PT668777E

PT668777E - Antigenio de membrana especifico para a prostata

Info

Publication number: PT668777E
Application number: PT94900538T
Authority: PT
Inventors: Ron S Israeli; Warren D W Heston; William R Fair
Original assignee: Sloan Kettering Inst Cancer
Priority date: 1992-11-05
Filing date: 1993-11-05
Publication date: 2007-01-31
Also published as: CA2147499C; EP0668777A1; DE69334071T2; EP1757694A2; JPH08506005A; EP1757695A2; ES2276390T3; EP0668777A4; JP2007014343A; ATE342356T1; DE69334071D1; CA2147499A1; US5538866A; JP4204642B2; EP0668777B1; EP0668777B2; WO1994009820A1; JP4202375B2; EP1757694A3; DK0668777T3

Description

DESCRIÇÃO

ANTIGÉNIO DE MEMBRANA ESPECÍFICO PARA A PRÓSTATA

Descrição

Antecedentes da Patente

Esta patente, a qual é aqui descrita, foi feita em parte com apoio do Governo através das bolsas NIH N.° DK47650 e CA58192 do Departamento de Saúde e Serviços Humanos. Adequadamente, o Governo norte-americano tem determinados direitos sobre esta patente.

Ao longo desta aplicação as várias referências são apresentadas dentro de parêntesis. A citação bibliográfica completa para estas referências pode ser encontrada no final de cada uma das séries de experiências. 0 cancro da próstata está entre os problemas médicos mais importantes nos Estados Unidos, dado que a doença é agora o mal mais comum que é diagnosticado em americanos do sexo masculino. Em 1992 existiam mais de 132 000 novos casos de cancro da próstata detectados, sendo mais de 36 000 mortes atribuíveis a esta doença, representando um aumento de 17,3 % em 4 anos (2) . A percentagem de sobrevivência durante cinco anos para os pacientes com cancro da próstata varia de 88 % para os que apresentavam uma forma localizada da doença, até 29 % para os que apresentavam a doença metastática. O rápido aumento no número de casos parece resultar em parte de um aumento da tomada de consciência da doença bem como também à utilização mais difundida de marcadores clínicos tais como as proteínas segregadas de antigénio específico da próstata (PSA) e da fosfatase do ácido prostático (PAP) (37). A glândula da próstata é um local com uma patologia importante o qual é afectado por condições tais como um crescimento benigno (BPH), neoplasia (cancro de próstata) e infecção (prostatite). 0 cancro da próstata representa a segunda causa principal de morte de cancro nos homens (1). No entanto o cancro da próstata é o local principal para o desenvolvimento de cancro nos homens. A diferença entre estas duas afirmações diz respeito ao facto do cancro da próstata acontecer com uma frequência crescente em homens envelhecidos, em especial nas idades que vão para além dos 60, numa altura em que a morte devido a outros factores ocorre frequentemente. Adicionalmente, o espectro da agressividade biológica do cancro da próstata é grande, de modo a que em alguns homens após a descoberta do tumor este permanece um tumor histológico oculto e não se torna clinicamente importante, enquanto que em outros se observa uma rápida progressão, dá origem a metástases e pode matar um homem num período relativamente curto de 2 a 5 anos (1, 3) .

Nas células de cancro da próstata, as duas proteínas específicas que são produzidas em concentrações muito altas são a fosfatase do ácido prostático (PAP) e antigénio específico da próstata (PSA) (4, 5, 6). Estas proteínas foram já caracterizadas e foram utilizadas para avaliar a resposta à terapia. Com o desenvolvimento de um cancro, é alterada a arquitectura normal da referida glândula, incluindo perda da estrutura de tubo normal utilizada para a remoção das secreções e, deste modo, as secreções alcançam o soro. De facto, a quantidade de PSA no soro é sugerida como sendo um método potencial de detecção do cancro da próstata. De facto, a quantidade relativa de PSA e, ou, PAP no cancro é reduzida quando comparada à dos tecidos normais ou benignos. 0 PAP foi um dos marcadores do soro mais cedo utilizados para a detecção do crescimento metástico (4). 0 PAP hidrolisa o fosfato de tirosina e apresenta uma ampla especificidade de substratos. A fosforilação da tirosina é frequentemente aumentada através da transformação oncogénica. Foi colocada como hipótese que durante a transformação neoplásica existiria menor actividade de fosfatase disponível para desactivar as proteínas que são activadas através da fosforilação dos resíduos de tirosina. Em alguns exemplos, a inserção de fosfatases, as quais apresentem uma actividade de fosfatase de tirosina, inverteu o fenótipo maligno. A PSA é uma protease e não é imediatamente visível de que modo é que a perda da sua actividade se relaciona com o desenvolvimento de cancro (5, 6). A actividade proteolítica do PSA é inibida pelo zinco. As concentrações de zinco são elevadas na próstata normal e são reduzidas no cancro da próstata. É possível que a perda de zinco permita uma actividade proteolítica do PSA mais elevada. Dado que as proteases estão normalmente envolvidas nas metástases e algumas proteases estimulam a actividade mitótica, pode ser posta a hipótese de que a actividade potencialmente aumentada do PSA pode desempenhar um papel nas metástases de tumores e na sua expansão (7).

Tanto o PSA como o PAP são encontrados nas secreções da próstata. Mas ambos aparentam ser dependentes da presença de andrógenios para a sua produção e sao substancialmente reduzidos após a falta de andrógenios. 0 antigénio de membrana especifico da próstata (PSM) o qual parece estar localizado na membrana da próstata foi identificado. Este antigénio foi identificado como sendo o resultado da produção de anticorpos monoclonais numa célula de cancro da próstata, as LNCaP (8). 0 Dr. Horoszewicz estabeleceu uma linha de células designada por LNCaP a partir do nodo linfático de um paciente refractário a hormonas, o qual tinha já sofrido muitos tratamentos prévios (9). Foi descoberto que esta linha apresentava um cariótipo aneuplóide de um humano do sexo masculino. Esta linha mantinha a funcionalidade de diferenciação prostática pois produzia tanto o PSA como o PAP. Possuía um receptor de andrógenio de elevada afinidade e especificidade. Foram imunizados ratos com as células de LNCaP e os hibridomas foram derivados de animais sensibilizados. Foi derivado um anticorpo monoclonal e foi designado por 7E11-C5 (8). As manchas do anticorpo eram consistentes com a sua localização na membrana e as fracções isoladas das membranas das células de LNCaP exibiam uma reacção fortemente positiva com as técnicas de immunoblotting e de ELISA. Este anticorpo não inibiu ou aumentou o crescimento das células de LNCaP in vitro ou in vivo. 0 anticorpo para este antigénio era notavelmente específico para as células epiteliais da próstata, dado que não foi observada nenhuma reactividade em qualquer outro componente. A revelação imuno-histoquímica das células de epitélio cancerosas foi mais intensa do que a observada em células de epitélio normais ou benignas. 0 Dr. Horoszewicz também relatou a descoberta de substâncias imuno-reactivas utilizando 7E11-C5 no soro de pacientes com cancro da próstata (8). A reactividade imunitária era detectável em quase 60 % dos pacientes com a referida doença na fase D-2 e numa percentagem ligeiramente mais baixa nos pacientes numa fase mais precoce da doença, mas o número de pacientes no último grupo referido era pequeno. Os pacientes com uma hiperplasia da próstata benigna (BPH) davam origem a um teste negativo. Os pacientes sem doença aparente davam origem a um teste negativo, mas cerca de 50 a 60 % dos pacientes que se encontravam em remissão mas ainda com a doença activa estável ou em progressão, demonstraram uma reactividade de soro positiva. Os pacientes com tumores que não de próstata não apresentaram reactividade imunitária ao 7E11-C5. 0 anticorpo monoclonal 7E11-C5 encontra-se actualmente em ensaios clínicos. Foram oxidados os grupos aldeído do anticorpo e o ligante/agente quelante de glicol-tirosil-(n, ε-dietilenotriamina - ácido pentacético)-lisina (GYK -DTPA) foi ligado aos aldeídos reactivos da cadeia pesada (10). O anticorpo resultante foi designado por CYT-356. Os padrões da revelação imuno-histoquímica eram semelhantes a não ser pela diferença de que o anticorpo modificado CYT-356 manchou os músculos interósseos. A comparação do CYT-356 com o anticorpo monoclonal 7E11-C5 sugeriu que ambos apresentavam ligação às fibras de músculo do tipo 2. A razão para a existente discrepância com o estudo mais antigo, o qual descreveu os músculos interósseos como dando origem a um teste negativo, foi sugerida como estando ligada a diferenças nas técnicas de fixação dos tecidos. No entanto, a reacção mais intensa e definida foi observada nas células de epitélio da próstata, em especial nas células cancerosas. A reactividade com o tecido de músculos interósseos de ratos foi detectada com estudos de imuno-histoquímica mas não com estudos de imagiologia. 0 anticorpo marcado com o i:L1índio colocado em tumores de LNCaP que cresceram em ratos nus com uma incorporação de quase 30 % da dose injectada por grama de tumor no quarto dia. Não foi observada, in vivo, nenhuma retenção selectiva do anticorpo em tumores negativos ao antigénio tais como o PC-3 e o DU-145, ou pelos músculos interósseos.

Pouquíssimo era conhecido sobre o antigénio PSM. Foi descrito um esforço para a purificação e caracterização em encontros, feito pelo Dr. George Wright e pelos seus colegas (11, 12). Estes investigadores mostraram que após uma electroforese em géis de acrilamida e de Western Blotting, o antigénio PSM mantinha um peso molecular de 10C kilodaltons (kd) . 0 tratamento químico e enzimático mostraram que são necessárias tanto as parcelas de peptídeo como de hidratos de carbono do antigénio PSM para o reconhecimento feito pelo anticorpo monoclonal 7E11-C5. Os estudos de ligação competitiva com lectinas específicas sugeriu que o galNAc é o hidrato de carbono dominante do epitopo antigénico. A glicoproteína de lOOkd unicamente encontrada nas células e tecidos da próstata foi purificada e caracterizada. A proteína foi proteoliticamente digerida com tripsina e foram sequenciados nove fragmentos de peptídeo. Utilizando a técnica de PCR degenerado (reacção em cadeia da polimerase), foi clonado cDNA de comprimento completo a 2,65 kilobase (kb) o qual codifica este antigénio. Os resultados preliminares revelaram que este antigénio é altamente expresso em tecidos de cancro da próstata, incluindo nas metástases dos nodos linfáticos e ósseos (13) . Foi determinada a sequência de DNA completa para o cDNA bem como também a sequência de aminoácidos previsível para o antigénio. Uma caracterização mais detalhada do antigénio PSM está agora a ser feita nos laboratórios dos proponentes da presente patente a qual inclui: a análise da expressão do gene PSM numa grande variedade de tecidos, transfecção do gene PSM em células que não expressem o antigénio, localização no cromossoma do gene do PSM, clonagem do gene de PSM genómico com a análise do promotor de PSM e com a geração de anticorpos policlonais e monoclonais contra domínios do peptídeo altamente antigénicos do antigénio PSM e identificação de quaisquer moléculas ligantes do PSM endógenas (ligandos).

Até este momento, as células de LNCaP disponibilizam o melhor sistema in vitro modelo para estudar o cancro da próstata humano, dado que as referidas células produzem todos os três tipos de marcadores biológicos prostáticos; o PSA, o PAP e o PSM. As células possuem um cariótipo aneuplóide masculino com um cromossoma Y, o qual expressa um receptor de andrógenio de elevada afinidade, e apresentam uma resposta hormonal tanto a testosterona como a DHT. Dado que o PSM aparenta ser uma glicoproteína transmembranar, é considerado um alvo atraente tanto para imagiologia dirigida a anticorpos como para a detecção de depósitos de tumor da próstata (38). Os proponentes demonstraram já a expressão da proteína PSM em membranas celulares LNCaP e em células PC-3 transfectadas com o cDNA do PSM e também a caracterização da expressão do mRNA de PSM em tecidos humanos, e em resposta a hormonas esteróides.

Breve Descrição das Figuras

Figura 1: 0 sinal na pista 2 representa o antigénio de PSM lOOkD. 0 EGFr foi utilizado como controlo positivo e é apresentado na pista 1. A incubação com apenas o anticorpo anti-rato de coelho (RAM) serviu como controlo negativo e é apresentado na pista 3.

Figure 2 A - D: As duas fotografias na parte superior mostram citospinas de LNCaP que se revelaram positivamente para o antigénio PSM. Na parte de baixo à esquerda está o DU-145 e em baixo à direita está a citospina PC-3, ambos negativos quanto à expressão de antigénio PSM.

Figure 3 A - D: Os dois painéis na parte superior são secções de próstata humana (BPH) as quais se revelaram positivamente para antigénio PSM. Os dois painéis na parte de baixo mostram secções invasoras de um carcinoma da próstata humana as quais se revelaram positivamente quanto à expressão do antigénio PSM.

Figure 4: 0 antigénio PSM lOOkD após a imunoprecipitação de células de LNCaP marcadas com 35S-metionina com o anticorpo Cyt - 356.

Figure 5: Géis com 3 % de agarose revelados com brometo de etidio. Estes géis revelaram os produtos de PCR obtidos utilizando os iniciadores de antigénio PSM degenerados. A seta aponta para a amostra IN-20, a qual é um produto de PCR 1.1 kb o qual foi mais tarde confirmado pelos proponentes como sendo um cDNA parcial o qual codifica para o gene de PSM.

o, "O

Figure 6 A - B: Géis com 2 de agarose de DNA plasmideo o qual resulta da clonagem TA dos produtos de PCR. Os enxertos são cortados do vector de PCR II (Invitrogen Corp.) por digestão com o EcoRI. 0 produto do cDNA parcial do gene de PSM 1.1 kb é apresentado na pista 3 do gel 1.

Figure 7: Autoradiograma que mostra o tamanho do cDNA representado no banco de LNCaP dos proponentes utilizando a transcriptase inversa M-MLV.

Figure 8: Análise de restrição de clones de comprimento completo do gene de PSM obtidos depois de análise do banco de cDNA. As amostras foram cortadas com os enzimas de restrição Not I e Sal I de modo a libertar o enxerto.

Figure 9: Autoradiograma Southern de plasmídeo dos clones do gene PSM de comprimento completo. 0 tamanho era de cerca de 2,7 kb.

Figure 10: Northern blot que revela a expressão do PSM limitada às linhas de células de LNCaP de cancro da próstata e de LNCaP H26 transfectada com Ras. As PC-3, DU-145, T-24, SKRC-27, HELA, MCF-7, HL-60, e todas as outras deram negativo.

Figure 11: Autoradiograma da análise Northern que revela a expressão de uma mensagem de PSM a 2,8 kb única para a linha de células LNCaP (pista 1), e ausente das linhas de células DU-145 (pista 2) e PC-3 (pista 3). A escalada de tamanhos do RNA é apresentada à esquerda (kb), e as bandas de RNA ribossomal 28S e 18S são indicadas à direita.

Figure 12 A - B: Os resultados de PCR para os tecidos de próstata de humanos utilizando iniciadores de gene PSM. As pistas são numeradas da esquerda para a direita. Pista 1, LNCaP; Pista 2, H26; Pista 3, DU-145; Pista 4, Próstata

Normal; Pista 5, BPH; Pista 6, Cancro da próstata; Pista 7, BPH; Pista 8, Normal; Pista 9, BPH; Pista 10, BPH; Pista 11, BPH; Pista 12, Normal; Pista 13, Normal; Pista 14, Cancro; Pista 15, Cancro; Pista 16, Cancro; Pista 17, Normal; Pista 18, Cancro; Pista 19, EM-20 Controlo; Pista 20, cDNA de PSM

Figura 13: Ponto isoeléctrico do antigénio PSM (não glicosilado)

Figura 14: 1—8 Estrutura Secundária do antigénio PSM

Figura 15: A — B A. Traçado da hidrofilicidade do antigénio PSM B. Previsão das extensões dos segmentos da membrana

Figura 16: 1-11 Homologia com as sequência dos receptores de transferina de galinha, de rato e humanos.

Figura 17 A — C: Detecção imuno-histoquímica da expressão do antigénio PSM em linhas de células da próstata. Os painéis na parte superior revelam, de um modo uniforme, um elevado nível de expressão em células de LNCaP; O painel do meio e o painel mais baixo são de, respectivamente, células DU-145 e PC-3 ambas negativas.

Figura 18: Autoradiograma do gel de proteína o qual revela produtos do PSM ligado entre si por transcrição/translação in vitro. 0 polipeptídeo PSM não glicosilado é observado a 84 kDa (pista 1) e a glicoproteína de PSM sintetizada após a adiçao de microssomas é observada a 100 kDa (pista 2)

Figura 19: Análise de Western Blot que detecta a expressão do PSM em células de PC-3 transfectadas que não expressem o PSM. As espécies de glicoproteínas PSM 100 kDa são claramente observadas em membranas de LNCaP (pista 1), em lisado de LNCaP em bruto (pista 2) e em células de PC-3 transfectadas com PSM (pista 4), mas não são detectadas em células de PC-3 nativas (pista 3).

Figura 20: Autoradiograma de gel de protecção de ribonuclease no ensaio de expressão do mRNA de PSM em tecidos humanos normais. A escalada de DNA 1 kb marcado por radiação (Gibco-BRL) é apresentada na pista 1. A sonda não digerida contém 400 nucleótidos (pista 2), a banda de PSM protegido esperada é de 350 nucleótidos, e controlo de tRNA é apresentado (pista 3) . É observado um sinal forte na próstata humana (pista 11), sendo também observados, embora muito fracos, sinais no cérebro de humano (pista 4) e na glândula salivar humana (pista 12).

Figura 21: Autoradiograma de gel de protecção de ribonuclease no ensaio de expressão do mRNA de PSM em tumores de LNCaP que cresceram em ratos nus, e em tecidos de próstata humana. A escalada do DNA 1 kb marcado com 32P é apresentada na pista 1. É apresentada a sonda não digerida com 298 nucleótidos (pista 2) e o controlo de tRNA é também apresentado (pista 3). A expressão do mRNA de PSM é claramente observável nas células de LNCaP (pista 4), nos tumores de LNCaP que foram feitos crescer de um modo ortotópico em ratos nus, com e sem matrigel (pistas 5 e 6), e nos tumores de LNCaP que foram implantados e feitos crescer de um modo subcutâneo, em ratos nus (pista 7) . A expressão do mRNA de PSM é também observada na próstata humana normal (pista 8), e num adenocarcinoma da próstata humana moderadamente diferenciado (pista 10). É observada uma expressão muito fraca numa amostra de tecido de próstata humana com hiperplasia benigna (pista 9).

Figura 22: Ensaio de protecção da ribonuclease para expressão de PSM em células de LNCaP tratadas com doses fisiológicas de vários esteróides, durante 24 horas. A escalada do DNA marcado com o 32P é apresentada na pista 1. É apresentada a sonda não digerida com 298 nucleótidos (pista 2), e é apresentado o controlo de tRNA (pista 3). A expressão do mRNA de PSM é mais expressiva em células de LNCaP não tratadas em meio de carvão limpo (pista 4) . Os proponentes observaram uma expressão de PSM significativamente diminuída nas células de LNCaP tratadas com DHT (pista 5), com testosterona (pista 6), com estradiol (pista 7) e com progesterona (pista 8), e uma fraca resposta com a dexametasona (pista 9).

Figura 23: Dados que ilustram resultados da presença de RNA e DNA de PSM e numa linha de células de Dunning transfectadas utilizando as técnicas de Southern e Western Blot.

Figura 24: A - B A Figura A diz respeito à capacidade das células transfectadas de citoquina de orientar células não modificadas. A administração foi dirigida ao flanco parental ou às células de próstata. Os resultados dizem respeito a considerações microambientais. A Figura B diz respeito à capacidade actual num local específico. O tumor foi implantado em células da próstata e foi tratado com células imunes em dois locais diferentes.

Figura 25: A - B Diz respeito à capacidade das citoquinas para inibir o crescimento de tumores primários. Aos animais foram administradas células de tumor parentais não modificadas e foram administradas, como uma vacina, células transfectadas. A seguinte prostatectomia do tumor dos roedores resultou num aumento da taxa de sobrevivência.

Figura 26: A amplificação feita por PCR com iniciadores aninhados melhorou o grau de detecção das células da próstata de cerca de uma célula prostática por 10,000 células de MCF-7 para uma razão melhor do que uma célula por um milhão de células de MCF-7, utilizando qualquer um dos PSA.

Figura 27: A amplificação feita por PCR com iniciadores aninhados melhorou o grau de detecção das células da próstata de cerca de uma célula prostática por 10,000 células de MCF-7 para uma razão melhor do que uma célula por um milhão de células de MCF-7, utilizando os iniciadores derivados do PSM.

Figura 28: Uma fotografia representativa de um gel revelado com brometo de etidio. As amostras presentes na pista A representam os produtos de PCR gerados a partir dos iniciadores exteriores e as amostras nas pistas marcadas como B são os produtos dos pares de iniciadores internos.

Figura 29: Autoradiografia do Southern Blot de PSM. A sensibilidade da análise de Southern Blot excedeu a da revelação com o brometo de etidio, tal como pode ser observado em várias amostras em que o produto exterior não é visível na figura 3 A a D, mas é detectável por Southern Blot tal como apresentado na figura 4.

Figura 30: Características dos 16 pacientes analisados no que diz respeito à sua fase clinica, ao tratamento, aos valores no soro de PSA e de PAP e aos resultados do ensaio.

Resumo da Patente

Esta patente disponibiliza uma molécula isolada de ácido nucleico de mamífero, a qual codifica um antigénio de membrana (PSM) específico da próstata de um mamífero. 0 ácido nucleico isolado de mamífero pode ser o DNA, o cDNA ou o RNA.

Esta patente também disponibiliza molécula de ácido nucleico seleccionado de entre o grupo que é constituído por: (a) um ácido nucleico que codifica um polipeptídeo antigénio de membrana específico da próstata humana que tem a sequência que é apresentada na SEQ ID N°: 2; (b) um ácido nucleico que tem a sequência que é apresentada na SEQ ID N°: 1 ou um fragmento da referida o qual codifica uma área antigénica para a qual pode ser gerado um anticorpo o qual é específico para um antigénio de membrana específico da próstata humana o qual apresenta a sequência apresentada na SEQ ID N°: 2; e (c) um ácido nucleico que apresenta pelo menos 15 nucleótidos consecutivos da sequência que é apresentada na SEQ ID N°: 1, ou da respectiva estirpe complementar. A molécula de ácido nucleico ou pode ser o DNA ou o RNA.

Esta patente disponibiliza um método para a detecção da expressão do antigénio de PSM o qual compreende o obter todo o mRNA da célula e provocar o contacto do mRNA assim obtido com uma molécula de ácido nucleico especifica de antigénio de PSM sob condições de formação de ligações cruzadas, determinando a presença de mRNA hibridizado com a sonda e, deste modo, detectando a expressão do antigénio de PSM pela célula. 0 antigénio de PSM em secções de tecido pode ser detectado de um modo semelhante.

Esta patente disponibiliza uma molécula de ácido nucleico isolada de antigénio de PSM a qual se encontra operacionalmente ligada a uma transcrição promotora do RNA. Esta patente disponibiliza ainda um vector que compreende uma molécula de ácido nucleico isolada de antigénio de PSM de mamífero.

Esta patente também disponibiliza um ácido nucleico o qual codifica um polipeptídeo antigénio de membrana específico da próstata humana o qual apresenta a sequência representada na SEQ ID N°: 2.

Esta patente disponibiliza ainda um vector o qual inclui a molécula de ácido nucleico aqui descrita.

Esta patente disponibiliza ainda um sistema de vector hospedeiro para a produção de um polipeptídeo o qual apresenta uma actividade biológica de um antigénio de PSM de mamífero, o qual compreende o vector que inclui a molécula de ácido nucleico de mamífero que codifica um antigénio de PSM de mamífero e um hospedeiro adequado. Um hospedeiro adequado para a expressão de um antigénio de PSM pode ser uma célula bacteriana, uma célula de insecto, ou uma célula de mamífero.

Para além do referido, esta patente disponibiliza uma célula de mamífero que compreende o vector aqui descrito.

Esta patente disponibiliza um método para determinar se um ligando, se pode ligar a um antigénio de PSM de mamífero, método este que inclui a promoção do contacto de uma célula de mamífero que apresenta uma molécula de DNA mamífero isolada que codifica um antigénio de PSM mamífero com o ligando sob condições que permitam a ligação de ligandos ao antigénio de PSM de mamífero, e a determinação se o ligando se liga a um antigénio de PSM de mamífero. Esta patente disponibiliza ainda ligandos que se ligam ao antigénio de PSM.

Esta patente disponibiliza um antigénio de PSM de mamífero purificado. Deste modo, esta patente disponibiliza um polipeptídeo com a sequência de um antigénio de membrana específico de próstata de humano que é apresentada na SEQ ID N°: 2.

Esta patente também disponibiliza um polipeptídeo codificado pela molécula de ácido nucleico de mamífero isolado o qual codifica um antigénio de PSM de mamífero.

De acordo com o referido, esta patente disponibiliza um polipeptídeo com a sequência do antigénio de membrana específico da próstata humana que é apresentada na SEQ ID N°: 2 ou uma área antigénica a qual é uma sequência de aminoácido hidrófila da próstata humana do referido antigénio de membrana específico, em que o polipeptídeo pode ser utilizado para gerar anticorpos os quais são específicos para o referido antigénio de membrana específico da próstata humana, desde que a área antigénica não seja constituída pelas sequências apresentadas na SEQ ID N°: 35. Esta patente disponibiliza ainda um método para identificar e purificar ligandos de antigénio de PSM de mamífero.

Esta patente disponibiliza ainda um método para produzir anticorpos policlonais e monoclonais utilizando polipeptídeos ou antigénios de PSM purificados os quais são codificados por uma molécula de ácido nucleico de mamífero isolado a qual codifica um antigénio de PSM de mamífero.

De acordo com o referido, esta patente disponibiliza um anticorpo monoclonal dirigido contra um antigénio de membrana específico da próstata humana, a sequência do referido antigénio está em seguida descrita na SEQ ID N°: 2 .

Esta patente disponibiliza anticorpos policlonais e monoclonais que muito provavelmente se dirigem, mas não estão limitados aos peptídeos Asp-Glu-Leu-Lys-Ala-Glu (SEQ ID N.° 35), ou Asn-Glu-Asp-Gly-Asn-Glu (SEQ ID N.° 36) ou Lys-Ser-Pro-Asp-Glu-Gly (SEQ ID N.° 37) do antigénio de PSM ou para o domínio da membrana exterior do antigénio de PSM ou para uma sequência de aminoácido hidrófila do antigénio de PSM. Os anticorpos desta patente são ainda caracterizados como sendo capazes de se ligar à superfície de uma célula de cancro da próstata.

Esta patente disponibiliza um agente terapêutico o qual compreende um anticorpo dirigido contra um antigénio de PSM de mamífero e um agente citotóxico que está conjugado ao referido anticorpo.

Esta patente também disponibiliza a utilização de, pelo menos, um anticorpo dirigido contra um antigénio de PSM para a preparação de uma composição de diagnóstico por imagiologia do cancro da próstata em pacientes humanos, na qual o referido anticorpo é capaz de se ligar à superfície celular de uma célula de cancro da próstata e é capaz de ser marcado com um agente de imagiologia sob condições que permitam formar um complexo entre o anticorpo monoclonal e o antigénio de PSM da superfície celular. Esta patente disponibiliza ainda uma composição a qual inclui uma quantidade detectável por imagiologia do anticorpo dirigido contra o antigénio de PSM e um suporte farmaceuticamente aceitável.

Esta patente disponibiliza ainda a utilização de múltiplos anticorpos dirigidos a diferentes epitopos de PSM para a preparação de uma composição de diagnóstico do cancro da próstata por imagiologia em pacientes humanos.

Esta patente disponibiliza também a utilização de um ácido nucleico marcado o qual apresenta, pelo menos, 15 nucleótidos consecutivos da sequência apresentada na SEQ ID N°: 1 para a preparação de uma composição de diagnóstico para detectar a do antigénio de PSM numa célula ou numa secção de tecido de uma amostra.

Esta patente disponibiliza também a utilização de um anticorpo monoclonal ou de uma composição tal como é aqui descrita, para a preparação de uma composição farmacêutica para tratar o cancro da próstata num paciente.

Esta patente disponibiliza um ensaio imunológico para medir a quantidade de antigénio de PSM numa amostra biológica tal como, por exemplo, no soro, o qual compreende os passos de a) promover o contacto da amostra biológica com, pelo menos, um anticorpo de PSM de modo a formar um complexo com o referido anticorpo e com o antigénio de PSM, e b) determinar a quantidade de antigénio de PSM na referida amostra biológica através da determinação do referido complexo.

Esta patente disponibiliza um método para purificar um antigénio de PSM de mamífero o qual compreende os passos de: a) Ligar o anticorpo dirigido contra o antigénio de PSM a uma matriz sólida; b) incubar o anticorpo ligado de a) com um lisado de célula que contenha um antigénio de PSM em condições que permitam a ligação do anticorpo e do antigénio de PSM; c) lavagem da matriz sólida ligada de modo a eliminar as impurezas e d) eluição do antigénio de PSM do anticorpo ligado.

Esta patente disponibiliza ainda mamíferos transgénicos, que não o Homem, os quais compreendem uma molécula de ácido nucleico isolada de um antigénio de PSM. Esta patente disponibiliza também um mamífero transgénico, que não o Homem, cujo genoma compreenda o DNA anti-mensageiro complementar do DNA que codifica um antigénio de PSM de mamífero o qual é colocado de modo a que seja transcrito para o mRNA anti-mensageiro complementar ao mRNA que codifica o antigénio de PSM e o qual faz ligações cruzadas com o mRNA que codifica o antigénio de PSM, reduzindo assim a sua translação.

Esta patente disponibiliza a utilização de uma molécula de DNA a qual codifica um antigénio de membrana específico da próstata operacionalmente ligado a um antigénio de membrana específico da próstata o qual se encontra operacionalmente ligado a um elemento regulador 5' para a preparação de uma composição farmacêutica para suprimir ou modular a capacidade metastática das células de tumor da próstata, o crescimento do tumor da próstata ou a eliminação das células de tumor da próstata, em que a referida composição farmacêutica é introduzida numa célula de tumor ou num paciente, de um modo tal que a expressão do antigénio de membrana específico da próstata fica sob o controlo do elemento regulador, suprimindo ou modulando assim a capacidade metastática das células de tumor de próstata, o crescimento do tumor da próstata ou a eliminação das células do tumor da próstata.

Esta patente disponibiliza a utilização de uma molécula de DNA que codifica um antigénio de membrana específico da próstata operacionalmente ligado a um elemento regulador 5' ligado a um DNA terapêutico para a preparação de uma composição farmacêutica para suprimir ou modular a capacidade metastática das células do tumor da próstata, o crescimento do tumor da próstata ou a eliminação de células do tumor da próstata, em que a referida composição farmacêutica é introduzida numa célula de tumor de um paciente, e deste modo suprime ou modula a capacidade metastática das células do tumor da próstata, o crescimento do tumor da próstata ou a eliminação das células do tumor da próstata.

Esta patente disponibiliza uma vacina terapêutica para prevenir o crescimento do tumor da próstata humano ou a estimulação de células do tumor da próstata num paciente. A vacina terapêutica e o suporte farmacêutico aceitável referidos podem ser administrados numa quantidade eficaz à célula da próstata, prevenindo deste modo o crescimento do tumor ou a estimulação das células de tumor no paciente.

Esta patente disponibiliza um método para detectar células de tumor hematogénicas micrometásticas num paciente, compreendendo (A) a realização de uma reacção em cadeia da polimerase (PCR) aninhada, em amostras de sangue, de medula óssea ou de nodos linfáticos do paciente através da utilização de iniciadores de antigénio de membrana especifico da próstata, e (B) verificação das micrometastases através de sequenciação de DNA e por análise Southern, detectando deste modo as células de tumor hematogénicas micrometásticas do paciente.

Esta patente disponibiliza a utilização de uma molécula de DNA a qual codifica um antigénio de membrana especifico da próstata operacionalmente ligado a um elemento regulador 5' para a preparação de uma composição farmacêutica para impedir a resposta mitogénica devido à transferina, em que a referida composição farmacêutica é introduzida numa célula de tumor, cuja expressão do gene se encontra directamente associado a um efeito patológico definido dentro de um organismo multicelular, impedindo assim a resposta mitogénica devido à transferina.

Descrição detalhada da Patente

Ao longo desta aplicação, as referências a nucleótidos específicos são feitas a nucleótidos presentes na estirpe de codificação do ácido nucleico. As seguintes abreviações padrão são utilizadas ao longo da especificação para indicar nucleótidos específicos: C = citosina A = adenosina T = timidina

G guanosina

Um "gene" diz respeito a uma molécula de ácido nucleico, cuja sequência inclui toda a informação necessária para a produção regulada normal de uma proteína em particular, incluindo a sequência de codificação estrutural, os promotores e os agentes melhorantes.

Esta patente disponibiliza um ácido nucleico isolado de mamífero, o qual codifica um antigénio (PSM) de membrana específico da próstata de mamífero.

Esta patente disponibiliza ainda uma molécula de DNA isolada de mamífero de uma molécula de ácido nucleico isolada de mamífero, a qual codifica um antigénio de membrana específico da próstata de mamífero. Esta patente também disponibiliza uma molécula de cDNA isolada de mamífero a qual codifica um antigénio de membrana específico da próstata de mamífero. Esta patente disponibiliza uma molécula de RNA isolada de mamífero a qual codifica um antigénio de membrana específico da próstata de mamífero.

Numa das configurações preferidas desta patente, a sequência nucleica isolada é de cDNA de seres humanos tal como é apresentado na sequência ID número 1. Esta sequência humana foi submetida ao GenBank (Los Álamos, Laboratório Nacional, Los Alamos, Novo México) com o Número de Registo, M99487 e a descrição como PSM, Homo sapiens, 2653 pares de bases.

Aqui também são descritos o DNA e o cDNA os quais codificam sucessões de aminoácidos que difiram das dos antigénio de PSM, mas que não deveriam produzir mudanças de fenótipo. Para além disso, aqui também são descritos os DNAs e cDNAs que sofrem hibridação dando origem ao DNA e ao cDNA da presente patente. Os métodos de hibridação são bem conhecidos para quem tenha experiência neste campo.

As moléculas de DNA da presente patente incluem também as moléculas de DNA que codificam os fragmentos de polipeptideos antigénicos, os quais diferem das formas que ocorrem naturalmente em termos da identidade ou do local de um ou mais dos resíduos de aminoácido (análogos de eliminação os quais contêm menos do que o número total dos resíduos especificados para a proteína, análogos de substituição nos quais um ou mais dos resíduos especificados são substituídos por outros resíduos e análogos de adição em que um ou mais resíduos de aminoácidos são acrescentados a uma parte terminal, ou do meio, dos polipeptideos) e os quais partilham algumas, ou todas, as propriedades das formas que ocorrem na natureza. Estas moléculas incluem: a incorporação de codões "preferidos" para a expressão feita em hospedeiros seleccionados de entre não mamíferos; a disponibilização de locais para divisão feita por enzimas de endonuclease de restrição; e a disponibilização de sequências de DNA iniciais, terminais ou intermediárias adicionais as quais facilitam a construção de vectores imediatamente expressos.

As moléculas de DNA aqui descritas e reivindicadas são úteis pela informação que elas disponibilizam relativamente à sequência de aminoácidos do polipeptídeo e como produtos para a síntese em grande escala do polipeptídeo através de uma grande variedade de técnicas recombinantes. A molécula é útil para gerar novos vectores de clonagem e de expressão, células hospedeiras eucariotas e procariotas transformadas e transfectadas, e novos e úteis métodos para o crescimento em cultura das referidas células hospedeiras capazes da expressão do polipeptídeo e de produtos relacionados.

Para além do referido, as moléculas de ácido nucleico isoladas de mamifero que codificam um antigénio de membrana especifico da próstata de mamifero são úteis para o desenvolvimento de sondas que servem para estudar a génese do tumor do cancro da próstata.

Esta patente disponibiliza também moléculas de ácido nucleico com, pelo menos, 15 nucleótidos capazes de especificamente formar ligações cruzadas com uma sequência de uma molécula de ácido nucleico que codifique o antigénio de membrana especifico da próstata.

Esta moléculas de ácido nucleico produzidas podem ser o DNA ou o RNA. Tal como é aqui utilizada, a frase "que especificamente forma ligações cruzadas" diz respeito à capacidade de uma molécula de ácido nucleico de reconhecer uma sequência de ácido nucleico complementar à sua própria e de formar segmentos de dupla hélice através de ligações de hidrogénio entre pares de bases complementares.

Esta molécula de ácido nucleico com, pelo menos, 15 nucleótidos capaz de especificamente formar ligações cruzadas com uma sequência de uma molécula de ácido nucleico que codifica o antigénio de membrana especifico da próstata, pode ser utilizada como uma sonda. A tecnologia das sondas de ácidos nucleicos é bem conhecida para quem tenha conhecimentos neste campo, que irá imediatamente reconhecer que as referidas sondas podem variar muito em comprimento e que podem ser marcadas com um rótulo facilmente detectável, tal como com um isótopo radioactivo ou com corante fluorescente, de modo a facilitar a detecção pela sonda. As moléculas da sonda de DNA podem ser produzidas através da inserção de uma molécula de DNA que codifique para o antigénio de PSM em vectores satisfatórios, tais como os plasmídeos ou os bacteriofagos, seguida de uma sua transformação em células bacterianas hospedeiras adequadas, e replicação nas células bacterianas hospedeiras transformadas obtendo-se as sondas de DNA, utilizando alguns métodos bem conhecidos neste campo.

Alternativamente, as sondas podem ser produzidas quimicamente a partir de sintetizadores de DNA.

As sondas de RNA podem ser geradas através da inserção de uma molécula de antigénio PSM a jusante de um promotor de bacteriof agos tal como ο T3, ο T7 ou o SP6. Podem ser produzidas grandes quantidades de sondas de RNA através da incubação de nucleótidos marcados com o fragmento de antigénio PSM linearizado no caso em que este contém um promotor a montante, na presença da polimerase de RNA adequada.

Esta patente disponibiliza também um molécula de ácido nucleico com, pelo menos, 15 nucleótidos capaz de, especificamente, formar ligações cruzadas com uma sequência de uma molécula de ácido nucleico a qual seja complementar à molécula de ácido nucleico de mamífero que codifica um antigénio de membrana específico da próstata de mamífero. Esta molécula pode ser uma molécula de DNA ou de RNA. A presente patente disponibiliza ainda um método para detectar a expressão de uma expressão de antigénio PSM de mamífero numa célula, método este que inclui a obtenção de todo o mRNA da célula, promoção do contacto do mRNA assim obtido com uma molécula de ácido nucleico marcada com, pelo menos, 15 nucleótidos capaz de especificamente formar ligações cruzadas com uma sequência da molécula de ácido nucleico que codifica um antigénio de PSM de mamífero sob condições que favoreçam as ligações cruzadas, determinando a presença de mRNA hibridizado à molécula e logo descobrindo a expressão do antigénio de membrana específico da próstata de mamífero na célula. As moléculas de ácido nucleico que foram sintetizadas acima podem ser utilizadas para detectar a expressão de um antigénio de PSM através da detecção da presença de mRNA que codifique para o antigénio de PSM. 0 mRNA total da célula pode ser isolado através de muitos procedimentos bem conhecidos para quem tenha uma experiência vulgar neste campo. As condições de hibridação das moléculas de ácido nucleico marcadas podem ser determinadas através de experimentação de rotina bem conhecida neste campo. A presença de mRNA com ligações cruzadas à sonda pode ser determinada por gel de electroforese ou através de outros métodos conhecidos neste campo. Através da medição da quantidade de híbrido obtido, pode ser determinada a expressão do antigénio de PSM feita pela célula. A marcação pode ser feita por radiação. Apenas como um exemplo, podem ser incorporados um ou mais nucleótidos radioactivos no ácido nucleico quando este é feito.

Numa configuração desta patente, os ácidos nucleicos são extraídos através de precipitação de células lisadas e o mRNA é isolado do extracto utilizando uma coluna oligo-dT a qual se liga às terminações de poli-A das moléculas de mRNA (13) . 0 mRNA é então exposto a uma sonda marcada radioactivamente numa membrana de nitrocelulose, e a sonda hibridiza-se às sequências de mRNA complementares, as quais ficam assim marcadas. A ligação pode ser detectada por autoradiografia de luminescência ou por contagem de cintilação. No entanto, são bem conhecidos outros métodos para executar estes passos, para quem tenha experiência neste campo, e a discussão acima feita é apenas um exemplo.

Esta patente ainda disponibiliza outro método para detectar a expressão de um antigénio de PSM em secções de tecido, o qual compreende o passo de promover o contacto das secções de tecido com uma molécula de ácido nucleico marcada com, pelo menos, 15 nucleótidos capaz de especificamente formar ligações cruzadas com uma sequência de moléculas de ácido nucleico que codifiquem um antigénio de PSM de mamífero sob condições que favoreçam a formação de ligações cruzadas, determinando assim a presença de mRNA que está ligado à molécula e deste modo detectando a expressão do antigénio de PSM de mamífero em secções de tecido. As sondas também são úteis para a hibridação in-situ ou para localizar tecidos os quais expressem este gene, ou para outros ensaios de hibridação para a presença deste gene ou do seu mRNA em vários tecidos biológicos. A hibridação in-situ utilizando uma molécula de ácido nucleico marcada é bem conhecida neste campo. De um modo simplificado, são incubadas secções de tecido com a molécula de ácido nucleico marcada de modo a permitir que a hibridação aconteça. A molécula irá levar um marcador útil para a detecção pois era já "marcada", a quantidade do híbrido irá ser determinada com base na detecção da quantidade do marcador e também deste modo será determinada a expressão do antigénio de PSM.

Esta patente disponibiliza ainda uma molécula de ácido nucleico do antigénio de PSM isolada operacionalmente ligada a um promotor de transcrição de RNA. A sequência do antigénio de PSM isolada pode ser ligada a sistemas de vectores. Vários vectores, incluindo os vectores de plasmideo, vectores de cosmideo, vectores de bacteriofago e outros vírus são bem conhecidos dos médicos com uma formação vulgar. Esta patente disponibiliza, adicionalmente, um vector que inclui a molécula de ácido nucleico isolada a qual codifica para o antigénio de PSM.

Como um exemplo para obter estes vectores, tanto o enxerto como o vector do DNA podem ser expostos a uma enzima de restrição de modo a criar terminações complementares em ambas as moléculas as quais podem formar um par de bases entre si e são então ligadas em conjunto com ligase de DNA. Alternativamente, os agentes ligantes podem ser ligados ao enxerto de DNA o qual corresponde a um local de restrição no vector do DNA, o qual é então digerido com a enzima de restrição a qual provoca uma quebra no referido local. Também estão disponíveis outros meios, os quais são conhecidos de qualquer médico com uma formação vulgar.

Numa das configurações, a sequência de PSM é clonada no local Not I/Sal I do pSPORT/vector (Gibco® - BRL) . Este plasmideo, o p55A-PSM, foi depositado no dia 14 de agosto de 1992 no seio da Colecção Americana de Culturas Tipo (ATCC), 12301 Parklawn Drive, Rockville, Maryland 20852, E.U.A. sob a alçada do Tratado de Budapeste para o Reconhecimento Internacional do Depósito de Microorganismos com a finalidade de Procedimento de Patente. Ao plasmideo p55A-PSM, foi atribuído o Número de Acesso ATCC 75294.

Esta patente disponibiliza ainda um sistema de vectores hospedeiro para a produção de um polipeptídeo o qual apresenta uma actividade biológica de antigénio de membrana especifico da próstata. Estes vectores podem ser transformados numa célula hospedeira adequada de modo a formar um sistema de vectores de células hospedeiras para a produção de um polipeptídeo o qual apresente uma actividade biológica de antigénio de PSM.

Os elementos reguladores necessários para a expressão incluem as sequências de promotor para ligar a polimerase de RNA e as sequências de iniciação de transcrição para a ligação ao ribossoma. Por exemplo, um vector de expressão bacteriano inclui um promotor tal como o promotor lac e para a iniciação de transcrição a sequência Shine-Dalgarno e o códão de iniciação o AUG (14) . De um modo semelhante, um vector de expressão eucariota inclui um promotor heterólogo ou homólogo para a polimerase II de RNA, um sinal de poliadenilação a jusante, o códão de iniciação AUG, e um códão de terminação para a separação do ribossoma. Os referidos vectores podem ser obtidos ou comercialmente ou podem ser construídos a partir das sequências descritas através de métodos bem conhecidos neste campo tais como, por exemplo, os métodos acima descritos para construir vectores em geral. Os vectores de expressão são úteis para produzir células que expressam o antigénio de PSM.

Esta patente disponibiliza ainda uma molécula de DNA ou cDNA isolada aqui já descrita acima, em que a célula hospedeira é seleccionada de entre o grupo que é constituído pelas células bacterianas (tais como a E. coli), células de leveduras, células de fungos, células de insectos e células de animais. As células de animais adequadas incluem, mas não estão limitadas a, células Vero, células HeLa, células Cos, células CV1 e várias células de mamífero primárias.

Esta patente disponibiliza adicionalmente um método de produzir um polipeptídeo que apresenta a actividade biológica do antigénio de membrana específico da próstata o qual compreende o crescimento de células hospedeiras de um sistema de vector o qual contém a sequência de antigénio de PSM sob condições adequadas que permitam a produção do polipeptídeo e a recuperação do polipeptídeo assim produzido.

Esta patente disponibiliza uma célula mamífero a qual compreende uma molécula de DNA que codifica um antigénio de PSM de mamífero, tal como uma célula mamífero que compreende um plasmídeo adaptado para a expressão numa célula de mamífero, a qual compreende uma molécula de DNA que codifica um antigénio de PSM de mamífero e os elementos reguladores necessários para a expressão do DNA na célula de mamífero localizados no DNA que codifica o antigénio de PSM de mamífero de um modo que permita a sua expressão.

Como hospedeiras, podem ser utilizadas várias células de mamífero, as quais incluem, mas não estão limitadas por, as células de fibroblasto de rato NIH3T3, as células CHO, as células HeLa, as células Ltk, as células Cos, etc. Podem ser introduzidos plasmídeos de expressão tais como os que foram acima descritos de modo a transfectar as células de mamífero por métodos conhecidos neste campo, tais como a precipitação com o fosfato de cálcio, a electroporação ou o DNA que codifica o antigénio de PSM de mamífero pode ser de outro modo introduzido em células de mamífero, tal como, por exemplo, através de microin jeccão, de modo a obter células de mamífero as quais compreendessem o DNA, tal como por exemplo o cDNA ou um plasmídeo, as quais codificassem um antigénio de PSM de mamífero.

Esta patente disponibiliza um método para determinar se um ligando se pode ligar um antigénio de membrana específico da próstata de mamífero, método este que inclui a promoção do contacto entre uma célula de mamífero a qual inclui uma molécula de DNA isolada, codificando um antigénio de membrana específico da próstata de mamífero com o ligando sob condições que permitam a ligação dos ligandos ao antigénio de membrana específico da próstata de mamífero e determinando assim se o ligando se liga a um antigénio de membrana específico da próstata de mamífero.

Aqui também são disponibilizados ligandos que estão ligados ao antigénio de PSM de mamífero.

Para além do referido, também é aqui disponibilizado um agente terapêutico o qual compreende um ligando identificado pelo método acima descrito e um agente citotóxico conjugado ao referido. 0 agente citotóxico pode ser ou um isótopo radioactivo ou uma toxina. Os exemplos dos isótopos radioactivos ou de toxinas são bem conhecidos mesmo para quem não tenha uma grande experiência. Os exemplos de isótopo radioactivos ou toxinas, são bem conhecidas para quem tenha conhecimentos neste campo.

Os suportes farmaceuticamente aceitáveis são bem conhecidos para quem tenha conhecimentos neste campo. Como um exemplo, um tal referido suporte farmaceuticamente aceitável pode ser o soro fisiológico.

Também disponibilizado pela presente patente é um antigénio de PSM de mamífero purificado. Quando é aqui utilizado, a designação "antigénio de membrana purificado específico da próstata" irá designar um antigénio, ou proteína, de membrana específico da próstata isolado que ocorre naturalmente (purificado a partir do existente na natureza ou produzido de um modo tal que as conformações primária, secundária e terciária, e modificações pós-translacionais são idênticas às do material que ocorre na natureza) bem como também aos polipeptídeos que não existem na natureza e que apresentam uma conformação estrutural primária (ou seja, a sequência contínua de resíduos de aminoácido). Os referidos polipeptídeos incluem os seus derivados e análogos.

Esta patente disponibiliza ainda um polipeptídeo codificado pela sequência de ácidos nucleicos de mamífero isolados do antigénio de PSM.

Acredita-se que possam existir ligandos naturais que interajam com o antigénio de PSM. Esta patente disponibiliza um método para identificar os referidos ligandos naturais ou outros ligandos que se podem ligar ao antigénio de PSM. Um método para identificar o referido ligando compreende os passos de a) ligar o antigénio de PSM de mamífero purificado a uma matriz sólida, b) incubar a proteína de PSM de mamífero purificada ligada com os potenciais ligandos sob condições que permitam a ligação de ligandos e do antigénio de PSM purificado; c) lavar o ligando e o complexo de antigénio PSM de mamífero purificado formado em b) de modo a eliminar as ligações não específicas e as impurezas e finalmente d) eluir o ligando do antigénio de PSM de mamífero purificado já ligado. As técnicas de ligar proteínas a uma matriz sólida são bem conhecidas neste campo. Os potenciais ligandos podem ser deduzidos a partir da estrutura de PSM de mamífero ou através de outras experiências empíricas conhecidas de médicos com uma qualificação vulgar. As condições para se estabelecer a ligação podem também ser facilmente determinadas e os protocolos para realizar a referida experimentação foram já à muito bem documentados (15) . 0 complexo de antigénio de PSM - ligando irá ser lavado. Finalmente, o ligando que se encontra ligado irá ser eluído e caracterizado. As técnicas de caracterização de ligandos padrão são bem conhecidas neste campo. 0 anterior método pode também ser utilizado para purificar ligandos provenientes de qualquer fonte biológica. Para a purificação de ligandos naturais na célula, irão ser utilizados lisados de células, soro ou outras amostras biológicas para serem incubados com o antigénio de PSM de mamífero ligado a uma matriz. Os ligandos naturais específicos serão então identificados e serão purificados tal como foi acima descrito.

Com a informação da sequência de proteína, as áreas antigénicas podem ser identificadas e podem ser gerados anticorpos dirigidos contra estas áreas e tendo como alvo o cancro da próstata para conseguir identificar o cancro por imagiologia ou para conseguir terapias.

Esta patente disponibiliza um anticorpo dirigido contra a sequência de aminoácidos de um antigénio de PSM de mamífero.

Esta patente disponibiliza um método para seleccionar as regiões específicas no antigénio de PSM de modo a gerar anticorpos. A sequência da proteína pode ser determinada a partir da sequência de DNA do PSM. As sequências de aminoácidos podem ser analisadas por métodos bem conhecidos de quem tenha experiência neste campo de modo a determinar se estas produzem regiões hidrofóbicas ou hidrófilas nas proteínas que são por elas construídas. No caso das proteínas da membrana de células, as regiões hidrofóbicas são bem conhecidas como fazendo parte da proteína que é inserida na bicamada lipídica da membrana da célula, enquanto que as regiões hidrófilas ficam situadas na superfície da célula, num ambiente aquoso. Normalmente, as regiões hidrófilas irão ser mais imunogénicas do que as regiões hidrofóbicas. Deste modo, as sequências de aminoácido hidrófilas podem ser seleccionadas e utilizadas para gerar anticorpos específicos para o antigénio de PSM de mamífero. Dando um exemplo, as sequências hidrófilas do antigénio de PSM humano apresentadas no traçado de hidrofilicidade da Figura 16 podem ser facilmente seleccionadas. Os peptídeos seleccionados podem ser preparados utilizando aparelhos comercialmente disponíveis. Como alternativa, o DNA, tal como um cDNA ou um fragmento do referido, pode ser clonado e pode ser expresso e o polipeptídeo resultante pode ser recuperado e utilizado como um imunogénio.

Os anticorpos policlonais contra estes peptídeos podem ser produzidos através da imunização de animais utilizando os peptídeos seleccionados. Os anticorpos monoclonais são preparados utilizando a tecnologia de hibridoma através da fusão de linfócitos B produtores de anticorpos de animais imunizados com células de mieloma e seleccionando a linha de células de hibridoma resultante que produz o anticorpo desejado. Alternativamente, os anticorpos monoclonais podem ser produzidos através de técnicas in vitro bem conhecidas para quem apresente alguma experiência neste campo. Estes anticorpos são úteis para detectar a expressão do antigénio de PSM de mamífero em animais vivos, em humanos, ou em tecidos biológicos ou fluidos isolados de animais ou de seres humanos.

Numa das configurações, são seleccionados os peptídeos Asp-Glu-Leu-Lys-Ala-Glu (SEQ ID N.° 35), Asn-Glu-Asp-Gly-Asn-Glu (SEQ ID N.° 36) e Lys-Ser-Pro-Asp-Glu-Gly (SEQ ID N.° 37) de antigénio de PSM humano.

Esta patente disponibiliza ainda anticorpos policlonais e monoclonais contra os peptídeos Asp-Glu-Leu-Lys-Ala-Glu (SEQ ID N.° 35), Asn-Glu-Asp-Gly-Asn-Glu (SEQ ID N.° 36) e Lys-Ser-Pro-Asp-Glu-Gly (SEQ ID N.° 37).

Esta patente disponibiliza um agente terapêutico que inclui anticorpos ou ligandos dirigidos contra o antigénio de PSM e um agente citotóxico a eles conjugado ou enzimas ligados a anticorpos que activam o percursor do medicamento para matar o tumor. 0 agente citotóxico pode ser um isótopo radioactivo ou uma toxina.

Esta patente disponibiliza uma utilização de um anticorpo monoclonal dirigido contra o peptídeo do antigénio de PSM de mamífero para a preparação de uma composição farmacêutica que se destina a ser administrada, para fins imagiológicos, em pacientes humanos com cancro da próstata, em que o referido anticorpo monoclonal é capaz de se ligar à superfície das células de cancro da próstata e o qual pode ser marcado com um agente de imagiologia sob condições que permitam a formação de um complexo entre o anticorpo monoclonal e um antigénio de membrana especifico da próstata da superfície celular. 0 agente de imagiologia é um isótopo radioactivo tal como o índio 111. Esta patente disponibiliza ainda um agente de imagiologia específico para o cancro da próstata, o qual compreende o anticorpo dirigido contra o antigénio de PSM e um isótopo radioactivo a ele ligado.

Esta patente também disponibiliza uma composição a qual compreende uma quantidade eficaz para a imagiologia do anticorpo dirigido contra o antigénio de PSM e um suporte farmaceuticamente aceitável. Os métodos para determinar as quantidades eficazes para a imagiologia são bem conhecidos de um médico qualificado. Um dos métodos envolve uma titulação utilizando várias quantidades diferentes do anticorpo.

Esta patente disponibiliza ainda um ensaio imunológico para medir a quantidade do antigénio de membrana específico da próstata numa amostra biológica, o qual compreende os passos de a) promover o contacto da amostra biológica com, pelo menos, um anticorpo dirigido contra o antigénio de PSM de modo a formar um complexo com o referido anticorpo e o antigénio de membrana específico da próstata, e b) medindo a quantidade do antigénio de membrana específico da próstata na referida amostra biológica para medir a quantidade do referido complexo. Um exemplo de uma amostra biológica é uma amostra de soro.

Esta patente disponibiliza um método para purificar um antigénio de membrana específico da próstata de mamífero, o qual compreende os passos de a) ligar o anticorpo dirigido contra o antigénio de PSM a uma matriz sólida; b) incubar o anticorpo imobilizado de a) com um lisado que contenha um antigénio de membrana especifico da próstata sob condições tais que o anticorpo e a membrana especifica da próstata se possam ligar; c) lavar a matriz sólida de modo a eliminar as impurezas e d) eluir o antigénio de membrana especifico da próstata do anticorpo que está imobilizado.

Esta patente disponibiliza também um mamífero transgénico, que não o Homem, o qual inclui a molécula de ácido nucleico isolada que codifica um antigénio de PSM de mamífero. Esta patente disponibiliza um mamífero transgénico, que não o Homem, cujo genoma inclui p DNA anti-mensageiro complementar ao DNA que codifica um antigénio de membrana específico da próstata de mamífero, posicionado de um modo tal que seja transcrito no mRNA anti-mensageiro complementar ao mRNA que codifica o antigénio de membrana específico da próstata e o qual sofre hibridização com o mRNA que codifica o antigénio específico da próstata, e que deste modo reduz sua translação.

Os animais que são sistemas modelo, os quais elucidam os papéis fisiológicos e de comportamento do antigénio de PSM de mamífero, são produzidos criando animais transgénicos nos quais a expressão do antigénio de PSM ou é aumentada ou é diminuída, ou a sequência de aminoácidos do antigénio de PSM expresso é alterada, utilizando uma grande variedade de técnicas. Os exemplos destas técnicas incluem, mas não estão limitados a: 1) Inserção de versões normais ou mutantes do DNA que codifica um antigénio de PSM de mamífero, através de micro-injecção, electroporação, transfecção retroviral ou outras técnicas que serão bem conhecidas para quem tenha experiência neste campo, em embriões não humanos fertilizados apropriados para produzir um animal transgénico, que não o homem (16) ou 2) Recombinação homóloga (17) de versões mutante ou normal, de humanos ou de animais, destes genes com o local do gene nativo em animais transgénicos de modo a alterar a regulação da expressão ou da estrutura destas sequências de antigénio de PSM. A técnica de recombinação homóloga é bem conhecida neste campo. Substitui o gene nativo com o gene inserido e é, deste modo, útil para produzir um animal que não pode expressar o antigénio de PSM nativo mas expressa, por exemplo, uma inserção de antigénio de PSM mutante a qual substituiu o antigénio de PSM nativo no genoma do animal através de recombinação, o que resulta na menor expressão do transportador. A micro-injecção acrescenta genes ao genoma, mas não os remove, e é, deste modo, útil para produzir um animal que expressa seus próprio antigénios de PSM bem como os adicionados, o que resulta numa sobre-expressão dos antigénios de PSM.

Um dos meios disponível para produzir um animal transgénico que não o ser humano, tal como, por exemplo, um rato é o seguinte: são acasalados ratos femininos, e os ovos fertilizados resultantes sao dissecados fora do seu oviductos. Os ovos são armazenados num meio apropriado tal como o méio de M2 (16) . 0 DNA ou o cDNA que codificam um antigénio de PSM de mamífero são purificados a partir de um vector através de métodos bem conhecidos neste campo. Os promotores passíveis de indução podem ser fundidos com a região de codificação do DNA de modo a disponibilizar meios experimentais para regular a expressão do transgene. Alternativa ou adicionalmente, elementos reguladores específicos do tecido podem ser fundidos com a região de codificação de modo a permitir uma expressão do transgene especifica do tecido. 0 DNA, numa solução adequadamente tamponada, pode ser colocado numa agulha de micro-injecção (a qual pode ser feita de tubos capilares utilizando uma bomba de pipetas) e o ovo a ser injectado é colocado num declive de uma depressão. A agulha é inserida no pronúcleo do ovo e a solução de DNA é injectada. 0 ovo injectado é então transferido para o oviducto de um rato pseudo-grávido (um rato fêmea estimulado pelas hormonas apropriadas para manter uma gravidez mas que não está realmente grávido), onde prossegue para o útero, se implanta e se desenvolve até ao final. Tal como foi acima referido, a micro-injecção não é o único método para inserir o DNA na célula de ovo e apenas foi aqui mencionada com o fim de servir de exemplo.

Outra utilização da sequência de antigénio de PSM é isolar o gene, ou genes, homólogos em diferentes mamíferos. 0 gene ou genes podem ser isolados por um varrimento com baixa severidade tanto do cDNA como das bibliotecas genómicas de diferentes mamíferos utilizando sondas de sequências de PSM. Os clones identificados como positivos irão ser analisados mais em pormenor através de técnicas de sequenciação de DNA que são bem conhecidas para quem tenha alguma experiência neste campo. Por exemplo, a descoberta de membros da família da proteína serina cinase por uma sondagem de homologia (18).

Esta patente disponibiliza a utilização de uma molécula de DNA a qual codifica um antigénio de membrana específico da próstata operacionalmente ligado a um elemento regulador 5 ' para a preparação de uma composição farmacêutica para suprimir ou modular a capacidade metastática das células de tumor da próstata, o crescimento do tumor da próstata ou a eliminação de células do tumor da próstata, em que a referida composição farmacêutica é introduzida nas células de um modo tal que a expressão do antigénio de membrana específico da próstata se encontra sob o controlo do elemento regulador, deste modo suprimindo ou modulando a capacidade metastática das células do tumor da próstata, o crescimento do tumor da próstata ou a eliminação de células do tumor da próstata. 0 paciente pode ser um mamífero ou, mais especif icamente, um ser humano. Numa das configurações, a molécula de DNA que codifica o antigénio de membrana específico da próstata operacionalmente ligado a um elemento regulador 5 ' forma parte de um vector de transferência o qual é inserido numa célula ou num organismo. Adicionalmente, o vector é capaz de replicar e expressar o antigénio de membrana especifico da próstata. A molécula de DNA que codifica o antigénio de membrana específico da próstata pode ser integrada no genoma de uma célula eucariota ou procariota ou numa célula hospedeira a qual contenha e, ou, expresse, um antigénio de membrana específico da próstata.

Adicionalmente, a molécula de DNA que codifica o antigénio de membrana específico da próstata pode ser introduzida através de um veículo de entrega bacteriano, virai, fungai, animal, ou lipossomal. Outros meios estão também disponíveis e são conhecidos de um médico com uma formação vulgar.

Adicionalmente, a molécula de DNA que codifica um antigénio de membrana específico da próstata operacionalmente ligado a um promotor ou agente melhorante. Têm sido descritos vários vectores virais os quais incluíram os feitos a partir de vários promotores e outros elementos reguladores derivados de fontes virais. Os promotores consistem em pequenos conjuntos de sequências de ácidos nucleicos que interagem especificamente com as proteínas celulares que estão envolvidas na transcrição. A combinação de diferentes sequências de reconhecimento e a concentração celular dos factores de transcrição de cognato determina a eficiência com que um gene é transcrito para um tipo de célula em particular.

Os exemplos de promotores adequados compreendem um promotor virai. Os promotores virais incluem: um promotor de adenovírus, um promotor do vírus de símio 40 (SV40), um promotor do citomegalovírus (CMV), um promotor de um vírus de tumor mamário de rato (MMTV) , um promotor do vírus de leucemia de murino Malony, um promotor de um vírus de sarcoma de murino e um promotor de um vírus de sarcoma de Rous .

Para além dos referidos, outro promotor adequado é um promotor de choques de calor. Adicionalmente, um promotor adequado é um promotor de bacteriofagos. Exemplos de promotores de bacteriofagos adequados incluem mas não estão limitados a, um promotor de T7, um promotor de T3, um promotor de SP6, um promotor de lambda e um promotor de baculovírus.

Também adequados como promotores são os promotores de células animais, tais como um promotor de interferões, um incitador de metalotioneína e um promotor de imunoglobulina. Um promotor fungai também é um promotor adequado. Os exemplos de promotores fungais compreedem mas não estão limitados a, um promotor de ADC1, um promotor de ARG, um promotor de ADH, um promotor de CYC1, um promotor de CUP, um promotor de EN01, uma promotor de GAL, um promotor de PHO, um promotor de PGK, um promotor de GAPDH e um promotor do factor do tipo de acasalamento. Adicionalmente, os promotores de células de plantas e os promotores de células de insectos são também adequados para os métodos aqui descritos.

Esta patente disponibiliza uma utilização de uma molécula de DNA a qual codifica um antigénio de membrana especifico da próstata operacionalmente ligado a um elemento regulador 5' o qual se encontra ligado com um DNA terapêutico que se destina à preparação de uma composição farmacêutica para suprimir ou para modular a capacidade metastática das células do tumor da próstata, do crescimento do tumor da próstata ou da eliminação de células do tumor da próstata, em que a referida composição farmacêutica é introduzida numa célula de tumor de um paciente, suprimindo assim ou modulando a capacidade metastática de células do tumor da próstata, do crescimento do tumor da próstata ou da eliminação de células do tumor da próstata. 0 assunto pode ser um mamífero ou mais especificamente um humano.

Adicionalemente, o DNA terapêutico, o qual é ligado à molécula de DNA que codifica um antigénio de membrana específico da próstata operacionalmente ligado a um elemento regulador 5' numa célula de tumor pode codificar para uma citoquina, para um antigénio virai, ou para um percursor do medicamento que activa a enzima. Outros meios também estão disponíveis e conhecidos a um médico qualificado ordinário. A citoquinas utilizadas podem ser interleuquina-12, interferão, a interleuquina-2, beta ou gama um macrofagócito granulocítico, ou outros factores de imunidade.

Para além do referido, esta patente disponibiliza uma célula do tumor da próstata, a qual compreende uma molécula de DNA isolada de um ácido nucleico de mamífero a qual codifica um antigénio de membrana específico da próstata de mamífero, sob o controlo de um antigénio de membrana específico da próstata operacionalmente ligados a um elemento regulador 5 ' .

Tal como é aqui utilizado, as moléculas de DNA incluem o DNA complementar (cDNA), o DNA sintético, e o DNA genómico.

Esta patente disponibiliza uma vacina terapêutica para impedir o crescimento do tumor da próstata humano ou a estimulação das células do tumor da próstata num paciente. A referida vacina terapêutica e um suporte farmaceuticamente aceitável, podem ser administrados numa quantidade eficaz à célula de próstata, o que prevenir o crescimento de tumor ou excitação de células de tumor assim nos pacientes. Outros meios estão também disponíveis e são conhecidos por um médico que possua qualificações vulgares.

Esta patente disponibiliza um método de detectar as células de tumor hematogénicas e micrometásticas um paciente, compreendendo os passos (A) executar a reacção em cadeia da polimerase aninhado encadeiam reacção (PCR) em sangue, em medula óssea ou em amostras de nódos de linfa do paciente, através da utilização dos agentes iniciadores do antigénio de membrana específico a próstata, e (B) verificar as micrometastases através de uma sequenciação com o DNA e com a análise Shouthern, detectando assim as células do paciente. 0 assunto pode ser um mamífero ou o mais especificamente um humano. A célula de tumor micrometastática pode ser um cancro da próstata e os iniciadores de DNA podem ser derivados de um antigénio da próstata. Adicionalmente, o paciente pode ser administrado, em simultâneo, com uma quantidade eficaz de hormonas, de modo a aumentar a expressão do antigénio de membrana específico da próstata.

Esta patente disponibiliza uma utilização de uma molécula de DNA, a qual codifica um antigénio de membrana específico da próstata operacionalmente ligado a um elemento regulador para a preparação de uma composição farmacêutica por impedir a resposta mitogénica devido à transferina, em que a referida composição farmacêutica é introduzida numa célula de tumor, e cujo gene de expressão seja directamente associado com um efeito patológico definido dentro de um organismo de multicelular, o que assim vai impedir a resposta mitogénica devido à transferina. A célula de tumor pode ser uma célula da próstata.

Detalhes experimentais Primeira Série de Experiências

Materiais de Experiências e Métodos A aproximação utilizada para a clonagem do gene envolveu a purificação do antigénio em grandes quantidades através da imunoprecipitação, e a micro-sequenciação de vários peptídeos internos destinados a serem utilizados para a síntese de iniciadores de oligonucleótidos degenerados para serem subsequentemente utilizados na reacção em cadeia da polimerase (19, 20) . Um cDNA parcial foi ampliado como um produto de PCR e este foi utilizado como sonda homóloga para clonar a molécula de cDNA de comprimento completo de uma biblioteca de plasmídeos de cDNA de uma linha de células LNCaP (Carcinoma do Nodo Linfático da Próstata) (8). As experiências iniciais revelaram aos proponentes que o anticorpo CYT-356 (9) não era capaz de detectar o antigénio produzido nas bactérias dado que o epitopo era a parte glicosilada do antigénio de PSM, e este facto tornava necessária a nossa mais difícil aproximação, contudo mais elaborada.

Análise Western do Antigénio de PSM

As proteínas de membrana foram isoladas das células através de lise hipotónica seguida por centrifugação ao longo de um gradiente de densidade de sacarose (21). Foi realizada a electrof orese de 10 a 20 μg das proteínas de membrana LNCaP, DU-145, e PC-3 através de um gel de resolução de SDS - PAGE a 10 % e com um gel de concentração de 4 % e de 9 a 10 milliamps durante de 16 a 18 horas. As proteínas foram electro-reveladas sobre membranas de PVDF (Millipore® Corp.) em tampão de transferência (base 48 mM Tris, Glicina a 39 mM, Metanol a 20%) a 25 volts durante a noite a 4 °C. As membranas foram bloqueadas em TSB (NaCl 0,15 M, base 0,01M Tris, BSAa 5%) durante 30 minutos à temperatura ambiente seguida por incubação com de 10 a 15 μρ/ηιΐ de anticorpo monoclonal CYT-356 (Cytogen Corp.) durante 2 horas. As membranas foram então incubadas com de 10 a 15 μρ/ιηΐ de imunoglobulina de anti-rato de coelho (Accurate Scientific) durante 1 hora à temperatura ambiente seguida por incubação com 125I-Proteína A (Amersham®) a lxlO6 cpm/ml à temperatura ambiente. As membranas foram então lavadas e autoradiografadas durante de 12 a 24 horas a -70 °C (Figura

Análise Imuno-histoquímica da Expressão do Antigénio de PSM 0 método de avidina-biotina para a detecção imuno-histoquímica foi utilizado para analisar tanto as secções de tecido humanas e como as linhas de células quanto à expressão do Antigénio PSM (22). As secções de tecido da próstata cortadas no criostato (com uma espessura de 4 a 6 μιη) foram fixas em metanol/acetona durante 10 minutos. Foram feitas citospinas de células em slides de vidro utilizando 50 000 células/lOC^l/slide. As amostras foram tratadas com peróxido de hidrogénio a 1 % em PBS durante de 10 a 15 minutos de modo a remover qualquer actividade de peroxidase endógena. As secções de tecido foram lavadas várias vezes com PBS, e foram então incubadas com o soro supressor apropriado durante 20 minutos. O soro supressor foi então eliminado por escoamento e as secções ou células foram então incubadas com o anticorpo monoclonal CYT-356 diluído durante 1 hora. As amostras foram então lavadas com PBS e foram consecutivamente incubadas com os anticorpos secundários (imunoglobulinas de cavalo ou de cabra, diluição de 1:200 durante 30 minutos), e com complexos de avidina-biotina (diluição de 1:25 durante 30 minutos). Foi utilizado o DAB como o cromogénio, seguido por uma contra-revelação feita com hematoxilina e foram suspensos. As secções congeladas das amostras de próstata e os duplicados de citospinas de células foram utilizadas como controlos para cada uma das experiências. Como controlo positivo, foi utilizado o anticorpo monoclonal da anti-citoqueratina CAM 5,2, seguindo o mesmo procedimento do que foi acima descrito. As secções de tecido foram, pelos proponentes, consideradas como expressando o antigénio de PSM se, pelo menos, 5 % das células demonstrarem uma reactividade imunitária. 0 sistema de avaliação desta patente é o seguinte: 1 = <5%; 2 = 5-19%; 3 = 20-75%; e 4 = >75% de células positivas. A homogeneidade contra a heterogeneidade foi considerada através da avaliação das células positivas e negativas em de 3 a 5 campos microscópicos com elevado poder de iluminação (400x), através do registo da percentagem de células positivas entre de 100 a 500 células. A intensidade da revelação imunitária é classificada numa escala de 1+ a 4+ onde 1+ representa uma fraca, 2 a 3+ representa uma moderada e 4+ representa uma intensa revelação imunitária quando comparada com os controlos positivos.

Imunoprecipitação do Antigénio de PSM Células de LNCaP 80 % confluência em caixas de petri lOOmm, foram colocadas sem alimentação em meio RPMI sem metionina durante 2 horas depois das quais foi adicionada a 35S-Metionina a 100 μϋί/ιηΐ e as células foram cultivadas durante mais de 16 a 18 horas. As células foram então lavadas e lisadas pela adição de lml de tampão de lise (Triton X-100 a 1%, Hepes de pH 7,5 a 50 mM, glicerol a 10%, MgCl2 150 mM, PMSF a 1 mM e EGTA a 1 mM) com incubação durante 20 minutos a 4 °C. Os lisados foram previamente tornados límpidos através da mistura com as células de

Pansorbin® (Calbiochem®) durante 90 minutos a 4 °C. Os lisados de células foram então misturados com esferas de Proteína A Sepharose® CL - 4B (Pharmacia®) previamente ligadas ao anticorpo CYT-356 (Cytogen Corp.) e ao anticorpo RAM (Accurate Scientific) durante de 3 a 4 horas a 4 °C. Em cada placa de Petri foram utilizadas 12 μρ de anticorpo por cada 3 mg de esferas. As esferas foram então lavadas com a solução tampão HNTG (Hepes pH 7,5 a 20 mM, NaCl a 150 mM, Triton X-100 a 0,1%, glicerol a 10% e ortovanadato de sódio a 2 mM) , foram novamente suspensas em solução tampão de carga de amostras a qual contém β-mercaptoetanol, desnaturado a 95 °C durante de 5 a 10 minutos e foram passadas durante a noite por um gel de SDS-PAGE a 10% e com um gel de concentração de 4% a 10 milliamps. Os géis foram revelados com Coomassie Blue, descolorados com ácido acético/metanol, e foram secos utilizando um secador de vácuo a 60 °C. Os géis foram então autoradiograf ados durante de 16 a 24 horas a -70 °C (Figura 2 A-D).

Imunoprecipitação em Grande Escala e Sequenciação do Peptídeo O procedimento descrito acima para a imunoprecipitação foi repetido com 8 caixas de petri confluência que continha cerca de 6 x 107 células de LNCaP. O produto da imunoprecipitação foi recolhido em conjunto e carregado em duas pistas de um gel de SDS - PAGE a 10% e sofreu electroforese a de 9 a 10 milliamps durante 16 horas. As proteínas foram electro-reveladas sobre membranas BA-85 de Nitrocelulose (Schleicher e Schuell®) durante 2 horas a 75 volts a 4 °C em solução tampão de transferência. As membranas foram reveladas com Ponceau Red de modo a visualizar as proteínas e a faixa de proteínas a lOOkD foi cortada, foi solubilizada e foi digerida proteoliticamente com tripsina. Foi então realizada uma HPLC na amostra digerida num aparelho Applied Biosystems Modelo 171C e foram seleccionados os picos de peptídeos claramente dominantes, os quais foram sequenciados por degradação de Edman modificada num Microsequenciador de Proteínas/Peptídeos da Applied Biosystems Modelo 477A pós-líquido (23). Os dados da sequenciação de todos os peptídeos são incluídos dentro deste documento. Os proponentes tentaram determinar a sequência do terminal amino do antigénio de PSM através de um método semelhante, o qual envolveu a purificação do antigénio através de imunoprecipitação e a transferência por "blot" eléctrico para uma membrana de PVDF (Millipore®) . A proteína foi analisada num aparelho Sequenciador de Proteínas/Peptídeos Applied Biosystems Modelo 477A e o terminal amino foi detectado como estando bloqueado e logo nenhum dado da sequência pode ser obtido através desta técnica.

Sequências de Peptídeo do Antigénio de PSM: 2T17 #5 SLYES (W) TK (SEQ ID N.° 3) 2T22 #9 (S)YPDGXNLPGG(g)VQR (SEQ ID N.° 4) 2T26 #3 FYDPMFK (SEQ ID N.° 5) 2T27 #4 IYNVIGTL_(K) (SEQ ID N.° 6) 2T34 #6 FLYXXTQIPHLAGTEQNFQLAK (SEQ ID N.° 7) 2T35 #2 G/PVILYSDPADYFAPD/GVK (SEQ ID N.° 8, 9) 2T38 #1 AFIDPLGLPDRPFYR (SEQ ID N.° 10) 2T46 #8 YAGESFPGIYDALFDIESK (SEQ ID N.° 11) 2T47 #7 TILFAS(W)DAEEFGXX(q)STE(E)A(E) .. (SEQ ID N.° 12)

Notas: ο X significa que nenhum resíduo pode ser identificado a na referida posição.

As maiúsculas dizem respeito a uma identificação mas com um grau de confiança mais baixo.

As (minúsculas) significam que o resíduo está presente mas a níveis muito baixos. ... indica que a sequência continua mas está abaixo do limite de detecção.

Todas estas sequências de peptídeo foram verificados como sendo únicas após uma busca muito completa de homologia dentro da base de dados translacionados em computador do Genbank. PCR degenerado

Foram sintetizados oligonucleótidos iniciadores degenerados não fosforilados em 5' mensageiro e anti-mensageiro, com de 17 a 20 nucleótidos de comprimento o que corresponde a partes dos anteriores peptideos, num Sintetizador de DNA da Applied Biosystems Modelo 394A. Estes iniciadores têm degenerações de 32 a 144. Os iniciadores utilizados são apresentados abaixo. Os aminoácidos sublinhados nos peptideos representam os resíduos utilizados para escolher os iniciadores.

Peptídeo 3: FYDPMFK (SEQ ID N.° 5)

Iniciador PSM "A" TT(C ou T) - TA(C ou T) - GA(C ou T) -OCX - ATG - TT (SEQ ID N° 13)

Iniciador PSM "B" AAC - ATX - GG (A ou G) - TC (A ou G) -TA(A ou G) - AA (SEQ ID N° 14) O iniciador A é um iniciador mensageiro e B é anti- mensageiro. A degeneração é de multiplicidade 32.

Peptídeo 4: IYNVIGTL (K) (SEQ ID N° 6)

Iniciador PSM "C" AT(T ou C ou A) - TA(T ou C) - AA(T ou C) GTX - AT(T ou C ou A) - GG (SEQ ID N° 15)

Iniciador PSM "D" CC (A ou T ou G) - ATX - AC (G ou A) - TT (A ou G) - TA (A ou G ou T) - A (SEQ ID N° 16) O iniciador C é um iniciador mensageiro e o D é anti- mensageiro. Degeneração é de multiplicidade 144.

Peptídeo 2: G/PVILYSDPADYFAPD /GVK (SEQ ID N° 8, 9)

Iniciador PSM "E" CCX - GCX - GA (T ou C) - TA (T ou C) -TT(T ou C) - GC (SEQ ID N° 17)

Iniciador PSM "F" GC(G ou A) - AA (A ou G) - TA (A ou G) -TXC - GCX - GG (SEQ ID N° 18) O iniciador E é um iniciador mensageiro e F é um iniciador anti-mensageiro. A Degeneração é de multiplicidade 128.

Peptídeo 6: FLYXXTQIPHLAGTEONFOLAK (SEQ ID N° 7)

Iniciador PSM "I" ACX - GA (A ou G) - CA(A ou G) - AA (T ou C) - TT(T ou C) - CA(A ou G) - CT (SEQ ID N° 19)

Iniciador PSM “J" AG - (T ou C)TG - (A ou G)AA - (A ou G)TT - (T ou C) TG - (T ou C)TC - XGT (SEQ ID N° 20)

Iniciador PSM "K" GA (A ou G) - CA (A ou G) - AA (T ou C) - TT(T ou C) CA(A ou G) - CT (SEQ ID N° 21)

Iniciador PSM “L" AG - (T ou C)TG - (A ou G)AA - (A ou G)TT - (T ou C)TG - (T ou C)TC (SEQ ID N° 22)

Os iniciadores I e K são iniciadores mensageiros e J e L são anti-mensageiros. Os I e J têm degenerações de multiplicidade 128 e K e L têm degenerações de multiplicidade 32.

Peptídeo 7: TILFAS(W)DAEEFGXX(q)STE(e)A(E)... (SEQ ID N.° 12)

Iniciador PSM "M" TGG - GA (T ou C) - GCX - GA (A ou G) - GA(A ou G) - TT(C ou T) - GG (SEQ ID N° 23)

Iniciador PSM "N" CC - (G ou A)AA - (T ou C)TC - (T ou C)TC - XGC - (A ou G)TC - CCA (SEQ ID N° 24)

Iniciador PSM "O" TGG - GA(T ou C) - GCX - GA (A ou G) -GA(A ou G) - TT (SEQ ID N° 25)

Iniciador PSM " P " AA - (T ou C)TC - (T ou C)TC - XGC - (A ou G)TC - CCA (SEQ ID N° 26)

Os iniciadores M e O são iniciadores mensageiros e N e P são anti-mensageiros. Os M e N têm degeneração de multiplicidade 64 e o O e P têm degeneração de multiplicidade 32. 0 PCR degenerado foi realizado utilizando um Termociclador de DNA Perkin-Elmer Modelo 480. O modelo de cDNA para o PCR foi preparado a partir do mRNA de LNCaP o qual tinha sido isolado por métodos padrão da cromatografia oligo dT (Pesquisa de Colaboração). A síntese do cDNA foi realizada tal como é de seguida descrito: 4.5 μΐ poly de LNCaP A+ RNA (2 μΐ) 1,0 μΐ Iniciadores Oligo dT (0,5 μΐ) 4.5 μΐ dH20 10 μΐ

Incubar a 68 °C x 10 minutos.

Arrefecimento rápido em gelo x 5 minutos.

Adicionar: 4 μΐ 5 x tampao RT 2 1—1 0,1 M DTT 1 μΐ 10 mM dNTPs 0, 5 μΐ RNasin (Promega) 1,5 μΐ dH20 19 μΐ

Incubar durante 2 minutos a 37 °C.

Adicionar 1 μΐ Transcriptase Inversa Superscript® (Gibco®-BRL)

Incubar durante 1 hora a 37 °C.

Adicionar 30 μΐ dH20.

Utilizar 2μ1 por reacção de PCR.

As reacções de PCR degenerado foram optimizadas através da variação das temperaturas de recozimento, das concentrações de Mg++, das concentrações de iniciadores, da composição tampão, dos tempos de extensão e do número de ciclos. O perfil óptimo, determinado pelos proponentes, do termociclador foi: Desnaturação a 94 °C x 30 segundos, Emparelhamento de 45 a 55 °C durante 1 minuto (dependendo do Tm médio dos iniciadores utilizados) e Extensão a 72 °C durante 2 minutos.

5μ1 10 x Tampao* de PCR

5μ1 2,5 mM de mistura dNTP 5μ1 de Mistura de Iniciadores (contendo de 0,5 a 1,0 μΐ de cada um dos iniciadores mensageiro e anti-mensageiro) 5μ1 100 mM de β-mercaptoetanol

2μ1 de modelo de cDNA de LNCaP 5μ1 25mM de MgC12 (2,5 mM final) 21μ1 dH20 2μ1 diluted Taq Polymerase (0,5υ/μ1) 50μ1 volume total

Os tubos foram revestidos com 60μ1 óleo mineral leve e foram amplificados durante 30 ciclos. Os produtos de PCR foram analisados através da realização de uma electroforese de 5μ1 de cada uma das amostras num gel de agarose a 2-3% após o que se revelou com brometo de etidio e foram fotografadas

ΙΟχ tampão de PCR

166 mM de NH4S04 670 mM Tris, pH 8,8 2 mg/ml BSA São apresentadas na Figura 5 as fotografias representativas que exibem os produtos de PCR.

Clonagem de Produtos de PCR

De modo a analisar mais em detalhe estes produtos de PCR, os mesmos foram clonados num vector de plasmídeo adequado através da técnica de "Clonagem TA" (Invitrogen® Corp.). A estratégia de clonagem aqui utilizada é a de ligar directamente os produtos de PCR a um vector de plasmídeo o qual possua resíduos T pendentes no local de inserção, explorando o facto de que a polimerase Taq deixa pendentes os resíduos A nas terminações dos produtos de PCR. As misturas de ligação são transformadas em células de E. coli competentes e as colónias resultantes são deixadas crescer, o plasmídeo do DNA é isolado pelo método de lise alcalina (24) , e é analisado por análise de restrição (Figura 6 A-B) .

Sequenciação de DNA dos Produtos de PCR

Os clones TA dos produtos de PCR foram então sequenciados através do método de dideóxido (25) utilizando a Sequenase (U.S. Biochemical). Foram desnaturadas de 3 a 4 μg de cada plasmídeo de DNA com NaOH e foram precipitadas com etanol. As reacções que serviram para marcar foram realizadas, tal como é referido nas recomendações dos fabricantes, utilizando o 35S-ATP, e as reacções foram terminadas utilizando o mesmo protocolo. Os produtos da sequenciação foram então analisados em géis de poliacrilamida a 6%/Ureia 7Μ através da utilização de um aparelho de sequenciação IBI. Os géis foram executados a 120 watts durante 2 horas. Após a electroforese, os géis foram fixos durante de 15 a 20 minutos em metanol a 10%/ácido acético a 10 %, foram transferidos para um papel Whatman 3MM e foram secos sobre um secador de vácuo Biorad® a 80 °C durante 2 horas. Os géis foram então autoradiografados à temperatura ambiente durante de 16 a 24 horas. Para determinar se os produtos do PCR eram os clones correctos, os proponentes analisaram as sequências obtidas nos terminais 5' e 3' das moléculas à procura das sequências de iniciador correctas, bem como também das sequências adjacentes as quais correspondiam a partes do peptídeos que não foram utilizadas na modelação dos iniciadores. O IN-20 foi confirmado como estando correcto e como representando um cDNA parcial para o gene de PSM. Nesta reacção de PCR, foram utilizados os iniciadores I e N. A sequência de DNA que os proponentes obtiveram ao ler do iniciador I foi a: ACG GAG CAA AAC TTT CAG CTT GCA AAG (SEQ ID NS 30) T E Q N F O L A K (SEQ ID N° 31)

Os aminoácidos sublinhados eram a parte do peptídeo 6 que foi utilizada para projectar este iniciador mensageiro e os restantes aminoácidos os quais estão de acordo com os que foram apresentados no referido peptídeo, confirmam que esta terminação da molécula representa a proteína correcta (antigénio de PSM).

Quando a outra terminação da molécula foi analisada pelos proponentes através da leitura do iniciador de N a sequência era: CTC TTC GGC ATC CCA GCT TGC AAA CAA AAT TGT TCT (SEQ ID N° 32)

Dado que isto representa uma sequência de DNA anti- mensageiro, é necessário que se demonstre a sequência mensageira complementar de modo a encontrar o referido peptideo.

Sequência mensageira: AGA ACA ATT TTG TTT GCA AGC TGG GAT GCC AAG GAG (SEQ ID N.° 33) R T I L F A S W D A E E (SEQ ID N.° 34)

Os aminoácidos aqui sublinhados representam a parte do peptideo 7 que foi utilizada para criar o iniciador N. Todos os aminoácidos que estão a montante deste iniciador são correctos no clone IN-20 clone, logo concordantes com os aminoácidos que foram encontrados no peptideo 7. Uma sequenciação de DNA mais detalhada permitiu, aos proponentes, a identificação da presença de outros peptideos de PSM, também aqui descritos, dentro da sequência de DNA do referido clone positivo. A sequência de DNA deste cDNA parcial foi descoberta como sendo única quando se pesquisou a base de dados computacionais do Genbank. A Construção da Biblioteca de cDNA e a Clonaqem do cDNA de PSM de Comprimento Completo

Uma biblioteca de cDNA de mRNA de LNCaP foi construída utilizando o sistema de plasmideo Superscript® (BRL®-

Gibco). A biblioteca foi transformada utilizando células DH5-a competentes e foram colocadas em placas de lOOmm, as quais continham LB mais 100 μg/ml de Carbenicilina. As placas foram deixadas crescer durante a noite a 37 °C e as colónias foram transferidas para filtros de nitrocelulose. Os filtros foram processados e foram analisados tal como em Grunstein e Hogness (26), utilizando a referida sonda homóloga de cDNA parcial a l,lkb a qual foi marcada radioactivamente com 32P-dCTP através de iniciadores aleatórios (27). Os proponentes obtiveram oito colónias positivas as quais depois da restrição de DNA e da análise de sequenciação provaram que representavam as moléculas de cDNA de comprimento completo, as quais codificam para o antigénio de PSM. Na Figura 7 é apresentado um autoradiograma que mostra o tamanho das moléculas de cDNA representado na biblioteca dos proponentes e na Figura 8 são apresentadas as análises de restrição de vários clones de comprimento completo. A Figura 9 representa uma análise Southern de plasmideo das amostras da figura 8, mostrando que todas eles sofrem hibridização a l.lkb da sonda de cDNA parcial.

Tanto o cDNA bem como também o antigénio, foram pesquisados através da base de dados computacional Genbank (Projecto do Genoma Humano) e foi descoberto que eram únicos.

Análise Northern da Expressão do Gene de PSM A análise Northern (28) do gene de PSM revelou que a expressão está limitada à próstata e ao carcinoma de próstata.

As amostras de RNA (de ou 10 μρ de RNA total ou de 2 μg de poli A+ RNA) foram desnaturadas e sofreram electroforese através de géis de agarose a 1,1%/formaldeido a 60 milliamps durante de 6 a 8 horas. O RNA foi então transferido para membranas de Nylon Nytran® (Schleicher e Schuell®) através de revelação por pressão num SSC de lOx com um Pós-blotter (Stratagene®) . 0 RNA foi ligado de um modo cruzado às membranas utilizando um Stratalinker (Stratagene®) e subsequentemente foi tratado num forno de vácuo a 80 °C durante 2 horas. Os "blots" foram previamente hibridizados a 65 °C durante 2 horas em solução de pré-hibridização (BRL®) e foram subsequentemente hibridizados durante 16 horas em solução tampão de hibridação (BRL®) contendo de 1 a 2 x 106 cpm/ml de sonda de cDNA com iniciador aleatório e marcada com 32P. As membranas foram lavadas duas vezes com SSPE lx/SDS a 1 % e duas vezes com SSPE 0,lx/SDS 1 % a 42 °C. As membranas foram então secas ao ar e autoradiografadas durante de 12 a 36 horas a -70 °C.

Análise de PCR da Expressão do Gene de PSM em Tecidos de Próstata Humanos

Foi realizado um PCR em 15 amostras de próstata humana de modo a determinar a expressão do gene de PSM. Foram utilizadas cinco amostras de cada um dos tecidos, o de próstata normal, o da hiperplasia da próstata benigna e o de cancro da próstata (histologia confirmada pelo Departamento de Patologia do MSKCC).

Foram inversamente transcritas 10 μρ do RNA total de cada uma das amostras de modo a fazer o modelo de cDNA tal como é descrito na secção IV. Os iniciadores utilizados correspondiam às terminações 5' e 3' do referido cDNA parcial a l,lkb, o IN-20, e então o tamanho esperado da faixa ampliada é de l,lkb. Dado que o Tm dos iniciadores dos proponentes é de 64 °C, os proponentes emparelharam os iniciadores no PCR a 60 °C. Os proponentes realizaram o PCR durante 35 ciclos utilizando as mesmas condiçoes que foram previamente descritas na secção IV.

As LNCaP e as LNCaP transfectadas de H26 - Ras (29) foram incluídas como controlo positivo e as DU-145 como controlo negativo. Das 15 amostras 14 ampliaram claramente a banda a 1,1 kb e então expressam o gene.

Resultados Experimentais

Foi identificado o gene que codifica o antigénio de PSM a 100 kD. A sequência de cDNA completa é apresentada sequência de ID #1. Por baixo da referida sequência de ácido nucleico está a sequência de aminoácidos transladada predita. O número total de aminoácidos é de 750, ID #2. A hidrofilicidade da sequência de proteína predita é apresentada na Figura 16. Na Figura 17 são apresentados três peptídeos com o ponto mais alto de hidrofilicidade. Os referidos são: Asp-Glu-Leu-Lys-Ala-Glu (SEQ ID N° 35); Asn-Glu-Asp-Gly-Asn-Glu (SEQ ID N° 36) e Lys-Ser-Pro-Asp-Glu-Gly (SEQ ID N° 37).

Através do método de Klein, Kanehisa e DeLisi, foi identificado um domínio que dá origem a uma membrana específica. A sequência é a definida do aminoácido #19 ao aminoácido #44: Ala-Gly-Ala-Leu-Val-Leu-Aal-Gly-Gly-Phe-Phe-Leu-Leu-Gly-Phe-Leu -Phe (SEQ ID N° 38). O referido domínio que dá origem a uma membrana predita foi analisado por computador com o PC Gene (programa de software de computador). Estes dados permitem a previsão de domínios de membrana internos e externos do antigénio de PSM os quais são uma ajuda no trabalho de projectar anticorpos para serem utilizados como detectores e como agentes melhorantes da imagiologia de cancro da próstata.

Quando a sequência do antigénio de PSM foi comparada com outras sequências conhecidas do GeneBank, foi detectada a homologia entre a sequência de antigénios de PSM e a sequência de receptores de transferina. Os dados são apresentados na Figura 18.

Discussões Experimentais

Utilizações Potenciais do Antigénio de PSM: 1. Detecção de tumores:

Microscópico: A designação não ambígua de um tumor pode ser realizada através da utilização de sondas para diferentes antigénios. Para o cancro da próstata, a sonda de antigénio de PSM pode provar-se ser benéfica. Deste modo poderia ser utilizado o PSM para fins de diagnóstico e isto poderia ser conseguido ao nível microscópico através da utilização de hibridação in situ utilizando sondas mensageiras (controlo) e sondas anti-mensageiro, derivadas da região de codificação do cDNA que foi clonado pelos proponentes. Isto poderia ser utilizado na avaliação da extensão extraprostática local, envolvendo os nódulos linfáticos, os ossos ou outros locais metásticos. As metástases dos ossos representam um problema muito importante no cancro da próstata, a rápida detecção da propagação metastática é especialmente requerida para determinar o estágio. Em alguns tumores, a detecção de células de tumor na medula óssea antecipa um prognóstico severo e sugere que as intervenções que sejam dirigidas às metástases sejam tentadas. A detecção da expressão do antigénio PSM em aspirados de medula óssea ou em secções podem disponibilizar rapidamente a tal informação mais cedo. Amplificação de PCR ou a hibridação in-situ podem ser utilizadas. Esta aproximação poderia ser desenvolvida para uma possível reacção da região metastática. 2. Identificação do local antigénico 0 conhecimento do cDNA para o antigénio também disponibiliza a identificação de áreas que iriam servir como bons antigénios para o desenvolvimento de anticorpos para serem utilizados contra as sequências de aminoácidos específicas do antigénio. As referidas sequências podem encontrar-se em diferentes regiões tais como fora da membrana ou dentro do antigénio de PSM. 0 desenvolvimento destes anticorpos específicos iria permitir uma identificação da imuno-histoquímica do antigénio. Estes anticorpos derivados poderiam então ser desenvolvidos para serem utilizados, em especial aqueles que conseguem funcionar em secções fixas com parafina bem como também numa secção congelada dado que são os que apresentam maior utilidade para o diagnóstico imunitário. 3. Polimorfismo de restrição do comprimento do fragmento e DNA genómico

Os polimorfismos de restrição do comprimento do fragmento (RFLPS) provaram já ser úteis na documentação da progressão dos danos genéticos que ocorrem durante o período de iniciação e promoção de um tumor. Pode ser que a análise RFLP demonstre que as alterações nos locais de restrição da sequência de PSM podem disponibilizar provas para a predisposição para o risco ou quanto ao potencial maligno ou quanto à progressão do tumor da próstata.

Dependendo da localização no cromossoma do antigénio de PSM, o gene de antigénio de PSM pode servir como um marcador de localização no cromossoma útil para a análise de cromossomas. 4. Soro

Com o desenvolvimento de anticorpos específicos do antigénio, se o antigénio ou se fragmentos dos antigénios seleccionados aparecerem no soro, estes podem servir como marcadores do soro quanto à presença de uma doença metastática e podem ser úteis individualmente ou então podem ser úteis em combinação com outros marcadores específicos da próstata. 5. Imagiologia

Dado que a sequência de cDNA implica que o antigénio apresenta as características de uma proteína que gera uma membrana com a maior parte da proteína na superfície exofacial, os anticorpos, especialmente os anticorpos monoclonais para os fragmentos de peptídeo expostos e específicos para o tumor, podem disponibilizar uma detecção por imagiologia da extensão local do tumor metástico ou do tumor residual após uma prostatectomia ou uma irradiação. 0 conhecimento da região de codificação permite a geração de anticorpos monoclonais e estes podem ser utilizados em combinação de modo a disponibilizar uma melhor e máxima detecção por imagiologia. Dado que o antigénio partilha uma semelhança com o receptor de transferina, isto com base numa análise do cDNA (cerca de 54 %) , pode ser que exista um ligando normal específico para este antigénio e logo a identificação do referido ligando, ou ligandos, iria disponibilizar outros meios para a detecção por imagiologia. 6. Isolamento de ligandos 0 antigénio de PSM pode ser utilizado para isolar o ligando (ou ligandos) normal que a ele se liga. Este ligando (ou ligandos) dependendo da especificidade podem ser utilizados para dirigir, ou então os seus niveis no soro podem ser indicativos de um estado de doença. Se for descoberto que o ligando normal para o PSM é uma molécula de suporte, nesse caso pode ser que o PSM possa ser utilizado para se ligar ao referido ligando tal como se pretende com fins terapêuticos (como uma substância quelante do ferro) de modo a ajudar na remoção do ligando da circulação. Se o ligando promove o crescimento do tumor ou as metástases, então o fornecer antigénio de PSM solúvel iria remover o ligando impedindo a sua ligação à próstata. Um maior conhecimento da estrutura do antigénio de PSM poderia conduzir à geração de um fragmento mais pequeno o qual se ligaria ao ligando o que poderia servir o mesmo propósito. 7. Utilizações terapêuticas a) Ligandos. 0 conhecimento de que a estrutura do cDNA do antigénio de PSM partilha uma homologia estrutural com o receptor de transferina (54 % ao nivel dos ácidos nucleicos) implica que pode existir um ligando endógeno para o receptor o qual pode ou não ser semelhante à transferina. Acredita-se que a transferina é um ligando que transporta o ferro para a célula depois de se ligar ao receptor de transferina. No entanto, a apotransferina tem sido relatada como sendo um factor de crescimento para algumas células as quais expressam o receptor de transferina (30). Se transferina é um ligando para este antigénio ou algum outro ligando se liga a este ligando permanece ainda uma incógnita. Se um ligando é identificado então pode ser utilizado para transportar uma substância específica tal como um ião metálico (como o ferro ou o zinco ou outro) para o tumor e servir assim como um meio de entrega de substâncias tóxicas (substâncias químicas radioactivas ou citotóxicas tais como as toxinas como rícino ou agentes de alquilação citotóxicos ou percursores de medicamentos citotóxicos) para dentro do tumor. 0 local metástico principal de ocorrência do tumor da próstata são os ossos. 0 osso e o tecido de micélio compacto de osso são ricos em transferina. Recentes estudos sugerem que este micro-ambiente é o que disponibiliza o meio de desenvolvimento ideal para o crescimento de metástases prostáticas no osso (31). Pode ser que o referido meio promova também a ligação, estes factores os quais reduzem a referida capacidade podem diminuir as metástases prostáticas no osso bem como o crescimento metástico prostático no osso.

Foi descoberto que o ligando para o novo antigénio (o qual se pensava ser um oncogene e um marcador do fenótipo maligno no carcinoma de peito) servia para induzir a diferenciação de células de cancro de peito e deste modo poderia servir como um tratamento e não como um promotor da doença. Pode ser que a ligação de um ligando à região correcta do PSM, quer seja feita com um ligando natural ou com um anticorpo, consiga desempenhar uma função semelhante.

Os anticorpos contra o antigénio de PSM em conjunto com um agente citotóxico serão úteis para eliminar as células de cancro da próstata. Os anticorpos receptores da transferina com conjugados toxicos são citotóxicos para um grande número de células de tumor dado que as células de tumor tendem a expressar elevados níveis de receptores de transferina (32) . Os receptores de transferina carregam moléculas para a célula através de endocitose. As combinações de medicamentos de anticorpos podem ser tóxicas. Uma toxina ligada à transferina pode ser tóxica. b) Os anticorpos contra o antigénio de PSM em conjunto com um agente citotóxico irão ser úteis para eliminar as células de cancro da próstata. 0 agente citotóxico pode ser um isótopo radioactivo ou uma toxina tal como é conhecido para quem tenha alguns conhecimentos neste campo. A ligação entre o anticorpo e a toxina ou o isótopo radioactivo pode ser uma ligação química. Como exemplos de toxinas ligadas directamente podem ser referidas a doxorubicina, o clorambucilo, o rícino, a exotoxina de pseudomonas etc., ou pode ser gerada uma toxina híbrida com V2 de especificidade para com o PSM e o outro de especificidade para com a toxina. Uma molécula bivalente tal como a referida pode servir se ligar ao tumor e o outro V2 para fazer a entrega de um agente citotóxico ao tumor ou ligar-se ao referido e activar um linfócito citotóxico tal como a ligação ao complexo receptor Tl - T3. Os anticorpos com a necessária especificidade podem também ser clonados em linfócitos T e substituindo o domínio da imunoglobulina do receptor de linfócito T (TcR); pela clonagem nas cadeias pesadas e leves de MAb desejadas; através da divisão dos segmentos de gene Uh e UL com as regiões constantes das cadeias TCR α e β e transfectar estes genes quiméricos Ab/TcR nos linfócitos T dos pacientes, propagando estas células híbridas e introduzindo-as no paciente (33). Um conhecimento específico dos antigénios específicos dos tecidos para definir os objectivos e a produção de MAb específicos para os referidos objectivos irá ajudar a tornar esta aproximação uma aproximação utilizável. Dado que a região que codifica o antigénio de PSM disponibiliza informação sobre toda a região de codificação, é possível gerar vários anticorpos os quais poderiam ser então utilizados em combinação de modo a terem acção aditiva ou sinergética anti-tumor. Os anticorpos podem ser ligados a enzimas os quais podem activar percursores não tóxicos dos medicamentos no local do tumor, tal como a Ab-carboxipeptidase e ácido 4-(bis(2 cloroetil) amino) benzoil-a-glutâmico e o respectivo medicamento activo, em ratos (34). É possível produzir uma quimera genética tóxica tal como o TP-40, um recombinante genético que possui o cDNA do TGF-alfa e uma parte tóxica da exotoxina de pseudomonas de modo a que o TGF e parte do híbrido se liguem ao receptor do factor de crescimento epidérmico (EGFR) e a parte das pseudomonas seja, de um modo enzimático, introduzida nas células e inactive a capacidade dos ribossomas de executar a síntese de proteínas o que resulta na morte celular. Quando for, pelos proponentes, conhecido o ligando para o antigénio de PSM pode ser feito o mesmo.

Para além do referido, uma vez que o ligando para o antigénio de PSM seja identificado, a toxina pode ser quimicamente conjugada aos ligandos. Os referidos ligandos conjugados podem ser terapeuticamente úteis. Como exemplos das referidas toxinas podem ser referidas a daunomicina, o clorambucilo, o rícino, a exotoxina de pseudomonas, etc. Alternativamente, podem ser criados elementos quiméricos através da ligação do cDNA do ligando com o cDNA da toxina.

Um exemplo de uma tal toxina é a TGF e a exotoxina de pseudomonas (35). 8. Outros 0 antigénio de PSM pode ter outras utilizações. É bem conhecido que a próstata é rica em zinco, e se o antigénio disponibilizar uma função relativa ao referido ou a outra função biológica, então o antigénio de PSM pode ser útil no tratamento de outras patologias da próstata tal como o crescimento hiperplástico benigno e, ou, a prostatite.

Dado que o antigénio de PSM purificado pode ser produzido, o antigénio de PSM purificado pode ser ligado a esferas e pode ser aqui utilizado como uma purificação de afinidade "padrão". Podem ser utilizados soro, urina ou outras amostras biológicas para serem incubadas com o antigénio de PSM que se encontra ligado às esferas. As esferas podem ser muito bem lavadas, e depois eluidas com um gradiente de sal ou de pH. A substância eluida é o gel de SDS purificado e pode ser utilizado como uma amostra para microsequenciação. As sequências irão ser comparadas com outras proteínas conhecidas e se foram únicas, a técnica de PCR degenerada pode ser utilizada para obter o ligando. Uma vez conhecido, a afinidade do ligando irá ser determinada através de protocolos padrão (15).

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Segunda Série de Experiências

Expressão do Antigénio de membrana específico da próstata

Os proponentes conseguiram recentemente clonar um DNA complementar de 2,65 kb o qual codifica o PSM, o antigénio de membrana especifico da próstata reconhecido pelo anticorpo monoclonal de anti-próstata 7E11-C5.3. A análise imuno-histoguimica das linhas de células LNCaP, DU-145 e PC-3 de cancro da próstata quanto à expressão de PSM utilizando o anticorpo 7E11-C5. 3 mostra uma intensa revelação nas células de LNCaP, e não detecta nenhuma expressão nas céluas de DU-145 e de PC-3. 0 conjunto de transcriçao/tradução in-vitro do cDNA de PSM 2,65 kb de comprimento completo dá origem a uma proteína de 84kDa o que corresponde ao peso molecular previsto do polipeptídeo de PSM. Uma modificação pós-translacional desta proteína com microssomas pancreáticos de cão dá origem ao esperado antigénio de PSM de 100 kDa. Após a transfecção das células de PC-3 com o cDNA de PSM de comprimento completo num vector de expressão eucariota, os proponentes detectaram a expressão da glicoproteína de PSM por análise Western utilizando o anticorpo monoclonal 7E11-C5.3. A análise da protecção da ribonuclease demonstra que a expressão do mRNA de PSM é quase completamente específica da próstata dentro dos tecidos humanos. A expressão do PSM parece ser mais elevada em estados com baixas concentrações hormonais e é hormonalmente modulado por esteróides, apresentando o DHT um efeito de diminuição da expressão do PSM na linha de células LNCaP do cancro da próstata humano, de 8 a 10 vezes, a testosterona apresenta um efeito de diminuição do PSM de 3 a 4 vezes e os corticoesteróides não apresentam nenhum efeito significativo. Os tecidos prostáticos normais e malignos apresentam, de um modo consistente, uma elevada expressão de PSM, tendo os proponentes observado uma expressão heterogénea, e às vezes ausente, de PSM na hiperplasia prostática benigna. Os tumores de LNCaP implantados e ortotopica e subcutaneamente feitos crescer em ratos nus, expressavam de um modo abundante o PSM disponibilizando assim um excelente sistema modelo in-vivo para estudar a regulação e a modulação da expressão de PSM.

Detalhes Experimentais

Materiais e Métodos Células e Reagentes:

As linhas de células LNCaP, DU-145 e PC-3 foram obtidas a partir da “American Type Culture Collection". Os detalhes relativos ao estabelecimento e às caracteristicas das referidas linhas de células foram já publicadas previamente (5A, 7A, 8A) . A menos que de outro modo seja especificado, as células de LNCaP foram cultivadas em meio RPMI 1640 suplementado com L-glutamina, com os aminoácidos não essenciais e com 5% de soro de bezerro fetal (Gibco-BRL, Gaithersburg, MD.) numa incubadora de CO2 a 37 °C. As células de DU-145 e PC-3 foram feitas crescer num meio essencial mínimo suplementado com 10 % de soro de bezerro fetal. Todas os meios de células foram obtidas a partir das Instalações de Preparação de Meios, MSKCC. As enzimas de restrição e de modificação foram compradas à Gibco-BRL a menos que seja indicado o contrário.

Detecção Imuno-histoquímica do PSM

Os proponentes utilizaram o método de detecção da avidina-biotina para analisar as linhas de células de cancro da próstata quanto à expressão do antigénio de PSM (9A). Foram feitas citospinas de células em lâminas de vidro utilizando 5 x 104 células/lOOul por lâmina. As lâminas foram lavadas duas vezes com PBS e foram então incubadas com o soro supressor adequado durante 20 minutos. O soro supressor foi retirado e as células foram incubadas com anticorpo monoclonal 7E11-C5.3 diluído (5g/ml) durante 1 hora. As amostras foram então lavadas com PBS e, em seguida, foram incubadas com os anticorpos secundários durante 30 minutos e com os complexos de avidina-biotina durante 30 minutos. A diaminobenzidina serviu aqui como cromogénio e o desenvolvimento de cor foi seguido por contra-revelação e montagem com hematoxilina. Os duplicados das citospinas de células foram utilizados como controlo para cada uma das experiência. Como um controlo positivo, foi utilizado o anticorpo monoclonal de anti-citoqueratina CAM 5.2, seguindo o mesmo procedimento que foi acima descrito. As células EJ de carcinoma de bexiga humana serviram como controlo negativo.

Transcrição / Translação In-Vitro do Antigénio de PSM 0 plasmideo 55A que contém o cDNA de PSM de comprimento completo a 2.65 kb no plasmideo pSPORT 1 (Gibco-BRL) foi transcrito in-vitro utilizando o sistema Promega TNT (Promega Corp. Madison, WI). Foi adicionada polimerase de RN A T 7 ao cDNA numa mistura de reacção a qual continha lisado de reticulócito de coelho, uma mistura de aminoácidos sem metionina, uma solução tampão e 35S-Metionina (Amersham) e foi incubada a 30 °C durante 90 minutos. A modificação pós-translacional da proteína resultante foi realizada através da adição de microssomas pancreáticos de cão à mistura de reacção (Promega Corp. Madison, WI. ) . Os produtos proteicos foram analisados por electroforese em géis de SDS-PAGE a 10 %, os quais foram subsequentemente tratados com um agente melhorante amplificador da autoradiografia (Amersham, Arlington Heights, IL.) de acordo com as instruções do fabricante e foram secos a 80 °C num secador de vácuo. Os géis foram autoradiografados durante a noite a -70 °C utilizando Hyperfilm MP (Amersham).

Transfecção do PSM para células PC-3 O cDNA de PSM de comprimento completo foi subclonado para o vector expressão eucariota pREP7 (Invitrogen, San Diego, CA.) . O DNA plasmideo foi purificado de bactérias DH5-alfa transformadas (Gibco-BRL) através da utilização de colunas para separar plasmídeos Qiagen maxi-prep (Qiagen Inc.,

Chatsworth, CA.). 0 DNA plasmídeo purificado (de 6 a lOg) foi diluído com 900 ul de meio de Optimem (Gibco-BRL) e foi misturado com 30 ul de reagente de Lipofectina (Gibco-BRL) o qual tinha já sido previamente diluído com 9001 de meio de Optimem. Esta mistura foi acrescentada a frascos T-75 com de 40 a 50 % de células PC-3 confluência em meio de Optimem. Depois de 24 a 36 horas, as células foram tripsinizadas e foram divididas em placas de pratos de 100 mm os quais continham meio de RPMI 1640 completados com 10 % de soro de bezerro fetal e 1 mg/ml de Higromicina B (Calbiochem, La Jolla, CA.). A dose de Higromicina B utilizada tinha sido previamente determinada por um ensaio de citotoxicidade de tempo decorrido / dose de resposta. As células foram mantidas neste meio durante de 2 a 3 semanas com mudanças de meio e de Higromicina B todo os 4 a 5 dias até que fossem aparentes colónias discretas. As colónias foram isoladas utilizando cilindros de clonagem de 6mm e foram expandidas no mesmo meio. Como controlo, foram também transfectadas células PC-3 apenas com o plasmídeo pREP7. O RNA foi isolado a partir das células transfectadas e a expressão do mRNA de PSM foi detectada tanto por análise de Proteção RNase (descrita mais tarde) como por análise Northern.

Detecção por Western Blot da Expressão do PSM

Foram isolados lisados de proteína em bruto das células PC-3 transfectadas com LNCaP, PC-3, e PSM tal como tinha sido previamente descrito (10A). As membranas das células de LNCaP foram também isoladas de acordo com os métodos publicados (10A). As concentrações de proteína foram quantificadas pelo método de Bradford através da utilização do kit de reagentes de proteína BioRad (BioRad, Richmond, CA.). Após a desnaturação, 20 g de proteína sofreram a 25 mA durante electroforese num gel de SDS - PAGE a 10 % 4 horas. Os géis foram electro-revelados sobre membranas Immobilon P (Millipore, Bedford, MA.) durante a noite a 4 °C. As membranas foram bloqueadas em NaCl 0,15 M/Tris-HCl 0,01 M (TS) mais 5 % de BSA seguido por uma 1 hora de incubação com o anticorpo monoclonal 7E11-C5.3 (10 g/ml).

Os "blots" foram lavados 4 vezes com NaCl 0,15 M/Tris-HCl 0,01 M/Tritão-X 100 (TS-X) a 0,05 % e foram incubados durante 1 hora com IgG de coelho anti-rato (Accurate Scientific, Westbury, N.Y.) numa concentração de 10 g/ml.

Os "blots" foram então lavados 4 vezes com o TS-X e foram marcados com a 125I-Protein A (Amersham, Arlington Heights, IL.) com uma concentração de 1 milhão de cpm/ml. Os "blots" foram então lavados 4 vezes com o TS-X e foram secos num papel Whatman 3MM, após o que foram autoradiografados durante a noite a -70 °C utilizando um Hyperfilm MP (Amersham).

Crescimento Ortotópico e Subcutâneo do Tumor LNCaP em Ratos Nus Foram recolhidas células de LNCaP de culturas subconfluência através de uma exposição de minuto a uma solução de tripsina a 0.25 % e EDTA a 0.02 %. As células foram de novo suspensas em meio de RPMI 1640 com 5 % de soro bovino fetal, foram lavadas e foram diluídas em, ou Matrigel (Collaborative Biomedical Products, Bedford, MA. ) ou em solução salina equilibrada de Hank livre de cálcio e de magnésio (HBSS). Apenas as suspensões de células com mais do que 9 0 % de viabilidade determinada pela exclusão de azul de tripano foram utilizadas para a injecção in vivo. Foram obtidos ratos nus atímicos do sexo masculinos suíços (nu/nu) com de 4 a 6 semanas de idade no "Memorial Sloan-Kettering Câncer Center Animal Facility". Para a injecção de células de tumor subcutânea foram injectadas um milhão de células de LNCaP re-suspensas em 0,2 ml de Matrigel na perna traseira de cada um dos ratos utilizando uma seringa descartável fornecida com uma agulha de medida 28. Para a injecção ortotópica, foram primeiro anestesiados os ratos com uma injecção intraperitonial de Pentobarbital e foram colocados na posição de supino. O abdómen foi limpo com Betadine e a próstata foi exposta através de uma incisão de linha média. Foram injectadas 2,5 milhões de célula de tumor LNCaP em 0,1 ml directamente em gualquer um dos lóbulos posteriores através da utilização de uma seringa de 1 ml descartável e de uma agulha de medida 28. Foram injectadas células de LNCaP com e sem Matrigel. A costura abdominal foi realizada apenas numa camada utilizando agrafos de incisão Autoclip (Clay Adams, Parsippany, N.J.). Os tumores foram recolhidos após de 6 a 8 semanas, a sua histologia foi confirmada utilizando os meios disponibilizados pelo Departamento de Patologia do Sloan-Kettering Câncer Center e foram congelados em azoto liquido para o subsequente isolamento de RNA.

Isolamento de RNA O RNA celular total foi isolado a partir das células e dos tecidos através de técnicas padrão (11, 12) bem como também utilizando o RNAzol B (Cinna/Biotecx, Houston, TX.). As concentrações e a qualidade do RNA foram avaliadas através de espectroscopia de UV num espectrofotómetro Beckman DU 640 e por análise de gel. As amostras de RNA total de tecido humano foram compradas aos Laboratórios Clontech, Inc., Paio Alto, CA.

Ensaios de Proteção da Ribonuclease

Uma parte do cDNA de PSM foi subclonado no vector de plasmídeo pSPORT 1 (Gibco-BRL) e a orientação do enxerto de cDNA relativo ao T7 do flanco e aos promotores de polimerase RNA SP6 foi verificada por análise de restrição. A linearização deste plasmideo a montante do enxerto de PSM seguida por uma transcrição com a polymerase de RNA SP6 dá origem a uma sonda de RNA anti-mensageiro com 400 nucleótidos de entre os quais 350 nucleótidos deveriam ser protegidos da digestão feita pela RNase através do RNA de PSM. Esta sonda foi utilizada na figura 20. O plasmideo IN-20, contendo um cDNA de PSM parcial a 1 kb no plasmideo pCR II (Invitrogen) também foi utilizado para a síntese da ribosonda. O IN-20 foi linearizado com Xmn I (Gibco-BRL) originando uma sonda de RNA anti-mensageiro com 298 nucleótidos quando é transcrito utilizando a polimerase SP6 de RNA, da qual deveriam ser protegidos 260 nucleótidos da digestão feita pela RNase através do mRNA de PSM. Esta sonda foi utilizada nas figuras 21 e 22. As sondas foram sintetizadas utilizando a Polimerase SP6 de RNA (Gibco -BRL) , a rNTPs (Gibco-BRL) , a RNAsin (Promega) e a 32P-rCTP (NEN, Wilmington, DE.) de acordo com os protocolos já publicados (13). As sondas foram purificadas utilizando colunas de purificação NENSORB 20 (NEN) e cerca de 1 milhão cpm de sonda de PSM purificada, e marcada radioactivamente, foi misturada com 10 g de cada um dos RNA e foi hibridizada durante a noite a 45 °C utilizando soluções tampão e reagentes do kit de RPA II (Ambion, Austin, TX). As amostras foram processadas tal como é descrito pelas instruções do fabricante e foram analisadas em géis de desnaturação de poliacrilamida a 5%/ureia a 7M utilizando os reagentes Seq ACRYL (ISS, Natick, MA.). Os géis foram previamente aquecidos a 55 °C e foram postos a funcionar durante cerca de 1 a 2 horas a 25 watts. Os géis foram então fixos durante 30 minutos em metanol a 10%/ácido acético a 10%, foram secos sobre papel de Whatman 3MM à 80 °C num secador de vácuo BioRad e foram autoradiografados durante a noite com Hyperfilm MP (Amersham). A quantificação da expressão de PSM foi determinada utilizando um densitómetro com varrimento de laser (LKB, Piscataway, NJ.).

Experiência de Modulação de Esteróides

Foram colocadas células de LNCaP (2 milhões) em placas dentro de frascos T-75 em meio RPMI 1640 com suplementos de 5 % de soro de bezerro fetal e foram deixadas crescer durante 24 horas até apresentar cerca de 30 a 40 % de confluência. Os frascos foram então lavados várias vezes com solução salina tampão de fosfato e foi adicionado meio RPMI suplementado com 5 % de soro extraído com carvão. As células foram então deixadas crescer durante outras 24 horas, tempo após o qual foram adicionados dihidrotesterona, testosterona, estradiol, progesterona e dexametasona (Steraloids Inc., WILTON, NH.) até chegar a uma concentração final de 2 nM. As células foram deixadas crescer durante outras 24 horas e o RNA foi então recolhido tal como foi previamente descrito e a expressão de PSM foi analisada por análise de protecção da ribonuclease.

Resultados Experimentais

Detecção Imuno-histoquímica de PSM:

Quando se utiliza o anticorpo monoclonal 7E11-C5.3 anti-PSM, a expressão de PSM é claramente detectável na linha de células de cancro da próstata LNCaP, mas não nas linhas de células PC-3 e DU-145 (figura 17) o que está de acordo com os resultados previamente publicados (4A). Todos os tecidos da próstata normais e malignos analisados se revelaram positivos quanto à expressão de PSM (dados nao publicados).

In-Vitro Transcrição/Translação de Antigénio de PSM:

Tal como é apresentado na figura 18, o conjunto da transcrição/translação in-vitro do cDNA de PSM comprimento completo a 2.65 kb, dá origem uma espécie de proteína com 84 kDa a qual está de acordo com o produto de proteína esperado da armação de leitura aberta com 750 aminoácidos do PSM. Após a modificação pós-translacional que é feita utilizando microssomas pancreáticos de cão, os proponentes obtiveram uma espécie de proteína glicosilada a 100 kDa consistente com o antigénio de PSM maduro, nativo.

Detecção do Antigénio de PSM em Membranas de Células LNCaP e em Células PC-3 Transfectadas:

Foram analisadas Células PC-3 transfectadas com comprimento completo do cDNA de PSM no vector de expressão pREP7 quanto à expressão de mRNA de SM por análise Northern (dados não apresentados). Foi seleccionado um clone com uma elevada expressão de mRNA de PSM para a análise de antigénio de PSM feita por "Western Blotting" utilizando o anticorpo7Ell-C5.3. Na figura 19, o antigénio de PSM de 100 kDa é bem expresso em lisado de células de LNCaP e nas fracções da membrana, bem como também nas células de PC-3 transfectadas com PSM, mas não em células de PC-3 nativas. Esta expressão detectável nas células de PC-3 transfectadas prova que o cDNA de PSM de 2,65 kb previamente clonado codifica o antigénio reconhecido pelo anticorpo monoclonal de anti-próstata 7E11-C5.3 e que o antigénio está a ser adequadamente glicosilado dentro das células de PC-3, dado que o anticorpo reconhece um epitopo que contém um hidrato de carbono dentro do PSM.

Expressão do mRNA de PSM: A expressão do mRNA de PSM em tecidos humanos normais foi analisada utilizando ensaios de protecção de ribonuclease. A expressão do PSM em tecidos aparece predominantemente dentro do tecido da próstata, sendo detectados níveis de expressão muito baixos no cérebro humano e nas glândula salivares (figura 20). Não era detectável nenhuma expressão de mRNA de PSM evidente em tecidos humanos sem ser a próstata quando foram analisados por análise Northern (dados não apresentados). Os proponentes também notaram em algumas ocasiões uma expressão de PSM detectável em tecidos do intestino delgado de humanos normais, no entanto esta expressão de mRNA é variável dependendo da ribosonda específica que estava a ser utilizada (dados não apresentados). Todas as amostras de próstata de humano normal e de adenocarcinoma de próstata de humano analisadas revelaram a expressão claramente detectável de PSM, ao mesmo tempo que os proponentes notaram que, geralmente, existia uma expressão diminuída ou ausente de PSM em tecidos os quais exibiam hiperplasia benigna (figura 21). Em tumores de LNCaP humanos feitos crescer ortotopicamente e subcutaneamente em ratos nus, os proponentes descobriram uma expressão de PSM abundante com ou sem a utilização de matrigel, o qual é necessário para o crescimento de células de LNCaP implantadas subcutaneamente (figura 21). A expressão do mRNA de PSM é modulada de um modo distinto pela presença de esteróides numa dosagem fisiológica (figura 22). O DHT regulou negativamente a expressão cerca de 8 a 10 vezes depois de 24 horas e a testosterona diminuiu a expressão de PSM cerca de 3 a 4 vezes. Estradiol e progesterona também regularam negativamente a expressão do PSM em células de LNCaP, talvez como resultado de se ligar ao receptor de androgénios transformado que é sabido existir na célula de LNCaP. Resumindo, a expressão do PSM é mais elevada nas células de LNCaP sem tratamento que foram cultivadas em meio livre de esteróides, uma situação que os proponentes propõem que simula o estado in-vivo livre de hormonas (castrado). Esta experiência foi repetida utilizando dosagens de esteróides que variavam de 2 a 200 nM e a intervalos de tempo de 6 horas a 7 dias com resultados semelhantes; A regulação negativa máxima do mRNA de PSM foi observada com o DHT a 24 horas com doses de 2 a 2 0 nM.

Discussão experimental

De modo a melhor entender a biologia da próstata humana tanto no estado normal quanto no neoplásico, os proponentes necessitaram de aumentar o seu conhecimento estudando as várias proteínas e outras características que são únicas a esta importante glândula. Uma pesquisa prévia disponibilizou dois valiosos marcadores biológicos prostáticos, o PAP e o PSA, ambos os quais apresentam um impacto importante no diagnóstico, tratamento e controlo das doenças de próstata. O presente trabalho, o qual descreve uma caracterização preliminar do antigénio de membrana específico da próstata (PSM) revelou que o referido é um gene com muitas características interessantes. 0 PSM é quase completamente específico da próstata tal como o são o PAP e o PSA, e como tal pode permitir uma maior descoberta das funções únicas e o comportamento da próstata. A sequência prevista da proteína de PSM (3) e a sua presença na membrana das células de LNCaP tal como foi determinado por análise de “Western Blotting" e imuno-histoquímica, indicam que é uma proteína que integra a membrana. Deste modo, o PSM disponibiliza um epitopo da superfície da célula atraente para as modalidades de diagnóstico dirigidas citotóxicas e por imagiologia tendo como alvo os anticorpos (14) . A capacidade para sintetizar o antigénio de PSM in-vitro e de produzir xenoenxertos de tumor, mantendo elevados niveis de expressão de PSM proporcionou um sistema modelo conveniente e atraente para os estudos e caracterização adicionais da regulação e modulação da expressão do PSM. Também o elevado nível de expressão do PSM nas células de LNCaP disponibiliza um excelente sistema modelo in-vitro. Dado que expressão do PSM apresenta resposta hormonal aos esteróides e pode ser altamente expresso numa doença refractária a hormonas (15), é imperativo elucidar o papel potencial do PSM na evolução do cancro da próstata independente do androgénio. A descoberta da expressão do mRNA de PSM em quantidades diminutas no cérebro, nas glândulas salivares e no intestino delgado suscita investigações adicionais, embora estes tecidos tenham sido negativos quanto à expressão de antigénio de PSM por ensaios de imuno-histoquímica utilizando o anticorpo 7E11-C5.3 (16). Em todos estes tecidos, em particular no intestino delgado, os proponentes descobriram a expressão do mRNA através da utilização de uma sonda que corresponde a uma região do cDNA de PSM perto da terminação 3', considerando que os proponentes não conseguiram detectar qualquer expressão quando utilizaram uma sonda da terminação 5' do PSM. Estes resultados podem indicar que a cópia do mRNA de PSM sofre diferentes divisões de acordo com os diferentes tecidos. Estudos de proteína já feitos sugeriam que o anticorpo 7E11-C5.3 possa ser utilizado para detectar duas outras espécies de proteína ligeiramente maiores para além do antigénio de PSM de 100 kDa (17) . Estas outras espécies de proteína podem ser observadas no lisado e nas amostras da membrana de LNCaP, presentes na figura 19. As possíveis origens destas proteínas podem incluir um mRNA de PSM alternativamente dividido, outros genes diferentes mas relacionados de perto com o PSM ou diferentes modificações pós-translacionais da proteína de PSM. Os proponentes estão presentemente a investigar estas possibilidades. A aproximação dos proponentes tem como base os promotores específicos do tecido da próstata: as enzimas ou as quimeras de citoquina. Os proponentes irão examinar a activação específica feita pelos promotores dos percursores de medicamentos tais a da ganciclovira não tóxica a qual é convertida num metabólito tóxico através da cinase de timidina de herpes simplex ou o percursor do medicamento ácido 4-(bis-(2-cloroetil)amino)benzoil-l-glutâmico o qual é convertido num agente alquilante de mostarda de ácido benzóico pela peptidase de carbóxido de pseudomonas G2. Dado que estas drogas são activadas pela enzima (quimera) especificamente no tumor, o medicamento activo apenas é libertado localmente no ambiente do tumor, destruindo assim as células de tumor que se encontram na vizinhança. Os proponentes também irão examinar a activação específica de promotores de citoquinas tais como a IL-12, a IL-2 ou a GMCSF no que respeita à activação e à vacinação específica anti-tumor. Finalmente, a activação dos promotores específicos dos tecidos para os genes da morte celular pode também ser útil neste campo.

Quimeras de Terapia de Genes 0 estabelecimento de um "DNA quimérico" para a terapia de genes exige a junção de diferentes segmentos de DNA de modo a obter um novo DNA o qual apresenta características de ambos as espécies precursoras de DNA que estiveram envolvidas na junção. Na presente proposta os dois pedaços que são unidos envolvem diferentes aspectos funcionais do DNA, a região do promotor a qual permite a leitura do DNA para a formação do mRNA irá disponibilizar a especificidade e a sequência de DNA que codifica o mRNA irá disponibilizar o DNA funcional terapêutico. mRNA da Enzima ou da Citoguina especificada pelo DNA:

Quando são eficazes, os medicamentos contra o tumor podem provocar a regressão de quantidades muito grandes do tumor. As exigências principais para um medicamento se designar activo contra um tumor é a necessidade de alcançar tanto um tempo bastante longo (t) e uma concentração suficientemente elevada (C) (cxt) de exposição do tumor ao medicamento tóxico de modo a assegurar que são causados danos suficientes às células de modo a ocorrer a morte celular. 0 medicamento deve também ser "activa" e a sua toxicidade para com as células de tumor maior do que para as células hospedeiras normais (22). A disponibilidade do medicamento para o tumor depende do fluxo de sangue para o tumor e a capacidade de difusão dos medicamentos. Apenas o fluxo de sangue para o tumor não confere selectividade pois o fluxo de sangue para muitos dos tecidos normais é com frequência tão grande como ou maior do que para o tumor. A maioria dos medicamentos citotóxicos quimioterapêuticos são com frequência tão tóxicos para os tecidos normais como para o tecido do tumor. As células que sofrem divisão são, com frequência, mais sensíveis do que as que as células normais que não se dividem, mas em muitos tumores sólidos de crescimento lento tal como o cancro da próstata, esta característica não confere especificidade contra as células de tumor (22). Já anteriormente tinham sido utilizados meios para aumentar a especificidade, para com os tumores, dos medicamentos de contra os tumores que envolviam o utilizar de enzimas para activar os percursores dos medicamentos os quais eram não tóxicos tornando-os agentes citotóxicos (19). Um dos problemas encontrados com esta aproximação era o de que a maioria das enzimas que era encontrada em tumores não era totalmente especifica na sua actividade e enzimas semelhantes activas para um determinado substrato ou a mesma enzima apenas com quantidades ligeiramente mais baixas, foram encontradas em outro tecidos e assim os tecidos normais estavam ainda sujeitos a sofrer danos.

De modo a disponibilizar uma especificidade absoluta e actividade única, foram descobertas enzimas virais, bacterianas e fúngicas, as quais apresentam uma especificidade única para os percursores dos medicamentos selecionados e as que não estivessem presentes em células humanas ou em outras células animais. As tentativas para utilizar enzimas tais como a cinase timidina de herpes simplex, deaminase de citosina bacteriana e a carboxipeptidase G-2 as quais foram ligadas a sistemas de orientação de anticorpos apresentaram apenas um modesto sucesso (19) . Infelizmente, as enzimas orientadas a anticorpos limitam o número de enzimas disponível por célula. Adicionalmente, a maioria dos anticorpos não apresenta uma razão de orientação para o tumor sobre a orientação para tecidos normais e assim os tecidos normais são ainda expostos o que reduz adicionalmente a especificidade destas enzimas únicas. Os anticorpos são moléculas grandes que apresentam pobres propriedades de difusão e a adição do peso molecular das enzimas reduz ainda mais a difusão dos anticorpos. A terapia de genes poderia produzir o melhor resultado desejado se fosse capaz de alcançar a expressão especifica de uma proteína no tumor e não no tecido normal de modo para que uma concentração local elevada da enzima esteja disponível para a produção, dentro do tumor, de medicamento activo (21).

Citoquinas: 0 grupo de pesquisa dos presentes proponentes demonstrou já que os proponentes podem especificamente e de um modo não tóxico "curar" um animal de um tumor já estabelecido, em modelos de cancro da bexiga ou da próstata. 0 cancro da próstata era o mais difícil de curar especialmente se tivesse crescido de um modo ortotópico na próstata. 0 trabalho dos presentes proponentes demonstrou que os tumores tais como o da bexiga e o da próstata, não são imunogénicos, ou seja, que a administração de células de tumor irradiadas ao animal antes da administração subsequente de células de tumor não irradiadas, não resultaram numa redução nem do número de células de tumor que produzem um tumor nem reduzem a taxa de crescimento do tumor. Mas se o tumor fosse transfectado com um retrovírus e conseguisse segregar elevadas concentrações de citoquinas tais como a II-2, então este poderia constituir como uma vacina contra o tumor e também poderia reduzir o potencial de crescimento de um tumor já estabelecido e em crescimento. A IL-2 era o melhor, a GM-CSF também apresentava actividade ao passo que várias outras citoquinas eram muito menos activas. Em estudos clínicos utilizando apenas a IL-2 para a estimulação imunitária, foram necessárias grandes concentrações a ser administradas de modo a que se provasse serem tóxicas. A chave para o sucesso das células de tumor modificadas no gene de citoquina é que a citoquina é produzida localmente no local do tumor, não é tóxica e estimula o reconhecimento imunitário do tumor e permite um reconhecimento e destruição especifica e não tóxica do tumor. Os mecanismos exactos de como a produção de IL-2 feita pelas células de tumor activa o reconhecimento imunitário, não são completamente óbvios, mas uma explicação é que evita a necessidade da produção de citoquina pelas células T ajudantes e estimula directamente a citotoxicidade activada pelos antigénios de tumor nas células CD8. Também pode acontecer a activação das células que continham antigénio.

Activação do DNA Quimérico Especifico dos Promotores de Tecidos

Sistemas de Tumor não Prostático:

Tem sido observado em tumores, que não o prostático, que a utilização de uma activação especifica do promotor pode, de um modo selectivo, conduzir à expressão de genes específicos de tecido do gene transfectado. Nos melanomas a utilização de um promotor de tirosinase o qual codifica para a enzima responsável para a expressão de melanina deu origem a uma expressão cerca de 50 vezes maior do que a expressão do gene dirigida pelo promotor em células de melanoma e não em células que não de melanoma. Uma activação específica semelhante foi observada nas células de melanoma transfectadas quando estas foram deixadas crescer em ratos. Na referida experiência nenhuma célula que não de melanoma nem nenhum melanócito expressaram o produto do gene dirigido pela tirosinase. O grupo de pesquisa dos Laboratórios Welcome conseguiram já clonar e obter a sequência da região promotora do gene que codifica o antigénio do carcinoembrião (CEA) . 0 CEA é expresso nas células do cólon nas células de carcinoma do cólon mas especificamente na citosina deaminase metastática, a qual converte a 5 flurorocitosina em 5 fluorouracilo e é observada um grande aumento da capacidade de selectivamente matar as células de tumor de cólon dirigidas pelo promotor CEA mas não dividindo as células de fígado normais que não estavam a sofrer divisão. In vivo eles observaram que as células de tumor espectadoras as quais não foram transfectadas com o gene de deaminase de citosina também foram mortas e que não existia nenhuma toxicidade para o animal hospedeiro à medida que os tumores grandes foram regredindo com o avanço do tratamento. A cinase de timidina do vírus da herpes simplex, (HSV), activa, de um modo semelhante, o percursor de medicamento designado por ganciclovir o qual é tóxico para as células de cancro que sofrem divisão e a timidina cinase do HSV foi apresentada como sendo especificamente activada pelos promotores específicos de tecido.

Sistemas de Tumor Prostático: A chave terapêutica para uma eficaz terapia de cancro é alcançar especificidade e poupar o paciente da toxicidade. A terapia de genes pode constituir uma parte fundamental da especificidade naqueles tecidos não essenciais tais como a próstata e as proteínas específicas de tecidos que produzem os tumores prostáticos, tais como a fosfatase ácida (PAP), o antigénio específico da próstata (PSA) e um gene que os proponentes clonaram, o antigénio de membrana específico da próstata (PSM). Os tecidos tais como a próstata contêm factores específicos de transcrição de tecidos selecionados, os quais são responsáveis por se ligar à região do promotor de DNA destes mRNA específicos dos tecidos. 0 promotor para o PSA foi clonado e os proponentes estão a investigar a sua utilização como um promotor especifico da próstata para as células de tumor da próstata. Normalmente os pacientes que estão a ser tratados para o cancro da próstata metástico foram colocados numa terapia de privação de androgénio a qual reduz dramaticamente a expressão do mRNA para o PSA. 0 PSM por outro lado aumenta a sua expressão com privação hormonal o que significa que seria ainda mais intensamente expresso em pacientes que são tratados com a terapia hormonal. Os trabalhos preliminares em colaboração com o Laboratório do Dr. John Isaacs, demonstrou que o PSM é expresso quando a região de cromossoma humano que contém o gene de PSM humano é transferida para um tumor de rato A-6. 0 A-6 é um tumor metástico independente do androgénio. 0 mesmo cromossoma transferido para tecidos ou tumores que não são derivados da próstata não é expresso e logo estas células poderiam ser utilizadas como um modelo animal para estas experiências. As células de PSA, de PSM e de LNCaP Humanas positivas podem ser utilizadas para os testar em ratos nus.

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Terceira Série de Experiências

Detecção Sensível de Micrometastases Hematogénicas Prostáticas Utilizando PSA e Iniciadores derivados de PSM na Reacção em Cadeia da Polimerase

Os proponentes desenvolveram um ensaio com base num PCR o qual permite uma sensível detecção de micrometástases hematogénicas em pacientes com cancro da próstata. Os proponentes executáramos um "PCR aninhado", amplificando as sequências de mRNA que são únicas dos antigénios específico da próstata e para o antigénio de membrana específico da próstata, e comparou os seus resultados respectivos. Foram detectadas micrometástases em 2/30 pacientes (6,7%) utilizando PCR com iniciadores de derivados do PSA, enquanto que os iniciadores derivados do PSM detectaram células de tumor em 19/16 pacientes (63,3 %) . Todos os 8 controlos neqativos deram neqativos no PCR com PSA e com o PSM. Os ensaios foram repetidos de modo a confirmar os resultados, e os produtos de PCR foram verificados por sequenciação de DNA e por análise Southern. Os pacientes que apresentavam células de tumor de próstata circulantes tal como as detectadas por PSM, e não por PSA-PCR incluíam 4 pacientes já previamente tratados com prostatectomia radical e com níveis de PSA no soro não detectáveis na altura deste ensaio. 0 significado destas descobertas com respeito a uma futura reincidência e progressão da doença irá ser investigada.

A melhoria na razão global de sobrevivência dos pacientes com cancro da próstata irá depender de um diagnóstico mais precoce. A doença localizada, sem evidência de expansões para além da próstata, é tratada com sucesso com uma prostatectomia radical ou com incidência externa de radiação, com excelentes resultados a longo prazo (2, 3). 0 problema principal é que cerca de dois terços dos homens diagnosticados com cancro da próstata apresentavam já evidências de uma avançada expansão para além da próstata na altura do diagnóstico, para a qual não existe, até agora, nenhuma cura (4). A utilização de marcadores de soro clínicos tais como o antigénio específico da próstata (PSA) e a fosfatase do ácido prostático (PAP) tem permitido ao médico a detecção de carcinomas na próstata mais precocemente e tem disponibilizado parâmetros úteis para seguir as respostas à terapia (5). No entanto, mesmo apesar da descoberta dos ensaios de PSA sensível no soro, dos varrimentos de radionuclídeos nos ossos, dos varrimentos CT e de outras modalidades da imagiologia, os proponentes ainda não conseguiram descobrir a presença de células micro-metásticas antes de elas se estabelecerem como metástases sólidas. 0 trabalho anterior foi feito utilizando a reacção em cadeia da polimerase para amplificar as sequências de mRNA únicas para as células malignas do peito, de leucemia e outras células malignas na circulação e para permitir a descoberta precoce de micrometástases (6, 7). Recentemente, foi publicada uma aproximação com base no PCR, a qual utiliza iniciadores derivados da sequência de DNA do PSA (8). Neste estudo 3/12 pacientes com cancro da próstata avançado, na fase D, apresentavam micro-metástases hematogénicas detectáveis.

Os proponentes recentemente identificaram e clonaram um cDNA de 2.65 kb o qual codifica o antigénio de membrana específico da próstata de 100 kDa (PSM), reconhecido pelo anticorpo monoclonal anti-próstata 7E11-C5.3 (9). O PSM aparenta ser uma glicoproteína de membrana íntegra a qual é muito significativamente expressa em tumores da próstata e em metástases e é quase completamente específico da próstata (10). Muitos tumores anaplásticos e metástases do osso apresentam uma variável, e às vezes nenhuma, expressão detectável de PSA, considerando que estas lesões aparentam expressar, de um modo contínuo, elevados níveis de PSM constantemente. É provável que as células de tumor da próstata que se escapam da glândula da próstata e entram na circulação tenham o potencial para formar metástases e são possivelmente as células mais agressivas e possivelmente as células anaplásticas, uma população de células as quais podem não expressar elevados níveis de PSA, mas que podem reter uma elevada expressão de PSM. Os proponentes decidiram, deste modo, utilizar os iniciadores de DNA derivados das sequências de PSA e PSM num ensaio de PCR para detectar células micro-metastáticas na circulação periférica. Apesar do elevado nível de amplificação e de sensibilidade do PCR de RNA convencional, os proponentes utilizaram uma aproximação de "PCR aninhado" na qual os proponentes ampliaram uma sequência alvo em primeiro lugar e em seguida utilizam este produto de PCR como modelo para outra sessão de amplificação de PCR com um novo conjunto de iniciadores totalmente contido dentro da sequência do anteriormente referido produto. Esta aproximação permitiu que os proponentes aumentassem o seu nível de detecção de uma célula de tumor da próstata por 10,000 células para um de mais de uma célula por dez milhões de células.

Detalhes Experimentais Materiais e Métodos Células e Reagentes:

Foram obtidas células de LNCaP e MCF-7 a partir da American Type Culture Collection (Rockville, MD.). Os detalhes relativos ao estabelecimento e às características das referidas linhas de células foram já publicadas (11,12). As células foram deixadas crescer em meio RPMI 1640 suplementado com L-glutamina, aminoácidos não essenciais, obtidos a partir da MSKCC Media Preparation Facility, e 5 % de soro de bezerro fetal (Gibco-BRL, Gaithersburg, MD.) numa incubadora de CO2 a 37 °C. Todos os meios das células foram obtidas a partir da MSKCC Media Preparation Facility. Os reagentes químicos de rotina eram do grau de pureza mais elevado possível e foram obtidos a partir da Sigma Chemical Company, St., Louis, MO.

Espécimes de Sangue de pacientes

Todos os espécimes de sangue utilizados neste estudo eram provenientes de pacientes observados nos gabinetes de consulta externa dos urologistas que faziam parte do pessoal da MSKCC. Foram recolhidos dois tubos com anti-coagulante (topo roxo) por paciente na altura da sua recolha regular de sangue. A obtenção dos espécimes foi feita tal como é indicado pela aprovação da Comissão de Revisão Institucional da MSKCC. As amostras foram rapidamente trazidas para o laboratório para serem imediatamente processadas. As determinações de PSA e PAP no soro foram realizadas através de técnicas padrão pelo Laboratório de Química Clinica da MSKCC. Foram executadas As determinações de PSA foram realizadas utilizando a análise de Tandem PSA (Hybritech, San Diego, CA.). Os oito espécimes de sangue utilizados como controlos negativos eram de 2 homens com valores normais de PSA no soro e BPH provado através de uma biópsia, uma mulher saudável, 3 homens saudáveis, um paciente com cancro de bexiga e um paciente com leucemia promielocítica aguda.

Processamento das amostras de sangue/Extração de RNA

Foram misturados 4 ml de sangue venoso com anti-coagulante inteiro com 3 ml de solução salina tamponada de fosfato a 0 °C e foram depois cuidadosamente colocados no topo de 8 ml de Ficoll (Pharmacia, Uppsala, Suécia) num tubo de poliestireno de 15 ml. Os tubos foram centrifugados a 200 x g durante 30 min. a 4 °C. Utilizando uma pipeta de pasteur estéril, a camada de revestimento tamponada (cerca de 1 ml) foi cuidadosamente removida e novamente diluída até 50 ml com solução salina tamponada de fosfato a 0 °C num tubo de polipropileno de 50 ml. Este tubo foi então centrifugado a 2000 x g durante 30 min. a 4 °C. O sobrenadante foi cuidadosamente decantado e o precipitado foi deixado secar por gotejar. Foi então adicionado um ml de RNazol B ao precipitado e o RNA total foi isolado seguindo as instruções dos fabricantes (Cinna/Biotecx, Houston, TX.). As concentrações e a pureza do RNA foram determinadas através de espectroscopia de UV num espectrofotómetro Beckman DU 640 e através de análise de gel.

Determinação da Sensibilidade do PCR

0 RNA foi isolado das células de LNCaP e das misturas de células de LNCaP e de MCF-7 em razões fixas (como, por exemplo, 1: 100, 1: 1000, etc.) usando RNAzol B. O PCR aninhado foi então executado tal como é descrito abaixo com tanto os iniciadores PSA como PSM de modo a determinar o limite de detecção do ensaio. O cDNA de LNCaP: MCF-7 (1: 100, 000) foi diluído com água destilada de modo a obter concentrações de 1: 1,000,000 e de 1: 10,000,000. As células de MCF-7 foram escolhidas porque foram previamente testadas e foi demonstrado para que não expressavam o PSM por PCR.

Reacção em Cadeia da Polimerase

Os iniciadores externos de PSA utilizaram partes do comprimento dos exões 4 e 5 de modo a dar origem a um produto de PCR de 486 bp e possibilitar a diferenciação entre o cDNA e uma possível contaminação com uma amplificação de DNA genómica. A sequência de iniciador a montante que começa no nucleótido 494 na sequência de cDNA do PSA é O 5'-TACCCACTGCATCAGGAACA-3' (SEQ. ID. N° 39) e O iniciador a jusante no nucleótido 960 é o 5'- CCTTGAAGCACACCATTACA-3' (SEQ. ID. N° 40). O iniciador a montante de PSA interno (começando no nucleótido 559) 5'- ACACAGGCCAGGTATTTCAG-3' (SEQ. ID. N° 41) e o iniciador a jusante (no nucleótido 894) 5'-GTCCAGCGTCCAGCACACAG-3'

(SEQ. ID. N° 42) dão origem a um produto de PCR com 355 bp. Todos os iniciadores foram sintetizados pela MSKCC Microchemistry Core Facility. Foram inversamente transcritos 5 g de RNA total em cDNA num volume total de 201 utilizando a transcriptase reversa Superscript (Gibco-BRL) de acordo com as recomendações dos fabricantes. 11 destes cDNA serviram como o modelo de inicio para a reacção de PCR do iniciador externo. A mistura de PCR 201 compreendia: 0,5 U de Taq polimerase (Promega Corp., Madison, WI.), solução tampão de reacção Promega, 1,5 mM de MgCl2, 200 M de dNTPs e 1,0 M de cada um dos iniciadores. Esta mistura foi então transferida para um termociclador de DNA Perkin Elmer 9600 e foi incubada durante 25 ciclos. O perfil de PCR era o seguinte: 94 °C x 15 segundos, 60 °C x 15 segundos e 72 °C durante 45 segundos. Depois de 25 ciclos, as amostras foram colocadas em gelo e 11 destas misturas de reacção serviram como modelo para outra repetição de PCR utilizando os iniciadores internos. O primeiro conjunto de tubos foi de novo colocado no termociclador para mais 25 ciclos adicionais. O PCR- PSM exigia que a selecção dos pares de iniciadores também contivesse um intrão de modo a ser seguro que era o cDNA que iria sofrer ampliação e não o DNA genómico. Dado que a sequência do DNA genómico de PSM ainda não ter sido determinada, a referida selecção envolvia o ir tentando diferentes conjuntos até que seja encontrado um par o qual produza o tamanho esperado do produto de PCR quando o cDNA é amplificado, mas sem apresentar nenhuma banda produzida a partir de um modelo de DNA genómico, o que indica a presença de um grande intrão. Os iniciadores externos de PSM dão origem a um produto de 946 bp e os iniciadores internos um produto de 434 bp. O iniciador externo a montante do PSM utilizado, era o 5'-ATGGGTGTTTGGTGGTATTGACC -3' (SEQ. ID. N° 43) (começando no nucleótido 1401) e o iniciador a jusante (no nucleótido 2348) era o 5'-TGCTTGGAGCATAGATGACATGC-3' (SEQ. ID. N° 44). O iniciador interno a montante do PSM (no nucleótido 1581) era o 5'-ACTCCTTCAAGAGCGTGGCG -3' (SEQ. ID. N° 45) e o iniciador a jusante (no nucleótido 2015) era o 5'-AACACCATCCCTCCTCGAACC -3' (SEQ. ID. N° 46). O cDNA utilizado era igual ao utilizado no ensaio de PSA. A mistura de PCR 501 compreendia: 1 U de Taq Polimerase (Promega) , 250 M de dNTPs, 10 mM de mercaptoetanol, 2 mM de MgCl2 e 51 de uma mistura tamponada lOx a qual continha: 166 mM de NH4S04, 670 mM de Tris pH 8,8 e 2 mg/ml de BSA acetilado. O PCR foi realizado num Termociclador de DNA Perkin Elmer 480 com os seguintes parâmetros: 94 °C x 4 minutos durante 1 ciclo, 94 °C x 30 segundos, 58 °C x 1 minuto e 72 °C x 1 minuto durante 25 ciclos, seguido por 72 °C x 10 minutos. As amostras foram então colocadas em gelo e 21 desta mistura de reacção foram utilizados como modelo durante outros 25 ciclos com uma nova mistura de reacção contendo os iniciadores de PSM internos. A qualidade do cDNA foi verificada através da execução das reacções de controlo que utilizam iniciadores derivados da -actina os quais dão origem a um produto de PCR de 446 bp. O iniciador a montante utilizado foi o 5'-AGGCCAACCGCGAGAAGATGA-3' (SEQ. ID. N° 47) (exão 3) e o iniciador a jusante foi o 5'-ATGTCACACTGGGGAAGC-3' (SEQ. ID. N° 48) (exão 4). A mistura completa de PSA e 101 de cada mistura de reacção de PSM foram colocadas em géis com agarose a 1,5 a 2 %, foram reveladas com brometo de etidio e foram fotografadas com um Sistema de Imagiologia Vídeo Eagle Eye (Stratagene, Torrey Pines, CA.). Os ensaios foram pelo menos repetidos 3 vezes para verificar os resultados.

Clonagem e Sequenciação dos Produtos de PCR

Os produtos de PCR foram clonados no vector plasmídeo pCR II utilizando o sistema de clonagem TA (Invitrogen) . Este plasmideos foram transformados para células de E. coli competentes utilizando métodos padrão (13) e o plasmídeo DNA foi isolado utilizando o Magic Minipreps (Promega) e foi analisado por análise de restrição. Os clones TA foram então sequenciados pelo método do dideóxido (14) utilizando a Sequenase (U.S. Biochemical). Foram desnaturadas de 3 a 4 g de cada plasmídeo com NaOH e foram precipitados com etanol. As reacções de marcação foram levadas a cabo de acordo com as recomendações dos fabricantes utilizando 35S-dATP (NEN) e as reacções foram terminadas tal como que foi apresentado no mesmo protocolo. Foram então analisados os produtos da sequenciação em géis de poliacrilamida a 6%/ureia a 7 M com os quais foram feitas corridas a 120 watts durante 2 horas. Os géis foram fixos durante 20 minutos em metanol a 10%/ácido acético a 10%, foram transferidos para papel Whatman 3MM e foram secos num secador de vácuo durante 2 horas a 80 °C. Os géis foram então autoradiografados à temperatura ambiente durante 18 horas.

Análise Southern

Os géis de agarose revelados com brometo de etídio dos produtos de PCR foram mergulhados durante 15 minutos em HC1 a 0,2 N, seguidos por 30 minutos em cada um dos seguintes NaOH 0,5N/NaCl 1,5 M e Tris de pH 7,5 0,1 M/NaCl a 1,5 M. Os géis foram então equilibrados durante 10 minutos em lOx SSC (NaCl l,5M/Citrato de sódio 0,15 M. O DNA foi transferido para membranas de Nylon Nytran (Schleicher e Schuell) por revelação por pressão em SSC a lOx com um Posi-blotter (Stratagene) . O DNA foi ligado de um modo cruzado à membrana utilizando um Stratalinker UV (Stratagene). Os "blots" foram previamente hibridizados a 65 °C durante 2 horas e foram de seguida cruzados com sondas de cDNA com iniciadores aleatórios marcadas com 32P, e desnaturadas (PSM ou PSA) (9, 15) . Os "blots" foram lavados duas vezes em SSPE lx/SDS a 0,5% a 42 °C e duas vezes em SSPE 0, lx/SDS a 0,5 % a 50 °C durante 20 minutos cada. As membranas foram secas ao ar e foram autoradiografadas durante 30 minutos a 1 hora a -70 °C com filme Kodak X-Omat.

Resultados experimentais A técnica dos proponentes de amplificação de PCR com os iniciadores aninhados melhorou o seu nivel de detecção de células prostáticas de cerca de uma célula prostática por 10,000 células de MCF-7 para melhor do que uma célula por milhão de células de MCF-7, utilizando os iniciadores derivados de PSA ou de PSM (figuras 26 e 27). Isto representa uma melhoria significativa na capacidade de detectar a doença de um modo precoce. As caracteristicas dos 16 pacientes analisados, no que respeita ao seu estado clínico, ao tratamento, aos valores de PSA e PAP no soro e os resultados do presente ensaio dos proponentes são apresentados na tabela 1. No total, o PSA-PCR detectou as células de tumor em 2/30 pacientes (6,7%), enquanto que o PSM-PCR detectou as células em 19/30 pacientes (63,3%). Não foram observados nenhum paciente positivo para as células de tumor por PSA e que não o fosse por PSM, enquanto que o PSM detectou 8 pacientes positivos não detectados por PSA. Os pacientes 10 e 11 na tabela 1, ambos num estado muito avançado da doença refractária às hormonas, foram detectados tanto por PSA como por PSM. Ambos os pacientes morreram após a altura em que estas amostras foram obtidas.

Os pacientes 4, 7, e 12, todos eles tratados com prostatectomias radicais para doença localizada clinicamente e todos eles apresentando valores de PSA no soro não detectáveis durante de 1 a 2 anos após a operação, eram positivos quanto a células de tumor de próstata circulantes por PSM-PCR, mas negativos por PSA-PCR. Na figura 28 é apresentada uma fotografia de gel PSM-PCR revelada com etidio representativa. As amostras que foram colocadas na pista A representam os produtos de PCR gerados a partir dos iniciadores exteriores e as amostras nas pistas identificadas como B são os produtos de pares de iniciadores internos. A autoradiografia de Southern Blot de PSM correspondente é apresentada na figura 29. A sensibilidade da análise de Southern Blot excedeu a do "blotting" com etidio, tal como pode ser observado em várias amostras onde o produto externo não é visível na figura 28, mas é detectável por Southern Blot tal como é apresentado na figura 29. Para além do referido, a amostra 3 nas figuras 28 e 29 (paciente 6 na figura 30) parece conter bandas externas e internas que são menores do que as correspondentes bandas nos outros pacientes. A sequenciação de DNA confirmou que a sequência de nucleótidos destas bandas está de acordo com a do PSM, com a excepção de uma pequena eliminação. Isto pode ou representar um artefacto de PCR, um cortar alternativo do mRNA de PSM neste paciente ou uma mutação do PSM. Os proponentes observaram condições semelhantes em outras amostras em várias ocasiões (dados não publicados). Todas as amostras sequenciadas e analisadas pela análise de Southern Blot foram confirmadas como sendo verdadeiros positivos para o PSA e PSM.

Detalhes experimentais A capacidade de avaliar com precisão os pacientes com cancro da próstata na altura do diagnóstico é claramente de suprema importância na selecção da terapia apropriada e na previsão da resposta a longo prazo ao tratamento e potencial cura. A avaliação feita antes da cirurgia consiste actualmente num exame físico, em determinações de PSA e de PAP no soro, em numerosas modalidades de imagiologia incluindo a ultrasonografia transrectal, o varrimento CT, o varrimento de radionuclídeos nos ossos e o varrimento plano MRI. No entanto, nenhuma das modalidades presentes dá resposta ao problema da doença micro-metastática hematogénica e o potencial impacto negativo no prognóstico que esta pode produzir. Os estudos prévios demonstraram que apenas uma percentagem fraccionária das células de tumor circulantes irá inevitavelmente dar origem a uma metástase sólida (16), no entanto, a detecção de e a potencial quantificação do teor de células de tumor circulantes pode provar ser válida para uma avaliação da doença feita com mais precisão. 0 impacto a longo termo da doença micro-metastática hematogénica deve ser estudado através da comparação dos percursos clínicos de pacientes nos quais foi detectado a existência destas células na sua circulação com pacientes numa fase e com tratamentos semelhantes, os quais deram negativo no mesmo teste. 0 nível de detecção significativamente mais alto das células de tumor com PSM quando comparado ao do PSA não é surpreendente para os proponentes, dado que os proponentes observaram uma expressão mais consistente do PSM em carcinomas de próstata de todas as fases e graus quando comparada à expressão variável do PSA em cancros da próstata menos diferenciados e anaplásticos. Os proponentes foram surpreendidos ao descobrir células de tumor nos três pacientes que tinham sofrido prostatectomias radicais com as subsequentes quantidades não detectáveis de PSA no soro. Estes pacientes seriam considerados como clinicamente curados por "cirurgia" pelos critérios padrão, no entanto eles aparentemente continuam a apresentar células de tumor da próstata. Será interessante seguir o percurso clinico destes pacientes quando comparados a outros sem a prova de PCR de doença residual. Os proponentes estão actualmente a analisar amostras como maiores números de pacientes de modo a verificar estas descobertas e talvez identificar os pacientes com risco de desenvolver a doença metastática.

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Quarta Série de Experiências

A EXPRESSÃO DO ANTIGÉNIO DE MEMBRANA ESPECÍFICO DA PRÓSTATA (PSM) DIMINUI A ESTIMULAÇÃO MITOGÉNICA DAS CÉLULAS DE CARCINOMA DA PRÓSTATA HUMANAS AGRESSIVAS PELA TRANSFERINA

Tem sido sugeria uma associação entre a transferina e cancro da próstata humano por vários investigadores. Foi já demonstrado que as secreções da próstata de pacientes com cancro da próstata são enriquecidas no que respeita ao seu conteúdo de transferina e que as células de cancro da próstata são ricas em receptores de transferina (J. Urol. 143, 381, 1990) . Foi já demonstrado que a transferina derivada de medula óssea estimula selectivamente o crescimento das células de cancro da próstata agressivas (PNAS 89, 6197, 1992). Os proponentes já tinham relatado que a clonagem do cDNA que codifica o antigénio de PSM de 100 kDa (Cancro Res. 53, 208, 1993). A análise da sequência de DNA revelou que uma parte da região de codificação, do nucleótido 1250 ao 1700, possuía uma homologia de 54 % ao receptor de transferina humano. As células PC-3 não expressam o mRNA de PSM ou proteína e exibem um crescimento de células aumentado como resposta à transferina, ao passo que, as células de cancro da próstata LNCaP, as quais expressam, em alto grau, o PSM apresentam uma resposta muito fraca à transferina. Para determinar se a expressão de PSM pelas células de cancro da próstata apresenta algum tipo de impacto na sua resposta mitogénica à transferina, os proponentes transfectaram, de um modo estável, o comprimento completo do cDNA de PSM para as células PC-3 de cancro da próstata. Os clones que expressavam em alto grau o mRNA de PSM foram identificados por análise Northern e a expressão da proteína PSM foi verificada por análise Western utilizando o anticorpo monoclonal anti-PSM 7E11-C5.3.

Os proponentes colocaram em placas 2 x 104 células de PC-3 ou de PC-3 transfectadas com PSM por cavidade em meio de RPMI com suplemento de soro de bovino fetal a 10 % e 24 hrs. depois foram adicionadas 1 μρ por ml de holotransferina às células. As células foram contadas no dia 1 como sendo muito mitogénicas para com as células PC-3. As células foram contadas no dia 1 para determinar a eficiência da colocação nas placas e no dia 5 para determinar o efeito da transferina. As experiências foram repetidas para verificar os resultados.

Os proponentes observaram que as células de PC-3 sofreram um aumento médio de 275 % para além dos controlos, enquanto que as células de LNCaP foram apenas estimuladas em 43%. As cinéticas de crescimento revelaram que as células de PC-3 tranfectadas com PSM apresentavam um crescimento mais lento em 30 % do que o das células nativas PC-3. Estes dados sugerem que expressão do PSM em células de cancro da próstata humanas metastáticas, agressivas, impede significativamente a sua resposta mitogénica em relação à transferina. A utilização de vacinas terapêuticas que consistem em preparações de células de tumor que segregam citoquina para o tratamento de cancro da próstata já estabelecido foi investigado no modelo do adenocarcinoma prostático de rato R3327 - MatLyLu rato de Dunning. Apenas as preparações de células de tumor irradiadas que segregavam o IL-2, eram capazes de curar os animais de tumores já estabelecidos subcutaneamente, e geravam memória imunológica que protegia os animais de outro desafio de formação de tumor. A imunoterapia era menos eficaz quando os tumores foram induzidos ortotopicamente, mas não obstante conduziu a resultados melhorados, fazendo demorar significativamente e, ocasionalmente impedindo o retorno de tumores depois da ressecção da próstata cancerosa. A indução de uma potente resposta imunitária em animais que apresentam tumores contra o tumor não imunogénico de MatLyLu suporta a opinião que a imunoterapia activa do cancro da próstata pode ter benefícios terapêuticos. SEQUÊNCIA LISTANDO (1) INFORMAÇÃO GERAL: (i) PREPONENTE: israelita, Ron S.

Heston, Warren D.W.

Feira, William R.

(ii) TÍTULO DE PATENTE: ANTIGÉNIO DE MEMBRANA ESPECÍFICO DA

PRÓSTATA (iii) NÚMERO DE SEQUÊNCIAS: 38 (iv) ENDEREÇO DE CORRESPONDÊNCIA: (A) DESTINATÁRIO: Cooper & Dunham (B) RUA: 30 Praça de Rockefeller (C) CIDADE: Nova Iorque (D) ESTADO: Nova Iorque (E) PAÍS: Estados Unidos da América (F) ZIP: 10112 (v) FORMA LEGÍVEL POR COMPUTADOR: (A) TIPO DE MEIO: Disquete (B) COMPUTADOR: IBM PC compatível

(C) SISTEMA OPERACIONAL: PC-DOS/MS-DOS (D) SOFTWARE: Patent In Release #1.0, Versão #1.25 (vi) DADOS DE APLICAÇÃO ACTUAIS: (A) NÚMERO DE APLICAÇÃO: (B) DATA DA ENTREGA: (C) CLASSIFICAÇÃO: (viii) INFORMAÇÃO DE ADVOGADO/AGENT: (A) NOME: White, John P. (B) NÚMERO DE INSCRIÇÃO: 28,678 (C) REFERENCE/N0 de DOCKET: 1747/41426 ( (ix) INFORMAÇÃO DE TELECOMUNICAÇÕES: (A) TELEFONE: (212) 977 - 9550 (B) TELEFAX: (212) 664 - 0525

(C) TELEX: 422523 COOP UI (2) INFORMAÇÃO PARA A SEQ ID N°: 1: (i) CARACTERÍSTICAS DE SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 2653 pares de base (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE HÉLICE: dupla (D) TOPOLOGIA: linear

(ii) TIPO DE MOLÉCULA: CDRA

(iii) HIPOTÉTICA: NÃO

(iv) ΑΝΤΙ-MENSAGEIRO: NÃO (vi) FONTE ORIGINAL: (A) ORGANISMO: HOMO SAPIENS (F) TIPO DE TECIDO: Carcinoma (vii) FONTE IMEDIATA: (B) CLONE: Antigénio de membrana específico da próstata (ix) CARACTERÍSTICA:

(A) NOME/CHAVE: CDS (B) LOCAL: 262 ..2511 (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID N°: 1: CTCAAAAGGG GCCGGATTTC CTTCTCCTGG AGGCAGATGT TGCCXCTCTC TCTCGCTCGG 60 ATTGGTTCAG TGCACTCTAG ASACACTSCT GIGGTGGAGA AACTGGBCCC CftGGTCTSGA 120 QCGAATTCCA GCCT8CAGGG CTGATAAGCG A^CATTAGT GAGATTSAGA GAGACTTTAC 180 CCCGCCGTGG TGGTTGGAGG 6CG0GCAGTA GAGCA8CAGC ACAGGCGCGG GTCCCG5GAG 240 GCCGGCTCTG CTCGCGCCGA 6 ATS TGG AAT CTC CTT CAC GAA ACC GAC TCG 291 «et Trp Asn Leu Leu Hie Glu Thr Asp Ser 15 10 GCT GTG GCC ACC GCG CGC CGC CCS CSC TGG CTG TGC GCT GGG GCG CÍG 339

Ala Vai Ala Thr Ala Arg Arg Pro Arg Trp Leu Cy» Ala Gly Ala Leu 15 20 25 GTG CTG GCG GGT GGC TTC TTT CTÇ CTC GGC TTC CTC TTC GGG TGG TTT 387

Vai Leu Ala Gly Gly Phe Pite Leu Leu Gly Phe Leu Phe Gly Trp Phe 30 33 40 ATA AAA TCC TCC AAT GAA GCT ACT AAC ATT ACT CCA AAG CAT AAT ATS 435 lie Lys Ser Ser Asn Giu Ala Thr Asa lie Thr Pro Lys «is Asa «et 45 50 55 AAA GCA TTT TTG GAT GAA TTG AAA GCT GAG AAC ATC AAG AA6 TTC TTA 403

Lys Ala Phe Leu Asp Glu leu Lye Ala Glu Asn Ile Lye Lys Phe Leu 60 65 70 TAT AAT TTT ACA CftG ATA CCA CAT TXA GCA GGA ACA GAA CAA AAC TTT £31

Tyr Asn Phe Thr Gla tle Pro «ia Leu Ala Gly Thr Glu Gin As» Phe 75 80 85 90 CAG CTT GCA AAC CAA ATT CAA TCC CAG TGG AAA GAA TTT GGC CTG GAT 579

Gin leu Ma Lys Gin Ile Gin Ser Gin Trp Lys Glu Phe Gly Leu Asp 95 100 105 TCT GTT GAG CTA GCA CAT TAT GAT GTC CTG TTG TCC TAC CCA AAT AAG €27

Ser Vai Glu Leu Ala Eis Tyr Asp Vai Leu Leu Ser Tyr Pro Asa Lys 110 115 120 ACT CAT CCC AAC TAC ATC TCA ATA ATT AAT GAA GAT GGA AAT GAfi ATT €75

Thr Hlβ Pr© Asn Tyr Ile Ser Xie Ile Asn Glu Asp Gly Asa Glu Ile 125 130 135 TTC AAC ACA TCA TTA TTT GAA CCA CCT CCT CCA GGA TAT GAA AAT GTT 723

Pise Asn Thr Ser Leu Phe Glu Pro Pro Pro Pro Gly Tyr Glu Asa Vai 140 145 150 TCG GAT ATT GTA CCA CCT TTC AGT GCT TTC TCT CCT CAA GGA ATG CCA 771

Ser Asp Ile Vai Pro Pro Phe Ser Ala Phe Se* Pro Gin Gly mx. Pro 195 ISO 165 170 GAG GGC GAT CTA GTG TAT GTT AAC TAT GCA CGft ACT GAA GAC TTC TTT 819

Glu Gly Asp Leu Vai Tyr Vai Asn Tyr Ala Arg Thr Glu Asp Phe Phe 175 ISO 185 AAA TTG GAA CGG GAC ATG AAA ATC AAT TGC TCT GGG AAA ATT GTA ATT 8Ê7

Lys Leu Glu Arg Asp Met Lys Ile Asn Cys Ser Gly Lys Ile Vai Ile 190 195 200 GCC AGA TAT GGG AAA GTT TTC ASA GGA AAT AAG GTT AAA AAT GCC CM Í15

Ala Arg Tyr Gly Lys Vai Phe Arg Gly Asn Lys Vai Lys Asn Ala Gin 205 210 215 963 963 AAA GOA GTC ATT CTC TAC TCC GAC CCT GCT GAC TAC Lya Gly Vai 225 11« Leu Tyr Ser Asp Pr© 230 Ala Asp Tyr GTG AAG TCC TAT CCA GAT GGT TGG AAT CTT CCT GGA Vai Lys 240 Ser Tyr Pr© ASp Gly 245 Trp Asa Leu Pro Gly 250 CGT GGA AAT Air· CTA AAT CTG AAT GGT GCA GGA GAC Arg 255 Gly Asn Ile Leu Asa Leu 250 Asn Gly Ala Gly 255 Asp GGT TAC CCA GCA AAT GAA TAT GCT TAT AGS CGT GGA Gly Tyr Pr© Ala Asn Glu Tyr 215 Ala Tyr Arg Arg 280 Gly GTT GGT CTT CCA AGT ATT CCT GTT CAT CCA ATT GGA Vai Gly Leu Pr© 290 Ser Ile Pr© val Kis 295 Pro lie Gly CAC AAG CTC CTA GAA AAA ATS GGT GGC TCA GCA CCA Gin Lys Leu 305 Leu Glu Lys Het Gly Gly 310 Ser Ala Pr© TGG AGA GGA AGT CTC AAA GTG CCC TAC AAT GTT GGA Trp Arg 320 Gly Ser Leu Lys VAI 325 Pro Tyr Asn Vai Gly 330 GGA AAC ΤΪΤ TCT ACA CAA AAA GTC AAG ATG CAC ATC Gly 335 As» Phe Ser Thr Gin Lys 340 Vai Lys JSet His 34$ Ile GAA GTG ACA AGA ATT TAC AAT GTG ATA GGT ACT CTC Glu Vai Thr Arg Ile Tyr Asn 355 Vai Ile Gly Thr 350 Leu GAA CCA GAC AGA TAT GTC ATT CTG GGA GGT CAC GGG Glu Pr© Asp Arg 370 Tyr Vai Ile Leu Gly 315 Gly His Arg TTT GGT GGT ATT GAC CCT CAG AGT GGA GCA GCT GTT Phe Gly Gly 385 Ile Asp Pr© Gin Ser Gly 390 Ala Ala Vai GTG AGG AGC TTT GOA ACA CTG AAA AAG GAA GGG TGG Vai Arg 400 Ser Phe Gly Thr Leu 405 Lys Lys Glu Gly Trp 410 ACA ATT TTG TTT GCA AGC TGG GAT GCA GAA GAA TTT Thr Ile Leu Phe Ala Ser Trp Asp Ala Glu Glu Phe

CTG GCA GGG OCC

Leu Ala Gly Ala 220 1023 1055 1107 2155 2203 2251 1299 1347 2395 1443 2492 1539

ΤΓΤ GCT CCT GGG Phe Ala Pr© Gly 23S ggt ggt stg cm Gly Gly Val Gin CCT CTC ACA CCA Pr© Leu Thr Pr© 270 ATT GCA GAC GCT Ile »a Glu Ala 285 TAC TAT OAT GCA Tyr Tyr Asp .Ala 200 CCA GAT AGC AGC Pro Asp Ser Ser

ISO AGA GGA GCA GTG Arg Gly Ala Vai 365 GAC TCA TGG GTG Aep Ser Txp Vai 380 GTT CAT GAA ATT Vai His Glu Ile 395 AGA CCT AOA AGA Arg Pr© Arg Arg 415 420 425 GGT CTT CTT GGT TCT ACT GAG TGG GCA GAG GAG AAT TCA AGA CTC CTT 15S7 Gly Leu Leu Gly Ser Thr Glu Trp Ala Glu Glu Asn Ser Arg Leu Leu 430 435 440 CAA GAG CGT GGC GTG GCT TAT ATT AAT GCT GAC TCA TCT ATA GAA GGA 1635 Gin Glu Arg Gly val Ala Tyr lie A®n Ala Asp Ser Ser ile Glu Gly 445 4 50: 455 AAC TAC ACT CTG AGA GTT GAT TCT ACA CCG CTG ATG TAC AGC TTG CTA 1683 Asn Tyr Thr Leu Arg Val Asp Cys Thr Pr© Leu Met Tyr Ser Leu Val 450 46$ 470 CAC AAC CTA ACA AAA GAG CTG AAA AGC CCX GAT GAA GGC TTT GAA GGC 1732 His Asn Leu Thr Lye Glu Leu Lys Ser Pr© ASp GiU Gly Phe Glu Gly 475 480 485 490 AAA TCT CTT TAT GAA AGT TGG ACT AAA AAA AGT CCT TCC CCA GAG TTC 1779 Lye Ser Leu Tyr Glu 495 Ser Trp Thr Lys Lys 500 Ser Pro Ser Fro Glu 505 Fhe AGT QQC ATG ccc AGG ATA AGC AAA TTG GGA TCT ÇGA AAT GAT TTT GAG 1627 Ser Gly Met Pr© 510 Arg lie Ser Lys Leu 515 Gly Ser Gly Aen Asp Phe 520 Glu στο TTC TTC CAA CGA CTT GGA ATT GCT TCA GGC AGA GCA CGS TAT ACT 1S75 Val Phe Phe 525 Gin Arg Leu Gly Ile 530 Ala Ser Gly Arg Ala 535 Arg Tyr Thr MA AAT TGG GAA ACA AAC AAA TTC AGC GGC TAT CCA CTG tat cac AGT 1923 Lys Aa» 540 Trp GlU Thr Aan Lye Phe 545 Ser Gly Tyr Pr© Leu 550 Tyr Mis Ser GTC TAT GAA ACA TAT GAG TTG GTG GAA AAG TTT TAT GAT CCA ATG TTT 1971 V#1 553 Tyr Glu Thr Tyr Glu 560 Leu Val Glu Lys Phe Tyr Asp 565 Pr© «et Fhe 570 ΑΑΆ TAT CAC CTC act GTG CCC CAG CGA GGA GGG ATG GTG TTT GAG 2019 LF6 Tyr Hie Leu Thr 575 Vai Ais Gin VAl Arg 560 Gly Gly Man Val Fhe '505 Glu CTA GCC AAT TCC ATA GTG CTC CCT TTT GAT TGT CGA GAT TAT GCT GTA 2067 Leu Ala Aen Ser 59C lie Val Leu Pro Fhe 595 Asp Cys Arg Asp Tyr Ala 600 val GTT TTA asa AAS TAT GCT GAC AAA ATC TAC AGT ATT TCT ATG AAA CAT 2115 Val leu Arg 605 Lys Ala Aap Lys 610 Ile Tyr Ser ile Ser €15 Met Lys His CCA CAG GAA ATG ACA TAC AGT GTA TCA TTT GAT TCA CTT TTT TCT 2163 Pxo Gin 620 Glu Met Lys Tfc r Tyr Ser 625 Val ser Phe Asp Ser 630 Leu Phe ser OCA GTA AAC AAT τη ACA GAA ATT GCT tcc AAS TTC AGT GAG ASA CTC 2211 Ala 625 Val Lys A&n Phe Thr £40 Glu Ile Ala Ser Lys Phe Ser £45 Glu Arg Leu £50 CAG GAC TTT GAC AAA ASC AAC CCA ATA GTA TTA A0A ATO ATO AAT GAT 2259 Gin Aep Phe Asp Lya £55 Ser Asn Pr© Xle Val 660 Leu Arg Hat Met Asn 665 Asp GAA CTC ATG TTT CTG GAA AGA GCA TTT ATT GAT CCA TTA GGG TTA CCA 2307 Gin Leu Met Fhe Leu €70 Glu Arg Ala Phe €75 ile Asp Pr© Leu Gly Leu £80 Pro GAC AGG CCT TTT TAT AGG CAT GTC ATC TAT GCT CCA AGC AGC CAC AAC 2355 Asp Arg Pr© €65 Phe Tyr Arg HiS Val 690 Ile Tyr Ala Pro Ser 695 Ser His Asn AAG TAT GCA GGG GAG TCA TTC CCA GOA ATT TAT GAT GCT CTG TTT GAT 2403 Lys Tyr 700 Ala Gly Glu Ser Fhe 705 Pr© Gly ile Tyr Asp 710 Ala Leu Phe Asp ATT GAA AGC AAA GTG GAC CCT TCC AAG GCC TGG GGA GAA GTG AAG AGA 24S1 11« Glu 715 Ser Lye Val Aep 720 Pr© Ser Lye Ala Trp 725 Gly Glu Val Lys Arg 730 CAG AW TAT GW SGA GCC TTC AÇA GTG CAG GCA GCT GCA GAG ACT TTG 2499 Gin Ile Tyr Val Ala 735 Ala Fhe Thr Val Gin 740 Ala Ala Ala Glu Thr 745 Leu AGT GAA GTA GCC TAAGAGGATT ΤΪΤΤΑΟΑΟΑΑ TCCGTATTGA ATTTGTGTGG 2551

Ser Glu Vai Ala 750

TATGTCACTC AGAAAGARTC GTAATGGGTA ΤΑΤΤΟΑΤΑΑΑ ΤΓΤΤΑΑΑΑΤΤ GCTATATTTG ARATÁAASTT GAATATTATA TATAAAAAAA AftAAftAAftAA AA 2621 2653 (2) INFORMAÇÃO PARA A SEQ ID N°: 2: (i) CARACTERÍSTICAS DE SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 750 aminoácidos (B) TIPO: aminoácido (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: proteína (xi) DESCRIÇÃO DE SEQUÊNCIA: SEQ ID N°: 2:

Hec Trp Asn Leu Leu Hie Glu Thr Asrp Ser Ala Vai Ala Thr Ala Arg 15 10 15

Phe Leu Leu Gly Phe Leu Phe Gly Trp Phe Ile Lye Ser Ser As» Glu 35 40 45

Ala Thr Aan lie Thr Pro Lys Hie Asn Met Lye Ala Phe Leu Asp Glu 50 55 €0

Leu Lys Ala Glu Asn Ile Lye Lye Phe Leu Tyr As» Phe Thr Gin Ile 55 70 75 80

Pr o His Leu Ala Gly Thr Glu Gin Asn Phe Gin Leu Ala Lye Gin lie 85 90 95

Gin Ser Gin Trp Lys Glu Phe Gly Leu Aep Ser Vai Glu Leu Ala Hie 100 105 110

Ser Ile Ile Asn Glu Asp Gly Asn Glu Ile Phe Mn Thr Ser Leu Phe 110 135 240

Vai Asn Tyr Ala Arg Thr Glu Αερ Phe Phe Lys Leu Glu Arg Asp Met 180 185 190

Lye Ile Asn cye Ser Gly Lye 11« Vai Ile Ala Arg Tyr Gly Lys vai 295 200 205

Phe Arg Gly Aen Lys Vai Lys Asn Al* Gin Leu Ala Gly Ala Lys G 210 215 220

Ser Tyr Pro Asp Gly Trp Αβη Leu Pro Gly Gly Gly Vai Gin Arg G: 245 250 255

Pro Ala Ae» Glu Tyr Ala Tyr Arg Arg Gly Ue Ala Glu Ala Vai GI 275 280 285

305 310 315 3J

Phe Ser Thr Gin Lys Vai Lys Set Hle ile Hia Ser Thr Asn Glu v* 340 345 350

Thr Arg Ile Tyr Asn Vai Ile Gly Thr Leu Arg Gly Ala Vai Glu Pi 355 350 355

Asp Arg Tyr Vai Ile Leu Gly Gly Hie Arg Asp Ser Trp Vai Phe 61 370 375 380

385 350 39S «C

Ser Phe Gly Thr Leu Lys Lys Glu Gly Trp Arg Pro Arg Arg Thr XI 405 410 415

Leu Phe Ala Ser Trp Asp Ala Glu Glu phe Gly Leu Leu Gly Ser Th 430 425 410

Glu Trp Ala Glu Glu A*n Ser Arg Leu Leu Gin Glu Arg Gly Vai Al 435 440 445

Tyr Ile Aan Ala Asp Ser Ser Ile Glu Gly Asn Tyr Thr Leu Arg Vai 450 455 >440

Ser Lys Leu §15 Gly Ser Gly AS» Aep 520 Phe Glu Vai Phe Phe 525 Gin Arg Leu Gly Ile 530 Ala Ser Gly Arg Ala S3S Arg Tyr Thr Lys AS» S40 Trp Glu Thr As» Lys 545 Phe Ser Gly Tyr Pr© S§0 Leu Tyr Eis Ser Vai SS5 Tyr Glu Tfer Tyr Glu 560 Leu Vai Glu Lys Phe Tyr 565 Aap Pro Het Phe 570 Lya Tyr His Leu Thr 575 Vai Ala Gin Vai Arg 530 Gly Gly *iet Vai Phe 505 Glu Leu Ala As» Ser §00 lie Vai Leu Pr© Phe 5SS Aap Cye Arg Aap Tyr 600 Ala Vai Vai Leu Arg 605 Lys Tyr Ala Asp Lye 610 ile Tyr Ser Ile Ser SIS Het Lys His Pro Gin 620 Glu Het Lys Thr Tyr Ser 625 Vai Ser Phe Aap 630 Ser Leu Phe Ser Ala 635 Vai Lys AS» Phe Thr 640 62 u Ile Ala Ser Lvb Phe 645 Ser Glu Arg Leu €50 61» Aap Phe Aep Lya 65S ser As» Pr© He Vai 660 Leu Arg Het Met Asn 66S Asp Gin Leu Het Phe 670 Leu Glu Arg· Ale Phe SIS Ile Asp Pro Leu Gly 660 Leu pro Aap Arg Pro 665 Phe Tyr Arg Kia Vai 690 Ile iyr Ala Pro Ser 655 Ser His As» Lye Tyr 700 Ala Gly Glu Ser Phe 705 Pro Gly lie Tyr Aap 71D Ala Leu Phe Aap Ile 71S Glu Ser Lys Vai Asp 720 Pro Ser Lys Ala Trp Gly 725 GlU Vai Lys Arg 710 Gin Ile Tyr Vai Ala 735 Ala Pita TÍÍE Vai Gin 740 Ala Ala Ala Glu Thr 745 Leu Ser Glu Vai Ala 750 (2) INFORMAÇÃO PARA A SEQ ID N°: 3: (i) CARACTERÍSTICAS DE SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 8 aminoácidos (B) TIPO: aminoácido (C) TIPO DE HÉLICE: dupla (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: peptídeo

(iii) HIPOTÉTICA: NÃO

(iv) ΑΝΤΙ-MENSAGEIRO: NAO (vi) FONTE ORIGINAL: (A) ORGANISMO: HOMO SAPIENS (F) TIPO DE TECIDO: Carcinoma (vii) FONTE IMEDIATA: (B) CLONE: Antigénio de membrana especifico da próstata (xi) DESCRIÇÃO DE SEQUÊNCIA: SEQ ID N°: 3:

Ser leu Tyr Glu Ser X&a Thr Lye 1 s (2) INFORMAÇÃO PARA A SEQ ID N°: 4: (i) CARACTERÍSTICAS DE SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 15 aminoácidos (B) TIPO: aminoácido (C) TIPO DE HÉLICE: dupla (D) TOPOLOGIA: linear

(ii) TIPO DE MOLÉCULA: PEPTÍDEO

(iii) HIPOTÉTICA: NÃO

(iv) ΑΝΤΙ-MENSAGEIRO: NÃO (vi) FONTE ORIGINAL: (A) ORGANISMO: HOMO SAPIENS (F) TIPO DE TECIDO: Carcinoma (vii) FONTE IMEDIATA: (B) CLONE: Antigénio de membrana especifico da ir-1- ^SLâtcÍ (xi) DESCRIÇÃO DE SEQUÊNCIA: SEQ ID N°: 4:

Ser Tyx Pro Aep Gly Xaa Jtam Leu Pro Gly Gly Qly i s io *** is (2) INFORMAÇÃO PARA A SEQ ID N°: 5: 1 CARACTERÍSTICAS DE SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 7 aminoácidos (B) TIPO: aminoácido (C) TIPO DE HÉLICE: dupla (D) TOPOLOGIA: linear

(ii) TIPO DE MOLÉCULA: PEPTÍDEO

(iii) HIPOTÉTICA: NÃO

(iv) ΑΝΤΙ-MENSAGEIRO: NÃO (vi) FONTE ORIGINAL: (A) ORGANISMO: HOMO SAPIENS (F) TIPO DE TECIDO: Carcinoma (vii) FONTE IMEDIATA: (B) CLONE: Antigénio de membrana especifico da próstata (xi) DESCRIÇÃO DE SEQUÊNCIA: SEQ ID N°: 5:

Phe Tyr Asp Pro Met Plíe hym 1 5 (2) INFORMAÇÃO PARA A SEQ ID N°: 6: (i) CARACTERÍSTICAS DE SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 9 aminoácidos (B) TIPO: aminoácido (C) TIPO DE HÉLICE: dupla (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: proteína

(iii) HIPOTÉTICA: NÃO

(iv) ΑΝΤΙ-MENSAGEIRO: NÃO (vi) FONTE ORIGINAL: (A) ORGANISMO: HOMO SAPIENS (F) TIPO DE TECIDO: Carcinoma (vii) FONTE IMEDIATA: (B) CLONE: Antigénio de membrana específico da próstata (xi) DESCRIÇÃO DE SEQUÊNCIA: SEQ ID N°: 6: 11* lyr Asn Vai II* 01y Thr L&u I*y& 1 5 (2) INFORMAÇÃO PARA A SEQ ID N°: 7: (i) CARACTERÍSTICAS DE SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 22 aminoácidos (B) TIPO: aminoácido (C) TIPO DE HÉLICE: dupla (D) TOPOLOGIA: linear

(ii) TIPO DE MOLÉCULA: PEPTÍDEO

(iii) HIPOTÉTICA: NÃO (iv) ANTI-MENSAGEIRO: NÃO (vi) FONTE ORIGINAL: (A) ORGANISMO: HOMO SAPIENS (F) TIPO DE TECIDO: Carcinoma (vii) FONTE IMEDIATA: (B) CLONE: Antigénio de membrana específico da próstata (xi) DESCRIÇÃO DE SEQUÊNCIA: SEQ ID N°: 7:

Aso Pbe Glo Um Ala lys 20 (2) INFORMAÇÃO PARA A SEQ ID N°: 8: (i) CARACTERÍSTICAS DE SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 17 aminoácidos (B) TIPO: aminoácido (C) TIPO DE HÉLICE: dupla (D) TOPOLOGIA: linear

(ii) TIPO DE MOLÉCULA: PEPTÍDEO

(iii) HIPOTÉTICA: NÃO

(iv) ΑΝΤΙ-MENSAGEIRO: NÃO (vi) FONTE ORIGINAL: (A) ORGANISMO: HOMO SAPIENS (F) TIPO DE TECIDO: Carcinoma (vii) FONTE IMEDIATA: (B) CLONE: Antigénio de membrana específico da próstata (xi) DESCRIÇÃO DE SEQUÊNCIA: SEQ ID N°: 8:

Lye (2) INFORMAÇÃO PARA A SEQ ID N°: 9: (i) CARACTERÍSTICAS DE SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 17 aminoácidos (B) TIPO: aminoácido (C) TIPO DE HÉLICE: dupla (D) TOPOLOGIA: linear

(ii) TIPO DE MOLÉCULA: PEPTÍDEO

(iii) HIPOTÉTICA: NÃO

(iv) ΑΝΤΙ-MENSAGEIRO: NÃO (vi) FONTE ORIGINAL: (A) ORGANISMO: HOMO SAPIENS (F) TIPO DE TECIDO: Carcinoma (vii) FONTE IMEDIATA: (B) CLONE: Antigénio de membrana especifico da próstata (xi) DESCRIÇÃO DE SEQUÊNCIA: SEQ ID N°: 9:

Pro Val He leu Tyr Ser Aso Pro Ale Asp Tyr Phe Ala Pro Gly V&l

x s 10 IS

Lye (2) INFORMAÇÃO PARA A SEQ ID N°: 10: (i) CARACTERÍSTICAS DE SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 15 aminoácidos (B) TIPO: aminoácido (C) TIPO DE HÉLICE: dupla (D) TOPOLOGIA: linear

(ii) TIPO DE MOLÉCULA: PEPTÍDEO

(iii) HIPOTÉTICA: NÃO

(iv) ΑΝΤΙ-MENSAGEIRO: NÃO (vi) FONTE ORIGINAL: (A) ORGANISMO: HOMO SAPIENS (F) TIPO DE TECIDO: Carcinoma (vii) FONTE IMEDIATA: (B) CLONE: Antigénio de membrana especifico da próstata (xi) DESCRIÇÃO DE SEQUÊNCIA: SEQ ID N°: 10: is

Ale Pite lie Asp Pro Leu Gly Leu Pro Asp Arf Pro Phe Tyr Ar$ ie

1 s (2) INFORMAÇÃO PARA A SEQ ID N°: 11: (i) CARACTERÍSTICAS DE SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 19 aminoácidos (B) TIPO: aminoácido (C) TIPO DE HÉLICE: dupla (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: PEPTÍDEO

(iii) HIPOTÉTICA: NÃO (iv) ΑΝΤΙ-MENSAGEIRO: NÃO (vi) FONTE ORIGINAL: (A) ORGANISMO: HOMO SAPIENS (F) TIPO DE TECIDO: Carcinoma (vii) FONTE IMEDIATA: (B) CLONE: Antigénio de membrana especifico da próstata (xi) DESCRIÇÃO DE SEQUÊNCIA: SEQ ID N°: 11:

Tyr Ala Sly 01« Ser Pfte Pro Gly Xle Tyr Aap Ala Leu Phe Asp Xis i s io is 61« Ser Lye (2) INFORMAÇÃO PARA A SEQ ID N°: 12: (i) CARACTERÍSTICAS DE SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 22 aminoácidos (B) TIPO: aminoácido (C) TIPO DE HÉLICE: dupla (D) TOPOLOGIA: linear

(ii) TIPO DE MOLÉCULA: PEPTÍDEO

(iii) HIPOTÉTICA: NÃO

(iv) ΑΝΤΙ-MENSAGEIRO: NÃO (vi) FONTE ORIGINAL: (A) ORGANISMO: HOMO SAPIENS (F) TIPO DE TECIDO: Carcinoma (vii) FONTE IMEDIATA: (B) CLONE: Antigénio de membrana especifico da próstata (xi) DESCRIÇÃO DE SEQUÊNCIA: SEQ ID N°: 12:

Tiir Ile Leu Ffte Ala Ser *Erp mp Ale 61« Gi» Phe Gly &aa xea Glu l S 10 15

Ser Tftr 01« 01» Ale 01» 20 (2) INFORMAÇÃO PARA A SEQ ID N°: 13: (i) CARACTERÍSTICAS DE SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 17 pares de base (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE HÉLICE: dupla (D) TOPOLOGIA: linear

(ii) TIPO DE MOLÉCULA: cDNA

(iii) HIPOTÉTICA: NÃO

(iv) ΑΝΤΙ-MENSAGEIRO: NÃO (vi) FONTE ORIGINAL: (A) ORGANISMO: HOMO SAPIENS (F) TIPO DE TECIDO: Carcinoma (vii) FONTE IMEDIATA: (B) CLONE: Antigénio de membrana especifico da próstata (xi) DESCRIÇÃO DE SEQUÊNCIA: SEQ ID N°: 13: TTYTAYGAYC CM&TGTT 17 (2) INFORMAÇÃO PARA A SEQ ID N°: 14: (i) CARACTERÍSTICAS DE SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 17 pares de base (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE HÉLICE: dupla (D) TOPOLOGIA: linear

(ii) TIPO DE MOLÉCULA: cDNA

(iii) HIPOTÉTICA: NÃO

(iv) ΑΝΤΙ-MENSAGEIRO: NÃO (vi) FONTE ORIGINAL: (A) ORGANISMO: HOMO SAPIENS (F) TIPO DE TECIDO: Carcinoma (vii) FONTE IMEDIATA: (B) CLONE: Antigénio de membrana especifico da próstata (xi) DESCRIÇÃO DE SEQUÊNCIA: SEQ ID N°: 14: AAOATMGGRT CRTARAA 17 (2) INFORMAÇÃO PARA A SEQ ID N°: 15: (i) CARACTERÍSTICAS DE SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 17 pares de base (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE HÉLICE: dupla (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: : cDNA (iii) HIPOTÉTICA: NÃO (iv) ANTI-MENSAGEIRO: NÃO (vi) FONTE ORIGINAL: (A) ORGANISMO: HOMO SAPIENS (F) TIPO DE TECIDO: Carcinoma (vii) FONTE IMEDIATA: (B) CLONE: Antigénio de membrana específico da próstata (xi) DESCRIÇÃO DE SEQUÊNCIA: SEQ ID N°: 15: ATHTÂYAí kYG TNAIHGG 17 (2) INFORMAÇÃO PARA A SEQ ID N°: 16 (i) CARACTERÍSTICAS DE SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 17 pares de base (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE HÉLICE: dupla (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: cDNA (iii) HIPOTÉTICA: NÃO (iv) ΑΝΤΙ-MENSAGEIRO: NÃO (vi) FONTE ORIGINAL: (A) ORGANISMO: HOMO SAPIENS (F) TIPO DE TECIDO: Carcinoma (vii) FONTE IMEDIATA: (xi) (B) CLONE: Antigénio de membrana específico da próstata DESCRIÇÃO DE SEQUÊNCIA: SEQ ID N°: 16: CCDATNACRT TRTADAT 17 (2) INFORMAÇÃO PARA A SEQ ID N°: 17 (i) CARACTERÍSTICAS DE SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 17 pares de base (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE HÉLICE: dupla (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: cDNA (iii) HIPOTÉTICA: NÃO (iv) ΑΝΤΙ-MENSAGEIRO: NÃO (vi) FONTE ORIGINAL: (A) ORGANISMO: HOMO SAPIENS (F) TIPO DE TECIDO: Carcinoma (vii) FONTE IMEDIATA: (B) CLONE: Antigénio de membrana específico da próstata (xi) DESCRIÇÃO DE SEQUÊNCIA: SEQ ID N°: 17: CCNGCNGAYT AYTTYGC 17 (2) INFORMAÇÃO PARA A SEQ ID N°: 18 (i) CARACTERÍSTICAS DE SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 17 pares de base (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE HÉLICE: dupla (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: cDNA (iii) HIPOTÉTICA: NÃO (iv) ΑΝΤΙ-MENSAGEIRO: NÃO (vi) FONTE ORIGINAL: (A) ORGANISMO: HOMO SAPIENS (F) TIPO DE TECIDO: Carcinoma (vii) FONTE IMEDIATA: (B) CLONE: Antigénio de membrana especifico da próstata (xi) DESCRIÇÃO DE SEQUÊNCIA: SEQ ID N°: 18: GCRAARTART CNGCNGG 17 (2) INFORMAÇÃO PARA A SEQ ID N°: 19 (i) CARACTERÍSTICAS DE SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 20 pares de base (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE HÉLICE: dupla (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: cDNA (iii) HIPOTÉTICA: NÃO (iv) ΑΝΤΙ-MENSAGEIRO: NÃO (vi) FONTE ORIGINAL: (A) ORGANISMO: HOMO SAPIENS (F) TIPO DE TECIDO: Carcinoma (vii) FONTE IMEDIATA: (B) CLONE: Antigénio de membrana especifico da próstata (xi) DESCRIÇÃO DE SEQUÊNCIA: SEQ ID N°: 19: ACNGARCARA AYTTYCARCT 20 (2) INFORMAÇÃO PARA A SEQ ID N°: 20 (i) CARACTERÍSTICAS DE SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 20 pares de base (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE HÉLICE: dupla (D) TOPOLOGIA: linear (Íi) TIPO DE MOLÉCULA: cDNA (iii) HIPOTÉTICA: NÃO (iv) ΑΝΤΙ-MENSAGEIRO: NÃO (vi) FONTE ORIGINAL: (A) ORGANISMO: HOMO SAPIENS (F) TIPO DE TECIDO: Carcinoma (vii) FONTE IMEDIATA: (B) CLONE: Antigénio de membrana especifico da próstata (xi) DESCRIÇÃO DE SEQUÊNCIA: SEQ ID N°: 20: AGYTGRAART TYTGYTCNGT 20 2) INFORMAÇÃO PARA A SEQ ID N°: 21 (i) CARACTERÍSTICAS DE SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 17 pares de base (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE HÉLICE: dupla (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: cDNA (iii) HIPOTÉTICA: NÃO (iv) ΑΝΤΙ-MENSAGEIRO: NÃO (vi) FONTE ORIGINAL: (A) ORGANISMO: HOMO SAPIENS (F) TIPO DE TECIDO: Carcinoma (vii) FONTE IMEDIATA: (B) CLONE: Antigénio de membrana especifico da próstata (xi) DESCRIÇÃO DE SEQUÊNCIA: SEQ ID N°: 21 GARCARAAYT TYCARCT 17 2) INFORMAÇÃO PARA A SEQ ID N°: 22: (i) CARACTERÍSTICAS DE SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 17 pares de base (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE HÉLICE: dupla (D) TOPOLOGIA: linear

(ii) TIPO DE MOLÉCULA: cDNA

(iii) HIPOTÉTICA: NÃO

(iv) ΑΝΤΙ-MENSAGEIRO: NÃO (vi) FONTE ORIGINAL: (A) ORGANISMO: HOMO SAPIENS (F) TIPO DE TECIDO: Carcinoma (vii) FONTE IMEDIATA: (B) CLONE: Antigénio de membrana especifico da próstata (xi) DESCRIÇÃO DE SEQUÊNCIA: SEQ ID N°: 22: AGYTGRAART TYTGYTC 17 (2) INFORMAÇÃO PARA A SEQ ID N°: 23: (i) CARACTERÍSTICAS DE SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 20 pares de base (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE HÉLICE: dupla (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: : cDNA (ííí; ) HIPOTÉTICA: NÃO (iv) ANTI-MENSAGEIRO: NÃO (vi) FONTE ORIGINAL: (A) ORGANISMO: HOMO SAPIENS (F) TIPO DE TECIDO: Carcinoma (vii) FONTE IMEDIATA: (B) CLONE: Antigénio de membrana especifico da próstata (xi) DESCRIÇÃO DE SEQUÊNCIA: SEQ ID N°: 23: TGGGAYGCNG ARGARTTYGG 20 (2) INFORMAÇÃO PARA A SEQ ID N°: 24: (i) CARACTERÍSTICAS DE SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 20 pares de base (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE HÉLICE: dupla (D) TOPOLOGIA: linear

(ii) TIPO DE MOLÉCULA: cDNA

(iii) HIPOTÉTICA: NÃO

(iv) ΑΝΤΙ-MENSAGEIRO: NÃO (vi) FONTE ORIGINAL: (A) ORGANISMO: HOMO SAPIENS (F) TIPO DE TECIDO: Carcinoma (vii) FONTE IMEDIATA: (B) CLONE: Antigénio de membrana específico da próstata (xi) DESCRIÇÃO DE SEQUÊNCIA: SEQ ID N°: 24: CCRAAYTCYT CNGCRTCCCA 20 (2) INFORMAÇÃO PARA A SEQ ID N°: 25: (i) CARACTERÍSTICAS DE SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 17 pares de base (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE HÉLICE: dupla (D) TOPOLOGIA: linear

(ii) TIPO DE MOLÉCULA: cDNA

(iii) HIPOTÉTICA: NÃO

(iv) ANTI-MENSAGEIRO: NÃO (vi) FONTE ORIGINAL: (A) ORGANISMO: HOMO SAPIENS (F) TIPO DE TECIDO: Carcinoma (vii) FONTE IMEDIATA: (B) CLONE: Antigénio de membrana específico da próstata (xi) DESCRIÇÃO DE SEQUÊNCIA: SEQ ID N°: 25: TGGGAYGCNG ARGARTT 17 (2) INFORMAÇÃO PARA A SEQ ID N°: 26: (i) CARACTERÍSTICAS DE SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 17 pares de base (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE HÉLICE: dupla (D) TOPOLOGIA: linear

(ii) TIPO DE MOLÉCULA: cDNA

(iii) HIPOTÉTICA: NÃO

(iv) ΑΝΤΙ-MENSAGEIRO: NÃO (vi) FONTE ORIGINAL: (A) ORGANISMO: HOMO SAPIENS (F) TIPO DE TECIDO: Carcinoma (vii) FONTE IMEDIATA: (B) CLONE: Antigénio de membrana especifico da próstata (xi) DESCRIÇÃO DE SEQUÊNCIA: SEQ ID N°: 26: AAYTCYTCNG CRTCCCA 17 (2) INFORMAÇÃO PARA A SEQ ID N°: 27: (i) CARACTERÍSTICAS DE SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 780 pares de base (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE HÉLICE: dupla (D) TOPOLOGIA: linear

(ii) TIPO DE MOLÉCULA: cDNA

(iii) HIPOTÉTICA: NÃO

(iv) ΑΝΤΙ-MENSAGEIRO: NÃO (xi) DESCRIÇÃO DE SEQUÊNCIA: SEQ ID N°: 27: TACACTTATC CCATTCGGAC ATGCCCACCT TGGAACTGGA GACCCTTACA CCCCftGGCTT £0 cccrrccrrc aaccacrccc asknstttcc accagttgas, tcttcaggac taccccacat 120 TGCTGTTCAG ACCATCTCTA GCAGTGCASC AGCCAGGCTC TTCAGCRAAA TGGATGGAGA 180 CACATGCTCT GAKAGNNGTT GGAAAGGTGC GATCCASHUT TCCTGTAAGG TNIíGACKKAA 240 CAAAGCAGGA GANNNKGCCA CAKTAATGGT G&AACTAGAT GTGAACAATT CCATGAAAGA 300

CftGGAAGATT CTGAACATCT TCGGTGCTAT CCftGGGATTT GAAGAACCTG ATCOGTATGT 360 TGTGATTGGA GCCCAGA6AG ACTCCTGGGG CCC&3GACTG GCTAAAGCTG GCACTGGAAC 420 TGCTATATTG TTGGAACTXX3 CCTGTGTGAT CTCAGACATA GTGAAAAACG AGGGCTACAA 480 ACCGAG3CGA A0CATCATCT TTGCTAGCTG GftGTGCAGGA GACTACGGAG CTGTGSGTGC S40 TACTGAATGG CTGGAGGGGT ACTCTGCCAT GCTGCATGCC AAftGCTTTCA CTTACATCAfJ £00 KGCTTGGATG CTCCAGTCCT GGGAQCAA3C CATGTCAAGA rrrCTGCCAG CCCCTTGCTG 660 720

TATATGCTGC TGGGGAGTAT TATGAAGGGG GTGAAGAATC CAGCAGCAGT CTCAGAGAGC SNKNCTCTAT AACAGACTTG OCCCAGACTG GGTAAAJíSGA GTTGTTCCTC TTGGCCTGGA (2) INFORMAÇÃO PARA A SEQ ID N°: 28: (i) CARACTERÍSTICAS DE SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 660 pares de base (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE HÉLICE: dupla (D) TOPOLOGIA: linear

(ii) TIPO DE MOLÉCULA: cDNA

(iii) HIPOTÉTICA: NÃO

(iv) ΑΝΤΙ-MENSAGEIRO: NÃO (xi) DESCRIÇÃO DE SEQUÊNCIA: SEQ ID N°: 28: TGCAGAAAAG CTATTCAAAft AC&TO3AASG AAACTCTCCT CCÍAGTTGGA ATATÀSATTC CTCATCTAAG CTGGSACTTT CAC&SAATCA AWmSTGAWS CTCACTSTGA ACAAtSSACT GAAA6ÃAACA AGAATACTTA ACATCTITOG 0SXTATTAAA SGCTATGAOG AACOU3ACC6 CTACATTGTA CTAGdAGCCC AGASAOACGC TTGGGGCCCT SGTffGTTGCG AAGtCCAiSTG TGGGAACA3G TCTSWCTGTT GAAACTTGCC CAASTATTCT CAGATATGAT TTCAAAAGAT GC^TTTAGAC CCAGCAGGAS TMPTAIUm GCCAGCTGOA CTGCAGGAGA CTATGGAGCT GTTGGTCCGA CTGAGTGCCT GGAGGGGTAC CTTTCATCTT TCCATCTAAA SSMSGCTTXC ACTTACATTA AfSOQGAlA AAGTCGTCCT GGGTACTASC AACTTCAAGG mOSCCAS CCCCCTA1TA TAIACACTTA TGGGQAAGAT AATGCAGGAN RCGTAAAGCA TCCGANNHNN «asammTGG AAAATATCXA TATCOAAACA GTAATTOGAT TAGCAAAATT GAS3AACTTT CCTÍGGACAA TGCTGCATTC CCTTTTCITG CATATTCASG AATCCCASCA m‘ITCT'I'l'CI' (2) INFORMAÇÃO PARA A SEQ ID N°: 29: (i) CARACTERÍSTICAS DE SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 540 pares de base (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE HÉLICE: dupla (D) TOPOLOGIA: linear

(ii) TIPO DE MOLÉCULA: cDNA

(iii) HIPOTÉTICA: NÃO

(iv) ΑΝΤΙ-MENSAGEIRO: NÃO (xi) DESCRIÇÃO DE SEQUÊNCIA: SEQ ID N°: 29:

TATGGAASGA GACTGTCCCT CTGACTGGAft AACAGACTCT ACATGTAOGA TGGTAACCTC

AGAAAGCAAG AATGTCAAGC TOICTGTSAC CAATOXCCTG AAAGAG&TAA AAATTCTTAA 780 60 120 180 240 300 360 420 480 54 Q 800 €60 £0 120

ISO

GkTCTTTGGA GTTATTARAG GCTJTGTAGfe ACCAGATCAC TATGTTGTAS TTGGGGCCCA GAGAGATGCft. TGGGGCCCTG QAGCTGCAAA ATOÍCGÇTGT AGGCACAGCT CTCCTATTGA 240 AACTTGCCCA GATGTTCTCA GATATGGTCT TAMÃSATSS GTTTCAGCCC AOCASAAGCA 300 TTA.TCTTTGC CAGTTGffi^rr GCTG5JU3ACT TTGGATCGGT TGGTGCCACT GAATGGCTAG 360 AGGGATACCT TTCGTCKCCr GCATTTAAAG GCTT2'bfeCT2' ATftTTAATCT GGATAAAGCG 420 GTTC1TSGTA CCAGCAACTT CAAfíGTTTCT GCCftGCCCkC TGTTGTATÃC GCtTATTGAG 400 AAAACAATGC AAAATtSTGAA GCATCCGGTT ACTGGGCAAT TTCTATATCA GGACAGCAAC 540 (2) INFORMAÇÃO PARA A SEQ ID N°: 30: (i) CARACTERÍSTICAS DE SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 27 pares de base (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE HÉLICE: dupla (D) TOPOLOGIA: linear

(ii) TIPO DE MOLÉCULA: PEPTÍDEO

(iii) HIPOTÉTICA: NÃO

(iv) ΑΝΤΙ-MENSAGEIRO: NÃO (vi) FONTE ORIGINAL: (A) ORGANISMO: HOMO SAPIENS (F) TIPO DE TECIDO: Carcinoma (vii) FONTE IMEDIATA: (B) CLONE: Antigénio de membrana especifico da próstata (xi) DESCRIÇÃO DE SEQUÊNCIA: SEQ ID N°: 30: ACGGAGCAAA ACTTTCAGCT TGCAAAG 27 (2) INFORMAÇÃO PARA A SEQ ID N°: 31: (i) CARACTERÍSTICAS DE SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 9 aminoácidos (B) TIPO: aminoácido (C) TIPO DE HÉLICE: dupla (D) TOPOLOGIA: linear

(ii) TIPO DE MOLÉCULA: PEPTÍDEO

(iii) HIPOTÉTICA: NÃO

(iv) ΑΝΤΙ-MENSAGEIRO: NÃO (vi) FONTE ORIGINAL: (A) ORGANISMO: HOMO SAPIENS (F) TIPO DE TECIDO: Carcinoma (vii) FONTE IMEDIATA: (B) CLONE: Membrana de Próstata Antigénio Específico (xi) DESCRIÇÃO DE SEQUÊNCIA: SEQ ID N°: 31:

Thr Slu Gin Asn Phe fila l»eu Ala Lys 1 s (2) INFORMAÇÃO PARA A SEQ ID N°: 32: (i) CARACTERÍSTICAS DE SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 36 pares de base (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE HÉLICE: dupla (D) TOPOLOGIA: linear

(ii) TIPO DE MOLÉCULA: PEPTÍDEO

(iii) HIPOTÉTICA: NÃO

(iv) ΑΝΤΙ-MENSAGEIRO: NÃO (vi) FONTE ORIGINAL: (A) ORGANISMO: HOMO SAPIENS (F) TIPO DE TECIDO: Carcinoma (vii) FONTE IMEDIATA: (B) CLONE: Antigénio de membrana especifico da próstata (xi) DESCRIÇÃO DE SEQUÊNCIA: SEQ ID N°: 32: CTCTTCGGCA TCCCAGCTTG CAAACAAAAT TGTTCT 36 (2) INFORMAÇÃO PARA A SEQ ID N°: 33: (i) CARACTERÍSTICAS DE SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 36 pares de base (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE HÉLICE: dupla (D) TOPOLOGIA: linear

(ii) TIPO DE MOLÉCULA: PEPTÍDEO

(iii) HIPOTÉTICA: NÃO

(iv) ΑΝΤΙ-MENSAGEIRO: NÃO (vi) FONTE ORIGINAL: (A) ORGANISMO: HOMO SAPIENS (F) TIPO DE TECIDO: Carcinoma (vii) FONTE IMEDIATA: (B) CLONE: Antigénio de membrana especifico da próstata (xi) DESCRIÇÃO DE SEQUÊNCIA: SEQ ID N°: 33: AGAACAATTT TGTTTGCAAG CTGGGATGCC AAGGAG 36 (2) INFORMAÇÃO PARA A SEQ ID N°: 34: (i) CARACTERÍSTICAS DE SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 12 aminoácidos (B) TIPO: aminoácido (C) TIPO DE HÉLICE: dupla (D) TOPOLOGIA: linear

(ii) TIPO DE MOLÉCULA: PEPTÍDEO

(iii) HIPOTÉTICA: NÃO

(iv) ΑΝΤΙ-MENSAGEIRO: NÃO (vi) FONTE ORIGINAL: (A) ORGANISMO: HOMO SAPIENS (G) TIPO DE CÉLULAS: Carcinoma (vii) FONTE IMEDIATA: (B) CLONE: Antigénio de membrana específico da próstata (xi) DESCRIÇÃO DE SEQUÊNCIA: SEQ ID N°: 34:

Thx 11 e Leu Phè Ala Ser Trp Asp Ala Glu Glu 1 S L» (2) INFORMAÇÃO PARA A SEQ ID N°: 35: (i) CARACTERÍSTICAS DE SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 6 aminoácidos (B) TIPO: aminoácido (C) TIPO DE HÉLICE: dupla (D) TOPOLOGIA: linear

(ii) TIPO DE MOLÉCULA: PEPTÍDEO

(iii) HIPOTÉTICA: NÃO

(iv) ΑΝΤΙ-MENSAGEIRO: NÃO (vi) FONTE ORIGINAL: (A) ORGANISMO: HOMO SAPIENS (G) TIPO DE CÉLULAS: Carcinoma (vii) FONTE IMEDIATA: (B) CLONE: Antigénio de membrana específico da próstata (xi) DESCRIÇÃO DE SEQUÊNCIA: SEQ ID N°: 35: ÂSp Glu heu Lye Ala Glu l s 2) INFORMAÇÃO PARA A SEQ ID N°: 36 (i) CARACTERÍSTICAS DE SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 6 aminoácidos (B) TIPO: aminoácido (C) TIPO DE HÉLICE: dupla (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: PEPTÍDEO (iii) HIPOTÉTICA: NÃO (iv) ΑΝΤΙ-MENSAGEIRO: NÃO (vi) FONTE ORIGINAL: (A) ORGANISMO: HOMO SAPIENS (G) TIPO DE CÉLULAS: Carcinoma (vii) FONTE IMEDIATA: (B) CLONE: Antigénio de membrana especifico da próstata (xi) DESCRIÇÃO DE SEQUÊNCIA: SEQ ID N°: 36:

As& Glu tep Gly Asn Glu

1 S (2) INFORMAÇÃO PARA A SEQ ID N°: 37 (i) CARACTERÍSTICAS DE SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 6 aminoácidos (B) TIPO: aminoácido (C) TIPO DE HÉLICE: dupla (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: PEPTÍDEO (iii) HIPOTÉTICA: NÃO (iv) ΑΝΤΙ-MENSAGEIRO: NÃO (vi) FONTE ORIGINAL: (A) ORGANISMO: HOMO SAPIENS (G) TIPO DE CÉLULAS: Carcinoma (vii) FONTE IMEDIATA: (B) CLONE: Antigénio de membrana especifico da próstata (xi) DESCRIÇÃO DE SEQUÊNCIA: SEQ ID N°: 37:

1' S (2) INFORMAÇÃO PARA A SEQ ID N°: 38 (i) CARACTERÍSTICAS DE SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 17 aminoácidos (B) TIPO: aminoácido (C) TIPO DE HÉLICE: dupla (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: PEPTÍDEO (iii) HIPOTÉTICA: NÃO (iv) ΑΝΤΙ-MENSAGEIRO: NÃO (vi) FONTE ORIGINAL: (A) ORGANISMO: HOMO SAPIENS (G) TIPO DE CÉLULAS: Carcinoma (vii) FONTE IMEDIATA: (B) CLONE: Antigénio de membrana especifico da próstata (xi) DESCRIÇÃO DE SEQUÊNCIA: SEQ ID N°: 38:

Ali Gly Ala Leu Vai Leu Ala Gly Gly Pite Phe Leu Leu Gly Phe Leu

1 5 10 IS

Lisboa, 5 de Janeiro de 2007

Claims

REIVINDICAÇÕES 1. Um ácido nucleico seleccionado de entre o grupo que é constituído por: (a) um ácido nucleico que codifica um polipeptídeo antigénio de membrana específico da próstata humana, o qual tem a sequência que é apresentada na SEQ ID N°: 2; (b) um ácido nucleico que tem a sequência que é apresentada na SEQ ID N°: 1 ou um fragmento da referida sequência, o qual codifica uma área antigénica para a qual um anticorpo pode ser gerado o qual é específico a um antigénio de membrana específico da próstata humana que tem a sequência apresentada na SEQ ID N°: 2; e (c) um ácido nucleico que apresenta, pelo menos, 15 nucleótidos sucessivos da sequência que é apresentada na SEQ ID N°: 1, ou as estirpes complementares das referidas.
2. Um ácido nucleico o qual codifica um polipeptídeo de antigénio de membrana específico da próstata humana que tem a sequência é apresentada na SEQ ID N°: 2. 3. 0 ácido nucleico da reivindicação 1, em que a área antigénica tem uma sequência seleccionada de entre o grupo que é constituído por: (a) ASP-GLU-LEU-LYS-ALA-GLU (SEQ ID N° : 35) (b) ASN-GLU-ASP-GLY-ASN-GLU (SEQ ID N° : 36) (c) LYS-SER-PRO-ASP-GLU-GLY (SEQ ID N° : 31) ; (d) (i) ASP-GLU-LEU-LYS-ALA-GLU (SEQ ID N° : 35); (ii) Asn-Glu-Asp-Gly-Asn-Glu (SEQ ID N° : 36); e (iii) LYS-SER-PRO-ASP-GLU-GLY (SEQ ID N°: 37); (e) o domínio de membrana exterior do referido antigénio de membrana específico da próstata humana; e (f) uma sequência de aminoácido hidrófila do referido antigénio de membrana especifico da próstata humana 4. 0 ácido nucleico da reivindicação 1 ou 3, incluindo os nucleótidos que têm a sequência apresentada na SEQ ID N°: 1. 5. 0 ácido nucleico de quaisquer uma das reivindicações de 1 a 4, em que o ácido nucleico é o DNA ou o cDNA. 6. 0 ácido nucleico de quaisquer uma das reivindicações de 1 a 4, em que o ácido nucleico é RNA. 7. 0 ácido nucleico de quaisquer uma das reivindicações 5 ou 6, operacionalmente ligado a um promotor de transcrição de RNA.
8. Um vector o qual compreende o ácido nucleico de quaisquer uma das reivindicações de 1 a 7. 9. 0 vector da reivindicação 8, em que o vector é um plasmideo, um cosmideo, bacteriofago ou outro vírus.
10. O vector da reivindicação 9, em que o vector é o plasmideo que é designado por P55A-PSM (ATCC 75294).
11. Um sistema de vector hospedeiro para a produção de um polipeptídeo, em que o sistema de vector hospedeiro inclui o vector da reivindicação 8, 9 ou 10 e uma célula hospedeira adequada. 12. 0 sistema de vector hospedeiro da reivindicação 11, em que a célula hospedeira adequada é uma célula bacteriana, um célula de leveduras, uma célula de insecto ou uma célula de mamífero.
13. Um método para produzir um polipeptídeo o qual inclui o crescimento do sistema de vector hospedeiro da reivindicação 11 ou 12 em condições adequadas que permitam a produção do polipeptídeo e a recuperação do polipeptídeo assim produzido.
14. Uma célula mamífero que compreende o vector da reivindicação 8, 9 ou 10.
15. Um polipeptídeo com a sequência de antigénio de membrana específico da próstata humana que é apresentada na SEQ ID N° : 2 ou uma área antigénica a qual é uma sequência hidrófila de aminoácidos do referido antigénio de membrana específico da próstata humana, em que o polipeptídeo pode ser utilizado para gerar anticorpos que são específicos do referido antigénio de membrana específico da próstata humana desde que a referida área antigénica não consista na sequência apresentada na SEQ ID N°: 35
16. O polipeptídeo da reivindicação 15, em que o polipeptídeo consiste na sequência de antigénio de membrana específico da próstata humana apresentada na SEQ ID N°: 2 ou uma área antigénica que é uma sequência de aminoácidos hidrófila do referido antigénio de membrana específico da próstata humana para a qual podem ser gerados anticorpos que são específicos para o referido antigénio de membrana específico da próstata humana, desde que a área antigénica não consista na sequência apresentada na SEQ ID N°: 35 17. Um polipeptídeo com a sequência do antigénio de membrana específico da próstata humana é apresentado na SEQ ID N°: 2.
18. Um anticorpo monoclonal dirigido contra o antigénio de membrana específico da próstata humana, a sequência do referido antigénio está em seguida descrita na SEQ ID N° : 2. 19. 0 anticorpo monoclonal da reivindicação 18 o qual se liga a uma área antigénica do antigénio de membrana especifico da próstata humana seleccionado de entre o grupo que constituído por: (a) ASP-GLU-LEU-LYS-ALA-GLU (SEQ ID N°: 35); (b) ASN-GLU-ASP-GLY-ASN-GLU (SEQ ID N°: 36); (C) LYS-SER-PRO-ASP-GLU-GLY (SEQ ID N°: 37); (d) o domínio de membrana exterior do referido antigénio de membrana específico da próstata humana; e (e) uma sequência de aminoácidos hidrófila do referido antigénio de membrana específico da próstata. 20. 0 anticorpo monoclonal das reivindicações 18 ou 19, caracterizados adicionalmente como sendo capaz de estabelecer uma ligação com a superfície de uma célula de cancro da próstata.
21. Uma composição que compreende o anticorpo monoclonal de qualquer uma das reivindicações de 19 a 20.
22. A composição da reivindicação 21, incluindo adicionalmente um agente conjugado ao anticorpo.
23. A composição da reivindicação 22, em que o referido agente é um agente de imagiologia, um agente terapêutico, uma toxina ou um agente citotóxico.
24. A composição de qualquer uma das reivindicações de 21 a 23 as quais incluam um suporte farmaceuticamente aceitável.
25. A composição da reivindicação 21 a qual é uma composição farmacêutica que inclui um suporte farmaceuticamente aceitável. 26. 0 anticorpo monoclonal de qualquer uma das reivindicações de 18 a 20, ou uma composição de qualquer uma das reivindicações de 21 a 25, para ser utilizada na terapia ou diagnóstico do cancro da próstata.
27. A utilização de um anticorpo monoclonal de qualquer uma das reivindicações de 18 a 20 ou uma composição de qualquer uma das reivindicações de 21 a 23 para a produção de uma composição farmacêutica para o tratamento do cancro da próstata num paciente humano.
28. A utilização de uma composição de qualquer uma das reivindicações de 21 a 25 para a preparação de uma composição de diagnóstico por imagiologia do cancro da próstata de num paciente.
29. Um ensaio imunológico para medir a quantidade de antigénio de membrana especifico da próstata humana que se encontra numa amostra biológica, o qual compreende os passos de: (a) promover o contacto das amostras biológicas com pelo menos um anticorpo monoclonal de qualquer uma das reivindicações de 18 a 20 ou com uma das composições das reivindicações 22 ou 23 de modo a formar um complexo entre o referido anticorpo e qualquer antigénio de membrana específico da próstata humana presente na amostra, e (b) medição da quantidade de antigénio de membrana específico da próstata humana no referido complexo, para medir a quantidade do referido antigénio de membrana específico da próstata humana na referida amostra biológica.
30. A utilização de um ácido nucleico marcado da reivindicação 1 (c) para a preparação de uma composição diagnóstico para a detectar a expressão de um antigénio de membrana específico da próstata humana numa célula ou numa secção de tecido de uma amostra.
31. A utilização da reivindicação 30, em que a amostra é o sangue, os nodos linfáticos ou a medula óssea. Lisboa, 5 de Janeiro de 2007