBMC与PSMA特异性肽或非特异性对照肽集合(人类HER2肽集合)一起各自以2μg/ml涂于IFNγELISPOT培养盘中之每孔。各PSMA特异性肽集合之组成提供于表1A中。在37℃及5％CO2下将培养盘培育16小时，且洗涤且在培育之后根据制造商说明书显色。通过CTL读数器对IFNγ斑点形成细胞(SFC)之数目进行计数。各条件以一式两份进行。代表性实验之结果呈现于表1B中。所报导之PSMA特异性反应系通过自PSMA肽集合之SFC平均数减去非特异性对照肽(人类HER2肽集合)之SFC平均数来计算且相对于在1e6PBMC下所观察之SFC归一化。^指示计数因为斑点数目过多以致无法计数而不准确。ND指示未测得。
结果。表28显示代表性IFNγELISPOT分析的结果，此分析系评估并比较疫苗在肌肉内(第2组、第3组、第4组及第5组)或皮内注射(第6组)局部给予之CpG(PF-03512676)不存在(第1组)或存在下诱导之IFNγT细胞反应。表1B中之此等结果绘制于图1中。如表1B及图1中所示，在CpG(PF-03512676)不存在下，在所有6只动物(第1组)中针对多个PSMA特异性肽集合侦测PSMA特异性IFNγT细胞反应。在DNA电穿孔之后3天通过肌肉内(第4组：3/6)或皮内(第5组：2/6)注射而另外接受CpG(PF-03512676)的一些动物中，所量测之针对PSMA肽之总反应适当较高。然而，当在同一天刚好在电穿孔之后随后递送CpG(第2组及第3组)时，若干动物未能产生较高反应(第2组：4/6；及第3组：3/6)，无论是与明矾混合或是未与明矾混合。然而，当低10倍剂量之CpG与DNA溶液一起共同电穿孔于肌肉中(第6组)时，在4/6动物中侦测到较高净反应，与未接受CpG之动物(第1组)相比，对肽集合H1及R1具有统计上较高之反应(P<0.05)。数据显示，当共同电穿孔于肌肉中时，低剂量CpG可有效增强DNA疫苗诱导之IFNγT细胞反应。
表28.在DNA电穿孔之后15天通过PBMC之IFNγELISPOT分析量测DNA疫苗在CpG(第2组、第3组、第4组、第5组及第6组)不存在(第1组)或存在下诱导之PSMA特异性IFNγT细胞反应
实施例17.通过局部施用抗CTLA-4抗体增强疫苗诱导之免疫反应
在猴研究中研究低剂量皮下施用抗CTLA-4单克隆抗体(CP-675,206)对恒河猴PSMA核酸所诱导之免疫反应的效应，其中通过使用IFNγELISPOT分析量测PSMA特异性T细胞反应来评估免疫反应。本研究中所使用之恒河猴PSMA核酸具有如SEQ ID NO:56)中所述之序列且编码SEQID NO:55之免疫原性PSMA多肽。
动物处理及样品收集。利用通过双侧肌肉内注射(2×5e10V.P.)递送之编码经修饰恒河猴PSMA多肽之腺病毒将五组、每测试组七(1至7号)只雄性印度恒河猴免疫。在腺病毒注射之后即刻使第1组接受运载体，且第2组至第4组在邻近疫苗引流淋巴结处分别以2×25mg、2×16.7mg及2×8.4mg之剂量接受双侧皮下注射抗CTLA-4抗体(CP-675,206)。
在免疫之后9天，自各动物分离周边血液单核细胞(PBMC)且进行IFNγELISPOT分析以量测恒河猴PSMA特异性T细胞反应。简言之，将来自个别动物之4e5PBMC与恒河猴PSMA特异性肽集合(表24A中所定义之P1、P2、P3或R1+R2)或非特异性对照肽集合(人类HER2肽集合)一起各自以2μg/ml涂于IFNγELISPOT培养盘中之每孔。在37℃及5％CO2下将培养盘培育16小时，且洗涤且在培育之后根据制造商说明书显色。通过CTL读数器对IFNγ斑点形成细胞(SFC)之数目进行计数。各条件以一式两份进行。将恒河猴PSMA特异性肽集合之背景经调节之SFC之一式两份之平均值相对于1e6PBMC中之反应归一化。来自各个别动物之对肽集合之个别反应及总反应呈现于表29中。
IFNγELISPOT分析程序。在4℃下将IFNγ特异性捕捉抗体(BDBioscience，#51-2525kc)涂于微量培养盘中之聚偏二氟乙烯(PVDF)膜上隔夜。用血清/蛋白质阻断培养盘以防止抗体之非特异性结合。在阻断之后，将效应细胞(诸如自免疫小鼠分离之脾细胞或自恒河猴分离之PBMC)及标靶(诸如来自肽文库之PSMA肽、经抗原特异性肽脉冲之标靶细胞或表达相关抗原之肿瘤细胞)添加至孔中且在37℃下在5％CO2培育箱中培育隔夜。通过PVDF膜表面上之涂布抗体来捕捉效应细胞所分泌之细胞因子。在移除细胞及培养基之后，将100μl经生物素标记之多株抗人类IFNγ抗体添加至各孔中以供侦测。通过根据制造商(Mabtech)方案添加抗生蛋白链菌素-辣根过氧化酶及沈淀受质3-氨基-9-乙基咔唑(AEC)以产生红色斑点来显现斑点。各斑点代表产生单一细胞因子之T细胞。
结果。表29显示代表性IFNγELISPOT分析的结果，此分析系比较疫苗在抗CTLA-4单克隆抗体(CP-675,206)不存在(第1组)或存在(第2组至第4组)下诱导之T细胞反应，抗CTLA-4单克隆抗体系通过在邻近疫苗引流淋巴结处皮下注射来局部施用。疫苗产生免疫反应(第1组)，该免疫反应因局部施用50mg剂量(第2组，P＝0.001，使用低估值之Stutent’s T检验法)之抗CTLA-4抗体(CP-675,206)而显著增强。该反应亦分别因33.4mg(第3组：P＝0.004，使用低估值之Stutent’s T检验法)及16.7mg(第4组：P＝0.05，Stutent’s T检验法)之低剂量抗CTLA-4抗体而显著增强。资料表明通过皮下注射递送之低剂量抗CTLA-4可显著增强疫苗诱导之免疫反应。
表29.疫苗在皮下注射之抗CTLA-4抗体(CP-675,206)不存在(第1组)或存在下诱导之IFNγT细胞反应。^指示计数由于较高斑点数目而被低估。TNTC指的是过多以致无法计数。
实施例18.低剂量舒尼替尼对骨髓源抑制细胞产生免疫调节作用
提供以下实施例以说明低剂量舒尼替尼在非肿瘤小鼠模型中对骨髓源抑制细胞(MDSC)的活体内免疫调节作用。
研究程序。
为产生MDSC增浓之脾细胞，将TUBO细胞(1×106)植入5只BALB/neuT小鼠之侧腹中且经约20至30天，直至肿瘤体积达到1000至1500mm3为止。接着将小鼠处死，移除脾脏且回收MDSC增浓之脾细胞。用5μM CFSE将脾细胞标记10分钟，用PBS洗涤且计数。随后使经标记之细胞以5×107个脾细胞/毫升再悬浮于PBS溶液中，且经由尾静脉静脉内注射而接受性转移至未处理BALB/c接受小鼠中。在接受性转移前3天，开始每日两次以5mg/kg、10mg/kg及20mg/kg向接受小鼠给予运载体或苹果酸舒尼替尼(索坦(Sutent))。在接受性转移之后，接受小鼠继续接受每日两次给予运载体或舒尼替尼，再持续两天，该时间点之后将小鼠处死，移除脾脏，收集脾细胞且加以处理以供表型分析。
对脾细胞进行计数且以5×106个细胞/毫升再悬浮于FACS染色缓冲液(PBS、0.2％(w/v)牛血清白蛋白及0.02％(w/v)迭氮化钠)中。对于脾细胞之流式细胞术染色，首先在4℃下将2.5×106个细胞与CD16/CD32之抗体培育10分钟以阻断Fc受体且将非特异性结合减至最少。接着在4℃下用针对鼠类细胞表面标记物之适当荧光团结合抗体(Biolegend)将脾细胞染色20分钟。对于T细胞(抗CD3(太平洋蓝)，克隆17A2)及MDSC(抗GR-1(APC)，克隆RB6-8C5及抗CD11b(PerCp Cy5.5)，克隆M1/70)，亦包括活/死染色剂。在抗体培育之后，用2ml FACS缓冲液洗涤经染色之脾细胞，通过离心形成集结粒且再悬浮于0.2ml FACS缓冲液中，接着在BDCANTO II流式细胞仪上获取资料。为监测舒尼替尼或运载体对接受性转移之MDSC存活率的影响，计算活单态闸中CFSE+,CD3-,GR1+,CD11b+之百分比。接着通过计算实际细胞数目占总脾细胞计数之百分比来确定每个脾脏之接受性转移之MDSC数目。通过FloJo及Graph pad软件来分析数据。
结果。表31中所呈现之资料表示接受性转移后2天来自每日两次给予运载体或5mg/kg、10mg/kg及20mg/kg舒尼替尼之小鼠的每个脾脏(n＝7/组)回收之接受性转移之CSFE+,CD3-,GR1+,CD11b+细胞之平均数目。数据显示，即使当给予低达5mg/kg时，每日两次给予舒尼替尼亦对MDSC具有活体内免疫调节作用，引起回收数目存在统计上显著之降低(与经运载体处理之对照组相比)。
表31.自每组7只小鼠之脾脏回收之CFSE+,CD3-,GR1+,CD11b+MDSC之平均数目及相应标准误差。通过单向ANOVA使用邓奈特氏多重比较检验(Dunnett's multiple comparison test)比较给予舒尼替尼之群组相对于0mg/kg(运载体)群组来确定统计显著性。
实施例19.三抗原腺病毒及DNA构建体之免疫原性
提供以下实施例以说明表达本发明所提供之三种抗原PSMA、PSCA及PSA之三抗原疫苗构建体(呈腺病毒载体或DNA质粒形式)在非人类灵长类动物中引发针对所有三种编码抗原之特异性T细胞反应的能力。
活体内研究程序。在初始免疫后9天将本发明所提供之各自表达三种抗原(PSMA、PSCA及PSA)之五种腺病毒载体(Ad-733、Ad-734、Ad-735、Ad-796及Ad-809)的T细胞免疫原性与各自仅表达单一抗原(PSMA、PSA或PSCA)之三种腺病毒载体之混合物相比较。评估针对表达单一抗原之单一腺病毒(第1组至第3组)的反应以显示特异性。简言之，将印度恒河猴(对于第1组及第3组，n＝6；对于第2组，n＝7；且对于第4组至第9组，n＝8)肌肉内注射总计1e11V.P.，随后在同一天皮内注射10mg/kg抗CTLA-4。在注射之后9天，自各动物分离周边血液单核细胞(PBMC)且进行IFNγELISPOT分析以量测PSMA、PSA及PSCA特异性T细胞反应。
在腺病毒及抗CTLA-4注射之后13周，当已建立T细胞反应时，猴接受通过电穿孔递送之DNA疫苗增强免疫(第1组：PSMA、质粒5166；第2组：PSA、质粒5297；第3组：PSCA、质粒5259；第4组：PSMA、PSA及PSCA、质粒5166、5259及5297之混合物；第4组：质粒457；第6组：质粒458；第7组：质粒459；第8组：质粒796；及第9组：质粒809)。总之，各动物接受总计5mg本发明所提供之质粒DNA，由此递送初始免疫中所使用之腺病毒中所编码之相同表达盒。在增强免疫接种之后9天，自各动物分离周边血液单核细胞(PBMC)且进行IFNγELISPOT分析。
IFNγELISPOT分析。简言之，将来自个别动物之4e5PBMC与PSMA特异性肽集合P1、P2、P3或H1及H2(表24A)、PSA特异性集合1或2(表25)、PSCA特异性集合(表26)或非特异性对照肽(人类HER2肽集合)一起各自以2μg/ml涂于IFNγELISPOT培养盘中之每孔。在37℃及5％CO2下将培养盘培育16小时，且洗涤且在培育之后根据制造商说明书显色。通过CTL读数器对IFNγ斑点形成细胞(SFC)之数目进行计数。各条件以一式两份进行。将抗原特异性肽集合之背景经调节之SFC之一式两份之平均值相对于1e6PBMC中之反应归一化。表中之抗原特异性反应呈现针对相应抗原特异性肽或肽集合之反应的总和。
结果：表27代表通过IFNγELISPOT评估与各自表达单一抗原之三种腺病毒之混合物相比各自表达所有三种抗原之五种不同腺病毒在印度恒河猴中之T细胞免疫原性的研究。仅接受Ad-PSMA(第1组)注射之动物大部分诱导对PSMA但不对PSA或PSCA具有特异性之反应(Stutent’s T检验法，P<0.03。优先诱导针对PSCA之反应的一只动物(#4)自统计分析中剔除)。仅接受Ad-PSA注射(第2组)之动物诱导对PSA但不对PSMA或PSCA具有特异性之反应(Stutent’s T检验法，P<0.02)。仅接受Ad-PSCA注射(第3组)之动物诱导对PSCA但不对PSMA或PSA具有特异性之反应(Stutent’sT检验法，P<0.03)。所有五种三抗原表达腺病毒载体(第5组至第9组)均诱导针对所有三种抗原之IFNγT细胞反应，该T细胞反应之量值因动物而各异。三抗原表达腺病毒诱导之PSCA反应之量值类似于个别载体之混合物(第4组)。然而，Ad-809(第9组)诱导之PSMA反应及Ad-796(第8组)诱导之PSA反应的量值各自分别显著优于混合物(Stutent’s T检验法，P＝0.04及P＝0.02)。此等结果指示，在非人类灵长类动物中，相对于接种个别腺病毒混合物，接种表达三种抗原之腺病毒可引发等效或优良T细胞免疫反应。
表28显示代表性研究之IFNγELISPOT结果，此研究系评估通过腺病毒初始免疫与抗CTLA-4之组合随后进行相应质粒DNA之电穿孔增强免疫递送之本发明所提供之五种不同三抗原表达盒之免疫原性。将免疫反应与类似地通过腺病毒初始免疫与抗CTLA-4及DNA电穿孔增强免疫免疫递送之表达单一抗原之三种构建体之混合物相比较。
仅接受Ad-PSMA与抗CTLA-4及随后之质粒-PSMA(第1组)免疫的所有动物均诱导对PSMA但不对PSA或PSCA具有特异性之反应。类似地，仅接受Ad-PSA与抗CTLA-4及随后之质粒-PSA免疫(第2组)的所有动物均诱导对PSA但不对PSMA或PSCA具有特异性之反应，且最终仅接受Ad-PSCA与抗CTLA-4及随后之质粒-PSCA(第3组)免疫的所有动物均诱导对PSCA但不对PSMA或PSA具有特异性之反应(Stutent’s T检验法，P<0.01)。
已用三抗原表达载体(第5组至第9组)或混合物(第4组)免疫之所有动物均诱导针对所有三种抗原之IFNγT细胞反应。所侦测之PSCA或PSA特异性IFNγT细胞之频率在所有此等群组(第4组至第9组)中分别相似。然而，接受三抗原表达载体接种之构建体第7组及第9组与三种表达单一抗原之构建体之混合物相比产生显著较高频率之PSMA反应。此等结果指示，在非人类灵长类动物中，相对于表达单一抗原之腺病毒及DNA之混合物，在一个盒中表达三种抗原之腺病毒及DNA疫苗可引发等效或优良IFNγT细胞反应。
表25.PSA肽集合：显示与来自PSA肽文库之13个氨基酸重叠的15种氨基酸肽之氨基酸位置及序列。
表26.PSCA肽集合：显示与来自PSCA肽文库之13个氨基酸重叠的15种氨基酸肽之氨基酸位置及序列。
表27.通过ELISPOT分析法所分析之在以抗CTLA-4进行腺病毒初始免疫之后，单一抗原(第1组：Ad-PSMA；第2组：Ad-PSA；第3组：Ad-PSCA；第4组：Ad-PSMA、Ad-PSA及Ad-PSCA之混合物)或三抗原表达腺病毒载体(第4组：Ad-733；第6组：Ad-734；第7组：Ad-735；第8组：Ad-796；及第9组：Ad-809)诱导之IFNγT细胞反应。
表28.通过ELISPOT分析法所分析之在以抗CTLA-4进行腺病毒初始免疫及DNA电穿孔增强免疫免疫之后单一抗原(第1组：PSMA；第2组：PSA；第3组：PSCA；第4组：PSMA、PSA及PSCA之混合物)或三抗原表达载体(第5组至第9组)诱导之IFNγT细胞反应。
实施例20.舒尼替尼降低STAT3磷酸化
提供以下实施例以说明舒尼替尼直接抑制STAT3(转录活化因子3之信号转导因子，脾脏中之免疫抑制关键介质)磷酸化之能力。
研究程序。研究索坦(Sutent)在皮下肿瘤小鼠模型中对脾脏中之STAT3之磷酸化状态的急性作用以评估该化合物之直接免疫调节作用。简言之，在10至12周龄雌性BALB/neuT小鼠右侧腹部皮下植入1e6TUBO细胞。在肿瘤植入后42天之后，通过经口管饲法施用20mg/kg索坦(Sutent)。在索坦(Sutent)给药后0、1、3、7及24小时，每个时间点根据IAUCUC准则处死3只动物，且即刻将脾脏瞬间冷冻于液氮中以保持磷酸化状态。将来自雌性BALB/c小鼠之脾脏瞬时冷冻以用作健康小鼠对照。
STAT3分析程序。瞬时冷冻之脾脏以100mg组织/500μL溶解缓冲液(70mM NaCl、50mMβ-甘油磷酸酯、10mM HEPES、1％Triton X-100、100mM Na3VO4、100mM PMSF、1mg/mL抗纤维蛋白溶酶肽)使用polytron组织均质机均质化。在10,000g下将所得消化物离心15分钟。分离上层清液且使用BCA蛋白质分析试剂盒(Pierce,Rockford,Illinois)测定蛋白质浓度。将40微克蛋白质添加至总STAT3(eBioscience，目录号85-86101-11)或磷酸化STAT3(eBioscience，目录号85-86102-11)ELISA试剂盒之各孔中。将任一蛋白质之相对含量与试剂盒中所提供之标准物及独立购买之标准物(Signaling Technologies，目录号9333-S)相比较。
结果。表29显示评估索坦(Sutent)对脾脏中之STAT3之磷酸化状态之影响的代表性STAT分析之结果。通过ELISA，来自健康或携带肿瘤之小鼠之两个脾脏提取物均显示类似STAT3蛋白含量(总STAT3)。然而，与健康BALB/c相比，来自携带肿瘤之小鼠的提取物具有显著较高之磷酸化STAT3含量(Stutent’s T检验法，P<0.001)。在索坦(Sutent)处理后仅1小时，磷酸化程度快速降低至与健康动物类似之程度，且与未经处理之小鼠相比在较低程度维持长达7小时。在24小时，STAT3磷酸化程度完全恢复至索坦(Sutent)处理前之程度。磷酸化动力学反映血液中之循环索坦(Sutent)之含量。脾脏中体现索坦(Sutent)之药物动力学概况之STAT3磷酸化之快速反应表明索坦(Sutent)在携带肿瘤之动物中的直接免疫调节功能。
表29.健康BALB/c小鼠及携带肿瘤之BALB/neuT小鼠在索坦(Sutent)处理之前或之后之多个时间点之磷酸化STAT3及总STAT3之相对含量
原始序列表
SEQ ID NO:1.全长人类PSMA的氨基酸序列
MWNLLHETDSAVATARRPRWLCAGALVLAGGFFLLGFLFGWFIKSSNEATNITPKHNMKAFLDELKAENIKKFLYNFTQIPHLAGTEQNFQLAKQIQSQWKEFGLDSVELAHYDVLLSYPNKTHPNYISIINEDGNEIFNTSLFEPPPPGYENVSDIVPPFSAFSPQGMPEGDLVYVNYARTEDFFKLERDMKINCSGKIVIARYGKVFRGNKVKNAQLAGAKGVILYSDPADYFAPGVKSYPDGWNLPGGGVQRGNILNLNGAGDPLTPGYPANEYAYRRGIAEAVGLPSIPVHPIGYYDAQKLLEKMGGSAPPDSSWRGSLKVPYNVGPGFTGNFSTQKVKMHIHSTNEVTRIYNVIGTLRGAVEPDRYVILGGHRDSWVFGGIDPQSGAAVVHEIVRSFGTLKKEGWRPRRTILFASWDAEEFGLLGSTEWAEENSRLLQERGVAYINADSSIEGNYTLRVDCTPLMYSLVHNLTKELKSPDEGFEGKSLYESWTKKSPSPEFSGMPRISKLGSGNDFEVFFQRLGIASGRARYTKNWETNKFSGYPLYHSVYETYELVEKFYDPMFKYHLTVAQVRGGMVFELANSIVLPFDCRDYAVVLRKYADKIYSISMKHPQEMKTYSVSFDSLFSAVKNFTEIASKFSERLQDFDKSNPIVLRMMNDQLMFLERAFIDPLGLPDRPFYRHVIYAPSSHNKYAGESFPGIYDALFDIESKVDPSKAWGEVKRQIYVAAFTVQAAAETLSEVA
SEQ ID NO:2.编码SEQ ID NO:1之全长人类PSMA的核苷酸序列
atgtggaatctccttcacgaaaccgactcggctgtggccaccgcgcgccgcccgcgctggctgtgcgctggggcgctggtgctggcgggtggcttctttctcctcggcttcctcttcgggtggtttataaaatcctccaatgaagctactaacattactccaaagcataatatgaaagcatttttggatgaattgaaagctgagaacatcaagaagttcttatataattttacacagataccacatttagcaggaacagaacaaaactttcagcttgcaaagcaaattcaatcccagtggaaagaatttggcctggattctgttgagctagcacattatgatgtcctgttgtcctacccaaataagactcatcccaactacatctcaataattaatgaagatggaaatgagattttcaacacatcattatttgaaccacctcctccaggatatgaaaatgtttcggatattgtaccacctttcagtgctttctctcctcaaggaatgccagagggcgatctagtgtatgttaactatgcacgaactgaagacttctttaaattggaacgggacatgaaaatcaattgctctgggaaaattgtaattgccagatatgggaaagttttcagaggaaataaggttaaaaatgcccagctggcaggggccaaaggagtcattctctactccgaccctgctgactactttgctcctggggtgaagtcctatccagatggttggaatcttcctggaggtggtgtccagcgtggaaatatcctaaatctgaatggtgcaggagaccctctcacaccaggttacccagcaaatgaatatgcttataggcgtggaattgcagaggctgttggtcttccaagtattcctgttcatccaattggatactatgatgcacagaagctcctagaaaaaatgggtggctcagcaccaccagatagcagctggagaggaagtctcaaagtgccctacaatgttggacctggctttactggaaacttttctacacaaaaagtcaagatgcacatccactctaccaatgaagtgacaagaatttacaatgtgataggtactctcagaggagcagtggaaccagacagatatgtcattctgggaggtcaccgggactcatgggtgtttggtggtattgaccctcagagtggagcagctgttgttcatgaaattgtgaggagctttggaacactgaaaaaggaagggtggagacctagaagaacaattttgtttgcaagctgggatgcagaagaatttggtcttcttggttctactgagtgggcagaggagaattcaagactccttcaagagcgtggcgtggcttatattaatgctgactcatctatagaaggaaactacactctgagagttgattgtacaccgctgatgtacagcttggtacacaacctaacaaaagagctgaaaagccctgatgaaggctttgaaggcaaatctctttatgaaagttggactaaaaaaagtccttccccagagttcagtggcatgcccaggataagcaaattgggatctggaaatgattttgaggtgttcttccaacgacttggaattgcttcaggcagagcacggtatactaaaaattgggaaacaaacaaattcagcggctatccactgtatcacagtgtctatgaaacatatgagttggtggaaaagttttatgatccaatgtttaaatatcacctcactgtggcccaggttcgaggagggatggtgtttgagctagccaattccatagtgctcccttttgattgtcgagattatgctgtagttttaagaaagtatgctgacaaaatctacagtatttctatgaaacatccacaggaaatgaagacatacagtgtatcatttgattcacttttttctgcagtaaagaattttacagaaattgcttccaagttcagtgagagactccaggactttgacaaaagcaacccaatagtattaagaatgatgaatgatcaactcatgtttctggaaagagcatttattgatccattagggttaccagacaggcctttttataggcatgtcatctatgctccaagcagccacaacaagtatgcaggggagtcattcccaggaatttatgatgctctgtttgatattgaaagcaaagtggacccttccaaggcctggggagaagtgaagagacagatttatgttgcagccttcacagtgcaggcagctgcagagactttgagtgaagtagcc
SEQ ID NO:3.经改组之PSMA抗原1的氨基酸序列
MASARRPRWLCAGALVLAGGFFLLGFLFGWFIKSSSEATNISPQHNVKAFLDEMKAENIKKFLYLFTQIPHLAGTEQNFQLAKQIQAEWKEFGLDSVELAHYDVLLSYPNETHPNYISIIDEDGNEIFNTSLFEPPPPGYENISDVVPPYSAFSPQGMPEGDLVYVNYARTEDFFKLERELKINCSGKILIARYGKVFRGNKVKNAQLAGAKGIILYSDPADYFAPGVKSYPDGWNLPGGGVQRGNVLNLNGAGDPLTPGYPANEYAYRRELAEAVGLPSIPVHPIGYYDAQKLLEKMGGSAPPDSSWKGSLKVPYNVGPGFTGNFSTQKVKMHIHSTNEVTRIYNVIGTIRGAVEPDRYVILGGHRDAWVFGGIDPQSGAAVVHEIVRSFGTLKKKGWRPRRTIIFASWDAEEFGLLGSTEWAEENSRLLQERGVAYINADSSIEGNYTLRVDCTPLMYSLVYNLTKELQSPDEGFEGKSLYESWTKKSPSPEFSGVPRINKLGSGNDFEVFFQRLGIASGRARYTKNWKTNKFSGYPLYHSVYETYELVEKFYDPMFKYHLTVAQVRGGLVFELADSIVLPFDCQDYAVVLRKYADKIYNLAMKHPEELKTYSVSFDSLFSAVKNFTEIASKFNQRLQDFDKNNPLLVRMLNDQLMFLERAFVDPLGLPDRPFYRHVIYAPSSHNKYAGESFPGIYDALFDIESKVDPSKAWGEVKRQIYVAAFTVQAAAETLSEVA
SEQ ID NO:4.编码SEQ ID NO:3之经改组PSMA抗原1的氨基酸序列的核苷酸序列
atggctagcgccagacggcccagatggctgtgcgccggagccctggtgctggccggaggattcttcctgctgggcttcctgttcggctggttcatcaagagcagcagcgaggccaccaacatcagcccccagcacaacgtgaaggcctttctggacgagatgaaggccgagaacatcaagaagtttctgtacctgttcacccagatcccccacctggccggcaccgagcagaacttccagctggccaagcagattcaggctgagtggaaagagttcggcctggacagcgtggagctggcccactacgacgtgctgctgtcctaccccaacgagacacaccccaactacatcagcatcatcgacgaggacggcaacgagattttcaacaccagcctgttcgagccccctccccctggctacgagaacatctccgacgtggtgcccccctacagcgccttcagccctcagggaatgcctgaaggcgacctggtgtacgtgaactacgcccggaccgaggacttcttcaagctggaacgggagctgaagatcaactgcagcggcaagatcctgatcgccagatacggcaaggtgttccggggcaacaaagtgaagaacgcacagctggctggagccaagggcatcatcctgtacagcgaccccgccgactacttcgcccctggcgtgaagtcctaccctgacggctggaacctgcctggcggcggagtgcagcggggcaacgtgctgaacctgaacggagccggcgaccctctgaccccaggctaccccgccaacgagtacgcctaccggcgggagctggccgaagccgtgggcctgcccagcatccccgtgcaccccatcggctactacgacgcccagaaactgctggaaaagatgggcggcagcgcccctcccgacagcagctggaagggcagcctgaaggtgccctacaacgtgggccctggcttcaccggcaacttcagcacccagaaagtgaagatgcacatccacagcaccaacgaagtgacccggatctacaacgtgatcggcaccatcagaggcgccgtggagcccgacagatacgtgatcctgggcggccaccgggacgcctgggtgttcggcggcatcgacccccagagcggagccgccgtggtgcacgagatcgtgcggagcttcggcaccctgaagaagaagggctggcggcccagacggaccatcatcttcgccagctgggacgccgaggaattcggactgctgggctctaccgagtgggccgaggaaaacagcagactgctgcaggaacggggcgtcgcctacatcaacgccgacagctccatcgagggcaactacaccctgcgggtggactgcacccccctgatgtacagcctggtgtacaacctgaccaaagagctgcagagccccgacgagggcttcgagggcaagagcctgtacgagagctggaccaagaagtcccccagccccgagttcagcggcgtgccccggatcaacaagctgggcagcggcaacgacttcgaggtgttcttccagaggctgggcattgccagcggcagagcccggtacaccaagaactggaaaaccaacaagttctccggctaccccctgtaccacagcgtgtacgagacatacgaactggtggagaagttctacgaccccatgttcaagtaccacctgaccgtggcccaggtccggggagggctggtgttcgaactggccgacagcatcgtgctgcccttcgactgccaggactatgctgtggtgctgcggaagtacgccgacaaaatctacaacctggccatgaagcaccccgaggaactgaaaacctacagcgtgtccttcgacagcctgttcagcgccgtgaagaacttcaccgagatcgccagcaagttcaaccagcggctgcaggacttcgacaagaacaaccccctgctggtccggatgctgaacgaccagctgatgttcctggaacgggccttcgtggaccccctgggcctgcctgaccggcccttctaccggcacgtgatctatgcccccagcagccacaacaagtacgctggcgagagcttccccggcatctacgatgccctgttcgacatcgagagcaaggtggaccccagcaaggcctggggcgaagtgaagcggcagatatacgtggccgccttcacagtgcaggccgctgccgagacactgagcgaggtggcc
SEQ ID NO:5.经改组之PSMA抗原2的氨基酸序列
MASARRPRWLCAGALVLAGGFFLLGFLFGWFIKSSSEATNITPQHNVKAFLDELKAENIKKFLYNFTQIPHLAGTEQNFELAKQIQAQWKEFGLDSVELSHYDVLLSYPNETHPNYISIIDEDGNEIFNTSLFEPPPPGYENISDVVPPYSAFSPQGMPEGDLVYVNYARTEDFFKLERDMKINCSGKILIARYGKVFRGNKVKNAQLAGAKGIILYSDPADYFAPGVKSYPDGWNLPGGGVQRGNVLNLNGAGDPLTPGYPANEYAYRRGIAEAVGLPSIPVHPIGYYDAQKLLEKMGGAAPPDSSWKGSLQVPYNVGPGFTGNFSTQKVKMHIHSTNEVTRIYNVIGTLKGAVEPDRYVILGGHRDAWVFGGIDPQSGAAVVHEIVRSFGTLKKKGWRPRRTILFASWDAEEFGLLGSTEWAEENSRLLQERGVAYINADSSIEGNYTLRVDCTPLMYSLVYNLTKELQSPDEGFEGKSLFDSWTEKSPSPEFSGLPRISKLGSGNDFEVFFQRLGIASGRARYTKDWKTSKFSGYPLYHSVYETYELVEKFYDPMFKYHLTVAQVRGGIVFELANSVVLPFDCQDYAVVLKKYADKIYNISMKHPQEMKTYSVSFDSLFSAVKNFTEIASKFNQRLQDFDKNNPILLRMMNDQLMFLERAFIDPLGLPDRPFYRHVIYAPSSHNKYAGESFPGIYDALFDIESKVDPSKAWGEVKRQIYVAAFTVQAAAETLSEVA
SEQ ID NO:6.编码SEQ ID NO:5之经改组PSMA抗原2的氨基酸序列的核苷酸序列
atggctagcgccagacggcccagatggctgtgtgctggcgccctggtgctggctggcggctttttcctgctgggcttcctgttcggctggttcatcaagagcagcagcgaggccaccaacatcaccccccagcacaacgtgaaggcctttctggacgagctgaaggccgagaatatcaagaagttcctgtacaacttcacccagatcccccacctggccggcaccgagcagaacttcgagctggccaagcagatccaggcccagtggaaagagttcggcctggacagcgtggaactgagccactacgacgtgctgctgagctaccccaacgagacacaccccaactacatcagcatcatcgacgaggacggcaacgagattttcaacaccagcctgttcgagccccctccacccggctacgagaacatcagcgacgtggtgcccccctacagcgcattcagtccacagggaatgcccgagggcgacctggtgtacgtgaactacgcccggaccgaggacttcttcaagctggaacgggacatgaagatcaactgcagcggcaagatcctgatcgccagatacggcaaggtgttccggggcaacaaagtgaagaacgcccagctggcaggcgccaagggcatcatcctgtacagcgaccccgccgactacttcgcccctggcgtgaagtcctaccccgacggctggaacctgcctggcggcggagtgcagaggggcaacgtgctgaacctgaacggcgctggcgaccctctgacccctggctaccccgccaacgagtacgcctacagacggggaatcgccgaggccgtgggcctgcctagcatccctgtgcaccccatcggctactacgacgcccagaaactgctggaaaagatgggcggagccgcccctcccgacagctcttggaagggcagcctgcaggtcccctacaacgtgggccctggcttcaccggcaacttcagcacccagaaagtgaagatgcacatccacagcaccaacgaagtgacccggatctacaacgtgatcggcaccctgaagggcgccgtggaacccgacagatacgtgatcctgggcggccaccgggacgcctgggtgttcggaggcatcgaccctcagagcggcgctgccgtggtgcacgagatcgtgcggagcttcggcacactgaagaagaagggctggcggcccagacggaccatcctgttcgccagctgggacgccgaggaattcggcctgctgggcagcaccgagtgggccgaggaaaacagtcggctgctgcaggaacggggcgtcgcctacatcaacgccgacagcagcatcgagggcaactacaccctgcgggtggactgcacccccctgatgtacagcctggtgtacaacctgaccaaagagctgcagagccccgacgagggcttcgagggcaagtccctgttcgactcctggaccgagaagtcccccagccccgagttcagcggcctgcccagaatcagcaagctgggcagcggcaacgacttcgaggtgttcttccagcggctgggaatcgccagcggcagagcccggtacaccaaggactggaaaaccagcaagttctccggctaccccctgtaccacagcgtgtacgagacatacgagctggtggaaaagttctacgaccccatgttcaagtaccacctgaccgtggcccaggtccgaggcggcatcgtgttcgaactggccaacagcgtggtgctgccattcgattgtcaggactacgccgtggtgctgaagaagtacgccgacaaaatctacaacatcagcatgaagcacccccaggaaatgaaaacctacagcgtgtccttcgacagcctgttcagcgccgtgaagaatttcaccgagatcgcctccaagttcaaccagagactgcaggacttcgacaagaacaaccccatcctgctgcggatgatgaacgaccagctgatgttcctggaacgggccttcatcgaccccctgggcctgcccgaccggcccttttaccggcacgtgatctatgcccccagcagccacaacaaatacgccggcgagagtttccccggcatctacgatgccctgttcgatatcgagagcaaggtggaccccagcaaggcctggggcgaagtgaagcggcagatttacgtggccgcattcacagtgcaggctgctgccgagacactgagcgaggtggcc
SEQ ID NO:7.经改组之PSMA抗原3的氨基酸序列
MASARRPRWLCAGALVLAGGFFLLGFLFGWFIKSSNEATNITPKHNMKAFLDELKAENIKKFLYNFTQIPHLAGTEQNFQLAKQIQSQWKEFGLDSVELAHYDVLLSYPNKTHPNYISIINEDGNEIFNTSLFEPPPPGYENVSDIVPPFSAFSPQGMPEGDLVYVNYARTEDFFKLERDMKINCSGKIVIARYGKVFRGNKVKNAQLAGAKGVILYSDPADYFAPGVKSYPDGWNLPGGGVQRGNILNLNGAGDPLTPGYPANEYAYRRGIAEAVGLPSIPVHPIGYYDAQKLLEKMGGSAPPDSSWRGSLKVPYNVGPGFTGNFSAQKLKLHIHSNTKVTRIYNVIGTLRGAVEPDRYVILGGHRDSWVFGGIDPQSGAAVVHEIVRTFGTLKKKGWRPRRTILFASWDAEEFGLLGSTEWAEENSRLLQERGVAYINADSSIEGNYTLRVDCTPLLHSLVYNLTKELKSPDEGFEGKSLYESWTKKSPSPELSGLPRISKLGSGNDFEVFFQRLGISSGRARYTKDWKTSKFSSYPLYHSIYETYELVVKFYDPMFKYHLTVAQVRGGMVFELANSIVLPFDCRDYAVALKNHAENLYSISMKHPQEMKTYSVSFDSLFSAVKNFTEIASKFSERLQDFDKSNPIVLRMMNDQLMFLERAFIDPLGLPDRPFYRHVIYAPSSHNKYAGESFPGIYDALFDIESKVDPSKAWGEVKRQIYVAAFTVQAAAETLSEVA
SEQ ID NO:8.编码SEQ ID NO:7之经改组的PSMA抗原3的氨基酸序列的核苷酸序列
atggctagcgccagacggcccagatggctgtgtgctggcgccctggtgctggctggcggctttttcctgctgggcttcctgttcggctggttcatcaagagcagcaacgaggccaccaacatcacccccaagcacaacatgaaggcctttctggacgagctgaaggccgagaatatcaagaagttcctgtacaacttcacccagatcccccacctggccggcaccgagcagaacttccagctggccaagcagatccagagccagtggaaagagttcggcctggacagcgtggaactggcccactacgacgtgctgctgagctaccccaacaagacccaccccaactacatcagcatcatcaacgaggacggcaacgagattttcaacaccagcctgttcgagccccctccacccggctacgagaacgtgtccgacatcgtgcccccattcagcgcattcagtccacagggaatgcccgagggcgacctggtgtacgtgaactacgcccggaccgaggacttcttcaagctggaacgggacatgaagatcaactgcagcggcaagatcgtgatcgccagatacggcaaggtgttccggggcaacaaagtgaagaacgcccagctggcaggcgccaagggcgtgatcctgtatagcgaccccgccgactacttcgcccctggcgtgaagtcctaccccgacggctggaacctgcctggcggcggagtgcagcggggcaacatcctgaacctgaacggcgctggcgaccccctgacccctggctatcccgccaacgagtacgcctacagacggggaatcgccgaggccgtgggcctgcctagcatccctgtgcaccccatcggctactacgacgcccagaaactgctggaaaagatgggcggcagcgcccctcccgatagctcttggagaggcagcctgaaggtgccctacaacgtgggccctggcttcaccggcaacttcagcgcccagaagctgaagctgcacatccacagcaacaccaaagtgacccggatctacaacgtgatcggcaccctgagaggcgccgtggaacccgacagatacgtgatcctgggcggccaccgggacagctgggtgttcggcggcatcgaccctcagtctggcgccgctgtggtgcacgagatcgtgcggacctttggcaccctgaagaagaagggctggcggcccagacggaccatcctgttcgccagctgggacgccgaggaattcggcctgctgggcagcaccgagtgggccgaggaaaacagtcggctgctgcaggaacggggcgtcgcctacatcaacgccgacagcagcatcgagggcaactacaccctgcgggtggactgcacccccctgctgcacagcctggtgtacaacctgaccaaagagctgaagtcccccgacgagggcttcgagggcaagagcctgtacgagagctggaccaagaagtcccccagccccgagctgagcggcctgcccagaatcagcaagctgggcagcggcaacgacttcgaggtgttcttccagcggctgggcatcagcagcggcagagcccggtacaccaaggactggaaaaccagcaagttcagcagctaccccctgtaccacagcatctacgagacatacgagctggtggtcaagttctacgaccccatgttcaagtaccacctgaccgtggcccaggtccgaggcggcatggtgttcgagctggccaacagcatcgtgctgcccttcgactgccgggactacgccgtggccctgaagaaccacgccgagaacctgtacagcatcagcatgaagcacccccaggaaatgaaaacctacagcgtgtccttcgacagcctgttcagcgccgtgaagaatttcaccgagatcgcctccaagttcagcgagcggctgcaggacttcgacaagagcaaccccatcgtgctgagaatgatgaacgaccagctgatgttcctggaacgggccttcatcgaccccctgggcctgcccgaccggcccttttaccggcacgtgatctatgcccccagcagccacaacaaatacgccggcgagagtttccccggcatctacgatgccctgttcgacatcgagagcaaggtggaccccagcaaggcctggggcgaagtgaagcggcagatttacgtggccgcattcacagtgcaggccgctgccgagacactgagcgaggtggcc
SEQ ID NO:9.膜结合PSMA抗原的氨基酸序列
MASARRPRWLCAGALVLAGGFFLLGFLFGWFIKSSNEATNITPKHNMKAFLDELKAENIKKFLYNFTQIPHLAGTEQNFQLAKQIQSQWKEFGLDSVELAHYDVLLSYPNKTHPNYISIINEDGNEIFNTSLFEPPPPGYENVSDIVPPFSAFSPQGMPEGDLVYVNYARTEDFFKLERDMKINCSGKIVIARYGKVFRGNKVKNAQLAGAKGVILYSDPADYFAPGVKSYPDGWNLPGGGVQRGNILNLNGAGDPLTPGYPANEYAYRRGIAEAVGLPSIPVHPIGYYDAQKLLEKMGGSAPPDSSWRGSLKVPYNVGPGFTGNFSTQKVKMHIHSTNEVTRIYNVIGTLRGAVEPDRYVILGGHRDSWVFGGIDPQSGAAVVHEIVRSFGTLKKEGWRPRRTILFASWDAEEFGLLGSTEWAEENSRLLQERGVAYINADSSIEGNYTLRVDCTPLMYSLVHNLTKELKSPDEGFEGKSLYESWTKKSPSPEFSGMPRISKLGSGNDFEVFFQRLGIASGRARYTKNWETNKFSGYPLYHSVYETYELVEKFYDPMFKYHLTVAQVRGGMVFELANSIVLPFDCRDYAVVLRKYADKIYSISMKHPQEMKTYSVSFDSLFSAVKNFTEIASKFSERLQDFDKSNPIVLRMMNDQLMFLERAFIDPLGLPDRPFYRHVIYAPSSHNKYAGESFPGIYDALFDIESKVDPSKAWGEVKRQIYVAAFTVQAAAETLSEVA
SEQ ID NO:10.编码SEQ ID NO:9之膜结合PSMA抗原的氨基酸序列的核苷酸序列
atggctagcgcgcgccgcccgcgctggctgtgcgctggggcgctggtgctggcgggtggcttctttctcctcggcttcctcttcgggtggtttataaaatcctccaatgaagctactaacattactccaaagcataatatgaaagcatttttggatgaattgaaagctgagaacatcaagaagttcttatataattttacacagataccacatttagcaggaacagaacaaaactttcagcttgcaaagcaaattcaatcccagtggaaagaatttggcctggattctgttgagctggcacattatgatgtcctgttgtcctacccaaataagactcatcccaactacatctcaataattaatgaagatggaaatgagattttcaacacatcattatttgaaccacctcctccaggatatgaaaatgtttcggatattgtaccacctttcagtgctttctctcctcaaggaatgccagagggcgatctagtgtatgttaactatgcacgaactgaagacttctttaaattggaacgggacatgaaaatcaattgctctgggaaaattgtaattgccagatatgggaaagttttcagaggaaataaggttaaaaatgcccagctggcaggggccaaaggagtcattctctactccgaccctgctgactactttgctcctggggtgaagtcctatccagatggttggaatcttcctggaggtggtgtccagcgtggaaatatcctaaatctgaatggtgcaggagaccctctcacaccaggttacccagcaaatgaatatgcttataggcgtggaattgcagaggctgttggtcttccaagtattcctgttcatccaattggatactatgatgcacagaagctcctagaaaaaatgggtggctcagcaccaccagatagcagctggagaggaagtctcaaagtgccctacaatgttggacctggctttactggaaacttttctacacaaaaagtcaagatgcacatccactctaccaatgaagtgacaagaatttacaatgtgataggtactctcagaggagcagtggaaccagacagatatgtcattctgggaggtcaccgggactcatgggtgtttggtggtattgaccctcagagtggagcagctgttgttcatgaaattgtgaggagctttggaacactgaaaaaggaagggtggagacctagaagaacaattttgtttgcaagctgggatgcagaagaatttggtcttcttggttctactgagtgggcagaggagaattcaagactccttcaagagcgtggcgtggcttatattaatgctgactcatctatagaaggaaactacactctgagagttgattgtacaccgctgatgtacagcttggtacacaacctaacaaaagagctgaaaagccctgatgaaggctttgaaggcaaatctctttatgaaagttggactaaaaaaagtccttccccagagttcagtggcatgcccaggataagcaaattgggatctggaaatgattttgaggtgttcttccaacgacttggaattgcttcaggcagagcacggtatactaaaaattgggaaacaaacaaattcagcggctatccactgtatcacagtgtctatgaaacatatgagttggtggaaaagttttatgatccaatgtttaaatatcacctcactgtggcccaggttcgaggagggatggtgtttgagctggccaattccatagtgctcccttttgattgtcgagattatgctgtagttttaagaaagtatgctgacaaaatctacagtatttctatgaaacatccacaggaaatgaagacatacagtgtatcatttgattcacttttttctgcagtaaagaattttacagaaattgcttccaagttcagtgagagactccaggactttgacaaaagcaacccaatagtattaagaatgatgaatgatcaactcatgtttctggaaagagcatttattgatccattagggttaccagacaggcctttttataggcatgtcatctatgctccaagcagccacaacaagtatgcaggggagtcattcccaggaatttatgatgctctgtttgatattgaaagcaaagtggacccttccaaggcctggggagaagtgaagagacagatttatgttgcagccttcacagtgcaggcagctgcagagactttgagtgaagtagcc
SEQ ID NO:11.胞溶质PSMA抗原的氨基酸序列
MASKSSNEATNITPKHNMKAFLDELKAENIKKFLYNFTQIPHLAGTEQNFQLAKQIQSQWKEFGLDSVELAHYDVLLSYPNKTHPNYISIINEDGNEIFNTSLFEPPPPGYENVSDIVPPFSAFSPQGMPEGDLVYVNYARTEDFFKLERDMKINCSGKIVIARYGKVFRGNKVKNAQLAGAKGVILYSDPADYFAPGVKSYPDGWNLPGGGVQRGNILNLNGAGDPLTPGYPANEYAYRRGIAEAVGLPSIPVHPIGYYDAQKLLEKMGGSAPPDSSWRGSLKVPYNVGPGFTGNFSTQKVKMHIHSTNEVTRIYNVIGTLRGAVEPDRYVILGGHRDSWVFGGIDPQSGAAVVHEIVRSFGTLKKEGWRPRRTILFASWDAEEFGLLGSTEWAEENSRLLQERGVAYINADSSIEGNYTLRVDCTPLMYSLVHNLTKELKSPDEGFEGKSLYESWTKKSPSPEFSGMPRISKLGSGNDFEVFFQRLGIASGRARYTKNWETNKFSGYPLYHSVYETYELVEKFYDPMFKYHLTVAQVRGGMVFELANSIVLPFDCRDYAVVLRKYADKIYSISMKHPQEMKTYSVSFDSLFSAVKNFTEIASKFSERLQDFDKSNPIVLRMMNDQLMFLERAFIDPLGLPDRPFYRHVIYAPSSHNKYAGESFPGIYDALFDIESKVDPSKAWGEVKRQIYVAAFTVQAAAETLSEVA
SEQ ID NO:12.编码SEQ ID NO:11之胞溶质PSMA抗原的氨基酸序列的核苷酸序列
atggctagcaaatcctccaatgaagctactaacattactccaaagcataatatgaaagcatttttggatgaattgaaagctgagaacatcaagaagttcttatataattttacacagataccacatttagcaggaacagaacaaaactttcagcttgcaaagcaaattcaatcccagtggaaagaatttggcctggattctgttgagctggcacattatgatgtcctgttgtcctacccaaataagactcatcccaactacatctcaataattaatgaagatggaaatgagattttcaacacatcattatttgaaccacctcctccaggatatgaaaatgtttcggatattgtaccacctttcagtgctttctctcctcaaggaatgccagagggcgatctagtgtatgttaactatgcacgaactgaagacttctttaaattggaacgggacatgaaaatcaattgctctgggaaaattgtaattgccagatatgggaaagttttcagaggaaataaggttaaaaatgcccagctggcaggggccaaaggagtcattctctactccgaccctgctgactactttgctcctggggtgaagtcctatccagatggttggaatcttcctggaggtggtgtccagcgtggaaatatcctaaatctgaatggtgcaggagaccctctcacaccaggttacccagcaaatgaatatgcttataggcgtggaattgcagaggctgttggtcttccaagtattcctgttcatccaattggatactatgatgcacagaagctcctagaaaaaatgggtggctcagcaccaccagatagcagctggagaggaagtctcaaagtgccctacaatgttggacctggctttactggaaacttttctacacaaaaagtcaagatgcacatccactctaccaatgaagtgacaagaatttacaatgtgataggtactctcagaggagcagtggaaccagacagatatgtcattctgggaggtcaccgggactcatgggtgtttggtggtattgaccctcagagtggagcagctgttgttcatgaaattgtgaggagctttggaacactgaaaaaggaagggtggagacctagaagaacaattttgtttgcaagctgggatgcagaagaatttggtcttcttggttctactgagtgggcagaggagaattcaagactccttcaagagcgtggcgtggcttatattaatgctgactcatctatagaaggaaactacactctgagagttgattgtacaccgctgatgtacagcttggtacacaacctaacaaaagagctgaaaagccctgatgaaggctttgaaggcaaatctctttatgaaagttggactaaaaaaagtccttccccagagttcagtggcatgcccaggataagcaaattgggatctggaaatgattttgaggtgttcttccaacgacttggaattgcttcaggcagagcacggtatactaaaaattgggaaacaaacaaattcagcggctatccactgtatcacagtgtctatgaaacatatgagttggtggaaaagttttatgatccaatgtttaaatatcacctcactgtggcccaggttcgaggagggatggtgtttgagctggccaattccatagtgctcccttttgattgtcgagattatgctgtagttttaagaaagtatgctgacaaaatctacagtatttctatgaaacatccacaggaaatgaagacatacagtgtatcatttgattcacttttttctgcagtaaagaattttacagaaattgcttccaagttcagtgagagactccaggactttgacaaaagcaacccaatagtattaagaatgatgaatgatcaactcatgtttctggaaagagcatttattgatccattagggttaccagacaggcctttttataggcatgtcatctatgctccaagcagccacaacaagtatgcaggggagtcattcccaggaatttatgatgctctgtttgatattgaaagcaaagtggacccttccaaggcctggggagaagtgaagagacagatttatgttgcagccttcacagtgcaggcagctgcagagactttgagtgaagtagcc
SEQ ID NO:13.分泌PSMA抗原的氨基酸序列
MASETDTLLLWVLLLWVPGSTGDAAKSSNEATNITPKHNMKAFLDELKAENIKKFLYNFTQIPHLAGTEQNFQLAKQIQSQWKEFGLDSVELAHYDVLLSYPNKTHPNYISIINEDGNEIFNTSLFEPPPPGYENVSDIVPPFSAFSPQGMPEGDLVYVNYARTEDFFKLERDMKINCSGKIVIARYGKVFRGNKVKNAQLAGAKGVILYSDPADYFAPGVKSYPDGWNLPGGGVQRGNILNLNGAGDPLTPGYPANEYAYRRGIAEAVGLPSIPVHPIGYYDAQKLLEKMGGSAPPDSSWRGSLKVPYNVGPGFTGNFSTQKVKMHIHSTNEVTRIYNVIGTLRGAVEPDRYVILGGHRDSWVFGGIDPQSGAAVVHEIVRSFGTLKKEGWRPRRTILFASWDAEEFGLLGSTEWAEENSRLLQERGVAYINADSSIEGNYTLRVDCTPLMYSLVHNLTKELKSPDEGFEGKSLYESWTKKSPSPEFSGMPRISKLGSGNDFEVFFQRLGIASGRARYTKNWETNKFSGYPLYHSVYETYELVEKFYDPMFKYHLTVAQVRGGMVFELANSIVLPFDCRDYAVVLRKYADKIYSISMKHPQEMKTYSVSFDSLFSAVKNFTEIASKFSERLQDFDKSNPIVLRMMNDQLMFLERAFIDPLGLPDRPFYRHVIYAPSSHNKYAGESFPGIYDALFDIESKVDPSKAWGEVKRQIYVAAFTVQAAAETLSEVA
SEQ ID NO:14.编码SEQ ID NO:13之分泌PSMA抗原的氨基酸序列的核苷酸序列
atggctagcgaaaccgacactttgttgttgtgggtgcttttgctttgggtacccggatctactggtgatgctgctaaatcctccaatgaagctactaacattactccaaagcataatatgaaagcatttttggatgaattgaaagctgagaacatcaagaagttcttatataattttacacagataccacatttagcaggaacagaacaaaactttcagcttgcaaagcaaattcaatcccagtggaaagaatttggcctggattctgttgagctagcacattatgatgtcctgttgtcctacccaaataagactcatcccaactacatctcaataattaatgaagatggaaatgagattttcaacacatcattatttgaaccacctcctccaggatatgaaaatgtttcggatattgtaccacctttcagtgctttctctcctcaaggaatgccagagggcgatctagtgtatgttaactatgcacgaactgaagacttctttaaattggaacgggacatgaaaatcaattgctctgggaaaattgtaattgccagatatgggaaagttttcagaggaaataaggttaaaaatgcccagctggcaggggccaaaggagtcattctctactccgaccctgctgactactttgctcctggggtgaagtcctatccagatggttggaatcttcctggaggtggtgtccagcgtggaaatatcctaaatctgaatggtgcaggagaccctctcacaccaggttacccagcaaatgaatatgcttataggcgtggaattgcagaggctgttggtcttccaagtattcctgttcatccaattggatactatgatgcacagaagctcctagaaaaaatgggtggctcagcaccaccagatagcagctggagaggaagtctcaaagtgccctacaatgttggacctggctttactggaaacttttctacacaaaaagtcaagatgcacatccactctaccaatgaagtgacaagaatttacaatgtgataggtactctcagaggagcagtggaaccagacagatatgtcattctgggaggtcaccgggactcatgggtgtttggtggtattgaccctcagagtggagcagctgttgttcatgaaattgtgaggagctttggaacactgaaaaaggaagggtggagacctagaagaacaattttgtttgcaagctgggatgcagaagaatttggtcttcttggttctactgagtgggcagaggagaattcaagactccttcaagagcgtggcgtggcttatattaatgctgactcatctatagaaggaaactacactctgagagttgattgtacaccgctgatgtacagcttggtacacaacctaacaaaagagctgaaaagccctgatgaaggctttgaaggcaaatctctttatgaaagttggactaaaaaaagtccttccccagagttcagtggcatgcccaggataagcaaattgggatctggaaatgattttgaggtgttcttccaacgacttggaattgcttcaggcagagcacggtatactaaaaattgggaaacaaacaaattcagcggctatccactgtatcacagtgtctatgaaacatatgagttggtggaaaagttttatgatccaatgtttaaatatcacctcactgtggcccaggttcgaggagggatggtgtttgagctagccaattccatagtgctcccttttgattgtcgagattatgctgtagttttaagaaagtatgctgacaaaatctacagtatttctatgaaacatccacaggaaatgaagacatacagtgtatcatttgattcacttttttctgcagtaaagaattttacagaaattgcttccaagttcagtgagagactccaggactttgacaaaagcaacccaatagtattaagaatgatgaatgatcaactcatgtttctggaaagagcatttattgatccattagggttaccagacaggcctttttataggcatgtcatctatgctccaagcagccacaacaagtatgcaggggagtcattcccaggaatttatgatgctctgtttgatattgaaagcaaagtggacccttccaaggcctggggagaagtgaagagacagatttatgttgcagccttcacagtgcaggcagctgcagagactttgagtgaagtagcc
SEQ ID NO:15.全长人类PSA的氨基酸序列
MASWVPVVFLTLSVTWIGAAPLILSRIVGGWECEKHSQPWQVLVASRGRAVCGGVLVHPQWVLTAAHCIRNKSVILLGRHSLFHPEDTGQVFQVSHSFPHPLYDMSLLKNRFLRPGDDSSHDLMLLRLSEPAELTDAVKVMDLPTQEPALGTTCYASGWGSIEPEEFLTPKKLQCVDLHVISNDVCAQVHPQKVTKFMLCAGRWTGGKSTCSGDSGGPLVCNGVLQGITSWGSEPCALPERPSLYTKVVHYRKWIKDTIVANP
SEQ ID NO:16.编码SEQ ID NO:15之全长人类PSA的氨基酸序列的核苷酸序列
atggctagctgggtcccggttgtcttcctcaccctgtccgtgacgtggattggcgctgcgcccctcatcctgtctcggattgtgggaggctgggagtgcgagaagcattcccaaccctggcaggtgcttgtggcctctcgtggcagggcagtctgcggcggtgttctggtgcacccccagtgggtcctcacagctgcccactgcatcaggaacaaaagcgtgatcttgctgggtcggcacagcttgtttcatcctgaagacacaggccaggtatttcaggtcagccacagcttcccacacccgctctacgatatgagcctcctgaagaatcgattcctcaggccaggtgatgactccagccacgacctcatgctgctccgcctgtcagagcctgccgagctcacggatgctgtgaaggtcatggacctgcccacccaggagccagcactggggaccacctgctacgcctcaggctggggcagcattgaaccagaggagttcttgaccccaaagaaacttcagtgtgtggacctccatgttatttccaatgacgtgtgtgcgcaagttcaccctcagaaggtgaccaagttcatgctgtgtgctggacgctggacagggggcaaaagcacctgctcgggtgattctgggggcccacttgtctgtaatggtgtgcttcaaggtatcacgtcatggggcagtgaaccatgtgccctgcccgaaaggccttccctgtacaccaaggtggtgcattaccggaagtggatcaaggacaccatcgtggccaacccc
SEQ ID NO:17.胞溶质PSA抗原的氨基酸序列
MASIVGGWECEKHSQPWQVLVASRGRAVCGGVLVHPQWVLTAAHCIRNKSVILLGRHSLFHPEDTGQVFQVSHSFPHPLYDMSLLKNRFLRPGDDSSHDLMLLRLSEPAELTDAVKVMDLPTQEPALGTTCYASGWGSIEPEEFLTPKKLQCVDLHVISNDVCAQVHPQKVTKFMLCAGRWTGGKSTCSGDSGGPLVCNGVLQGITSWGSEPCALPERPSLYTKVVHYRKWIKDTIVANP
SEQ ID NO:18.编码SEQ ID NO:17之胞溶质PSA抗原的氨基酸序列的核苷酸序列
atggctagcattgtgggaggctgggagtgcgagaagcattcccaaccctggcaggtgcttgtggcctctcgtggcagggcagtctgcggcggtgttctggtgcacccccagtgggtcctcacagctgcccactgcatcaggaacaaaagcgtgatcttgctgggtcggcacagcttgtttcatcctgaagacacaggccaggtatttcaggtcagccacagcttcccacacccgctctacgatatgagcctcctgaagaatcgattcctcaggccaggtgatgactccagccacgacctcatgctgctccgcctgtcagagcctgccgagctcacggatgctgtgaaggtcatggacctgcccacccaggagccagcactggggaccacctgctacgcctcaggctggggcagcattgaaccagaggagttcttgaccccaaagaaacttcagtgtgtggacctccatgttatttccaatgacgtgtgtgcgcaagttcaccctcagaaggtgaccaagttcatgctgtgtgctggacgctggacagggggcaaaagcacctgctcgggtgattctgggggcccacttgtctgtaatggtgtgcttcaaggtatcacgtcatggggcagtgaaccatgtgccctgcccgaaaggccttccctgtacaccaaggtggtgcattaccggaagtggatcaaggacaccatcgtggccaacccc
SEQ ID NO:19.膜结合PSA抗原的氨基酸序列
MASARRPRWLCAGALVLAGGFFLLGFLFGWFIKSSNEATNITPGIVGGWECEKHSQPWQVLVASRGRAVCGGVLVHPQWVLTAAHCIRNKSVILLGRHSLFHPEDTGQVFQVSHSFPHPLYDMSLLKNRFLRPGDDSSHDLMLLRLSEPAELTDAVKVMDLPTQEPALGTTCYASGWGSIEPEEFLTPKKLQCVDLHVISNDVCAQVHPQKVTKFMLCAGRWTGGKSTCSGDSGGPLVCNGVLQGITSWGSEPCALPERPSLYTKVVHYRKWIKDTIVANP
SEQ ID NO:20.编码SEQ ID NO:19之膜结合PSA抗原的氨基酸序列的核苷酸序列
atggctagcgcgcgccgcccgcgctggctgtgcgctggggcgctggtgctggcgggtggcttctttctcctcggcttcctcttcgggtggtttataaaatcctccaatgaagctactaacattactccaggaattgtgggaggctgggagtgcgagaagcattcccaaccctggcaggtgcttgtggcctctcgtggcagggcagtctgcggcggtgttctggtgcacccccagtgggtcctcacagctgcccactgcatcaggaacaaaagcgtgatcttgctgggtcggcacagcttgtttcatcctgaagacacaggccaggtatttcaggtcagccacagcttcccacacccgctctacgatatgagcctcctgaagaatcgattcctcaggccaggtgatgactccagccacgacctcatgctgctccgcctgtcagagcctgccgagctcacggatgctgtgaaggtcatggacctgcccacccaggagccagcactggggaccacctgctacgcctcaggctggggcagcattgaaccagaggagttcttgaccccaaagaaacttcagtgtgtggacctccatgttatttccaatgacgtgtgtgcgcaagttcaccctcagaaggtgaccaagttcatgctgtgtgctggacgctggacagggggcaaaagcacctgctcgggtgattctgggggcccacttgtctgtaatggtgtgcttcaaggtatcacgtcatggggcagtgaaccatgtgccctgcccgaaaggccttccctgtacaccaaggtggtgcattaccggaagtggatcaaggacaccatcgtggccaacccctga
SEQ ID NO:21.全长人类PSCA的氨基酸序列
MASKAVLLALLMAGLALQPGTALLCYSCKAQVSNEDCLQVENCTQLGEQCWTARIRAVGLLTVISKGCSLNCVDDSQDYYVGKKNITCCDTDLCNASGAHALQPAAAILALLPALGLLLWGPGQL
SEQ ID NO:22.编码SEQ ID NO:21之全长人类PSCA的氨基酸序列的核苷酸序列
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SEQ ID NO:23.质粒5166的核苷酸序列
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SEQ ID NO:24.质粒5259的核苷酸序列
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SEQ ID NO:25.质粒5297的核苷酸序列
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SEQ ID NO:26.质粒460的核苷酸序列
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SEQ ID NO:28.质粒454的核苷酸序列
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SEQ ID NO:29.质粒5300的核苷酸序列
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SEQ ID NO:30.质粒449的核苷酸序列
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SEQ ID NO:31.质粒603的核苷酸序列
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SEQ ID NO:32.质粒455的核苷酸序列
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SEQ ID NO:33.质粒456的核苷酸序列
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SEQ ID NO:34.质粒457的核苷酸序列
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SEQ ID NO:36.质粒459的核苷酸序列
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SEQ ID NO:37.PSHUTTLE IRES的核苷酸序列
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AAAATTAATAGGAGAGAAAAACACATAAACACCTGAAAAACCCTCCTGCCTAGGCAAAATAGCACCCTCCCGCTCCAGAACAACATACAGCGCTTCCACAGCGGCAGCCATAACAGTCAGCCTTACCAGTAAAAAAGAAAACCTATTAAAAAAACACCACTCGACACGGCACCAGCTCAATCAGTCACAGTGTAAAAAAGGGCCAAGTGCAGAGCGAGTATATATAGGACTAAAAAATGACGTAACGGTTAAAGTCCACAAAAAACACCCAGAAAACCGCACGCGAACCTACGCCCAGAAACGAAAGCCAAAAAACCCACAACTTCCTCAAATCGTCACTTCCGTTTTCCCACGTTACGTCACTTCCCATTTTAAGAAAACTACAATTCCCAACACATACAAGTTACTCCGCCCTAAAACCTACGTCACCCGCCCCGTTCCCACGCCCCGCGCCACGTCACAAACTCCACCCCCTCATTATCATATTGGCTTCAATCCAAAATAAGGTATATTATTGATGATGTTAATTAACATGCATGGATCCATATGCGGTGTGAAATACCGCACAGATGCGTAAGGAGAAAATACCGCATCAGGCGCTCTTCCGCTTCCTCGCTCACTGACTCGCTGCGCTCGGTCGTTCGGCTGCGGCGAGCGGTATCAGCTCACTCAAAGGCGGTAATACGGTTATCCACAGAATCAGGGGATAACGCAGGAAAGAACATGTGAGCAAAAGGCCAGCAAAAGGCCAGGAACCGTAAAAAGGCCGCGTTGCTGGCGTTTTTCCATAGGCTCCGCCCCCCTGACGAGCATCACAAAAATCGACGCTCAAGTCAGAGGTGGCGAAACCCGACAGGACTATAAAGATACCAGGCGTTTCCCCCTGGAAGCTCCCTCGTGCGCTCTCCTGTTCCGACCCTGCCGCTTACCGGATACCTGTCCGCCTTTCTCCCTTCGGGAAGCGTGGCGCTTTCTCATAGCTCACGCTGTAGGTATCTCAGTTCGGTGTAGGTCGTTCGCTCCAAGCTGGGCTGTGTGCACGAACCCCCCGTTCAGCCCGACCGCTGCGCCTTATCCGGTAACTATCGTCTTGAGTCCAACCCGGTAAGACACGACTTATCGCCACTGGCAGCAGCCACTGGTAACAGGATTAGCAGAGCGAGGTATGTAGGCGGTGCTACAGAGTTCTTGAAGTGGTGGCCTAACTACGGCTACACTAGAAGGACAGTATTTGGTATCTGCGCTCTGCTGAAGCCAGTTACCTTCGGAAAAAGAGTTGGTAGCTCTTGATCCGGCAAACAAACCACCGCTGGTAGCGGTGGTTTTTTTGTTTGCAAGCAGCAGATTACGCGCAGAAAAAAAGGATCTCAAGAAGATCCTTTGATCTTTTCTACGGGGTCTGACGCTCAGTGGAACGAAAACTCACGTTAAGGGATTTTGGTCATGAGATTATCAAAAAGGATCTTCACCTAGATCCTTTTAAATTAAAAATGAAGTTTTAAATCAATCTAAAGTATATATGAGTAAACTTGGTCTGACAGTTACCAATGCTTAATCAGTGAGGCACCTATCTCAGCGATCTGTCTATTTCGTTCATCCATAGTTGCCTGACTCCCCGTCGTGTAGATAACTACGATACGGGAGGGCTTACCATCTGGCCCCAGTGCTGCAATGATACCGCGAGACCCACGCTCACCGGCTCCAGATTTATCAGCAATAAACCAGCCAGCCGGAAGGGCCGAGCGCAGAAGTGGTCCTGCAACTTTATCCGCCTCCATCCAGTCTATTAATTGTTGCCGGGAAGCTAGAGTAAGTAGTTCGCCAGTTAATAGTTTGCGCAACGTTGTTGCCATTGCTGCAGCCATGAGATTATCAAAAAGGATCTTCACCTAGATCCTTTTCACGTAGAAAGCCAGTCCGCAGAAACGGTGCTGACCCCGGATGAATGTCAGCTACTGGGCTATCTGGACAAGGGAAAACGCAAGCGCAAAGAGAAAGCAGGTAGCTTGCAGTGGGCTTACATGGCGATAGCTAGACTGGGCGGTTTTATGGACAGCAAGCGAACCGGAATTGCCAGCTGGGGCGCCCTCTGGTAAGGTTGGGAAGCCCTGCAAAGTAAACTGGATGGCTTTCTTGCCGCCAAGGATCTGATGGCGCAGGGGATCAAGCTCTGATCAAGAGACAGGATGAGGATCGTTTCGCATGATTGAACAAGATGGATTGCACGCAGGTTCTCCGGCCGCTTGGGTGGAGAGGCTATTCGGCTATGACTGGGCACAACAGACAATCGGCTGCTCTGATGCCGCCGTGTTCCGGCTGTCAGCGCAGGGGCGCCCGGTTCTTTTTGTCAAGACCGACCTGTCCGGTGCCCTGAATGAACTGCAAGACGAGGCAGCGCGGCTATCGTGGCTGGCCACGACGGGCGTTCCTTGCGCAGCTGTGCTCGACGTTGTCACTGAAGCGGGAAGGGACTGGCTGCTATTGGGCGAAGTGCCGGGGCAGGATCTCCTGTCATCTCACCTTGCTCCTGCCGAGAAAGTATCCATCATGGCTGATGCAATGCGGCGGCTGCATACGCTTGATCCGGCTACCTGCCCATTCGACCACCAAGCGAAACATCGCATCGAGCGAGCACGTACTCGGATGGAAGCCGGTCTTGTCGATCAGGATGATCTGGACGAAGAGCATCAGGGGCTCGCGCCAGCCGAACTGTTCGCCAGGCTCAAGGCGAGCATGCCCGACGGCGAGGATCTCGTCGTGACCCATGGCGATGCCTGCTTGCCGAATATCATGGTGGAAAATGGCCGCTTTTCTGGATTCATCGACTGTGGCCGGCTGGGTGTGGCGGACCGCTATCAGGACATAGCGTTGGCTACCCGTGATATTGCTGAAGAGCTTGGCGGCGAATGGGCTGACCGCTTCCTCGTGCTTTACGGTATCGCCGCTCCCGATTCGCAGCGCATCGCCTTCTATCGCCTTCTTGACGAGTTCTTCTGAATTTTGTTAAAATTTTTGTTAAATCAGCTCATTTTTTAACCAATAGGCCGAAATCGGCACCATCCCTTATAAATCAAAAGAATAGACCGAGATAGGGTTGAGTGTTGTTCCAGTTTGGAACAAGAGTCCACTATTAAAGAACGTGGACTCCAACGTCAAAGGGCGAAAAACCGTCTATCAGGGCGATGGCCCACTACGTGAACCATCACCCTAATCAAGTTTTTTGTGGTCGAGGTGCCGTAAAGCACTAAATCGGAACCCTAAAGGGAGCCCCCGATTTAGAGCTTGACGGGGAAAGCCGGCGAACGTGGCGAGAAAGGAAGGGAAGAAAGCGAAAGGAGCGGGCGCTAGGGCGCTGGCAAGTGTAGCGGTCACGCTGCGCGTAACCACCACACCCGCGCGCTTAATGCGCCGCTACAGGGCGCGTCCATTCGCCATTCAGGATCGAATTAATTCTTAATTAA
SEQ ID NO:38.Her-2抗原的氨基酸序列：
MASELAALCRWGLLLALLPPGAASTQVCTGTDMKLRLPASPETHLDMLRHLYQGCQVVQGNLELTYLPTNASLSFLQDIQEVQGYVLIAHNQVRQVPLQRLRIVRGTQLFEDNYALAVLDNGDPLDSVAPAAGATPGGLQELQLRSLTEILKGGVLIRRSPQLCHQDTVLWEDVFRKNNQLALVLMDTNRSRACHPCAPMCKANHCWGESSQDCQTLTRTICTSACARCKAPLPTDCCHEQCAAGCTGPKHSDCLACLHFNHSGICELHCPALVTYNTDTFESMPNPEGRYTFGASCVTACPYNYLSTDVGSCTLVCPLHNQEVTAEDGTQRCEKCSKPCARVCYGLGMEHLREARAITSANVQDFVGCKKIFGSLAFLPESFDGDPASGTAPLQPEQLQVFETLEEITGYLYISAWPDSFPNLSVFQNLRVIRGRILHNGAYSLTLQGLGISWLGLRSLQELGSGLALVHRNARLCFVHTVPWDQLFRNPHQALLHSGNRPEEDCVGEGFVCYSLCAHGHCWGPGPTQCVNCSHFLRGQECVEECRVLQGLPREYVNARHCLPCHPECQPQNGSVTCFGPEADQCVACAHYKDPPFCVARCPSGVKPDLSYMPIWKFPDEEGACQPCPINCTHSCVDLDDKGCPAEQRASPLTSIISAVVGILLVVVLGVVFGILIKRRQQKIRKYTMRRNEDLGPSSPMDSTFYRSLLEDEDMGELVDAEEYLVPQQGFFCPDPTPGTGSTAHRRHRSSSARNGGGDLTLGMEPSGEGPPRSPRAPSEGTGSDVFDGDLAVGVTKGLQSLSPQDLSPLQRYSEDPTLPLPSETDGKVAPLSCSPQPEFVNQSDVQPKSPLTPEGPPSPARPTGATLERAKTLSPGKNGVVKDVFTFGGAVENPEFLAPREGTASPPHPSPAFSPAFDNLFFWDQNSSEQGPPPSNFEGTPTAENPEFLGLDVPV
(信号序列加下划线)
SEQ ID NO:39.编码SEQ ID NO:38之Her-2抗原氨基酸序列的核酸序列
ATGGCTAGCGAGCTGGCCGCCCTGTGTAGATGGGGACTGCTGCTGGCTCTGCTGCCTCCTGGAGCCGCTTCTACACAGGTCTGCACCGGCACCGACATGAAGCTGAGACTGCCCGCCAGCCCCGAGACACACCTGGACATGCTGCGGCACCTGTACCAGGGCTGCCAGGTGGTCCAGGGGAATCTGGAACTGACCTACCTGCCCACCAACGCCAGCCTGAGCTTCCTGCAGGACATCCAGGAAGTGCAGGGCTACGTCCTGATCGCCCACAACCAGGTCCGCCAGGTGCCCCTGCAGCGGCTGAGAATCGTGCGGGGCACCCAGCTGTTCGAGGACAACTACGCCCTGGCCGTGCTGGACAACGGCGACCCTCTGGATAGCGTGGCCCCTGCTGCTGGGGCTACACCTGGCGGACTGCAGGAACTGCAGCTGCGGAGCCTGACCGAGATCCTGAAGGGCGGCGTGCTGATCAGGCGGAGCCCTCAGCTGTGCCACCAGGACACCGTGCTGTGGGAGGACGTGTTCCGGAAGAACAACCAGCTGGCCCTCGTGCTGATGGACACCAACAGAAGCCGGGCCTGCCACCCCTGCGCCCCCATGTGCAAGGCCAATCACTGCTGGGGAGAGAGCAGCCAGGACTGCCAGACCCTGACCCGGACCATCTGCACCAGCGCCTGCGCCAGATGCAAGGCCCCCCTGCCTACCGACTGCTGCCACGAACAGTGCGCCGCTGGCTGCACCGGCCCCAAGCACAGCGATTGCCTGGCCTGCCTGCACTTCAACCACAGCGGCATCTGCGAGCTGCACTGCCCTGCCCTGGTGACATACAACACCGACACCTTCGAGAGCATGCCCAACCCCGAGGGCCGGTACACCTTCGGCGCCAGCTGTGTGACCGCCTGCCCCTACAACTACCTGAGCACCGACGTGGGCAGCTGCACCCTGGTGTGCCCCCTGCACAACCAGGAAGTGACCGCCGAGGACGGCACCCAGAGATGCGAGAAGTGCAGCAAGCCTTGCGCCAGAGTGTGCTACGGCCTGGGCATGGAACACCTGAGAGAGGCCAGAGCCATCACCAGCGCCAACGTGCAGGACTTCGTGGGCTGCAAGAAGATTTTCGGCTCCCTGGCCTTCCTGCCCGAGAGCTTCGACGGCGATCCTGCCTCTGGCACCGCCCCTCTGCAGCCTGAGCAGCTGCAGGTCTTCGAGACACTGGAAGAGATCACCGGCTACCTGTACATCAGCGCCTGGCCCGACAGCTTCCCCAACCTGAGCGTGTTCCAGAACCTGAGAGTGATCCGGGGCAGAATCCTGCACAACGGCGCCTACAGCCTGACCCTGCAGGGCCTGGGAATCAGCTGGCTGGGCCTGCGGAGCCTGCAGGAACTGGGATCTGGCCTGGCTCTGGTGCACCGGAACGCCCGGCTGTGCTTCGTGCACACCGTGCCCTGGGACCAGCTGTTCAGAAACCCCCACCAGGCTCTGCTGCACAGCGGCAACCGGCCCGAAGAGGATTGCGTGGGCGAGGGCTTCGTGTGCTACTCCCTGTGCGCCCACGGCCACTGTTGGGGACCTGGCCCTACCCAGTGCGTGAACTGCAGCCACTTCCTGCGGGGCCAAGAATGCGTGGAAGAGTGCCGGGTGCTGCAGGGACTGCCCCGGGAATACGTGAACGCCAGACACTGCCTGCCTTGCCACCCCGAGTGCCAGCCCCAGAATGGCAGCGTGACCTGCTTCGGACCCGAGGCCGATCAGTGTGTGGCCTGCGCCCACTACAAGGACCCCCCATTCTGCGTGGCCAGATGCCCCAGCGGCGTGAAGCCCGACCTGAGCTACATGCCCATCTGGAAGTTCCCCGACGAGGAAGGCGCCTGCCAGCCTTGCCCCATCAACTGCACCCACAGCTGCGTGGACCTGGACGACAAGGGCTGCCCTGCCGAGCAGAGAGCCAGCCCCCTGACCAGCATCATCAGCGCCGTGGTGGGAATCCTGCTGGTGGTGGTGCTGGGCGTGGTGTTCGGCATCCTGATCAAGCGGCGGCAGCAGAAGATCCGGAAGTACACCATGCGGCGGAACGAGGACCTGGGCCCCTCTAGCCCCATGGACAGCACCTTCTACCGGTCCCTGCTGGAAGATGAGGACATGGGCGAGCTGGTGGACGCCGAGGAATACCTGGTGCCTCAGCAGGGCTTCTTCTGCCCCGACCCTACCCCTGGCACCGGCTCTACCGCCCACAGACGGCACAGAAGCAGCAGCGCCAGAAACGGCGGAGGCGACCTGACCCTGGGAATGGAACCTAGCGGCGAGGGACCTCCCAGAAGCCCTAGAGCCCCTAGCGAGGGCACCGGCAGCGACGTGTTCGATGGCGATCTGGCCGTGGGCGTGACCAAGGGACTGCAGAGCCTGAGCCCCCAGGACCTGTCCCCCCTGCAGAGATACAGCGAGGACCCCACCCTGCCCCTGCCCAGCGAGACAGATGGCAAGGTGGCCCCCCTGAGCTGCAGCCCTCAGCCCGAGTTCGTGAACCAGAGCGACGTGCAGCCCAAGTCCCCCCTGACACCCGAGGGACCTCCAAGCCCTGCCAGACCTACCGGCGCCACCCTGGAAAGAGCCAAGACCCTGAGCCCCGGCAAGAACGGCGTGGTGAAAGACGTGTTCACCTTCGGAGGCGCCGTGGAAAACCCCGAGTTCCTGGCCCCCAGAGAGGGCACAGCCAGCCCTCCACACCCCAGCCCAGCCTTCTCCCCCGCCTTCGACAACCTGTTCTTCTGGGACCAGAACAGCAGCGAGCAGGGCCCACCCCCCAGCAATTTCGAGGGCACCCCCACCGCCGAGAATCCTGAGTTCCTGGGCCTGGACGTGCCCGTGTGA
SEQ ID NO:40.抗CD40抗体CP870,893之重链的氨基酸序列：
MDWTWRILFLVAAATGAHSQVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTGYYMHWVRQAPGQGLEWMGWINPDSGGTNYAQKFQGRVTMTRDTSISTAYMELNRLRSDDTAVYYCARDQPLGYCTNGVCSYFDYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSNFGTQTYTCNVDHKPSNTKVDKTVERKCCVECPPCPAPPVAGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTFRVVSVLTVVHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPAPIEKTISKTKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPMLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK.
SEQ ID NO:41.抗CD40抗体CP870,893之轻链之酸序列：
MRLPAQLLGLLLLWFPGSRCDIQMTQSPSSVSASVGDRVTITCRASQGIYSWLAWYQQKPGKAPNLLIYTASTLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQANIFPLTFGGGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC.
SEQ ID NO:42.抗CTLA-4抗体曲美目单抗之重链之酸序列
QVQLVESGGGVVQPGRSLRLSCAASGFTFSSYGMHWVRQAPGKGLEWVAVIWYDGSNKYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARDPRGATLYYYYYGMDVWGQGTTVTVSSASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSNFGTQTYTCNVDHKPSNTKVDKTVERKCCVECPPCPAPPVAGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTFRVVSVLTVVHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPAPIEKTISKTKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPMLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
SEQ ID NO:43.抗CTLA-4抗体曲美目单抗之轻链之酸序列
DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQSINSYLDWYQQKPGKAPKLLIYAASSLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQYYSTPFTFGPGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC
SEQ ID NO:44.CpG 7909的核苷酸序列
5'TCGTCGTTTTGTCGTTTTGTCGTT3'
SEQ ID NO:45.CpG 24555的核苷酸序列
5'TCGTCGTTTTTCGGTGCTTTT3'
SEQ ID NO:46.CpG 10103的核苷酸序列
5'TCGTCGTTTTTCGGTCGTTTT3'
SEQ ID NO:47.eGFP的氨基酸序列
MVSKGEELFTGVVPILVELDGDVNGHKFSVSGEGEGDATYGKLTLKFICTTGKLPVPWPTLVTTLTYGVQCFSRYPDHMKQHDFFKSAMPEGYVQERTIFFKDDGNYKTRAEVKFEGDTLVNRIELKGIDFKEDGNILGHKLEYNYNSHNVYIMADKQKNGIKVNFKIRHNIEDGSVQLADHYQQNTPIGDGPVLLPDNHYLSTQSALSKDPNEKRDHMVLLEFVTAAGITLGMDELYK
SEQ ID NO:48.HBV核心抗原的氨基酸序列
MDIDPYKEFGATVELLSFLPSDFFPSVRDLLDTASALYREALESPEHCSPHHTALRQAILCWGELMTLATWVGNNLEDPASRDLVVNYVNTNMGLKIRQLLWFHISCLTFGRETVLEYLVSFGVWIRTPPAYRPPNAPILSTLPETTVVRRRGRGRSPRRRTPSPRRRRSQSPRRRRSQSRESQC
SEQ ID NO:49.HBV表面抗原的氨基酸序列
MENITSGFLGPLLVLQAGFFLLTRILTIPQSLDSWWTSLNFLGGSPVCLGQNSQSPTSNHSPTSCPPICPGYRWMCLRRFIIFLFILLLCLIFLLVLLDYQGMLPVCPLIPGSTTTSTGPCKTCTTPAQGNSMFPSCCCTKPTDGNCTCIPIPSSWAFAKYLWEWASVRFSWLSLLVPFVQWFVGLSPTVWLSAIWMMWYWGPSLYSIVSPFIPLLPIFFCLWVYI
SEQ ID NO:50.恒河猴PSMA ECD蛋白的氨基酸序列：
MASETDTLLLWVLLLWVPGSTGDAAHHHHHHKSSSEATNITPKHNMKAFLDELKAENIKKFLHNFTQIPHLAGTEQNFQLAKQIQSQWKEFGLDSVELTHYDVLLSYPNKTHPNYISIINEDGNEIFNTSLFEPPPAGYENVSDIVPPFSAFSPQGMPEGDLVYVNYARTEDFFKLERDMKINCSGKIVIARYGKVFRGNKVKNAQLAGATGVILYSDPADYFAPGVKSYPDGWNLPGGGVQRGNILNLNGAGDPLTPGYPANEYAYRRGIAEAVGLPSIPVHPIGYYDAQKLLEKMGGSASPDSSWRGSLKVPYNVGPGFTGNFSTQKVKMHIHSTSEVTRIYNVIGTLRGAVEPDRYVILGGHRDSWVFGGIDPQSGAAVVHEIVRSFGTLKKEGWRPRRTILFASWDAEEFGLLGSTEWAEENSRLLQERGVAYINADSSIEGNYTLRVDCTPLMYSLVYNLTKELESPDEGFEGKSLYESWTKSPSPEFSGMPRISKLGSGNDFEVFFQRLGIASGRARYTKNWETNKFSSYPLYHSVYETYELVEKFYDPMFKYHLTVAQVRGGMVFELANSVVLPFDCRDYAVVLRKYADKIYNISMKHPQEMKTYSVSFDSLFSAVKNFTEIASKFSERLRDFDKSNPILLRMMNDQLMFLERAFIDPLGLPDRPFYRHVIYAPSSHNKYAGESFPGIYDALFDIESKVDPSQAWGEVKRQISIATFTVQAAAETLSEVA
SEQ ID NO:51.大鼠Her-2p66肽(H-2d T细胞表位)的氨基酸序列
TYVPANASL
SEQ ID NO:52.大鼠Her-2p169肽(H-2d T细胞表位)的氨基酸序列
DMVLWKDVFRKNNQL
SEQ ID NO:53.HBV核心抗原p87肽的氨基酸序列
SYVNTNMGL
SEQ ID NO:54.大鼠Her-2抗原(rHer-2)的氨基酸序列：
MASELAAWCRWGFLLALLPPGIAGTQVCTGTDMKLRLPASPETHLDMLRHLYQGCQVVQGNLELTYVPANASLSFLQDIQEVQGYMLIAHNQVKRVPLQRLRIVRGTQLFEDKYALAVLDNRDPQDNVAASTPGRTPEGLRELQLRSLTEILKGGVLIRGNPQLCYQDMVLWKDVFRKNNQLAPVDIDTNRSRACPPCAPACKDNHCWGESPEDCQILTGTICTSGCARCKGRLPTDCCHEQCAAGCTGPKHSDCLACLHFNHSGICELHCPALVTYNTDTFESMHNPEGRYTFGASCVTTCPYNYLSTEVGSCTLVCPPNNQEVTAEDGTQRCEKCSKPCARVCYGLGMEHLRGARAITSDNVQEFDGCKKIFGSLAFLPESFDGDPSSGIAPLRPEQLQVFETLEEITGYLYISAWPDSLRDLSVFQNLRIIRGRILHDGAYSLTLQGLGIHSLGLRSLRELGSGLALIHRNAHLCFVHTVPWDQLFRNPHQALLHSGNRPEEDCGLEGLVCNSLCAHGHCWGPGPTQCVNCSHFLRGQECVEECRVWKGLPREYVSDKRCLPCHPECQPQNSSETCFGSEADQCAACAHYKDSSSCVARCPSGVKPDLSYMPIWKYPDEEGICQPCPINCTHSCVDLDERGCPAEQRASPVTFIIATVVGVLLFLILVVVVGILIKRRRQKIRKYTMRRNEDLGPSSPMDSTFYRSLLEDDDMGDLVDAEEYLVPQQGFFSPDPTPGTGSTAHRRHRSSSTRSGGGELTLGLEPSEEGPPRSPLAPSEGAGSDVFDGDLAMGVTKGLQSLSPHDLSPLQRYSEDPTLPLPPETDGYVAPLACSPQPEFVNQSEVQPQPPLTPEGPLPPVRPAGATLERPKTLSPGKNGVVKDVFAFGGAVENPEFLVPREGTASPPHPSPAFSPAFDNLFFWDQNSSEQGPPPSNFEGTPTAENPEFLGLDVPV
SEQ ID NO:55.恒河猴PSMA抗原的氨基酸序列：
MASARRPRWLCAGALVLAGGFFLLGFLFGWFIKSSSEATNITPKHNMKAFLDELKAENIKKFLHNFTQIPHLAGTEQNFQLAKQIQSQWKEFGLDSVELTHYDVLLSYPNKTHPNYISIINEDGNEIFNTSLFEPPPAGYENVSDIVPPFSAFSPQGMPEGDLVYVNYARTEDFFKLERDMKINCSGKIVIARYGKVFRGNKVKNAQLAGATGVILYSDPADYFAPGVKSYPDGWNLPGGGVQRGNILNLNGAGDPLTPGYPANEYAYRRGIAEAVGLPSIPVHPIGYYDAQKLLEKMGGSASPDSSWRGSLKVPYNVGPGFTGNFSTQKVKMHIHSTSEVTRIYNVIGTLRGAVEPDRYVILGGHRDSWVFGGIDPQSGAAVVHEIVRSFGTLKKEGWRPRRTILFASWDAEEFGLLGSTEWAEENSRLLQERGVAYINADSSIEGNYTLRVDCTPLMYSLVYNLTKELESPDEGFEGKSLYESWTKKSPSPEFSGMPRISKLGSGNDFEVFFQRLGIASGRARYTKNWETNKFSSYPLYHSVYETYELVEKFYDPMFKYHLTVAQVRGGMVFELANSVVLPFDCRDYAVVLRKYADKIYNISMKHPQEMKTYSVSFDSLFSAVKNFTEIASKFSERLRDFDKSNPILLRMMNDQLMFLERAFIDPLGLPDRPFYRHVIYAPSSHNKYAGESFPGIYDALFDIESKVDPSQAWGEVKRQISIATFTVQAAAETLSEVA
SEQ ID NO:56.编码SEQ ID NO:55之恒河猴PSMA抗原的核苷酸序列：
ATGGCTAGCGCTAGAAGGCCCAGATGGCTGTGCGCTGGCGCCCTGGTGCTGGCTGGCGGATTCTTCCTGCTGGGCTTCCTGTTCGGCTGGTTCATCAAGTCCTCCAGCGAGGCCACCAACATCACCCCCAAGCACAACATGAAGGCCTTTCTGGACGAGCTGAAGGCCGAGAATATCAAGAAGTTCCTGCACAACTTCACCCAGATCCCCCACCTGGCCGGCACCGAGCAGAACTTCCAGCTGGCCAAGCAGATCCAGTCCCAGTGGAAAGAGTTCGGCCTGGACTCCGTGGAACTGACCCACTACGACGTGCTGCTGTCCTACCCCAACAAGACCCACCCCAACTACATCTCCATCATCAACGAGGACGGCAACGAAATCTTCAACACCTCCCTGTTCGAGCCCCCACCAGCCGGCTACGAGAACGTGTCCGACATCGTGCCCCCATTCTCCGCATTCAGTCCACAAGGCATGCCCGAGGGCGACCTGGTGTACGTGAACTACGCCAGGACCGAGGACTTCTTCAAGCTGGAAAGGGACATGAAGATCAACTGCTCCGGCAAGATCGTGATCGCCAGATACGGCAAGGTGTTCAGGGGCAACAAAGTGAAGAACGCTCAGCTGGCTGGGGCCACCGGCGTGATCCTGTACTCTGACCCCGCCGACTACTTCGCCCCAGGCGTGAAGTCCTACCCCGACGGCTGGAACCTGCCAGGTGGCGGAGTGCAGAGGGGCAACATCCTGAACCTGAACGGCGCTGGCGACCCCCTGACCCCAGGATACCCCGCCAACGAGTACGCCTACAGAAGAGGAATCGCCGAGGCCGTGGGCCTGCCCTCTATCCCAGTGCACCCCATCGGCTACTACGACGCCCAGAAACTGCTGGAAAAGATGGGCGGCTCCGCCTCCCCCGACTCCTCTTGGAGAGGCTCCCTGAAGGTGCCCTACAACGTGGGCCCAGGCTTCACCGGCAACTTCTCCACCCAGAAAGTGAAGATGCACATCCACTCCACCTCCGAAGTGACCAGGATCTACAACGTGATCGGCACCCTGAGAGGCGCCGTGGAACCCGACAGATACGTGATCCTGGGCGGCCACAGGGACAGCTGGGTGTTCGGCGGCATCGACCCACAGTCTGGCGCCGCTGTGGTGCACGAGATCGTGCGGTCCTTCGGAACCCTGAAGAAAGAGGGATGGCGCCCCAGAAGGACAATCCTGTTCGCCTCCTGGGACGCCGAGGAATTCGGCCTGCTGGGATCCACCGAGTGGGCCGAGGAAAACTCCAGGCTGCTGCAGGAAAGGGGCGTCGCCTACATCAACGCCGACTCCTCCATCGAGGGCAACTACACCCTGAGGGTGGACTGCACCCCCCTGATGTACTCCCTGGTGTACAACCTGACCAAAGAGCTGGAATCCCCCGACGAGGGCTTCGAGGGCAAGTCCCTGTACGAGTCCTGGACCAAGAAGTCCCCATCCCCCGAGTTCTCCGGCATGCCCAGGATCTCCAAGCTGGGCTCCGGCAACGACTTCGAGGTGTTCTTCCAGAGGCTGGGAATCGCCTCCGGCAGGGCCAGATACACCAAGAACTGGGAGACAAACAAGTTCTCCTCCTACCCCCTGTACCACTCCGTGTACGAAACCTACGAGCTGGTGGAAAAGTTCTACGACCCCATGTTCAAGTACCACCTGACCGTGGCCCAGGTCCGCGGAGGCATGGTGTTCGAGCTGGCCAACTCCGTGGTGCTGCCCTTCGACTGCAGAGACTATGCTGTGGTGCTGAGGAAGTACGCCGACAAAATCTACAACATCTCCATGAAGCACCCCCAGGAAATGAAGACCTACTCCGTGTCCTTCGACTCCCTGTTCTCCGCCGTGAAGAATTTCACCGAGATCGCCTCCAAGTTCTCCGAGAGGCTGAGGGACTTCGACAAGTCCAACCCCATCCTGCTGAGGATGATGAACGACCAGCTGATGTTCCTGGAAAGGGCCTTCATCGACCCCCTGGGCCTGCCAGACAGGCCCTTCTACAGGCACGTGATCTACGCCCCATCCTCCCACAACAAATACGCCGGCGAGTCCTTCCCCGGCATCTACGATGCCCTGTTCGACATCGAGTCCAAGGTGGACCCCTCCCAGGCTTGGGGCGAAGTGAAGAGGCAGATCAGTATCGCCACATTCACAGTGCAGGCCGCTGCCGAAACCCTGTCCGAGGTGGCC

Claims (48)

1.一种分离的免疫原性PSMA多肽，其氨基酸序列与SEQ ID NO:1之人类PSMA的氨基酸15-750具有90％至99％相同性且在相应位置包含人类PSMA蛋白之至少10、11、12、13、14、15、16、17、18或19个保守T细胞表位之氨基酸。
2.如权利要求1之分离的免疫原性PSMA多肽，其包含人类PSMA的至少15、16、17、18或19个保守T细胞表位。
3.如权利要求2之分离的免疫原性PSMA多肽，其与SEQ ID NO:1之人类PSMA的氨基酸15-750具有94％至97％相同性。
4.如权利要求3之分离的免疫原性PSMA多肽，其包含选自如下一组的氨基酸序列：
a)SEQ ID NO:3之氨基酸序列；
b)SEQ ID NO:5之氨基酸序列；
c)SEQ ID NO:7之氨基酸序列；及
d)SEQ ID NO:9之氨基酸序列。
5.如权利要求3之分离的免疫原性PSMA多肽，其由选自如下一组的氨基酸序列组成：
a)SEQ ID NO:3之氨基酸序列；
b)SEQ ID NO:5之氨基酸序列；
c)SEQ ID NO:7之氨基酸序列；及
d)SEQ ID NO:9之氨基酸序列。
6.一种组合物，其包含如权利要求1至5中任一项之分离的免疫原性PSMA多肽或其功能变体，及药用可接受之赋形剂。
7.如权利要求6之组合物，其进一步包含免疫原性PSA多肽。
8.如权利要求7之组合物，其中该免疫原性PSA多肽由SEQ IDNO:17之氨基酸序列组成。
9.如权利要求8之组合物，其中该免疫原性PSA多肽由SEQ IDNO:19之氨基酸序列组成。
10.一种分离的核酸分子，其包含编码如权利要求1至5中任一项之免疫原性PSMA多肽之核苷酸序列。
11.一种分离的核酸分子，其包含选自如下一组的核苷酸序列或其简并变体：
a)SEQ ID NO:4之核苷酸序列；
b)SEQ ID NO:6之核苷酸序列；
c)SEQ ID NO:8之核苷酸序列；及
d)SEQ ID NO:10之核苷酸序列。
12.一种质粒构建体，其包含如权利要求10或权利要求11之分离的核酸分子。
13.一种载体，其包含如权利要求10或权利要求11之核酸分子。
14.一种组合物，其包含如权利要求10或权利要求11之分离的核酸分子、如权利要求12之质粒构建体或如权利要求13之载体。
15.如权利要求14之组合物，其进一步包含编码由SEQ ID NO:17之氨基酸序列或SEQ ID NO:19之氨基酸序列组成的免疫原性PSA多肽之核酸分子。
16.如权利要求15之组合物，其进一步包含编码人类PSCA蛋白之核酸分子。
17.如权利要求16之组合物，其为疫苗组合物。
18.抑制哺乳动物中之异常细胞增殖的方法，其包含给所述哺乳动物施用有效量的如权利要求6至9或14至17中任一项之组合物。
19.引发哺乳动物之免疫反应的方法，其包含给所述哺乳动物施用有效量的如权利要求6至9或14至17中任一项之组合物。
20.治疗人类之前列腺癌的方法，其包含给该人施用有效量的如权利要求6至9或14至17中任一项之组合物。
21.增强疫苗之治疗效应以便治疗哺乳动物之赘生性病症的方法，该方法包含向接受该疫苗之该哺乳动物施用(1)有效量之至少一种免疫抑制细胞抑制剂及(2)有效量之至少一种免疫效应细胞增强剂。
22.增强疫苗之免疫原性以便治疗哺乳动物之赘生性病症的方法，该方法包含向接受该疫苗之该哺乳动物施用(1)有效量之至少一种免疫抑制细胞抑制剂及(2)有效量之至少一种免疫效应细胞增强剂。
23.如权利要求21至22中任一项之方法，其中该哺乳动物为人类。
24.如权利要求23之方法，其中该赘生性病症为癌症。
25.如权利要求24之方法，其中该至少一种免疫抑制细胞抑制剂选自蛋白激酶抑制剂、COX-2抑制剂或PDE5抑制剂；且其中该至少一种免疫效应细胞增强剂选自CTLA-4抑制剂、CD40激动剂、TLR激动剂、4-1BB激动剂、OX40激动剂、GITR激动剂、PD-1拮抗剂或PD-L1拮抗剂。
26.如权利要求25之方法，其中：
1)该蛋白激酶抑制剂选自如下一组：伊马替尼(imatinib)、索拉非尼(sorafenib)、拉帕替尼(lapatinib)、扎克替玛(zactima)、MP-412、达沙替尼(dasatinib)、来他替尼(lestaurtinib)、拉帕替尼(lapatinib)、苹果酸舒尼替尼(sunitinib malate)、阿西替尼(axitinib)、埃罗替尼(erlotinib)、吉非替尼(gefitinib)、博索替尼(bosutinib)、坦罗莫司(temsirolismus)及尼勒替尼(nilotinib)；
2)该CTLA-4抑制剂选自如下一组：伊匹单抗(ipilimumab)及曲美目单抗(Tremelimumab)；
3)该CD40激动剂为选自如下一组的抗CD40抗体：G28-5、mAb89、EA-5、S2C6、CP870893及达西珠单抗(dacetuzumab)；且
4)该TLR激动剂为选自如下一组的CpG寡核苷酸：CpG 24555、CpG10103、CpG7909及CpG1018。
27.如权利要求26之方法，其中该至少一种免疫抑制细胞抑制剂为蛋白激酶抑制剂且其中该至少一种免疫效应细胞增强剂为CTLA-4抑制剂。
28.如权利要求27之方法，其中该蛋白激酶抑制剂选自索拉非尼、达沙替尼、伊马替尼、阿西替尼或苹果酸舒尼替尼，且其中该CTLA-4抑制剂为曲美目单抗。
29.如权利要求28之方法，其中该蛋白激酶抑制剂为以约1至25毫克/剂量经口施用之苹果酸舒尼替尼，且曲美目单抗为以约10至150毫克/剂量经皮内或皮下施用。
30.如权利要求29之方法，其进一步包含第二免疫效应细胞增强剂，其中该第二免疫效应细胞增强剂为选自CpG24555、CpG10103、CpG7909、CpG1018或CpG1018之TLR激动剂。
31.治疗人类赘生性病症的方法，包含给该人施用(1)有效量的疫苗、(2)有效量的至少一种免疫抑制细胞抑制剂及(3)有效量的至少一种免疫效应细胞增强剂，其中该疫苗能够引发针对与该赘生性病症相关之肿瘤相关抗原之免疫反应。
32.如权利要求31之方法，其中该赘生性病症为前列腺癌。
33.如权利要求32之方法，其中该疫苗包含编码选自如下一组的免疫原性PSMA多肽之核酸分子：
1)由SEQ ID NO:9之氨基酸序列组成的多肽；
2)由SEQ ID NO:3之氨基酸4-739组成的多肽；
3)由SEQ ID NO:5之氨基酸4-739组成的多肽；及
4)由SEQ ID NO:7之氨基酸4-739组成的多肽。
34.如权利要求33之方法，其中该分离的核酸分子包含选自如下一组的核苷酸序列：
1)包含SEQ ID NO:4之核苷酸10-2217的核苷酸序列；
2)包含SEQ ID NO:6之核苷酸10-2217的核苷酸序列；
3)包含SEQ ID NO:8之核苷酸10-2217的核苷酸序列；及
4)包含SEQ ID NO:10之核苷酸10-2217的核苷酸序列，或任一所述核苷酸序列之简并变体。
35.如权利要求33之方法，其中该疫苗进一步包含编码免疫原性PSA多肽之核酸分子且其中该免疫原性PSA多肽选自如下一组：
1)包含SEQ ID NO:17之氨基酸序列或SEQ ID NO:17之氨基酸4-240的多肽；
2)由SEQ ID NO:17之氨基酸序列或SEQ ID NO:17之氨基酸4-240组成的多肽；
3)包含SEQ ID NO:19之氨基酸序列或SEQ ID NO:19之氨基酸4-281的多肽；及
4)由SEQ ID NO:19之氨基酸序列或SEQ ID NO:19之氨基酸4-281组成的多肽。
36.如权利要求35之方法，其中该疫苗进一步包含编码该人类PSCA多肽之核酸分子。
37.如权利要求36之方法，其中该免疫原性PSCA多肽为全长人类PSCA。
38.如权利要求32之方法，其中该疫苗包含编码选自由免疫原性PSMA多肽、免疫原性PSA多肽及免疫原性PSCA多肽组成的组中之至少两种免疫原性PAA多肽的多抗原构建体。
39.如权利要求32之方法，其中该疫苗包含编码选自由免疫原性PSMA多肽、免疫原性PSA多肽及免疫原性PSCA多肽组成的组中之至少三种免疫原性PAA多肽的多抗原构建体。
40.如权利要求38或权利要求39之方法，其中该免疫原性PSMA多肽系选自如下一组：1)由SEQ ID NO:9之氨基酸序列组成的多肽；
2)由SEQ ID NO:3之氨基酸4-739组成的多肽；
3)由SEQ ID NO:5之氨基酸4-739组成的多肽；及
4)由SEQ ID NO:7之氨基酸4-739组成的多肽，
其中该免疫原性PSA多肽选自如下一组：1)包含SEQ ID NO:17之氨基酸序列或SEQ ID NO:17之氨基酸4-240的多肽；
2)由SEQ ID NO:17之氨基酸序列或SEQ ID NO:17之氨基酸4-240组成的多肽；
3)包含SEQ ID NO:19之氨基酸序列或SEQ ID NO:19之氨基酸4-281的多肽；及
4)由SEQ ID NO:19之氨基酸序列或SEQ ID NO:19之氨基酸4-281组成的多肽，且
其中该免疫原性PSCA多肽为全长人类PSCA。
41.如权利要求40之方法，其中该至少一种免疫抑制细胞抑制剂选自蛋白激酶抑制剂、COX-2抑制剂或PDE5抑制剂；且其中该至少一种免疫效应细胞增强剂选自CTLA-4抑制剂、CD40激动剂、TLR激动剂、4-1BB激动剂、OX40激动剂、GITR激动剂、PD-1拮抗剂或PD-L1拮抗剂。
42.如权利要求25之方法，其中：
1)该蛋白激酶抑制剂系选自如下一组：伊马替尼、索拉非尼、拉帕替尼、扎克替玛、MP-412、达沙替尼、来他替尼、拉帕替尼、苹果酸舒尼替尼、阿西替尼、埃罗替尼、吉非替尼、博索替尼、坦罗莫司及尼勒替尼；
2)该CTLA-4抑制剂选自由伊匹单抗及曲美目单抗组成的组；
3)该CD40激动剂为选自如下一组的抗CD40抗体：G28-5、mAb89、EA-5、S2C6、CP870893及达西珠单抗；及
4)该TLR激动剂为选自如下一组的CpG寡核苷酸：CpG24555、CpG10103、CpG7909及CpG1018。
43.如权利要求42之方法，其中该至少一种免疫抑制细胞抑制剂为蛋白激酶抑制剂，且其中该至少一种免疫效应细胞增强剂为CTLA-4抑制剂。
44.如权利要求43之方法，其中该蛋白激酶抑制剂选自索拉非尼、达沙替尼、伊马替尼、阿西替尼、博索替尼或苹果酸舒尼替尼，且其中该CTLA-4抑制剂为曲美目单抗。
45.如权利要求44之方法，其中该蛋白激酶抑制剂为以约1至25毫克/剂量经口施用之苹果酸舒尼替尼，且曲美目单抗以约10至150毫克/剂量经皮内或皮下施用。
46.如权利要求44之方法，其中该蛋白激酶抑制剂为每天两次以约1、2、3、4或5毫克/剂量经口施用之阿西替尼，且曲美目单抗系以约10至150毫克/剂量经皮内或皮下施用。
47.如权利要求45或权利要求46之方法，其进一步包含第二免疫效应细胞增强剂，其中该第二免疫效应细胞增强剂为选自CpG24555、CpG10103、CpG7909或CpG1018之TLR激动剂。
48.如权利要求47之方法，其中该疫苗为DNA疫苗，且其中该疫苗及该TLR激动剂以混合物形式通过电穿孔法施用。
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