TW201348447A - 前列腺相關抗原及基於疫苗之免疫治療療程 - Google Patents

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Abstract

本發明提供(a)分離之免疫原性PAA多肽；(b)編碼免疫原性PAA多肽之分離之核酸分子；(c)包含免疫原性PAA多肽或編碼免疫原性PAA多肽之分離之核酸分子的疫苗組合物；(d)與使用多肽、核酸分子及組合物相關之方法；及(e)基於疫苗之免疫治療療程，其包括共同投與疫苗與免疫抑制細胞抑制劑及免疫效應細胞增強劑之組合。

Description

前列腺相關抗原及基於疫苗之免疫治療療程 對相關申請案之參考
本申請案主張2012年5月4日申請之美國臨時申請案第61/642,844號之權益，該申請案以全文引用的方式併入本文中。
對序列表之參考
本申請案正與呈電子格式之序列表一起提交。序列表以名稱為「PC71854A SEQ LISTING_ST25.TXT」之.txt格式文檔提供，其創建於2013年4月4日且大小為257KB。該.txt文檔中所含之序列表為本說明書之一部分且以全文引用的方式併入本文中。
本發明大體上係關於免疫治療且特定言之，係關於治療或預防贅生性病症之疫苗及方法。
在世界範圍內，癌症為死亡之一個主要誘因。傳統癌症管理療程已成功地管理循環癌症及實體癌症之選擇性群組。然而，許多腫瘤對傳統方法具有抗性。近年來，已研究治療癌症之免疫療法，該方法包括藉由在遠離腫瘤之部位投與疫苗組合物來產生宿主源全身性腫瘤特異性主動免疫反應。已提出多種類型疫苗，包括含有分離之腫瘤相關抗原的疫苗。
在全世界發達國家中，前列腺癌為第二最常診斷出之癌症且為 人類之癌症相關死亡之第四主要誘因。已證明與正常對應物相比，前列腺癌細胞過度表現各種前列腺相關抗原(PAA)，諸如前列腺特異性抗原(PSA)、前列腺特異性膜抗原(PSMA)及前列腺幹細胞抗原(PSCA)。因此，此等抗原代表經由使用基於疫苗之免疫療法誘導針對表現該等抗原之癌症之特異性免疫反應的可能標靶。(參看例如Marrari,A.,M.Iero等人，(2007).「Vaccination therapy in prostate cancer」.Cancer Immunol Immunother 56(4)：429-45。)
PSCA為123個胺基酸之膜蛋白。全長人類PSCA之胺基酸序列由SEQ ID NO：21之胺基酸4-123組成。PSCA具有高度組織特異性且表現於超過85%前列腺癌樣本上，其中表現量隨著格里森分數(Gleason score)提高及雄激素非依賴性增強而增加。其表現於80-100%前列腺癌骨轉移患者中。
PSA為胰舒血管素樣絲胺酸蛋白酶，其完全由前列腺之腺泡及導管襯層中之柱狀上皮細胞產生。PSA mRNA轉譯為具有261個胺基酸之非活性前原PSA前驅物。前原PSA具有24個額外殘基，該等殘基構成前區(信號多肽)及原多肽。原多肽之釋放產生具有237個胺基酸之成熟細胞外形式，該形式具有酶活性。人類全長PSA之胺基酸序列提供於SEQ ID NO：15中。PSA具有器官特異性，且因此，其由良性前列腺增生(BPH)組織、原發性前列腺癌組織及轉移性前列腺癌組織之上皮細胞產生。
PSMA，亦稱為葉酸水解酶1(FOLH1)，由750個胺基酸組成。人類全長PSMA之胺基酸序列提供於SEQ ID NO：1中。PSMA包括細胞質域(胺基酸1-19)、跨膜域(胺基酸20-43)及細胞外域(胺基酸44-750)。PSMA為表現於前列腺癌細胞表面上及新生血管上之II型二聚跨膜蛋白。其亦表現於正常前列腺細胞、腦、唾液腺及膽樹上。然而，在前列腺癌細胞中，發現其表現量為正常組織的1000倍。其充分 表現於諸如結腸癌、乳癌、肝癌、膀胱癌、胰臟癌、肺癌、腎癌以及黑素瘤及肉瘤之多種其他實體腫瘤之新生血管上。因此，PSMA不僅被視為前列腺癌細胞特異性標靶，而且為其他癌症之全癌瘤標靶。PSMA之表現似乎為前列腺癌瘤之通用特徵且其增強之表現與腫瘤侵襲有關。PSMA表現在高等級腫瘤、轉移性病變及雄激素非依賴性疾病中最高。
雖然已鑑別許多腫瘤相關抗原且已研究許多此等抗原作為基於蛋白質或基於DNA之疫苗用於治療或預防癌症，但迄今大部分臨床試驗未能產生治療性產品。開發癌症疫苗之挑戰之一在於癌症抗原通常來源於自身且因此具有不良免疫原性，此係因為免疫系統經自身調節而不識別自身蛋白質。因此，需要一種可增強癌症疫苗之免疫原性或治療效應的方法。
已研究許多方法以便增強免疫原性或增強癌症疫苗之抗腫瘤效力。此種方法之一包括使用各種免疫調節劑，諸如TLR促效劑、TNFR促效劑、CTLA-4抑制劑及蛋白激酶抑制劑。
Toll樣受體(TLR)為表現於造血細胞及非造血細胞上之1型膜受體。在TLR家族中，已鑑別至少11個成員。此等受體之特徵在於其能夠識別病原性生物體所表現之病原體相關分子模式(PAMP)。已發現觸發TLR將藉由增強細胞素產生、趨化因子受體表現(CCR2、CCR5及CCR7)及協同刺激分子表現而引起深遠發炎反應。因而，此等受體在先天免疫系統中對隨之而來之後天免疫反應的極性發揮控制作用。在TLR中，已廣泛研究TLR9在免疫反應中之功能。刺激TLR9受體藉由增加促發炎性細胞素之產生及協同刺激分子對T細胞之呈現而將抗原呈現細胞(APC)導向激活強效TH1主導型T細胞反應。發現CpG寡核苷酸，即TLR9配位體，為一類強效免疫刺激因子。已針對多種腫瘤模型在小鼠中測試CpG療法，且一致顯示促進腫瘤抑制或消退。
細胞毒性T淋巴細胞抗原4(CTLA-4)為免疫球蛋白超家族之成員且表現於輔助T細胞表面上。CTLA-4為CD28依賴性T細胞活化之負調節劑，且充當適應性免疫反應之抑制檢查點。類似於T細胞協同刺激蛋白質CD28，CTLA-4結合抗原呈現細胞上之CD80及CD86。CTLA-4向T細胞傳遞抑制信號，而CD28傳遞刺激信號。針對人類CTLA-4之人類抗體已描述為許多疾病病狀中之免疫刺激調節劑，諸如治療或預防病毒性及細菌性感染以及用於治療癌症(WO 01/14424及WO 00/37504)。各種臨床前研究已顯示單株抗體所致之CTLA-4阻斷可增強針對免疫原性腫瘤之宿主免疫反應且甚至可排除已確立之腫瘤。已在治療各種類型實體腫瘤之臨床試驗中研究兩種完全人類抗人類CTLA-4單株抗體(mAb)，即伊匹單抗(ipilimumab，MDX-010)及曲美目單抗(Tremelimumab，亦稱為CP-675206)。
腫瘤壞死因子(TNF)超家族為接合特定同源細胞表面受體TNF受體(TNFR)超家族之一組細胞素。腫瘤壞死因子超家族之成員藉由配位體介導之三聚合而起作用，從而募集若干個細胞內接附子以活化多個信號轉導路徑，諸如細胞凋亡、NF-kB路徑、JNK路徑，以及免疫及發炎反應。TNF超家族之實例包括CD40配位體、OX40配位體、4-1BB配位體、CD27、CD30配位體(CD153)、TNF-α、TNF-β、RANK配位體、LT-α、LT-β、GITR配位體及LIGHT。TNFR超家族包括例如CD40、OX40、4-1BB、CD70(CD27配位體)、CD30、TNFR2、RANK、LT-βR、HVEM、GITR、TROY及RELT。在B淋巴細胞、樹突狀細胞、濾泡樹突狀細胞、造血祖細胞、上皮細胞及癌瘤之表面上發現CD40。CD40結合配位體(CD40-L)，該配位體為醣蛋白且表現於活化T細胞(主要為CD4+以及一些CD8+)以及嗜鹼細胞/肥大細胞上。由於CD40在先天性及適應性免疫反應中之作用，因此已研究CD40促效劑，包括各種CD40促效抗體，諸如完全人類促效劑CD40單株抗體 CP870893，作為疫苗佐劑及用於治療之用途。
蛋白激酶為催化蛋白質中之特定殘基磷酸化的酶家族。蛋白激酶為信號轉導路徑中的關鍵元件，其負責將細胞外信號(包括細胞素對其受體之作用)轉導至細胞核，從而觸發各種生物事件。蛋白激酶在標準細胞生理學中之許多作用包括細胞週期控制及細胞生長、分化、細胞凋亡、細胞遷移及有絲分裂。諸如c-Src、c-Abl、有絲分裂原活化蛋白質(MAP)激酶、磷脂醯肌醇-3-激酶(PI3K)AKT及表皮生長因子(EGF)受體之激酶通常在癌細胞中活化且已知有助於腫瘤形成。邏輯上，目前正開發許多激酶抑制劑用於抗癌症治療，詳言之酪胺酸激酶抑制劑(TKI)、細胞週期素依賴性激酶抑制劑、極光(aurora)激酶抑制劑、細胞週期檢查點抑制劑、表皮生長因子受體(EGFR)抑制劑、FMS樣酪胺酸激酶抑制劑、來源於血小板之生長因子受體(PDGFR)抑制劑、激酶插入域抑制劑、靶向PI3K/Akt/mTOR路徑之抑制劑、靶向Ras-Raf-MEK-ERK(ERK)路徑之抑制劑、血管內皮生長因子受體(VEGFR)激酶抑制劑、c-kit抑制劑及絲胺酸/蘇胺酸激酶抑制劑。臨床研究中已研究用於抗癌症療法之許多激酶抑制劑，包括例如MK0457、VX-680、ZD6474、MLN8054、AZD2171、SNS-032、PTK787/ZK222584、索拉非尼(Sorafenib；BAY43-9006)、SU5416、SU6668 AMG706、紮克替瑪(Zactima；ZD6474)、MP-412、達沙替尼(Dasatinib)、CEP-701(來他替尼(Lestaurtinib))、XL647、XL999、泰克泊(Tykerb)(拉帕替尼(Lapatinib))、MLN518(先前稱為CT53518)、PKC412、ST1571、AMN107、AEE 788、OSI-930、OSI-817、蘋果酸舒尼替尼(Sunitinib malate)(紓癌特(Sutent))；SU11248)、瓦他拉尼(Vatalanib；PTK787/ZK 222584)、SNS-032、SNS-314及阿西替尼(Axitinib；AG-013736)。吉非替尼(Gefitinib)及埃羅替尼(Erlotinib)為兩種經口可利用之EGFR-TKI。
已研究之免疫調節劑通常全身性投與患者，例如藉由經口投藥、靜脈內注射或輸注、或肌肉內注射。限制一些免疫調節劑之有效使用的一個主要因素為高度全身性暴露於所投與之藥劑所致的毒性。舉例而言，相對於CD40促效劑，已報導對於所例示之促效性CD40抗體，0.3mg/kg為最大耐受劑量且更高劑量可引發副作用，包括靜脈血栓栓塞、3級頭痛、導致毒性效應(諸如冷戰及其類似效應)之細胞素釋放及暫時性肝中毒。(Vanderheide等人，J Clin.Oncol.25(7)：876-8833(2007年3月)。在患有轉移性腎細胞癌瘤之患者中研究靜脈內曲美目單抗(一種抗CTLA-4抗體)加經口舒尼替尼之組合的臨床試驗中，觀察到腎衰竭快速發作且因此，不推薦以每日高於6mg/kg曲美目單抗加37.5mg舒尼替尼之劑量進行進一步研究。參看：Brian I.Rini等人：Phase 1 Dose-Escalation Trial of Tremelimumab Plus Sunitinib in Patients With Metastatic Renal Cell Carcinoma.Cancer 117(4)：758-767(2011)]。因此，需要基於疫苗之免疫治療療程，其中以不會引發嚴重不良副作用(諸如肝中毒或腎衰竭)之有效劑量投與免疫調節劑。
在一些態樣中，本發明提供分離之免疫原性PSMA多肽及免疫原性PSA多肽，該等多肽適用於例如引發活體內(例如在動物中，包括人類)或活體外免疫反應、產生抗體、或用作治療癌症(包括前列腺癌)之疫苗中的組分。在一個態樣中，本發明提供分離之免疫原性PSMA多肽，其與SEQ ID NO：1之人類PSMA之胺基酸15-750具有至少90%一致性且在相應位置包含人類PSMA之至少10、11、12、13、14、15、16、17、18或19個保守T細胞抗原決定基之胺基酸。
在其他態樣中，本發明提供編碼免疫原性PAA多肽之核酸分子。在一些實施例中，本發明提供分離之核酸分子或其簡併變異體，其包含編碼本發明所提供之免疫原性PSMA多肽或該多肽之功能變異體的 核苷酸序列。
在一些其他態樣中，本發明提供多抗原核酸構築體，該等構築體各自編碼兩個或兩個以上免疫原性PAA多肽。
本發明亦提供含有一或多種本發明核酸分子之載體。載體適用於選殖或表現由該等核酸分子編碼之免疫原性PAA多肽，或用於向宿主細胞或宿主動物(諸如人類)遞送呈組合物(諸如疫苗)形式之核酸分子。
在一些其他態樣中，本發明提供組合物，其包含一或多個免疫原性PAA多肽、編碼免疫原性PAA多肽之分離之核酸分子、或含有編碼免疫原性PAA多肽之核酸分子之載體或質體。在一些實施例中，該組合物為適用於在諸如小鼠、狗、猴或人類之哺乳動物中引發針對PAA之免疫反應的免疫原性組合物。在一些實施例中，該組合物為疫苗組合物，其適用於對諸如人類之哺乳動物進行免疫、用於抑制異常細胞增殖、用於防止癌症發展(用作預防劑)或用於治療與PAA過度表現相關之病症(諸如癌症，尤其是前列腺癌)(用作治療劑)。
在再其他態樣中，本發明提供使用免疫原性PAA多肽、分離之核酸分子及包含上文所述之免疫原性PAA多肽或分離之核酸分子之組合物的方法。在一些實施例中，本發明提供在哺乳動物，尤其是人類中引發針對PAA之免疫反應的方法，該方法包含向該哺乳動物投與有效量之本發明所提供針對標靶PAA具有免疫原性之多肽、有效量之編碼此種免疫原性多肽之分離之核酸分子、或包含此種免疫原性PAA多肽或編碼此種免疫原性PAA多肽之分離之核酸分子的組合物。多肽或核酸疫苗可與一或多種佐劑一起使用。
在又其他態樣中，本發明提供基於疫苗之免疫治療療程(或「VBIR」)，其包括將遞送各種腫瘤相關抗原(TAA)來誘導TAA特異性免疫反應以治療多種癌症的疫苗與至少一種免疫抑制細胞抑制劑及 至少一種免疫效應細胞增強劑的組合共同投與。特定言之，在一些態樣中，本發明提供一種增強疫苗之免疫原性或治療效應以便治療哺乳動物之贅生性病症的方法，該方法包含向接受該疫苗之該哺乳動物投與有效量之至少一種免疫抑制細胞抑制劑及至少一種免疫效應細胞增強劑。在另一態樣中，本發明提供一種治療哺乳動物之贅生性病症的方法，該方法包含向該哺乳動物投與疫苗、至少一種免疫抑制細胞抑制劑及至少一種免疫效應細胞增強劑。
圖1. PJV7563載體之示意性說明。
圖2. 5個病毒2A卡匣之胺基酸比對。跳過之甘胺酸-脯胺酸鍵由星號指示。
圖3. 較佳EMCV IRES之序列。轉譯起始位點由星號指示。極少IRES元件不包括EMCV L蛋白質之加下劃線之前5個密碼子。
圖4. 點陣圖，其顯示經修飾之人類PSMA抗原(胺基酸15-750)及全長人類PSCA在經雙抗原疫苗構築體轉染之HEK293細胞表面上之表現，如藉由流動式細胞測量術所量測。
圖5A及5B. 西方墨點法影像，其顯示經修飾之人類PSMA抗原(胺基酸15-750)及全長人類PSCA在經雙抗原疫苗構築體轉染之HEK293細胞中之表現，如藉由西方墨點法用PSMA及PSCA特異性單株抗體所量測。
圖6. 西方墨點法影像，其顯示人類PSA胞溶質抗原(胺基酸25-261)在經雙抗原疫苗構築體轉染之HEK293細胞中之表現，如藉由西方墨點法用PSA特異性單株抗體所量測。泳道5300展現比PSA高出約2kD之模糊色帶，與2A肽之C末端融合一致。
圖7A、7B. 點陣圖，其顯示經修飾之人類PSMA抗原(胺基酸15-750)及全長人類PSCA在經三抗原疫苗構築體轉染之HEK293細胞表面 上之表現，如藉由流動式細胞測量術所量測。(圖7A. 單抗原對照及單啟動子三抗原構築體。圖7B. 雙啟動子三抗原構築體。)
圖8A、8B. 西方墨點法影像，其顯示人類PSA在經三抗原疫苗構築體轉染之HEK293細胞中之表現，如藉由西方墨點法用PSA特異性單株抗體所量測。泳道5297中之色帶溢入泳道5259及456中。雖然在所掃描之凝膠中不可見，但泳道456、457及458展現比PSA高出約2kD之色帶，與2A肽之C末端融合一致。(圖8A. 單啟動子三抗原構築體。圖8B. 雙啟動子三抗原構築體。)
圖9A至9D. 描繪藉由IFN-γ ELISPOT分析評估三抗原疫苗之免疫原性的代表性研究之結果的圖表。
圖10A至10D. 描繪藉由IFN-γ ELISPOT分析評估三抗原疫苗之免疫原性的代表性研究之結果的圖表。
圖11. 描繪藉由抗PSMA抗體效價評估三抗原疫苗之免疫原性的代表性研究之結果的圖表。
圖12. 描繪藉由抗PSCA抗體效價評估三抗原疫苗之免疫原性的代表性研究之結果的圖表。
圖13. 描繪藉由抗PSMA抗體細胞表面結合評估三抗原疫苗之免疫原性的代表性研究之結果的圖表。
圖14. 描繪藉由抗PSCA抗體細胞表面結合評估三抗原疫苗之免疫原性的代表性研究之結果的圖表。
圖15A至15C. 描繪藉由IFN-γ ELISPOT分析評估雙抗原疫苗之免疫原性的代表性研究之結果的圖表。
圖16A至16C. 描繪藉由IFN-γ ELISPOT分析評估雙抗原疫苗之免疫原性的代表性研究之結果的圖表。
圖17. 描繪藉由抗PSMA抗體效價評估雙抗原疫苗之免疫原性的代表性研究之結果的圖表。
圖18. 描繪藉由抗PSCA抗體效價評估雙抗原疫苗之免疫原性的代表性研究之結果的圖表。
圖19. 描繪藉由抗PSMA抗體細胞表面結合評估雙抗原疫苗之免疫原性的代表性研究之結果的圖表。
圖20. 描繪藉由抗PSCA抗體細胞表面結合評估雙抗原疫苗之免疫原性的代表性研究之結果的圖表。
圖21A至21D. 描繪藉由IFN-γ ELISPOT分析評估雙抗原疫苗之免疫原性的代表性研究之結果的圖表。
圖22. 描繪藉由抗PSMA抗體效價評估雙抗原疫苗之免疫原性的代表性研究之結果的圖表。
圖23. 描繪藉由抗PSCA抗體效價評估雙抗原疫苗之免疫原性的代表性研究之結果的圖表。
圖24. 描繪藉由抗PSMA抗體細胞表面結合評估雙抗原疫苗之免疫原性的代表性研究之結果的圖表。
圖25. 描繪藉由抗PSCA抗體細胞表面結合評估雙抗原疫苗之免疫原性的代表性研究之結果的圖表。
圖26. 描繪代表性研究之結果的圖表，此研究係評估經修飾之人類PSMA抗原(aa 15-750)相對於全長人類PSMA(aa 1-750)在C57BL/6小鼠中引發之T細胞免疫反應。
圖27A、27B. 描繪代表性研究之結果的圖表，此研究係藉由IFN-γ ELISPOT分析來評估經修飾之人類PSMA抗原(aa 15-750)相對於全長人類PSMA抗原(aa 1-750)在巴斯德(Pasteur)(HLA-A2/DR1)轉殖基因小鼠中之T細胞免疫反應。
圖28. 描繪藉由抗PSMA抗體效價評估經修飾之人類PSMA及全長PSMA疫苗之免疫原性的代表性研究之結果的圖表。
圖29. 描繪藉由抗PSMA抗體細胞表面結合評估經修飾之人類 PSMA及全長PSMA疫苗之免疫原性的代表性研究之結果的圖表。
圖30. 描繪代表性研究之結果的圖表，此研究係評估經10mg/kg抗CTLA-4(CP-675,206)注射之印度恆河猴(Rhesus macaques)中之血液抗CTLA-4單株抗體含量(藉由競爭性ELISA加以量測)。
圖31A及31B. 描繪代表性研究之結果的圖表，此研究係藉由細胞內細胞素染色分析、根據疫苗誘導之免疫反應之品質來評估抗鼠類CTLA-4單株抗體(純系9H10)之免疫調節活性。
圖32. 描繪代表性研究之結果的圖表，此研究係在用蘋果酸舒尼替尼(紓癌特(Sutent))作為單一療法或與對照物(對照)或癌症疫苗(rHER2)組合治療後評估並比較皮下腫瘤生長速率。
圖33A至33D. 顯示代表性研究之小鼠個別腫瘤生長速率的圖表，此研究係評估並比較20mg/kg蘋果酸舒尼替尼(紓癌特(Sutent))與對照物(對照)或癌症疫苗(rHER2)之抗腫瘤效力。
圖34. 顯示圖33所述研究中之小鼠群組之卡普蘭-麥爾存活曲線(Kaplan-Meier survival curve)的圖表，該研究係評估蘋果酸舒尼替尼(紓癌特(Sutent))與對照物(對照)或癌症疫苗(癌症)在經蘋果酸舒尼替尼(紓癌特(Sutent))與對照物(對照)或癌症疫苗(rHER2)處理之小鼠中之抗腫瘤效力。
圖35A、35B. 顯示圖33中之經處理小鼠之周邊血液中之骨髓源抑制細胞(Gr1+CD11b+)及含Treg之CD25+CD4+細胞之變化的圖表。
圖36A至36C. 顯示自小鼠腫瘤中分離之骨髓源抑制細胞(Gr1+CD11b+)、Tregs(CD4+CD25+Foxp3+)及PD-1+ CD8 T細胞之總數變化的圖表。
圖37. 顯示代表性研究中之小鼠群組之卡普蘭-麥爾存活曲線的圖表，此研究係評估蘋果酸舒尼替尼(紓癌特(Sutent))及抗鼠類CTLA-4單株抗體(純系9D9)與對照物(對照)或癌症疫苗(疫苗)之組合在攜帶 皮下TUBO腫瘤之BALB/neuT小鼠中之抗腫瘤效力。
圖38. 顯示具有皮下TUBO腫瘤之BALB/neuT小鼠之血液舒尼替尼含量之動力學的圖表。
圖39. 顯示代表性研究中之小鼠群組之卡普蘭-麥爾存活曲線的圖表，此研究係評估蘋果酸舒尼替尼(紓癌特(Sutent))及對照物或癌症疫苗給藥對具有皮下TUBO腫瘤之BALB/neuT小鼠之抗腫瘤效力。
圖40. 描繪代表性研究中之小鼠群組之IFNγ ELISPOT結果的圖表，此研究係評估rHER2疫苗與免疫調節劑一起給藥時所誘導之抗原特異性T細胞反應之量值。
圖41A及41B. 描繪代表性研究之結果的圖表，此研究係藉由細胞內細胞素染色分析、根據疫苗誘導之免疫反應之品質來評估CpG7909(PF-03512676)之免疫調節活性。
圖42A、42B. 描繪代表性研究之結果的圖表，此研究係藉由細胞內細胞素染色分析、根據疫苗誘導之免疫反應之品質來評估促效性抗鼠類CD40單株抗體之免疫調節活性。
圖43. 顯示代表性研究中之小鼠群組之卡普蘭-麥爾存活曲線的圖表，此研究係評估低劑量蘋果酸舒尼替尼(紓癌特(Sutent))及對照物或癌症疫苗在攜帶自發性乳腺腫瘤之BALB/neuT小鼠中之抗腫瘤效力。
A.定義
術語「佐劑」係指當與疫苗免疫原一起給藥時能夠增強、加速或延長免疫反應的物質。
術語「促效劑」係指促進(誘導、引起、增強或增加)另一分子或受體之活性的物質。術語促效劑涵蓋結合受體的物質(例如抗體、來自另一物種之天然配位體之同源物)及促進受體功能而不與其結合(例 如藉由活化相關蛋白質)的物質。
術語「拮抗劑」或「抑制劑」係指部分或完全阻斷、抑制或中和另一分子或受體之生物活性的物質。
術語「共同投藥」係指在治療週期中向同一個體投與兩種或兩種以上藥劑。該兩種或兩種以上藥劑可涵蓋在單一調配物中且因此同時投與。或者，該兩種或兩種以上藥劑可處於各別物理調配物中且分別(依序或同時)投與該個體。術語「同時投與」或「同時投藥」意謂投與第一藥劑及投與第二藥劑在時間上彼此重疊，而術語「依序投與」或「依序投藥」意謂投與第一藥劑及投與第二藥劑在時間上彼此不重疊。
術語「保守T細胞抗原決定基」係指如SEQ ID NO.1中所述之人類PSMA蛋白之以下胺基酸序列之一：胺基酸168-176(GMPEGDLVY)；胺基酸347-356(HSTNGVTRIY)；胺基酸557-566(ETYELVEKFY)；胺基酸207-215(KVFRGNKVK)；胺基酸431-440(STEWAEENSR)；胺基酸4-12(LLHETDSAV)；胺基酸27-35(VLAGGFFLL)；胺基酸168-177(GMPEGDLVYV)；胺基酸441-450(LLQERGVAYI)；胺基酸469-477(LMYSLVHNL)；胺基酸711-719(ALFDIESKV)；胺基酸663-671(MNDQVMFL)；胺基酸178-186(NYARTEDFF)；胺基酸227-235(LYSDPADYF)； 胺基酸624-632(TYSVSFDSL)；胺基酸334-348(TGNFSTQKVKMHIHS)；胺基酸459-473(NYTLRVDCTPLMYSL)；胺基酸687-701(YRHVIYAPSSHNKYA)；及胺基酸730-744(RQIYVAAFTVQAAAE)。
術語「胞溶質」意謂在宿主細胞表現編碼特定多肽之核苷酸序列之後，所表現之多肽保留在宿主細胞內。
術語「簡併變異體」係指具有鹼基取代、但編碼相同多肽的DNA序列。
術語「有效量」係指投與哺乳動物之足以在哺乳動物中引起所要作用的量。
術語指定多肽之「片段」係指比該指定多肽短且與該指定多肽之序列具有100%一致性的多肽。
術語「一致」或「一致性」百分比在兩個或兩個以上核酸或多肽序列的情況下係指當根據最大一致性比較且比對時，兩個或兩個以上序列或子序列相同或具有規定百分比之相同胺基酸殘基或核苷酸。
術語「免疫效應細胞增強劑」或「IEC增強劑」係指能夠增加或增強哺乳動物中一或多種類型免疫效應細胞之數目、品質或功能的物質。免疫效應細胞之實例包括細胞溶解CD8 T細胞、CD40 T細胞、NK細胞及B細胞。
術語「免疫調節劑」係指能夠改變(例如抑制、降低、增加、增強或刺激)哺乳動物之先天性體液或細胞免疫系統之任何組分之工作的物質。因此，術語「免疫調節劑」涵蓋如本文所定義之「免疫效應細胞增強劑」及如本文所定義之「免疫抑制細胞抑制劑」以及影響哺乳動物之免疫系統之其他組分的物質。
術語「免疫反應」係指宿主脊椎動物之免疫系統對特定物質(諸 如抗原或免疫原)之任何可偵測反應，包括(但不限於)先天性免疫反應(例如Toll受體信號傳導級聯活化)、細胞介導之免疫反應(例如由T細胞(諸如抗原特異性T細胞及免疫系統之非特異性細胞)介導之反應)及體液免疫反應(例如由B細胞介導之反應，諸如產生抗體並分泌至血漿、淋巴及/或組織液中)。免疫反應之實例包括Toll樣受體活化、淋巴介質(例如細胞素(例如Th1、Th2或Th17型細胞素)或趨化因子)表現或分泌、巨噬細胞活化、樹突狀細胞活化、T細胞(例如CD4+或CD8+ T細胞)活化、NK細胞活化、B細胞活化(例如抗體產生及/或分泌)、免疫原(例如抗原(例如免疫原性聚多肽))與MHC分子結合、誘導細胞毒性T淋巴細胞(「CTL」)反應、誘導B細胞反應(例如抗體產生)及免疫系統細胞(例如T細胞及B細胞)之擴增(例如細胞群體之生長)有所變化，及抗原呈現細胞對抗原之處理及呈現有所增加。術語「免疫反應」亦涵蓋脊椎動物免疫系統之一或多種組分在活體外對特定物質(諸如抗原或免疫原)之任何可偵測反應。
術語「免疫原性」係指物質(不論單獨或與載劑連接時)在佐劑存在或不存在下能夠引起、引發、刺激或誘導針對特定抗原之免疫反應、或者改良、增強、增加或延長針對特定抗原之預先存在之免疫反應。
術語「免疫原性PSA多肽」係指針對人類PSA蛋白或針對表現人類PSA蛋白之細胞具有免疫原性的多肽。
術語「免疫原性PSCA多肽」係指針對人類PSCA蛋白或針對表現人類PSCA蛋白之細胞具有免疫原性的多肽。
術語「免疫原性PSMA多肽」係指針對人類PSMA蛋白或針對表現人類PSMA蛋白之細胞具有免疫原性的多肽。
術語「免疫原性PAA多肽」係指如上文所定義之「免疫原性PSA多肽」、「免疫原性PSCA多肽」或「免疫原性PSMA多肽」。
術語「免疫原性PSA核酸分子」係指編碼如本文所定義之免疫原性PSA多肽的核酸分子。
術語「免疫原性PSCA核酸分子」係指編碼如本文所定義之「免疫原性PSCA多肽」的核酸分子。
術語「免疫原性PSMA核酸分子」係指編碼如本文所定義之「免疫原性PSMA多肽」的核酸分子。
術語「免疫原性PAA核酸分子」係指編碼如上文所定義之「免疫原性PSA多肽」、「免疫原性PSCA多肽」或「免疫原性PSMA多肽」的核酸分子。
術語「免疫抑制細胞抑制劑」或「ISC抑制劑」係指能夠減少或抑制哺乳動物之免疫抑制細胞之數目或功能的物質。免疫抑制細胞之實例包括調節T細胞(「T regs」)、骨髓源抑制細胞及腫瘤相關巨噬細胞。
術語「皮內投藥」或「皮內投與」在向哺乳動物(包括人類)投與諸如治療劑或免疫調節劑之物質的情況下係指將該物質遞送至該哺乳動物之皮膚之真皮層中。哺乳動物之皮膚由三層組成，即表皮層、真皮層及皮下層。表皮為皮膚之相對較薄之堅韌外層。表皮中之大部分細胞為角質細胞。真皮，即皮膚之下一層，為纖維及彈性組織(主要由膠原蛋白、彈性蛋白及肌原纖維蛋白組成)之較厚層，其賦予皮膚可撓性及強度。真皮含有神經末梢、汗腺及油(皮脂)腺、毛囊及血管。真皮之厚度視皮膚之位置而不同。在人類中，其在眼瞼上為約0.3mm且在背上為約3.0mm。皮下層由容納較大血管及神經之脂肪及結締組織組成。此層之厚度在整個身體及人與人之間不同。術語「皮內投藥」係指將物質遞送至真皮層內部。相比之下，「皮下投藥」係指將物質投與皮下層中且「表面投藥」係指將物質投與皮膚表面上。
術語「局部投藥」或「局部投與」涵蓋各自如上文所定義之 「表面投藥」、「皮內投藥」及「皮下投藥」。此術語亦涵蓋「腫瘤內投藥」，其係指將物質投與腫瘤內部。局部投藥意欲允許投藥部位周圍之較高局部濃度持續一段時間直至所投與之物質已達成全身性生物分佈，而「全身性投藥」意欲使所投與之物質被吸收至血液中且由循環系統分佈至整個身體之器官或組織而快速獲得全身性暴露。
術語「哺乳動物」係指屬於哺乳綱之任何動物物種。哺乳動物之實例包括：人類；非人類靈長類動物，諸如猴；實驗室動物，諸如大鼠、小鼠、豚鼠；家畜，諸如貓、狗、兔、牛、綿羊、山羊、馬及豬；及捕獲之野生動物，諸如獅、虎、象及其類似物。
術語「膜結合」意謂在宿主細胞表現編碼特定多肽之核苷酸序列之後，所表現之多肽結合、連接或以其他方式締合細胞膜。
術語「贅生性病症」係指細胞以異常高且不受控制之速率增殖的病狀，該速率超過周圍正常組織且與周圍正常組織之速率不協調。其通常產生稱為「腫瘤」之實體病變或結塊。此術語涵蓋良性及惡性贅生性病症。在本發明中可與術語「癌症」互換使用之術語「惡性贅生性病症」係指以腫瘤細胞能夠擴散至身體內之其他位置(稱為「轉移」)為特徵的贅生性病症。術語「良性贅生性病症」係指腫瘤細胞缺乏轉移能力的贅生性病症。
術語「可操作地連接」係指如此所述之組分處於允許其以預定方式起作用之關係中的並接。「可操作地連接」於轉殖基因的控制序列以在與控制序列相容之條件下達成轉殖基因之表現的方式接合。
術語「直系同源物」係指彼此相似且起源於共同祖先之不同物種中的基因。
術語「醫藥學上可接受之賦形劑」係指免疫原性或疫苗組合物中除活性成分(例如抗原、抗原編碼核酸、免疫調節劑或佐劑)以外的物質，其與活性成分相容且不會在投與其之個體中引起顯著副作用。
術語「肽」、「多肽」及「蛋白質」在本文中可互換使用且係指任何長度之胺基酸之多聚形式，其可包括編碼及非編碼胺基酸、經化學或生物化學修飾或衍生化之胺基酸及具有經修飾之多肽骨架的多肽。
術語「預防(preventing或prevent)」係指(a)防止病症發生或(b)延遲病症發作或病症之症狀發作。
術語「前列腺相關抗原」(或PAA)係指特異性表現於前列腺腫瘤細胞上或由腫瘤細胞以高於相同組織類型之非腫瘤細胞的頻率或密度加以表現的TAA(如本文所定義)。PAA之實例包括PSA、PSCA及PSMA。
術語「分泌」在多肽的情況下意謂在宿主細胞表現編碼該多肽之核苷酸序列之後，將所表現之多肽分泌至宿主細胞外部。
術語「次最佳劑量」在用於描述諸如蛋白激酶抑制劑之免疫調節劑之量時係指當免疫調節劑單獨投與患者時，免疫調節劑劑量低於對所治療之疾病產生所要治療效應所需之最小量。
術語「治療(treating、treatment或treat)」係指消除病症、降低病症之嚴重程度、或降低病症之症狀的嚴重程度或發生頻率。
術語「腫瘤相關抗原」或「TAA」係指由腫瘤細胞特異性表現或由腫瘤細胞以高於相同組織類型之非腫瘤細胞之頻率或密度表現的抗原。腫瘤相關抗原可為宿主非正常表現之抗原；其可經突變、截短、異常褶疊，或宿主正常表現之分子之其他異常顯現形式；其可與正常表現、但表現量異常高之分子相同；或其可表現於異常情況或環境中。腫瘤相關抗原可為例如蛋白質或蛋白質片段、複雜碳水化合物、神經節苷脂、半抗原、核酸，或此等或其他生物分子之任何組合。
術語「疫苗」係指供投與哺乳動物以引發針對特定抗原之免疫反應的免疫原性組合物。
術語指定多肽之「變異體」係指與該指定多肽之胺基酸序列具有小於100%但大於80%之一致性且展現該指定多肽之至少一些免疫原性活性的多肽。
術語「載體」係指能夠輸送或轉移外來核酸分子的核酸分子。該術語涵蓋表現載體及轉錄載體。術語「表現載體」係指能夠表現標靶細胞中之插入物的載體，且一般含有驅動該插入物表現的控制序列，諸如增強子、啟動子及終止子序列。術語「轉錄載體」係指能夠轉錄但不轉譯之載體。轉錄載體係用於擴增其插入物。外來核酸分子稱為「插入物」或「轉殖基因」。載體一般由插入物及充當載體骨架之較大序列組成。基於載體之結構或來源，主要載體類型包括質體載體、黏質體載體、噬菌體載體(諸如λ噬菌體)、病毒載體(諸如腺病毒(Ad)載體)及人工染色體。
B.免疫原性前列腺相關抗原(PAA)多肽
在一些態樣中，本發明提供分離之免疫原性PSA多肽及免疫原性PSMA多肽，該等多肽適用於例如引發活體內(例如在動物中，包括人類)或活體外免疫反應、活化效應T細胞，或分別產生PSA及PSMA特異性抗體，或用作治療癌症(尤其是前列腺癌)之疫苗中的組分。此等多肽可藉由此項技術中已知的方法根據本發明來製備。可在活體外分析或活體內分析中量測多肽引發免疫反應之能力。用於測定多肽或DNA構築體引發免疫反應之能力的活體外分析在此項技術中為已知的。此種活體外分析之一個實例為量測多肽或表現多肽之核酸刺激T細胞反應的能力，如美國專利7,387,882中所述，該專利之揭示內容併入本申請案中。該分析方法包含以下步驟：(1)使培養之抗原呈現細胞與抗原接觸，藉此可由該等抗原呈現細胞吸收並處理該抗原，從而產生一或多種經處理抗原；(2)在足以使T細胞對一或多個經處理抗原有反應的條件下使該等抗原呈現細胞與T細胞接觸；(3)測定T細胞對 一或多個該等經處理抗原是否有反應。所使用之T細胞可為CD8+ T細胞或CD4+ T細胞。可藉由量測一或多種細胞素(諸如干擾素-γ及介白素-2)之釋放、抗原呈現細胞(腫瘤細胞)之溶解及B細胞之抗體產生來測定T細胞反應。
B-1.免疫原性PSMA多肽
在一個態樣中，本發明提供分離之免疫原性PSMA多肽，其與SEQ ID NO：1之人類PSMA之胺基酸15-750具有至少90%一致性且在相應位置包含人類PSMA之至少10、11、12、13、14、15、16、17、18或19個保守T細胞抗原決定基之胺基酸。
在一些實施例中，該等免疫原性PSMA多肽包含人類PSMA之至少15、16、17、18或19個保守T細胞抗原決定基。
在一些實施例中，本發明提供一種由SEQ ID NO：9之胺基酸序列組成的免疫原性PSMA多肽或與SEQ ID NO：9之胺基酸序列具有93%至99%、94%至98%或94%至97%一致性的免疫原性PSMA多肽。
一些特定免疫原性PSMA多肽之實例包括：1)由SEQ ID NO：1之胺基酸15-750組成的多肽；2)包含SEQ ID NO：3之胺基酸4-739的多肽；3)包含SEQ ID NO：5之胺基酸4-739的多肽；4)包含SEQ ID NO：7之胺基酸4-739的多肽；2)包含SEQ ID NO：3之胺基酸序列的多肽；3)包含SEQ ID NO：5之胺基酸序列的多肽；及4)包含SEQ ID NO：7之胺基酸序列的多肽。
在其他實施例中，本發明提供一種選自由以下組成之群的免疫原性PSMA多肽：1)由SEQ ID NO：11之胺基酸序列組成的多肽；2)由SEQ ID NO：13之胺基酸序列組成的多肽；及 3)包含SEQ ID NO：13之胺基酸序列的多肽。
在一些其他實施例中，本發明提供分離之免疫原性PSMA多肽，其為以下多肽中之任一者的變異體：2)包含SEQ ID NO：3之胺基酸4-739的多肽；3)包含SEQ ID NO：5之胺基酸4-739的多肽；及4)包含SEQ ID NO：7之胺基酸4-739的多肽，其中該變異體之胺基酸序列與SEQ ID NO：1之序列具有93%至99%一致性且與SEQ ID NO：3、5或7之胺基酸序列具有至少80%、至少85%、至少90%、至少95%或至少99%一致性。
指定PAA多肽之變異體可藉由缺失、插入或取代親本免疫原性PAA多肽中之一或多個胺基酸來獲得。用於產生此種變異體之一個實例為多肽中個別胺基酸之保守取代，亦即，藉由將一個胺基酸取代為具有相似性質之另一胺基酸。
本發明之免疫原性PSMA多肽可如下構築：保留SEQ ID NO：1之人類PSMA之一些或所有保守T細胞抗原決定基，同時在相應位置用人類PSMA之一或多種直系同源物中所發現之胺基酸來取代人類PSMA之其餘區域中之某些胺基酸。可用於製造免疫原性PSMA多肽之各種PSMA直系同源物之序列可得自GeneBank資料庫。此等直系同源物以及其NCBI ID編號提供於表18中。用來自一或多種直系同源物之胺基酸取代人類PSMA之胺基酸可為保守取代或非保守取代或兩者，且可基於此項技術中已知的許多因素加以選擇，包括需要達成之分異度、MHC結合、取代位點處存在直系同源物胺基酸、表面暴露及維持蛋白質之3-D結構以供進行最佳處理及呈現。
B-2.免疫原性PSA多肽
在另一態樣中，本發明提供分離之免疫原性PSA多肽。在一個實施例中，分離之免疫原性PSA多肽為由SEQ ID NO：15之胺基酸序列或 SEQ ID NO：15之胺基酸4-263組成的多肽或其變異體。在另一實施例中，分離之免疫原性PSA多肽為由SEQ ID NO：17之胺基酸序列或SEQ ID NO：17之胺基酸4-240組成的多肽或其變異體。在另一實施例中，分離之免疫原性PSA多肽為由SEQ ID NO：19之胺基酸序列或SEQ ID NO：19之胺基酸4-281組成的多肽或其變異體。
C.編碼免疫原性PAA多肽之核酸分子
在一些態樣中，本發明提供編碼免疫原性PAA多肽之核酸分子。核酸分子可為脫氧核糖核苷酸(DNA)或核糖核苷酸(RNA)。因此，核酸分子可包含本文所揭示之核苷酸序列，其中胸苷(T)亦可為尿嘧啶(U)，其體現DNA及RNA之化學結構之間的差異。核酸分子可為修飾形式、單股或雙股形式、或線性或環狀形式。核酸分子可使用此項技術中已知的方法根據本發明來製備。
C-1.編碼免疫原性PSMA多肽之核酸分子
在一個態樣中，本發明提供分離之核酸分子或其簡併變異體，其包含編碼免疫原性PSMA多肽(包括本發明所提供之免疫原性PSMA多肽)或其功能變異體的核苷酸序列。
在一些實施例中，該核苷酸序列編碼膜結合免疫原性PSMA多肽。在一些特定實施例中，該分離之核酸分子包含選自由以下組成之群的核苷酸序列或其簡併變異體：1)編碼SEQ ID NO：9之胺基酸序列的核苷酸序列；2)編碼SEQ ID NO：3之胺基酸4-739的核苷酸序列；3)編碼SEQ ID NO：5之胺基酸4-739的核苷酸序列；及4)編碼SEQ ID NO：7之胺基酸4-739的核苷酸序列。
在一些其他特定實施例中，該核苷酸序列編碼SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：7或SEQ ID NO：9之免疫原性PSMA多肽之變異體，其中該變異體具有(a)與SEQ ID NO：1之胺基酸序列具有93% 至99%一致性且(b)與SEQ ID NO：3、5或7之胺基酸序列具有至少80%、至少85%、至少90%、至少95%或至少99%一致性的胺基酸序列。
在再一些其他特定實施例中，該分離之核酸分子包含選自由以下組成之群的核苷酸序列或其簡併變異體：1)包含SEQ ID NO：4之核苷酸10-2217的核苷酸序列；2)包含SEQ ID NO：6之核苷酸10-2217的核苷酸序列；3)包含SEQ ID NO：8之核苷酸10-2217的核苷酸序列；及4)包含SEQ ID NO：10之核苷酸10-2217的核苷酸序列。
C-2.編碼免疫原性PSA多肽之核酸分子
在另一態樣中，本發明提供分離之核酸分子或其簡併變異體，其編碼免疫原性PSA多肽，包括本發明所提供之免疫原性PSA多肽。
在一些實施例中，該分離之核酸分子包含編碼胞溶質免疫原性PSA多肽之核苷酸序列或由其組成。在一個實施例中，該核苷酸序列編碼由SEQ ID NO：17之連續胺基酸殘基4-240組成的胞溶質免疫原性PSA多肽。在另一實施例中，該核苷酸序列編碼包含SEQ ID NO：17之胺基酸序列的胞溶質免疫原性PSA多肽。在再另一實施例中，該核苷酸序列編碼由SEQ ID NO：17之胺基酸序列組成的胞溶質免疫原性PSA多肽。在又另一實施例中，該核苷酸序列編碼上文所提供之該等胞溶質免疫原性多肽中之任一者的功能變異體。
在一些其他實施例中，該分離之核酸分子包含編碼膜結合免疫原性PSA多肽之核苷酸序列。在一個實施例中，該核苷酸序列編碼包含SEQ ID NO：19之連續胺基酸殘基4-281的膜結合免疫原性PSA多肽。在另一實施例中，該核苷酸序列編碼包含SEQ ID NO：19之胺基酸序列的膜結合免疫原性PSA多肽。在再另一實施例中，該核苷酸序列編碼由SEQ ID NO：19之胺基酸序列組成的膜結合免疫原性PSA多 肽。在又其他實施例中，該核苷酸序列編碼上文所提供之該等膜結合免疫原性PSA多肽中之任一者的功能變異體。
本發明所提供之特定核酸分子之實例包括：1)由SEQ ID NO：18之核苷酸序列組成的核酸分子；2)包含SEQ ID NO：18之核苷酸序列的核酸分子；3)由SEQ ID NO：20之核苷酸序列組成的核酸分子；4)包含SEQ ID NO：20之核苷酸序列的核酸分子；及5)以上核酸分子1)-4)中之任一者的簡併變異體。
C-3.編碼兩種或兩種以上免疫原性PAA多肽之核酸分子
在另一態樣中，本發明提供一種核酸分子，其編碼超過一種免疫原性PAA多肽，例如至少兩種、至少三種或至少四種免疫原性PAA多肽。此種核酸分子在本發明中亦稱為「多抗原構築體」、「多抗原疫苗」、「多抗原質體」及其類似物。因此，在一些態樣中，一個核酸分子攜帶兩個編碼核苷酸序列，其中每一個編碼核苷酸序列表現個別免疫原性PAA多肽。此種核酸分子在本發明中亦稱為「雙抗原構築體」、「雙抗原疫苗」或「雙抗原質體」等。在一些其他態樣中，一個核酸分子攜帶三個編碼核苷酸序列，其中每一個編碼核苷酸序列表現個別免疫原性PAA多肽。此種核酸分子在本發明中亦稱為「三抗原構築體」、「三抗原疫苗」或「三抗原質體」。多抗原構築體所編碼之個別PAA多肽可具有針對相同抗原(諸如PSMA、PSA或PSCA)的免疫原性。多抗原構築體所編碼之個別PAA多肽可具有針對不同抗原的免疫原性，例如一種PAA多肽為PSMA多肽而另一種為PSA多肽。特定言之，一種多抗原構築體可編碼以下組合中之任一者中的兩種或兩種以上免疫原性PAA多肽：1)至少一種免疫原性PSMA多肽及至少一種免疫原性PSA多肽；2)至少一種免疫原性PSMA多肽及至少一種PSCA多肽； 3)至少一種免疫原性PSA多肽及至少一種PSCA多肽；及4)至少一種免疫原性PSMA多肽、至少一種免疫原性PSA多肽及至少一種PSCA多肽。
多抗原構築體所編碼之免疫原性PSMA多肽可為胞溶質型、分泌型或膜結合型，但較佳為膜結合型。類似地，多抗原構築體所編碼之免疫原性PSA多肽可為胞溶質型、分泌型或膜結合型，但較佳為胞溶質型。
在一些實施例中，本發明提供一種多抗原構築體，其編碼至少一種膜結合免疫原性PSMA多肽及至少一種膜結合PSA多肽。
在一些其他實施例中，本發明提供一種多抗原構築體，其編碼至少一種膜結合免疫原性PSMA多肽、至少一種胞溶質PSA多肽及至少一種PSCA多肽，其中該至少一種胞溶質PSA多肽包含SEQ ID NO：17之胺基酸4-240且其中該至少一種免疫原性PSMA多肽係選自由以下組成之群：1)包含SEQ ID NO：1之胺基酸15-750的多肽；2)包含SEQ ID NO：3之胺基酸序列的多肽；3)包含SEQ ID NO：5之胺基酸序列的多肽；4)包含SEQ ID NO：7之胺基酸序列的多肽；5)包含SEQ ID NO：9之胺基酸4-739的多肽；6)包含SEQ ID NO：3之胺基酸4-739的多肽；7)包含SEQ ID NO：5之胺基酸4-739的多肽；8)包含SEQ ID NO：7之胺基酸4-739的多肽；及9)包含SEQ ID NO：9之胺基酸序列的多肽。
在一些特定實施例中，本發明提供一種多抗原構築體，其包含至少一個編碼免疫原性PSMA多肽之核苷酸序列、至少一個編碼免疫原性PSA多肽之核苷酸序列及至少一個編碼人類PSCA多肽之核苷酸 序列，其中該核苷酸序列編碼SEQ ID NO：17或SEQ ID NO：17之胺基酸4-240之免疫原性PSA多肽，且其中編碼該免疫原性PSMA多肽之核苷酸序列係選自由以下組成之群：1)SEQ ID NO：2之核苷酸序列；2)SEQ ID NO：4之核苷酸序列；3)SEQ ID NO：6之核苷酸序列；4)SEQ ID NO：8之核苷酸序列；5)SEQ ID NO：10之核苷酸序列；6)包含SEQ ID NO：4之核苷酸10-2217的核苷酸序列；7)包含SEQ ID NO：6之核苷酸10-2217的核苷酸序列；8)包含SEQ ID NO：8之核苷酸10-2217的核苷酸序列；及9)包含SEQ ID NO：10之核苷酸10-2217的核苷酸序列。
本發明所提供之特定多抗原構築體之實例包括包含SEQ ID NO：23-36中所述之核苷酸序列的核酸分子。
本發明所提供之多抗原構築體可使用此項技術中已知的各種技術根據本發明來製備。舉例而言，可藉由在單一質體中併入多個獨立啟動子來構築多抗原構築體(Huang,Y.,Z.Chen，等人(2008).「Design,construction,and characterization of a dual-promoter multigenic DNA vaccine directed against an HIV-1 subtype C/B' recombinant」.J Acquir Immune Defic Syndr 47(4)：403-411；Xu,K.,Z.Y.Ling等人(2011).「Broad humoral and cellular immunity elicited by a bivalent DNA vaccine encoding HA and NP genes from an H5N1 virus」.Viral Immunol 24(1)：45-56)。質體可經工程改造以運載多個表現卡匣，各表現卡匣由以下組成：a)在增強子元件存在或不存在下用於起始RNA聚合酶依賴性轉錄之真核啟動子；b)編碼標靶抗原之基因；及c)轉錄終止序列。質體遞送至經轉染之細胞核中時，各啟動子 起始轉錄，從而產生各別mRNA，各mRNA編碼標靶抗原之一。mRNA經獨立地轉譯，藉此產生所要抗原。
本發明所提供之多抗原構築體亦可使用單一載體藉由使用病毒2A樣多肽來構築(Szymczak,A.L.及D.A.Vignali(2005).「Development of 2A peptide-based strategies in the design of multicistronic vectors」.Expert Opin Biol Ther 5(5)：627-638；de Felipe,P.,G.A.Luke等人(2006).「E unum pluribus：multiple proteins from a self-processing polyprotein」.Trends Biotechnol 24(2)：68-75；Luke,G.A.,P.de Felipe等人(2008).「Occurrence,function and evolutionary origins of『2A-like』sequences in virus genomes」.J Gen Virol 89(Pt 4)：1036-1042；Ibrahimi,A.,G.Vande Velde等人(2009).「Highly efficient multicistronic lentiviral vectors with peptide 2A sequences」.Hum Gene Ther 20(8)：845-860；Kim,J.H.,S.R.Lee等人(2011).「High cleavage efficiency of a 2A peptide derived from porcine teschovirus-1 in human cell lines,zebrafish and mice」.PLoS One 6(4)：e18556)。此等多肽，亦稱為裂解卡匣或CHYSEL(順式作用水解酶元件)，約20個胺基酸長且具有高度保守羧基末端D-V/I-EXNPGP基元(圖2)。該等卡匣在自然界中非常稀有，最常發現於病毒中，諸如口蹄疫病毒(Foot-and-mouth disease virus，FMDV)、馬鼻炎A病毒(ERAV)、腦心肌炎病毒(EMCV)、豬捷申病毒(Porcine teschovirus，PTV)及明脈扁刺蛾病毒(Thosea asigna virus，TAV)(Luke,G.A.,P.de Felipe等人(2008).「Occurrence,function and evolutionary origins of『2A-like』sequences in virus genomes」.J Gen Virol 89(Pt 4)：1036-1042)。利用基於2A之多抗原表現策略，可將編碼多個標靶抗原之基因一起連接在單一開放閱讀框架中，用2A卡匣隔開。可將整個開放閱讀框架選殖於具有單一啟動子及終止子之 載體中。構築體遞送至宿主細胞時，編碼多個抗原之mRNA轉錄並轉譯為單一聚合蛋白。在轉譯2A卡匣期間，核糖體跳過C末端甘胺酸與脯胺酸之間的鍵。核糖體跳過之作用類似於在下游蛋白質之上游釋放的共轉譯自動催化「裂解」。2A卡匣併入兩個蛋白質抗原之間引起約20個胺基酸添加至上游多肽之C末端上且1個胺基酸(脯胺酸)添加至下游蛋白質之N末端。在此方法之改適方案中，可在2A卡匣之N末端併入蛋白酶裂解位點，使得普遍存在的蛋白酶使卡匣自上游蛋白質裂解(Fang,J.,S.Yi等人(2007).「An antibody delivery system for regulated expression of therapeutic levels of monoclonal antibodies in vivo」.Mol Ther 15(6)：1153-1159)。
用於構築本發明所提供之多抗原構築體之另一策略包括使用內部核糖體進入位點或IRES。內部核糖體進入位點為在某些RNA分子之5'未轉譯區域中發現的RNA元件(圖3)(Bonnal,S.,C.Boutonnet等人(2003).「IRESdb：the Internal Ribosome Entry Site database」.Nucleic Acids Res 31(1)：427-428)。其將真核核糖體吸引至RNA以促進下游開放閱讀框架之轉譯。不同於正常細胞7-甲基鳥苷帽依賴性轉譯，IRES介導之轉譯可在RNA分子內較遠處之AUG密碼子處起始。可利用高效方法以便用於多順反子表現載體(Bochkov,Y.A.及A.C.Palmenberg(2006).「Translational efficiency of EMCV IRES in bicistronic vectors is dependent upon IRES sequence and gene location」.Biotechniques 41(3)：283-284,286,288)。通常，兩個轉殖基因以經IRES分隔之兩個各別開放閱讀框架形式插入啟動子與轉錄終止子之間的載體中。構築體遞送至宿主細胞時，轉錄編碼兩個轉殖基因之單一長轉錄物。第一個ORF將以傳統帽依賴性方式轉譯，在IRES上游之終止密碼子處終止。第二個ORF將以帽非依賴性方式使用IRES轉譯。以此方式，可由自具有單一表現卡匣之載體轉錄之單一 mRNA產生兩種獨立的蛋白質。
雖然此處在DNA疫苗構築體的情況下描述多抗原表現策略，但該等原理類似地適用於病毒載體基因疫苗的情況。
D.含有編碼免疫原性PAA多肽之核酸分子的載體
本發明之另一態樣係關於含有一或多種本發明之核酸分子的載體。該等載體適用於選殖或表現由該等核酸分子編碼之免疫原性PAA多肽，或用於向宿主細胞或宿主動物(諸如人類)遞送呈組合物(諸如疫苗)形式之核酸分子。可製備含有並表現本發明之核酸分子的多種載體，諸如質體載體、黏質體載體、噬菌體載體及病毒載體。
在一些實施例中，本發明提供一種基於質體之載體，其含有本發明之核酸分子。適合質體載體之代表性實例包括pBR325、pUC18、pSKF、pET23D及pGB-2。質體載體以及構築此種載體之方法的其他代表性實例描述於美國專利第5,580,859號、第5,589,466號、第5,688,688號、第5,814,482號及第5,580,859號中。
在其他實施例中，本發明提供由諸如反轉錄病毒、α病毒、腺病毒之病毒構築之載體。反轉錄病毒載體之代表性實例更詳細描述於以下文獻中：EP 0,415,731；PCT公開案第WO 90/07936號、第WO 91/0285號、第WO 9311230號、第WO 9310218號、第WO 9403622號、第WO 9325698號、第WO 9325234號；及美國專利第5,219,740號、第5,716,613號、第5,851,529號、第5,591,624號、第5,716,826號、第5,716,832號及第5,817,491號。可由α病毒產生之載體的代表性實例描述於美國專利第5,091,309號及第5,217,879號、第5,843,723號及第5,789,245號中。在一些特定實施例中，本發明提供來源於非人類靈長類動物腺病毒(諸如猿腺病毒)之腺病毒載體。此種腺病毒載體之實例以及其製備描述於PCT申請公開案WO 2005/071093及WO 2010/086189中，且包括非複製載體，諸如ChAd3、ChAd4、ChAd5、 ChAd7、ChAd8、ChAd9、ChAd10、ChAd11、ChAd16、ChAd17、ChAd19、ChAd20、ChAd22、ChAd24、ChAd26、ChAd30、ChAd31、ChAd37、ChAd38、ChAd44、ChAd63、ChAd68、ChAd82、ChAd55、ChAd73、ChAd83、ChAd146、ChAd147、PanAd1、Pan Ad2及Pan Ad3，及勝任複製型載體，諸如Ad4及Ad7載體。在由猿腺病毒構築腺病毒載體時，較佳使來自病毒基因組區域之一或多個選自E1A、E1B、E2A、E2B、E3及E4之早期基因缺失，或藉由缺失或突變使其不具功能。在一個特定實施例中，該載體係由ChAd3或ChAd68構築。適合載體亦可由其他病毒產生，諸如：痘病毒，諸如金絲雀痘病毒或痘苗病毒(Fisher-Hoch等人，PNAS 86：317-321,1989；Flexner等人，Ann.N.Y.Acad.Sci.569：86-103,1989；Flexner等人，Vaccine 8：17-21,1990；美國專利第4,603,112號、第4,769,330號及第5,017,487；WO 89/01973)；腺相關載體(參看例如美國專利第5,872,005號)；SV40(Mulligan等人，Nature 277：108-114,1979)；疱疹(Kit,Adv.Exp.Med.Biol.215：219-236,1989；美國專利第5,288,641號)；及慢病毒，諸如HIV(Poznansky,J.Virol.65：532-536,1991)。
構築載體之方法在此項技術中已熟知。表現載體通常包括一或多個可操作地連接於欲表現之核酸序列的控制元件。術語「控制元件」總體係指啟動子區域、聚腺苷酸化信號、轉錄終止序列、上游調控域、複製起點、內部核糖體進入位點(「IRES」)、增強子及其類似物，其總體提供編碼序列在受者細胞中之複製、轉錄及轉譯。並非所有此等控制元件均需要始終存在，只要所選編碼序列能夠在適當宿主細胞中複製、轉錄並轉譯即可。基於熟習此項技術者已知的許多因素選擇控制元件，諸如特定宿主細胞及其他載體組件之來源或結構。為增強免疫原性PAA多肽之表現，可在編碼免疫原性PAA多肽之序列上 游提供Kozak序列。對於脊椎動物，已知Kozak序列為(GCC)NCCATGG，其中N為A或G且GCC之保守程度較低。可使用之例示性Kozak序列包括ACCAUGG及ACCATGG。
E.包含免疫原性PAA多肽之組合物(多肽組合物)
在另一態樣中，本發明提供包含本發明所提供之一或多種分離之免疫原性PAA多肽的組合物(「多肽組合物」)。在一些實施例中，該多肽組合物為適用於在諸如小鼠、狗、非人類靈長類動物或人類之哺乳動物中引發針對PAA蛋白之免疫反應的免疫原性組合物。在一些其他實施例中，該多肽組合物為疫苗組合物，其適用於對諸如人類之哺乳動物進行免疫、用於抑制異常細胞增殖、用於防止癌症發展(用作預防劑)或用於治療與PAA過度表現相關之病症(諸如癌症，尤其是前列腺癌)(用作治療劑)。
本發明所提供之多肽組合物可含有單一類型之免疫原性PAA多肽，諸如免疫原性PSMA多肽、免疫原性PSA多肽或免疫原性PSCA多肽。組合物亦可含有兩種或兩種以上不同類型之免疫原性PAA多肽之組合。舉例而言，多肽組合物可含有以下組合中之任一者中的免疫原性PAA多肽：1)免疫原性PSMA多肽及免疫原性PSA多肽；2)免疫原性PSMA多肽及PSCA多肽；或3)免疫原性PSMA多肽、免疫原性PSA多肽及PSCA多肽。
本發明所提供之免疫原性組合物或疫苗組合物可進一步包含醫藥學上可接受之賦形劑。用於免疫原性組合物或疫苗組合物之醫藥學上可接受之賦形劑在此項技術中為已知的。適合賦形劑之實例包括生物相容性油類，諸如菜籽油、葵花油、花生油、棉籽油、荷荷芭油、角鯊烷、角鯊烯、生理鹽水溶液、防腐劑及滲透壓控制劑、運載氣體、pH值控制劑、有機溶劑、疏水性藥劑、酶抑制劑、吸水聚合 物、界面活性劑、吸附引發劑、pH值調節劑及抗氧化劑。
組合物，尤其是免疫原性組合物或疫苗組合物中之免疫原性PAA多肽可連接於、結合於或以其他方式併入載劑中以供投與接受者。術語「載劑」係指免疫原性多肽可連接或以其他方式締合以便向接受者(例如患者)遞送免疫原性多肽的物質或結構。載劑自身可具有免疫原性。載劑之實例包括免疫原性多肽、免疫CpG島、螺血氰蛋白(KLH)、破傷風類毒素(TT)、霍亂毒素次單位B(CTB)、細菌或細菌殘骸、脂質體、甲殼素酶體(chitosome)、病毒體、微球體、樹突狀細胞或其類似物。一或多種免疫原性PAA多肽分子可連接於單一載體分子。用於將免疫原性多肽連接於載體之方法在此項技術中為已知的。
本發明所提供之疫苗組合物或免疫原性組合物可與一或多種免疫調節劑或佐劑結合使用。免疫調節劑或佐劑可與疫苗組合物分別調配，或其可為同一疫苗組合物調配物之一部分。因此，在一個實施例中，疫苗組合物進一步包含一或多種免疫調節劑或佐劑。下文提供免疫調節劑及佐劑之實例。
多肽組合物，包括免疫原性組合物及疫苗組合物，可用任何適合劑型，諸如液體形式(例如溶液、懸浮液或乳液)及固體形式(例如膠囊劑、錠劑或粉劑)且藉由熟習此項技術者已知的方法來製備。
F.包含免疫原性PAA核酸分子之組合物(核酸組合物)
本發明亦提供一種包含本發明所提供之分離之核酸分子或載體的組合物(本文之「核酸組合物」)。核酸組合物適用於在哺乳動物(包括人類)中活體外或活體內引發針對PAA蛋白之免疫反應。
在一些特定實施例中，該核酸組合物為投與人類以抑制異常細胞增殖、防止癌症發展(用作預防劑)或用於治療與PAA過度表現相關之癌症(用作治療劑)或引發對特定人類PAA(諸如PSMA、PSA及PSCA)之免疫反應的DNA疫苗組合物。組合物中之核酸分子可為 「裸」核酸分子，亦即，簡單地呈不含促進轉染或表現之元件的分離之DNA形式。或者，組合物中之核酸分子可併入載體中。
本發明所提供之核酸組合物可包含個別之分離核酸分子，該等核酸分子各自僅編碼一種類型免疫原性PAA多肽，諸如免疫原性PSMA多肽、免疫原性PSA多肽或免疫原性PSCA多肽。
核酸組合物可包含本發明所提供之編碼兩種或兩種以上類型免疫原性PAA多肽之多抗原構築體。多抗原構築體可編碼以下組合中之任一者中的兩種或兩種以上免疫原性PAA多肽：1)免疫原性PSMA多肽及免疫原性PSA多肽；2)免疫原性PSMA多肽及免疫原性PSCA多肽；3)免疫原性PSA多肽及免疫原性PSCA多肽；及4)免疫原性PSMA多肽、免疫原性PSA多肽及免疫原性PSCA多肽。
核酸組合物，包括DNA疫苗組合物，可進一步包含醫藥學上可接受之賦形劑。適用於核酸組合物(包括DNA疫苗組合物)之醫藥學上可接受之賦形劑的實例為熟習此項技術者所熟知的且包括糖類等。此種賦形劑可為水性或非水性溶液、懸浮液及乳液。非水性賦形劑之實例包括丙二醇、聚乙二醇、諸如橄欖油之植物油及諸如油酸乙酯之可注射有機酯。水性賦形劑之實例包括水、醇/水溶液、乳液或懸浮液，包括生理鹽水及緩衝介質。適合賦形劑亦包括幫助細胞吸收聚核苷酸分子之藥劑。此種藥劑之實例為(i)調節細胞通透性之化合物，諸如布比卡因(bupivacaine)；(ii)用於囊封聚核苷酸之脂質體或病毒粒子；或(iii)自身與聚核苷酸締合之陽離子脂質或二氧化矽、金或鎢微粒。陰離子及中性脂質體在此項技術中為熟知的(關於製造脂質體之方法的詳細描述，參看例如Liposomes：A Practical Approach,RPC New編，IRL出版社(1990))且適用於遞送較大範圍之產物，包括聚核苷 酸。陽離子脂質在此項技術中亦為已知的且常用於基因遞送。此種脂質包括LipofectinTM，亦稱為DOTMA(N-[1-(2,3-二油氧基)丙基]-N,N,N-三甲基氯化銨)、DOTAP(1,2-雙(油氧基)-3-(三甲銨基)丙烷)、DDAB(二甲基二(十八烷)溴化銨)、DOGS(二(十八烷)醯胺基甘胺醯基精胺)及膽固醇衍生物，諸如DCChol(3β-(N-(N',N'-二甲基胺基甲烷)-胺甲醯基)膽固醇)。此等陽離子脂質之描述可見於EP 187,702、WO 90/11092、美國專利第5,283,185號、WO 91/15501、WO 95/26356及美國專利第5,527,928號中。可用於本發明所提供之核酸疫苗的特定適用陽離子脂質調配物為VAXFECTIN，其為陽離子脂質(GAP-DMORIE)與中性磷脂(DPyPE)之混合物，當合併在水性媒劑中時，其自組裝以形成脂質體。
用於基因遞送之陽離子脂質較佳與諸如DOPE(二油基磷脂醯乙醇胺)之中性脂質結合使用，如WO 90/11092中作為一個實例所描述。另外，DNA疫苗亦可與諸如CRL1005之非離子嵌段共聚物一起調配。
G.免疫原性PAA多肽、核酸分子及組合物之用途
在其他態樣中，本發明提供使用免疫原性PAA多肽、分離之核酸分子及包含上述免疫原性PAA多肽或分離之核酸分子之組合物的方法。
在一個態樣中，本發明提供一種在哺乳動物，尤其是人類中引發針對PAA之免疫反應的方法，該方法包含向該哺乳動物投與有效量之(1)本發明所提供之針對標靶PAA具有免疫原性之免疫原性PAA多肽；(2)編碼此種免疫原性PAA多肽之分離之核酸分子；(3)包含此種免疫原性PAA多肽之組合物；或(4)包含編碼此種免疫原性PAA多肽之分離之核酸分子的組合物。
在一些實施例中，本發明提供一種在人類中引發針對PSMA之免疫反應的方法，該方法包含向人類投與有效量之本發明所提供之免疫 原性PSMA組合物，其中該免疫原性PSMA組合物係選自：(1)免疫原性PSMA多肽；(2)編碼免疫原性PSMA多肽之分離之核酸分子；(3)包含免疫原性PSMA多肽之組合物；或(4)包含編碼免疫原性PSMA多肽之分離之核酸分子的組合物。
在一些其他實施例中，本發明提供一種在人類中引發針對PSA之免疫反應的方法，該方法包含向人類投與有效量之本發明所提供之免疫原性PSA組合物，其中該免疫原性PSA組合物係選自：(1)免疫原性PSA多肽；(2)編碼免疫原性PSA多肽之分離之核酸分子；(3)包含免疫原性PSA多肽之組合物；或(4)包含編碼免疫原性PSA多肽之分離之核酸分子的組合物。
在另一態樣中，本發明提供一種抑制人類中之異常細胞增殖的方法，其中該異常細胞增殖與PAA之過度表現相關。該方法包含向人類投與有效量之本發明所提供之針對PAA過度表現具有免疫原性的免疫原性PAA組合物。免疫原性PAA組合物可為(1)免疫原性PAA多肽；(2)編碼一或多種免疫原性PAA多肽之分離之核酸分子；(3)包含免疫原性PAA多肽之組合物；或(4)包含編碼一或多種免疫原性PAA多肽之分離之核酸分子的組合物。在一些實施例中，該方法係用於抑制人類前列腺中之異常細胞增殖。在一個特定實施例中，本發明提供一種抑制過度表現PSMA之前列腺中之異常細胞增殖的方法，該方法包含向該人類投與有效量之(1)免疫原性PSMA多肽；(2)編碼一或多種免疫原性PSMA多肽之分離之核酸分子；(3)包含免疫原性PSMA多肽之組合物；或(4)包含編碼一或多種免疫原性PSMA多肽之分離之核酸分子的組合物。
在另一態樣中，本發明提供一種治療人類之癌症的方法，其中癌症與PAA之過度表現相關。該方法包含向人類投與有效量之能夠引發針對過度表現之PAA之免疫反應的免疫原性PAA組合物。免疫原性 PAA組合物可為(1)免疫原性PAA多肽；(2)編碼一或多種免疫原性PAA多肽之分離之核酸分子；(3)包含免疫原性PAA多肽之組合物；或(4)包含編碼一或多種免疫原性PAA多肽之分離之核酸分子的組合物。可用該方法治療之癌症的實例包括乳癌、胃癌、卵巢癌、肺癌、膀胱癌、結腸直腸癌、腎癌、胰臟癌及前列腺癌。
在一些實施例中，本發明提供一種治療人類之前列腺癌的方法，該方法包含向人類投與有效量之上文所提供之核酸組合物。組合物中之核酸可僅編碼一種特定免疫原性PAA多肽，諸如免疫原性PSMA多肽、免疫原性PSA多肽或免疫原性PSCA多肽。組合物中之核酸亦可編碼兩種或兩種以上不同的免疫原性PAA多肽，諸如：(1)免疫原性PSMA多肽及免疫原性PSA多肽；(2)免疫原性PSMA多肽及免疫原性PSCA多肽；(3)免疫原性PSA多肽及免疫原性PSCA多肽；(4)免疫原性PSMA多肽、免疫原性PSA多肽及免疫原性PSCA多肽。組合物中之各個別核酸分子可僅編碼一種特定免疫原性PAA多肽，諸如PSMA多肽、PSA多肽或PSCA多肽。或者，組合物中之個別核酸分子可為編碼兩種不同類型免疫原性PAA多肽之多抗原構築體，諸如：(1)免疫原性PSMA多肽及免疫原性PSA多肽；(2)免疫原性PSMA多肽及免疫原性PSCA多肽；(3)免疫原性PSCA多肽及免疫原性PSA多肽；或(4)免疫原性PSMA多肽、免疫原性PSA多肽及免疫原性PSCA多肽。在一些特定實施例中，該核酸組合物包含至少編碼(4)免疫原性PSMA多肽、免疫原性PSA多肽及免疫原性PSCA多肽的多抗原構築體。疫苗組合物中所含有或用於治療人類前列腺癌之疫苗組合物中之核酸所表現之免疫原性PSCA多肽較佳為人類全長PSCA蛋白。
多肽及核酸組合物可藉由此項技術中已知的許多方法投與動物，包括人類。適合方法之實例包括：(1)肌肉內、皮內、表皮內、靜脈內、動脈內、皮下或腹膜內投藥；(2)經口投藥；及(3)表面施用 (諸如眼部、鼻內及陰道內施用)。皮內或表皮內投與可使用之核酸疫苗組合物的一種特定方法為使用PowderMed銷售之粒子介導表皮遞送(Particle Mediated Epidermal Delivery，PMEDTM)疫苗遞送裝置進行的基因槍遞送。PMED為向動物或人類投與疫苗之無針方法。PMED系統包括使DNA沈澱於微觀金粒子上，接著藉由氦氣推入表皮中。經DNA塗佈之金粒子遞送至表皮之APC及角質細胞，且一旦進入此等細胞之核內，DNA即自金溶離且變得具有轉錄活性，從而產生編碼蛋白質。此蛋白質接著由APC呈現至淋巴細胞以誘導T細胞介導之免疫反應。用於肌肉內投與本發明所提供之核酸疫苗的另一特定方法為電穿孔。電穿孔使用受控制之電脈衝在細胞膜中暫時產生孔隙，由此促進細胞吸收注入肌肉中之核酸疫苗。在CpG與核酸疫苗組合使用的情況下，CpG及核酸疫苗較佳共同調配於一種調配物中且藉由電穿孔經肌肉內投與該調配物。
依本發明所提供之指定方法投與之組合物中之免疫原性PAA多肽或編碼免疫原性PAA多肽之核酸的有效量可容易由熟習此項技術者確定且將視許多因素而定。在治療癌症(諸如前列腺癌)之方法中，確定免疫原性PAA多肽或核酸之有效量時可能考慮的因素包括(但不限於)：(1)欲治療之個體，包括個體之免疫狀態及健康狀況；(2)欲治療之癌症的嚴重程度或階段；(3)所使用或表現之特定免疫原性PAA多肽；(4)所要預防或治療程度；(5)投藥方法及時程；及(6)所使用之其他治療劑(諸如佐劑或免疫調節劑)。在核酸疫苗組合物(包括多抗原疫苗組合物)的情況下，調配及遞送方法為確定引發有效免疫反應所需之核酸劑量之關鍵因素之一。舉例而言，當核酸疫苗組合物調配為水溶液且藉由皮下注射針注射或氣動注射投與時，核酸之有效量可在2微克/劑量至10毫克/劑量之範圍內，而當核酸製備為經塗佈之金珠粒且使用基因槍技術遞送時，可能僅需要16奈克/劑量至16微克/劑量。 藉由電穿孔之核酸疫苗之劑量範圍一般在0.5至10毫克/劑量範圍內。在核酸疫苗與CpG一起藉由電穿孔以共同調配物形式投與的情況下，核酸疫苗之劑量可在0.5至5毫克/劑量範圍內，且CpG之劑量通常在0.05毫克至5毫克/劑量範圍內，諸如每人0.05、0.2、0.6或1.2毫克/劑量。
本發明之核酸或多肽疫苗組合物可依初打-加打策略使用以誘導穩固且長期的免疫反應。基於重複注射相同免疫原性構築體的初打及加打接種方案為熟知的。一般而言，第一劑量可能不產生保護性免疫，而是僅使免疫系統「致敏」。在第二或第三劑量(「加打」)之後產生保護性免疫反應。加打係根據習知技術進行，且在投藥時程、投藥途徑、佐劑選擇、劑量及與另一疫苗一起投與時之可能順序上可憑經驗進一步優化。在一個實施例中，本發明之核酸或多肽疫苗係依習知的同質疫苗初打-加打策略使用，其中相同疫苗以多次劑量投與動物。在另一實施例中，核酸或多肽疫苗組合物係以異質疫苗初打-加打接種法使用，其中以預定時間間隔投與含有相同抗原之不同類型疫苗。舉例而言，核酸構築體可以質體形式投與初始劑量(「初打」)且作為載體之一部分投與隨後劑量(加打)，或反之亦然。
治療前列腺癌時，本發明之多肽或核酸疫苗可與基於其他抗原(諸如基於前列腺酸性磷酸酶之抗原及雄激素受體)之前列腺癌疫苗一起使用。
本發明之多肽或核酸疫苗組合物可與一或多種佐劑一起使用。適合佐劑之實例包括：(1)水包油乳液調配物(存在或不存在其他特定免疫刺激劑，諸如胞壁醯多肽或細菌細胞壁組分)，諸如(a)MF59TM(PCT公開案第90/14837號；Vaccine design：the subunit and adjuvant approach,Powell及Newman編，Plenum Press 1995中的第10章)，其含有5%角鯊烯、0.5% Tween 80(聚氧乙烯脫水山梨醇單油酸酯)及0.5% Span 85(脫水山梨醇三油酸酯)，使用微流體化床調配成亞微米粒子；(b)SAF，其含有10%角鯊烯、0.4% Tween 80、5%普洛尼克(pluronic)嵌段聚合物L121及thr-MDP，經微流體化床處理成亞微米乳液或渦旋產生較大粒徑之乳液；及(c)RIBITM佐劑系統(RAS)(Ribi Immunochem,Hamilton,MT)，其含有2%角鯊烯、0.2% Tween 80及一或多種細菌細胞壁組分，諸如單磷醯脂質A(MPL)、海藻糖二黴菌酸酯(TDM)及細胞壁骨架(CWS)；(2)皂素佐劑，諸如QS21、STIMULONTM(Cambridge Bioscience,Worcester,MA)、Abisco®(Isconova,Sweden)或Iscomatrix®(Commonwealth Serum Laboratories,Australia)；(3)完全弗氏佐劑(Complete Freund's Adjuvant，CFA)及不完全弗氏佐劑(IFA)；(4)細胞素，諸如介白素(例如IL-1、IL-2、IL-4、IL-5、IL-6、IL-7、IL-12等(PCT公開案第WO 99/44636號))、干擾素(例如γ干擾素)、巨噬細胞群落刺激因子(M-CSF)、腫瘤壞死因子(TNF)等；(5)單磷醯脂質A(MPL)或3-O-脫醯基化MPL(3dMPL)，當與肺炎球菌醣類一起使用時，視情況實質上不存在明礬(例如GB-2220221、EP-A-0689454、WO 00/56358)；(6)3dMPL與例如QS21及/或水包油乳液之組合(例如EP-A-0835318、EP-A-0735898、EP-A-0761231)；(7)包含CpG基元，亦即，含有至少一個CG二核苷酸之寡核苷酸，其中胞嘧啶未經甲基化(例如Krieg,Vaccine(2000)19：618-622；Curr Opin Mol Ther(2001)3：15-24；WO 98/40100、WO 98/55495、WO 98/37919及WO 98/52581)；(8)聚氧乙烯醚或聚氧乙烯酯(例如WO 99/52549)；(9)聚氧乙烯脫水山梨醇酯界面活性劑與辛苯聚醇之組合(例如WO 01/21207)或聚氧化乙烯烷基醚或酯界面活性劑與至少一種其他非離子界面活性劑(諸如辛苯聚醇)之組合(例如WO 01/21152)；(10)皂素及免疫刺激寡核苷酸(例如CpG寡核苷酸)(例如WO 00/62800)；(11)金屬鹽，包括鋁鹽(諸如明礬、磷酸鋁、氫氧化 鋁)；(12)皂素及水包油乳液(例如WO 99/11241)；(13)皂素(例如QS21)+3dMPL+IM2(視情況+固醇)(例如WO 98/57659)；(14)充當可增強組合物之效力之免疫刺激劑的其他物質，諸如胞壁醯多肽，包括N-乙醯基-胞壁醯基-L-蘇胺醯基-D-異麩醯胺酸(thr-MDP)、N-25乙醯基-降胞壁醯-L-丙胺醯基-D-異麩醯胺酸(nor-MDP)、N-乙醯基胞壁醯-L-丙胺醯基-D-異麩醯胺醯基-L-丙胺酸-2-(1'-2'-二軟脂醯基-sn-甘油-3-羥基磷醯氧基)-乙胺(MTP-PE)；(15)toll樣受體(TLR)之天然或合成配位體(例如Kanzler等人，Nature Med.13：1552-1559(2007))，包括TLR3配位體，諸如polyl：C及類似化合物，諸如喜通諾(Hiltonol)及阿普林津(Ampligen)。
本發明之多肽或核酸疫苗組合物可與一或多種免疫調節劑一起使用。適合免疫調節劑之實例包括蛋白質酪胺酸激酶抑制劑(諸如阿法替尼(afatinib)、阿西替尼、西地尼布、埃羅替尼、吉非替尼、葛蘭丁寧(grandinin)、拉帕替尼、來他替尼、奈拉替尼(neratinib)、帕唑帕尼、奎紮替尼(quizartinib)、瑞格非尼(regorafenib)、司馬沙尼、索拉非尼、舒尼替尼、替沃紮尼(tivozanib)、托西拉尼(toceranib)、博索替尼及凡德他尼)、CD40促效劑(諸如CD40促效劑抗體)、OX40促效劑(諸如OX40促效劑抗體)、CTLA-4抑制劑(諸如抗CTLA-4抗體伊匹單抗及曲美目單抗)、TLR促效劑、4-1BB促效劑、Tim-1拮抗劑、LAGE-3拮抗劑及PD-L1與PD-1拮抗劑。
H.基於疫苗之免疫治療療程(VBIR)
在另一態樣中，本發明提供一種增強用於治療哺乳動物(尤其是人類)之贅生性病症之疫苗之免疫原性或治療效應的方法。該方法包含向接受用於治療贅生性病症之疫苗的哺乳動物投與(1)有效量之至少一種免疫抑制細胞抑制劑(ISC抑制劑)及(2)有效量之至少一種免疫效應細胞增強劑(IEC增強劑)。該方法可與呈任何形式之疫苗或調配 物組合使用，例如次單位疫苗、基於蛋白質之疫苗、基於肽之疫苗或基於核酸之疫苗，諸如基於DNA之疫苗、基於RNA之疫苗、基於質體之疫苗或基於載體之疫苗。另外，該方法不限於任何特定類型疫苗或任何特定類型癌症。相反，該方法可與意欲用於治療贅生性病症(包括良性、前惡性及惡性贅生性病症)之任何疫苗組合使用。舉例而言，該方法可與意欲用於治療以下贅生性病症中之任一者的疫苗組合使用：癌瘤，包括膀胱癌(包括加速性及轉移性膀胱癌)、乳癌、結腸癌(包括結腸直腸癌)、腎癌、肝癌、肺癌(包括小細胞肺癌及非小細胞肺癌及肺腺癌)、卵巢癌、前列腺癌、睪丸癌、生殖泌尿道癌、淋巴系統癌瘤、直腸癌、喉癌、胰臟癌(包括外分泌胰臟癌)、食道癌、胃癌、膽囊癌、子宮頸癌、甲狀腺癌及皮膚癌(包括鱗狀細胞癌)；淋巴造血系腫瘤，包括白血病、急性淋巴細胞性白血病、急性淋巴母細胞白血病、B細胞淋巴瘤、T細胞淋巴瘤、霍奇金氏淋巴瘤(Hodgkins lymphoma)、非霍奇金氏淋巴瘤、毛細胞淋巴瘤、組織細胞淋巴瘤及柏克特氏淋巴瘤(Burketts lymphoma)；骨髓造血系腫瘤，包括急性及慢性骨髓性白血病、骨髓發育不良症候群、骨髓白血病及前髓細胞性白血病；中樞及周邊神經系統腫瘤，包括星形細胞瘤、神經母細胞瘤、神經膠質瘤及神經鞘瘤；起源於間質之腫瘤，包括纖維肉瘤、橫紋肌肉瘤及骨肉瘤；其他腫瘤，包括黑素瘤、著色性乾皮病(xenoderma pigmentosum)、角化棘皮瘤、精原細胞瘤、甲狀腺濾泡癌及畸胎癌；黑素瘤、不可切除之III期或IV期惡性黑素瘤、鱗狀細胞癌、小細胞肺癌、非小細胞肺癌、神經膠質瘤、胃腸癌、腎癌、卵巢癌、肝癌、結腸直腸癌、子宮內膜癌、腎癌、前列腺癌、甲狀腺癌、神經母細胞瘤、胰臟癌、多形性膠質母細胞瘤、子宮頸癌、胃癌、膀胱癌、肝癌、乳癌、結腸癌及頭頸癌、胃癌、生殖細胞腫瘤、骨癌、骨腫瘤、成人骨惡性纖維組織細胞瘤；兒童期骨惡性纖維組織細胞 瘤、肉瘤、兒科肉瘤、鼻竇天然殺手、贅瘤、血漿細胞贅瘤；骨髓發育不良症候群；神經母細胞瘤；睪丸生殖細胞腫瘤、眼內黑素瘤、骨髓發育不良症候群；骨髓發育不良/脊髓增生病、滑膜肉瘤、慢性骨髓白血病、急性淋巴母細胞白血病、費城染色體陽性急性淋巴母細胞白血病(Ph+ ALL)、多發性骨髓瘤、急性骨髓性白血病、慢性淋巴細胞白血病及肥大細胞增多症。
在一些實施例中，本發明提供一種增強用於治療人類前列腺癌之疫苗之免疫原性或治療效應的方法。所投與之疫苗能夠引發針對任何人類PAA(諸如PSMA、PSA或PSCA)之免疫反應。在一些特定實施例中，所投與之疫苗包含編碼能夠引發針對人類PAA(諸如PSMA、PSA或PSCA)之免疫原性之抗原的核酸分子。疫苗中可含有之特定核酸分子的實例包括本發明所提供之以下各物：1)編碼免疫原性PSMA多肽、免疫原性PSA多肽或免疫原性PSCA多肽之核酸分子；2)編碼本發明所提供之兩種免疫原性PAA多肽的核酸分子，諸如a)免疫原性PSMA多肽及免疫原性PSA多肽；b)免疫原性PSMA多肽及免疫原性PSCA多肽；或c)免疫原性PSA多肽及免疫原性PSCA多肽；及3)編碼三種免疫原性PAA多肽之核酸分子，該三種免疫原性PAA多肽為免疫原性PSMA多肽、免疫原性PSA多肽及免疫原性PSCA多肽。
在另一態樣中，本發明提供一種治療哺乳動物(尤其是人類)之贅生性病症的方法。該方法包含向該哺乳動物投與(1)有效量之能夠引發針對與該贅生性病症相關之TAA之免疫反應的疫苗；(2)有效量之至少一種免疫抑制細胞抑制劑(ISC抑制劑)；及(3)有效量之至少一種免疫效應細胞增強劑(IEC增強劑)。能夠引發針對特定TAA之免疫反 應的任何疫苗均可用於該方法中。許多TAA在此項技術中為已知的。除前列腺相關抗原以外，以下為此項技術中已知的TAA實例：針對結腸直腸癌之CEA、MUC-1、Ep-CAM、5T4、hCG-b、K-ras及TERT；針對卵巢癌之CEA、Muc-1、p53、間皮素(mesothelin)、存活素及NY-ESO-1；針對非小細胞肺癌之Muc-1、5T4、WT-1、TERT、CEA、EGF-R及MAGE-A3；針對腎細胞癌瘤之5T4；及針對胰臟癌之Muc-1、間皮素、K-Ras、磷脂結合蛋白A2、TERT及CEA。新TAA持續得到鑑別。能夠引發針對任何已知或新TAA之免疫反應的疫苗均可用於該方法中。另外，所投與之疫苗可呈任何形式或調配物，例如次單位疫苗、基於蛋白質之疫苗、基於肽之疫苗或基於核酸之疫苗，諸如基於DNA之疫苗、基於RNA之疫苗、基於質體之疫苗或基於載體之疫苗。
在一些實施例中，本發明提供一種治療人類前列腺癌之方法，該方法包含向人類投與能夠引發針對任何人類PAA(諸如PSMA、PSA或PSCA)之免疫反應的疫苗。在一些特定實施例中，所投與之疫苗包含編碼能夠引發針對人類PAA(諸如PSMA、PSA或PSCA)之免疫原性之抗原的核酸分子。疫苗中可含有之特定核酸分子的實例包括本發明所提供之以下各物：1)編碼免疫原性PSMA多肽、免疫原性PSA多肽或免疫原性PSCA多肽之核酸分子；2)編碼本發明所提供之兩種免疫原性PAA多肽的核酸分子，諸如a)免疫原性PSMA多肽及免疫原性PSA多肽；b)免疫原性PSMA多肽及免疫原性PSCA多肽；或c)免疫原性PSA多肽及免疫原性PSCA多肽；及3)編碼三種免疫原性PAA多肽之核酸分子，該三種免疫原性PAA多肽為免疫原性PSMA多肽、免疫原性PSA多肽及免疫原性PSMA多 肽。
上文所述之治療哺乳動物之贅生性病症的方法及增強用於治療哺乳動物之贅生性病症之疫苗之免疫原性或治療效應的方法替代地稱為「基於疫苗之免疫治療療程」(或「VBIR」)。
在基於疫苗之免疫治療療程中，可藉由任何適合方法及途徑投與IEC增強劑及ISC抑制劑，包括(1)全身性投藥，諸如靜脈內、肌肉內或經口投藥；及(2)局部投藥，諸如皮內及皮下投藥。在適當或適合的情況下，與全身性投藥相比，局部投藥一般更佳。局部投與任何IEC增強劑及ISC抑制劑可在適合局部投與醫藥劑之哺乳動物身體的任何位置進行；然而，更佳在緊鄰疫苗引流淋巴結處局部投與此等免疫調節劑。
選自單一類別IEC增強劑之兩種或兩種以上特定IEC增強劑(例如兩種CTLA促效劑)可與ISC抑制劑組合投與。另外，選自兩種或兩種以上不同類別IEC增強劑之兩種或兩種以上特定IEC增強劑(例如，一種CTLA-4拮抗劑及一種TLR促效劑)可一起投與。類似地，選自單一類別ISC抑制劑之兩種或兩種以上特定ISC抑制劑(例如，兩種或兩種以上蛋白激酶抑制劑)可與IEC增強劑組合投與。另外，選自兩種或兩種以上不同類別ISC抑制劑之兩種或兩種以上特定ISC抑制劑(例如，一種蛋白激酶抑制劑及一種COX-2抑制劑)可一起投與。
在基於疫苗之免疫治療療程中，疫苗可與所使用之任何或所有免疫調節劑(亦即，ISC抑制劑及IEC增強劑)同時或依序投與。類似地，當使用兩種或兩種以上免疫調節劑時，其可相對於彼此同時或依序投與。在一些實施例中，疫苗相對於一種免疫調節劑同時投與(例如，於混合物中)，但相對於一或多種其他免疫調節劑依序投與。在基於疫苗之免疫治療療程中共同投與疫苗及免疫調節劑可包括以下情況：投與疫苗及至少一種免疫調節劑以使得每一者同時存在於投藥部 位(諸如疫苗引流淋巴結)處，縱使抗原及免疫調節劑並非同時投與。共同投與疫苗及免疫調節劑亦可包括以下情況：疫苗或免疫調節劑自投藥部位清除，但至少在一或多種其他免疫調節劑投與投藥部位之前，所清除之疫苗或免疫調節劑之至少一種細胞性作用持續存在於投藥部位(諸如疫苗引流淋巴結)。在核酸疫苗與CpG之組合投與的情況下，疫苗及CpG可包含於單一調配物中且藉由任何適合方法一起投與。在一些實施例中，共同調配物(混合物)中之核酸疫苗及CpG係藉由肌肉內注射與電穿孔之組合來投與。
任何ISC抑制劑均可用於基於疫苗之免疫治療療程。SIC抑制劑類別之實例包括蛋白激酶抑制劑、環加氧酶-2(COX-2)抑制劑、磷酸二酯酶5型(PDE5)抑制劑及DNA交聯劑。COX-2抑制劑之實例包括塞內昔布(celecoxib)及羅非昔布(rofecoxib)。PDE5抑制劑之實例包括阿伐那非(avanafil)、羅地那非(lodenafil)、米羅那非(mirodenafil)、西地那非(sildenafil)、他達那非(tadalafil)、伐地那非(vardenafil)、優地那非(udenafil)及紮普司特(zaprinast)。DNA交聯劑之實例為環磷醯胺。下文詳細描述特定蛋白激酶抑制劑之實例。
術語「蛋白激酶抑制劑」係指充當蛋白激酶之選擇性或非選擇性抑制劑之任何物質。術語「蛋白激酶」係指催化三磷酸腺苷之末端磷酸根轉移至蛋白質受質之酪胺酸、絲胺酸或蘇胺酸殘基的酶。蛋白激酶包括受體酪胺酸激酶及非受體酪胺酸激酶。受體酪胺酸激酶之實例包括EGFR(例如EGFR/HER1/ErbB1、HER2/Neu/ErbB2、HER3/ErbB3、HER4/ErbB4)、INSR(胰島素受體)、IGF-IR、IGF-II1R、IRR(胰島素受體相關受體)、PDGFR(例如PDGFRA、PDGFRB)、c-KIT/SCFR、VEGFR-1/FLT-1、VEGFR-2/FLK-1/KDR、VEGFR-3/FLT-4、FLT-3/FLK-2、CSF-1R、FGFR 1-4、CCK4、TRK A-C、MET、RON、EPHA 1-8、EPHB 1-6、AXL、MER、TYRO3、 TIE、TEK、RYK、DDR 1-2、RET、c-ROS、LTK(白血球酪胺酸激酶)、ALK(多形性淋巴瘤激酶)、ROR 1-2、MUSK、AATYK 1-3及RTK 106。非受體酪胺酸激酶之實例包括BCR-ABL、Src、Frk、Btk、Csk、Abl、Zap70、Fes/Fps、Fak、Jak、Ack及LIMK。在本發明所提供之基於疫苗之免疫治療療程中，蛋白激酶抑制劑係以次最佳劑量投與哺乳動物。術語「次最佳劑量」係指以標靶贅生性病症之單一療法投與酪胺酸激酶抑制劑(亦即，其中單獨投與蛋白激酶抑制劑而不投與任何其他治療劑)時低於最小有效劑量的劑量。
適用於基於疫苗之免疫治療療程的特定蛋白激酶抑制劑之實例包括拉帕替尼(Lapatinib)、AZD 2171、ET18OCH 3、靛玉紅-3'-肟(Indirubin-3'-oxime)、NSC-154020、PD 169316、槲皮素(Quercetin)、羅斯維汀(Roscovitine)、曲西立濱(Triciribine)、ZD 1839、5-碘殺結核菌素(5-Iodotubercidin)、阿達福斯汀(Adaphostin)、阿洛辛(Aloisine)、阿爾斯特隆(Alsterpaullone)、胺基金雀異黃素(Aminogenistein)、API-2、芹菜素(Apigenin)、牛蒡子苷元(Arctigenin)、ARRY-334543、阿西替尼(AG-013736)、AY-22989、AZD 2171、雙吲哚基順丁烯二醯亞胺IX、CCl-779、白屈菜紅鹼(Chelerythrine)、DMPQ、DRB、依地福新(Edelfosine)、ENMD-981693、三羥異黃酮類似物、埃羅替尼(Erlotinib)、法舒地爾(Fasudil)、吉非替尼(ZD1839)、H-7、H-8、H-89、HA-100、HA-1004、HA-1077、HA-1100、羥基法舒地爾(Hydroxyfasudil)、肯泡隆(Kenpaullone)、KN-62、KY12420、LFM-A13、四羥黃酮(Luteolin)、LY294002、LY-294002、楸毒素(Mallotoxin)、ML-9、MLN608、NSC-226080、NSC-231634、NSC-664704、NSC-680410、NU6102、奧羅莫星(Olomoucine)、羥吲哚I、PD 153035、PD 98059、根皮酯(Phloridzin)、白皮杉醇(Piceatannol)、苦鬼臼脂素 (Picropodophyllin)、PKI、PP1、PP2、PTK787/ZK222584、PTK787/ZK-222584、珀伐拉諾A(Purvalanol A)、雷帕慕恩(Rapamune)、雷帕黴素(Rapamycin)、Ro 31-8220、粗糠柴黴素(Rottlerin)、SB202190、SB203580、西羅莫司、SL327、SP600125、星形孢菌素(Staurosporine)、STI-571、SU1498、SU4312、SU5416、SU5416(司馬沙尼(Semaxanib))、SU6656、SU6668、syk抑制劑、TBB、TCN、替伏汀(Tyrphostin)AG 1024、替伏汀AG 490、替伏汀AG 825、替伏汀AG 957、U0126、W-7、渥曼青黴素(Wortmannin)、Y-27632、紮克替瑪(Zactima)(ZD6474)、ZM 252868、吉非替尼(Iressa.RTM.)、蘋果酸舒尼替尼(Sutent.RTM.；SU11248)、埃羅替尼(Tarceva.RTM.；OSI-1774)、拉帕替尼(GW572016；GW2016)、卡拉替尼(canertinib)(CI 1033)、塞瑪昔布(semaxinib)(SU5416)、瓦他拉尼(vatalanib)(PTK787/ZK222584)、索拉非尼(sorafenib)(BAY 43-9006)、伊馬替尼(imatinib)(Gleevec.RTM.；STI571)、達沙替尼(dasatinib)(BMS-354825)、來氟米特(leflunomide)(SU101)、凡德他尼(vandetanib)(Zactima.RTM.；ZD6474)及尼勒替尼(nilotinib)。適用於本發明中之其他蛋白激酶抑制劑描述於例如美國專利第5,618,829號、第5,639,757號、第5,728,868號、第5,804,396號、第6,100,254號、第6,127,374號、第6,245,759號、第6,306,874號、第6,313,138號、第6,316,444號、第6,329,380號、第6,344,459號、第6,420,382號、第6,479,512號、第6,498,165號、第6,544,988號、第6,562,818號、第6,586,423號、第6,586,424號、第6,740,665號、第6,794,393號、第6,875,767號、第6,927,293號及第6,958,340號。
在一些實施例中，蛋白激酶抑制劑為多激酶抑制劑，其為作用於超過一種特定激酶之抑制劑。多激酶抑制劑之實例包括伊馬替尼、索拉非尼、拉帕替尼、BIRB-796及AZD-1152、AMG706、紮克替瑪 (ZD6474)、MP-412、索拉非尼(BAY 43-9006)、達沙替尼、CEP-701(來他替尼)、XL647、XL999、Tykerb(拉帕替尼)、MLN518(先前稱為CT53518)、PKC412、ST1571、AEE 788、OSI-930、OSI-817、蘋果酸舒尼替尼(紓癌特(Sutent))、阿西替尼(AG-013736)、埃羅替尼、吉非替尼、阿西替尼、博索替尼、坦羅莫司及尼勒替尼(AMN107)。在一些特定實施例中，酪胺酸激酶抑制劑為舒尼替尼、索拉非尼或者舒尼替尼或索拉非尼之醫藥學上可接受之鹽或衍生物(諸如蘋果酸鹽或甲苯磺酸鹽)。
Pfizer Inc.以商標SUTENT(紓癌特)銷售之蘋果酸舒尼替尼在化學上描述為(2S)-羥基-丁二酸N-[2-(二乙基胺基)乙基]-5-[(Z)-(5-氟-1,2-二氫-2-側氧基-3H-吲哚-3-次基)甲基]-2,4-二甲基-1H-吡咯-3-甲醯胺化合物(1：1)。該化合物、其合成及特定多晶型物描述於美國專利第6,573,293號、美國專利公開案第2003-0229229號、第2003-0069298號及第2005-0059824號中及J.M.Manley,M.J.Kalman,B.G.Conway,C.C.Ball,J.L Havens及R.Vaidyanathan,「Early Amidation Approach to 3-[(4-amido)pyrrol-2-yl]-2-indolinones」,J.Org.Chew.68,6447-6450(2003)中。舒尼替尼調配物及其L-蘋果酸鹽描述於PCT公開案第WO 2004/024127號中。蘋果酸舒尼替尼在美國已被批准用於治療患有局部不可切除之晚期或轉移性疾病之患者的胃腸基質腫瘤、晚期腎細胞癌瘤及進行性良好分化型胰臟神經內分泌腫瘤。用於人類胃腸基質腫瘤(GIST)及晚期腎細胞癌瘤(RCC)之蘋果酸舒尼替尼之推薦劑量為50mg，每日口服一次，按照治療4週隨後停藥2週之時程(時程4/2)。用於胰臟神經內分泌腫瘤(pNET)之蘋果酸舒尼替尼之推薦劑量為37.5mg，每日口服一次。
在基於疫苗之免疫治療療程中，蘋果酸舒尼替尼可以單劑量或多劑量經口投與。通常，蘋果酸舒尼替尼遞送兩個、三個、四個或四 個以上連續週劑量，隨後為約1或2週或多於2週之不遞送蘋果酸舒尼替尼之「停止」期。在一個實施例中，遞送劑量約4週，停止2週。在另一實施例中，遞送蘋果酸舒尼替尼兩週，停止1週。然而，亦可遞送整個治療期而無「停止」期。在基於疫苗之免疫治療療程中經口投與人類之蘋果酸舒尼替尼之有效量通常低於40毫克/人/劑量。舉例而言，可經口投與37.5、31.25、25、18.75、12.5、6.25毫克/人/天。在一些實施例中，經口投與1至25毫克/人/劑量範圍內之蘋果酸舒尼替尼。在一些其他實施例中，經口投與6.25、12.5或18.75毫克/人/劑量範圍內之蘋果酸舒尼替尼。其他給藥方案及變化為可預見的，且將根據醫師指導來確定。
以商標NEXAVAR銷售之甲苯磺酸索拉非尼亦為多激酶抑制劑。其化學名稱為4-(4-{3-[4-氯-3-(三氟甲基)苯基]脲基}苯氧基)-N-甲基吡啶-2-甲醯胺。其在美國中已被批准用於治療原發性腎癌(晚期腎細胞癌)及晚期原發性肝癌(肝細胞癌)。推薦日劑量為400毫克，每日口服兩次。在本發明所提供之基於疫苗之免疫治療療程中，經口投與之甲苯磺酸索拉非尼之有效量通常低於400毫克/人/天。在一些實施例中，經口投與之甲苯磺酸索拉非尼之有效量在10至300毫克/人/天範圍內。在一些其他實施例中，經口投與之甲苯磺酸索拉非尼之有效量為10至200毫克/人/天，諸如10、20、60、80、100、120、140、160、180或200毫克/人/天。
以商標INLYTA銷售之阿西替尼為VEGF受體1、2及3之選擇性抑制劑。其化學名稱為(N-甲基-2-[3-((E)-2-吡啶-2-基-乙烯基)-1H-吲唑-6-基硫基]-苯甲醯胺。其已被批准用於在一種先前全身性治療失敗後治療晚期腎細胞癌瘤。起始劑量為5mg，每日口服兩次。可基於個體安全性及耐受性進行劑量調節。在本發明所提供之基於疫苗之免疫治療療程中，經口投與之阿西替尼之有效量通常低於5mg，每日兩次。 在一些其他實施例中，經口投與之阿西替尼之有效量為1-5mg，每日兩次。在一些其他實施例中，經口投與之阿西替尼之有效量為1、2、3、4或5mg，每日兩次。
在基於疫苗之免疫治療療程中，可使用任何IEC增強劑。其可為小分子或大分子(諸如蛋白質、多肽、DNA、RNA及抗體)。可使用之IEC增強劑之實例包括TNFR促效劑、CTLA-4拮抗劑、TLR促效劑、漸進式細胞死亡蛋白1(PD-1)拮抗劑(諸如BMS-936558)、抗PD-1抗體(CT-011)及漸進式細胞死亡蛋白1配位體1(PD-L1)拮抗劑(諸如BMS-936559)、淋巴細胞活化基因3(LAG3)拮抗劑及含T細胞免疫球蛋白及黏蛋白結構域之分子3(TIM-3)拮抗劑。下文詳細提供特定TNFR促效劑、CTLA-4拮抗劑及TLR促效劑之實例。
TNFR促效劑
TNFR促效劑之實例包括OX40、4-1BB(諸如BMS-663513)、GITR(諸如TRX518)及CD40之促效劑。下文詳細描述特定CD40促效劑之實例。
CD40促效劑為結合細胞上之CD40受體且能夠增加一或多種CD40或CD40L相關活性的物質。因此，CD40「促效劑」涵蓋CD40「配位體」。
CD40促效劑之實例包括CD40促效抗體、CD40促效抗體之片段、CD40配位體(CD40L)及CD40L之片段及衍生物，諸如寡聚物CD40L(例如二價三聚CD40L)、含有其及其變異體之融合蛋白質。
用於本發明中之CD40配位體包括任何肽、多肽或蛋白質或編碼肽、多肽或蛋白質之核酸，其可結合並活化細胞上之一或多種CD40受體。適合CD40配位體描述於例如美國專利第6,482,411號、第6,410,711號、美國專利第6,391,637號及美國專利第5,981,724號中，所有該等專利及申請案及其中所揭示之CD40L序列係以全文引用的方 式併入本文中。雖然人類CD40配位體較佳用於人類治療，但來自任何物種之CD40配位體均可用於本發明。用於其他動物物種時，諸如用於獸醫學實施例中，與欲治療之動物相匹配之CD40配位體種類較佳。在某些實施例中，CD40配位體為gp39肽或蛋白質寡聚物，包括天然形成之gp39肽、多肽或蛋白質寡聚物以及包含寡聚序列之gp39肽、多肽、蛋白質(及編碼核酸)。雖然諸如二聚物、三聚物及四聚物之寡聚物在本發明之某些態樣中較佳，但在本發明之其他態樣中涵蓋使用較大寡聚結構，只要寡聚結構保留結合並活化一或多種CD40受體之能力即可。
在某些其他實施例中，CD40促效劑為抗CD40抗體或其抗原結合片段。抗體可為人類、人類化或部分人類嵌合抗CD40抗體。特定抗CD40單株抗體之實例包括G28-5、mAb89、EA-5或S2C6單株抗體及CP870893。在一個特定實施例中，抗CD40促效劑抗體為CP870893或達西珠單抗(dacetuzumab)(SGN-40)。
CP-870,893為臨床上已作為抗腫瘤療法之完全人類促效CD40單株抗體(mAb)。CP870,893之結構及製備揭示於WO2003041070中(其中識別該抗體之內部識別碼為「21.4.1」)。CP-870,893之重鏈及輕鏈之胺基酸序列分別闡述於SEQ ID NO：40及SEQ ID NO：41中。在臨床試驗中，CP870,893藉由靜脈內輸注投與之劑量一般在每次輸注0.05至0.25mg/kg範圍內。在I期臨床研究中，CP-870893之最大耐受劑量(MTD)估計為0.2mg/kg且劑量限制毒性包括3級CRS及3級蕁麻疹。[Jens Ruter等人：Immune modulation with weekly dosing of an agonist CD40 antibody in a phase I study of patients with advanced solid tumors.Cancer Biology & Therapy 10：10,983-993；2010年11月15日。]在本發明所提供之基於疫苗之免疫治療療程中，CP-870,893可經皮內、皮下或經皮投與。較佳為經皮內投與。該療程中欲投與之 CP870893之有效量一般低於0.2mg/kg，通常在0.01mg/kg至0.15mg/kg或0.05至0.1mg/kg範圍內。
達西珠單抗(亦稱為SGN-40或huS2C6；CAS編號88-486-59-9)為已在頑固性淋巴瘤、彌漫性大B細胞淋巴瘤及多發性骨髓瘤之臨床試驗中研究之另一種抗CD40促效劑抗體。在臨床試驗中，以2mg/kg至16mg/kg範圍內之週劑量經靜脈內投與達西珠單抗。在本發明所提供之基於疫苗之免疫治療療程中，可經皮內、皮下或經皮投與達西珠單抗。較佳為經皮內投與。該基於疫苗之免疫治療療程中欲投與之達西珠單抗之有效量一般低於16mg/kg，通常在0.2mg/kg至14mg/kg或0.5至8mg/kg或1至5mg/kg範圍內。
CTLA-4抑制劑
適用於本發明所提供之基於疫苗之免疫治療療程中的抗CTLA-4拮抗劑包括(而不限於)抗CTLA-4抗體(諸如人類抗CTLA-4抗體、小鼠抗CTLA-4抗體、哺乳動物抗CTLA-4抗體、人類化抗CTLA-4抗體、單株抗CTLA-4抗體、多株抗CTLA-4抗體、嵌合抗CTLA-4抗體、抗CTLA-4結構域抗體)、抗CTLA-4抗體片段(諸如單鏈抗CTLA-4片段、重鏈抗CTLA-4片段及輕鏈抗CTLA-4片段)及促進協同刺激路徑之CTLA-4抑制劑。在一些實施例中，CTLA-4抑制劑為伊匹單抗或曲美目單抗。
作為YERVOY銷售之伊匹單抗(亦稱為MEX-010或MDX-101)為人類抗人類CTLA-4抗體。伊匹單抗亦可用其CAS登記號477202-00-9提及，且在PCT公開案第WO 01/14424號中揭示為抗體10DI，該公開案以全文引用的方式併入本文中用於達成所有目的。PCT公開案第WO 2007/67959號中提供包含伊匹單抗之醫藥組合物的實例。伊匹單抗在美國已被批准用於治療不可切除性或轉移性黑素瘤。作為單一療法之伊匹單抗之推薦劑量為每3週靜脈內投與3mg/kg，總計4次劑量。在 本發明所提供之方法中，伊匹單抗係局部，尤其是皮內或皮下投與。局部投與之伊匹單抗之有效量通常在5至200毫克/劑量/人範圍內。在一些實施例中，伊匹單抗之有效量在10至150毫克/劑量/人/劑量範圍內。在一些特定實施例中，伊匹單抗之有效量為約10、25、50、75、100、125、150、175或200毫克/劑量/人。
曲美目單抗(亦稱為CP-675,206)為完全人類IgG2單株抗體且CAS編號為745013-59-6。曲美目單抗在美國專利第6,682,736號中揭示為抗體11.2.1，該專利以全文引用的方式併入本文中用於達成所有目的。曲美目單抗之重鏈及輕鏈之胺基酸序列分別闡述於SEQ ID NO：42及SEQ ID NO：43中。已在用於治療各種腫瘤(包括黑素瘤及乳癌)之臨床試驗中研究曲美目單抗，其中曲美目單抗以單次劑量或多次劑量每4或12週以0.01至15mg/kg之劑量範圍靜脈內投與。在本發明所提供之療程中，曲美目單抗係局部，尤其是皮內或皮下投與。皮內或皮下投與之曲美目單抗之有效量通常在5至200毫克/劑量/人範圍內。在一些實施例中，曲美目單抗之有效量在10至150毫克/劑量/人/劑量範圍內。在一些特定實施例中，曲美目單抗之有效量為約10、25、50、75、100、125、150、175或200毫克/劑量/人。
Toll樣受體(TLR)促效劑
術語「toll樣受體促效劑」或「TLR促效劑」係指充當toll樣受體(TLR)之促效劑的化合物。此促效劑包括TLR1、TLR2、TLR3、TLR4、TLR5、TLR6、TLR7、TLR8、TLR9、TLR10及TLR11或其組合之促效劑。除非另外指示，否則提及TLR促效劑化合物可包括呈任何醫藥學上可接受之形式的化合物，包括任何異構體(例如非對映異構體或對映異構體)、鹽、溶劑合物、多晶型物及其類似物。詳言之，若化合物具有光學活性，則提及該化合物可包括該化合物之各對映異構體以及該等對映異構體外消旋混合物。此外，化合物可鑑別為 一或多種特定TLR之促效劑(例如TLR7促效劑、TLR8促效劑或TLR7/8促效劑)。
可用此項技術中已知的任何適合方式來評估特定化合物之TLR促效作用。不考慮所採用之特定分析法，若用化合物進行分析引起特定TLR所介導之一些生物活性之至少一個臨限值增加，則化合物可鑑別為特定TLR之促效劑。反之，若用於執行為偵測特定TLR介導之生物活性所設計的分析時，化合物未能引發生物活性之臨限值增加，則可鑑別該化合物不充當特定TLR之促效劑。除非另外指示，否則生物活性增加係指同一生物活性與在適當對照中所觀察到之結果相比有所增加。分析法可能或可能不結合適當對照進行。熟習此項技術者可憑經驗充分熟悉特定分析(例如在適當對照中在特定分析條件下所觀察到之值範圍)，因此並非總是需要進行對照來確定化合物在特定分析中之TLR促效作用。
與諸如蛋白質、肽及其類似物之大生物分子相反，適用於本發明方法之某些TLR促效劑為小有機分子。小分子TLR促效劑之實例包括以下專利中所揭示者，例如：美國專利第4,689,338號、第4,929,624號、第4,988,815號、第5,037,986號、第5,175,296號、第5,238,944號、第5,266,575號、第5,268,376號、第5,346,905號、第5,352,784號、第5,367,076號、第5,389,640號、第5,395,937號、第5,446,153號、第5,482,936號、第5,693,811號、第5,741,908號、第5,756,747號、第5,939,090號、第6,039,969號、第6,083,505號、第6,110,929號、第6,194,425號、第6,245,776號、第6,331,539號、第6,376,669號、第6,451,810號、第6,525,064號、第6,545,016號、第6,545,017號、第6,558,951號及第6,573,273號。適用於本發明所提供之方法的特定小分子TLR促效劑之實例包括4-胺基-α,α,2-三甲基-1H-咪唑并[4,5-c]喹啉-1-乙醇、N-(2-{2-[4-胺基-2-(2-甲氧基乙基)-1H-咪 唑并[4,5-c]喹啉-1-基]乙氧基-}乙基)-N-甲基嗎啉-4-甲醯胺、1-(2-胺基-2-甲基丙基)-2-(乙氧基甲基-)-1H-咪唑并[4,5-c]喹啉-4-胺、N-[4-(4-胺基-2-乙基-1H-咪唑并[4,5-c]喹啉-1-基)丁基]甲磺醯胺、N-[4-(4-胺基-2-丙基-1H-咪唑并[4,5-c]喹啉-1-基)丁基]甲磺醯胺及咪喹莫特(imiquimod)。尤其適用於本發明所提供之方法或療程的一些TLR促效劑論述於以下評述論文中：Folkert Steinhagen等人，TLR-based immune adjuvants.Vaccine 29(2011)：3341-3355。
在一些實施例中，TLR促效劑為TLR9促效劑，尤其是CpG寡核苷酸(或CpG.ODN)。CpG寡核苷酸為依序含有經磷酸酯鍵連接之胞嘧啶及鳥嘌呤之短核酸分子，其中胞嘧啶之嘧啶環未經甲基化。CpG基元為包括未甲基化中心CpG的鹼基模式，此中心CpG被至少一個側接於中心CpG(3'及5'側)之鹼基圍繞。CpG寡核苷酸包括D及K寡核苷酸。整個CpG寡核苷酸可未經甲基化，或部分可未經甲基化。適用於本發明所提供之方法的CpG寡核苷酸之實例包括美國專利第6194388號、第6207646號、第6214806號、第628371號、第6239116號及第6339068號中所揭示者。
與天然RNA及DNA相比，CpG寡核苷酸可涵蓋各種化學修飾及取代，包括磷酸二酯核苷間橋連、β-D-核糖(脫氧核糖)單元及/或天然核苷鹼基(腺嘌呤、鳥嘌呤、胞嘧啶、胸嘧啶、尿嘧啶)。化學修飾之實例為熟習此項技術者已知的且描述於例如以下文獻中：Uhlmann E.等人，(1990),Chem.Rev.90：543；「Protocols for Oligonucleotides and Analogs」,Synthesis and Properties and Synthesis and Analytical Techniques,S.Agrawal編，Humana Press,Totowa,USA 1993；Crooke,ST.等人，(1996)Annu.Rev.Pharmacol.Toxicol.36：107-129；及Hunziker J.等人，(1995),Mod.Synth.Methods 7：331-417。特定言之，CpG寡核苷酸可含有經修飾之胞嘧啶。經修飾之胞嘧啶為胞嘧啶之天 然存在或非天然存在之嘧啶鹼基類似物，其可置換此鹼基而不損害寡核苷酸之免疫刺激活性。經修飾之胞嘧啶包括(但不限於)5-經取代之胞嘧啶(例如5-甲基胞嘧啶、5-氟胞嘧啶、5-氯胞嘧啶、5-溴胞嘧啶、5-碘胞嘧啶、5-羥基胞嘧啶、5-羥甲基胞嘧啶、5-二氟甲基胞嘧啶及未經取代或經取代之5-炔基胞嘧啶)、6-經取代之胞嘧啶、N4-經取代之胞嘧啶(例如N4-乙基胞嘧啶)、5-氮雜-胞嘧啶、2-巰基胞嘧啶、異胞嘧啶、假異胞嘧啶、具有縮合環系統之胞嘧啶類似物(例如N,N'-伸丙基胞嘧啶或啡噁嗪)以及尿嘧啶及其衍生物(例如5-氟尿嘧啶、5-溴尿嘧啶、5-溴乙烯基尿嘧啶、4-硫尿嘧啶、5-羥基尿嘧啶、5-丙炔基尿嘧啶)。一些較佳胞嘧啶包括5-甲基胞嘧啶、5-氟胞嘧啶、5-羥基胞嘧啶、5-羥甲基胞嘧啶及N4-乙基胞嘧啶。
CpG寡核苷酸亦可含有經修飾之鳥嘌呤。經修飾之鳥嘌呤為鳥嘌呤之天然存在或非天然存在之嘌呤鹼基類似物，其可置換此鹼基而不損害寡核苷酸之免疫刺激活性。經修飾之鳥嘌呤(包括但不限於)7-脫氮鳥嘌呤、7-脫氮-7-經取代之鳥嘌呤、次黃嘌呤、N2-經取代之鳥嘌呤(例如N2-甲基鳥嘌呤)、5-胺基-3-甲基-3H,6H-噻唑并[4,5-d]嘧啶-2,7-二酮、2,6-二胺基嘌呤、2-胺基嘌呤、嘌呤、吲哚、腺嘌呤、經取代之腺嘌呤(例如N6-甲基腺嘌呤、8-側氧基腺嘌呤)、8-經取代之鳥嘌呤(例如8-羥基鳥嘌呤及8-溴鳥嘌呤)及6-硫鳥嘌呤。在本發明之一些實施例中，鳥嘌呤鹼基經通用鹼基(例如4-甲基吲哚、5-硝基吲哚及K-鹼基)、芳環系統(例如苯并咪唑或二氯苯并咪唑、1-甲基-1H-[1,2,4]三唑-3-甲酸醯胺)或氫原子取代。
在某些態樣中，CpG寡核苷酸包括經修飾之骨架。已證明當活體內投與時，核酸骨架之修飾可增強核酸之活性。二級結構，諸如莖環，可穩定核酸以防降解。或者，核酸穩定可經由磷酸骨架修飾來實現。較佳穩定核酸具有至少一個部分硫代磷酸酯修飾骨架。硫代磷酸 酯可使用自動化技術、採用胺基磷酸酯或H-膦酸酯化合物來合成。例如，可如美國專利第4,469,863號中所述製造芳基膦酸酯及烷基膦酸酯；且可藉由自動化固相合成、使用市售試劑來製備烷基磷酸三酯(其中帶電含氧部分如美國專利第5,023,243號及歐洲專利第092,574號中所述經烷基化)。已描述用於製造其他DNA骨架修飾及取代之方法(Uhlmann,E.及Peyman,A.(1990)Chem.Rev.90：544；Goodchild,J.(1990)Bioconjugate Chem.1：165)。具有CpG基元之2'-O-甲基核酸亦引起免疫活化，如同經乙氧基修飾之CpG核酸。實際上，已發現無骨架修飾完全消除CpG效應，但藉由5-甲基C置換C已將其大大降低。具有硫代磷酸酯鍵聯之構築體提供最大活性且防止核酸因細胞內之外切核酸酶及內切核酸酶而降解。其他經修飾之寡核苷酸包括經磷酸二酯修飾之寡核苷酸、磷酸二酯與硫代磷酸酯寡核苷酸之組合、甲基膦酸酯、甲基硫代磷酸酯、二硫代磷酸酯、對乙氧基及其組合。相對於CpG核酸，此等組合中之每一者及其對免疫細胞之特定作用更詳細論述於PCT公開案第WO 96/02555號及第WO 98/18810號及美國專利第6,194,388號及第6,239,116號中。
CpG寡核苷酸可具有一或兩個可及5'端。可產生具有兩個此種5'端之經修飾寡核苷酸，例如使兩個寡核苷酸經由3'-3'鍵聯連接以產生具有一或兩個可及5'端之寡核苷酸。3'-3'鍵聯可為磷酸二酯、硫代磷酸酯或任何其他經修飾之核苷間橋連。用於實現該等鍵聯之方法在此項技術中為已知的。舉例而言，該等鍵聯已描述於以下文獻中：Seliger,H.等人，Oligonucleotide analogs with terminal 3'-3'- and 5'-5'- internucleotidic linkages as antisense inhibitors of viral gene expression,Nucleosides and Nucleotides(1991),10(1-3),469-77；及Jiang等人，Pseudo-cyclic oligonucleotides：in vitro and in vivo properties,Bioorganic and Medicinal Chemistry(1999),7(12),2727-2735。
另外，可使用其他間隔基(諸如三乙二醇或四乙二醇磷酸酯部分)來製備3'-3'連接之寡核苷酸，其中3'端核苷間鍵聯不為磷酸二酯、硫代磷酸酯或其他經修飾橋連(Durand,M.等人，Triple-helix formation by an oligonucleotide containing one(dA)12 and two(dT)12 sequences bridged by two hexaethylene glycol chains,Biochemistry(1992),31(38),9197-204；美國專利第5,658,738號及第5,668,265號)。或者，可使用標準胺基磷酸酯化學反應、由乙二醇、丙二醇或由無鹼基脫氧核糖(dSpacer)單元獲得非核苷酸連接子(Fontanel,Marie Laurence等人，Nucleic Acids Research(1994),22(11),2022-7)。非核苷酸連接子可併入一次或多次，或彼此組合，從而允許兩個欲連接之寡核苷酸之3'端之間存在任何理想距離。
位於核苷之3'及/或5'端之磷酸二酯核苷間橋連可由經修飾之核苷間橋連置換，其中該經修飾之核苷間橋連係選自例如硫代磷酸酯、二硫代磷酸酯、NR1R2-胺基磷酸酯、硼烷磷酸酯、膦酸α-羥基苯甲基酯、磷酸-(C1-C21)-O-烷基酯、磷酸-[(C6-C21)芳基-(C1-C21)-O-烷基酯、(C1-C8)烷基磷酸酯及/或(C6-C12)芳基磷酸酯橋連、(C7-C12)-α-羥甲基-芳基(例如揭示於PCT公開案第WO 95/01363號中)，其中(C6-C12)芳基、(C6-C20)芳基及(C6-C14)芳基視情況經鹵素、烷基、烷氧基、硝基、氰基取代，且其中R1及R2彼此獨立地為氫、(C1-C18)烷基、(C6-C20)芳基、(C6-C14)芳基、(C1-C8)烷基，較佳為氫、(C1-C8)烷基，較佳為(C1-C4)烷基及/或甲氧基乙基，或R1及R2與攜帶其之氮原子一起形成5至6員雜環，該雜環可另外含有選自O、S及N之群的另一雜原子。
藉由脫磷酸橋連置換位於核苷之3'及/或5'端之磷酸二酯橋連(脫磷酸橋連描述於例如Uhlmann E.及Peyman A.,「Methods in Molecular Biology」，第20卷，「Protocols for Oligonucleotides and Analogs」,S.Agrawal編，Humana Press,Totowa 1993，第16章，第355 頁及下文中)，其中脫磷酸橋連係選自例如以下脫磷酸橋連：甲縮醛、3'-硫甲縮醛、甲基羥胺、肟、亞甲基二甲基伸肼基、二亞甲碸及/或矽烷基。
用於本發明所提供之方法或療程中的CpG寡核苷酸可視情況具有嵌合骨架。嵌合骨架為包含超過一種類型鍵聯之骨架。在一個實施例中，嵌合骨架可由下式表示：5' Y1 N1ZN2Y2 3'。Y1及Y2為具有1至10個核苷酸之核酸分子。Y1及Y2各自包括至少一個經修飾之核苷酸間鍵聯。因為嵌合寡核苷酸之至少2個核苷酸包括骨架修飾，因此，此等核酸為一種類型「穩定免疫刺激核酸」之一個實例。
相對於嵌合寡核苷酸，Y1及Y2被視為彼此無關。此意謂Y1及Y2各自可能或可能不在同一分子中具有彼此不同的序列及不同的骨架鍵聯。在一些實施例中，Y1及/或Y2具有3至8個核苷酸。N1及N2為具有0至5個核苷酸之核酸分子，只要N1ZN2具有總計至少6個核苷酸即可。N1ZN2之核苷酸具有磷酸二酯骨架且不包括具有經修飾骨架之核酸。Z為免疫刺激核酸基元，較佳係選自本文中所述者。
式Y1 N1ZN2Y2之中心核苷酸(N1ZN2)具有磷酸二酯核苷酸間鍵聯且Y1及Y2具有至少一個但可具有超過一個或甚至可具有所有經修飾之核苷酸間鍵聯。在較佳實施例中，Y1及/或Y2具有至少2個或2至5個經修飾之核苷酸間鍵聯，或Y1具有5個經修飾之核苷酸間鍵聯且Y2具有2個經修飾之核苷酸間鍵聯。在一些實施例中，經修飾之核苷酸間鍵聯為經硫代磷酸酯修飾之鍵聯、二硫代磷酸酯鍵聯或經對乙氧基修飾之鍵聯。
適用於本發明所提供之方法之特定CpG寡核苷酸之實例包括：5' TCGTCGTTTTGTCGTTTTGTCGTT3'(CpG 7909)；5' TCGTCGTTTTTCGGTGCTTTT3'(CpG 24555)；及5' TCGTCGTTTTTCGGTCGTTTT3'(CpG 10103)。
已廣泛研究合成的單股24聚體CpG7909作為單一療法及與化學治療劑組合用於治療癌症以及作為佐劑用於針對癌症及傳染病之疫苗。據報導，靜脈內單一劑量之CpG 7909具良好耐受性而無臨床效應且無顯著毒性直至高達1.05mg/kg，而皮下單一劑量CpG 7909具有0.45mg/kg之最大耐受劑量(MTD)且具有肌痛之劑量限制毒性及體質性效應。[參看Zent,Clive S等人，Phase I clinical trial of CpG oligonucleotide 7909(PF-03512676)in patients with previously treated chronic lymphocytic leukemia.Leukemia and Lymphoma,53(2)：211-217(7)(2012)]。在本發明所提供之療程中，可藉由注射至肌肉中或任何其他適合方法來投與CpG7909。較佳在鄰近疫苗引流淋巴結處局部投與，尤其是藉由皮內或皮下投藥。為與諸如DNA疫苗之核酸疫苗一起使用，較佳可將CpG與疫苗共同調配於單一調配物中且藉由肌肉內注射聯合電穿孔來投與。藉由肌肉內、皮內或皮下投與之CpG7909之有效量通常在10微克/劑量至10毫克/劑量範圍內。在一些實施例中，CpG7909之有效量在0.05毫克至14毫克/劑量範圍內。在一些特定實施例中，CpG7909之有效量為約0.05、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5或1毫克/劑量。其他CpG寡核苷酸，包括CpG 24555及CpG 10103，可用類似方式及劑量投與。
在一些特定實施例中，本發明提供一種增強用於治療人類贅生性病症之疫苗之免疫原性或治療效應的方法，該方法包含向該人類投與(1)有效量之至少一種ISC抑制劑及(2)有效量之至少一種IEC增強劑，其中該至少一種ISC抑制劑為選自甲苯磺酸索拉非尼、蘋果酸舒尼替尼、阿西替尼、埃羅替尼、吉非替尼、阿西替尼、博索替尼、坦羅莫司或尼勒替尼之蛋白激酶抑制劑，且其中該至少一種IEC增強劑係選自CTLA-4抑制劑、TLR促效劑或CD40促效劑。在一些較佳實施例中，療程包含向人類投與(1)有效量之至少一種ISC抑制劑及(2)有效 量之至少一種IEC增強劑，其中該至少一種ISC抑制劑為選自阿西替尼、甲苯磺酸索拉非尼或蘋果酸舒尼替尼之蛋白激酶抑制劑，且其中該至少一種IEC增強劑為選自伊匹單抗或曲美目單抗之CTLA-4抑制劑。在一些其他較佳實施例中，該療程包含向人類投與(1)有效量之至少一種ISC抑制劑及(2)有效量之至少兩種IEC增強劑，其中該至少一種ISC抑制劑為選自舒尼替尼或阿西替尼之蛋白激酶抑制劑，且其中該至少兩種IEC增強劑為曲美目單抗及選自CpG7909、CpG2455或CpG10103之TLR促效劑。
在一些其他實施例中，本發明提供一種治療人類前列腺癌之方法，該方法投與向人類投與(1)有效量之能夠引發針對人類PAA之免疫反應的疫苗；(2)有效量之至少一種ISC抑制劑；及(3)有效量之至少一種IEC增強劑，其中該至少一種ISC抑制劑為選自甲苯磺酸索拉非尼、蘋果酸舒尼替尼、阿西替尼、埃羅替尼、吉非替尼、阿西替尼、博索替尼、坦羅莫司或尼勒替尼之蛋白激酶抑制劑，且其中該至少一種IEC增強劑係選自CTLA-4抑制劑、TLR促效劑或CD40促效劑。在一些較佳實施例中，該方法包含向人類投與(1)有效量之能夠引發針對人類PAA之免疫反應的疫苗；(2)有效量之至少一種ISC抑制劑；及(3)有效量之至少一種IEC增強劑，其中該至少一種ISC抑制劑為選自甲苯磺酸索拉非尼、蘋果酸舒尼替尼或阿西替尼之蛋白激酶抑制劑，且其中該至少一種IEC增強劑為選自伊匹單抗或曲美目單抗之CTLA-4抑制劑。
在一些其他特定實施例中，該方法包含向人類投與(1)有效量之至少一種ISC抑制劑及(2)有效量之至少兩種IEC增強劑，其中該至少一種ISC抑制劑為選自舒尼替尼或阿西替尼之蛋白激酶抑制劑，且其中該至少兩種IEC增強劑為曲美目單抗及選自CpG7909、CpG2455或CpG10103之TLR促效劑。
其他治療劑
本發明所提供之基於疫苗之免疫治療療程可進一步包含其他治療劑。可使用多種癌症治療劑，包括化學治療劑及激素治療劑。一般熟習此項技術者應認識到可存在及開發用於本發明所提供之VBIR的其他癌症療法，且不應侷限於本文所述之彼等治療形式。
術語「化學治療劑」係指可引起癌細胞死亡或干擾癌細胞生長、分裂、修復及/或發揮功能的化學或生物學物質。化學治療劑之實例包括WO2006/088639、WO2006/129163及US 20060153808中所揭示者，各案之揭示內容係以引用的方式併入本文中。特定化學治療劑之實例包括：(1)烷基化劑，諸如苯丁酸氮芥(LEUKERAN)、環磷醯胺(CYTOXAN)、異環磷醯胺(IFEX)、氮芥鹽酸鹽(MUSTARGEN)、塞替派(thiotepa)(THIOPLEX)、鏈脲佐菌素(streptozotocin)(ZANOSAR)、卡莫司汀(carmustine)(BICNU、GLIADEL WAFER)、洛莫司汀(CEENU)及達卡巴嗪(DTIC-DOME)；(2)生物鹼或植物長春生物鹼，包括細胞毒性抗生素，諸如小紅莓(doxorubicin)(ADRIAMYCIN)、表阿比星(epirubicin)(ELLENCE、PHARMORUBICIN)、道諾黴素(daunorubicin)(CERUBIDINE、DAUNOXOME)、奈莫柔比星(nemorubicin)、伊達比星(idarubicin)(IDAMYCIN PFS、ZAVEDOS)、米托蒽醌(mitoxantrone)(DHAD、NOVANTRONE)、更生黴素(dactinomycin)(放線菌素D、COSMEGEN)、普卡黴素(plicamycin)(MITHRACIN)、絲裂黴素(mitomycin)(MUTAMYCIN)及博來黴素(bleomycin)(BLENOXANE)、酒石酸長春瑞濱(vinorelbine tartrate)(NAVELBINE)、長春鹼(vinblastine)(VELBAN)、長春新鹼(vincristine)(ONCOVIN)及長春地辛(vindesine)(ELDISINE)；(3)抗代謝物，諸如卡培他濱(capecitabine)(XELODA)、阿糖胞苷(cytarabine)(CYTOSAR-U)、氟達拉濱 (fludarabine)(FLUDARA)、吉西他濱(gemcitabine)(GEMZAR)、羥基脲(HYDRA)、甲胺喋呤(FOLEX、MEXATE、TREXALL)、奈拉濱(nelarabine)(ARRANON)、三甲曲沙(trimetrexate)(NEUTREXIN)及培美曲塞(pemetrexed)(ALIMTA)；(4)嘧啶拮抗劑，諸如5-氟尿嘧啶(5-FU)、卡培他濱(XELODA)、雷替曲賽(raltitrexed)(TOMUDEX)、喃氟啶尿嘧啶(tegafur-uracil)(UFTORAL)及吉西他濱(GEMZAR)；(5)紫杉烷，諸如歐洲紫杉醇(docetaxel)(TAXOTERE)、太平洋紫杉醇(paclitaxel)(TAXOL)；(6)鉑藥物，諸如順鉑(cisplatin)(PLATINOL)及卡鉑(carboplatin)(PARAPLATIN)及奧克賽鉑(oxaliplatin)(ELOXATIN)；(7)拓撲異構酶抑制劑，諸如伊立替康(irinotecan)(CAMPTOSAR)、拓撲替康(topotecan)(HYCAMTIN)、依託泊苷(etoposide)(ETOPOPHOS、VEPESSID、TOPOSAR)及替尼泊苷(teniposide)(VUMON)；(8)表鬼臼黴素(epipodophyllotoxins)(鬼臼黴素衍生物)，諸如依託泊苷(etoposide)(ETOPOPHOS、VEPESSID、TOPOSAR)；(9)葉酸衍生物，諸如亞葉酸(WELLCOVORIN)；(10)亞硝基脲，諸如卡莫司汀(carmustine)(BiCNU)、洛莫司汀(lomustine)(CeeNU)；(11)受體酪胺酸激酶，包括表皮生長因子受體(EGFR)、血管內皮生長因子(VEGF)、胰島素受體、胰島素樣生長因子受體(IGFR)、肝細胞生長因子受體(HGFR)及來源於血小板之生長因子受體(PDGFR)之抑制劑，諸如吉非替尼(IRESSA)、埃羅替尼(TARCEVA)、硼替佐米(VELCADE)、甲磺酸伊馬替尼(GLEEVEC)、吉非替尼、拉帕替尼、索拉非尼、沙立度胺(thalidomide)、舒尼替尼(紓癌特(SUTENT))、阿西替尼、利妥昔單抗(RITUXAN、MABTHERA)、曲妥珠單抗(trastuzumab)(HERCEPTIN)、西妥昔單抗(cetuximab)(ERBITUX)、貝伐單抗(bevacizumab)(AVASTIN)及蘭尼單抗(ranibizumab)(LUCENTIS)、lym-1(ONCOLYM)、 WO2002/053596中所揭示之針對胰島素樣生長因子-1受體(IGF-1R)之抗體；(12)血管生成抑制劑，諸如貝伐單抗(AVASTIN)、蘇拉明(suramin)(GERMANIN)、血管生長抑素、SU5416、沙立度胺及基質金屬蛋白酶抑制劑(諸如巴馬司他(batimastat)及馬立馬斯他(marimastat))及WO2002055106中所揭示者；及(13)蛋白酶體抑制劑，諸如硼替佐米(VELCADE)。
術語「激素治療劑」係指抑制或消除激素之產生、或者抑制或抵消激素對癌細胞生長及/或存活之作用的化學或生物學物質。適用於VBIR之該等藥劑之實例包括US20070117809中所揭示者。特定激素治療劑之實例包括他莫昔芬(tamoxifen)(NOLVADEX)、托瑞米芬(toremifene)(Fareston)、氟維司群(fulvestrant)(FASLODEX)、阿那曲唑(anastrozole)(ARIMIDEX)、依西美坦(exemestane)(AROMASIN)、雷曲唑(letrozole)(FEMARA)、乙酸甲地孕酮(megestrol acetate)(MEGACE)、戈舍瑞林(goserelin)(ZOLADEX)、亮丙立德(leuprolide)(LUPRON)、阿比特龍(abiraterone)及MDV3100。
本發明所提供之VBIR亦可與其他療法組合使用，包括(1)移除所有或部分參與激素產生之器官或腺體(諸如卵巢、睪丸、腎上腺及垂體腺)的手術法；及(2)輻射處理，其中使患者之器官或腺體經歷足以抑制或消除靶向激素產生之量的輻射。
I.實例
提供以下實例以說明本發明之某些實施例。其應視為不以任何方式限制本發明之範疇。根據以上論述及此等實例，熟習此項技術者可確定本發明之基本特徵，且在不背離其精神及範疇的情況下，可對本發明進行各種變化及修改以使其適應各種用途及條件。
實例1. 來源於人類PSMA蛋白之呈胞溶質、分泌及膜結合形式之抗原
實例1說明分別稱為「人類PSMA胞溶質抗原」、「人類PSMA分泌 抗原」及「人類PSMA膜結合抗原」之三種免疫原性PSMA多肽的構築及此等多肽之生物學性質。
1A.免疫原性PSMA多肽之設計
基於天然人類PSMA蛋白序列構築編碼呈胞溶質、分泌及修飾形式之免疫原性PSMA多肽的DNA構築體且測試其誘導抗腫瘤效應子免疫反應之能力。各人類PSMA抗原形式之結構及製備提供如下。
1A1.人類PSMA胞溶質抗原。呈胞溶質形式之免疫原性PSMA多肽設計成當免疫原性多肽一經表現即保留在細胞內。移除人類PSMA之細胞質域(胺基酸1-19)及跨膜域(胺基酸20-43)，產生由SEQ ID NO：1之人類PSMA之胺基酸44-750(細胞外域或ECD)組成的胞溶質PSMA多肽。可將最佳Kozak序列「MAS」添加至多肽之N末端以增強表現。
1A2.人類PSMA分泌抗原。呈分泌形式之免疫原性PSMA多肽設計成當多肽一經表現即分泌至細胞外。分泌多肽具有SEQ ID NO：1之人類PSMA之胺基酸44-750(ECD)及具有胺基酸序列ETDTLLLWVLLLWVPGSTGD之Igκ分泌元件及處於N末端之雙胺基酸連接子(AA)，以便PSMA抗原一經表現即使PSMA抗原之分泌最大化。
1A3.人類PSM膜結合抗原。免疫原性PSMA膜結合多肽設計成使細胞表面上之多肽穩定。移除人類PSMA蛋白之前14個胺基酸，且所得免疫原性多肽由SEQ ID NO：1之人類PSMA蛋白之胺基酸15-750組成。由SEQ ID NO：1之天然人類PSMA蛋白之胺基酸15-750組成且與天然人類PSMA蛋白具有100%序列一致性的免疫原性多肽在本發明中亦稱為「經修飾之人類PSMA」、「經修飾之hPSMA」或「hPSMAmod」抗原。
1B.製備DNA質體以供表現PSMA抗原
將編碼PSMA胞溶質抗原、PSMA分泌抗原及PSMA修飾抗原之DNA構築體個別地選殖至適用於動物活體內測試之PJV7563載體中(圖 1)。將PJV7563載體中之DNA之兩股定序以確定設計完整性。
由序列經確定之純系製造大規模質體DNA製劑(Qiagen/CsCl)。質體DNA之品質由高260/280比率、高超螺旋/切口DNA比率、低內毒素含量(<10U/mg DNA)及負生物負荷確定。
1C. PSMA構築體在哺乳動物細胞中之表現
藉由FACS測定PSMA胞溶質抗原、分泌抗原及修飾抗原之表現。用編碼各種免疫原性PSMA多肽之PJV7563 PMED載體轉染哺乳動物之293個細胞。三天後，用小鼠抗PSMA抗體，隨後用螢光結合(FITC)之大鼠抗小鼠二級抗體將293個細胞染色。相對於陰性對照以平均螢光強度(MFI)報導的以下資料確定經修飾之人類PSMA抗原表現於細胞表面上。
1D. PSMA質體於金粒子上之調配物(用於ND10/X15)
粒子介導之表皮遞送技術(PMED)為向動物或患者投與疫苗之無針法。PMED系統包括使DNA沈澱於微觀金粒子上，接著藉由氦氣推入表皮中。單次使用裝置ND10使用來自內部氣缸之加壓氦氣來遞送金粒子，且循環遞送裝置X15使用經由高壓軟管連接至X15之外部氦氣瓶來遞送金粒子。此兩種裝置在研究中均用於遞送PSMA DNA質體。金粒子之直徑通常為1-3μm，且粒子經調配以含有2μg PSMA質體/1mg金粒子。(Sharpe,M.等人：P.Protection of mice from H5N1 influenza challenge by prophylactic DNA vaccination using particle mediated epidermal delivery.Vaccine,2007,25(34)：6392-98；Roberts LK等人：Clinical safety and efficacy of a powdered Hepatitis B nucleic acid vaccine delivered to the epidermis by a commercial prototype device.Vaccine,2005；23(40)：4867-78)。
1E.用於活體內研究之轉殖基因小鼠
使用兩種人類HLA轉殖基因小鼠模型來評估不同HLA對各種PSMA抗原之呈現，且使用人類PSMA轉殖基因小鼠模型來評估針對人類PSMA之免疫耐受性之破壞。第一個HLA轉殖基因小鼠模型利用HLA A2/DR1小鼠(得自the Pasteur Institute,Paris,France；亦稱為「巴斯德小鼠」)。巴斯德小鼠被剔除鼠類β-2微球蛋白，且不表現功能H-2b分子；因此，據信此模型表示抗原於人類HLA A2及DR1情況下之呈現(Pajot,A.,M.-L.Michel,N.Faxilleau,V.Pancre,C.Auriault,D.M.Ojcius,F.A.Lemonnier，及Y.-C.Lone.A mouse model of human adaptive immune functions：HLA-A2.1-/HLA-DR1-transgenic H-2 class I-/class II-knockout mice.Eur.J.Immunol.2004,34：3060-69)。第二種HLA轉殖基因小鼠模型使用在H2bk基因座嵌有人類HLA A24與人類β-2微球蛋白共價鍵聯之小鼠。此等小鼠缺乏鼠類β-2微球蛋白且不表現功能H-2b分子。此模型允許評估人類HLA A24情況下之抗原呈現。
1F.呈胞溶質、分泌及修飾形式之人類PSMA蛋白之免疫原性
研究設計。使用PMED法，在初打/加打/加打療程(每次接種相隔兩週)中用各種PSMA DNA構築體將8至10週齡轉殖基因小鼠免疫。或者，藉由肌肉內注射用編碼PSMA抗原之腺病毒載體以含於50μl(PBS)中之1×109個病毒粒子對小鼠進行初打。腺病毒載體(得自Stratagene之pShuttle-CMV載體)經修飾而在多個選殖位點內含有NheI及BglII限制位點。接著用NheI及BglII對編碼經修飾之人類PSMA之DNA進行限制消化，接合至此載體中且確定序列。接著將pShuttle人類PSMA經修飾載體與pAdEasy-1載體重組，且根據AdEasy系統(Stratagene)擴增病毒。20天後，如上文所述，其用PMED加打。在所使用之各療程中，在干擾素-γ(IFNγ)ELISPOT分析中之最後一次免疫 之後7天量測抗原特異性T細胞反應。ELISPOT分析類似於夾心酶聯免疫吸附分析法(ELISA)。簡言之，在微量培養盤中，在4℃下將IFNγ特異性捕捉抗體(BD Bioscience，#51-2525kc)塗佈於聚偏二氟乙烯(PVDF)膜上隔夜。用血清/蛋白質阻斷培養盤以防止與抗體之非特異性結合。阻斷之後，將效應細胞(諸如自經PSMA免疫之小鼠中分離之脾細胞)及標靶(諸如來自肽文庫之PSMA肽，經肽脈衝之標靶細胞或表現相關抗原之腫瘤細胞)或有絲分裂原(其將刺激脾細胞非特異性產生IFNγ)添加至孔中且在37℃下在5% CO2培育箱中培育隔夜。藉由PVDF膜表面上之塗佈抗體來捕捉效應細胞所分泌之細胞素。在移除細胞及培養基之後，將100μl經生物素標記之多株抗小鼠IFNγ抗體(0.5mg/ml，BD Bioscience，#51-1818kz)添加至各孔以供偵測。藉由添加抗生蛋白鏈菌素-辣根過氧化酶(HRP，BD Bioscience，#557630)及沈澱受質3-胺基-9-乙基咔唑以產生紅色斑點來顯現斑點。各斑點代表產生單一細胞素之T細胞。一般而言，在此處揭示之研究中，ELISpot分析設置如下：(1)在來源於由15個胺基酸之肽(11個胺基酸重疊)製得之PSMA肽文庫(參看表16)之PSMA特異性肽存在下，(2)與已知HLA A2.1限制性PSMA特異性肽一起，或(3)與腫瘤細胞一起培養來自PSMA免疫小鼠之5×105個脾細胞。為量測內源性抗原呈現之識別，將脾細胞與天然表現PSMA之人類HLA A2前列腺癌細胞(亦即LNCaP，獲自ATCC)一起培養，或與經編碼且因此表現經修飾之人類PSMA抗原之腺病毒轉導之HLA A2腫瘤細胞一起培養。另外，將人類PSMA ECD蛋白添加至ELISpot分析以量測特異性產生CD4 IFNγ之細胞。作為對照，在IFNγ ELISpot分析中，適當時使用HLA A2限制性HER-2特異性肽p168-175或者不表現PSMA或無關蛋白(諸如BSA)之腫瘤細胞作為陰性對照。資料結果係以1×106個脾細胞中分泌IFNγ之斑點形成細胞(SFC)數以歸一化格式提供。對所測試之各PSMA抗原肽進 行至少三次研究。
結果。利用巴斯德小鼠脾細胞與來源於PSMA肽文庫之肽一起培養之ELISpot分析之資料呈現於表1中。陽性反應定義為具有SFC>100。如表1中所示，用以上實例1A中所述之所有三種抗原形式(人類PSMA胞溶質、分泌及經修飾抗原)製得之免疫原性PMSA多肽能夠誘導T細胞反應。經修飾之人類PSMA抗原形式誘導具有最佳寬度及量值之T細胞反應。
( )=標準差
對巴斯德小鼠中由各種PSMA疫苗形式(其識別HLA A2.1限制性PSMA肽脈衝標靶細胞以及PSMA+ HLA A2.1 LNCaP腫瘤細胞)誘導之T細胞反應進行之ELISpot分析之資料呈現於表2中。此處使用不表現PSMA之人類前列腺癌細胞株PC3作為陰性對照。陽性反應定義為具有SFC>50。如表2中所示，所測試之各種PSMA構築體能夠誘導T細胞識別已知HLA A2限制性PSMA抗原決定基以及PSMA蛋白及人類前列腺癌細胞LNCaP。然而，經修飾之PSMA構築體顯示可誘導具有最佳寬度及量值之T細胞反應。
( )=標準差
1G.在巴斯德小鼠或非人類靈長類動物中所量測之體液免疫反應
1G1.夾心ELISA分析法。使用自動化Biotek系統進行標準夾心ELISA分析。25μl天然PSMA蛋白於PBS中以1.0μg/ml塗佈培養盤隔夜，洗滌培養盤且每孔用35μl 5% FBS 1×PBS-T 0.05%阻斷，且在室溫下在振盪器上以600RPM培育1小時。傾析阻斷培養基且連續稀釋經接種之小鼠血清，其中在5%FBS 1×PBS-T 0.05%中以1：100或1：500開始製造半對數稀釋液，且將25μl經稀釋血清樣品添加至96孔培養 盤之各孔中並在室溫下在振盪器上以600RPM培育1小時。使用Biotek ELx405，用75微升/孔1×PBS-T 0.05%中將培養盤洗滌三次，且將25微升/孔之1：30,000經稀釋抗小鼠IgG HRP(AbCam目錄號ab20043)二級抗體(於1×PBS-T 0.05%中稀釋)添加至96孔培養盤之各孔且在室溫下在振盪器上以600RPM培育1小時。使用Biotek Elx405，用75微升/孔1×PBS-T 0.05%將培養盤洗滌5次。將TMB受質以1：10稀釋，且將25μl添加至各孔中並在室溫下培育30分鐘。藉由每孔添加12.5μl 1M H2SO4來停止反應。使用Spectramax Plus在450nm波長下對讀盤。資料係以效價報導且此等資料可以第一陽性(平均值及兩個值超過5% FBS PBS+3倍標準差)及/或以OD 0.5或1.0下之計算效價報導。使用來自無關接種小鼠之血清作為陰性對照。
結果。表3中所呈現之資料顯示，在所有小鼠中，人類PSMA胞溶質抗原不誘導任何抗PSMA反應，而經修飾之人類PSMA抗原始終誘導良好抗PSMA抗體反應。
表5中呈現之資料顯示，人類PSMA抗原誘導之抗體與PSMA文庫中之多個肽抗原決定基反應。將各組中之個別小鼠的血清等量彙集且在ELISA分析中在1：500稀釋度下進行測試。並行測試接種抗白喉(CRM)類毒素之小鼠陰性對照組。用0.03μg來源於PSMA肽文庫之單一15aa肽塗佈96孔ELISA培養盤之各孔。OD值高於0.10被視為陽性。
1G2. FACS細胞結合分析。此分析使用各種前列腺癌細胞株。使用LNCaP(ATCC)作為表現PSMA之人類前列腺癌細胞且使用PC3 (ATCC)作為不表現PSMA之陰性人類前列腺癌細胞。在一些分析中，細胞結合分析使用經工程改造以穩定表現人類天然全長PSMA之TRAMP-C2細胞株及不表現PSMA之親本TRAMP-C2細胞株(陰性對照)。如下進行細胞結合分析：LNCaP及PC3細胞(或TRAMP-C2PSMA及TRAMP C2)以2×105個細胞/孔(50μL)塗於96孔培養盤中之各別孔中。如1f中所述得自接種PSMA之小鼠的血清用FACS緩衝液(PBS pH 7.4，1% FBS，25mM HEPES及1mM EDTA)1：50稀釋。將50μL經稀釋之J591-A抗體(小鼠抗人類PSMA抗體純系J591-A，得自ATCC)添加至經稀釋之測試血清或FACS緩衝液(未經染色之樣品)中以便在染色培養盤中達成適當細胞數目/孔。藉由吸移混合所有物質，接著在冰上保持20分鐘。用FACS緩衝液將細胞洗滌兩次；每次洗滌藉由在5℃下以1200RPM離心5分鐘來進行。將含經PE標記之山羊抗小鼠Ig之1：200稀釋液(Sigma，目錄號P9670-5)及0.25μl Live/Dead Aqua染色劑(Invitrogen，目錄號L34957)的50μL第二染色溶液添加至含細胞之各孔中且在冰上保持20分鐘。如先前所述將細胞洗滌兩次。使經洗滌之細胞集結粒再懸浮於125 μL FACS緩衝液中，接著向各孔中添加75μL 4%三聚甲醛溶液以固定細胞。將樣品保持在冰上且避光保存至少15分鐘。在FACS Canto II上運作樣品。記錄各樣品之10,000個活細胞事件。各細胞類型之對照樣品為1)未經染色之細胞；2)僅具有二級抗體之細胞；3)具有J591加二級抗體之細胞；及4)具有未處理血清加二級抗體之細胞。資料係以相對於陰性對照之平均螢光強度(MFI)報導。
FACS細胞結合分析之結果。表4顯示所分泌與經修飾之人類PSMA抗原所誘導之抗體能夠結合人類PSMA陽性前列腺癌細胞(LNCaP)而不結合PSMA陰性前列腺癌細胞(PC3)。經修飾之PSMA抗原在所有小鼠中始終誘導良好抗PSMA抗體反應。
1G3.抗體依賴性細胞介導之細胞毒性(ADCC)分析
研究設計。用藉由腺病毒遞送(1e11 V.P.，肌肉內注射)之編碼經修飾人類PSMA抗原之核酸將印度恆河猴免疫，隨後分別以8週及6週間隔進行2次PMED免疫(每次免疫8次致動，下腹部右側及左側各4次致動)。動物在第二次PMED免疫時亦在鄰近各腹股溝引流淋巴結處接受皮內注射3mg CpG(PF-03512676)。由在任何免疫之前(免疫前血漿)及最後一次PMED免疫之後8天(免疫血漿)自血液收集之血漿來測定抗體依賴性細胞介導之細胞毒性。
抗體依賴性細胞介導之細胞毒性分析。使用標準鉻51釋放分析來測定抗體依賴性細胞介導之細胞毒性。使用人類前列腺癌細胞株LNCaP及PC3作為標靶細胞。使用新近分離之人類PBMC細胞作為效應細胞。效應子：標靶細胞設定為30：1。簡言之，對於一個標記反應， 將200μl中之1.5×106個標靶細胞與200μCi 51Cr一起培育(37℃，5% CO2，1小時)。將細胞洗滌3次且將細胞濃度調節至2×105個細胞/毫升。以2×濃度製造對照單株抗體(mAb)或測試血漿(1：50)，且將175μl各(視分析大小而定)mAb/血漿稀釋液添加至175μl標靶細胞中。在Eppendorf管中在4℃下將混合物培育30分鐘。將細胞洗滌一次以釋放未結合之抗體。此時，將100μl新近分離之效應細胞與100μl結合單株抗體或測試血漿之標靶細胞一起添加至96孔培養盤之各孔中且在37℃及5% CO2下培育4小時。以一式兩份測試樣品。將100μl 2N HCl添加至目標孔中以便達成最大釋放，且將100μl培養基添加至目標孔中以便達成自發性釋放。如下計算比溶胞率：釋放百分比=(ER-SR)/(MR-SR)×100，其中ER(效應子+標靶細胞釋放)為實驗釋放，SR(單獨標靶細胞用培養基培育)為自發性釋放，且MR(單獨標靶細胞用2N HCl培育)為最大釋放。藉由自抗原特異性標靶(LNCaP)釋放中減去無關標靶(PC3)釋放來計算比溶胞率百分比。
結果。來自抗體依賴性細胞毒性分析之資料呈現於表6中。經來源於hPSMA免疫動物之免疫血漿塗佈之人類前列腺PSMA+癌細胞株LNCaP被效應細胞溶解，而經相同免疫血清塗佈之人類前列腺PSMA-癌細胞株PC3未被效應細胞溶解。類似地，經免疫前血漿塗佈之LNCaP未被效應細胞溶解。使用針對HER-2之單株抗體赫賽汀作為陽性對照，因為已知LNCaP細胞表現HER-2(Li,Cozzi等人2004)。使用 針對B細胞抗原(CD20)之單株抗體美羅華(Rituxan)作為陰性對照抗體，因為LNCaP細胞不表現CD20。據報導，兩種單株抗體均具有ADCC活性(Dall'Ozzo,Tartas等人，2004；Collins,O'Donovan等人，2011)。
實例2. 構築改組之PSMA抗原
此實例說明作為如實例1中所述之經修飾人類PSMA抗原(SEQ ID NO：9)之變異體的各種免疫原性PSMA多肽之構築及某些生物學性質。
2A.設計改組之PSMA抗原
設計作為如實例1所述之經修飾人類PSMA抗原(SEQ ID NO：9)之變異體的各種免疫原性PSMA多肽。此等變異體係藉由向經修飾之人類PSMA抗原序列中引入選自人類PSMA直系同源物之突變而產生。此等變異體在本發明中可互換稱為「改組之PSMA抗原」或「改組且修飾之PSMA抗原」。以下提供用於產生此等變異體之原理及程序。
編寫計算算法以選擇針對改組變異體之點突變。首先，使用NCBI之PSI-BLAST組裝PSMA及12種直系同源物(附錄2a)之多序列比對。來自PSI-BLAST之輸出包括直系同源物中各殘基在各PSMA位置之傾向。接著，perl程式碼使用此等傾向來如下選擇點突變：
1)在所有位置中，選擇最常觀察到之殘基，該殘基與天然人類PSMA中之一致性不匹配。
2)驗證此突變位置與所鑑別之I或II類人類PSMA抗原決定基不重疊以確保點突變不在如上文所定義之保守T細胞抗原決定基內(表19)。
3)經由BLOSUM62矩陣計算人類殘基突變之相似性以驗證殘基取代之BLOSUM62相似性分數在0至1(包括)範圍內。
按照此迭代程序直至相對於人類PSMA達到某一序列一致性百分 比(低於100)。
為充當此算法之輸入，組裝PSMA直系同源物以使用得自NCBI之PSI-BLAST構築位置特異性機率矩陣。另外，將所鑑別之PSMA抗原決定基區列於文檔中，從而亦提供給改組算法。非改組區域亦延伸至蛋白質之胞溶質區及跨膜區以避免膜結合功能問題。直系同源PSMA蛋白序列、BLOSUM62矩陣及PSI-BLAST程式係自NCBI網站下載。
接著使用此等輸入資料運作改組程式碼，且產生與原始人類PSMA具有94%序列一致性之人類PSMA變異體。另外，三個改良HLA-A2結合之突變基於其在Epitoptimizer算法(Houghton,Engelhorn等人2007)中之效能而引入。此等突變為M664L(抗原決定基：663-671)、I676V(抗原決定基：668-676)及N76L(抗原決定基：75-83)。所得抗原稱為「經改組且修飾之PSMA抗原1」、「經改組且修飾之PSMA 1」或「經改組之PSMA抗原1」。
基於抗原決定基之共同序列分級<1%且神經網之IC50(單一最佳法)<500之結果顯示，自HLA A2.1、HLA A3、HLA A11、HLA A24及HLA B7預測之抗原決定基在此改組抗原中高度保守。設計實例1中所述之經修飾人類PSMA抗原之兩種其他變異體，該兩種變異體具有較高序列一致性及更具限制性之BLOSUM分數截止值(1)以移除所有非保守取代。此兩種變異體分別亦稱為「經改組且修飾之PSMA抗原2」及「經改組且修飾之PSMA抗原3」。經改組且修飾之PSMA抗原1至3相對於經修飾之人類PSMA構築體(例如人類PSMA之胺基酸15-750)之一致性百分比分別約為93.6%、94.9%及96.4%。
經改組且修飾之PSMA抗原1具有SEQ ID NO：3之胺基酸序列且相對於經修飾之人類PSMA抗原具有以下突變：N47S、T53S、K55Q、M58V、L65M、N76L、S98A、Q99E、K122E、N132D、V154I、I157V、F161Y、D191E、M192L、V201L、 V225I、I258V、G282E、I283L、R320K、L362I、S380A、E408K、L417I、H475Y、K482Q、M509V、S513N、E542K、M583L、N589D、R598Q、S613N、I614L、S615A、Q620E、M622L、S647N、E648Q、S656N、I659L、V660L、L661V、M664L、I676V。
經改組且修飾之PSMA抗原2具有SEQ ID NO：5之胺基酸序列且相對於經修飾之人類PSMA抗原具有以下突變：突變：N47S、K55Q、M58V、Q91E、S98A、A111S、K122E、N132D、V154I、I157V、F161Y、V201L、V225I、I258V、S312A、R320K、K324Q、R363K、S380A、E408K、H475Y、K482Q、Y494F、E495D、K499E、M509L、N540D、E542K、N544S、M583I、I591V、R598Q、R605K、S613N、S647N、E648Q、S656N、V660L。
經改組且修飾之PSMA抗原3具有SEQ ID NO：7之胺基酸序列且相對於經修飾之人類PSMA抗原具有以下突變：突變：T339A、V342L、M344L、T349N、N350T、E351K、S401T、E408K、M470L、Y471H、H475Y、F506L、M509L、A531S、N540D、E542K、N544S、G548S、V555I、E563V、V603A、R605K、K606N、Y607H、D609E、K610N、I611L。
2B.接種後在巴斯德小鼠中量測之免疫反應
研究設計。如實例1F中所述，使用PMED法在初打/加打/加打療程(每次接種相隔兩週)中用表現經改組且修飾之PSMA抗原之各種質體DNA將8至10週齡巴斯德小鼠免疫。分別在干擾素-γ(IFNγ)ELISPOT分析及夾心ELISA中之最後一次免疫之後7天量測抗原特異性T及B細胞反應。
結果。表7中呈現之ELISpot資料顯示，所有經改組且修飾之PSMA抗原能夠誘導在寬度及量值方面與經修飾之人類PSMA抗原極為相似之T細胞反應。SFC>100被視為陽性。「＊」符號表示過多而無法準確計數。
如表8中所示，所有改組PSMA抗原均能夠誘導識別已知HLA A2限制性PSMA抗原決定基之T細胞以及經攜帶PSMA轉殖基因之腺病毒轉導以表現PSMA之人類HLA A2腫瘤細胞。不表現PSMA之腫瘤細胞充當陰性對照且未被識別。SFC>50被視為陽性。
表9中所示之ELISpot資料係用耗乏CD8之脾細胞獲得；因此，資料代表對CD4 T細胞具特異性之T細胞反應。資料顯示由經改組且修飾之PSMA抗原2引發之CD4反應與經修飾之人類PSMA抗原所誘導之CD4反應極為相似。SFC>50被視為陽性。
表10中之資料顯示，所有經改組且修飾之PSMA抗原均能夠誘導抗人類PSMA抗體反應。經改組且修飾之PSMA抗原2及經修飾之人類 PSMA抗原在所有小鼠中誘導一致抗體反應。
表11中之ELISpot資料顯示，HLA A24小鼠中由經改組且修飾之PSMA抗原2誘導之總體T細胞反應在寬度及量值方面與經修飾之人類PSMA抗原極為相似。SFC>100視為陽性。
2C.經改組且修飾之PSMA抗原破壞針對人類PSMA之免疫耐受性
研究設計。人類PSMA轉殖基因小鼠模型所使用之小鼠係利用驅動PSMA特異性表現於前列腺中之最少大鼠前列腺鹼性蛋白(probasin)啟動子製得(Zhang,Thomas等人，2000 Endocrinology 141(12)：4698-4710)。此等小鼠在C57BL/6背景下製得。RT-PCR及免疫組織化學染色資料確定此等PSMA轉殖基因小鼠中之前列腺腹側及背外側根部中的PSMA表現。預期人類PSMA蛋白在此等小鼠中之內源性表現可產生免疫耐受性。
結果。如表12中所示，僅20% PSMA轉殖基因小鼠能夠使用經修飾之人類PSMA抗原建立對人類PSMA之T細胞反應。然而，67% PSMA轉殖基因小鼠能夠使用經改組且修飾之PSMA抗原2建立PSMA特異性T細胞反應。資料表明，經改組且修飾之PSMA抗原2中包括非自身胺基酸序列可改良針對自身人類PSMA抗原之耐受性破壞。SFC>50被視為陽性。
實例3. 各種免疫原性PSA多肽之設計
實例3說明呈胞溶質、分泌及膜結合形式之免疫原性PSA多肽之構築及某些生物學性質。
3A.各種PSA抗原形式之構築
類似於實例1中關於三種不同的免疫原性PSMA多肽形式(例如胞溶質、膜結合及分泌形式)所述，亦基於人類PSA序列設計呈三種形式之免疫原性PSA多肽。由天然人類PSA之胺基酸25-261組成之呈胞溶質形式之免疫原性PSA多肽係藉由缺失分泌信號及原結構域(胺基酸1-24)而構築。此胞溶質免疫原性PSA多肽之胺基酸序列提供於SEQ ID NO：17中。PSA多肽之分泌形式為天然全長人類PSA(胺基酸1-261)。呈膜結合形式之免疫原性PSA多肽係藉由將免疫原性PSA多肽胞溶質形式(天然人類PSA之胺基酸25-261)連接於人類PSMA跨膜域(人類PSMA之胺基酸15-54)而構築。
3B.巴斯德及HLA A24小鼠中之免疫反應
研究設計。如實例1中所述，使用實例3A中所提供之PMED在初打/加打/加打療程(每次接種相隔兩週)中用表現各種PSA抗原之DNA將8至10週齡HLA A2巴斯德小鼠或HLA A24小鼠免疫。在干擾素-γ(IFNγ)ELISPOT分析及夾心ELISA中之最後一次免疫之後7天量測抗原特異性T及B細胞反應。
結果。表13顯示來源於自HLA A2巴斯德小鼠或HLA A24小鼠分離之脾細胞(與來源於PSA肽文庫之肽一起培養)的ELISpot資料。可在HLA A2及HLA A24小鼠中偵測到T細胞反應。SFC>100被視為陽性。
表14中所示之ELISpot資料指示呈胞溶質及膜結合形式之免疫原性PSA多肽能夠誘導T細胞識別經腺病毒轉導以表現胞溶質PSA抗原(SKmel5-Ad-PSA)之人類腫瘤細胞而不識別經腺病毒轉導以表現eGFP (SKmel5-Ad-eGFP)之細胞。此兩種抗原亦引發針對PSA蛋白之反應。分泌型PSA抗原未能誘導T細胞針對SKmel5-Ad-PSA或PSA蛋白。SFC>50被視為陽性。
表15中之資料顯示，呈分泌及膜結合形式之免疫原性PSA多肽能夠誘導抗PSA抗體反應。
實例4. 多抗原疫苗構築體之構築
在此實例中，描述用於表現來自單組分DNA疫苗構築體之多種抗原的若干策略。此等多抗原DNA疫苗構築體具有與pPJV7563相同 的通用質體骨架。雖然此處在DNA疫苗的情況下描述多抗原表現策略，但該等原理類似地適用於病毒載體基因疫苗(諸如腺病毒載體)的情況。除非另外規定，否則多抗原構築體中包括之基因編碼如上文之實例中所述之經修飾之人類PSMA抗原(指定為PSMA)、全長人類PSCA(指定為PSCA)及人類PSA胞溶質抗原(指定為PSA)。
實例4A. 雙抗原構築體
4A1.利用多個啟動子構築雙抗原構築體
通用策略。用於產生多價核酸疫苗構築體之一種策略為將多個獨立啟動子併入單一質體中(Huang,Y.,Z.Chen等人，(2008).「Design,construction,and characterization of a dual-promoter multigenic DNA vaccine directed against an HIV-1 subtype C/B' recombinant」.J Acquir Immune Defic Syndr 47(4)：403-411；Xu,K.,Z.Y.Ling等人，(2011).「Broad humoral and cellular immunity elicited by a bivalent DNA vaccine encoding HA and NP genes from an H5N1 virus」.Viral Immunol 24(1)：45-56)。質體可經工程改造以運載多個表現卡匣，各表現卡匣由以下組成：a)在增強子元件存在或不存在下起始RNA聚合酶依賴性轉錄之真核啟動子；b)編碼標靶抗原之基因；及c)轉錄終止序列。質體遞送至經轉染之細胞核中時，各啟動子起始轉錄，從而產生各別mRNA，各mRNA編碼標靶抗原之一。mRNA將獨立地經轉譯，藉此產生所要抗原。
質體460(PSMA/PSCA雙啟動子)。使用定點突變誘發、PCR及限制片段插入技術來構築質體460。首先，使用定點突變誘發利用MD5及MD6引子根據製造商方案(Quickchange套組，Agilent Technologies,Santa Clara,CA)將Kpn I限制位點引入質體5259中之CMV啟動子上游。其次，藉由PCR使用攜帶Kpn I限制位點之引子(MD7及MD8)自質體5166擴增由最少的CMV啟動子、人類PSMA及兔B球蛋白轉錄終止 子組成之表現卡匣。用Kpn I消化PCR擴增子且插入經小牛腸道鹼性磷酸酶(CIP)處理之質體5259的新引入之Kpn I位點中。
4A2.利用2A肽構築雙抗原構築體
通用策略。多種蛋白質抗原亦可藉由使用病毒2A樣肽而由單一載體表現(Szymczak,A.L.及D.A.Vignali(2005).「Development of 2A peptide-based strategies in the design of multicistronic vectors」.Expert Opin Biol Ther 5(5)：627-638；de Felipe,P.,G.A.Luke等人，(2006).「E unum pluribus：multiple proteins from a self-processing polyprotein」.Trends Biotechnol 24(2)：68-75；Luke,G.A.,P.de Felipe等人，(2008).「Occurrence,function and evolutionary origins of 『2A-like』sequences in virus genomes」.J Gen Virol 89(Pt 4)：1036-1042；Ibrahimi,A.,G.Vande Velde等人，(2009).「Highly efficient multicistronic lentiviral vectors with peptide 2A sequences」.Hum Gene Ther 20(8)：845-860；Kim,J.H.,S.R.Lee等人，(2011).「High cleavage efficiency of a 2A peptide derived from porcine teschovirus-1 in human cell lines,zebrafish and mice」.PLoS One 6(4)：e18556)。此等肽，亦稱為裂解卡匣或CHYSEL(順式作用水解酶元件)，為約20個胺基酸長且具有高度保守羧基末端D-V/I-EXNPGP基元(圖2)。該等卡匣在自然界中非常稀有，最常發現於病毒中，諸如口蹄疫病毒(FMDV)、馬鼻炎A病毒(ERAV)、腦心肌炎病毒(EMCV)、豬捷申病毒(PTV)及明脈扁刺蛾病毒病毒(TAV)(Luke,G.A.,P.de Felipe等人，(2008).「Occurrence,function and evolutionary origins of『2A-like』sequences in virus genomes」.J Gen Virol 89(Pt 4)：1036-1042)。在基於2A之多抗原表現策略下，可將編碼多個標靶抗原之基因一起連接在單一開放閱讀框架中，用2A卡匣隔開。可將整個開放閱讀框架選殖於具有單一啟動子及終止子之載體中。基因疫苗遞送至 細胞時，編碼多個抗原之mRNA轉錄並轉譯為單一聚合蛋白。在轉譯2A卡匣期間，核糖體跳過C末端甘胺酸與脯胺酸之間的鍵。核糖體跳過之作用類似於在下游蛋白質之上游釋放之共轉譯自動催化「裂解」。在兩個蛋白質抗原之間併入2A卡匣引起約20個胺基酸添加至上游多肽之C末端上且1個胺基酸(脯胺酸)添加至下游蛋白質之N末端。在此方法之改適方案中，可在2A卡匣之N末端併入蛋白酶裂解位點，使得普存蛋白酶使卡匣自上游蛋白質裂解(Fang,J.,S.Yi等人(2007).「An antibody delivery system for regulated expression of therapeutic levels of monoclonal antibodies in vivo」.Mol Ther 15(6)：1153-1159)。
質體451(PSMA-T2A-PSCA)。使用重疊PCR及限制片段交換技術構築質體451。首先，藉由PCR使用質體5166作為模板利用引子119及117來擴增編碼人類PSMA胺基酸15-750之基因。藉由PCR使用質體5259作為模板利用引子118及120來擴增編碼全長人類PSCA之基因。PCR使得重疊TAV 2A(T2A)序列添加在PSMA之3'端及PSCA之5'端。將擴增子混合在一起且藉由PCR利用引子119及120加以擴增。用Nhe I及Bgl II消化PSMA-T2A-PSCA擴增子且插入經類似方式消化之質體5166中。甘胺酸-絲胺酸連接子包括在PSMA與T2A卡匣之間以促進高裂解效率。
質體454(PSCA-F2A-PSMA)。使用PCR及限制片段交換技術製造質體454。首先，藉由PCR使用質體5259作為模板利用引子42及132來擴增編碼全長人類PSCA之基因。用BamH I消化擴增子且插入經類似方式消化之經CIP處理之質體5300中。甘胺酸-絲胺酸連接子包括在PSCA與FMDV 2A(F2A)卡匣之間以促進高裂解效率。
質體5300(PSA-F2A-PSMA)。使用重疊PCR及限制片段交換技術來構築質體5300。首先，藉由PCR利用引子MD1及MD2自質體5297擴 增編碼PSA胺基酸25-261之基因。藉由PCR利用引子MD3及MD4自質體5166擴增編碼人類PSMA胺基酸15-750之基因。PCR使得重疊F2A序列添加在PSA之3'端及PSMA之5'端。將擴增子混合在一起且藉由PCR加以延伸。用Nhe I及Bgl II消化PSA-F2A-PSMA擴增子且插入經類似方式消化之質體pPJV7563中。
4A3.利用內部核糖體進入位點之雙抗原構築體
通用策略：自單一質體或載體表現多種蛋白質抗原之第三種策略包括使用內部核糖體進入位點或IRES。內部核糖體進入位點為在某些RNA分子之5'未轉譯區域中發現的RNA元件(圖3)(Bonnal,S.,C.Boutonnet等人，(2003).「IRESdb：the Internal Ribosome Entry Site database」.Nucleic Acids Res 31(1)：427-428)。其將真核核糖體吸引至RNA以促進下游開放閱讀框架之轉譯。不同於正常細胞7-甲基鳥苷帽依賴性轉譯，IRES介導之轉譯可在RNA分子內較遠處之AUG密碼子處起始。可利用高效方法以便用於多順反子表現載體(Bochkov,Y.A.及A.C.Palmenberg(2006).「Translational efficiency of EMCV IRES in bicistronic vectors is dependent upon IRES sequence and gene location」.Biotechniques 41(3)：283-284,286,288)。通常，將兩個轉殖基因作為由IRES隔開之兩個各別開放閱讀框架插入啟動子與轉錄終止子之間的載體中。基因疫苗遞送至細胞時，轉錄編碼兩個轉殖基因之單一長轉錄物。第一個ORF將以傳統帽依賴性方式轉譯，在IRES上游之終止密碼子處終止。第二個ORF將以帽非依賴性方式使用IRES轉譯。以此方式，可由自具有單一表現卡匣之載體轉錄之單一mRNA產生兩種獨立的蛋白質。
質體449(PSMA-mIRES-PSCA)。使用重疊PCR及限制片段交換技術來構築質體449。首先，藉由PCR利用引子124及123自質體5259擴增編碼全長人類PSCA之基因。藉由PCR利用引子101及125自pShuttle- IRES擴增極少EMCV IRES。將重疊擴增子混合在一起且藉由PCR利用引子101及123加以擴增。用Bgl II及BamH I消化IRES-PSCA擴增子且插入經Bgl II消化之經CIP處理之質體5166中。為固定IRES內之自發性突變，用來自pShuttle-IRES之等效片段置換含Avr II至Kpn I序列之IRES。
質體603(PSCA-pIRES-PSMA)。使用PCR及無縫選殖技術來構築質體603。藉由PCR利用引子SD546及SD547自質體455擴增3'端連接於較佳EMCV IRES之編碼全長人類PSCA之基因。藉由PCR使用引子SD548及SD550自質體5166擴增編碼人類PSMA胺基酸15-750之基因。藉由無縫選殖根據製造商說明書(Invitrogen,Carlsbad,CA)將兩個重疊PCR擴增子插入經Nhe I及Bgl II消化之pPJV7563中。
質體455(PSCA-mIRES-PSA)。使用重疊PCR及限制片段交換技術來構築質體455。首先，藉由PCR利用引子115及114自質體5297擴增編碼人類PSA胺基酸25-261之基因。藉由PCR利用引子101及116自pShuttle-IRES擴增極少EMCV IRES。將重疊擴增子混合在一起且藉由PCR利用引子101及114加以擴增。用Bgl II及BamH I消化IRES-PSA擴增子且插入經Bgl II消化之經CIP處理之質體5259中。為固定此純系內之自發性突變，用來自新鮮重疊PCR反應之等效片段置換Bgl II至BstE II序列。
實例4B. 三抗原DNA構築體
通用策略。表徵雙抗原表現載體引導PSMA、PSCA及/或PSA在經轉染之HEK293細胞中表現的能力(圖4-6)。選擇許多雙抗原表現卡匣，包括PSA-F2A-PSMA、PSMA-mIRES-PSCA、PSMA-T2A-PSCA、PSA-T2A-PSCA、PSCA-F2A-PSMA、PSCA-pIRES-PSMA及PSMA-mIRES-PSA，以便以各種組合形式併入三抗原表現載體中。在所有情況下，載體係基於親本pPJV7563質體骨架。四種載體(質體456、 457、458及459)利用具有兔B球蛋白轉錄終止子之單一完全CMV啟動子來驅動所有三種抗原之表現。兩種其他載體(質體846及850)併入雙啟動子策略與IRES或2A之組合以驅動三種抗原之表現。具有多個2A卡匣之載體經工程改造以運載不同卡匣，從而將第一卡匣與第二卡匣之間在質體/載體擴增期間的重組可能性減至最小。藉由流動式細胞測量術(圖7)及西方墨點法(圖8)來顯示抗原表現。
質體456(PSA-F2A-PSMA-mIRES-PSCA)。藉由限制片段交換來構築質體456。用Nhe I及Hpa I消化質體5300且將約1.8kb之插入物接合至經類似方式消化之質體449。
質體457(PSA-F2A-PSMA-T2A-PSCA)。藉由限制片段交換來構築質體457。用Nhe I及Hpa I消化質體5300且將約1.8kb之插入物接合至經類似方式消化之質體451。
質體458(PSA-T2A-PSCA-F2A-PSMA)。使用PCR及限制片段交換技術來構築質體458。藉由PCR利用引子119及139自質體5297擴增編碼人類PSA胺基酸25-261之基因，從而將T2A序列及Nhe I限制位點添加於3'端。用Nhe I消化擴增子且插入經類似方式消化之質體454中。
質體459(PSCA-F2A-PSMA-mIRES-PSA)。藉由限制片段交換來構築質體459。用Nhe I及Bgl II消化質體454且將含PSCA-F2A-PSMA之插入物接合至經類似方式消化之質體455。
質體846(CBA-PSA,CMV-PSCA-pIRES-PSMA)。使用PCR及無縫選殖技術來構築質體846。首先，合成由以下組成之表現卡匣：1)雞β肌動蛋白(CBA)基因之啟動子及5'未轉譯區；2)混合雞β肌動蛋白/兔β血球蛋白內含子；3)編碼人類PSA胺基酸25-261之基因；及4)牛生長激素終止子。藉由PCR利用引子3SalICBA及5SalIBGH自質體796擴增此PSA表現卡匣。使用GeneArt無縫選殖及組裝套組(Invitrogen,Carlsbad,CA)將擴增子選殖於質體603之SalI位點中。此質體遞送至細 胞中時，CBA啟動子將驅使PSA停止表現，而CMV啟動子將驅使PSCA及PSMA停止表現。
質體850(CBA-PSA,CMV-PSCA-F2A-PSMA)。使用PCR及無縫選殖技術來構築質體850。首先，藉由PCR利用引子3SalICBA及5SalIBGH自質體796擴增CBA啟動子驅動之PSA表現卡匣。使用GeneArt無縫選殖術將擴增子選殖於質體454之SalI位點中。此質體遞送至細胞中時，CBA啟動子將驅使PSA停止表現，而CMV啟動子將驅使PSCA及PSMA停止表現。
實例4C. 三抗原腺病毒構築體
通用策略。如同DNA質體，病毒疫苗載體可經工程改造以遞送多種前列腺癌抗原。將上文關於DNA疫苗所述之三種多抗原表現策略，即雙啟動子、2A肽及內部核糖體入口位點，以各種組合併入以產生三抗原腺病毒載體。簡言之，將多抗原表現卡匣選殖於經修飾以運載四環素操縱序列(TetO2)之兩個複本的pShuttle-CMV質體中。使用AdEasy載體系統根據製造商方案(Agilent Technologies,Inc.,Santa Clara,CA)產生重組腺病毒血清型5載體。病毒於HEK293細胞中擴增且藉由雙氯化銫色帶根據標準方案加以純化。在活體內研究之前，根據病毒粒子濃度、傳染性效價、無菌度、內毒素、基因組及轉殖基因完整性、轉殖基因一致性及表現充分表徵病毒儲備物。
腺病毒-733(PSA-F2A-PSMA-T2A-PSCA)。Ad-733為質體457之病毒等效物。具有四環素操縱子之單一CMV啟動子驅使三種抗原停止表現以便在大規模生產期間抑制轉殖基因在表現Tet抑制因子之HEK293細胞株中的表現。多抗原表現策略包括兩種不同的2A序列。
腺病毒-734(PSA-T2A-PSCA-F2A-PSMA)。Ad-734為質體458之病毒等效物。具有四環素操縱子之單一CMV啟動子驅使三種抗原停止表現以便在大規模生產期間抑制轉殖基因在表現Tet抑制因子之HEK293細胞株中的表現。多抗原表現策略包括兩種不同的2A序列。
腺病毒-735(PSCA-F2A-PSMA-mIRES-PSA)。Ad-735為質體459之病毒等效物。具有四環素操縱子之單一CMV啟動子驅使三種抗原停止表現以便在大規模生產期間抑制轉殖基因在表現Tet抑制因子之HEK293細胞株中的表現。多抗原表現策略包括2A序列及IRES。
腺病毒-796(CBA-PSA,CMV-PSCA-pIRES-PSMA)。Ad-796為質體846之病毒等效物。雞β肌動蛋白啟動子驅使PSA停止表現，而CMV-TetO2啟動子驅使PSCA及PSMA停止表現。多抗原表現策略包括兩個啟動子及IRES。
腺病毒-809(CBA-PSA,CMV-PSCA-F2A-PSMA)。Ad-809為質體850之病毒等效物。雞β肌動蛋白啟動子驅使PSA停止表現，而CMV-TetO2啟動子驅使PSCA及PSMA停止表現。多抗原表現策略包括兩個啟動子及2A序列。
實例5. 三抗原DNA疫苗之免疫原性
實例5說明表現PSMA、PSCA及PSA之三抗原核酸疫苗構築體引發針對所有三種經編碼之前列腺抗原之抗原特異性T及B細胞反應的能力。
細胞免疫反應研究。根據下述程序研究如實例5中所述之含有PSMA、PSCA及PSA之三抗原構築體在C57BL/6小鼠中的免疫原性。
藉由PMED投藥、用編碼人類PSMA、PSCA及PSA抗原之DNA疫苗構築體、在第0天對雌性C57BL/6小鼠進行初打且在第14天、第28天及第49天加打。評估總計四種不同的三抗原接種策略，該等策略包括三種共同表現標靶蛋白質之DNA疫苗及一種共同調配方法。對於共同表現而言，使用如下編碼經2A肽或內部核糖體進入位點(IRES)連接之所有三種前列腺抗原之單一DNA質體：PSA-F2A-PSMA-T2A-PSCA(質體ID#457)、PSA-T2A-PSCA-F2A-PSMA(質體ID#458)及PSCA-F2A-PSMA-IRES-PSA(質體ID#459)。對於共同調配方法，將三種不同的DNA質體(各自個別地編碼PSMA、PSCA或PSA)共同調配於單一金粒子上以供PMED遞送。除共同調配以外，控制共同表現(2A及IRES)之DNA元件在長度、轉殖基因表現效率及連接於標靶轉殖基因之外來遺傳物質之存在方面不同。作為對照，C57BL/6小鼠接種表現單一前列腺抗原(PSMA、PSCA或PSA)之DNA。對於共同表現之三抗原或單抗原DNA疫苗，經PMED投藥給予劑量2μg之DNA疫苗質體，而經PMED投藥投與1μg經共同調配之各三抗原DNA疫苗(總計3μg)。藉由在第56天，即最終PMED接種後7天自各動物收集脾臟來量測針對三抗原及單抗原疫苗之細胞免疫反應。分離脾細胞且進行IFN-γ ELISPOT分析以量測PSMA、PSCA及PSA特異性T細胞反應。簡言之，將來自個別動物之2×105個脾細胞與每孔5×104個穩定表現單一人類前列腺抗原或一起表現PSMA、PSCA及PSA之TRAMP-C2(轉殖基因腺癌小鼠前列腺)細胞一起，或與10μg/ml個別人類PSMA、PSCA及PSA特異性肽或肽集合(關於肽及肽集合組成，參看表22)或作為對照之單獨培養基一起塗於每孔。各條件以一式三份進行。在37℃及5% CO2下將培養盤培育20小時，洗滌且在培育之後根據製造商說明書顯色。藉由Cellular Technology Ltd.(CTL)讀數器對IFN-γ斑點形成細胞(SFC)數目進行計數。結果呈現於圖9及10中，該等圖顯示每組五 隻小鼠之相對於1×106個脾細胞歸一化之PSMA、PSCA或PSA特異性SFC平均數+/-標準差。
抗體反應研究。藉由在第56天，即最終PMED接種後7天自各動物收集血清來量測針對三抗原及單抗原疫苗之抗體反應。對血清進行酶聯免疫吸附分析法(ELISA)以測定抗PSMA及抗PSCA抗體效價。簡言之，用1μg/ml人類PSMA或PSCA塗佈ELISA培養盤且在4℃下培育隔夜。接著阻斷培養盤且在室溫下與1%牛血清白蛋白(BSA)一起培育1小時。各血清樣品一式兩份以1：100稀釋度開始連續稀釋，且在室溫下培育1小時。洗滌後，將辣根過氧化酶(HRP)結合之山羊抗小鼠多株IgG抗體在室溫下培育1小時。洗滌後，在室溫下將TMB過氧化酶EIA受質培育30分鐘。藉由添加1N硫酸停止比色反應，接著在450nm下 讀取吸光度。繪製各血清樣品之滴定曲線(樣品稀釋度相對於吸光度)。接著獲取在高於偵測下限(LLOD；背景加3倍標準差)之光學密度(OD)值下所測試之最稀血清樣品或經計算以達成1.0之OD值的血清稀釋液的血清效價(隨後轉化成效價倒數)。結果呈現於圖11及12中，該等圖顯示每組五隻小鼠之平均效價+/-標準差。
亦對血清進行螢光活化細胞分選(FACS)分析以量測抗體與適當細胞株之細胞表面上所表現之人類PSMA或PSCA的結合，從而確定多抗原疫苗所產生之抗體是否能夠分別識別天然PSMA及PSCA構形。利用LNCaP(人類前列腺腺癌)細胞來量測抗體與天然PSMA之結合。PC3(人類前列腺癌)細胞充當FACS分析中之對照，因為此等細胞不表現人類PSMA。利用經表現人類PSCA之腺病毒(Ad-PSCA)轉導之MIA-PaCa-2(人類胰臟癌)細胞來量測抗體與天然PSCA之結合。未經轉導之MIA-PaCa-2細胞充當對照。簡言之，為量測抗PSMA抗體結合，在4℃下將2×105個LNCaP或PC3細胞與小鼠血清之1：100稀釋液或15μg/ml對照小鼠抗人類PSMA單株抗體(mAb)(純系J591-A)一起培育20分鐘。為量測抗PSCA抗體結合，在4℃下將2×105個經Ad-PSCA轉導及未經轉導之MIA-PaCa-2細胞與小鼠血清之1：30稀釋液或4μg/ml對照小鼠抗人類PSCA mAb(純系7F5)一起培育20分鐘。隨後，洗滌細胞且在4℃下與結合第二藻紅素(PE)之山羊抗小鼠IgG抗體及活/死染料一起再培育20分鐘。培育後，洗滌細胞且再懸浮於1.5%三聚甲醛中，且在FACS Canto II上獲取10,000個活細胞。結果呈現於圖13及14中，該等圖顯示每組五隻小鼠之小鼠血清相對於單獨第二抗小鼠抗體之平均螢光強度(MFI)平均變化倍數+/-標準差。未量測抗體效價，此係因為PSA以細胞質蛋白形式由此研究中所研究之多抗原疫苗表現。
結果：
圖9A-9D顯示藉由IFN-γ ELISPOT分析法評估三抗原疫苗之細胞 免疫反應之代表性研究之結果。簡言之，利用PMED在第0天對每組5隻小鼠進行初打，且在第14天、第28天及第49天進行加打。在第56天，即最後一次PMED接種後7天，藉由IFN-γ ELISPOT分析法檢查對(A)TRAMP C2-PSMA、(B)TRAMP C2-PSCA、(C)TRAMP C2-PSA及(D)TRAMP C2-PSMA-PSA-PSCA細胞之T細胞反應，評估內源性前列腺抗原之識別。以TRAMP C2細胞作為分析法之背景對照。對於針對內源性PSMA之IFN-γ T細胞反應，在單獨接種PSMA PMED後觀察到對TRAMP C2-PSMA之顯著反應，此與其他研究中所見之反應一致。在接種三抗原後，對TRAMP C2-PSMA偵測到類似之PSMA特異性IFN-γ T細胞反應。相比之下，接種共同調配之PSMA、PSCA及PSA後觀察到反應完全消除(＊指示p<0.05，雙向ANOVA)。對於針對內源性PSCA之IFN-γ T細胞反應，當將單一PSCA疫苗與四種不同的三抗原疫苗比較時，未觀察到針對TRAMP C2-PSCA細胞之反應存在顯著差異。對於針對內源性PSA之IFN-γ T細胞之反應，當將單一PSA疫苗與PSCA-F2A-PSMA-IRES-PSA(＊＊＊指示p<0.001，雙向ANOVA)或共同調配疫苗(＊指示p<0.05，雙向ANOVA)之免疫原性比較時，偵測到對TRAMP C2-PSA之反應量值顯著降低。當檢查針對TRAMP C2-PSMA-PSCA-PSA之反應時，在PSA-F2A-PSMA-T2A-PSCA疫苗後觀察到最高量值IFN-γ T細胞反應。總而言之，此等資料顯示使用共同表現DNA接種策略，尤其是利用PSA-F2A-PSMA-T2A-PSCA疫苗構築體，可識別內源性PSMA、PSCA及PSA以及對所有三種前列腺抗原產生抗原特異性T細胞反應。然而，共同調配之DNA接種策略卻會損失對PSMA及PSA之抗原特異性IFN-γ T細胞反應。
圖10A至10D顯示藉由IFN-γ ELISPOT分析法評估三抗原疫苗之免疫原性的代表性研究之結果。簡言之，利用PMED在第0天對每組5隻小鼠進行初打，且在第14天、第28天及第49天進行加打。在第56 天，藉由IFN-γ ELISPOT分析法評估針對(A)PSMA肽、(B)PSMA肽集合、(C)PSCA肽及(D)PSA肽之T細胞反應(參看表22)。以單獨培養基作為分析法之背景對照。對於針對個別PSMA肽及PSMA肽集合之IFN-γ T細胞反應，與單一PSMA疫苗相比，在投與PSA-F2A-PSMA-T2A-PSCA三抗原疫苗後觀察到最高量值反應。類似地，在投與PSA-F2A-PSMA-T2A-PSCA疫苗後，偵測到對PSCA及PSA特異性肽之最高量值IFN-γ T細胞反應。共同調配之PSMA、PSCA及PSA疫苗對PSMA特異性肽產生低T細胞反應至無T細胞反應，且對PSCA及PSA特異性肽產生低量值反應。此等資料顯示，當自同一疫苗構築體共同表現時，會對PSMA、PSCA及PSA產生T細胞反應。接種在PSA-F2A-PSMA-T2A-PSCA之後，對所有三種前列腺抗原存在一致且穩固之IFN-γ T細胞反應，且在接種PSA-T2A-PSCA-F2A-PSMA、PSMA-F2A-PSMA-IRES-PSA及共同調配之PSMA、PSCA及PSA之後，對前列腺抗原之IFN-γ T細胞反應之量值顯著降低。
圖11顯示藉由抗PSMA抗體效價評估三抗原疫苗之免疫原性的代表性研究之結果。簡言之，利用PMED在第0天對每組5隻小鼠進行初打，且在第14天、第28天及第49天進行加打。在第56天，藉由ELISA評估血清抗PSMA抗體效價。接種PSMA之所有動物均產生顯著抗PSMA抗體效價。效價之間無顯著差異，但與接種PSMA之其他組相比，接種PSA-F2A-PSMA-T2A-PSCA產生的效價稍低。此等資料顯示使用共同表現及共同調配疫苗策略在三抗原接種後產生抗PSMA特異性抗體。
圖12顯示藉由抗PSCA抗體效價評估三抗原疫苗之免疫原性的代表性研究之結果。簡言之，利用PMED在第0天對每組5隻小鼠進行初打，且在第14天、第28天及第49天進行加打。在第56天，藉由ELISA評估血清抗PSCA抗體效價。在接種單獨PSCA以及共同調配之 PSMA、PSCA及PSA的小鼠中偵測抗體效價。此等結果指示，與共同表現之DNA接種策略相比，共同調配PSMA、PSCA及PSA引發可偵測之抗PSCA抗體效價。
圖13顯示藉由抗PSMA抗體細胞表面結合來評估三抗原疫苗之免疫原性的代表性研究之結果。簡言之，利用PMED在第0天對每組5隻小鼠進行初打，且在第14天、第28天及第49天進行加打。在第56天，藉由LNCaP及PC3細胞之血清抗體結合來評估細胞表面天然PSMA之識別。PC3細胞充當分析之背景對照。與接種PSA-T2A-PSCA-F2A-PSMA及單獨PSMA之小鼠相比，接種PSA-F2A-PSMA-T2A-PSCA產生與LNCaP細胞之結合能力顯著較低之抗PSMA抗體(＊指示p值<0.05，單向ANOVA)。所有其他PSMA接種組均顯示在抗PSMA抗體結合方面無顯著差異。J591-A mAb相對於單獨二級抗體之變化倍數為45.3(資料未顯示)。總體而言，此等資料顯示使用共同表現及共同調配DNA接種策略在三抗原接種後產生識別天然PSMA之抗PSMA特異性抗體。
圖14顯示藉由抗PSCA抗體細胞表面結合來評估三抗原疫苗之免疫原性的代表性研究之結果。簡言之，利用PMED在第0天對每組5隻小鼠進行初打，且在第14天、第28天及第49天進行加打。在第56天，藉由經Ad-PSCA轉導及未經轉導之MIA-PaCa-2細胞之血清抗體結合來評估細胞表面天然PSCA之識別。未經轉導之親本細胞充當分析之背景對照。除單一PSMA及單一PSA細胞疫苗以外，與親本細胞相比，利用PSCA之所有疫苗療程均對經Ad-PSCA轉導之MIA-PaCa-2細胞產生顯著抗PSCA抗體結合。接種PSCA之群組之間在對經Ad-PSCA轉導之MIA-PaCa-2細胞之抗PSCA抗體結合方面無顯著差異(單向ANOVA，p值>0.05)。7F5 mAb相對於單獨二級抗體之變化倍數為18.7(資料未顯示)。總體而言，此等資料顯示使用共同表現及共同調配 DNA接種策略在三抗原接種後產生識別天然PSCA之抗PSCA特異性抗體。
實例6. 雙抗原疫苗之免疫原性
提供以下實例以說明表現兩種前列腺抗原之雙抗原疫苗引發針對兩種經編碼之前列腺抗原之抗原特異性T及B細胞反應的能力。
6A.含PSMA及PSCA之雙抗原疫苗在C57BL/6中之免疫原性：
研究程序。
細胞免疫反應研究。藉由PMED表皮注射利用人類PSMA及PSCA表現DNA在第0天對雌性C57BL/6小鼠進行初打且在第14天、第28天、第42天及第70天進行加打。評估總計5種不同的雙抗原DNA接種策略，該等策略包括4種共同表現抗原之DNA疫苗及一種共同調配方法。對於共同表現而言，投與單一DNA疫苗質體，其編碼經雙啟動子、2A肽或IRES連接之兩種前列腺抗原PSMA及PSCA。此等質體包括PSMA-PSCA雙啟動子(質體ID#460)、PSMA-T2A-PSCA(質體ID#451)、PSCA-F2A-PSMA(質體ID#454)及PSCA-IRES-PSMA(質體ID#603)。對於共同調配而言，將兩種不同的DNA質體(各自個別地編碼PSMA及PSCA)共同調配於單一金粒子上以供PMED遞送。除共同調配以外，控制共同表現之DNA元件(雙啟動子2A及IRES)在長度、轉殖基因表現效率及連接於標靶轉殖基因之外來遺傳物質之存在方面不同。作為對照，C57BL/6小鼠接種表現單一前列腺抗原(PSMA或PSCA)之DNA。對於共同表現之雙抗原或單抗原DNA疫苗，根據PMED投藥給予總劑量2μg之DNA疫苗，而對於共同調配，投與2μg各DNA疫苗質體(每次投與總計4μg DNA)。藉由在第77天，即最終PMED接種後7天自各動物收集脾臟來量測雙抗原及單抗原疫苗之細胞免疫反應。分離脾細胞且進行IFN-γ ELISPOT分析以量測PSMA及PSCA特異性T細胞反應。簡言之，將來自個別動物之2×105個脾細胞 與具有5×104個/孔之表現單一內源性人類前列腺抗原或一起表現PSMA、PSCA及PSA之TRAMP-C2細胞一起，或與10μg/ml個別人類PSMA及PSCA特異性肽或肽集合(關於肽及肽集合組成，參看表22)或作為對照之單獨培養基一起塗於每孔。各條件以一式三份進行。在37℃及5% CO2下將培養盤培育20小時，洗滌且在培育之後根據製造商說明書顯色。藉由CTL讀數器對IFN-γ SFC數目進行計數。結果呈現於圖15及16中，該等圖顯示每組五隻小鼠之相對於1×106個脾細胞歸一化之PSMA或PSCA特異性SFC平均數+/-標準差。
抗體反應研究。藉由在第77天，即最終PMED接種後7天自各動物收集血清來量測針對雙抗原及單抗原疫苗之抗體反應。使用ELISA如實例5中所述來測定血清中之抗PSMA及抗PSCA抗體效價。結果呈現於圖17及18中，該等圖顯示每組五隻小鼠之平均效價+/-標準差。
亦對血清進行FACS分析以量測抗體與適當細胞株之細胞表面上所表現之人類PSMA或PSCA的結合，從而確定多抗原疫苗所產生之抗體是否能夠分別識別天然PSMA及PSCA構形。未量測抗體與細胞表面天然PSA之結合，此係因為PSA以細胞質蛋白形式由此研究中所研究之多抗原疫苗表現。根據如實例5中所述之程序進行FACS分析。結果呈現於圖19及20中，該等圖顯示每組五隻小鼠之小鼠血清相對於單獨第二抗小鼠抗體之MFI平均變化倍數+/-標準差。未量測抗體效價及與細胞表面天然PSA之結合，此係因為PSA以細胞質蛋白形式由此研究中所研究之多抗原疫苗表現。
結果。
圖15A至15C顯示藉由IFN-γ ELISPOT分析評估雙抗原疫苗之免疫原性的代表性研究之結果。簡言之，利用PMED在第0天對每組5隻小鼠進行初打，且在第14天、第28天、第42天及第70天進行加打。在第77天，藉由IFN-γ ELISPOT分析藉由研究針對(A)TRAMP C2-PSMA、 (B)TRAMP C2-PSCA及(C)TRAMP C2-PSMA-PSA-PSCA細胞之T細胞反應來評估內源性PSMA及PSCA之識別。TRAMP C2細胞充當分析之背景對照。對於針對內源性PSMA之IFN-γ T細胞反應，在接種PSMA-PSCA雙啟動子、PSMA-T2A-PSCA、PSCA-IRES-PSMA及共同調配之PSMA、PSCA之後，與接種單獨PSMA相比，TRAMP C2-PSMA之反應量值顯著降低(＊＊及＊＊＊分別指示p值<0.01及<0.001，雙向ANOVA)。然而，PSCA-F2A-PSMA疫苗構築體引發針對TRAMP C2-PSMA細胞之IFN-γ T細胞反應的量值與單一PSMA疫苗類似。對於針對內源性PSCA之IFN-γ T細胞反應，在接種若干種雙抗原疫苗(包括PSMA-PSCA雙啟動子、PSCA-F2A-PSMA、PSCA-IRES-PSMA及共同調配之PSMA PSCA)之後，與單獨PSCA疫苗相比，觀察到顯著增加之反應(＊、＊＊及＊＊＊分別指示p值<0.05、0.01及0.001，雙向ANOVA)。PSCA-T2A-PSMA疫苗構築體引發針對TRAMP C2-PSCA細胞之IFN-γ T細胞反應的量值與單一PSCA疫苗類似。比較針對TRAMP C2-PSMA-PSA-PSCA之IFN-γ T細胞反應，接種不同雙抗原疫苗的群組之間無顯著差異。總而言之，此等資料顯示使用共同表現及共同調配DNA接種策略在雙抗原接種後產生PSMA及PSCA特異性T細胞反應。
圖16A至16C顯示藉由IFN-γ ELISPOT分析評估雙抗原疫苗之免疫原性的代表性研究之結果。簡言之，利用PMED在第0天對每組5隻小鼠進行初打，且在第14天、第28天、第42天及第70天進行加打。在第77天，藉由IFN-γ ELISPOT分析評估針對(A)PSMA肽、(B)PSMA肽集合及(C)PSCA肽之T細胞反應(參看表22)。單獨培養基充當分析之背景對照。對於針對個別PSMA肽及肽集合之IFN-γ T細胞反應，在PSMA-T2A-PSCA及PSCA-F2A-PSMA雙抗原接種之後觀察到與單一PSMA疫苗相比之最高量值反應。在接種PSMA-PSCA雙啟動子、PSCA-IRES-PSMA及共同調配之PSMA PSCA之後觀察到針對個別 PSMA肽之IFN-γ T細胞反應顯著降低。接種不同雙抗原疫苗之群組之間的針對PSCA特異性肽之IFN-γ T細胞反應類似。此等資料亦顯示當共同表現於相同DNA疫苗構築體上或作為共同調配物遞送時產生針對PSMA及PSCA兩者之T細胞反應。
圖17顯示藉由抗PSMA抗體效價評估雙抗原疫苗之免疫原性的代表性研究之結果。簡言之，利用PMED在第0天對每組5隻小鼠進行初打，且在第14天、第28天、第42天及第70天進行加打。在第77天，藉由ELISA評估血清抗PSMA抗體效價。接種PSMA之所有動物均產生顯著抗PSMA抗體效價。與接種PSMA之所有其他小鼠群組相比，接種雙疫苗構築體PSCA-F2A-PSMA及單一PSMA疫苗之小鼠產生顯著較高之抗體效價(單向ANOVA，p值<0.05)。與接受PSMA-T2A-PSCA疫苗之小鼠相比，接種PSMA-PSCA雙啟動子及共同調配之PSMA及PSCA產生較高抗體效價。總而言之，此等資料顯示使用共同表現及共同調配接種策略在利用PSMA及PSCA進行雙抗原DNA接種後產生抗PSMA特異性抗體。
圖18顯示藉由抗PSCA抗體效價評估雙抗原疫苗之免疫原性的代表性研究之結果。簡言之，利用PMED在第0天對每組5隻小鼠進行初打，且在第14天、第28天、第42天及第70天進行加打。在第77天，藉由ELISA評估血清抗PSCA抗體效價。與接種PSCA之所有其他小鼠群組相比，接種共同調配之PSMA及PSCA及單一PSCA疫苗之小鼠產生顯著較高之抗體效價(單向ANOVA)。與接種PSMA-T2A-PSCA、PSCA-F2A-PSMA及PSCA-IRES-PSMA相比，接種PSMA-PSCA雙啟動子產生較高抗體效價。此等結果指示PSMA及PSCA之共同表現或共同調配引發抗PSCA抗體。
圖19顯示藉由抗PSMA抗體細胞表面結合評估雙抗原疫苗之免疫原性的代表性研究之結果。簡言之，利用PMED在第0天對每組5隻小 鼠進行初打，且在第14天、第28天、第42天及第70天進行加打。在第77天，藉由LNCaP及PC3細胞之血清抗體結合來評估細胞表面天然PSMA之識別。PC3細胞充當分析之背景對照。除單一PSCA疫苗以外，與對照PC3細胞相比，利用PSMA之所有疫苗療程均產生針對LNCaP細胞之顯著抗PSMA抗體結合。接種PSMA之群組之間在針對LNCaP細胞之抗PSMA抗體結合方面無顯著差異(單向ANOVA，p值>0.05)。J591-A mAb相對於單獨二級抗體之變化倍數為45.3(資料未顯示)。此等資料顯示使用共同表現及共同調配接種策略在雙抗原DNA接種後產生可識別天然PSMA之抗PSMA特異性抗體。
圖20顯示藉由抗PSCA抗體細胞表面結合來評估雙抗原疫苗之免疫原性的代表性研究之結果。簡言之，利用PMED在第0天對每組5隻小鼠進行初打，且在第14天、第28天、第42天及第70天進行加打。在第77天，藉由經Ad-PSCA轉導及未經轉導之MIA-PaCa-2細胞之血清抗體結合來評估細胞表面天然PSCA之識別。未經轉導之親本細胞充當分析之背景對照。除單一PSMA疫苗以外，與對照細胞相比，利用PSCA之所有疫苗療程均產生針對經Ad-PSCA轉導之MIA-PaCa-2細胞之顯著抗PSCA抗體結合。接種PSCA之群組之間在針對經Ad-PSCA轉導之MIA-PaCa-2細胞之抗PSCA抗體結合方面無顯著差異(單向ANOVA，p值>0.05)。7F5 mAb相對於單獨二級抗體之變化倍數為18.7(資料未顯示)。總體而言，此等資料顯示使用共同表現及共同調配接種策略在雙抗原DNA接種後產生可識別天然PSCA之抗PSCA特異性抗體。
6B.含PSMA及PSA或PSCA及PSA之雙抗原疫苗在C57BL/6中之免疫原性：
研究程序。
細胞免疫反應研究。藉由PMED表皮注射利用人類PSMA、PSCA 及PSA表現DNA在第0天對雌性C57BL/6小鼠進行初打且在第14天及第28天進行加打。評估總計4種不同的雙抗原疫苗策略，該等策略包括兩種共同表現方法及兩種共同調配策略。對於共同表現而言，投與單一DNA質體，其編碼兩種前列腺抗原，即由2A肽連接之PSMA及PSA(質體ID#5300)或由IRES連接之PSCA及PSA(質體ID#455)。對於共同調配而言，將個別地編碼PSMA、PSCA或PSA之質體共同調配於單一金粒子上以供PMED遞送。特定言之，此等質體包括共同調配之PSMA及PSA以及共同調配之PSCA及PSA。作為對照，C57BL/6小鼠接種表現單一前列腺抗原PSMA、PSCA或PSA之DNA。對於共同表現之雙抗原或單抗原疫苗而言，根據PMED投藥給予劑量2μg之DNA，而對於共同調配而言，投與2μg各DNA疫苗質體(每次投與總計4μg DNA)。藉由在第35天自各動物收集脾臟來量測雙抗原及單抗原疫苗之細胞免疫反應。分離脾細胞且進行IFN-γ ELISPOT分析以量測PSMA、PSCA及PSA特異性T細胞反應。簡言之，將來自個別動物之2×105個脾細胞與5×104個/孔之穩定表現單一內源性人類前列腺抗原或一起表現PSMA、PSCA及PSA之TRAMP-C2細胞一起，或與10μg/ml個別人類PSMA、PSCA及PSA特異性肽或肽集合(關於肽及肽集合組成，參看表22)或作為對照之單獨培養基一起塗於每孔。各條件以一式三份進行。在37℃及5% CO2下將培養盤培育20小時，洗滌且在培育之後根據製造商說明書顯色。藉由CTL讀數器對IFN-γ SFC數目進行計數。結果呈現於圖21及22中，該等圖顯示每組五隻小鼠之相對於1×106個脾細胞歸一化之PSMA、PSCA及PSA特異性SFC平均數+/-標準差。
抗體反應研究。藉由PMED利用人類PSMA、PSCA及PSA表現DNA在第0天對雌性C57BL/6小鼠進行初打且在第14天、第28天及第49天進行加打。藉由在第56天，即最終PMED接種後7天自各動物收 集血清來量測針對雙抗原及單抗原疫苗之抗體反應。使用ELISA分析如實例5中所述來測定血清中之抗PSMA及抗PSCA抗體效價。結果呈現於圖23及24中，該等圖顯示每組五隻小鼠之平均效價+/-標準差。
亦對血清進行FACS分析以量測抗體與適當細胞株之細胞表面上所表現之人類PSMA或PSCA的結合，從而確定多抗原疫苗所產生之抗體是否能夠分別識別天然PSMA及PSCA構形。未量測抗體與細胞表面天然PSA之結合，此係因為PSA以細胞質蛋白形式由此研究中所研究之多抗原疫苗表現。根據如實例5中所述之程序進行FACS分析。結果呈現於圖25及26中，該等圖顯示每組五隻小鼠之小鼠血清相對於單獨第二抗小鼠抗體之MFI平均倍數變化+/-標準差。未量測抗體效價及與細胞表面天然PSA之結合，此係因為PSA以細胞質蛋白形式由此研究中所研究之多抗原疫苗表現。
結果。
圖21A至21D顯示藉由IFN-γ ELISPOT分析評估雙抗原疫苗之免疫原性的代表性研究之結果。簡言之，利用PMED在第0天對每組5隻小鼠進行初打，且在第14天及第28天進行加打。在第35天，藉由IFN-γ ELISPOT分析藉由研究對(A)TRAMP C2-PSMA、(B)TRAMP C2-PSCA、(C)TRAMP C2-PSA及(D)TRAMP C2-PSMA-PSA-PSCA細胞之T細胞反應來評估內源性PSMA、PSCA及PSA之識別。TRAMP C2細胞充當分析之背景對照。對於針對細胞上內源性表現之PSMA的IFN-γ T細胞反應，在接種含PSMA之雙抗原(PSA-F2A-PSMA及共同調配之PSMA及PSA)及單獨PSMA之後，未觀察到針對TRAMP C2-PSMA之反應之間存在顯著差異。同樣，對於針對內源性PSCA之IFN-γ T細胞反應，與單一PSCA疫苗相比，在雙PSCA-IRES-PSA與共同調配之PSCA及PSA疫苗之間未觀察到針對TRAMP C2-PSCA之反應量值存在差異。對於針對內源性PSA之IFN-γ T細胞反應，當將單一PSA疫 苗之免疫原性與PSA-F2A-PSMA(＊＊＊指示p<0.001，雙向ANOVA)及共同調配之PSMA及PSA(＊＊指示p<0.01，雙向ANOVA)比較時，偵測到針對TRAMP C2-PSA之反應量值顯著增加。當將接受雙PSCA及PSA疫苗之動物與接受單一PSA疫苗之動物比較時，在針對TRAMP C2-PSA之反應量值方面未觀察到差異。當研究針對TRAMP C2-PSMA-PSA-PSCA之IFN-γ T細胞反應時，在接種不同雙抗原疫苗之群組之間在反應方面無顯著差異。總而言之，此等資料顯示使用共同表現及共同調配疫苗策略在雙抗原DNA接種後產生PSMA及PSA特異性T細胞反應以及PSCA及PSA特異性T細胞反應。
圖22顯示藉由抗PSMA抗體效價評估雙抗原疫苗之免疫原性的代表性研究之結果。簡言之，利用PMED在第0天對每組5隻小鼠進行初打，且在第14天、第28天及第49天進行加打。在第56天，藉由ELISA評估血清抗PSMA抗體效價。接種PSMA之所有動物均產生顯著抗PSMA抗體效價。在接種PSA-F2A-PSMA、共同調配之PSMA及PSA以及單獨PSMA之小鼠之間在抗體效價方面無顯著差異(單向ANOVA，p值>0.05)。總而言之，此等資料顯示使用共同表現及共同調配疫苗策略在利用PSMA及PSA進行雙抗原DNA接種後產生抗PSMA特異性抗體。
圖23顯示藉由抗PSCA抗體效價評估雙抗原疫苗之免疫原性的代表性研究之結果。簡言之，利用PMED在第0天對每組5隻小鼠進行初打，且在第14天、第28天及第49天進行加打。在第56天，藉由ELISA評估血清抗PSCA抗體效價。接種PSCA之所有動物均產生顯著抗PSCA抗體效價。接種PSCA-IRES-PSA、共同調配之PSCA及PSA與單獨PSCA之小鼠之間在抗體效價方面無顯著差異(單向ANOVA，p值>0.05)，但PSCA-IRES-PSA接種後產生之抗體效價傾向於低於接種PSCA之其他群組。此等結果指示PSCA及PSA之共同表現或共同調配 引發抗PSCA抗體。
圖24顯示藉由抗PSMA抗體細胞表面結合來評估雙抗原疫苗之免疫原性的代表性研究之結果。簡言之，利用PMED在第0天對每組5隻小鼠進行初打，且在第14天、第28天及第49天進行加打。在第56天，藉由LNCaP及PC3細胞之血清抗體結合來評估細胞表面天然PSMA之識別。PC3細胞充當分析之背景對照。接種PSMA之群組之間在針對LNCaP細胞之抗PSMA抗體結合方面無顯著差異(單向ANOVA，p值>0.05)。J591-A mAb相對於單獨二級抗體之變化倍數為45.3(資料未顯示)。總體而言，此等資料顯示使用共同表現及共同調配疫苗策略在雙抗原接種後產生可識別天然PSMA之抗PSMA特異性抗體。
圖25顯示藉由抗PSCA抗體細胞表面結合來評估雙抗原疫苗之免疫原性的代表性研究之結果。簡言之，利用PMED在第0天對每組5隻小鼠進行初打，且在第14天、第28天及第49天進行加打。在第56天，藉由經Ad-PSCA轉導及未經轉導之MIA-PaCa-2細胞之血清抗體結合來評估細胞表面天然PSCA之識別。未經轉導之親本細胞充當分析之背景對照。接種PSCA之所有小鼠群組對經Ad-PSCA轉導之MIA-PaCa-2細胞顯示極低抗PSCA抗體結合。與接種單獨PSCA之小鼠相比，PSCA-IRES-PSA接種顯著降低對經Ad-PSCA轉導之MIA-PaCa-2細胞之結合(＊指示p<0.05，單向ANOVA)。總而言之，此等資料顯示PSCA及PSA之共同表現或共同調配使得抗PSCA特異性抗體極少識別天然PSCA。
實例7. 經修飾之人類PSMA抗原之免疫原性
研究設計。對使用編碼由SEQ ID NO：1之天然人類PSMA蛋白之15-750個胺基酸(aa)組成之免疫原性PSMA多肽(「經修飾之人類PSMA抗原」或「經修飾hPSMA」)之構築體進行DNA接種所誘導之免疫反應與天然人類全長PSMA蛋白(全長hPSMA)所誘導之免疫反應進行比 較。利用PMED投與2μg劑量之編碼全長hPSMA或經修飾hPSMA之DNA疫苗在第0天對雌性C57BL/6小鼠或雌性巴斯德(HLA-A2/DR1)轉殖基因小鼠群組進行初打且在第14天、第28天進行加打。對小鼠取血且在第35天(第三次接種之後7天)處死，且藉由IFN-γ ELISPOT分析在脾細胞中測定針對hPSMA全長蛋白之T細胞免疫反應。對於C57BL/6小鼠，將來自個別動物之5×105個脾細胞之單一細胞懸浮液與10μg經純化hPSMA蛋白、5×104個單獨TRAMP-C2細胞或表現hPSMA或PSMA-PSA-PSCA融合蛋白之TRAMP-C2細胞一起塗於每孔。對於巴斯德(HLA-A2/DR1)轉殖基因小鼠，將來自個別動物之5×105個脾細胞之單一細胞懸浮液與5×104個經來源於人類PSMA蛋白序列之已知HLA-A2限制性CD8+ T細胞抗原決定基脈衝之表現人類HLA-A2之K562細胞一起塗於每孔(表23)。亦使用10μg/ml經純化PSMA蛋白或5×104個已經表現對照蛋白質(Ad-eGFP)或全長人類PSMA蛋白(Ad-hPSMA)之腺病毒載體轉導之SK-Mel5細胞來測定巴斯德小鼠中之反應。各條件以一式三份進行。在37℃及5% CO2下將培養盤培育20小時，洗滌且在培育之後根據製造商說明書顯色。藉由CTL讀數器對IFN-γ SFC數目進行計數。結果呈現於圖19及20中，該等圖顯示每組之PSMA特異性SFC平均數/百萬脾細胞+/-標準差。
ELISA分析。在第35天在自各動物收集之血清中量測經修飾及全長PSMA疫苗誘導之抗體反應。對血清進行ELISA以便使用如實例5中所述之ELISA分析測定血清中之抗PSMA抗體效價。結果呈現於圖26中，該圖顯示每組小鼠數目之平均效價+/-標準差。
FACS分析。亦對血清進行FACS分析以量測抗體與適當細胞株之細胞表面上所表現之人類PSMA的結合，從而確定經修飾及全長PSMA疫苗所產生之抗體是否能夠識別天然PSMA構形。根據如實例5中所述之程序進行FACS分析。結果呈現於圖29中，該圖顯示每組小 鼠數目之小鼠血清相對於單獨第二抗小鼠抗體之MFI平均變化倍數+/-標準差。
結果。圖26顯示代表性研究之結果，此研究係評估經修飾之人類PSMA(aa 15-750)相對於全長人類PSMA(aa 1-750)在C57BL/6小鼠中引發之T細胞免疫反應，如藉由IFN-γ ELISPOT分析所測定。利用PMED以表現經修飾之hPSMA或hPSMA全長蛋白之DNA疫苗在第0天對每組五(5)隻小鼠進行初打且在第14天及第28天進行加打。在第35天，藉由IFNγ ELISPOT分析測定針對TRAMP C2-PSMA或經純化人類PSMA ECD蛋白(參考圖26中之經純化hPSMA蛋白)之T細胞反應來比較所引發之針對hPSMA全長蛋白之反應。TRAMP C2細胞充當分析之背景對照。所引發之針對TRAMP C2-PSMA或經純化hPSMA蛋白之IFN-γ T細胞反應的量值在各群組之間無顯著差異(雙向ANOVA，p值>0.05)。此等結果指示表現經修飾之hPSMA及hPSMA全長蛋白之DNA疫苗在C57BL/6小鼠中引發等效T細胞免疫反應。
圖27A及27B顯示藉由IFN-γ ELISPOT分析評估經修飾之人類PSMA抗原(aa 15-750)相對於全長人類PSMA抗原(aa 1-750)在巴斯德(HLA-A2/DR1)轉殖基因小鼠中之T細胞免疫反應的代表性研究之結果。利用PMED以編碼經修飾hPSMA或hPSMA全長蛋白之DNA疫苗在第0天對每組十(10)隻小鼠進行初打且在第14天及第28天進行加打。 在第35天，藉由IFN-γ ELISPOT分析使用(A)代表已知CD8+抗原決定基之來源於PSMA之HLA-A2限制性肽及(B)經Ad-hPSMA或經純化hPSMA全長蛋白轉導之SK-Mel5細胞來測定所引發之針對hPSMA全長蛋白之T細胞反應。hHER2 106肽及SK-Mel5 Ad-eGFP在分析中充當陰性對照。經修飾之hPSMA疫苗引發最高量值之針對HLA-A2限制性CD8+ T細胞抗原決定基之IFN-γ T細胞免疫反應，但群組之間的差異不顯著(雙向ANOVA，p值>0.05)。類似地，經修飾之hPSMA疫苗引發最高量值之針對經Ad-hPSMA轉導之SK-Mel5細胞之免疫反應及顯著(雙向ANOVA，p值>0.05)較高頻率之針對經純化hPSMA蛋白之IFN-γ SFC。此等結果顯示在巴斯德(HLA-A2/DR1)轉殖基因小鼠中，表現經修飾之hPSMA蛋白之DNA疫苗在誘導針對hPSMA蛋白之T細胞反應方面比hPSMA全長蛋白更有效。
圖28顯示藉由抗PSMA抗體效價評估經修飾之人類PSMA疫苗及全長PSMA疫苗之免疫原性的代表性研究之結果。簡言之，利用PMED在第0天對小鼠進行初打，且在第14天及第28天進行加打。9隻巴斯德小鼠接種經修飾PSMA，10隻巴斯德小鼠接種全長PSMA，且每組5隻C57BL/6小鼠接種經修飾或全長PSMA。在第35天，藉由ELISA評估血清抗PSMA抗體效價。不出所料，與巴斯德小鼠相比，C57BL/6小鼠產生顯著更大之抗PSMA抗體效價(單向ANOVA)。比較相同品系之小鼠之間的抗體效價，接種經修飾及全長PSMA之小鼠之間在抗體效價方面無顯著差異(單向ANOVA，p值>0.05)。總體而言，此等結果顯示，與經修飾之人類PSMA疫苗相比，接種人類PSMA之全長型式產生等效抗PSMA抗體效價。
圖29顯示藉由抗PSMA抗體細胞表面結合來評估經修飾之人類PSMA疫苗及全長PSMA疫苗之免疫原性的代表性研究之結果。簡言之，利用PMED在第0天對每組5隻C57BL/6小鼠進行初打，且在第14 天及第28天進行加打。在第35天，藉由LNCaP及PC3細胞之血清抗體結合來評估細胞表面天然PSMA之識別。PC3細胞充當分析之背景對照。接種經修飾或全長PSMA之小鼠之間在針對LNCaP細胞之抗PSMA抗體結合方面無顯著差異(單向ANOVA，p值>0.05)。J591-A mAb相對於單獨二級抗體之變化倍數為14.3(資料未顯示)。總體而言，此等資料顯示在經修飾或全長PSMA接種之後可產生可識別天然PSMA之抗PSMA特異性抗體。
實例8. 抗CTLA-4抗體對疫苗誘導之免疫反應的影響
在猴研究中研究局部投與抗CTLA-4單株抗體(CP-675,206)對本發明所提供之人類PSMA核酸分子所誘導之免疫反應之影響，其中藉由使用IFNγ ELISPOT分析量測PSMA特異性T細胞反應來評估免疫反應。
動物處理及樣品收集。用經腺病毒(肌肉內注射之1e11 V.P.)遞送之編碼經修飾之人類PSMA抗原(SEQ ID NO：9)之核酸(SEQ ID NO：10)將三組、每測試組5至6隻(1至5或6號)雄性印度恆河猴免疫，隨後分別以6及9週間隔藉由PMED進行2次DNA免疫(每次免疫8次致動，下腹部右側及左側各4次致動)。第2組及第3組中之動物在PMED免疫之後隨後在鄰近各腹股溝引流淋巴結處另外接受雙側皮內注射3mg CpG(PF-03512676)。在第二次PMED免疫時，在鄰近各左及右腹股溝疫苗引流淋巴結處，第2組亦接受靜脈內注射10mg/kg抗CTLA-4單株抗體(CP-675,206)，且第3組接受皮內注射5mg/kg抗CTLA-4單株抗體(CP-675,206)。
在最後一次PMED免疫之後16天自各動物收集周邊血液樣品。自樣品中分離周邊血液單核細胞(PBMC)且進行IFNγ ELISPOT分析以量測PSMA特異性T細胞反應。簡言之，將來自個別動物之4e5 PBMC與各2μg/ml之PSMA特異性肽集合、10μg/ml之hPSMA ECD蛋白、10 μg/ml之恆河猴PSMA ECD蛋白或各2μg/ml之非特異性對照肽(人類HER2肽集合)一起塗於IFNγ ELISPOT培養盤中之每孔。各PSMA特異性肽集合之組成提供於表24A中。在37℃及5% CO2下將培養盤培育16小時，且洗滌且在培育之後根據製造商說明書顯色。藉由CTL讀數器對IFNγ斑點形成細胞(SFC)之數目進行計數。各條件以一式兩份進行。結果呈現於表24B中，該表顯示得自三重複實驗之PSMA特異性SFC平均數減去相對於1e6 PBMC歸一化之非特異性對照肽之SFC平均數。^指示計數不準確，因為斑點數過多以致無法計數。
IFNγ ELISPOT分析程序。在4℃下將IFNγ特異性捕捉抗體(BD Bioscience，#51-2525kc)塗佈於微量培養盤中之聚偏二氟乙烯(PVDF)膜上隔夜。用血清/蛋白質阻斷培養盤以防止抗體之非特異性結合。在阻斷之後，將效應細胞(諸如自免疫小鼠分離之脾細胞或自恆河猴分離之PBMC)及標靶(諸如來自肽文庫之PSMA肽、經抗原特異性肽脈衝之標靶細胞或表現相關抗原之腫瘤細胞)添加至孔中且在37℃下在5% CO2培育箱中培育隔夜。藉由PVDF膜表面上之塗佈抗體來捕捉效應細胞所分泌之細胞素。在移除細胞及培養基之後，向各孔中添加100μl經生物素標記之多株抗人類IFNγ抗體以供偵測。藉由根據製造商(Mabtech)方案添加抗生蛋白鏈菌素-辣根過氧化酶及沈澱受質3-胺基-9-乙基咔唑(AEC)以產生紅色斑點來顯現斑點。各斑點代表產生單一細胞素之T細胞。
結果。表24B.顯示代表性IFNγ ELISPOT分析之結果，此分析係評估並比較藉由靜脈內注射全身性給予(第2組)或藉由在鄰近疫苗引流淋巴結處皮內注射局部給予(第3組)之疫苗在抗CTLA-4單株抗體(CP-675,206)不存在(第1組)或存在下所誘導之T細胞反應。如表1B中所示，PSMA疫苗在CpG(PF-03512676)及抗CTLA-4單株抗體(CP-675,206)不存在下誘導針對多種PSMA特異性肽及蛋白質之可量測IFNγ T 細胞反應。藉由添加CpG(PF-03512676)及全身性遞送抗CTLA-4抗體(CP-675,206；第2組)來適當增強反應。然而，當藉由在鄰近疫苗引流淋巴結處皮內注射來局部遞送抗CTLA-4單株抗體(CP-675,206)(第3組)時觀察到針對多種PSMA肽及PSMA蛋白之反應更有效且顯著增強。
實例9. CTLA-4抗體在投與獼猴之後的全身性暴露
藉由皮內或靜脈內注射投與抗CTLA-4抗體曲美目單抗(CP675206)之後，研究該抗體在在印度恆河猴中之血液含量。
動物處理及樣品收集。將每組三隻動物注射10mg/kg抗CTLA-4抗體曲美目單抗，單次靜脈內注射至隱靜脈中或多次0.2ml皮內雙側注射於鄰近腹股溝引流淋巴結處之大腿中。在注射後0、1、2、4、 8、12、24及48小時將血液樣品收集於含肝素鋰作為抗凝血劑之2.0ml真空採血管中。在4℃下在1500×g下離心10分鐘後自真空採血管中之上層清液中收集血漿。藉由定量ELISA分析根據下文所提供之程序來量測血漿中之曲美目單抗含量。
曲美目單抗定量ELISA分析程序。將384孔高度結合分析培養盤(VWR-Greiner Bio-Bio-One，目錄號82051-264)每孔塗佈25μl CD-152(CTLA-4；Ancell Immunology Research Products，目錄號501-020)(1.0μg/ml，於100mM碳酸鹽-碳酸氫鹽塗佈緩衝液中)且在4℃下培育隔夜。用1×PBS-Tween(0.01M PBS pH 7.4/0.05% Tween 20)將培養盤洗滌6次，且每孔使用40μL 5% FBS/1×PBS-Tween阻斷，且在室溫下以600rpm振盪培育1小時。藉由製造以下曲美目單抗稀釋液來製備標準物：200、67、22、7.4、2.5、0.82、0.27、0.09及0.03ng/mL。將樣品稀釋至1：100、1：1,000及1：10,000。稀釋劑由1%未處理獼猴血清及含5% FBS之1×PBS-Tween(0.01M PBS pH 7.4/0.05% Tween 20)組成。將25μL/孔之各標準物、樣品及稀釋劑對照物一式兩份轉移至培養盤中且在室溫下以600rpm振盪培育1小時。在用1×PBS-Tween洗滌6次之後，添加25μL/孔之用1×PBS-Tween以1：5,000稀釋之二級抗體(山羊抗人類IgG HRP，Southern Biotech，目錄號9042-05)，接著在室溫下以600rpm振盪培育1小時。在用1×PBS-Tween洗滌6次之後，添加25μL/孔之TMB過氧化酶EIA受質(溶液A+B)(Bio-Rad，目錄號172-1067)且在室溫下將培養盤培育4分鐘。藉由添加12.5μL/孔之1N硫酸來停止比色反應，接著在450nm下讀取吸光度。使用標準曲線對各樣品中之曲美目單抗之量進行定量，其中使用0.27至67ng/mL作為定量範圍。
結果。得自代表性研究之血漿抗CTLA-4含量呈現於圖30中。如所示，與靜脈內注射(AUC0-24=7.2×106ng．h/ml)相比，皮內注射抗 CTLA-4抗體曲美目單抗顯示血液中之抗體之較緩慢釋放動力學及較低全身暴露(AUC0-24=4.9×106ng．h/ml)分佈。
實例10. 抗CTLA-4抗體對疫苗誘導小鼠之免疫反應的影響
研究程序。藉由PMED利用表現rHer-2之DNA對每組6隻雌性BALB/c小鼠進行初打，且隔4週進行加打。如圖式中所指示，在PMED致動當天投與150μg對小鼠CTLA-4具特異性之單株抗體(純系9H10，Bioxcell或#BE0131)或同型對照單株抗體(Bioxcell #BE0091)且在PMED之後各天藉由局部皮內或全身腹膜內注射投與100μg。在最後一次PMED免疫之後7天藉由ICS分析量測自個別小鼠分離之脾細胞中的多功能(多細胞素陽性)T細胞免疫反應。在用10μg/ml疫苗特異性抗原決定基肽(rHer-2特異性抗原特異性CD8(p66)、CD4(p169)抗原決定基或無關肽HBV(核心抗原p87))刺激5小時之後，首先針對CD4、CD3及CD8將脾細胞染色，隨後穿透並針對IFNα、TNFα及IL-2表現(藉由流動式細胞測量術加以分析)進行染色。藉由自疫苗特異性反應減去針對無關肽HBV之反應來計算各動物之抗原特異性單、雙或三重細胞素陽性T細胞總數/總脾臟且藉由每個脾臟分離之脾細胞總數歸一化。
結果。圖31A及31B顯示藉由細胞內細胞素染色分析針對疫苗誘導之免疫反應之品質來評估抗CTLA-4單株抗體(純系9H10)之免疫調節活性的代表性研究之結果。在最後一次PMED之後7天，觀察到藉由局部皮內遞送抗CTLA-4所致之抗原特異性單一及雙重細胞素陽性CD8 T細胞反應及藉由全身性遞送所致之雙重及三重細胞素陽性CD8 T細胞反應顯著增加。另外，觀察到藉由皮內遞送所致之抗原特異性單一細胞素陽性CD4 T細胞及藉由全身性遞送抗CTLA-4所致之雙重細胞素陽性細胞顯著增加(＊指示P<0.05，史都登氏T檢驗法(Student's T-test)。
實例11. 舒尼替尼與抗癌症疫苗組合的協同效應
研究程序。研究蘋果酸舒尼替尼與抗癌症DNA疫苗組合在BALB/neuT轉殖基因雌性小鼠中的抗腫瘤效力。
將表現大鼠Her-2(rHer-2)腫瘤相關抗原之異型接合BALB/neuT轉殖基因雌性小鼠皮下植入表現rHer-2之1e6 TUBO細胞中，該等細胞來源於BALB/neuT小鼠之自發性乳腺腫瘤。在腫瘤細胞植入後7天之後，每天一次以如圖式中所指示之劑量向小鼠經口給予媒劑或蘋果酸舒尼替尼。在起始蘋果酸舒尼替尼療法之後3天，用包含以下之療程使小鼠免疫：(a)表現不表現於腫瘤或小鼠中之抗原的對照疫苗；或(b)表現SEQ ID NO：54之大鼠Her-2抗原(rHER2)的DNA癌症疫苗構築體，該抗原表現於腫瘤及小鼠中。藉由每週兩次量測皮下TUBO腫瘤之長直徑(a)及短直徑(b)且根據a×b2×0.5mm3計算體積來分析腫瘤生長速度。得自各處理組10小鼠的腫瘤體積之平均值及平均值之標準誤差針對腫瘤植入後天數作圖。
結果。圖32顯示評估並比較蘋果酸舒尼替尼作為單一療法或與DNA癌症疫苗組合處理後之皮下腫瘤生長速率的代表性研究之結果。雖然接受DNA癌症疫苗(rHER2：肌肉內注射1e9 V.P.、表現rHer-2之腺病毒，隨後為每兩週兩次藉由PMED致動投與表現rHer-2之DNA)之小鼠的腫瘤繼續快速生長，但接受20mg/kg或40mg/kg劑量之蘋果酸舒尼替尼與對照疫苗(對照：肌肉內注射1e9 V.P.、表現eGFP之腺病毒，隨後為每兩週兩次藉由PMED致動投與表現HBV核心抗原之DNA)之小鼠腫瘤的腫瘤生長速率顯著降低，其中與40mg/kg劑量相比，20mg/kg顯示次最佳效力。然而當癌症疫苗與20mg/kg之次最佳劑量之蘋果酸舒尼替尼共同投與時，腫瘤生長的生長速率比經相同劑量之蘋果酸舒尼替尼與對照疫苗共同投與所處理之小鼠慢得多且與經較高劑量之蘋果酸舒尼替尼處理之小鼠類似。癌症疫苗使接受次最佳 劑量之蘋果酸舒尼替尼的小鼠得到額外治療效益。
圖33A至33D顯示代表性研究之小鼠個別腫瘤生長速率，此研究係評估並比較20mg/kg蘋果酸舒尼替尼與對照物(對照)或DNA癌症疫苗(rHER2)之抗腫瘤效力。簡言之，在腫瘤細胞植入後7天之後，每處理組之十隻小鼠每日經口給予媒劑或20mg/kg蘋果酸舒尼替尼(紓癌特(Sutent))，持續34天。在起始紓癌特(Sutent)給藥之後3天，起始一系列免疫(藉由腺病毒初打，隨後藉由PMED)，該系列免疫在中止紓癌特(Sutent)療法之後繼續。特定言之，小鼠用對照疫苗免疫，包含肌肉內注射1e9 V.P.、表現eGFP之腺病毒，隨後為每兩週兩次(兩次9天)及每週四次藉由PMED致動投與表現HBV核心及表面抗原之DNA；或用改為包含表現rHer-2之腺病毒及DNA之癌症疫苗免疫。接受媒劑與對照疫苗之動物的腫瘤在第7天左右變得可量測且繼續生長，在腫瘤植入50天之後達到2000mm3。接受紓癌特(Sutent)與對照疫苗之動物的腫瘤生長顯著削弱，直至中止紓癌特(Sutent)療法為止。腫瘤在中止紓癌特(Sutent)之後即刻顯示快速生長速率，大多數在腫瘤植入50天之後達到2000mm3。僅接受癌症疫苗接種之動物的腫瘤生長速率適當慢於未接受癌症疫苗或紓癌特(Sutent)之動物。癌症疫苗與紓癌特(Sutent)之組合不僅在紓癌特(Sutent)治療期間抑制腫瘤生長(圖33)，而且在中止紓癌特(Sutent)治療之後在60%動物中顯著削弱腫瘤進展。
圖34顯示圖2B中所述研究之小鼠群組之卡普蘭-麥爾存活曲線，此研究係評估紓癌特(Sutent)與對照物(對照)或癌症疫苗(rHER2)之抗腫瘤效力。當腫瘤體積達到2000mm3時，根據IAUCUC準則將小鼠處死。與經媒劑及對照疫苗處理、在無紓癌特(Sutent)的情況下經癌症疫苗處理或在無癌症疫苗的情況下經紓癌特(Sutent)處理之小鼠相比，僅經紓癌特(Sutent)(20mg/kg)及癌症疫苗處理之小鼠顯示顯著 延長之存活時間(＊P<0.01，對數排序檢驗(Log-rank Test))。圖35A至35D顯示圖2B中之經處理小鼠的周邊血液中骨髓源抑制細胞(Gr1+CD11b+)及含Treg之CD25+CD4+細胞之百分比。簡言之，將PBMC染色且藉由流動式細胞測量術分析各組五隻小鼠在第27天(紓癌特(Sutent)或媒劑處理起始後20天)之下頜下血液中的Gr1、CD11b、CD3、CD4及CD25之表現。顯示各處理組之平均值及平均值之標準誤差。與未接受紓癌特(Sutent)、亦未接受癌症疫苗(媒劑+對照物)之小鼠相比，在藉由紓癌特(Sutent)與對照或癌症疫苗處理之小鼠中觀察到骨髓源抑制細胞%存在統計上顯著之降低。然而，與在無紓癌特(Sutent)之情況下經癌症疫苗處理(媒劑+rHER2)或在無癌症疫苗之情況下經紓癌特(Sutent)處理(紓癌特(Sutent)+對照物)之小鼠相比，在經紓癌特(Sutent)與癌症疫苗組合(紓癌特(Sutent)+rHER2)處理之小鼠中觀察到顯著較低之骨髓源抑制細胞。觀察到紓癌特(Sutent)與癌症疫苗使CD4群體中之含Treg之CD25+ CD4+ T細胞出現統計上顯著之減少。與在無紓癌特(Sutent)之情況下經癌症疫苗處理或在無癌症疫苗之情況下經紓癌特(Sutent)處理之小鼠相比，此等小鼠血液中之CD4群體中含Treg之CD25+ CD4+ T細胞之%顯著較低。＊指示P<0.05(藉由史都登氏T檢驗法)。
圖36A至36C顯示自小鼠腫瘤中分離的骨髓源抑制細胞(Gr1+CD11b+)、Tregs(CD4+CD25+Foxp3+)及PD-1+ CD8 T細胞之總數。簡言之，在植入TUBO細胞之後3天以20mg/kg向小鼠投與單一每日經口劑量之媒劑或紓癌特(Sutent)，持續28天。相同小鼠用對照疫苗免疫，包含肌肉內注射1e9 V.P.、表現eGFP之腺病毒，隨後為每兩週兩次投與藉由PMED遞送之表現HBV核心抗原之DNA；或用包含表現rHer-2之腺病毒及DNA之癌症疫苗免疫。在鄰近右側腹股溝引流淋巴結處利用PMED投藥皮內注射50μg CpG(PF-03512676)。在第二次 PMED及CpG投藥之後7天，自每處理組之6隻小鼠中分離個別腫瘤。由分離之皮下腫瘤製備之單一細胞懸浮液藉由Gr1、Cd11b、CD3、CD8、CD25、FoxP3及PD-1特異性抗體染色且藉由流動式細胞測量術加以分析。對每μg各處理組腫瘤中的如圖所示之特定細胞總數之平均值及平均值之標準誤差作圖。(＊指示P<0.05，史都登氏T檢驗法)。雖然向小鼠給予癌症疫苗(A及B)時與接受對照疫苗之小鼠(A及B)相比在腫瘤中發現之免疫抑制Treg或MDSC之頻率無顯著差異，但用紓癌特(Sutent)處理小鼠(A及B)時與僅接受癌症疫苗之小鼠相比觀察到顯著降低。與接受癌症疫苗之小鼠(C)相比，在經紓癌特(Sutent)處理之小鼠(C)中亦觀察到PD-1+CD8 T細胞減少。總而言之，此等資料顯示減少Treg、MDSC或CD8+PD-1+T細胞之藥劑與疫苗之組合有利於降低攜帶腫瘤之動物的腫瘤負荷。
實例12. 疫苗與舒尼替尼及抗CTLA-4抗體之組合的抗癌症效力
研究癌症疫苗與舒尼替尼及抗CTLA-4單株抗體(純系9D9)之組合在攜帶皮下TUBO腫瘤之BALB/neuT小鼠中的抗腫瘤效力。
研究程序。簡言之，每日以20mg/kg向各組十隻小鼠經口給予媒劑或蘋果酸舒尼替尼，在腫瘤植入後第10天開始直至第64天為止。在第13天起始接種不編碼抗原(對照疫苗)或SEQ ID NO：54之大鼠Her-2抗原(癌症疫苗)的DNA構築體作為腺病毒載體，隨後利用DNA進行各別抗原(HBV抗原或rHer-2)之每週兩次免疫、每兩週兩次免疫及每週七次免疫。在PMED注射後第20、27、41、55、62、69、76、83、90及97天將經抗鼠類CTLA-4單株抗體處理之小鼠群組(實心圓及空心三角形)經腹膜內注射250μg抗體。
結果。圖37顯示代表性研究之小鼠群組的卡普蘭-麥爾存活曲線，此研究係評估舒尼替尼及抗鼠類CTLA-4單株抗體(純系9D9)與癌症疫苗之組合的抗腫瘤效力。在經紓癌特(Sutent)與對照疫苗(空心 圓)、抗鼠類CTLA-4單株抗體(空心三角形)或癌症疫苗(實心三角形)處理之小鼠中觀察到存活時間延長。在經紓癌特(Sutent)及癌症疫苗與抗鼠類CTLA-4之組合處理之小鼠(實心圓)中觀察到存活時間進一步延長。藉由對數排序檢驗來計算P值。
實例13. 舒尼替尼之全身性暴露及抗癌症疫苗與低劑量舒尼替尼之組合的抗癌症效力
舒尼替尼全身性暴露研究。
研究舒尼替尼在具有皮下TUBO腫瘤之BALB/neuT小鼠中的血液動力學。簡言之，在腫瘤植入之後6天每天一次(SID)以20mg/kg或以6小時間隔每天兩次(BID)以10mg/kg向各處理組之20隻小鼠經口投與紓癌特(Sutent)。在紓癌特(Sutent)給予之後在如所指示之若干個時間點(0、2、4、6、8、10、12及24小時)將來自2至3隻小鼠之下頜下血液收集於肝素鋰管中。在×1000g下離心15分鐘之後自管中回收血漿上層清液，且藉由LC/MS/MS量測血漿樣品之舒尼替尼含量。將各組在各時間點之平均值及平均值之標準誤差作圖。
結果呈現於圖38中。將各組在各時間點之平均值及平均值之標準誤差作圖。水平點劃線標記單一治法中有效抑制腫瘤生長所必需之最小舒尼替尼血液含量50ng/ml(Mendel,D.等人，「In vivo antitumor activity of SU11248, a novel tyrosine kinase inhibitor targeting vascular endothelial growth factor and platelet-derived growth factor receptors：determination of a pharmacokinetic/pharmacodynamic relationship」.Clinical Cancer Research,203,9：327-337)。如所示，接受20mg/kg SID或10mg/kg BID之小鼠的血液舒尼替尼含量僅在24小時內短暫維持50ng/ml之可有效抑制腫瘤生長之目標有效劑量。20mg/kg SID群組之血液含量在2小時達到高於50ng/ml之峰值，在6小時下降至50ng/ml且在紓癌特(Sutent)給予後12小時自血液中清除。接受10mg/kg BID之群組中的含量在2小時時達到高於50ng/ml之峰值，但在4小時時快速下降至低於50ng/ml，在第二劑量後2小時再次達到峰值。在4小時時含量快速下降至50ng/ml，且在第二劑量之後18小時自血液中清除。儘管利用每日兩次給藥療程，但接受10mg/kg之動物仍顯示比20mg/kg單一每日給藥療程更短的目標濃度下暴露持續時間。
抗腫瘤效力研究。
研究長期投與低劑量舒尼替尼與抗癌症疫苗之組合在具有皮下TUBO腫瘤之BALB/neuT小鼠中的抗腫瘤效力。簡言之，小鼠以20mg/kg SID持續31天或以10mg/kg BID持續104天給予蘋果酸舒尼替尼(紓癌特(Sutent))，且接受對照疫苗或癌症疫苗。不遞送抗原之對照疫苗及遞送SEQ ID NO：54之大鼠her-2抗原(rHer-2)之癌症疫苗在第9天藉由腺病毒給予，隨後為每兩週五次藉由PMED投與分別遞送HBV抗原或rHer-2之DNA。
結果呈現於圖39中。雖然癌症疫苗改良投與20mg/kg紓癌特(Sutent)之小鼠的存活時間，但投與10mg/kg紓癌特(Sutent)之小鼠的存活時間甚至存在顯著改良(＊P=0.05，對數排序檢驗)。
實例14. CPG或CD40促效劑對癌症疫苗誘導之免疫反應的影響
BALB/c小鼠之免疫原性研究
在BALB/c小鼠中研究局部投與免疫調節劑對癌症誘導之抗原特異性免疫反應之量值及品質的影響，其中藉由使用IFNγ ELISPOT分析或細胞內細胞素染色分析量測rHER2特異性T細胞反應來評估免疫反應。簡言之，利用編碼rHER2抗原序列(SEQ ID NO：54)之DNA質體表現構築體藉由PMED遞送系統使如所指示之每組4至6隻雌性BALB/c小鼠免疫。藉由在PMED刺激之後隨後在鄰近疫苗引流腹股溝淋巴結處皮內注射而局部投與免疫調節劑CpG7909(PF-03512676)及抗CD40單株促效抗體。藉由IFNγ ELISPOT或細胞內細胞素染色分析根據下 文所述之程序來量測抗原特異性T細胞反應。
細胞內細胞素染色(ICS)分析
藉由ICS分析量測自個別動物分離之脾細胞或PBMC的rHer-2特異性多功能(多細胞素陽性)T細胞免疫反應。通常，將1e6脾細胞與1μg/ml佈雷菲德菌素A(Brefeldin A)及10μg/ml肽刺激劑(rHer-2特異性CD8 p66、rHer-2特異性CD4 p169或無關HBV p87)一起在37℃下在5% CO2培育箱中培育5小時。在刺激之後，洗滌脾細胞且在4℃下用Fcγ阻斷劑(抗小鼠CD16/CD32)阻斷10分鐘，隨後用Live/dead aqua染色劑抗小鼠CD3ePE-Cy7、抗小鼠CD8a太平洋藍(Pacific blue)及抗小鼠CD45R/B220 PerCP-Cy5.5染色20分鐘。洗滌細胞，在4℃下用4%三聚甲醛固定隔夜，在室溫下用BD固定/滲透溶液滲透30分鐘且與抗小鼠IFNγ APC、抗小鼠TNFα Alexa488及抗小鼠IL-2 PE一起在室溫下培育30分鐘。洗滌細胞且獲取20,000個CD4或CD8 T細胞以供藉由流動式細胞測量術加以分析。藉由自疫苗特異性反應中減去對無關肽HBV之rHer-2特異性反應來計算各動物之抗原特異性單、雙或三重細胞素陽性T細胞總數/總脾臟，且相對於對自脾臟分離之脾細胞總數歸一化。
IFNγ ELISPOT分析結果
圖40顯示代表性研究之小鼠群組的IFNγ ELISPOT結果，此研究係評估rHER2疫苗與所示免疫調節劑一起投與時所誘導之抗原特異性T細胞反應之量值。簡言之，藉由PMED利用編碼rHER2抗原序列(SEQ ID NO：54)之DNA質體表現構築體將每處理組之各小鼠(n=4)免疫，隨後即刻如所指示投與100μg對照大鼠IgG單株抗體(Bioxcell #BE0089：對照mAb)或50μg CpG7909或100μg抗CD40單株抗體(Bioxcell #BE0016-2：a-CD40 mAb)。在PMED致動之後7天藉由對以10μg/ml濃度與對照或rHer-2特異性p66肽混合的5e5脾細胞之IFNγ ELISPOT分析來量測抗原特異性免疫反應。根據個別動物之ELISPOT結果計算含1e5 CD8 T細胞之脾細胞的總IFNγ分泌細胞數目，且將脾細胞中之CD8 T細胞之%及各組之平均值及標準平均值誤差作圖。如所示，與接受對照抗體之小鼠相比，CpG7909及抗CD40單株抗體均顯著增強rHer-2 DNA所誘導之抗原特異性免疫反應之量值。
細胞內細胞素染色(ICS)分析結果。圖41A及41B顯示藉由細胞內細胞素染色分析針對疫苗誘導之免疫反應之品質評估CpG 7909之免疫調節活性的代表性研究之結果。簡言之，以4週間隔利用藉由PMED遞送之編碼rHER2抗原序列(SEQ ID NO：54)之DNA質體表現構築體將各動物免疫兩次。在藉由PMED進行兩次DNA免疫之後即刻在鄰近右側疫苗引流腹股溝淋巴結處將各組小鼠(n=5)皮內注射PBS(PMED組)或50μg CpG 7909(PMED+CpG組)。在藉由PMED進行最後一次免疫之後7天，對自各個別小鼠分離之脾細胞進行ICS分析以偵測分泌IFNγ、TNFα及/或IL-2之抗原特異性多功能CD8或CD4 T細胞。與PBS相比，偵測到經局部遞送CpG 7909處理之小鼠中的rHer-2特異性多細胞素陽性CD8及CD4 T細胞反應顯著增加。與PBS相比，在接受局部遞送之CpG7909投藥的動物中觀察到單一細胞素陽性CD8群體增加(＊指示P<0.05，史都登氏T檢驗法)。
圖42A及42B顯示藉由細胞內細胞素染色分析、針對疫苗誘導之免疫反應之品質來評估促效抗CD40單株抗體之免疫調節活性的代表性研究之結果。簡言之，以4週間隔利用藉由PMED遞送之編碼rHER2抗原序列(SEQ ID NO：54)之DNA質體表現構築體將各動物免疫兩次。在藉由PMED投與第一次免疫之後1天，在鄰近右側疫苗引流腹股溝淋巴結處將各組小鼠(n=6)皮內注射100μg同型IgG對照(PMED與IgG)或抗CD40單株抗體(PMED與aCD40)。在最後一次PMED之後7天，對自各個別小鼠分離之脾細胞進行ICS分析以偵測分泌IFNγ、TNFα及/ 或IL-2之rHer-2特異性多功能CD8或CD4 T細胞。與同型IgG對照相比，在經局部遞送之抗CD40單株抗體處理之小鼠中偵測到rHer-2特異性三重細胞素陽性CD8及CD4 T細胞反應顯著增加。局部投與抗CD40單株抗體亦顯著增加rHer-2特異性單一及雙重細胞素陽性CD4 T細胞(＊指示P<0.05，史都登氏T檢驗法)。
實例15. 癌症疫苗與低劑量舒尼替尼之組合的抗癌症效力
研究抗癌症疫苗與低劑量舒尼替尼之組合在具有自發性乳腺墊腫瘤之BALB/neuT小鼠中的抗腫瘤效力。
動物處理。簡言之，每天兩次向13至14週齡雌性小鼠經口投與5mg/kg蘋果酸舒尼替尼(紓癌特(Sutent))，持續112天。在第3天藉由腺病毒注射投與不遞送抗原之對照疫苗及遞送SEQ ID NO：54之大鼠Her-2抗原(rHer-2)之癌症疫苗作為初打，隨後每兩週7次藉由PMED投與分別遞送HBV抗原(對照疫苗)或rHer-2(癌症疫苗)之DNA。當所有10個乳腺墊均變成腫瘤陽性時或當任何乳腺腫瘤之體積達到2000mm3時測定存活終點。結果呈現於圖43中。
結果。與先前公開之紓癌特(Sutent)藥物動力學分佈(Mendel,D.,Laird,D.等人，「In vivo antitumor activity of SU11248,a novel tyrosine kinase inhibitor targeting vascular endothelial growth factor and platelet-derived growth factor receptors：determination of a pharmacokinetic/ pharmacodynamic relationship」.Clinical Cancer Research,203,9：327-337)及先前資料(圖38)相比，預期每天兩次給予5mg/kg紓癌特(Sutent)之小鼠中的紓癌特(Sutent)之CMax顯著低於在小鼠及人類中達成有效抗腫瘤效力所必需之最小血液含量。資料顯示經低劑量紓癌特(Sutent)單一療法處理之小鼠之存活率出現快速而短暫之改良。然而，當與癌症疫苗一起投與時，觀察到存活率之更持續且顯著之改良(P<0.0001，對數排序檢驗)。
實例16. 藉由局部投與CPG來增強疫苗誘導之免疫反應
在猴研究中研究局部投與CpG(PF-03512676)對本發明所提供之人類PSMA核酸誘導之免疫反應的免疫增強作用，其中藉由使用IFNγ ELISPOT分析量測PSMA特異性T細胞反應來評估免疫反應。
動物處理及樣品收集。利用藉由電穿孔遞送之編碼經修飾之人類PSMA抗原之質體DNA(SEQ ID NO：1之胺基酸15-750)將6組、每測試組6隻(1至6號)中國食蟹猴免疫。簡言之，所有動物均在第0天接受雙側肌肉內注射5mg質體DNA，隨後電穿孔(DNA EP)。隨後，剛好在電穿孔之後，第2組在鄰近DNA注射部位處接受雙側肌肉內注射與1mg礬混合之2mg CpG。第3組及第4組分別在第0天或第3天接受在無礬之情況下在鄰近DNA注射部位處遞送之2mg CpG之雙側肌肉內注射。第5組在第3天接受在鄰近疫苗引流腹股溝淋巴結處遞送之2mg雙側皮內注射CpG。第6組在第0天接受與共同電穿孔於肌肉中之DNA溶液混合之200μg CpG之雙側注射。
IFNγ ELISPOT分析程序。在DNA免疫之後15天自各動物收集周邊血液樣品。自血液樣品分離周邊血液單核細胞(PBMC)且進行IFNγ ELISPOT分析以量測PSMA特異性T細胞反應。簡言之，將來自個別動物之4e5 PBMC與PSMA特異性肽或非特異性對照肽集合(人類HER2肽集合)一起各自以2μg/ml塗於IFNγ ELISPOT培養盤中之每孔。各PSMA特異性肽集合之組成提供於表1A中。在37℃及5% CO2下將培養盤培育16小時，且洗滌且在培育之後根據製造商說明書顯色。藉由CTL讀數器對IFNγ斑點形成細胞(SFC)之數目進行計數。各條件以一式兩份進行。代表性實驗之結果呈現於表1B中。所報導之PSMA特異性反應係藉由自PSMA肽集合之SFC平均數減去非特異性對照肽(人類HER2肽集合)之SFC平均數來計算且相對於在1e6 PBMC下所觀察之SFC歸一化。^指示計數因為斑點數目過多以致無法計數而不準確。 ND指示未測得。
結果。表28顯示代表性IFNγ ELISPOT分析的結果，此分析係評估並比較疫苗在肌肉內(第2組、第3組、第4組及第5組)或皮內注射(第6組)局部給予之CpG(PF-03512676)不存在(第1組)或存在下誘導之IFNγ T細胞反應。表1B中之此等結果繪製於圖1中。如表1B及圖1中所示，在CpG(PF-03512676)不存在下，在所有6隻動物(第1組)中針對多個PSMA特異性肽集合偵測PSMA特異性IFNγ T細胞反應。在DNA電穿孔之後3天藉由肌肉內(第4組：3/6)或皮內(第5組：2/6)注射而另外接受CpG(PF-03512676)的一些動物中，所量測之針對PSMA肽之總反應適當較高。然而，當在同一天剛好在電穿孔之後隨後遞送CpG(第2組及第3組)時，若干動物未能產生較高反應(第2組：4/6；及第3組：3/6)，無論是與明礬混合或是未與明礬混合。然而，當低10倍劑量之CpG與DNA溶液一起共同電穿孔於肌肉中(第6組)時，在4/6動物中偵測到較高淨反應，與未接受CpG之動物(第1組)相比，對肽集合H1及R1具有統計上較高之反應(P<0.05)。資料顯示，當共同電穿孔於肌肉中時，低劑量CpG可有效增強DNA疫苗誘導之IFNγ T細胞反應。
實例17. 藉由局部投與抗CTLA-4抗體增強疫苗誘導之免疫反應
在猴研究中研究低劑量皮下投與抗CTLA-4單株抗體(CP-675,206)對恆河猴PSMA核酸所誘導之免疫反應的效應，其中藉由使用IFNγ ELISPOT分析量測PSMA特異性T細胞反應來評估免疫反應。本研究中所使用之恆河猴PSMA核酸具有如SEQ ID NO：56)中所述之序列且編碼SEQ ID NO：55之免疫原性PSMA多肽。
動物處理及樣品收集。利用藉由雙側肌肉內注射(2×5e10 V.P.)遞送之編碼經修飾恆河猴PSMA多肽之腺病毒將五組、每測試組七(1至7號)隻雄性印度恆河猴免疫。在腺病毒注射之後即刻使第1組接受媒劑，且第2組至第4組在鄰近疫苗引流淋巴結處分別以2×25mg、2×16.7mg及2×8.4mg之劑量接受雙側皮下注射抗CTLA-4抗體(CP-675,206)。
在免疫之後9天，自各動物分離周邊血液單核細胞(PBMC)且進行IFNγ ELISPOT分析以量測恆河猴PSMA特異性T細胞反應。簡言之，將來自個別動物之4e5 PBMC與恆河猴PSMA特異性肽集合(表24A中所定義之P1、P2、P3或R1+R2)或非特異性對照肽集合(人類HER2肽集合)一起各自以2μg/ml塗於IFNγ ELISPOT培養盤中之每孔。在37℃及5% CO2下將培養盤培育16小時，且洗滌且在培育之後根據製造商說明書顯色。藉由CTL讀數器對IFNγ斑點形成細胞(SFC)之數目進行計數。各條件以一式兩份進行。將恆河猴PSMA特異性肽集合之背景經調節之SFC之一式兩份之平均值相對於1e6 PBMC中之反應歸一化。來自各個別動物之對肽集合之個別反應及總反應呈現於表29中。
IFNγ ELISPOT分析程序。在4℃下將IFNγ特異性捕捉抗體(BD Bioscience，#51-2525kc)塗於微量培養盤中之聚偏二氟乙烯(PVDF)膜上隔夜。用血清/蛋白質阻斷培養盤以防止抗體之非特異性結合。在阻斷之後，將效應細胞(諸如自免疫小鼠分離之脾細胞或自恆河猴分離之PBMC)及標靶(諸如來自肽文庫之PSMA肽、經抗原特異性肽脈衝之標靶細胞或表現相關抗原之腫瘤細胞)添加至孔中且在37℃下在5% CO2培育箱中培育隔夜。藉由PVDF膜表面上之塗佈抗體來捕捉效應細胞所分泌之細胞素。在移除細胞及培養基之後，將100μl經生物素標記之多株抗人類IFNγ抗體添加至各孔中以供偵測。藉由根據製造商(Mabtech)方案添加抗生蛋白鏈菌素-辣根過氧化酶及沈澱受質3-胺基-9-乙基咔唑(AEC)以產生紅色斑點來顯現斑點。各斑點代表產生單一細胞素之T細胞。
結果。表29顯示代表性IFNγ ELISPOT分析的結果，此分析係比較疫苗在抗CTLA-4單株抗體(CP-675,206)不存在(第1組)或存在(第2組至第4組)下誘導之T細胞反應，抗CTLA-4單株抗體係藉由在鄰近疫苗引流淋巴結處皮下注射來局部投與。疫苗產生免疫反應(第1組)， 該免疫反應因局部投與50mg劑量(第2組，P=0.001，使用低估值之史都登氏T檢驗法)之抗CTLA-4抗體(CP-675,206)而顯著增強。該反應亦分別因33.4mg(第3組：P=0.004，使用低估值之史都登氏T檢驗法)及16.7mg(第4組：P=0.05，史都登氏T檢驗法)之低劑量抗CTLA-4抗體而顯著增強。資料表明藉由皮下注射遞送之低劑量抗CTLA-4可顯著增強疫苗誘導之免疫反應。
實例18.低劑量舒尼替尼對骨髓源抑制細胞產生免疫調節作用
提供以下實例以說明低劑量舒尼替尼在非腫瘤小鼠模型中對骨髓源抑制細胞(MDSC)的活體內免疫調節作用。
研究程序。
為產生MDSC增濃之脾細胞，將TUBO細胞(1×106)植入5隻BALB/neuT小鼠之側腹中且經約20至30天，直至腫瘤體積達到1000至1500mm3為止。接著將小鼠處死，移除脾臟且回收MDSC增濃之脾細胞。用5μM CFSE將脾細胞標記10分鐘，用PBS洗滌且計數。隨後使經標記之細胞以5×107個脾細胞/毫升再懸浮於PBS溶液中，且經由尾靜脈靜脈內注射而接受性轉移至未處理BALB/c接受小鼠中。在接受性轉移前3天，開始每日兩次以5mg/kg、10mg/kg及20mg/kg向接受小鼠給予媒劑或蘋果酸舒尼替尼(紓癌特(Sutent))。在接受性轉移之後，接受小鼠繼續接受每日兩次給予媒劑或舒尼替尼，再持續兩天，該時間點之後將小鼠處死，移除脾臟，收集脾細胞且加以處理以供表型分析。
對脾細胞進行計數且以5×106個細胞/毫升再懸浮於FACS染色緩衝液(PBS、0.2%(w/v)牛血清白蛋白及0.02%(w/v)疊氮化鈉)中。對於脾細胞之流動式細胞測量術染色，首先在4℃下將2.5×106個細胞與CD16/CD32之抗體培育10分鐘以阻斷Fc受體且將非特異性結合減至最少。接著在4℃下用針對鼠類細胞表面標記物之適當螢光團結合抗體(Biolegend)將脾細胞染色20分鐘。對於T細胞(抗CD3(太平洋藍)，純系17A2)及MDSC(抗GR-1(APC)，純系RB6-8C5及抗CD11b(PerCp Cy5.5)，純系M1/70)，亦包括活/死染色劑。在抗體培育之後，用2ml FACS緩衝液洗滌經染色之脾細胞，藉由離心形成集結粒且再懸浮於0.2ml FACS緩衝液中，接著在BD CANTO II流式細胞儀上獲取資料。為監測舒尼替尼或媒劑對接受性轉移之MDSC存活率的影響，計 算活單態閘中CFSE+,CD3-,GR1+,CD11b+之百分比。接著藉由計算實際細胞數目佔總脾細胞計數之百分比來確定每個脾臟之接受性轉移之MDSC數目。藉由FloJo及Graph pad軟體來分析資料。
結果。表31中所呈現之資料表示接受性轉移後2天來自每日兩次給予媒劑或5mg/kg、10mg/kg及20mg/kg舒尼替尼之小鼠的每個脾臟(n=7/組)回收之接受性轉移之CSFE+,CD3-,GR1+,CD11b+細胞之平均數目。資料顯示，即使當給予低達5mg/kg時，每日兩次給予舒尼替尼亦對MDSC具有活體內免疫調節作用，引起回收數目存在統計上顯著之降低(與經媒劑處理之對照組相比)。
實例19. 三抗原腺病毒及DNA構築體之免疫原性
提供以下實例以說明表現本發明所提供之三種抗原PSMA、PSCA及PSA之三抗原疫苗構築體(呈腺病毒載體或DNA質體形式)在非人類靈長類動物中引發針對所有三種編碼抗原之特異性T細胞反應的能力。
活體內研究程序。在初打後9天將本發明所提供之各自表現三種抗原(PSMA、PSCA及PSA)之五種腺病毒載體(Ad-733、Ad-734、Ad-735、Ad-796及Ad-809)的T細胞免疫原性與各自僅表現單一抗原(PSMA、PSA或PSCA)之三種腺病毒載體之混合物相比較。評估針對 表現單一抗原之單一腺病毒(第1組至第3組)的反應以顯示特異性。簡言之，將印度恆河猴(對於第1組及第3組，n=6；對於第2組，n=7；且對於第4組至第9組，n=8)肌肉內注射總計1e11 V.P.，隨後在同一天皮內注射10mg/kg抗CTLA-4。在注射之後9天，自各動物分離周邊血液單核細胞(PBMC)且進行IFNγ ELISPOT分析以量測PSMA、PSA及PSCA特異性T細胞反應。
在腺病毒及抗CTLA-4注射之後13週，當已建立T細胞反應時，猴接受藉由電穿孔遞送之DNA疫苗增強免疫(第1組：PSMA、質體5166；第2組：PSA、質體5297；第3組：PSCA、質體5259；第4組：PSMA、PSA及PSCA、質體5166、5259及5297之混合物；第4組：質體457；第6組：質體458；第7組：質體459；第8組：質體796；及第9組：質體809)。總之，各動物接受總計5mg本發明所提供之質體DNA，由此遞送初打中所使用之腺病毒中所編碼之相同表現卡匣。在加打接種之後9天，自各動物分離周邊血液單核細胞(PBMC)且進行IFNγ ELISPOT分析。
IFNγ ELISPOT分析。簡言之，將來自個別動物之4e5 PBMC與PSMA特異性肽集合P1、P2、P3或H1及H2(表24A)、PSA特異性集合1或2(表25)、PSCA特異性集合(表26)或非特異性對照肽(人類HER2肽集合)一起各自以2μg/ml塗於IFNγ ELISPOT培養盤中之每孔。在37℃及5% CO2下將培養盤培育16小時，且洗滌且在培育之後根據製造商說明書顯色。藉由CTL讀數器對IFNγ斑點形成細胞(SFC)之數目進行計數。各條件以一式兩份進行。將抗原特異性肽集合之背景經調節之SFC之一式兩份之平均值相對於1e6 PBMC中之反應歸一化。表中之抗原特異性反應呈現針對相應抗原特異性肽或肽集合之反應的總和。
結果：表27代表藉由IFNγ ELISPOT評估與各自表現單一抗原之三種腺病毒之混合物相比各自表現所有三種抗原之五種不同腺病毒在 印度恆河猴中之T細胞免疫原性的研究。僅接受Ad-PSMA(第1組)注射之動物大部分誘導對PSMA但不對PSA或PSCA具有特異性之反應(史都登氏T檢驗法，P<0.03。優先誘導針對PSCA之反應的一隻動物(#4)自統計分析中剔除)。僅接受Ad-PSA注射(第2組)之動物誘導對PSA但不對PSMA或PSCA具有特異性之反應(史都登氏T檢驗法，P<0.02)。僅接受Ad-PSCA注射(第3組)之動物誘導對PSCA但不對PSMA或PSA具有特異性之反應(史都登氏T檢驗法，P<0.03)。所有五種三抗原表現腺病毒載體(第5組至第9組)均誘導針對所有三種抗原之IFNγ T細胞反應，該T細胞反應之量值因動物而各異。三抗原表現腺病毒誘導之PSCA反應之量值類似於個別載體之混合物(第4組)。然而，Ad-809(第9組)誘導之PSMA反應及Ad-796(第8組)誘導之PSA反應的量值各自分別顯著優於混合物(史都登氏T檢驗法，P=0.04及P=0.02)。此等結果指示，在非人類靈長類動物中，相對於接種個別腺病毒混合物，接種表現三種抗原之腺病毒可引發等效或優良T細胞免疫反應。
表28顯示代表性研究之IFNγ ELISPOT結果，此研究係評估藉由腺病毒初打與抗CTLA-4之組合隨後進行相應質體DNA之電穿孔加打遞送之本發明所提供之五種不同三抗原表現卡匣之免疫原性。將免疫反應與類似地藉由腺病毒初打與抗CTLA-4及DNA電穿孔加打免疫遞送之表現單一抗原之三種構築體之混合物相比較。
僅接受Ad-PSMA與抗CTLA-4及隨後之質體-PSMA(第1組)免疫的所有動物均誘導對PSMA但不對PSA或PSCA具有特異性之反應。類似地，僅接受Ad-PSA與抗CTLA-4及隨後之質體-PSA免疫(第2組)的所有動物均誘導對PSA但不對PSMA或PSCA具有特異性之反應，且最終僅接受Ad-PSCA與抗CTLA-4及隨後之質體-PSCA(第3組)免疫的所有動物均誘導對PSCA但不對PSMA或PSA具有特異性之反應(史都登氏T 檢驗法，P<0.01)。
已用三抗原表現載體(第5組至第9組)或混合物(第4組)免疫之所有動物均誘導針對所有三種抗原之IFNγ T細胞反應。所偵測之PSCA或PSA特異性IFNγ T細胞之頻率在所有此等群組(第4組至第9組)中分別相似。然而，接受三抗原表現載體接種之構築體第7組及第9組與三種表現單一抗原之構築體之混合物相比產生顯著較高頻率之PSMA反應。此等結果指示，在非人類靈長類動物中，相對於表現單一抗原之腺病毒及DNA之混合物，在一個卡匣中表現三種抗原之腺病毒及DNA疫苗可引發等效或優良IFNγ T細胞反應。
實例20.舒尼替尼降低STAT3磷酸化
提供以下實例以說明舒尼替尼直接抑制STAT3(轉錄活化因子3之 信號轉導因子，脾臟中之免疫抑制關鍵介體)磷酸化之能力。
研究程序。研究紓癌特(Sutent)在皮下腫瘤小鼠模型中對脾臟中之STAT3之磷酸化狀態的急性作用以評估該化合物之直接免疫調節作用。簡言之，在10至12週齡雌性BALB/neuT小鼠右側腹部皮下植入1e6 TUBO細胞。在腫瘤植入後42天之後，藉由經口管飼法投與20mg/kg紓癌特(Sutent)。在紓癌特(Sutent)給藥後0、1、3、7及24小時，每個時間點根據IAUCUC準則處死3隻動物，且即刻將脾臟瞬間冷凍於液氮中以保持磷酸化狀態。將來自雌性BALB/c小鼠之脾臟瞬時冷凍以用作健康小鼠對照。
STAT3分析程序。瞬時冷凍之脾臟以100mg組織/500μL溶解緩衝液(70mM NaCl、50mM β-甘油磷酸酯、10mM HEPES、1% Triton X-100、100mM Na3VO4、100mM PMSF、1mg/mL抗纖維蛋白溶酶肽)使用polytron組織均質機均質化。在10,000g下將所得消化物離心15分鐘。分離上層清液且使用BCA蛋白質分析套組(Pierce,Rockford,Illinois)測定蛋白質濃度。將40微克蛋白質添加至總STAT3(eBioscience，目錄號85-86101-11)或磷酸化STAT3(eBioscience，目錄號85-86102-11)ELISA套組之各孔中。將任一蛋白質之相對含量與套組中所提供之標準物及獨立購買之標準物(Signaling Technologies，目錄號9333-S)相比較。
結果。表29顯示評估紓癌特(Sutent)對脾臟中之STAT3之磷酸化狀態之影響的代表性STAT分析之結果。藉由ELISA，來自健康或攜帶腫瘤之小鼠之兩個脾臟提取物均顯示類似STAT3蛋白含量(總STAT3)。然而，與健康BALB/c相比，來自攜帶腫瘤之小鼠的提取物具有顯著較高之磷酸化STAT3含量(史都登氏T檢驗法，P<0.001)。在紓癌特(Sutent)處理後僅1小時，磷酸化程度快速降低至與健康動物類似之程度，且與未經處理之小鼠相比在較低程度維 持長達7小時。在24小時，STAT3磷酸化程度完全恢復至紓癌特(Sutent)處理前之程度。磷酸化動力學反映血液中之循環紓癌特(Sutent)之含量。脾臟中體現紓癌特(Sutent)之藥物動力學概況之STAT3磷酸化之快速反應表明紓癌特(Sutent)在攜帶腫瘤之動物中的直接免疫調節功能。
原始序列表
SEQ ID NO：1. 全長人類PSMA之胺基酸序列
SEQ ID NO：2. 編碼SEQ ID NO：1之全長人類PSMA的核苷酸序列
SEQ ID NO：3. 經改組之PSMA抗原1之胺基酸序列
SEQ ID NO：4. 編碼SEQ ID NO：3之經改組PSMA抗原1之胺基酸序列的核苷酸序列
SEQ ID NO：5. 經改組之PSMA抗原2之胺基酸序列
SEQ ID NO：6. 編碼SEQ ID NO：5之經改組PSMA抗原2之胺基酸序列的核苷酸序列
SEQ ID NO：7. 經改組之PSMA抗原3之胺基酸序列
SEQ ID NO：8. 編碼SEQ ID NO：7之經改組之PSMA抗原3之胺基酸序列的核苷酸序列
SEQ ID NO：9. 膜結合PSMA抗原之胺基酸序列
SEQ ID NO：10. 編碼SEQ ID NO：9之膜結合PSMA抗原之胺基酸序列的核苷酸序列
SEQ ID NO：11. 胞溶質PSMA抗原之胺基酸序列
SEQ ID NO：12. 編碼SEQ ID NO：11之胞溶質PSMA抗原之胺基酸序列的核苷酸序列
SEQ ID NO：13. 分泌PSMA抗原之胺基酸序列
SEQ ID NO：14. 編碼SEQ ID NO：13之分泌PSMA抗原之胺基酸序列的核苷酸序列
SEQ ID NO：15. 全長人類PSA之胺基酸序列
SEQ ID NO：16. 編碼SEQ ID NO：15之全長人類PSA之胺基酸序列的核苷酸序列
SEQ ID NO：17. 胞溶質PSA抗原之胺基酸序列
SEQ ID NO：18. 編碼SEQ ID NO：17之胞溶質PSA抗原之胺基酸序列的核苷酸序列
SEQ ID NO：19. 膜結合PSA抗原之胺基酸序列
SEQ ID NO：20. 編碼SEQ ID NO：19之膜結合PSA抗原之胺基酸序列的核苷酸序列
SEQ ID NO：21. 全長人類PSCA之胺基酸序列
SEQ ID NO：22. 編碼SEQ ID NO：21之全長人類PSCA之胺基酸序列的核苷酸序列
SEQ ID NO：23. 質體5166之核苷酸序列
SEQ ID NO：24. 質體5259之核苷酸序列
SEQ ID NO：25. 質體5297之核苷酸序列
SEQ ID NO：26. 質體460之核苷酸序列
SEQ ID NO：27. 質體451之核苷酸序列
SEQ ID NO：28. 質體454之核苷酸序列
SEQ ID NO：29.質體5300之核苷酸序列
SEQ ID NO：30. 質體449之核苷酸序列
SEQ ID NO：31. 質體603之核苷酸序列
SEQ ID NO：32. 質體455之核苷酸序列
SEQ ID NO：33. 質體456之核苷酸序列
SEQ ID NO：34. 質體457之核苷酸序列
SEQ ID NO：35. 質體458之核苷酸序列
SEQ ID NO：36. 質體459之核苷酸序列
SEQ ID NO：37. PSHUTTLE IRES之核苷酸序列
SEQ ID NO：38. Her-2抗原之胺基酸序列： (信號序列加下劃線)
SEQ ID NO：39. 編碼SEQ ID NO：38之Her-2抗原胺基酸序列的核酸序列
SEQ ID NO：40. 抗CD40抗體CP870,893之重鏈之胺基酸序列：
SEQ ID NO：41. 抗CD40抗體CP870,893之輕鏈之酸序列：
SEQ ID NO：42. 抗CTLA-4抗體曲美目單抗之重鏈之酸序列
SEQ ID NO：43. 抗CTLA-4抗體曲美目單抗之輕鏈之酸序列
SEQ ID NO：44. CpG 7909之核苷酸序列5' TCGTCGTTTTGTCGTTTTGTCGTT3'
SEQ ID NO：45. CpG 24555之核苷酸序列5' TCGTCGTTTTTGGGTGCTTTT3'
SEQ ID NO：46. CpG 10103之核苷酸序列 5' TCGTCGTTTTTCGGTCGTTTT3'
SEQ ID NO：47. eGFP之胺基酸序列
SEQ ID NO：48. HBV核心抗原之胺基酸序列
SEQ ID NO：49. HBV表面抗原之胺基酸序列
SEQ ID NO：50. 恆河猴PSMA ECD蛋白之胺基酸序列：
SEQ ID NO：51. 大鼠Her-2 p66肽(H-2d T細胞抗原決定基)之胺基酸序列TYVPANASL
SEQ ID NO：52. 大鼠Her-2 p169肽(H-2d T細胞抗原決定基)之胺基酸序列DMVLWKDVFRKNNQL
SEQ ID NO：53. HBV核心抗原p87肽之胺基酸序列SYVNTNMGL
SEQ ID NO：54. 大鼠Her-2抗原(rHer-2)之胺基酸序列：
SEQ ID NO：55. 恆河猴PSMA抗原之胺基酸序列：
SEQ ID NO：56. 編碼SEQ ID NO：55之恆河猴PSMA抗原的核苷酸序 列：
<110> 美商輝瑞大藥廠
<120> 前列腺相關抗原及基於疫苗之免疫治療療程
<130> PC71854A
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<151> 2012-05-04
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<220>
<223> 合成構築體
<400> 53
<210> 54
<211> 957
<212> PRT
<213> 人造
<220>
<223> 合成構築體
<400> 54
<210> 55
<211> 739
<212> PRT
<213> 人造
<220>
<223> 合成構築體
<400> 55
<210> 56
<211> 2217
<212> DNA
<213> 人造
<220>
<223> 合成構築體
<400> 56

Claims (48)

  1. 一種分離之免疫原性PSMA多肽，其胺基酸序列與SEQ ID NO：1之人類PSMA之胺基酸15-750具有90%至99%一致性且在相應位置包含人類PSMA蛋白之至少10、11、12、13、14、15、16、17、18或19個保守T細胞抗原決定基之胺基酸。
  2. 如請求項1之分離之免疫原性PSMA多肽，其包含人類PSMA之至少15、16、17、18或19個保守T細胞抗原決定基。
  3. 如請求項2之分離之免疫原性PSMA多肽，其與SEQ ID NO：1之人類PSMA之胺基酸15-750具有94%至97%一致性。
  4. 如請求項3之分離之免疫原性PSMA多肽，其包含選自由以下組成之群的胺基酸序列：a)SEQ ID NO：3之胺基酸序列；b)SEQ ID NO：5之胺基酸序列；c)SEQ ID NO：7之胺基酸序列；及d)SEQ ID NO：9之胺基酸序列。
  5. 如請求項3之分離之免疫原性PSMA多肽，其由選自由以下組成之群的胺基酸序列組成：a)SEQ ID NO：3之胺基酸序列；b)SEQ ID NO：5之胺基酸序列；c)SEQ ID NO：7之胺基酸序列；及d)SEQ ID NO：9之胺基酸序列。
  6. 一種組合物，其包含如請求項1至5中任一項之分離之免疫原性PSMA多肽或其功能變異體，及醫藥學上可接受之賦形劑。
  7. 如請求項6之組合物，其進一步包含免疫原性PSA多肽。
  8. 如請求項7之組合物，其中該免疫原性PSA多肽由SEQ ID NO：17 之胺基酸序列組成。
  9. 如請求項8之組合物，其中該免疫原性PSA多肽由SEQ ID NO：19之胺基酸序列組成。
  10. 一種分離之核酸分子，其包含編碼如請求項1至5中任一項之免疫原性PSMA多肽之核苷酸序列。
  11. 一種分離之核酸分子，其包含選自由以下組成之群的核苷酸序列或其簡併變異體：a)SEQ ID NO：4之核苷酸序列；b)SEQ ID NO：6之核苷酸序列；c)SEQ ID NO：8之核苷酸序列；及d)SEQ ID NO：10之核苷酸序列。
  12. 一種質體構築體，其包含如請求項10或請求項11之分離之核酸分子。
  13. 一種載體，其包含如請求項10或請求項11之核酸分子。
  14. 一種組合物，其包含如請求項10或請求項11之分離之核酸分子、如請求項12之質體構築體或如請求項13之載體。
  15. 如請求項14之組合物，其進一步包含編碼由SEQ ID NO：17之胺基酸序列或SEQ ID NO：19之胺基酸序列組成之免疫原性PSA多肽之核酸分子。
  16. 如請求項15之組合物，其進一步包含編碼人類PSCA蛋白之核酸分子。
  17. 如請求項16之組合物，其為疫苗組合物。
  18. 一種如請求項6至9或14至17中任一項之組合物之用途，其係用於製造用以抑制哺乳動物中之異常細胞增殖的藥物。
  19. 一種如請求項6至9或14至17中任一項之組合物之用途，其係用於製造用以引發哺乳動物之免疫反應的藥物。
  20. 一種如請求項6至9或14至17中任一項之組合物之用途，其係用於製造用以治療人類之前列腺癌的藥物。
  21. 一種至少一種免疫抑制細胞抑制劑及至少一種免疫效應細胞增強劑之用途，其係用於製造用以增強疫苗之治療作用以便為接受該疫苗之哺乳動物治療贅生性病症的藥物。
  22. 一種至少一種免疫抑制細胞抑制劑及至少一種免疫效應細胞增強劑之用途，其係用於製造用以增強疫苗之免疫原性以便為接受該疫苗之哺乳動物治療贅生性病症的藥物。
  23. 如請求項21至22中任一項之用途，其中該哺乳動物為人類。
  24. 如請求項23之用途，其中該贅生性病症為癌症。
  25. 如請求項24之用途，其中該至少一種免疫抑制細胞抑制劑係選自蛋白激酶抑制劑、COX-2抑制劑或PDE5抑制劑；且其中該至少一種免疫效應細胞增強劑係選自CTLA-4抑制劑、CD40促效劑、TLR促效劑、4-1BB促效劑、OX40促效劑、GITR促效劑、PD-1拮抗劑或PD-L1拮抗劑。
  26. 如請求項25之用途，其中：1)該蛋白激酶抑制劑係選自由以下組成之群：伊馬替尼(imatinib)、索拉非尼(sorafenib)、拉帕替尼(lapatinib)、紮克替瑪(zactima)、MP-412、達沙替尼(dasatinib)、來他替尼(lestaurtinib)、拉帕替尼(lapatinib)、蘋果酸舒尼替尼(sunitinib malate)、阿西替尼(axitinib)、埃羅替尼(erlotinib)、吉非替尼(gefitinib)、博索替尼(bosutinib)、坦羅莫司(temsirolismus)及尼勒替尼(nilotinib)；2)該CTLA-4抑制劑係選自由以下組成之群：伊匹單抗(ipilimumab)及曲美目單抗(Tremelimumab)；3)該CD40促效劑為選自由以下組成之群的抗CD40抗體：G28- 5、mAb89、EA-5、S2C6、CP870893及達西珠單抗(dacetuzumab)；且4)該TLR促效劑為選自由以下組成之群的CpG寡核苷酸：CpG 24555、CpG 10103、CpG7909及CpG1018。
  27. 如請求項26之用途，其中該至少一種免疫抑制細胞抑制劑為蛋白激酶抑制劑且其中該至少一種免疫效應細胞增強劑為CTLA-4抑制劑。
  28. 如請求項27之用途，其中該蛋白激酶抑制劑係選自索拉非尼、達沙替尼、伊馬替尼、阿西替尼或蘋果酸舒尼替尼且其中該CTLA-4抑制劑為曲美目單抗。
  29. 如請求項28之用途，其中該蛋白激酶抑制劑為以約1至25毫克/劑量經口投與之蘋果酸舒尼替尼，且曲美目單抗係以約10至150毫克/劑量經皮內或皮下投與。
  30. 如請求項29之用途，其進一步包含第二免疫效應細胞增強劑，其中該第二免疫效應細胞增強劑為選自CpG24555、CpG10103、CpG7909或CpG1018之TLR促效劑。
  31. 一種疫苗、至少一種免疫抑制細胞抑制劑及至少一種免疫效應細胞增強劑之用途，其係用於製造治療人類贅生性病症的藥物，其中該疫苗能夠引發針對與該贅生性病症相關之腫瘤相關抗原之免疫反應。
  32. 如請求項31之用途，其中該贅生性病症為前列腺癌。
  33. 如請求項32之用途，其中該疫苗包含編碼選自由以下組成之群的免疫原性PSMA多肽之核酸分子：1)由SEQ ID NO：9之胺基酸序列組成之多肽；2)由SEQ ID NO：3之胺基酸4-739組成之多肽；3)由SEQ ID NO：5之胺基酸4-739組成之多肽；及 4)由SEQ ID NO：7之胺基酸4-739組成之多肽。
  34. 如請求項33之用途，其中該分離之核酸分子包含選自由以下組成之群的核苷酸序列：1)包含SEQ ID NO：4之核苷酸10-2217的核苷酸序列；2)包含SEQ ID NO：6之核苷酸10-2217的核苷酸序列；3)包含SEQ ID NO：8之核苷酸10-2217的核苷酸序列；及4)包含SEQ ID NO：10之核苷酸10-2217的核苷酸序列，或任何核苷酸序列之簡併變異體。
  35. 如請求項33之用途，其中該疫苗進一步包含編碼免疫原性PSA多肽之核酸分子且其中該免疫原性PSA多肽係選自由以下組成之群：1)1)包含SEQ ID NO：17之胺基酸序列或SEQ ID NO：17之胺基酸4-240的多肽；2)由SEQ ID NO：17之胺基酸序列或SEQ ID NO：17之胺基酸4-240組成的多肽；3)包含SEQ ID NO：19之胺基酸序列或SEQ ID NO：19之胺基酸4-281的多肽；及4)由SEQ ID NO：19之胺基酸序列或SEQ ID NO：19之胺基酸4-281組成的多肽。
  36. 如請求項35之用途，其中該疫苗進一步包含編碼該人類PSCA多肽之核酸分子。
  37. 如請求項36之用途，其中該免疫原性PSCA多肽為全長人類PSCA。
  38. 如請求項32之用途，其中該疫苗包含編碼選自由免疫原性PSMA多肽、免疫原性PSA多肽及免疫原性PSCA多肽組成之群之至少兩個免疫原性PAA多肽的多抗原構築體。
  39. 如請求項32之用途，其中該疫苗包含編碼選自由免疫原性PSMA多肽、免疫原性PSA多肽及免疫原性PSCA多肽組成之群之至少三個免疫原性PAA多肽的多抗原構築體。
  40. 如請求項38或請求項39之用途，其中該免疫原性PSMA多肽係選自由以下組成之群：1)由SEQ ID NO：9之胺基酸序列組成的多肽；2)由SEQ ID NO：3之胺基酸4-739組成的多肽；3)由SEQ ID NO：5之胺基酸4-739組成的多肽；及4)由SEQ ID NO：7之胺基酸4-739組成之多肽，其中該免疫原性PSA多肽係選自由以下組成之群：1)包含SEQ ID NO：17之胺基酸序列或SEQ ID NO：17之胺基酸4-240的多肽；2)由SEQ ID NO：17之胺基酸序列或SEQ ID NO：17之胺基酸4-240組成的多肽；3)包含SEQ ID NO：19之胺基酸序列或SEQ ID NO：19之胺基酸4-281的多肽；及4)由SEQ ID NO：19之胺基酸序列或SEQ ID NO：19之胺基酸4-281組成的多肽，且其中該免疫原性PSCA多肽為全長人類PSCA。
  41. 如請求項40之用途，其中該至少一種免疫抑制細胞抑制劑係選自蛋白激酶抑制劑、COX-2抑制劑或PDE5抑制劑；且其中該至少一種免疫效應細胞增強劑係選自CTLA-4抑制劑、CD40促效劑、TLR促效劑、4-1BB促效劑、OX40促效劑、GITR促效劑、PD-1拮抗劑或PD-L1拮抗劑。
  42. 如請求項25之用途，其中：1)該蛋白激酶抑制劑係選自由以下組成之群：伊馬替尼、索拉非尼、拉帕替尼、紮克替瑪、MP-412、達沙替尼、來他替尼、 拉帕替尼、蘋果酸舒尼替尼、阿西替尼、埃羅替尼、吉非替尼、博索替尼、坦羅莫司及尼勒替尼；2)該CTLA-4抑制劑係選自由伊匹單抗及曲美目單抗組成之群；3)該CD40促效劑為選自由以下組成之群的抗CD40抗體：G28-5、mAb89、EA-5、S2C6、CP870893及達西珠單抗；及4)該TLR促效劑為選自由以下組成之群的CpG寡核苷酸：CpG 24555、CpG10103、CpG7909及CpG1018。
  43. 如請求項42之用途，其中該至少一種免疫抑制細胞抑制劑為蛋白激酶抑制劑且其中該至少一種免疫效應細胞增強劑為CTLA-4抑制劑。
  44. 如請求項43之用途，其中該蛋白激酶抑制劑係選自索拉非尼、達沙替尼、伊馬替尼、阿西替尼、博索替尼或蘋果酸舒尼替尼且其中該CTLA-4抑制劑為曲美目單抗。
  45. 如請求項44之用途，其中該蛋白激酶抑制劑為以約1至25毫克/劑量經口投與之蘋果酸舒尼替尼且曲美目單抗係以約10至150毫克/劑量經皮內或皮下投與。
  46. 如請求項44之用途，其中該蛋白激酶抑制劑為每天兩次以約1、2、3、4或5毫克/劑量經口投與之阿西替尼，且曲美目單抗係以約10至150毫克/劑量經皮內或皮下投與。
  47. 如請求項45或請求項46之用途，其進一步包含第二免疫效應細胞增強劑，其中該第二免疫效應細胞增強劑為選自CpG24555、CpG10103、CpG7909或CpG1018之TLR促效劑。
  48. 如請求項47之用途，其中該疫苗為DNA疫苗且其中該疫苗及該TLR促效劑係以混合物形式藉由電穿孔法投與。
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