KR20190042760A - 전립선 관련된 항원 및 백신 기재 면역치료 요법 - Google Patents

전립선 관련된 항원 및 백신 기재 면역치료 요법 Download PDF

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KR20190042760A
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헬렌 킴 조
마이클 로버트 더마이어
카린 우테 주스
브라이언 그레고리 피어스
조이스 치 탄
반 토 차이
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Abstract

본원은 (a) 단리된 면역원성 PAA 폴리펩타이드; (b) 면역원성 PAA 폴리펩타이드를 암호화하는 단리된 핵산 분자; (c) 면역원성 PAA 폴리펩타이드 또는 면역원성 PAA 폴리펩타이드를 암호화하는 단리된 핵산 분자를 포함하는 백신 조성물; (d) 상기 폴리펩타이드, 핵산 분자 및 조성물의 용도에 관한 방법; 및 (e) 백신을 면역-억제성-세포 억제제 및 면역-효과기-세포 증폭자와 함께 병용 투여함을 수반하는 백신 기재 면역치료 요법을 제공한다.

Description

전립선 관련된 항원 및 백신 기재 면역치료 요법{PROSTATE-ASSOCIATED ANTIGENS AND VACCINE-BASED IMMUNOTHERAPY REGIMENS}
본 발명은 일반적으로 면역치료 및 구체적으로 신생물 질환의 치료 또는 예방을 위한 백신 및 방법에 관한 것이다.
관련 출원에 대한 참조
본원은 2012년 5월 4일자로 출원된 미국 가 출원 제 61/642,844 호를 우선권 주장하고, 상기 출원은 내용 전체가 본 발명에 참고로 인용된다.
서열 목록에 대한 참조
본원은 전자 포맷의 서열 목록과 함께 출원 중이다. 상기 서열 목록은 2013년 4월 4일자로 생성된 "PC71854A SEQ LISTING_ST25.TXT" 표제의 .txt 포맷, 257 KB 크기의 파일로 제공된다. 상기 .txt 파일에 함유된 서열 목록은 명세서의 부분이고, 내용 전체가 본 발명에 참고로 인용된다.
암은 세계적으로 선두적인 사망 원인이다. 전통적인 암 관리 요법들은 순환암 및 고형암의 선택 군의 관리에 성공적이었다. 그러나, 많은 종양들이 전통적인 접근법들에 내성이다. 최근 수년간, 종양으로부터 먼 부위에 백신 조성물을 투여함으로써 숙주 기원의 능동적인 전신 종양-특이성 면역 반응을 발생시킴을 수반하는 암 치료용 면역요법이 탐구되어 왔다. 단리된 종양-관련 항원을 함유하는 백신들을 포함한 다양한 유형의 백신들이 제안되었다.
전립선암은 두 번째로 가장 흔하게 진단되는 암이며 세계적으로 선진국 남성들에서 암-관련 사망의 4 번째 선두 원인이다. 다양한 전립선-관련된 항원(PAA), 예를 들어 전립선-특이성 항원(PSA), 전립선-특이성 막 항원(PSMA), 및 전립선 줄기세포 항원(PSCA)이 정상적인 상대에 비해 전립선 암세포에 의해 과발현되는 것으로 나타났다. 따라서, 상기 항원들은 백신-기재 면역요법의 사용을 통한 상기 항원을 발현하는 암에 대한 특이적 면역 반응의 유도에 가능한 표적을 나타낸다. (예를 들어 문헌[Marrari, A., M. lero, et al. (2007). "Vaccination therapy in prostate cancer." Cancer Immunol lmmunother 56(4): 429-45]을 참조하시오).
PSCA는 123- 아미노산 막 단백질이다. 전장의 인간 PSCA의 아미노산 서열은 서열번호 21의 아미노산 4-123으로 이루어진다. PSCA는 높은 조직 특이성을 가지며 85% 초과의 전립선 암 시편상에서 발현되고, 이때 발현 수준은 보다 높은 글리슨(Gleason) 점수와 함께 증가하며 안드로젠 독립적이다. PSCA는 전립선 암환자의 골 전이의 80 내지 100%에서 발현된다.
PSA는 전립선의 소핵 및 도관 내층 원주상피세포에 의해 독점적으로 생성되는 칼리크레인-유사 세린 프로테아제이다. PSA mRNA는 불활성 261- 아미노산 프리프로PSA 전구체로서 번역된다. 프리프로PSA는 프리-영역(신호 폴리펩타이드) 및 프로폴리펩타이드를 구성하는 24 개의 추가적인 잔기들을 갖는다. 상기 프로폴리펩타이드의 방출로, 효소적으로 활성인 성숙한 세포외 형태의 237-아미노산이 생성된다. 인간 전장의 PSA의 아미노산 서열은 서열번호 15에 제공된다. PSA는 기관-특이성이며, 그 결과 양성 전립선 과형성(BPH) 조직, 원발성 전립선암 조직, 및 전이성 전립선암 조직의 상피 세포들에 의해 생산된다.
PSMA(또한 폴레이트 하이드롤라제 1(FOLH1)으로서 공지됨)는 750 개 아미노산으로 구성된다. 인간 전장의 PSMA의 아미노산 서열은 서열번호 1에 제공된다. PSMA는 세포질 도메인(아미노산 1-19), 막관통 도메인(아미노산 20-43), 및 세포외 도메인(아미노산 44-750)을 포함한다. PSMA는 전립선암 세포의 표면 및 신생혈관상에서 발현되는 II형 이량체성 막관통 단백질이다. PSMA는 또한 정상적인 전립선 세포, 뇌, 침샘 및 담관상에서 발현된다. 그러나, 전립선 암세포에서 PSMA는 정상 조직보다 1000 배 더 높은 수준으로 발현되는 것으로 밝혀졌다. PSMA는 다양한 다른 고형 종양들, 예를 들어 결장암, 유방암, 간암, 방광암, 췌장암, 폐암, 신장암뿐만 아니라 흑색종 및 육종의 신생혈관상에서 풍부하게 발현된다. 따라서, PSMA는 전립선 암세포에 특이적인 표적일뿐만 아니라 다른 암들에 대한 범-암종 표적으로 간주된다. 상기 PSMA의 발현은 전립선 암종의 보편적인 특징인 것으로 보이며 그의 증가된 발현은 종양 공격성과 상관있다. PSMA 발현은 고도 종양, 전이성 병변 및 안드로젠-독립적인 질병에서 가장 높다.
다수의 종양-관련 항원들이 동정되고 이들 항원 중 다수가 암의 치료 또는 예방을 위한 단백질-기재 또는 DNA-기재 백신으로서 탐구되었지만, 지금까지 대부분의 임상 시험들은 치료 제품을 생산하지 못했다. 암백신의 개발에 있어서 도전 중 하나는 상기 암 항원이 대개는 자기-유래되고, 따라서 면역계는 자기-단백질을 인식하지 않고 자기-조절되기 때문에, 불충분하게 면역원성이라는 점에 있다. 따라서, 암 백신의 면역원성 또는 치료 효과를 증대시키는 방법이 필요하다.
다수의 접근법들이 암 백신의 면역원성을 증대시키거나 또는 종양 억제 효능을 증대시키기 위해 탐구되었다. 상기와 같은 접근법 중 하나는 다양한 면역 조절제, 예를 들어 TLR 작용물질, TNFR 작용물질, CTLA-4 억제제, 및 단백질 키나제 억제제의 사용을 수반한다.
톨형 수용체(TLR)는 조혈 및 비-조혈 세포상에서 발현되는 1형 막 수용체이다. 11 개 이상의 구성원이 상기 TLR 과에서 동정되었다. 이들 수용체는 병원성 유기체에 의해 발현되는 병원체-관련된 분자 패턴(PAMP)을 인식하는 그들의 능력을 특징으로 한다. TLR의 촉발이, 증대된 사이토킨 생산, 케모킨 수용체 발현(CCR2, CCR5 및 CCR7), 및 공동자극 분자 발현을 통해 충분한 염증 반응을 이끌어내는 것으로 밝혀졌다. 선천적 면역계에서 이들 수용체는 그 자체가, 이어지는 후척적 면역반응의 극성에 대한 조절을 발휘한다. 상기 TLR 중에서, TLR9가 면역 반응에서의 그의 작용에 대해 광범위하게 조사되었다. 상기 TLR9의 자극은 염증전 사이토킨의 생산 및 T 세포에 대한 공동자극 분자의 제공을 증가시킴으로써 항원-제공 세포(APC)를 초회항원자극 효능, TH1-지배된 T-세포 반응으로 향하게 한다. TLR9에 대한 리간드인 CpG 올리고뉴클레오타이드는 효능있는 면역자극 인자의 부류인 것으로 밝혀졌다. CpG요법은 마우스에서 광범위한 종양 모델에 대해 시험되었으며, 종양 억제 또는 회귀를 촉진하는 것으로 일관되게 입증되었다.
세포독성 T-림프구 항원 4(CTLA-4)는 면역글로불린 상과의 일원이며 헬퍼 T 세포의 표면상에서 발현된다. CTLA-4는 CD28 의존성 T 세포 활성화의 음의 조절제이며, 적합한 면역 반응에 대한 억제 체크포인트로서 작용한다. T-세포 공동자극 단백질 CD28과 유사하게, CTLA-4는 항원-제공 세포상의 CD80 및 CD86에 결합한다. CTLA-4는 T 세포로 억제 신호를 전송하는 반면, CD28은 자극 신호를 전송한다. 인간 CTLA-4에 대한 인간 항체는 다수의 질병 상태들에서 면역자극 조절제로서, 예를 들어 바이러스 및 세균 감염의 치료 또는 예방 및 암 치료에 대해서 개시되었다(WO 01/14424 및 WO 00/37504). 다양한 전임상 연구들은 단클론 항체에 의한 CTLA-4 봉쇄가 면역원 종양에 대한 숙주 면역 반응을 증대시키고, 심지어 확립된 종양을 물리칠 수 있는 것으로 밝혀졌다. 2 개의 완전 인간 항-인간 CTLA-4 단클론 항체(mAb), 이필리뮤맵(MDX-010) 및 트레멜리뮤맵(또한 CP675206으로서 공지됨)이 다양한 유형의 고형 종양의 치료에서의 임상 시험에서 조사되었다.
종양 괴사 인자(TNF) 상과는 특정한 동족 세포 표면 수용체, TNF 수용체(TNFR) 상과와 연동하는 사이토킨의 한 군이다. 상기 종양 괴사 인자 상과의 구성원들은 리간드-매개된 삼량체화를 통해 작용하여, 다수의 세포내 어댑터들을 모집하여 다수의 신호 전달 경로들, 예를 들어 세포사멸, NF-kB 경로, JNK 경로뿐만 아니라 면역 및 염증 반응을 활성화시킨다. 상기 TNF 상과의 예는 CD40 리간드, OX40 리간드, 4-1BB 리간드, CD27, CD30 리간드(CD153), TNF-알파, TNF-베타, RANK 리간드, LT-알파, LT-베타, GITR 리간드, 및 LIGHT를 포함한다. 상기 TNFR 상과는 예를 들어 CD40, OX40, 4-1BB, CD70 (CD27 리간드), CD30, TNFR2, RANK, LT-베타 R, HVEM, GITR, TROY, 및 RELT를 포함한다. CD40은 B 림프구, 수지상 세포, 여포성 수지상 세포, 조혈 선조 세포, 상피 세포, 및 암종의 표면상에서 발견된다. CD40은 리간드(CD40-L)에 결합하며, 상기 리간드는 당단백질이고 활성화된 T 세포, 대개는 CD4+, 그러나 또한 일부는 CD8+뿐만 아니라 호염구/비만 세포상에서 발현된다. 선천적이고 적합한 면역 반응에서의 CD40의 역할로 인해, 다양한 CD40 작용물질 항체, 예를 들어 완전 인간 작용물질 CD40 단클론 항체 CP870,893을 포함한 CD40 작용물질들이 백신 항원보강제로서 및 요법들에서의 용법에 대해 탐구되었다.
단백질 키나제는 단백질 중 특정 잔기의 인산화를 촉매화하는 효소들의 한 과이다. 단백질 키나제는, 그의 수용체상에서, 핵에 대한 사이토킨의 작용을 포함하여, 다양한 생물학적 사건들을 촉발하는 세포외 신호의 전달을 맡고 있는 신호 전달 경로의 핵심 요소이다. 정상 세포 생리학에서 단백질 키나제의 다수의 역할은 세포 주기 조절 및 세포 성장, 분화, 세포사멸, 세포 이동성 및 체세포 분열의 유도를 포함한다. 키나제, 예를 들어 c-Src, c-Abl, 미토젠 활성화된 단백질(MAP) 키나제, 포스포티딜이노시톨-3-키나제(PI3K) AKT, 및 상피 성장 인자(EGF) 수용체는 암세포에서 통상적으로 활성화되며 종양형성에 기여하는 것으로 공지되어 있다. 논리적으로, 다수의 키나제 억제제들, 특히 타이로신 키나제 억제제(TKI): 사이클린-의존성 키나제 억제제, 오로라 키나제 억제제, 세포 주기 체크포인트 억제제, 상피 성장 인자 수용체(EGFR) 억제제, FMS-유사 타이로신 키나제 억제제, 혈소판-유래된 성장 인자 수용체(PDGFR) 억제제, 키나제 삽입 도메인 억제제, PI3K/Akt/mTOR 경로를 표적화하는 억제제, Ras-Raf-MEK-ERK(ERK) 경로를 표적화하는 억제제, 혈관 내피 성장 인자 수용체(VEGFR) 키나제 억제제, c-키트 억제제 및 세린/쓰레오닌 키나제 억제제가 현재 항암 요법을 위해 개발 중에 있다. 다수의 키나제 억제제들, 예를 들어 MK0457, VX-680, ZD6474, MLN8054, AZD2171, SNS-032, PTK787/ZK222584, 소라페니브(Sorafenib)(BAY43-9006), SU5416, SU6668 AMG706, 작티마(Zactima)(ZD6474), MP-412, 다사티니브(Dasatinib), CEP-701, (레스타우르티니브(Lestaurtinib)), XL647, XL999, 타이커브(Tykerb), (라파티니브(Lapatinib)), MLN518(이전에 CT53518로서 공지됨), PKC412, ST1571, AMN107, AEE 788, OSI-930, OSI-817, 수니티니브 말레이트(Sunitinib malate)(슈텐트(Sutent); SU11248), 바탈라니브(Vatalanib)(PTK787/ZK 222584), SNS-032, SNS-314 및 악시티니브(Axitinib)(AG-013736)를 포함하는 억제제들이 항암 요법에 사용하기 위해서 임상 연구에서 조사되었다. 제피티니브 및 에를로니티브는 2 개의 경구 이용 가능한 EGFR-TKI이다.
탐색된 면역 조절제들은 전형적으로는 환자에게, 예를 들어 경구 투여, 정맥내 주사 또는 주입, 또는 근육내 주사에 의해 전신적으로 투여된다. 상기 면역 조절제들 중 일부의 유효 사용을 제한하는 한 가지 주요 인자는 투여되는 작용제에 대한 높은 전신 노출에 의해 야기되는 독성이다. 예를 들어, CD40 작용물질에 관하여, 0.3 ㎎/㎏이 예시된 작용물질 CD40 항체에 최대로 허용되는 용량이며 보다 더 높은 용량은 정맥혈전색전증, 3급 두통, 한기 등과 같은 독성 효과를 생성시키는 사이토킨 방출, 및 일시적인 간 독성을 포함한 부작용들을 이끌어낼 수 있음이 보고되었다(문헌[Vanderheide et al., J Clin. Oncol. 25(7): 876-8833 (March 2007)]). 전이성 신세포 암종이 있는 환자에서 정맥내 트레멜리뮤맵(항-CTLA-4 항체) + 경구 수니티니브의 조합을 조사하기 위한 임상 시험에서, 신부전의 빠른 발병이 관찰되었으며, 그 결과 하루에 6 ㎎/㎏ 초과 용량의 트레멜리뮤맵 + 37.5 ㎎의 수니티니브의 추가적인 조사는 권장되지 않았다. 문헌[Brian I. Rini et al.: Phase 1 Dose-Escalation Trial of Tremelimumab Plus Sunitinib in Patients With Metastatic Renal Cell Carcinoma. Cancer 117(4):758-767 (2011)]을 참조하시오.
따라서, 간독성 또는 신부전과 같은 심한 부작용을 이끌어내지 않는 유효 용량으로 면역 조절제를 투여하는 백신-기재 면역치료 요법이 필요하다.
일부의 태양에서, 본원은, 예를 들어 생체내(예를 들어 인간을 포함한 동물내) 또는 시험관내에서 면역 반응을 유도하여 항체를 생성시키기에 유용하거나, 또는 전립선암을 포함한 암의 치료를 위한 백신 중 하나의 성분으로서 사용하기에 유용한, 단리된 면역원성 PSMA 폴리펩타이드 및 면역원성 PSA 폴리펩타이드를 제공한다. 하나의 태양에서, 본원은 서열번호 1의 인간 PSMA의 아미노산 15 - 750에 대해 90% 이상의 일치성을 갖고 상응하는 위치에서 상기 인간 PSMA의 보존된 T 세포 에피토프의 10, 11, 12, 13 ,14, 15, 16, 17, 18, 또는 19 이상의 아미노산을 포함하는 단리된 면역원성 PSMA 폴리펩타이드를 제공한다.
다른 태양에서, 본원은 면역원성 P 아미노산 폴리펩타이드를 암호화하는 핵산 분자를 제공한다. 일부 실시태양에서, 본원은 본원에 의해 제공된, 면역원성 PSMA 폴리펩타이드 또는 상기 폴리펩타이드의 작용성 변체를 암호화하는 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 단리된 핵산 분자 또는 그의 축퇴성 변이체를 제공한다.
일부 다른 태양에서, 본원은 각각 2 개 이상의 면역원성 P 아미노산 폴리펩타이드를 암호화하는 다중-항원 핵산 구축물을 제공한다.
본원은 또한 본 발명의 하나 이상의 핵산 분자를 함유하는 벡터를 제공한다. 상기 벡터는 상기 핵산 분자에 의해 암호화된 면역원성 P 아미노산 폴리펩타이드의 클로닝 또는 발현, 또는 조성물, 예를 들어 백신 중의 상기 핵산 분자의 숙주 세포 또는 숙주 동물, 예를 들어 인간으로의 전달에 유용하다.
일부 추가의 태양에서, 본원은 하나 이상의 면역원성 P 아미노산 폴리펩타이드, 면역원성 P 아미노산 폴리펩타이드를 암호화하는 단리된 핵산 분자, 또는 면역원성 P 아미노산 폴리펩타이드를 암호화하는 핵산 분자를 함유하는 벡터 또는 플라스미드를 포함하는 조성물을 제공한다. 일부 실시태양에서, 상기 조성물은 포유동물, 예를 들어 마우스, 개, 원숭이 또는 인간에서 PAA에 대한 면역 반응을 이끌어내기에 유용한 면역원성 조성물이다. 일부 실시태양에서, 상기 조성물은 포유동물, 예를 들어 인간의 면역화, 비정상 세포 증식의 억제, 암 발생에 대한 보호(예방제로서 사용됨)의 제공, 또는 P 아미노산 과-발현과 관련된 질환, 예를 들어 암, 특히 전립선 암의 치료(치료제로서 사용됨)에 유용한 백신 조성물이다.
더욱 다른 태양에서, 본원은 상기 본 발명에 개시된 면역원성 P 아미노산 폴리펩타이드, 단리된 핵산 분자, 및 면역원성 P 아미노산 폴리펩타이드 또는 단리된 핵산 분자를 포함하는 조성물의 사용 방법을 제공한다. 일부 실시태양에서, 본원은 포유동물, 특히 인간에서 PAA에 대한 면역 반응을 이끌어내는 방법을 제공하며, 상기 방법은 상기 포유동물에게 유효량의, 표적 PAA에 대해 면역원성인 본 발명에 의해 제공된 폴리펩타이드, 유효량의, 상기와 같은 면역원성 폴리펩타이드를 암호화하는 단리된 핵산 분자, 또는 상기와 같은 면역원성 P 아미노산 폴리펩타이드 또는 상기와 같은 면역원성 P 아미노산 폴리펩타이드를 암호화하는 단리된 핵산 분자를 포함하는 조성물을 투여함을 포함한다. 상기 폴리펩타이드 또는 핵산 백신을 하나 이상의 항원보강제와 함께 사용할 수 있다.
더욱 다른 태양에서, 본원은 하나 이상의 면역-억제성-세포 억제제 및 하나 이상의 면역-효과기-세포 증폭자와 함께 다양한 암을 치료하기 위한 T 아미노산 특이성 면역 반응을 유도하기 위해 다양한 종양 관련된 항원(TAA)을 전달하는 백신을 병용-투여함을 포함하는 백신-기재 면역치료 요법(또는 "VBIR")을 제공한다. 구체적으로, 일부 태양에서, 본원은 포유동물에서 신생물질환의 치료를 위한 백신의 면역원성 또는 치료 효과를 증대시키는 방법을 제공하며, 상기 방법은 상기 백신을 수용하는 포유동물에게 유효량의 하나 이상의 면역-억제성-세포 억제제 및 하나 이상의 면역-효과기-세포 증폭자를 투여함을 포함한다. 추가의 태양에서, 본원은 포유동물에게, 하나 이상의 면역-억제성-세포 억제제 및 하나 이상의 면역-효과기-세포 증폭자를 투여함을 포함하는, 상기 포유동물에서 신생물 질환을 치료하는 방법을 제공한다.
도 1은 PJV7563 벡터의 개략적인 예시이다.
도 2는 5 개의 바이러스 2A 카세트의 아미노산 정렬이다. 건너뛴 글리신-프롤린 결합을 별표로 나타낸다.
도 3은 바람직한 EMCV IRES의 서열이다. 번역 개시 부위를 별표로 나타낸다. 최소 IRES 요소는 상기 EMCV L 단백질의 밑줄친 처음 5 개 코돈을 제외한다.
도 4는 유식 세포측정에 의해 측정된 바와 같은 이중 항원 백신 구축물로 형질감염된 HEK293 세포의 표면상의 인간 PSMA 변형된 항원(아미노산 15 - 750) 및 전장의 인간 PSCA의 발현을 나타내는 점 플롯이다.
도 5a 및 5b는 PSMA 및 PSCA 특이성 단클론 항체에 의한 웨스턴 블럿팅에 의해 측정된 바와 같은 이중 항원 백신 구축물로 형질감염된 HEK293 세포 중의 인간 PSMA 변형된 항원(아미노산 15 - 750) 및 전장의 인간 PSCA의 발현을 나타내는 웨스턴 블럿의 상이다.
도 6은 PSA 특이성 단클론 항체에 의한 웨스턴 블럿팅에 의해 측정된 바와 같은 이중 항원 백신 구축물로 형질감염된 HEK293 세포 중의 인간 PSA 시토솔 항원(아미노산 25-261)의 발현을 나타내는 웨스턴 블럿의 상이다. 레인 5300은, 2A 펩타이드의 C-말단 융합과 일치하는, PSA보다 약 2 kD 더 큰 희미한 밴드를 나타내었다.
도 7a 및 7b는 유식 세포측정에 의해 측정된 바와 같은 삼중 항원 백신 구축물로 형질감염된 HEK293 세포의 표면상의 인간 PSMA 변형된 항원(아미노산 15 - 750) 및 전장의 인간 PSCA의 발현을 나타내는 점 플롯이다(도 7a. 단일 항원 대조군 및 단일 프로모터 삼중 항원 구축물. 도 7b. 이중 프로모터 삼중 항원 구축물).
도 8a 및 8b는 PSA 특이성 단클론 항체에 의한 웨스턴 블럿팅에 의해 측정된 바와 같은 삼중 항원 백신 구축물로 형질감염된 HEK293 세포 중의 인간 PSA의 발현을 나타내는 웨스턴 블럿의 상이다. 레인 5259 및 456 중의 밴드들은 레인 5297로부터의 넘침이다. 스캐닝된 젤에서 볼 수는 없지만, 레인 456, 457 및 458은 2A 펩타이드의 C-말단 융합과 일치하는, PSA보다 약 2 kD 더 큰 밴드를 나타내었다. (도 8a. 단일 프로모터 삼중 항원 구축물. 도 8b. 이중 프로모터 삼중 항원 구축물).
도 9a 내지 9d는 IFN-γ ELISPOT 분석에 의해 삼중 항원 백신의 면역원성을 평가하는 전형적인 연구의 결과를 묘사하는 그래프이다.
도 10a 내지 10d는 IFN-γ ELISPOT 분석에 의해 삼중 항원 백신의 면역원성을 평가하는 전형적인 연구의 결과를 묘사하는 그래프이다.
도 11은 항-PSMA 항체 역가에 의해 삼중 항원 백신의 면역원성을 평가하는 전형적인 연구의 결과를 묘사하는 그래프이다.
도 12는 항-PSCA 항체 역가에 의해 삼중 항원 백신의 면역원성을 평가하는 전형적인 연구의 결과를 묘사하는 그래프이다.
도 13은 항-PSMA 항체 세포-표면 결합에 의해 삼중 항원 백신의 면역원성을 평가하는 전형적인 연구의 결과를 묘사하는 그래프이다.
도 14는 항-PSCA 항체 세포-표면 결합에 의해 삼중 항원 백신의 면역원성을 평가하는 전형적인 연구의 결과를 묘사하는 그래프이다.
도 15a 내지 15c는 IFN-γ ELISPOT 분석에 의해 이중 항원 백신의 면역원성을 평가하는 전형적인 연구의 결과를 묘사하는 그래프이다.
도 16a 내지 16c는 IFN-γ ELISPOT 분석에 의해 이중 항원 백신의 면역원성을 평가하는 전형적인 연구의 결과를 묘사하는 그래프이다.
도 17은 항-PSMA 항체 역가에 의해 이중 항원 백신의 면역원성을 평가하는 전형적인 연구의 결과를 묘사하는 그래프이다.
도 18은 항-PSCA 항체 역가에 의해 이중 항원 백신의 면역원성을 평가하는 전형적인 연구의 결과를 묘사하는 그래프이다.
도 19는 항-PSMA 항체 세포-표면 결합에 의해 이중 항원 백신의 면역원성을 평가하는 전형적인 연구의 결과를 묘사하는 그래프이다.
도 20은 항-PSCA 항체 세포-표면 결합에 의해 이중 항원 백신의 면역원성을 평가하는 전형적인 연구의 결과를 묘사하는 그래프이다.
도 21a 내지 21d는 IFN-γ ELISPOT 분석에 의해 이중 항원 백신의 면역원성을 평가하는 전형적인 연구의 결과를 묘사하는 그래프이다.
도 22는 항-PSMA 항체 역가에 의해 이중 항원 백신의 면역원성을 평가하는 전형적인 연구의 결과를 묘사하는 그래프이다.
도 23은 항-PSCA 항체 역가에 의해 이중 항원 백신의 면역원성을 평가하는 전형적인 연구의 결과를 묘사하는 그래프이다.
도 24는 항-PSMA 항체 세포-표면 결합에 의해 이중 항원 백신의 면역원성을 평가하는 전형적인 연구의 결과를 묘사하는 그래프이다.
도 25는 항-PSCA 항체 세포-표면 결합에 의해 이중 항원 백신의 면역원성을 평가하는 전형적인 연구의 결과를 묘사하는 그래프이다.
도 26은 C57BL/6 마우스에서 인간 PSMA 변형된 항원(아미노산 15 - 750) 대 전장의 인간 PSMA(아미노산 1 - 750)에 의해 유도된 T 세포 면역 반응을 평가하는 전형적인 연구의 결과를 묘사하는 그래프이다.
도 27a 및 27b는 IFN-γ ELISPOT 분석에 의해 파스퇴르(HLA-A2/DR1) 트랜스제닉 마우스에서 인간 PSMA 변형된 항원(아미노산 15 - 750) 대 전장의 인간 PSMA 항원(아미노산 1 - 750)의 T 세포 면역 반응을 평가하는 전형적인 연구의 결과를 묘사하는 그래프이다.
도 28은 항-PSMA 항체 역가에 의해 인간 변형된 및 전장의 PSMA 백신의 면역원성을 평가하는 전형적인 연구의 결과를 묘사하는 그래프이다.
도 29는 항-PSMA 항체 세포-표면 결합에 의해 인간 변형된 및 전장의 PSMA 백신의 면역원성을 평가하는 전형적인 연구의 결과를 묘사하는 그래프이다.
도 30은 항-CTLA-4(CP675,206) 10 ㎎/㎏이 주사된 인도 붉은털 원숭이에서 경쟁 ELISA에 의해 측정된 혈액 항-CTLA-4 단클론 항체 수준을 평가하는 전형적인 연구의 결과를 묘사하는 그래프이다.
도 31a 및 31b는 세포내 사이토킨 염색 분석에 의해, 백신 유도된 면역 반응의 질에 대한 항-쥐 CTLA-4 단클론 항체(클론 9H10)의 면역조절 활성을 평가하는 전형적인 연구의 결과를 묘사하는 그래프이다.
도 32는 단독요법으로서 또는 대조용(대조군) 또는 암 백신(rHER2)과 함께 수니티니브 말레이트(슈텐트)로 처리시 피하 종양 성장률을 평가하고 비교하는 전형적인 연구의 결과를 묘사하는 그래프이다.
도 33a 내지 33d는 대조용(대조군) 또는 암 백신(rHER2)과 함께 수니티니브 말레이트(슈텐트) 20 ㎎/㎏의 종양-억제 효능을 평가하고 비교하는 전형적인 연구로부터 마우스의 개별적인 종양 성장률을 나타내는 그래프이다.
도 34는 대조용(대조군) 또는 암 백신(암)과 함께 수니티니브 말레이트(슈텐트)로 처리된 대조용(대조군) 또는 암 백신(rHER2)과 함께 수니티니브 말레이트(슈텐트)의 종양-억제 효능을 평가하는 도 33에 개시된 연구로부터의 마우스 군들의 카플란-마이어 생존 곡선을 나타내는 그래프이다.
도 35a 및 35b는 도 33에서 처리된 마우스로부터의 말초 혈액 중 골수 유래된 억제인자 세포(Gr1+CD11b+) 및 CD25+CD4+ 세포를 함유하는 Treg의 변화를 나타내는 그래프이다.
도 36a 내지 36c는 마우스의 종양으로부터 단리된 골수 유래된 억제인자 세포(Gr1+CD11b+), Treg(CD4+CD25+Foxp3+), 및 PD-1+ CD8 T 세포의 총수의 변화를 나타내는 그래프이다.
도 37은 피하 TUBO 종양 함유 BALB/neuT 마우스에서 대조용(대조군) 또는 암 백신(백신)과 함께 수니티니브 말레이트(슈텐트) 및 항-쥐 CTLA-4 단클론 항체(클론 9D9)의 종양-억제 효능을 평가하는 전형적인 연구로부터의 마우스 군들의 카플란-마이어 생존 곡선을 나타내는 그래프이다.
도 38은 피하 TUBO 종양을 갖는 BALB/neuT 마우스의 혈중 수니티니브 수준의 동역학을 나타내는 그래프이다.
도 39는 수니티니브 말레이트(슈텐트) 및 대조용 또는 암 백신이 투여된 피하 TUBO 종양을 갖는 BALB/neuT 마우스의 종양-억제 효능을 평가하는 전형적인 연구로부터의 마우스 군들의 카플란-마이어 생존 곡선을 나타내는 그래프이다.
도 40은 면역 조절제와 함께 제공시 rHER2 백신에 의해 유도된 항원 특이성 T 세포 반응의 크기를 평가하는 전형적인 연구로부터의 마우스 군들의 IFNγ ELISPOT 결과를 묘사하는 그래프이다.
도 41a 및 41b는 세포내 사이토킨 염색 분석에 의해, 백신 유도된 면역 반응의 질에 대한 CpG7909(PF-03512676)의 면역조절 활성을 평가하는 전형적인 연구의 결과를 묘사하는 그래프이다.
도 42a 및 42b는 세포내 사이토킨 염색 분석에 의해, 백신 유도된 면역 반응의 질에 대한 작용성 항-쥐 CD40 단클론 항체의 면역조절 활성을 평가하는 전형적인 연구의 결과를 묘사하는 그래프이다.
도 43은 자발적인 유방 종양 함유 BALB/neuT 마우스에서 낮은 용량의 수니티니브 말레이트(슈텐트) 및 대조용 또는 암 백신의 종양-억제 효능을 평가하는 전형적인 연구로부터의 마우스 군들의 카플란-마이어 생존 곡선을 나타내는 그래프이다.
A. 정의
"항원보강제"란 용어는 백신 면역원과 함께 제공시 면역 반응을 증대시키거나, 촉진하거나 또는 연장시킬 수 있는 물질을 지칭한다.
"작용물질"이란 용어는 또 다른 분자 또는 수용체의 활성을 촉진(유도, 유발, 증대 또는 증가)시키는 물질이다. 작용물질이란 용어는 수용체(예를 들어 항체, 또 다른 종으로부터의 천연 리간드의 동족체)와 결합하는 물질 및 결합 없이 수용체 작용을 촉진하는(예를 들어 회합된 단백질을 활성화시킴으로써) 물질을 포함한다.
"길항물질" 또는 "억제제"란 용어는 또 다른 분자 또는 수용체의 생물 활성을 부분적으로 또는 완전히 차단하거나, 억제하거나 또는 중화시키는 물질을 지칭한다.
"병용-투여"란 용어는 치료 기간 동안 동일한 환자에게 2 개 이상의 작용제를 투여함을 지칭한다. 상기 2 개 이상의 작용제는 단일 제형 중에 포함되고 따라서 동시에 투여될 수 있다. 한편으로, 상기 2 개 이상의 작용제는 별도의 물리적 제형 중에 존재하여 환자에게 별도로, 연속적으로 또는 동시에 투여될 수 있다. "동시에 투여되는" 또는 "동시 투여"란 용어는 제 1 작용제의 투여와 제 2 작용제의 투여가 서로 시간이 겹침을 의미하는 반면, "연속적으로 투여되는" 또는 "연속 투여는" 상기 제 1 작용제의 투여와 제 2 작용제의 투여가 서로 시간이 겹치지 않음을 의미한다.
"보존된 T 세포 에피토프"란 용어는 서열번호 1에 설명된 바와 같은 인간 PSMA 단백질의 하기 아미노산 서열들 중 하나를 지칭한다:
아미노산 168-176 (GMPEGDLVY),
아미노산 347-356 (HSTNGVTRIY),
아미노산 557-566 (ETYELVEKFY),
아미노산 207-215 (KVFRGNKVK),
아미노산 431-440 (STEWAEENSR),
아미노산 4-12 (LLHETDSAV),
아미노산 27-35 (VLAGGFFLL),
아미노산 168-177 (GMPEGDLVYV),
아미노산 441-450 (LLQERGVAYI),
아미노산 469-477 (LMYSLVHNL),
아미노산 711-719 (ALFDIESKV),
아미노산 663-671 (MNDQVMFL),
아미노산 178-186 (NYARTEDFF),
아미노산 227-235 (LYSDPADYF),
아미노산 624-632 (TYSVSFDSL),
아미노산 334-348 (TGNFSTQKVKMHIHS),
아미노산 459-473 (NYTLRVDCTPLMYSL),
아미노산 687-701 (YRHVIYAPSSHNKYA), 및
아미노산 730-744 (RQIYVAAFTVQAAAE).
"시토솔"이란 용어는 특정 폴리펩타이드를 암호화하는 뉴클레오타이드 서열이 숙주 세포에 의해 발현된 후, 상기 발현된 폴리펩타이드가 상기 숙주 세포 내부에 유지됨을 의미한다.
"축퇴성 변이체"란 용어는 염기의 치환을 갖지만 동일한 폴리펩타이드를 암호화하는 DNA 서열을 지칭한다.
"유효량"이란 용어는 포유동물에서 목적하는 효과를 유발시키기에 충분한, 상기 포유동물에게 투여되는 양을 지칭한다.
주어진 폴리펩타이드의 "단편"이란 용어는 상기 주어진 폴리펩타이드보다 더 짧고 상기 주어진 폴리펩타이드의 서열과 100% 일치성을 공유하는 폴리펩타이드를 지칭한다.
2 개 이상의 핵산 또는 폴리펩타이드 서열과 관련하여 "일치하는" 또는 "일치성" 퍼센트란 용어는 최대의 대응으로 비교 및 정렬 시, 동일하거나 또는 동일한 아미노산 잔기 또는 뉴클레오타이드의 명시된 백분율을 갖는 2 개 이상의 서열 또는 하위서열을 지칭한다.
"면역-효과기-세포 증폭자" 또는 "IEC 증폭자"란 용어는 포유동물의 면역 효과기 세포의 하나 이상의 유형의 수, 성질 또는 작용을 증가시키거나 증대시킬 수 있는 물질을 지칭하다. 면역 효과기 세포의 예는 세포용해성 CD8 T 세포, CD40 T 세포, NK 세포 및 B 세포를 포함한다.
"면역 조절제"란 용어는 포유동물의 선천적인, 체액 또는 세포 면역계의 임의의 성분의 작용을 변경(예를 들어 억제, 감소, 증가, 증대 또는 자극)시킬 수 있는 물질을 지칭한다. 따라서, "면역 조절제"란 용어는 본 발명에 정의된 바와 같은 "면역-효과기-세포 증폭자" 및 본 발명에 정의된 바와 같은 "면역-억제성-세포 억제제"뿐만 아니라 포유동물의 면역계의 다른 성분들에 영향을 미치는 물질을 포함한다.
"면역 반응"이란 용어는 숙주 척추동물의 면역계에 의한 특정 물질(예를 들어 항원 또는 면역원)에 대한 임의의 검출 가능한 반응, 예를 들어 비제한적으로 선천적인 면역 반응(예를 들어 톨 수용체 신호화 캐스케이드의 활성화), 세포-매개된 면역 반응(예를 들어 T 세포, 예를 들어 항원-특이성 T 세포, 및 상기 면역계의 비-특이성 세포에 의해 매개되는 반응들), 및 체액 면역 반응(예를 들어 B 세포에 의해 매개되는 반응들, 예를 들어 혈장, 림프 및/또는 조직액내로의 항체의 생성 및 분비)을 지칭한다. 면역 반응의 예는 톨-형 수용체 활성화의 변경(예를 들어 증가), 림포카인(예를 들어 사이토킨(예를 들어 Th1, Th2 또는 Th17 유형 사이토킨) 또는 케모킨) 발현 또는 분비, 대식세포 활성화, 수지상 세포 활성화, T 세포(예를 들어 CD4+ 또는 CD8+ T 세포) 활성화, NK 세포 활성화, B 세포 활성화(예를 들어 항체 생성 및/또는 분비), MHC 분자에 대한 면역원(예를 들어 항원(예를 들어 면역원성 폴리폴리펩타이드))의 결합, 세포독성 T 림프구("CTL") 반응의 유도, B 세포 반응(예를 들어 항체 생성)의 유도, 및 상기 면역계 세포(예를 들어 T 세포 및 B 세포)의 확대(예를 들어 세포 집단의 성장), 및 항원 제공 세포에 의한 항원의 증가된 가공 및 제공을 포함한다. "면역 반응"이라는 용어는 또한 시험관내에서 척추 동물의 면역계의 하나 이상의 성분에 의한 특정 물질(예를 들어 항원 또는 면역원)에 대한 임의의 검출 가능한 반응을 포함한다.
"면역원성"이란 용어는 항원보강제의 존재 또는 부재 하에서, 단독으로든 또는 담체에 결합된 경우든, 면역 반응을 유발, 유도, 자극 또는 촉진하거나, 또는 특정한 항원에 대한 기존 면역 반응을 개선, 증대, 증가 또는 연장시키는 물질의 능력을 지칭한다.
"면역원성 PSA 폴리펩타이드"란 용어는 인간 PSA 단백질에 대해 또는 인간 PSA 단백질을 발현하는 세포에 대해 면역원성인 폴리펩타이드를 지칭한다.
"면역원성 PSCA 폴리펩타이드"란 용어는 인간 PSCA 단백질에 대해 또는 인간 PSCA 단백질을 발현하는 세포에 대해 면역원성인 폴리펩타이드를 지칭한다.
"면역원성 PSMA 폴리펩타이드"란 용어는 인간 PSMA 단백질에 대해 또는 인간 PSMA 단백질을 발현하는 세포에 대해 면역원성인 폴리펩타이드를 지칭한다.
"면역원성 P 아미노산 폴리펩타이드"란 용어는 상기 본 발명에 정의된 바와 같은 "면역원성 PSA 폴리펩타이드", "면역원성 PSCA 폴리펩타이드" 또는 "면역원성 PSMA 폴리펩타이드"를 지칭한다.
"면역원성 PSA 핵산 분자"란 용어는 본 발명에 정의된 바와 같은 면역원성 PSA 폴리펩타이드를 암호화하는 핵산 분자를 지칭한다.
"면역원성 PSCA 핵산 분자"란 용어는 본 발명에 정의된 바와 같은 면역원성 PSCA 폴리펩타이드를 암호화하는 핵산 분자를 지칭한다.
"면역원성 PSMA 핵산 분자"란 용어는 본 발명에 정의된 바와 같은 면역원성 PSMA 폴리펩타이드를 암호화하는 핵산 분자를 지칭한다.
"면역원성 P 아미노산 핵산 분자"란 용어는 상기 본 발명에 정의된 바와 같은 "면역원성 PSA 폴리펩타이드", "면역원성 PSCA 폴리펩타이드" 또는 "면역원성 PSMA 폴리펩타이드"를 암호화하는 핵산 분자를 지칭한다.
"면역-억제성-세포 억제제" 또는 "ISC 억제제"란 용어는 포유동물의 면역 억제성 세포의 수 또는 작용을 감소시키거나 억제시킬 수 있는 물질을 지칭한다. 면역 억제성 세포의 예는 조절성 T 세포("T reg"), 골수-유래된 억제제 세포, 및 종양-관련된 대식세포를 포함한다.
물질, 예를 들어 치료제 또는 면역 조절제를 인간을 포함한 포유동물에게 투여함과 관련하여, "피내 투여" 또는 "피내로 투여한다"란 용어는 상기 포유동물의 피부의 진피층내로의 상기 물질의 전달을 지칭한다. 포유동물의 피부는 3 개의 층, 즉 표피, 진피 및 피하층으로 구성된다. 상기 표피는 비교적 얇고, 질긴 피부 외층이다. 상기 표피 중 세포의 대부분은 각질세포이다. 상기 피부의 다음층인 진피는 상기 피부에 유연성과 강도를 제공하는 섬유성 탄성 조직(주로 콜라겐, 엘라스틴 및 피브릴린으로 만들어짐)의 두꺼운 층이다. 상기 진피는 신경 단부, 땀샘 및 오일(지방)샘, 모낭 및 혈관을 함유한다. 상기 진피는 상기 피부의 위치에 따라 두께가 다양하다. 인간에서, 상기 진피는 눈꺼풀에서 약 0.3 ㎜이고 등에서는 약 3.0 ㎜이다. 상기 피하층은 보다 큰 혈관 및 신경을 수용하는 지방 및 결합 조직으로 구성된다. 상기 층의 두께는 전신을 통해 다양하며 사람마다 다르다. "피내 투여"란 용어는 물질의 상기 진피층 내부로의 전달을 지칭한다. 대조적으로, "피하 투여"는 물질의 상기 피하층내로의 투여를 지칭하고, "국소 투여"는 물질의 상기 피부 표면상으로의 투여를 지칭한다.
"국소 투여" 또는 "국소로 투여된"이란 용어는, 각각 상기 본 발명에 정의된 바와 같은 "국소 투여", "피내 투여" 및 "피하 투여"를 포함한다. 상기 용어는 또한 "종양내 투여"를 포함하며, 상기 투여는 물질의 종양 내부로의 투여를 지칭한다. 국소 투여는 투여된 물질에 의해 전신적인 생체내분포가 성취될 때까지의 기간 동안 투여 부위 주변에 높은 국소 농도를 허용함을 의미하는 반면, "전신 투여"는 투여된 물질이 순환계를 통해 신체 전체에 기관 또는 조직으로 분배됨으로써 빠르게 혈액 내로 흡수되고 전신 노출이 획득됨을 의미한다.
"포유동물"이란 용어는 포유동물 강의 임의의 동물 종을 지칭한다. 포유동물의 예는 인간; 비인간 영장류, 예를 들어 원숭이; 실험용 동물, 예를 들어 래트, 마우스, 기니 피그; 가축용 동물, 예를 들어 고양이, 개, 토끼, 소, 양, 염소, 말 및 돼지; 및 감금된 야생 동물, 예를 들어 사자, 호랑이, 코끼리 등을 포함한다.
"막-결합된"이란 용어는 특정 폴리펩타이드를 암호화하는 뉴클레오타이드 서열이 숙주 세포에 의해 발현된 후에, 상기 발현된 폴리펩타이드가 상기 세포의 막에 결합되거나, 부착되거나, 또는 달리 관련됨을 의미한다.
"신생물 질환"이란 용어는 세포가 비정상적으로 높고 조절되지 않는 속도로 증식하는 상태를 지칭하며, 이때 상기 속도는 주변 정상 조직의 경우를 능가하고 상기 조직과 조화되지 않는다. 그 결과, 대개는 "종양"으로서 공지된 고형 병변 또는 덩어리가 생성된다. 상기 용어는 양성 및 악성 신생물 질환을 포함한다. "악성 신생물 질환"이란 용어는 본원에서 "암"이란 용어와 호환적으로 사용되며, 신체내 다른 장소로 종양 세포를 확산시키는 능력("전이"로서 공지됨)을 특징으로 하는 신생물 질환을 지칭한다. "양성 신생물 질환"이란 용어는 종양 세포가 전이하는 능력이 없는 신생물 질환을 지칭한다.
"작동적으로 결합된"이란 용어는 그렇게 개시된 성분들이 그들의 의도된 방식으로 작용하도록 허용되는 관계로 놓이는 병렬을 지칭한다. 트랜스유전자에 "작동적으로 결합된" 조절 서열은 상기 트랜스유전자의 발현이 상기 조절 서열과 양립성인 조건 하에서 성취되도록 하는 방식으로 연결된다.
"오솔로그"란 용어는 서로 유사하고 공통의 조상으로부터 기원하는 상이한 종들의 유전자를 지칭한다.
"약학적으로 허용 가능한 부형제"란 용어는 활성 성분(예를 들어 항원, 항원-암호화 핵산, 면역 조절제 또는 항원보강제)과 상용성이고 상기 부형제가 투여된 환자에서 현저한 부적합한 효과를 유발하지 않는 상기 활성 성분 이외의, 면역원성 또는 백신 조성물 중의 물질을 지칭한다.
"펩타이드", "폴리펩타이드" 및 "단백질"이란 용어는 본 발명에서 호환적으로 사용되며, 암호화된 및 비암호화된 아미노산, 화학적으로 또는 생화학적으로 변형된 또는 유도체화된 아미노산, 및 변형된 폴리펩타이드 주쇄를 갖는 폴리펩타이드를 지칭한다.
"예방하는" 또는 "예방하다"란 용어는 (a) 질환이 발생하는 것을 막거나 또는 (b) 질환의 발병 또는 질환의 증상의 개시를 지연시킴을 지칭한다.
"전립선-관련된-항원"(또는 PAA)이란 용어는 전립선 종양 세포상에서 특이적으로 발현되거나 또는 동일한 조직 유형의 비-종양 세포에 의한 경우보다 종양 세포에 의해 더 높은 빈도 또는 밀도로 발현되는 TAA(본 발명에서 정의된 바와 같은)를 지칭한다. PAA의 예는 PSA, PSCA 및 PSMA를 포함한다.
폴리펩타이드와 관련하여 "분비된"이란 용어는 상기 폴리펩타이드를 암호화하는 뉴클레오타이드 서열이 숙주 세포에 의해 발현된 후에, 상기 발현된 폴리펩타이드가 상기 숙주 세포의 외부로 분비됨을 의미한다.
"최적이하 용량"이란 용어는 면역 조절제, 예를 들어 단백질 키나제 억제제의 양을 개시하는데 사용될 때, 상기 면역 조절제가 단독으로 환자에게 투여될 때 치료되는 질병에 목적하는 치료 효과를 생성시키는데 필요한 최소량 이하인 상기 면역 조절제의 용량을 지칭한다.
"치료하는", "치료" 또는 "치료하다"란 용어는 질환을 없애거나, 질환의 중증도를 감소시키거나, 또는 질환의 증상의 중증도 또는 발생 빈도를 감소시킴을 지칭한다.
"종양-관련된 항원" 또는 "TAA"란 용어는 종양 세포에 의해 특이적으로 발현되거나 또는 동일한 조직 유형의 비-종양 세포에 의해서보다는 종양 세포에 의해 더 높은 빈도 또는 밀도로 발현되는 항원을 지칭한다. 종양-관련된 항원은 숙주에 의해 정상적으로 발현되지 않는 항원일 수 있거나; 상기 항원은 돌연변이되거나, 절두되거나, 잘못접히거나, 또는 상기 숙주에 의해 정상적으로 발현된 분자의 달리 비정상적인 징후일 수 있거나; 상기 항원은 정상적으로 발현되지만 비정상적으로 높은 수준으로 발현되는 분자와 일치할 수 있거나; 또는 상기 항원은 비정상적인 상황 또는 환경에서 발현될 수도 있다. 종양-관련된 항원은 예를 들어 단백질 또는 단백질 단편, 복합 탄수화물, 강글리오사이드, 합텐, 핵산, 또는 이들 또는 다른 생물 분자들의 임의의 조합일 수 있다.
"백신"이란 용어는 특정 항원에 대해 면역 반응을 이끌어내기 위해서 포유동물에게 투여하기 위한 면역원성 조성물을 지칭한다.
주어진 폴리펩타이드의 "변체"란 용어는 상기 주어진 폴리펩타이드의 아미노산 서열과 100% 미만 80% 초과의 일치성을 공유하고 상기 주어진 폴리펩타이드의 면역원성 활성 중 적어도 일부를 나타내는 폴리펩타이드를 지칭한다.
"벡터"란 용어는 외래 핵산 분자를 운반 또는 전달할 수 있는 핵산 분자를 지칭한다. 상기 용어는 발현 벡터 및 전사 벡터 모두를 포함한다. "발현 벡터"란 용어는 삽입물을 표적 세포에서 발현시킬 수 있는 벡터를 지칭하며, 일반적으로 상기 삽입물의 발현을 구동하는 조절 서열, 예를 들어 증폭자, 프로모터 및 종결자 서열을 함유한다. "전사 벡터"란 용어는 전사될 수 있지만 번역될 수는 없는 벡터를 지칭한다. 전사 벡터는 그의 삽입물을 증폭시키는데 사용된다. 상기 외래 핵산 분자를 "삽입물" 또는 "트랜스유전자"라 칭한다. 벡터는 일반적으로 삽입물 및 상기 벡터의 주쇄로서 사용되는 보다 큰 서열로 이루어진다. 벡터의 구조 또는 기원을 근거로, 주요 유형의 벡터는 플라스미드 벡터, 코스미드 벡터, 파지 벡터, 예를 들어 람다 파지, 바이러스 벡터, 예를 들어 아데노바이러스(Ad) 벡터, 및 인공 염색체를 포함한다.
B. 면역원성 전립선-관련된-항원(PAA) 폴리펩타이드
일부 태양에서, 본원은 예를 들어 생체내에서(예를 들어 인간을 포함한 동물에서) 또는 시험관내에서 면역 반응을 이끌어내거나, 효과기 T 세포를 활성화시키거나, 또는 각각 PSA 및 PSMA에 특이적인 항체를 발생시키는데 유용하거나, 또는 암, 특히 전립선암의 치료를 위한 백신 중의 성분으로서 사용하기에 유용한 단리된 면역원성 PSA 폴리펩타이드 및 PSMA 폴리펩타이드를 제공한다. 이들 폴리펩타이드는 본원에 비추어 당해 분야에 공지된 방법에 의해 제조될 수 있다. 면역 반응을 이끌어내는 상기 폴리펩타이드의 능력을 시험관내 분석 또는 생체내 분석으로 측정할 수 있다. 면역 반응을 이끌어내는 폴리펩타이드 또는 DNA 구축물의 능력을 측정하기 위한 시험관내 분석은 당해 분야에 공지되어 있다. 상기와 같은 시험관내 분석의 일례는 미국특허 제 7,387,882 호(그의 명세는 본 출원에 인용된다)에 개시된 바와 같이 T 세포 반응을 자극하는 폴리펩타이드 또는 상기 폴리펩타이드를 발현하는 핵산의 능력을 측정하는 것이다. 상기 분석 방법은 (1) 배양물 중의 항원 제공 세포를 항원과 접촉시키고 이에 의해 상기 항원을 상기 항원 제공 세포에 의해 흡수 및 가공하여, 하나 이상의 가공된 항원을 생성시키고; (2) 상기 항원 제공 세포를, T 세포가 상기 가공된 항원 중 하나 이상에 반응하기에 충분한 조건 하에서 상기 T 세포와 접촉시키고; (3) 상기 T 세포가 상기 가공된 항원 중 하나 이상에 반응하는지의 여부를 측정하는 단계들을 포함한다. 상기 사용된 T 세포는 CD8+ T 세포 또는 CD4+ T 세포일 수 있다. T 세포 반응을, 사이토킨, 예를 들어 인터페론-감마 및 인터류킨-2 중 하나 이상의 방출, 상기 항원 제공 세포(종양 세포)의 용해, 및 B 세포에 의한 항체의 생산을 측정함으로써 측정할 수 있다.
B-1. 면역원성 PSMA 폴리펩타이드
하나의 태양에서, 본원은 서열번호 1의 인간 PSMA의 아미노산 15 - 750에 90% 이상의 일치성을 갖고 상응하는 위치에서 상기 인간 PSMA의 보존된 T 세포 에피토프의 10, 11, 12, 13 ,14, 15, 16, 17, 18, 또는 19 이상의 아미노산을 포함하는 단리된 면역원성 PSMA 폴리펩타이드를 제공한다.
일부 실시태양에서, 상기 면역원성 PSMA 폴리펩타이드는 상기 인간 PSMA의 보존된 T 세포 에피토프의 15, 16, 17, 18 또는 19 이상을 포함한다.
일부 실시태양에서, 본원은 서열번호 9의 아미노산 서열로 이루어지는 면역원성 PSMA 폴리펩타이드, 또는 서열번호 9의 아미노산 서열에 93% 내지 99%, 94% 내지 98%, 또는 94% 내지 97% 일치성을 갖는 면역원성 PSMA 폴리펩타이드를 제공한다.
일부 특정한 면역원성 PSMA 폴리펩타이드의 예는 하기를 포함한다:
1) 서열번호 1의 아미노산 15 - 750으로 이루어지는 폴리펩타이드;
2) 서열번호 3의 아미노산 4 - 739를 포함하는 폴리펩타이드;
3) 서열번호 5의 아미노산 4 - 739를 포함하는 폴리펩타이드;
4) 서열번호 7의 아미노산 4 - 739를 포함하는 폴리펩타이드;
2) 서열번호 3의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩타이드;
3) 서열번호 5의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩타이드; 및
4) 서열번호 7의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩타이드.
다른 실시태양에서, 본원은 하기로 이루어진 군 중에서 선택된 면역원성 PSMA 폴리펩타이드를 제공한다:
1) 서열번호 11의 아미노산 서열로 이루어지는 폴리펩타이드;
2) 서열번호 13의 아미노산 서열로 이루어지는 폴리펩타이드; 및
3) 서열번호 13의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩타이드.
일부 다른 실시태양에서, 본원은 하기 폴리펩타이드 중 어느 하나의 변체인 단리된 면역원성 PSMA 폴리펩타이드를 제공하며:
2) 서열번호 3의 아미노산 4 - 739를 포함하는 폴리펩타이드;
3) 서열번호 5의 아미노산 4 - 739를 포함하는 폴리펩타이드; 및
4) 서열번호 7의 아미노산 4 - 739를 포함하는 폴리펩타이드,
여기에서 상기 변체의 아미노산 서열은 서열번호 1의 서열에 93% 내지 99% 일치성을 가지며 서열번호 3, 5 또는 7의 아미노산 서열과 80% 이상, 85% 이상, 90% 이상, 95% 이상, 또는 99% 이상의 일치성을 공유한다.
주어진 P 아미노산 폴리펩타이드의 변체를, 모 면역원성 P 아미노산 폴리펩타이드 중의 하나 이상의 아미노산을 결실, 삽입 또는 치환시킴으로써 수득할 수 있다. 상기와 같은 변체의 생성에 대한 일례는 상기 폴리펩타이드의 개별적인 아미노산의 보존적 치환, 즉 하나의 아미노산을 유사한 성질을 갖는 또 다른 것에 대해 치환시킴에 의한 치환이다.
본 발명의 면역원성 PSMA 폴리펩타이드를, 서열번호 1의 인간 PSMA의 보존된 T 세포 에피토프 중 일부 또는 전부를 보존시키면서 상기 인간 PSMA의 나머지 영역 중 몇몇 아미노산을 상응하는 위치에서 인간 PSMA의 하나 이상의 오솔로그에서 발견되는 아미노산으로 치환시킴으로써 제작할 수 있다. 상기 면역원성 PSMA 폴리펩타이드의 제조에 사용될 수 있는 다양한 PSMA 오솔로그의 서열은 진뱅크(GeneBank) 데이터베이스로부터 입수할 수 있다. 이들 오솔로그를 그들의 NCBI ID 번호와 함께 표 18에 제공한다. 인간 PSMA의 아미노산의, 상기 오솔로그 중 하나 이상으로부터의 아미노산에 의한 치환은 보존적 치환 또는 비-보존적 치환이거나 또는 이 둘 모두일 수 있으며, 당해 분야에 공지된 다수의 인자들, 예를 들어 성취하고자 하는데 필요한 일탈, MHC 결합, 치환 부위에서 오솔로그 아미노산의 존재, 표면 노출, 및 최적의 가공 및 제공을 위한 단백질의 3-D 구조의 유지를 기준으로 선택될 수 있다.
B-2. 면역원성 PSA 폴리펩타이드
또 다른 태양에서, 본원은 단리된 면역원성 PSA 폴리펩타이드를 제공한다. 하나의 실시태양에서, 상기 단리된 면역원성 PSA 폴리펩타이드는 서열번호 15의 아미노산 서열 또는 서열번호 15의 아미노산 4 - 263으로 이루어진 폴리펩타이드 또는 그의 변체이다. 또 다른 실시태양에서, 상기 단리된 면역원성 PSA 폴리펩타이드는 서열번호 17의 아미노산 서열 또는 서열번호 17의 아미노산 4 - 240으로 이루어진 폴리펩타이드 또는 그의 변체이다. 추가의 실시태양에서, 상기 단리된 면역원성 PSA 폴리펩타이드는 서열번호 19의 아미노산 서열 또는 서열번호 19의 아미노산 4 - 281로 이루어진 폴리펩타이드 또는 그의 변체이다.
C. 면역원성 P 아미노산 폴리펩타이드를 암호화하는 핵산 분자
일부 태양에서, 본원은 면역원성 P 아미노산 폴리펩타이드를 암호화하는 핵산 분자를 제공한다. 상기 핵산 분자는 데옥시리보뉴클레오타이드(DNA) 또는 리보뉴클레오타이드(RNA)일 수 있다. 따라서, 핵산 분자는 본 발명에 개시된 뉴클레오타이드 서열을 포함할 수 있으며, 상기 서열에서 티미딘(T)은 또한 유라실(U)일 수 있고, 이는 DNA와 RNA의 화학 구조간의 차이를 반영한다. 상기 핵산 분자는 변형된 형태, 단일 또는 이중 가닥 형태, 또는 선형 또는 환상 형태일 수 있다. 상기 핵산 분자를 본원에 비추어 당해 분야에 공지된 방법을 사용하여 제조할 수 있다.
C-1. 면역원성 PSMA 폴리펩타이드를 암호화하는 핵산 분자
하나의 태양에서, 본원은 본원에 의해 제공된 면역원성 PSMA 폴리펩타이드 또는 그의 작용성 변체를 포함하여, 상기 면역원성 PSMA 폴리펩타이드를 암호화하는 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 단리된 핵산 분자 또는 그의 축퇴성 변이체를 제공한다.
일부 실시태양에서, 상기 뉴클레오타이드 서열은 막-결합된 면역원성 PSMA 폴리펩타이드를 암호화한다. 일부 특정한 실시태양에서, 상기 단리된 핵산 분자는 하기로 이루어진 군 중에서 선택된 뉴클레오타이드 서열 또는 그의 축퇴성 변이체를 포함한다:
1) 서열번호 9의 아미노산 서열을 암호화하는 뉴클레오타이드 서열;
2) 서열번호 3의 아미노산 4 - 739를 암호화하는 뉴클레오타이드 서열;
3) 서열번호 5의 아미노산 4 - 739를 암호화하는 뉴클레오타이드 서열; 및
4) 서열번호 7의 아미노산 4 - 739를 암호화하는 뉴클레오타이드 서열.
일부 다른 특정한 실시태양들에서, 상기 뉴클레오타이드 서열은 서열번호 3, 서열번호 5, 서열번호 7 또는 서열번호 9의 면역원성 PSMA 폴리펩타이드의 변체를 암호화하며, 여기에서 상기 변체는 (a) 서열번호 1의 아미노산 서열과 93% 내지 99%의 일치성 및 (b) 서열번호 3, 5 또는 7의 아미노산 서열과 80% 이상, 85% 이상, 90% 이상, 95% 이상 또는 99% 이상의 일치성을 갖는 아미노산 서열을 갖는다.
여전히 일부 다른 특정한 실시태양들에서, 상기 단리된 핵산 분자는 하기로 이루어진 군 중에서 선택된 뉴클레오타이드 서열 또는 그의 축퇴성 변이체를 포함한다:
1) 서열번호 4의 뉴클레오타이드 10 - 2217을 포함하는 뉴클레오타이드 서열;
2) 서열번호 6의 뉴클레오타이드 10 - 2217을 포함하는 뉴클레오타이드 서열;
3) 서열번호 8의 뉴클레오타이드 10 - 2217을 포함하는 뉴클레오타이드 서열; 및
4) 서열번호 10의 뉴클레오타이드 10 - 2217을 포함하는 뉴클레오타이드 서열.
C-2. 면역원성 PSA 폴리펩타이드를 암호화하는 핵산 분자
또 다른 태양에서, 본원은 본원에 의해 제공된 면역원성 PSA 폴리펩타이드를 포함하여, 상기 면역원성 PSA 폴리펩타이드를 암호화하는 단리된 핵산 분자 또는 그의 축퇴성 변이체를 제공한다.
일부 실시태양에서, 상기 단리된 핵산 분자는 시토솔 면역원성 PSA 폴리펩타이드를 암호화하는 뉴클레오타이드 서열을 포함하거나 상기 서열로 이루어진다. 하나의 실시태양에서, 상기 뉴클레오타이드 서열은 서열번호 17의 연속적인 아미노산 잔기 4 - 240으로 이루어진 시토솔 면역원성 PSA 폴리펩타이드를 암호화한다. 또 다른 실시태양에서, 상기 뉴클레오타이드 서열은 서열번호 17의 아미노산 서열을 포함하는 시토솔 면역원성 PSA 폴리펩타이드를 암호화한다. 더욱 또 다른 실시태양에서, 상기 뉴클레오타이드 서열은 서열번호 17의 아미노산 서열로 이루어진 시토솔 면역원성 PSA 폴리펩타이드를 암호화한다. 더욱 또 다른 실시태양에서, 상기 뉴클레오타이드 서열은 상기 본 발명에 제공된 상기 시토솔 면역원성 폴리펩타이드들 중 어느 하나의 작용성 변체를 암호화한다.
일부 다른 실시태양들에서, 상기 단리된 핵산 분자는 막-결합된 면역원성 PSA 폴리펩타이드를 암호화하는 뉴클레오타이드 서열을 포함한다. 하나의 실시태양에서, 상기 뉴클레오타이드 서열은 서열번호 19의 연속적인 아미노산 잔기 4 - 281을 포함하는 막-결합된 면역원성 PSA 폴리펩타이드를 암호화한다. 또 다른 실시태양에서, 상기 뉴클레오타이드 서열은 서열번호 19의 아미노산 서열을 포함하는 막-결합된 면역원성 PSA 폴리펩타이드를 암호화한다. 더욱 또 다른 실시태양에서, 상기 뉴클레오타이드 서열은 서열번호 19의 아미노산 서열로 이루어진 막-결합된 면역원성 PSA 폴리펩타이드를 암호화한다. 더욱 또 다른 실시태양에서, 상기 뉴클레오타이드 서열은 상기 본 발명에 제공된 상기 막-결합된 면역원성 PSA 폴리펩타이드들 중 어느 하나의 작용성 변체를 암호화한다.
본원에 의해 제공된 특정 핵산 분자의 예는 하기를 포함한다:
1) 서열번호 18의 뉴클레오타이드 서열로 이루어진 핵산 분자;
2) 서열번호 18의 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 핵산 분자;
3) 서열번호 20의 뉴클레오타이드 서열로 이루어진 핵산 분자;
4) 서열번호 20의 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 핵산 분자; 및
5) 상기 핵산 분자 1) 내지 4) 중 어느 하나의 축퇴성 변이체.
C-3. 2 개 이상의 면역원성 P 아미노산 폴리펩타이드를 암호화하는 핵산 분자
또 다른 태양에서, 본원은 하나보다 많은 면역원성 P 아미노산 폴리펩타이드, 예를 들어 2 개 이상, 3 개 이상 또는 4 개 이상의 면역원성 P 아미노산 폴리펩타이드를 암호화하는 핵산 분자를 제공한다. 상기와 같은 핵산 분자를 또한 본원에서 "다중-항원 구축물", "다중-항원 백신" 또는 "다중-항원 플라스미드" 등으로 칭한다. 따라서, 일부 태양에서, 하나의 핵산 분자는 2 개의 암호화 뉴클레오타이드 서열을 지니며, 여기에서 상기 암호화 뉴클레오타이드 서열들은 각각 개별적인 면역원성 P 아미노산 폴리펩타이드를 발현한다. 상기와 같은 핵산 분자를 또한 본원에서 "이중 항원 구축물", "이중 항원 백신" 또는 "이중 항원 플라스미드" 등으로 칭한다. 일부 다른 태양에서, 하나의 핵산 분자는 3 개의 암호화 뉴클레오타이드 서열을 지니며, 여기에서 상기 암호화 뉴클레오타이드 서열들은 각각 개별적인 면역원성 P 아미노산 폴리펩타이드를 발현한다. 상기와 같은 핵산 분자를 또한 본원에서 "삼중 항원 구축물", "삼중 항원 백신" 또는 "삼중 항원 플라스미드"라 칭한다. 다중-항원 구축물에 의해 암호화된 상기 개별적인 P 아미노산 폴리펩타이드들은 동일한 항원, 예를 들어 PSMA, PSA 또는 PSCA에 대해 면역원성일 수 있다. 다중-항원 구축물에 의해 암호화된 상기 개별적인 P 아미노산 폴리펩타이드는 상이한 항원에 대해 면역원성일 수 있다, 예를 들어 하나의 P 아미노산 폴리펩타이드는 PSMA 폴리펩타이드이고 또 다른 하나는 PSA 폴리펩타이드이다. 구체적으로, 하나의 다중-항원 구축물은 하기의 조합들 중 어느 하나로 2 개 이상의 면역원성 P 아미노산 폴리펩타이드를 암호화할 수 있다:
1) 하나 이상의 면역원성 PSMA 폴리펩타이드 및 하나 이상의 면역원성 PSA 폴리펩타이드;
2) 하나 이상의 면역원성 PSMA 폴리펩타이드 및 하나 이상의 PSCA 폴리펩타이드;
3) 하나 이상의 면역원성 PSA 폴리펩타이드 및 하나 이상의 PSCA 폴리펩타이드; 및
4) 하나 이상의 면역원성 PSMA 폴리펩타이드, 하나 이상의 면역원성 PSA 폴리펩타이드 및 하나 이상의 PSCA 폴리펩타이드.
다중-항원 구축물에 의해 암호화된 상기 면역원성 PSMA 폴리펩타이드는 시토솔이거나, 분비되거나, 또는 막-결합될 수 있지만, 바람직하게는 막-결합될 수 있다. 유사하게, 다중-항원 구축물에 의해 암호화된 상기 면역원성 PSA 폴리펩타이드는 시토솔이거나, 분비되거나 또는 막-결합될 수 있지만, 바람직하게는 시토솔이다.
일부 실시태양에서, 본원은 하나 이상의 막-결합된 면역원성 PSMA 폴리펩타이드 및 하나 이상의 막-결합된 PSA 폴리펩타이드를 암호화하는 다중-항원 구축물을 제공한다.
일부 다른 실시태양들에서, 본원은 하나 이상의 막-결합된 면역원성 PSMA 폴리펩타이드, 하나 이상의 시토솔 PSA 폴리펩타이드, 및 하나 이상의 PSCA 폴리펩타이드를 암호화하는 다중-항원 구축물을 제공하며, 여기에서 상기 하나 이상의 시토솔 PSA 폴리펩타이드는 서열번호 17의 아미노산 4 - 240을 포함하고 상기 하나 이상의 면역원성 PSMA 폴리펩타이드는 하기로 이루어진 군 중에서 선택된다:
1) 서열번호 1의 아미노산 15 - 750을 포함하는 폴리펩타이드;
2) 서열번호 3의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩타이드;
3) 서열번호 5의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩타이드;
4) 서열번호 7의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩타이드;
5) 서열번호 9의 아미노산 4 - 739를 포함하는 폴리펩타이드;
6) 서열번호 3의 아미노산 4 - 739를 포함하는 폴리펩타이드;
7) 서열번호 5의 아미노산 4 - 739를 포함하는 폴리펩타이드;
8) 서열번호 7의 아미노산 4 - 739를 포함하는 폴리펩타이드; 및
9) 서열번호 9의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩타이드.
일부 특정한 실시태양들에서, 본원은 면역원성 PSMA 폴리펩타이드를 암호화하는 하나 이상의 뉴클레오타이드 서열, 면역원성 PSA 폴리펩타이드를 암호화하는 하나 이상의 뉴클레오타이드 서열, 및 인간 PSCA 폴리펩타이드를 암호화하는 하나 이상의 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 다중-항원 구축물을 제공하며, 여기에서 상기 뉴클레오타이드 서열은 서열번호 17 또는 서열번호 17의 아미노산 4 - 240의 면역원성 PSA 폴리펩타이드를 암호화하고 상기 면역원성 PSMA 폴리펩타이드를 암호화하는 뉴클레오타이드 서열은 하기로 이루어진 군 중에서 선택된다:
1) 서열번호 2의 뉴클레오타이드 서열;
2) 서열번호 4의 뉴클레오타이드 서열;
3) 서열번호 6의 뉴클레오타이드 서열;
4) 서열번호 8의 뉴클레오타이드 서열;
5) 서열번호 10의 뉴클레오타이드 서열;
6) 서열번호 4의 뉴클레오타이드 10 - 2217을 포함하는 뉴클레오타이드 서열;
7) 서열번호 6의 뉴클레오타이드 10 - 2217을 포함하는 뉴클레오타이드 서열;
8) 서열번호 8의 뉴클레오타이드 10 - 2217을 포함하는 뉴클레오타이드 서열; 및
9) 서열번호 10의 뉴클레오타이드 10 - 2217을 포함하는 뉴클레오타이드 서열.
본원에 의해 제공된 특이적인 다중-항원 구축물의 예는 서열번호 23 - 36에 설명된 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 핵산 분자를 포함한다.
본원에 의해 제공된 다중-항원 구축물을 본원에 비추어 당해 분야에 공지된 다양한 기법들을 사용하여 제조할 수 있다. 예를 들어, 다중-항원 구축물을, 다수의 독립적인 프로모터들을 단일 플라스미드에 통합시킴으로써 제작할 수 있다(문헌[Huang, Y., Z. Chen, et al. (2008). "Design, construction, and characterization of a dual-promoter multigenic DNA vaccine directed against an HIV-1 subtype C/B' recombinant." J Acquir Immune Defic Syndr 47(4): 403-411]; 문헌[Xu, K., Z. Y. Ling, et al. (2011). "Broad humoral and cellular immunity elicited by a bivalent DNA vaccine encoding HA and NP genes from an H5N1 virus." Viral Immunol 24(1): 45-56]). 상기 플라스미드를, 각각의 발현 카세트가 a) 증폭자 요소의 존재 또는 부재 하에서, RNA 폴리머라제 의존적인 전사를 개시하기 위한 진핵생물 프로모터, b) 표적 항원을 암호화하는 유전자, 및 c) 전사 종결자 서열로 이루어지는, 다수의 상기 카세트를 지니도록 조작할 수 있다. 상기 플라스미드를 형질감염된 세포 핵에 전달하는 경우, 각각의 프로모터로부터 전사가 개시되어 별도의 mRNA들을 생산할 것이며, 이들은 각각 상기 표적 항원들 중 하나를 암호화한다. 상기 mRNA들은 독립적으로 번역될 것이며, 이에 의해 목적하는 항원을 생산할 것이다.
본원에 의해 제공된 다중-항원 구축물을 또한 바이러스 2A-형 폴리펩타이드의 사용을 통해 단일 벡터를 사용하여 제작할 수 있다(문헌[Szymczak, A. L. and D. A. Vignali (2005). "Development of 2A peptide-based strategies in the design of multicistronic vectors." Expert Opin Biol Ther 5(5): 627-638]; 문헌[de Felipe, P., G. A. Luke, et al. (2006). "E unum pluribus: multiple proteins from a self-processing polyprotein." Trends Biotechnol 24(2): 68-75]; 문헌[Luke, G. A., P. de Felipe, et al. (2008). "Occurrence, function and evolutionary origins of '2A-like' sequences in virus genomes." J Gen Virol 89(Pt 4): 1036-1042]; 문헌[Ibrahimi, A., G. Vande Velde, et al. (2009). "Highly efficient multicistronic lentiviral vectors with peptide 2A sequences." Hum Gene Ther 20(8): 845-860]; 문헌[Kim, J. H., S. R. Lee, et al. (2011). "High cleavage efficiency of a 2A peptide derived from porcine teschovirus-1 in human cell lines, zebrafish and mice." PLoS One 6(4): e18556]). 이들 폴리펩타이드(또한 절단 카세트 또는 CHYSEL(시스-작용 하이드롤라제 요소)이라 칭한다)는 고도로 보존된 카복시 말단 D-V/I-EXNPGP 동기와 함께 대략 20 아미노산 길이이다(도 2). 상기 카세트는 자연에서는 드물며, 가장 통상적으로는 바이러스, 예를 들어 구제역 바이러스(FMDV), 말 비염 A 바이러스(ERAV), 뇌심근염 바이러스(EMCV), 돼지 테스코바이러스(PTV), 및 토세아 어사이나(Thosea asigna) 바이러스(TAV)에서 발견된다(문헌[Luke, G. A., P. de Felipe, et al. (2008). "Occurrence, function and evolutionary origins of '2A-like' sequences in virus genomes." J Gen Virol 89(Pt 4): 1036-1042]). 2A-기재 다중-항원 발현 전략에 의해, 다중 표적 항원을 암호화하는 유전자들을, 2A 카세트에 의해 분리된 단일의 개방 판독 프레임에 함께 결합시킬 수 있다. 상기 전체 개방 판독 프레임을 단일 프로모터 및 종결자를 갖는 벡터에 클로닝시킬 수 있다. 상기 구축물을 숙주 세포에 전달시, 상기 다중 항원을 암호화하는 mRNA는 단일 다중단백질로서 전사되고 번역될 것이다. 상기 2A 카세트의 번역 중에, 리보솜은 상기 C-말단 글리신과 프롤린 사이의 결합을 생략한다. 상기 리보솜 생략은 하류 단백질로부터 상류를 떼어놓는 동시번역 자가촉매적 "절단"처럼 작용한다. 2 개 단백질 항원사이에 2A 카세트의 통합은 상류 폴리펩타이드의 C-말단상에 약 20 개 아미노산 및 하류 단백질의 N-말단에 한 개 아미노산(프롤린)의 첨가를 생성시킨다. 상기 방법론의 적응에서, 프로테아제 절단 부위를, 편재하는 프로테아제들이 상기 상류 단백질로부터 상기 2A 카세트를 절단하도록 상기 카세트의 N 말단에 통합시킬 수 있다(문헌[Fang, J., S. Yi, et al. (2007). "An antibody delivery system for regulated expression of therapeutic levels of monoclonal antibodies in vivo." Mol Ther 15(6): 1153-1159]).
본원에 의해 제공된 다중-항원 구축물을 제작하기 위한 또 다른 전략은 내부 리보솜 진입 부위, 또는 IRES의 사용을 수반한다. 내부 리보솜 진입 부위는 몇몇 RNA 분자의 5' 번역되지 않은 영역에서 발견되는 RNA 요소들(도 3)이다(문헌[Bonnal, S., C. Boutonnet, et al. (2003). "IRESdb: the Internal Ribosome Entry Site database." Nucleic Acids Res 31(1): 427-428]). 상기 부위는 진핵생물 리보솜을 상기 RNA로 유인하여 하류 개방 판독 프레임의 번역을 촉진한다. 정상적인 세포 7-메틸구아노신 캡-의존적인 번역과 달리, IRES-매개된 번역은 RNA 분자내에서 먼 AUG 코돈에서 개시될 수 있다. 다중-시스트론 발현 벡터에 사용하기 위해서 고도로 효율적인 과정을 활용할 수 있다(문헌[Bochkov, Y. A. and A. C. Palmenberg (2006). "Translational efficiency of EMCV IRES in bicistronic vectors is dependent upon IRES sequence and gene location." Biotechniques 41(3): 283-284, 286, 288]). 전형적으로, 2 개의 트랜스유전자를, 2 개의 별도의 개방 판독 프레임이 IRES에 의해 분리되므로, 프로모터와 전사 종결자 사이에서 벡터에 삽입한다. 상기 구축물을 숙주 세포에 전달시, 2 개의 트랜스유전자를 모두 암호화하는 단일의 긴 전사물이 전사될 것이다. 제 1 ORF가 상기 전통적인 캡-의존적인 방식으로 번역되어, 상기 IRES의 상류 정지 코돈에서 종결될 것이다. 제 2 ORF는 상기 IRES를 사용하여 캡-의존적인 방식으로 번역될 것이다. 이렇게 하여, 2 개의 독립적인 단백질들이 단일 발현 카세트를 갖는 벡터로부터 전사된 단일의 mRNA로부터 생산될 수 있다.
여기에서는 상기 다중-항원 발현 전략을 DNA 백신 구축물과 관련하여 개시하지만, 상기 원리를 바이러스 벡터 유전자 백신과 관련하여 유사하게 적용한다.
D. 면역원성 P 아미노산 폴리펩타이드를 암호화하는 핵산 분자를 함유하는 벡터
본 발명의 또 다른 태양은 본 발명의 하나 이상의 핵산을 함유하는 벡터에 관한 것이다. 상기 벡터는 상기 핵산 분자에 의해 암호화된 면역원성 P 아미노산 폴리펩타이드를 클로닝하거나 발현하기에, 또는 백신과 같은 조성물 중의 상기 핵산 분자를 숙주 세포 또는 숙주 동물, 예를 들어 인간에게 전달하기에 유용하다. 광범위하게 다양한 벡터들, 예를 들어 플라스미드 벡터, 코스미드 벡터, 파지 벡터 및 바이러스 벡터를 본 발명의 핵산 분자를 함유하고 발현하도록 제조할 수 있다.
일부 실시태양에서, 본원은 본 발명의 핵산 분자를 함유하는 플라스미드-기재 벡터를 제공한다. 적합한 플라스미드 벡터의 전형적인 예는 pBR325, pUC18, pSKF, pET23D, 및 pGB-2를 포함한다. 플라스미드 벡터의 다른 전형적인 예뿐만 아니라 상기와 같은 벡터의 제작 방법이 미국특허 제 5,580,859 호, 미국특허 제 5,589,466 호, 미국특허 제 5,688,688 호, 미국특허 제 5,814,482 호 및 미국특허 제 5,580,859 호에 개시되어 있다.
다른 실시태양들에서, 본 발명은 바이러스, 예를 들어 레트로바이러스, 알파바이러스, 아데노바이러스로부터 제작된 벡터를 제공한다. 레트로바이러스 벡터의 전형적인 예는 EP 0,415,731; PCT 공보 WO 90/07936; WO 91/0285, WO 9311230; WO 9310218, WO 9403622; WO 9325698; WO 9325234; 및 미국특허 제 5,219,740 호, 미국특허 제 5,716,613 호, 미국특허 제 5,851,529 호, 미국특허 제 5,591,624 호, 미국특허 제 5,716,826 호, 미국특허 제 5,716,832 호, 및 미국특허 제 5,817,491 호에 보다 상세히 개시되어 있다. 알파바이러스로부터 생성될 수 있는 벡터의 전형적인 예는 미국특허 제 5,091,309 호, 및 미국특허 제 5,217,879 호, 미국특허 제 5,843,723 호, 및 미국특허 제 5,789,245 호에 개시되어 있다. 일부 특정한 실시태양들에서, 본원은 비-인간 영장류 아데노바이러스, 예를 들어 유인원 아데노바이러스로부터 유래된 아데노바이러스 벡터를 제공한다. 상기와 같은 아데노바이러스 벡터들의 예뿐만 아니라 이들의 제조가 PCT 출원 공보 WO2005/071093 및 WO 2010/086189에 개시되어 있으며, 비-복제 벡터, 예를 들어 ChAd3, ChAd4, ChAd5, ChAd7, ChAd8, ChAd9, ChAd10, ChAd11, ChAd16, ChAd17, ChAd19, ChAd20, ChAd22, ChAd24, ChAd26, ChAd30, ChAd31, ChAd37, ChAd38, ChAd44, ChAd63, ChAd68, ChAd82, ChAd55, ChAd73, ChAd83, ChAd146, ChAd147, PanAd1, PanAd2, 및 PanAd3, 및 복제-가능 벡터, 예를 들어 Ad4 및 Ad7 벡터를 포함한다. 상기 유인원 아데노바이러스로부터 아데노바이러스 벡터의 제작에서, E1A, E1B, E2A, E2B, E3, 및 E4로부터 선택된 바이러스의 게놈 영역으로부터의 초기 유전자들 중 하나 이상을 결실 또는 돌연변이에 의해 결실시키거나, 또는 비-작용성으로 만드는 것이 바람직하다. 특정한 실시태양에서, 상기 벡터는 ChAd3 또는 ChAd68로부터 제작된다. 적합한 벡터를 또한 다른 바이러스, 예를 들어 폭스 바이러스, 예를 들어 카나리아 폭스 바이러스 또는 우두 바이러스(문헌[Fisher-Hoch et al., PNAS 86:317-321, 1989]; 문헌[Flexner et al., Ann. N.Y. Acad. Sci. 569:86-103, 1989]; 문헌[Flexner et al., Vaccine 8:17-21, 1990]; 미국특허 제 4,603,112 호, 미국특허 제 4,769,330 호 및 미국특허 제 5,017,487 호; WO 89/01973); 아데노-관련된 벡터(예를 들어 미국특허 제 5,872,005 호를 참조하시오); SV40(문헌[Mulligan et al., Nature 277:108-114, 1979]); 헤르페스(문헌[Kit, Adv. Exp. Med. Biol. 215:219-236, 1989]; 미국특허 제 5,288,641 호); 및 렌티바이러스, 예를 들어 HIV (문헌[Poznansky, J. Virol. 65:532-536, 1991])로부터 생성시킬 수 있다.
벡터의 제작 방법들은 당해 분야에 널리 공지되어 있다. 발현 벡터는 전형적으로 발현시키고자 하는 핵산 서열에 작동적으로 결합된 하나 이상의 조절 요소를 포함한다. "조절 요소"란 용어는 집합적으로, 수용 세포에서 집합적으로 암호화 서열의 복제, 전사 및 번역을 제공하는 프로모터 영역, 폴리아데닐화 신호, 전사 종결 서열, 상류 조절 도메인, 복제의 기원, 내부 리보솜 진입 부위("IRES"), 증폭자 등을 지칭한다. 선택된 암호화 서열이 적합한 숙주 세포에서 복제되고 전사되고 번역될 수 있는 한, 이들 조절 요소가 모두 항상 필요한 것은 아니다. 상기 조절 요소들을 당해 분야의 숙련가들에게 공지된 다수의 인자들, 예를 들어 특정한 숙주 세포 및 다른 벡터 성분들의 공급원 또는 구조를 기준으로 선택한다. 면역원성 P 아미노산 폴리펩타이드의 발현을 증대시키기 위해서, 코작 서열을 상기 면역원성 P 아미노산 폴리펩타이드를 암호화하는 서열의 상류에 제공할 수 있다. 척추동물의 경우, 공지된 코작 서열은 (GCC)NCCATGG이며, 여기에서 N은 A 또는 G 이고 GCC는 덜 보존된다. 사용될 수 있는 예시적인 코작 서열은 ACCAUGG 및 ACCATGG를 포함한다.
E. 면역원성 P 아미노산 폴리펩타이드를 포함하는 조성물(폴리펩타이드 조성물)
또 다른 태양에서, 본원은 본원에 의해 제공된 하나 이상의 단리된 면역원성 P 아미노산 폴리펩타이드를 포함하는 조성물("폴리펩타이드 조성물")을 제공한다. 일부 실시태양에서, 상기 폴리펩타이드 조성물은 포유동물, 예를 들어 마우스, 개, 비인간 영장류 또는 인간에서 P 아미노산 단백질에 대한 면역 반응을 이끌어내기에 유용한 면역원성 조성물이다. 일부 다른 실시태양들에서, 상기 폴리펩타이드 조성물은 포유동물, 예를 들어 인간의 면역화, 비정상적인 세포 증식의 억제, 암 발생에 대한 보호의 제공(예방제로서 사용된다) 또는 P 아미노산 과발현과 관련된 질환, 예를 들어 암, 특히 전립선암의 치료(치료제로서 사용된다)에 유용한 백신 조성물이다.
본원에 의해 제공된 폴리펩타이드 조성물은 단일 유형의 면역원성 P 아미노산 폴리펩타이드, 예를 들어 면역원성 PSMA 폴리펩타이드, 면역원성 PSA 폴리펩타이드, 또는 면역원성 PSCA 폴리펩타이드를 함유할 수 있다. 조성물은 또한 2 가지 이상의 상이한 유형의 면역원성 P 아미노산 폴리펩타이드들의 조합을 함유할 수도 있다. 예를 들어, 폴리펩타이드 조성물은 하기의 조합들 중 어느 하나의 면역원성 P 아미노산 폴리펩타이드를 함유할 수 있다:
1) 면역원성 PSMA 폴리펩타이드 및 면역원성 PSA 폴리펩타이드;
2) 면역원성 PSMA 폴리펩타이드 및 PSCA 폴리펩타이드; 또는
3) 면역원성 PSMA 폴리펩타이드, 면역원성 PSA 폴리펩타이드 및 PSCA 폴리펩타이드.
본원에 의해 제공된 면역원성 조성물 또는 백신 조성물은 약학적으로 허용 가능한 부형제를 또한 포함할 수 있다. 면역원성 또는 백신 조성물에 대해 약학적으로 허용 가능한 부형제는 당해 분야에 공지되어 있다. 적합한 부형제의 예는 생체적합헝 오일, 예를 들어 평지씨 오일, 해바라기꽃 오일, 땅콩 오일, 면실유, 호호바 오일, 스쿠알란, 스쿠알렌, 생리 식염수, 보존제 및 삼투압 조절제, 캐리어 기체, pH-조절제, 유기 용매, 소수성 작용제, 효소 억제제, 수 흡수성 중합체, 계면활성제, 흡수 촉진제, pH 개질제, 및 산화방지제를 포함한다.
조성물, 특히 면역원성 조성물 또는 백신 조성물 중의 상기 면역원성 P 아미노산 폴리펩타이드를 수용자에의 투여를 위해 담체에 결합시키거나, 접합시키거나, 또는 달리 통합시킬 수 있다. "담체"란 용어는 면역원성 폴리펩타이드가 부착되거나 또는 수용자(예를 들어 환자)에게 상기 면역원성 폴리펩타이드의 전달을 위해 달리 결합될 수 있는 물질 또는 구축물을 지칭한다. 상기 담체 자체가 면역원성일 수도 있다. 담체의 예는 면역원성 폴리펩타이드, 면역 CpG섬, 림펫 헤모시아닌(KLH), 파상풍 독소(TT), 콜레라 독소 서브유닛 B(CTB), 세균 또는 세균 고스트, 리포솜, 키토솜, 바이로솜, 미소구, 수지상 세포 등을 포함한다. 하나 이상의 면역원성 P 아미노산 폴리펩타이드 분자를 단일 담체 분자에 결합시킬 수 있다. 면역원성 폴리펩타이드를 담체에 결합시키는 방법은 당해 분야에 공지되어 있다.
본원에 의해 제공된 백신 조성물 또는 면역원성 조성물을 하나 이상의 면역 조절제 또는 항원보강제와 함께 사용할 수 있다. 상기 면역 조절제 또는 항원보강제는 상기 백신 조성물과 별도로 제형화되거나, 또는 동일한 백신 조성물 제형의 부분일 수 있다. 따라서, 하나의 실시태양에서, 상기 백신 조성물은 하나 이상의 면역 조절제 또는 항원보강제를 추가로 포함한다. 면역 조절제 및 항원보강제의 예를 하기 본 발명에 제공한다.
상기 면역원성 및 백신 조성물을 포함하여, 상기 폴리펩타이드 조성물을 임의의 적합한 투여형, 예를 들어 액체 형태(예를 들어 용액, 현탁액 또는 유화액) 및 고체 형태(예를 들어 캡슐, 정제, 또는 분말)로서, 및 당해 분야의 숙련가에게 공지된 방법에 의해 제조할 수 있다.
F. 면역원성 P 아미노산 핵산 분자를 포함하는 조성물(핵산 조성물)
본원은 또한 본원에 의해 제공된 단리된 핵산 분자 또는 벡터를 포함하는 조성물(본 발명에서 "핵산 조성물")을 제공한다. 상기 핵산 조성물은 인간을 포함한 포유동물 생체내에서 또는 시험관내에서 P 아미노산 단백질에 대한 면역 반응을 이끌어내기에 유용하다.
일부 실시태양에서, 상기 핵산 조성물은 비정상적인 세포 증식의 억제, 암 발생에 대한 보호의 제공(예방제로서 사용된다) 또는 P 아미노산 과발현과 관련된 암의 치료(치료제로서 사용된다), 또는 특정한 인간 PAA, 예를 들어 PSMA, PSA 및 PSCA에 대한 면역 반응을 이끌어내기 위해 인간에게 투여하기 위한 DNA 백신 조성물이다. 상기 조성물 중의 핵산 분자는 "네이키드(naked)" 핵산 분자, 즉 단순히 형질감염 또는 발현을 촉진하는 요소가 없는 단리된 DNA의 형태로 존재할 수 있다. 한편으로, 상기 조성물 중의 핵산 분자를 벡터에 통합시킬 수 있다.
본원에 의해 제공된 핵산 조성물은, 각각 단지 한가지 유형의 면역원성 P 아미노산 폴리펩타이드, 예를 들어 면역원성 PSMA 폴리펩타이드, 면역원성 PSA 폴리펩타이드, 또는 면역원성 PSCA 폴리펩타이드를 암호화하는 개별적인 단리된 핵산 분자를 포함할 수 있다.
핵산 조성물은 2 가지 이상의 유형의 면역원성 P 아미노산 폴리펩타이드들을 암호화하는 본원에 의해 제공된 다중-항원 구축물을 포함할 수도 있다. 다중-항원 구축물은 하기의 조합들 중 어느 하나의 2 개 이상의 면역원성 P 아미노산 폴리펩타이드를 암호화할 수 있다:
1) 면역원성 PSMA 폴리펩타이드 및 면역원성 PSA 폴리펩타이드;
2) 면역원성 PSMA 폴리펩타이드 및 면역원성 PSCA 폴리펩타이드;
3) 면역원성 PSA 폴리펩타이드 및 면역원성 PSCA 폴리펩타이드; 및
4) 면역원성 PSMA 폴리펩타이드, 면역원성 PSA 폴리펩타이드 및 면역원성 PSCA 폴리펩타이드.
상기 DNA 백신 조성물을 포함하여, 상기 핵산 조성물은 약학적으로 허용 가능한 부형제를 또한 포함할 수 있다. DNA 백신 조성물을 포함하여, 핵산 조성물에 적합한 약학적으로 허용 가능한 부형제의 예는 당해 분야의 숙련가들에게 널리 공지되어 있으며, 당 등을 포함한다. 상기와 같은 부형제는 수성 또는 비수성 용액, 현탁액 및 유화액일 수 있다. 비수성 부형제의 예는 프로필렌 글리콜, 폴리에틸렌 글리콜, 식물성 오일, 예를 들어 올리브 오일, 및 주사성 유기 에스터, 예를 들어 에틸 올리에이트를 포함한다. 수성 부형제의 예는 염수 및 완충 매질을 포함하여, 물, 알콜/수성 용액, 유화액 또는 현탁액을 포함한다. 적합한 부형제는 또한 상기 폴리뉴클레오타이드 분자의 세포 흡수를 지원하는 작용제를 포함한다. 상기와 같은 작용제의 예는 (i) 세포 침투성을 변형시키는 화학물질, 예를 들어 부피바카인, (ii) 상기 폴리뉴클레오타이드의 캡슐화를 위한 리포솜 또는 바이러스 입자, 또는 (iii) 자신을 상기 폴리뉴클레오타이드와 회합시키는 양이온성 지질 또는 실리카, 금, 또는 텅스텐 미세입자이다. 음이온성 및 중성 리포솜은 당해 분야에 널리 공지되어 있으며(리포솜 제조 방법에 대한 상세한 설명에 대해서, 예를 들어 문헌[Liposomes: A Practical Approach, RPC New Ed, IRL press (1990)]을 참조하시오) 이들은 폴리뉴클레오타이드를 포함한 넓은 범위의 생성물들을 전달하는데 유용하다. 양이온성 지질이 또한 당해 분야에 공지되어 있으며 유전자 전달에 통상적으로 사용된다. 상기와 같은 지질은 리포펙틴(상표)(또한 DOTMA(N-[1-(2,3-다이올레일옥시)프로필-N,N,N-트라이메틸암모늄 클로라이드)로서 공지됨), DOTAP(1,2-비스(올레일옥시)-3-(트라이메틸암모니오)프로판), DDAB(다이메틸다이옥타데실-암모늄 브로마이드), DOGS(다이옥타데실아미돌로글리실 스페르민) 및 콜레스테롤 유도체, 예를 들어 DCChol(3-베타-(N-(N',N'-다이메틸 아미노메탄)-카바모일)콜레스테롤)을 포함한다. 이들 양이온성 지질의 설명을 EP 187,702, WO 90/11092, 미국특허 제 5,283,185 호, WO 91/15501, WO 95/26356, 및 미국특허 제 5,527,928 호에서 찾을 수 있다. 본원에 의해 제공된 핵산 백신과 함께 사용될 수 있는 특히 유용한 양이온성 지질 제형은 박스펙틴(VAXFECTIN)이며, 이는 수성 비히클 중에서 결합시 자가-조립되어 리포솜을 형성하는 양이온성 지질(GAP-DMORIE)과 중성 인지질(DPyPE)의 혼합물이다. 유전자 전달을 위한 양이온성 지질을 바람직하게는 예로서, WO 90/11092에 개시된 바와 같이, DOPE (다이올레일 포스파티딜에탄올아민)과 같은 중성 지질과 함께 사용한다. 또한, DNA 백신을 비이온성 블록 공중합체, 예를 들어 CRL1005와 또한 제형화할 수 있다.
G. 면역원성 PAA 폴리펩타이드, 핵산 분자 및 조성물의 용도
다른 태양에서, 본원은 상기 본 발명에 개시된 면역원성 PAA 폴리펩타이드, 단리된 핵산 분자, 및 상기 면역원성 PAA 폴리펩타이드 또는 단리된 핵산 분자를 포함하는 조성물의 사용 방법을 제공한다.
하나의 태양에서, 본원은 포유동물, 특히 인간에서 PAA에 대한 면역 반응을 이끌어내는 방법을 제공하며, 상기 방법은 상기 포유동물에게 유효량의 (1) 상기 표적 PAA에 대해 면역원성인 본원에 의해 제공된 면역원성 PAA 폴리펩타이드, (2) 상기와 같은 면역원성 PAA 폴리펩타이드를 암호화하는 단리된 핵산 분자, (3) 상기와 같은 면역원성 PAA 폴리펩타이드를 포함하는 조성물, 또는 (4) 상기와 같은 면역원성 PAA 폴리펩타이드를 암호화하는 단리된 핵산 분자를 포함하는 조성물을 투여함을 포함한다.
일부 실시태양에서, 본원은 인간에서 PSMA에 대한 면역 반응을 이끌어내는 방법을 제공하며, 상기 방법은 상기 인간에게 유효량의 본원에 의해 제공된 면역원성 PSMA 조성물을 투여함을 포함하며, 여기에서 상기 면역원성 PSMA 조성물은 (1) 면역원성 PSMA 폴리펩타이드, (2) 상기와 같은 면역원성 PSMA 폴리펩타이드를 암호화하는 단리된 핵산 분자, (3) 면역원성 PSMA 폴리펩타이드를 포함하는 조성물, 및 (4) 면역원성 PSMA 폴리펩타이드를 암호화하는 단리된 핵산 분자를 포함하는 조성물 중에서 선택된다.
일부 다른 실시태양에서, 본원은 인간에서 PSA에 대한 면역 반응을 이끌어내는 방법을 제공하며, 상기 방법은 상기 인간에게 유효량의 본원에 의해 제공된 면역원성 PSA 조성물을 투여함을 포함하며, 여기에서 상기 면역원성 PSA 조성물은 (1) 면역원성 PSA 폴리펩타이드, (2) 면역원성 PSA 폴리펩타이드를 암호화하는 단리된 핵산 분자, (3) 면역원성 PSA 폴리펩타이드를 포함하는 조성물, 및 (4) 면역원성 PSA 폴리펩타이드를 암호화하는 단리된 핵산 분자를 포함하는 조성물 중에서 선택된다.
또 다른 태양에서, 본 발명은 인간에서 비정상적인 세포 증식을 억제하는 방법을 제공하며, 여기에서 상기 비정상적인 세포 증식은 PAA의 과발현과 관련된다. 상기 방법은 상기 인간에게 유효량의, 상기 과발현된 PAA에 대해 면역원성인 본원에 의해 제공된 면역원성 PAA 조성물을 투여함을 포함한다. 상기 면역원성 PAA 조성물은 (1) 면역원성 PAA 폴리펩타이드, (2) 하나 이상의 면역원성 PAA 폴리펩타이드를 암호화하는 단리된 핵산 분자, (3) 면역원성 PAA 폴리펩타이드를 포함하는 조성물, 또는 (4) 하나 이상의 면역원성 PAA 폴리펩타이드를 암호화하는 단리된 핵산 분자를 포함하는 조성물일 수 있다. 일부 실시태양에서, 상기 방법은 인간의 전립선에서 비정상적인 세포 증식을 억제하기 위한 것이다. 특정한 실시태양에서, 본원은 PSMA를 과발현하는 전립선에서 비정상적인 세포 증식의 억제 방법을 제공하며, 상기 방법은 상기 인간에게 유효량의 (1) 면역원성 PSMA 폴리펩타이드, (2) 하나 이상의 면역원성 PSMA 폴리펩타이드를 암호화하는 단리된 핵산 분자, (3) 면역원성 PSMA 폴리펩타이드를 포함하는 조성물, 또는 (4) 하나 이상의 면역원성 PSMA 폴리펩타이드를 암호화하는 단리된 핵산 분자를 포함하는 조성물을 투여함을 포함한다.
또 다른 태양에서, 본원은 PAA의 과발현과 관련된 인간의 암의 치료 방법을 제공한다. 상기 방법은 상기 인간에게 유효량의, 상기 과발현된 PAA에 대한 면역 반응을 이끌어낼 수 있는 면역원성 PAA 조성물을 투여함을 포함한다. 상기 면역원성 PAA 조성물은 (1) 면역원성 PAA 폴리펩타이드, (2) 하나 이상의 면역원성 PAA 폴리펩타이드를 암호화하는 단리된 핵산 분자, (3) 면역원성 PAA 폴리펩타이드를 포함하는 조성물, 또는 (4) 하나 이상의 면역원성 PAA 폴리펩타이드를 암호화하는 단리된 핵산 분자를 포함하는 조성물일 수 있다. 상기 방법에 의해 치료될 수 있는 암의 예는 유방암, 위암, 난소암, 폐암, 방광암, 결장직장암, 신장암, 췌장암 및 전립선암을 포함한다.
일부 실시태양에서, 본원은 인간의 전립선암의 치료 방법을 제공하며, 상기 방법은 상기 인간에게 유효량의 상기 본 발명에 제공된 핵산 조성물을 투여함을 포함한다. 상기 조성물 중의 핵산은 오직 하나의 특정한 면역원성 PAA 폴리펩타이드, 예를 들어 면역원성 PSMA 폴리펩타이드, 면역원성 PSA 폴리펩타이드, 또는 면역원성 PSCA 폴리펩타이드만을 암호화할 수 있다. 상기 조성물 중의 핵산은 2 개 이상의 상이한 면역원성 PAA 폴리펩타이드, 예를 들어 (1) 면역원성 PSMA 폴리펩타이드 및 면역원성 PSA 폴리펩타이드; (2) 면역원성 PSMA 폴리펩타이드 및 면역원성 PSCA 폴리펩타이드; (3) 면역원성 PSA 폴리펩타이드 및 면역원성 PSCA 폴리펩타이드; (4) 면역원성 PSMA 폴리펩타이드, 면역원성 PSA 폴리펩타이드 및 면역원성 PSCA 폴리펩타이드를 또한 암호화할 수도 있다. 상기 조성물 중의 각각의 개별적인 핵산 분자는 오직 하나의 특정한 면역원성 PAA 폴리펩타이드, 예를 들어 PSMA 폴리펩타이드, PSA 폴리펩타이드, 또는 PSCA 폴리펩타이드만을 암호화할 수 있다. 한편으로 상기 조성물 중의 개별적인 핵산은 2 개의 상이한 유형의 면역원성 PAA 폴리펩타이드, 예를 들어 (1) 면역원성 PSMA 폴리펩타이드 및 면역원성 PSA 폴리펩타이드; (2) 면역원성 PSMA 폴리펩타이드 및 면역원성 PSCA 폴리펩타이드; (3) 면역원성 PSCA 폴리펩타이드 및 면역원성 PSA 폴리펩타이드; 또는 (4) 면역원성 PSMA 폴리펩타이드, 면역원성 PSA 폴리펩타이드 및 면역원성 PSCA 폴리펩타이드를 암호화하는 다중-항원 구축물일 수도 있다. 일부 특정한 실시태양들에서, 상기 핵산 조성물은 적어도 (4) 면역원성 PSMA 폴리펩타이드, 면역원성 PSA 폴리펩타이드 및 면역원성 PSCA 폴리펩타이드를 암호화하는 다중-항원 구축물을 포함한다. 인간의 전립선암의 치료를 위해 백신 조성물 중에 함유되거나 또는 백신 조성물 중의 핵산에 의해 발현된 상기 면역원성 PSCA 폴리펩타이드는 바람직하게는 인간 전장의 PSCA 단백질이다.
상기 폴리펩타이드 및 핵산 조성물을 인간을 포함한 동물에게, 당해 분야에 공지된 다수의 방법들에 의해 투여할 수 있다. 적합한 방법의 예는 (1) 근육내, 피내, 표피내, 정맥내, 동맥내, 피하, 또는 복강내 투여, (2) 경구 투여, 및 (3) 국소 적용(예를 들어 눈, 비내 및 질내 적용)을 포함한다. 사용될 수 있는 핵산 백신 조성물의 피내 또는 표피내 투여의 하나의 특정한 방법은 파우더메드(PowderMed)에 의해 시판되는 파티클 미디에이티드 에피더말 딜리버리(Particle Mediated Epidermal Delivery(PMED(상표)) 백신 전달 장치를 사용하는 유전자 건 전달이다. PMED는 동물 또는 인간에 대한 백신의 무침 투여 방법이다. 상기 PMED 시스템은 미세 금입자상에 DNA를 침전시키고 이어서 헬륨 가스에 의해 표피내로 추진시킴을 포함한다. 상기 DNA-코팅된 금 입자를 APC 및 상기 표피의 각질세포로 전달하고, 일단 이들 세포의 핵 내에서, 상기 DNA는 상기 금으로부터 용리되어 전사 활성으로 되고, 암호화된 단백질을 생산한다. 이어서 상기 단백질은 상기 APC에 의해 림프구에 제공되어 T-세포-매개된 면역 반응을 유도한다. 본원에 의해 제공된 핵산 백신의 근육내 투여를 위한 또 다른 특정한 방법은 전기천공법이다. 전기천공법은 세포막 중에 일시적인 기공을 생성시키기 위해 조절된 전기 펄스를 사용하며, 이는 근육내로 주입된 상기 핵산 백신의 세포 흡수를 촉진한다. CpG가 핵산 백신과 함께 사용되는 경우, 상기 CpG및 핵산 백신은 하나의 제형으로 동시-제형화되고 상기 제형은 전기천공법에 의해 근육내로 투여된다.
본원에 의해 제공된 주어진 방법에서 투여되는 조성물 중의 면역원성 PAA 폴리펩타이드 또는 면역원성 PAA를 암호화하는 핵산의 유효량은 당해 분야의 숙련가에 의해 쉽게 측정되며 다수의 인자들에 따라 변할 것이다. 전립선암과 같은 암의 치료 방법에서, 상기 면역원성 PAA 폴리펩타이드 또는 핵산의 유효량을 측정하는데 고려될 수 있는 인자들은 비제한적으로 (1) 환자의 면역 상태 및 건강을 포함하여, 치료하고자 하는 환자, (2) 치료하고자 하는 암의 중증도 및 병기, (3) 사용되거나 발현된 특정한 면역원성 PAA 폴리펩타이드, (4) 목적하는 보호 또는 치료의 정도, (5) 투여 방법 및 스케줄, 및 (6) 사용되는 다른 치료제(예를 들어 항원보강제 또는 면역 조절제)를 포함한다. 다중-항원 백신 조성물을 포함하여 핵산 백신 조성물의 경우에, 상기 제형화 및 전달 방법은 유효한 면역 반응을 이끌어내는데 필요한 핵산의 용량을 측정하기 위한 핵심 인자 중에 있다. 예를 들어, 상기 핵산의 유효량은, 상기 핵산 백신 조성물을 수용액으로서 제형화하고 피하 주사침 주사 또는 공기식 주사에 의해 투여하는 경우 2 ㎍/용량 내지 10 ㎎/용량의 범위에 있을 수 있는 반면, 상기 핵산을 코팅된 금 비드로서 제조하고 유전자 건 기술을 사용하여 전달하는 경우에는 단지 16 ng/용량 내지 16 ㎍/용량만이 필요할 수 있다. 전기천공법에 의한 핵산 백신의 용량 범위는 일반적으로 0.5 내지 10 ㎎/용량의 범위이다. 상기 핵산 백신을 공-제형 중에서 전기천공법에 의해 CpG와 함께 투여하는 경우, 상기 핵산 백신의 용량은 0.5 내지 5 ㎎/용량의 범위 중에 있을 수 있으며, 상기 CpG의 용량은 전형적으로 개인당 0.05 ㎎ 내지 5 ㎎/용량의 범위, 예를 들어 0.05, 0.2, 0.6 또는 1.2 ㎎/용량이다.
본 발명의 핵산 또는 폴리펩타이드 백신 조성물을 초회항원자극-추가접종(prime-boost) 전략에 사용하여 강하고 오래 지속되는 면역 반응을 유도할 수 있다. 동일한 면역원성 구축물의 반복된 주사를 기본으로 하는 초회항원자극 및 추가접종 백신화 프로토콜은 널리 공지되어 있다. 일반적으로, 최초 용량은 보호성 면역을 생성시키지 않고, 단지 면역계를 "준비"시킬 수 있다. 보호성 면역 반응은 두 번째 또는 세 번째 용량("추가접종") 후에 발생한다. 상기 추가접종은 통상적인 기법에 따라 수행되며, 경험적으로 투여 스케줄, 투여 경로, 항원보강제의 선택, 용량, 및 또 다른 백신과 함께 투여시 가능한 시퀀스에 관하여 추가로 최적화될 수 있다. 하나의 실시태양에서, 본 발명의 핵산 또는 폴리펩타이드 백신을 통상적인 상동성 초회항원자극-추가접종 전략에 사용하며, 여기에서 같은 백신을 수회 용량으로 동물에게 투여한다. 또 다른 실시태양에서, 상기 핵산 또는 폴리펩타이드 백신 조성물을 이종 초회항원자극-추가접종 백신화에 사용하며, 여기에서 동일한 항원을 함유하는 상이한 유형의 백신들을 소정의 시간 간격으로 투여한다. 예를 들어, 핵산 구축물을 초기 용량("초회항원자극")으로 플라스미드의 형태로, 및 후속 용량("추가접종")으로 벡터의 부분으로서, 또는 이와 역으로 투여할 수 있다.
전립선암의 치료를 위해서, 본 발명의 폴리펩타이드 또는 핵산 백신을 다른 항원들, 예를 들어 산성인산화효소-기재 항원 및 안드로젠 수용체를 기본으로 하는 전립선암 백신과 함께 사용할 수 있다.
본 발명의 폴리펩타이드 또는 핵산 백신 조성물을 하나 이상의 항원보강제와 함께 사용할 수 있다. 적합한 항원보강제의 예는 (1) 수중 유적형 유화액 제형(다른 특정한 면역자극제, 예를 들어 뮤라밀 폴리펩타이드 또는 세균세포벽 성분과 함께 또는 상기 성분 없이), 예를 들어 (a) 미세유동화기를 사용하여 서브미크론 입자로 제형화된, 5% 스쿠알렌, 0.5% 트윈 80(폴리옥시에틸렌 솔비탄 모노-올리에이트) 및 0.5% 스판(Span) 85(솔비탄 트라이올리에이트)를 함유하는 MF59(상표)(PCT 공보 제 WO 90/14837 호; 문헌[Chapter 10 in Vaccine design: the subunit and adjuvant approach, eds. Powell & Newman, Plenum Press 1995]), (b) 서브미크론 유화액으로 미세유동화되거나 또는 와동되어 보다 큰 입자 크기 유화액을 생성시키는, 10% 스쿠알렌, 0.4% 트윈 80, 5% 플루로닉-차단된 중합체 L121, 및 thr-MDP를 함유하는 SAF, 및 (c) 2% 스쿠알렌, 0.2% 트윈 80, 및 하나 이상의 세균 세포벽 성분, 예를 들어 모노인지질 A(MPL), 트레할로스 다이마이콜레이트(TDM), 및 세포벽 골격(CWS)을 함유하는 RIBI(상표) 항원보강제 시스템(RAS)(리비 임뮤노켐(Ribi Immunochem), 미국 몬타나주 해밀튼 소재); (2) 사포닌 항원보강제, 예를 들어 QS21, 스티뮬론(STIMULON)(상표)(캠브리지 바이오사이언스(Cambridge Bioscience), 미국 매사추세츠주 월세스터 소재), 아비스코(Abisco)(등록상표)(아이스코노바(Isconova), 스웨덴 소재), 또는 아이스코매트릭스(Iscomatrix)(등록상표)(커몬웰쓰 시럼 레보라토리즈(Commonwealth Serum Laboratories), 오스트레일리아 소재); (3) 완전 프로인트 항원보강제(CFA) 및 불완전 프로인트 항원보강제(IFA); (4) 사이토킨, 예를 들어 인터류킨(예를 들어, IL-1, IL-2, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-12(PCT 공보 제 WO 99/44636 호) 등), 인터페론(예를 들어 감마 인터페론), 대식세포 콜로니 자극 인자(M-CSF), 종양 괴사 인자(TNF) 등; (5) 모노인지질 A(MPL) 또는 3-O-데아실화된 MPL(3dMPL), 임의로 뉴모코커스 사카라이드와 함께 사용시 알룸의 실질적인 부재 하에서(예를 들어 GB-2220221, EP-A-0689454, WO 00/56358); (6) 3dMPL과, 예를 들어 QS21, 및/또는 수중 유적형 유화액의 조합(예를 들어 EP-A-0835318, EP-A-0735898, EP-A-0761231); (7) CpG동기를 포함하는, 즉 하나 이상의 CG 다이뉴클레오타이드를 함유하는 올리고뉴클레오타이드(이때 시토신은 메틸화되지 않는다)(예를 들어 문헌[Krieg, Vaccine (2000) 19:618-622]; 문헌[Krieg, Curr Opin Mol Ther (2001) 3:15-24]; WO 98/40100, WO 98/55495, WO 98/37919 및 WO 98/52581); (8) 폴리옥시에틸렌 에테르 또는 폴리옥시에틸렌 에스터(예를 들어 WO 99/52549); (9) 옥톡시놀과 함께 폴리옥시에틸렌 솔비탄 에스터 계면활성제(예를 들어 WO 01/21207) 또는 하나 이상의 추가적인 비이온성 계면활성제, 예를 들어 옥톡시놀과 함께 폴리옥시에틸렌 알킬 에테르 또는 에스터 계면활성제(예를 들어 WO 01/21152); (10) 사포닌 및 면역자극성 올리고뉴클레오타이드(예를 들어 CpG 올리고뉴클레오타이드)(예를 들어 WO 00/62800); (11) 알루미늄 염을 포함하는 금속염(예를 들어 알룸, 알루미늄 포스페이트, 알루미늄 하이드록사이드); (12) 사포닌 및 수중 유적형 유화액(예를 들어 WO 99/11241); (13) 사포닌(예를 들어 QS21) + 3dMPL + IM2(임의로 + 스테롤)(예를 들어 WO 98/57659); (14) 상기 조성물의 효능을 증대시키기 위한 면역자극제로서 작용하는 다른 물질들, 예를 들어 N-아세틸-뮤라밀-L-쓰레오닐-D-아이소글루타민(thr-MDP), N-25 아세틸-노르뮤라밀-L-알라닐-D-아이소글루타민(nor-MDP), N-아세틸뮤라밀-L-알라닐-D-아이소글루타니닐-L-알라닌-2-(1'-2'-다이팔미토일-sn-글리세로-3-하이드록시포스포릴옥시)-에틸아민 MTP-PE)를 포함하는 뮤라밀 폴리펩타이드, (15) 천연 또는 합성의 톨형 수용체(TLR)에 대한 리간드(예를 들어 문헌[Kanzler et al., Nature Med. 13:1552-1559 (2007)]), 예를 들어 TLR3 리간드, 예를 들어 폴릴:C 및 유사한 화합물, 예를 들어 힐토놀(Hiltonol) 및 암플리젠(Ampligen)을 포함한다.
본 발명의 폴리펩타이드 또는 핵산 백신 조성물을 하나 이상의 면역 조절제와 함께 사용할 수 있다. 적합한 면역 조절제의 예는 단백질 타이로신 키나제 억제제(예를 들어 아파티니브, 악시티니브, 세디라니브, 에를로티니브, 제피티니브, 그랜디닌, 라파티니브, 레스타우르티니브, 네라티니브, 파조파니브, 퀴자르티니브, 레고라페니브, 세막사니브, 소라페니브, 수니티니브, 티보자니브, 토세라니브, 보수티니브 및 반데타니브), CD40 작용물질(예를 들어 CD40 작용물질 항체), OX40 작용물질(예를 들어 OX40 작용물질 항체), CTLA-4 억제제(예를 들어 안티CTLA-4 항체 이필리뮤맵 및 트레멜리뮤맵), TLR 작용물질, 4-1BB 작용물질, Tim-1 길항물질, LAGE-3 길항물질, 및 PD-L1 및 PD-1 길항물질을 포함한다.
H. 백신-기재 면역치료 요법(VBIR)
추가의 태양에서, 본원은 포유동물, 특히 인간에서 신생물 질환의 치료를 위한 백신의 면역원성 또는 치료 효과를 증대시키는 방법을 제공한다. 상기 방법은 신생물 질환의 치료를 위해 상기 백신을 수용하는 포유동물에게 (1) 유효량의 하나 이상의 면역-억제성-세포 억제제(ISC 억제제) 및 (2) 유효량의 하나 이상의 면역-효과기-세포 증폭자(IEC 증폭자)를 투여함을 포함한다. 상기 방법을 임의의 형태 또는 제형의 백신, 예를 들어 서브유닛 백신, 단백질-기재 백신, 펩타이드-기재 백신, 또는 핵산-기재 백신, 예를 들어 DNA-기재 백신, RNA-기재 백신, 플라스미드-기재 백신, 또는 벡터-기재 백신과 함께 사용할 수 있다. 또한, 상기 방법은 임의의 특정 유형의 백신 또는 임의의 특정 유형의 암으로 제한되지 않는다. 오히려, 상기 방법을 신생물 질환, 예를 들어 양성, 전-암성, 및 악성 신생물 질환의 치료에 의도된 임의의 백신과 함께 사용할 수 있다. 예를 들어, 상기 방법을 하기의 신생물 질환들 중 어느 하나의 치료에 의도된 백신과 함께 사용할 수 있다: 방광(가속화된 및 전이성 방광암 포함), 유방, 결장(결장직장암 포함), 신장, 간, 폐(소세포 및 비소세포 폐암 및 폐 선암종 포함), 난소, 전립선, 고환, 비뇨생식관, 림프계, 직장, 후두, 췌장(외분비 췌장 암종 포함), 식도, 위, 방광, 경부, 갑상선 및 피부(편평세포 암종 포함); 림프 계통의 조혈 종양, 예를 들어 백혈병, 급성 림프구성 백혈병, 급성 림프모구성 백혈병, B-세포 림프종, T-세포 림프종, 호지킨 림프종, 비-호지킨 림프종, 모세포 림프종, 조직구 림프종, 및 버킷 림프종; 골수 계통 조혈 종양, 예를 들어 급성 및 만성 골수성 백혈병, 골수이형성 증후군, 골수성 백혈병, 및 전골수구성 백혈병; 중추 및 말초 신경계의 종양, 예를 들어 성상세포종, 신경모세포종, 신경교종 및 슈반종; 중간엽 기원의 종양, 예를 들어 섬유육종, 횡문근육종, 및 골육종; 다른 종양, 예를 들어 흑색종, 색소성 건피증, 각질가시세포종, 정상피종, 갑상선모낭암, 및 기형암종; 흑색종, 절제불능 III 또는 IV기 악성 흑색종, 편평세포 암종, 소세포 폐암, 비소세포 폐암, 신경교종, 위장암, 신장암, 난소암, 간암, 결장직장암, 자궁내막암, 신장암, 전립선암, 갑상선암, 신경모세포종, 췌장암, 다형성 교모세포종, 경부암, 위암, 방광암, 간암, 유방암, 결장암, 및 두경부암, 위암, 생식세포 종양, 골암, 골 종양, 뼈의 성인 악성 섬유성 조직구증; 뼈의 아동 악성 섬유성 조직구증, 육종, 소아 육종, 부비동 천연 살해제, 신생물, 혈장세포 신생물; 골수이형성 증후군; 신경모세포종; 고환 생식세포 종양, 안내 흑색종, 골수이형성 증후군; 골수이형성/골수증식성 질병, 활막종, 만성 골수성 백혈병, 급성 림프모구성 백혈병, 필라델피아 염색체 양성 급성 림프모구성 백혈병(Ph + ALL), 다발성 골수종, 급성 골수성 백혈병, 만성 림프구성 백혈병 및 비만세포종.
일부 실시태양에서, 본원은 인간의 전립선암의 치료를 위한 백신의 면역원성 또는 치료 효과의 증대 방법을 제공한다. 상기 투여되는 백신은 임의의 인간 PAA, 예를 들어 PSMA, PSA 또는 PSCA에 대한 면역 반응을 이끌어낼 수 있다. 일부 특정한 실시태양에서, 상기 투여되는 백신은 인간 PAA, 예를 들어 PSMA, PSA 또는 PSCA에 대한 면역 반응을 이끌어낼 수 있는 항원을 암호화하는 핵산 분자를 포함한다. 상기 백신 중에 함유될 수 있는 특정한 핵산 분자의 예는 본원에 의해 제공된 하기를 포함한다:
1) 면역원성 PSMA 폴리펩타이드, 면역원성 PSA 폴리펩타이드 또는 면역원성 PSCA 폴리펩타이드를 암호화하는 핵산 분자;
2) 본원에 의해 제공된 2 개의 면역원성 PAA 폴리펩타이드, 예를 들어 a) 면역원성 PSMA 폴리펩타이드 및 면역원성 PSA 폴리펩타이드; b) 면역원성 PSMA 폴리펩타이드 및 면역원성 PSCA 폴리펩타이드; 또는 c) 면역원성 PSA 폴리펩타이드 및 면역원성 PSCA 폴리펩타이드를 암호화하는 핵산 분자; 및
3) 면역원성 PSMA 폴리펩타이드, 면역원성 PSA 폴리펩타이드 및 면역원성 PSCA 폴리펩타이드인 3 개의 면역원성 PAA 폴리펩타이드를 암호화하는 핵산 분자.
또 다른 추가의 태양에서, 본원은 포유동물, 특히 인간에서 신생물 질환의 치료 방법을 제공한다. 상기 방법은 상기 포유동물에게 (1) 유효량의, 상기 신생물 질환과 관련된 TAA에 대한 면역반응을 이끌어낼 수 있는 백신, (2) 유효량의 하나 이상의 면역-억제성-세포 억제제(ISC 억제제) 및 (3) 유효량의 하나 이상의 면역-효과기-세포 증폭자(IEC 증폭자)를 투여함을 포함한다. 특정한 TAA에 대한 면역 반응을 이끌어낼 수 있는 임의의 백신을 상기 방법에 사용할 수 있다. 다수의 TAA들이 당해 분야에 공지되어 있다. 상기 전립선-관련된 항원 외에, 하기는 당해 분야에 공지된 TAA의 예들이다: 결장직장암의 경우 CEA, MUC-1, Ep-CAM, 5T4, hCG-b, K-ras, 및 TERT; 난소암의 경우 CEA, Muc-1, p53, 메소텔린, 설비빈(Survivin), 및 NY-ESO-1; 비소세포 폐암의 경우 Muc-1, 5T4, WT-1, TERT, CEA, EGF-R 및 MAGE-A3; 신세포 암종의 경우 5T4; 및 췌장암의 경우 Muc-1, 메소텔린, K-Ras, 아넥신(Annexin) A2, TERT, 및 CEA. 신규의 TAA들이 계속해서 확인되고 있다. 상기 공지된 및 신규의 TAA 중 어느 하나에 대한 면역반응을 이끌어낼 수 있는 백신을 상기 방법에 사용할 수 있다. 또한, 상기 투여되는 백신은 임의의 형태 또는 제형의 백신, 예를 들어 서브유닛 백신, 단백질-기재 백신, 펩타이드-기재 백신, 또는 핵산-기재 백신, 예를 들어 DNA-기재 백신, RNA-기재 백신, 플라스미드-기재 백신, 또는 벡터-기재 백신일 수 있다.
일부 실시태양에서, 본원은 인간의 전립선암의 치료 방법을 제공하며, 상기 방법은 상기 인간에게, 임의의 인간 PAA, 예를 들어 PSMA, PSA 또는 PSCA에 대한 면역 반응을 이끌어낼 수 있는 백신을 투여함을 포함한다. 일부 특정한 실시태양에서, 상기 투여되는 백신은 인간 PAA, 예를 들어 PSMA, PSA 또는 PSCA에 대한 면역 반응을 이끌어낼 수 있는 항원을 암호화하는 핵산 분자를 포함한다. 상기 백신 중에 함유될 수 있는 특정한 핵산 분자의 예는 본원에 의해 제공된 하기를 포함한다:
1) 면역원성 PSMA 폴리펩타이드, 면역원성 PSA 폴리펩타이드 또는 면역원성 PSCA 폴리펩타이드를 암호화하는 핵산 분자;
2) 본원에 의해 제공된 2 개의 면역원성 PAA 폴리펩타이드, 예를 들어 a) 면역원성 PSMA 폴리펩타이드 및 면역원성 PSA 폴리펩타이드; b) 면역원성 PSMA 폴리펩타이드 및 면역원성 PSCA 폴리펩타이드; 또는 c) 면역원성 PSA 폴리펩타이드 및 면역원성 PSCA 폴리펩타이드를 암호화하는 핵산 분자; 및
3) 면역원성 PSMA 폴리펩타이드, 면역원성 PSA 폴리펩타이드 및 면역원성 PSMA 폴리펩타이드인 3 개의 면역원성 PAA 폴리펩타이드를 암호화하는 핵산 분자.
상기 본 발명에 개시된 포유동물의 신생물 질환의 치료 방법, 및 포유동물에서 신생물 질환의 치료를 위한 백신의 면역원성 또는 치료 효과를 증대시키는 방법을 한편으로 "백신-기재 면역치료 요법"(또는 "VBIR")이라 칭한다.
상기 백신-기재 면역치료 요법에서, 상기 IEC 증폭자 및 ISC 억제제를 임의의 적합한 방법 및 경로, 예를 들어 (1) 전신 투여, 예를 들어 정맥내, 근육내 또는 경구 투여, 및 (2) 국소 투여, 예를 들어 피내 및 피하 투여에 의해 투여할 수 있다. 적합한 경우, 국소 투여가 전신 투여보다 일반적으로 바람직하다. 임의의 IEC 증폭자 및 ISC 억제제의 국소 투여를 약제의 국소 투여에 적합한 포유동물 신체의 임의의 위치에서 수행할 수 있으나; 이들 면역 조절제를 상기 백신 배액 림프절에 가깝게 국소적으로 투여하는 것이 보다 바람직하다.
단일 부류의 IEC 증폭자로부터의 2 개 이상의 특정한 IEC 증폭자(예를 들어 2 개의 CTLA-작용물질)를 상기 ISC 억제제와 함께 투여할 수도 있다. 또한, 2 개 이상의 상이한 부류의 IEC 증폭자로부터 2 개 이상의 특정한 IEC 증폭자(예를 들어 하나의 CTLA-4 길항물질 및 하나의 TLR 작용물질)를 함께 투여할 수도 있다. 유사하게, 단일 부류의 ISC 억제제로부터 2 개 이상의 특정한 ISC 억제제(예를 들어 2 개 이상의 단백질 키나제 억제제)를 상기 IEC 증폭자와 함께 투여할 수 있다. 또한, 2 개 이상의 상이한 부류의 ISC 억제제로부터 2 개 이상의 특정한 ISC 억제제(예를 들어 하나의 단백질 키나제 억제제 및 하나의 COX-2 억제제)를 함께 투여할 수도 있다.
상기 백신-기재 면역치료 요법에서, 상기 백신을 사용되는 면역 조절제(즉 ISC 억제제 및 IEC 증폭자) 중 어느 하나 또는 전부와 동시에 또는 연속적으로 투여할 수 있다. 유사하게, 2 개 이상의 면역 조절제가 사용되는 경우, 이들을 서로에 대해 동시에 또는 연속적으로 투여할 수 있다. 일부의 실시태양들에서, 백신을 하나의 면역 조절제에 대해 동시에(예를 들어 혼합물 중에서), 그러나 하나 이상의 추가적인 면역 조절제들에 대해서는 연속적으로 투여한다. 상기 백신-기재 면역치료 섭생에서 상기 백신 및 면역 조절제의 병용 투여는, 상기 항원과 면역 조절제가 동시에 투여되지 않는다하더라도, 상기 백신과 하나 이상의 면역 조절제를, 이들 각각이 투여 부위, 예를 들어 백신 배액 림프절에 동시에 존재하도록 투여하는 경우를 포함할 수 있다. 상기 백신 및 면역 조절제의 병용투여는 또한 상기 백신 또는 상기 면역 조절제가 상기 투여 부위로부터 제거되지만, 상기 제거된 백신 또는 면역 조절제의 하나 이상의 세포 효과가 상기 투여 부위, 예를 들어 백신 배액 림프절에서, 적어도 하나 이상의 추가적인 면역 조절제들이 상기 투여 부위에 투여될 때까지 지속되는 경우를 포함할 수 있다. 핵산 백신을 CpG와 함께 투여하는 경우에, 상기 백신 및 CpG는 단일 제형 중에 함유되며 임의의 적합한 방법에 의해 함께 투여될 수 있다. 일부의 실시태양들에서, 공-제형(혼합물) 중의 상기 핵산 백신 및 CpG를 전기천공법과 함께 근육내 주사에 의해 투여한다.
임의의 ISC 억제제를 상기 백신-기재 면역치료 요법에 사용할 수 있다. SIC 억제제 부류의 예는 단백질 키나제 억제제, 사이클로옥시게나제-2(COX-2) 억제제, 포스포다이에스테라제 유형 5(PDE5) 억제제, 및 DNA 가교결합제를 포함한다. 예시적인 COX-2 억제제는 셀레콕시브 및 로페콕시브를 포함한다. PDE5 억제제의 예는 아바나필, 로데나필, 미로데나필, 실데나필, 타랄라필, 발데나필, 유데나필, 및 자프리나스트를 포함한다. DNA 가교결합제의 일례는 사이클로포스파미드이다. 특정한 단백질 키나제 억제제의 예를 하기에 상세히 개시한다.
"단백질 키나제 억제제"란 용어는 단백질 키나제의 선택성 또는 비-선택성 억제제로서 작용하는 임의의 물질을 지칭한다. "단백질 키나제"란 용어는 단백질 기질 중 타이로신, 세린 또는 쓰레오닌으로의 아데노신 트라이포스페이트의 말단 포스페이트의 전달을 촉진하는 효소를 지칭한다. 단백질 키나제는 수용체 타이로신 키나제 및 비-수용체 타이로신 키나제를 포함한다. 수용체 타이로신 키나제의 예는 EGFR(예를 들어, EGFR/HER1/ErbB1, HER2/Neu/ErbB2, HER3/ErbB3, HER4/ErbB4), INSR(인슐린 수용체), IGF-IR, IGF-II1R, IRR(인슐린 수용체-관련된 수용체), PDGFR(예를 들어, PDGFRA, PDGFRB), c-KIT/SCFR, VEGFR-1/FLT-1, VEGFR-2/FLK-1/KDR, VEGFR-3/FLT-4, FLT-3/FLK-2, CSF-1R, FGFR 1-4, CCK4, TRK A-C, MET, RON, EPHA 1-8, EPHB 1-6, AXL, MER, TYRO3, TIE, TEK, RYK, DDR 1-2, RET, c-ROS, LTK(백혈구 타이로신 키나제), ALK(역형성 림프종 키나제), ROR 1-2, MUSK, AATYK 1-3, 및 RTK 106을 포함한다. 비-수용체 타이로신 키나제의 예는 BCR-ABL, Src, Frk, Btk, Csk, Abl, Zap70, Fes/Fps, Fak, Jak, Ack, 및 LIMK를 포함한다. 본원에 의해 제공된 백신-기재 면역치료 요법에서, 상기 단백질 키나제 억제제를 최적이하 용량으로 상기 포유동물에게 투여한다. "최적이하 용량"이란 용어는 표적 신생물 질환에 대해 상기 타이로신 키나제 억제제를 단독요법으로 투여할 때(즉 상기 단백질 키나제 억제제를 임의의 다른 치료제 없이 단독으로 투여할 때) 최소 유효 용량 이하인 용량을 지칭한다.
백신-기재 면역치료 요법에 사용하기에 적합한 특정한 단백질 키나제 억제제의 예는 라파티니브, AZD 2171, ET18OCH 3, 인디루빈-3'-옥심, NSC-154020, PD 169316, 퀘르세틴, 로스코비틴, 트리시리빈, ZD 1839, 5-요오도튜베르시딘, 아다포스틴, 알로이신, 알스테르폴론, 아미노제니스테인, API-2, 아피제닌, 아크티제닌, ARRY-334543, 액시티니브(AG-013736), AY-22989, AZD 2171, 비스인돌릴말레이미드 IX, CCl-779, 켈레리쓰린, DMPQ, DRB, 에델포신, ENMD-981693, 에르브스타틴 유사체, 에를로티니브, 파수딜, 제피티니브(ZD1839), H-7, H-8, H-89, HA-100, HA-1004, HA-1077, HA-1100, 하이드록시파수딜, 켄폴론, KN-62, KY12420, LFM-A13, 루테올린, LY294002, LY-294002, 말로톡신, ML-9, MLN608, NSC-226080, NSC-231634, NSC-664704, NSC-680410, NU6102, 올로뮤신, 옥스인돌 I, PD 153035, PD 98059, 플로리드진, 피세아타놀, 피크로포도필린, PKI, PP1, PP2, PTK787/ZK222584, PTK787/ZK-222584, 푸르발라놀 A, 라파뮨, 라파마이신, Ro 31-8220, 로틀레린, SB202190, SB203580, 시롤리무스, SL327, SP600125, 스타우로스포린, STI-571, SU1498, SU4312, SU5416, SU5416(세막사니브), SU6656, SU6668, syk 억제제, TBB, TCN, 티르포스틴 AG 1024, 티르포스틴 AG 490, 티르포스틴 AG 825, 티르포스틴 AG 957, U0126, W-7, 월트만닌, Y-27632, 작티마(ZD6474), ZM 252868. 제피티니브(이레사.RTM.), 수니티니브 말레이트(슈텐트.RTM.; SU11248), 에를로티니브(타세바.RTM.; OSI-1774), 라파티니브(GW572016; GW2016), 카네르티니브(CI 1033), 세막시니브(SU5416), 바탈라니브(PTK787/ZK222584), 소라페니브(BAY 43-9006), 이마티니브(글리벡.RTM.; STI571), 다사티니브(BMS-354825), 레플루노미드(SU101), 반데타니브(작티마.RTM.; ZD6474), 및 닐로티니브를 포함한다. 본 발명에 사용하기에 적합한 추가의 단백질 키나제 억제제들이 예를 들어 미국특허 제 5,618,829 호, 미국특허 제 5,639,757 호, 미국특허 제 5,728,868호, 미국특허 제 5,804,396 호, 미국특허 제 6,100,254 호, 미국특허 제 6,127,374 호, 미국특허 제 6,245,759 호, 미국특허 제 6,306,874 호, 미국특허 제 6,313,138 호, 미국특허 제 6,316,444 호, 미국특허 제 6,329,380 호, 미국특허 제 6,344,459 호, 미국특허 제 6,420,382 호, 미국특허 제 6,479,512 호, 미국특허 제 6,498,165 호, 미국특허 제 6,544,988 호, 미국특허 제 6,562,818 호, 미국특허 제 6,586,423 호, 미국특허 제 6,586,424 호, 미국특허 제 6,740,665 호, 미국특허 제 6,794,393 호, 미국특허 제 6,875,767 호, 미국특허 제 6,927,293 호, 미국특허 제 6,958,340 호에 개시되어 있다.
일부 실시태양에서, 상기 단백질 키나제 억제제는 하나보다 많은 특정한 키나제상에서 작용하는 억제제인 다중-키나제 억제제이다. 다중-키나제 억제제의 예는 이마티니브, 소라페니브, 라파티니브, BIRB-796, 및 AZD-1152, AMG706, 작티마(ZD6474), MP-412, 소라페니브(BAY 43-9006), 다사티니브, CEP-701(레스타우르티니브), XL647, XL999, 타이커브(라파티니브), MLN518(이전에 CT53518로서 공지됨), PKC412, ST1571, AEE 788, OSI-930, OSI-817, 수니티니브 말레이트(슈텐트), 악시티니브(AG-013736), 에를로티니브, 제피티니브, 악시티니브, 보수티니브, 템시롤리스무스 및 닐로티니브(AMN107)를 포함한다. 일부 특정한 실시태양들에서, 상기 타이로신 키나제 억제제는 수니티니브, 소라페니브, 또는 수니티니브 또는 소라페니브의 약학적으로 허용 가능한 염 또는 유도체(예를 들어 말레이트 또는 토실레이트)이다.
화이자 인코포레이티드에 의해 상표명 슈텐트로 시판되는 수니티니브 말레이트는 화학적으로 N-[2-(다이에틸아미노)에틸]-5-[(Z)-(5-플루오로-1,2-다이하이드로-2-옥소-3H-인돌-3-일리딘)메틸]-2,4-다이메틸-1H-피롤-3-카복스아미드를 갖는 부탄디오산, 하이드록시-, (2S)-, 화합물(1:1)로서 개시된다. 상기 화합물, 그의 합성, 및 특정한 다형체들이 미국특허 제 6,573,293 호, 미국 특허 공보 제 2003-0229229 호, 제 2003-0069298 호 및 제 2005-0059824 호, 및 문헌[J. M. Manley, M. J. Kalman, B. G. Conway, C. C. Ball, J. L Havens and R. Vaidyanathan, "Early Amidation Approach to 3-[(4-amido)pyrrol-2-yl]-2-indolinones," J. Org. Chew. 68, 6447-6450 (2003)]에 개시되어 있다. 수니티니브 및 그의 L-말레이트 염의 제형들이 PCT 공보 제 WO 2004/024127 호에 개시되어 있다. 수니티니브 말레이트는 절제할 수 없는, 국소적으로 진행되거나 전이된 질병이 있는 환자에서 위장 간질 종양, 진행된 신장세포 암종, 및 진행성, 잘-분화된 췌장 신경내분비 종양의 치료에 대해서 미국에서 승인되었다. 인간의 경우 위장 간질 종양(GIST) 및 진행된 신장세포 암종(RCC)에 대한 수니티니브 말레이트의 권장 용량은 치료시 4주의 스케줄로, 하루에 1 회 경구로 50 ㎎ 복용한 다음, 2 주 쉰다(스케줄 4/2). 췌장 신경내분비 종양(pNET)에 대한 수니티니브 말레이트의 권장 용량은 하루에 1 회 경구로 37.5 ㎎ 복용한다.
상기 백신-기재 면역치료 요법에서, 수니티니브 말레이트를 단일 용량 또는 수회 용량으로 경구 투여할 수 있다. 전형적으로, 수니티니브 말레이트를 2, 3, 4 주 또는 그 이상의 연속된 매주 용량으로 전달한 다음 약 1 또는 2 주 또는 그 이상의 기간 동안 "쉬며", 이때 수니티니브 말레이트는 전달되지 않는다. 하나의 실시태양에서, 상기 용량을 약 4 주 동안 전달하고, 2 주 쉰다. 또 다른 실시태양에서, 상기 수니티니브 말레이트를 2 주 동안 전달하고, 1 주 쉰다. 그러나, 전체 치료 기간 동안 "쉬는" 기간 없이 전달할 수도 있다. 상기 백신-기재 면역치료 요법에서 인간에게 경구 투여되는 수니티니브 말레이트의 유효량은 전형적으로 용량당 개인당 40 ㎎ 이하이다. 예를 들어, 상기 수니티니브 말레이트를 하루에 개인당 37.5, 31.25, 25, 18.75, 12.5, 6.25 ㎎으로 경구 투여할 수도 있다. 일부 실시태양에서, 수니티니브 말레이트를 용량당 개인당 1 내지 25 ㎎의 범위로 경구 투여한다. 일부 다른 실시태양에서, 수니티니브 말레이트를 용량당 개인당 6.25, 12.5 또는 18.75 ㎎ 범위로 경구 투여한다. 다른 투여 요법 및 변동이 예견될 수 있으며, 의사의 안내를 통해 결정될 것이다.
상표명 넥사바(NEXAVAR)로서 시판되는 소라페니브 토실레이트가 또한 다중-키나제 억제제이다. 그의 화학명은 4-(4-{3-[4-클로로-3-(트라이플루오로메틸)페닐]유레이도}페녹시)-N-메틸피리딘-2-카복스아미드이다. 상기는 미국에서 원발성 신장암(진행된 신장세포 암종) 및 진행된 원발성 간암(간세포 암종)의 치료에 대해 승인되어 있다. 1일 권장 용량은 매일 2 회 400 ㎎ 경구 복용된다. 본원에 의해 제공된 백신-기재 면역치료 요법에서, 경구 투여되는 소라페니브 토실레이트의 유효량은 전형적으로 하루에 개인당 400 ㎎ 이하이다. 일부 실시태양에서, 경구 투여되는 소라페니브 토실레이트의 유효량은 하루에 개인당 10 내지 300 ㎎의 범위이다. 일부 다른 실시태양들에서, 경구 투여되는 소라페니브 토실레이트의 유효량은 하루에 개인당 10 내지 200 ㎎, 예를 들어 하루에 개인당 10, 20, 60, 80, 100, 120, 140, 160, 180, 또는 200 ㎎이다.
상표명 인리타(INLYTA)로 시판되는 악시티니브는 VEGF 수용체 1, 2 및 3의 선택성 억제제이다. 그의 화학명은 (N-메틸-2-[3-((E)-2-피리딘-2-일-비닐)-1H-인다졸-6-일설파닐]-벤즈아미드이다. 상기 악시티니브는 1 회 선행의 전신 치료의 실패 후 진행된 신장세포 암종의 치료에 승인되어 있다. 출발 용량은 하루에 2 회 경구로 5 ㎎이다. 용량 조절은 개별적인 안전성 및 허용성을 기준으로 수행될 수 있다. 본원에 의해 제공된 백신-기재 면역치료 요법에서, 경구 투여되는 악시티니브의 유효량은 전형적으로 하루에 2 회 5 ㎎ 이하이다. 일부 다른 실시태양에서, 경구 투여되는 악시티니브의 유효량은 하루에 2 회 1 내지 5 ㎎이다. 일부 다른 실시태양들에서, 경구 투여되는 악시티니브의 유효량은 하루에 2 회 1, 2, 3, 4 또는 5 ㎎이다.
상기 백신-기재 면역치료 요법에서 임의의 IEC 증폭자를 사용할 수 있다. 상기 증폭자는 소분자 또는 대분자(예를 들어 단백질, 폴리펩타이드, DNA, RNA 및 항체)일 수 있다. 사용될 수 있는 IEC 증폭자의 예는 TNFR 작용물질, CTLA-4 길항물질, TLR 작용물질, 프로그램화된 세포사 단백질 1(PD-1) 길항물질(예를 들어 BMS-936558), 항-PD-1 항체 CT-011), 및 프로그램화된 세포사 단백질 1 리간드 1(PD-L1) 길항물질(예를 들어 BMS-936559), 림프구-활성화 유전자 3(LAG3) 길항물질, 및 T 세포 면역글로불린- 및 뮤신-도메인-함유 분자-3(TIM-3) 길항물질을 포함한다. 특정한 TNFR 작용물질, CTLA-4 길항물질, 및 TLR 작용물질의 예를 본 발명에서 하기에 상세히 제공한다.
TNFR 작용물질.
TNFR 작용물질의 예는 OX40, 4-1BB(예를 들어 BMS-663513), GITR(예를 들어 TRX518), 및 CD40을 포함한다. 특정한 CD40 작용물질의 예는 본 발명에서 하기에 개시된다.
CD40 작용물질은 세포상의 CD40 수용체에 결합하는 물질이며 하나 이상의 CD40 또는 CD40L 관련된 활성을 증가시킬 수 있다. 따라서, CD40 "작용물질"은 CD40 "리간드"를 포함한다.
CD40 작용물질의 예는 CD40 작용물질 항체, 단편 CD40 작용물질 항체, CD40 리간드(CD40L), 및 CD40L의 단편 및 유도체, 예를 들어 올리고머성(예를 들어 2가, 삼량체성 CD40L), 융합 단백질 함유 및 그의 변체를 포함한다.
본 발명에 사용하기 위한 CD40 리간드는 세포상의 하나 이상의 CD40 수용체에 결합하고 이를 활성화시킬 수 있는 임의의 펩타이드, 폴리펩타이드 또는 단백질, 또는 펩타이드, 폴리펩타이드 또는 단백질을 암호화하는 핵산을 포함한다. 적합한 CD40 리간드는 예를 들어 미국특허 제 6,482,411 호, 미국특허 제 6,410,711 호; 미국특허 제 6,391,637 호; 및 미국특허 제 5,981,724 호(이들 특허 및 출원 및 상기 중에 개시된 CD40L 서열은 모두 내용 전체가 본 발명에 참고로 인용된다)에 개시되어 있다. 인간 CD40 리간드는 인간 치료에 사용하기에 바람직할 것이나, 임의의 종으로부터의 CD40 리간드를 본 발명에 사용할 수도 있다. 다른 동물 종들, 예를 들어 수의학적 실시태양에 사용하기 위해서, 치료하려는 동물에게 합치되는 CD40 리간드의 종이 바람직할 것이다. 몇몇 실시태양들에서, 상기 CD40 리간드는 gp39 펩타이드 또는 단백질 올리고머, 예를 들어 올리고머화 서열을 포함하는 gp39 펩타이드, 폴리펩타이드, 단백질(및 암호화 핵산)뿐만 아니라 천연 형성 gp39 펩타이드, 폴리펩타이드 또는 단백질 올리고머이다. 이량체, 삼량체 및 사량체와 같은 올리고머가 본 발명의 몇몇 태양들에 바람직하지만, 본 발명의 다른 태양들에서 상기 올리고머 구조가 하나 이상의 CD40 수용체(들)에 결합하고 활성화시키는 능력을 유지하는 한, 보다 큰 올리고머성 구조들도 사용이 고려된다.
몇몇 다른 실시태양들에서, 상기 CD40 작용물질은 항-CD40 항체, 또는 그의 항원-결합 단편이다. 상기 항체는 인간, 인간화된 또는 부분-인간 키메릭 항-CD40 항체일 수 있다. 특이적인 항-CD40 단클론 항체의 예는 G28-5, mAb89, EA-5 또는 S2C6 단클론 항체, 및 CP870,893을 포함한다. 특정한 실시태양에서, 상기 항-CD40 작용물질 항체는 CP870,893 또는 다세투주맵(SGN-40)이다.
CP870,893은 종양-억제 치료로서 임상적으로 조사된 완전 인간 작용물질 CD40 단클론 항체(mAb)이다. CP870,893의 구조 및 제조가 WO2003041070(여기에서 상기 항체는 내부 확인된 "21.4.1"에 의해 확인된다)에 개시되어 있다. CP870,893의 중쇄 및 경쇄의 아미노산 서열은 각각 서열번호 40 및 서열번호 41에 설명된다. 임상 시험에서, CP870,893을 일반적으로 주입당 0.05 내지 0.25 ㎎/㎏ 범위의 용량으로 정맥내 주입에 의해 투여하였다. I기 임상 연구에서, CP870,893의 최대 허용 용량(MTD)은 0.2 ㎎/㎏인 것으로 평가되었으며 용량-제한 독성은 3등급 CRS 및 3등급 두드러기를 포함하였다(문헌[Jens Ruter et al.: Immune modulation with weekly dosing of an agonist CD40 antibody in a phase I study of patients with advanced solid tumors. Cancer Biology & Therapy 10:10, 983-993; November 15, 2010]). 본원에 의해 제공된 백신-기재 면역치료 요법에서, CP870,893을 피내, 피하 또는 국소 투여할 수 있다. 피내 투여가 바람직하다. 상기 요법에서 투여되는 CP870,893의 유효량은 일반적으로 0.2 ㎎/㎏ 이하, 전형적으로 0.01 내지 0.15 ㎎/㎏ 또는 0.05 내지 0.1 ㎎/㎏의 범위이다.
다세투주맵(또한 SGN-40 또는 huS2C6으로서 공지됨; CAS 번호 88-486-59-9)은 무통성 림프종, 확산성 큰 B 세포 림프종 및 다발성 골수종에 대한 임상 시험에서 조사된 또 다른 항-CD40 작용물질 항체이다. 상기 임상 시험에서, 다세투주맵을 2 ㎎/㎏ 내지 6 ㎎/㎏ 범위의 매주 용량으로 정맥내 투여하였다. 본원에 의해 제공된 백신-기재 면역치료 요법에서, 다세투주맵을 피내, 피하 또는 국소 투여할 수 있다. 피내 투여가 바람직하다. 상기 백신-기재 면역치료 요법에서 투여되는 다세투주맵의 유효량은 일반적으로 16 ㎎/㎏ 이하, 전형적으로 0.2 내지 14 ㎎/㎏ 또는 0.5 내지 8 ㎎/㎏, 또는 1 내지 5 ㎎/㎏의 범위이다.
CTLA-4 억제제.
본원에 의해 제공된 백신-기재 면역치료 요법에 사용하기에 적합한 항-CTLA-4 길항물질 작용제는 비제한적으로 항-CTLA-4 항체(예를 들어 인간 항-CTLA-4 항체, 마우스 항-CTLA-4 항체, 포유동물 항-CTLA-4 항체, 인간화된 항-CTLA-4 항체, 단클론 항-CTLA-4 항체, 다클론 항-CTLA-4 항체, 키메릭 항-CTLA-4 항체, 항-CTLA-4 도메인 항체), 항-CTLA-4 항체의 단편(예를 들어 (단쇄 항-CTLA-4 단편, 중쇄 항-CTLA-4 단편, 및 경쇄 항-CTLA-4 단편), 및 공-자극 경로를 작동시키는 CTLA-4의 억제제를 포함한다. 일부 실시태양들에서, 상기 CTLA-4 억제제는 이필리뮤맵 또는 트레멜리뮤맵이다.
예르보이(YERVOY)로서 시판되는 이필리뮤맵(또한 MEX-010 또는 MDX-101로서 공지됨)은 인간 항-인간 CTLA-4 항체이다. 이필리뮤맵을 또한 그의 CAS 등록 번호 477202-00-9로 지칭할 수 있으며, 이는 PCT 공보 제 WO 01/14424 호(내용 전체가 모든 목적을 위해서 본 발명에 참고로 인용된다)에서 항체 10DI로서 개시되어 있다. 이필리뮤맵을 포함하는 약학 조성물의 예가 PCT 공보 제 WO 2007/67959 호에 제공되어 있다. 이필리뮤맵은 미국에서 절제할 수 없거나 전이성인 흑색종의 치료에 승인되어 있다. 단독요법으로서 이필리뮤맵의 권장 용량은 총 4 회의 용량에 대해서 매 3 주마다 정맥내 투여에 의해서 3 ㎎/㎏이다. 본 발명에 의해 제공된 방법에서, 이필리뮤맵을 국소, 특히 경피 또는 피하로 투여한다. 국소 투여되는 이필리뮤맵의 유효량은 전형적으로 개인당 5 내지 200 ㎎/용량의 범위이다. 일부 실시태양에서, 상기 이필리뮤맵의 유효량은 용량당 개인당 10 내지 150 ㎎/용량의 범위이다. 일부 특정한 실시태양에서, 상기 이필리뮤맵의 유효량은 개인당 약 10, 25, 50, 75, 100, 125, 150, 175, 또는 200 ㎎/용량이다.
트레멜리뮤맵(또한 CP675,206으로서 공지됨)은 완전 인간 IgG2 단클론 항체이며 CAS 번호 745013-59-6을 갖는다. 트레멜리뮤맵은 미국특허 제 6,682,736 호(내용 전체가 모든 목적을 위해서 본 발명에 참고로 인용된다)에 항체 11.2.1로서 개시되어 있다. 트레멜리뮤맵의 중쇄 및 경쇄의 아미노산 서열들은 각각 서열번호 42 및 43에 설명된다. 트레멜리뮤맵은 흑색종 및 유방암을 포함한 다양한 종양들의 치료에 대한 임상 시험에서 조사되었으며; 여기에서 트레멜리뮤맵은 0.01 및 15 ㎎/㎏ 범위의 용량으로 매 4 또는 12주마다 단일 용량 또는 수회 용량으로서 정맥내 투여되었다. 본 발명에 의해 제공된 요법에서, 트레멜리뮤맵은 경구, 특히 피내 또는 피하 투여된다. 피내 또는 피하 투여되는 트레멜리뮤맵의 유효량은 전형적으로 개인당 5 내지 200 ㎎/용량의 범위이다. 일부 실시태양에서, 상기 트레멜리뮤맵의 유효량은 용량당 개인당 10 내지 150 ㎎/용량의 범위이다. 일부 특정한 실시태양에서, 상기 트레멜리뮤맵의 유효량은 개인당 약 10, 25, 50, 75, 100, 125, 150, 175, 또는 200 ㎎/용량이다.
톨형 수용체(TLR) 작용물질.
"톨형 수용체 작용물질" 또는 "TLR 작용물질"이란 용어는 톨형 수용체(TLR)의 작용물질로서 작용하는 화합물을 지칭한다. 상기는 TLR1, TLR2, TLR3, TLR4, TLR5, TLR6, TLR7, TLR8, TLR9, TLR10, 및 TLR11의 작용물질 또는 이들의 조합을 포함한다. 달리 나타내지 않는 한, TLR 작용물질 화합물에 대한 언급은 임의의 이성질체(예를 들어 부분입체이성질체 또는 거울상이성질체), 염, 용매화물, 다형태 등을 포함하여, 임의의 약학적으로 허용 가능한 형태의 상기 화합물을 포함할 수 있다. 특히, 화합물이 광학적으로 활성인 경우, 상기 화합물에 대한 언급은 상기 화합물들 각각의 거울상이성질체뿐만 아니라 상기 거울상이성질체들의 라세미 혼합물을 포함할 수 있다. 또한, 화합물을 하나 이상의 특정한 TLR의 작용물질(예를 들어 TLR7 작용물질, TLR8 작용물질, 또는 TLR7/8 작용물질)로서 나타낼 수도 있다.
특정 화합물에 대한 TLR 아고니즘(agonism)을 당해 분야에 공지된 임의의 적합한 방식으로 평가할 수 있다. 상기 사용된 특정 분석에 관계없이, 상기 분석을 하나의 화합물로 수행한 결과 적어도 특정한 TLR에 의해 매개된 일부 생물 활성의 한계 증가가 생성되는 경우 상기 화합물을 상기 특정한 TLR의 작용물질로서 나타낼 수 있다. 반대로, 하나의 화합물이 명시된 TLR에 의해 매개된 생물 활성을 검출하도록 설계된 분석을 수행하기 위해 사용될 때, 상기 화합물이 상기 생물 활성의 한계 증가를 이끌어내지 못하는 경우, 상기 화합물을 상기 명시된 TLR의 작용물질로서 작용하지 않는 것으로서 나타낼 수 있다. 달리 나타내지 않는 한, 생물 활성의 증가는 적합한 대조군에서 관찰된 경우에 비해 동일한 생물 활성의 증가를 지칭한다. 분석을 적합한 대조군과 함께 수행할 수도, 수행하지 않을 수도 있다. 경험상, 당해 분야의 숙련가는 특정한 분석에서 한 화합물의 TLR 아고니즘을 측정하기 위해 대조용 실험을 항상 수행할 필요는 없을만큼 충분한 특정 분석에 대한 친숙도(예를 들어 특정한 분석 조건 하에서 적합한 대조군에서 관찰되는 값들의 범위)를 나타낼 수 있다.
본 발명의 방법에서 유용한 몇몇 TLR 작용물질은 큰 생물 분자들, 예를 들어 단백질, 펩타이드 등과 상반되게, 작은 유기 분자들이다. 소분자 TLR 작용물질의 예는 예를 들어 미국특허 제 4,689,338 호; 미국특허 제 4,929,624 호; 미국특허 제 4,988,815 호; 미국특허 제 5,037,986 호; 미국특허 제 5,175,296 호; 미국특허 제 5,238,944 호; 미국특허 제 5,266,575 호; 미국특허 제 5,268,376 호; 미국특허 제 5,346,905 호; 미국특허 제 5,352,784 호; 미국특허 제 5,367,076 호; 미국특허 제 5,389,640 호; 미국특허 제 5,395,937 호; 미국특허 제 5,446,153 호; 미국특허 제 5,482,936 호; 미국특허 제 5,693,811 호; 미국특허 제 5,741,908 호; 미국특허 제 5,756,747 호; 미국특허 제 5,939,090 호; 미국특허 제 6,039,969 호; 미국특허 제 6,083,505 호; 미국특허 제 6,110,929 호; 미국특허 제 6,194,425 호; 미국특허 제 6,245,776 호; 미국특허 제 6,331,539 호; 미국특허 제 6,376,669 호; 미국특허 제 6,451,810 호; 미국특허 제 6,525,064 호; 미국특허 제 6,545,016 호; 미국특허 제 6,545,017 호; 미국특허 제 6,558,951 호; 및 미국특허 제 6,573,273 호에 개시된 것들을 포함한다. 본 발명에 의해 제공된 방법에 유용한 특정한 소분자 TLR 작용물질의 예는 4-아미노-알파,알파,2-트라이메틸-1H-이미다조[4,5-c]퀴놀린-1-에탄올, N-(2-{2-[4-아미노-2-(2-메톡시에틸)-1H-이미다조[4,5-c]퀴놀린-1-일]에톡시-}에틸)-N-메틸모폴린-4-카복스아미드, 1-(2-아미노-2-메틸프로필)-2-(에톡시메틸-)-1H-이미다조[4,5-c]퀴놀린-4-아민, N-[4-(4-아미노-2-에틸-1H-이미다조[4,5-c]퀴놀린-1-일)부틸]메탄설폰아미드, N-[4-(4-아미노-2-프로필-1H-이미다조[4,5-c]퀴놀린-1-일)부틸]메탄설폰아미드, 및 이미퀴모드를 포함한다. 본원에 의해 제공된 방법 또는 요법에 특히 유용한 일부 TLR 작용물질들은 문헌[Folkert Steinhagen, et al.: TLR-based immune adjuvants. Vaccine 29 (2011): 3341-3355]에 논의되어 있다.
일부 실시태양들에서, 상기 TLR 작용물질은 TLR9 작용물질, 특히 CpG 올리고뉴클레오타이드(또는 CpG.ODN)이다. CpG 올리고뉴클레오타이드는 시토신에 이어서 포스페이트 결합에 의해 결합된 구아닌을 함유하는 짧은 핵산 분자이며, 여기에서 상기 시토신의 피리미딘 고리는 메틸화되지 않는다. CpG동기는 중심 CpG(그의 3' 및 5' 측면)에 측면 인접하는 하나 이상의 염기에 의해 둘러싸인 메틸화되지 않은 중심 CpG를 포함하는 염기들의 패턴이다. CpG 올리고뉴클레오타이드는 D 및 K 올리고뉴클레오타이드를 모두 포함한다. 상기 전체 CpG 올리고뉴클레오타이드는 메틸화되지 않거나 또는 부분이 메틸화되지 않을 수도 있다. 본원에 의해 제공된 방법에 유용한 CpG 올리고뉴클레오타이드의 예는 미국특허 제 6194388 호, 미국특허 제 6207646 호, 미국특허 제 6214806 호, 미국특허 제 628371 호, 미국특허 제 6239116 호, 및 미국특허 제 6339068 호에 개시된 것들을 포함한다.
상기 CpG 올리고뉴클레오타이드는 포스포다이에스터 뉴클레오사이드간 가교, 베타-D-리보스(데옥시리보스) 단위 및/또는 천연 뉴클레오사이드 염기(아데닌, 구아닌, 시토신, 티민, 유라실)를 포함하여, 천연 RNA 및 DNA에 비해 다양한 화학적 변형 및 치환을 포함할 수 있다. 화학적 변형들의 예는 숙련가에게 공지되어 있으며 예를 들어 문헌[Uhlmann E. et al. (1990), Chem. Rev. 90:543; "Protocols for Oligonucleotides and Analogs", Synthesis and Properties and Synthesis and Analytical Techniques, S. Agrawal, Ed., Humana Press, Totowa, USA 1993]; 문헌[Crooke, ST. et al. (1996) Annu. Rev. Pharmacol. Toxicol. 36:107-129]; 및 문헌[Hunziker J. et al., (1995), Mod. Synth. Methods 7:331-417]에 개시되어 있다. 구체적으로, CpG 올리고뉴클레오타이드는 변형된 시토신을 함유할 수 있다. 변형된 시토신은 상기 올리고뉴클레오타이드의 면역자극 활성에 손상없이 염기를 치환할 수 있는 시토신의 천연 또는 비천연 피리미딘 염기 유사체이다. 변형된 시토신은 비제한적으로 5-치환된 시토신(예를 들어 5-메틸-시토신, 5-플루오로시토신, 5-클로로-시토신, 5-브로모-시토신, 5-요오도-시토신, 5-하이드록시-시토신, 5-하이드록시메틸-시토신, 5-다이플루오로메틸-시토신, 및 비치환되거나 치환된 5-알키닐-시토신), 6-치환된 시토신, N4-치환된 시토신(예를 들어 N4-에틸-시토신), 5-아자-시토신, 2-머캅토-시토신, 아이소시토신, 슈도-아이소시토신, 축합된 고리 시스템을 갖는 시토신 유사체(예를 들어 N,N'-프로필렌 시토신 또는 페녹사진), 및 유라실 및 그의 유도체(예를 들어 5-플루오로-유라실, 5-브로모-유라실, 5-브로모비닐-유라실, 4-티오-유라실, 5-하이드록시-유라실, 5-프로피닐-유라실)을 포함한다. 상기 바람직한 시토신 중 일부는 5-메틸-시토신, 5-플루오로-시토신, 5-하이드록시-시토신, 5-하이드록시메틸-시토신, 및 N4-에틸-시토신을 포함한다.
CpG 올리고뉴클레오타이드는 또한 변형된 구아닌을 함유할 수 있다. 변형된 구아닌은 상기 올리고뉴클레오타이드의 면역자극 활성에 손상없이 염기를 치환할 수 있는 구아닌의 천연 또는 비천연 퓨린 염기 유사체이다. 변형된 구아닌은 비제한적으로 7-데아자구아닌, 7-데아자-7-치환된 구아닌, 하이폭산틴, N2-치환된 구아닌(예를 들어 N2-메틸-구아닌), 5-아미노-3-메틸-3H,6H-티아졸로[4,5-d]피리미딘-2,7-다이온, 2,6-다이아미노퓨린, 2-아미노퓨린, 퓨린, 인돌, 아데닌, 치환된 아데닌(예를 들어 N6-메틸-아데닌, 8-옥소-아데닌), 8-치환된 구아닌(예를 들어 8-하이드록시구아닌 및 8-브로로구아닌), 및 6-티오구아닌을 포함한다. 본원의 일부 실시태양에서, 상기 구아닌 염기는 만능 염기(예를 들어 4-메틸-인돌, 5-나이트로-인돌, 및 K-염기), 방향족 고리 시스템(예를 들어 벤즈이미다졸 또는 다이클로로-벤즈이미다졸, 1-메틸-1H-[1,2,4]트라이아자-3-카복실산 아미드) 또는 수소 원자에 의해 치환된다.
몇몇 태양에서, 상기 CpG 올리고뉴클레오타이드는 변형된 주쇄를 포함한다. 상기 핵산 주쇄의 변형은 생체내 투여될 때 핵산의 증대된 활성을 제공함이 입증되었다. 2차 구조, 예를 들어 줄기 고리는 핵산을 변성에 대해서 안정화시킬 수 있다. 한편으로, 핵산 안정화는 포스페이트 주쇄 변형을 통해서 수행될 수 있다. 바람직한 안정한 핵산은 적어도 부분적인 포스포로티오에이트 변형된 주쇄를 갖는다. 포스포로티오에이트를 포스포아미데이트 또는 H-포스포네이트 화학을 사용하는 자동화 기법을 사용하여 합성할 수 있다. 아릴- 및 알킬-포스포네이트를 예를 들어 미국특허 제 4,469,863 호에 개시된 바와 같이 제조할 수 있으며; 알킬포스포트라이에스터(여기에서 하전된 산소 부분은 미국특허 제 5,023,243 호 및 유럽특허 제 092,574 호에 개시된 바와 같이 알킬화된다)는 상업적으로 입수할 수 있는 시약들을 사용하여 자동화된 고상 합성에 의해 제조할 수 있다. 다른 DNA 주쇄 변형 및 치환의 생성 방법이 개시되었다(문헌[Uhlmann, E. and Peyman, A. (1990) Chem. Rev. 90:544]; 문헌[Goodchild, J. (1990) Bioconjugate Chem. 1:165]). CpG동기를 갖는 2'-O-메틸 핵산은 또한, 에톡시-변형된 CpG핵산과 같이, 면역 활성화를 유발한다. 실제로, 상기 CpG효과를 완전히 없애는 주쇄 변형은 발견되지 않았지만, 일반적으로 상기 효과는 상기 C를 5-메틸 C로 치환시킴으로써 크게 감소된다. 포스포로티오에이트 결합을 갖는 구축물은 최대 활성을 제공하며 세포내 엑소- 및 엔도-뉴클레아제에 의해 상기 핵산을 변성으로부터 보호한다. 다른 변형된 올리고뉴클레오타이드는 포스포다이에스터 변형된 올리고뉴클레오타이드, 포스포다이에스터 및 포스포로티오에이트 올리고뉴클레오타이드, 메틸포스포네이트, 메틸포스포로티오에이트, 포스포로다이티오에이트, p-에톡시의 조합, 및 이들의 조합을 포함한다. 이들 각각의 조합 및 면역세포에 대한 이들의 특정한 효과는 WO 96/02555 및 WO 98/18810 및 미국특허 제 6,194,388 호 및 미국특허 제 6,239,116 호에서 CpG핵산에 대하여 보다 상세히 논의되어 있다.
상기 CpG 올리고뉴클레오타이드는 하나 또는 2 개의 이용 가능한 5' 단부를 가질 수 있다. 예를 들어, 2 개의 올리고뉴클레오타이드를 3'-3' 결합을 통해 부착시켜 하나 또는 2 개의 이용 가능한 5' 단부를 갖는 올리고뉴클레오타이드를 생성시킴으로써 2 개의 상기와 같은 5' 단부를 갖는 변형된 올리고뉴클레오타이드를 생성시키는 것이 가능하다. 상기 3'-3'-결합은 포스포다이에스터, 포스포로티오에이트 또는 임의의 다른 변형된 뉴클레오사이드간 가교일 수 있다. 상기와 같은 결합을 수행하는 방법은 당해 분야에 공지되어 있다. 예를 들어, 상기와 같은 결합은 문헌[Seliger, H. et al., Oligonucleotide analogs with terminal 3'-3'- and 5'-5'-internucleotidic linkages as antisense inhibitors of viral gene expression, Nucleosides and Nucleotides (1991), 10(1 -3), 469-77] 및 문헌[Jiang, et al., Pseudo-cyclic oligonucleotides: in vitro and in vivo properties, Bioorganic and Medicinal Chemistry (1999), 7(12), 2727-2735]에 개시되었다.
또한, 3'-말단 뉴클레오사이드들간의 결합이 포스포다이에스터, 포스포로티오에이트 또는 다른 변형된 가교가 아닌 3'-3'-결합된 올리고뉴클레오타이드를 추가적인 이격자, 예를 들어 트라이- 또는 테트라-에틸렌글리콜 포스페이트 부분을 사용하여 제조할 수 있다(문헌[Durand, M. et al., Triple-helix formation by an oligonucleotide containing one (dA)12 and two (dT)12 sequences bridged by two hexaethylene glycol chains, Biochemistry (1992), 31 (38), 9197-204], 미국특허 제 5,658,738 호 및 미국특허 제 5,668,265 호). 한편으로, 비-뉴클레오타이드 링커를 표준 포스포아미다이트 화학을 사용하여 에탄다이올, 프로판다이올, 또는 무염기 데옥시리보스(d이격자) 단위(문헌[Fontanel, Marie Laurence et al., Nucleic Acids Research (1994), 22(11), 2022-7])로부터 유도할 수 있다. 상기 비-뉴클레오타이드 링커를 1 회 또는 수회 통합시키거나, 또는 서로 결합시켜, 결합시키고자 하는 2 개의 올리고뉴클레오타이드의 3'-단부들 간에 임의의 바람직한 거리를 허용할 수 있다.
뉴클레오사이드의 3' 및/또는 5' 단부에 위치한 포스포다이에스터 뉴클레오사이드간 가교를 변형된 뉴클레오사이드간 가교에 의해 치환시킬 수 있으며, 여기에서 상기 변형된 뉴클레오사이드간 가교는 예를 들어 포스포로티오에이트, 포스포로다이티오에이트, NRiR2-포스포아미데이트, 보라노포스페이트, a-하이드록시벤질 포스포네이트, 포스페이트-(C1-C21)-O-알킬 에스터, 포스페이트-[(C6-C21)아릴-(C1-C21)-O-알킬]에스터, (C1-C8)알킬포스포네이트 및/또는 (C6-C21)아릴포스포네이트 가교, (C7-C12)-a-하이드록시메틸-아릴(예를 들어 PCT 공보 제 WO 95/01363) 중에서 선택되며, 여기에서 (C6-C12)아릴, (C6-C20)아릴 및 (C6-C14)아릴은 할로겐, 알킬, 알콕시, 나이트로, 시아노에 의해 임의로 치환되고, Ri 및 R2는 서로 독립적으로 수소, (C1-C18)-알킬, (C6-C20)-아릴, (C6-C14)-아릴, (C1-C8)-알킬, 바람직하게는 수소, (C1-C8)-알킬, 바람직하게는 (C1-C4)-알킬 및/또는 메톡시에틸이거나, 또는 R1 및 R2는 이들을 수반하는 질소원자와 함께 5 내지 6-원 헤테로사이클릭 고리를 형성하며, 상기 고리는 O, S 및 N 기 중에서 선택된 추가의 헤테로원자를 추가로 함유할 수 있다.
포스포다이에스터 가교의 데포스포 가교(데포스포 가교는 예를 들어 문헌[Uhlmann E. and Peyman A. in "Methods in Molecular Biology", Vol. 20, "Protocols for Oligonucleotides and Analogs", S. Agrawal, Ed., Humana Press, Totowa 1993, Chapter 16, pp. 355 ff]에 개시되어 있다)에 의한 치환은 뉴클레오사이드의 3' 및/또는 5' 단부에 위치하며, 여기에서 데포스포 가교는 예를 들어 데포스포 가교 폼아세탈, 3'-티오폼아세탈, 메틸하이드록실아민, 옥심, 메틸렌다이메틸하이드라조, 다이메틸렌설폰 및/또는 실릴기 중에서 선택된다.
본원에 의해 제공된 방법 또는 요법에 사용하기 위한 CpG 올리고뉴클레오타이드는 임의로 키메릭 주쇄를 가질 수도 있다. 키메릭 주쇄는 한 가지보다 많은 유형의 결합을 포함하는 것이다. 하나의 실시태양에서, 상기 키메릭 주쇄는 식 5' Y1 N1ZN2Y2 3'에 의해 나타낼 수 있다. Y1 및 Y2는 1 내지 10 개의 뉴클레오타이드를 갖는 핵산 분자이다. Y1 및 Y2는 각각 하나 이상의 변형된 뉴클로타이드간 결합을 포함한다. 상기 키메릭 올리고뉴클레오타이드들 중 2 개 이상의 뉴클레오타이드가 주쇄 변형을 갖기 때문에, 이들 핵산은 한 가지 유형의 "안정화된 면역자극성 핵산"의 일례이다.
상기 키메릭 올리고뉴클레오타이드에 관하여, Y1 및 Y2는 서로 독립적인 것으로 간주된다. 이는 Y1 및 Y2가 각각 동일한 분자에서 서로 상이한 서열 및 상이한 주쇄 결합을 가질 수도, 또는 갖지 않을 수도 있음을 의미한다. 일부 실시태양에서, Y1 및/또는 Y2는 3 내지 8 개의 뉴클레오타이드를 갖는다. N1 및 N2는 N1N2가 총 6 개 이상의 뉴클레오타이드를 갖는 한 0 내지 5 개의 뉴클레오타이드를 갖는 핵산 분자이다. N1ZN2의 뉴클레오타이드는 포스포다이에스터 주쇄를 가지며 변형된 주쇄를 갖는 핵산을 포함하지 않는다. Z는 면역자극성 핵산 동기이며, 바람직하게는 본 발명에 인용된 것들 중에서 선택된다.
식 Y1 N1ZN2Y2의 중심 뉴클레오타이드 (N1ZN2)는 포스포다이에스터 뉴클레오타이드간 결합을 가지며 Y1 및 Y2는 변형된 뉴클레오타이드간 결합을 하나 이상 갖지만, 하나 초과 또는 심지어 전부 가질 수도 있다. 바람직한 실시태양에서, Y1 및/또는 Y2는 2 개 이상 또는 2 내지 5 개의 변형된 뉴클레오타이드간 결합을 갖거나 또는 Y1은 5 개의 변형된 뉴클레오타이드간 결합을 갖고 Y2는 2 개의 변형된 뉴클레오타이드간 결합을 갖는다. 일부 실시태양들에서, 상기 변형된 뉴클레오타이드간 결합은 포스포로티오에이트 변형된 결합, 포스포로다이티오에이트 결합 또는 p-에톡시 변형된 결합이다.
본원에 의해 제공된 방법들에서 유용한 특정한 CpG 올리고뉴클레오타이드의 예는 하기를 포함한다:
5' TCGTCGTTTTGTCGTTTTGTCGTT3' (CpG7909);
5' TCGTCGTTTTTCGGTGCTTTT3' (CpG24555); 및
5' TCGTCGTTTTTCGGTCGTTTT3' (CpG10103).
합성 24머 단일 가닥인 CpG7909는 단독요법으로서 및 화학요법제뿐만 아니라, 암 및 감염성 질병에 대한 백신용 항원보강제로서의 항원보강제로서 암의 치료를 위해 광범위하게 연구되었다. CpG7909의 단일 정맥내 용량은 1.05 ㎎/㎏까지 임상적 효과도, 현저한 독성도 없이 잘 허용되는 반면, 단일 용량 피하 CpG7909는 근육통의 용량 제한 독성 및 체질 영향과 함께 0.45 ㎎/㎏의 최대 허용 용량(MTD)을 갖는 것으로 보고되었다(문헌[Zent, Clive S, et al: Phase I clinical trial of CpGoligonucleotide 7909 (PF-03512676) in patients with previously treated chronic lymphocytic leukemia. Leukemia and Lymphoma, 53(2):211-217(7)(2012)]을 참조하시오). 본원에 의해 제공된 요법에서, CpG7909를 근육내 주사 또는 임의의 다른 적합한 방법에 의해 투여할 수 있다. 특히 피내 또는 피하 투여에 의해 백신 배액 림프절에 가깝게 국소 투여하는 것이 바람직하다. DNA 백신과 같은 핵산 백신과 함께 사용하기 위해서, CpG를 바람직하게는 단일 제형으로 상기 백신과 동시-제형화하고 전기천공법과 결합된 근육내 주사에 의해 투여할 수 있다. 근육내, 피내 또는 피하 투여에 의한 CpG7909의 유효량은 전형적으로 10 ㎍/용량 내지 10 ㎎/용량의 범위이다. 일부 실시태양들에서, CpG7909의 유효량은 0.05 ㎎ 내지 14 ㎎/용량의 범위이다. 일부 특정한 실시태양들에서, CpG7909의 유효량은 약 0.05, 0.1, 0.2, 0.3, 0.4, 0.5, 1 ㎎/용량이다. CpG24555 및 CpG10103을 포함하여, 다른 CpG 올리고뉴클레오타이드를 유사한 방식 및 용량 수준으로 투여할 수 있다.
일부 특정한 실시태양들에서, 본원은 인간에서 신생물 질환의 치료를 위한 백신의 면역원성 또는 치료 효과를 증대시키는 방법을 제공하며, 상기 방법은 상기 인간에게 (1) 유효량의 하나 이상의 ISC 억제제, 및 (2) 유효량의 하나 이상의 IEC 증폭자를 투여함을 포함하고, 여기에서 상기 하나 이상의 ISC 억제제는 소라페니브 토실레이트, 수니티니브 말레이트, 악시티니브, 에를로티니브, 제피티니브, 악시티니브, 보수티니브, 템시롤리스무스 및 닐로티니브 중에서 선택된 단백질 키나제 억제제이고 상기 하나 이상의 IEC 증폭자는 CTLA-4 억제제, TLR 작용물질 및 CD40 작용물질 중에서 선택된다. 일부 바람직한 실시태양에서, 요법은 상기 인간에게 (1) 유효량의 하나 이상의 ISC 억제제, 및 (2) 유효량의 하나 이상의 IEC 증폭자를 투여함을 포함하고, 여기에서 상기 하나 이상의 ISC 억제제는 악시티니브, 소라페니브 토실레이트 및 수니티니브 말레이트 중에서 선택된 단백질 키나제 억제제이고 상기 하나 이상의 IEC 증폭자는 이필리뮤맵 및 트레멜리뮤맵 중에서 선택된 CTLA-4 억제제이다. 일부 추가의 바람직한 실시태양에서, 상기 요법은 상기 인간에게 (1) 유효량의 하나 이상의 ISC 억제제, 및 (2) 유효량의 2 개 이상의 IEC 증폭자를 투여함을 포함하고, 여기에서 상기 하나 이상의 ISC 억제제는 수니티니브 및 악시티니브 중에서 선택된 단백질 키나제 억제제이고 상기 2 개 이상의 IEC 증폭자는 트레멜리뮤맵, 및 CpG7909, CpG2455, 및 CpG10103 중에서 선택된 TLR 작용물질이다.
일부 다른 실시태양들에서, 본원은 인간에서 전립선암의 치료 방법을 제공하며, 상기 방법은 상기 인간에게 (1) 유효량의, 인간 PAA에 대한 면역 반응을 이끌어낼 수 있는 백신, (2) 유효량의 하나 이상의 ISC 억제제, 및 (3) 유효량의 하나 이상의 IEC 증폭자를 투여함을 포함하고, 여기에서 상기 하나 이상의 ISC 억제제는 소라페니브 토실레이트, 수니티니브 말레이트, 악시티니브, 에를로티니브, 제피티니브, 악시티니브, 보수티니브, 템시롤리스무스 및 닐로티니브 중에서 선택된 단백질 키나제 억제제이고 상기 하나 이상의 IEC 증폭자는 CTLA-4 억제제, TLR 작용물질 및 CD40 작용물질 중에서 선택된다. 일부 바람직한 실시태양에서, 상기 방법은 상기 인간에게 (1) 유효량의, 인간 PAA에 대한 면역 반응을 이끌어낼 수 있는 백신, (2) 유효량의 하나 이상의 ISC 억제제, 및 (3) 유효량의 하나 이상의 IEC 증폭자를 투여함을 포함하고, 여기에서 상기 하나 이상의 ISC 억제제는 악시티니브, 소라페니브 토실레이트 및 수니티니브 말레이트 중에서 선택된 단백질 키나제 억제제이고 상기 하나 이상의 IEC 증폭자는 이필리뮤맵 및 트레멜리뮤맵 중에서 선택된 CTLA-4 억제제이다.
일부 추가의 바람직한 실시태양에서, 상기 방법은 상기 인간에게 (1) 유효량의 하나 이상의 ISC 억제제, 및 (2) 유효량의 2 개 이상의 IEC 증폭자를 투여함을 포함하고, 여기에서 상기 하나 이상의 ISC 억제제는 수니티니브 및 악시티니브 중에서 선택된 단백질 키나제 억제제이고 상기 2 개 이상의 IEC 증폭자는 트레멜리뮤맵, 및 CpG7909, CpG2455, 및 CpG10103 중에서 선택된 TLR 작용물질이다.
추가적인 치료제들.
본원에 의해 제공된 백신-기재 면역치료 요법은 추가적인 치료제를 또한 포함할 수 있다. 화학요법제 및 호르몬 치료제를 포함하여 광범위하게 다양한 암 치료제들을 사용할 수 있다. 당해 분야의 통상적인 숙련가는, 본원에 의해 제공된 VBIR에 사용될 수 있고 여기에서 설명된 요법의 형태들로 제한되지 않는 다른 암 요법의 존재 및 발달을 인식할 것이다.
"화학요법제"란 용어는 암세포사를 유발하거나 또는 암세포의 성장, 분열, 수복 및/또는 작용을 방해할 수 있는 화학적 또는 생물학적 물질을 지칭한다. 화학요법제의 예는 WO2006/088639, WO2006/129163, 및 US 20060153808(이들의 명세는 본 발명에 참고로 인용된다)에 개시된 것들을 포함한다. 특정한 화학요법제의 예는 (1) 알킬화제, 예를 들어 클로람부실(류케란(LEUKERAN)), 사이클로포스파미드(사이톡산(CYTOXAN)), 이포스파미드(이펙스(IFEX)), 메클로르에타민 하이드로클로라이드(머스타젠(MUSTAARGEN)), 티오테파(티오플렉스(THIOPLEX)), 스트렙토조토신(자노사(ZANOSAR)), 카머스틴(빅누(BICNU), 글리아델 와퍼(GLIADEL WAFER)), 로머스틴(시누(CEENU)), 및 다카바진(디틱돔(DTIC-DOME)); (2) 세포독성 항생제를 포함한 알칼로이드 또는 식물 빈카 알칼로이드, 예를 들어 독소루비신(아드리아마이신(ADRIAMYCIN)), 에피루비신(엘렌스(ELLENCE), 파모루비신(PHARMORUBICIN)), 다우노루비신(세루비딘(CERUBIDINE), 다우녹솜(DAUNOXOME)), 네모루비신, 이다루비신(이다마이신(IDAMYCIN) PFS, 자베도스(ZAVEDOS)), 미톡산트론(DHAD, 노반트론(NOVANTRONE)), 닥티노마이신(액티노마이신 D, 코스메젠(COSMEGEN)), 플리카마이신(미트라신(MITHRACIN)), 미토마이신(뮤타마이신(MUTAMYCIN)), 및 블레오마이신(블레녹산(BLENOXANE)), 비노렐빈 타르트레이트(나벨빈(NAVELBINE)), 빈블라스틴(벨반(VELBAN)), 빈크리스틴(온코빈(ONCOVIN)), 및 빈데신(엘디신(ELDISINE)); (3) 대사길항물질, 예를 들어 카페시타빈(젤로다(XELODA)), 시타라빈(시토사(CYTOSAR)-U), 플루다라빈(플루다라(FLUDARA)), 젬시타빈(젬자(GEMZAR)), 하이드록시유레아(하이드라(HYDRA)), 메토트렉세이트(폴렉스(FOLEX), 멕사테(MEXATE), 트렉살(TREXALL)), 넬라라빈(아라논(ARRANON)), 트라이메트렉세이트(뉴트렉신(NEUTREXIN)), 및 페메트렉시드(알림타(ALIMTA)); (4) 피리미딘 길항물질, 예를 들어 5-플루오로유라실(5-FU); 카페시타빈(젤로다), 랄티트렉시드(토뮤덱스(TOMUDEX)), 테가퓨어-유라실(유프토랄(UFTORAL)), 및 젬시타빈(젬자); (5) 탁산, 예를 들어 도세탁셀(탁소테레(TAXOTERE)), 패클리탁셀(탁솔(TAXOL)); (6) 백금 약물, 예를 들어 시스플라틴(플라티놀(PLATINOL)) 및 카보플라틴(파라플라틴(PARAPLATIN)), 및 옥살리플라틴(엘록사틴(ELOXATIN)); (7) 국소이성화효소 억제제, 예를 들어 이리노테칸(캄토사(CAMPTOSAR)), 토포테칸(하이캠틴(HYCAMTIN)), 에토포시드(에토포포스(ETOPOPHOS), 베페시드(VEPESSID), 토포사(TOPOSAR)), 및 테니포시드(뷰몬(VUMON)); (8) 에피포도필로톡신(포도필로톡신 유도체), 예를 들어 에토포시드(에토포포스, 베페시드, 토포사); (9) 엽산 유도체, 예를 들어 류코보린(웰코보린(WELLCOVORIN)); (10) 나이트로소유레아, 예를 들어 카머스틴(BiCNU), 로머스틴(CeeNU); (11) 상피 성장 인자 수용체(EGFR), 혈관 내피 성장 인자(VEGF), 인슐린 수용체, 인슐린-유사 성장 인자 수용체(IGFR), 간세포 성장 인자 수용체(HGFR), 및 혈소판-유래된 성장 인자 수용체(PDGFR)를 포함한, 수용체 타이로신 키나제의 억제제, 예를 들어 제피티니브(이레사(IRESSA)), 에를로티니브(타세바(TARCEVA)), 볼테조미브(벨케이드(VELCADE)), 이마티니브 메실레이트(글리벡(GLEEVEC)), 제네피티니브, 라파티니브, 소라페니브, 탈리도미드, 수니티니브(슈텐트), 악시티니브, 리툭시맵(리툭산(RITUXAN), 멥테라(MABTHERA)), 트라스투주맵(허셉틴(HERCEPTIN)), 세툭시맵(에르비툭스(ERBITUX)), 베바시주맵(아바스틴(AVASTIN)), 및 라니비주맵(루센티스(LUCENTIS)), lym-1(온콜림(ONCOLYM)), 인슐린-유사 성장 인자-1 수용체(IGF-1R)에 대한 항체(WO2002/053596에 개시된 것); (12) 혈관형성 억제제, 예를 들어 베바시주맵(아바스틴(AVASTIN)), 슈라민(제르마닌(GERMANIN)), 안지오스타틴, SU5416, 탈리도미드, 및 기질 메탈로프로테이나제 억제제(예를 들어 바티마스태트 및 마리마스태트), 및 WO2002055106에 개시된 것들; 및 (13) 프로테아솜 억제제, 예를 들어 보르테조미브(벨케이드)를 포함한다.
"호르몬 치료제"란 용어는 호르몬의 생산을 억제하거나 제거하거나, 또는 암세포의 성장 및/또는 생존에 대한 호르몬의 작용을 억제하거나 중화시키는 화학적 또는 생물학적 물질을 지칭한다. 특정한 호르몬 치료제의 예는 타목시펜(놀바덱스(NOLVADEX)), 토레미펜(파레스톤(Fareston)), 풀베스트란트(파스로덱스(FASLODEX)), 아나스트로졸(아리미덱스(ARIMIDEX)), 엑세메스탄(아로마신(AROMASIN)), 레트로졸(페마라(FEMARA)), 메제스트롤 아세테이트(메제이스(MEGACE)), 고세렐린(졸라덱스(ZOLADEX)), 류프롤리드(루프론(LUPRON)), 아비라테론 및 MDV3100을 포함한다.
본원에 의해 제공된 VBIR을 또한 다른 요법들, 예를 들어 (1) 상기 호르몬의 생산에 관여하는 기관 또는 샘들, 예를 들어 난소, 고환, 부신, 및 뇌하수체샘의 일부 또는 전부를 제거하는 외과적 방법, 및 (2) 상기 환자의 기관 또는 샘에, 표적 호르몬의 생산을 억제하거나 제거하기에 충분한 양의 방사선을 가하는 방사선 치료와 함께 사용할 수 있다.
I. 실시예
하기의 실시예들은 본 발명의 몇몇 실시태양들을 예시하기 위해 제공된다. 이들 실시예를, 본 발명의 범위를 임의의 방식으로 제한하는 것으로 해석해서는 안 된다. 상기 논의 및 이들 실시예로부터, 당해 분야의 숙련가들은 본 발명의 필수적인 특징들을 확인할 수 있으며, 본 발명의 진의 및 범위로부터 이탈됨 없이 이들 특징이 다양한 용도 및 조건에 적합하도록 본 발명의 다양한 변화 및 변경을 수행할 수 있다.
실시예 1. 인간 PSMA 단백질로부터 유도된 시토솔, 분비된 및 막-결합된 포맷의 항원
실시예 1은 각각 "인간 PSMA 시토솔 항원", "인간 PSMA 분비된 항원" 및 "인간 PSMA 막-결합된 항원"이라 지칭되는 3 개의 면역원성 PSMA 폴리펩타이드의 제작 및 이들 폴리펩타이드의 생물학적 성질들을 예시한다.
1A. 면역원성 PSMA 폴리펩타이드의 설계
시토솔, 분비된 및 변형된 포맷의 면역원성 PSMA 폴리펩타이드를 암호화하는 DNA 구축물을 고유의 인간 PSMA 단백질 서열을 기본으로 제작하고 종양-억제 효과기 면역 반응을 유도하는 이들의 능력에 대해 시험하였다. 상기 인간 PSMA 항원 포맷들 각각의 구조 및 제조를 하기와 같이 제공한다.
1A1. 인간 PSMA 시토솔 항원.
시토솔 형태의 면역원성 PSMA 폴리펩타이드를, 상기 폴리펩타이드가 일단 발현되면 세포 내부에서 상기 면역원성 폴리펩타이드를 유지하도록 설계하였다. 상기 인간 PSMA의 세포질 도메인(아미노산 1-19) 및 막관통 도메인(아미노산 20-43)을 제거하여, 서열번호 1의 인간 PSMA의 아미노산 44-750(세포외 도메인 또는 ECD)으로 이루어지는 시토솔 PSMA 폴리펩타이드를 생성시켰다.
1A2. 인간 PSMA 분비된 항원.
분비된 형태의 면역원성 PSMA 폴리펩타이드를, 상기 폴리펩타이드가 일단 발현되면 세포 밖에서 상기 폴리펩타이드를 분비하도록 설계하였다. 상기 분비된 폴리펩타이드를, 상기 폴리펩타이드가 일단 발현되면 상기 PSMA 항원의 분비를 최대화하기 위해서, 서열번호 1의 인간 PSMA의 아미노산 44-750(ECD), 및 N-말단에 아미노산 서열 ETDTLLLWVLLLWVPGSTGD 및 2- 아미노산 링커(AA)를 갖는 Ig 카파 분비 요소로 제조한다.
1A3. 인간 PSMA 막-결합된 항원.
면역원성 PSMA 막-결합된 폴리펩타이드를 세포 표면상에서 상기 폴리펩타이드가 안정화되도록 설계하였다. 상기 인간 PSMA 단백질의 처음 14개 아미노산을 제거하였으며 생성된 면역원성 폴리펩타이드는 서열번호 1의 인간 PSMA 단백질의 아미노산 15 - 750으로 이루어진다. 서열번호 1의 고유 인간 PSMA 단백질의 아미노산 15 - 750으로 이루어지고 고유 인간 PSMA 단백질과 100% 서열 일치성을 공유하는 면역원성 폴리펩타이드를 또한 본원에서 "변형된 인간 PSMA", "변형된 hPSMA", 또는 "hPSMAmod" 항원이라 칭한다.
1B. PSMA 항원을 발현시키기 위한 DNA 플라스미드의 제조
상기 PSMA 시토솔, PSMA 분비된, 및 PSMA 변형된 항원을 암호화하는 DNA 구축물을, 동물에서 생체내 시험에 적합한 PJV7563 벡터에 개별적으로 클로닝시켰다(도 1). 상기 PJV7563 벡터 중 DNA의 2 개의 가닥을 모두 서열화하여 상기 설계 완전성을 확인하였다.
대규모 플라스미드 DNA 제제(퀴아겐/CsCl)는 서열 확인된 클론으로부터 생성되었다. 상기 플라스미드 DNA의 질을 고 260/280 비, 높은 초나선/끊긴 DNA 비, 낮은 내독소 수준(<10 U/㎎ DNA) 및 음성 생물오염에 의해 확인하였다.
1C. 포유동물 세포에서 PSMA 구축물의 발현
상기 PSMA 시토솔, 분비된 및 변형된 항원의 발현을 FACS에 의해 측정하였다. 포유동물 293 세포를 다양한 면역원성 PSMA 폴리펩타이드를 암호화하는 PJV7563 PMED 벡터로 형질감염시켰다. 3일 후에, 상기 293 세포를 마우스 항-PSMA 항체로 염색한 다음, 형광 접합된(FITC) 래트 항-마우스 2차 항체로 염색하였다. 음성 대조군에 대한 평균 형광 강도(MFI)로서 보고된 하기의 데이터는 인간 PSMA 변형된 항원이 세포 표면상에서 발현됨을 입증한다.
Figure pat00001
1D. 금 입자상에의 PSMA 플라스미드의 제형화(ND10/X15에 대해서)
입자 매개된 표피 전달 기술(PMED)은 동물 또는 환자에게 백신을 투여하는 무침 방법이다. 상기 PMED 시스템은 미세 금 입자상에 DNA의 침전에 이어서 헬륨 가스에 의해 표피내로 추진시킴을 수반한다. 1회용 기구인 ND10은 내부 실린더로부터 가압된 헬륨을 사용하여 금 입자를 전달하며, 반복사용되는 전달 기구인 X15는 고압 호스를 통해 X15에 연결된 외부 헬륨 탱크를 사용하여 상기 금 입자를 전달한다. 이들 기구를 모두 상기 PSMA DNA 플라스미드의 전달을 위해 연구에 사용하였다. 상기 금 입자는 직경이 대개 1 내지 3 ㎛이었고 금 입자 1 ㎎당 2 ㎍의 PSMA 플라스미드를 함유하도록 제형화되었다(문헌[Sharpe, M. et al.: P. Protection of mice from H5N1 influenza challenge by prophylactic DNA vaccination using particle mediated epidermal delivery. Vaccine, 2007, 25(34): 6392-98]: 문헌[Roberts LK, et al.: Clinical safety and efficacy of a powdered Hepatitis B nucleic acid vaccine delivered to the epidermis by a commercial prototype device. Vaccine, 2005; 23(40):4867-78]).
1E. 생체내 연구에 사용된 트랜스제닉 마우스
2 개의 인간 HLA 트랜스제닉 마우스 모델을 사용하여 상이한 HLA에 의한 다양한 PSMA 항원의 제공을 평가하였으며 인간 PSMA 트랜스제닉 마우스 모델을 사용하여 인간 PSMA에 대한 면역 관용의 파괴를 평가하였다. 첫 번째 HLA 트랜스제닉 마우스 모델은 HLA A2/DR1 마우스(파스퇴르 인스티튜트(Pasteur Institute)(프랑스 파리 소재)로부터; 또한 "파스퇴르 마우스"라 칭한다)를 사용한다. 파스퇴르 마우스를 쥐 β-2-미세글로불린에 대해서 녹아웃시키고 상기 마우스는 작용성 H-2b 분자를 발현하지 않으며; 따라서 상기 모델은 인간 HLA A2 및 DR1 상황에서 항원 제공을 나타내는 것으로 여겨진다(문헌[Pajot, A., M.-L. Michel, N. Faxilleau, V. Pancre, C. Auriault, D.M. Ojcius, F.A. Lemonnier, and Y.-C. Lone. A mouse model of human adaptive immune functions: HLA-A2.1-/HLA-DR1-transgenic H-2 class I-/class II-knockout mice. Eur. J. Immunol. 2004, 34:3060-69]). 두 번째 HLA 트랜스제닉 마우스 모델은 H2bk 자리에서 인간 β-2-미세글로불린에 공유 결합된 인간 HLA A24를 넣은(konck in) 마우스를 사용한다. 이들 마우스는 쥐 β-2-미세글로불린이 없으며 작용성 H-2b 분자를 발현하지 않는다. 상기 모델은 인간 HLA A24와 관련하여 항원 제공의 평가를 허용한다.
1F. 시토솔, 분비된 및 변형된 포맷의 인간 PSMA 단백질의 면역원성
연구 설계.
8 내지 10주령 트랜스제닉 마우스를 초회항원자극/추가접종/추가접종 요법으로, 각각의 백신화 사이에 2 주 간격으로, 다양한 PSMA DNA 구축물과 PMED 방법을 사용하여 면역시켰다. 한편으로, 마우스를 근육내 주사에 의해 50 ㎕(PBS) 중의 1 x 109 바이러스 입자로, 상기 PSMA 항원을 암호화하는 아데노바이러스 벡터로 초회항원자극하였다. 상기 아데노바이러스 벡터(스트라타진(Stratagene)으로부터의 p셔틀-CMV 벡터)를 다수의 클로닝 부위내에 NheI 및 BglII 제한 부위를 함유하도록 변형시켰다. 이어서 상기 변형된 인간 PSMA를 암호화하는 DNA를 NheI 및 BglII로 제한 절단하고, 상기 벡터에 연결하고 서열을 확인하였다. 이어서 상기 p셔틀 인간 PSMA 변형된 벡터를 pAdEasy-1 벡터와 재결합시키고 바이러스를 상기 AdEasy 시스템(스트라타진)에 따라 번식시켰다. 20일 후에, 상술한 바와 같이 PMED로 추가접종하였다. 상기 사용된 요법들 각각에서, 항원 특이성 T 세포 반응을 인터페론-감마(IFNγ) ELISPOT 분석에서 최종 면역화 후 7일째에 측정하였다. 상기 ELISPOT 분석은 샌드위치 효소-결합된 면역흡수 분석(ELISA)과 유사한다. 간단히, IFNγ에 특이적인 포획 항체(BD 바이오사이언스, #51-2525kc)를 4 ℃에서 미세플레이트상에서 밤새 폴리비닐리덴 플루오라이드(PVDF) 멤브레인상에 코팅한다. 상기 플레이트를 혈청/단백질로 차단하여 상기 항체에 대한 비특이적 결합을 방지한다. 차단 후에, 효과기 세포(예를 들어 PSMA 면역된 마우스로부터 단리된 비장세포) 및 표적(예를 들어 펩타이드 라이브러리로부터의 PSMA 펩타이드, 펩타이드로 펄스화된 표적 세포 또는 관련 항원을 발현하는 종양 세포) 또는 미토젠(IFNγ를 생산하도록 비장세포를 비특이적으로 자극한다)을 상기 웰에 가하고 37 ℃에서 5% CO2 배양기에서 밤새 배양한다. 효과기 세포에 의해 분비된 사이토킨을 PVDF 멤브레인의 표면상의 코팅 항체에 의해 포획한다. 상기 세포 및 배양 배지를 제거한 후에, 100 ㎕의 비오틴화된 다클론 항-마우스 IFNγ 항체(0.5 ㎎/㎖-BD 바이오사이언스, #51-1818kz)를 검출을 위해 상기 웰들 각각에 가하였다. 스트렙트아비딘-양고추냉이 퍼옥시다제(HRP, BD 바이오사이언스, #557630) 및 침전 기질, 3-아미노-9-에틸카바졸(AEC)을 가하여 적색 스폿을 제공함으로써 스폿들을 가시화한다. 각각의 스폿은 단일 사이토킨 생산 T 세포를 나타낸다. 일반적으로 여기에 개시된 연구에서 상기 ELISPOT 분석은 하기와 같이 설정되었다: PSMA 면역된 마우스로부터 5 x 105 비장세포를 (1) 11 개 아미노산까지 겹치는 15- 아미노산 펩타이드로 제조된 PSMA 펩타이드 라이브러리(표 16 참조)로부터 유래된 PSMA 특이성 펩타이드의 존재 하에서, (2) 공지된 HLA A2.1 제한된 PSMA 특이성 펩타이드와 함께, 또는 (3) 종양 세포와 함께 배양하였다. 내생적인 항원 제공의 인식을 측정하기 위해서, 비장세포를 PSMA를 천연으로 발현하는 인간 HLA A2 전립선암 세포(즉 LNCaP, ATCC로부터 입수할 수 있다)와 함께 배양하거나, 또는 인간 PSMA 변형된 항원을 암호화하고 따라서 발현하는 아데노바이러스로 형질도입된 HLA A2 종양 세포와 함께 배양하였다. 또한, 인간 PSMA ECD 단백질을 상기 ELISPOT 분석에 가하여 특이적 CD4 IFNγ 생산 세포를 측정하였다. 적합한 경우 대조를 위해서, PSMA 또는 관련되지 않은 단백질, 예를 들어 BSA를 발현하지 않는 종양 세포 또는 HLA A2 제한된 HER-2 특이성 펩타이드 p168-175를 상기 IFNγ ELISPOT 분석에서 음성 대조군으로서 사용하였다. 데이터 결과를, IFNγ를 1 x 106 비장세포를 분비하는 스폿 형성 세포(SFC)의 수에 대해 표준화된 포맷으로 제공한다. 시험된 PSMA 항원 펩타이드 각각에 대해 3 회 이상의 연구를 수행하였다.
결과.
PSMA 펩타이드 라이브러리로부터 유래된 펩타이드와 함께 배양된 파스퇴르 마우스의 비장세포를 사용한 ELISPOT 분석으로부터의 데이터를 표 1에 나타낸다. 양성 반응은 SFC > 100을 갖는 것으로서 정의된다. 표 1에 나타낸 바와 같이, 상기 실시예 1A에 개시된 3 개의 항원 포맷, 인간 PSMA 시토솔, 분비된 및 변형된 항원들 모두로 제조된 면역원성 PSMA 폴리펩타이드들은 T 세포 반응을 유도할 수 있다. 상기 인간 PSMA 변형된 항원 포맷이 T 세포 반응의 가장 큰 폭과 크기를 유도하였다.
[표 1]
파스퇴르 마우스에서 인간 PSMA 시토솔, 분비된 및 변형된 항원들에 의해 유도된 T 세포 반응
Figure pat00002
파스퇴르 마우스(HLA A2.1 제한된 PSMA 펩타이드 펄스화된 표적 세포뿐만 아니라 PSMA+ HLA A2.1 LNCaP 종양 세포를 인식하였다)에서 다양한 PSMA 백신 포맷들에 의해 유도된 T 세포 반응에 대한 ELISPOT 분석으로부터의 데이터를 표 2에 나타낸다. PC3(PSMA를 발현하지 않는 인간 전립선 암 세포주)을 여기에서 음성 대조군으로서 사용하였다. 양성 반응을 SFC > 50을 갖는 것으로서 정의한다. 표 2에 나타낸 바와 같이, 시험된 다양한 PSMA 구축물들은 공지된 HLA A2 제한된 PSMA 에피토프뿐만 아니라 PSMA 단백질 및 인간 전립선암 세포 LNCaP를 인식하는 T 세포를 유도할 수 있다. 그러나, 상기 PSMA 변형된 구축물이 가장 큰 폭 및 크기의 T 세포 반응을 유도하는 것으로 나타났다.
[표 2]
HLA A2.1 제한된 PSMA 펩타이드 펄스화된 표적 세포뿐만 아니라, PSMA+ HLA A2.1 LNCaP 종양 세포를 인식하는 파스퇴르 마우스에서 인간 PSMA 시토솔, 분비된 및 변형된 항원에 의해 유도된 T 세포 반응
Figure pat00003
1G. 파스퇴르 마우스 또는 비인간 영장류에서 측정된 체액 면역 반응
1G1. 샌드위치 ELISA 분석.
표준 샌드위치 ELISA 분석을 자동화된 바이오텍(Biotek) 시스템을 사용하여 수행하였다. 플레이트를 밤새 25 ㎕의 PBS 중 고유 PSMA 단백질로 1.0 ㎍/㎖로 코팅하고, 상기 플레이트를 세척하고 35 ㎕/웰의 5% FBS 1X PBS-T 0.05%로 차단하고 진탕기 상에서 600 RPM으로 RT에서 1 시간 동안 배양하였다. 상기 차단 매질을 경사분리하고 1:100 또는 1:500에서 출발하여 5% FBS 1X PBS-T 0.05% 중에서 절반 로그 희석시킨 일련의 희석된 백신화된 마우스 혈청을 제조하고 상기 희석된 혈청 25 μ 샘플을 상기 96 웰 플레이트의 각 웰에 가하고 진탕기에서 600 RPM으로 RT에서 1 시간 동안 배양하였다. 상기 플레이트를 바이오텍 ELx405를 사용하여 1 X PBS-T 0.05% 중의 75 ㎕/웰로 3 회 세척하고, 1:30,000 희석된 항-마우스 IgG HRP(에이비캠(AbCam) 카탈로그 번호 ab20043) 2차 항체(1X PBS-T 0.05% 중에서 희석됨) 25 ㎕/웰을 상기 96 웰 플레이트의 각 웰에 가하고 진탕기에서 600 RPM으로 RT에서 1 시간 동안 배양하였다. 상기 플레이트를 바이오텍 ELx405를 사용하여 1 X PBS-T 0.05% 중의 75 ㎕/웰로 5 회 세척하였다. TMB 기질을 1:10으로 희석하고 25 ㎕를 각 웰에 가하고 RT에서 30 분 동안 배양하였다. 상기 반응을 12.5 ㎕/웰의 1M H2SO4를 가하여 정지시켰다. 플레이트를 스펙트라맥스 플러스(Spectramax Plus)를 사용하여 450 ㎚ 파장에서 판독하였다. 데이터를 역가로서 보고하고 이를 첫 번째 양의 수(5% FBS PBS 이상의 평균 및 양쪽 값 모두 + 3 x 표준 편차평균)로서 및/또는 0.5 또는 1.0의 OD에서 계산된 역가로서 보고할 수 있었다. 관련되지 않은 백신화된 마우스로부터의 혈청을 음성 대조군으로서 사용하였다.
[표 3]
ELISA 분석에 의해 측정된 바와 같은 인간 PSMA 항원에 의한 항-PSMA 항체 반응의 유도
Figure pat00004
결과.
표 3에 제공된 데이터는 인간 PSMA 시토솔 항원이 어떠한 항-PSMA 반응도 유도하지 않은 반면, 인간 PSMA 변형된 항원은 모든 마우스에서 양호한 항-PSMA 항체 반응을 일관되게 유도하였음을 보인다.
표 5에 제공된 데이터는 상기 인간 PSMA 항원에 의해 유도된 항체들이 PSMA 라이브러리에서 다수의 펩타이드 에피토프에 반응하였음을 보인다. 각 그룹의 개별적인 마우스로부터의 혈청을 동량으로 모으고 ELISA 분석에서 1:500 희석으로 시험하였다. 항-디프테리아(CRM) 독소로 백신화시킨 마우스의 음성 대조군을 병행 시험하였다. 상기 96 웰 ELISA 플레이트의 각 웰을 PSMA 펩타이드 라이브러리로부터 유래된 단일 15 아미노산 펩타이드 0.03 ㎍으로 코팅하였다. 0.10 이상의 OD 값을 양으로 간주한다.
1G2. FACS 세포 결합 분석.
다양한 전립선암 세포주를 본 분석에 사용하였다. LNCaP(ATCC)를 PSMA를 발현하는 인간 전립선암 세포로서 사용하고 PC3(ATCC)를 PSMA를 발현하지 않는 음성 인간 전립선암 세포로서 사용하였다. 일부 분석에서, 인간 고유 전장의 PSMA를 안정하게 발현하도록 조작된 TRAMP-C2 세포주 및 PSMA를 발현하지 않는 모 TRAMP-C2 세포주(음성 대조군)를 상기 세포 결합 분석에 사용하였다. 상기 세포 결합 분석을 하기와 같이 수행하였다: LNCaP 및 PC3 세포(또는 TRAMP-C2PSMA 및 TRAMP c2)를 96 웰 플레이트에서 별도의 웰에 2 x 105 세포/웰(50 ㎕)로 도말하였다. 상기 1f에 개시된 바와 같이, PSMA 백신화된 마우스로부터의 혈청을 FACS 완충제(PBS pH 7.4, 1% FBS, 25 mM HEPES, 및 1 mM EDTA)로 1:50 희석하였다. 50 ㎕의 희석된 J591-A 항체(마우스 항-인간 PSMA 항체, ATCC로부터 클론 J591-A)를 상기 희석된 시험 혈청 또는 FACS 완충제(염색되지 않은 샘플)에 가하여 상기 염색 플레이트에서 웰당 적합한 세포수를 성취하였다. 피펫팅함으로써 모두를 혼합하고 이어서 얼음상에서 20 분간 유지시켰다. 상기 세포를 FACS 완충제로 2 회 세척하고; 각각의 세척물을 5 ℃에서 5 분간 1200 RPM에서 원심분리시켰다. 1:200 희석의 PE-표지된 염소 항-마우스 Ig(시그마, catP9670-5) 및 0.25 ㎕의 생/사 아쿠아(Aqua) 색소(인비트로젠, 카탈로그 번호 L34957)를 함유하는 50 ㎕의 2차 염색 용액을 각각의 세포 함유 웰에 가하고 20 분 동안 얼음상에서 유지시켰다. 세포를 앞서 개시한 바와 같이 2 회 세척하였다. 세척된 세포 펠릿을 125 ㎕ FACS 완충제에 재현탁하고 이어서 75 ㎕ 4% 파라폼알데하이드 용액을 각 웰에 가하여 세포를 고정시켰다. 샘플들을 얼음상에서 유지시키고 15 분 이상 빛을 차단시켰다. 샘플들을 FACS 칸토(Canto) II 상에서 실행시켰다. 1만 개의 살아있는 세포 사건이 각 샘플에 대해서 기록되었다. 각 세포 유형에 대한 대조용 샘플은 1) 염색되지 않은 세포, 2) 2차 항체만을 갖는 세포, 3) J591 + 2차 항체를 갖는 세포, 및 4) 고유 혈청 + 2차 항체를 갖는 세포이었다. 데이터를 음성 대조군에 대한 평균 형광 강도(MFI)로서 기록하였다.
FACS 세포 결합 분석의 결과.
표 4는 인간 PSMA 분비된 및 변형된 항원 모두에 의해 유도된 항체들이 인간 PSMA 양성 전립선암 세포(LNCaP)에 결합할 수 있고 PSMA 음성 전립선암 세포(PC3)에는 결합할 수 없음을 나타낸다. 상기 PSMA 변형된 항원은 모든 마우스에서 양호한 항-PSMA 항체 반응을 일관되게 유도하였다.
[표 4]
FACS에 의해 측정된 바와 같은 인간 전립선암 세포에 대한 항-PSMA 항체의 결합
Figure pat00005
[표 5]
PSMA 라이브러리에서 다수의 펩타이드에 반응한 PSMA 백신에 의해 유도된 항체. 이 결과를 근거로, PSMA 4개의 B 세포가 확인되었다. 1: 아미노산 138 - 147, 2: 아미노산 119 - 123, 3: 아미노산1-3-1-6, 4: 아미노산 649 - 659
Figure pat00006
1G3. 항체-독립적인 세포-매개된 세포독성(ADCC) 분석
연구 설계.
인도 붉은털 원숭이를 아데노바이러스(1e11 V.P. 근육내 주사된)에 의해 전달된 인간 PSMA 변형된 항원을 암호화하는 핵산으로 면역시킨 다음 각각 8 주 및 6 주 간격으로 2 회 PMED 면역화(8 회 작동/면역화, 하복부 좌측 및 우측 각각 4 회씩 작동)시켰다. 상기 동물에게 또한 두 번째 PMED 면역화시에 각각의 서혜부 배액 림프절에 가깝게 3 ㎎의 CpG(PF-03512676)를 피내 주사하였다. 항체 의존적인 세포-매개된 세포독성을, 임의의 면역화 전(면역-전 혈장) 및 최종 PMED 면역화 후 8일째(면역 혈장)에 혈액으로부터 수거한 혈장으로부터 측정하였다.
항체-의존적인 세포-매개된 세포독성 분석.
항체-의존적인 세포-매개된 세포독성을 표준 크로뮴 51 방출 분석을 사용하여 측정하였다. 인간 전립선암 세포주 LNCaP 및 PC3을 표적 세포로서 사용하였다. 새로 단리된 인간 PBMC 세포를 효과기 세포로서 사용하였다. 효과기 대 표적 세포를 30:1로 설정하였다. 간단히, 하나의 표지화 반응에 대해서, 200 ㎕ 중의 1.5 x 106 표적 세포를 200 μCi 51Cr과 함께 배양하였다(37 ℃, 5% CO2 1 시간). 세포를 3 회 세척하고 세포 농도를 2 x 105 세포/㎖로 조절하였다. 대조용 단클론 항체(mAb) 또는 시험 혈장(1:50)을 2X 농도로 제조하고 상기 각각의 (분석의 크기에 따라) mAb/혈장 희석물 175 ㎕을 175 ㎕의 표적 세포에 가하였다. 상기 혼합물을 에펜도르프 튜브에서 4 ℃에서 30 분 동안 배양하였다. 세포를 1 회 세척하여 결합되지 않은 항체를 제거하였다. 이때, 100 ㎕의 새로 단리된 효과기 세포를 100 ㎕의 단클론 항체 또는 시험 혈장 결합된 표적 세포와 함께 상기 96 웰 플레이트의 각 웰에 가하고 37 ℃ 및 5% CO2에서 4 시간 동안 배양하였다. 샘플들을 중복 시험하였다. 100 ㎕ 2N HCl을 최대의 방출을 위해 표적 웰에 가하고 100 ㎕의 배지를 자발적인 방출을 위해 상기 표적 웰에 가하였다. 비(specific) 용해를 하기와 같이 계산하였다: 방출 퍼센트 = (ER-SR)/(MR-SR) x 100(이때 ER(효과기 + 표적 세포 방출)은 실험적인 방출이었고, SR(표적 세포만 배지와 배양됨)은 자발적인 방출이었으며, MR(표적 세포만 2N HCl과 배양됨)은 최대 방출이었다). 비 용해 퍼센트를 항원 특이적 표적(LNCaP) 방출로부터 관련없는 표적(PC3) 방출을 감함으로써 계산하였다.
[표 6]
인간 PSMA 변형된 백신화된 동물로부터의 혈장에서 측정된 항체 의존적인 세포독성 활성
Figure pat00007
결과.
상기 항체 의존적인 세포독성 분석으로부터의 데이터를 표 6에 제공한다. 상기 hPSMA 면역된 동물로부터 유래된 면역 혈장으로 코팅된 인간 전립선 PSMA+ 암 세포주, LNCaP는 효과기 세포에 의해 용해된 반면, 동일한 면역 혈청으로 코팅된 인간 전립선 PSMA- 암세포주, PC3은 효과기 세포에 의해 용해되지 않았다. 유사하게, 면역-전 혈장으로 코팅된 LNCaP는 효과기 세포에 의해 용해되지 않았다. HER-2에 대한 단클론 항체인 허셉틴을, LNCaP 세포가 HER-2를 발현하는 것으로 공지되어 있기 때문에(문헌[Li, Cozzi et al. 2004]), 양성 대조군으로서 사용하였다. B 세포 항원(CD20)에 대해 단클론성인 리툭산을, LNCaP 세포가 CD20을 발현하지 않기 때문에, 음성 대조용 항체로서 사용하였다. 상기 두 단클론 항체들은 모두 ADCC 활성을 갖는 것으로 보고되어 있다(문헌[(Dall'Ozzo, Tartas et al. 2004]; 문헌[Collins, O'Donovan et al. 2011]).
실시예 2. PSMA 셔플링된 항원의 제작
본 실시예는 실시예 1에 개시된 바와 같은 인간 PSMA 변형된 항원(서열번호 9)의 변체인 다양한 면역원성 PSMA 폴리펩타이드의 제작 및 몇몇 생물학적 성질들을 예시한다.
2A. PSMA 셔플링된 항원의 설계
실시예 1에 개시된 바와 같은 인간 PSMA 변형된 항원(서열번호 9)의 변체인 다양한 면역원성 PSMA 폴리펩타이드를 설계하였다. 이들 변체를, 상기 인간 PSMA의 오솔로그 중에서 선택된 돌연변이를 상기 인간 PSMA 변형된 항원 서열에 도입시킴으로써 생성시켰다. 이들 변체를 본원에서 "PSMA 셔플링된 항원" 또는 "셔플링된 PSMA 변형된 항원"으로서 호환적으로 지칭한다. 이들 변체의 생성에 사용된 원리 및 과정을 하기에 제공한다.
연산 알고리즘을 작성하여 상기 셔플링된 변체에 대한 점 돌연변이를 선택하였다. 먼저, PSMA 및 12 개 오솔로그(부록 2a)의 다중 서열 정렬을 NCBI의 PSI-BLAST를 사용하여 조립하였다. PSI-BLAST로부터의 결과는 상기 오솔로그 중 각각의 PSMA 위치에서 각 잔기에 대한 성향을 포함하였다. 이어서 상기 펄 스크립트는 이러한 성향을 하기와 같이 점 돌연변이를 선택하는데 사용하였다:
1) 모든 위치들 중에서, 고유 인간 PSMA 중에서 일치하지 않는 가장 통상적으로 관찰되는 잔기를 선택한다.
2) 상기 점 돌연변이가 상기 본 발명에 정의된 바와 같은 보존된 T 세포 에피토프내에 확실히 있지 않도록, 상기 돌연변이 위치가 확인된 I 또는 II 부류 인간 PSMA 에피토프와 겹치지 않음을 확인한다(표 19).
3) 상기 인간 잔기에 대한 돌연변이의 유사성을 BLOSUM62 매트릭스를 통해 계산하여 상기 잔기 치환에 대한 BLOSUM62 유사성 점수가 0 내지 1(포함)의 범위내에 있음을 확인한다.
상기 반복 과정을, 상기 인간 PSMA에 대해 일정 퍼센트의 서열 일치성(100 이하)이 도달될 때까지 수행한다.
상기 알고리즘에 대한 입력으로서 제공하기 위해서, NCBI로부터 PSI-BLAST를 사용하여, 상기 PSMA 오솔로그들을 조립하여 위치-특이성 확률을 작성하였다. 또한, 상기 PSMA의 확인된 에피토프 영역을, 상기 셔플 알고리즘에 또한 제공된 파일에 나열하였다. 상기 비-셔플링 영역을 또한 상기 단백질의 시토솔 및 막관통 영역까지 연장시켜 막-결합된 작용성 문제를 피하였다. 상기 이종상동성 PSMA 단백질 서열, BLOSUM62 매트릭스, 및 PSI-BLAST 프로그램은 NCBI 사이트로부터 내려받았다.
이어서 상기 셔플링 스크립트를 상기 입력 데이터를 사용하여 실행시키고 원래 인간 PSMA와 94% 서열 일치성을 갖는 인간 PSMA의 변체를 생성시켰다. 또한, HLA-A2 결합을 개선시키는 3 개의 돌연변이를 그들의 성능을 기준으로 에피트옵티마이저(Epitoptimizer) 알고리즘(문헌[Houghton, Engelhorn et al. 2007])에 도입시켰다. 이들 돌연변이는 M664L(에피토프: 663-671), I676V(에피토프: 668-676), 및 N76L(에피토프: 75-83)이다. 상기 생성 항원을 "셔플링된 PSMA 변형된 항원 1", "셔플링된 PSMA 변형된 1", 또는 "PSMA 셔플링된 항원 1"이라 칭한다.
일치 순위 <1% 및 신경망 분석(단일 최선 방법)에 의한 IC50 <500을 갖는 에피토프에 근거한 결과는 HLA A2.1, HLA A3, HLA A11, HLA A24, 및 HLA B7로부터 예견된 에피토프가 상기 셔플링된 항원에서 고도로 보존됨을 나타내었다. 실시예 1에 개시된 인간 PSMA 변형된 항원의 2 개의 추가적인 변체를, 보다 높은 서열 일치성 및 1의 보다 제한적인 BLOSUM 점수 컷오프로 설계하여 모든 비-보존적 치환을 제거하였다. 이들 두 변체를 또한 각각 "셔플링된 PSMA 변형된 항원 2" 및 "셔플링된 PSMA 변형된 항원 3"이라 칭한다. 인간 PSMA 변형된 구축물(예를 들어 인간 PSMA의 아미노산 15 - 750)에 관하여 셔플링된 PSMA 변형된 항원 1 내지 3의 일치성 퍼센트는 각각 대략 93.6%, 94.9% 및 96.4%이다.
상기 셔플링된 PSMA 변형된 항원 1은 서열번호 3의 아미노산 서열을 가지며 인간 PSMA 변형된 항원에 비해 하기의 돌연변이들을 갖는다:
N47S, T53S, K55Q, M58V, L65M, N76L, S98A, Q99E, K122E, N132D, V154I, I157V, F161Y, D191E, M192L, V201L, V225I, I258V, G282E, I283L, R320K, L362I, S380A, E408K, L417I, H475Y, K482Q, M509V, S513N, E542K, M583L, N589D, R598Q, S613N, I614L, S615A, Q620E, M622L, S647N, E648Q, S656N, I659L, V660L, L661V, M664L, I676V.
상기 셔플링된 PSMA 변형된 항원 2는 서열번호 5의 아미노산 서열을 가지며 인간 PSMA 변형된 항원에 비해 하기의 돌연변이들을 갖는다:
돌연변이:
N47S, K55Q, M58V, Q91E, S98A, A111S, K122E, N132D, V154I, I157V, F161Y, V201L, V225I, I258V, S312A, R320K, K324Q, R363K, S380A, E408K, H475Y, K482Q, Y494F, E495D, K499E, M509L, N540D, E542K, N544S, M583I, I591V, R598Q, R605K, S613N, S647N, E648Q, S656N, V660L.
상기 셔플링된 PSMA 변형된 항원 3은 서열번호 7의 아미노산 서열을 가지며 인간 PSMA 변형된 항원에 비해 하기의 돌연변이들을 갖는다:
돌연변이:
T339A, V342L, M344L, T349N, N350T, E351K, S401T, E408K, M470L, Y471H, H475Y, F506L, M509L, A531S, N540D, E542K, N544S, G548S, V555I, E563V, V603A, R605K, K606N, Y607H, D609E, K610N, I611L.
2B. 파스퇴르 마우스에서 백신화 후 측정된 면역 반응
연구 설계.
8 내지 10주령 파스퇴르 마우스를 실시예 1F에 개시된 바와 같이 각각의 백신화 사이에 2 주 떨어져서, 초회항원자극/추가접종/추가접종 요법에서 셔플링된 PSMA 변형된 항원을 발현하는 다양한 플라스미드 DNA로 PMED 방법을 사용하여 면역시켰다. 항원 특이성 T 및 B 세포 반응을 각각 인터페론-감마(IFNγ) ELISPOT 분석 및 샌드위치 ELISA에서 최종 면역화후 7일째에 측정하였다.
[표 7]
PSMA 펩타이드 라이브러리에서 펩타이드 풀에 대한 다양한 셔플링된 PSMA 변형된 항원에 의해 유도된 T 세포 반응
Figure pat00008
결과.
표 7에 제공된 ELISPOT 데이터는 전체 셔플링된 PSMA 변형된 항원이 상기 인간 PSMA 변형된 항원과 매우 유사한 폭 및 크기로 T 세포 반응을 유도할 수 있음을 입증한다. SFC > 100은 양으로 간주된다. "*" 기호는 정확하게 카운트하기에는 너무 많음을 나타낸다.
[표 8]
HLA A2 표적 및 PSMA 단백질에 대한 셔플링된 PSMA 변형된 항원에 의해 유도된 T 세포 반응
Figure pat00009
표 8에 나타낸 바와 같이, 모든 셔플링된 PSMA 항원은 공지된 HLA A2 제한된 PSMA 에피토프뿐만 아니라 PSMA를 발현하도록 PSMA 트랜스유전자를 갖는 아데노바이러스로 형질도입된 인간 HLA A2 종양 세포를 인식하는 T 세포를 유도할 수 있다. PSMA를 발현하지 않은 종양 세포는 음성 대조군으로서 작용하였으며 인식되지 않았다. SFC > 50은 양으로 간주된다.
[표 9]
CD4 T 세포에 특이적인 셔플링된 PSMA 변형된 항원에 의해 유도된 T 세포 반응
Figure pat00010
표 9에 나타낸 ELISPOT 데이터를, CD8이 없는 비장세포에 의해 획득하였으며; 따라서 상기 데이터는 CD4 T 세포에 특이적인 T 세포 반응을 나타낸다. 상기 데이터는 셔플링된 PSMA 변형된 항원 2에 의해 유도된 CD4 반응이 상기 인간 PSMA 변형된 항원에 의해 유도된 경우와 매우 유사함을 보인다. SFC > 50은 양으로 간주된다.
[표 10]
ELISA 분석에 의해 측정된 바와 같은 항-PSMA 항체 반응의 유도
Figure pat00011
표 10의 데이터는 상기 셔플링된 PSMA 변형된 항원이 모두 항-인간 PSMA 항체 반응을 유도할 수 있음을 입증한다. 셔플링된 PSMA 변형된 항원 2 및 상기 인간 PSMA 변형된 항원은 모든 마우스에서 일관된 항체 반응을 유도하였다.
[표 11]
인간 PSMA 변형된 항원 및 셔플링된 PSMA 변형된 항원 2에 의해 유도된 HLA A24 마우스에서 T 세포 반응
Figure pat00012
표 11의 ELISPOT 데이터는 HLA A24 마우스에서 셔플링된 PSMA 변형된 항원 2에 의해 유도된 전체 상기 T 세포 반응이 상기 인간 PSMA 변형된 항원과 폭 및 크기가 매우 유사함을 입증한다. SFC > 100은 양으로 간주된다.
2C. 셔플링된 PSMA 변형된 항원에 의한 인간 PSMA의 면역 관용의 파괴
연구 설계.
상기 인간 PSMA 트랜스제닉 마우스 모델은 특이적으로 전립선에서 PSMA의 발현을 구동하는 최소 래트 프로바신 프로모터를 사용하여 제조된 마우스를 사용한다(문헌[Zhang, Thomas et al. 2000) Endocrinology 141(12): 4698-4710]). 상기 마우스는 C57BL/6 배경에서 제조되었다. RT-PCR 및 면역 조직화학 염색 데이터는 이들 PSMA 트랜스제닉 마우스에서 전립선의 배 및 등쪽외측 뿌리에서 PSMA의 발현을 입증하였다. 상기 마우스에서 인간 PSMA 단백질의 내생적인 발현은 면역 관용을 생성시키는 것으로 예상된다.
결과.
표 12에 나타낸 바와 같이, 상기 PSMA 트랜스제닉 마우스의 단지 20%만이 상기 인간 PSMA 변형된 항원을 사용하여 인간 PSMA에 대한 T 세포 반응을 탑재할 수 있었다. 그러나, 상기 PSMA 트랜스제닉 마우스의 67%는 상기 셔플링된 PSMA 변형된 항원 2를 사용하여 PSMA 특이성 T 세포 반응을 탑재할 수 있었다. 상기 데이터는 상기 셔플링된 PSMA 변형된 항원 2 중의 비-자기 아미노산 서열의 포함이 상기 자기 인간 PSMA 항원에 대한 파괴 관용을 개선시켰음을 암시한다. SFC > 50은 양으로 간주된다.
[표 12]
공지된 PSAM 에피토프(PADYFAPGVKSYPDG; 문헌[Durso RJ, Clim Cancer Res. 2007 Jul 1;13(13):3999-400])에 대한 인간 PSMA 트랜스제닉 마우스에서 T 세포 반응
Figure pat00013
실시예 3. 다양한 면역원성 PSA 폴리펩타이드의 설계
실시예 3은 시토솔, 분비된 및 막-결합된 형태의 면역원성 PSA 폴리펩타이드의 제작 및 몇몇 생물학적 성질을 예시한다.
3A. 다양한 PSA 항원 형태의 제작
상기 3 개의 상이한 면역원성 PSMA 폴리펩타이드 형태(예를 들어 시토솔, 막-결합된, 및 분비된 형태)에 대해 실시예 1에 개시된 바와 유사한, 3 가지 형태의 면역원성 PSA 폴리펩타이드들을 또한 인간 PSA 서열을 근거로 설계하였다. 고유 인간 PSA의 아미노산 25-261로 이루어지는, 시토솔 형태의 면역원성 PSA 폴리펩타이드를, 분비 신호 및 앞 도메인(아미노산 1-24)을 결실시킴으로써 제작한다. 상기 시토솔 면역원성 PSA 폴리펩타이드의 아미노산 서열을 서열번호 17에 제공한다. 상기 PSA 폴리펩타이드의 분비된 형태는 고유의 전장의 인간 PSA(아미노산 1-261)이다. 막-결합된 형태의 면역원성 PSA 폴리펩타이드를, 상기 면역원성 PSA 폴리펩타이드 시토솔 형태(고유 인간 PSA의 아미노산 25-261)를 상기 인간 PSMA 막관통 도메인(상기 인간 PSMA의 아미노산 15-54)에 결합시킴으로써 제작한다.
3B. 파스퇴르 및 HLA A24 마우스의 면역 반응
연구 설계.
8 내지 10주령 HLA A2 파스퇴르 마우스 또는 HLA A24 마우스를 실시예 1에 개시된 바와 같이 각각의 백신화 사이에 2 주 떨어져서, 초회항원자극/추가접종/추가접종 요법에서 다양한 PSA 항원을 발현하는 DNA로 실시예 3A에 제공된 PMED를 사용하여 면역시켰다. 항원 특이성 T 및 B 세포 반응을 인터페론-감마(IFNγ) ELISPOT 분석 및 샌드위치 ELISA에서 최종 면역화후 7일째에 측정하였다.
[표 13]
PSA 폴리펩타이드로 백신화된 파스퇴르 마우스 및 HLA A24 마우스에서 T 세포 반응의 유도
Figure pat00014
결과.
표 13은 PSA 펩타이드 라이브러리로부터 유도된 펩타이드와 함께 배양된 HLA A2 파스퇴르 마우스 또는 HLA A24 마우스로부터 단리된 비장세포로부터 유도된 ELISPOT 데이터를 나타낸다. T 세포 반응을 HLA A2 및 HLA A24 마우스 모두에서 검출할 수 있다. SFC > 100은 양으로 간주된다.
[표 14]
PSA+ HLA A2.1+ SKmel5 인간 암세포에 대한 파스퇴르 마우스에서 PSA 항원에 의한 T 세포 반응의 유도
Figure pat00015
표 14에 나타낸 ELISPOT 데이터는 시토솔 및 막-결합된 형태 모두에서 면역원성 PSA 폴리펩타이드가, 시토솔 PSA 항원(Skmel5-Ad-PSA)을 발현하는 아데노바이러스로 형질도입된 인간 종양 세포를 인식하지만 eGFP(SKmel5-Ad-eGFP)를 발현하는 아데노바이러스로 형질도입된 세포는 인식하지 않는 T 세포를 유도할 수 있음을 가리킨다. 이들 두 항원은 또한 PSA 단백질에 대한 반응을 이끌어냈다. 상기 PSA 분비된 항원은 T 세포가 SKmel5-Ad-PSA 또는 PSA 단백질 모두를 유도하게 하는데 실패했다. SFC > 50은 양으로 간주된다.
[표 15]
샌드위치 ELISA 분석에 의해 측정된 바와 같은 항-PSA 항체 반응의 유도
Figure pat00016
표 15의 데이터는 분비된 및 막-결합된 형태 모두의 면역원성 PSA 폴리펩타이드가 항-PSA 항체 반응을 유도할 수 있음을 입증한다.
[표 16]
인간 PSAMA 펩타이드 라이브러리 펩타이드 풀 및 상응하는 아미노산 서열
Figure pat00017
Figure pat00018
Figure pat00019
[표 17]
인간 PSA 펩타이드 라이브러리
[표 18]
PSMA 오솔로그
Figure pat00021
[표 19]
서열번호 1에 설명된 바와 같은 인간 PSMA에서 보존된 T 세포 에피토프
Figure pat00022
실시예 4. 다중-항원 백신 구축물의 제작
본 실시예에서, 단일 성분 DNA 백신으로부터의 다중 항원을 발현하기 위한 다수의 전략들을 개시한다. 이들 다중-항원 DNA 백신 구축물은 pPJV7563과 동일한 일반적인 플라스미드 주쇄를 공유한다. 상기 다중-항원 발현 전략을 여기에서 DNA 백신과 관련하여 개시하지만, 원리를 바이러스 벡터 유전자 백신(예를 들어 아데노바이러스 벡터)과 관련하여 유사하게 적용할 것이다. 달리 명시되지 않는 한, 상기 다중-항원 구축물에 포함된 유전자는 상기 본 발명에서 실시예에 개시된 바와 같이 인간 PSMA 변형된 항원(PSMA로서 나타냄), 전장의 인간 PSCA(PSCA로서 나타냄), 및 인간 PSA 시토솔 항원(PSA로서 나타냄)을 암호화한다.
실시예 4A. 이중 항원 구축물
4A1. 다수의 프로모터를 사용하는 이중 항원 구축물의 제작
일반적인 전략.
다가 핵산 백신 구축물의 생성을 위한 한 가지 전략은 다수의 독립적인 프로모터들을 단일의 플라스미드에 통합시키는 것이다(문헌[Huang, Y., Z. Chen, et al. (2008). "Design, construction, and characterization of a dual-promoter multigenic DNA vaccine directed against an HIV-1 subtype C/B' recombinant." J Acquir Immune Defic Syndr 47(4): 403-411]; 문헌[Xu, K., Z. Y. Ling, et al. (2011). "Broad humoral and cellular immunity elicited by a bivalent DNA vaccine encoding HA and NP genes from an H5N1 virus." Viral Immunol 24(1): 45-56]). 상기 플라스미드를 다수의 발현 카세트를 갖도록 조작할 수 있으며, 상기 카세트는 각각 a) 증폭자 요소와 함께 또는 상기 요소 없이, RNA 폴리머라제 의존적인 전사를 개시하기 위한 진핵생물 프로모터, b) 표적 항원을 암호화하는 유전자, 및 c) 전사 종결자 서열로 이루어진다. 상기 플라스미드를 상기 형질감염된 세포 핵에 전달할 때, 전사가 각각의 프로모터로부터 개시되어 별도의 mRNA들을 생산할 것이며, 이들은 각각 상기 표적 항원들 중 하나를 암호화할 것이다. 상기 mRNA는 독립적으로 번역되어, 목적하는 항원을 생산할 것이다.
플라스미드 460(PSMA/PSCA 이중 프로모터).
플라스미드 460을 부위-특이적 돌연변이, PCR 및 제한 단편 삽입의 기법들을 사용하여 제작하였다. 먼저, KpnI 제한 부위를 제조사의 프로토콜(퀵체인지(Quickchange) 키트, 에이질런트 테크놀로지스(Agilent Technologies), 미국 캘리포니아주 산타 클라라 소재)에 따라 MD5 및 MD6 프라이머와 함께 부위-특이적 돌연변이를 사용하여 플라스미드 5259 중의 CMV 프로모터의 상류에 도입시켰다. 둘 째로, 최소 CMV 프로모터, 인간 PSMA 및 토끼 B 글로불린 전사 종결자로 이루어지는 발현 카세트를 KpnI 제한 부위를 갖는 프라이머(MD7 및 MD8)를 사용하여 플라스미드 5166으로부터 PCR에 의해 증폭시켰다. 상기 PCR 앰플리콘을 KpnI로 절단하고 송아지 장 알칼리성 포스파타제(CIP)-처리된 플라스미드 5259의 새로 도입된 KpnI 부위에 삽입하였다.
4A2. 2A 펩타이드를 사용하는 이중 항원 구축물의 제작
일반적인 전략.
다수의 단백질 항원을 또한 바이러스 2A-유사 펩타이드의 사용을 통해 단일 벡터로부터 발현시킬 수 있다(문헌[Szymczak, A. L. and D. A. Vignali (2005). "Development of 2A peptide-based strategies in the design of multicistronic vectors." Expert Opin Biol Ther 5(5): 627-638]; 문헌[de Felipe, P., G. A. Luke, et al. (2006). "E unum pluribus: multiple proteins from a self-processing polyprotein." Trends Biotechnol 24(2): 68-75]; 문헌[Luke, G. A., P. de Felipe, et al. (2008). "Occurrence, function and evolutionary origins of '2A-like' sequences in virus genomes." J Gen Virol 89(Pt 4): 1036-1042]; 문헌[Ibrahimi, A., G. Vande Velde, et al. (2009). "Highly efficient multicistronic lentiviral vectors with peptide 2A sequences." Hum Gene Ther 20(8): 845-860]; 문헌[Kim, J. H., S. R. Lee, et al. (2011). "High cleavage efficiency of a 2A peptide derived from porcine teschovirus-1 in human cell lines, zebrafish and mice." PLoS One 6(4): e18556]). 이들 펩타이드(또한 절단 카세트 또는 CHYSEL(시스-작용 하이드롤라제 요소)이라 칭함)는 고도로 보존된 카복시 말단 D-V/I-EXNPGP 동기와 함께 대략 20 아미노산 길이이다(도 2). 상기 카세트는 자연에서 드물고, 가장 흔히는 바이러스, 예를 들어 구제역 바이러스(FMDV), 말 비염 A 바이러스(ERAV), 뇌심근염 바이러스(EMCV), 돼지 테스코바이러스(PTV), 및 토세아 어사이나(Thosea asigna) 바이러스(TAV)에서 발견된다(문헌[Luke, G. A., P. de Felipe, et al. (2008). "Occurrence, function and evolutionary origins of '2A-like' sequences in virus genomes." J Gen Virol 89(Pt 4): 1036-1042]). 2A-기재 다중-항원 발현 전략에 의해, 다중 표적 항원을 암호화하는 유전자들을, 2A 카세트에 의해 분리된 단일의 개방 판독 프레임에 함께 결합시킬 수 있다. 상기 전체 개방 판독 프레임을 단일 프로모터 및 종결자를 갖는 벡터에 클로닝시킬 수 있다. 상기 유전자 백신을 세포에 전달시, 상기 다중 항원을 암호화하는 mRNA는 단일 다중단백질로서 전사되고 번역될 것이다. 상기 2A 카세트의 번역 중에, 리보솜은 상기 C-말단 글리신과 프롤린 사이의 결합을 생략한다. 상기 리보솜 생략은 하류 단백질로부터 상류를 떼어놓는 동시번역 자가촉매적 "절단"처럼 작용한다. 2 개 단백질 항원사이에 2A 카세트의 통합은 상류 폴리펩타이드의 C-말단상에 약 20 개 아미노산 및 하류 단백질의 N-말단에 한 개 아미노산(프롤린)의 첨가를 생성시킨다. 상기 방법론의 적응에서, 프로테아제 절단 부위를, 편재하는 프로테아제들이 상기 상류 단백질로부터 상기 2A 카세트를 절단하도록 상기 카세트의 N 말단에 통합시킬 수 있다(문헌[Fang, J., S. Yi, et al. (2007). "An antibody delivery system for regulated expression of therapeutic levels of monoclonal antibodies in vivo." Mol Ther 15(6): 1153-1159]).
플라스미드 451(PSMA-T2A-PSCA).
플라스미드 451을 중복 PCR 및 제한 단편 교환의 기법들을 사용하여 제작하였다. 먼저, 인간 PSMA 아미노산 15 - 750을 암호화하는 유전자를 프라이머 119 및 117과 함께 주형으로서 플라스미드 5166을 사용하여 PCR에 의해 증폭시켰다. 전장의 인간 PSCA를 암호화하는 유전자를 프라이머 118 및 120과 함께 주형으로서 플라스미드 5259를 사용하여 PCR에 의해 증폭시켰다. PCR은 PSMA의 3' 단부 및 PSCA의 5' 단부에 중복하는 TAV 2A(T2A) 서열을 첨가시켰다. 상기 앰플리콘들을 함께 혼합하고 프라이머 119 및 120과 함께 PCR에 의해 증폭시켰다. 상기 PSMA-T2A-PSCA 앰플리콘을 NheI 및 BglII로 절단하고 유사하게 절단된 플라스미드 5166에 삽입하였다. 글리신-세린 링커를 PSMA와 T2A 카세트 사이에 포함시켜 높은 절단 효율을 촉진하였다.
플라스미드 454(PSCA-F2A-PSMA).
플라스미드 454를 PCR 및 제한 단편 교환 기법을 사용하여 생성시켰다. 먼저, 전장의 인간 PSCA를 암호화하는 유전자를 프라이머 42 및 132와 함께 주형으로서 플라스미드 5259를 사용하여 PCR에 의해 증폭시켰다. 상기 앰플리콘을 BamHI으로 절단하고 유사하게 절단된, CIP-처리된 플라스미드 5300에 삽입하였다. 글리신-세린 링커를 PSCA와 FMDV 2A(F2A) 카세트 사이에 포함시켜 높은 절단 효율을 촉진하였다.
플라스미드 5300(PSA-F2A-PSMA).
플라스미드 5300을 중복 PCR 및 제한 단편 교환 기법을 사용하여 제작하였다. 먼저, PSA 아미노산 25-261을 암호화하는 유전자를 프라이머 MD1 및 MD2와 함께 플라스미드 5297로부터 PCR에 의해 증폭시켰다. 인간 PSMA 아미노산 15 - 750을 암호화하는 유전자를 프라이머 MD3 및 MD4와 함께 플라스미드 5166으로부터 PCR에 의해 증폭시켰다. PCR은 PSA의 3' 단부 및 PSMA의 5' 단부에 중복하는 F2A 서열을 첨가시켰다. 상기 앰플리콘들을 함께 혼합하고 PCR에 의해 연장시켰다. 상기 PSA-F2A-PSMA 앰플리콘을 NheI 및 BglII로 절단하고 유사하게 절단된 플라스미드 pPJV7563에 삽입하였다.
4A3. 내부 리보솜 진입 부위를 사용하는 이중 항원 제작
일반적인 전략:
단일의 플라스미드 또는 벡터로부터 다중 단백질 항원을 발현하기 위한 세 번째 전략은 내부 리보솜 진입 부위, 또는 IRES의 사용을 수반한다. 내부 리보솜 진입 부위는 일부 RNA 분자들의 5' 번역되지 않은 영역에서 발견되는 RNA 요소(도 3)이다(문헌[Bonnal, S., C. Boutonnet, et al. (2003). "IRESdb: the Internal Ribosome Entry Site database." Nucleic Acids Res 31(1): 427-428]). 상기 부위는 진핵생물 리보솜들을 상기 RNA로 유인하여 하류 개방 판독 프레임의 번역을 촉진한다. 정상적인 세포 7-메틸구아노신 캡-의존성 번역과 달리, IRES-매개된 번역은 RNA 분자내에서 먼 AUG 코돈에서 개시될 수 있다. 매우 효율적인 과정을 다중-시스트론 발현 벡터에 사용하기 위해 활용할 수 있다(문헌[Bochkov, Y. A. and A. C. Palmenberg (2006). "Translational efficiency of EMCV IRES in bicistronic vectors is dependent upon IRES sequence and gene location." Biotechniques 41(3): 283-284, 286, 288]). 전형적으로, 2 개의 트랜스유전자를, IRES에 의해 분리된 2 개의 별도의 개방 판독 프레임으로서 프로모터와 전사 종결자 사이에서 벡터에 삽입한다. 상기 유전자 백신의 세포에의 전달시, 상기 두 트랜스유전자를 모두 암호화하는 단일의 긴 전사물이 전사될 것이다. 제 1 ORF가 전통적인 캡-의존성 방식으로 번역되어, 상기 IRES의 상류 정지 코돈에서 종결될 것이다. 제 2 ORF는 상기 IRES를 사용하여 캡-의존성 방식으로 번역될 것이다. 이렇게 하여, 2 개의 독립적인 단백질이, 단일의 발현 카세트를 갖는 벡터로부터 전사된 단일 mRNA로부터 생산될 수 있다.
플라스미드 449(PSMA-mIRES-PSCA).
플라스미드 449를 중복 PCR 및 제한 단편 교환 기법을 사용하여 제작하였다. 먼저, 전장의 인간 PSCA를 암호화하는 유전자를 프라이머 124 및 123과 함께 플라스미드 5259로부터 PCR에 의해 증폭시켰다. 최소 EMCV IRES를 프라이머 101 및 125와 함께 p셔틀-IRES로부터 PCR에 의해 증폭시켰다. 상기 중복 앰플리콘들을 함께 혼합하고 프라이머 101 및 123과 함께 PCR에 의해 증폭시켰다. 상기 IRES-PSCA 앰플리콘을 BglII 및 BamHI으로 절단하고 BglII-절단된, CIP-처리된 플라스미드 5166에 삽입하였다. 상기 IRES내에 자발적인 돌연변이를 고정시키기 위해서, AvrII 내지 KpnI 서열을 함유하는 IRES를 p셔틀-IRES로부터의 동등한 단편으로 치환시켰다.
플라스미드 603(pSCA-pIRES-PSMA).
플라스미드 603을 PCR 및 무솔기 클로닝 기법을 사용하여 제작하였다. 바람직한 EMCV IRES에 대해 그의 3' 단부에서 결합된 전장의 인간 PSCA를 암호화하는 유전자를 프라이머 SD546 및 SD547과 함께 PCR에 의해 플라스미드 455로부터 증폭시켰다. 인간 PSMA 아미노산 15 - 750을 암호화하는 유전자를 프라이머 SD548 및 SD550을 사용하여 플라스미드 5166으로부터 PCR에 의해 증폭시켰다. 2 개의 중복 PCR 앰플리콘을 제조사의 설명(인비트로젠, 미국 캘리포니아주 칼스바트 소재)에 따라 무솔기 클로닝에 의해 NheI 및 BglII- 절단된 pPJV7563에 삽입하였다.
플라스미드 455(PSCA-mIRES-PSA).
플라스미드 455를 중복 PCR 및 제한 단편 교환 기법을 사용하여 제작하였다. 먼저, 인간 PSA 아미노산 25-261을 암호화하는 유전자를 프라이머 115 및 114와 함께 플라스미드 5297로부터 PCR에 의해 증폭시켰다. 최소 EMCV IRES를 프라이머 101 및 116과 함께 p셔틀-IRES로부터 PCR에 의해 증폭시켰다. 상기 중복 앰플리콘들을 함께 혼합하고 프라이머 101 및 114와 함께 PCR에 의해 증폭시켰다. 상기 IRES-PSA 앰플리콘을 BglII 및 BamHI으로 절단하고 BglII-절단된, CIP-처리된 플라스미드 5259에 삽입하였다. 상기 클론내에 자발적인 돌연변이를 고정시키기 위해서, 상기 BglII 내지 BstEII 서열을 새로운 중복 PCR 반응으로부터의 동등한 단편으로 치환시켰다.
실시예 4B. 3중 항원 DNA 구축물
일반적인 전략.
PSMA, PSCA 및/또는 PSA의 발현을 지시하는 이중 항원 발현 벡터의 능력을 형질감염된 HEK293 세포에서 특성화하였다(도 4 내지 6). PSA-F2A-PSMA, PSMA-mIRES-PSCA, PSMA-T2A-PSCA, PSA-T2A-PSCA, PSCA-F2A-PSMA, PSCA-pIRES-PSMA, 및 PSMA-mIRES-PSA를 포함하여, 다수의 이중 항원 발현 카세트를 3중 항원 발현 벡터내로의 다양한 조합의 통합을 위해서 선택하였다. 모든 경우에, 상기 벡터들은 모 pPJV7563 플라스미드 주쇄를 기본으로 하였다. 4 개의 벡터(플라스미드 456, 457, 458 및 459)는 토끼 B 글로불린 전사 종결자와 함께 단일 완전 CMV 프로모터를 사용하여 3 개의 항원 모두의 발현을 구동하였다. 2 개의 다른 벡터(플라스미드 846 및 850)를 IRES 또는 2A와 함께 이중 프로모터 전략에 통합시켜 상기 3 개의 항원의 발현을 구동시켰다. 다수의 2A 카세트를 갖는 벡터를, 플라스미드/벡터 증폭 중 상기 첫 번째 및 두 번째 카세트간의 재결합 가능성을 최소화하기 위해서 상이한 카세트들을 갖도록 조작하였다. 항원 발현을 유식 세포측정(도 7) 및 웨스턴 블럿팅(도 8)에 의해 입증하였다.
플라스미드 456(PSA-F2A-PSMA-mIRES-PSCA).
플라스미드 456을 제한 단편 교환에 의해 제작하였다. 플라스미드 5300을 NheI 및 HpaI으로 절단하고 약 1.8 kb 삽입물을 유사하게 절단된 플라스미드 449에 연결하였다.
플라스미드 457(PSA-F2A-PSMA-T2A-PSCA).
플라스미드 457을 제한 단편 교환에 의해 제작하였다. 플라스미드 5300을 NheI 및 HpaI으로 절단하고 약 1.8 kb 삽입물을 유사하게 절단된 플라스미드 451에 연결하였다.
플라스미드 458(PSA-T2A-PSCA-F2A-PSMA).
플라스미드 458을 PCR 및 제한 단편 교환 기법을 사용하여 제작하였다. 인간 PSA 아미노산 25-261을 암호화하는 유전자를 프라이머 119 및 139와 함께 플라스미드 5297로부터 PCR에 의해 증폭시켜, 3' 단부에 T2A 서열 및 NheI 제한 부위를 첨가시켰다. 상기 앰플리콘을 NheI로 절단하고 유사하게 절단된 플라스미드 454에 삽입하였다.
플라스미드 459(PSCA-F2A-PSMA-mIRES-PSCA).
플라스미드 459를 제한 단편 교환에 의해 제작하였다. 플라스미드 454를 NheI 및 BglII로 절단하고 PSCA-F2A-PSMA 함유 삽입물을 유사하게 절단된 플라스미드 455에 연결하였다.
플라스미드 846(CBA-PSA, CMV-PSCA-pIRES-PSMA).
플라스미드 846을 PCR 및 무솔기 클로닝 기법을 사용하여 제작하였다. 먼저, 1) 닭 베타 액틴(CBA) 유전자로부터의 프로모터 및 5' 번역되지 않은 영역, 2) 하이브리드 닭 베타 액틴/토끼 베타 글로빈 인트론, 3) 인간 PSA 아미노산 25-261을 암호화하는 유전자, 및 4) 소 성장 호르몬 종결자로 이루어진 발현 카세트를 합성하였다. 상기 PSA 발현 카세트를 프라이머 3SalICBA 및 5SalIBGH와 함께 플라스미드 796으로부터 PCR에 의해 증폭시켰다. 상기 앰플리콘을 진아트(GeneArt) 무솔기 클로닝 및 어셈블리 키트(인비트로젠, 미국 캘리포니아주 칼스바트 소재)를 사용하여 플라스미드 603의 Sall 부위내로 클로닝하였다. 상기 플라스미드의 세포내 전달시, PSA 발현은 CBA 프로모터를 축출하는 반면, PSCA 및 PSMA 발현은 CMV 프로모터를 축출할 것이다.
플라스미드 850(CBA-PSA, CMV-PSCA-F2A-PSMA).
플라스미드 850을 PCR 및 무솔기 클로닝 기법을 사용하여 제작하였다. 먼저, CBA 프로모터-구동된 PSA 발현 카세트를 프라이머 3SalICBA 및 5SalIBGH와 함께 플라스미드 796으로부터 PCR에 의해 증폭시켰다. 상기 앰플리콘을 진아트 무솔기 클로닝을 사용하여 플라스미드 454의 Sall 부위내로 클로닝하였다. 상기 플라스미드의 세포내 전달시, PSA 발현은 CBA 프로모터를 축출하는 반면, PSCA 및 PSMA 발현은 CMV 프로모터를 축출할 것이다.
[표 20]
다중-항원을 발현하는 플라스미드의 목록
Figure pat00023
[표 21]
다중-항원 플라스미드의 제작에 사용된 프라이머의 목록
Figure pat00024
실시예 4C. 3중 항원 아데노바이러스 구축물
일반적인 전략.
DNA 플라스미드의 경우와 같이, 바이러스 백신 벡터를 다수의 전립선암 항원을 전달하도록 조작할 수 있다. 상기 DNA 백신에 대해 개시된 3 개의 다중-항원 발현 전략, 즉 이중 프로모터, 2A 펩타이드 및 내부 리보솜 진입 부위를 다양한 조합으로 통합시켜 3중 항원 아데노바이러스 벡터를 생성시켰다. 간단히, 상기 다중-항원 발현 카세트를, 테트라사이클린 오퍼레이터 서열(TetO2)의 2 개 사본을 갖도록 변형된 p셔틀-CMV 플라스미드에 클로닝하였다. 재조합 아데노바이러스 혈청형 5 벡터를 제조사의 프로토콜(에이질런트 테크놀로지스 인코포레이티드, 미국 캘리포니아주 산타 클라라 소재)에 따라 AdEasy 벡터 시스템을 사용하여 생성시켰다. 바이러스를 HEK293 세포에서 증폭시키고 표준 프로토콜에 따라 이중 염화 세슘 밴딩에 의해 정제시켰다. 생체내 연구에 앞서, 바이러스 스톡을 바이러스 입자 농도, 감염 역가, 무균성, 내독소, 게놈 및 트랜스유전자 완전성, 트랜스유전자 정체 및 발현에 대해서 철저히 특성화하였다.
아데노바이러스-733(PSA-F2A-PSMA-T2A-PSCA).
Ad-733은 플라스미드 457의 바이러스 등가물이다. 상기 3 개 항원의 발현은 Tet 리프레서 발현 HEK293 계통에서 대규모 생산시 트랜스유전자 발현을 억제하는 테트라사이클린 오퍼레이터와 함께 단일 CMV 프로모터를 축출한다. 다중-항원 발현 전략은 2 개의 상이한 2A 서열을 포함한다.
아데노바이러스-734(PSA-T2A-PSCA-F2A-PSMA).
Ad-734는 플라스미드 458의 바이러스 등가물이다. 상기 3 개 항원의 발현은 Tet 리프레서 발현 HEK293 계통에서 대규모 생산시 트랜스유전자 발현을 억제하는 테트라사이클린 오퍼레이터와 함께 단일 CMV 프로모터를 축출한다. 다중-항원 발현 전략은 2 개의 상이한 2A 서열을 포함한다.
아데노바이러스-735(PSCA-F2A-PSMA-mIRES-PSA).
Ad-735는 플라스미드 459의 바이러스 등가물이다. 상기 3 개 항원의 발현은 Tet 리프레서 발현 HEK293 계통에서 대규모 생산시 트랜스유전자 발현을 억제하는 테트라사이클린 오퍼레이터와 함께 단일 CMV 프로모터를 축출한다. 다중-항원 발현 전략은 2A 서열 및 IRES를 포함한다.
아데노바이러스-796(CBA-PSA, CMV-PSCA-pIRES-PSMA).
Ad-796은 플라스미드 846의 바이러스 등가물이다. PSA의 발현은 닭 베타 액틴 프로모터를 축출하는 반면 PSCA 및 PSMA 발현은 CMV-TetO2 프로모터를 축출한다. 다중-항원 발현 전략은 2 개의 프로모터 및 IRES를 포함한다.
아데노바이러스-809(CBA-PSA, CMV-PSCA-F2A-PSMA).
Ad-809는 플라스미드 850의 바이러스 등가물이다. PSA의 발현은 닭 베타 액틴 프로모터를 축출하는 반면 PSCA 및 PSMA 발현은 CMV-TetO2 프로모터를 축출한다. 다중-항원 발현 전략은 2 개의 프로모터 및 2A 서열을 포함한다.
실시예 5. 3중 항원 DNA 백신의 면역원성
실시예 5는 3 개의 암호화된 전립선 항원 모두에 대한 항원-특이성 T 및 B 세포 반응을 이끌어내는, PSMA, PSCA 및 PSA를 발현하는 3 중 항원 핵산 백신 구축물의 능력을 예시한다.
세포 면역 반응 연구.
실시예 5에 개시된 바와 같이, PSMA, PSCA 및 PSA를 함유하는 3중 항원 구축물의 면역원성을 하기에 개시된 과정에 따라 C57BL/6 마우스에서 연구하였다.
암컷 C57BL/6 마우스를 PMED 투여에 의해 인간 PSMA, PSCA 및 PSA 항원을 암호화하는 DNA 백신 구축물로 0일째에 초회항원자극하고 14, 28 및 49일째에 추가접종하였다. 전부, 4 개의 상이한 3중 항원 백신화 전략들을 평가하였으며, 상기 표적 단백질을 동시-발현하는 3 개의 DNA 백신 및 하나의 동시-제형화 접근법을 포함하였다. 동시-발현의 경우, 2A 펩타이드 또는 내부 리보솜 진입 부위(IRES)에 의해 결합된 3 개의 전립선 항원 모두를 암호화하는 단일 DNA 플라스미드를 하기와 같이 사용하였다: PSA-F2A-PSMA-T2A-PSCA(플라스미드 ID 457), PSA-T2A-PSCA-F2A-PSMA(플라스미드 ID 458) 및 PSCA-F2A-PSMA-IRES-PSA(플라스미드 ID 459). 동시-제형화 접근법의 경우, 각각 개별적으로 PSMA, PSCA 또는 PSA를 암호화하는 3 개의 상이한 DNA 플라스미드를 PMED 전달을 위해 단일 금 입자상에 동시-제형화하였다. 동시-제형화를 제외하고, 동시-발현을 조절하는 DNA 요소(2A 및 IRES)는 길이, 트랜스유전자 발현 효율 및 표적 트랜스유전자에 결합된 외래 유전자 물질의 존재가 상이하다. 대조군으로서, C57BL/6마우스를, 단일 전립선 항원, PSMA, PSCA 또는 PSA를 발현하는 DNA로 백신화하였다. 상기 동시-발현된 3중 또는 단일 항원 DNA 백신의 경우, PMED 투여당 2 ㎍ 용량의 DNA 백신 플라스미드를 제공한 반면, PMED 투여당 1 ㎍의 각각의 상기 동시-제형화된 3중 항원 DNA 백신(총 3 ㎍)을 투여하였다. 상기 3중 및 단일 항원 백신에 대한 세포 면역 반응을, 최종 PMED 백신화 후 7일째인 56일에 각각의 동물로부터 비장을 수거함으로써 측정하였다. 비장세포를 단리하고 IFN-γ ELISPOT 분석을 수행하여 PSMA, PSCA 및 PSA-특이성 T 세포 반응을 측정하였다. 간단히, 개별적인 동물로부터 웰당 2 x 105 비장세포를, 단일 인간 전립선 항원 또는 PSMA, PSCA 및 PSA를 함께 안정하게 발현하는, 웰당 5 x 104의 TRAMP-C2(트랜스제닉 선암종 마우스 전립선) 세포와 함께, 또는 10 ㎍/㎖의 개별적인 인간 PSMA, PSCA 및 PSA-특이성 펩타이드 또는 이들의 풀(펩타이드 및 펩타이드 풀 조성에 대해서 표 22를 참조하시오)과 함께, 또는 대조군으로서 배지만으로 도말하였다. 각각의 조건을 3 회 중복 수행하였다. 상기 플레이트를 37 ℃ 및 5% CO2에서 20 시간 동안 배양하였고, 제조사의 설명에 따라 배양 후 세척하고 전개시켰다. IFN-γ 스폿 형성 세포(SFC)의 수를 셀룰라 테크놀로지 리미티드(Cellular Technology Ltd.)(CTL) 판독기에 의해 카운트하였다. 상기 결과를 도 9 및 10에 제공하며, 이들 도면은 1 x 106 비장세포로 표준화된, 그룹당 5 마리 마우스의 PSMA, PSCA 또는 PSA-특이성 SFC의 평균수 +/- 표준편차를 나타낸다.
[표 22]
ELISPOT 분석에서 시험된 15머 PSMA, PSCA 및 PSA 펩타이다. 각 펩타이드의 N- 및 C-말단 단부의 아미노산 위치를 나타낸다.
Figure pat00025
항체 반응 연구.
3중 및 단일 항원 백신에 대한 항체 반응을, 최종 PMED 백신화후 7일째인 56일에 각 동물로부터 혈청을 수거하여 측정하였다. 혈청에 효소-결합된 면역흡수 분석(ELISA)을 가하여 항-PSMA 및 항-PSCA 항체 역가를 측정하였다. 간단히, ELISA 플레이트를 1 ㎍/㎖의 인간 PSMA 또는 PSCA로 코팅하고 4 ℃에서 밤새 배양하였다. 이어서 플레이트를 차단하고 RT에서 1 시간 동안 1% 소 혈청 알부민(BSA)과 함께 배양하였다. 각각의 혈청 샘플을 1:100 희석으로 출발하여 연속해서 중복 희석하고 RT에서 1 시간 동안 배양하였다. 세척 후에, 양고추냉이-퍼옥시다제(HRP)-접합된 염소 항-마우스 다중클론 IgG 항체를 RT에서 1 시간 동안 배양하였다. 세척 후에, TMB 퍼옥시다제 EIA-기질을 RT에서 30 분 동안 배양하였다. 비색측정 반응을 1N 황산의 첨가에 의해 정지시키고 이어서 흡광도를 450 ㎚에서 판독하였다. 적정 곡선을 각 혈청 샘플에 대해 플롯팅하였다(샘플 희석 대 흡광도). 이어서 혈청 역가(후속으로 상호 역가로 변환됨)를 검출 하한 이상의 광학 밀도(OD) 값으로 시험된 가장 묽은 혈청 샘플(LLOD; 배경 + 3 표준 편차) 또는 1.0의 OD 값을 성취하는 것으로 계산된 혈청 희석비로서 취하였다. 결과를 도 11 및 12에 제공하며, 이는 그룹당 5 마리 마우스의 평균 역가 +/- 표준 편차를 나타낸다.
혈청에 또한 형광-활성화된 세포 분류(FACS) 분석을 가하여 적합한 세포주의 세포 표면상에서 발현된 인간 PSMA 또는 PSCA에 대한 항체 결합을 측정하고, 따라서 상기 다중-항원 백신에 의해 생성된 항체가 각각 고유의 PSMA 및 PSCA 형태를 인식할 수 있는지의 여부를 측정하였다. LNCaP(인간 전립선 선암종) 세포를 사용하여 고유 PSMA에 대한 항체 결합을 측정하였다. PC3(인간 전립선암) 세포는, 인간 PSMA를 발현하지 않으므로, FACS 분석에서 대조군으로서 작용하였다. 인간 PSCA를 발현하는 아데노바이러스(Ad-PSCA)로 형질도입된 MIA-PaCa-2(인간 췌장 암종) 세포를 사용하여 고유 PSCA에 대한 항체 결합을 측정하였다. 형질도입되지 않은 MIA-PaCa-2 세포는 대조군으로서 작용하였다. 간단히, 항-PSMA 항체 결합을 측정하기 위해서, 2 x 105 LNCaP 또는 PC3 세포를 1:100 희석의 마우스 혈청 또는 15 ㎍/㎖의 대조용 마우스-항-인간 PSMA 단클론 항체(mAb)(클론 J591-A)와, 4 ℃에서 20 분 동안 배양하였다. 항-PSCA 항체 결합을 측정하기 위해서, 2 x 105 Ad-PSCA 형질도입된 및 형질도입되지 않은 MIA-PaCa-2 세포를 1:30 희석의 마우스 혈청 또는 4 ㎍/㎖의 대조용 마우스 항-인간 PSCA mAb(클론 7F5)와, 4 ℃에서 20 분 동안 배양하였다. 후속으로, 세포를 세척하고 2차 피코에리쓰린(PE)-접합된 염소-항-마우스 IgG 항체 및 생/사 염료와 함께 4 ℃에서 추가로 20 분 동안 배양하였다. 상기 배양 후에, 세포를 세척하고 1.5% 파라폼알데하이드에 재현탁하고, 10,000 개의 살아있는 세포를 FACS 칸토 II상에서 획득하였다. 상기 결과를 도 13 및 14에 제공하며, 이들 도면은 그룹당 5 마리 마우스의 2차 항-마우스 항체 단독에 대한 마우스 혈청의 평균 형광 강도(MFI)의 평균 변화 배수 +/- 표준 편차를 나타낸다. 항체 역가는, PSA가 상기 연구에서 조사된 다중-항원 백신에 의한 세포질 단백질로서 발현되기 때문에, 측정하지 않았다.
결과.
도 9a 내지 9d는 IFN-γ ELISPOT 분석에 의한 상기 3중 항원 백신의 세포 면역 반응을 평가하는 전형적인 연구의 결과를 도시한다. 간단히, 그룹당 5 마리의 마우스를 0일째에 초회항원 자극하고 14, 28 및 49일째에 PMED로 추가접종하였다. 최종 PMED 백신화 후 7일째인 56일에, 상기 내생적인 전립선 항원의 인식을 IFN-γ ELISPOT 분석에 의해 (A) TRAMP C2-PSMA, (B) TRAMP C2-PSCA, (C) TRAMP C2-PSA, 및 (D) TRAMP C2-PSMA-PSA-PSCA 세포에 대한 T 세포 반응을 검사함으로써 평가하였다. 상기 TRAMP C2 세포는 상기 분석에 대한 배경 대조군으로서 작용하였다. 내생적인 PSMA에 대한 IFN-γ T 세포 반응에 대해서, 상기 PSMA PMED 백신화에 이어서 TRAMP C2-PSMA에 대한 현저한 반응이 관찰되었으며, 이는 다른 연구들에서 나타난 반응들과 일치하였다. 상기 3중 항원 백신화에 이어서 TRAMP C2-PSMA에 대한 유사한 PSMA-특이성 IFN-γ T 세포 반응이 검출되었다. 대조적으로, 상기 반응의 완전한 제거가 동시-제형화된 PSMA, PSCA 및 PSA 백신화에 이어서 관찰되었다(*는 2-원 ANOVA에 의해 p<0.05를 가리킨다). 내생적인 PSCA에 대한 IFN-γ T 세포 반응에 대해서, 상기 4 개의 상이한 3중 항원 백신에 대해 상기 단일 PSCA 백신의 비교시, 상기 TRAMP C2-PSCA 세포에 대한 반응의 현저한 차이는 관찰되지 않았다. 내생적인 PSA에 대한 IFN-γ T 세포 반응에 대해서, PSCA-F2A-PSMA-IRES-PSA(***는 2원 ANOVA에 의해 p<0.001을 가리킨다) 또는 상기 동시-제형화된 백신(*는 2원 ANOVA에 의해 p<0.05를 가리킨다)에 대해 상기 단일 PSA 백신의 면역원성 비교시, 상기 TRAMP C2-PSCA에 대한 반응 크기의 현저한 감소가 검출되었다. TRAMP C2-PSMA-PSCA-PSA에 대한 반응의 검사시, 최고 크기의 IFN-γ T 세포 반응이 상기 PSA-F2A-PSMA-T2A-PSCA 백신에 이어서 관찰되었다. 하나로 합쳐서, 이들 데이터는 내생적인 PSMA, PSCA 및 PSA의 인식 및 동시-발현 DNA 백신화 전략을 사용하는, 특히 상기 PSA-F2A-PSMA-T2A-PSCA 백신 구축물에 의한 3 개의 전립선 항원 모두에 대한 항원-특이성 T 세포 반응의 발생을 입증한다. 그러나, 상기 동시-제형화 DNA 백신화 전략은 PSMA 및 PSA에 대한 항원-특이성 IFN-γ T 세포 반응을 상실시켰다.
도 10a 내지 10d는 IFN-γ ELISPOT 분석에 의한 상기 3중 항원 백신의 면역원성을 평가하는 전형적인 연구의 결과를 도시한다. 간단히, 그룹당 5 마리의 마우스를 0일째에 초회항원자극하고 14, 28 및 49일째에 PMED로 추가접종하였다. 56일째에, (A) PSMA 펩타이드, (B) PSMA 펩타이드 풀, (C) PSCA 펩타이드, 및 (D) PSA 펩타이드에 대한 T 세포 반응(표 22 참조)을 IFN-γ ELISPOT 분석에 의해 평가하였다. 배지는 단독으로 상기 분석에 대한 배경 대조군으로서 작용하였다. 단일 PSMA 백신에 비해, PSMA 펩타이드의 개별 및 풀 모두에 대한 IFN-γ T 세포 반응에 대해서, 최고 크기의 반응은 PSA-F2A-PSMA-T2A-PSCA 3중 항원 백신의 투여에 이어서 관찰되었다. 유사하게, PSCA 및 PSA-특이성 펩타이드에 대한 최고 크기의 IFN-γ T 세포 반응이 상기 PSA-F2A-PSMA-T2A-PSCA 백신의 투여에 이어서 검출되었다. 상기 동시-제형화된 PSMA, PSCA 및 PSA 백신은 상기 PSMA-특이성 펩타이드에 대해 낮은 T 세포 반응 내지 무반응을 생성시켰고 상기 PSCA 및 PSA-특이성 펩타이드에 대해 낮은 정도의 반응을 생성시켰다. 이들 데이터는 또한 동일한 백신 구축물로부터 동시-발현시 PSMA, PSCA 및 PSA에 대한 T 세포 반응의 생성을 입증한다. PSA-F2A-PSMA-T2A-PSCA 백신화에 이은 상기 3 개 전립선 항원에 대한 일관되고 확고한 IFN-γ T 세포 반응, 및 PSA-T2A-PSCA-F2A-PSMA, PSMA-F2A-PSMA-IRES-PSA 및 동시-제형화된 PSMA, PSCA 및 PSA 백신화에 이은 상기 전립선 항원들에 대한 IFN-γ T 세포 반응의 크기의 현저한 감소가 존재하였다.
도 11은 항-PSMA 항체 역가에 의한 상기 3중 항원 백신의 면역원성을 평가하는 전형적인 연구의 결과를 도시한다. 간단히, 그룹당 5 마리의 마우스를 0일째에 초회항원자극하고 14, 28 및 49일째에 PMED로 추가접종하였다. 56일째에, 혈청 항-PSMA 항체 역가를 ELISA에 의해 평가하였다. PSMA에 의해 백신화된 모든 동물들은 현저한 항-PSMA 항체 역가를 생성시켰다. 역가들간에 현저한 차이는 없었지만, PSA-F2A-PSMA-T2A-PSCA에 의한 백신화는 PSMA에 의해 백신화된 다른 그룹들에 비해 약간 더 낮은 역가를 생성시켰다. 이들 데이터는 동시-발현 및 동시-제형화 백신 전략을 사용한, 3중 항원 백신화에 따른 항-PSMA-특이성 항체의 생성을 입증한다.
도 12는 항-PSCA 항체 역가에 의한 상기 3중 항원 백신의 면역원성을 평가하는 전형적인 연구의 결과를 도시한다. 간단히, 그룹당 5 마리의 마우스를 0일째에 초회항원자극하고 14, 28 및 49일째에 PMED로 추가접종하였다. 56일째에, 혈청 항-PSMA 항체 역가를 ELISA에 의해 평가하였다. 항체 역가를 PSCA 단독, 및 동시-제형화된 PSMA, PSCA 및 PSA로 백신화된 마우스에서 검출하였다. 이들 결과는 PSMA, PSCA 및 PSA의 동시-제형화가 상기 동시-발현된 DNA 백신화 전략에 비해 검출 가능한 항-PSCA 항체 역가를 유도함을 가리킨다.
도 13은 항-PSMA 항체 세포-표면 결합에 의한 상기 3중 항원 백신의 면역원성을 평가하는 전형적인 연구의 결과를 도시한다. 간단히, 그룹당 5 마리의 마우스를 0일째에 초회항원자극하고 14, 28 및 49일째에 PMED로 추가접종하였다. 56일째에, 세포-표면 고유 PSMA의 인식을 LNCaP 및 PC3 세포에 대한 혈청 항체 결합에 의해 평가하였다. 상기 PC3 세포는 상기 분석에 대한 배경 대조군으로서 작용하였다. PSA-F2A-PSMA-T2A-PSCA 백신화는, PSA-F2A-PSCA-T2A-PSMA 및 PSMA 단독으로 백신화된 마우스에 비해 LNCaP 세포에 대해 현저하게 더 낮은 결합 능력을 갖는 항-PSMA 항체를 생성시켰다(*는 일원 ANOVA에 의한 p-값 < 0.05를 가리킨다). 모든 다른 PSMA 백신화된 그룹은 항-PSMA 항체 결합에서 현저한 차이를 나타내지 않았다. J591-A mAb에 대한 2차 항체 단독의 변화 배수는 45.3이었다(데이터 도시 안 됨). 종합적으로, 이들 데이터는 동시-발현 및 동시-제형화 DNA 백신화 전략 모두를 사용하여, 3중 항원 백신화에 따른 고유 PSMA를 인식하는 항-PSMA-특이성 항체의 생성을 입증한다.
도 14는 항-PSCA 항체 세포-표면 결합에 의한 상기 3중 항원 백신의 면역원성을 평가하는 전형적인 연구의 결과를 도시한다. 간단히, 그룹당 5 마리의 마우스를 0일째에 초회항원자극하고 14, 28 및 49일째에 PMED로 추가접종하였다. 56일째에, 세포-표면 고유 PSCA의 인식을 Ad-PSCA 형질도입된 및 형질도입되지 않은 MIA-PaCa-2 세포에 대한 혈청 항체 결합에 의해 평가하였다. 상기 형질도입되지 않은, 모 세포는 상기 분석에 대한 배경 대조군으로서 작용하였다. 상기 단일 PSMA 및 단일 PSA 세포 백신을 제외하고, PSCA에 의한 모든 백신 요법은 상기 모 세포에 비해 Ad-PSCA 형질도입된 MIA-PaCa-2 세포에 대해 현저한 항-PSCA 항체 결합을 생성시켰다. 상기 PSCA-백신화된 그룹들 간에 Ad-PSCA 형질도입된 MIA-PaCa-2 세포에 대한 항-PSCA 항체 결합의 현저한 차이는 없었다(일원 ANOVA, p-값 > 0.05). 7F5 mAb에 대한 2차 항체 단독의 변화 배수는 18.7이었다(데이터 도시 안 됨). 종합적으로, 이들 데이터는 동시-발현 및 동시-제형화 DNA 백신화 전략 모두를 사용하여, 3중 항원 백신화에 따른 고유 PSCA를 인식하는 항-PSCA-특이성 항체의 생성을 입증한다.
실시예 6. 이중 항원 백신의 면역원성
하기의 실시예들은 2 개의 암호화된 전립선 항원에 대한 항원-특이성 T 및 B 세포 반응을 이끌어내는 상기 두 전립선 항원을 발현하는 이중 항원 백신의 능력을 예시하기 위해 제공된다.
6A. C57BL/6에서 PSMA 및 PSCA를 함유하는 이중 항원 백신의 면역원성
연구 과정.
세포 면역 반응 연구.
암컷 C57BL/6 마우스를 PMED 표피 주사에 의해 인간 PSMA 및 PSCA 발현 DNA로 0일째에 초회항원자극하고 14, 28, 42 및 70일째에 추가접종하였다. 전부, 5 개의 상이한 이중 항원 DNA 백신화 전략들을 평가하였으며, 상기 전략은 상기 항원들을 동시-발현하는 4 개의 DNA 백신 및 하나의 동시-제형화 접근법을 포함하였다. 동시-발현의 경우, 이중 프로모터, 2A 펩타이드 또는 IRES에 의해 결합된 2 개의 전립선 항원, PSMA 및 PSCA를 암호화하는 단일 DNA 플라스미드를 투여하였다. 이들은 PSMA-PSCA 이중 프로모터(플라스미드 ID 460), PSMA-T2A-PSCA(플라스미드 ID 451), PSCA-F2A-PSMA(플라스미드 ID 454) 및 PSCA-IRES-PSMA(플라스미드 ID 603)를 포함하였다. 동시-제형화의 경우, 각각 개별적으로 PSMA 및 PSCA를 암호화하는 2 개의 상이한 DNA 플라스미드를 PMED 전달을 위해 단일 금 입자상에 동시-제형화하였다. 동시-제형화를 제외하고, 동시-발현을 조절하는 DNA 요소(이중 프로모터, 2A 및 IRES)는 길이, 트랜스유전자 발현 효율 및 표적 트랜스유전자에 결합된 외래 유전자 물질의 존재가 상이하다. 대조군으로서, C57BL/6 마우스를, 단일 전립선 항원, PSMA 또는 PSCA를 발현하는 DNA로 백신화하였다. 상기 동시-발현된 이중 또는 단일 항원 DNA 백신의 경우, 총 2 ㎍ 용량의 DNA 백신을 PMED 투여당 제공한 반면, 2 ㎍의 각각의 DNA 백신 플라스미드(투여당 총 4 ㎍의 DNA)를 상기 동시-제형화를 위해서 제공하였다. 상기 이중 및 단일 항원 백신에 대한 세포 면역 반응을, 최종 PMED 백신화 후 7일째인 77일에 각각의 동물로부터 비장을 수거함으로써 측정하였다. 비장세포를 단리하고 IFN-γ ELISPOT 분석을 수행하여 PSMA 및 PSCA-특이성 T 세포 반응을 측정하였다. 간단히, 개별적인 동물로부터 웰당 2 x 105 비장세포를, 단일의 내생적인 인간 전립선 항원 또는 PSMA, PSCA 및 PSA를 함께 발현하는, 웰당 5 x 104의 TRAMP-C2 세포와 함께, 또는 10 ㎍/㎖의 개별적인 인간 PSMA 및 PSCA-특이성 펩타이드 또는 이들의 풀(펩타이드 및 펩타이드 풀 조성에 대해서 표 22를 참조하시오)과 함께, 또는 대조군으로서 배지만으로 도말하였다. 각각의 조건을 3 회 중복 수행하였다. 상기 플레이트를 37 ℃ 및 5% CO2에서 20 시간 동안 배양하였고, 제조사의 설명에 따라 배양 후 세척하고 전개시켰다. IFN-γ SFC의 수를 CTL 판독기에 의해 카운트하였다. 상기 결과를 도 15 및 16에 제공하며, 이들 도면은 1 x 106 비장세포로 표준화된, 그룹당 5 마리 마우스의 PSMA 또는 PSCA-특이성 SFC의 평균수 +/- 표준편차를 나타낸다.
항체 반응 연구.
이중 및 단일 항원 백신에 대한 항체 반응을, 최종 PMED 백신화후 7일째인 77일에 각 동물로부터 혈청을 수거하여 측정하였다. 실시예 5에 개시된 바와 같이 ELISA를 사용하여 혈청 중 항-PSMA 및 항-PSCA 항체 역가를 측정하였다. 결과를 도 17 및 18에 제공하며, 이는 그룹당 5 마리 마우스의 평균 역가 +/- 표준 편차를 나타낸다.
혈청에 또한 FACS 분석을 가하여 적합한 세포주의 세포 표면상에서 발현된 인간 PSMA 또는 PSCA에 대한 항체 결합을 측정하고, 따라서 상기 다중-항원 백신에 의해 생성된 항체가 각각 고유의 PSMA 및 PSCA 형태를 인식할 수 있는지의 여부를 측정하였다. 세포-표면 고유 PSA에 대한 항체 결합은, PSA가 본 연구에서 조사된 다중-항원 백신에 의해 세포질 단백질로서 발현되지 않으므로 측정하지 않았다. 상기 FACS 분석을 실시예 5에 개시된 바와 같은 과정에 따라 수행하였다. 상기 결과를 도 19 및 20에 제공하며, 이들 도면은 그룹당 5 마리 마우스의 2차 항-마우스 항체 단독에 대한 마우스 혈청의 MFI의 평균 변화 배수 +/- 표준 편차를 나타낸다. 항체 역가 및 세포-표면 고유 PSA에 대한 결합은, PSA가 상기 연구에서 조사된 다중-항원 백신에 의한 세포질 단백질로서 발현되기 때문에, 측정하지 않았다.
결과.
도 15a 내지 15c는 IFN-γ ELISPOT 분석에 의한 상기 이중 항원 백신의 면역원성을 평가하는 전형적인 연구의 결과를 도시한다. 간단히, 그룹당 5 마리의 마우스를 0일째에 초회항원 자극하고 14, 28, 42 및 70일째에 PMED로 추가접종하였다. 77일째에, 내생적인 PSMA 및 PSCA의 인식을 IFN-γ ELISPOT 분석에 의해 (A) TRAMP C2-PSMA, (B) TRAMP C2-PSCA, 및 (C) TRAMP C2-PSMA-PSA-PSCA 세포에 대한 T 세포 반응을 검사함으로써 평가하였다. 상기 TRAMP C2 세포는 상기 분석에 대한 배경 대조군으로서 작용하였다. 내생적인 PSMA에 대한 IFN-γ T 세포 반응에 대해서, 상기 반응 TRAMP C2-PSMA의 크기는 PSMA 단독 백신화에 비해, PSMA-PSCA 이중 프로모터, PSMA-T2A-PSCA, PSCA-IRES-PSMA 및 동시-제형화된 PSMA PSCA에 의한 백신화에 따라 현저하게 감소하였다(** 및 ***는, 2-원 ANOVA에 의해, 각각 p-값 < 0.01 및 < 0.001을 가리킨다). 그러나, 상기 PSCA-F2A-PSMA 백신 구축물은 단일 PSMA 백신으로서 상기 TRAMP C2-PSMA 세포에 대해 유사한 크기의 IFN-γ T 세포 반응을 유도하였다. 내생적인 PSCA에 대한 IFN-γ T 세포 반응에 대해서, 상기 PSCA 백신 단독에 비해, PSMA-PSCA 이중 프로모터, PSCA-T2A-PSMA, PSCA-IRES-PSMA 및 동시-제형화된 PSMA PSCA를 포함한, 다수의 이중 항원 백신들에 의한 백신화에 따라 현저하게 증가된 반응이 관찰되었다(*, ** 및 ***는, 2-원 ANOVA에 의해, 각각 p-값 < 0.05, 0.01 및 0.001을 가리킨다). 상기 PSCA-T2A-PSMA 백신 구축물은 단일 PSCA 백신으로서 상기 TRAMP C2-PSCA 세포에 대해 유사한 크기의 IFN-γ T 세포 반응을 유도하였다. TRAMP C2-PSMA-PSA-PSCA에 대한 상기 IFN-γ T 세포 반응들을 비교시, 상이한 이중 항원 백신들에 의해 백신화된 그룹들 간에 현저한 차이는 없었다. 하나로 합쳐서, 이들 데이터는 동시-발현 및 동시-제형화 DNA 백신화 전략 모두를 사용하여, 이중 항원 백신화에 따른 PSMA 및 PSCA-특이성 T 세포 반응의 생성을 입증한다.
도 16a 내지 16c는 IFN-γ ELISPOT 분석에 의한 상기 이중 항원 백신의 면역원성을 평가하는 전형적인 연구의 결과를 도시한다. 간단히, 그룹당 5 마리의 마우스를 0일째에 초회항원자극하고 14, 28, 42 및 70일째에 PMED로 추가접종하였다. 77일째에, (A) PSMA 펩타이드, (B) PSMA 펩타이드 풀, 및 (C) PSCA 펩타이드에 대한 T 세포 반응(표 22 참조)을 IFN-γ ELISPOT 분석에 의해 평가하였다. 배지는 단독으로 상기 분석에 대한 배경 대조군으로서 작용하였다. 단일 PSMA 백신에 비해, PSMA 펩타이드의 개별 및 풀 모두에 대한 IFN-γ T 세포 반응에 대해서, 최고 크기의 반응은 PSMA-T2A-PSCA 및 PSCA-F2A-PSMA 이중 항원 백신화에 이어서 관찰되었다. 개별적인 PSMA 펩타이드에 대한 IFN-γ T 세포 반응의 현저한 감소가 PSMA-PSCA 이중 프로모터, PSCA-IRES-PSMA 및 동시-제형화된 PSMA PSCA에 의한 제형화에 이어서 관찰되었다. 상기 PSCA-특이성 펩타이드에 대한 IFN-γ T 세포 반응은 상기 상이한 이중 항원 백신들에 의해 백신화된 그룹들간에 유사하였다. 이들 데이터는 또한 동일한 DNA 백신 구축물상에서 동시-발현시 또는 공동-제형화로서 전달시, PSMA 및 PSCA 모두에 대한 T 세포 반응의 발생을 입증한다.
도 17은 항-PSMA 항체 역가에 의한 상기 이중 항원 백신의 면역원성을 평가하는 전형적인 연구의 결과를 도시한다. 간단히, 그룹당 5 마리의 마우스를 0일째에 초회항원자극하고 14, 28, 42 및 70일째에 PMED로 추가접종하였다. 77일째에, 혈청 항-PSMA 항체 역가를 ELISA에 의해 평가하였다. PSMA에 의해 백신화된 모든 동물들은 현저한 항-PSMA 항체 역가를 생성시켰다. 상기 이중 백신 구축물, PSCA-F2A-PSMA, 및 단일 PSMA 백신으로 백신화된 마우스는 PSMA로 백신화된 마우스의 모든 다른 그룹들에 비해 현저하게 더 높은 항체 역가를 생성시켰다(일원 ANOVA, p-값 < 0.05). PSMA-PSCA 이중 프로모터 및 동시-제형화된 PSMA 및 PSCA에 의한 백신화는 상기 PSMA-T2A-PSCA 백신을 제공받은 마우스에 비해 더 높은 항체 역가를 생성시켰다. 하나로 합쳐서, 이들 데이터는 동시-발현 및 동시-제형화 백신 전략을 사용한, PSMA 및 PSCA에 의한 이중 항원 DNA 백신화에 따른 항-PSMA-특이성 항체의 생성을 입증한다.
도 18은 항-PSCA 항체 역가에 의한 상기 이중 항원 백신의 면역원성을 평가하는 전형적인 연구의 결과를 도시한다. 간단히, 그룹당 5 마리의 마우스를 0일째에 초회항원자극하고 14, 28, 42 및 70일째에 PMED로 추가접종하였다. 77일째에, 혈청 항-PSCA 항체 역가를 ELISA에 의해 평가하였다. 상기 동시-제형화된 PSMA 및 PSCA, 및 단일 PSCA 백신으로 백신화된 마우스는 PSCA로 백신화된 마우스의 모든 다른 그룹들에 비해 현저하게 더 높은 항체 역가를 생성시켰다(일원 ANOVA). PSMA-PSCA 이중 프로모터에 의한 백신화는 상기 PSMA-T2A-PSCA, PSCA-F2A-PSMA 및 PSCA-IRES-PSMA에 의한 백신화에 비해 더 높은 항체 역가를 생성시켰다. 이들 결과는 PSMA 및 PSCA의 동시-발현 또는 동시-제형화가 항-PSCA 항체를 유도함을 가리킨다.
도 19는 항-PSMA 항체 세포-표면 결합에 의한 상기 이중 항원 백신의 면역원성을 평가하는 전형적인 연구의 결과를 도시한다. 간단히, 그룹당 5 마리의 마우스를 0일째에 초회항원자극하고 14, 28, 42 및 70일째에 PMED로 추가접종하였다. 77일째에, 세포-표면 고유 PSMA의 인식을 LNCaP 및 PC3 세포에 대한 혈청 항체 결합에 의해 평가하였다. 상기 PC3 세포는 상기 분석에 대한 배경 대조군으로서 작용하였다. 상기 단일 PSCA 백신을 제외하고, PSMA에 의한 모든 백신 요법들은 대조용 PC3 세포에 비해 LNCaP 세포에 대해 현저한 항-PSMA 항체 결합을 생성시켰다. 상기 PSMA-백신화된 그룹들 간에 LNCaP 세포에 대한 항-PSMA 항체 결합에 있어서 현저한 차이는 없었다(일원 ANOVA, p-값 > 0.05). J591-A mAb에 대한 2차 항체 단독의 변화 배수는 45.3이었다(데이터 도시 안 됨). 이들 데이터는 동시-발현 및 동시-제형화 백신화 전략 모두를 사용하여, 이중 항원 DNA 백신화에 따른 고유 PSMA를 인식하는 항-PSMA-특이성 항체의 생성을 입증한다.
도 20은 항-PSCA 항체 세포-표면 결합에 의한 상기 이중 항원 백신의 면역원성을 평가하는 전형적인 연구의 결과를 도시한다. 간단히, 그룹당 5 마리의 마우스를 0일째에 초회항원자극하고 14, 28, 42 및 70일째에 PMED로 추가접종하였다. 77일째에, 세포-표면 고유 PSCA의 인식을 Ad-PSCA 형질도입된 및 형질도입되지 않은 MIA-PaCa-2 세포에 대한 혈청 항체 결합에 의해 평가하였다. 상기 형질도입되지 않은, 모 세포는 상기 분석에 대한 배경 대조군으로서 작용하였다. 상기 단일 PSMA 백신을 제외하고, PSCA에 의한 모든 백신 요법은 상기 대조용 세포에 비해 Ad-PSCA 형질도입된 MIA-PaCa-2 세포에 대해 현저한 항-PSCA 항체 결합을 생성시켰다. 상기 PSCA-백신화된 그룹들 간에 Ad-PSCA 형질도입된 MIA-PaCa-2 세포에 대한 항-PSCA 항체 결합의 현저한 차이는 없었다(일원 ANOVA, p-값 > 0.05). 7F5 mAb에 대한 2차 항체 단독의 변화 배수는 18.7이었다(데이터 도시 안 됨). 종합적으로, 이들 데이터는 동시-발현 및 동시-제형화 DNA 백신화 전략 모두를 사용하여, 이중 항원 DNA 백신화에 따른 고유 PSCA를 인식하는 항-PSCA-특이성 항체의 생성을 입증한다.
6B. C57BL/6에서 PSMA 및 PSA 또는 PSCA 및 PSA를 함유하는 이중 항원 백신의 면역원성
연구 과정.
세포 면역 반응 연구.
암컷 C57BL/6 마우스를 PMED 표피 주사에 의해 인간 PSMA, PSCA 및 PSA 발현 DNA로 0일째에 초회항원자극하고 14 및 28일째에 추가접종하였다. 전부, 4 개의 상이한 이중 항원 DNA 백신화 전략들을 평가하였으며, 상기 전략은 2 개의 동시-발현 접근법 및 2 개의 동시-제형화 전략을 포함하였다. 동시-발현의 경우, 2A 펩타이드에 의해 결합된 2 개의 전립선 항원, PSMA 및 PSA(플라스미드 ID 5300) 또는 IRES에 의해 결합된 PSCA 및 PSA(플라스미드 ID 455)를 암호화하는 단일 DNA 플라스미드를 투여하였다. 동시-제형화의 경우, PSMA, PSCA 및 PSA를 개별적으로 암호화하는 플라스미드를 PMED 전달을 위해 단일 금 입자상에 동시-제형화하였다. 구체적으로, 이들은 동시-제형화된 PSMA 및 PSA 및 동시-제형화된 PSCA 및 PSA를 포함하였다. 대조군으로서, C57BL/6 마우스를, 단일 전립선 항원, PSMA, PSCA 또는 PSA를 발현하는 DNA로 백신화하였다. 상기 동시-발현된 이중 또는 단일 항원 백신의 경우, PMED 투여당 2 ㎍ 용량의 DNA를 제공한 반면, 2 ㎍의 각각의 DNA 백신 플라스미드(투여당 총 4 ㎍의 DNA)를 상기 동시-제형화를 위해서 제공하였다. 상기 이중 및 단일 항원 백신에 대한 세포 면역 반응을, 35일째에 각각의 동물로부터 비장을 수거함으로써 측정하였다. 비장세포를 단리하고 IFN-γ ELISPOT 분석을 수행하여 PSMA, PSCA 및 PSA-특이성 T 세포 반응을 측정하였다. 간단히, 개별적인 동물로부터 웰당 2 x 105 비장세포를, 단일의 내생적인 인간 전립선 항원 또는 PSMA, PSCA 및 PSA를 함께 발현하는, 웰당 5 x 104의 TRAMP-C2 세포와 함께, 또는 10 ㎍/㎖의 개별적인 인간 PSMA, PSCA 및 PSA-특이성 펩타이드 또는 이들의 풀(펩타이드 및 펩타이드 풀 조성에 대해서 표 22를 참조하시오)과 함께, 또는 대조군으로서 배지만으로 도말하였다. 각각의 조건을 3 회 중복 수행하였다. 상기 플레이트를 37 ℃ 및 5% CO2에서 20 시간 동안 배양하였고, 제조사의 설명에 따라 배양 후 세척하고 전개시켰다. IFN-γ SFC의 수를 CTL 판독기에 의해 카운트하였다. 상기 결과를 도 21 및 22에 제공하며, 이들 도면은 1 x 106 비장세포로 표준화된, 그룹당 5 마리 마우스의 PSMA, PSCA 및 PSA-특이성 SFC의 평균수 +/- 표준편차를 나타낸다.
항체 반응 연구.
암컷 C57BL/6 마우스를 PMED에 의해 인간 PSMA, PSCA 및 PSA 발현 DNA로 0일째에 초회항원자극하고 14, 28 및 49일째에 추가접종하였다. 상기 이중 및 단일 항원 백신에 대한 항체 반응을, 최종 PMED 백신화후 7일째인 56일에 각 동물로부터 혈청을 수거하여 측정하였다. 실시예 5에 개시된 바와 같이 ELISA 분석을 사용하여 혈청 중 항-PSMA 및 항-PSCA 항체 역가를 측정하였다. 결과를 도 23 및 24에 제공하며, 이는 그룹당 5 마리 마우스의 평균 역가 +/- 표준 편차를 나타낸다.
혈청에 또한 FACS 분석을 가하여 적합한 세포주의 세포 표면상에서 발현된 인간 PSMA 또는 PSCA에 대한 항체 결합을 측정하고, 따라서 상기 다중-항원 백신에 의해 생성된 항체가 각각 고유의 PSMA 및 PSCA 형태를 인식할 수 있는지의 여부를 측정하였다. 세포-표면 고유 PSA에 대한 항체 결합은, PSA가 본 연구에서 조사된 다중-항원 백신에 의해 세포질 단백질로서 발현되므로 측정하지 않았다. 상기 FACS 분석을 실시예 5에 개시된 바와 같은 과정에 따라 수행하였다. 상기 결과를 도 25 및 26에 제공하며, 이들 도면은 그룹당 5 마리 마우스의 2차 항-마우스 항체 단독에 대한 마우스 혈청의 MFI의 평균 변화 배수 +/- 표준 편차를 나타낸다. 항체 역가 및 세포-표면 고유 PSA에 대한 결합은, PSA가 상기 연구에서 조사된 다중-항원 백신에 의한 세포질 단백질로서 발현되기 때문에, 측정하지 않았다.
결과.
도 21a 내지 21d는 IFN-γ ELISPOT 분석에 의한 상기 이중 항원 백신의 면역원성을 평가하는 전형적인 연구의 결과를 도시한다. 간단히, 그룹당 5 마리의 마우스를 0일째에 초회항원 자극하고 14 및 28일째에 PMED로 추가접종하였다. 35일째에, 내생적인 PSMA, PSCA 및 PSA의 인식을 IFN-γ ELISPOT 분석에 의해 (A) TRAMP C2-PSMA, (B) TRAMP C2-PSCA, (C) TRAMP C2-PSA 및 (D) TRAMP C2-PSMA-PSA-PSCA 세포에 대한 T 세포 반응을 검사함으로써 평가하였다. 상기 TRAMP C2 세포는 상기 분석에 대한 배경 대조군으로서 작용하였다. 세포상의 내생적으로 발현된 PSMA에 대한 IFN-γ T 세포 반응에 대해서, 이중 항원 함유 PSMA(PSA-F2A-PSMA 및 동시-제형화된 PSMA 및 PSA) 및 PSMA 단독에 의한 백신화에 따른 TRAMP C2-PSMA에 대한 반응들간에 현저한 차이는 관찰되지 않았다. 마찬가지로, 내생적인 PSCA에 대한 IFN-γ T 세포 반응에 대해서, 단일 PSCA 백신에 비해 상기 이중 PSCA-IRES-PSA 및 동시-제형화된 PSCA 및 PSA 백신간의 TRAMP C2-PSMA에 대한 반응 크기의 차이는 관찰되지 않았다. 내생적인 PSA에 대한 IFN-γ T 세포 반응에 대해서, PSA-F2A-PSMA(***는 2원 ANOVA에 의해 p < 0.001을 가리킨다) 및 동시-제형화된 PSMA 및 PSA(**는 2원 ANOVA에 의해 p < 0.01을 가리킨다)에 대한 단일 PSA 백신의 면역원성과 비교시 TRAMP C2-PSA에 대한 반응 크기의 현저한 증가가 검출되었다. 상기 단일 PSA 백신에 대해 상기 이중 PSCA 및 PSA 백신을 제공받은 동물들을 비교시 TRAMP C2-PSA에 대한 반응 크기의 차이는 관찰되지 않았다. TRAMP C2-PSMA-PSA-PSCA에 대한 상기 IFN-γ T 세포 반응들을 비교시, 상이한 이중 항원 백신들에 의해 백신화된 그룹들 간에 현저한 차이는 없었다. 하나로 합쳐서, 이들 데이터는 동시-발현 및 동시-제형화 백신 전략 모두를 사용하여, 이중 항원 DNA 백신화에 따른 PSCA 및 PSA-특이성 T 세포 반응뿐만 아니라 PSMA 및 PSA-특이성 T 세포 반응의 생성을 입증한다.
도 22는 항-PSMA 항체 역가에 의한 상기 이중 항원 백신의 면역원성을 평가하는 전형적인 연구의 결과를 도시한다. 간단히, 그룹당 5 마리의 마우스를 0일째에 초회항원자극하고 14, 28 및 49일째에 PMED로 추가접종하였다. 56일째에, 혈청 항-PSMA 항체 역가를 ELISA에 의해 평가하였다. PSMA에 의해 백신화된 모든 동물들은 현저한 항-PSMA 항체 역가를 생성시켰다. PSCA-F2A-PSMA, 동시-제형화된 PSMA 및 PSA, 및 PSMA 단독으로 백신화된 마우스들 간의 항체 역가에서 현저한 차이는 없었다(일원 ANOVA, p-값 > 0.05). 하나로 합쳐서, 이들 데이터는 동시-발현 및 동시-제형화 백신 전략을 사용한, PSMA 및 PSCA에 의한 이중 항원 DNA 백신화에 따른 항-PSMA-특이성 항체의 생성을 입증한다.
도 23은 항-PSCA 항체 역가에 의한 상기 이중 항원 백신의 면역원성을 평가하는 전형적인 연구의 결과를 도시한다. 간단히, 그룹당 5 마리의 마우스를 0일째에 초회항원자극하고 14, 28, 및 49일째에 PMED로 추가접종하였다. 56일째에, 혈청 항-PSMA 항체 역가를 ELISA에 의해 평가하였다. PSCA에 의해 백신화된 모든 동물들은 현저한 항-PSCA 항체 역가를 생성시켰다. PSCA-IRES-PSA 백신화에 따라 생성된 항체 역가가 PSCA로 백신화된 다른 그룹들보다 낮은 경향이 있었지만, PSCA-IRES-PSA, 동시-제형화된 PSCA 및 PSA, 및 PSCA 단독으로 백신화된 마우스들 간의 항체 역가에서 현저한 차이는 없었다(일원 ANOVA, p-값 > 0.05). 이들 결과는 PSCA 및 PSA의 동시-발현 또는 동시-제형화가 항-PSCA 항체를 유도함을 가리킨다.
도 24는 항-PSMA 항체 세포-표면 결합에 의한 상기 이중 항원 백신의 면역원성을 평가하는 전형적인 연구의 결과를 도시한다. 간단히, 그룹당 5 마리의 마우스를 0일째에 초회항원자극하고 14, 28 및 49일째에 PMED로 추가접종하였다. 56일째에, 세포-표면 고유 PSMA의 인식을 LNCaP 및 PC3 세포에 대한 혈청 항체 결합에 의해 평가하였다. 상기 PC3 세포는 상기 분석에 대한 배경 대조군으로서 작용하였다. 상기 PSMA-백신화된 그룹들 간에 LNCaP 세포에 대한 항-PSMA 항체 결합에 있어서 현저한 차이는 없었다(일원 ANOVA, p-값 > 0.05). J591-A mAb에 대한 2차 항체 단독의 변화 배수는 45.3이었다(데이터 도시 안 됨). 종합적으로, 이들 데이터는 동시-발현 및 동시-제형화 백신 전략 모두를 사용하여, 이중 항원 백신화에 따른 고유 PSMA를 인식하는 항-PSMA-특이성 항체의 생성을 입증한다.
도 25는 항-PSCA 항체 세포-표면 결합에 의한 상기 이중 항원 백신의 면역원성을 평가하는 전형적인 연구의 결과를 도시한다. 간단히, 그룹당 5 마리의 마우스를 0일째에 초회항원자극하고 14, 28, 및 49일째에 PMED로 추가접종하였다. 56일째에, 세포-표면 고유 PSCA의 인식을 Ad-PSCA 형질도입된 및 형질도입되지 않은 MIA-PaCa-2 세포에 대한 혈청 항체 결합에 의해 평가하였다. 상기 형질도입되지 않은, 모 세포는 상기 분석에 대한 배경 대조군으로서 작용하였다. PSCA에 의해 백신화된 모든 그룹의 마우스는 Ad-PSCA 형질도입된 MIA-PaCa-2 세포에 대해 매우 낮은 항-PSCA 항체 결합을 입증하였다. PSCA-IRES-PSA 백신화는 PSCA 단독으로 백신화된 마우스에 비해 Ad-PSCA 형질도입된 MIA-PaCa-2 세포에 현저하게 감소된 결합을 생성시켰다(*는 일원 ANOVA에 의해 p < 0.05를 나타낸다). 하나로 합쳐서, 이들 데이터는 PSCA 및 PSA의 동시-발현 및 동시-제형화가 항-PSCA-특이성 항체에 의한 고유 PSCA의 매우 낮은 인식을 생성시킴을 입증한다.
실시예 7. 인간 PSMA 변형된 항원의 면역원성
연구 설계.
서열번호 1의 고유 인간 PSMA 단백질의 15 - 750 아미노산으로 이루어지는 면역원성 PSMA 폴리펩타이드("인간 PSMA 변형된 항원" 또는 "hPSMA 변형된")를 암호화하는 구축물을 사용하여 DNA 백신화에 의해 유도된 면역 반응을 고유의 인간 전장의 PSMA 단백질(hPSMA 전장의)에 의해 유도된 것들과 비교하였다. 암컷 C57BL/6 마우스 또는 암컷 파스퇴르(HLA-A2/DR1) 트랜스제닉 마우스의 그룹을 hPSMA 전장의 또는 hPSMA 변형된 단백질을 암호화하는 DNA 백신 2 ㎍ 용량으로 PMED 투여에 의해 0일째에 초회항원자극하고 14, 28일째에 추가접종하였다. 마우스를 방혈시키고 35일째(세 번째 백신화 후 7일째)에 죽이고 상기 hPSMA 전장의 단백질에 대한 T 세포 면역 반응을 IFN-γ ELISPOT 분석에 의해 비장세포에서 측정하였다. C57BL/6 마우스에 대해서, 웰당 개별적인 동물로부터의 5 x 105 비장세포의 단세포 현탁액을, 10 ㎍의 정제된 hPSMA 단백질, 5 x 105 TRAMP-C2 세포 단독, 또는 hPSMA 또는 PSMA-PSA-PSCA 융합 단백질을 발현하는 TRAMP-C2 세포와 함께 도말하였다. 파스퇴르(HLA-A2/DR1) 트랜스제닉 마우스의 경우, 웰당 개별적인 동물로부터의 5 x 105 비장세포의 단세포 현탁액을, 상기 인간 PSMA 단백질 서열로부터 유도된 공지된 HLA-A2-제한된 CD8+ T 세포 에피토프로 펄스화시킨 인간 HLA-A2를 발현하는 5 x 104 K562 세포와 함께 도말하였다(표 23). 파스퇴르 마우스에서의 반응을, 또한 대조용 단백질(Ad-eGFP) 또는 완전-길이 인간 PSMA 단백질(Ad-hPSMA)을 발현하는 아데노바이러스 벡터로 형질도입시킨 5 x 104 SK-Mel5 세포 또는 10 ㎍/㎖의 정제된 PSMA 단백질을 사용하여 측정하였다. 각각의 조건을 3 회 중복 수행하였다. 상기 플레이트를 37 ℃ 및 5% CO2에서 20 시간 동안 배양하고, 제조사의 설명에 따라 배양 후 세척하고 전개시켰다. IFN-γ SFC의 수를 CTL 판독기에 의해 카운트하였다. 결과를 도 19 및 20에 제공하며, 이들 도면은 그룹당 PSMA-특이성 SFC/백만 비장세포의 평균 수 +/- 표준편차를 도시한다.
ELISA 분석.
상기 변형된 및 전장의 PSMA 백신에 의해 유발된 항체 반응을 35일째에 수거된 각각의 동물로부터 혈청 중에서 측정하였다. 혈청에 ELISA를 수행하여 상기 혈청 중 항-PSMA 항체 역가를 측정하고 실시예 5에 개시된 바와 같은 ELISA 분석을 사용하여 측정하였다. 상기 결과를 도 26에 제공하며, 상기 도면은 그룹당 마우스의 수의 평균 역가 +/- 표준 편차를 도시한다.
FACS 분석.
혈청에 또한 FACS 분석을 수행하여 적합한 세포주의 세포 표면상에서 발현된 어느 한 인간 PSMA에 대한 항체 결합을 측정하고, 따라서 상기 변형된 및 전장의 PSMA 백신에 의해 생성된 항체가 고유 PSMA 형태를 인식할 수 있는 지의 여부를 결정하였다. 상기 FACS 분석을 실시예 5에 개시된 바와 같은 과정에 따라 수행하였다. 결과를 도 29에 제공하며, 상기 도면은 그룹당 마우스의 수의 2차 항-마우스 항체 단독에 대한 마우스 혈청의 MFI의 평균 변화 배수 +/- 표준 편차를 나타낸다.
[표 23]
파스퇴스(HLA-A2/DR1) 트랜스제닉 마우스에 대해 수행된 분석에서 시험된 HLA-A2 제한된 펩타이드 에피토프. 펩타이드를 10 ㎍/㎖의 농도에서 개별적으로 시험하였다. 각 펩타이드의 N- 및 C-말단 단부의 아미노산 위치를 가리킨다.
Figure pat00026
결과.
도 26은 IFN-γ ELISPOT 분석에 의해 측정된 C57BL/6 마우스에서 인간 PSMA 변형된(아미노산 15 - 750) 대 전장의 인간 PSMA(아미노산 1 - 750)에 의해 유도된 T 세포 면역 반응을 평가하기 위한 전형적인 연구의 결과를 나타낸다. 그룹당 5 마리의 마우스를 0일째에 초회항원자극하고 14 및 28일째에 hPSMA 변형된 또는 hPSMA 전장의 단백질을 발현하는 DNA 백신으로 PMED 추가접종하였다. 35일째에, 상기 hPSMA 전장의 단백질에 대해 유도된 반응을 IFNγ ELISPOT 분석에 의해 TRAMP C2-PSMA 또는 정제된 인간 PSMA ECD 단백질(도 26에서 정제된 hPSMA 단백질이라 칭한다)에 대한 T 세포 반응을 측정함으로써 비교하였다. TRAMP C2 세포는 상기 분석에 대한 배경 대조군으로서 작용하였다. TRAMP C2-PSMA 또는 정제된 hPSMA 단백질에 대해 유도된 상기 IFN-γ T 세포 반응의 크기는 그룹들간에 현저하게 상이하지 않았다(2-원 ANOVA, p-값 > 0.05). 이들 결과는 hPSMA 변형된 및 hPSMA 전장의 단백질을 발현하는 DNA 백신이 C57BL/6 마우스에서 동등한 T 세포 면역 반응을 이끌어냄을 가리킨다.
도 27a 및 27b는 IFN-γ ELISPOT 분석에 의해 측정된 파스퇴르(HLA-A2/DR1) 트랜스제닉 마우스에서 인간 PSMA 변형된 항원(아미노산 15 - 750) 대 전장의 인간 PSMA 항원(아미노산 1 - 750)의 T 세포 면역 반응을 평가하기 위한 전형적인 연구의 결과를 나타낸다. 그룹당 10 마리의 마우스를 0일째에 초회항원자극하고 14 및 28일째에 hPSMA 변형된 또는 hPSMA 전장의 단백질을 암호화하는 DNA 백신으로 PMED 추가접종하였다. 35일째에, 상기 hPSMA 전장의 단백질에 대해 유도된 T 세포 반응을 (A) 공지된 CD8+ 에피토프를 나타내는 PSMA 유도된 HLA-A2-제한된 펩타이드 및 (B) Ad-hPSMA 또는 정제된 hPSMA 전장의 단백질로 형질도입된 SK-Mel5 세포를 사용하여 IFNγ ELISPOT 분석에 의해 측정하였다. 상기 hHER2 106 펩타이드 및 SK-Mel5 Ad-eGFP는 상기 분석에서 음성 대조군으로서 작용하였다. 상기 hPSMA 변형된 백신은 상기 HLA-A2-제한된 CD8+ T 세포 에피토프에 대해 가장 큰 크기의 IFN-γ T 세포 면역 반응을 이끌어내었지만, 그룹들간의 차이는 현저하지 않았다(2원 ANOVA, p-값 > 0.05). 유사하게, 상기 hPSMA 변형된 백신은 Ad=hPSMA로 형질도입된 SK-Mel5 세포에 대해 가장 큰 크기의 면역 반응 및 상기 정제된 hPSMA 단백질에 대해 현저하게(2원 ANOVA, p-값 > 0.05) 더 큰 빈도의 IFN-γ SFC를 이끌어내었다. 이들 결과는 상기 hPSMA 변형된 단백질을 발현하는 DNA 백신이 상기 hPSMA 단백질에 대한 T 세포 반응의 유도에 있어서 파스퇴르(HLA-A2/DR1) 트랜스제닉 마우스에서 hPSMA 완전-길이 단백질보다 더 효능이 있음을 입증한다.
도 28은 항-PSMA 항체 역가에 의해 상기 인간 변형된 및 전장의 PSMA 백신의 면역원성을 평가하는 전형적인 연구의 결과를 나타낸다. 간단히, 마우스를 0일째에 초회항원자극하고 14 및 28일째에 PMED로 추가접종하였다. 9 마리의 파스퇴르 마우스를 변형된 PSMA로 백신화하고, 10 마리의 파스퇴르 마우스를 전장의 PSMA로 백신화하며, 그룹당 5 마리의 C57BL/6 마우스를 변형되거나 전장의 PSMA로 백신화하였다. 35일째에, 혈청 항-PSMA 항체 역가를 ELISA에 의해 평가하였다. 예상된 바와 같이, C57BL/6 마우스는 파스퇴르 마우스에 비해 현저하게 더 큰 항-PSMA 항체 역가를 생성시켰다(일원 ANOVA). 동일한 계통의 마우스간의 항체 역가 비교시, 변형된 및 전장의 PSMA로 백신화된 마우스들간의 항체 역가의 현저한 차이는 존재하지 않았다(일원 ANOVA, p-값 > 0.05). 종합적으로, 이들 결과는 인간 PSMA의 전장의 버전에 의한 백신화가 상기 인간 변형된 PSMA 백신에 비해 동등한 항-PSMA 항체 역가를 생성시킴을 입증한다.
도 29는 항-PSMA 항체 세포-표면 결합에 의해 상기 인간 변형된 및 전장의 PSMA 백신의 면역원성을 평가하는 전형적인 연구의 결과를 나타낸다. 간단히, 그룹당 5 마리의 C57BL/6 마우스를 0일째에 초회항원자극하고 14 및 28일째에 PMED로 추가접종하였다. 35일째에, 세포-표면 고유 PSMA의 인식을 LNCaP 및 PC3 세포에 대한 혈청 항체 결합에 의해 평가하였다. 상기 PC3 세포는 상기 분석에 대한 배경 대조군으로서 작용하였다. 변형된 또는 전장의 PSMA로 백신화된 마우스들간에 LNCaP 세포에 대한 항-PSMA 항체 결합의 현저한 차이는 존재하지 않았다(일원 ANOVA, p-값 > 0.05). 상기 J591-A mAb에 대한 2차 항체 단독의 변화 배수는 14.3이었다(데이터 도시 안 됨). 종합적으로, 이들 데이터는 변형된 또는 전장의 PSMA 백신화에 따라 고유 PSMA를 인식하는 항-PSMA-특이성 항체를 생성시키는 것이 가능함을 입증한다.
실시예 8. 백신-유도된 면역 반응에 대한 항-CTLA-4 항체의 효과
본 발명에 의해 제공된 인간 PSMA 핵산 분자에 위해 유도된 면역 반응에 대한 항-CTLA-4 단클론 항체(CP675, 206)의 국소 투여 효과를 원숭이 연구에서 조사하였으며, 여기에서 상기 면역 반응을 IFNγ ELISPOT 분석을 사용하여 PSMA 특이성 T 세포 반응을 측정함으로써 평가하였다.
동물 처리 및 샘플 수집.
각 시험 그룹당 5 내지 6 마리(#1 내지 5 또는 6)의 수컷 인도 붉은털 원숭이 세 그룹을 아데노바이러스에 의해 전달된(1e11 V.P. 근육내 주사된) 인간 PSMA 변형된 항원(서열번호 9)을 암호화하는 핵산(서열번호 10)으로 면역시킨 다음 각각 6 및 9주 간격으로 PMED에 의해 2 회 DNA 면역화(8 회 작동/면역화, 하복부의 각각 우측 및 좌측당 4 회의 작동)시켰다. 그룹 2 및 3의 동물들에게 상기 각 서혜부 배액 림프절에 가깝게 PMED 면역화후 후속으로 3 ㎎의 CpG(PE-03512676)를 양측 피내 주사로 추가 제공하였다. 그룹 2에게 또한 항-CTLA-4 단클론 항체(CP675, 206)의 정맥내 주사 10 ㎎/㎏을 제공하고 그룹 3에게 상기 2차 PMED 면역화 시에 각각의 좌우측 서혜부 백신 배액 림프절에 가깝게 항-CTLA-4 단클론 항체(CP675,206)의 피내 주사 5 ㎎/㎏을 제공하였다.
말초 혈액 샘플을 최종 PMED 면역화후 16일째에 각각의 동물로부터 수거하였다. 말초 혈액 단핵 세포(PBMC)를 상기 샘플들로부터 단리하고 IFNγ ELISPOT 분석을 수행하여 PSMA 특이성 T 세포 반응을 측정하였다. 간단히, 개별적인 동물로부터 4e5 PBMC를 웰당 각각 2 ㎍/㎖의 PSMA 특이성 펩타이드들의 풀, 10 ㎍/㎖의 hPSMA ECD 단백질, 10 ㎍/㎖의 붉은털 원숭이 PSMA ECD 단백질 또는 각각 2 ㎍/㎖의 비특이성 대조용 펩타이드들(인간 HER2 펩타이드 풀)과 함께 IFNγ ELISPOT 플레이트에 도말하였다. 상기 PSMA 특이성 펩타이드 풀 각각의 조성을 표 24a에 제공한다. 상기 플레이트를 37 ℃ 및 5% CO2에서 16 시간 동안 배양하고 제조사의 설명에 따라 배양 후 세척하고 전개시켰다. IFNγ 스폿 형성 세포(SFC)의 수를 CTL 판독기에 의해 카운트하였다. 각각의 조건을 중복 수행하였다. 결과를 표 24b에 제공하며, 상기 표는 1e6 PBMC로 표준화된 비특이적 대조용 펩타이드로부터의 SFC의 평균수를 감한, 상기 3회 중복으로부터의 PSMA 특이성 SFC의 평균수를 나타낸다. ^는 스폿의 수가 카운트하기에 너무 많기 때문에 정확하지 않음을 가리킨다.
IFNγ ELISPOT 분석 과정.
IFNγ(BD 바이오사이언스, #51-2525kc)에 특이적인 포획 항체를 4 ℃에서 밤새 미세플레이트 중의 폴리비닐 플루오라이드(PVDF) 멤브레인상에 코팅한다. 상기 플레이트를 혈청/단백질로 차단하여 상기 항체에 대한 비특이적 결합을 방지한다. 차단 후, 효과기 세포(예를 들어 면역된 마우스로부터 단리된 비장세포 또는 붉은털 원숭이로부터 단리된 PBMC) 및 표적(예를 들어 펩타이드 라이브러리로부터의 PSMA 펩타이드, 항원 특이성 펩타이드로 펄스화된 표적 세포 또는 관련 항원을 발현하는 종양 세포)을 상기 웰에 가하고 5% CO2 배양기에서 37 ℃에서 밤새 배양한다. 효과기 세포에 의해 분비된 사이토킨을 상기 PVDF 멤브레인의 표면상 코팅 항체에 의해 포획한다. 상기 세포 및 배양 배지의 제거 후에, 100 ㎕의 비오틴화된 다클론 항-인간IFNγ 항체의 검출을 위해 상기 각각의 웰에 가하였다. 상기 스폿을, 제조사(맵테크(Mabtech)) 프로토콜에 따라 스트렙트아비딘-양고추냉이 퍼옥시다제 및 침전물 기질, 3-아미노-9-에틸카바졸(AEC)을 가하여 적색 스폿을 제공함으로써 가시화하였다. 각각의 스폿은 단일의 사이토킨 생산 T 세포를 나타낸다.
결과.
표 24b는 정맥내 주사에 의해 전신적으로(그룹 2) 또는 백신 배액 림프절에 가깝게 피내 주사에 의해 국소적으로(그룹 3) 제공된 항-CTLA-4 단클론 항체(CP675,206)와 함께 또는 상기 항체 없이 백신에 의해 유도된 T 세포 반응을 평가하고 비교하는 전형적인 IFNγ ELISPOT 분석의 결과를 나타낸다. 표 1B에 나타낸 바와 같이, PSMA 백신은 CpG(PF-13512676) 및 항-CTLA-4 단클론 항체(CP675,026)의 부재 하에서 다중 PSMA 특이적 펩타이드 및 단백질에 대한 측정 가능한 IFNγ T 세포 반응을 유도하였다. 상기 반응은 CpG(PF-13512676)의 첨가 및 항-CTLA-4 항체(CP675,206; 그룹 2)의 전신 전달에 의해 보통으로 증대되었다. 그러나, 다수의 PSMA 펩타이드 및 PSMA 단백질에 대한 상기 반응의 보다 효능있고 현저한 증대는 상기 항-CTLA-4 단클론 항체(CP675,206)를 상기 백신 배액 림프절에 가깝게 피내 주사에 의해 국소 전달한 경우(그룹 3)에 관찰되었다.
[표 24a]
PSMA 펩타이드 풀: 각각의 펩타이드 풀(즉 P1, P2, P3, H1, H2, R1 및 R2)은 하기에 나타낸 바와 같이 인간 PSMA 단백질(hPMSA 단백질) 또는 붉은털 원숭이 PSMA 단백질(rPMSA 단백질) 서열로부터의 15머 펩타이드들로 구성된다. 각 펩타이드의 N- 및 C-말단 단부의 아미노산 위치를 나타낸다.
Figure pat00027
Figure pat00028
[표 24b]
정맥내 주사(그룹 2) 또는 국소 피내 주사(그룹 3)에 의해 전신적으로 제공된 항-CTLA-4 항체 트레멜리뮤맵(CP-675,206)이 있는 또는 상기 항체가 없는(그룹 1) 백신에 의해 유도된 T 세포 반응들.
Figure pat00029
실시예 9. 원숭이에서 투여 후 CTLA-4 항체의 전신 노출
항-CTLA-4 항체 트레멜리뮤맵(CP675206)의 혈액 수준을, 상기 항체를 피내 또는 정맥내 주사에 의해 투여 후 인도 붉은털 원숭이에서 조사하였다.
동물 처리 및 샘플 수집.
처리 그룹당 3 마리의 동물에게 항-CTLA-4 항체 트레멜리뮤맵 10 ㎎/㎏을, 복재 정맥내에 단일의 정맥내 주사로 또는 서혜부 배액 림프절에 가깝게 허벅지에 수회의 0.2 ㎖ 피내 양측 주사로 주사하였다. 혈액 샘플을 주사후 0, 1, 2, 4, 8, 12, 24 및 48 시간째에 응고방지제로서 리튬 헤파린을 함유하는 2.0 ㎖ 배큐테이너(vacuutainer) 튜브에 수거하였다. 혈장을 4 ℃ 1500 x g에서 10 분간 원심분리 후에 상기 배큐테이너 튜브 중의 상등액으로부터 수거하였다. 상기 혈장 중 트레멜리뮤맵의 수준을 하기에 제공된 과정에 따라 정량적인 ELISA 분석에 의해 측정하였다.
트레멜리뮤맵 정량적인 ELISA 분석 과정.
384-웰 고 결합 분석 플레이트(VWR 그레이너 바이오 원(Greiner Bio-One) 카탈로그 번호 82051-264)를 100 mM 카보네이트-바이카보네이트 코팅 완충제 중의 1.0 ㎍/㎖의 CD-152(CTLA-4; 안셀 임뮤놀로지 리써치 프로덕츠(Ancell Immunology Research Products) 카탈로그 번호 501-020) 25 ㎕/웰로 코팅하고 4 ℃에서 밤새 배양하였다. 플레이트를 1x PBS-트윈(0.01M PBS pH 7.4/0.05% 트윈 20)으로 6 회 세척하고 5% FBS/1x PBS-트윈 40 ㎕/웰을 사용하여 차단하고 600 rpm RT에서 1 시간 동안 진탕시키면서 배양하였다. 표준물을, 트레멜리뮤맵의 하기 희석물들을 제조함으로써 제조하였다: 200, 67, 22, 7.4, 2.5, 0.82, 0.27, 0.09 및 0.03 ng/mL. 상기 샘플들을 1:100, 1:1,000 및 1:10,000으로 희석하였다. 상기 희석물은 1x PBS-트윈(0.01M PBS pH 7.4/0.05% 트윈 20) 중의 1% 고유 키노몰구스 마카크 혈청 및 5% FBS로 이루어졌다. 25 ㎕/웰의 각 표준물, 샘플 및 희석 대조군을 중복하여 상기 플레이트로 옮기고 600 rpm RT에서 1 시간 동안 진탕시키면서 배양하였다. 1x PBS-트윈으로 6회 세척 후에, 1x PBS-트윈으로 1:5,000 희석한, 25 ㎕/웰의 2차 항체(염소 항-인간 IgG HRP, 서던 바이오테크(Southern Biotech) 카탈로그 번호 9042-05)를 가하고 이어서 600 rpm 실온에서 1 시간 동안 진탕시키면서 배양하였다. 1x PBS-트윈으로 6회 세척 후에, 25 ㎕/웰의 TMB 퍼옥시다제 EIA-기질(용액 A+B)(바이오 래드 카탈로그 번호 172-1067)을 가하고 상기 플레이트들을 RT에서 4 분 동안 배양하였다. 비색측정 반응을, 12.5 ㎕/웰의 1N 황산의 첨가에 의해 정지시키고, 이어서 흡광도를 450 ㎚에서 판독하였다. 각 샘플 중의 트레멜리뮤맵의 양을 정량적인 범위로서 사용된 0.27 내지 67 ng/㎖로 표준 곡선을 사용하여 정량분석하였다.
결과.
전형적인 연구로부터의 혈장 항-CTLA-4 수준을 도 30에 제공한다. 도시된 바와 같이, 항-CTLA-4 항체 트레멜리뮤맵의 피내 주사는 정맥내 주사(AUC0-24= 7.2 x 106 ng.시간/㎖)보다 더 느린 혈중 상기 항체의 방출 동역학 및 더 낮은 전신 노출(AUC0-24= 4.9 x 106 ng.시간/㎖) 프로파일을 나타낸다.
실시예 10. 마우스에서 백신-유도된 면역 반응에 대한 항-CTLA-4 항체의 효과
연구 과정.
그룹당 6 마리의 암컷 BALB/c 마우스를 4 주 간격으로 분리된 PMED에 의해 rHer-2 발현 DNA로 초회항원자극하고 추가접종하였다. 마우스 CTLA-4(클론 9H10, 바이옥셀(Bioxcell) 또는 #BE0131) 또는 아이소타입 대조용 단클론 항체(바이옥셀 #BE0091)에 특이적인 단클론 항체 150 ㎍을 PMED 작동일들에 투여하고 100 ㎍을 범례에 가리킨 바와 같이 국소 피내 또는 전신 복강내 주사에 의해 PMED 후의 날들에 투여하였다. 상기 다중작용성(다중-사이토킨 양성) T 세포 면역 반응을, ICS 분석에 의해 최종 PMED 면역화후 7일째에 개별적인 마우스들로부터 단리된 비장세포로부터 측정하였다. 백신 특이성 에피토프 펩타이드(rHer-2 특이성 항원 특이성 CD8(p66), CD4(p169) 에피토프 또는 관련없는 펩타이드 HBV(코어 항원 p87)) 10 ㎍/㎖로 5 시간 자극 후에, 상기 비장세포들을 먼저 CD4, CD3 및 CD8에 대해 염색한 다음 침투시키고 IFNα, TNFα 및 IL-2 발현에 대해 염색하고 유식세포측정에 의해 분석하였다. 각 동물의 전체 비장에 대한 항원 특이성 단일, 이중 또는 3중 사이토킨 양성 T 세포의 총수를, 상기 백신 특이적 반응으로부터 관련없는 펩타이드 HBV에 대한 반응을 감하여 계산하고 비장당 단리된 비장세포의 총수에 의해 표준화한다.
결과.
도 31a 및 31b는 세포내 사이토킨 염색 분석에 의해 상기 백신 유도된 면역 반응의 질에 대한 항-CTLA-4 단클론 항체(클론 9H10)의 면역조절 활성을 평가하는 전형적인 연구의 결과를 나타낸다. 최종 PMED 후 7일째에, 항-CTLA-4의 국소 피내 전달에 의한 항원 특이성 단일 및 이중 사이토킨 양성 CD8 T 세포 반응 및 전신 전달에 의한 이중 및 3중 사이토킨 양성 CD8 T 세포 반응의 현저한 증가가 관찰되었다. 또한, 항-CTLA-4의 피내 전달에 의한 항원 특이성 단일 사이토킨 양성 CD4 T 세포 및 항-CTLA-4의 전신 전달에 의한 이중 사이토킨 양성 세포의 현저한 증가가 관찰되었다(*는 스튜던츠 T-시험에 의해 P < 0.05를 가리킨다).
실시예 11. 항암 백신과 병용된 수니티니브의 상승작용 효과
연구 과정.
항암 DNA 백신과 병용된 수니티니브 말레이트의 종양억제 효능을 BALB/neuT 트랜스제닉 암컷 마우스에서 조사하였다. 래트 Her-2(rHer-2) 종양 관련 항원을 발현하는 이형접합체 BALB/neuT 트랜스제닉 암컷 마우스에게 BALB/neuT 마우스의 자발적인 유방 종양으로부터 유래된 rHer-2를 발현하는 1e6 TUBO 세포를 피하 이식하였다. 종양세포 이식후 7일 후에, 상기 마우스에게 범례에 나타낸 바와 같은 용량의 비히클 또는 수니티니브 말레이트를 경구로 하루에 한 번 투여하였다. 수니티니브 말레이트 요법의 개시 후 3일째에, 상기 마우스를 (a) 상기 마우스의 종양에서 발현되지 않는 항원을 발현하는 대조용 백신 또는 (b) 상기 종양 및 마우스에서 발현되는 서열번호 54의 래트 Her-2 항원(rHER2)을 발현하는 DNA 암 백신 구축물을 포함하는 요법으로 면역화시켰다. 상기 종양 성장률을 1주일에 2 회 피하 TUBO 종양의 긴(a) 및 짧은 직경(b)을 측정하고 상기 부피를 a x b2 x 0.5 ㎣으로서 계산함으로써 분석하였다. 각 처리 그룹당 10 마리 마우스로부터의 종양 부피의 평균 및 평균의 표준 편차를 종양 이식후 일수에 대해서 플롯팅한다.
결과.
도 32는 단독요법으로서 또는 상기 DNA 암 백신과 병용된 수니티니브 말레이트에 의한 처리시 피하 종양 성장률을 평가하고 비교하는 전형적인 연구의 결과를 나타낸다. 상기 DNA 암 백신(rHER2: 1e9 V.P.의 rHer-2 발현 아데노바이러스의 근육내 주사에 이어서 PMED에 의한 rHer-2 발현 DNA의 2 회 격주 작동)을 제공받은 마우스로부터의 종양은 빠르게 계속 성장한 반면, 수니티니브 말레이트 20 ㎎/㎏ 또는 40 ㎎/㎏ 용량을 대조용 백신(대조군: 1e9 V.P.의 eGFP 발현 아데노바이러스의 근육내 주사에 이어서 PMED에 의해 HBV 코어 항원 발현 DNA의 2 회 격주 작동)과 함께 제공받은 마우스로부터의 종양은 상기 종양 성장률이 현저하게 감소하였으며, 이때 20 ㎎/㎏이 상기 40 ㎎/㎏ 용량에 비해 최적이하의 효능을 나타내었다. 그러나, 상기 암 백신을 20 ㎎/㎏의 최적이하 용량의 수니티니브 말레이트와 함께 투여시, 상기 종양은 대조용 백신을 함께 투여한 동일한 용량의 수니티니브 말레이트로 처리된 마우스에서보다 훨씬 더 느리고, 보다 높은 용량의 수니티니브 말레이트로 처리한 마우의 경우와 유사한 성장률로 성장하였다. 암 백신은 최적이하 용량의 수니티니브 말레이트를 제공받은 마우스에게 추가의 치료 이점을 제공한다.
도 33a 내지 33d는 대조용(대조군) 또는 DNA 암 백신(rHER2)과의 수니티니브 말레이트 20 ㎎/㎏의 종양-억제 효능을 평가하고 비교하는 전형적인 연구로부터의 마우스의 개별적인 종양 성장률을 나타낸다. 간단히, 종양 세포 이식 후 7일 후에, 처리 그룹당 10 마리의 마우스에게 비히클 또는 20 ㎎/㎏ 수니티니브 말레이트(슈텐트)를 34일 동안 매일 경구 투여하였다. 상기 슈텐트 투여 개시후 3일째에, 아데노바이러스에 이어서 PMED에 의해 초회항원자극된 일련의 면역화를 개시하였으며, 슈텐트 치료의 중단 후에도 계속하였다. 구체적으로 상기 마우스를 1e9 V.P.의 eGFP 발현 아데노바이러스의 근육내 주사에 이어서 2 회 격주로, PMED에 의해 HBV 코어 및 표면 항원을 발현하는 DNA의 2 회 9일 및 4 회 매주 작동으로 구성된 대조용 백신 또는 대신에 rHer-2 발현 아데노바이러스 및 DNA로 구성된 암 백신으로 면역시켰다. 상기 대조용 백신과 함께 비히클을 제공받은 상기 동물의 종양은 대략 7일 정도에 측정이 가능하게 되었으며 계속 성장하여 종양 이식후 50일 후에 2000 ㎣에 도달하였다. 대조용 백신과 함께 슈텐트를 제공받은 동물의 종양 성장은 슈텐트 치료를 중단할 때까지 현저하게 감소되었다. 상기 종양은 슈텐트의 중단 직후에 빠른 성장률을 나타내었으며, 종양 이식후 50일 후에 대부분 2000 ㎣에 도달하였다. 오직 암 백신만을 제공받은 동물의 종양 성장률은 암 백신 또는 슈텐트를 제공받지 않은 동물들보다 보통으로 더 느렸다. 암 백신과 슈텐트와의 조합은 슈텐트 치료 동안 상기 종양 성장을 억제했을 뿐만 아니라(도 33) 슈텐트 치료의 중단 후 상기 동물의 60%에서 상기 종양의 진행이 현저하게 감소하였다.
도 34는 대조용(대조군) 또는 암 백신(rHER2)과 함께 슈텐트의 종양-억제 효능을 평가하는 도 2B에 개시된 연구로부터 마우스의 그룹의 카플란-마이어 생존 곡선을 나타낸다. 상기 종양 부피가 IAUCUC 지침에 따라 2000 ㎣에 도달했을 때 상기 마우스를 죽였다. 오직 슈텐트(20 ㎎/㎏) 및 암 백신으로 처리된 마우스만이, 비히클 및 대조용 백신, 슈텐트 없는 암 백신 또는 암 백신 없는 슈텐트로 처리된 마우스에 비해 현저하게 연장된 생존을 나타내었다(로그-순위 시험에 의해 *P < 0.01). 도 35a 내지 35d는 도 2b에서 처리된 마우스로부터의 말초 혈액 중 골수 유래된 억제인자 세포(Gr1+CD11b+) 및 Treg 함유 CD25+CD4+ 세포의 백분율을 나타낸다. 간단히, PBMC를 염색하고 d27(슈텐트 또는 비히클 처리의 개시후 20일째)에 각 그룹으로부터의 5 마리 마우스의 턱밑샘 출혈로부터의 Gr1, CD11b, CD3, CD4 및 CD25의 발현에 대해 유식 세포측정에 의해 분석하였다. 각 처리 그룹의 평균 및 평균의 표준 오차를 나타낸다. 골수 유래된 억제인자 세포의 통계학적 유의수준의 감소%가, 슈텐트도 암 백신도 제공받지 않은 마우스(비히클+대조군)에 비해 대조군 또는 암 백신과 슈텐트에 의해 처리된 마우스에서 관찰되었다. 그러나 현저하게 더 낮은 골수 유래된 억제인자 세포는 슈텐트 없는 암 백신(비히클+rHER2) 또는 암 백신 없는 슈텐트(슈텐트+대조군)로 처리된 마우스에 비해, 슈텐트와 암백신의 조합(슈텐트+rHER2)으로 처리된 마우스에서 관찰되었다. 상기 CD4 집단에서 Treg 함유 CD25+ CD4+ T 세포의 통계학적 유의수준의 감소는 암백신과 병용된 슈텐트에 의해 관찰되었다. 이들 마우스는 혈액 중에, 슈텐트 없는 암백신 또는 암백신 없는 슈텐트로 처리된 마우스보다 현저하게 더 낮은 상기 CD4 집단 중 Treg 함유 CD25+ CD4+ T 세포%를 가졌다. *는 스튜던츠 T-시험에 의해 P < 0.05를 가리킨다.
도 36a 내지 36c는 마우스의 종양으로부터 단리된 골수 유래된 억제인자 세포(Gr1+CD11b+), Treg(CD4+CD25+Foxp3+) 및 PD-1+ CD8 T 세포의 총 수를 나타낸다. 간단히, 상기 마우스에게 28일 동안 TUBO 세포의 이식후 3일째에 20 ㎎/㎏의 슈텐트 또는 비히클의 단일 매일 경구 용량을 제공하였다. 같은 마우스를 1e9 V.P.의 eGFP 발현 아데노바이러스의 근육내 주사에 이어서, PMED에 의해 전달된 HBV 코어 항원을 발현하는 DNA의 2 회 격주 투여로 구성된 대조용 백신 또는 rHer-2 발현 아데노바이러스 및 DNA로 구성된 암 백신으로 면역시켰다. 50 ㎍의 CpG(PF-03512676)의 피내 주사를 우측 서혜부 배액 림프절에 가깝게 PMED 투여와 함께 제공하였다. 2차 PMED 및 CpG투여 후 7일째에, 개별적인 종양이, 처리 그룹당 6 마리의 마우스로부터 단리되었다. 상기 단리된 피하 종양으로부터 제조된 단세포 현탁액을 Gr1, Cd11b, CD3, CD8, CD25, FoxP3, 및 PD-1에 특이적인 항체에 의해 염색하고 유식 세포측정에 의해 분석하였다. 각 처리 그룹으로부터의 종양의 ㎍당 도면에 가리킨 바와 같은 특정 세포들의 총수의 평균 및 상기 평균의 표준 편차를 플롯팅한다(*는 스튜던츠 T 시험에 의해 P < 0.05를 가리킨다). 마우스에게 암 백신(A 및 B)을 제공했을 때 대조용 백신(A 및 B)을 제공받은 마우스에 비해 종양에서 발견된 면역 억제성 Treg 또는 MDSC의 빈도에 현저한 차이는 없었지만, 상기 마우스를 슈텐트로 처리했을 때(A 및 B) 암 백신만을 제공받은 마우스에 비해 현저한 감소가 관찰되었다. PC-1+CD8 T 세포의 감소가 또한, 단지 암 백신(C)만을 제공받은 마우스에 비해 슈텐트(C)로 처리된 마우스에서 관찰되었다. 하나로 합치면, 이들 데이터는 상기 백신과 함께 Treg, MDSC 또는 CD8+PD-1+T 세포를 감소시키는 작용제가 종양 함유 동물에서 종양 크기를 감소시키는데 이로울 것임을 입증한다.
실시예 12. 수니티니브 및 항-CTLA-4 항체와 병용된 백신의 항암 효능
수니티니브 및 항-CTLA-4 단클론 항체(클론 9D9)와 병용된 암 백신의 종양 억제 효능을 피하 TUBO 종양 함유 BALB/neuT 마우스에서 조사하였다.
연구 과정.
간단히, 각 그룹당 10 마리의 마우스에게 64일까지 종양 이식후 10일째에 출발하여 20 ㎎/㎏의 비히클 또는 수니티니브 말레이트를 매일 경구 투여하였다. 아데노바이러스 벡터로서 항원이 없거나(대조용 백신) 또는 서열번호 54의 래트 Her-2 항원(암 백신)을 암호화하는 DNA 구축물에 의한 백신화를 13일째에 개시하였으며, 이어서 2 회의 매주 면역화, 2 회의 격주 면역화, 및 DNA에 의한 각 항원(HBV 항원 또는 rHer-2)의 7 회의 매주 면역화를 수행하였다. 항-쥐 CTLA-4 단클론 항체로 처리된 마우스(칠한 원 및 빈 삼각형)의 그룹들에 PMED 주사직후 20, 27, 41, 55, 62, 69, 76, 83, 90, 및 97 일째에 상기 항체 250 ㎍을 복강내 주사하였다.
결과.
도 37은 암 백신과 함께 수니티니브 및 항-쥐 CTLA-4 단클론 항체(클론 9D9)의 종양-억제 효능을 평가하는 전형적인 연구로부터의 마우스 군의 카플란-마이어 생존 곡선을 나타낸다. 증가된 생존 시간이, 대조용 백신과 슈텐트(빈 원), 항-쥐 CTLA-4 단클론 항체(빈 삼각형) 또는 암 백신(칠한 삼각형)으로 처리된 마우스에서 관찰되었다. 슈텐트 및 암 백신과 함께 항-쥐 CTLA-4(칠한 원)로 처리한 마우스에서 추가적인 생존 증가가 관찰되었다. P 값은 로그-순위 시험에 의해 계산되었다.
실시예 13. 수니티니브의 전신 노출 및 저 용량 수니티니브와 병용된 항암 백신의 항암 효능
수니티니브 전신 노출 연구
혈액 수니티니브의 동역학을 피하 TUBO 종양이 있는 BALB/neuT 마우스에서 조사하였다. 간단히, 각 처리 그룹당 20 마리의 마우스에게 슈텐트를 종양 이식후 6일째에 경구로, 하루에 1 회(SID) 20 ㎎/㎏ 또는 하루에 2 회(BID) 6 시간 간격으로 10 ㎎/㎏ 제공하였다. 2 내지 3 마리 마우스로부터 턱밑샘 혈액을, 지시된 바와 같이(0, 2, 4, 6, 8, 10, 12, 및 24 시간) 슈텐트 투여후 여러 시점들에서 리튬 헤파린 튜브에 수거하였다. 상기 혈장 상등액을 x1000 g에서 15 분간 원심분리 후 상기 튜브로부터 회수하고, 상기 혈장 샘플로부터 수니티니브 수준을 LC/MS/MS에 의해 측정하였다. 각 시점에서 각 그룹의 평균 및 상기 평균의 표준 편차를 플롯팅한다.
결과를 도 38에 제공한다. 각 시점에서 각 그룹의 평균 및 상기 평균의 표준 오차를 플롯팅한다. 수평 점선은, 단독요법에서 종양 성장을 유효하게 억제시키기 위해 필요한 최소 수니티니브 혈액 수준, 50 ng/㎖를 표시한다(문헌[Mendel, D., et al.: “In vivo antitumor activity of SU11248, a novel tyrosine kinase inhibitor targeting vascular endothelial growth factor and platelet-derived growth factor receptors: determination of a pharmacokinetic/ pharmacodynamic relationship”. Clinical Cancer Research, 203, 9:327-337]). 나타낸 바와 같이, 20 ㎎/㎏ SID 또는 10 ㎎/㎏ BID만을 제공받은 마우스에서 혈액 수니티니브 수준은, 24 시간 이내에 일시적으로 종양 성장을 유효하게 억제하는 50 ng/㎖의 표적 유효 용량을 유지한다. 20 ㎎/㎏ SID 그룹에서 혈액 수준은 2 시간째에 50 ng/㎖ 이상에서 절정이었으며, 6 시간째에 50 ng/㎖로 떨어지고, 슈텐트 투여후 12 시간까지 상기 혈액에서 제거되었다. 10 ㎎/㎏ BID를 제공받은 그룹에서 상기 수준은 2 시간째에 50 ng/㎖ 이상에서 절정이었으나 4 시간까지 50 ng/㎖ 이하에서 빠르게 떨어졌다가 2차 투여 후 2 시간째에 다시 절정이었다. 상기 수준은 4 시간까지 50 ng/㎖까지 빠르게 떨어졌으며 상기 2차 투여후 18 시간까지 상기 혈액에서 제거되었다. 하루에 2 회 투여 요법에도 불구하고, 10 ㎎/㎏을 제공받은 동물들은 상기 20 ㎎/㎏ 매일 1 회 투여 요법의 경우보다 표적 농도에서 더 낮은 노출 지속기간을 나타낸 채로 있었다.
종양 억제 효능 연구
항암 백신과 병용된 저 용량 수니티니브의 장기간 투여의 종양 억제 효능을 피하 TUBO 종양이 있는 BALB/neuT 마우스에서 조사하였다. 간단히, 상기 마우스에게 31일 동안 20 ㎎/㎏ SID 또는 104일 동안 10 ㎎/㎏ BID로 수니티니브 말레이트(슈텐트)를 제공하였으며 대조용 백신 또는 암 백신을 제공하였다. 항원을 전달하지 않는 대조용 백신, 및 서열번호 54의 래트 her-2 항원(rHer-2)을 전달하는 암 백신을 9일째에 아데노바이러스에 의해 제공한 다음 후속으로 각각 HBV 항원 또는 hHer-2를 전달하는 PMED에 의해 상기 DNA를 5 회 격주로 투여하였다.
결과를 도 39에 제공한다. 상기 암 백신은 슈텐트 20 ㎎/㎏을 제공받은 마우스의 생존을 개선시켰지만, 심지어 슈텐트 10 ㎎/㎏을 제공받은 마우스의 생존도 현저하게 개선시켰다(로그 순위 시험에 의해 *P = 0.05).
실시예 14. 암 백신에 의해 유도된 면역 반응에 대한 CPG 또는 CD40 작용물질의 효과
BLAB/c 마우스에서 면역원성 연구
암에 의해 유발된 항원 특이성 면역 반응의 크기 및 성질에 대한 면역 조절제의 국소 투여 효과를 BALB/c 마우스에서 조사하였으며, 여기에서 상기 면역 반응을, IFNγ ELISPOT 분석 또는 세포내 사이토킨 염색 분석을 사용하여 rHER2 특이성 T 세포 반응을 측정함으로써 평가하였다. 간단히, 나타낸 바와 같이 그룹당 4 내지 6 마리의 암컷 BALB/c 마우스를 PMED 전달 시스템에 의해 rHER2 항원 서열(서열번호 54)을 암호화하는 DNA 플라스미드 발현 구축물로 면역시켰다. 상기 면역 조절제, CpG7909(PF-03512676) 및 항-CD40 단클론 작용물질 항체를, 상기 PMED 작동후 후속적으로 상기 백신 배액 서혜부 림프절에 가깝게 피내 주사에 의해 국소 투여하였다. 항원 특이적 T 세포 반응을 하기에 개시된 과정에 따라 IFNγ ELISPOT 또는 세포내 사이토킨 염색 분석에 의해 측정하였다.
세포내 사이토킨 염색 (ICS) 분석
상기 rHer-2 특이성 다작용성(다중-사이토킨 양성) T 세포 면역 반응을 ICS 분석에 의해 개별적인 동물로부터 단리된 비장세포 또는 PBMC로부터 측정하였다. 전형적으로 1e6 비장세포를 브레펠딘(Brefeldin) A 1 ㎍/㎖ 및 펩타이드 자극제(rHer-2 특이성 CD8 p66, rHer-2 특이성 CD4 p169 또는 관련없는 HBV p87) 10 ㎍/㎖와 함께 5% CO2 배양기에서 37 ℃에서 5 시간 동안 배양하였다. 상기 자극 후에, 상기 비장세포를 세척하고 10 분간 4 ℃에서 Fcγ 블록(항-마우스 CD16/CD32)으로 차단시킨 다음 생/사 용액 염료, 항-마우스 CD3ePE-Cy7, 항-마우스 CD8a 퍼시픽 블루, 및 항-마우스 CD45R/B220 PerCPCy5.5로 20 분 염색시켰다. 상기 세포를 세척하고, 4 ℃에서 밤새 4% 파라폼알데하이드로 고정시키고, RT에서 30 분 동안 BD fix/perm 용액으로 침투성으로 만들고 RT에서 30 분 동안 항-마우스 IFNγ APC, 항-마우스 TNFα 알렉사(Alexa)488 및 항-마우스 IL-2 PE와 함께 배양하였다. 상기 세포를 세척하고 20,000 CD4 또는 CD8 T 세포를 유식 세포측정에 의한 분석을 위해 획득하였다. 각 동물의 전체 비장당 항원 특이성 단일, 이중 또는 3중 사이토킨 양성 T 세포의 총 수를, 상기 백신 특이성 반응으로부터 관련없는 펩타이드 HBV에 대한 rHer-2 특이성 반응을 감하여 계산하고 상기 비장으로부터 단리된 비장세포의 총 수에 대해 표준화하였다.
IFNγELISPOT 분석 결과
도 40은 나타낸 바와 같이 면역 조절제와 함께 제공시 rHER2 백신에 의해 유도된 항원 특이성 T 세포 반응의 크기를 평가하는 전형적인 연구로부터 마우스의 그룹으로부터 IFNγ ELISPOT 결과를 나타낸다. 간단히, 처리 그룹(n=4)당 각각의 마우스를 PMED에 의해 rHER2 항원 서열(서열번호 54)을 암호화하는 DNA 플라스미드 발현 구축물로 면역시킨 바로 다음에 바로, 나타낸 바와 같은 100 ㎍의 대조용 래트 IgG 단클론 항체(바이옥셀 #BE0089: 대조용 mAb) 또는 50 ㎍ CpG7909 또는 100 ㎍의 항-CD40 단클론 항체(바이옥셀 #BE0016-2: a-CD40 mAb)로 면역시켰다. 상기 항원 특이성 면역 반응을 상기 PMED 작동 후 7일째에, 대조용 또는 rHer-2 특이성 p66 펩타이드와 10 ㎍/㎖ 농도로 혼합된 5e5 비장세포로부터 IFNγ ELISPOT 분석에 의해 측정하였다. 1e5 CD8 T 세포를 함유하는 비장세포로부터 전체 IFNγ 분비 세포의 수를, 개별적인 동물로부터의 ELISPOT 결과로부터 계산하고 비장세포의 CD8 T 세포의 % 및 각 그룹의 평균 및 오차의 표준 평균을 플롯팅한다. 나타낸 바와 같이, CpG7909 및 항-CD40 단클론 항체는 모두 대조용 항체를 제공받은 마우스에 비해 rHer-2 DNA에 의해 유도된 항원 특이성 면역 반응의 크기를 현저하게 증대시켰다.
세포내 사이토킨 염색(ICS) 분석 결과.
도 41a 및 도 41b는 세포내 사이토킨 염색 분석에 의해 상기 백신 유도된 면역 반응의 질에 대한 CpG7909의 면역조절 활성을 평가하는 전형적인 연구의 결과를 나타낸다. 간단히, 각각의 동물을 4-주 간격으로 PMED에 의해 전달된 rHER2 항원 서열(서열번호 54)을 암호화하는 DNA 플라스미드 발현 구축물로 2 회 면역시켰다. 각 그룹의 마우스(n=5)에게, PMED에 의한 상기 두 DNA 면역화 모두에 바로 이어서 우측 백신 배액 서혜부 마디에 가깝게 PBS(PMED 그룹) 또는 50 ㎍의 CpG7909(PMED + CpG그룹)를 피내 주사로 제공하였다. PMED에 의한 최종 면역화후 7일째에, 각각의 개별적인 마우스로부터 단리된 비장세포상에서 ICS 분석을 수행하여 IFNγ, TNFα 및/또는 IL-2를 분비하는 항원 특이성 다중작용성 CD8 또는 CD4 T 세포를 검출하였다. rHer-2 특이성 다중-사이토킨 양성 CD8 및 CD4 T 세포 반응의 현저한 증가가, PBS에 비해 CpG7909의 국소 전달로 처리된 마우스로부터 검출되었다. 단일 사이토킨 양성 CD8 집단의 증가가, PBS에 비해 CpG7909 투여의 국소 전달을 제공받은 동물에서 관찰되었다(*는 스튜던츠 T 시험에 의해 P < 0.05를 가리킨다).
도 42a 및 42b는 세포내 사이토킨 염색 분석에 의해 상기 백신 유도된 면역 반응의 질에 대한 작용물질 항-CD40 단클론 항체의 면역조절 활성을 평가하는 전형적인 연구의 결과를 나타낸다. 간단히, 각각의 동물을 4-주 간격으로 PMED에 의해 전달된 rHER2 항원 서열(서열번호 54)을 암호화하는 DNA 플라스미드 발현 구축물로 2 회 면역시켰다. 각 그룹의 마우스(n=6)에게, PMED에 의한 상기 1차 면역화 투여후 하루째에, 우측 백신 배액 서혜부 마디에 가깝게 아이소타입 IgG 대조군(IgG와 함께 PMED) 또는 항-CD40 단클론 항체(CD40과 함께 PMED)의 피내 주사 100 ㎍을 제공하였다. 최종 PMED 후 7일째에, 각각의 개별적인 마우스로부터 단리된 비장세포상에서 ICS 분석을 수행하여 IFNγ, TNFα 및/또는 IL-2를 분비하는 rHer-2 특이성 다중작용성 CD8 또는 CD4 T 세포를 검출하였다. rHer-2 특이성 3중-사이토킨 양성 CD8 및 CD4 T 세포 반응의 현저한 증가가, 아이소타입 IgG 대조군에 비해 항-CD50 단클론 항체의 국소 전달로 처리된 마우스로부터 검출되었다. 또한 국소로 제공된 항-CD40 단클론 항체에 의한 rHer-2 특이성 단일 및 이중 사이토킨 양성 CD4 T 세포의 현저한 증가가 존재하였다(*는 스튜던츠 T 시험에 의해 P < 0.05를 가리킨다).
실시예 15. 저 용량 수니티니브와 병용된 암 백신의 항암 효능
저 용량 수니티니브와 병용된 항암 백신의 종양 억제 효능을 자발적인 유방 패드 종양이 있는 BALB/neuT 마우스에서 조사하였다.
동물 처리.
간단히, 13 내지 14주령 암컷 마우스에게 수니티니브 말레이트(슈텐트) 5 ㎎/㎏을 112일 동안 하루에 2 회 경구로 제공하였다. 항원을 전달하지 않는 대조용 백신, 및 서열번호 54의 래트 Her-2 항원(rHer-2)을 전달하는 암 백신을 초회항원자극으로서 3일째에 아데노바이러스 주사에 의해 제공한 다음 PMED에 의해, HBV 항원(대조용 항원) 또는 rHer-2(암 백신)를 각각 전달하는 DNA를 7 회 격주로 투여하였다. 생존 종점을, 10 개의 유방패드가 모두 종양 양성으로 되거나 또는 유방 종양 중 어느 하나의 부피가 2000 ㎣에 도달했을 때로 결정하였다. 결과를 도 43에 제공한다.
결과.
슈텐트의 앞서 공개된 약동학 프로파일(문헌[Mendel, D., Laird, D., et al.: “In vivo antitumor activity of SU11248, a novel tyrosine kinase inhibitor targeting vascular endothelial growth factor and platelet-derived growth factor receptors: determination of a pharmacokinetic/ pharmacodynamic relationship”. Clinical Cancer Research, 203, 9:327-337]) 및 선행 데이터(도 38)에 비해, 하루에 2 회 5 ㎎/㎏을 투여한 마우스에서 슈텐트의 Cmax는 마우스 및 인간에서 효율적인 종양 억제 효능을 성취하기 위해 필요한 최소 혈액 수준보다 현저하게 더 낮은 것으로 예상된다. 상기 데이터는 저 용량 슈텐트 단독요법으로 처리된 마우스의 생존의 빠르고 일시적인 개선을 나타낸다. 그러나 상기 암 백신과 함께 제공시, 생존의 보다 지속적이고 현저한 개선이 관찰되었다(로그 순위 시험에 의해 P < 0.0001).
실시예 16. CpG의 국소 투여에 의한 백신-유도된 면역 반응의 증대
본 발명에 의해 제공된 인간 PSMA 핵산에 의해 유도된 면역 반응에 대한 CpG(PF-03512676)의 국소 투여의 면역 증대를 원숭이 연구에서 조사하였으며, 여기에서 상기 면역 반응을 IFNγ ELISPOT 분석을 사용하여 PSMA 특이성 T 세포 반응을 측정함으로써 평가하였다.
동물 처리 및 샘플 수거.
각각의 시험 그룹당 6 마리(#1 내지 6)씩, 6 개 그룹의 중국 키노몰구스 마카크를, 전기천공법에 의해 전달된 인간 PSMA 변형된 항원(서열번호 1의 아미노산 15 - 750)을 암호화하는 플라스미드 DNA로 면역시켰다. 간단히, 모든 동물에게 0일째에 5 ㎎의 플라스미드 DNA의 양측 근육내 주사를 제공한 다음 전기천공법(DNA EP)을 수행하였다. 상기 전기천공법 직후 후속으로, 그룹 2에게 상기 DNA 주사 부위에 가깝게 1 ㎎ 알룸과 혼합된 2 ㎎의 CpG를 양측 근육내 주사로 제공하였다. 그룹 3 및 4에게 각각 0일 또는 3일째에 상기 DNA 주사 부위에 가깝게 알룸 없이 전달된 2 ㎎의 CpG를 양측 근육내 주사하였다. 그룹 5에게 3일째에 상기 백신 배액 서혜부 마디에 가깝게 전달된 CpG의 양측 근육내 주사 2 ㎎을 제공하였다. 그룹 6에게 DNA 용액과 혼합된 200 ㎍의 CpG의 양측 주사를 제공하고 0일째에 근육내로 동시-전기천공법하였다.
IFNγ ELISPOT 분석 과정.
말초 혈액 샘플을 상기 DNA 면역화 후 15일째에 각 동물로부터 수거하였다. 말초 혈액 단핵세포(PBMC)를 상기 혈액 샘플로부터 단리하고 IFNγ ELISPOT 분석을 가하여 PSMA 특이성 T 세포 반응을 측정하였다. 간단히, 개별적인 동물로부터 4e5 PBMC를 웰당 IFNγ ELISPOT 플레이트 중 각각 2 ㎍/㎖의 PSMA 특이성 펩타이드들의 풀 또는 비특이성 대조용 펩타이드(인간 HER2 펩타이드 풀)와 함께 도말하였다. 상기 PSMA 특이성 펩타이드 풀의 각각의 조성을 표 1a에 제공한다. 상기 플레이트를 37 ℃ 및 5% CO2에서 16 시간 동안 배양하고 제조사의 설명에 따라 배양 후 세척하고 전개시켰다. IFNγ 스폿 형성 세포(SFC)의 수를 CTL 판독기에 의해 카운트하였다. 각각의 조건을 중복 수행하였다. 전형적인 실험의 결과를 표 1b에 제공한다. 보고된 PSMA 특이성 반응을, 상기 PSMA 펩타이드 풀에 대한 SFC의 평균수로부터 비특이성 대조용 펩타이드(인간 HER2 펩타이드 풀)에 대한 SFC의 평균 수를 감함으로써 계산하고 1e6 PBMC에 대해 관찰된 SFC에 대해 표준화하였다. ^는 상기 스폿의 수가 카운트하기에 너무 많기 때문에 정확하지 않음을 가리킨다. ND는 측정 안 됨을 가리킨다.
결과.
표 28은 근육내(그룹 2, 3, 4 및 5) 또는 피내 주사(그룹 6)에 의해 국소로 제공된 CpG(PF-03512676)가 있거나 없는(그룹 1) 백신에 의해 유도된 IFNγT 세포 반응을 평가하고 비교하는 전형적인 IFNγ ELISPOT 분석의 결과를 나타낸다. 표 1b 중의 이들 결과를 도 1에 플롯팅한다. 표 1b 및 도 1에 나타낸 바와 같이, 상기 PSMA 특이성 IFNγ T 세포 반응은 모든 6 마리의 동물들(그룹 1)에서 CpG(PF-03512676)의 부재 하에서 다수의 PSMA 특이성 펩타이드 풀에 대해 검출되었다. 측정된 PSMA 펩타이드에 대한 전체 반응은 DNA 전기천공법 후 3일째에 근육내(그룹 4: 3/6) 또는 피내(그룹 5: 2/6) 주사에 의해 CpG(PF-03512676)를 추가로 제공받은 몇몇 동물에서 보통으로 더 높았다. 그러나, CpG를 같은 날에 전기천공법 직후에 후속으로 전달받은 경우(그룹 2 및 3), 알룸과 혼합되었든지 또는 혼합되지 않았든지 간에, 높은 반응(그룹 2: 4/6 및 그룹 3: 3/6)을 생성시키지 못한 다수의 동물들이 존재하였다. 그러나 10배 더 낮은 용량의 CpG를 상기 DNA 용액과 근육내로 동시-전기천공법시킨 경우 4/6 동물에서 더 높은 순 반응이 검출되었으며, 이때 CpG를 제공받지 않은 동물(그룹 1)에 비해 펩타이드 풀 H1 및 R1에 대해서 통계학적으로 더 높은 반응(P < 0.05)이 존재하였다. 상기 데이터는 낮은 용량의 CpG가, 근육내로 동시-전기천공법시 DNA 백신에 의해 유도되는 IFNγ T 세포 반응을 유효하게 증대시킬 수 있음을 보인다.
[표 28]
CpG없이(그룹 1) 또는 CpG와 함께(그룹 2, 3, 4, 5 및 6) DNA 백신에 의해 유도된 PSMA 특이성 IFN T 세포 반응을 DNA 전기천공법 후 15일째에, PBMC로부터 IFNELISPOT 분석에 의해 측정한다.
Figure pat00030
실시예 17. 항-CTLA-4 항체의 국소 투여에 의한 백신-유도된 면역 반응의 증대
붉은털 원숭이 PSMA 핵산에 의해 유도된 면역 반응에 대한 항-CTLA-4 단클론 항체(CP675,206)의 저 용량 피하 투여 효과를 원숭이 연구에서 조사하였으며, 여기에서 상기 면역 반응을 IFNγ ELISPOT 분석을 사용하여 PSMA 특이성 T 세포 반응을 측정함으로써 평가하였다. 상기 연구에 사용된 붉은털 원숭이 PSMA 핵산은 서열번호 56에 설명된 바와 같은 서열을 가지며 서열번호 55의 면역원성 PSMA 폴리펩타이드를 암호화한다.
동물 처리 및 샘플 수거.
각 시험 그룹당 7마리(#1 내지 7)씩, 5 개 그룹의 수컷 인도 붉은털 원숭이를, 양측 근육내 주사(2x 5e10 V.P.)에 의해 전달된 붉은털 원숭이 PSMA 변형된 폴리펩타이드를 암호화하는 아데노바이러스로 면역시켰다. 상기 아데노바이러스 주사에 이어서 바로, 그룹 1에게 비히클을 제공하고, 그룹 2 내지 4에게 백신 배액 림프절에 가깝게 각각 2x 25 ㎎, 2x 16.7 ㎎ 및 2x 8.4 ㎎의 용량으로 항-CTLA-4 항체(CP675,206)를 양측 피하 주사로 제공하였다.
상기 면역화후 9일째에, 말초 혈액 단핵 세포(PBMC)를 각각의 동물로부터 단리하고 IFNγ ELISPOT 분석을 가하여 붉은털 원숭이 PSMA 특이성 T 세포 반응을 측정하였다. 간단히, 개별적인 동물로부터 4e5 PBMC를 IFNγ ELISPOT 플레이트에서 웰당 각각 2 ㎍/㎖로, 붉은털 원숭이 PSMA 특이성 펩타이드(표 24a에 정의된 P1, P2, P3 또는 R1+R2)의 풀 또는 비특이성 대조용 펩타이드(인간 HER2 펩타이드 풀)과 함께 도말하였다. 상기 플레이트를 37 ℃ 및 5% CO2에서 16 시간 동안 배양하고 제조사의 설명에 따라 배양 후 세척하고 전개시켰다. IFNγ 스폿 형성 세포(SFC)의 수를 CTL 판독기에 의해 카운트하였다. 각각의 조건을 중복 수행하였다. 상기 붉은털원숭이 PSMA 특이성 펩타이드 풀의 배경 조절된 SFC로부터 중복물의 평균을 1e6 PBMC에서의 반응들에 표준화하였다. 각각의 개별적인 동물로부터의 펩타이드 풀에 대한 개별적 및 합계 반응을 표 29에 제공한다.
IFNγ ELISPOT 분석 과정.
IFNγ(BD 바이오사이언스, #51-2525kc)에 특이적인 포획 항체를 4 ℃에서 밤새 미세플레이트에서 폴리비닐리덴 플루오라이드(PVDF) 멤브레인상에 코팅한다. 상기 플레이트를 혈청/단백질로 차단하여 상기 항체에 대한 비특이적 결합을 방지한다. 차단 후, 효과기 세포(예를 들어 면역된 마우스로부터 단리된 비장세포 또는 붉은털 원숭이로부터 단리된 PBMC) 및 표적(예를 들어 펩타이드 라이브러리로부터의 PSMA 펩타이드, 항원 특이성 펩타이드로 펄스화된 표적 세포 또는 관련 항원을 발현하는 종양 세포)을 상기 웰에 가하고 5% CO2 배양기에서 37 ℃에서 밤새 배양한다. 효과기 세포에 의해 분비된 사이토킨을 상기 PVDF 멤브레인의 표면상 코팅 항체에 의해 포획한다. 상기 세포 및 배양 배지의 제거 후에, 100 ㎕의 비오틴화된 다클론 항-인간IFNγ 항체를 검출을 위해 상기 각각의 웰에 가하였다. 상기 스폿을, 제조사(맵테크) 프로토콜에 따라 스트렙트아비딘-양고추냉이 퍼옥시다제 및 침전물 기질, 3-아미노-9-에틸카바졸(AEC)을 가하여 적색 스폿을 제공함으로써 가시화하였다. 각각의 스폿은 단일의 사이토킨 생산 T 세포를 나타낸다.
결과.
표 29는 백신 배액 림프절에 가깝게 피내 주사에 의해 국소적으로 제공된 항-CTLA-4 단클론 항체(CP675,206)와 함께(그룹 2 내지 4) 또는 상기 항체 없는(그룹 1) 백신에 의해 유도된 T 세포 반응을 비교하는 전형적인 IFNγ ELISPOT 분석의 결과를 나타낸다. 상기 백신은 50 ㎎의 용량으로 항-CTLA-4 항체(CP675,206)의 국소 투여(그룹 2, 과소평가된 값들을 사용하여 스튜던츠 T 시험에 의해 P = 0.001)에 의해 현저하게 증대된 면역 반응(그룹 1)을 생성시켰다. 상기 반응은 각각 33.4 ㎎(그룹 3: 과소평가된 값들을 사용하여 스튜던트 T 시험에 의해 P = 0.004) 및 16.7 ㎎(그룹 4: 스튜던트 T 시험에 의해 P = 0.05)의 저 용량의 항-CTLA-4 항체에 의해 또한 현저하게 증대되었다. 상기 데이터는 피하 주사에 의해 전달된 저 용량의 항-CTLA-4가 상기 백신 유도된 면역 반응을 현저하게 증대시킬 수 있음을 암시한다.
[표 29]
항-CTLA-4 항체(CP-675,206) 없이(그룹 1) 또는 상기 항체의 피하 주사와 함께 상기 백신에 의해 유도된 IFN T 세포 반응. ^는 높은 스폿 수로 인해 카운트가 과소평가됨을 가리킨다. TNTC는 카운트하기에 너무 많음을 의미한다.
Figure pat00031
실시예 18. 저 용량 수니티니브에 의한 골수 유래된 억제인자 세포의 면역조절
하기의 실시예를 비-종양 마우스 모델에서, 생체내 골수 유래된 억제인자 세포(MDSC)에 대한 저 용량 수니티니브의 면역조절 효과를 예시하기 위해 제공한다.
연구 과정.
MDSC 농축된 비장세포를 생성시키기 위해서, TUBO 세포(1x106)를 5 BALB/neuT 마우스의 옆구리에 이식하고, 종양 부피가 1000 내지 1500 ㎣에 도달할 때까지 대략 20 내지 30일 동안 두었다. 이어서 마우스를 죽이고, 비장을 제거하고 MDSC 농축된 비장세포를 회수하였다. 비장세포를 10 분 동안 5 μM CFSE로 표지하고, PBS로 세척하고 카운트하였다. 표지된 세포를 후속으로 PBS 용액 중에 5 x 107 비장세포/㎖로 재현탁하고 i.v. 꼬리 정맥 주사를 통해 비처리된 BALB/c 수용 마우스에게 입양 전달하였다. 입양 전달 3일전에, 상기 수용 마우스에게 비히클 또는 수니티니브 말레이트(슈텐트)를 5 ㎎/㎏, 10 ㎎/㎏ 및 20 ㎎/㎏으로 하루에 2 회 투여하기 시작하였다. 입양 전달에 이어서, 수용 마우스에게 추가로 2일 동안 비히클 또는 수니티니브를 하루에 2 회 계속 제공하였으며, 그 후에 상기 마우스를 죽이고, 비장을 제거하고, 비장세포를 회수하고 표현형 분석을 진행하였다.
비장세포를 카운트하고 FACS 염색 완충제(PBS, 0.2%(w/v) 소 혈청 알부민, 및 0.02%(w/v) 나트륨 아지드)에 5 x 106 세포/㎖로 재현탁하였다. 비장세포의 유식세포 측정 염색을 위해서, 먼저 2.5 x 106 세포를 CD16/CD32에 대한 항체와 함께 4 ℃에서 10 분 배양하여, Fc 수용체를 차단하고 비-특이적 결합을 최소화하였다. 이어서 비장세포를 4 ℃에서 20 분 동안 쥐 세포 표면 마커에 대한 적합한 형광단 접합된 항체(바이오레전드(Biolegend))로 염색하였다. T 세포(항-CD3(퍼시픽 블루), 클론 17A2) 및 MDSC(항-GR-1(APC), 클론 RB6-8C5 및 항-CD11b(PerCp Cy5.5), 클론 M1/70)의 경우, 생/사 염료를 또한 포함시켰다. 항체 배양에 이어서, 염색된 비장세포를 2 ㎖의 FACS 완충제로 세척하고, 원심분리에 의해 펠릿화하고 BD CANTO II 유식 세포계상에서 데이터 획득 전에 0.2 ㎖의 FACS 완충제에 재현탁시켰다. 상기 입양 전달된 MDSC 생존에 대한 수니티니브 또는 비히클의 효과를 모니터하기 위해서, 우리는 생생한 단일선 게이트 중 CFSE+, CD3-, GR1+, CD11b+의 백분율을 계산하였다. 이어서 우리는 얼마나 많은 실제 세포수가 전체 비장세포 카운트에 상당하는지의 백분율을 계산함으로써 비장당 입양 전달된 MDSC의 수를 측정하였다. 데이터를 플로조 및 그래프 패드(FloJo and Graphpad) 소프트웨어에 의해 분석하였다.
결과.
표 31에 제공된 데이터는 입양 전달 후 2일째에, 비히클 또는 5 ㎎/㎏, 10 ㎎/㎏ 및 20 ㎎/㎏ 수니티니브가 하루에 2회 투여된 마우스로부터 비장 당(n=7/그룹) 회수된 입양 전달된 CSFE+,CD3-,GR1+,CD11b+ 세포의 평균수를 나타낸다. 상기 데이터는 하루에 2회 투여된 수니티니브가 생체내에서, 5 ㎎/㎏ 정도로 낮게 투여된 경우에조차, MDSC에 대해 면역조절 효과를 가지며, 그 결과 비히클 처리된 대조군에 비해 회수된 수의 통계학적 유의수준의 감소를 생성시킴을 입증한다.
[표 31]
그룹당 7마리 마우스에서, 비장으로부터 회수된 CFSE+, CD3-, CR1+, CD11b+ MDSC의 평균 수 및 상응하는 표준 오차. 듄네트 다중 비교 실험을 사용하여 일원 ANOVA 에 의해, 0 mg/kg(비히클) 그룹에 대해 수니티니브 투여된 그룹을 비교하여 통계학적 유의 수준을 측정하였다.
Figure pat00032
실시예 19. 3중 항원 아데노바이러스 및 DNA 구축물의 면역원성
하기의 실시예는 비인간 영장류에서 본 발명에 의해 제공된 3 개의 항원 PSMA, PSCA 및 PSA 모두에 대해 특이적인 T 세포 반응을 이끌어내는, 상기 3 개의 항원을 발현하는 3중 항원 백신 구축물(아데노바이러스 벡터 또는 DNA 플라스미드의 형태)의 능력을 예시하기 위해 제공된다.
생체내 연구 과정.
본 발명에 의해 제공된 3 개의 항원을 각각 발현하는 5 개의 아데노바이러스 벡터(PSMA, PSCA 및 PSA; Ad-733, Ad-734, Ad-735, Ad-796 및 Ad-809)의 T 세포 면역원성을, 초회항원자극 후 9일째에, 각각 오직 단일 항원(PSMA, PSA 또는 PSCA)만을 발현하는 3 개의 아데노바이러스 벡터들의 혼합물과 비교하였다. 단일 항원을 발현하는 단일 아데노바이러스(그룹 1 내지 3)에 대한 반응을 평가하여 특이성을 입증하였다. 간단히, 인도 붉은털 원숭이(그룹 1 및 3의 경우 n=6, 그룹 2의 경우 n=7, 및 그룹 4 내지 9의 경우 n=8)를 총 1e11 V.P.으로 근육내 주사한 다음 같은날에 항-CTLA-4 10 ㎎/㎏을 피내 주사하였다. 상기 주사후 9일째에, 말초 혈액 단핵 세포(PBMC)를 각 동물로부터 단리하고 IFNγ ELISPOT 분석을 가하여 PSMA, PSA 및 PSCA 특이성 T 세포 반응을 측정하였다.
상기 아데노바이러스 및 항-CTLA-4 주사 후 13주째에(이때 상기 T 세포 반응은 수축되었다), 상기 원숭이들에게 전기천공법에 의해 전달된 DNA(그룹 1: PSMA, 플라스미드 5166; 그룹 2: PSA, 플라스미드 5297; 그룹 3: PSCA, 플라스미드 5259; 그룹 4: PSMA, PSA 및 PSCA의 혼합물, 플라스미드 5166, 5259 및 5297; 그룹 4: 플라스미드 457; 그룹 6: 플라스미드 458; 그룹 7: 플라스미드 459; 그룹 8: 플라스미드 796 및 그룹 9: 플라스미드 809) 추가접종 백신화를 제공하였다. 요약하면, 각 동물에게 초회항원자극에 사용된 아데노바이러스에서 암호화된 동일한 발현 카세트를 전달하는 본 발명에 의해 제공된 플라스미드 DNA 총 5 ㎎을 제공하였다. 상기 추가접종 백신화 후 9일째에, 말초 혈액 단핵세포(PBMC)를 각 동물로부터 단리하고 IFNγ ELISPOT 분석을 가하였다.
IFNγ ELISPOT 분석.
간단히, 개별적인 동물로부터 4e5 PBMC를 IFNγ ELISPOT 플레이트에서 웰당 각각 2 ㎍/㎖로, PSMA 특이성 펩타이드 풀 P1, P2, P3 또는 H1+H2(표 24A), PSA 특이성 풀 1 또는 2(표 25), PSCA 특이성 풀(표 26) 또는 비특이성 대조용 펩타이드(인간 HER2 펩타이드 풀)와 함께 도말하였다. 상기 플레이트를 37 ℃ 및 5% CO2에서 16 시간 동안 배양하고 제조사의 설명에 따라 배양 후 세척하고 전개시켰다. IFNγ 스폿 형성 세포(SFC)의 수를 CTL 판독기에 의해 카운트하였다. 각각의 조건을 중복 수행하였다. 상기 항원 특이성 펩타이드 풀들의 배경 조절된 SFC로부터 상기 중복물의 평균을 1e6 PBMC에서의 반응들에 표준화하였다. 상기 표의 항원 특이성 반응들은 상응하는 항원 특이성 펩타이드 또는 펩타이드 풀에 대한 반응들의 합을 제공한다.
결과.
표 27a는 IFNγ ELISPOT에 의해, 인도 붉은털 원숭이에서 단일 항원을 각각 발현하는 3 개 아데노바이러스의 혼합물과 비교하여 3 개의 항원 모두를 각각 발현하는 5 개의 상이한 아데노바이러스의 T 세포 면역원성을 평가하는 연구를 나타낸다. 오직 Ad-PSMA(그룹 1) 주사만을 제공받은 동물들의 대부분은 PSMA에 대한 특이성 반응을 유도하였으나 PSA 또는 PSCA에 대해서는 유도하지 않았다(스튜던츠 T 시험, P<0.03. PSCA에 대해 반응을 유도한 한 마리 동물(#4)을 상기 통계학적 분석으로부터 우선적으로 제거하였다). 오직 Ad-PSA(그룹 2) 주사만을 제공받은 동물들은 PSA에 대한 특이성 반응을 유도하였으나 PSMA 또는 PSCA에 대해서는 유도하지 않았다(스튜던츠 T 시험, P<0.02). 오직 Ad-PSCA(그룹 3) 주사만을 제공받은 동물들은 PSCA에 대한 특이성 반응을 유도하였으나 PSMA 또는 PSA에 대해서는 유도하지 않았다(스튜던츠 T 시험, P<0.03). 아데노바이러스 벡터를 발현하는 5 개의 3중-항원 모두(그룹 5 내지 9)는 3 개의 항원 모두에 대해 IFNγ T 세포 반응을 유도하였다(그 크기는 동물에 의해 변화된다). 상기 3중 항원 발현 아데노바이러스에 의해 유도된 PSCA에 대한 반응들의 크기는 개별적인 벡터들의 혼합물(그룹 4)과 유사하였다. 그러나 Ad-809(그룹 9)에 의해 유도된 PSMA에 대한 반응 및 Ad-796(그룹 8)에 의해 유도된 PSA에 대한 반응의 크기는 각각 상기 혼합물보다 현저하게 더 우수하였다(스튜던츠 T 시험, 각각 P = 0.04 및 P = 0.02). 이들 결과는 3중 항원을 발현하는 아데노바이러스에 의한 백신화가 비인간 영장류에서 개별적인 아데노바이러스들의 혼합물에 의한 백신화와 동등하거나 이보다 더 우수한 T 세포 면역 반응을 이끌어낼 수 있음을 가리킨다.
표 27b는 상기 IFNγ ELISPOT 결과가 항-CTLA-4와 함께 아데노바이러스 초회항원자극에 이어서 상응하는 플라스미드 DNA의 전기천공법 추가접종에 의해 전달된 본 발명에서 제공된 5 개의 상이한 3중 항원 발현 카세트의 면역원성을 평가하는 연구를 나타냄을 보인다. 상기 면역 반응들을 항-CTLA-4에 의한 아데노바이러스 초회항원자극 및 DNA 전기천공법 추가접종 면역화에 의해 유사하게 전달된 단일 항원을 발현하는 3 개 구축물들의 혼합물과 비교한다.
항-CTLA-4에 이어서 플라스미드-PSMA와 함께 오직 Ad-PSMA만을 제공받은 동물들(그룹 1)은 모두 PSMA에 대한 특이적인 반응을 유도하였지만 PSA 또는 PSCA에 대해서는 유도하지 못했다. 유사하게, 항-CTLA-4에 이어서 플라스미드-PSA 면역화와 함께 오직 Ad-PSA만을 제공받은 동물들(그룹 2)은 모두 PSA에 대한 특이적인 반응을 유도하였지만 PSMA 또는 PSCA에 대해서는 유도하지 못했고 최종적으로 항-CTLA-4에 이어서 플라스미드-PSCA와 함께 오직 Ad-PSCA만을 제공받은 동물들(그룹 3)은 모두 PSCA에 대한 특이적인 반응을 유도하였지만 PSMA 또는 PSA에 대해서는 유도하지 못했다(스튜던츠 T 시험, P < 0.01).
상기 3중-항원 발현 벡터(그룹 5 내지 9) 또는 상기 혼합물(그룹 4)로 면역된 모든 동물들은 3 개의 항원 모두에 대해 IFNγ T 세포 반응을 유도하였다. 검출된 PSCA 또는 PSA 특이성 IFNγ T 세포의 빈도는 각각 이들 그룹(그룹 4 내지 9) 모두에서 유사하였다. 그러나 3중 항원 발현 벡터 백신화를 제공받은 구축물 그룹 7 및 9는 3 개의 단일 항원 발현 구축물의 혼합물(그룹 4)보다 PSMA에 대한 반응의 빈도가 현저하게 높았다. 이들 결과는 하나의 카세트에서 아데노바이러스 및 3중 항원을 발현하는 DNA 백신이 비인간 영장류에서 아데노바이러스 및 단일 항원을 발현하는 DNA의 혼합물에 대해 동등하거나 보다 우수한 IFNγ T 세포 반응을 이끌어낼 수 있음을 가리킨다.
[표 25]
PSA 펩타이드 풀: PSA 펩타이드 라이브러리로부터 13 개 아미노산이 중복되는 15 개 아미노산 펩타이드의 아미노산 위치 및 서열.
Figure pat00033
Figure pat00034
[표 26]
PSCA 펩타이드 풀: PSCA 펩타이드 라이브러리로부터 13 개 아미노산이 중복되는 15 개 아미노산 펩타이드의 아미노산 위치 및 서열.
Figure pat00035
Figure pat00036
[표 27a]
ELISPOT 분석에 의해 분석된 항-CTLA-4에 의한 아데노바이러스 초회항원자극 후 단일 항원(그룹 1: Ad-PSMA; 그룹 2: Ad-PSA; 그룹 3: Ad-PSCA; 그룹 4: Ad-PSMA, Ad-PSA 및 Ad-PSCA의 혼합물) 또는 3중 항원 발현 아데노바이러스 벡터(그룹 4: Ad-733; 그룹 6: Ad-734; 그룹 7: Ad-735; 그룹 8: Ad-796 및 그룹 9: Ad-809)에 의해 유도된 IFNγ T 세포 반응.
Figure pat00037
[표 27b]
ELISPOT 분석에 의해 분석된 항-CTLA-4에 의한 아데노바이러스 초회항원자극 및 DNA 전기천공법 추가접종 백신화 후 단일 항원(그룹 1: PSMA; 그룹 2: PSA; 그룹 3: PSCA; 그룹 4: PSMA, PSA 및 PSCA의 혼합물) 또는 3중 항원 발현 벡터(그룹 5 내지 9)에 의해 유도된 IFNγ T 세포 반응.
Figure pat00038
실시예 20. 수니티니브에 의한 STAT3 인산화의 감소
하기의 실시예는 비장에서 면역 억제의 핵심 매개체인 STAT3(전사 3의 활성제의 신호 전달제)의 인산화를 직접 억제하는 수니티니브의 능력을 예시하기 위해 제공된다.
연구 과정.
비장에서 STAT3의 인산화 상태에 대한 슈텐트의 실제 효과를, 상기 화합물의 직접적인 면역조절 효과를 평가하기 위해서 피하 종양 마우스 모델에서 조사하였다. 간단히, 10 내지 12주령 암컷 BALB/neuT 마우스에게 우측 옆구리에 1e6 TUBO 세포를 피하 이식하였다. 종양 이식후 41일 후에, 슈텐트를 경구 위관영영에 의해 20 ㎎/㎏으로 제공하였다. 슈텐트 투여후 0, 1, 3, 7 및 24 시간째에, 시점당 3 마리의 동물을 IAUCUC 지침하에 죽이고 비장을 액체 질소에 바로 급속 동결시켜 인산화 방태를 보존하였다. 암컷 BALB/c 마우스로부터의 비장을 급속 동결시켜 건강한 마우스 대조군으로서 사용하였다.
STAT3 분석 과정.
급속 동결된 비장을 폴리트론 조직 균질화기를 사용하여 500 ㎕ 용해 완충제(70 mM NaCl, 50 mM β-글리세롤 포스페이트, 10 mM HEPES, 1% 트리톤 X-100, 100 mM Na3VO4, 100 mM PMSF, 1 ㎎/㎖ 류펩틴) 당 100 ㎎ 조직으로 균질화시켰다. 생성되는 절단물들을 10,000 g에서 15 분간 원심분리시켰다. 상등액을 단리하고 단백질 농도를 BCA 단백질 분석 키트(피어스(Pierce), 미국 일리노이주 록포드 소재)를 사용하여 측정하였다. 40 ㎍의 단백질을 전체 STAT3(이바이오사이언스(eBioscience), 카탈로그 번호 85-86101-11) 또는 포스포-STAT3(이바이오사이언스, 카탈로그 번호 85-86102-11) ELISA 키트의 각 웰에 가하였다. 어느 한 단백질의 상대적인 수준을 상기 키트에 제공된 표준 및 독립적으로 구입한 표준(시그널링 테크놀로지스(Signaling Technologies), cat np. 9333-S)과 비교하였다.
결과.
표 30은 상기 비장에서 STAT3의 인산화 상태에 대한 슈텐트의 효과를 평가하는 전형적인 STAT 분석의 결과를 나타낸다. 건강한 또는 종양 함유 마우스로부터의 비장 추출물은 모두 ELISA에 의해 유사한 수준의 STAT3 단백질을 나타내었다(전체 STAT3). 그러나, 건강한 BALB/c에 비해, 종양 함유 마우스로부터의 추출물은 현저하게 더 높은 수준의 인산화된 STAT3를 가졌다(스튜던츠 T 시험, P < 0.001). 상기 인산화 수준은 슈텐트 처리후 단지 1 시간째에 건강한 동물과 유사한 수준으로 감소하였으며 7 시간까지 처리되지 않은 마우스보다 더 낮은 수준에서 유지되었다. 24 시간째에, STAT3의 인산화 수준은 슈텐트 처리전의 수준으로 완전하게 회복되었다. 상기 인산화 동역학은 혈중 순환하는 슈텐트의 수준을 반영한다. 상기 슈텐트의 약동학 프로파일을 반영하는 상기 비장 중 STAT3 인산화의 빠른 반응은 종양 함유 동물에서 슈텐트의 직접적인 면역조절 작용을 암시한다.
[표 30]
다중 시점에서 슈텐트 처리 전 또는 처리 후 건강한 BALB/c 및 종양 함유 BALB/neuT 마우스로부터의 인산화된 STAT3 및 전체 STAT3의 상대적인 수준.
Figure pat00039
원 서열 목록
서열번호 1. 전장의 인간 PSMA의 아미노산 서열
Figure pat00040
서열번호 2. 서열번호 1의 전장의 인간 PSMA를 암호화하는 뉴클레오타이드 서열
Figure pat00041
Figure pat00042
서열번호 3. PSMA 셔플링된 항원 1의 아미노산 서열
Figure pat00043
서열번호 4. 서열번호 3의 PSMA 셔플링된 항원 1의 아미노산 서열을 암호화하는 뉴클레오타이드 서열
Figure pat00044
Figure pat00045
서열번호 5. PSMA 셔플링된 항원 2의 아미노산 서열
Figure pat00046
Figure pat00047
서열번호 6. 서열번호 5의 PSMA 셔플링된 항원 2의 아미노산 서열을 암호화하는 뉴클레오타이드 서열
Figure pat00048
Figure pat00049
서열번호 7. PSMA 셔플링된 항원 3의 아미노산 서열
Figure pat00050
서열번호 8. 서열번호 7의 PSMA 셔플링된 항원 3의 아미노산 서열을 암호화하는 뉴클레오타이드 서열
Figure pat00051
Figure pat00052
서열번호 9. 막-결합된 PSMA 항원의 아미노산 서열
Figure pat00053
서열번호 10. 서열번호 9의 막-결합된 PSMA 항원의 아미노산 서열을 암호화하는 뉴클레오타이드 서열
Figure pat00054
Figure pat00055
서열번호 11. 시토솔 PSMA 항원의 아미노산 서열
Figure pat00056
Figure pat00057
서열번호 12. 서열번호 11의 시토솔 PSMA 항원의 아미노산 서열을 암호화하는 뉴클레오타이드 서열
Figure pat00058
서열번호 13. 분비된 PSMA 항원의 아미노산 서열
Figure pat00059
서열번호 14. 서열번호 13의 분비된 PSMA 항원의 아미노산 서열을 암호화하는 뉴클레오타이드 서열
Figure pat00060
Figure pat00061
서열번호 15. 전장의 인간 PSA의 아미노산 서열
Figure pat00062
서열번호 16. 서열번호 15의 전장의 인간 PSA의 아미노산 서열을 암호화하는 뉴클레오타이드 서열
Figure pat00063
서열번호 17. 시토솔 PSA 항원의 아미노산 서열
Figure pat00064
서열번호 18. 서열번호 17의 시토솔 PSA 항원의 아미노산 서열을 암호화하는 뉴클레오타이드 서열
Figure pat00065
서열번호 19. 막-결합된 PSA 항원의 아미노산 서열
Figure pat00066
서열번호 20. 서열번호 19의 막-결합된 PSA 항원의 아미노산 서열을 암호화하는 뉴클레오타이드 서열
Figure pat00067
서열번호 21. 전장의 인간 PSCA의 아미노산 서열
Figure pat00068
서열번호 22. 서열번호 21의 전장의 인간 PSCA의 아미노산 서열을 암호화하는 뉴클레오타이드 서열
Figure pat00069
서열번호 23. 플라스미드 5166의 뉴클레오타이드 서열
Figure pat00070
Figure pat00071
Figure pat00072
Figure pat00073
서열번호 24. 플라스미드 5259의 뉴클레오타이드 서열
Figure pat00074
Figure pat00075
Figure pat00076
서열번호 25. 플라스미드 5297의 뉴클레오타이드 서열
Figure pat00077
Figure pat00078
Figure pat00079
Figure pat00080
서열번호 26. 플라스미드 460의 뉴클레오타이드 서열
Figure pat00081
Figure pat00082
Figure pat00083
Figure pat00084
Figure pat00085
서열번호 27. 플라스미드 451의 뉴클레오타이드 서열
Figure pat00086
Figure pat00087
Figure pat00088
Figure pat00089
서열번호 28. 플라스미드 454의 뉴클레오타이드 서열
Figure pat00090
Figure pat00091
Figure pat00092
Figure pat00093
서열번호 29. 플라스미드 5300의 뉴클레오타이드 서열
Figure pat00094
Figure pat00095
Figure pat00096
Figure pat00097
Figure pat00098
서열번호 30. 플라스미드 449의 뉴클레오타이드 서열
Figure pat00099
Figure pat00100
Figure pat00101
Figure pat00102
Figure pat00103
서열번호 31. 플라스미드 603의 뉴클레오타이드 서열
Figure pat00104
Figure pat00105
Figure pat00106
Figure pat00107
서열번호 32. 플라스미드 455의 뉴클레오타이드 서열
Figure pat00108
Figure pat00109
Figure pat00110
Figure pat00111
서열번호 33. 플라스미드 456의 뉴클레오타이드 서열
Figure pat00112
Figure pat00113
Figure pat00114
Figure pat00115
Figure pat00116
서열번호 34. 플라스미드 457의 뉴클레오타이드 서열
Figure pat00117
Figure pat00118
Figure pat00119
Figure pat00120
Figure pat00121
서열번호 35. 플라스미드 458의 뉴클레오타이드 서열
Figure pat00122
Figure pat00123
Figure pat00124
Figure pat00125
Figure pat00126
서열번호 36. 플라스미드 459의 뉴클레오타이드 서열
Figure pat00127
Figure pat00128
Figure pat00129
Figure pat00130
Figure pat00131
서열번호 37. p셔틀 IRES의 뉴클레오타이드 서열
Figure pat00132
Figure pat00133
Figure pat00134
Figure pat00135
Figure pat00136
서열번호 38. Her-2 항원의 아미노산 서열
Figure pat00137
Figure pat00138
(신호 서열 밑줄 침)
서열번호 39. 서열번호 38의 Her-2 항원 아미노산 서열을 암호화하는 핵산 서열
Figure pat00139
Figure pat00140
Figure pat00141
서열번호 40. 항-CD40 항체 CP870,893의 중쇄의 아미노산 서열
Figure pat00142
서열번호 41. 항-CD40 항체 CP870,893의 경쇄의 아미노산 서열
Figure pat00143
서열번호 42. 항-CTLA-4 항체 트레멜리뮤맵의 중쇄의 아미노산 서열
Figure pat00144
서열번호 43. 항-CTLA-4 항체 트레멜리뮤맵의 경쇄의 아미노산 서열
Figure pat00145
서열번호 44. CpG7909의 뉴클레오타이드 서열
Figure pat00146
서열번호 45. CpG24555의 뉴클레오타이드 서열
Figure pat00147
서열번호 46. CpG10103의 뉴클레오타이드 서열
Figure pat00148
서열번호 47. eGFP의 아미노산 서열
Figure pat00149
서열번호 48. HBV 코어 항원의 아미노산 서열
Figure pat00150
서열번호 49. HBV 표면 항원의 아미노산 서열
Figure pat00151
서열번호 50. 붉은털 원숭이 PSMA ECD 단백질의 아미노산 서열
Figure pat00152
Figure pat00153
서열번호 51. 래트 Her-2 p66 펩타이드(H-2d T 세포 에피토프)의 아미노산 서열
Figure pat00154
서열번호 52. 래트 Her-2 p169 펩타이드(H-2d T 세포 에피토프)의 아미노산 서열
Figure pat00155
서열번호 53. HBV 코어 항원 p87 펩타이드의 아미노산 서열
Figure pat00156
서열번호 54. 래트 Her-2 항원(rHer-2)의 아미노산 서열
Figure pat00157
Figure pat00158
서열번호 55. 붉은털 원숭이 PSMA 항원의 아미노산 서열
Figure pat00159
서열번호 56. 서열번호 55의 붉은털 원숭이 PSMA 항원을 암호화하는 뉴클레오타이드 서열
Figure pat00160
Figure pat00161
<110> PFIZER INC. <120> Prostate-Associated Antigens and Vaccine-Based Immunotherapy Regimens <130> PC71854A <140> PCT/IB2013/053377 <141> 2013-04-29 <150> 61/642,844 <151> 2012-05-04 <160> 56 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 750 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 1 Met Trp Asn Leu Leu His Glu Thr Asp Ser Ala Val Ala Thr Ala Arg 1 5 10 15 Arg Pro Arg Trp Leu Cys Ala Gly Ala Leu Val Leu Ala Gly Gly Phe 20 25 30 Phe Leu Leu Gly Phe Leu Phe Gly Trp Phe Ile Lys Ser Ser Asn Glu 35 40 45 Ala Thr Asn Ile Thr Pro Lys His Asn Met Lys Ala Phe Leu Asp Glu 50 55 60 Leu Lys Ala Glu Asn Ile Lys Lys Phe Leu Tyr Asn Phe Thr Gln Ile 65 70 75 80 Pro His Leu Ala Gly Thr Glu Gln Asn Phe Gln Leu Ala Lys Gln Ile 85 90 95 Gln Ser Gln Trp Lys Glu Phe Gly Leu Asp Ser Val Glu Leu Ala His 100 105 110 Tyr Asp Val Leu Leu Ser Tyr Pro Asn Lys Thr His Pro Asn Tyr Ile 115 120 125 Ser Ile Ile Asn Glu Asp Gly Asn Glu Ile Phe Asn Thr Ser Leu Phe 130 135 140 Glu Pro Pro Pro Pro Gly Tyr Glu Asn Val Ser Asp Ile Val Pro Pro 145 150 155 160 Phe Ser Ala Phe Ser Pro Gln Gly Met Pro Glu Gly Asp Leu Val Tyr 165 170 175 Val Asn Tyr Ala Arg Thr Glu Asp Phe Phe Lys Leu Glu Arg Asp Met 180 185 190 Lys Ile Asn Cys Ser Gly Lys Ile Val Ile Ala Arg Tyr Gly Lys Val 195 200 205 Phe Arg Gly Asn Lys Val Lys Asn Ala Gln Leu Ala Gly Ala Lys Gly 210 215 220 Val Ile Leu Tyr Ser Asp Pro Ala Asp Tyr Phe Ala Pro Gly Val Lys 225 230 235 240 Ser Tyr Pro Asp Gly Trp Asn Leu Pro Gly Gly Gly Val Gln Arg Gly 245 250 255 Asn Ile Leu Asn Leu Asn Gly Ala Gly Asp Pro Leu Thr Pro Gly Tyr 260 265 270 Pro Ala Asn Glu Tyr Ala Tyr Arg Arg Gly Ile Ala Glu Ala Val Gly 275 280 285 Leu Pro Ser Ile Pro Val His Pro Ile Gly Tyr Tyr Asp Ala Gln Lys 290 295 300 Leu Leu Glu Lys Met Gly Gly Ser Ala Pro Pro Asp Ser Ser Trp Arg 305 310 315 320 Gly Ser Leu Lys Val Pro Tyr Asn Val Gly Pro Gly Phe Thr Gly Asn 325 330 335 Phe Ser Thr Gln Lys Val Lys Met His Ile His Ser Thr Asn Glu Val 340 345 350 Thr Arg Ile Tyr Asn Val Ile Gly Thr Leu Arg Gly Ala Val Glu Pro 355 360 365 Asp Arg Tyr Val Ile Leu Gly Gly His Arg Asp Ser Trp Val Phe Gly 370 375 380 Gly Ile Asp Pro Gln Ser Gly Ala Ala Val Val His Glu Ile Val Arg 385 390 395 400 Ser Phe Gly Thr Leu Lys Lys Glu Gly Trp Arg Pro Arg Arg Thr Ile 405 410 415 Leu Phe Ala Ser Trp Asp Ala Glu Glu Phe Gly Leu Leu Gly Ser Thr 420 425 430 Glu Trp Ala Glu Glu Asn Ser Arg Leu Leu Gln Glu Arg Gly Val Ala 435 440 445 Tyr Ile Asn Ala Asp Ser Ser Ile Glu Gly Asn Tyr Thr Leu Arg Val 450 455 460 Asp Cys Thr Pro Leu Met Tyr Ser Leu Val His Asn Leu Thr Lys Glu 465 470 475 480 Leu Lys Ser Pro Asp Glu Gly Phe Glu Gly Lys Ser Leu Tyr Glu Ser 485 490 495 Trp Thr Lys Lys Ser Pro Ser Pro Glu Phe Ser Gly Met Pro Arg Ile 500 505 510 Ser Lys Leu Gly Ser Gly Asn Asp Phe Glu Val Phe Phe Gln Arg Leu 515 520 525 Gly Ile Ala Ser Gly Arg Ala Arg Tyr Thr Lys Asn Trp Glu Thr Asn 530 535 540 Lys Phe Ser Gly Tyr Pro Leu Tyr His Ser Val Tyr Glu Thr Tyr Glu 545 550 555 560 Leu Val Glu Lys Phe Tyr Asp Pro Met Phe Lys Tyr His Leu Thr Val 565 570 575 Ala Gln Val Arg Gly Gly Met Val Phe Glu Leu Ala Asn Ser Ile Val 580 585 590 Leu Pro Phe Asp Cys Arg Asp Tyr Ala Val Val Leu Arg Lys Tyr Ala 595 600 605 Asp Lys Ile Tyr Ser Ile Ser Met Lys His Pro Gln Glu Met Lys Thr 610 615 620 Tyr Ser Val Ser Phe Asp Ser Leu Phe Ser Ala Val Lys Asn Phe Thr 625 630 635 640 Glu Ile Ala Ser Lys Phe Ser Glu Arg Leu Gln Asp Phe Asp Lys Ser 645 650 655 Asn Pro Ile Val Leu Arg Met Met Asn Asp Gln Leu Met Phe Leu Glu 660 665 670 Arg Ala Phe Ile Asp Pro Leu Gly Leu Pro Asp Arg Pro Phe Tyr Arg 675 680 685 His Val Ile Tyr Ala Pro Ser Ser His Asn Lys Tyr Ala Gly Glu Ser 690 695 700 Phe Pro Gly Ile Tyr Asp Ala Leu Phe Asp Ile Glu Ser Lys Val Asp 705 710 715 720 Pro Ser Lys Ala Trp Gly Glu Val Lys Arg Gln Ile Tyr Val Ala Ala 725 730 735 Phe Thr Val Gln Ala Ala Ala Glu Thr Leu Ser Glu Val Ala 740 745 750 <210> 2 <211> 2250 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 2 atgtggaatc tccttcacga aaccgactcg gctgtggcca ccgcgcgccg cccgcgctgg 60 ctgtgcgctg gggcgctggt gctggcgggt ggcttctttc tcctcggctt cctcttcggg 120 tggtttataa aatcctccaa tgaagctact aacattactc caaagcataa tatgaaagca 180 tttttggatg aattgaaagc tgagaacatc aagaagttct tatataattt tacacagata 240 ccacatttag caggaacaga acaaaacttt cagcttgcaa agcaaattca atcccagtgg 300 aaagaatttg gcctggattc tgttgagcta gcacattatg atgtcctgtt gtcctaccca 360 aataagactc atcccaacta catctcaata attaatgaag atggaaatga gattttcaac 420 acatcattat ttgaaccacc tcctccagga tatgaaaatg tttcggatat tgtaccacct 480 ttcagtgctt tctctcctca aggaatgcca gagggcgatc tagtgtatgt taactatgca 540 cgaactgaag acttctttaa attggaacgg gacatgaaaa tcaattgctc tgggaaaatt 600 gtaattgcca gatatgggaa agttttcaga ggaaataagg ttaaaaatgc ccagctggca 660 ggggccaaag gagtcattct ctactccgac cctgctgact actttgctcc tggggtgaag 720 tcctatccag atggttggaa tcttcctgga ggtggtgtcc agcgtggaaa tatcctaaat 780 ctgaatggtg caggagaccc tctcacacca ggttacccag caaatgaata tgcttatagg 840 cgtggaattg cagaggctgt tggtcttcca agtattcctg ttcatccaat tggatactat 900 gatgcacaga agctcctaga aaaaatgggt ggctcagcac caccagatag cagctggaga 960 ggaagtctca aagtgcccta caatgttgga cctggcttta ctggaaactt ttctacacaa 1020 aaagtcaaga tgcacatcca ctctaccaat gaagtgacaa gaatttacaa tgtgataggt 1080 actctcagag gagcagtgga accagacaga tatgtcattc tgggaggtca ccgggactca 1140 tgggtgtttg gtggtattga ccctcagagt ggagcagctg ttgttcatga aattgtgagg 1200 agctttggaa cactgaaaaa ggaagggtgg agacctagaa gaacaatttt gtttgcaagc 1260 tgggatgcag aagaatttgg tcttcttggt tctactgagt gggcagagga gaattcaaga 1320 ctccttcaag agcgtggcgt ggcttatatt aatgctgact catctataga aggaaactac 1380 actctgagag ttgattgtac accgctgatg tacagcttgg tacacaacct aacaaaagag 1440 ctgaaaagcc ctgatgaagg ctttgaaggc aaatctcttt atgaaagttg gactaaaaaa 1500 agtccttccc cagagttcag tggcatgccc aggataagca aattgggatc tggaaatgat 1560 tttgaggtgt tcttccaacg acttggaatt gcttcaggca gagcacggta tactaaaaat 1620 tgggaaacaa acaaattcag cggctatcca ctgtatcaca gtgtctatga aacatatgag 1680 ttggtggaaa agttttatga tccaatgttt aaatatcacc tcactgtggc ccaggttcga 1740 ggagggatgg tgtttgagct agccaattcc atagtgctcc cttttgattg tcgagattat 1800 gctgtagttt taagaaagta tgctgacaaa atctacagta tttctatgaa acatccacag 1860 gaaatgaaga catacagtgt atcatttgat tcactttttt ctgcagtaaa gaattttaca 1920 gaaattgctt ccaagttcag tgagagactc caggactttg acaaaagcaa cccaatagta 1980 ttaagaatga tgaatgatca actcatgttt ctggaaagag catttattga tccattaggg 2040 ttaccagaca ggccttttta taggcatgtc atctatgctc caagcagcca caacaagtat 2100 gcaggggagt cattcccagg aatttatgat gctctgtttg atattgaaag caaagtggac 2160 ccttccaagg cctggggaga agtgaagaga cagatttatg ttgcagcctt cacagtgcag 2220 gcagctgcag agactttgag tgaagtagcc 2250 <210> 3 <211> 739 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> synthetic construct <400> 3 Met Ala Ser Ala Arg Arg Pro Arg Trp Leu Cys Ala Gly Ala Leu Val 1 5 10 15 Leu Ala Gly Gly Phe Phe Leu Leu Gly Phe Leu Phe Gly Trp Phe Ile 20 25 30 Lys Ser Ser Ser Glu Ala Thr Asn Ile Ser Pro Gln His Asn Val Lys 35 40 45 Ala Phe Leu Asp Glu Met Lys Ala Glu Asn Ile Lys Lys Phe Leu Tyr 50 55 60 Leu Phe Thr Gln Ile Pro His Leu Ala Gly Thr Glu Gln Asn Phe Gln 65 70 75 80 Leu Ala Lys Gln Ile Gln Ala Glu Trp Lys Glu Phe Gly Leu Asp Ser 85 90 95 Val Glu Leu Ala His Tyr Asp Val Leu Leu Ser Tyr Pro Asn Glu Thr 100 105 110 His Pro Asn Tyr Ile Ser Ile Ile Asp Glu Asp Gly Asn Glu Ile Phe 115 120 125 Asn Thr Ser Leu Phe Glu Pro Pro Pro Pro Gly Tyr Glu Asn Ile Ser 130 135 140 Asp Val Val Pro Pro Tyr Ser Ala Phe Ser Pro Gln Gly Met Pro Glu 145 150 155 160 Gly Asp Leu Val Tyr Val Asn Tyr Ala Arg Thr Glu Asp Phe Phe Lys 165 170 175 Leu Glu Arg Glu Leu Lys Ile Asn Cys Ser Gly Lys Ile Leu Ile Ala 180 185 190 Arg Tyr Gly Lys Val Phe Arg Gly Asn Lys Val Lys Asn Ala Gln Leu 195 200 205 Ala Gly Ala Lys Gly Ile Ile Leu Tyr Ser Asp Pro Ala Asp Tyr Phe 210 215 220 Ala Pro Gly Val Lys Ser Tyr Pro Asp Gly Trp Asn Leu Pro Gly Gly 225 230 235 240 Gly Val Gln Arg Gly Asn Val Leu Asn Leu Asn Gly Ala Gly Asp Pro 245 250 255 Leu Thr Pro Gly Tyr Pro Ala Asn Glu Tyr Ala Tyr Arg Arg Glu Leu 260 265 270 Ala Glu Ala Val Gly Leu Pro Ser Ile Pro Val His Pro Ile Gly Tyr 275 280 285 Tyr Asp Ala Gln Lys Leu Leu Glu Lys Met Gly Gly Ser Ala Pro Pro 290 295 300 Asp Ser Ser Trp Lys Gly Ser Leu Lys Val Pro Tyr Asn Val Gly Pro 305 310 315 320 Gly Phe Thr Gly Asn Phe Ser Thr Gln Lys Val Lys Met His Ile His 325 330 335 Ser Thr Asn Glu Val Thr Arg Ile Tyr Asn Val Ile Gly Thr Ile Arg 340 345 350 Gly Ala Val Glu Pro Asp Arg Tyr Val Ile Leu Gly Gly His Arg Asp 355 360 365 Ala Trp Val Phe Gly Gly Ile Asp Pro Gln Ser Gly Ala Ala Val Val 370 375 380 His Glu Ile Val Arg Ser Phe Gly Thr Leu Lys Lys Lys Gly Trp Arg 385 390 395 400 Pro Arg Arg Thr Ile Ile Phe Ala Ser Trp Asp Ala Glu Glu Phe Gly 405 410 415 Leu Leu Gly Ser Thr Glu Trp Ala Glu Glu Asn Ser Arg Leu Leu Gln 420 425 430 Glu Arg Gly Val Ala Tyr Ile Asn Ala Asp Ser Ser Ile Glu Gly Asn 435 440 445 Tyr Thr Leu Arg Val Asp Cys Thr Pro Leu Met Tyr Ser Leu Val Tyr 450 455 460 Asn Leu Thr Lys Glu Leu Gln Ser Pro Asp Glu Gly Phe Glu Gly Lys 465 470 475 480 Ser Leu Tyr Glu Ser Trp Thr Lys Lys Ser Pro Ser Pro Glu Phe Ser 485 490 495 Gly Val Pro Arg Ile Asn Lys Leu Gly Ser Gly Asn Asp Phe Glu Val 500 505 510 Phe Phe Gln Arg Leu Gly Ile Ala Ser Gly Arg Ala Arg Tyr Thr Lys 515 520 525 Asn Trp Lys Thr Asn Lys Phe Ser Gly Tyr Pro Leu Tyr His Ser Val 530 535 540 Tyr Glu Thr Tyr Glu Leu Val Glu Lys Phe Tyr Asp Pro Met Phe Lys 545 550 555 560 Tyr His Leu Thr Val Ala Gln Val Arg Gly Gly Leu Val Phe Glu Leu 565 570 575 Ala Asp Ser Ile Val Leu Pro Phe Asp Cys Gln Asp Tyr Ala Val Val 580 585 590 Leu Arg Lys Tyr Ala Asp Lys Ile Tyr Asn Leu Ala Met Lys His Pro 595 600 605 Glu Glu Leu Lys Thr Tyr Ser Val Ser Phe Asp Ser Leu Phe Ser Ala 610 615 620 Val Lys Asn Phe Thr Glu Ile Ala Ser Lys Phe Asn Gln Arg Leu Gln 625 630 635 640 Asp Phe Asp Lys Asn Asn Pro Leu Leu Val Arg Met Leu Asn Asp Gln 645 650 655 Leu Met Phe Leu Glu Arg Ala Phe Val Asp Pro Leu Gly Leu Pro Asp 660 665 670 Arg Pro Phe Tyr Arg His Val Ile Tyr Ala Pro Ser Ser His Asn Lys 675 680 685 Tyr Ala Gly Glu Ser Phe Pro Gly Ile Tyr Asp Ala Leu Phe Asp Ile 690 695 700 Glu Ser Lys Val Asp Pro Ser Lys Ala Trp Gly Glu Val Lys Arg Gln 705 710 715 720 Ile Tyr Val Ala Ala Phe Thr Val Gln Ala Ala Ala Glu Thr Leu Ser 725 730 735 Glu Val Ala <210> 4 <211> 2217 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Synthetic Construct <400> 4 atggctagcg ccagacggcc cagatggctg tgcgccggag ccctggtgct ggccggagga 60 ttcttcctgc tgggcttcct gttcggctgg ttcatcaaga gcagcagcga ggccaccaac 120 atcagccccc agcacaacgt gaaggccttt ctggacgaga tgaaggccga gaacatcaag 180 aagtttctgt acctgttcac ccagatcccc cacctggccg gcaccgagca gaacttccag 240 ctggccaagc agattcaggc tgagtggaaa gagttcggcc tggacagcgt ggagctggcc 300 cactacgacg tgctgctgtc ctaccccaac gagacacacc ccaactacat cagcatcatc 360 gacgaggacg gcaacgagat tttcaacacc agcctgttcg agccccctcc ccctggctac 420 gagaacatct ccgacgtggt gcccccctac agcgccttca gccctcaggg aatgcctgaa 480 ggcgacctgg tgtacgtgaa ctacgcccgg accgaggact tcttcaagct ggaacgggag 540 ctgaagatca actgcagcgg caagatcctg atcgccagat acggcaaggt gttccggggc 600 aacaaagtga 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catgtcatct atgctccaag cagccacaac 2040 aagtatgcag gggagtcatt cccaggaatt tatgatgctc tgtttgatat tgaaagcaaa 2100 gtggaccctt ccaaggcctg gggagaagtg aagagacaga tttatgttgc agccttcaca 2160 gtgcaggcag ctgcagagac tttgagtgaa gtagcc 2196 <210> 15 <211> 263 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 15 Met Ala Ser Trp Val Pro Val Val Phe Leu Thr Leu Ser Val Thr Trp 1 5 10 15 Ile Gly Ala Ala Pro Leu Ile Leu Ser Arg Ile Val Gly Gly Trp Glu 20 25 30 Cys Glu Lys His Ser Gln Pro Trp Gln Val Leu Val Ala Ser Arg Gly 35 40 45 Arg Ala Val Cys Gly Gly Val Leu Val His Pro Gln Trp Val Leu Thr 50 55 60 Ala Ala His Cys Ile Arg Asn Lys Ser Val Ile Leu Leu Gly Arg His 65 70 75 80 Ser Leu Phe His Pro Glu Asp Thr Gly Gln Val Phe Gln Val Ser His 85 90 95 Ser Phe Pro His Pro Leu Tyr Asp Met Ser Leu Leu Lys Asn Arg Phe 100 105 110 Leu Arg Pro Gly Asp Asp Ser Ser His Asp Leu Met Leu Leu Arg Leu 115 120 125 Ser Glu Pro Ala Glu Leu Thr Asp Ala Val Lys Val Met Asp Leu Pro 130 135 140 Thr Gln Glu Pro Ala Leu Gly Thr Thr Cys Tyr Ala Ser Gly Trp Gly 145 150 155 160 Ser Ile Glu Pro Glu Glu Phe Leu Thr Pro Lys Lys Leu Gln Cys Val 165 170 175 Asp Leu His Val Ile Ser Asn Asp Val Cys Ala Gln Val His Pro Gln 180 185 190 Lys Val Thr Lys Phe Met Leu Cys Ala Gly Arg Trp Thr Gly Gly Lys 195 200 205 Ser Thr Cys Ser Gly Asp Ser Gly Gly Pro Leu Val Cys Asn Gly Val 210 215 220 Leu Gln Gly Ile Thr Ser Trp Gly Ser Glu Pro Cys Ala Leu Pro Glu 225 230 235 240 Arg Pro Ser Leu Tyr Thr Lys Val Val His Tyr Arg Lys Trp Ile Lys 245 250 255 Asp Thr Ile Val Ala Asn Pro 260 <210> 16 <211> 789 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 16 atggctagct gggtcccggt tgtcttcctc accctgtccg tgacgtggat tggcgctgcg 60 cccctcatcc tgtctcggat tgtgggaggc tgggagtgcg agaagcattc ccaaccctgg 120 caggtgcttg tggcctctcg tggcagggca gtctgcggcg gtgttctggt gcacccccag 180 tgggtcctca cagctgccca ctgcatcagg aacaaaagcg tgatcttgct gggtcggcac 240 agcttgtttc atcctgaaga cacaggccag gtatttcagg tcagccacag cttcccacac 300 ccgctctacg atatgagcct cctgaagaat cgattcctca ggccaggtga tgactccagc 360 cacgacctca tgctgctccg cctgtcagag cctgccgagc tcacggatgc tgtgaaggtc 420 atggacctgc ccacccagga gccagcactg gggaccacct gctacgcctc aggctggggc 480 agcattgaac cagaggagtt cttgacccca aagaaacttc agtgtgtgga cctccatgtt 540 atttccaatg acgtgtgtgc gcaagttcac cctcagaagg tgaccaagtt catgctgtgt 600 gctggacgct ggacaggggg caaaagcacc tgctcgggtg attctggggg cccacttgtc 660 tgtaatggtg tgcttcaagg tatcacgtca tggggcagtg aaccatgtgc cctgcccgaa 720 aggccttccc tgtacaccaa ggtggtgcat taccggaagt ggatcaagga caccatcgtg 780 gccaacccc 789 <210> 17 <211> 240 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Synthetic Construct <400> 17 Met Ala Ser Ile Val Gly Gly Trp Glu Cys Glu Lys His Ser Gln Pro 1 5 10 15 Trp Gln Val Leu Val Ala Ser Arg Gly Arg Ala Val Cys Gly Gly Val 20 25 30 Leu Val His Pro Gln Trp Val Leu Thr Ala Ala His Cys Ile Arg Asn 35 40 45 Lys Ser Val Ile Leu Leu Gly Arg His Ser Leu Phe His Pro Glu Asp 50 55 60 Thr Gly Gln Val Phe Gln Val Ser His Ser Phe Pro His Pro Leu Tyr 65 70 75 80 Asp Met Ser Leu Leu Lys Asn Arg Phe Leu 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1380 tttggcagta caccaatggg cgtggatagc ggtttgactc acggggattt ccaagtctcc 1440 accccattga cgtcaatggg agtttgtttt ggcaccaaaa tcaacgggac tttccaaaat 1500 gtcgtaataa ccccgccccg ttgacgcaaa tgggcggtag gcgtgtacgg tgggaggtct 1560 atataagcag agctcgttta gtgaaccgtc agatcgcctg gagacgccat ccacgctgtt 1620 ttgacctcca tagaagacac cgggaccgat ccagcctccg cggccgggaa cggtgcattg 1680 gaacgcggat tccccgtgcc aagagtgact caccgtccgg atctcagcaa gcaggtatgt 1740 actctccagg gtgggcctgg cttccccagt caagactcca gggatttgag ggacgctgtg 1800 ggctcttctc ttacatgtac cttttgcttg cctcaaccct gactatcttc caggtcagga 1860 tcccagagtc aggggtctgt attttcctgc tggtggctcc agttcaggaa cagtaaaccc 1920 tgctccgaat attgcctctc acatctcgtc aatctccgcg aggactgggg accctgtgac 1980 gaacatggct agcgcgcgcc gcccgcgctg gctgtgcgct ggggcgctgg tgctggcggg 2040 tggcttcttt ctcctcggct tcctcttcgg gtggtttata aaatcctcca atgaagctac 2100 taacattact ccaaagcata atatgaaagc atttttggat gaattgaaag ctgagaacat 2160 caagaagttc ttatataatt ttacacagat accacattta gcaggaacag aacaaaactt 2220 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DNA <213> Artificial <220> <223> Synthetic Construct <400> 36 ggcgtaatgc tctgccagtg ttacaaccaa ttaaccaatt ctgattagaa aaactcatcg 60 agcatcaaat gaaactgcaa tttattcata tcaggattat caataccata tttttgaaaa 120 agccgtttct gtaatgaagg agaaaactca ccgaggcagt tccataggat ggcaagatcc 180 tggtatcggt ctgcgattcc gactcgtcca acatcaatac aacctattaa tttcccctcg 240 tcaaaaataa ggttatcaag tgagaaatca ccatgagtga cgactgaatc cggtgagaat 300 ggcaaaagct tatgcatttc tttccagact tgttcaacag gccagccatt acgctcgtca 360 tcaaaatcac tcgcatcaac caaaccgtta ttcattcgtg attgcgcctg agcgagacga 420 aatacgcgat cgctgttaaa aggacaatta caaacaggaa tcaaatgcaa ccggcgcagg 480 aacactgcca gcgcatcaac aatattttca cctgaatcag gatattcttc taatacctgg 540 aatgctgttt tcccggggat cgcagtggtg agtaaccatg catcatcagg agtacggata 600 aaatgcttga tggtcggaag aggcataaat tccgtcagcc agtttagtct gaccatctca 660 tctgtaacat cattggcaac gctacctttg ccatgtttca gaaacaactc tggcgcatcg 720 ggcttcccat acaatcgata gattgtcgca cctgattgcc cgacattatc gcgagcccat 780 ttatacccat ataaatcagc 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Gly Ala Thr Val Glu Leu Leu 1 5 10 15 Ser Phe Leu Pro Ser Asp Phe Phe Pro Ser Val Arg Asp Leu Leu Asp 20 25 30 Thr Ala Ser Ala Leu Tyr Arg Glu Ala Leu Glu Ser Pro Glu His Cys 35 40 45 Ser Pro His His Thr Ala Leu Arg Gln Ala Ile Leu Cys Trp Gly Glu 50 55 60 Leu Met Thr Leu Ala Thr Trp Val Gly Asn Asn Leu Glu Asp Pro Ala 65 70 75 80 Ser Arg Asp Leu Val Val Asn Tyr Val Asn Thr Asn Met Gly Leu Lys 85 90 95 Ile Arg Gln Leu Leu Trp Phe His Ile Ser Cys Leu Thr Phe Gly Arg 100 105 110 Glu Thr Val Leu Glu Tyr Leu Val Ser Phe Gly Val Trp Ile Arg Thr 115 120 125 Pro Pro Ala Tyr Arg Pro Pro Asn Ala Pro Ile Leu Ser Thr Leu Pro 130 135 140 Glu Thr Thr Val Val Arg Arg Arg Gly Arg Gly Arg Ser Pro Arg Arg 145 150 155 160 Arg Thr Pro Ser Pro Arg Arg Arg Arg Ser Gln Ser Pro Arg Arg Arg 165 170 175 Arg Ser Gln Ser Arg Glu Ser Gln Cys 180 185 <210> 49 <211> 226 <212> PRT <213> Orthohepadnavirus hepatitis B virus <400> 49 Met Glu Asn Ile Thr Ser Gly Phe Leu Gly Pro Leu Leu Val Leu Gln 1 5 10 15 Ala Gly Phe 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Ser Trp Asp Ala Glu Glu Phe Gly Leu 405 410 415 Leu Gly Ser Thr Glu Trp Ala Glu Glu Asn Ser Arg Leu Leu Gln Glu 420 425 430 Arg Gly Val Ala Tyr Ile Asn Ala Asp Ser Ser Ile Glu Gly Asn Tyr 435 440 445 Thr Leu Arg Val Asp Cys Thr Pro Leu Met Tyr Ser Leu Val Tyr Asn 450 455 460 Leu Thr Lys Glu Leu Glu Ser Pro Asp Glu Gly Phe Glu Gly Lys Ser 465 470 475 480 Leu Tyr Glu Ser Trp Thr Lys Ser Pro Ser Pro Glu Phe Ser Gly Met 485 490 495 Pro Arg Ile Ser Lys Leu Gly Ser Gly Asn Asp Phe Glu Val Phe Phe 500 505 510 Gln Arg Leu Gly Ile Ala Ser Gly Arg Ala Arg Tyr Thr Lys Asn Trp 515 520 525 Glu Thr Asn Lys Phe Ser Ser Tyr Pro Leu Tyr His Ser Val Tyr Glu 530 535 540 Thr Tyr Glu Leu Val Glu Lys Phe Tyr Asp Pro Met Phe Lys Tyr His 545 550 555 560 Leu Thr Val Ala Gln Val Arg Gly Gly Met Val Phe Glu Leu Ala Asn 565 570 575 Ser Val Val Leu Pro Phe Asp Cys Arg Asp Tyr Ala Val Val Leu Arg 580 585 590 Lys Tyr Ala Asp Lys Ile Tyr Asn Ile Ser Met Lys His Pro Gln Glu 595 600 605 Met Lys Thr Tyr Ser Val Ser Phe Asp Ser Leu Phe Ser Ala Val Lys 610 615 620 Asn Phe Thr Glu Ile Ala Ser Lys Phe Ser Glu Arg Leu Arg Asp Phe 625 630 635 640 Asp Lys Ser Asn Pro Ile Leu Leu Arg Met Met Asn Asp Gln Leu Met 645 650 655 Phe Leu Glu Arg Ala Phe Ile Asp Pro Leu Gly Leu Pro Asp Arg Pro 660 665 670 Phe Tyr Arg His Val Ile Tyr Ala Pro Ser Ser His Asn Lys Tyr Ala 675 680 685 Gly Glu Ser Phe Pro Gly Ile Tyr Asp Ala Leu Phe Asp Ile Glu Ser 690 695 700 Lys Val Asp Pro Ser Gln Ala Trp Gly Glu Val Lys Arg Gln Ile Ser 705 710 715 720 Ile Ala Thr Phe Thr Val Gln Ala Ala Ala Glu Thr Leu Ser Glu Val 725 730 735 Ala <210> 51 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Synthetic Construct <400> 51 Thr Tyr Val Pro Ala Asn Ala Ser Leu 1 5 <210> 52 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Synthetic Construct <400> 52 Asp Met Val Leu Trp Lys Asp Val Phe Arg Lys Asn Asn Gln Leu 1 5 10 15 <210> 53 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Synthetic Construct <400> 53 Ser Tyr Val Asn Thr Asn Met Gly Leu 1 5 <210> 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Met Pro Ile Trp Lys Tyr Pro Asp Glu Glu Gly 610 615 620 Ile Cys Gln Pro Cys Pro Ile Asn Cys Thr His Ser Cys Val Asp Leu 625 630 635 640 Asp Glu Arg Gly Cys Pro Ala Glu Gln Arg Ala Ser Pro Val Thr Phe 645 650 655 Ile Ile Ala Thr Val Val Gly Val Leu Leu Phe Leu Ile Leu Val Val 660 665 670 Val Val Gly Ile Leu Ile Lys Arg Arg Arg Gln Lys Ile Arg Lys Tyr 675 680 685 Thr Met Arg Arg Asn Glu Asp Leu Gly Pro Ser Ser Pro Met Asp Ser 690 695 700 Thr Phe Tyr Arg Ser Leu Leu Glu Asp Asp Asp Met Gly Asp Leu Val 705 710 715 720 Asp Ala Glu Glu Tyr Leu Val Pro Gln Gln Gly Phe Phe Ser Pro Asp 725 730 735 Pro Thr Pro Gly Thr Gly Ser Thr Ala His Arg Arg His Arg Ser Ser 740 745 750 Ser Thr Arg Ser Gly Gly Gly Glu Leu Thr Leu Gly Leu Glu Pro Ser 755 760 765 Glu Glu Gly Pro Pro Arg Ser Pro Leu Ala Pro Ser Glu Gly Ala Gly 770 775 780 Ser Asp Val Phe Asp Gly Asp Leu Ala Met Gly Val Thr Lys Gly Leu 785 790 795 800 Gln Ser Leu Ser Pro His Asp Leu Ser Pro Leu Gln Arg Tyr Ser Glu 805 810 815 Asp Pro Thr Leu Pro Leu Pro Pro Glu Thr Asp Gly Tyr Val Ala Pro 820 825 830 Leu Ala Cys Ser Pro Gln Pro Glu Phe Val Asn Gln Ser Glu Val Gln 835 840 845 Pro Gln Pro Pro Leu Thr Pro Glu Gly Pro Leu Pro Pro Val Arg Pro 850 855 860 Ala Gly Ala Thr Leu Glu Arg Pro Lys Thr Leu Ser Pro Gly Lys Asn 865 870 875 880 Gly Val Val Lys Asp Val Phe Ala Phe Gly Gly Ala Val Glu Asn Pro 885 890 895 Glu Phe Leu Val Pro Arg Glu Gly Thr Ala Ser Pro Pro His Pro Ser 900 905 910 Pro Ala Phe Ser Pro Ala Phe Asp Asn Leu Phe Phe Trp Asp Gln Asn 915 920 925 Ser Ser Glu Gln Gly Pro Pro Pro Ser Asn Phe Glu Gly Thr Pro Thr 930 935 940 Ala Glu Asn Pro Glu Phe Leu Gly Leu Asp Val Pro Val 945 950 955 <210> 55 <211> 739 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Synthetic Construct <400> 55 Met Ala Ser Ala Arg Arg Pro Arg Trp Leu Cys Ala Gly Ala Leu Val 1 5 10 15 Leu Ala Gly Gly Phe Phe Leu Leu Gly Phe Leu Phe Gly Trp Phe Ile 20 25 30 Lys Ser Ser Ser Glu Ala Thr Asn Ile Thr Pro Lys His Asn Met Lys 35 40 45 Ala Phe Leu Asp Glu Leu Lys Ala Glu Asn Ile Lys Lys Phe Leu His 50 55 60 Asn Phe Thr Gln Ile Pro His Leu Ala Gly Thr Glu Gln Asn Phe Gln 65 70 75 80 Leu Ala Lys Gln Ile Gln Ser Gln Trp Lys Glu Phe Gly Leu Asp Ser 85 90 95 Val Glu Leu Thr His Tyr Asp Val Leu Leu Ser Tyr Pro Asn Lys Thr 100 105 110 His Pro Asn Tyr Ile Ser Ile Ile Asn Glu Asp Gly Asn Glu Ile Phe 115 120 125 Asn Thr Ser Leu Phe Glu Pro Pro Pro Ala Gly Tyr Glu Asn Val Ser 130 135 140 Asp Ile Val Pro Pro Phe Ser Ala Phe Ser Pro Gln Gly Met Pro Glu 145 150 155 160 Gly Asp Leu Val Tyr Val Asn Tyr Ala Arg Thr Glu Asp Phe Phe Lys 165 170 175 Leu Glu Arg Asp Met Lys Ile Asn Cys Ser Gly Lys Ile Val Ile Ala 180 185 190 Arg Tyr Gly Lys Val Phe Arg Gly Asn Lys Val Lys Asn Ala Gln Leu 195 200 205 Ala Gly Ala Thr Gly Val Ile Leu Tyr Ser Asp Pro Ala Asp Tyr Phe 210 215 220 Ala Pro Gly Val Lys Ser Tyr Pro Asp Gly Trp Asn Leu Pro Gly Gly 225 230 235 240 Gly Val Gln Arg Gly Asn Ile Leu Asn Leu Asn Gly Ala Gly Asp Pro 245 250 255 Leu Thr Pro Gly Tyr Pro Ala Asn Glu Tyr Ala Tyr Arg Arg Gly Ile 260 265 270 Ala Glu Ala Val Gly Leu Pro Ser Ile Pro Val His Pro Ile Gly Tyr 275 280 285 Tyr Asp Ala Gln Lys Leu Leu Glu Lys Met Gly Gly Ser Ala Ser Pro 290 295 300 Asp Ser Ser Trp Arg Gly Ser Leu Lys Val Pro Tyr Asn Val Gly Pro 305 310 315 320 Gly Phe Thr Gly Asn Phe Ser Thr Gln Lys Val Lys Met His Ile His 325 330 335 Ser Thr Ser Glu Val Thr Arg Ile Tyr Asn Val Ile Gly Thr Leu Arg 340 345 350 Gly Ala Val Glu Pro Asp Arg Tyr Val Ile Leu Gly Gly His Arg Asp 355 360 365 Ser Trp Val Phe Gly Gly Ile Asp Pro Gln Ser Gly Ala Ala Val Val 370 375 380 His Glu Ile Val Arg Ser Phe Gly Thr Leu Lys Lys Glu Gly Trp Arg 385 390 395 400 Pro Arg Arg Thr Ile Leu Phe Ala Ser Trp Asp Ala Glu Glu Phe Gly 405 410 415 Leu Leu Gly Ser Thr Glu Trp Ala Glu Glu Asn Ser Arg Leu Leu Gln 420 425 430 Glu Arg Gly Val Ala Tyr Ile Asn Ala Asp Ser Ser Ile Glu Gly Asn 435 440 445 Tyr Thr Leu Arg Val Asp Cys Thr Pro Leu Met Tyr Ser Leu Val Tyr 450 455 460 Asn Leu Thr Lys Glu Leu Glu Ser Pro Asp Glu Gly Phe Glu Gly Lys 465 470 475 480 Ser Leu Tyr Glu Ser Trp Thr Lys Lys Ser Pro Ser Pro Glu Phe Ser 485 490 495 Gly Met Pro Arg Ile Ser Lys Leu Gly Ser Gly Asn Asp Phe Glu Val 500 505 510 Phe Phe Gln Arg Leu Gly Ile Ala Ser Gly Arg Ala Arg Tyr Thr Lys 515 520 525 Asn Trp Glu Thr Asn Lys Phe Ser Ser Tyr Pro Leu Tyr His Ser Val 530 535 540 Tyr Glu Thr Tyr Glu Leu Val Glu Lys Phe Tyr Asp Pro Met Phe Lys 545 550 555 560 Tyr His Leu Thr Val Ala Gln Val Arg Gly Gly Met Val Phe Glu Leu 565 570 575 Ala Asn Ser Val Val Leu Pro Phe Asp Cys Arg Asp Tyr Ala Val Val 580 585 590 Leu Arg Lys Tyr Ala Asp Lys Ile Tyr Asn Ile Ser Met Lys His Pro 595 600 605 Gln Glu Met Lys Thr Tyr Ser Val Ser Phe Asp Ser Leu Phe Ser Ala 610 615 620 Val Lys Asn Phe Thr Glu Ile Ala Ser Lys Phe Ser Glu Arg Leu Arg 625 630 635 640 Asp Phe Asp Lys Ser Asn Pro Ile Leu Leu Arg Met Met Asn Asp Gln 645 650 655 Leu Met Phe Leu Glu Arg Ala Phe Ile Asp Pro Leu Gly Leu Pro Asp 660 665 670 Arg Pro Phe Tyr Arg His Val Ile Tyr Ala Pro Ser 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actgctccgg caagatcgtg atcgccagat acggcaaggt gttcaggggc 600 aacaaagtga agaacgctca gctggctggg gccaccggcg tgatcctgta ctctgacccc 660 gccgactact tcgccccagg cgtgaagtcc taccccgacg gctggaacct gccaggtggc 720 ggagtgcaga ggggcaacat cctgaacctg aacggcgctg gcgaccccct gaccccagga 780 taccccgcca acgagtacgc ctacagaaga ggaatcgccg aggccgtggg cctgccctct 840 atcccagtgc accccatcgg ctactacgac gcccagaaac tgctggaaaa gatgggcggc 900 tccgcctccc ccgactcctc ttggagaggc tccctgaagg tgccctacaa cgtgggccca 960 ggcttcaccg gcaacttctc cacccagaaa gtgaagatgc acatccactc cacctccgaa 1020 gtgaccagga tctacaacgt gatcggcacc ctgagaggcg ccgtggaacc cgacagatac 1080 gtgatcctgg gcggccacag ggacagctgg gtgttcggcg gcatcgaccc acagtctggc 1140 gccgctgtgg tgcacgagat cgtgcggtcc ttcggaaccc tgaagaaaga gggatggcgc 1200 cccagaagga caatcctgtt cgcctcctgg gacgccgagg aattcggcct gctgggatcc 1260 accgagtggg ccgaggaaaa ctccaggctg ctgcaggaaa ggggcgtcgc ctacatcaac 1320 gccgactcct ccatcgaggg caactacacc ctgagggtgg actgcacccc cctgatgtac 1380 tccctggtgt acaacctgac caaagagctg gaatcccccg acgagggctt cgagggcaag 1440 tccctgtacg agtcctggac caagaagtcc ccatcccccg agttctccgg catgcccagg 1500 atctccaagc tgggctccgg caacgacttc gaggtgttct tccagaggct gggaatcgcc 1560 tccggcaggg ccagatacac caagaactgg gagacaaaca agttctcctc ctaccccctg 1620 taccactccg tgtacgaaac ctacgagctg gtggaaaagt tctacgaccc catgttcaag 1680 taccacctga ccgtggccca ggtccgcgga ggcatggtgt tcgagctggc caactccgtg 1740 gtgctgccct tcgactgcag agactatgct gtggtgctga ggaagtacgc cgacaaaatc 1800 tacaacatct ccatgaagca cccccaggaa atgaagacct actccgtgtc cttcgactcc 1860 ctgttctccg ccgtgaagaa tttcaccgag atcgcctcca agttctccga gaggctgagg 1920 gacttcgaca agtccaaccc catcctgctg aggatgatga acgaccagct gatgttcctg 1980 gaaagggcct tcatcgaccc cctgggcctg ccagacaggc ccttctacag gcacgtgatc 2040 tacgccccat cctcccacaa caaatacgcc ggcgagtcct tccccggcat ctacgatgcc 2100 ctgttcgaca tcgagtccaa ggtggacccc tcccaggctt ggggcgaagt gaagaggcag 2160 atcagtatcg ccacattcac agtgcaggcc gctgccgaaa ccctgtccga ggtggcc 2217

Claims (20)

  1. (a) 면역원성 전립선-특이성 막 항원(PSMA) 폴리펩타이드를 암호화하는 뉴클레오타이드 서열, 및 면역원성 전립선 줄기세포 항원(PSCA) 폴리펩타이드를 암호화하는 뉴클레오타이드 서열; 및
    (b) 면역원성 PSMA 폴리펩타이드를 암호화하는 뉴클레오타이드 서열, 및 면역원성 전립선-특이성 항원(PSA) 폴리펩타이드를 암호화하는 뉴클레오타이드 서열
    에 의해 정의되는 2개의 뉴클레오타이드 서열에 의해 각각 암호화되는 2개의 면역원성 전립선-관련된 항원(PAA) 폴리펩타이드를 암호화하는 다중-항원 구축물로서,
    이때,
    (1) 상기 면역원성 PSA 폴리펩타이드가 (i) 서열번호 17의 아미노산 4 - 240 또는 (ii) 서열번호 17의 아미노산 서열을 포함하고;
    (2) 상기 면역원성 PSCA 폴리펩타이드가 (i) 서열번호 21의 아미노산 4 - 123 또는 (ii) 서열번호 21의 아미노산 서열을 포함하고; 및
    (3) 상기 면역원성 PSMA 폴리펩타이드가
    (i) 서열번호 1의 아미노산 서열의 아미노산 15 - 750을 포함하는 폴리펩타이드;
    (ii) 서열번호 3의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩타이드;
    (iii) 서열번호 5의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩타이드;
    (iv) 서열번호 7의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩타이드;
    (v) 서열번호 9의 아미노산 4 - 739를 포함하는 폴리펩타이드;
    (vi) 서열번호 3의 아미노산 4 - 739를 포함하는 폴리펩타이드;
    (vii) 서열번호 5의 아미노산 4 - 739를 포함하는 폴리펩타이드;
    (viii) 서열번호 7의 아미노산 4 - 739를 포함하는 폴리펩타이드; 및
    (ix) 서열번호 9의 아미노산 서열 을 포함하는 폴리펩타이드
    로 이루어진 군으로부터 선택되는,
    다중-항원 구축물.
  2. 제 1 항에 있어서,
    상기 면역원성 PSMA 폴리펩타이드가 (1) 서열번호 9의 아미노산 서열 또는 (2) 서열번호 9의 아미노산 4 - 739를 포함하는, 다중-항원 구축물.
  3. 제 2 항에 있어서,
    상기 면역원성 PSCA 폴리펩타이드가 서열번호 21의 아미노산 서열을 포함하는, 다중-항원 구축물.
  4. 제 3 항에 있어서,
    상기 면역원성 PSA 폴리펩타이드를 암호화하는 뉴클레오타이드 서열이 서열번호 18이고, 상기 면역원성 PSMA 폴리펩타이드를 암호화하는 뉴클레오타이드 서열이 서열번호 10인, 다중-항원 구축물.
  5. 제 3 항에 있어서,
    (a) 면역원성 PSMA 폴리펩타이드를 암호화하는 뉴클레오타이드 서열 및 (b) 면역원성 PSCA 폴리펩타이드 또는 면역원성 PSA 폴리펩타이드를 암호화하는 뉴클레오타이드 서열의 사이에 위치하는 내부 리보솜 진입 부위(IRES) 서열을 더 포함하는, 다중-항원 구축물.
  6. 제 3 항에 있어서,
    (a) 면역원성 PSMA 폴리펩타이드를 암호화하는 뉴클레오타이드 서열 및 (b) 면역원성 PSCA 폴리펩타이드 또는 면역원성 PSA 폴리펩타이드를 암호화하는 뉴클레오타이드 서열의 사이에 위치하는 2A 펩타이드 서열을 암호화하는 뉴클레오타이드 서열을 더 포함하는, 다중-항원 구축물.
  7. 제 6 항에 있어서,
    상기 2A 펩타이드 서열이 T2A 펩타이드 서열 또는 F2A 펩타이드 서열인, 다중-항원 구축물.
  8. 제 6 항에 있어서,
    (1) 면역원성 PSCA 폴리펩타이드를 암호화하는 뉴클레오타이드 서열 및 (2) 면역원성 PSMA 폴리펩타이드를 암호화하는 뉴클레오타이드 서열을 포함하는, 다중-항원 구축물.
  9. 제 8 항에 있어서,
    상기 2A 펩타이드 서열이 F2A 펩타이드 서열인, 다중-항원 구축물.
  10. 제 1 항에 있어서,
    (1) 서열번호 26, 27, 28 또는 29의 뉴클레오타이드 서열, 또는 (2) 서열번호 26, 27, 28 및 29의 뉴클레오타이드 서열 중 어느 하나의 축퇴성 변이체를 포함하는, 다중-항원 구축물.
  11. 제 1 항에 있어서,
    (1) 서열번호 30 또는 31의 뉴클레오타이드 서열, 또는 (2) 서열번호 30 또는 31의 뉴클레오타이드 서열의 축퇴성 변이체를 포함하는, 다중-항원 구축물.
  12. 제 1 항 내지 제 11 항 중 어느 한 항에 따른 다중-항원 구축물을 포함하는 벡터.
  13. 제 12 항에 따른 벡터를 포함하는 조성물.
  14. 제 1 항 내지 제 11 항 중 어느 한 항에 따른 다중-항원 구축물을 포함하는 조성물.
  15. 제 13 항 또는 제 14 항에 있어서,
    부형제를 더 포함하는 조성물.
  16. 제 15 항에 있어서,
    백신 조성물인, 조성물.
  17. 제 16 항에 있어서,
    항원보강제를 더 포함하는, 조성물.
  18. 포유동물에서 신생물 질환을 치료하는 용도의, 제 1 항 내지 제 11 항 중 어느 한 항에 따른 다중-항원 구축물 또는 제 12 항에 따른 벡터.
  19. 포유동물에서 전립선-관련된 항원(PAA)에 대한 면역 반응을 유도하는 용도의, 제 1 항 내지 제 11 항 중 어느 한 항에 따른 다중-항원 구축물 또는 제 12 항에 따른 벡터.
  20. 포유동물에서 전립선암을 치료하는 용도의, 제 1 항 내지 제 11 항 중 어느 한 항에 따른 다중-항원 구축물 또는 제 12 항에 따른 벡터.
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