CN115066434A - 核酸连接的免疫-夹心测定(nulisa) - Google Patents

核酸连接的免疫-夹心测定(nulisa) Download PDF

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冯威
A·格兹博斯基
尹轶苑
陈世平
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Allama Biosciences
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Abstract

本文公开了使用捕获/释放机制以减少非特异性结合并且实现具有渺摩尔‑水平灵敏度的检测的高灵敏度免疫测定。本文还公开了可以用于实施这些高灵敏度免疫测定的试剂盒。

Description

核酸连接的免疫-夹心测定(NULISA)
相关申请
本发明申请主张2019年12月3日提交的美国临时专利申请No.62/943,135的优先权益，该专利申请的公开内容以其全部作为参考并入本文。
序列表
本说明书与序列表的计算机可读形式(CRF)拷贝一起提交。创建于2020年12月1日的标题为14582-003-228_SEQ_LISTING.txt的CRF的大小为13,423字节并且以其全部作为参考并入本文。
1.技术领域
本发明涉及分子生物学领域。具体地，本发明公开涉及用于检测靶标生物分子或分子复合物的高灵敏度免疫测定。
2.背景技术
检测生物样品中微量的靶标分子或分子复合物对于科学研究和临床研究是至关重要的。通过本发明和聚合酶链反应(PCR)的进步，在近几十年在核酸检测和分析中获得了巨大发展。然而，当前用于检测其它生物分子，如蛋白的免疫测定的一般表现仍是许多重要应用的技术瓶颈。例如，据估计早期癌症检测需要以4,000个分子/mL或者～7渺摩尔(attomolar，aM或10-18M)有效检测分析物，这超出了现有免疫测定技术的能力范围。因此，急需改善免疫测定性能。本发明公开提供了解决这些需要和提供相关优势的高灵敏度免疫测定。
3.发明内容
实施方式1.用于检测样品中分析物的测定方法，其包括：
(1)将包含第一结合剂和第一递呈基团的第一结合部分、包含第二结合剂的第二结合部分和样品在溶液中混合，其中：
(i)所述第一和第二结合剂结合至分析物并形成免疫复合物，
(ii)通过第一递呈基团和偶联至第一固体表面的第一接受基团之间的结合，将所述免疫复合物捕获至与溶液接触的第一固体表面上，并且
(iii)所述第一结合部分还包含第一靶标标记并且所述第二结合部分还包含第二靶标标记；
(2)清洗所述第一固体表面以除去未结合的分子；
(3)基于所述第一靶标标记和所述第二靶标标记之间的邻近性，从所述免疫复合物产生报告分子；且
(4)检测所述报告分子，借此检测所述分析物。
实施方式2.根据实施方式1所述的测定方法，其中(i)所述第一靶标标记包含第一标识码(“ID”)，它是分析物特异的(“靶标ID”)；(ii)所述第二靶标标记包含第二靶标ID；或者(iii)(i)和(ii)两者。
实施方式3.根据实施方式1或2所述的测定方法，其中(i)所述报告分子包含所述第一靶标ID；(ii)所述报告分子包含所述第二靶标ID；或者(iii)(i)和(ii)两者。
实施方式4.用于检测样品中分析物的测定方法，其包括：
(1)将包含第一结合剂和第一递呈基团的第一结合部分、包含第二结合剂的第二结合部分和样品在溶液中混合，其中：
(i)所述第一和第二结合剂结合至分析物并形成免疫复合物，
(ii)通过第一递呈基团和偶联至第一固体表面的第一接受基团之间的结合，将所述免疫复合物捕获至与溶液接触的第一固体表面上，并且
(iii)所述第一结合部分还包含第一靶标标记，所述第一靶标标记包含分析物特异的(“靶标ID”)第一标识码(“ID”)，并且所述第二结合部分还包含第二靶标标记，所述第二靶标标记包含第二靶标ID；
(2)清洗所述第一固体表面以除去未结合的分子；
(3)从所述免疫复合物产生报告分子，其中所述报告分子包含(i)所述第一靶标ID、(ii)所述第二靶标ID或者(iii)所述第一和所述第二靶标ID两者；和
(4)检测所述报告分子，借此检测所述分析物。
实施方式5.根据实施方式4所述的测定方法，其中基于所述第一靶标标记和所述第二靶标标记之间的邻近性，从所述免疫复合物产生所述报告分子。
实施方式6.根据实施方式1至5中任一项所述的测定方法，其中所述报告分子是核酸报告分子。
实施方式7.根据实施方式6所述的测定方法，其中：
(i)所述报告分子中的所述第一靶标ID是所述第一结合部分中的所述第一靶标ID的互补序列；
(ii)所述报告分子中的所述第二靶标ID是所述第一结合部分中的所述第二靶标ID的互补序列；
(iii)(i)和(ii)两者。
实施方式8.根据实施方式1至7中任一项所述的测定方法，还在步骤(2)和(3)之间包括步骤(2a)：通过破坏所述第一递呈基团和所述第一接受基团之间的结合，从所述第一固体表面释放所述免疫复合物，其中步骤(2a)在步骤(3)之前、之后或同时。
实施方式9.根据实施方式8所述的测定方法，其中所述第二结合部分还包含第二递呈基团。
实施方式10.根据实施方式9所述的测定方法，其中所述方法还在步骤2(a)和步骤(3)之间包括步骤2(b)：
(2b)引入第二固体表面并通过第二递呈基团和偶联至所述第二固体表面的第二接受基团之间的结合将所述免疫复合物重新捕获至所述第二固体表面上。
实施方式11.根据实施方式10所述的测定方法，其中所述方法还在步骤2(b)和步骤(3)之间包括步骤2(c)：
(2c)清洗所述第二固体表面以除去未结合的分子。
实施方式12.根据实施方式10或11所述的测定方法还包括步骤(2d)：通过破坏所述第二递呈基团和所述第二接受基团之间的结合从所述第二固体表面释放所述免疫复合物。
实施方式13.根据实施方式12所述的测定方法，其中步骤(2d)在步骤(3)之前、之后或同时。
实施方式14.根据实施方式2至13中任一项所述的测定方法，其中(i)所述第一靶标ID和所述第二靶标ID是相同的；或者(ii)所述第一靶标ID和所述第二靶标ID是不同的。
实施方式15.根据以上实施方式中任一项所述的测定方法，还包括步骤(2e)：将包含样品特异的ID(“样品ID”)的样品标记结合(i)至所述第一靶标标记，(ii)至所述第二靶标标记或者(iii)至所述第一靶标标记和所述第二靶标标记两者。
实施方式16.根据实施方式15所述的测定方法，其中在每个样品中所形成的报告分子包含样品ID。
实施方式17.根据以上实施方式中任一项所述的测定方法，其中所述第一递呈基团是融合至所述第一结合剂的多肽、缀合至所述第一结合剂的多核苷酸或者缀合至所述第一结合剂的化合物。
实施方式18.根据实施方式9至17中任一项所述的测定方法，其中所述第二递呈基团是融合至所述第二结合剂的多肽、缀合至所述第二结合剂的多核苷酸或者缀合至所述第二结合剂的化合物。
实施方式19.根据以上实施方式中任一项所述的测定方法，其中所述方法还包括从所述免疫复合物释放所述报告分子。
实施方式20.根据实施方式6至19中任一项所述的测定方法，其中步骤(4)还包括核酸报告分子的PCR扩增。
实施方式21.根据实施方式6至20中任一项所述的测定方法，其中所述方法还包括纯化所述核酸报告分子。
实施方式22.根据以上实施方式中任一项所述的测定方法，其中步骤(1)包括在将所述免疫复合物捕获至所述第一固体表面上之前在溶液中形成所述免疫复合物。
实施方式23.根据实施方式1至21中任一项所述的测定方法，其中步骤(1)包括在所述第一固体表面上形成所述免疫复合物之前将所述第一结合剂预捕获至所述第一固体表面上。
实施方式24.根据实施方式1至21中任一项所述的测定方法，其中在步骤(1)中，在溶液中形成所述免疫复合物并同时捕获至所述第一固体表面上。
实施方式25.根据以上实施方式中任一项所述的测定方法，其中：
(i)所述第一结合剂直接结合至分析物并且所述第二结合剂直接结合至分析物；
(ii)所述第一结合剂直接结合至分析物并且所述第二结合剂间接结合至分析物；
(iii)所述第一结合剂间接结合至分析物并且所述第二结合剂直接结合至分析物；或者
(iv)所述第一结合剂间接结合至分析物并且所述第二结合剂间接结合至分析物。
实施方式26.根据以上实施方式中任一项所述的测定方法，其中：
(i)所述第一结合剂结合至直接结合至分析物的第一一抗或其片段；
(ii)所述第二结合剂结合至直接结合至分析物的第二一抗或其片段；或者
(iii)(i)和(ii)两者。
实施方式27.根据实施方式1至25中任一项所述的测定方法，其中：
(i)所述第一和第二结合剂结合至分析物上的非干扰表位；
(ii)所述第一和第二结合剂结合至分析物上的非重叠表位；或者
(iii)所述第一和第二结合剂结合至分析物上的不同表位。
实施方式28.根据以上实施方式中任一项所述的测定方法，还包括:
(i)步骤(2)和(3)之间的至少一个其它重新捕获循环，其包括：从捕获它的固体表面上释放所述免疫复合物，在与所述第一接受基团偶联的其它固体表面上重新捕获所述免疫复合物，并清洗所述其它固体表面以除去未结合的分子；
(ii)步骤(2c)和(2d)之间的至少一个其它重新捕获循环，其包括：从捕获它的固体表面上释放所述免疫复合物，在与所述第一或所述第二接受基团偶联的其它固体表面上重新捕获所述免疫复合物，并清洗所述其它固体表面以除去未结合的分子；或者
(iii)(i)和(ii)两者。
实施方式29.根据实施方式8至28中任一项所述的测定方法，其中任何所述释放是通过将温度升高至70℃。
实施方式30.根据以上实施方式中任一项所述的测定方法，其中(i)所述第一递呈基团通过硫酯基团、二硫键或可切割键结合所述第一接受基团；(ii)所述第二递呈基团通过硫酯基团、二硫键或可切割键结合所述第二接受基团；或者(i)和(ii)两者。
实施方式31.根据实施方式30所述的测定方法，其中(i)所述第一递呈基团通过光可切割键、化学可切割键或酶促可切割键结合所述第一接受基团；(ii)所述第二递呈基团通过光可切割键、化学可切割键或酶促可切割键结合所述第二接受基团；或者(i)和(ii)两者。
实施方式32.根据实施方式1至29中任一项所述的测定方法，其中(i)所述第一递呈基团通过蛋白-蛋白相互作用结合所述第一接受基团；(ii)所述第二递呈基团通过蛋白-蛋白相互作用结合所述第二接受基团；或者(i)和(ii)两者。
实施方式33.根据实施方式1至29中任一项所述的测定方法，其中(i)所述第一递呈基团通过生物素与链霉亲和素或抗生物素蛋白结合所述第一接受基团；(ii)所述第二递呈基团通过生物素与链霉亲和素或抗生物素蛋白结合所述第二接受基团；或者(i)和(ii)两者。
实施方式34.根据实施方式1至29中任一项所述的测定方法，其中
(i)所述第一递呈基团是第一核酸标签(“第一标签”)并且所述第一接受基团是第一核酸捕获探针(“第一探针”)；或者
(ii)所述第二递呈基团是第二核酸标签(“第二标签”)并且所述第二接受基团是第二核酸捕获探针(“第二探针”)。
实施方式35.根据实施方式9至29中任一项所述的测定方法，其中(i)所述第一递呈基团是第一核酸标签(“第一标签”)并且所述第一接受基团是第一核酸捕获探针(“第一探针”)；和(ii)所述第二递呈基团是第二核酸标签(“第二标签”)并且所述第二接受基团是第二核酸捕获探针(“第二探针”)。
实施方式36.根据实施方式34或35所述的测定方法，其中：
(i)所述第一探针是特异性结合至所述第一标签的蛋白；
(ii)所述第一探针是特异性结合至所述第一标签的蛋白和核酸复合物；
(iii)所述第一探针是核酸分子，其中所述第一探针或其片段与所述第一标签或其片段互补；或者
(iv)所述第一探针是核酸分子，其中所述第一探针或其片段与所述第一标签或其片段杂交。
实施方式37.根据实施方式34至36中任一项所述的测定方法，其中：
(i)所述第二探针是特异性结合至所述第二标签的蛋白；
(ii)所述第二探针是特异性结合至所述第二标签的蛋白和核酸复合物；
(iii)所述第二探针是核酸分子，其中所述第二探针或其片段与所述第二标签或其片段互补；或者
(iv)所述第二探针是核酸分子，其中所述第二探针或其片段与所述第二标签或其片段杂交。
实施方式38.根据实施方式36或37所述的测定方法，其中所述互补性为至少80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％互补。
实施方式39.根据实施方式34至38中任一项所述的测定方法，其中(i)所述第一探针直接偶联至所述第一固体表面；或者(ii)所述第二探针直接偶联至所述第二固体表面。
实施方式40.根据实施方式34至38中任一项所述的测定方法，其中(i)所述第一探针直接偶联至所述第一固体表面；并且(ii)所述第二探针直接偶联至所述第二固体表面。
实施方式41.根据实施方式34至38中任一项所述的测定方法，其中(i)所述第一探针与直接偶联至所述第一固体表面的通用探针杂交；或者(ii)所述第二探针与直接偶联至所述第二固体表面的通用探针杂交。
实施方式42.根据实施方式34至38中任一项所述的测定方法，其中(i)所述第一探针与直接偶联至所述第一固体表面的通用探针杂交；且(ii)所述第二探针与直接偶联至所述第二固体表面的通用探针杂交。
实施方式43.根据实施方式34至38中任一项所述的测定方法，其中(i)所述第一探针与生物素缀合，生物素结合直接偶联至所述第一固体表面的链霉亲和素或抗生物素蛋白；或者(ii)所述第二探针与生物素缀合，生物素结合直接偶联至所述第二固体表面的链霉亲和素或抗生物素蛋白。
实施方式44.根据实施方式34至38中任一项所述的测定方法，其中(i)所述第一探针与生物素缀合，生物素结合直接偶联至所述第一固体表面的链霉亲和素或抗生物素蛋白；且(ii)所述第二探针与生物素缀合，生物素结合直接偶联至所述第二固体表面的链霉亲和素或抗生物素蛋白。
实施方式45.根据实施方式34至44中任一项所述的测定方法，其中在步骤(1)中，所述第一标签和第二标签被协同捕获在所述第一固体表面上。
实施方式46.根据实施方式45所述的测定方法，其中所述第一探针的第一片段与所述第一标签或其片段互补，并且所述第一探针的第二片段与所述第二标签或其片段互补，其中所述互补区包括所述第一和所述第二标签的非缀合末端。
实施方式47.根据实施方式45所述的测定方法，其中所述第一探针的连续片段由第一片段和紧邻的第二片段组成，其中所述第一片段与所述第一标签或其片段互补，并且所述第二片段与所述第二标签或其片段互补，从而当所述第一和第二标签连接以形成连接的核酸时，所述连接的核酸的连接区与所述第一探针的连续片段互补。
实施方式48.根据实施方式45所述的测定方法，其中所述第一探针的第一片段与所述第一标签或其片段互补，并且其中所述第一探针的单独的第二片段与所述第二标签或其片段互补；并且其中所述互补区不包括所述第一和所述第二标签的非缀合末端。
实施方式49.根据实施方式45所述的测定方法，其中所述第一固体表面与所述第一探针和其它核酸探针两者偶联，并且其中所述其它探针或其片段与所述第一标签或其片段互补。
实施方式50.根据实施方式35至49中任一项所述的测定方法，其中在步骤(2b)中，所述第一标签和第二标签被协同捕获在所述第二固体表面上。
实施方式51.根据实施方式50所述的测定方法，其中所述第二探针的第一片段与所述第一标签或其片段互补，并且所述第二探针的第二片段与所述第二标签或其片段互补，其中所述互补区包括所述第一和所述第二标签的非缀合末端。
实施方式52.根据实施方式50所述的测定方法，其中所述第二探针的连续片段由第一片段和紧邻的第二片段组成，其中所述第一片段与所述第一标签或其片段互补，并且所述第二片段与所述第二标签或其片段互补，从而当所述第一和第二标签连接以形成连接的核酸时，所述连接的核酸的连接区与所述第二探针的连续片段互补。
实施方式53.根据实施方式50所述的测定方法，其中所述第二探针的第一片段与所述第一标签或其片段互补，并且其中所述第二探针的单独的第二片段与所述第二标签或其片段互补；并且其中所述互补区不包括所述第一和所述第二标签的非缀合末端。
实施方式54.根据实施方式50所述的测定方法，其中所述第二固体表面与所述第二探针和其它核酸探针两者偶联，并且其中所述其它探针或其片段与所述第二标签或其片段互补。
实施方式55.根据实施方式34至54中任一项所述的测定方法，其中(i)所述第一标签和所述第一探针的互补片段由10至30个碱基对组成；(ii)所述第二标签和所述第二探针的互补片段由10至30个碱基对组成；或者(i)和(ii)两者。
实施方式56.根据实施方式34至55中任一项所述的测定方法，其中(i)所述第一标签和所述第一探针的互补片段由20至30个碱基对组成；(ii)所述第二标签和所述第二探针的互补片段由20至30个碱基对组成；或者(i)和(ii)两者。
实施方式57.根据实施方式34至56中任一项所述的测定方法，其中(i)所述第一标签包含A和/或T富集序列并且所述第一探针包含互补的A和/或T富集序列；(ii)所述第二标签包含A和/或T富集序列并且所述第二探针包含互补的A和/或T富集序列；或者(i)和(ii)两者。
实施方式58.根据实施方式57所述的测定方法，其中所述A和/或T富集序列具有短的长度，从而来自互补的A和/或T富集序列的结合弱于所述第一结合剂与所述分析物之间的结合以及所述第二结合剂和所述分析物之间的结合，借此在释放步骤(2a)和/或(2d)中保持免疫复合物稳定。
实施方式59.根据以上实施方式中任一项所述的测定方法，其中所述分析物是两个分子的结合对；其中所述第一结合剂结合所述结合对的一个分子，并且所述第二结合剂结合所述结合对的另一个分子。
实施方式60.根据以上实施方式中任一项所述的测定方法，其中所述分析物为核酸，并且用于核酸分析物的第一和第二结合剂包含与所述核酸分析物的不同片段互补的核酸。
实施方式61.根据实施方式1或59中任一项所述的测定方法，其中所述分析物是肽或蛋白，并且(i)所述第一结合剂是特异性结合所述分析物的抗体或抗体片段；(ii)所述第二结合剂是特异性结合所述分析物的抗体或抗体片段；或(i)和(ii)两者。
实施方式62.根据以上实施方式中任一项所述的测定方法，其中所述样品是血清样品或血浆样品。
实施方式63.根据实施方式6至62中任一项所述的测定方法，其中：
(i)在步骤(3)中，产生所述核酸报告分子，同时所述免疫复合物被捕获至所述第一固体表面上；或者
(ii)在步骤(3)中，在从所述第一固体表面释放所述免疫复合物之后产生所述核酸报告分子。
实施方式64.根据实施方式10至62中任一项所述的测定方法，其中：
(i)在步骤(3)中，产生所述核酸报告分子，同时所述免疫复合物被捕获至所述第二固体表面上；或者
(ii)在步骤(3)中，在从所述第二固体表面释放所述免疫复合物之后产生所述核酸报告分子。
实施方式65.根据实施方式1至64中任一项所述的测定方法，其中：(i)所述第一靶标标记直接结合至所述第一结合剂；或者(ii)所述第一靶标标记间接结合至所述第一结合剂。
实施方式66.根据实施方式1至65中任一项所述的测定方法，其中：(i)所述第二靶标标记直接结合至所述第二结合剂；或者(ii)所述第二靶标标记间接结合至所述第二结合剂。
实施方式67.根据实施方式1至66中任一项所述的测定方法，其中：
(i)将所述第一靶标标记缀合至所述第一结合剂；
(ii)所述第一靶标标记非共价结合至所述第一结合剂；
(iii)将所述第一靶标标记缀合至所述第一递呈基团；
(iv)所述第一靶标标记非共价结合至所述第一递呈基团；或者
(v)所述第一靶标标记是所述第一递呈基团的一部分。
实施方式68.根据实施方式1至67中任一项所述的测定方法，其中：
(i)将所述第二靶标标记缀合至所述第二结合剂；
(ii)所述第二靶标标记非共价结合至所述第二结合剂；
(iii)将所述第二靶标标记缀合至所述第二递呈基团；
(iv)所述第二靶标标记非共价结合至所述第二递呈基团；或者
(v)所述第二靶标标记是所述第二递呈基团的一部分。
实施方式69.根据实施方式1至68中任一项所述的测定方法，其中：(i)所述第一递呈基团直接结合至所述第一结合剂；或者(ii)所述第一递呈基团间接结合至所述第一结合剂。
实施方式70.根据实施方式9至69中任一项所述的测定方法，其中：(i)所述第二递呈基团直接结合至所述第二结合剂；或者(ii)所述第二递呈基团间接结合至所述第二结合剂。
实施方式71.根据实施方式1至70中任一项所述的测定方法，其中：
(i)将所述第一递呈基团缀合至所述第一结合剂；
(ii)所述第一递呈基团非共价结合至所述第一结合剂；
(iii)将所述第一递呈基团缀合至所述第一靶标标记；
(iv)所述第一递呈基团非共价结合至所述第一靶标标记；或者
(v)所述第一递呈基团是所述第一靶标标记的一部分。
实施方式72.根据实施方式9至71中任一项所述的测定方法，其中：
(i)将所述第二递呈基团缀合至所述第二结合剂；
(ii)所述第二递呈基团非共价结合至所述第二结合剂；
(iii)将所述第二递呈基团缀合至所述第二靶标标记；
(iv)所述第二递呈基团非共价结合至所述第二靶标标记；或者
(v)所述第二递呈基团是所述第二靶标标记的一部分。
实施方式73.根据实施方式1至72中任一项所述的测定方法，其中：
(i)所述第一靶标标记是核酸分子；
(ii)所述第二靶标标记是核酸分子；或者
(iii)(i)和(ii)两者。
实施方式74.根据实施方式34至73中任一项所述的测定方法，其中：
(i)所述第一靶标标记与所述第一标签杂交；
(ii)所述第二靶标标记与所述第二标签杂交；或者
(iii)(i)和(ii)两者。
实施方式75.根据实施方式15至74中任一项所述的测定方法，其中所述样品标记是单链核酸分子(“单链样品标记”)。
实施方式76.根据实施方式15至74中任一项所述的测定方法，其中所述样品标记是双链核酸分子(“双链样品标记”)。
实施方式77.根据实施方式76所述的测定方法，其中所述样品标记是：
(i)包含两个5'悬突的双链核酸分子；
(ii)包含两个3'悬突的双链核酸分子；
(iii)包含5'悬突和3'悬突的双链核酸分子；
(iv)包含5'悬突和平末端的双链核酸分子；或者
(v)包含3'悬突和平末端的双链核酸分子。
实施方式78.根据实施方式77所述的测定方法，其中所述样品标记：
(i)通过所述样品标记的悬突与所述第一靶标标记杂交；
(ii)通过所述样品标记的悬突与所述第二靶标标记杂交；或者
(iii)(i)和(ii)两者。
实施方式79.根据实施方式34至78中任一项所述的测定方法，其中步骤(3)包括通过连接以下部分产生所述核酸报告分子：
(a)所述部分为所述第一标签和所述第二标签，并且检测由所述第一标签的片段和所述第二标签的片段所组成的所述核酸报告分子；
(b)所述部分为所述第一标签和所述第二标签的替代核酸(“第二替代物”)，并且检测由所述第一标签的片段和所述第二替代物的片段所组成的所述核酸报告分子；
(c)所述部分为第一标签的替代核酸(“第一替代物”)和所述第二标签，并且检测由所述第一替代物的片段和所述第二标签的片段所组成的所述核酸报告分子；或者
(d)所述部分为所述第一替代物和所述第二替代物，并且检测由所述第一替代物的片段和所述第二替代物的片段所组成的所述核酸报告分子；
其中所述第一标签或其片段与所述第一替代物或其片段互补，并且所述第二标签或其片段与所述第二替代物或其片段互补。
实施方式80.根据实施方式34至78中任一项所述的测定方法，其中步骤(3)包括通过连接以下部分产生所述核酸报告分子：
(a)所述部分为所述第一标签和所述第二靶标标记，并且检测由所述第一标签的片段和所述第二靶标标记的片段所组成的所述核酸报告分子；
(b)所述部分为所述第一标签和所述第二靶标标记的替代核酸(“第二替代物”)，并且检测由所述第一标签的片段和所述第二替代物的片段所组成的所述核酸报告分子；
(c)所述部分为第一标签的替代核酸(“第一替代物”)和所述第二靶标标记，并且检测由所述第一替代物的片段和所述第二靶标标记的片段所组成的所述核酸报告分子；或者
(d)所述部分为所述第一替代物和所述第二替代物，并且检测由所述第一替代物的片段和所述第二替代物的片段所组成的所述核酸报告分子；
其中所述第一标签或其片段与所述第一替代物或其片段互补，并且所述第二靶标标记或其片段与所述第二替代物或其片段互补。
实施方式81.根据实施方式34至78中任一项所述的测定方法，其中步骤(3)包括通过连接以下部分产生所述核酸报告分子：
(a)所述部分为所述第一靶标标记和所述第二标签，并且检测由所述第一靶标标记的片段和所述第二标签的片段所组成的所述核酸报告分子；
(b)所述部分为所述第一靶标标记和所述第二标签的替代核酸(“第二替代物”)，并且检测由所述第一靶标标记的片段和所述第二替代物的片段所组成的所述核酸报告分子；
(c)所述部分为第一靶标标记的替代核酸(“第一替代物”)和所述第二标签，并且检测由所述第一替代物的片段和所述第二标签的片段所组成的所述核酸报告分子；或者
(d)所述部分为所述第一替代物和所述第二替代物，并且检测由所述第一替代物的片段和所述第二替代物的片段所组成的所述核酸报告分子；
其中所述第一靶标标记或其片段与所述第一替代物或其片段互补，并且所述第二标签或其片段与所述第二替代物或其片段互补。
实施方式82.根据实施方式34至78中任一项所述的测定方法，其中步骤(3)包括通过连接以下部分产生所述核酸报告分子：
(a)所述部分为所述第一靶标标记和所述第二靶标标记，并且检测由所述第一靶标标记的片段和所述第二靶标标记的片段所组成的所述核酸报告分子；
(b)所述部分为所述第一靶标标记和所述第二靶标标记的替代核酸(“第二替代物”)，并且检测由所述第一靶标标记的片段和所述第二替代物的片段所组成的所述核酸报告分子；
(c)所述部分为第一靶标标记的替代核酸(“第一替代物”)和所述第二靶标标记，并且检测由所述第一替代物的片段和所述第二靶标标记的片段所组成的所述核酸报告分子；或者
(d)所述部分为所述第一替代物和所述第二替代物，并且检测由所述第一替代物的片段和所述第二替代物的片段所组成的所述核酸报告分子；
其中所述第一靶标标记或其片段与所述第一替代物或其片段互补，并且所述第二靶标标记或其片段与所述第二替代物或其片段互补。
实施方式83.根据实施方式79至82中任一项所述的测定方法，其中所述连接包括连接：
(i)(a)所述第一标签或其第一替代物，(b)所述第二标签或其第二替代物，和(c)单链样品标记的替代核酸(“样品替代物”)或双链样品标记的一条链；
(ii)(a)所述第一标签或其第一替代物，(b)所述第二靶标标记或其第二替代物，和(c)单链样品标记的替代核酸(“样品替代物”)或双链样品标记的一条链；
(iii)(a)所述第一靶标标记或其第一替代物，(b)所述第二标签或其第二替代物，和(c)单链样品标记的替代核酸(“样品替代物”)或双链样品标记的一条链；或者
(iv)(a)所述第一靶标标记或其第一替代物，(b)所述第二靶标标记或其第二替代物，和(c)单链样品标记的替代核酸(“样品替代物”)或双链样品标记的一条链；
其中所述样品标记或其片段与所述样品替代物或其片段互补。
实施方式84.根据实施方式83所述的测定方法，其中(i)至(iv)中每一个中的连接包括(a)和(b)之间的连接(c)。
实施方式85.根据实施方式79至84中任一项所述的测定方法，其中通过邻位连接形成所述核酸报告分子。
实施方式86.根据实施方式79至84中任一项所述的测定方法，其中通过邻位延伸形成所述核酸报告分子。
实施方式87.根据实施方式79至86中任一项所述的测定方法，其中所述核酸报告分子包括(a)所述第一靶标ID或所述第一靶标ID的替代核酸(“第一靶标ID替代物”)、(b)所述第二靶标ID或所述第二靶标ID的替代核酸(“第二靶标ID替代物”)和(c)样品ID。
实施方式88.根据实施方式2至87中任一项所述的测定方法，其包括通过同时检测与每种分析物有关的独特靶标ID，同时检测样品中至少两个分析物。
实施方式89.根据实施方式88所述的测定方法，其包括通过在步骤(1)中将无功能结合剂添加至所述溶液，从所述分析物中的至少一种按比例降低信号，其中所述无功能结合剂与所述第一结合剂竞争与所述分析物的结合，但是所述无功能结合剂未缀合或缀合至不结合所述第一接受基团的递呈基团。
实施方式90.根据实施方式2至89中任一项所述的测定方法，其中在步骤(4)中，检测所述分析物包括所述第一和所述第二靶标ID的共检测。
实施方式91.根据以上实施方式中任一项所述的测定方法，其中在步骤(1)中还包括混合参比分析物。
实施方式92.根据实施方式91所述的测定方法，其中所述参比分析物是在所述样品中不存在的分析物。
实施方式93.根据实施方式91或92所述的测定方法，其中所述参比分析物是所述样品中不存在的蛋白、核酸或化合物。
实施方式94.根据实施方式93所述的测定方法，其中所述参比分析物是病毒蛋白、细菌蛋白或昆虫蛋白。
实施方式95.根据实施方式15至94中任一项所述的测定方法，其包括通过同时检测与每种样品有关的所述核酸报告分子中的独特样品ID，同时检测至少两个样品中的所述分析物。
实施方式96.根据实施方式95所述的测定方法还包括在步骤(4)中的检测之前或同时混合来自所述至少两个样品的所述核酸报告分子。
实施方式97.根据实施方式15至95中任一项所述的测定方法，其包括通过同时检测与每种样品中的每种分析物有关的所述核酸报告分子中的独特样品ID和独特靶标ID，同时检测至少两个样品中的至少两个分析物。
实施方式98.根据实施方式97所述的测定方法还包括在步骤(4)中的检测之前或同时混合来自所述至少两个样品的用于所述至少两个分析物的所述核酸报告分子。
实施方式99.根据以上实施方式中任一项所述的测定方法，其中通过多重qPCR、多重数字PCR或NGS检测所述核酸报告分子。
实施方式100.根据以上实施方式中任一项所述的测定方法，其中通过NGS检测所述核酸报告分子。
实施方式101.根据实施方式91至100中任一项所述的测定方法，其中检测还包括将从所述样品的分析物所产生的报告分子对从所述参比分析物所产生的报告分子进行归一化。
实施方式102.根据以上实施方式中任一项所述的测定方法，其中(i)所述第一固体表面选自磁性颗粒表面和微量滴定板的孔；(ii)所述第二固体表面选自磁性颗粒表面和微量滴定板的孔；或者(i)和(ii)两者。
实施方式103.用于检测样品中分析物的测定方法，其包括：
(1)将包含第一结合剂和第一递呈基团的第一结合部分、包含第二结合剂和第二递呈基团的第二结合部分和样品在溶液中混合，其中：
(i)所述第一和第二结合剂结合至分析物并形成免疫复合物，
(ii)通过第一递呈基团和偶联至第一固体表面的第一接受基团之间的结合，将所述免疫复合物捕获至与溶液接触的第一固体表面上，并且
(iii)所述第一结合部分还包含第一靶标标记，所述第一靶标标记包含分析物特异的(“靶标ID”)第一标识码(“ID”)，并且所述第二结合部分还包含第二靶标标记，所述第二靶标标记包含第二靶标ID；
(2)清洗所述第一固体表面以除去未结合的分子；
(3)通过破坏所述第一递呈基团和所述第一接受基团之间的结合从所述第一固体表面释放所述免疫复合物；
(4)引入第二固体表面并通过所述第二递呈基团和偶联至所述第二固体表面的所述第二接受基团之间的结合将所述免疫复合物重新捕获至所述第二固体表面上；
(5)清洗所述第二固体表面以除去未结合的分子；
(6)将包含样品特异的ID(“样品ID”)的样品标记结合(i)至所述第一靶标标记，(ii)至所述第二靶标标记或者(iii)至所述第一靶标标记和所述第二靶标标记两者；
(7)基于所述第一靶标标记和所述第二靶标标记之间的邻近性从所述免疫复合物产生核酸报告分子，其中所述核酸报告分子包含所述第一靶标ID、所述第二靶标ID和所述样品ID；
(8)通过破坏所述第二递呈基团和所述第二接受基团之间的结合从所述第二固体表面释放所述免疫复合物；和
(9)通过qPCR检测所述核酸报告分子，借此检测所述分析物。
实施方式104.用于检测至少两个样品中的分析物的测定方法，其包括：
(1)将包含第一结合剂和第一递呈基团的第一结合部分、包含第二结合剂和第二递呈基团的第二结合部分和样品在溶液中混合，其中：
(i)所述第一和第二结合剂结合至分析物并形成免疫复合物，
(ii)通过第一递呈基团和偶联至第一固体表面的第一接受基团之间的结合，将所述免疫复合物捕获至与溶液接触的第一固体表面上，并且
(iii)所述第一结合部分还包含第一靶标标记，所述第一靶标标记包含分析物特异的(“靶标ID”)第一标识码(“ID”)，并且所述第二结合部分还包含第二靶标标记，所述第二靶标标记包含第二靶标ID；
(2)清洗所述第一固体表面以除去未结合的分子；
(3)通过破坏所述第一递呈基团和所述第一接受基团之间的结合从所述第一固体表面释放所述免疫复合物；
(4)引入第二固体表面并通过所述第二递呈基团和偶联至所述第二固体表面的所述第二接受基团之间的结合将所述免疫复合物重新捕获至所述第二固体表面上；
(5)清洗所述第二固体表面以除去未结合的分子；
(6)将包含样品特异的ID(“样品ID”)的样品标记结合(i)至所述第一靶标标记，(ii)至所述第二靶标标记或者(iii)至所述第一靶标标记和所述第二靶标标记两者；
(7)基于所述第一靶标标记和所述第二靶标标记之间的邻近性从所述免疫复合物产生核酸报告分子，其中所述核酸报告分子包含所述第一靶标ID、所述第二靶标ID和所述样品ID；
(8)混合来自所述至少两个样品的所述核酸报告分子；
(9)通过破坏所述第二递呈基团和所述第二接受基团之间的结合从所述第二固体表面释放所述免疫复合物；
(9)扩增所述核酸报告分子；
(10)纯化所述核酸报告分子；和
(11)通过下一代测序(NGS)检测所述核酸报告分子，借此检测所述分析物。
实施方式105.用于检测样品中分析物的系统，其包括：
(i)第一结合部分，其包含第一结合剂、第一递呈基团和第一靶标标记；
(ii)第二结合部分，其包含第二结合剂和第二靶标标记；和
(iii)第一接受基团；
并且其中
(i)所述第一和第二结合剂结合所述分析物上的表位；和
(ii)所述第一递呈基团结合所述第一接受基团。
实施方式106.根据实施方式105所述的系统，其中(i)所述第一靶标标记包含第一标识码(“ID”)，它是分析物特异的(“靶标ID”)；(ii)所述第二靶标标记包含第二靶标ID；或者(iii)(i)和(ii)两者。
实施方式107.用于检测样品中分析物的系统，其包括：
(i)第一结合部分，其包含第一结合剂、第一递呈基团和第一靶标标记，所述第一靶标标记包含第一标识码(“ID”)，它是分析物特异的(“靶标ID”)；
(ii)第二结合部分，其包含第二结合剂和第二靶标标记，所述第二靶标标记包含第二靶标ID；和
(iii)第一接受基团；
并且其中
(i)所述第一和第二结合剂结合所述分析物上的表位；和
(ii)所述第一递呈基团结合所述第一接受基团。
实施方式108.根据实施方式105至107中任一项所述的系统，其中所述报告分子是核酸报告分子。
实施方式109.根据实施方式105至108中任一项所述的系统，其中所述第二结合部分还包含第二递呈基团，其中所述系统还包含第二接受基团，并且其中所述第二递呈基团结合所述第二接受基团。
实施方式110.根据实施方式106至109中任一项所述的系统，其中(i)所述第一靶标ID和所述第二靶标ID是相同的；或者(ii)所述第一靶标ID和所述第二靶标ID是不同的。
实施方式111.根据实施方式105至110中任一项所述的系统，还包括包含样品特异的ID(“样品ID”)的样品标记，其中所述样品标记结合(i)至所述第一靶标标记，(ii)至所述第二靶标标记或者(iii)至所述第一靶标标记和所述第二靶标标记两者。
实施方式112.根据实施方式106至111中任一项所述的系统，还包括用于邻位连接或邻位延伸以产生核酸报告分子的试剂包含(i)所述第一靶标ID和所述第二靶标ID，或者(ii)所述第一靶标ID、所述第二靶标ID和所述样品ID。
实施方式113.根据实施方式105至112中任一项所述的系统，还包括第一固体表面。
实施方式114.根据实施方式109至113中任一项所述的系统，还包括第二固体表面。
实施方式115.根据实施方式113或114所述的系统，其中(i)所述第一固体表面是磁性颗粒表面和微量滴定板的孔；(ii)所述第二固体表面是磁性颗粒表面和微量滴定板的孔；或(i)和(ii)两者。
实施方式116.根据实施方式114或115所述的系统，其中所述第一固体表面与所述第一接受基团偶联，并且所述第二固体表面与所述第二接受基团偶联。
实施方式117.根据实施方式105至116中任一项所述的系统，其中所述第一递呈基团是融合至所述第一结合剂的多肽、缀合至所述第一结合剂的多核苷酸或者缀合至所述第一结合剂的化合物。
实施方式118.根据实施方式109至117中任一项所述的系统，其中所述第二递呈基团是融合至所述第二结合剂的多肽、缀合至所述第二结合剂的多核苷酸或者缀合至所述第二结合剂的化合物。
实施方式119.根据实施方式108至118中任一项所述的系统，还包括用于所述核酸报告分子的PCR扩增的试剂。
实施方式120.根据实施方式108至119中任一项所述的系统，还包括用于纯化所述核酸报告分子的试剂。
实施方式121.根据实施方式105至120中任一项所述的系统，其中：
(i)所述第一结合剂直接结合至分析物并且所述第二结合剂直接结合至分析物；
(ii)所述第一结合剂直接结合至分析物并且所述第二结合剂间接结合至分析物；
(iii)所述第一结合剂间接结合至分析物并且所述第二结合剂直接结合至分析物；或者
(iv)所述第一结合剂间接结合至分析物并且所述第二结合剂间接结合至分析物。
实施方式122.根据实施方式105至121中任一项所述的系统，其中：
(i)所述第一结合剂结合至直接结合至分析物的第一一抗或其片段；
(ii)所述第二结合剂结合至直接结合至分析物的第二一抗或其片段；或者
(iii)(i)和(ii)两者。
实施方式123.根据实施方式105至122中任一项所述的系统，其中：
(i)所述第一和第二结合剂结合至分析物上的非干扰表位；
(ii)所述第一和第二结合剂结合至分析物上的非重叠表位；或者
(iii)所述第一和第二结合剂结合至分析物上的不同表位。
实施方式124.根据实施方式105至123中任一项所述的系统，其中(i)所述第一递呈基团通过硫酯基团、二硫键或可切割键结合所述第一接受基团；(ii)所述第二递呈基团通过硫酯基团、二硫键或可切割键结合所述第二接受基团；或者(i)和(ii)两者。
实施方式125.根据实施方式124所述的系统，其中(i)所述第一递呈基团通过光可切割键、化学可切割键或酶促可切割键结合所述第一接受基团；(ii)所述第二递呈基团通过光可切割键、化学可切割键或酶促可切割键结合所述第二接受基团；或者(i)和(ii)两者。
实施方式126.根据实施方式105至123中任一项所述的系统，其中(i)所述第一递呈基团通过蛋白-蛋白相互作用结合所述第一接受基团；(ii)所述第二递呈基团通过蛋白-蛋白相互作用结合所述第二接受基团；或者(i)和(ii)两者。
实施方式127.根据实施方式105至123中任一项所述的系统，其中(i)所述第一递呈基团通过生物素与链霉亲和素或抗生物素蛋白结合所述第一接受基团；(ii)所述第二递呈基团通过生物素与链霉亲和素或抗生物素蛋白结合所述第二接受基团；或者(i)和(ii)两者。
实施方式128.根据实施方式105至123中任一项所述的系统，其中
(i)所述第一递呈基团是第一核酸标签(“第一标签”)并且所述第一接受基团是第一核酸捕获探针(“第一探针”)；或者
(ii)所述第二递呈基团是第二核酸标签(“第二标签”)并且所述第二接受基团是第二核酸捕获探针(“第二探针”)。
实施方式129.根据实施方式109至123中任一项所述的系统，其中(i)所述第一递呈基团是第一核酸标签(“第一标签”)并且所述第一接受基团是第一核酸捕获探针(“第一探针”)；和(ii)所述第二递呈基团是第二核酸标签(“第二标签”)并且所述第二接受基团是第二核酸捕获探针(“第二探针”)。
实施方式130.根据实施方式128或129所述的系统，其中：
(i)所述第一探针是特异性结合至所述第一标签的蛋白；
(ii)所述第一探针是特异性结合至所述第一标签的蛋白和核酸复合物；
(iii)所述第一探针是核酸分子，其中所述第一探针或其片段与所述第一标签或其片段互补；或者
(iv)所述第一探针是核酸分子，其中所述第一探针或其片段与所述第一标签或其片段杂交。
实施方式131.根据实施方式128或130所述的系统，其中：
(i)所述第二探针是特异性结合至所述第二标签的蛋白；
(ii)所述第二探针是特异性结合至所述第二标签的蛋白和核酸复合物；
(iii)所述第二探针是核酸分子，其中所述第二探针或其片段与所述第二标签或其片段互补；或者
(iv)所述第二探针是核酸分子，其中所述第二探针或其片段与所述第二标签或其片段杂交。
实施方式132.根据实施方式130或131所述的系统，其中所述互补性为至少80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％互补。
实施方式133.根据实施方式128至132中任一项所述的系统，其中(i)所述第一探针直接偶联至所述第一固体表面；或者(ii)所述第二探针直接偶联至所述第二固体表面。
实施方式134.根据实施方式128至132中任一项所述的系统，其中(i)所述第一探针直接偶联至所述第一固体表面；并且(ii)所述第二探针直接偶联至所述第二固体表面。
实施方式135.根据实施方式128至132中任一项所述的系统，其中(i)所述第一探针与直接偶联至所述第一固体表面的通用探针杂交；或者(ii)所述第二探针与直接偶联至所述第二固体表面的通用探针杂交。
实施方式136.根据实施方式128至132中任一项所述的系统，其中(i)所述第一探针与直接偶联至所述第一固体表面的通用探针杂交；且(ii)所述第二探针与直接偶联至所述第二固体表面的通用探针杂交。
实施方式137.根据实施方式128至132中任一项所述的系统，其中(i)所述第一探针与生物素缀合，生物素结合直接偶联至所述第一固体表面的链霉亲和素或抗生物素蛋白；或者(ii)所述第二探针与生物素缀合，生物素结合直接偶联至所述第二固体表面的链霉亲和素或抗生物素蛋白。
实施方式138.根据实施方式128至132中任一项所述的系统，其中(i)所述第一探针与生物素缀合，生物素结合直接偶联至所述第一固体表面的链霉亲和素或抗生物素蛋白；且(ii)所述第二探针与生物素缀合，生物素结合直接偶联至所述第二固体表面的链霉亲和素或抗生物素蛋白。
实施方式139.根据实施方式128至138中任一项所述的系统，其中所述第一标签和第二标签被协同捕获在所述第一固体表面上。
实施方式140.根据实施方式139所述的系统，其中所述第一探针的第一片段与所述第一标签或其片段互补，并且所述第一探针的第二片段与所述第二标签或其片段互补，其中所述互补区包括所述第一和所述第二标签的非缀合末端。
实施方式141.根据实施方式139所述的系统，其中所述第一探针的连续片段由第一片段和紧邻的第二片段组成，其中所述第一片段与所述第一标签或其片段互补，并且所述第二片段与所述第二标签或其片段互补，从而当所述第一和第二标签连接以形成连接的核酸时，所述连接的核酸的连接区与所述第一探针的连续片段互补。
实施方式142.根据实施方式139所述的系统，其中所述第一探针的第一片段与所述第一标签或其片段互补，并且其中所述第一探针的单独的第二片段与所述第二标签或其片段互补；并且其中所述互补区不包括所述第一和所述第二标签的非缀合末端。
实施方式143.根据实施方式139所述的系统，其中所述第一固体表面与所述第一探针和其它核酸探针两者偶联，并且其中所述其它探针或其片段与所述第一标签或其片段互补。
实施方式144.根据实施方式128至143中任一项所述的系统，其中所述第一标签和第二标签被协同捕获在所述第二固体表面上。
实施方式145.根据实施方式144所述的系统，其中所述第二探针的第一片段与所述第一标签或其片段互补，并且所述第二探针的第二片段与所述第二标签或其片段互补，其中所述互补区包括所述第一和所述第二标签的非缀合末端。
实施方式146.根据实施方式144所述的系统，其中所述第二探针的连续片段由第一片段和紧邻的第二片段组成，其中所述第一片段与所述第一标签或其片段互补，并且所述第二片段与所述第二标签或其片段互补，从而当所述第一和第二标签连接以形成连接的核酸时，所述连接的核酸的连接区与所述第二探针的连续片段互补。
实施方式147.根据实施方式144所述的系统，其中所述第二探针的第一片段与所述第一标签或其片段互补，并且其中所述第二探针的单独的第二片段与所述第二标签或其片段互补；并且其中所述互补区不包括所述第一和所述第二标签的非缀合末端。
实施方式148.根据实施方式144所述的系统，其中所述第二固体表面与所述第二探针和其它核酸探针两者偶联，并且其中所述其它探针或其片段与所述第二标签或其片段互补。
实施方式149.根据实施方式128至148中任一项所述的系统，其中(i)所述第一标签和所述第一探针的互补片段由10至30个碱基对组成；(ii)所述第二标签和所述第二探针的互补片段由10至30个碱基对组成；或者(i)和(ii)两者。
实施方式150.根据实施方式128至149中任一项所述的系统，其中(i)所述第一标签和所述第一探针的互补片段由20至30个碱基对组成；(ii)所述第二标签和所述第二探针的互补片段由20至30个碱基对组成；或者(i)和(ii)两者。
实施方式151.根据实施方式128至150中任一项所述的系统，其中(i)所述第一标签包含A和/或T富集序列并且所述第一探针包含互补的A和/或T富集序列；(ii)所述第二标签包含A和/或T富集序列并且所述第二探针包含互补的A和/或T富集序列；或者(i)和(ii)两者。
实施方式152.根据实施方式151所述的系统，其中所述A和/或T富集序列具有短的长度，从而来自互补的A和/或T富集序列的结合弱于所述第一结合剂与所述分析物之间的结合以及所述第二结合剂和所述分析物之间的结合两者。
实施方式153.根据实施方式105至152中任一项所述的系统，其中所述分析物是两个分子的结合对；其中所述第一结合剂结合所述结合对的一个分子，并且所述第二结合剂结合所述结合对的另一个分子。
实施方式154.根据实施方式105至153中任一项所述的系统，其中所述分析物为核酸，并且用于核酸分析物的第一和第二结合剂包含与所述核酸分析物的不同片段互补的核酸。
实施方式155.根据实施方式105至153中任一项所述的系统，其中所述分析物是肽或蛋白，且(i)所述第一结合剂是特异性结合所述分析物的抗体或抗体片段；(ii)所述第二结合剂是特异性结合所述分析物的抗体或抗体片段；或者(i)和(ii)两者。
实施方式156.根据实施方式105至155中任一项所述的系统，其中所述样品是血清样品或血浆样品。
实施方式157.根据实施方式105至156中任一项所述的系统，(i)所述第一靶标标记直接结合至所述第一结合剂；或者(ii)所述第一靶标标记间接结合至所述第一结合剂。
实施方式158.根据实施方式105至157中任一项所述的系统，其中：(i)所述第二靶标标记直接结合至所述第二结合剂；或者(ii)所述第二靶标标记间接结合至所述第二结合剂。
实施方式159.根据实施方式105至158中任一项所述的系统，其中：
(i)将所述第一靶标标记缀合至所述第一结合剂；
(ii)所述第一靶标标记非共价结合至所述第一结合剂；
(iii)将所述第一靶标标记缀合至所述第一递呈基团；
(iv)所述第一靶标标记非共价结合至所述第一递呈基团；或者
(v)所述第一靶标标记是所述第一递呈基团的一部分。
实施方式160.根据实施方式105至159中任一项所述的系统，其中：
(i)将所述第二靶标标记缀合至所述第二结合剂；
(ii)所述第二靶标标记非共价结合至所述第二结合剂；
(iii)将所述第二靶标标记缀合至所述第二递呈基团；
(iv)所述第二靶标标记非共价结合至所述第二递呈基团；或者
(v)所述第二靶标标记是所述第二递呈基团的一部分。
实施方式161.根据实施方式105至160中任一项所述的系统，其中：(i)所述第一递呈基团直接结合至所述第一结合剂；或者(ii)所述第一递呈基团间接结合至所述第一结合剂。
实施方式162.根据实施方式109至161中任一项所述的系统，其中：(i)所述第二递呈基团直接结合至所述第二结合剂；或者(ii)所述第二递呈基团间接结合至所述第二结合剂。
实施方式163.根据实施方式105至162中任一项所述的系统，其中：
(i)将所述第一递呈基团缀合至所述第一结合剂；
(ii)所述第一递呈基团非共价结合至所述第一结合剂；
(iii)将所述第一递呈基团缀合至所述第一靶标标记；
(iv)所述第一递呈基团非共价结合至所述第一靶标标记；或者
(v)所述第一递呈基团是所述第一靶标标记的一部分。
实施方式164.根据实施方式109至163中任一项所述的系统，其中：
(i)将所述第二递呈基团缀合至所述第二结合剂；
(ii)所述第二递呈基团非共价结合至所述第二结合剂；
(iii)将所述第二递呈基团缀合至所述第二靶标标记；
(iv)所述第二递呈基团非共价结合至所述第二靶标标记；或者
(v)所述第二递呈基团是所述第二靶标标记的一部分。
实施方式165.根据实施方式105至164中任一项所述的系统，其中：
(i)所述第一靶标标记是核酸分子；
(ii)所述第二靶标标记是核酸分子；或者
(iii)(i)和(ii)两者。
实施方式166.根据实施方式128至165中任一项所述的系统，其中：
(i)所述第一靶标标记与所述第一标签杂交；
(ii)所述第二靶标标记与所述第二标签杂交；或者
(iii)(i)和(ii)两者。
实施方式167.根据实施方式106至166中任一项所述的系统，其中所述样品标记是单链核酸分子(“单链样品标记”)。
实施方式168.根据实施方式106至166中任一项所述的系统，其中所述样品标记是双链核酸分子(“双链样品标记”)。
实施方式169.根据实施方式168所述的系统，其中所述样品标记是：
(i)包含两个5'悬突的双链核酸分子；
(ii)包含两个3'悬突的双链核酸分子；
(iii)包含5'悬突和3'悬突的双链核酸分子；
(iv)包含5'悬突和平末端的双链核酸分子；或者
(v)包含3'悬突和平末端的双链核酸分子。
实施方式170.根据实施方式169所述的系统，其中所述样品标记：
(i)通过所述样品标记的悬突与所述第一靶标标记杂交；
(ii)通过所述样品标记的悬突与所述第二靶标标记杂交；或者
(iii)(i)和(ii)两者。
实施方式171.根据实施方式106至170中任一项所述的系统，其中所述系统能够通过同时检测与每种分析物有关的独特靶标ID同时检测所述样品中的至少两个分析物。
实施方式172.根据实施方式105至171中任一项所述的系统，其中所述系统还包含参比分析物。
实施方式173.根据实施方式172所述的系统，其中所述参比分析物是在所述样品中不存在的分析物。
实施方式174.根据实施方式172或173所述的系统，其中所述参比分析物是所述样品中不存在的蛋白、核酸或化合物。
实施方式175.根据实施方式174所述的系统，其中所述参比分析物是病毒蛋白、细菌蛋白或昆虫蛋白。
实施方式176.根据实施方式111至175中任一项所述的系统，其中所述系统能够通过同时检测与每种样品有关的所述核酸报告分子中的独特样品ID来同时检测至少两个样品中的所述分析物。
实施方式177.根据实施方式110至176中任一项所述的系统，其中所述系统能够通过同时检测与每种样品中的每种分析物有关的所述核酸报告分子中的独特样品ID和独特靶标ID，同时检测至少两种样品中的至少两种分析物。
实施方式178.根据实施方式105至177中任一项所述的系统，其包括用于检测核酸报告分子的多重qPCR、多重数字PCR或NGS的试剂和/或机器。
实施方式179.根据实施方式105至177中任一项所述的系统，其包括用于检测所述核酸报告分子的NGS的试剂和/或机器。
实施方式180.根据实施方式105至179中任一项所述的系统，其中所述系统包含在试剂盒中。
实施方式181.根据实施方式180所述的系统，其中所述试剂盒还包含结合缓冲液、固定化缓冲液、清洗缓冲液、释放缓冲液或它们的任意组合。
实施方式182.用于检测样品中分析物的系统，其包括：(1)第一结合部分，其包含第一结合剂、第一递呈基团和第一靶标标记，所述第一靶标标记包含第一标识码(“ID”)，它是分析物特异的(“靶标ID”)；(2)第二结合部分，其包含第二结合剂、第二递呈基团和第二靶标标记，所述第二靶标标记包含第二靶标ID；(3)第一接受基团、第一固体表面、第二接受基团和第二固体表面；(4)用于连接的试剂和包含样品特异的ID(“样品ID”)的样品标记；和(5)用于定量PCR的试剂；其中：
(i)所述第一和第二结合剂结合至分析物并形成免疫复合物，
(ii)所述第一接受基团偶联至所述第一固体表面并配置以捕获所述第一递呈基团；
(iii)所述第二接受基团偶联至所述第二固体表面并配置以捕获所述第二递呈基团；
(iv)所述第一靶标标记直接或间接结合至所述第一结合剂并且所述第二靶标标记直接或间接结合至所述第二结合剂；
(v)所述第一递呈基团直接或间接结合至所述第一结合剂并且所述第二递呈基团直接或间接结合至所述第二结合剂；和
(vi)所述样品标记结合至所述第一靶标标记和所述第二靶标标记两者。
实施方式183.根据实施方式182所述的系统，其中所述系统包含在试剂盒中。
实施方式184.根据实施方式183所述的系统，其中所述试剂盒还包含结合缓冲液、固定化缓冲液、清洗缓冲液、释放缓冲液或它们的任意组合。
实施方式185.用于检测样品中分析物的系统，其包括：(1)第一结合部分，其包含第一结合剂、第一递呈基团和第一靶标标记，所述第一靶标标记包含第一标识码(“ID”)，它是分析物特异的(“靶标ID”)；(2)第二结合部分，其包含第二结合剂、第二递呈基团和第二靶标标记，所述第二靶标标记包含第二靶标ID；(3)第一接受基团、第一固体表面、第二接受基团和第二固体表面；和(4)用于连接的试剂和包含样品特异的ID(“样品ID”)的样品标记；其中：
(i)所述第一和第二结合剂结合至分析物并形成免疫复合物，
(ii)所述第一接受基团偶联至所述第一固体表面并配置以捕获所述第一递呈基团；
(iii)所述第二接受基团偶联至所述第二固体表面并配置以捕获所述第二递呈基团；
(iv)所述第一靶标标记直接或间接结合至所述第一结合剂并且所述第二靶标标记直接或间接结合至所述第二结合剂；
(v)所述第一递呈基团直接或间接结合至所述第一结合剂并且所述第二递呈基团直接或间接结合至所述第二结合剂；和
(vi)所述样品标记结合至所述第一靶标标记和所述第二靶标标记两者。
实施方式186.根据实施方式185所述的系统，其中所述系统包含在试剂盒中。
实施方式187.根据实施方式186所述的系统，其中所述试剂盒还包含结合缓冲液、固定化缓冲液、清洗缓冲液、释放缓冲液或它们的任意组合。
本文提供了使用双捕获结合剂的测定方法。在一些实施方式中，本文提供了用于检测样品中分析物的测定方法，其包括：
(1)将第一结合剂、第二结合剂和样品在溶液中混合，其中所述第一和第二结合剂结合所述分析物上的非干扰表位并形成免疫复合物，并且其中所述免疫复合物通过缀合至所述第一结合剂的第一递呈基团和偶联至所述第一表面的第一接受基团之间的结合捕获在与所述溶液接触的第一固体表面上；
(2)清洗所述第一固体表面以除去未结合的分子；
(3)通过破坏所述第一递呈基团和所述第一接受基团之间的结合从所述第一固体表面释放所述免疫复合物；
(4)引入第二固体表面并通过缀合至所述第二结合剂的第二递呈基团和偶联至所述第二固体表面的第二接受基团之间的结合重新捕获所述免疫复合物；
(3)清洗所述第二固体表面以除去未结合的分子；和
(6)检测所述免疫复合物。
在一些实施方式中，步骤(1)包括在将所述免疫复合物捕获至所述第一固体表面上之前在溶液中形成所述免疫复合物。在一些实施方式中，步骤(1)包括在所述第一固体表面上形成所述免疫复合物之前将所述第一结合剂预捕获至所述第一固体表面上。在一些实施方式中，在步骤(1)中，在溶液中形成所述免疫复合物并同时捕获至所述第一固体表面上。
在一些实施方式中，本文所提供的测定方法还在步骤(5)和(6)之间包括至少一个其它重新捕获循环，其包括：从捕获它的固体表面上释放所述免疫复合物，在与所述第一或所述第二接受基团偶联的其它固体表面上重新捕获所述免疫复合物，并清洗所述其它固体表面以除去未结合的分子。
在一些实施方式中，(i)所述第一递呈基团通过硫酯基团、二硫键或可切割键结合所述第一接受基团；(ii)所述第二递呈基团通过硫酯基团、二硫键或可切割键结合所述第二接受基团；或者(i)和(ii)两者。
在一些实施方式中，(i)所述第一递呈基团通过光可切割键、化学可切割键或酶促可切割键结合所述第一接受基团；(ii)所述第二递呈基团通过光可切割键、化学可切割键或酶促可切割键结合所述第二接受基团；或者(i)和(ii)两者。
在一些实施方式中，(i)所述第一递呈基团是第一核酸标签(“第一标签”)并且所述第一接受基团是第一核酸捕获探针(“第一探针”)，其中所述第一探针或其片段与所述第一标签或其片段互补；或者(ii)所述第二递呈基团是第二核酸标签(“第二标签”)并且所述第二接受基团是第二核酸捕获探针(“第二探针”)，其中所述第二探针或其片段与所述第二标签或其片段互补。
在一些实施方式中，(i)所述第一递呈基团是所述第一标签并且所述第一接受基团是所述第一探针；且(ii)所述第二递呈基团是所述第二标签并且所述第二接受基团是所述第二探针。
在一些实施方式中，(i)所述第一探针直接偶联至所述第一固体表面；(ii)所述第二探针直接偶联至所述第二固体表面；或者(i)和(ii)两者。
在一些实施方式中，(i)所述第一探针与直接偶联至所述第一固体表面的通用探针杂交；(ii)所述第二探针与直接偶联至所述第二固体表面的通用探针杂交；或者(i)和(ii)两者。
在一些实施方式中，(i)所述第一探针与生物素缀合，所述生物素结合直接偶联至所述第一固体表面的链霉亲和素或抗生物素蛋白；(ii)所述第二探针与生物素缀合，所述生物素结合直接偶联至所述第二固体表面的链霉亲和素或抗生物素蛋白；或者(i)和(ii)两者。
在一些实施方式中，在步骤(1)中，所述第一标签和第二标签被协同捕获在所述第一固体表面上。
在一些实施方式中，所述第一探针的第一片段与所述第一标签或其片段互补，并且所述第一探针的第二片段与所述第二标签或其片段互补，其中所述互补区包括所述第一和所述第二标签的非缀合末端。
在一些实施方式中，所述第一探针的连续片段由第一片段和紧邻的第二片段组成，其中所述第一片段与所述第一标签或其片段互补，并且所述第二片段与所述第二标签或其片段互补，从而当所述第一和第二标签连接以形成连接的核酸时，所述连接的核酸的连接区与所述第一探针的连续片段互补。
在一些实施方式中，所述第一探针的第一片段与所述第一标签或其片段互补，并且所述第一探针的单独的第二片段与所述第二标签或其片段互补；其中所述互补区不包括所述第一和所述第二标签的非缀合末端。
在一些实施方式中，所述第一固体表面与所述第一探针和所述第二探针两者偶联。
在一些实施方式中，(i)所述第一标签和所述第一探针的互补片段由10至25个碱基对组成；(ii)所述第二标签和所述第二探针的互补片段由10至25个碱基对组成；或者(i)和(ii)两者。
本文还提供了使用单捕获结合剂的测定方法。在一些实施方式中，本文提供了用于检测样品中分析物的测定方法，其包括：
(1)将第一结合剂、第二结合剂和样品在溶液中混合；其中所述第一和第二结合剂结合所述分析物上的非干扰表位并且形成免疫复合物；并且其中所述免疫复合物通过缀合至所述第一结合剂的第一核酸标签(“第一标签”)和偶联至所述第一固体表面的第一核酸捕获探针(“第一探针”)之间的杂交捕获至与溶液接触的第一固体表面上；
(2)清洗所述第一固体表面以除去未结合的分子；
(3)通过所述第一标签和所述第一探针之间的杂交的解除，从所述第一固体表面释放所述免疫复合物；
(4)引入与第二核酸探针(“第二探针”)偶联的第二固体表面并且通过所述第一标签和所述第二探针之间的杂交在所述第二固体表面上重新捕获所述免疫复合物；
(5)清洗所述第二固体表面以除去未结合的分子；和
(6)检测所述免疫复合物。
在一些实施方式中，所述第二探针与所述第一探针相同。
在一些实施方式中，步骤(1)包括在将所述免疫复合物捕获至所述第一固体表面上之前在溶液中形成所述免疫复合物。在一些实施方式中，步骤(1)包括在所述第一固体表面上形成所述免疫复合物之前将所述第一结合剂预捕获至所述第一固体表面上。在一些实施方式中，在步骤(1)中，在溶液中形成所述免疫复合物并同时捕获至所述第一固体表面上。
在一些实施方式中，本文所提供的测定方法在步骤(5)和(6)之间包括至少一个其它重新捕获循环，其包括：从捕获它的固体表面上释放所述免疫复合物；在与(a)第一探针、(b)第二探针或者(c)与第一标签杂交的另一种核酸探针偶联的其它固体表面上重新捕获所述免疫复合物；并清洗所述其它固体表面以除去未结合的分子。
在一些实施方式中，(i)所述第一探针直接偶联至所述第一固体表面；(ii)所述第二探针直接偶联至所述第二固体表面；或者(i)和(ii)两者。
在一些实施方式中，(i)所述第一探针与直接偶联至所述第一固体表面的通用探针杂交；(ii)所述第二探针与直接偶联至所述第二固体表面的通用探针杂交；或者(i)和(ii)两者。
在一些实施方式中，(i)所述第一探针与生物素缀合，所述生物素结合直接偶联至所述第一固体表面的链霉亲和素或抗生物素蛋白；(ii)所述第二探针与生物素缀合，所述生物素结合直接偶联至所述第二固体表面的链霉亲和素或抗生物素蛋白；或者(i)和(ii)两者。
在一些实施方式中，将所述第二结合剂缀合至第二核酸标签(“第二标签”)。
在一些实施方式中，在步骤(1)中，所述第一标签和第二标签被协同捕获在所述第一固体表面上。
在一些实施方式中，所述第一探针的第一片段与所述第一标签或其片段互补，并且所述第一探针的第二片段与所述第二标签或其片段互补；其中所述互补区包括所述第一和所述第二标签的非缀合末端。
在一些实施方式中，所述第一探针的连续片段由第一片段和紧邻的第二片段组成，其中所述第一片段与所述第一标签或其片段互补，并且所述第二片段与所述第二标签或其片段互补，从而当所述第一和第二标签连接以形成连接的核酸时，所述连接的核酸的连接区与所述第一探针的连续片段互补。
在一些实施方式中，所述第一探针的第一片段与所述第一标签或其片段互补，并且所述第一探针的单独的第二片段与所述第二标签或其片段互补；其中所述互补区不包括所述第一和所述第二标签的非缀合末端。
在一些实施方式中，所述第一固体表面与所述第一探针和其它核酸探针两者偶联，并且所述其它探针或其片段与所述第二标签或其片段互补。
在一些实施方式中，在步骤(4)中，所述第一标签和第二标签被协同捕获在所述第二固体表面上。
在一些实施方式中，所述第二探针的第一片段与所述第一标签或其片段互补，并且所述第二探针的第二片段与所述第二标签或其片段互补；其中所述互补区包括所述第一和所述第二标签的非缀合末端。
在一些实施方式中，所述第二探针的连续片段由第一片段和紧邻的第二片段组成，所述第一片段与所述第一标签或其片段互补，并且所述第二片段与所述第二标签或其片段互补，从而当所述第一和第二标签连接以形成连接的核酸时，所述连接的核酸的连接区与所述第二探针的连续片段互补。
在一些实施方式中，所述第二探针的第一片段与所述第一标签或其片段互补，并且所述第二探针的单独的第二片段与所述第二标签或其片段互补；其中所述互补区不包括所述第一和所述第二标签的非缀合末端。
在一些实施方式中，所述第二固体表面与所述第二探针和其它核酸探针两者偶联，并且其中所述其它探针或其片段与所述第二标签或其片段互补。
在一些实施方式中，所述第一标签和所述第一探针的互补片段由10至25个碱基对组成。
本文所提供的测定方法检测了样品中的分析物，其包括在步骤(6)中检测所述免疫复合物。
在一些实施方式中，所述样品是血清样品或血浆样品。
在一些实施方式中，所述分析物是两个分子的结合对；其中所述第一结合剂结合所述结合对的一个分子，并且所述第二结合剂结合所述结合对的另一个分子。
在一些实施方式中，(i)所述第一结合剂是特异性结合所述分析物的抗体或抗体片段；(ii)所述第二结合剂是特异性结合所述分析物的抗体或抗体片段，或(i)和(ii)两者。
在一些实施方式中，在步骤(6)中：检测所述免疫复合物，同时所述免疫复合物捕获至固体表面上。在一些实施方式中，在步骤(6)中：在从固体表面释放至溶液之后检测所述免疫复合物。
在一些实施方式中，所述第一结合剂或所述第二结合剂中的任一个与可检测标志物缀合。在一些实施方式中，所述第一结合剂与可检测标志物缀合。在一些实施方式中，所述第二结合剂与可检测标志物缀合。在一些实施方式中，所述可检测标志物为核酸。
在一些实施方式中，步骤(6)包括通过连接所述第一标签和所述第二标签产生核酸报告分子，并且检测由所述第一标签的片段和所述第二标签的片段所组成的所述核酸报告分子。
在一些实施方式中，步骤(6)包括通过连接以下部分产生核酸报告分子：(a)所述部分为所述第一标签和所述第二标签的替代核酸(“第二替代物”)，并且检测由所述第一标签的片段和所述第二替代物的片段所组成的所述核酸报告分子；(b)所述部分为第一标签的替代核酸(“第一替代物”)和所述第二标签，并且检测由所述第一替代物的片段和所述第二标签的片段所组成的所述核酸报告分子；或者(c)所述部分为所述第一替代物和所述第二替代物，并且检测由所述第一替代物的片段和所述第二替代物的片段所组成的所述核酸报告分子；其中所述第一标签或其片段与所述第一替代物或其片段互补，并且所述第二标签或其片段与所述第二替代物或其片段互补。
在一些实施方式中，通过邻位连接形成所述核酸报告分子。在一些实施方式中，通过邻位延伸形成所述核酸报告分子。
在一些实施方式中，通过qPCR、数字PCR或下一代测序(NGS)检测所述核酸报告分子。
在一些实施方式中，通过滚环扩增(RCA)、链置换扩增(SDA)、环介导等温扩增(LAMP)、重组酶聚合酶扩增(RPA)或者QuantiGene测定检测所述核酸报告分子。
在一些实施方式中，在所述第一标签或其第一替代物或者在所述第二标签或其第二替代物中，所述核酸报告分子含有标识码(“ID”)片段，它是分析物特异的(“靶标ID”)。在一些实施方式中，所述核酸报告分子在所述第一标签或所述第一替代物中含有第一靶标ID，并且在所述第二标签或所述第二替代物中含有第二靶标ID。
在一些实施方式中，本文所提供的测定方法包括通过同时检测与每种分析物有关的独特靶标ID同时检测所述样品中的至少两个分析物。
在一些实施方式中，本文所提供的测定方法包括通过在步骤(1)中将无功能结合剂添加至所述溶液，从所述分析物中的至少一种按比例降低信号，其中所述无功能结合剂与所述第一结合剂竞争与所述分析物的结合，但是所述无功能结合剂未缀合或缀合至不结合所述第一接受基团的递呈基团。
在一些实施方式中，至少一种分析物为核酸，并且用于核酸分析物的第一和第二结合剂包含与核酸分析物的不同片段互补的核酸。
在一些实施方式中，在步骤(6)中，检测所述分析物包括所述第一和所述第二靶标ID的共检测。
在一些实施方式中，所述分析物是两个分子的结合对；其中所述第一结合剂结合所述结合对的一个分子，并且所述第二结合剂结合所述结合对的另一个分子。
在一些实施方式中，在每个样品中所形成的核酸报告分子含有样品特异的ID(“样品ID”)，其中所述样品ID(1)插入在所述第一标签或其替代物和所述第二标签或其替代物之间，(2)包含在所述第一替代物或所述第二替代物中，或者(3)连接至所述第一标签或其替代物或者所述第二标签或其替代物。
在一些实施方式中，本文所提供的测定方法包括通过同时检测与每种样品有关的所述核酸报告分子中的独特样品ID，同时检测至少两个样品中的所述分析物。
在一些实施方式中，所述核酸报告分子包含(a)在所述第一标签或所述第一替代物或者在所述第二标签或所述第二替代物中的靶标ID，和(b)(1)插入在所述第一标签或其替代物和所述第二标签或其替代物之间，(2)包含在所述第一替代物或所述第二替代物中，或者(3)连接至所述第一标签或其替代物或者所述第二标签或其替代物的样品ID。
在一些实施方式中，本文所提供的测定方法包括通过同时检测与每种样品中的每种分析物有关的所述核酸报告分子中的独特样品ID和独特靶标ID，同时检测至少两个样品中的至少两个分析物。
在一些实施方式中，通过多重qPCR、多重数字PCR或NGS检测所述核酸报告分子。
在一些实施方式中，(i)所述第一固体表面是磁性颗粒表面和微量滴定板的孔；(ii)所述第二固体表面是磁性颗粒表面和微量滴定板的孔；或(i)和(ii)两者。
在一些实施方式中，本文提供了用于检测样品中分析物的系统，其包含：第一结合剂、第二结合剂、第一递呈基团、第二递呈基团、第一接受基团和第二接受基团；其中(i)所述第一和第二结合剂结合所述分析物上的非干扰表位，并且(ii)所述第一和第二递呈基团分别结合所述第一和第二接受基团。
在一些实施方式中，本文所提供的系统还包括第一固体表面和第二固体表面。
在一些实施方式中，(i)所述第一固体表面是磁性颗粒表面和微量滴定板的孔；(ii)所述第二固体表面是磁性颗粒表面和微量滴定板的孔；或(i)和(ii)两者。
在一些实施方式中，所述第一固体表面与所述第一接受基团偶联，并且所述第二第一固体表面与所述第二接受基团偶联。
在一些实施方式中，本文所提供的系统还包括可检测标志物。
在一些实施方式中，将所述可检测标志物缀合至所述第一结合剂或所述第二结合剂。
在一些实施方式中，将所述第一结合剂缀合至所述第一递呈基团，并且将所述第二结合剂缀合至所述第二递呈基团。
在一些实施方式中，(i)所述第一递呈基团通过硫酯基团、二硫键或可切割键结合所述第一接受基团；(ii)所述第二递呈基团通过硫酯基团、二硫键或可切割键结合所述第二接受基团；或者(i)和(ii)两者。
在一些实施方式中，(i)所述第一递呈基团通过光可切割键、化学可切割键或酶促可切割键结合所述第一接受基团；(ii)所述第二递呈基团通过光可切割键、化学可切割键或酶促可切割键结合所述第二接受基团；或者(i)和(ii)两者。
在一些实施方式中，本文提供了用于检测样品中分析物的系统，其包含：第一结合剂、第二结合剂、第一核酸标签(“第一标签”)、第二核酸标签(“第二标签”)、第一核酸捕获探针(“第一探针”)和第二核酸捕获探针(“第二探针”)；其中(i)所述第一和第二结合剂结合所述分析物上的非干扰表位；(ii)所述第一探针或其片段与所述第一标签或其片段互补；和(iii)所述第二探针或其片段与所述第二标签或其片段互补。
在一些实施方式中，本文所提供的系统还包括第一固体表面和第二固体表面。
在一些实施方式中，(i)所述第一固体表面是磁性颗粒表面和微量滴定板的孔；(ii)所述第二固体表面是磁性颗粒表面和微量滴定板的孔；或(i)和(ii)两者。
在一些实施方式中，所述第一固体表面与所述第一探针偶联，并且所述第二第一固体表面与所述第二探针偶联。
在一些实施方式中，将所述第一结合剂缀合至所述第一标签，并且将所述第二结合剂缀合至所述第二标签。
在一些实施方式中，(i)所述第一标签和所述第一探针的互补片段由10至25个碱基对组成；(ii)所述第二标签和所述第二探针的互补片段由10至25个碱基对组成；或者(i)和(ii)两者。
在一些实施方式中，(i)所述第一结合剂是特异性结合所述分析物的抗体或抗体片段；(ii)所述第二结合剂是特异性结合所述分析物的抗体或抗体片段；或(i)和(ii)两者。
本文还提供了用于检测样品中分析物的系统，其包含：第一结合剂、第二结合剂、第一核酸标签(“第一标签”)、第一核酸捕获探针(“第一探针”)和第二核酸捕获探针(“第二探针”)；其中(i)所述第一和第二结合剂结合所述分析物上的非干扰表位；(ii)所述第一探针或其片段与所述第一标签或其片段互补；和(iii)所述第二探针或其片段与所述第一标签或其片段互补。
在一些实施方式中，所述第二探针与所述第一探针相同。
在一些实施方式中，将所述第一结合剂缀合至所述第一标签。
在一些实施方式中，本文所提供的系统还包括可检测标志物。在一些实施方式中，将所述第一结合剂或所述第二结合剂中的任一个缀合至所述可检测标志物。
在一些实施方式中，本文所提供的系统还包括第二核酸标签(“第二标签”)。在一些实施方式中，将所述第二标签缀合至所述第二结合剂。
在一些实施方式中，所述第一探针的片段与所述第二标签或其片段互补。
在一些实施方式中，本文所提供的系统还包括第一固体表面和第二固体表面。
在一些实施方式中，(i)所述第一固体表面是磁性颗粒表面和微量滴定板的孔；(ii)所述第二固体表面是磁性颗粒表面和微量滴定板的孔；或(i)和(ii)两者。
在一些实施方式中，(1)所述第一固体表面与所述第一探针偶联；(2)所述第二固体表面与所述第二探针偶联；或者(1)和(2)两者。
在一些实施方式中，本文所提供的系统还包括其它核酸探针，其中所述其它探针或其片段与所述第二标签或其片段互补。
在一些实施方式中，本文所提供的系统还包括第一固体表面和第二固体表面，其中所述第一固体表面与所述第一探针和所述其它探针偶联，并且所述第二固体表面与所述第二探针和所述其它探针偶联。
在一些实施方式中，(i)所述第一结合剂是特异性结合所述分析物的抗体或抗体片段；(ii)所述第二结合剂是特异性结合所述分析物的抗体或抗体片段；或(i)和(ii)两者。
在一些实施方式中，(i)所述第一标签和所述第一探针的互补片段由10至25个碱基对组成；(ii)所述第二标签和所述第二探针的互补片段由10至25个碱基对组成；或者(i)和(ii)两者。
在一些实施方式中，所述系统包含在试剂盒中。
在一些实施方式中，所述试剂盒还包含结合缓冲液、固定化缓冲液、清洗缓冲液、释放缓冲液或它们的任意组合。
4.附图说明
图1是单分子阵列(SIMOA)测定工作流程的示意图。如所示的，所述技术基于夹心ELISA，但是在该测定的最终读取阶段，对具有信号产生部分的分子一次一个地进行分离、检测和计数。基于所使用的抗体对的质量，该测定的检测下限(LOD)受限于两位数至个位数fM的范围(Yeung,J.Imm.Meth.437:53-63(2016))。
图2是免疫PCR工作流程的示意图。如所示的，将预缀合至所述检测抗体的核酸节段用作免疫复合物的报告分子，并且使用PCR扩增所述报告分子并产生可检测信号。尽管由报告分子的PCR扩增所产生的信号强度显著增强，但是与夹心ELISA相比，LOD的改善不大，大概改善了约10倍(Potuckova,J.Immu.Meth.371:38-47(2011))。
图3A-3C是邻位连接测定(“PLA”)(图3A)、邻位延伸测定(“PEA”)(图3B)和固相PLA(图3C)的示意图。如所示的，当两个结合剂邻近，从而它们所连接的核酸可以连接(PLA；图3A)或延伸(PEA；图3B)时，产生了核酸报告分子。邻位-基检测测定也具有在中-至-低fM范围的LOD。在固相PLA中，所述靶标分析物的两个结合剂分别与核酸缀合，并且第三结合剂将所述分析物捕获至固体表面(图3C)。固相邻位测定已证实处于个位数fM范围的LOD(NongRY,Nature protocols,8(6):1234-1249(2013))。然而，相同靶标蛋白的3个互不干扰的抗体的要求在测定开发中造成了显著困难。
图4A-4D是使用捕获-和-释放机制的本文所提供的测定方法的示意图。图4A显示了包括双捕获结合剂的测定方法。图4B显示了包括双捕获结合剂并且将核酸标签和探针用于捕获-和-释放的测定方法。图4C显示了包括单捕获结合剂的测定方法，其利用了所述第一递呈基团和所述第一接受基团之间的可再生键。图4D显示了包括单捕获结合剂的测定方法，其利用了用于捕获-和-释放的相同核酸标签和探针对之间的杂交。
图5A-5C是使用不同核酸报告分子构造的本文所提供的测定方法的示意图。通过将第一标签的替代物(“第一替代物”)连接至所述第二标签(图5A)，通过将所述第一标签连接至所述第二标签的替代物(“第二替代物”)(图5B)或者通过将所述第一替代物连接至所述第二替代物(图5C)产生了所述核酸报告分子。尽管图中显示了连接，但是还可以通过延伸产生所述报告分子。
图6A-6D是在本文所提供的测定方法中使用的示例性捕获构造的示意图。图6A显示了直接捕获构造。图6B显示了使用通用探针的间接捕获构造。图6C显示了使用生物素/链霉亲和素对的间接捕获构造。图6D显示了直接协同捕获构造，其中所述第一和第二核酸标签协同结合所述核酸捕获探针。
图7A-7C是在本文所提供的测定方法中使用的协同捕获的示例性构造的示意图。图7A显示了协同捕获，其中所述探针的连续片段与所述第一标签和第二标签的连接区杂交。图7B显示了协同捕获，其中所述探针的片段与所述第一标签的片段杂交，并且所述探针的单独的片段与所述第二标签的片段杂交。图7C显示了协同捕获，其中固体表面与所述第一和第二探针两者偶联，其分别捕获所述第一和第二标签。
图8A-8G是NULISA免疫测定的实施方式的示意图。图8A-8B显示了包括两个可释放、正交键的测定方法，其中在每个结合剂和它们各自的固体表面之间实施至少一次所述捕获/释放过程。图8A显示了使用缀合至所述结合剂的两种核酸标签通过核酸报告分子的形成的检测；和图8B显示了通过缀合至所述第二结合剂的核酸分子的iPCR的检测。图8C-8D显示了在所述第一固体表面上包括一个可释放且可再生键的测定方法，其中在所述第一结合剂和不止一个固体表面以及所述核酸报告分子之间反复进行捕获/释放。图8C显示了使用缀合至所述结合剂的两种核酸标签通过核酸报告分子的形成的检测；图8D显示了通过缀合至所述第二结合剂的核酸分子的iPCR的检测；图8E显示了在所述第一结合剂和所述第二结合剂两者实施捕获和释放之后，缀合至所述第一结合剂的所述第一靶标标记的检测；图8F显示了非核酸报告分子或标记的检测；和图8G显示了其中结合剂1和结合剂2间接结合至靶标的实施方式，例如，结合剂1和结合剂2结合至第一抗体，所述第一抗体直接结合至所述分析物。
图9A-9B是本文所提供的测定方法的示意图，所述测定方法将标识码(ID)引入所述核酸报告分子。在图9A中，将一个ID引入缀合至所述结合剂之一的所述核酸标签之一。在图9B中，将两个ID分别引入两个结合剂的两个标签中。
图10A-10B是使用间接ID码化方法的本文所提供的测定方法的示意图。在图10A中，通过将可以与所述第一标签杂交的第一核酸替代物(“第一替代物”)和所述第二标签连接形成所述核酸报告分子，并且将一个ID引入所述第一替代物。在图10B中，通过将第一替代物与可以与第二标签杂交的第二核酸替代物(“第二替代物”)连接形成所述核酸报告分子；并且与ID一起引入每个替代物。
图11是本文所提供的多重测定方法的示意图，其可以通过对每种分析物检测在缀合至结合剂的标签中所引入的独特ID同时检测多个分析物。
图12是使用独特ID实现增强的特异性的本文所提供的测定方法的示意图。如所示的，通过作为“真实信号”的检测要求共检测分别引入缀合至结合剂1和结合剂2的标签的ID1和ID 2，所述方法降低了与仅ID 1或ID 2(但是不能与ID 1或ID 2两者)的检测有关的假阳性信号。
图13是本文所提供的用于检测蛋白-蛋白相互作用的测定方法的示意图，其中通过与独特ID有关的结合剂捕获结合对中的每种蛋白，并且通过单一免疫复合物中的两种ID的共检测来反映两种蛋白的相互作用。
图14A-14C是本文所提供的测定方法的示意图，所述方法引入样品特异的ID(“样品ID”)并且可以同时检测多个样品。图14A显示了所述第一和第二核酸标签之间样品ID的掺入以形成用于检测的报告分子。图14B显示了在作为用于检测的报告分子的一部分的第一或第二替代核酸中的样品ID的掺入。图14C显示了样品ID与所述第一或第二核酸标签或其替代物的连接以形成用于检测的报告分子。
图15A-15J是本文所提供的用于检测核酸分析物的测定方法的示意图，其包括分析物-结合剂复合物在溶液中的形成(图15A)、免疫复合物向所述第一固体表面的捕获(图15B)、所述免疫复合物从所述第一表面的释放(图15C)、所述免疫复合物向所述第二表面的重新捕获(图15D)、报告分子产生(图15E)；图15F-15J显示了核酸检测的替代工作流程，包括分析物-结合剂复合物在溶液中的形成(图15F)、所述分析物-结合剂复合物向所述第一表面的捕获(图15G)、所述分析物-结合剂复合物的释放(图15H)、所述分析物-结合剂复合物向所述第二表面的重新捕获(图15I)和报告分子产生(图15J)。
图16是示例性NULISA免疫测定构造的示意图。如所示的，将所述分析物的两个结合剂分别与核酸标签(分别为“CP”和“L”)缀合，其中CP通过通用探针(多聚T)间接偶联至所述第一固体表面(顺磁珠1)并且L通过链霉亲和素/生物素结合间接偶联至所述第二固体表面(顺磁珠2)。在形成免疫测定并通过本文所公开的捕获/释放机制降低非特异性结合之后，通过L、CP替代R(与CP的一部分杂交)和作为样品ID的短低聚SI的连接形成了所述免疫复合物的核酸报告分子。作为L的节段掺入靶标ID(TI)。连接子(CNT)是配置用于连接的桥接探针。
图17是使用NULISA免疫测定用于人EGFR-Fc蛋白检测的滴定曲线。
图18A-18C显示了本文所提供的核酸连接的免疫复合物的基本构造。
图19A-19D显示了本文所提供的核酸连接的免疫复合物的一些其它构造。
图20A-20E显示了NULISA替代工作流程，其包括免疫复合物在溶液中的形成(图20A)、通过所述第一核酸捕获探针分子(“CP1”或者“第一探针”)将结合剂1捕获至所述第一固体表面(图20B)、所述免疫复合物从所述第一表面的释放(图20C)和核酸报告分子的产生(图20D)，以及当所述免疫复合物释放(每对中右侧的柱)或未释放(每对中左侧的柱)至溶液时所产生的信号比较(图20E)。
图21A-21I显示了多重NULISA的步骤，其包括孵浴(图21A)、免疫复合物向所述第一固体表面的捕获(图21B)、第一清洗(图21C)、免疫复合物从所述第一固体表面的释放(图21D)、免疫复合物向所述第二固体表面的捕获(图21E)、第二清洗(图21F)、样品标记的结合和连接以产生含有两个分析物特异的标识码(“靶标ID”)和一个样品特异的标识码(“样品ID”)的核酸报告分子(图21G)、最终清洗和洗脱(图21H)以及PCR扩增和检测(图21I)。作为另外一种选择，在预先扩增或不预先扩增的情况下，可以将具有靶标ID和样品ID的连接产物混合以用于测序。
图22显示了NULISAseq的示例性构造。在这种构造中，CP可以是第一递呈基团(第一标签)，偶联至顺磁珠的多聚-T可以是第一接受基团(第一探针)，R可以是包含第一靶标ID(TI)的第一靶标标记，L可以是包含第二靶标ID(TI)的第二靶标标记，生物素化的CP2可以是第二递呈基团，链霉亲和素可以是第二接受基团并且CNT(“连接子”的缩写)可以是具有结合至所述第二靶标标记的3'悬突和结合至所述第一靶标标记的5'悬突的样品标记，SI可以是样品标记(CNT)内的样品ID，顺磁珠1可以是第一固体表面并且顺磁珠2可以是第二固体表面。
图23A-23B显示了NULISAseq的高灵敏度和多重性机制，包括(图23A)来自图22的“L”的片段的示例性序列，用于连接的桥接探针(来自图22的“CNT”)和来自图22的“R”的片段的示例性序列；和(图23B)具有3个分析物和3个样品的多重NULISAseq的示例性连接产物。
图24A-24B显示了分析物P24的qPCR定量和测序，包括不同浓度P24间的码分配和qPCR结果(图24A)以及通过测序相对于qPCR的定量之间的比较(24B)。
图25A-25C显示了5重NILISAseq的结果，包括5个重复测定中每一个中的测序结果(图25A)、变异系数(CV)的平均值(图25B)和每个测定的检测限(LOD)(图25C)。
5.具体实施方式
在进一步描述本发明公开之前，应理解本发明公开不局限于本文所述的具体实施方式，并且还应理解本文所使用的术语仅出于描述具体实施方式的目的，并且不意欲限制。
5.1定义
除非在本文中另外定义，否则结合本发明所使用的科学和技术术语应具有本领域那些技术人员通常所理解的含义。此外，除非上下文另外要求，否则单数术语应包括复数并且复数术语应包括单数。一般地，结合本文所描述的分子生物学、免疫学、遗传学以及蛋白和核酸化学和杂交所使用的术语以及这些领域的技术是本领域中熟知且常用的那些。
如本文所使用的，术语“检测”或其语法等价形式广泛用于包括确定分析物的存在(即它是否存在)的任何方式或者所述分析物的任何测量形式。因此，“检测”可以包括确定、测量或评价分析物的存在或不存在或量或位置。包括定量、半定量和定性确定、测量或评价。这种确定、测量或评价可以是相对的，例如，当检测样品中两种或更多种不同的分析物时，或者可以是绝对的。照此，当在样品中靶标分析物的定量的背景中使用时，术语“定量”可以表示绝对或相对定量。可以通过包含已知浓度的一种或多种对照分析物和/或将所检测的靶标分析物水平与已知对照分析物(例如，通过标准曲线产生)进行参比来实现绝对定量。作为另外一种选择，可以通过两种或更多种不同靶标分析物之间所检测的水平或量的比较以提供两种或更多种不同分析物中每一种的相对定量，即相对于彼此的定量来实现相对定量。
如本文所使用的，术语“分析物”可以是通过本文所提供的测定方法所检测的任何物质(例如，分子)或实体。所述分析物是本文所提供的测定方法的靶标。因此，所述分析物可以是需要检测的任何生物分子或化合物，例如肽或蛋白、核酸分子或小分子，包括有机和无机分子。所述分析物可以是细胞或微生物，包括病毒，或其片段或产物。所述分析物可以是可以对其开发特异性结合剂并且其能够同时结合至少两种“结合剂”的任何物质或实体。在一些实施方式中，所述分析物是蛋白或多肽。照此，所关心的分析物包括蛋白质分子，如多肽、蛋白或朊病毒或者含有蛋白或多肽组分或其片段的任何分子。在一些实施方式中，所述分析物是全部或部分蛋白质分子。所述分析物还可以是单个分子或者含有两个或更多个分子亚基的复合物，所述亚基可以或可以不彼此共价结合并且可以是相同或不同的。因此，可以通过本文所描述的测定方法检测的分析物可以是复合物分析物，其可以是蛋白质复合物。这种复合物因此可以是均-或杂-多聚体。分子(例如，蛋白)聚集体也可以是靶标分析物。所述聚集体分析物可以是相同蛋白或不同蛋白的聚集体。所述分析物也可以是由蛋白或肽或者核酸分子，如DNA或RNA所组成的复合物。在一些实施方式中，所述分析物是由蛋白和核酸两者所组成的复合物，例如，调控因子，如转录因子。
如本文所使用的，术语“样品”可以是任何生物学和临床样品，包括(例如)生物的任何细胞或组织样品，或者由此衍生的任何体液或制剂，以及样品，如细胞培养物、细胞制备、细胞裂解液等。还包括环境样品，例如，土壤和水样品或者食品样品。样品可以是新鲜制备的或者先前以任何适当方式处理的(例如，为了存储所处理的)。
因此，代表性样品包括含有生物分子的任何材料，或者任何其它所期望的分析物或靶标分析物，包括(例如)食品和类似产品、临床和环境样品。所述样品可以是生物样品，包括病毒或细胞材料，包括原核或真核细胞、病毒、噬菌体、支原体、原生质体和细胞器。这些生物材料包括所有类型的哺乳动物和非哺乳动物细胞、植物细胞、藻类，包括蓝绿藻、真菌、细菌、原生动物等。代表性样品还包括全血和血液-来源的产物，如血浆、血清和血沉棕黄层、血细胞、尿液、粪便、脑脊髓液或任何其它体液(例如，呼吸分泌物、唾液、乳汁等)、组织、活组织检查、细胞培养物、细胞混悬液、条件培养基或其它细胞培养物组成样品等。可以以任何适当或所期望的方式预处理样品以制备用于在本文所公开的方法中的使用。例如，可以通过细胞胞溶或者分析物的纯化、分离等处理样品。
如本文所使用的，术语“结合”或其语法等价形式表示分子(例如，结合剂和分析物，或者递呈基团和接受基团)之间形成复合物的相互作用。相互作用可以是(例如)非共价相互作用，包括氢键、离子键、疏水相互作用和/或范德华相互作用。与分析物有关的如本文所使用的“结合剂”是能够结合至所述分析物的任何分子或实体。在一些实施方式中，结合剂特异性结合至其靶标分析物，即所述结合剂以大于样品中其它组分的亲和力结合至所述靶标分析物。在一些实施方式中，结合剂对靶标分析物的结合可以不同于对非靶标分析物的结合，其中结合剂不结合至非靶标分析物或者可忽略或不可检测地结合至非靶标分析物，或者任何这种非特异性结合(如果存在)处于可以区分的相对低水平。靶标分析物及其结合剂之间的结合通常是非共价的。在本文所提供的方法中所使用的结合剂可以共价缀合至递呈基团(例如，核酸标签)而不会显著消除结合剂与其靶标分析物的结合亲和力。
可以选择结合剂以对于靶标分析物具有高结合亲和力。在一些实施方式中，所述结合剂可以对所述靶标分析物具有至少约10-4M、至少约10-6M或者至少10-9M或以上的结合亲和力。所述结合剂可以是多种不同类型的分子，只要它对于所述靶标分析物显示出必要的结合亲和力。在其它实施方式中，所述结合剂可以对于其靶标分析物具有中等或甚至低亲和力，例如，小于约10-4M。
所述结合剂可以是大分子。在一些实施方式中，所述结合剂是抗体或其结合片段、衍生物或模拟物。当抗体是结合剂时，它们可以来源于多克隆组合物，从而特异性不同的非均一抗体群体分别与相同递呈基团缀合，或者可以来源于单克隆组合物，其中对于所述靶标分析物具有相同特异性的相同抗体的均一群体分别与相同递呈基团缀合。照此，所述结合剂可以是单克隆或多克隆抗体。
在一些实施方式中，所述结合剂是其抗体片段、衍生物或模拟物，其中这些片段、衍生物和模拟物对于所述靶标分析物具有必要的结合亲和力。这些抗体片段或衍生物通常包括受试者抗体的至少VH和VL域，以保留受试者抗体的结合特征。在一些实施方式中，所述结合剂是结合所述分析物的抗体片段。如本文所使用的抗体片段是指除全抗体以外的分子，其包含抗体部分，并且通常抗原结合位点。抗体片段的实例包括(但不限于)Fab、Fab'、F(ab')2、Fv、单链抗体分子(例如，scFv)、二硫键-连接的scFv(dsscFv)、双链抗体、三链抗体、四链抗体、微抗体、双重可变域抗体(DVD)、单一可变域抗体(例如，骆驼抗体、羊驼抗体)、重链抗体的单一可变域(VHH)和由抗体片段所形成的多重特异性抗体。在一些实施方式中，所述结合剂是Fab。在一些实施方式中，所述结合剂是scFv。在一些实施方式中，所述结合剂是单一可变域抗体。
在一些实施方式中，所述结合剂是抗体模拟物。抗体模拟物可以是像抗体一样可以特异性结合抗原，但是在结构上与抗体无关的分子。抗体模拟物通常是摩尔质量在约2至20kDa之内的人工肽。有时也将核酸和小分子认为是抗体模拟物。本领域中已知的抗体模拟物包括亲和体(affibodies)、人泛素(affilins)、粘合素(affimers)、亲和素(affitins)、阿尔法体(alphabodies)、抗运载蛋白(anticalins)、适体(aptamers)、高亲和性多聚体(avimers)、DARPins、Fynomers、Kunitz结构域肽、单体和nanoCLAMP。
在一些实施方式中，多聚核酸适体适合用作结合剂。多聚核酸适体可以是RNA寡核苷酸，其可以起作用以选择性结合蛋白，其基本上以与受体或抗体相同的方式(Conrad等人，Methods Enzymol.(1996),267(Combinatorial Chemistry),336-367)。上述抗体、其片段、衍生物和模拟物可以得自商品化来源和/或可以使用任何适当的技术制备，其中产生多克隆抗体、单克隆抗体、其片段、衍生物和模拟物，包括其重组衍生物的方法是本领域技术人员所熟知的(例如，美国专利No.5,851,829和5,965,371)。
除了抗体-基肽/多肽或者蛋白-基结合域之外，所述结合剂还可以是凝集素、可溶性细胞-表面受体或其衍生物、亲和体(affibody)或来自噬菌体展示或核糖体展示的任何重组衍生的蛋白或肽或者任何类型的组合肽或蛋白文库。
所述结合剂还可以是配体。所述配体结合剂可以具有不同尺寸。在一些实施方式中，所述配体结合剂具有约50至约10,000道尔顿，约50至约5,000道尔顿或者约100至约1000道尔顿的尺寸。在一些实施方式中，所述配体结合剂具有分子量为约10,000道尔顿或以上的尺寸。
在一些实施方式中，所述结合剂是能够以必要的亲和力结合至所述靶标分析物的小分子。所述小分子可以是小有机分子。所述小分子可以包括与靶标分析物结构相互作用所必需的一个或多个官能团，例如，疏水性、亲水性、静电或甚至共价相互作用所必需的基团。当所述靶标分析物是蛋白时，所述小分子结合剂可以包括与蛋白结构相互作用，如氢键作用、疏水-疏水相互作用、静电相互作用等所必需的官能团，并且通常包括至少胺、酰胺、巯基、羰基、羟基或羧基。在一些实施方式中，包括至少两个官能团。所述小分子结合剂还可以包括可以被修饰和/或参与和递呈基团(例如，核酸标签)的共价键合，同时不会显著不利影响小分子结合至其靶标分析物的能力的区域。
小分子结合剂还可以包括被一个或多个上述官能团取代的环碳或杂环结构和/或芳族或多芳族结构。小分子结合剂还可以含有生物分子中存在的结构，包括肽、糖、脂肪酸、类固醇、嘌呤、嘧啶、衍生物、结构类似物或它们的组合。可以筛选这些化合物以识别所关心的那些。多种不同的筛选规程在本领域中是已知的。
小分子结合剂也可以来源于天然存在的或合成化合物，其可以得自多种来源，包括合成或天然化合物文库。例如，多种方式对于多种有机化合物和生物分子的随机和直接合成可用。作为另外一种选择，处于细菌、真菌、植物和动物提取物的形式的天然化合物文库是可用或易于产生的。另外，天然或合成产生的文库和化合物是通过常规化学、物理和生物化学方式易于修饰的，并且可以用于产生组合文库。可以对已知的小分子进行直接或随机化学修饰，如酰基化、烷基化、酯化、酰胺化等，以生产结构类似物。照此，所述小分子结合剂可以得自天然存在或合成分子文库，包括通过组合方式所产生的化合物文库，即化合物多样性组合文库。当得自这些文库时，选择所述小分子结合剂以证实所述蛋白靶标在方便的结合亲和力测定中的一定所期望的亲和力。
本文所提供的测定方法使用结合分析物的非干扰“表位”的第一结合剂和第二结合剂。如本领域中所理解的，分析物的表位是指结合剂所结合的分析物表面上的位点。表位可以是分析物表面上的局部区域。表位可以由分子的化学活性表面分组，如氨基酸或糖侧链组成。表位可以具有特定立体结构特性和特定电荷特征。表位可以是分析物分子的连续片段。表位还可以是具有连接在一起的抗原的不止一个不连续片段的分子。如果所述分析物是多肽或蛋白，则其表位可以沿多肽链的一级序列包括连续或不连续序列。在一些实施方式中，在本文所公开的测定方法中使用的所述第一和所述第二结合剂具有相同分子类型。例如，所述第一和第二结合剂均可以是结合所述分析物的非干扰表位的单克隆抗体。在一些实施方式中，所述第一和所述第二结合剂可以是不同的。例如，所述第一结合剂可以是抗体，并且所述第二结合剂可以是小分子。
当相对于分析物使用时，术语“结合部分”是指包括分子或一系列不止一个分子的部分，从而所述部分作为整体能够特异性结合至分析物。所述结合部分可以包括一个或多个结合剂、一个或多个靶标标记、一个或多个样品标记和/或一个或多个递呈基团。所述结合部分还可以包括结合剂、靶标标记、样品标记和/或递呈基团。作为另外一种选择，所述结合部分可以包括结合剂、靶标标记和/或递呈基团。所述结合部分中的分子可以作为一个部分通过共价、非公价或者共价或非共价分子间相互作用的组合保持在一起。作为另外一种选择，所述结合部分中的分子可以通过与不是所述结合部分的一部分的分子，例如所述分析物或一个或多个接受基团的相互作用保持在一起。另外，所述结合部分中的分子可以作为一个部分通过(i)所述结合部分内分子之间的分子间相互作用和(ii)通过与不是所述结合部分的一部分的分子，例如所述分析物或一个或多个接受基团的相互作用保持在一起。在一个实施方式中，所述结合部分包含结合剂或由其组成。在一些实施方式中，所述结合部分包含靶标标记或由其组成。在某些实施方式中，所述结合部分包含递呈基团或由其组成。在其它实施方式中，所述结合部分包含样品标记或由其组成。在一个实施方式中，所述结合部分包含结合剂和靶标标记或由其组成。在一些实施方式中，所述结合部分包含结合剂和递呈基团或由其组成。在某些实施方式中，所述结合部分包含结合剂和样品标记或由其组成。在其它实施方式中，所述结合部分包含靶标标记和递呈基团或由其组成。在一个实施方式中，所述结合部分包含靶标标记和样品标记或由其组成。在其它实施方式中，所述结合部分包含递呈基团和样品标记或由其组成。在其它实施方式中，所述结合部分包含结合剂、靶标标记和递呈基团或由其组成。在一些实施方式中，所述结合部分包含结合剂、靶标标记和样品标记或由其组成。在某些实施方式中，所述结合部分包含结合剂、递呈基团和样品标记或由其组成。在一些实施方式中，所述结合部分包含靶标标记、递呈基团和样品标记或由其组成。在其它实施方式中，所述结合部分包含结合剂、靶标标记、递呈基团和样品标记或由其组成。在一些实施方式中，所述结合部分包含结合剂、靶标标记、递呈基团和样品标记中的任一项或由其组成。在一些实施方式中，所述结合部分以任意组合或排列包含结合剂、靶标标记、递呈基团和样品标记中的任何两个或由其组成。在一些实施方式中，所述结合部分以任意组合或排列包含结合剂、靶标标记、递呈基团和样品标记中的任何3个或由其组成。在一些实施方式中，所述结合部分包含结合剂、靶标标记、递呈基团和样品标记中的全部4个或由其组成。
术语“递呈基团”和“接受基团”在本文中相对于彼此使用，其表示可以在适当条件下形成复合物的结合对。如在本文所公开的测定方法中使用的，递呈基团可以缀合至所述靶标分析物的结合剂，并且接受基团可以偶联至固体表面。因此，递呈基团和接受基团之间的结合允许分析物被捕获至所述固体表面。在一些实施方式中，递呈基团和接受基团之间所形成的键是“可释放的”，从而允许所捕获的结合剂从所述固体表面上释放。在一些实施方式中，递呈基团和接受基团之间所形成的键是“可更新的”，从而允许所述结合剂能够重新捕获至与相同接受基团偶联的另一个固体表面。与以上所讨论的“结合剂”及其“分析物”的结合对相同，“递呈基团”和“接受基团”的结合对可以采取多种形式。“递呈基团”和“接受基团”的结合对的实例包括(但不限于)抗原和抗所述抗原的抗体(包括其片段、衍生物或模拟物)、配体及其受体、互补的核酸链、生物素和抗生物素蛋白(或者链霉亲和素或中性抗生物素蛋白)、凝集素和碳水化合物，并且反之亦然。“递呈基团”和“接受基团”的其它结合对包括荧光素和抗-荧光素、地高辛/抗-地高辛以及DNP(二硝基苯酚)/抗-DNP，并且反之亦然。在一些实施方式中，“递呈基团”和“接受基团”的结合对是核酸的互补链并且被称为“标签”和“探针”。在一些实施方式中，“递呈基团”和“接受基团”的结合对是抗原和抗体或者抗原和抗体片段。
术语“靶标标记”是指辅助检测和鉴定靶标分子的部分。术语“样品标记”是指辅助检测和鉴定靶标的样品来源的部分。适合于靶标标记和样品标记的标记包括可以提供可以与特定靶标或样品相关联的识别符(identifier)的标记。可以在本发明公开的背景中用于靶标标记和/或样品标记的常规标记是可以通过测序与靶标或样品相关联的核苷酸序列。在一些实施方式中，靶标标记包含靶标ID。在某些实施方式中，靶标标记由靶标ID组成。在其它实施方式中，靶标标记是靶标ID。在一些实施方式中，样品标记包含样品ID。在某些实施方式中，样品标记由样品ID组成。在其它实施方式中，所述样品标记是样品ID。适合于本发明公开的靶标标记和样品标记的其它标记包括含有其它可识别或相关信息的分析，如荧光分子或者荧光分子的组合或序列，和/或比色部分或者比色部分的组合或序列。对本发明公开所考虑的其它标记包括发光、光散射、放射性核素、底物、辅因子、抑制剂、化学发光部分、磁性颗粒等。教导这些标记的用途的专利包括美国专利No.3,817,837；3,850,752；3,939,350；3,996,345；4,277,437；4,275,149；和4,366,241。多种标记是可商购的并且可以在本发明的背景中使用。
当相对于靶标或样品使用时，术语“标识码”或“ID”是指可以通过分子或一系列分子中所包含的识别信息用于直接或间接识别所述靶标或所述样品的所述分子或所述一系列分子。这种ID可以是具有给定序列、独特荧光标记、独特比色标记、荧光标记序列、比色标记序列或者任何其它分子或分子组合的核酸分子，只要用作ID的分子或分子组合可以识别特定靶标或样品或另外将特定靶标或样品与其它靶标或样品相区别或者与预期靶标或样品相关联。用作这些ID的核酸分子也称为码序列。这种ID还可以是含有来源于，但不同于原始ID的信息的其它衍生分子，只要这些所衍生的分子或所衍生的信息可以识别特定靶标或样品或另外将特定靶标或样品与其它靶标或样品相区分并且可以与预期靶标或样品相关联。例如，核酸ID可以包括原始核酸码序列和/或原始核酸码序列的反向互补序列两者，因为两者可以区分并与预期靶标或样品相关联。所述码序列可以是任何天然或非天然序列，其在未作为码序列引入预定样品、预定靶标或预定样品或靶标的任何部分时不存在，从而所述码序列可以识别所述样品或靶标并与所述样品或靶标相关联。码序列可以对于群体中单一核酸物质是唯一的，或者码序列可以是群体中几个不同的核酸物质所共有的。群体中每个核酸探针可以包括不同于来自所述群体中所有其它核酸探针的码序列。作为另外一种选择，群体中每个核酸探针可以包括不同于来自群体中一些或大部分其它核酸探针的码序列。对于具体实例，从来自一个样品的免疫复合物所产生的所有报告分子可以具有相同的样品码序列(样品ID)。对于另一个实例，从来自相同样品的免疫复合物所产生的所有报告分子可以具有不同的靶标码序列(靶标ID)。此外，对于相同靶标并且具有相同结合剂，从来自相同样品的免疫复合物所产生的所有报告分子可以具有相同的靶标码序列(靶标ID)。
在本文中，如在短语如“A和/或B”中所使用的术语“和/或”旨在包括A和B两者；A或B；(单独的)A；和(单独的)B。同样地，如在短语如“A、B和/或C”中所使用的术语“和/或”旨在涵盖以下实施方式中的每一个：A、B和C；A、B或C；A或C；A或B；B或C；A和C；A和B；B和C；(单独的)A；(单独的)B；和(单独的)C。
5.2免疫测定
本文提供了解决现有免疫测定的限制并且使得能够通过核酸-基信号放大对免疫复合物进行单分子检测的测定方法。本文所提供的方法通过捕获-和-释放机制降低了背景信号。因此，本文提供了包括捕获-和-释放机制的用于检测样品中分析物的测定方法。在一些实施方式中，所述捕获-和-释放机制基于核酸对的杂交和解离。
5.2.1捕获-和-释放机制
本文所提供的测定方法使用捕获-和-释放机制以减少非特异性背景信号。将所述免疫复合物捕获到固体表面上并将其释放回溶液的过程可以被应用于如本文所公开的不同测定形式(例如，图4A-4D和图8A-8D)。
5.2.1.1使用双捕获结合剂的捕获-和-释放
在一些实施方式中，如图4A、8A和8B所示，本文所提供的测定方法使用包括两个结合剂的捕获-和-释放机制，其分别可以通过两个固体表面上的两个接受基团捕获。在一些实施方式中，本文提供了用于检测样品中分析物的测定方法，其包括以下步骤：
(1)将第一结合剂、第二结合剂和样品在溶液中混合，其中所述第一和第二结合剂结合所述分析物上的非干扰表位并形成免疫复合物，并且其中所述免疫复合物通过缀合至所述第一结合剂的第一递呈基团和偶联至所述第一表面的第一接受基团之间的结合捕获在与所述溶液接触的第一固体表面上；
(2)清洗所述第一固体表面以除去未结合的分子；
(3)通过破坏所述第一递呈基团和所述第一接受基团之间的结合从所述第一固体表面释放所述免疫复合物；
(4)引入第二固体表面并通过缀合至所述第二结合剂的第二递呈基团和偶联至所述第二固体表面的第二接受基团之间的结合重新捕获所述免疫复合物；
(5)清洗所述第二固体表面以除去未结合的分子；和
(6)检测所述免疫复合物。
在图4A、8A和8B中，通过生物正交的(即各自独立且特异的)所述递呈基团(“PG”)和所述接受基团(“RG”)之间的两个键实现了所述第一结合剂(“结合剂1”)向/从所述第一固体表面(“表面1”)的捕获/释放以及所述第二结合剂(“结合剂2”)向/从所述第二固体表面(“表面2”)的捕获/释放。所述第一递呈基团(“PG1”)和所述第一接受基团(“RG1”)之间的键，即所述第一键(“键1”)是可释放的。在一些实施方式中，所述第二递呈基团(“PG2”)和所述第二接受基团(“RG2”)之间的键，即第二键(“键2”)也是可释放的，并且可以在表面2上或者在从表面2释放之后检测所述免疫复合物。在一些实施方式中，键2不是可释放的，并且可以在表面2上检测所述免疫复合物。
如本领域的常规技术人员将理解的，另一轮捕获/释放将进一步降低非特异性背景信号。在一些实施方式中，键1是可再生的，并且可以通过结合剂1实施至少另外一轮捕获/释放。具体地，可以通过在结合剂1上的PG1和新表面1上的RG1之间形成另一个键，通过新表面1重新捕获从表面2释放的免疫复合物。在一些实施方式中，键2是可再生的，并且可以通过结合剂2实施至少另外一轮捕获/释放。具体地，可以通过在结合剂2上的PG2和新表面2上的RG2之间形成另一个键，通过新表面2重新捕获从表面1或表面2释放的免疫复合物。在一些实施方式中，键1和键2两者是可再生的，并且可以通过键1、键2或两者实施不止一个重新捕获循环。在一些实施方式中，键1和键2均不是可再生的，并且仅实施了一个捕获/释放循环。
因此，在一些实施方式中，本文所提供的测定方法还包括在步骤(5)和(6)之间的至少一个其它重新捕获循环，其包括：从捕获它的所述固体表面上释放所述免疫复合物，将所述免疫复合物重新捕获到与所述第一接受基团偶联的其它固体表面上，并且清洗所述其它固体表面以除去未结合的分子。在一些实施方式中，本文所提供的测定方法还包括在步骤(5)和(6)之间的至少一个其它重新捕获循环，其包括：从捕获它的所述固体表面上释放所述免疫复合物，将所述免疫复合物重新捕获到与所述第二接受基团偶联的其它固体表面上，并且清洗所述其它固体表面以除去未结合的分子。可以包括其它重新捕获循环。
可以通过蛋白固定化领域的技术人员已知的多种不同方法实现可释放键。例如，在一些实施方式中，所述可释放键是通过硫酯基团的连接(例如，美国专利4,284,553)。在一些实施方式中，所述可释放键是可切割键(例如，Leriche,Bioorganic&Med.Chem.20(2):571-581(2012))。在一些实施方式中，所述可释放键是二硫键(例如，Chan,Biochemistry15(19):4215-4222(1976))。在一些实施方式中，所述可释放键是光可切割键(例如，光可切割的间臂，其可得自Integrated DNA Technologies,Inc.；Wan,PLoS ONE 13(2):e0191987(2018))。在一些实施方式中，所述可释放键是可以通过适当酶促活性切割的键，其包括(例如)磷酸二酯、磷脂、酯或b-半乳糖。在一些实施方式中，所述可释放键是可以通过化学酶促反应切割的键，如Staphy-eSrtA对(例如，Ham等人，Nature Communications 7:11140(2016))及其它(Rabuka,Curr.Opin.Chem.Biol.14,790–796(2010)；Rashidian,J.Am.Chem.Soc.134:8455–8467(2012)；Kosa,Nat.Methods 9,981–984(2012))。在一些实施方式中，在精氨酸残基和用4-(氧代乙酰基)苯氧基乙酸衍生化的吸附剂之间形成可释放键(例如，Duerksen-Hughes,Biochemistry,28(21):8530-6(1989))。在一些实施方式中，所述可释放键是通过结合竞争破坏的非共价键(例如，Nguyen,Biomol.Eng.22(2005)147-150)。还可以通过蛋白固定化领域的技术人员已知的多种不同方法实现可再生键。例如，在结合对(例如，抗原和抗体、配体和受体、互补核酸等)之间形成的非共价键，包括氢键可以是可再生的。还可以通过(例如)金属-亲和力(例如，Cheung,Appl.Microbiol.Biotechnol.96,1411–1420(2012))、N-卤胺结构(例如，Hui,Biomacromolecules 14 585–601(2013))或者二硫键(例如，Boitieux,Anal.Chim.Acta197:229–237(1987))的使用实现所述可释放和可再生键。
在一些实施方式中，在步骤(3)中，通过将过量的游离第一递呈基团或游离第一接受基团添加至所述溶液，通过结合竞争从所述第一固体表面释放所述免疫复合物。“游离的”递呈基团是指未缀合至结合剂的递呈基团。“游离的”接受基团是指未偶联至固体表面的接受基团。
在一些实施方式中，通过核酸杂交形成所述可释放和可再生键，其中所述递呈基团和所述接受基团包括彼此互补的核酸。在一些实施方式中，所述递呈基团是核酸，其可以结合作为DNA/RNA特异性蛋白质或者适体结合伴侣的接受基团(例如，US5312730)。在一些实施方式中，所述接受基团是核酸，其可以结合作为DNA/RNA特异性蛋白质或者适体结合伴侣的递呈基团。
在一些实施方式中，所述第一递呈基团是第一核酸标签(“第一标签”)并且所述第一接受基团是第一核酸捕获探针(“第一探针”)，其中所述第一探针或其片段与所述第一标签或其片段互补。在一些实施方式中，所述第二递呈基团是第二核酸标签(“第二标签”)并且所述第二接受基团是第二核酸捕获探针(“第二探针”)，其中所述第二探针或其片段与所述第二标签或其片段互补。
在一些实施方式中，如图4B所示，所述第一递呈基团是所述第一标签且所述第一接受基团是所述第一探针，其中所述第一探针或其片段与所述第一标签或其片段互补；并且所述第二递呈基团是所述第二标签且所述第二接受基团是所述第二探针，其中所述第二探针或其片段与所述第二标签或其片段互补。因此，本文提供了用于检测样品中分析物的测定方法，其包括以下步骤：
(1)将第一结合剂、第二结合剂和样品在溶液中混合，其中所述第一和第二结合剂结合所述分析物上的非干扰表位并形成免疫复合物，并且其中所述免疫复合物通过缀合至所述第一结合剂的第一标签和偶联至所述第一表面的第一探针之间的杂交捕获在与所述溶液接触的第一固体表面上；
(2)清洗所述第一固体表面以除去未结合的分子；
(3)通过所述第一标签和所述第一探针之间的杂交的解除，从所述第一固体表面释放所述免疫复合物；
(4)引入第二固体表面并通过缀合至所述第二结合剂的第二标签和偶联至所述第二固体表面的第二探针之间的杂交将所述免疫复合物重新捕获至所述第二固体表面上；
(5)清洗所述第二固体表面以除去未结合的分子；和
(6)检测所述免疫复合物。
在一些实施方式中，本文所提供的测定方法还包括在步骤(5)和(6)之间的至少一个其它重新捕获循环，其包括：通过所述第二标签和所述第二探针之间的杂交的解除从捕获它的所述固体表面上释放所述免疫复合物，将所述免疫复合物重新捕获到与所述第一接受基团偶联的其它固体表面上，并且清洗所述其它固体表面以除去未结合的分子。在一些实施方式中，本文所提供的测定方法还包括在步骤(5)和(6)之间的至少一个其它重新捕获循环，其包括：通过所述第一标签和所述第一探针之间的杂交的解除从捕获它的所述固体表面上释放所述免疫复合物，将所述免疫复合物重新捕获到与所述第二接受基团偶联的其它固体表面上，并且清洗所述其它固体表面以除去未结合的分子。
5.2.1.2使用单捕获结合剂的捕获-和-释放
在一些实施方式中，如图4C、8C和8D所示，本文所提供的测定方法使用仅包括一个结合剂的捕获-和-释放机制，所述一个结合剂经由一个可释放和可再生键被所述固体表面捕获，尽管使用了两个结合剂来形成所述免疫复合物。在一些实施方式中，所述第一结合剂被两个固体表面顺序捕获。在一些实施方式中，本文提供了用于检测样品中分析物的测定方法，其包括以下步骤：
(1)将第一结合剂、第二结合剂和样品在溶液中混合；其中所述第一和第二结合剂结合所述分析物上的非干扰表位并形成免疫复合物；并且其中所述免疫复合物通过缀合至所述第一结合剂的第一递呈基团和偶联至所述第一固体表面的第一接受基团之间的结合捕获在与所述溶液接触的第一固体表面上；
(2)清洗所述第一固体表面以除去未结合的分子；
(3)通过破坏所述第一递呈基团和所述第一接受基团之间的结合从所述第一固体表面释放所述免疫复合物；
(4)引入第二固体表面并通过所述第一递呈基团和偶联至所述第二固体表面的所述第二接受基团之间的结合重新捕获所述免疫复合物；
(5)清洗所述第二固体表面以除去未结合的分子；和
(6)检测所述免疫复合物
可以在所述第二固体表面上重复完全相同的捕获/释放机制。因此，在一些实施方式中，所述第二接受基团与所述第一接受基团相同。
如图4C、8C和8D所示，可以通过作为所述第一结合剂(“结合剂1”)的第一递呈基团(“PG1”)和所述第一固体表面(“表面1”)的第一接受基团(“RG1”)之间的所述第一键(“键1”)的可释放和可再生的键实现捕获/释放。然后，相同的递呈基团(PG1)可以与所述第二固体表面(“表面2”)的第二接受基团(“RG2”)形成第二键(“键2”)。RG2可以与RG1相同。在一些实施方式中，键2也是可释放的，并且可以在表面2上或者在从表面2释放后检测所述免疫复合物。在一些实施方式中，键2不是可释放的，并且可以在表面2上检测所述免疫复合物。
如本领域的常规技术人员将理解的，另一轮捕获/释放将进一步降低非特异性背景信号。由于键1是可再生的，因此可以通过结合剂1实施至少另外一轮捕获/释放。具体地，可以通过在结合剂1上的PG1和新表面1上的RG1之间形成另一个键，通过新表面1重新捕获从表面2释放的免疫复合物。在一些实施方式中，键2也是可再生的，并且可以通过在结合剂1上的PG1与新表面2上的RG2之间形成另一个键，通过新表面2重新捕获从表面1或2释放的所述免疫复合物。在一些实施方式中，键1和键2两者是可再生的，并且可以通过键1、键2或两者实施不止一个捕获/释放循环。
因此，在一些实施方式中，本文所提供的测定方法还包括在步骤(5)和(6)之间的至少一种其它重新捕获循环，其包括：从捕获它的所述固体表面上释放所述免疫复合物，将所述免疫复合物重新捕获到与所述第一接受基团偶联的其它固体表面上，并且清洗所述其它固体表面以除去未结合的分子。在一些实施方式中，本文所提供的测定方法还包括在步骤(5)和(6)之间的至少一个其它重新捕获循环，其包括：从捕获它的所述固体表面上释放所述免疫复合物，将所述免疫复合物重新捕获到与所述第二接受基团偶联的其它固体表面上，并且清洗所述其它固体表面以除去未结合的分子。可以包括其它重新捕获循环。
如以上所描述的，可以通过蛋白固定化领域的技术人员已知的多种不同方法，包括本文所公开的那些方法实现可释放键和可再生键。在一些实施方式中，通过核酸杂交形成所述可释放和可再生键，其中所述递呈基团和所述接受基团包括彼此互补的核酸。
在一些实施方式中，所述第一递呈基团是核酸标签(“第一标签”)并且所述第一接受基团是核酸捕获探针(“第一探针”)，其中所述第一探针或其片段与所述第一标签或其片段互补。因此，如图4D所示，本文还提供了用于检测样品中分析物的测定方法，其包括：
(1)将第一结合剂、第二结合剂和样品在溶液中混合；其中所述第一和第二结合剂结合所述分析物上的非干扰表位并形成免疫复合物；并且其中所述免疫复合物通过缀合至所述第一结合剂的第一核酸标签(“第一标签”)和偶联至所述第一固体表面的第一核酸捕获探针(“第一探针”)之间的杂交捕获至与溶液接触的第一固体表面上；
(2)清洗所述第一固体表面以除去未结合的分子；
(3)通过所述第一标签和所述第一探针之间的杂交的解除，从所述第一固体表面释放所述免疫复合物；
(4)引入与第二核酸探针(“第二探针”)偶联的第二固体表面并且通过所述第一标签和所述第二探针之间的杂交在所述第二固体表面上重新捕获所述免疫复合物；
(5)清洗所述第二固体表面以除去未结合的分子；和
(6)检测所述免疫复合物。
在一些实施方式中，所述第二探针与所述第一探针相同。
在一些实施方式中，本文所提供的测定方法还包括在步骤(5)和(6)之间的至少一个其它重新捕获循环，其包括：从捕获它的所述固体表面上释放所述免疫复合物；将所述免疫复合物重新捕获到与所述探针偶联的其它固体表面上，所述探针可以是所述第一探针、所述第二探针或与所述第一标签杂交的另一种核酸探针；并且清洗所述其它固体表面以除去未结合的分子。
作为捕获/释放机制的核酸杂交的使用使本文所公开的测定方法具有几个优势，至少因为核酸杂交条件与蛋白结合条件大为不同。首先，可以在溶液中实施通过所述第一结合剂和所述第二结合剂对靶标分析物的结合，这使得能够具有快速的结合动力学并且允许大量的样品输入。其次，通过核酸杂交的免疫复合物在固体表面上的捕获通常是更有效、特异且可预测的。可以设计捕获探针序列以特异性靶向预期免疫复合物，其在多重测定形式中是有用的。第三，可以通过缓冲液中盐浓度的改变实现杂交的解除，如释放机制，这帮助使释放效率最大化，同时维持了免疫复合物的完整性。通过较短的节段或者A、T富集序列，通过有目的地在所述捕获探针和所述标签之间设计相对弱的杂交连接，可以识别适当的释放缓冲条件，其中所指明的杂交连接解除以释放所述免疫复合物，同时更长或更强的互补序列之间的免疫复合物及其它杂交保持稳定。第四，可以将通过杂交的捕获/释放再生或重复多个循环，而不会使效率和选择性变差。因此，可以在所述测定中实施其它轮的捕获/释放直至达到所期望的低背景水平。稳健的捕获/释放机制确保了所述测定方法的前所未有的可预测性和可靠性。另一种意外的益处在于由于它们带负电荷的寡核苷酸标签，偶联至所述第一和第二表面的所述核酸捕获探针帮助进一步降低所述第一结合剂和所述第二结合剂的非特异性捕集。
5.2.2免疫复合物的形成
本文所公开的测定方法包括步骤(1)：通过将第一结合剂、第二结合剂和样品在溶液中混合形成免疫复合物，其中所述第一和第二结合剂结合所述分析物上的非干扰表位，并且其中通过缀合至所述第一结合剂的第一递呈基团和偶联至所述第一表面的第一接受基团之间的结合将所述免疫复合物捕获至与所述溶液接触的第一固体表面上。在一些实施方式中，所述第一递呈基团是核酸标签并且所述第一接受基团是核酸捕获探针，其中所述探针或其片段与所述标签或其片段互补。
如本文所公开的，在所述测定方法中使用的结合剂可以是结合特异性靶标分析物的任何分子或分子的一部分。照此，结合剂可以包括任何蛋白、肽、核酸、碳水化合物、脂质或小分子。在一些实施方式中，结合剂包括抗体。在一些实施方式中，结合剂包括抗体片段。在一些实施方式中，结合剂包括抗体模拟物。在一些实施方式中，结合剂包括小分子。
在本文所公开的测定方法中使用的结合剂可以缀合至递呈基团(例如，核酸标签)。所述结合剂和递呈基团可以直接通过键或间接通过连接基团连接在一起。当使用连接基团时，可以选择这些基团以提供所述递呈基团和结合剂的共价连接并维持所述结合剂对其靶标分析物所期望的结合亲和力。连接基团可以基于所述结合剂而改变。当存在时，所述连接基团通常是生物学惰性的。多种连接基团是本领域技术人员已知的，并且可以在本文所公开的测定方法中使用。在一些实施方式中，连接基团包括在任一端以能够共价键合至所述递呈基团或所述结合剂的反应性官能性封端的间臂基团。
间臂基团可以包括脂族和不饱和烃链，含有杂原子，如氧(醚，如聚乙二醇)或氮(聚胺)的间臂、肽、碳水化合物、可以含有杂原子的环或非环系统。间臂基团还可以包括结合至金属的配体，从而金属离子的存在配位两个或更多个配体以形成复合物。具体的间臂元件包括：1,4-二氨基己烷、二甲苯二胺、对苯二甲酸、3,6-二氧杂辛二酸、乙二胺-N,N-双乙酸、1,1'-亚乙基双(5-氧-3-吡咯啶甲酸)、4,4'-亚乙基二哌啶。潜在的反应官能性包括亲核官能团(胺、醇、硫醇、酰肼)、亲电子官能团(醛、酯、乙烯基酮、环氧化物、异氰酸酯、马来酰亚胺)、能够进行环化加成反应的官能团，从而形成二硫键或结合至金属。具体实例包括伯胺和仲胺、氧肟酸、N-羟基琥珀酰亚胺基酯、N-羟基琥珀酰亚胺基碳酸酯、氧基羰基咪唑、硝基苯酯、三氟乙酯、缩水甘油醚、乙烯基砜和马来酰亚胺。可以在本文中使用的特异性接头基团还包括杂官能化合物，如叠氮苯甲酰基酰肼、N-[4-(对-叠氮基水杨基氨基)丁基]-3'-[2'-吡啶基二硫代]丙酰胺)、双-硫代琥珀酰亚胺基辛二酸酯、二甲基己二酸亚氨酯、二琥珀酰亚胺基酒石酸酯、N-马来酰亚胺丁酰氧基琥珀酰亚胺酯、N-羟基硫代琥珀酰亚胺基-4-叠氮苯甲酸酯、N-琥珀酰亚胺基[4-叠氮苯基]-1,3'-二硫丙酸酯、N-琥珀酰亚胺基[4-碘乙酰]氨基苯甲酸酯、戊二醛和琥珀酰亚胺基-4-[N-马来酰亚胺甲基]环己烷-1-羧酸酯、3-(2-吡啶基二硫代)丙酸N-羟基琥珀酰亚胺酯(SPDP)、4-(N-马来酰亚胺甲基)-环己烷-1-羧酸N-羟基琥珀酰亚胺酯(SMCC)等。
可以使用本领域中已知的任何方法制备在本文所公开的测定方法中使用的结合剂/递呈基团缀合物。在一些实施方式中，所述递呈基团(例如，核酸标签)可以直接或通过连接基团缀合至所述结合剂。如本领域中已知的，所述组分可以通过官能团彼此共价结合，其中这些官能团可以存在于所述组分上或者可以使用一个或多个步骤，例如，氧化反应、还原反应、裂解反应等将这些官能团引入到所述组分中。可以用于将所述组分共价键合在一起的官能团包括：羟基、巯基、氨基等。可以选择修饰以提供共价键的不同组分的特定部分，从而不显著不利地干扰组分对于所述靶标分析物所期望的结合亲和力。当必要和/或期望时，如本领域中已知的，可以使用封端基团保护所述组分上的某些部分，参见，例如，Green&Wuts,Protective Groups in Organic Synthesis(John Wley&Sons)(1991)；美国专利No.5,733,523。
当将所述核酸标签用作递呈基团时，还可以使用获得核酸-蛋白缀合物的体外规程产生结合剂/递呈基团缀合物。所关心的这些体外规程的实例包括：RepA基规程(参见，例如，Fitzgerald,Drug Discov.Today(2000)5:253-258和WO 98/37186)、核糖体展示基规程(参见，例如，Hanes等人，Proc.Natl Acad.Sci.USA(1997)94:4937-42；Roberts,Curr OpinChem Biol(1999)Jun；3:268-73；Schaffitzel等人，J Immunol Methods(1999)Dec 10；231:1 19-35；和WO 98/54312)。
如在本文所公开的测定方法中使用的，所述接受基团(例如，核酸捕获探针)可以通过本领域中已知的任何方式“偶联”至固体表面，其可以是直接的或者是(例如)通过如以上所描述的用于连接所述递呈基团和所述结合剂的连接基团间接的。例如，所述接受基团可以通过共价键(例如，化学交联)或者通过非共价结合，例如，通过链霉亲和素-生物素基偶联(在一个结构域上提供生物素并且在另一个上提供链霉亲和素)偶联至固体表面。在一些实施方式中，例如，所述固体表面是磁珠表面，其可以通过(例如)所述磁珠上的羧酸与所述核酸捕获探针之间的结合，与作为所述递呈基团的核酸捕获探针偶联。在一些实施方式中，所述固体表面可以与作为所述递呈基团的蛋白A/G共价偶联。
所述递呈基团和接受基团可以是本文所公开的或另外本领域中已知的任何结合对，其包括(但不限于)抗原和所述抗原的抗体(包括其片段、衍生物或模拟物)、配体及其受体、核酸的互补链、生物素和抗生物素蛋白(或者链霉亲和素或中性抗生物素蛋白)、凝集素和碳水化合物，并且反之亦然。“递呈基团”和“接受基团”的其它结合对包括荧光素和抗-荧光素、地高辛/抗-地高辛以及DNP(二硝基苯酚)/抗-DNP，并且反之亦然。在一些实施方式中，“递呈基团”和“接受基团”的结合对是核酸的互补链并且被称为“标签”和“探针”。在一些实施方式中，“递呈基团”和“接受基团”的结合对是抗原和抗体或者抗原和抗体片段。
如以上所描述的，可以在本文所公开的测定方法中测定的样品可以是含有一种或多种所关心的组分的材料或材料的混合物。在一些实施方式中，所述样品来源于生物学来源。例如，所述样品可以得自受试者，其可以是体内或原位获得、触及或收集的生物学组织或流体。示例性样品包括生物流体，如血液样品、尿液样品、血浆样品、唾液样品、脑脊髓液样品、精液样品、痰液样品、粘液样品、透析液样品、小肠液样品、关节液样品、浆液样品。在一些实施方式中，所述样品是血液样品。在一些实施方式中，所述样品是尿液样品。在一些实施方式中，所述样品是唾液样品。在一些实施方式中，所述样品是血浆样品。在一些实施方式中，所述样品是脑脊髓液样品。示例性样品包括组织样品。所述组织样品可以是液体组织样品。所述组织样品可以是匀浆组织样品。所述组织样品可以得自患病组织。在一些实施方式中，所述样品是癌症样品。
所述固体表面还可以包括本领域中已知的任何载体，在所述载体上可以用于分子的固定化。在一些实施方式中，所述固体表面可以是适合于连接核酸并有助于测定步骤的任何表面。固体表面的实例包括珠(例如，磁珠、
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珠)、颗粒、胶体、单界面、管、芯片、多孔板、微量滴定板、载玻片、膜、比色皿、凝胶和树脂。示例性固体表面可以包括磁性颗粒的表面和微量滴定板的孔。当所述固相为颗粒材料(例如，珠)时，它可以在多孔板的孔中分布以允许平行处理。在一些实施方式中，所述固体表面是磁珠的表面。所述磁珠可以与递呈基团偶联。在一些实施方式中，所述磁珠可以是羧酸酯-修饰的磁珠、胺-封闭的磁珠、低聚(dT)-涂覆的磁珠、链霉亲和素-涂覆的磁珠、蛋白A/G涂覆的磁珠或者二氧化硅-涂覆的磁珠。在一些实施方式中，所述固体表面是微量滴定板的孔。在一些实施方式中，所述第一和第二固体表面是相同的。在一些实施方式中，所述第一和所述第二固体表面是不同的。在一些实施方式中，在本文所公开的测定方法中使用的所述第一和第二固体表面两者是磁性颗粒的表面。在一些实施方式中，在本文所公开的测定方法中使用的所述第一和第二表面两者是微量滴定板的表面。
如以上所描述的，在本文所公开的测定方法中测量的分析物可以是任何生物分子。在一些实施方式中，所述分析物是蛋白分析物。在一些实施方式中，所述分析物是肽分析物。在一些实施方式中，所述分析物是包括至少两个分子的复合物。在一些实施方式中，所述分析物是包括至少两个蛋白的蛋白复合物。在一些实施方式中，所述分析物是两个蛋白的结合对。在一些实施方式中，所述分析物是包括至少蛋白和至少核酸的大分子复合物。在一些实施方式中，所述分析物是核酸分析物。
在一些实施方式中，所述分析物是两种不同分子的结合对，所述第一结合剂结合所述结合对的一种分子，并且所述第二结合剂结合所述结合对的另一种分子。
在一些实施方式中，所述分析物是两种不同蛋白的结合对，所述第一结合剂结合所述结合对的一种蛋白，并且所述第二结合剂结合所述结合对的另一种蛋白。因此，本文提供了用于检测样品中蛋白-蛋白相互作用的测定方法，其包括以下步骤：
(1)将第一结合剂、第二结合剂和样品在溶液中混合，其中所述第一结合剂结合所述结合对的一种蛋白并且所述第二结合剂结合所述结合对的另一种蛋白并且形成免疫复合物，并且其中所述免疫复合物通过缀合至所述第一结合剂的第一递呈基团和偶联至所述第一表面的第一接受基团之间的结合捕获在与所述溶液接触的第一固体表面上；
(2)清洗所述第一固体表面以除去未结合的分子；
(3)通过破坏所述第一递呈基团和所述第一接受基团之间的结合从所述第一固体表面释放所述免疫复合物；
(4)引入第二固体表面并通过缀合至所述第二结合剂的第二递呈基团和偶联至所述第二固体表面的第二接受基团之间的结合重新捕获所述免疫复合物；
(5)清洗所述第二固体表面以除去未结合的分子；和
(6)检测所述免疫复合物。
在一些实施方式中，所述第一递呈基团是第一核酸标签(“第一标签”)并且所述第一接受基团是第一核酸捕获探针(“第一探针”)，其中所述第一探针或其片段与所述第一标签或其片段互补。在一些实施方式中，所述第二递呈基团是第二核酸标签(“第二标签”)并且所述第二接受基团是第二核酸捕获探针(“第二探针”)，其中所述第二探针或其片段与所述第二标签或其片段互补。
在一些实施方式中，本文提供了用于检测样品中蛋白-蛋白相互作用的测定方法，其包括以下步骤：
(1)将第一结合剂、第二结合剂和样品在溶液中混合；
其中所述第一结合剂结合所述结合对的一种蛋白并且所述第二结合剂结合所述结合对的另一种蛋白并且形成免疫复合物；并且其中所述免疫复合物通过缀合至所述第一结合剂的第一递呈基团和偶联至所述第一表面的第一接受基团之间的结合捕获在与所述溶液接触的第一固体表面上；
(2)清洗所述第一固体表面以除去未结合的分子；
(3)通过破坏所述第一递呈基团和所述第一接受基团之间的结合从所述第一固体表面释放所述免疫复合物；
(4)引入与第二接受基团偶联的第二固体表面并通过所述第一递呈基团和所述第二接受基团之间的结合将所述免疫复合物重新捕获至所述第二固体表面上；
(5)清洗所述第二固体表面以除去未结合的分子；和
(6)检测所述免疫复合物。
在一些实施方式中，所述第一递呈基团是第一核酸标签(“第一标签”)并且所述第一接受基团是第一核酸捕获探针(“第一探针”)，其中所述探针或其片段与所述标签或其片段互补。在一些实施方式中，所述第二接受基团是第二核酸捕获探针(“第二探针”)，其中所述探针或其片段与所述标签或其片段互补。
所述分析物可以是核酸分子(例如，DNA&RNA)。在一些实施方式中，所述分析物是DNA分子。在一些实施方式中，所述分析物是RNA分子。本文所提供的测定方法可以直接检测样品(如血浆和尿液)中的核酸分子而无需核酸分离。如图15所示，核酸分析物可以杂交并捕获至所述第一表面上，释放到溶液中，并且重新捕获至所述第二表面，同时靶标-探针复合物在整个分析程序期间保持完整。因此，在一些实施方式中，本文所提供的测定方法可以用于检测核酸分析物。例如，本文提供了用于检测样品中核酸分析物的测定方法，其包括以下步骤：
(1)将第一结合剂、第二结合剂和样品在溶液中混合，其中所述第一和第二结合剂结合所述核酸分析物上的非干扰表位并形成免疫复合物，并且其中所述免疫复合物通过缀合至所述第一结合剂的第一递呈基团和偶联至所述第一表面的第一接受基团之间的结合捕获至与所述溶液接触的第一固体表面上；其中用于所述核酸分析物的所述第一和第二结合剂是与所述核酸分析物的不同片段互补的核酸；
(2)清洗所述第一固体表面以除去未结合的分子；
(3)通过破坏所述第一递呈基团和所述第一接受基团之间的结合从所述第一固体表面释放所述免疫复合物；
(4)引入第二固体表面并通过缀合至所述第二结合剂的第二递呈基团和偶联至所述第二固体表面的第二接受基团之间的结合重新捕获所述免疫复合物；
(5)清洗所述第二固体表面以除去未结合的分子；和
(6)检测所述免疫复合物。
在一些实施方式中，本文提供了用于检测样品中核酸分析物的测定方法，其包括以下步骤：
(1)将第一核酸标签(“第一标签”)、第二核酸标签(“第二标签”)和样品在溶液中混合，其中所述第一标签的片段和所述第二标签的片段分别与所述核酸分析物的不同片段互补并形成免疫复合物；
其中所述免疫复合物通过所述第一标签和偶联至所述第一固体表面的第一核酸捕获探针(“第一探针”)之间的杂交捕获至与所述溶液接触的第一固体表面上，其中所述第一探针或其片段与所述第一标签或其片段互补；
(2)清洗所述第一固体表面以除去未结合的分子；
(3)通过所述第一标签和所述第一探针之间的杂交的解除，从所述第一固体表面释放所述免疫复合物；
(4)引入第二固体表面并且通过所述第二标签和偶联至所述第二固体表面的第二核酸捕获探针(“第二探针”)之间的杂交将所述免疫复合物重新捕获至所述第二固体表面上；其中所述第二探针或其片段与所述第二标签或其片段互补；
(5)清洗所述第二固体表面以除去未结合的分子；和
(6)检测所述免疫复合物。
所述方法可以通过下一代测序(NGS)用于大量靶标的高通量分析，包括突变、甲基化、易位、融合和/或拷贝数变异等的分析。作为另外一种选择，可以通过qPCR、数字PCR或其它核酸分析技术分析所选的靶标。
可以在多种不同方法中实施本文所提供的测定方法中的步骤1。例如，在一些实施方式中，所述第一结合剂可以预结合至所述第一表面，其一旦接触所述样品，则捕获所述分析物。在一些其它实施方式中，可以随后或与样品同时添加所述第二结合剂，从而通过多轮添加/孵浴/清洗步骤在所述表面上形成所述免疫复合物。
因此，在一些实施方式中，步骤(1)包括在将所述免疫复合物捕获至所述第一固体表面上之前在溶液中形成所述免疫复合物。在一些实施方式中，步骤(1)包括在所述第一固体表面上形成所述免疫复合物之前将所述第一结合剂预捕获至所述第一固体表面上。在一些实施方式中，在步骤(1)中，在溶液中形成所述免疫复合物并同时捕获至所述第一固体表面上。
在一些实施方式中，所述第一结合剂预结合至所述第一表面，将所述样品添加至所述溶液以使得分析物结合所述第一结合剂，并且随后，添加所述第二结合剂以结合所述分析物并形成由所述分析物和所述结合剂所组成的免疫复合物。在一些实施方式中，将所述第一结合剂预结合至所述第一表面，并且同时添加所述样品和所述第二结合剂以形成所述免疫复合物。本领域的常规技术人员将理解可以使用如本文所公开的不同方法或者具有添加/孵浴/清洗的不同顺序的变化形式来形成所述免疫复合物。
5.2.3替代捕获探针构造
如以上所描述的，本文提供了用于检测样品中分析物的测定方法，其包括以下步骤：
(1)将第一结合剂、第二结合剂和样品在溶液中混合，其中所述第一和第二结合剂结合所述分析物上的非干扰表位并形成免疫复合物，并且其中所述免疫复合物通过缀合至所述第一结合剂的第一标签和偶联至所述第一表面的第一探针之间的杂交捕获在与所述溶液接触的第一固体表面上；
(2)清洗所述第一固体表面以除去未结合的分子；
(3)通过所述第一标签和所述第一探针之间的杂交的解除，从所述第一固体表面释放所述免疫复合物；
(4)引入第二固体表面并通过缀合至所述第二结合剂的第二标签和偶联至所述第二固体表面的第二探针之间的结合重新捕获所述免疫复合物；
(5)清洗所述第二固体表面以除去未结合的分子；和
(6)检测所述免疫复合物。
本文还提供了用于检测样品中分析物的测定方法，其包括：
(1)将第一结合剂、第二结合剂和样品在溶液中混合；其中所述第一和第二结合剂结合所述分析物上的非干扰表位并形成免疫复合物；并且其中所述免疫复合物通过缀合至所述第一结合剂的第一核酸标签(“第一标签”)和偶联至所述第一固体表面的第一核酸捕获探针(“第一探针”)之间的杂交捕获至与溶液接触的第一固体表面上；
(2)清洗所述第一固体表面以除去未结合的分子；
(3)通过所述第一标签和所述第一探针之间的杂交的解除，从所述第一固体表面释放所述免疫复合物；
(4)引入与第二核酸探针(“第二探针”)偶联的第二固体表面并且通过所述第一标签和所述第二探针之间的杂交在所述第二固体表面上重新捕获所述免疫复合物；
(5)清洗所述第二固体表面以除去未结合的分子；和
(6)检测所述免疫复合物。
除了图4A-4D和图6A中所示的直接捕获构造外，图6B显示了间接捕获实例，其中所述捕获探针包括两个节段：与结合剂的标签互补的一个节段以及与连接至所述表面的另一个捕获探针互补的另一个节段。间接捕获方法的优势包括(例如)直接偶联至所述固体表面的捕获探针上的序列可以是通用的(例如，多聚T或A)，因此在多重测定中提供灵活性。图6C显示了另一种示例性间接捕获方法，其中所述捕获探针是生物素化的，并且所述表面涂覆有链霉亲和素或抗生物素蛋白。因此，将所述捕获探针通过生物素-链霉亲和素/抗生物素蛋白的高特异性结合偶联至表面。
因此，在一些实施方式中，在本文所提供的测定方法中使用直接捕获，其中将所述第一探针直接偶联至所述第一固体表面(图6A)。在一些实施方式中，将所述第二探针直接偶联至所述第二固体表面。在一些实施方式中，将所述第一探针直接偶联至所述第一固体表面，并且将所述第二探针直接偶联至所述第二固体表面。
在一些实施方式中，在本文所提供的测定方法中使用间接捕获，其中所述第一探针与直接偶联至所述第一固体表面的通用探针杂交，其中所述第一探针的片段与所述通用探针或其片段互补(图6B)。在一些实施方式中，所述第二探针与直接偶联至所述第二固体表面的通用探针杂交，其中所述第二探针的片段与所述通用探针或其片段互补。在一些实施方式中，所述第一探针与直接偶联至所述第一固体表面的通用探针杂交，并且所述第二探针与直接偶联至所述第二固体表面的通用探针杂交。
在一些实施方式中，在本文所提供的测定方法中使用间接捕获，其中所述第一探针与生物素缀合，所述生物素结合直接偶联至所述第一固体表面的链霉亲和素或抗生物素蛋白(图6C)。在一些实施方式中，所述第二探针与生物素缀合，所述生物素结合直接偶联至所述第二固体表面的链霉亲和素或抗生物素蛋白。在一些实施方式中，所述第一探针与生物素缀合，所述生物素结合直接偶联至所述第一固体表面的链霉亲和素或抗生物素蛋白，并且所述第二探针与生物素缀合，所述生物素结合直接偶联至所述第二固体表面的链霉亲和素或抗生物素蛋白。
在一些实施方式中，可以在本文所描述的测定方法中使用协同捕获。如图6D中所示，捕获探针同时杂交至结合剂1和2的核酸标签的较短节段。可以设置测定条件，从而由于相对短的互补节段，单个结合剂的标签无法单独稳定杂交至所述捕获探针。当两种结合剂结合至靶标蛋白并形成免疫复合物时，所述两种结合剂的标签以足以稳定捕获至表面的强度协同杂交至所述捕获探针。这种方法还减少了不是免疫复合物的一部分的非特异性结合剂，其降低或甚至消除了对于释放/重新捕获轮次的需要。
因此，在一些实施方式中，在本文所提供的测定方法中使用直接协同捕获，其中在步骤(1)中所述第一标签和第二标签被协同捕获在所述固体表面上(图6D)。本文提供了用于检测样品中分析物的测定方法，其包括以下步骤：
(1)将第一结合剂、第二结合剂和样品在溶液中混合，其中所述第一和第二结合剂结合所述分析物上的非干扰表位并形成免疫复合物，并且其中所述免疫复合物通过缀合至所述第一结合剂的第一核酸标签(“第一标签”)和偶联至所述表面的核酸捕获探针(“探针”)之间以及缀合至所述第二结合剂的第二核酸标签(“第二标签”)和所述探针之间的杂交捕获至与所述溶液接触的固体表面上；
(2)清洗所述固体表面以除去未结合的分子；和
(3)检测所述免疫复合物。
还可以重复协同捕获以进一步减少非特异性结合。在一些实施方式中，通过解除所述第一和第二标签与所述探针之间的协同杂交从所述第一固体表面释放所述免疫复合物，并且将所述免疫复合物在所述第二固体表面上协同重新捕获，并且其中所述第二固体表面还与所述探针偶联。
协同捕获可以采取不同形式。在一些实施方式中，所述探针的连续片段由第一片段和紧邻的第二片段组成，其中所述第一片段与所述第一标签或其片段互补，并且所述第二片段与所述第二标签或其片段互补，从而当所述第一和第二标签连接以形成连接的核酸时，所述连接的核酸的连接区与所述第一探针的连续片段互补(图7A)。在一些实施方式中，所述第一标签和第二标签也被协同捕获在所述第二固体表面上。在一些实施方式中，所述第二探针的连续片段由第一片段和紧邻的第二片段组成，其中所述第一片段与所述第一标签或其片段互补，并且所述第二片段与所述第二标签或其片段互补，从而当所述第一和第二标签连接以形成连接的核酸时，所述连接的核酸的连接区与所述第二探针的连续片段互补。在一些实施方式中，所述第二探针与所述第一探针相同。在一些实施方式中，将所述免疫复合物通过不同机制捕获在所述第二固体表面上。例如，所述第二表面可以与结合所述第一结合剂或所述第二结合剂的抗体偶联。
在一些实施方式中，所述第一探针的第一片段与所述第一标签或其片段互补，并且所述第一探针的单独的第二片段与所述第二标签或其片段互补(图6D和7B)。在一些实施方式中，所述第一标签和第二标签也协同重新捕获在所述第二固体表面上。在一些实施方式中，所述第二探针的第一片段与所述第一标签或其片段互补，并且所述第二探针的单独的第二片段与所述第二标签或其片段互补。在一些实施方式中，所述第二探针与所述第一探针相同。在一些实施方式中，所述互补区包括所述第一和所述第二标签的未缀合末端，或“游离”末端，即未与各自结合剂缀合的末端(图6D)。在一些实施方式中，所述互补区不包括所述第一和所述第二标签的未缀合末端(图7B)。在一些实施方式中，所述互补区包括所述第一和所述第二标签的缀合末端(图7B)。在一些实施方式中，所述第二探针与所述第一探针相同。在一些实施方式中，将所述免疫复合物通过不同机制捕获在所述第二固体表面上。例如，所述第二表面可以与结合所述第一结合剂或所述第二结合剂的抗体偶联。
在一些实施方式中，在本文所提供的测定方法中使用直接协同捕获，其中所述第一固体表面与所述第一探针和所述第二探针两者偶联(图7C)。本文提供了用于检测样品中分析物的测定方法，其包括以下步骤：
(1)将第一结合剂、第二结合剂和样品在溶液中混合，其中所述第一和第二结合剂结合所述分析物上的非干扰表位并形成免疫复合物，并且其中所述免疫复合物通过缀合至所述第一结合剂的第一核酸标签(“第一标签”)和偶联至所述表面的第一核酸捕获探针(“第一探针”)之间的杂交以及缀合至所述第二结合剂的第二核酸标签(“第二标签”)和偶联至所述表面的第二核酸捕获探针(“第二探针”)之间的杂交捕获至与所述溶液接触的固体表面上；
(2)清洗所述固体表面以除去未结合的分子；和
(3)检测所述免疫复合物。
在一些实施方式中，所述第一标签和第二标签也协同重新捕获在所述第二固体表面上，并且其中所述第二固体表面也与所述第一探针和所述第二探针两者偶联。在一些实施方式中，所述第一固体表面与第一探针以及其它探针偶联，并且所述第二固体表面与第二探针和其它探针偶联，其中所述第一和第二探针两者可以与所述第一标签和所述其它探针杂交并且可以与所述第二标签杂交。在一些实施方式中，所述第二探针与所述第一探针相同。在一些实施方式中，将所述免疫复合物通过不同机制捕获在所述第二固体表面上。例如，所述第二表面可以与结合所述第一结合剂或所述第二结合剂的抗体偶联。
核酸标签和核酸捕获探针之间的互补序列设计以有助于所述标签与所述探针之间的特异性杂交，以及所述杂交的免疫复合物随后的解离。在一个实施方式中，可以使用长度适当、具有低G/C或不具有G/C的序列，所述序列可以在杂交中提供足够的强度并且可以在释放期间在低盐条件下溶解而不会破坏所述免疫复合物。在一些实施方式中，可以使用仅包括多聚T/A或多聚“TA”/“AT”的序列。如本领域的常规技术人员将理解的，可以使用具有适当杂交强度的任何序列。
在一些实施方式中，在本文所提供的测定方法中使用的核酸标签和核酸捕获探针的互补片段的超过80％、超过85％、超过90％、超过95％或超过98％是腺嘌呤(“A”)和胸腺嘧啶(“T”)对。在一些实施方式中，所述第一标签和所述第一探针的互补片段的超过80％、超过85％、超过90％、超过95％或超过98％是A和T对。在一些实施方式中，所述第二标签和所述第二探针的互补片段的超过80％、超过85％、超过90％、超过95％或超过98％是A和T对。在一些实施方式中，所述第一标签和所述第一探针的互补片段的超过80％是A和T对，并且所述第二标签和所述第二探针的互补片段的超过80％是A和T对。在一些实施方式中，所述第一标签和所述第一探针的互补片段包含A和T对，并且所述第二标签和所述第二探针的互补片段包含A和T对。
在一些实施方式中，在本文所提供的测定方法中使用的通用探针和核酸捕获探针的互补片段的超过80％、超过85％、超过90％、超过95％或超过98％的互补片段是腺嘌呤(“A”)和胸腺嘧啶(“T”)对。在一些实施方式中，所述通用探针和所述第一探针的互补片段的超过80％、超过85％、超过90％、超过95％或超过98％是A和T对。在一些实施方式中，所述通用探针和所述第二捕获探针的互补片段的超过80％、超过85％、超过90％、超过95％或超过98％是A和T对。在一些实施方式中，所述通用探针和所述第一探针的互补片段的超过80％是A和T对，并且所述通用探针和所述第二探针的互补片段的超过80％是A和T对。在一些实施方式中，所述通用探针和所述第一探针的互补片段包含A和T对，并且所述通用探针和所述第二探针的互补片段包含A和T对。
在一些实施方式中，在本文所提供的测定方法中使用的核酸标签和核酸捕获探针的互补片段由10至30个碱基对、10至25个碱基对、12至20个碱基对或者10至16个碱基对组成。在一些实施方式中，在本文所提供的测定方法中使用的核酸标签和核酸捕获探针的互补片段由10至25个碱基对组成。在一些实施方式中，在本文所提供的测定方法中使用的核酸标签和核酸捕获探针的互补片段由12至20个碱基对组成。在一些实施方式中，在本文所提供的测定方法中使用的核酸标签和核酸捕获探针的互补片段由12至16个碱基对组成。在一些实施方式中，在本文所提供的测定方法中使用的核酸标签和核酸捕获探针的互补片段由12至14个碱基对组成。在一些实施方式中，所述第一标签和所述第一探针的互补片段由10至25个碱基对组成。在一些实施方式中，所述第二标签和所述第二探针的互补片段由10至25个碱基对组成。在一些实施方式中，所述第一标签和所述第一探针的互补片段由12至20个碱基对组成。在一些实施方式中，所述第二标签和所述第二探针的互补片段由12至20个碱基对组成。在一些实施方式中，所述第一标签和所述第一探针的互补片段由12至16个碱基对组成。在一些实施方式中，所述第二标签和所述第二探针的互补片段由12至16个碱基对组成。
5.2.4检测
在通过捕获/释放机制充分耗尽不是所述免疫复合物的一部分的非特异性结合剂之后，可以检测所述免疫复合物。照此，本文所提供的测定方法包括步骤(6)，检测所述免疫复合物。
在一些实施方式中，检测所述免疫复合物，同时所述免疫复合物捕获至固体表面上。所述固体表面可以是所述第二表面。如果在步骤(5)和(6)之间包括至少一种其它捕获/释放循环，则所述固体表面也可以是另一种固体表面。在一些实施方式中，将所述免疫复合物从所述固体表面释放到溶液中并在所述溶液中检测。
在一些实施方式中，本文所提供的测定方法包括检测所述免疫复合物的第一结合剂。在一些实施方式中，本文所提供的测定方法包括检测所述免疫复合物的第二结合剂。在一些实施方式中，本文所提供的测定方法包括检测缀合至所述免疫复合物的第一结合剂的第一递呈基团。在一些实施方式中，本文所提供的测定方法包括检测缀合至所述免疫复合物的第一结合剂或者第二结合剂的第二递呈基团。在一些实施方式中，通过缀合至所述第一结合剂的可检测标志物检测所述免疫复合物。在一些实施方式中，通过缀合至所述第二结合剂的可检测标志物检测所述免疫复合物。
在一些实施方式中，所述可检测标志物为核酸，其可以通过聚合酶链反应(PCR)扩增和检测(图2)。可以使用免疫-PCR技术，其通过将蛋白分析物检测转化为核酸报告分子来利用核酸技术的能力进行蛋白检测(例如，US5,665,539)。如图8B和8D所示，预缀合至检测结合剂的核酸节段可以用作免疫复合物的报告分子，并且使用PCR扩增所述报告分子并产生可检测信号。在一些实施方式中，可以检测用于捕获/释放的核酸标签，并且无需其它可检测标志物。在一些实施方式中，将所述第一标签用于通过PCR的检测。在一些实施方式中，将所述第二标签用于通过PCR的检测。
可以通过本领域中已知的任何方法检测所述免疫复合物。例如，可以使用特异性结合至所述第一结合剂、所述第二结合剂、所述第一递呈基团或所述第二递呈基团的抗体实现免疫复合物的检测。可以用能够将无色或接近无色的底物或共底物转化为高度有色的产物或能够与发色团形成有色复合物的产物的酶，包括(例如)辣根过氧化物酶、碱性磷酸酶或β-半乳糖苷酶来标记用于检测的抗体。作为另外一种选择，所述检测系统可以使用酶，在存在适当底物的情况下，所述酶发光。可以通过目视、分光光度法、电化学法、荧光法或发光法检测所形成的产品的量，并且可以将其与类似处理的对照进行比较。所述检测系统也可以使用放射性标记的抗体，在此情况下通过闪烁计数或γ计数定量免疫复合物的量。可以使用的其它检测系统包括基于来源于金黄色葡萄球菌Cowan株I(Staphylococcusaureus Cowan strain I)的蛋白A、来自C组葡萄球菌(group C Staphylococcus sp.)(26RP66株)的蛋白G的使用的那些。
在一些实施方式中，通过免疫荧光检测所述免疫复合物。在一些实施方式中，通过测量缀合至结合剂的可检测标志物检测所述免疫复合物。所述可检测标志物可以是荧光-标记的试剂。所述标记的试剂可以是第二抗体。所述可检测标志物可以是比色检测试剂、荧光检测试剂或化学发光检测试剂。所述比色可检测标志物可以包括PNPP(磷酸对-硝基苯酯)、ABTS(2,2'-联氮-双(3-乙基苯并噻唑-6-磺酸))或者OPD(o-苯二胺)。所述荧光可检测标志物包括QuantaBluTM或者QuantaRedTM(Thermo Scientific,Waltham,MA)。所述发光可检测标志物包括luminol或萤光素。在一些实施方式中，所述可检测标志物可以包括引发剂(例如，H2O2)和示踪剂(例如，异鲁米诺-缀合物)。
第二抗体可以是(例如)抗-人IgA抗体、抗-人IgD抗体、抗-人IgE抗体、抗-人IgG抗体或者抗-人IgM抗体。所述第二抗体可以是单克隆或多克隆抗体。第二抗体可以来源于任何哺乳动物，包括小鼠、大鼠、仓鼠、山羊、骆驼、鸡、兔等。第二抗体也可以是重组的。第二抗体可以缀合至酶(例如，辣根过氧化物酶(HRP)、碱性磷酸酶(AP)、荧光素酶等)或者染料(例如，比色染料、荧光染料、荧光能量共振转移(FRET)-染料、时间分辨(TR)-FRET染料等)。在一些实施方式中，第二抗体可以缀合至荧光素(FITC)基染料，如异硫氰酸荧光素。在一些实施方式中，第二抗体可以缀合至Alexa
Figure BDA0003780256640000661
488(Life technologies)。
用于实施免疫测定和生物物理学蛋白-相互作用测定的方法和规程在本领域中是熟知的。参见，例如，Wild D.,The Immunoassay Handbook,Elsevier Science，第4版(2013)；Fu H.,Protein-Protein Interactions,Humana Press，第4版(2004)。
5.2.4.1核酸报告分子的产生
如图8A和8C所示，在一些实施方式中，核酸标签可以缀合至在本文所公开的测定方法中使用的结合剂。所述核酸标签可以用于允许高灵敏度检测的核酸报告分子的产生。如以上所描述的，本文提供了用于检测样品中分析物的双捕获结合剂测定方法，其包括：
(1)将第一结合剂、第二结合剂和样品在溶液中混合，其中所述第一和第二结合剂结合所述分析物上的非干扰表位并形成免疫复合物，并且其中所述免疫复合物通过缀合至所述第一结合剂的第一标签和偶联至所述第一表面的第一探针之间的杂交捕获在与所述溶液接触的第一固体表面上；
(2)清洗所述第一固体表面以除去未结合的分子；
(3)通过所述第一标签和所述第一探针之间的杂交的解除，从所述第一固体表面释放所述免疫复合物；
(4)引入第二固体表面并通过缀合至所述第二结合剂的第二标签和偶联至所述第二固体表面的第二探针之间的结合重新捕获所述免疫复合物；
(5)清洗所述第二固体表面以除去未结合的分子；和
(6)检测所述免疫复合物。
本文还提供了用于检测样品中分析物的单捕获结合剂测定方法，其包括：
(1)将第一结合剂、第二结合剂和样品在溶液中混合；其中所述第一和第二结合剂结合所述分析物上的非干扰表位并形成免疫复合物；并且其中所述免疫复合物通过缀合至所述第一结合剂的第一核酸标签(“第一标签”)和偶联至所述第一固体表面的第一核酸捕获探针(“第一探针”)之间的杂交捕获至与溶液接触的第一固体表面上；
(2)清洗所述第一固体表面以除去未结合的分子；
(3)通过所述第一标签和所述第一探针之间的杂交的解除，从所述第一固体表面释放所述免疫复合物；
(4)引入与第二核酸探针(“第二探针”)偶联的第二固体表面并且通过所述第一标签和所述第二探针之间的杂交在所述第二固体表面上重新捕获所述免疫复合物；
(5)清洗所述第二固体表面以除去未结合的分子；和
(6)检测所述免疫复合物。
在单捕获结合剂测定方法的一些实施方式中，所述第二结合剂也缀合至第二核酸标签(“第二标签”)。
在双捕获结合剂测定方法和单捕获结合剂测定方法两者中，在通过捕获/释放机制充分耗尽不是所述免疫复合物的一部分的非特异性第一结合剂和第二结合剂之后，可以使用所述第一标签和所述第二标签产生核酸报告分子。所述核酸报告分子可以采取多种形式。例如，如图4B(e)中所示，所述第一标签和所述第二标签可以连接以产生所述核酸报告分子。如本领域的常规技术人员将理解的，可以在该步骤中部署本文所公开的或另外本领域中已知的任何报告分子产生方法，包括(如)连接、聚合延伸或协同杂交。
在一些实施方式中，所述第二捕获不必需是可释放的，并且可以通过在所述第二表面上捕获的免疫复合物产生所述核酸报告分子。作为另外一种选择，首先，可以在产生所述核酸报告分子之前将所述免疫复合物释放回溶液。
邻位连接测定(PLA)和邻位延伸测定(PEA)在本领域中是已知的(例如，US6,511,809、US6,878,515、US7,306,904、US9,777,315、US10,174,366、WO9700446、Greenwood C,Biomol.Det.&Quan.4(2015)10-16)。邻位-基检测与免疫-PCR的不同在于它们基于通过两个核酸-缀合的结合剂对靶标分析物的同时识别以引发可扩增产物的形成。因此，不是免疫复合物的一部分的单个核酸-缀合的结合剂将不会产生报告分子，因此避免了来自单个非特异性结合的结合剂的背景。在一些实施方式中，将邻位连接用于产生所述核酸报告分子(图3A)，其中一旦形成免疫复合物，则使所述第一标签和所述第二标签足够邻近以连接，并且将由所述第一标签的片段和所述第二标签的片段所组成的连接产物的片段用作扩增子以产生用于检测的信号。在一些实施方式中，将邻位延伸用于产生所述核酸报告分子(图3B)，其中一旦形成免疫复合物，则使所述第一标签和所述第二标签足够邻近以彼此相互作用并形成双螺旋，从而使所述双螺旋的至少一个核酸标签的3'端可以延伸以产生延伸产物，其可以用作扩增子以产生用于检测的信号。在一些实施方式中，将协同杂交用于产生所述核酸报告分子，其中一旦形成免疫复合物，则使所述第一标签和所述第二标签足够邻近以彼此相互作用并形成杂交产物，其可以用作扩增子以产生用于检测的信号。
可以在本文所提供的测定方法的步骤(1)中使用所述核酸标签来产生所述核酸报告分子。如图4B(e)所示，可以通过经由邻位连接、邻位延伸或协同杂交将所述第一标签和所述第二标签直接连接在一起产生所述报告分子。作为另外一种选择，如图5A-5C所示，可以使用可以与所述核酸标签杂交的核酸替代物产生所述核酸报告分子。例如，在一些实施方式中，使用替代核酸，其中所述第一替代物或其片段与所述第一标签或其片段互补，并且所述第二替代物或其片段与所述第二标签或其片段互补。在一些实施方式中，可以通过经由邻位连接、邻位延伸或协同杂交将所述第一替代物连接至所述第二标签来产生所述报告分子(图5A)。在一些实施方式中，可以通过经由邻位连接、邻位延伸或协同杂交将所述第一标签连接至所述第二替代物来产生所述报告分子(图5B)。作为另外一种选择，可以通过经由邻位连接、邻位延伸或协同杂交将所述第一替代物连接至所述第二替代物来产生所述报告分子(图5C)。在一些实施方式中，可以在形成所述免疫复合物之后添加所述第一替代物和/或所述第二替代物。在另一个实施方式中，在所述免疫复合物形成之前，所述第一替代物和所述第二替代物分别预杂交至所述第一标签和所述第二标签。
因此，在一些实施方式中，本文所提供的测定方法的步骤(6)包括通过经由邻位连接、邻位延伸或协同杂交将所述第一标签和所述第二标签连接来产生核酸报告分子，并检测由所述第一标签的片段和所述第二标签的片段所组成的所述核酸报告分子。在一些实施方式中，使用替代核酸，其中所述第一标签或其片段与所述第一替代物或其片段互补，并且所述第二标签或其片段与所述第二替代物或其片段互补。在一些实施方式中，本文所提供的测定方法的步骤(6)包括通过经由邻位连接、邻位延伸或协同杂交将所述第一标签和所述第二替代物连接来产生核酸报告分子，并检测由所述第一标签的片段和所述第二替代物的片段所组成的所述核酸报告分子。在一些实施方式中，本文所提供的测定方法的步骤(6)包括通过经由邻位连接、邻位延伸或协同杂交将所述第一替代物和所述第二标签连接来产生核酸报告分子，并检测由所述第一替代物的片段和所述第二标签的片段所组成的所述核酸报告分子。在一些实施方式中，本文所提供的测定方法的步骤(6)包括通过经由邻位连接、邻位延伸或协同杂交将所述第一替代物和所述第二替代物连接来产生核酸报告分子，并检测由所述第一替代物的片段和所述第二替代物的片段所组成的所述核酸报告分子。
尽管如以上所描述的，如图5A-5C和8A-8B中举例说明的测定方法使用了邻位连接，但是邻位延伸、协同杂交或本领域中已知的其它方法也可以用于产生用于检测的核酸报告分子。
5.2.4.2核酸报告分子的检测
可以使用任何现有核酸检测技术检测在最后步骤中所产生的报告分子，所述现有核酸检测技术包括(但不限于)PCR、定量PCR(qPCR)、数字PCR(dPCR)或下一代测序(NGS)。在一些实施方式中，所述检测为定性检测。在一些实施方式中，所述检测为定量检测。在一些实施方式中，通过qPCR检测所述核酸报告分子。在一些实施方式中，通过dPCR检测所述核酸报告分子。在一些实施方式中，通过NGS检测所述核酸报告分子。
除了这些常见的技术之外，还可以使用其它核酸扩增/检测方法，其包括(但不限于)滚环扩增(RCA)、链置换扩增(SDA)、环介导等温扩增(LAMP)和重组酶聚合酶扩增(RPA)。能够高灵敏度核酸检测而无需靶向扩增的其它技术也可以用于在本文所公开的测定方法中检测核酸报告分子。这些包括(但不限于)来自ThermoFisher Scientific(ThermoFisher(2019))的QuantiGene测定、来自Quanterix(Rissin DM(2010))的SIMOA测定和来自MilliporeSigma(MilliporeSigma(2019))的SMCxPROTM。因此，在一些实施方式中，通过滚环扩增(RCA)、链置换扩增(SDA)、环介导等温扩增(LAMP)、重组酶聚合酶扩增(RPA)或者QuantiGene测定检测所述核酸报告分子。
5.2.5多重技术
由于在本文所公开的测定方法中所产生的报告分子是核酸分子，因为可以作为可以通过DNA测序或其它方法解码的标识码(ID)引入独特序列。包含N个碱基核苷酸的ID节段可以产生多至4N个独特标识代码。如图9A-9B所示，一种方法是直接将ID引入一个结合剂的标签(图9A)或者两个结合剂的标签(图9B)中。在一些实施方式中，所述核酸报告分子在所述第一标签中含有ID。在一些实施方式中，所述核酸报告分子在所述第二标签中含有ID。在一些实施方式中，所述核酸报告分子在所述第一标签中含有第一ID并且在所述第二标签中含有第二ID。
图10显示了间接ID码化方法，其中ID位于在结合剂的相应标签上杂交的单独的单链核酸分子上(即核酸替代物)。在一些实施方式中，使用替代核酸，其中所述第一标签或其片段与所述第一替代物或其片段互补，并且所述第二标签或其片段与所述第二替代物或其片段互补。在图10A中，仅所述第一结合剂间接通过第一替代物ID化。通过将所述第一替代物与所述第二标签连接产生了所述核酸报告分子。在图10B中，所述第一和所述第二结合剂两者是间接ID化的。尽管在图9A-9B和10A-10B中举例说明了连接，但是还可以通过如以上所公开的邻位延伸、协同杂交以及本领域中已知的其它方法产生所述报告分子。另外，可以在测定前在试剂生产方法中完成具有ID的核酸替代物与其相关结合剂标签的退火。作为另外一种选择，它可以作为测定的一部分实施。
在一些实施方式中，本文提供了测定方法，其中所述核酸报告分子在所述第一标签、所述第一替代物、所述第二标签或所述第二替代物中含有ID。在一些实施方式中，所述核酸报告分子由所述第一标签的片段和所述第二替代物的片段组成，并且在所述第一标签或所述第二替代物中含有ID。在一些实施方式中，所述核酸报告分子在所述第一标签中含有第一ID并且在所述第二替代物中含有第二ID。在一些实施方式中，所述核酸报告分子由所述第一替代物的片段和所述第二标签的片段组成，并且在所述第一替代物或所述第二标签中含有ID。在一些实施方式中，所述核酸报告分子在所述第一替代物中含有第一ID并且在所述第二替代物中含有第二ID。在一些实施方式中，所述核酸报告分子由所述第一替代物的片段和所述第二替代物的片段组成，并且在所述第一替代物或所述第二替代物中含有ID。在一些实施方式中，所述核酸报告分子在所述第一替代物中含有第一ID并且在所述第二替代物中含有第二ID。
以上所描述的ID方法的一种应用是同时检测并测量相同样品中的多个不同的分析物。在一些实施方式中，如本文所公开的核酸报告分子含有分析物特异的ID(“靶标ID”)。每种分析物分配了独特的ID。照此，本文提供了测定方法，其包括通过同时检测与每种分析物有关的独特靶标ID同时检测所述样品中的至少两个分析物。在一些实施方式中，本文所提供的测定方法通过同时检测与每种分析物有关的独特靶标ID，同时检测了样品中至少3、至少4、至少5、至少6、至少7、至少8、至少9、至少10、至少12、至少15、至少20、至少30、至少40、至少50、至少60、至少70、至少80、至少90或者至少100种分析物。
在一些实施方式中，所述分析物是蛋白。在一些实施方式中，所述分析物包括至少一种蛋白和至少一种核酸。所述核酸可以是DNA或RNA。本文所提供的测定方法可以用于蛋白、DNA和RNA的分析的事实使其成为用于多组学分析的理想平台。
如图11所示，一个ID足以代表靶标分析物或者与所述分析物所形成的免疫复合物的标识。一旦将ID引入报告分子，则可以通过已有的多重核酸检测技术，如多重qPCR、多重数字PCR或下一代测序(NGS)检测和定量它。
在本文所提供的测定方法中ID在核酸报告分子中的引入还可以帮助改善所述测定的特异性。如图12所示，所述第一结合剂和所述第二结合剂中的每一个与独特的ID结合，并且仅将来自含有两种结合剂的ID的报告分子所产生的信号记为正确信号。该方案可以用于降低或消除通过不同结合对之间的交叉反应性或非特异性结合所产生的假阳性信号。因此，本文提供了通过分别与所述第一和第二结合剂结合的所述第一和所述第二靶标ID的共检测，用于检测样品中分析物的测定方法。
在本文所提供的测定方法中ID在所述核酸报告分子中的掺入还可以用于检测分子之间的相互作用，例如，蛋白-蛋白相互作用。如图13所示，含有设计用于不同分子的两种结合剂的ID的报告分子的共检测和定量将表示这两种结合分子在测定条件下的相互作用和亲和力。在一些实施方式中，本文所提供的测定方法检测蛋白-蛋白相互作用。因此，本文提供了用于检测样品中分析物的测定方法，其中所述分析物是两种不同蛋白的结合对；其中所述第一结合剂结合一种蛋白，并且所述第二结合剂结合所述结合对的另一种蛋白；并且其中通过所述第一和所述第二靶标ID的共检测来检测所述结合对。
除了分析物特异的“靶标ID”之外，在本文所提供的测定方法中所产生的核酸报告分子也可以包括样品特异的“样品ID”。如图14A-14C中所示，当对特定样品实施本文所提供的测定方法时，可以在报告分子产生步骤时或之前，在测定期间引入样品ID以识别所述样品。通过掺入所述报告分子中的这种样品ID，可以将来自多种样品的报告分子混合在一起并通过NGS同时读取。在一些实施方式中，可以独立于结合剂标签在核酸上携带样品ID，并且可以将所述样品ID在连接步骤掺入报告分子，如图14A所示。因此，在一些实施方式中，在每种样品中所形成的核酸报告分子含有作为样品ID的ID，其中将所述样品ID插入所述第一标签或替代物和所述第二标签或替代物之间。
在一些实施方式中，所述核酸报告分子由所述第一标签的片段和所述第二标签的片段组成，并且含有在所述第一标签和所述第二标签之间插入的样品ID。在一些实施方式中，所述核酸报告分子由所述第一标签的片段和所述第二替代物的片段组成，并且含有在所述第一标签和所述第二替代物之间插入的样品ID。在一些实施方式中，所述核酸报告分子由所述第一替代物的片段和所述第二标签的片段组成，并且含有在所述第一替代物和所述第二标签之间插入的样品ID。在一些实施方式中，所述核酸报告分子由所述第一替代物的片段和所述第二替代物的片段组成，并且含有在所述第一替代物和所述第二替代物之间插入的样品ID。
作为另外一种选择，可以在测定步骤期间将所述样品ID掺入杂交至标签的核酸替代物上，如图14B所示。因此，在一些实施方式中，在每种样品中所形成的核酸报告分子在所述第一替代物或所述第二替代物中含有样品ID。在一些实施方式中，所述核酸报告分子由所述第一标签的片段和所述第二替代物的片段组成，并且在所述第二替代物中含有样品ID。在一些实施方式中，所述核酸报告分子由所述第一替代物的片段和所述第二标签的片段组成，并且在所述第一替代物中含有样品ID。在一些实施方式中，所述核酸报告分子由所述第一替代物的片段和所述第二替代物的片段组成，并且在所述第一替代物或所述第二替代物中含有样品ID。
作为另外一种选择，可以在测定步骤期间通过连接将所述样品ID掺入至核酸标签或其替代物，如图14C所示。因此，在一些实施方式中，在每种样品中所形成的核酸报告分子含有连接至所述第一标签或所述第二标签或它们各自替代物的样品ID。在一些实施方式中，所述核酸报告分子由所述第一标签的片段和所述第二标签的片段组成，并且含有连接至所述第一标签或所述第二标签的样品ID。在一些实施方式中，所述核酸报告分子由所述第一标签的片段和所述第二替代物的片段组成，并且含有连接至所述第一标签或所述第二替代物的样品ID。在一些实施方式中，所述核酸报告分子由所述第一替代物的片段和所述第二标签的片段组成，并且含有连接至所述第一替代物或所述第二标签的样品ID。在一些实施方式中，所述核酸报告分子由所述第一替代物的片段和所述第二替代物的片段组成，并且含有连接至所述第一替代物或所述第二替代物的样品ID。
照此，本文还提供了测定方法，其包括通过在每种样品中所形成的核酸报告分子中掺入独特样品ID并同时检测与每种样品结合的核酸报告分子中的独特样品ID来同时检测至少两种样品中的分析物。在一些实施方式中，本文所提供的测定方法通过同时检测与每种样品结合的独特样品ID来同时检测至少3、至少4、至少5、至少6、至少7、至少8、至少9、至少10、至少15、至少20、至少30、至少40、至少50、至少60、至少70、至少80、至少90、至少100、至少150、至少200、至少250、至少300、至少350、至少400、至少450或者至少500个样品中的分析物。
在一些实施方式中，在本文所提供的测定方法中所产生的核酸报告分子可以包含靶标ID和样品ID两者。在一些实施方式中，所述核酸报告分子包含(a)在所述第一标签或所述第一替代物或者在所述第二标签或所述第二替代物中的靶标ID，和(b)(1)插入在所述第一标签或其替代物和所述第二标签或其替代物之间，(2)包含在所述第一替代物或所述第二替代物中，或者(3)连接至所述第一标签或其替代物或者所述第二标签或其替代物的样品ID。
在一些实施方式中，所述核酸报告分子由所述第一标签的片段和所述第二标签的片段组成，并且含有靶标ID和样品ID。所述核酸报告分子可以在所述第一标签或所述第二标签中含有靶标ID。所述核酸报告分子可以在所述第一标签中含有第一靶标ID并且在所述第二标签中含有第二靶标ID。所述核酸报告分子可以含有在所述第一标签或所述第二标签之间插入的样品ID。
在一些实施方式中，所述核酸报告分子由所述第一标签的片段和所述第二替代物的片段组成，并且含有靶标ID和样品ID。所述核酸报告分子可以在所述第一标签或所述第二替代物中含有靶标ID。所述核酸报告分子可以在所述第一标签中含有第一靶标ID并且在所述第二替代物中含有第二靶标ID。所述核酸报告分子可以含有在所述第一标签和所述第二替代物之间插入的样品ID。所述核酸报告分子还可以在所述第二替代物中含有样品ID。
在一些实施方式中，所述核酸报告分子由所述第一替代物的片段和所述第二标签的片段组成，并且含有靶标ID和样品ID。所述核酸报告分子可以在所述第一替代物或所述第二标签中含有靶标ID。所述核酸报告分子可以在所述第一替代物中含有第一靶标ID并且在所述第二标签中含有第二靶标ID。所述核酸报告分子可以含有在所述第一替代物和所述第二标签之间插入的样品ID。所述核酸报告分子还可以在所述第一替代物中含有样品ID。
在一些实施方式中，所述核酸报告分子由所述第一替代物的片段和所述第二替代物的片段组成，并且含有靶标ID和样品ID。所述核酸报告分子可以在所述第一替代物或所述第二替代物中含有靶标ID。所述核酸报告分子可以在所述第一替代物中含有第一靶标ID并且在所述第二替代物中含有第二靶标ID。所述核酸报告分子可以含有在所述第一替代物和所述第二替代物之间插入的样品ID。所述核酸报告分子还可以在所述第一替代物或所述第二替代物中含有样品ID。
照此，本文还提供了测定方法，其包括通过同时检测独特样品ID和与每种分析物结合的独特靶标ID和与每种样品结合的独特样品ID，同时检测至少两种样品中的至少两种分析物。
在一些实施方式中，本文所提供的测定方法通过同时检测每个样品的核酸报告分子中的独特样品ID和独特靶标ID来同时检测至少3、至少4、至少5、至少6、至少7、至少8、至少9、至少10、至少15、至少20、至少30、至少40、至少50、至少60、至少70、至少80、至少90、至少100、至少150、至少200、至少250、至少300、至少350、至少400、至少450或者至少500个样品中的至少两种分析物。
在一些实施方式中，本文所提供的测定方法通过同时检测每个样品的核酸报告分子中的独特样品ID和独特靶标ID来同时检测至少3、至少4、至少5、至少6、至少7、至少8、至少9、至少10、至少15、至少20、至少30、至少40、至少50、至少60、至少70、至少80、至少90、至少100、至少150、至少200、至少250、至少300、至少350、至少400、至少450或者至少500个样品中的至少3个分析物。
在一些实施方式中，本文所提供的测定方法通过同时检测每个样品的核酸报告分子中的独特样品ID和独特靶标ID来同时检测至少3、至少4、至少5、至少6、至少7、至少8、至少9、至少10、至少15、至少20、至少30、至少40、至少50、至少60、至少70、至少80、至少90、至少100、至少150、至少200、至少250、至少300、至少350、至少400、至少450或者至少500个样品中的至少5个分析物。
在一些实施方式中，本文所提供的测定方法通过同时检测每个样品的核酸报告分子中的独特样品ID和独特靶标ID来同时检测至少3、至少4、至少5、至少6、至少7、至少8、至少9、至少10、至少15、至少20、至少30、至少40、至少50、至少60、至少70、至少80、至少90、至少100、至少150、至少200、至少250、至少300、至少350、至少400、至少450或者至少500个样品中的至少10个分析物。
在一些实施方式中，本文所提供的测定方法通过同时检测每个样品的核酸报告分子中的独特样品ID和独特靶标ID来同时检测至少3、至少4、至少5、至少6、至少7、至少8、至少9、至少10、至少15、至少20、至少30、至少40、至少50、至少60、至少70、至少80、至少90、至少100、至少150、至少200、至少250、至少300、至少350、至少400、至少450或者至少500个样品中的至少20个分析物。
在一些实施方式中，本文所提供的测定方法通过同时检测每个样品的核酸报告分子中的独特样品ID和独特靶标ID来同时检测至少3、至少4、至少5、至少6、至少7、至少8、至少9、至少10、至少15、至少20、至少30、至少40、至少50、至少60、至少70、至少80、至少90、至少100、至少150、至少200、至少250、至少300、至少350、至少400、至少450或者至少500个样品中的至少50个分析物。
在一些实施方式中，本文所提供的测定方法通过同时检测每个样品的核酸报告分子中的独特样品ID和独特靶标ID来同时检测至少3、至少4、至少5、至少6、至少7、至少8、至少9、至少10、至少15、至少20、至少30、至少40、至少50、至少60、至少70、至少80、至少90、至少100、至少150、至少200、至少250、至少300、至少350、至少400、至少450或者至少500个样品中的至少80个分析物。
在一些实施方式中，本文所提供的测定方法通过同时检测每个样品的核酸报告分子中的独特样品ID和独特靶标ID来同时检测至少3、至少4、至少5、至少6、至少7、至少8、至少9、至少10、至少15、至少20、至少30、至少40、至少50、至少60、至少70、至少80、至少90、至少100、至少150、至少200、至少250、至少300、至少350、至少400、至少450或者至少500个样品中的至少100个分析物。
如本领域的常规技术人员将理解的，可以在本文所公开的测定方法中使用如以上所描述的和如图4A至7C以及9A-14中所示的核酸-基捕获和ID构造的不同排列与组合。
可以通过多重qPCR、多重数字PCR或NGS检测本文所公开的多重测定方法中的所述核酸报告分子。例如，在一些实施方式中，可以通过NGS检测本文所公开的多重测定方法中的所述核酸报告分子。NGS检测通过本文所公开的测定方法所产生的核酸报告分子的使用包括至少以下优势。首先，NGS能够检测和读取样品中的核酸分子序列。如本文所描述的，通过将靶标和样品ID标签引入所述报告分子，NGS能够以超大规模进行多重检测。例如，NGS可以在单次运行中读取100个样品，每个样品包含10个靶标的混合池(即1000重)。这显著降低了每个数据点的成本。第二，NGS可以对相同序列分子的数目进行计数和集合，从而以单分子分辨率提供数字定量。由于预先设计了报告分子序列并且该序列较短，因此与从头测序相比，可以以低成本、更快速地完成作为报告分子检测方法的NGS。另外，根据通信理论，可以使用广泛的纠错算法，如奇偶检验、汉明码(例如，Bystrykh,PLoS ONE 7(5):e36852(2012))和Levenshtein码(例如，Buschmann,BMC Bioinformatics.2013；14:272(2013))并且其可以在本文中应用以减少假阳性计数，从而NGS基定量可以实现高精度，且无重复测序。
由于NGS是单分子检测和计数法，因此测序仪器对可以测序的分子总数设置了上限。例如，来自Illumina的MiSeq系统能够在每次运行进行2500万次读取，这将一次运行中要测序的分子总数限制为2500万。在其中靶标以低浓度或甚至在检测限(“LOD”)附近存在的大多数应用中，该限制不是限制性的。然而，在多重测试中，已知一些靶标以比其它高多个数量级的水平表达，从而消耗了测序带宽而不会提供有用的临床/生物学信息。因此，需要有目的地减少从这些大量分析物所产生的信号，同时在多重测定形式中维持对其它分析物的灵敏度。
本文所提供的这种测定方法另外解决了这种需要并提供了相关优势。在一些实施方式中，本文提供了测定方法，其中以准确且已知的比例减少了从高浓度靶标分析物所产生的报告分子的数目，从而可以将有限的检测带宽有效分配给不同的靶标分析物。本文所公开的测定方法在产生所述报告分子之前，使用接受基团(例如，核酸捕获探针)将免疫复合物捕获至固体表面上，这通过仅将一部分由此所产生的免疫复合物选择性捕获至所述表面，提供了减少高丰度分析物的信号的难得机会。
例如，在一些实施方式中，所述结合剂可以以已知比例与或不与它们的递呈基团(例如，核酸标签)缀合。例如，如果将与递呈基团缀合的结合剂与无递呈基团的相同结合剂以1％的浓度混合，则仅可以将1％的免疫复合物捕获至所述表面并且所述报告分子与靶标分析物之比将为1％。还可以使用无功能递呈基团，即不结合接受基团的递呈基团。例如，如果仅0.1％的第一结合剂缀合至功能性第一递呈基团(例如，所述第一标签)，并且其余99.9％的所述第一结合剂缀合至可以不被所述第一接受基团(例如，所述第一探针)捕获的第一递呈基团(例如，所述第一标签)，则所述报告分子与免疫复合物之比将为1:1000，从而将通过该分析物所产生的信号有效降低1000倍。
可以使用这种部分捕获的替代方法，其引入了无功能接受基团(例如，核酸捕获探针)的已知部分。在图6B和6C所示的间接捕获方法中，例如，可以包括特定比例的不具有与通用捕获探针互补的节段(图6B)或未生物素化(图6C)的第一捕获探针。因此，无法将相同比例的免疫复合物捕获在表面上并因此无法产生用于检测的核酸报告分子。例如，如果所述接受基团仅含有0.1％的可以偶联至所述固体表面的功能性分子(其余99.9％是无功能的假分子)，则所述报告分子与免疫复合物之比也将为1:1000，从而将通过该分析物所产生的信号减少1000倍。
因此，本文还提供了测定方法，其包括通过在步骤(1)中向所述溶液添加无功能结合剂来按比例降低通过所述测定所检测的分析物的量，其中所述无功能结合剂与所述第一结合剂竞争对所述分析物的结合，但是所述无功能结合剂未缀合或缀合至不结合所述第一接受基团的递呈基团。在一些实施方式中，所述无功能结合剂是未缀合的。在一些实施方式中，所述无功能结合剂缀合至不结合所述第一接受基团的递呈基团。在一些实施方式中，所述无功能结合剂缀合至不可以与偶联至所述第一固体表面的第一探针杂交的核酸标签。
因此，本文还提供了测定方法，其包括通过在步骤(1)中向所述溶液添加无功能接受剂来按比例降低通过所述测定所检测的分析物的量，其中所述无功能接受剂与所述第一接收基团竞争对所述第一递呈基团的结合，但是所述无功能接受剂不可以与所述第一固体表面偶联。
在一些实施方式中，本文还提供了测定方法，其包括通过在步骤(1)中向所述溶液添加无功能结合剂来按比例降低通过所述测定所检测的分析物的量，其中所述无功能结合剂与所述第一结合剂或所述第二结合剂竞争对所述分析物的结合，但是所述无功能结合剂形成了不可以检测的免疫复合物。在一些实施方式中，本文所提供的测定方法通过检测缀合至所述第一结合剂或所述第二结合剂的可检测标志物来检测所述免疫复合物，并且所述无功能结合剂未缀合至所述可检测标志物，或者缀合至不可以产生用于检测的信号的缺陷性可检测标志物。在一些实施方式中，通过所述核酸报告分子检测所述免疫复合物，并且所述无功能结合剂可以缀合至缺少用于产生所述核酸报告分子的正确节段的核酸标签。本领域的常规技术人员将理解可以采用作为本文所公开的方法的变化形式的不同方法来按比例降低通过所述样品中高丰度分析物所产生的信号，因此允许同时检测可以以相差几个数量级的浓度存在的多个分析物。
除NGS之外，多种其它单分子检测技术，如数字PCR、SIMOA对可以在单次运行中通过所述系统读取的靶标分子总数(仪器带宽)具有限制。准确控制报告分子/免疫复合物之比的上述方法可以适用于所有这些技术以最大程度有效使用系统资源。
5.2.6使用靶标ID和/或样品ID的测定方法
在一个方面，本文提供了用于检测样品中分析物的测定方法，其包括：
(1)将包含第一结合剂和第一递呈基团的第一结合部分、包含第二结合剂的第二结合部分和样品在溶液中混合，其中：
(i)所述第一和第二结合剂结合至分析物并形成免疫复合物，
(ii)通过第一递呈基团和偶联至第一固体表面的第一接受基团之间的结合，将所述免疫复合物捕获至与溶液接触的第一固体表面上，并且
(iii)所述第一结合部分还包含第一靶标标记并且所述第二结合部分还包含第二靶标标记；
(2)清洗所述第一固体表面以除去未结合的分子；
(3)基于所述第一靶标标记和所述第二靶标标记之间的邻近性，从所述免疫复合物产生报告分子；且
(4)检测所述报告分子，借此检测所述分析物。
如第5.1节中所述，靶标标记可以提供可以与特定靶标相关联的识别符以帮助检测和鉴定靶标分子。照此，在本文所提供的方法，包括本节(第5.2.6节)和前段中的那些方法的一些实施方式中，每个靶标标记可以包含一个或多个靶标ID。在一个具体的实施方式中，所述第一靶标标记包含第一靶标ID。在另一个实施方式中，所述第二靶标标记包含第二靶标ID。在另一个实施方式中，所述第一靶标标记包含第一靶标ID，并且所述第二靶标标记包含第二靶标ID。
如以上第5.2.4节中进一步描述的，在本文所提供的方法，包括本节(第5.2.6节)的那些方法的一些实施方式中，可以基于所述第一靶标标记和所述第二靶标标记之间的邻近性产生所述报告分子。因此，在一个实施方式中，所述报告分子包含所述第一靶标ID。在另一个实施方式中，所述报告分子包含所述第二靶标ID。在另一个实施方式中，所述报告分子包含所述第一靶标ID和所述第二靶标ID。在其它实施方式中，所述报告分子包含所述第一靶标ID和所述第二靶标ID。在一个实施方式中，所述报告分子包含所述第一靶标ID和所述样品ID。在另一个实施方式中，所述报告分子包含所述第二靶标ID和所述样品ID。在其它实施方式中，所述报告分子包含所述第一靶标ID、所述第二靶标ID和所述样品ID。
在一个方面，本文提供了用于检测样品中分析物的测定方法，其包括：
(1)将包含第一结合剂和第一递呈基团的第一结合部分、包含第二结合剂的第二结合部分和样品在溶液中混合，其中：
(i)所述第一和第二结合剂结合至分析物并形成免疫复合物，
(ii)通过第一递呈基团和偶联至第一固体表面的第一接受基团之间的结合，将所述免疫复合物捕获至与溶液接触的第一固体表面上，并且
(iii)所述第一结合部分还包含第一靶标标记，所述第一靶标标记包含分析物特异的(“靶标ID”)第一标识码(“ID”)，并且所述第二结合部分还包含第二靶标标记，所述第二靶标标记包含第二靶标ID；
(2)清洗所述第一固体表面以除去未结合的分子；
(3)从所述免疫复合物产生报告分子，其中所述报告分子包含(i)所述第一靶标ID、(ii)所述第二靶标ID或者(iii)所述第一和所述第二靶标ID两者；和
(4)检测所述报告分子，借此检测所述分析物。
尤其如根据第5.2.4.1节和图3A-3C中的描述所清楚地，在本文所提供的方法的多个实施方式中，可以基于与结合剂和分析物两者之间的结合特异性相关的免疫复合物的性质产生所述报告分子。在本文，包括在第5.2.6节中所提供的方法的一个实施方式中，基于所述第一靶标标记和所述第二靶标标记之间的邻近性产生所述报告分子。在另一个实施方式中，基于所述第一靶标ID和所述第二靶标ID之间的邻近性产生所述报告分子。在另一个实施方式中，基于所述第一结合剂和所述第二结合剂之间的邻近性产生所述报告分子。
在一个方面，本文提供了用于检测样品中分析物的测定方法，其包括：
(1)将包含第一结合剂的第一结合部分、包含第二结合剂的第二结合部分和样品在溶液中混合，其中：
(i)所述第一和第二结合剂结合至所述分析物并形成免疫复合物；和
(ii)所述第一结合部分还包含第一靶标标记，所述第一靶标标记包含分析物特异的(“靶标ID”)第一标识码(“ID”)，并且所述第二结合部分还包含第二靶标标记，所述第二靶标标记包含第二靶标ID；
(2)从所述免疫复合物产生报告分子，其中基于所述第一靶标标记和所述第二靶标标记之间的邻近性产生所述报告分子，并且其中所述报告分子包含(i)所述第一靶标ID、(ii)所述第二靶标ID或者(iii)所述第一和所述第二靶标ID两者；和
(3)检测所述报告分子，借此检测所述分析物。
如第5.2.4节和图8F所公开的，在本文所提供的方法，包括本节(第5.2.6节)的那些方法的一些实施方式中，所述报告分子是非核酸报告分子。在其它实施方式中，所述报告分子是核酸报告分子。照此，在一个具体实施方式中，本文所提供的方法包括：
(1)将包含第一结合剂和第一递呈基团的第一结合部分、包含第二结合剂的第二结合部分和样品在溶液中混合，其中：
(i)所述第一和第二结合剂结合至分析物并形成免疫复合物，
(ii)通过第一递呈基团和偶联至第一固体表面的第一接受基团之间的结合，将所述免疫复合物捕获至与溶液接触的第一固体表面上，并且
(iii)所述第一结合部分还包含第一靶标标记并且所述第二结合部分还包含第二靶标标记；
(2)清洗所述第一固体表面以除去未结合的分子；
(3)基于所述第一靶标标记和所述第二靶标标记之间的邻近性，从所述免疫复合物产生核酸报告分子；且
(4)检测所述报告分子，借此检测所述分析物。
在另一个具体的实施方式中，本文所提供的方法包括：
(1)将包含第一结合剂和第一递呈基团的第一结合部分、包含第二结合剂的第二结合部分和样品在溶液中混合，其中：
(i)所述第一和第二结合剂结合至分析物并形成免疫复合物，
(ii)通过第一递呈基团和偶联至第一固体表面的第一接受基团之间的结合，将所述免疫复合物捕获至与溶液接触的第一固体表面上，并且
(iii)所述第一结合部分还包含第一靶标标记，所述第一靶标标记包含分析物特异的(“靶标ID”)第一标识码(“ID”)，并且所述第二结合部分还包含第二靶标标记，所述第二靶标标记包含第二靶标ID；
(2)清洗所述第一固体表面以除去未结合的分子；
(3)从所述免疫复合物产生核酸报告分子，其中所述核酸报告分子包含(i)所述第一靶标ID、(ii)所述第二靶标ID或者(iii)所述第一和所述第二靶标ID两者；和
(4)检测所述报告分子，借此检测所述分析物。
另外，如以上第5.2.1.1节中所述，可以从所述第一表面释放所述免疫复合物并且在所述第二表面中重新捕获以进一步提供信噪比。因此，在一个实施方式中，本文所提供的方法包括：
(1)将包含第一结合剂和第一递呈基团的第一结合部分、包含第二结合剂的第二结合部分和样品在溶液中混合，其中：
(i)所述第一和第二结合剂结合至分析物并形成免疫复合物，
(ii)通过第一递呈基团和偶联至第一固体表面的第一接受基团之间的结合，将所述免疫复合物捕获至与溶液接触的第一固体表面上，并且
(iii)所述第一结合部分还包含第一靶标标记并且所述第二结合部分还包含第二靶标标记；
(2)清洗所述第一固体表面以除去未结合的分子；
(2a)通过破坏所述第一递呈基团和所述第一接受基团之间的结合从所述第一固体表面释放所述免疫复合物；
(3)基于所述第一靶标标记和所述第二靶标标记之间的邻近性，从所述免疫复合物产生报告分子；且
(4)检测所述报告分子，借此检测所述分析物。
在另一个实施方式中，本文所提供的方法包括：
(1)将包含第一结合剂和第一递呈基团的第一结合部分、包含第二结合剂的第二结合部分和样品在溶液中混合，其中：
(i)所述第一和第二结合剂结合至分析物并形成免疫复合物，
(ii)通过第一递呈基团和偶联至第一固体表面的第一接受基团之间的结合，将所述免疫复合物捕获至与溶液接触的第一固体表面上，并且
(iii)所述第一结合部分还包含第一靶标标记并且所述第二结合部分还包含第二靶标标记；
(2)清洗所述第一固体表面以除去未结合的分子；
(3)通过破坏所述第一递呈基团和所述第一接受基团之间的结合从所述第一固体表面释放所述免疫复合物，从而基于所述第一靶标标记和所述第二靶标标记之间的邻近性从所述免疫复合物同时产生报告分子；和
(4)检测所述报告分子，借此检测所述分析物。
在另一个实施方式中，本文所提供的方法包括：
(1)将包含第一结合剂和第一递呈基团的第一结合部分、包含第二结合剂的第二结合部分和样品在溶液中混合，其中：
(i)所述第一和第二结合剂结合至分析物并形成免疫复合物，
(ii)通过第一递呈基团和偶联至第一固体表面的第一接受基团之间的结合，将所述免疫复合物捕获至与溶液接触的第一固体表面上，并且
(iii)所述第一结合部分还包含第一靶标标记并且所述第二结合部分还包含第二靶标标记；
(2)清洗所述第一固体表面以除去未结合的分子；
(3)基于所述第一靶标标记和所述第二靶标标记之间的邻近性，从所述免疫复合物产生报告分子；且
(3a)通过破坏所述第一递呈基团和所述第一接受基团之间的结合从所述第一固体表面释放所述免疫复合物；和
(4)检测所述报告分子，借此检测所述分析物。
在另一个实施方式中，本文所提供的方法包括：
(1)将包含第一结合剂和第一递呈基团的第一结合部分、包含第二结合剂的第二结合部分和样品在溶液中混合，其中：
(i)所述第一和第二结合剂结合至分析物并形成免疫复合物，
(ii)通过第一递呈基团和偶联至第一固体表面的第一接受基团之间的结合，将所述免疫复合物捕获至与溶液接触的第一固体表面上，并且
(iii)所述第一结合部分还包含第一靶标标记，所述第一靶标标记包含分析物特异的(“靶标ID”)第一标识码(“ID”)，并且所述第二结合部分还包含第二靶标标记，所述第二靶标标记包含第二靶标ID；
(2)清洗所述第一固体表面以除去未结合的分子；
(2a)通过破坏所述第一递呈基团和所述第一接受基团之间的结合从所述第一固体表面释放所述免疫复合物；
(3)从所述免疫复合物产生报告分子，其中所述报告分子包含(i)所述第一靶标ID、(ii)所述第二靶标ID或者(iii)所述第一和所述第二靶标ID两者；和
(4)检测所述报告分子，借此检测所述分析物。
在另一个实施方式中，本文所提供的方法包括：
(1)将包含第一结合剂和第一递呈基团的第一结合部分、包含第二结合剂的第二结合部分和样品在溶液中混合，其中：
(i)所述第一和第二结合剂结合至分析物并形成免疫复合物，
(ii)通过第一递呈基团和偶联至第一固体表面的第一接受基团之间的结合，将所述免疫复合物捕获至与溶液接触的第一固体表面上，并且
(iii)所述第一结合部分还包含第一靶标标记，所述第一靶标标记包含分析物特异的(“靶标ID”)第一标识码(“ID”)，并且所述第二结合部分还包含第二靶标标记，所述第二靶标标记包含第二靶标ID；
(2)清洗所述第一固体表面以除去未结合的分子；
(3)通过破坏所述第一递呈基团和所述第一接受基团之间的结合从所述第一固体表面释放所述免疫复合物，并且同时从所述免疫复合物产生报告分子，其中所述报告分子包含(i)所述第一靶标ID、(ii)所述第二靶标ID或者(iii)所述第一和所述第二靶标ID两者；和
(4)检测所述报告分子，借此检测所述分析物。
在其它实施方式中，本文所提供的方法包括：
(1)将包含第一结合剂和第一递呈基团的第一结合部分、包含第二结合剂的第二结合部分和样品在溶液中混合，其中：
(i)所述第一和第二结合剂结合至分析物并形成免疫复合物，
(ii)通过第一递呈基团和偶联至第一固体表面的第一接受基团之间的结合，将所述免疫复合物捕获至与溶液接触的第一固体表面上，并且
(iii)所述第一结合部分还包含第一靶标标记，所述第一靶标标记包含分析物特异的(“靶标ID”)第一标识码(“ID”)，并且所述第二结合部分还包含第二靶标标记，所述第二靶标标记包含第二靶标ID；
(2)清洗所述第一固体表面以除去未结合的分子；
(3)从所述免疫复合物产生报告分子，其中所述报告分子包含(i)所述第一靶标ID、(ii)所述第二靶标ID或者(iii)所述第一和所述第二靶标ID两者；
(3a)通过破坏所述第一递呈基团和所述第一接受基团之间的结合从所述第一固体表面释放所述免疫复合物；和
(4)检测所述报告分子，借此检测所述分析物。
另外，如以上第5.2.1.1节中所述，可以从所述第一表面释放所述免疫复合物并且在所述第二表面中重新捕获以进一步提供信噪比。图21A-21F显示了包括这种双捕获的测定方法的示例性示意图。因此，在本文所提供的方法的一个实施方式中，所述第二结合部分还包含第二递呈基团。在另一个实施方式中，所述方法还在步骤2(a)和步骤(3)之间包括步骤2(b)：(2b)引入第二固体表面并通过第二递呈基团和偶联至所述第二固体表面的第二接受基团之间的结合将所述免疫复合物重新捕获至所述第二固体表面上。照此，在一些实施方式中，本文所提供的方法包括：
(1)将包含第一结合剂和第一递呈基团的第一结合部分、包含第二结合剂的第二结合部分和样品在溶液中混合，其中：
(i)所述第一和第二结合剂结合至分析物并形成免疫复合物，
(ii)通过第一递呈基团和偶联至第一固体表面的第一接受基团之间的结合，将所述免疫复合物捕获至与溶液接触的第一固体表面上，并且
(iii)所述第一结合部分还包含第一靶标标记并且所述第二结合部分还包含第二靶标标记；
(2)清洗所述第一固体表面以除去未结合的分子；
(2a)通过破坏所述第一递呈基团和所述第一接受基团之间的结合从所述第一固体表面释放所述免疫复合物；
(2b)引入第二固体表面并通过所述第二递呈基团和偶联至所述第二固体表面的所述第二接受基团之间的结合将所述免疫复合物重新捕获至所述第二固体表面上；
(3)基于所述第一靶标标记和所述第二靶标标记之间的邻近性，从所述免疫复合物产生报告分子；且
(4)检测所述报告分子，借此检测所述分析物。
在其它实施方式中，本文所提供的方法包括：
(1)将包含第一结合剂和第一递呈基团的第一结合部分、包含第二结合剂的第二结合部分和样品在溶液中混合，其中：
(i)所述第一和第二结合剂结合至分析物并形成免疫复合物，
(ii)通过第一递呈基团和偶联至第一固体表面的第一接受基团之间的结合，将所述免疫复合物捕获至与溶液接触的第一固体表面上，并且
(iii)所述第一结合部分还包含第一靶标标记，所述第一靶标标记包含分析物特异的(“靶标ID”)第一标识码(“ID”)，并且所述第二结合部分还包含第二靶标标记，所述第二靶标标记包含第二靶标ID；
(2)清洗所述第一固体表面以除去未结合的分子；
(2a)通过破坏所述第一递呈基团和所述第一接受基团之间的结合从所述第一固体表面释放所述免疫复合物；
(2b)引入第二固体表面并通过所述第二递呈基团和偶联至所述第二固体表面的所述第二接受基团之间的结合将所述免疫复合物重新捕获至所述第二固体表面上；
(3)从所述免疫复合物产生报告分子，其中所述报告分子包含(i)所述第一靶标ID、(ii)所述第二靶标ID或者(iii)所述第一和所述第二靶标ID两者；和
(4)检测所述报告分子，借此检测所述分析物。
另外，本文所提供的方法还在步骤2(b)和步骤(3)之间包括步骤2(c)：(2)清洗所述第二固体表面以除去未结合的分子。照此，在一些实施方式中，本文所提供的方法包括：
(1)将包含第一结合剂和第一递呈基团的第一结合部分、包含第二结合剂的第二结合部分和样品在溶液中混合，其中：
(i)所述第一和第二结合剂结合至分析物并形成免疫复合物，
(ii)通过第一递呈基团和偶联至第一固体表面的第一接受基团之间的结合，将所述免疫复合物捕获至与溶液接触的第一固体表面上，并且
(iii)所述第一结合部分还包含第一靶标标记并且所述第二结合部分还包含第二靶标标记；
(2)清洗所述第一固体表面以除去未结合的分子；
(2a)通过破坏所述第一递呈基团和所述第一接受基团之间的结合从所述第一固体表面释放所述免疫复合物；
(2b)引入第二固体表面并通过所述第二递呈基团和偶联至所述第二固体表面的所述第二接受基团之间的结合将所述免疫复合物重新捕获至所述第二固体表面上；
(2c)清洗所述第二固体表面以除去未结合的分子；
(3)基于所述第一靶标标记和所述第二靶标标记之间的邻近性，从所述免疫复合物产生报告分子；且
(4)检测所述报告分子，借此检测所述分析物。
在其它实施方式中，本文所提供的方法包括：
(1)将包含第一结合剂和第一递呈基团的第一结合部分、包含第二结合剂的第二结合部分和样品在溶液中混合，其中：
(i)所述第一和第二结合剂结合至分析物并形成免疫复合物，
(ii)通过第一递呈基团和偶联至第一固体表面的第一接受基团之间的结合，将所述免疫复合物捕获至与溶液接触的第一固体表面上，并且
(iii)所述第一结合部分还包含第一靶标标记，所述第一靶标标记包含分析物特异的(“靶标ID”)第一标识码(“ID”)，并且所述第二结合部分还包含第二靶标标记，所述第二靶标标记包含第二靶标ID；
(2)清洗所述第一固体表面以除去未结合的分子；
(2a)通过破坏所述第一递呈基团和所述第一接受基团之间的结合从所述第一固体表面释放所述免疫复合物；
(2b)引入第二固体表面并通过所述第二递呈基团和偶联至所述第二固体表面的所述第二接受基团之间的结合将所述免疫复合物重新捕获至所述第二固体表面上；
(2c)清洗所述第二固体表面以除去未结合的分子；
(3)从所述免疫复合物产生报告分子，其中所述报告分子包含(i)所述第一靶标ID、(ii)所述第二靶标ID或者(iii)所述第一和所述第二靶标ID两者；和
(4)检测所述报告分子，借此检测所述分析物。
另外，本文所提供的方法还包括步骤2(d)：通过破坏所述第二递呈基团和所述第二接受基团之间的结合从所述第二固体表面释放所述免疫复合物。照此，在一些实施方式中，本文所提供的方法包括：
(1)将包含第一结合剂和第一递呈基团的第一结合部分、包含第二结合剂的第二结合部分和样品在溶液中混合，其中：
(i)所述第一和第二结合剂结合至分析物并形成免疫复合物，
(ii)通过第一递呈基团和偶联至第一固体表面的第一接受基团之间的结合，将所述免疫复合物捕获至与溶液接触的第一固体表面上，并且
(iii)所述第一结合部分还包含第一靶标标记并且所述第二结合部分还包含第二靶标标记；
(2)清洗所述第一固体表面以除去未结合的分子；
(2a)通过破坏所述第一递呈基团和所述第一接受基团之间的结合从所述第一固体表面释放所述免疫复合物；
(2b)引入第二固体表面并通过所述第二递呈基团和偶联至所述第二固体表面的所述第二接受基团之间的结合将所述免疫复合物重新捕获至所述第二固体表面上；
(2c)清洗所述第二固体表面以除去未结合的分子；
(2d)通过破坏所述第二递呈基团和所述第二接受基团之间的结合从所述第二固体表面释放所述免疫复合物；
(3)基于所述第一靶标标记和所述第二靶标标记之间的邻近性，从所述免疫复合物产生报告分子；且
(4)检测所述报告分子，借此检测所述分析物。
在其它实施方式中，本文所提供的方法包括：
(1)将包含第一结合剂和第一递呈基团的第一结合部分、包含第二结合剂的第二结合部分和样品在溶液中混合，其中：
(i)所述第一和第二结合剂结合至分析物并形成免疫复合物，
(ii)通过第一递呈基团和偶联至第一固体表面的第一接受基团之间的结合，将所述免疫复合物捕获至与溶液接触的第一固体表面上，并且
(iii)所述第一结合部分还包含第一靶标标记，所述第一靶标标记包含分析物特异的(“靶标ID”)第一标识码(“ID”)，并且所述第二结合部分还包含第二靶标标记，所述第二靶标标记包含第二靶标ID；
(2)清洗所述第一固体表面以除去未结合的分子；
(2a)通过破坏所述第一递呈基团和所述第一接受基团之间的结合从所述第一固体表面释放所述免疫复合物；
(2b)引入第二固体表面并通过所述第二递呈基团和偶联至所述第二固体表面的所述第二接受基团之间的结合将所述免疫复合物重新捕获至所述第二固体表面上；
(2c)清洗所述第二固体表面以除去未结合的分子；
(2d)通过破坏所述第二递呈基团和所述第二接受基团之间的结合从所述第二固体表面释放所述免疫复合物；
(3)从所述免疫复合物产生报告分子，其中所述报告分子包含(i)所述第一靶标ID、(ii)所述第二靶标ID或者(iii)所述第一和所述第二靶标ID两者；和
(4)检测所述报告分子，借此检测所述分析物。
在其它实施方式中，本文所提供的方法包括：
(1)将包含第一结合剂和第一递呈基团的第一结合部分、包含第二结合剂的第二结合部分和样品在溶液中混合，其中：
(i)所述第一和第二结合剂结合至分析物并形成免疫复合物，
(ii)通过第一递呈基团和偶联至第一固体表面的第一接受基团之间的结合，将所述免疫复合物捕获至与溶液接触的第一固体表面上，并且
(iii)所述第一结合部分还包含第一靶标标记并且所述第二结合部分还包含第二靶标标记；
(2)清洗所述第一固体表面以除去未结合的分子；
(2a)通过破坏所述第一递呈基团和所述第一接受基团之间的结合从所述第一固体表面释放所述免疫复合物；
(2b)引入第二固体表面并通过所述第二递呈基团和偶联至所述第二固体表面的所述第二接受基团之间的结合将所述免疫复合物重新捕获至所述第二固体表面上；
(2c)清洗所述第二固体表面以除去未结合的分子；
(3)通过破坏所述第二递呈基团和所述第二接受基团之间的结合从所述第二固体表面释放所述免疫复合物，并且基于所述第一靶标标记和所述第二靶标标记之间的邻近性从所述免疫复合物产生报告分子；和
(4)检测所述报告分子，借此检测所述分析物。
在其它实施方式中，本文所提供的方法包括：
(1)将包含第一结合剂和第一递呈基团的第一结合部分、包含第二结合剂的第二结合部分和样品在溶液中混合，其中：
(i)所述第一和第二结合剂结合至分析物并形成免疫复合物，
(ii)通过第一递呈基团和偶联至第一固体表面的第一接受基团之间的结合，将所述免疫复合物捕获至与溶液接触的第一固体表面上，并且
(iii)所述第一结合部分还包含第一靶标标记，所述第一靶标标记包含分析物特异的(“靶标ID”)第一标识码(“ID”)，并且所述第二结合部分还包含第二靶标标记，所述第二靶标标记包含第二靶标ID；
(2)清洗所述第一固体表面以除去未结合的分子；
(2a)通过破坏所述第一递呈基团和所述第一接受基团之间的结合从所述第一固体表面释放所述免疫复合物；
(2b)引入第二固体表面并通过所述第二递呈基团和偶联至所述第二固体表面的所述第二接受基团之间的结合将所述免疫复合物重新捕获至所述第二固体表面上；
(2c)清洗所述第二固体表面以除去未结合的分子；
(3)通过破坏所述第二递呈基团和所述第二接受基团之间的结合从所述第二固体表面释放所述免疫复合物，并且从所述免疫复合物产生报告分子，其中所述报告分子包含(i)所述第一靶标ID、(ii)所述第二靶标ID或者(iii)所述第一和所述第二靶标ID两者；和
(4)检测所述报告分子，借此检测所述分析物。
照此，在一些实施方式中，本文所提供的方法包括：
(1)将包含第一结合剂和第一递呈基团的第一结合部分、包含第二结合剂的第二结合部分和样品在溶液中混合，其中：
(i)所述第一和第二结合剂结合至分析物并形成免疫复合物，
(ii)通过第一递呈基团和偶联至第一固体表面的第一接受基团之间的结合，将所述免疫复合物捕获至与溶液接触的第一固体表面上，并且
(iii)所述第一结合部分还包含第一靶标标记并且所述第二结合部分还包含第二靶标标记；
(2)清洗所述第一固体表面以除去未结合的分子；
(2a)通过破坏所述第一递呈基团和所述第一接受基团之间的结合从所述第一固体表面释放所述免疫复合物；
(2b)引入第二固体表面并通过所述第二递呈基团和偶联至所述第二固体表面的所述第二接受基团之间的结合将所述免疫复合物重新捕获至所述第二固体表面上；
(2c)清洗所述第二固体表面以除去未结合的分子；
(3)基于所述第一靶标标记和所述第二靶标标记之间的邻近性，从所述免疫复合物产生报告分子；
(4)通过破坏所述第二递呈基团和所述第二接受基团之间的结合从所述第二固体表面释放所述免疫复合物；和
(5)检测所述报告分子，借此检测所述分析物。
在其它实施方式中，本文所提供的方法包括：
(1)将包含第一结合剂和第一递呈基团的第一结合部分、包含第二结合剂的第二结合部分和样品在溶液中混合，其中：
(i)所述第一和第二结合剂结合至分析物并形成免疫复合物，
(ii)通过第一递呈基团和偶联至第一固体表面的第一接受基团之间的结合，将所述免疫复合物捕获至与溶液接触的第一固体表面上，并且
(iii)所述第一结合部分还包含第一靶标标记，所述第一靶标标记包含分析物特异的(“靶标ID”)第一标识码(“ID”)，并且所述第二结合部分还包含第二靶标标记，所述第二靶标标记包含第二靶标ID；
(2)清洗所述第一固体表面以除去未结合的分子；
(2a)通过破坏所述第一递呈基团和所述第一接受基团之间的结合从所述第一固体表面释放所述免疫复合物；
(2b)引入第二固体表面并通过所述第二递呈基团和偶联至所述第二固体表面的所述第二接受基团之间的结合将所述免疫复合物重新捕获至所述第二固体表面上；
(2c)清洗所述第二固体表面以除去未结合的分子；
(3)从所述免疫复合物产生报告分子，其中所述报告分子包含(i)所述第一靶标ID、(ii)所述第二靶标ID或者(iii)所述第一和所述第二靶标ID两者；和
(4)通过破坏所述第二递呈基团和所述第二接受基团之间的结合从所述第二固体表面释放所述免疫复合物；和
(5)检测所述报告分子，借此检测所述分析物。
在一个方面，本文提供了用于检测样品中分析物的测定方法，其包括：
(1)将包含第一结合剂和第一递呈基团的第一结合部分、包含第二结合剂的第二结合部分和样品在溶液中混合，其中：
(i)所述第一和第二结合剂结合所述分析物上的非干扰表位并形成免疫复合物，
(ii)通过第一递呈基团和偶联至第一固体表面的第一接受基团之间的结合，将所述免疫复合物捕获至与溶液接触的第一固体表面上，并且
(iii)所述第一结合部分还包含第一靶标标记，所述第一靶标标记包含分析物特异的(“靶标ID”)第一标识码(“ID”)，并且所述第二结合部分还包含第二靶标标记，所述第二靶标标记包含第二靶标ID；
(2)清洗所述第一固体表面以除去未结合的分子；
(3)产生核酸报告分子，其包含所述第一靶标ID和所述第二靶标ID；和
(4)检测所述核酸报告分子，借此检测所述分析物。
如以上第5.2.1.1和5.2.1.2节所述，可以检测所述免疫复合物并且在固体表面上或者在从固体表面释放之后产生所述核酸报告分子。图20A-20D提供了在从固体表面释放后产生核酸报告分子的示例性示意图(如图20B-20C中的第一表面所指明的)并且图20E提供了显示来自该示例性捕获和释放测定的确实数据，其中通过经由如在所述核酸报告分子中所产生的靶标标记中的靶标ID所确定的信号检测所述分析物。照此，在一个实施方式中，本文所提供的方法还在步骤(2)和(3)之间包括步骤(2a)：通过破坏所述第一递呈基团和所述第一接受基团之间的结合从所述第一固体表面释放所述免疫复合物；在一个具体实施方式中，本文所提供的方法包括：
(1)将包含第一结合剂和第一递呈基团的第一结合部分、包含第二结合剂的第二结合部分和样品在溶液中混合，其中：
(i)所述第一和第二结合剂结合所述分析物上的非干扰表位并形成免疫复合物，
(ii)通过第一递呈基团和偶联至第一固体表面的第一接受基团之间的结合，将所述免疫复合物捕获至与溶液接触的第一固体表面上，并且
(iii)所述第一结合部分还包含第一靶标标记，所述第一靶标标记包含分析物特异的(“靶标ID”)第一标识码(“ID”)，并且所述第二结合部分还包含第二靶标标记，所述第二靶标标记包含第二靶标ID；
(2)清洗所述第一固体表面以除去未结合的分子；
(2a)通过破坏所述第一递呈基团和所述第一接受基团之间的结合从所述第一固体表面释放所述免疫复合物；
(3)产生核酸报告分子，其包含所述第一靶标ID和所述第二靶标ID；和
(4)检测所述核酸报告分子，借此检测所述分析物。
另外，如以上第5.2.1.1节中所述，可以从所述第一表面释放所述免疫复合物并且在所述第二表面中重新捕获以进一步提供信噪比。图21A-21F显示了包括这种双捕获的测定方法的示例性示意图。因此，在本文所提供的方法的一个实施方式中，所述第二结合部分还包含第二递呈基团。在另一个实施方式中，所述方法还在步骤2(a)和步骤(3)之间包括步骤2(b)和步骤2(c)：(2b)引入第二固体表面并通过所述第二递呈基团和偶联至所述第二固体表面的所述第二接受基团之间的结合将所述免疫复合物重新捕获至所述第二固体表面上；和(2c)清洗所述第二固体表面以除去未结合的分子。照此，在一些实施方式中，本文所提供的方法包括：
(1)将包含第一结合剂和第一递呈基团的第一结合部分、包含第二结合剂和第二递呈基团的第二结合部分和样品在溶液中混合，其中：
(i)所述第一和第二结合剂结合所述分析物上的非干扰表位并形成免疫复合物，
(ii)通过第一递呈基团和偶联至第一固体表面的第一接受基团之间的结合，将所述免疫复合物捕获至与溶液接触的第一固体表面上，并且
(iii)所述第一结合部分还包含第一靶标标记，所述第一靶标标记包含分析物特异的(“靶标ID”)第一标识码(“ID”)，并且所述第二结合部分还包含第二靶标标记，所述第二靶标标记包含第二靶标ID；
(2)清洗所述第一固体表面以除去未结合的分子；
(2a)通过破坏所述第一递呈基团和所述第一接受基团之间的结合从所述第一固体表面释放所述免疫复合物；
(2b)引入第二固体表面并通过所述第二递呈基团和偶联至所述第二固体表面的所述第二接受基团之间的结合将所述免疫复合物重新捕获至所述第二固体表面上；
(2c)清洗所述第二固体表面以除去未结合的分子；
(3)产生核酸报告分子，其包含所述第一靶标ID和所述第二靶标ID；和
(4)检测所述核酸报告分子，借此检测所述分析物。
类似地，如以上在本节和在第5.2.1.1和5.2.1.2节中所述，可以检测所述免疫复合物并且在固体表面上或者在从固体表面释放之后产生所述核酸报告分子。图21G-21I提供了在捕获并从第一和第二固体表面释放之后产生核酸报告分子的示例性示意图，并且图24A-24B和25A-25C提供了显示该示例性捕获和释放测定的确实数据，其中通过经由如在所述核酸报告分子中所产生的靶标标记中的靶标ID所确定的信号检测所述分析物。因此，在一个实施方式中，本文所提供的方法还包括步骤(2d)：通过破坏所述第二递呈基团和所述第二接受基团之间的结合从所述第二固体表面释放所述免疫复合物。在一个具体实施方式中，本文所提供的方法包括：
(1)将包含第一结合剂和第一递呈基团的第一结合部分、包含第二结合剂和第二递呈基团的第二结合部分和样品在溶液中混合，其中：
(i)所述第一和第二结合剂结合所述分析物上的非干扰表位并形成免疫复合物，
(ii)通过第一递呈基团和偶联至第一固体表面的第一接受基团之间的结合，将所述免疫复合物捕获至与溶液接触的第一固体表面上，并且
(iii)所述第一结合部分还包含第一靶标标记，所述第一靶标标记包含分析物特异的(“靶标ID”)第一标识码(“ID”)，并且所述第二结合部分还包含第二靶标标记，所述第二靶标标记包含第二靶标ID；
(2)清洗所述第一固体表面以除去未结合的分子；
(2a)通过破坏所述第一递呈基团和所述第一接受基团之间的结合从所述第一固体表面释放所述免疫复合物；
(2b)引入第二固体表面并通过所述第二递呈基团和偶联至所述第二固体表面的所述第二接受基团之间的结合将所述免疫复合物重新捕获至所述第二固体表面上；
(2c)清洗所述第二固体表面以除去未结合的分子；
(2d)通过破坏所述第二递呈基团和所述第二接受基团之间的结合从所述第二固体表面释放所述免疫复合物；
(3)产生核酸报告分子，其包含所述第一靶标ID和所述第二靶标ID；和
(4)检测所述核酸报告分子，借此检测所述分析物。
如以上在第5.2.5节中进一步描述的，除了分析物特异的“靶标ID”之外，在本文所提供的测定方法中所产生的核酸报告分子也可以包括样品特异的“样品ID”。图22和图23A-23B提供了产生具有样品ID的核酸报告分子的示例性示意图并且图24A-24B和25A-25C提供了显示这些多重测定的确实数据，其中通过经由如所述核酸报告分子中所产生的靶标标记中的靶标ID以及样品ID所确定的信号检测所述分析物，借此经由所述样品ID解析样品并且经由所述靶标ID解析分析物。因此，在一个实施方式中，本文所提供的方法还包括步骤(2e)：将包含样品特异的ID(“样品ID”)的样品标记结合(i)至所述第一靶标标记，(ii)至所述第二靶标标记或者(iii)至所述第一靶标标记和所述第二靶标标记两者。在一个具体实施方式中，本文所提供的方法包括：
(1)将包含第一结合剂和第一递呈基团的第一结合部分、包含第二结合剂和第二递呈基团的第二结合部分和样品在溶液中混合，其中：
(i)所述第一和第二结合剂结合所述分析物上的非干扰表位并形成免疫复合物，
(ii)通过第一递呈基团和偶联至第一固体表面的第一接受基团之间的结合，将所述免疫复合物捕获至与溶液接触的第一固体表面上，并且
(iii)所述第一结合部分还包含第一靶标标记，所述第一靶标标记包含分析物特异的(“靶标ID”)第一标识码(“ID”)，并且所述第二结合部分还包含第二靶标标记，所述第二靶标标记包含第二靶标ID；
(2)清洗所述第一固体表面以除去未结合的分子；
(2a)通过破坏所述第一递呈基团和所述第一接受基团之间的结合从所述第一固体表面释放所述免疫复合物；
(2b)引入第二固体表面并通过所述第二递呈基团和偶联至所述第二固体表面的所述第二接受基团之间的结合将所述免疫复合物重新捕获至所述第二固体表面上；
(2c)清洗所述第二固体表面以除去未结合的分子；
(2d)通过破坏所述第二递呈基团和所述第二接受基团之间的结合从所述第二固体表面释放所述免疫复合物；
(2e)将包含样品特异的ID(“样品ID”)的样品标记结合(i)至所述第一靶标标记，(ii)至所述第二靶标标记或者(iii)至所述第一靶标标记和所述第二靶标标记两者；
(3)产生核酸报告分子，其包含所述第一靶标ID和所述第二靶标ID；和
(4)检测所述核酸报告分子，借此检测所述分析物。
每个结合部分可以包含一个或多个靶标标记。在一个实施方式中，所述第一结合部分包含一个靶标标记。在另一个实施方式中，所述第一结合部分包含两个靶标标记。在其它实施方式中，所述第一结合部分包含3个靶标标记。在另一个实施方式中，所述第一结合部分包含4个靶标标记。在另一个实施方式中，所述第一结合部分包含5个或更多个靶标标记。在一个实施方式中，所述第二结合部分包含一个靶标标记。在另一个实施方式中，所述第二结合部分包含2个靶标标记。在其它实施方式中，所述第二结合部分包含3个靶标标记。在另一个实施方式中，所述第二结合部分包含4个靶标标记。在另一个实施方式中，所述第二结合部分包含5个或更多个靶标标记。在一些实施方式中，所述第一结合部分和所述第二结合部分之间的靶标标记是不同的。在某些实施方式中，所述第一结合部分和所述第二结合部分之间的靶标标记是相同的。在一些其它实施方式中，所述第一结合部分内的靶标标记是不同的。在其它实施方式中，所述第一结合部分内的靶标标记是相同的。在一些其它实施方式中，所述第二结合部分内的靶标标记是不同的。在其它实施方式中，所述第二结合部分内的靶标标记是相同的。在一些实施方式中，所述第一结合部分具有如本段中所提供的任何靶标标记，并且所述第二结合部分以任意组合具有如本段中所提供的任何靶标标记。在一个具体的实施方式中，所述第一结合部分包含第一靶标标记并且所述第二结合部分包含第二靶标标记，其中所述第一靶标标记和所述第二靶标标记是不同的。在另一个具体的实施方式中，所述第一结合部分包含第一靶标标记并且所述第二结合部分包含第二靶标标记，其中所述第一靶标标记和所述第二靶标标记是相同的。
作为另外一种选择，所述两个结合部分之一可以不具有靶标标记。在本文，包括在本第5.2.6节中所提供的方法的一个实施方式中，所述第一结合部分缺少靶标标记。在另一个实施方式中，所述第二结合部分缺少靶标标记。在其它实施方式中，所述第一结合部分不包含靶标标记。在另一个实施方式中，所述第二结合部分不包含靶标标记。在一个实施方式中，所述第一结合部分不包含靶标标记，并且所述第二结合部分包含一个靶标标记。在另一个实施方式中，所述第一结合部分包含一个靶标标记，并且所述第二结合部分不包含靶标标记。在另一个实施方式中，所述第一结合部分不包含靶标标记，并且所述第二结合部分包含2、3、4、5或更多个靶标标记。在另一个实施方式中，所述第一结合部分包含2、3、4、5或更多个靶标标记，并且所述第二结合部分不包含靶标标记。在一个实施方式中，所述第一结合部分缺少靶标标记，并且所述第二结合部分包含一个靶标标记。在另一个实施方式中，所述第一结合部分包含一个靶标标记，并且所述第二结合部分缺少靶标标记。在另一个实施方式中，所述第一结合部分缺少靶标标记，并且所述第二结合部分包含2、3、4、5或更多个靶标标记。在另一个实施方式中，所述第一结合部分包含2、3、4、5或更多个靶标标记，并且所述第二结合部分缺少靶标标记。
类似地，所述两个结合部分之一可以不具有递呈基团。在本文，包括在本第5.2.6节中所提供的方法的一个实施方式中，所述第一结合部分缺少递呈基团。在另一个实施方式中，所述第二结合部分缺少递呈基团。在其它实施方式中，所述第一结合部分不包含递呈基团。在另一个实施方式中，所述第二结合部分不包含递呈基团。在一个实施方式中，所述第一结合部分不包含递呈基团，并且所述第二结合部分包含一个递呈基团。在另一个实施方式中，所述第一结合部分包含一个递呈基团，并且所述第二结合部分不包含递呈基团。在一个实施方式中，所述第一结合部分缺少递呈基团，并且所述第二结合部分包含一个递呈基团。在另一个实施方式中，所述第一结合部分包含一个递呈基团，并且所述第二结合部分缺少递呈基团。
另外，在本文所提供的方法，包括本节(第5.2.6节)和前段中的那些方法的一些实施方式中，每个靶标标记可以包含一个或多个靶标ID。在一个实施方式中，所述第一靶标标记包含第一靶标ID。在另一个实施方式中，所述第二靶标标记包含第二靶标ID。在一些实施方式中，所述第一靶标标记和所述第二靶标标记之间的靶标ID是不同的。在某些实施方式中，所述第一靶标标记和所述第二靶标标记之间的靶标ID是相同的。在一个具体的实施方式中，所述第一靶标标记包含第一靶标ID并且所述第二靶标标记包含第二靶标ID，其中所述第一靶标ID和所述第二靶标ID是不同的。在另一个具体的实施方式中，所述第一靶标标记包含第一靶标ID并且所述第二靶标标记包含第二靶标ID，其中所述第一靶标ID和所述第二靶标ID是相同的。
类似地，如以上第5.2.5节中进一步所描述的，在本文所提供的方法，包括本节(第5.2.6节)中的那些方法的一些实施方式中，每个核酸报告分子可以包含一个或多个靶标ID和/或样品ID。在一个实施方式中，在每个样品中所形成的核酸报告分子含有样品ID。在另一个实施方式中，在每个样品中所形成的核酸报告分子含有靶标ID。在其它实施方式中，在每个样品中所形成的核酸报告分子含有所述第一靶标ID。在另一个实施方式中，在每个样品中所形成的核酸报告分子含有所述第二靶标ID。
在另一个实施方式中，在每个样品中所形成的核酸报告分子含有样品ID和第一靶标ID。在一个实施方式中，在每个样品中所形成的核酸报告分子含有样品ID和第二靶标ID。在另一个实施方式中，在每个样品中所形成的核酸报告分子含有第一靶标ID和第二靶标ID。在其它实施方式中，在每个样品中所形成的核酸报告分子含有第一靶标ID和第二靶标ID，其中所述核酸报告分子缺少样品ID。在另一个实施方式中，在每个样品中所形成的核酸报告分子含有第一靶标ID、第二靶标ID和样品ID。
由于所述核酸报告分子是从由包含第一靶标标记的第一结合部分、包含第二靶标标记的第二结合部分、分析物和/或样品标记所形成的免疫复合物所产生的，因此在本文(包括在本节(第5.2.6节)中)所提供的方法中所形成的这种免疫复合物可以类似地包含一个或多个靶标ID和/或样品ID。在一个实施方式中，在每个样品中所形成的免疫复合物含有样品ID。在另一个实施方式中，在每个样品中所形成的免疫复合物含有靶标ID。在其它实施方式中，在每个样品中所形成的免疫复合物含有所述第一靶标ID。在另一个实施方式中，在每个样品中所形成的免疫复合物含有所述第二靶标ID。在另一个实施方式中，在每个样品中所形成的免疫复合物含有样品ID和第一靶标ID。在一个实施方式中，在每个样品中所形成的免疫复合物含有样品ID和第二靶标ID。在另一个实施方式中，在每个样品中所形成的免疫复合物含有第一靶标ID和第二靶标ID。在其它实施方式中，在每个样品中所形成的免疫复合物含有第一靶标ID和第二靶标ID，其中所述免疫复合物缺少样品ID。在另一个实施方式中，在每个样品中所形成的免疫复合物含有第一靶标ID、第二靶标ID和样品ID。
此外，由于样品ID包含在样品标记中并且靶标ID包含在靶标标记中，因此在本文(包括在本节(第5.2.6节)中)所提供的方法中所形成的免疫复合物可以包含一个或多个靶标标记和/或样品标记。在一个实施方式中，在每个样品中所形成的免疫复合物含有样品标记。在另一个实施方式中，在每个样品中所形成的免疫复合物含有靶标标记。在其它实施方式中，在每个样品中所形成的免疫复合物含有所述第一靶标标记。在另一个实施方式中，在每个样品中所形成的免疫复合物含有所述第二靶标标记。在另一个实施方式中，在每个样品中所形成的免疫复合物含有样品标记和第一靶标标记。在一个实施方式中，在每个样品中所形成的免疫复合物含有样品标记和第二靶标标记。在另一个实施方式中，在每个样品中所形成的免疫复合物含有第一靶标标记和第二靶标标记。在其它实施方式中，在每个样品中所形成的免疫复合物含有第一靶标标记和第二靶标标记，其中所述免疫复合物缺少样品标记。在另一个实施方式中，在每个样品中所形成的免疫复合物含有第一靶标标记、第二靶标标记和样品标记。
如第5.1节所提供的，ID包括原始ID分子和含有衍生自(但不同于)原始ID的信息的衍生ID分子，只要这些衍生分子或衍生信息可以识别特定靶标或样品或另外将特定靶标或样品与其它靶标或样品相区分并且可以与预期靶标或样品相关联。具体地，当ID是核酸码序列时，核酸ID可以包括原始核酸码序列和/或原始核酸码序列的反向互补序列两者，因为两者可以区分并与预期靶标或样品相关联。因此，在一些实施方式中，所述报告分子中的第一靶标ID包含所述第一结合部分中的第一靶标ID的原始序列或由其组成。在某些实施方式中，所述报告分子中的所述第一靶标ID包含所述第一结合部分中的所述第一靶标ID的互补序列或由其组成。在一个实施方式中，所述报告分子中的所述第二靶标ID包含所述第二结合部分中的第二靶标ID的原始序列或由其组成。在其它实施方式中，所述报告分子中的所述第二靶标ID包含所述第二结合部分中的所述第二靶标ID的互补序列或由其组成。在一个实施方式中，所述报告分子中的所述样品ID包含所述样品标记中的所述样品ID的原始序列或由其组成。在另一个实施方式中，所述报告分子中的所述样品ID包含所述样品标记中的所述样品ID的互补序列或由其组成。
在一个实施方式中，所述报告分子中的所述第一靶标ID包含所述第一结合部分中的所述第一靶标ID的原始序列或由其组成，并且所述报告分子中的所述第二靶标ID包含所述第二结合部分中的所述第二靶标ID的原始序列或由其组成。在一个实施方式中，所述报告分子中的所述第一靶标ID包含所述第一结合部分中的所述第一靶标ID的原始序列或由其组成，并且所述报告分子中的所述样品ID包含所述样品标记中的所述样品ID的原始序列或由其组成。在一个实施方式中，所述报告分子中的所述第二靶标ID包含所述第二结合部分中的所述第二靶标ID的原始序列或由其组成，并且所述报告分子中的所述样品ID包含所述样品标记中的所述样品ID的原始序列或由其组成。
在一个实施方式中，所述报告分子中的所述第一靶标ID包含所述第一结合部分中的所述第一靶标ID的互补序列或由其组成，并且所述报告分子中的所述第二靶标ID包含所述第二结合部分中的所述第二靶标ID的互补序列或由其组成。在一个实施方式中，所述报告分子中的所述第一靶标ID包含所述第一结合部分中的所述第一靶标ID的互补序列或由其组成，并且所述报告分子中的所述样品ID包含所述样品标记中的所述样品ID的互补序列或由其组成。在一个实施方式中，所述报告分子中的所述第二靶标ID包含所述第二结合部分中的所述第二靶标ID的互补序列或由其组成，并且所述报告分子中的所述样品ID包含所述样品标记中的所述样品ID的互补序列或由其组成。
在一个实施方式中，所述报告分子中的所述第一靶标ID包含所述第一结合部分中的所述第一靶标ID的原始序列或由其组成，并且所述报告分子中的所述第二靶标ID包含所述第二结合部分中的所述第二靶标ID的互补序列或由其组成。在一个实施方式中，所述报告分子中的所述第一靶标ID包含所述第一结合部分中的所述第一靶标ID的原始序列或由其组成，并且所述报告分子中的所述样品ID包含所述样品标记中的所述样品ID的互补序列或由其组成。在一个实施方式中，所述报告分子中的所述第二靶标ID包含所述第二结合部分中的所述第二靶标ID的原始序列或由其组成，并且所述报告分子中的所述样品ID包含所述样品标记中的所述样品ID的互补序列或由其组成。在一个实施方式中，所述报告分子中的所述第一靶标ID包含所述第一结合部分中的所述第一靶标ID的互补序列或由其组成，并且所述报告分子中的所述第二靶标ID包含所述第二结合部分中的所述第二靶标ID的原始序列或由其组成。在一个实施方式中，所述报告分子中的所述第一靶标ID包含所述第一结合部分中的所述第一靶标ID的互补序列或由其组成，并且所述报告分子中的所述样品ID包含所述样品标记中的所述样品ID的原始序列或由其组成。在一个实施方式中，所述报告分子中的所述第二靶标ID包含所述第二结合部分中的所述第二靶标ID的互补序列或由其组成，并且所述报告分子中的所述样品ID包含所述样品标记中的所述样品ID的原始序列或由其组成。
在一个实施方式中，所述报告分子中的所述第一靶标ID包含所述第一结合部分中的所述第一靶标ID的原始序列或由其组成，所述报告分子中的所述第二靶标ID包含所述第二结合部分中的所述第二靶标ID的原始序列或由其组成，并且所述报告分子中的所述样品ID包含所述样品标记中的所述样品ID的原始序列或由其组成。
在一个实施方式中，所述报告分子中的所述第一靶标ID包含所述第一结合部分中的所述第一靶标ID的互补序列或由其组成，所述报告分子中的所述第二靶标ID包含所述第二结合部分中的所述第二靶标ID的原始序列或由其组成，并且所述报告分子中的所述样品ID包含所述样品标记中的所述样品ID的原始序列或由其组成。在一个实施方式中，所述报告分子中的所述第一靶标ID包含所述第一结合部分中的所述第一靶标ID的原始序列或由其组成，所述报告分子中的所述第二靶标ID包含所述第二结合部分中的所述第二靶标ID的互补序列或由其组成，并且所述报告分子中的所述样品ID包含所述样品标记中的所述样品ID的原始序列或由其组成。在一个实施方式中，所述报告分子中的所述第一靶标ID包含所述第一结合部分中的所述第一靶标ID的原始序列或由其组成，所述报告分子中的所述第二靶标ID包含所述第二结合部分中的所述第二靶标ID的原始序列或由其组成，并且所述报告分子中的所述样品ID包含所述样品标记中的所述样品ID的互补序列或由其组成。
在一个实施方式中，所述报告分子中的所述第一靶标ID包含所述第一结合部分中的所述第一靶标ID的互补序列或由其组成，所述报告分子中的所述第二靶标ID包含所述第二结合部分中的所述第二靶标ID的互补序列或由其组成，并且所述报告分子中的所述样品ID包含所述样品标记中的所述样品ID的原始序列或由其组成。在一个实施方式中，所述报告分子中的所述第一靶标ID包含所述第一结合部分中的所述第一靶标ID的互补序列或由其组成，所述报告分子中的所述第二靶标ID包含所述第二结合部分中的所述第二靶标ID的原始序列或由其组成，并且所述报告分子中的所述样品ID包含所述样品标记中的所述样品ID的互补序列或由其组成。
在一个实施方式中，所述报告分子中的所述第一靶标ID包含所述第一结合部分中的所述第一靶标ID的互补序列或由其组成，所述报告分子中的所述第二靶标ID包含所述第二结合部分中的所述第二靶标ID的互补序列或由其组成，并且所述报告分子中的所述样品ID包含所述样品标记中的所述样品ID的原始序列或由其组成。在一个实施方式中，所述报告分子中的所述第一靶标ID包含所述第一结合部分中的所述第一靶标ID的原始序列或由其组成，所述报告分子中的所述第二靶标ID包含所述第二结合部分中的所述第二靶标ID的互补序列或由其组成，并且所述报告分子中的所述样品ID包含所述样品标记中的所述样品ID的互补序列或由其组成。
在一个实施方式中，所述报告分子中的所述第一靶标ID包含所述第一结合部分中的所述第一靶标ID的互补序列或由其组成，所述报告分子中的所述第二靶标ID包含所述第二结合部分中的所述第二靶标ID的原始序列或由其组成，并且所述报告分子中的所述样品ID包含所述样品标记中的所述样品ID的互补序列或由其组成。在一个实施方式中，所述报告分子中的所述第一靶标ID包含所述第一结合部分中的所述第一靶标ID的原始序列或由其组成，所述报告分子中的所述第二靶标ID包含所述第二结合部分中的所述第二靶标ID的互补序列或由其组成，并且所述报告分子中的所述样品ID包含所述样品标记中的所述样品ID的互补序列或由其组成。
在一个实施方式中，所述报告分子中的所述第一靶标ID包含所述第一结合部分中的所述第一靶标ID的互补序列或由其组成，所述报告分子中的所述第二靶标ID包含所述第二结合部分中的所述第二靶标ID的互补序列或由其组成，并且所述报告分子中的所述样品ID包含所述样品标记中的所述样品ID的互补序列或由其组成。
如根据本发明公开清楚地，在本文所提供的方法，包括在本节(第5.2.6节)中所提供的那些方法中，所述第一结合部分中的递呈基团和所述第二结合部分中的递呈基团分别可以是在本发明公开中所提供的递呈基团的任何实施方式，包括在第3、5.1、5.2.1至5.2.6、5.3.1至5.3.3和6节中所提供的那些。所述第一结合部分中的递呈基团和所述第二结合部分中的递呈基团的组合可以是在本发明公开中所提供的递呈基团，包括在第3、5.1、5.2.1至5.2.6、5.3.1至5.3.3和6节中所提供的那些递呈基团的任何实施方式。在本文所提供的方法的一个实施方式中，所述第一递呈基团是融合至所述第一结合剂的多肽。在本文所提供的方法的另一个实施方式中，所述第一递呈基团是缀合至所述第一结合剂的多核苷酸。在本文所提供的方法的另一个实施方式中，所述第一递呈基团是缀合至所述第一结合剂的化合物。在本文所提供的方法的一个实施方式中，所述第二递呈基团是融合至所述第二结合剂的多肽。在本文所提供的方法的另一个实施方式中，所述第二递呈基团是缀合至所述第二结合剂的多核苷酸。在本文所提供的方法的另一个实施方式中，所述第二递呈基团是缀合至所述第二结合剂的化合物。
在本文所提供的方法的一些实施方式中，所述第一递呈基团选自融合至所述第一结合剂的多肽、缀合至所述第一结合剂的多核苷酸或者缀合至所述第一结合剂的化合物；并且所述第二递呈基团选自融合至所述第二结合剂的多肽、缀合至所述第二结合剂的多核苷酸或者缀合至所述第二结合剂的化合物。在一个实施方式中，所述第一递呈基团是融合至所述第一结合剂的多肽，并且所述第二递呈基团是融合至所述第二结合剂的多肽。在一个实施方式中，所述第一递呈基团是融合至所述第一结合剂的多肽，并且所述第二递呈基团是缀合至所述第二结合剂的多核苷酸。在一个实施方式中，所述第一递呈基团是融合至所述第一结合剂的多肽，并且所述第二递呈基团是缀合至所述第二结合剂的化合物。在一个实施方式中，所述第一递呈基团是缀合至所述第一结合剂的多核苷酸，并且所述第二递呈基团是融合至所述第二结合剂的多肽。在一个实施方式中，所述第一递呈基团是缀合至所述第一结合剂的多核苷酸，并且所述第二递呈基团是缀合至所述第二结合剂的多核苷酸。所述第一递呈基团是缀合至所述第一结合剂的多核苷酸，并且所述第二递呈基团是缀合至所述第二结合剂的多核苷酸。在一个实施方式中，所述第一递呈基团是缀合至所述第一结合剂的多核苷酸，并且所述第二递呈基团是缀合至所述第二结合剂的化合物。在一个实施方式中，所述第一递呈基团是缀合至所述第一结合剂的化合物，并且所述第二递呈基团是融合至所述第二结合剂的多肽。在一个实施方式中，所述第一递呈基团是缀合至所述第一结合剂的化合物，并且所述第二递呈基团是缀合至所述第二结合剂的多核苷酸。在一个实施方式中，所述第一递呈基团是缀合至所述第一结合剂的化合物，并且所述第二递呈基团是缀合至所述第二结合剂的化合物。
本发明公开还提供本文，包括本第5.2.6节中所提供的方法还包括从所述免疫复合物释放所述报告分子。如根据描述，包括第6节中的描述清楚地，所述报告分子可以从所述免疫复合物释放到所述溶液中以用于检测。在一个实施方式中，本文所提供的方法包括在检测所述报告分子之前，从所述免疫复合物释放所述报告分子。在另一个实施方式中，本文所提供的方法包括在检测所述报告分子的同时，从所述免疫复合物释放所述报告分子。在另一个实施方式中，在检测所述报告分子之前，未从所述免疫复合物释放所述报告分子。在另一个实施方式中，在检测所述报告分子之后，从所述免疫复合物释放所述报告分子。
本发明公开还提供本第5.2.6节中所提供的方法的步骤(4)还包括所述核酸报告分子的PCR扩增。如根据本发明公开清楚地，这种PCR可以是本节以及其它节，如第5.2.4(包括5.2.4.1和5.2.4.2)、5.2.5和6节中所提供的任何PCR，以及本领域已知且实践的任何适合的PCR。
本发明公开还提供本第5.2.6节中所提供的方法还包括纯化所述核酸报告分子。在一些实施方式中，本文所提供的方法还包括通过选择在本领域中已知且实践的给定尺寸的核酸片段，纯化所述核酸报告分子。在一个实施方式中，本文所提供的方法还包括通过亲合纯化来纯化所述核酸报告分子。在一个实施方式中，本文所提供的方法还包括使用与所述核酸报告分子或其片段互补的核酸亲和标签，通过亲合纯化来纯化所述核酸报告分子。在一个实施方式中，本文所提供的方法还包括使用与所述核酸报告分子或其片段杂交的核酸亲和标签，通过亲合纯化来纯化所述核酸报告分子。在其它实施方式中，本文所提供的方法还包括通过结合至亲和标签并在适当清洗后在低盐缓冲液或水中洗脱来纯化所述核酸报告分子，其导致所述核酸报告分子不含污染核苷酸、引物、接头、接头二聚体、酶、缓冲液添加剂或盐。
如根据本文所提供的公开内容，包括第3、5.2.2和6节的那些公开内容清楚地，在本文所提供的方法中所述免疫复合物的形成和所述免疫复合物的捕获可以是同时的或者以先后顺序的，如在捕获之前形成或者在形成之前捕获。在本文所提供的方法，包括本节(第5.2.6节)所述的方法的一个实施方式中，所述方法的步骤(1)包括在将所述免疫复合物捕获至所述第一固体表面之前，在所述溶液中形成所述免疫复合物。在另一个实施方式中，本文所提供的方法的步骤(1)包括在所述第一固体表面上形成所述免疫复合物之前将所述第一结合剂预捕获至所述第一固体表面上。在另一个实施方式中，在本文所提供的方法的步骤(1)中，在溶液中形成所述免疫复合物并同时捕获至所述第一固体表面上。
本发明公开还提供本文所提供的方法，包括本节(第5.2.6节)中的那些方法的多个步骤，以允许从在所述方法中所形成的免疫复合物产物报告分子的任何顺序实施所述步骤。因此，在一个实施方式中，可以在从所述免疫复合物产生报告分子的步骤之前实施通过破坏所述第一递呈基团和所述第一接受基团之间的结合从所述第一固体表面释放所述免疫复合物的步骤。在另一个实施方式中，可以在从所述免疫复合物产生报告分子的步骤之后实施通过破坏所述第一递呈基团和所述第一接受基团之间的结合从所述第一固体表面释放所述免疫复合物的步骤。在其它实施方式中，可以在从所述免疫复合物产生报告分子的步骤的同时实施通过破坏所述第一递呈基团和所述第一接受基团之间的结合从所述第一固体表面释放所述免疫复合物的步骤。在一个实施方式中，可以在从所述免疫复合物产生报告分子的步骤之前实施通过破坏所述第二递呈基团和所述第二接受基团之间的结合从所述第二固体表面释放所述免疫复合物的步骤。在另一个实施方式中，可以在从所述免疫复合物产生报告分子的步骤之后实施通过破坏所述第二递呈基团和所述第二接受基团之间的结合从所述第二固体表面释放所述免疫复合物的步骤。在其它实施方式中，可以在从所述免疫复合物产生报告分子的步骤的同时实施通过破坏所述第二递呈基团和所述第二接受基团之间的结合从所述第二固体表面释放所述免疫复合物的步骤。
如图8A-8G所示，本文所提供的用于所述方法的结合剂可以直接或间接结合至分析物。照此，在本文所提供的方法，包括本节(第5.2.6节)所述的方法的一些实施方式中，所述结合剂直接结合至所述分析物。在本文所提供的方法的其它实施方式中，所述结合剂间接结合至所述分析物。因此，在一些实施方式中，所述第一结合剂直接结合至所述分析物。在其它实施方式中，所述第二结合剂直接结合至所述分析物。在其它实施方式中，所述第一结合剂间接结合至所述分析物。在其它实施方式中，所述第二结合剂间接结合至所述分析物。此外，所述第一结合剂和所述分析物之间的结合关系的任何实施方式可以与所述第二结合剂和所述分析物之间的结合关系的任何实施方式组合。在一个具体的实施方式中，所述第一结合剂直接结合至所述分析物并且所述第二结合剂直接结合至所述分析物。在另一个实施方式中，所述第一结合剂直接结合至所述分析物并且所述第二结合剂间接结合至所述分析物。在另一个实施方式中，所述第一结合剂间接结合至所述分析物并且所述第二结合剂直接结合至所述分析物。在另一个实施方式中，所述第一结合剂间接结合至所述分析物并且所述第二结合剂间接结合至所述分析物。
如图8G所示，所述结合剂可以通过中间体，例如，抗所述分析物的一抗间接结合至分析物。照此，在本文所提供的方法，包括本节(第5.2.6节)所述的方法的一些实施方式中，所述结合剂结合至直接结合至分析物的一抗或其片段。因此，在一些实施方式中，所述第一结合剂结合至直接结合至分析物的第一一抗或其片段。在其它实施方式中，所述第二结合剂结合至直接结合至分析物的第二一抗或其片段。在其它实施方式中，所述第一结合剂结合至直接结合至分析物的第一一抗或其片段，并且所述第二结合剂结合至直接结合至分析物的第二一抗或其片段。在其它实施方式中，所述第一结合剂直接结合至所述分析物，并且所述第二结合剂结合至直接结合至分析物的第二一抗或其片段。在一些其它实施方式中，所述第一结合剂结合至直接结合至分析物的第一一抗或其片段，并且所述第二结合剂直接结合至所述分析物。
如根据两个结合剂可以同时结合至分析物的本发明公开清楚地，在本文所提供的方法，包括第5.1和5.2节的方法的一些实施方式中，所述第一和第二结合剂可以结合允许同时结合的所述分析物上的表位，借此提高检测的特异性。在一些实施方式中，所述第一和第二结合剂结合至所述分析物上的非干扰表位。在其它实施方式中，所述第一和第二结合剂结合至所述分析物上的非重叠表位。在其它实施方式中，所述第一和第二结合剂结合至所述分析物上的不同表位。在其它实施方式中，所述第一和第二结合剂结合至所述分析物上单独的表位。在其它实施方式中，所述第一和第二结合剂结合至所述分析物上两个结合剂可以同时但单独结合而无任何空间位阻的两个表位。
本发明公开提供并且常规技术人员通过阅读本发明公开将理解本文所提供的方法，包括本节(5.2.6)所述的方法可以包括其它释放、清洗和/或捕获循环以进一步富集或纯化所述免疫复合物并提高信噪比。在本文所提供的方法，包括本节(第5.2.6节)所述的方法的一个实施方式中，所述方法还在步骤(2)和(3)之间包括1、2、3、4或5或者至少1、至少2、至少3、至少4或至少5个其它重新捕获循环，其包括：从捕获它的固体表面上释放所述免疫复合物，在与所述第一接受基团偶联的其它固体表面上重新捕获所述免疫复合物，并清洗所述其它固体表面以除去未结合的分子。在本文所提供的方法的另一个实施方式中，所述方法还在步骤(2)和(2a)之间包括1、2、3、4或5或者至少1、至少2、至少3、至少4或至少5个其它重新捕获循环，其包括：从捕获它的固体表面上释放所述免疫复合物，在与所述第一或所述第二接受基团偶联的其它固体表面上重新捕获所述免疫复合物，并清洗所述其它固体表面以除去未结合的分子。在本文所提供的方法的另一个实施方式中，所述方法还在步骤(2c)和(2d)之间包括1、2、3、4或5或者至少1、至少2、至少3、至少4或至少5个其它重新捕获循环，其包括：从捕获它的固体表面上释放所述免疫复合物，在与所述第一或所述第二接受基团偶联的其它固体表面上重新捕获所述免疫复合物，并清洗所述其它固体表面以除去未结合的分子。在本文所提供的方法的另一个实施方式中，所述方法还在步骤(2)和(3)之间包括1、2、3、4或5或者至少1、至少2、至少3、至少4或至少5个其它重新捕获循环，其包括：从捕获它的固体表面上释放所述免疫复合物，在与所述第一接受基团偶联的其它固体表面上重新捕获所述免疫复合物，并清洗所述其它固体表面以除去未结合的分子；并且在步骤(2c)和(2d)之间包括1、2、3、4或5或者至少1、至少2、至少3、至少4或至少5个其它重新捕获循环，其包括：从捕获它的固体表面上释放所述免疫复合物，在与所述第一或所述第二接受基团偶联的其它固体表面上重新捕获所述免疫复合物，并清洗所述其它固体表面以除去未结合的分子。在本文所提供的方法的其它实施方式中，所述方法还在步骤(2)和(2a)之间包括1、2、3、4或5或者至少1、至少2、至少3、至少4或至少5个其它重新捕获循环，其包括：从捕获它的固体表面上释放所述免疫复合物，在与所述第一接受基团偶联的其它固体表面上重新捕获所述免疫复合物，并清洗所述其它固体表面以除去未结合的分子；并且在步骤(2c)和(2d)之间包括1、2、3、4或5或者至少1、至少2、至少3、至少4或至少5个其它重新捕获循环，其包括：从捕获它的固体表面上释放所述免疫复合物，在与所述第一或所述第二接受基团偶联的其它固体表面上重新捕获所述免疫复合物，并清洗所述其它固体表面以除去未结合的分子。
对所述方法提供了本文所提供的方法，包括第6.2.2和6.4节中举例说明的那些方法的释放步骤的多种适合的方式。如本发明公开中，包括本第5.2.6节中所述，可以通过提高温度同时维持所述报告分子完整来实现这种释放，包括释放结合部分的不同组分之间、所述报告分子和所述免疫复合物之间、递呈基团和接受基团之间或者接受基团和固体表面之间的结合。因此，在一些实施方式中，在本文所提供的方法，包括本节(第5.2.6节)中所提供的方法中，通过将温度提高至至少50℃、至少55℃、至少60℃、至少65℃、至少70℃、至少75℃、至少80℃、至少85℃、至少90℃来释放任何所述释放。在其它实施方式中，通过将温度提高至约50℃、约55℃、约60℃、约65℃、约70℃、约75℃、约80℃、约85℃、约90℃来释放任何所述释放。在一些其它实施方式中，通过将盐浓度提高至至少1M、至少1.5M、至少2M、至少2.5M、至少3M、至少3.5M或者至少4M的盐来释放任何所述释放。在某些实施方式中，通过将盐浓度提高至约1M、约1.5M、约2M、约2.5M、约3M、约3.5M或者约4M的盐来释放任何所述释放。在一个实施方式中，通过将pH升高至至少10、至少10.1、至少10.2、至少10.3、至少10.4、至少10.5、至少10.6、至少10.7、至少10.8、至少10.9、至少11、至少11.1、至少11.2、至少11.3、至少11.4、至少11.5、至少11.6、至少11.7、至少11.8、至少11.9、至少12、至少12.1、至少12.2、至少12.3、至少12.4、至少12.5、至少13、至少13.5或者至少14来释放任何所述释放。在另一个实施方式中，通过将pH升高至约10、约10.1、约10.2、约10.3、约10.4、约10.5、约10.6、约10.7、约10.8、约10.9、约11、约11.1、约11.2、约11.3、约11.4、约11.5、约11.6、约11.7、约11.8、约11.9、约12、约12.1、约12.2、约12.3、约12.4、约12.5、约13、约13.5或者约14来释放任何所述释放。
对于本文所提供的方法，包括本节(第5.2.6节)中所提供的方法，可以通过在本发明公开的任何地方，包括第3、5.3.1、5.3.2和6节中所提供的结合、连接、偶联或另外连接所述递呈基团和所述接受基团的多种实施方式，将所述递呈基团和所述接受基团结合、连接、偶联或另外连接在一起。在本文所提供的方法的一个实施方式中，所述第一递呈基团通过硫酯基团、二硫键或可切割键结合所述第一接受基团。在本文所提供的方法的另一个实施方式中，所述第二递呈基团通过硫酯基团、二硫键或可切割键结合所述第二接受基团。在本文所提供的方法的另一个实施方式中，所述第一递呈基团通过硫酯基团、二硫键或可切割键结合所述第一接受基团；并且所述第二递呈基团通过硫酯基团、二硫键或可切割键结合所述第二接受基团。在本文所提供的方法的一个实施方式中，所述第一递呈基团通过光可切割键、化学可切割键或酶促可切割键结合所述第一接受基团。在本文所提供的方法的另一个实施方式中，所述第二递呈基团通过光可切割键、化学可切割键或酶促可切割键结合所述第二接受基团。在本文所提供的方法的另一个实施方式中，所述第一递呈基团通过光可切割键、化学可切割键或酶促可切割键结合所述第一接受基团；并且所述第二递呈基团通过光可切割键、化学可切割键或酶促可切割键结合所述第二接受基团。在本文所提供的方法的一个实施方式中，所述第一递呈基团通过蛋白-蛋白相互作用结合所述第一接受基团。在本文所提供的方法的另一个实施方式中，所述第二递呈基团通过蛋白-蛋白相互作用结合所述第二接受基团。在本文所提供的方法的另一个实施方式中，所述第一递呈基团通过蛋白-蛋白相互作用结合所述第一接受基团；并且所述第二递呈基团通过蛋白-蛋白相互作用结合所述第二接受基团。在本文所提供的方法的一个实施方式中，所述第一递呈基团通过生物素与链霉亲和素或抗生物素蛋白结合所述第一接受基团。在本文所提供的方法的另一个实施方式中，所述第二递呈基团通过生物素与链霉亲和素或抗生物素蛋白结合所述第二接受基团。在本文所提供的方法的另一个实施方式中，所述第一递呈基团通过生物素与链霉亲和素或抗生物素蛋白结合所述第一接受基团；并且所述第二递呈基团通过生物素与链霉亲和素或抗生物素蛋白结合所述第二接受基团。在一些实施方式中，所述第一递呈基团通过在本段中所提供的实施方式中的任一个结合所述第一接受基团，并且所述第二递呈基团通过在本段中所提供的实施方式中的任一个结合所述第二接受基团。照此，本发明公开提供在本段中所提供的用于所述第一递呈基团和所述第一接受基团之间的结合的任何实施方式可以与本段中所提供的用于所述第二递呈基团和所述第二接受基团之间的结合的任何其它实施方式组合。
如本发明公开，包括第3、5.1、5.2.1至5.2.6、5.3.1至5.3.3和6节的公开内容中所提供的，在本文所提供的方法，包括本第5.2.6节中所提供的那些方法的一些实施方式中，所述递呈基团可以是核酸。类似地，在本文所提供的方法，包括本第5.2.6节中所提供的那些方法的一些实施方式中，所述接受基团可以是核酸。在一个实施方式中，作为核酸的所述递呈基团结合所述接受基团。在另一个实施方式中，所述第一递呈基团是第一核酸标签(“第一标签”)并且所述第一接受基团是第一核酸捕获探针(“第一探针”)。在其它实施方式中，所述第二递呈基团是第二核酸标签(“第二标签”)并且所述第二接受基团是第二核酸捕获探针(“第二探针”)。在另一个实施方式中，(i)所述第一递呈基团是第一核酸标签(“第一标签”)并且所述第一接受基团是第一核酸捕获探针(“第一探针”)；且(ii)所述第二递呈基团是第二核酸标签(“第二标签”)并且所述第二接受基团是第二核酸捕获探针(“第二探针”)。在一个实施方式中，所述第一探针是特异性结合至所述第一标签的蛋白。在另一个实施方式中，所述第一探针是特异性结合至所述第一标签的蛋白和核酸复合物。在另一个实施方式中，所述第一探针是核酸分子，其中所述第一探针或其片段与所述第一标签或其片段互补。在其它实施方式中，所述第一探针是核酸分子，其中所述第一探针或其片段与所述第一标签或其片段杂交。在一个实施方式中，所述第二探针是特异性结合至所述第二标签的蛋白。在另一个实施方式中，所述第二探针是特异性结合至所述第二标签的蛋白和核酸复合物。在另一个实施方式中，所述第二探针是核酸分子，其中所述第二探针或其片段与所述第二标签或其片段互补。在其它实施方式中，所述第二探针是核酸分子，其中所述第二探针或其片段与所述第二标签或其片段杂交。
另外，这种第一标签、第一探针、第二标签和第二探针可以如前段中所提供以多种方式组合。因此，在一个实施方式中，所述第一探针是特异性结合至所述第一标签的蛋白并且所述第二探针是特异性结合至所述第二标签的蛋白。在另一个实施方式中，所述第一探针是特异性结合至所述第一标签的蛋白并且所述第二探针是特异性结合至所述第二标签的蛋白和核酸复合物。在另一个实施方式中，所述第一探针是特异性结合至所述第一标签的蛋白并且所述第二探针是核酸分子，其中所述第二探针或其片段与所述第二标签或其片段互补。在其它实施方式中，所述第一探针是特异性结合至所述第一标签的蛋白并且所述第二探针是核酸分子，其中所述第二探针或其片段与所述第二标签或其片段杂交。
另外，在一个实施方式中，所述第一探针是特异性结合至所述第一标签的蛋白和核酸复合物，并且所述第二探针是特异性结合至所述第二标签的蛋白。在另一个实施方式中，所述第一探针是特异性结合至所述第一标签的蛋白和核酸复合物，并且所述第二探针是特异性结合至所述第二标签的蛋白和核酸复合物。在另一个实施方式中，所述第一探针是特异性结合至所述第一标签的蛋白和核酸复合物并且所述第二探针是核酸分子，其中所述第二探针或其片段与所述第二标签或其片段互补。在其它实施方式中，所述第一探针是特异性结合至所述第一标签的蛋白和核酸复合物并且所述第二探针是核酸分子，其中所述第二探针或其片段与所述第二标签或其片段杂交。
作为另外一种选择，在一个实施方式中，所述第一探针是核酸分子，其中所述第一探针或其片段与所述第一标签或其片段互补，并且所述第二探针是特异性结合至所述第二标签的蛋白。在另一个实施方式中，所述第一探针是核酸分子，其中所述第一探针或其片段与所述第一标签或其片段互补，并且所述第二探针是特异性结合至所述第二标签的蛋白和核酸复合物。在另一个实施方式中，所述第一探针是核酸分子，其中所述第一探针或其片段与所述第一标签或其片段互补，并且所述第二探针是核酸分子，其中所述第二探针或其片段与所述第二标签或其片段互补。在其它实施方式中，所述第一探针是核酸分子，其中所述第一探针或其片段与所述第一标签或其片段互补，并且所述第二探针是核酸分子，其中所述第二探针或其片段与所述第二标签或其片段杂交。
另外，在一个实施方式中，所述第一探针是核酸分子，其中所述第一探针或其片段与所述第一标签或其片段杂交，并且所述第二探针是特异性结合至所述第二标签的蛋白。在另一个实施方式中，所述第一探针是核酸分子，其中所述第一探针或其片段与所述第一标签或其片段杂交，并且所述第二探针是特异性结合至所述第二标签的蛋白和核酸复合物。在另一个实施方式中，所述第一探针是核酸分子，其中所述第一探针或其片段与所述第一标签或其片段杂交，并且所述第二探针是核酸分子，其中所述第二探针或其片段与所述第二标签或其片段互补。在其它实施方式中，所述第一探针是核酸分子，其中所述第一探针或其片段与所述第一标签或其片段杂交，并且所述第二探针是核酸分子，其中所述第二探针或其片段与所述第二标签或其片段杂交。
前段中所提供的互补性可以是多种水平的互补性，只要对于本文所提供的多种方法，互补片段的结合为捕获、清洗和/或释放提供了充分结合。在本文，包括在本第5.2.6节中所提供的方法的一个实施方式中，所述互补性为至少80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％互补。在另一个实施方式中，所述互补性为约80％、约81％、约82％、约83％、约84％、约85％、约86％、约87％、约88％、约89％、约90％、约91％、约92％、约93％、约94％、约95％、约96％、约97％、约98％或约99％的互补。
在某些实施方式中，作为核酸的所述递呈基团结合或杂交至作为核酸的所述接受基团。因此，在一些实施方式中，所述第一递呈基团是第一核酸标签(“第一标签”)并且所述第一接受基团是第一核酸捕获探针(“第一探针”)，其中所述第一探针或其片段与所述第一标签或其片段互补。在某些实施方式中，所述第二递呈基团是第二核酸标签(“第二标签”)并且所述第二接受基团是第二核酸捕获探针(“第二探针”)，其中所述第二探针或其片段与所述第二标签或其片段互补。在一个实施方式中，所述第一递呈基团是第一核酸标签(“第一标签”)并且所述第一接受基团是第一核酸捕获探针(“第一探针”)，其中所述第一探针或其片段与所述第一标签或其片段互补；并且所述第二递呈基团是第二核酸标签(“第二标签”)并且所述第二接受基团是第二核酸捕获探针(“第二探针”)，其中所述第二探针或其片段与所述第二标签或其片段互补。
因此，在本文所提供的方法的一些具体实施方式中，所述方法包括：
(1)将包含第一结合剂和第一标签的第一结合部分、包含第二结合剂和第二标签的第二结合部分和样品在溶液中混合，其中：
(i)所述第一和第二结合剂结合所述分析物上的非干扰表位并形成免疫复合物，
(ii)通过所述第一标签和偶联至所述第一固体表面的第一探针之间的结合，将所述免疫复合物捕获至与溶液接触的第一固体表面上，并且
(iii)所述第一结合部分还包含第一靶标标记，所述第一靶标标记包含分析物特异的(“靶标ID”)第一标识码(“ID”)，并且所述第二结合部分还包含第二靶标标记，所述第二靶标标记包含第二靶标ID；
(2)清洗所述第一固体表面以除去未结合的分子；
(2a)通过破坏所述第一标签和所述第一探针之间的结合从所述第一固体表面释放所述免疫复合物；
(2b)引入第二固体表面并通过所述第二标签和偶联至所述第二固体表面的所述第二探针之间的结合将所述免疫复合物重新捕获至所述第二固体表面上；
(2c)清洗所述第二固体表面以除去未结合的分子；
(2d)通过破坏所述第二标签和所述第二探针之间的结合从所述第二固体表面释放所述免疫复合物；
(2e)将包含样品特异的ID(“样品ID”)的样品标记结合(i)至所述第一靶标标记，(ii)至所述第二靶标标记或者(iii)至所述第一靶标标记和所述第二靶标标记两者；
(3)产生核酸报告分子，其包含所述第一靶标ID和所述第二靶标ID；和
(4)检测所述核酸报告分子，借此检测所述分析物。
本发明公开还提供并且本领域的常规技术人员通过阅读本发明公开将理解对于本文所提供的方法，包括本节(第5.2.6节)中所提供的方法，可以通过在本发明公开的任何地方，包括第3、5.2.3和6节中所提供的将所述接受基团与所述固体表面结合、连接、偶联或另外连接的多种实施方式，将所述接受基团结合、连接、偶联或另外连接至所述固体表面。由于所述接受基团可以是核酸捕获探针，因此本发明公开提供对于本文所提供的方法，包括本节(第5.2.6节)所提供的方法，可以通过在本发明公开的任何地方，包括第3、5.2.3和6节中所提供的将所述核酸捕获探针(例如，第一探针和/或第二探针)与所述固体表面结合、连接、偶联或另外连接的多种实施方式，将所述核酸捕获探针(例如，第一探针和/或第二探针)结合、连接、偶联或另外连接至的所述固体表面。在本文所提供的方法，包括本节(第5.2.6节)中所提供的方法的一个实施方式中，所述第一探针直接偶联至所述第一固体表面。在另一个实施方式中，所述第一探针与直接偶联至所述第一固体表面的通用探针杂交。在其它实施方式中，所述第一探针与生物素缀合，生物素结合直接偶联至所述第一固体表面的链霉亲和素或抗生物素蛋白。在另一个实施方式中，所述第一探针与化合物(例如，FITC)缀合，所述化合物结合特异性结合该化合物(例如，FITC)并且直接偶联至所述第一固体表面的抗体。在本文所提供的方法，包括本节(第5.2.6节)中所提供的方法的一个实施方式中，所述第二探针直接偶联至所述第二固体表面。在另一个实施方式中，所述第二探针与直接偶联至所述第二固体表面的通用探针杂交。在其它实施方式中，所述第二探针与生物素缀合，生物素结合直接偶联至所述第二固体表面的链霉亲和素或抗生物素蛋白。在另一个实施方式中，所述第二探针与化合物(例如，FITC)缀合，所述化合物结合特异性结合该化合物(例如，FITC)并且直接偶联至所述第二固体表面的抗体。
在某些实施方式中，前段中所提供的用于结合、连接、偶联或另外连接所述第一探针和所述第一固体表面的任何实施方式可以与前段中所提供的用于结合、连接、偶联或另外连接所述第二探针和所述第二固体表面的任何其它实施方式组合。因此，在本文所提供的方法，包括本节(第5.2.6节)中所提供的方法的一个实施方式中，所述第一探针直接偶联至所述第一固体表面，并且所述第二探针直接偶联至所述第二固体表面。在另一个实施方式中，所述第一探针直接偶联至所述第一固体表面，并且所述第二探针与直接偶联至所述第二固体表面的通用探针杂交。在其它实施方式中，所述第一探针直接偶联至所述第一固体表面，并且所述第二探针与生物素缀合，所述生物素结合直接偶联至所述第二固体表面的链霉亲和素或抗生物素蛋白。在另一个实施方式中，所述第一探针直接偶联至所述第一固体表面，并且所述第二探针与化合物(例如，FITC)缀合，所述化合物结合特异性结合该化合物(例如，FITC)并且直接偶联至所述第二固体表面的抗体。在一个实施方式中，所述第一探针与直接偶联至所述第一固体表面的通用探针杂交，并且所述第二探针直接偶联至所述第二固体表面。在另一个实施方式中，所述第一探针与直接偶联至所述第一固体表面的通用探针杂交，并且所述第二探针与直接偶联至所述第二固体表面的通用探针杂交。在其它实施方式中，所述第一探针与直接偶联至所述第一固体表面的通用探针杂交，并且所述第二探针与生物素缀合，所述生物素结合直接偶联至所述第二固体表面的链霉亲和素或抗生物素蛋白。在另一个实施方式中，所述第一探针与直接偶联至所述第一固体表面的通用探针杂交，并且所述第二探针与化合物(例如，FITC)缀合，所述化合物结合特异性结合该化合物(例如，FITC)并且直接偶联至所述第二固体表面的抗体。在一个实施方式中，所述第一探针与生物素缀合，所述生物素结合直接偶联至所述第一固体表面的链霉亲和素或抗生物素蛋白，并且所述第二探针直接偶联至所述第二固体表面。在另一个实施方式中，所述第一探针与生物素缀合，所述生物素结合直接偶联至所述第一固体表面的链霉亲和素或抗生物素蛋白，并且所述第二探针与直接偶联至所述第二固体表面的通用探针杂交。在其它实施方式中，所述第一探针与生物素缀合，所述生物素结合直接偶联至所述第一固体表面的链霉亲和素或抗生物素蛋白，并且所述第二探针与生物素缀合，所述生物素结合直接偶联至所述第二固体表面的链霉亲和素或抗生物素蛋白。在另一个实施方式中，所述第一探针与生物素缀合，所述生物素结合直接偶联至所述第一固体表面的链霉亲和素或抗生物素蛋白，并且所述第二探针与化合物(例如，FITC)缀合，所述化合物结合特异性结合该化合物(例如，FITC)并且直接偶联至所述第二固体表面的抗体。在一个实施方式中，所述第一探针与化合物(例如，FITC)缀合，所述化合物结合特异性结合该化合物(例如，FITC)并且直接偶联至所述第一固体表面的抗体，并且所述第二探针直接偶联至所述第二固体表面。在另一个实施方式中，所述第一探针与化合物(例如，FITC)缀合，所述化合物结合特异性结合该化合物(例如，FITC)并且直接偶联至所述第一固体表面的抗体，并且所述第二探针与直接偶联至所述第二固体表面的通用探针杂交。在其它实施方式中，所述第一探针与化合物(例如，FITC)缀合，所述化合物结合特异性结合该化合物(例如，FITC)并且直接偶联至所述第一固体表面的抗体，并且所述第二探针与生物素缀合，所述生物素结合直接偶联至所述第二固体表面的链霉亲和素或抗生物素蛋白。在另一个实施方式中，所述第一探针与化合物(例如，FITC)缀合，所述化合物结合特异性结合该化合物(例如，FITC)并且直接偶联至所述第一固体表面的抗体，并且所述第二探针与化合物(例如，FITC)缀合，所述化合物结合特异性结合该化合物(例如，FITC)并且直接偶联至所述第二固体表面的抗体。
如以上第3、5.2.3、5.2.4和5.2.5节中所描述的，所述核酸捕获探针可以被协同捕获在所述固体表面。在本文，包括本节(第5.2.6节)中所提供的方法的一个实施方式中，所述第一标签和第二标签被协同捕获在所述第一固体表面上。在本文所提供的方法的另一个实施方式中，所述第一标签和第二标签被协同捕获在所述第二固体表面上。在本文所提供的方法的其它实施方式中，在步骤(1)中所述第一标签和第二标签被协同捕获在所述第一固体表面上。在本文所提供的方法的另一个实施方式中，在步骤(2b)中所述第一标签和第二标签被协同捕获在所述第二固体表面上。在一些实施方式中，本节(第5.2.6节)，包括本段所述的用于本文所提供的方法的协同捕获可以采取不同形式，包括第3、5.2.3、5.2.4和5.2.5节中所述的任何实施方式。在一个具体的实施方式中，所述第一标签和第二标签以第3、5.2.3、5.2.4和5.2.5节中所体现的任何形式被协同捕获在所述第一固体表面上。在另一个具体的实施方式中，在步骤(1)中，所述第一标签和第二标签以第3、5.2.3、5.2.4和5.2.5节中所体现的任何形式被协同捕获在所述第一固体表面上。在其它实施方式中，所述第一标签和第二标签以第3、5.2.3、5.2.4和5.2.5节中所体现的任何形式被协同捕获在所述第二固体表面上。在另一个实施方式中，所述第一标签和第二标签以第3、5.2.3、5.2.4和5.2.5节中所体现的任何形式在步骤(2b)中被协同捕获在所述第二固体表面上。在一些实施方式中，所述第一标签和第二标签以第3、5.2.3、5.2.4和5.2.5节中所体现的任何形式被协同捕获在所述第一固体表面上，并且所述第一标签和第二标签以第3、5.2.3、5.2.4和5.2.5节中所体现的任何形式被协同捕获在所述第二固体表面上。在某些实施方式中，所述第一标签和第二标签以第3、5.2.3、5.2.4和5.2.5节中所体现的任何形式在步骤(1)中被协同捕获在所述第一固体表面上，并且所述第一标签和第二标签以第3、5.2.3、5.2.4和5.2.5节中所体现的任何形式在步骤(2b)中被协同捕获在所述第二固体表面上。在一些实施方式中，所述第一固体表面与所述第一探针和其它核酸探针两者偶联，并且其中所述其它探针或其片段与所述第一标签或其片段互补。在某些实施方式中，所述第二固体表面与所述第二探针和其它核酸探针两者偶联，并且其中所述其它探针或其片段与所述第二标签或其片段互补。在其它实施方式中，所述第一固体表面与所述第一探针和其它核酸探针偶联，并且其中所述其它探针或其片段与所述第一标签或其片段互补，并且所述第二固体表面与所述第二探针和其它核酸探针两者偶联，并且其中所述其它探针或其片段与所述第二标签或其片段互补。
在包括核酸结合或杂交的本文所提供的方法的任何实施方式中，两个核酸的互补片段可以具有出于所述递呈基团(例如，所述第一标签和/或所述第二标签)和所述接受基团(例如，所述第一探针和/或所述第二探针)的结合或者所述接受基团(例如，所述第一探针和/或所述第二探针)和所述固体表面(例如，所述第一固体表面和/或所述第二固体表面)的结合的目的，提供足够的相互作用的任何长度。在本文所提供的方法的一些实施方式中，这些互补片段可以是10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49或50个或者更多个碱基对。在本文所提供的方法的一个实施方式中，所述第一标签和所述第一探针的互补片段由10至30个碱基对组成。在本文所提供的方法的另一个实施方式中，所述第一标签和所述第一探针的互补片段由20至30个碱基对组成。在本文所提供的方法的另一个实施方式中，所述第一标签和所述第一探针的互补片段由10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39或40个碱基对组成。在本文所提供的方法的一个实施方式中，所述第二标签和所述第二探针的互补片段由10至30个碱基对组成。在本文所提供的方法的另一个实施方式中，所述第二标签和所述第二探针的互补片段由20至30个碱基对组成。在本文所提供的方法的另一个实施方式中，所述第二标签和所述第二探针的互补片段由10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39或40个碱基对组成。在本文所提供的方法的一个实施方式中，所述第一标签和所述第一探针的互补片段由10至30个碱基对组成，并且所述第二标签和所述第二探针的互补片段由10至30个碱基对组成。在本文所提供的方法的另一个实施方式中，所述第一标签和所述第一探针的互补片段由20至30个碱基对组成，并且所述第二标签和所述第二探针的互补片段由20至30个碱基对组成。在本文所提供的方法的另一个实施方式中，所述第一标签和所述第一探针的互补片段由10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39或40个碱基对组成，并且所述第二标签和所述第二探针的互补片段由10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39或40个碱基对组成。
对于包括核酸结合或杂交的本文所提供的方法的任何实施方式，出于所述递呈基团(例如，所述第一标签和/或所述第二标签)和所述接受基团(例如，所述第一探针和/或所述第二探针)的结合或者所述接受基团(例如，所述第一探针和/或所述第二探针)和所述固体表面(例如，所述第一固体表面和/或所述第二固体表面)的结合的目的，两个核酸的互补片段可以是一对互补的A和/或T富集序列或者一对互补的G和/或C富集序列。在本文所提供的方法的一个实施方式中，所述第一标签包含A和/或T富集序列并且所述第一探针包含互补的T和/或A富集序列。在另一个实施方式中，所述第一标签包含多聚-A和/或多聚-T序列并且所述第一探针包含互补的多聚-T和/或多聚-A序列。在其它实施方式中，所述第一标签包含G和/或C富集序列并且所述第一探针包含互补的C和/或G富集序列。在另一个实施方式中，所述第一标签包含多聚-G和/或多聚-C序列并且所述第一探针包含互补的多聚-C和/或多聚-G序列。在本文所提供的方法的一个实施方式中，所述第二标签包含A和/或T富集序列并且所述第二探针包含互补的T和/或A富集序列。在另一个实施方式中，所述第二标签包含多聚-A和/或多聚-T序列并且所述第二探针包含互补的多聚-T和/或多聚-A序列。在其它实施方式中，所述第二标签包含G和/或C富集序列并且所述第二探针包含互补的C和/或G富集序列。在另一个实施方式中，所述第二标签包含多聚-G和/或多聚-C序列并且所述第二探针包含互补的多聚-C和/或多聚-G序列。
在本文所提供的方法的一个实施方式中，所述第一标签包含A和/或T富集序列并且所述第一探针包含互补的T和/或A富集序列，并且所述第二标签包含A和/或T富集序列并且所述第二探针包含互补的T和/或A富集序列。在另一个实施方式中，所述第一标签包含A和/或T富集序列并且所述第一探针包含互补的T和/或A富集序列，并且所述第二标签包含多聚-A和/或多聚-T序列并且所述第二探针包含互补的多聚-T和/或多聚-A序列。在其它实施方式中，所述第一标签包含A和/或T富集序列并且所述第一探针包含互补的T和/或A富集序列，并且所述第二标签包含G和/或C富集序列并且所述第二探针包含互补的C和/或G富集序列。在另一个实施方式中，所述第一标签包含A和/或T富集序列并且所述第一探针包含互补的T和/或A富集序列，并且所述第二标签包含多聚-G和/或多聚-C序列并且所述第二探针包含互补的多聚-C和/或多聚-G序列。
在本文所提供的方法的一个实施方式中，所述第一标签包含多聚-A和/或多聚-T序列并且所述第一探针包含互补的多聚-T和/或多聚-A序列，并且所述第二标签包含A和/或T富集序列并且所述第二探针包含互补的T和/或A富集序列。在另一个实施方式中，所述第一标签包含多聚-A和/或多聚-T序列并且所述第一探针包含互补的多聚-T和/或多聚-A序列，并且所述第二标签包含多聚-A和/或多聚-T序列并且所述第二探针包含互补的多聚-T和/或多聚-A序列。在其它实施方式中，所述第一标签包含多聚-A和/或多聚-T序列并且所述第一探针包含互补的多聚-T和/或多聚-A序列，并且所述第二标签包含G和/或C富集序列并且所述第二探针包含互补的C和/或G富集序列。在另一个实施方式中，所述第一标签包含多聚-A和/或多聚-T序列并且所述第一探针包含互补的多聚-T和/或多聚-A序列，并且所述第二标签包含多聚-G和/或多聚-C序列并且所述第二探针包含互补的多聚-C和/或多聚-G序列。
在本文所提供的方法的一个实施方式中，所述第一标签包含G和/或C富集序列并且所述第一探针包含互补的C和/或G富集序列，并且所述第二标签包含A和/或T富集序列并且所述第二探针包含互补的T和/或A富集序列。在另一个实施方式中，所述第一标签包含G和/或C富集序列并且所述第一探针包含互补的C和/或G富集序列，并且所述第二标签包含多聚-A和/或多聚-T序列并且所述第二探针包含互补的多聚-T和/或多聚-A序列。在其它实施方式中，所述第一标签包含G和/或C富集序列并且所述第一探针包含互补的C和/或G富集序列，并且所述第二标签包含G和/或C富集序列并且所述第二探针包含互补的C和/或G富集序列。在另一个实施方式中，所述第一标签包含G和/或C富集序列并且所述第一探针包含互补的C和/或G富集序列，并且所述第二标签包含多聚-G和/或多聚-C序列并且所述第二探针包含互补的多聚-C和/或多聚-G序列。
在本文所提供的方法的一个实施方式中，所述第一标签包含多聚-G和/或多聚-C序列并且所述第一探针包含互补的多聚-C和/或多聚-G序列，并且所述第二标签包含A和/或T富集序列并且所述第二探针包含互补的T和/或A富集序列。在另一个实施方式中，所述第一标签包含多聚-G和/或多聚-C序列并且所述第一探针包含互补的多聚-C和/或多聚-G序列，并且所述第二标签包含多聚-A和/或多聚-T序列并且所述第二探针包含互补的多聚-T和/或多聚-A序列。在其它实施方式中，所述第一标签包含多聚-G和/或多聚-C序列并且所述第一探针包含互补的多聚-C和/或多聚-G序列，并且所述第二标签包含G和/或C富集序列并且所述第二探针包含互补的C和/或G富集序列。在另一个实施方式中，所述第一标签包含多聚-G和/或多聚-C序列并且所述第一探针包含互补的多聚-C和/或多聚-G序列，并且所述第二标签包含多聚-G和/或多聚-C序列并且所述第二探针包含互补的多聚-C和/或多聚-G序列。
在本文所提供的方法，包括前5段中所提供的那些方法的某些实施方式中，所述互补序列具有短的长度，从而来自互补序列的结合弱于所述第一结合剂和所述分析物之间的结合以及所述第二结合剂和所述分析物之间的结合两者，借此使免疫复合物在任何释放步骤，例如，释放步骤(2a)和/或(2d)中保持稳定。在一些具体的实施方式中，所述A和/或T富集序列具有短的长度，从而来自互补的A和/或T富集序列的结合弱于所述第一结合剂与所述分析物之间的结合以及所述第二结合剂与所述分析物之间的结合，借此使免疫复合物在任何释放步骤，例如，在释放步骤(2a)和/或(2d)中保持稳定。在其它具体的实施方式中，所述多聚-A和/或多聚-T序列具有短的长度，从而来自互补的多聚-A和/或多聚-T序列的结合弱于所述第一结合剂与所述分析物之间的结合以及所述第二结合剂与所述分析物之间的结合两者，借此使免疫复合物在任何释放步骤，例如，在释放步骤(2a)和/或(2d)中保持稳定。在其它具体实施方式中，所述G和/或C富集序列具有短的长度，从而来自互补的G和/或C富集序列的结合弱于所述第一结合剂与所述分析物之间的结合以及所述第二结合剂与所述分析物之间的结合两者，借此使免疫复合物在任何释放步骤，例如，在释放步骤(2a)和/或(2d)中保持稳定。在一些其它具体实施方式中，所述多聚-G和/或多聚-C序列具有短的长度，从而来自互补的多聚-G和/或多聚-C序列的结合弱于所述第一结合剂与所述分析物之间的结合以及所述第二结合剂与所述分析物之间的结合两者，借此使免疫复合物在任何释放步骤，例如，在释放步骤(2a)和/或(2d)中保持稳定。
在本文所提供的方法，包括本第5.2.6节中所提供的方法中所检测的分析物可以是如第3、5.2.2和6节中所述的多种分子。在一个具体的实施方式中，所述分析物是两个分子的结合对；其中所述第一结合剂结合所述结合对的一个分子，并且所述第二结合剂结合所述结合对的另一个分子。在另一个实施方式中，所述分析物为核酸，并且用于核酸分析物的第一和第二结合剂包含与所述核酸分析物的不同片段互补的核酸。在另一个实施方式中，所述分析物是肽或蛋白，且(i)所述第一结合剂是特异性结合所述分析物的抗体或抗体片段；(ii)所述第二结合剂是特异性结合所述分析物的抗体或抗体片段；或者(i)和(ii)两者。
在本文所提供的方法，包括本第5.2.6节中所提供的方法中所检测的分析物可以来自如第3和6节中所述的多种样品。在本文所提供的方法的一些具体实施方式中，所述样品是体液样品。在一个实施方式中，所述样品是组织样品。在一个实施方式中，所述样品是细胞样品。在一个实施方式中，所述样品是血液样品。在一个实施方式中，所述样品是骨髓样品。在一个实施方式中，所述样品是血浆样品。在一个实施方式中，所述样品是血清样品。在一个实施方式中，所述样品是尿液样品。在一个实施方式中，所述样品是脑脊髓液样品。
在本文所提供的方法的多个实施方式中，如第3、5.2.4(包括5.2.4.1和5.2.4.2)、5.2.5和6节中所述，可以在将所述免疫复合物捕获至固体表面上的同时或者在从所述固体表面释放所述免疫复合物之后，产生所述核酸报告分子。在一个具体的实施方式中，产生所述核酸报告分子(例如，在步骤(3)中)，同时所述免疫复合物捕获至所述第一固体表面上。在另一个具体的实施方式中，在从所述第一固体表面释放所述免疫复合物之后，产生所述核酸报告分子(例如，在步骤(3)中)。在另一个具体的实施方式中，产生所述核酸报告分子(例如，在步骤(3)中)，同时所述免疫复合物捕获至所述第二固体表面上。在另一个具体实施方式中，在从所述第二固体表面释放所述免疫复合物之后，产生所述核酸报告分子(例如，在步骤(3)中)。
本发明公开提供对于本文所提供的方法，包括本第5.2.6节和第3、5.2.1至5.2.5和6节中的那些方法的多种实施方式，所述靶标标记、所述结合剂和所述递呈基团可以在每个结合部分中具有多种构造。在本文所提供的方法，包括本第5.2.6节的那些方法的一个实施方式中，所述靶标标记直接结合至所述结合剂。在另一个实施方式中，所述靶标标记间接结合至所述结合剂。在另一个实施方式中，所述第一靶标标记直接结合至所述第一结合剂。在其它实施方式中，所述第一靶标标记间接结合至所述第一结合剂。在一些实施方式中，所述第二靶标标记直接结合至所述第二结合剂。在某些实施方式中，所述第二靶标标记间接结合至所述第二结合剂。在一个实施方式中，所述第一靶标标记直接结合至所述第一结合剂，并且所述第二靶标标记直接结合至所述第二结合剂。在另一个实施方式中，所述第一靶标标记直接结合至所述第一结合剂，并且所述第二靶标标记间接结合至所述第二结合剂。在另一个实施方式中，所述第一靶标标记间接结合至所述第一结合剂，并且所述第二靶标标记直接结合至所述第二结合剂。在其它实施方式中，所述第一靶标标记间接结合至所述第一结合剂，并且所述第二靶标标记间接结合至所述第二结合剂。在本文所提供的方法，包括本第5.2.6节的那些方法的一个实施方式中，所述靶标标记缀合至所述结合剂。在另一个实施方式中，所述靶标标记非共价结合至所述结合剂。在其它实施方式中，所述靶标标记缀合至所述递呈基团。在另一个实施方式中，所述靶标标记非共价结合至所述递呈基团。在另一个实施方式中，所述靶标标记是所述递呈基团的一部分，例如，所述靶标标记和所述递呈基团均为核酸，并且所述靶标标记是所述递呈基团序列内的核酸片段。在本文所提供的方法，包括本第5.2.6节的那些方法的一个实施方式中，所述第一靶标标记缀合至所述第一结合剂。在另一个实施方式中，所述第一靶标标记非共价结合至所述第一结合剂。在其它实施方式中，所述第一靶标标记缀合至所述第一递呈基团。在另一个实施方式中，所述第一靶标标记非共价结合至所述第一递呈基团。在另一个实施方式中，所述第一靶标标记是所述第一递呈基团的一部分，例如，所述第一靶标标记和所述第一递呈基团均为核酸分子并且所述第一靶标标记是所述第一递呈基团序列内的核酸片段。在本文所提供的方法，包括本第5.2.6节的那些方法的一个实施方式中，所述第二靶标标记缀合至所述第二结合剂。在另一个实施方式中，所述第二靶标标记非共价结合至所述第二结合剂。在其它实施方式中，所述第二靶标标记缀合至所述第二递呈基团。在另一个实施方式中，所述第二靶标标记非共价结合至所述第二递呈基团。在另一个实施方式中，所述第二靶标标记是所述第二递呈基团的一部分，例如，所述第二靶标标记和所述第二递呈基团均为核酸分子并且所述第二靶标标记是所述第二递呈基团序列内的核酸片段。
在所述第一结合部分中所述第一靶标标记、所述第一结合剂和所述第一递呈基团中的构造可以是本文，包括本第5.2.6节以及前段中所提供的任何实施方式，并且该实施方式可以与本文，包括本第5.2.6节和前段中所提供的所述第二结合部分中的所述第二靶标标记、所述第二结合剂和所述第二递呈基团中的构造的任何实施方式组合。在本文所提供的方法，包括本第5.2.6节的那些方法的一个具体实施方式中，所述第一靶标标记缀合至所述第一结合剂并且所述第二靶标标记缀合至所述第二结合剂。在另一个实施方式中，所述第一靶标标记缀合至所述第一结合剂，并且所述第二靶标标记非共价结合至所述第二结合剂。在其它实施方式中，所述第一靶标标记缀合至所述第一结合剂，并且所述第二靶标标记缀合至所述第二递呈基团。在另一个实施方式中，所述第一靶标标记缀合至所述第一结合剂，并且所述第二靶标标记非共价结合至所述第二递呈基团。在另一个实施方式中，所述第一靶标标记缀合至所述第一结合剂并且所述第二靶标标记是所述第二递呈基团的一部分，例如，所述第二靶标标记和所述第二递呈基团均为核酸分子并且所述第二靶标标记是所述第二递呈基团序列内的核酸片段。
在本文所提供的方法，包括本第5.2.6节的那些方法的一些具体实施方式中，所述第一靶标标记非共价结合至所述第一结合剂并且所述第二靶标标记缀合至所述第二结合剂。在另一个实施方式中，所述第一靶标标记非共价结合至所述第一结合剂并且所述第二靶标标记非共价结合至所述第二结合剂。在其它实施方式中，所述第一靶标标记非共价结合至所述第一结合剂并且所述第二靶标标记缀合至所述第二递呈基团。在另一个实施方式中，所述第一靶标标记非共价结合至所述第一结合剂并且所述第二靶标标记非共价结合至所述第二递呈基团。在另一个实施方式中，所述第一靶标标记非共价结合至所述第一结合剂并且所述第二靶标标记是所述第二递呈基团的一部分，例如，所述第二靶标标记和所述第二递呈基团均为核酸分子并且所述第二靶标标记是所述第二递呈基团序列内的核酸片段。
在本文所提供的方法，包括本第5.2.6节的那些方法的一些具体实施方式中，所述第一靶标标记缀合至所述第一递呈基团并且所述第二靶标标记缀合至所述第二结合剂。在另一个实施方式中，所述第一靶标标记缀合至所述第一递呈基团并且所述第二靶标标记非共价结合至所述第二结合剂。在其它实施方式中，所述第一靶标标记缀合至所述第一递呈基团并且所述第二靶标标记缀合至所述第二递呈基团。在另一个实施方式中，所述第一靶标标记缀合至所述第一递呈基团并且所述第二靶标标记非共价结合至所述第二递呈基团。在另一个实施方式中，所述第一靶标标记缀合至所述第一递呈基团并且所述第二靶标标记是所述第二递呈基团的一部分，例如，所述第二靶标标记和所述第二递呈基团均为核酸分子并且所述第二靶标标记是所述第二递呈基团序列内的核酸片段。
在本文所提供的方法，包括本第5.2.6节的那些方法的一些具体实施方式中，所述第一靶标标记非共价结合至所述第一递呈基团并且所述第二靶标标记缀合至所述第二结合剂。在另一个实施方式中，所述第一靶标标记非共价结合至所述第一递呈基团并且所述第二靶标标记非共价结合至所述第二结合剂。在其它实施方式中，所述第一靶标标记非共价结合至所述第一递呈基团并且所述第二靶标标记缀合至所述第二递呈基团。在另一个实施方式中，所述第一靶标标记非共价结合至所述第一递呈基团并且所述第二靶标标记非共价结合至所述第二递呈基团。在另一个实施方式中，所述第一靶标标记非共价结合至所述第一递呈基团并且所述第二靶标标记是所述第二递呈基团的一部分，例如，所述第二靶标标记和所述第二递呈基团均为核酸分子并且所述第二靶标标记是所述第二递呈基团序列内的核酸片段。
在本文所提供的方法，包括本第5.2.6节的那些方法的一些具体实施方式中，所述第一靶标标记是所述第一递呈基团的一部分，例如，所述第一靶标标记和所述第一递呈基团均为核酸分子并且所述第一靶标标记是所述第一递呈基团序列内的核酸片段，并且所述第二靶标标记缀合至所述第二结合剂。在另一个实施方式中，所述第一靶标标记是所述第一递呈基团的一部分，例如，所述第一靶标标记和所述第一递呈基团均为核酸分子并且所述第一靶标标记是所述第一递呈基团序列内的核酸片段，并且所述第二靶标标记非共价结合至所述第二结合剂。在其它实施方式中，所述第一靶标标记是所述第一递呈基团的一部分，例如，所述第一靶标标记和所述第一递呈基团均为核酸分子并且所述第一靶标标记是所述第一递呈基团序列内的核酸片段，并且所述第二靶标标记缀合至所述第二递呈基团。在另一个实施方式中，所述第一靶标标记是所述第一递呈基团的一部分，例如，所述第一靶标标记和所述第一递呈基团均为核酸分子并且所述第一靶标标记是所述第一递呈基团序列内的核酸片段，并且所述第二靶标标记非共价结合至所述第二递呈基团。在另一个实施方式中，所述第一靶标标记是所述第一递呈基团的一部分，例如，所述第一靶标标记和所述第一递呈基团均为核酸分子并且所述第一靶标标记是所述第一递呈基团序列内的核酸片段，并且所述第二靶标标记是所述第二递呈基团的一部分，例如，所述第二靶标标记和所述第二递呈基团均为核酸分子并且所述第二靶标标记是所述第二递呈基团序列内的核酸片段。
类似地，对于本文所提供的方法，包括本第5.2.6节和第3、5.2.1至5.2.5和6节的那些方法的多种实施方式，所述结合剂和所述递呈基团可以在每个结合部分中具有多种构型。在本文所提供的方法，包括本第5.2.6节的那些方法的一个实施方式中，所述递呈基团直接结合至所述结合剂。在另一个实施方式中，所述递呈基团间接结合至所述结合剂。在另一个实施方式中，所述第一递呈基团直接结合至所述第一结合剂。在其它实施方式中，所述第一递呈基团间接结合至所述第一结合剂。在一些实施方式中，所述第二递呈基团直接结合至所述第二结合剂。在某些实施方式中，所述第二递呈基团间接结合至所述第二结合剂。在一个实施方式中，所述第一递呈基团直接结合至所述第一结合剂，并且所述第二递呈基团直接结合至所述第二结合剂。在另一个实施方式中，所述第一递呈基团直接结合至所述第一结合剂，并且所述第二递呈基团间接结合至所述第二结合剂。在另一个实施方式中，所述第一递呈基团间接结合至所述第一结合剂，并且所述第二递呈基团直接结合至所述第二结合剂。在其它实施方式中，所述第一递呈基团间接结合至所述第一结合剂，并且所述第二递呈基团间接结合至所述第二结合剂。在本文所提供的方法，包括本第5.2.6节的那些方法的一个实施方式中，所述递呈基团缀合至所述结合剂。在另一个实施方式中，所述递呈基团非共价结合至所述结合剂。在其它实施方式中，所述递呈基团缀合至所述递呈基团。在另一个实施方式中，所述递呈基团非共价结合至所述递呈基团。在另一个实施方式中，所述递呈基团是所述递呈基团的一部分，例如，所述递呈基团和所述递呈基团均为核酸，并且所述递呈基团是所述递呈基团序列内的核酸片段。在本文所提供的方法，包括本第5.2.6节的那些方法的一个实施方式中，所述第一递呈基团缀合至所述第一结合剂。在另一个实施方式中，所述第一递呈基团非共价结合至所述第一结合剂。在其它实施方式中，所述第一递呈基团缀合至所述第一递呈基团。在另一个实施方式中，所述第一递呈基团非共价结合至所述第一递呈基团。在另一个实施方式中，所述第一递呈基团是所述第一靶标标记的一部分，例如，所述第一递呈基团和所述第一靶标标记均为核酸分子并且所述第一递呈基团是所述第一靶标标记序列内的核酸片段。在本文所提供的方法，包括本第5.2.6节的那些方法的一个实施方式中，所述第二递呈基团缀合至所述第二结合剂。在另一个实施方式中，所述第二递呈基团非共价结合至所述第二结合剂。在其它实施方式中，所述第二递呈基团缀合至所述第二递呈基团。在另一个实施方式中，所述第二递呈基团非共价结合至所述第二递呈基团。在另一个实施方式中，所述第二递呈基团是所述第二靶标标记的一部分，例如，所述第二递呈基团和所述第二靶标标记均为核酸分子并且所述第二递呈基团是所述第二靶标标记序列内的核酸片段。
所述第一递呈基团、所述第一结合剂和所述第一结合部分中的所述第一递呈基团中的构型可以是本文，包括在本第5.2.6节和前段中所提供的任何实施方式，并且该实施方式可以与本文，包括在本第5.2.6节和前段中所提供的所述第二递呈基团、所述第二结合剂和所述第二结合部分中的所述第二递呈基团中的任何构型实施方式组合。在本文所提供的方法，包括本第5.2.6节的那些方法的一个具体实施方式中，所述第一递呈基团缀合至所述第一结合剂并且所述第二递呈基团缀合至所述第二结合剂。在另一个实施方式中，所述第一递呈基团缀合至所述第一结合剂，并且所述第二递呈基团非共价结合至所述第二结合剂。在其它实施方式中，所述第一递呈基团缀合至所述第一结合剂，并且所述第二递呈基团缀合至所述第二递呈基团。在另一个实施方式中，所述第一递呈基团缀合至所述第一结合剂，并且所述第二递呈基团非共价结合至所述第二递呈基团。在另一个实施方式中，所述第一递呈基团缀合至所述第一结合剂并且所述第二递呈基团是所述第二靶标标记的一部分，例如，所述第二递呈基团和所述第二靶标标记均为核酸分子并且所述第二递呈基团是所述第二靶标标记序列内的核酸片段。
在本文所提供的方法，包括本第5.2.6节的那些方法的一些具体实施方式中，所述第一递呈基团非共价结合至所述第一结合剂并且所述第二递呈基团缀合至所述第二结合剂。在另一个实施方式中，所述第一递呈基团非共价结合至所述第一结合剂，并且所述第二递呈基团非共价结合至所述第二结合剂。在其它实施方式中，所述第一递呈基团非共价结合至所述第一结合剂，并且所述第二递呈基团缀合至所述第二递呈基团。在另一个实施方式中，所述第一递呈基团非共价结合至所述第一结合剂，并且所述第二递呈基团非共价结合至所述第二递呈基团。在另一个实施方式中，所述第一递呈基团非共价结合至所述第一结合剂，并且所述第二递呈基团是所述第二靶标标记的一部分，例如，所述第二递呈基团和所述第二靶标标记均为核酸分子并且所述第二递呈基团是所述第二靶标标记序列内的核酸片段。
在本文所提供的方法，包括本第5.2.6节的那些方法的一些具体实施方式中，所述第一递呈基团缀合至所述第一递呈基团并且所述第二递呈基团缀合至所述第二结合剂。在另一个实施方式中，所述第一递呈基团缀合至所述第一递呈基团，并且所述第二递呈基团非共价结合至所述第二结合剂。在其它实施方式中，所述第一递呈基团缀合至所述第一递呈基团，并且所述第二递呈基团缀合至所述第二递呈基团。在另一个实施方式中，所述第一递呈基团缀合至所述第一递呈基团，并且所述第二递呈基团非共价结合至所述第二递呈基团。在另一个实施方式中，所述第一递呈基团缀合至所述第一递呈基团，并且所述第二递呈基团是所述第二靶标标记的一部分，例如，所述第二递呈基团和所述第二靶标标记均为核酸分子并且所述第二递呈基团是所述第二靶标标记序列内的核酸片段。
在本文所提供的方法，包括本第5.2.6节的那些方法的一些具体实施方式中，所述第一递呈基团非共价结合至所述第一递呈基团并且所述第二递呈基团缀合至所述第二结合剂。在另一个实施方式中，所述第一递呈基团非共价结合至所述第一递呈基团，并且所述第二递呈基团非共价结合至所述第二结合剂。在其它实施方式中，所述第一递呈基团非共价结合至所述第一递呈基团，并且所述第二递呈基团缀合至所述第二递呈基团。在另一个实施方式中，所述第一递呈基团非共价结合至所述第一递呈基团，并且所述第二递呈基团非共价结合至所述第二递呈基团。在另一个实施方式中，所述第一递呈基团非共价结合至所述第一递呈基团，并且所述第二递呈基团是所述第二靶标标记的一部分，例如，所述第二递呈基团和所述第二靶标标记均为核酸分子并且所述第二递呈基团是所述第二靶标标记序列内的核酸片段。
在本文所提供的方法，包括本第5.2.6节的那些方法的一些具体实施方式中，所述第一递呈基团是所述第一靶标标记的一部分，例如，所述第一递呈基团和所述第一靶标标记均为核酸分子并且所述第一递呈基团是所述第一靶标标记序列内的核酸片段，并且所述第二递呈基团缀合至所述第二结合剂。在另一个实施方式中，所述第一递呈基团是所述第一靶标标记的一部分，例如，所述第一递呈基团和所述第一靶标标记均为核酸分子并且所述第一递呈基团是所述第一靶标标记序列内的核酸片段，并且所述第二递呈基团非共价结合至所述第二结合剂。在其它实施方式中，所述第一递呈基团是所述第一靶标标记的一部分，例如，所述第一递呈基团和所述第一靶标标记均为核酸分子并且所述第一递呈基团是所述第一靶标标记序列内的核酸片段，并且所述第二递呈基团缀合至所述第二递呈基团。在另一个实施方式中，所述第一递呈基团是所述第一靶标标记的一部分，例如，所述第一递呈基团和所述第一靶标标记均为核酸分子并且所述第一递呈基团是所述第一靶标标记序列内的核酸片段，并且所述第二递呈基团非共价结合至所述第二递呈基团。在另一个实施方式中，所述第一递呈基团是所述第一靶标标记的一部分，例如，所述第一递呈基团和所述第一靶标标记均为核酸分子并且所述第一递呈基团是所述第一靶标标记序列内的核酸片段，并且所述第二递呈基团是所述第二靶标标记的一部分，例如，所述第二递呈基团和所述第二靶标标记均为核酸分子并且所述第二递呈基团是所述第二靶标标记序列内的核酸片段。
如根据本发明公开清楚地，在本文所提供的方法，包括本第5.2.6节以及第3、5.2.1至5.2.5和6节所述的方法的一些实施方式中，所述靶标标记(例如，所述第一靶标标记和/或所述第二靶标标记)可以是核酸分子。在一个实施方式中，所述第一靶标标记是核酸分子。在另一个实施方式中，所述第二靶标标记是核酸分子。在其它实施方式中，所述第一靶标标记是核酸分子，并且所述第二靶标标记是核酸分子。本发明公开还提供在本文所提供的方法，包括本第5.2.6节以及第3、5.2.1至5.2.5和6节所述的方法的一些实施方式中，当所述靶标标记是核酸分子时，所述靶标标记与也是核酸分子的接受基团杂交。在一个实施方式中，所述第一靶标标记与所述第一标签杂交。在另一个实施方式中，所述第二靶标标记与所述第二标签杂交。在其它实施方式中，所述第一靶标标记与所述第一标签杂交，并且所述第二靶标标记与所述第二标签杂交。
另外，本发明公开提供了包含样品ID的样品标记，其中对于本文所提供的方法，包括本第5.2.6节和第3、5.2.1至5.2.5和6节所述的方法的多种实施方式，所述样品标记结合至所述免疫复合物。所述样品标记可以结合至所述结合部分的任何组分，通过两种结合部分(例如，所述第一结合部分和所述第二结合部分)所形成的免疫复合物、所述接受基团或者偶联至所述固体表面的组分。在一个实施方式中，所述样品标记结合至靶标标记。在另一个实施方式中，所述样品标记结合至所述递呈基团(例如，作为核酸分子的递呈基团)。在其它实施方式中，所述样品标记结合至结合剂。在另一个实施方式中，所述样品标记结合至接受基团。在一个实施方式中，所述样品标记结合至所述第一靶标标记。在另一个实施方式中，所述样品标记结合至所述第一递呈基团(例如，作为核酸分子的递呈基团)。在另一个实施方式中，所述样品标记结合至所述第一标签。在其它实施方式中，所述样品标记结合至所述第一结合剂。在另一个实施方式中，所述样品标记结合至所述第一接受基团。在一个实施方式中，所述样品标记结合至所述第二靶标标记。在另一个实施方式中，所述样品标记结合至所述第二递呈基团(例如，作为核酸分子的递呈基团)。在另一个实施方式中，所述样品标记结合至所述第二标签。在其它实施方式中，所述样品标记结合至所述第二结合剂。在另一个实施方式中，所述样品标记结合至所述第二接受基团。
此外，所述样品标记与所述第一结合部分或所述第一接受基团的组分之间的结合的任何实施方式可以与所述样品标记与所述第二结合部分或所述第二接受基团的组分之间的结合的任何实施方式组合。因此，在一个实施方式中，所述样品标记结合至所述第一靶标标记和所述第二靶标标记。在另一个实施方式中，所述样品标记结合至所述第一靶标标记和所述第二递呈基团(例如，作为核酸分子的递呈基团)。在另一个实施方式中，所述样品标记结合至所述第一靶标标记和所述第二标签。在其它实施方式中，所述样品标记结合至所述第一靶标标记和所述第二结合剂。在另一个实施方式中，所述样品标记结合至所述第一靶标标记和所述第二接受基团。
在一个实施方式中，所述样品标记结合至所述第一递呈基团(例如，作为核酸分子的递呈基团)和所述第二靶标标记。在另一个实施方式中，所述样品标记结合至所述第一递呈基团(例如，作为核酸分子的递呈基团)和所述第二递呈基团(例如，作为核酸分子的递呈基团)。在另一个实施方式中，所述样品标记结合至所述第一递呈基团(例如，作为核酸分子的递呈基团)和所述第二标签。在其它实施方式中，所述样品标记结合至所述第一递呈基团(例如，作为核酸分子的递呈基团)和所述第二结合剂。在另一个实施方式中，所述样品标记结合至所述第一递呈基团(例如，作为核酸分子的递呈基团)和所述第二接受基团。
在一个实施方式中，所述样品标记结合至所述第一标签和所述第二靶标标记。在另一个实施方式中，所述样品标记结合至所述第一标签和所述第二递呈基团(例如，作为核酸分子的递呈基团)。在另一个实施方式中，所述样品标记结合至所述第一标签和所述第二标签。在其它实施方式中，所述样品标记结合至所述第一标签和所述第二结合剂。在另一个实施方式中，所述样品标记结合至所述第一标签和所述第二接受基团。
在一个实施方式中，所述样品标记结合至所述第一结合剂和所述第二靶标标记。在另一个实施方式中，所述样品标记结合至所述第一结合剂和所述第二递呈基团(例如，作为核酸分子的递呈基团)。在另一个实施方式中，所述样品标记结合至所述第一结合剂和所述第二标签。在其它实施方式中，所述样品标记结合至所述第一结合剂和所述第二结合剂。在另一个实施方式中，所述样品标记结合至所述第一结合剂和所述第二接受基团。
在一个实施方式中，所述样品标记结合至所述第一接受基团和所述第二靶标标记。在另一个实施方式中，所述样品标记结合至所述第一接受基团和所述第二递呈基团(例如，作为核酸分子的递呈基团)。在另一个实施方式中，所述样品标记结合至所述第一接受基团和所述第二标签。在其它实施方式中，所述样品标记结合至所述第一接受基团和所述第二结合剂。在另一个实施方式中，所述样品标记结合至所述第一接受基团和所述第二接受基团。
在本文，包括在本第5.2.6节和第3、5.2.1至5.2.5和6节中所提供的多个实施方式中，所述样品标记可以是核酸分子并且所述样品标记中的所述样品ID可以是识别样品或与样品相关联的核酸序列。在一个实施方式中，所述样品标记是单链核酸分子(“单链样品标记”)。在另一个实施方式中，所述样品标记是双链核酸分子(“双链样品标记”)。在本文，包括在本第5.2.6节和第3、5.2.1至5.2.5和6节中所提供的多个实施方式中，对于双链样品标记，本发明公开还提供所述样品标记对于样品可以不具有悬突(例如，两个平末端)、具有一个悬突(例如，一个平末端)或者具有两个悬突(无平末端)。在一个实施方式中，所述样品标记是包含两个5'悬突的双链核酸分子。在一个实施方式中，所述样品标记是包含两个3'悬突的双链核酸分子。在一个实施方式中，所述样品标记是包含5'悬突和3'悬突的双链核酸分子。在一个实施方式中，所述样品标记是包含5'悬突和平末端的双链核酸分子。在一个实施方式中，所述样品标记是包含3'悬突和平末端的双链核酸分子。
在本文所提供的方法的多个实施方式中，当所述样品标记为双链核酸分子并且具有一个或两个悬突时，则所述样品标记可以通过其悬突与所述结合部分的任何核酸组分、通过两个结合部分所形成的免疫复合物、所述接受基团或偶联至所述固体表面的核酸组分杂交。在本文所提供的方法的多个实施方式中，当所述样品标记为单链核酸分子时，则所述样品标记可以与所述结合部分的任何核酸组分、通过两个结合部分所形成的免疫复合物、所述接受基团或偶联至所述固体表面的核酸组分杂交。
如根据本发明公开清楚地，所述靶标标记、所述递呈基团、所述结合剂和/或所述接受基团中的每一个均可以是核酸分子。因此，当它们是核酸分子或者具有作为核酸分子的组分时，所述样品标记可以通过其悬突与所述靶标标记、所述递呈基团、所述结合剂和/或所述接受基团杂交。在一个实施方式中，所述样品标记与靶标标记杂交。在另一个实施方式中，所述样品标记与所述递呈基团(例如，作为核酸分子的递呈基团)杂交。在其它实施方式中，所述样品标记与结合剂杂交。在另一个实施方式中，所述样品标记与接受基团杂交。在一个实施方式中，所述样品标记与所述第一靶标标记杂交。在另一个实施方式中，所述样品标记与所述第一递呈基团(例如，作为核酸分子的递呈基团)杂交。在另一个实施方式中，所述样品标记与所述第一标签杂交。在其它实施方式中，所述样品标记与所述第一结合剂杂交。在另一个实施方式中，所述样品标记与所述第一接受基团杂交。在一个实施方式中，所述样品标记与所述第二靶标标记杂交。在另一个实施方式中，所述样品标记与所述第二递呈基团(例如，作为核酸分子的递呈基团)杂交。在另一个实施方式中，所述样品标记与所述第二标签杂交。在其它实施方式中，所述样品标记与所述第二结合剂杂交。在另一个实施方式中，所述样品标记与所述第二接受基团杂交。
此外，所述样品标记与所述第一结合部分或所述第一接受基团的组分之间的杂交的任何实施方式可以与所述样品标记与所述第二结合部分或所述第二接受基团的组分之间的杂交的任何实施方式组合。因此，在一个实施方式中，所述样品标记与所述第一靶标标记和所述第二靶标标记杂交。在另一个实施方式中，所述样品标记与所述第一靶标标记和所述第二递呈基团(例如，作为核酸分子的递呈基团)杂交。在另一个实施方式中，所述样品标记与所述第一靶标标记和所述第二标签杂交。在其它实施方式中，所述样品标记与所述第一靶标标记和所述第二结合剂杂交。在另一个实施方式中，所述样品标记与所述第一靶标标记和所述第二接受基团杂交。
在一个实施方式中，所述样品标记与所述第一递呈基团(例如，作为核酸分子的递呈基团)和所述第二靶标标记杂交。在另一个实施方式中，所述样品标记与所述第一递呈基团(例如，作为核酸分子的递呈基团)和所述第二递呈基团(例如，作为核酸分子的递呈基团)杂交。在另一个实施方式中，所述样品标记与所述第一递呈基团(例如，作为核酸分子的递呈基团)和所述第二标签杂交。在其它实施方式中，所述样品标记与所述第一递呈基团(例如，作为核酸分子的递呈基团)和所述第二结合剂杂交。在另一个实施方式中，所述样品标记与所述第一递呈基团(例如，作为核酸分子的递呈基团)和所述第二接受基团杂交。
在一个实施方式中，所述样品标记与所述第一标签和所述第二靶标标记杂交。在另一个实施方式中，所述样品标记与所述第一标签和所述第二递呈基团(例如，作为核酸分子的递呈基团)杂交。在另一个实施方式中，所述样品标记与所述第一标签和所述第二标签杂交。在其它实施方式中，所述样品标记与所述第一标签和所述第二结合剂杂交。在另一个实施方式中，所述样品标记与所述第一标签和所述第二接受基团杂交。
在一个实施方式中，所述样品标记与所述第一结合剂和所述第二靶标标记杂交。在另一个实施方式中，所述样品标记与所述第一结合剂和所述第二递呈基团(例如，作为核酸分子的递呈基团)杂交。在另一个实施方式中，所述样品标记与所述第一结合剂和所述第二标签杂交。在其它实施方式中，所述样品标记与所述第一结合剂和所述第二结合剂杂交。在另一个实施方式中，所述样品标记与所述第一结合剂和所述第二接受基团杂交。
在一个实施方式中，所述样品标记与所述第一接受基团和所述第二靶标标记杂交。在另一个实施方式中，所述样品标记与所述第一接受基团和所述第二递呈基团(例如，作为核酸分子的递呈基团)杂交。在另一个实施方式中，所述样品标记与所述第一接受基团和所述第二标签杂交。在其它实施方式中，所述样品标记与所述第一接受基团和所述第二结合剂杂交。在另一个实施方式中，所述样品标记与所述第一接受基团和所述第二接受基团杂交。
本领域的常规技术人员将理解当双链样品标记与如本第5.2.6节，包括本段和之前6段中所述的两个项目杂交时，在一些实施方式中，所述双链样品标记通过其5'悬突与第一项目杂交并且通过其3'悬突与第二项目杂交。在其它实施方式中，所述双链样品标记通过其3'悬突与第一项目杂交并且通过其5'悬突与第二项目杂交。在其它实施方式中，所述双链样品标记通过其5'悬突与第一项目杂交并且通过其5'悬突与第二项目杂交。在其它实施方式中，所述双链样品标记通过其3'悬突与第一项目杂交并且通过其3'悬突与第二项目杂交。当双链样品标记与如本第5.2.6节，包括本段和之前6段中所述的一个项目杂交时，在一些实施方式中，所述双链样品标记通过其5'悬突与所述项目杂交。在某些实施方式中，所述双链样品标记通过其3'悬突与所述项目杂交。当所述样品标记是单链样品标记时，这种样品标记可以通过任何部分或其核酸序列，包括任一端、两端(5'端和3'端)和任何内部序列，与如本第5.2.6节，包括本段和之前6段中所述的任一个项目或两个项目杂交。
在一些具体的实施方式中，所述样品标记通过所述样品标记的悬突(例如，5'悬突或3'悬突)与所述第一靶标标记杂交。在另一个具体的实施方式中，所述样品标记通过所述样品标记的悬突(例如，5'悬突或3'悬突)与所述第二靶标标记杂交。在另一个实施方式中，所述样品标记通过所述样品标记的悬突(例如，5'悬突或3'悬突)与所述第一靶标标记杂交并且通过所述样品标记的悬突(例如，5'悬突或3'悬突)与所述第二靶标标记杂交。在另一个实施方式中，所述样品标记通过所述样品标记的5'悬突与所述第一靶标标记杂交并且通过所述样品标记的3'悬突与所述第二靶标标记杂交。在一个实施方式中，所述样品标记通过所述样品标记的5'悬突与所述第一靶标标记杂交并且通过所述样品标记的5'悬突与所述第二靶标标记杂交。在其它实施方式中，所述样品标记通过所述样品标记的3'悬突与所述第一靶标标记杂交并且通过所述样品标记的5'悬突与所述第二靶标标记杂交。在另一个实施方式中，所述样品标记通过所述样品标记的3'悬突与所述第一靶标标记杂交并且通过所述样品标记的3'悬突与所述第二靶标标记杂交。
如第3、5.2.4.1、5.2.5和6节中详细描述的，在本文所提供的方法，包括本第5.2.6节中所提供的方法的多个实施方式中，可以通过连接以下部分产生所述核酸报告分子：(i)所述第一靶标标记和所述第一递呈基团(例如，第一标签)中的任一个，和(ii)所述第二靶标标记和所述第二递呈基团(例如，第二标签)中的任一个。因此，在一个实施方式中，所述方法包括通过连接以下部分产生所述核酸报告分子：
(a)所述部分为所述第一标签和所述第二标签，并且检测由所述第一标签的片段和所述第二标签的片段所组成的所述核酸报告分子；
(b)所述部分为所述第一标签和所述第二标签的替代核酸(“第二替代物”)，并且检测由所述第一标签的片段和所述第二替代物的片段所组成的所述核酸报告分子；
(c)所述部分为所述第一标签的替代核酸(“第一替代物”)和所述第二标签，并且检测由所述第一替代物的片段和所述第二标签的片段所组成的所述核酸报告分子；或者
(d)所述部分为所述第一替代物和所述第二替代物，并且检测由所述第一替代物的片段和所述第二替代物的片段所组成的所述核酸报告分子；
其中所述第一标签或其片段与所述第一替代物或其片段互补，并且所述第二标签或其片段与所述第二替代物或其片段互补。
作为另外一种选择，本文所提供的方法包括通过连接以下部分产生所述核酸报告分子：
(a)所述部分为所述第一标签和所述第二靶标标记，并且检测由所述第一标签的片段和所述第二靶标标记的片段所组成的所述核酸报告分子；
(b)所述部分为所述第一标签和所述第二靶标标记的替代核酸(“第二替代物”)，并且检测由所述第一标签的片段和所述第二替代物的片段所组成的所述核酸报告分子；
(c)所述部分为所述第一标签的替代核酸(“第一替代物”)和所述第二靶标标记，并且检测由所述第一替代物的片段和所述第二靶标标记的片段所组成的所述核酸报告分子；或者
(d)所述部分为所述第一替代物和所述第二替代物，并且检测由所述第一替代物的片段和所述第二替代物的片段所组成的所述核酸报告分子；
其中所述第一标签或其片段与所述第一替代物或其片段互补，并且所述第二靶标标记或其片段与所述第二替代物或其片段互补。
类似地，本文所提供的方法包括通过连接以下部分产生所述核酸报告分子：
(a)所述部分为所述第一靶标标记和所述第二标签，并且检测由所述第一靶标标记的片段和所述第二标签的片段所组成的所述核酸报告分子；
(b)所述部分为所述第一靶标标记和所述第二标签的替代核酸(“第二替代物”)，并且检测由所述第一靶标标记的片段和所述第二替代物的片段所组成的所述核酸报告分子；
(c)所述部分为所述第一靶标标记的替代核酸(“第一替代物”)和所述第二标签，并且检测由所述第一替代物的片段和所述第二标签的片段所组成的所述核酸报告分子；或者
(d)所述部分为所述第一替代物和所述第二替代物，并且检测由所述第一替代物的片段和所述第二替代物的片段所组成的所述核酸报告分子；
其中所述第一靶标标记或其片段与所述第一替代物或其片段互补，并且所述第二标签或其片段与所述第二替代物或其片段互补。
另外，本文所提供的方法包括通过连接以下部分产生所述核酸报告分子：
(a)所述部分为所述第一靶标标记和所述第二靶标标记，并且检测由所述第一靶标标记的片段和所述第二靶标标记的片段所组成的所述核酸报告分子；
(b)所述部分为所述第一靶标标记和所述第二靶标标记的替代核酸(“第二替代物”)，并且检测由所述第一靶标标记的片段和所述第二替代物的片段所组成的所述核酸报告分子；
(c)所述部分为所述第一靶标标记的替代核酸(“第一替代物”)和所述第二靶标标记，并且检测由所述第一替代物的片段和所述第二靶标标记的片段所组成的所述核酸报告分子；或者
(d)所述部分为所述第一替代物和所述第二替代物，并且检测由所述第一替代物的片段和所述第二替代物的片段所组成的所述核酸报告分子；
其中所述第一靶标标记或其片段与所述第一替代物或其片段互补，并且所述第二靶标标记或其片段与所述第二替代物或其片段互补。
此外，在本文所提供的方法，包括本第5.2.6节中所提供的方法的多个实施方式中，可以通过连接以下部分产生所述核酸报告分子：(i)所述第一靶标标记和所述第一递呈基团(例如，第一标签)中的任一个，(ii)所述第二靶标标记和所述第二递呈基团(例如，第二标签)中的任一个，和(iii)所述样品标记。因此，在本文所提供的方法，包括本第5.2.6节和以上4段中所提供的方法的一些实施方式中，对于所述方法的连接包括连接以下部分：
(i)(a)所述第一标签或其第一替代物，(b)所述第二标签或其第二替代物，和(c)单链样品标记的替代核酸(“样品替代物”)或双链样品标记的一条链；
(ii)(a)所述第一标签或其第一替代物，(b)所述第二靶标标记或其第二替代物，和(c)单链样品标记的替代核酸(“样品替代物”)或双链样品标记的一条链；
(iii)(a)所述第一靶标标记或其第一替代物，(b)所述第二标签或其第二替代物，和(c)单链样品标记的替代核酸(“样品替代物”)或双链样品标记的一条链；或者
(iv)(a)所述第一靶标标记或其第一替代物，(b)所述第二靶标标记或其第二替代物，和(c)单链样品标记的替代核酸(“样品替代物”)或双链样品标记的一条链；
其中所述样品标记或其片段与所述样品替代物或其片段互补。在一些具体的实施方式中，本段的(i)至(iv)中每一个中的连接包括在(a)和(b)之间的连接(c)。在其它具体的实施方式中，本段的(i)至(iv)中每一个中的连接包括以(a)，然后(c)并且然后(b)的方向，将(a)连接至(c)。在一个实施方式中，本段的(i)至(iv)中每一个中的连接包括以(b)，然后(c)并且然后(a)的方向，将(a)连接至(c)。在另一个实施方式中，本段的(i)至(iv)中每一个中的连接包括以(c)，然后(a)并且然后(b)的方向，将(a)连接至(c)。在其它实施方式中，本段的(i)至(iv)中每一个中的连接包括以(c)，然后(b)并且然后(a)的方向，将(a)连接至(c)。在另一个实施方式中，本段的(i)至(iv)中每一个中的连接包括以(a)，然后(b)并且然后(c)的方向，将(a)连接至(c)。在另一个实施方式中，本段的(i)至(iv)中每一个中的连接包括以(b)，然后(a)并且然后(c)的方向，将(a)连接至(c)。
因此，如根据以上描述，包括本第5.2.6节中的描述清楚地，本发明公开提供在本文所提供的方法的一些实施方式中，可以通过连接以下部分产生所述核酸报告分子：(i)所述第一靶标标记和所述第一递呈基团(例如，第一标签)中的任一个，(ii)所述第二靶标标记和所述第二递呈基团(例如，第二标签)中的任一个，和/或(iii)样品标记。本发明公开还提供这种连接可以是连接(ligation)，例如平末端连接或粘端连接或它们的任意组合。在一个实施方式中，通过粘端连接形成所述核酸报告分子。在其它实施方式中，通过平末端连接形成所述核酸报告分子。在另一个实施方式中，通过在所述样品标记的一端的平末端连接和在所述样品标记的另一端的粘端连接形成所述核酸报告分子。在一个实施方式中，通过在所述样品标记的一端的平末端连接和在所述样品标记的另一端的平末端连接形成所述核酸报告分子。在另一个实施方式中，通过在所述样品标记的一端的粘端连接和在所述样品标记的另一端的粘端连接形成所述核酸报告分子。
另外，在另一个实施方式中，可以通过本领域已知且实践的产生核酸报告分子的其它方式形成所述核酸报告分子。在本文所提供的方法，包括本第5.2.6节中所提供的方法的一个实施方式中，通过邻位连接形成所述核酸报告分子。在另一个实施方式中，通过邻位延伸形成所述核酸报告分子。在另一个实施方式中，通过PCR形成所述核酸报告分子。在具体的实施方式中，使用通过连接(例如，连接)下列部分所形成的模板，通过PCR形成所述核酸报告分子：(i)所述第一靶标标记和所述第一递呈基团(例如，第一标签)中的任一个，(ii)所述第二靶标标记和所述第二递呈基团(例如，第二标签)中的任一个，和/或(iii)样品标记，如本第5.2.6节，包括以上7段所述的。
如根据本发明公开清楚地，在本文所提供的方法中，包括在本第5.2.6节中所述的方法中所产生的所述核酸报告分子可以包含(i)所述第一靶标标记和所述第一递呈基团(例如，第一标签)中的任一个，(ii)所述第二靶标标记和所述第二递呈基团(例如，第二标签)中的任一个，和/或(iii)样品标记。因此，在本文所提供的方法，包括在本第5.2.6节中所述的方法中所产生的所述核酸报告分子可以以本文，包括本第5.2.6节和第3、5.2.1至5.2.5和6节中所提供的所有可能的组合和构造包含所述第一靶标ID、所述第二靶标ID和/或所述样品ID。在一个实施方式中，所述核酸报告分子包含所述第一靶标ID或者所述第一靶标ID的替代核酸(“第一靶标ID替代物”)。在另一个实施方式中，所述核酸报告分子包含所述第二靶标ID或者所述第二靶标ID的替代核酸(“第二靶标ID替代物”)。在另一个实施方式中，所述核酸报告分子包含所述样品ID。在其它实施方式中，所述核酸报告分子包含(a)所述第一靶标ID或所述第一靶标ID替代物，和(b)所述第二靶标ID或所述第二靶标ID替代物。在一个实施方式中，所述核酸报告分子包含(a)所述第一靶标ID或所述第一靶标ID替代物，和(b)所述样品ID。在另一个实施方式中，所述核酸报告分子包含(a)所述第二靶标ID或所述第二靶标ID替代物，和(b)所述样品ID。在其它实施方式中，所述核酸报告分子包含(a)所述第一靶标ID或所述第一靶标ID替代物，(b)所述第二靶标ID或所述第二靶标ID替代物，和(c)所述样品ID。在一些实施方式中，所述核酸报告分子包含(a)所述第一靶标ID或所述第一靶标ID替代物，(b)所述第二靶标ID或所述第二靶标ID替代物和(c)所述样品ID，其中所述样品ID在(a)所述第一靶标ID或所述第一靶标ID替代物和(b)所述第二靶标ID或所述第二靶标ID替代物之间。在某些实施方式中，所述核酸报告分子包含(a)所述第一靶标ID或所述第一靶标ID替代物，(b)所述第二靶标ID或所述第二靶标ID替代物和(c)所述样品ID，其中(a)、(b)和(c)顺序布置为(a)，然后(c)，然后(b)。在其它实施方式中，所述核酸报告分子包含(a)所述第一靶标ID或所述第一靶标ID替代物，(b)所述第二靶标ID或所述第二靶标ID替代物和(c)所述样品ID，其中(a)、(b)和(c)顺序布置为(b)，然后(c)，然后(a)。在一个实施方式中，所述核酸报告分子包含(a)所述第一靶标ID或所述第一靶标ID替代物，(b)所述第二靶标ID或所述第二靶标ID替代物和(c)所述样品ID，其中(a)、(b)和(c)顺序布置为(a)，然后(b)，然后(c)。在另一个实施方式中，所述核酸报告分子包含(a)所述第一靶标ID或所述第一靶标ID替代物，(b)所述第二靶标ID或所述第二靶标ID替代物和(c)所述样品ID，其中(a)、(b)和(c)顺序布置为(b)，然后(a)，然后(c)。在另一个实施方式中，所述核酸报告分子包含(a)所述第一靶标ID或所述第一靶标ID替代物，(b)所述第二靶标ID或所述第二靶标ID替代物和(c)所述样品ID，其中(a)、(b)和(c)顺序布置为(c)，然后(a)，然后(b)。在其它实施方式中，所述核酸报告分子包含(a)所述第一靶标ID或所述第一靶标ID替代物，(b)所述第二靶标ID或所述第二靶标ID替代物和(c)所述样品ID，其中(a)、(b)和(c)顺序布置为(c)，然后(b)，然后(a)。
另外，在本文所提供的方法的一些实施方式中，所述核酸报告分子可以在所述第一替代物、所述第二替代物、所述第一靶标ID替代物或所述第二靶标ID替代物中含有样品ID，在照此的每种情况下，本文，包括在本第5.2.6节中提供了第一替代物、第二替代物、第一靶标ID替代物或第二靶标ID替代物。
由于本文，包括本第5.2.6节中所提供的方法可以将每种分析物与本文所提供的一种或多种靶标ID相关联，因为所述测定方法可以通过同时检测与每种分析物相关联的靶标ID并将靶标ID与分析物相关联来同时检测所述样品中的至少两种分析物。因此，在一些实施方式中，本文所提供的测定方法通过同时检测与每种分析物相关联的独特靶标ID，同时检测所述样品中至少3、至少4、至少5、至少6、至少7、至少8、至少9、至少10、至少12、至少15、至少20、至少30、至少40、至少50、至少60、至少70、至少80、至少90或者至少100种分析物。在其它实施方式中，本文所提供的测定方法通过同时检测与每种分析物有关的独特靶标ID，同时检测了所述样品中约3、约4、约5、约6、约7、约8、约9、约10、约12、约15、约20、约30、约40、约50、约60、约70、约80、约90或约100种分析物。在某些实施方式中，本文所提供的测定方法通过同时检测与每种分析物相关联的独特靶标ID，同时检测所述样品中至少100、至少150、至少200、至少250、至少300、至少350、至少400、至少450、至少500、至少550、至少600、至少650、至少700、至少750、至少800、至少850、至少900、至少950、至少1000、至少1100、至少1200、至少1300、至少1400、至少1500、至少1600、至少1700、至少1800、至少1900或至少2000种分析物。在其它实施方式中，本文所提供的测定方法通过同时检测与每种分析物相关联的独特靶标ID，同时检测所述样品中约100、约150、约200、约250、约300、约350、约400、约450、约500、约550、约600、约650、约700、约750、约800、约850、约900、约950、约1000、约1100、约1200、约1300、约1400、约1500、约1600、约1700、约1800、约1900或约2000种分析物。
为了确保从所述分析物所产生的信号在检测范围内，可以将来自所述分析物的信号放大或增强或者可以调低。本文所提供的用于减少从高浓度靶标分析物所产生的报告分子数目的方法包括降低捕获的准确且已知的比例，从而可以将有限的检测带宽有效分配给不同的靶标分析物。因此，在一些实施方式中，本文，包括本第5.2.6节中所提供的方法包括部分捕获方式，如第3和5.2.5节所提供的。在一个具体的实施方式中，本文所提供的方法包括通过在步骤(1)中将无功能结合剂添加至所述溶液，从所述分析物中的至少一种按比例降低信号，其中所述无功能结合剂与所述第一结合剂竞争与所述分析物的结合，但是所述无功能结合剂未缀合或缀合至不结合所述第一接受基团的递呈基团。
本发明公开提供可以准确确定并从多类噪音中解析出正确信号，因为所述方法提供了所述靶标ID和具体靶标之间的相关性。在一些实施方式中，仅将包含全部与所述靶标正确相关联的靶标ID的核酸报告分子确定为特定靶标的信号。在一个具体的实施方式中，在一些实施方式中，仅将包含均与所述靶标正确相关联的两个靶标ID的核酸报告分子确定为特定靶标的信号。在本文，包括本第5.2.6节中所提供的方法的另一个具体实施方式中，检测所述分析物包括所述第一和所述第二靶标ID的共检测。在本文，包括本第5.2.6节中所提供的方法的其它具体实施方式中，所述方法的步骤(4)中的检测所述分析物包括所述第一和所述第二靶标ID的共检测。
如根据图23A-23B清楚地，可以对包含所述第一和所述第二靶标ID的核酸报告分子进行测序和定量。照此，为了将多重测定中每种测定对每种分析物的灵敏度和特异性维持在与单重测定相同的水平上，可以识别，从其它报告分子中解析出并确定从分析物的第一结合剂和第二结合剂的预期结合对所产生的报告分子。在本文所提供的方法，包括本第5.2.6节中的那些方法的一些实施方式中，可以确定包含与靶标分析物的所述第一结合剂和所述第二结合剂的预期结合对相关联的靶标ID(例如，所述第一靶标ID和所述第二靶标ID)的报告分子并将其从包含与预期在结合靶标分析物中不配对的所述第一结合剂和所述第二结合剂相关的靶标ID的报告分子中解析出。在某些实施方式中，可以确定从与靶标分析物的所述第一结合剂和所述第二结合剂的预期结合对相关联的靶标标记(例如，所述第一靶标标记和所述第二靶标标记)所产生的报告分子并将其从与预期在结合靶标分析物中不配对的所述第一结合剂和所述第二结合剂相关联的靶标标记所产生的报告分子中解析出。在其它实施方式中，可以确定从与靶标分析物的所述第一结合剂和所述第二结合剂的预期结合对相关联的递呈基团(例如，所述第一递呈基团和所述第二递呈基团)所产生的报告分子并将其从与预期在结合靶标分析物中不配对的所述第一结合剂和所述第二结合剂相关联的递呈基团所产生的报告分子中解析出。
本发明公开还提供并且本领域的常规技术人员通过阅读本发明申请将理解在本文，包括在本第5.2.6节中所提供的方法的一些实施方式中，所述方法还包括混合参比分析物，从而可以根据从所述参比分析物所产生的报告分子归一化样品间差异。在本文，包括在本第5.2.6节中所提供的方法的一个实施方式中，所述方法还包括混合参比分析物。在另一个实施方式中，所述方法的步骤(1)还包括混合参比分析物。在另一个实施方式中，所述参比分析物是在所述样品中不存在的分析物。在其它实施方式中，所述参比分析物是所述样品中不存在的蛋白、核酸或化合物。在一个实施方式中，所述参比分析物是病毒蛋白、细菌蛋白或昆虫蛋白。在另一个实施方式中，所述参比分析物是病毒核酸分子、细菌核酸分子或昆虫核酸分子。
如根据本发明公开清楚地，所述方法的多种实施方式提供了包含样品ID和/或靶标ID的核酸报告分子。照此，在一些实施方式中，本文所提供的方法包括通过同时检测与每种样品相关联的核酸报告分子中的独特样品ID，同时检测至少两个样品中的所述分析物。在其它实施方式中，本文所提供的方法包括通过同时检测与每种分析物相关联的独特样品ID和独特靶标ID以及与每种样品相关联的独特样品ID，同时检测至少两种样品中的至少两种分析物。在一些其它实施方式中，本文所提供的方法还包括同时检测任何数目的样品，如第3、5.2.5和6节中所提供的。在其它实施方式中，本文所提供的方法还包括同时检测与如第3、5.2.5和6节中所提供的任何数目的靶标任意组合的如第3、5.2.5和6节中所提供的任何数目的样品。在一些其它实施方式中，本文所提供的方法还包括在所述方法的检测步骤之前或同时混合来自至少两个样品的所述核酸报告分子。在一些其它实施方式中，本文所提供的方法还包括在所述方法的检测步骤之前或同时混合来自至少两个样品的至少两种分析物的所述核酸报告分子。在某些实施方式中，本文所提供的方法还包括在所述方法的检测步骤之前或同时混合如第3、5.2.5和6节中所提供的任何数目的样品。在其它实施方式中，本文所提供的方法还包括在所述方法的检测步骤之前或同时，混合与如第3、5.2.5和6节中所提供的任何数目的靶标任意组合的如第3、5.2.5和6节中所提供的任何数目的样品。
另外，在本文，包括在本第5.2.6节中所提供的方法的一些实施方式中，可以通过多重qPCR、多重数字PCR或NGS检测本文所公开的多重测定方法中的所述核酸报告分子，照此在第3、5.2.5和6节中提供了多重qPCR、多重数字PCR或NGS。在具体的实施方式中，通过NGS检测所述核酸报告分子。在第3、5.2.5和6节中进一步提供了这种NGS。
如以上进一步描述的，可以根据从所述参比分析物所产生的报告分子的水平归一化在本文所提供的方法中所产生的报告分子的样品间差异。因此，在本文，包括在本第5.2.6节中所提供的方法的一个实施方式中，所述方法还包括对从所述参比分析物所产生的报告分子归一化从所述样品的分析物所产生的报告分子。在另一个实施方式中，所述方法的检测步骤还包括将从所述样品的分析物所产生的报告分子对从所述参比分析物所产生的报告分子进行归一化。
在本文所提供的方法的一些实施方式中，所述固体表面可以是在本领域中已知和使用的任何适合的固体表面。在本文，包括在本第5.2.6节中所提供的方法的某些实施方式中，所述固体表面可以是如第3、5.2.2至5.3.3和6节中所提供的任何固体表面。在本文，包括在本第5.2.6节中所提供的方法的一些其它实施方式中，所述第一固体表面可以是第3、5.2.2至5.3.3和6节中所提供的任何固体表面，并且所述第二固体表面可以是第3、5.2.2至5.3.3和6节中所提供的任何固体表面。在一个实施方式中，所述第一固体表面是磁性颗粒表面。在另一个实施方式中，所述第一固体表面是微量滴定板的孔。在其它实施方式中，所述第二固体表面是磁性颗粒表面。在另一个实施方式中，所述第二固体表面是微量滴定板的孔。在一个实施方式中，所述第一固体表面是磁性颗粒表面并且所述第二固体表面是磁性颗粒表面。在另一个实施方式中，所述第一固体表面是磁性颗粒表面并且所述第二固体表面是微量滴定板的孔。在其它实施方式中，所述第一固体表面是微量滴定板的孔并且所述第二固体表面是磁性颗粒表面。在其它实施方式中，所述第一固体表面是微量滴定板的孔并且所述第二固体表面是微量滴定板的孔。
另外，本发明公开提供了并且本领域的常规技术人员通过阅读本发明公开将理解本第5.2.6节中所提供的方法的任何实施方式可以与本第5.2.6节以及本发明公开的其它节，包括第3、4、5.1、5.2.1至5.2.5、5.3、5.4和6节中所提供的任何其它实施方式组合。
在一个具体方面，本文提供了用于检测样品中分析物的测定方法，其包括：
(1)将包含第一结合剂和第一递呈基团的第一结合部分、包含第二结合剂和第二递呈基团的第二结合部分和样品在溶液中混合，其中：
(i)所述第一和第二结合剂结合至分析物并形成免疫复合物，
(ii)通过第一递呈基团和偶联至第一固体表面的第一接受基团之间的结合，将所述免疫复合物捕获至与溶液接触的第一固体表面上，并且
(iii)所述第一结合部分还包含第一靶标标记，所述第一靶标标记包含分析物特异的(“靶标ID”)第一标识码(“ID”)，并且所述第二结合部分还包含第二靶标标记，所述第二靶标标记包含第二靶标ID；
(2)清洗所述第一固体表面以除去未结合的分子；
(3)通过破坏所述第一递呈基团和所述第一接受基团之间的结合从所述第一固体表面释放所述免疫复合物；
(4)引入第二固体表面并通过所述第二递呈基团和偶联至所述第二固体表面的所述第二接受基团之间的结合将所述免疫复合物重新捕获至所述第二固体表面上；
(5)清洗所述第二固体表面以除去未结合的分子；
(6)将包含样品特异的ID(“样品ID”)的样品标记结合(i)至所述第一靶标标记，(ii)至所述第二靶标标记或者(iii)至所述第一靶标标记和所述第二靶标标记两者；
(7)基于所述第一靶标标记和所述第二靶标标记之间的邻近性从所述免疫复合物产生核酸报告分子，其中所述核酸报告分子包含所述第一靶标ID、所述第二靶标ID和所述样品ID；
(8)通过破坏所述第二递呈基团和所述第二接受基团之间的结合从所述第二固体表面释放所述免疫复合物；和
(9)通过qPCR检测所述核酸报告分子，借此检测所述分析物。
在另一个具体方面，本文提供了用于检测至少两种样品中的分析物的测定方法，其包括：
(1)将包含第一结合剂和第一递呈基团的第一结合部分、包含第二结合剂和第二递呈基团的第二结合部分和样品在溶液中混合，其中：
(i)所述第一和第二结合剂结合至分析物并形成免疫复合物，
(ii)通过第一递呈基团和偶联至第一固体表面的第一接受基团之间的结合，将所述免疫复合物捕获至与溶液接触的第一固体表面上，并且
(iii)所述第一结合部分还包含第一靶标标记，所述第一靶标标记包含分析物特异的(“靶标ID”)第一标识码(“ID”)，并且所述第二结合部分还包含第二靶标标记，所述第二靶标标记包含第二靶标ID；
(2)清洗所述第一固体表面以除去未结合的分子；
(3)通过破坏所述第一递呈基团和所述第一接受基团之间的结合从所述第一固体表面释放所述免疫复合物；
(4)引入第二固体表面并通过所述第二递呈基团和偶联至所述第二固体表面的所述第二接受基团之间的结合将所述免疫复合物重新捕获至所述第二固体表面上；
(5)清洗所述第二固体表面以除去未结合的分子；
(6)将包含样品特异的ID(“样品ID”)的样品标记结合(i)至所述第一靶标标记，(ii)至所述第二靶标标记或者(iii)至所述第一靶标标记和所述第二靶标标记两者；
(7)基于所述第一靶标标记和所述第二靶标标记之间的邻近性从所述免疫复合物产生核酸报告分子，其中所述核酸报告分子包含所述第一靶标ID、所述第二靶标ID和所述样品ID；
(8)混合来自所述至少两个样品的所述核酸报告分子；
(9)通过破坏所述第二递呈基团和所述第二接受基团之间的结合从所述第二固体表面释放所述免疫复合物；
(9)扩增所述核酸报告分子；
(10)纯化所述核酸报告分子；和
(11)通过下一代测序(NGS)检测所述核酸报告分子，借此检测所述分析物。
5.3系统
本文还提供了用于实施本文所公开的测定方法的系统。本文所公开的系统可以用于检测样品中的分析物。本文所公开的系统还可以用于检测样品中的多个分析物、多个样品中的分析物或者多个样品中的多个分析物。在一些实施方式中，本文所提供的系统用于实施定性检测样品中分析物的测定方法。在一些实施方式中，本文所提供的系统用于实施定量检测样品中分析物的测定方法。在一些实施方式中，本文所提供的系统包含在试剂盒中。
5.3.1使用双捕获结合剂的系统
在一些实施方式中，本文提供了用于检测样品中分析物的系统，其包含：第一结合剂、第二结合剂、第一递呈基团、第二递呈基团、第一接受基团和第二接受基团；其中(i)所述第一和第二结合剂结合所述分析物上的非干扰表位，并且(ii)所述第一和第二递呈基团分别可以结合所述第一和第二接受基团。
在一些实施方式中，所述系统还包含第一固体表面和第二固体表面。所述第一和第二接受基团分别可以偶联至所述第一和第二固体表面。在一些实施方式中，所述系统还包含可检测标志物。在本文所提供的系统中，所述可检测标志物可以缀合至所述第一结合剂。在本文所提供的系统中，所述可检测标志物可以缀合至所述第二结合剂。
所述第一和所述第二结合剂分别可以缀合至所述第一和第二递呈基团。在一些实施方式中，在本文所提供的系统中，所述第一结合剂可以缀合至所述第一递呈基团。在一些实施方式中，在本文所提供的系统中，所述第二结合剂可以缀合至所述第二递呈基团。在一些实施方式中，在本文所提供的系统中，所述第一和所述第二结合剂两者分别缀合至所述第一和第二递呈基团。
在一些实施方式中，在本文所提供的系统中，所述第一固体表面与所述第一接受基团偶联。在一些实施方式中，在本文所提供的系统中，所述第二第一固体表面与所述第二接受基团偶联。在一些实施方式中，在本文所提供的系统中，所述第一和第二固体表面两者分别与所述第一和第二接受基团偶联。
所述递呈基团和接受基团可以是本文所公开的任何结合对，包括(例如)抗体和抗原、配体和受体、互补核酸、生物素和抗生物素蛋白(或者链霉亲和素或中性抗生物素蛋白)、凝集素和碳水化合物，并且反之亦然。在一些实施方式中，所述第一递呈基团通过硫酯基团结合所述第一接受基团。所述第一递呈基团还可以通过二硫键结合所述第一接受基团。所述第一递呈基团还可以通过可切割键结合所述第一接受基团。在一些实施方式中，所述第二递呈基团通过硫酯基团结合所述第二接受基团。所述第二递呈基团还可以通过二硫键结合所述第二接受基团。所述第二递呈基团还可以通过可切割键结合所述第二接受基团。在一些实施方式中，所述第一和所述第二递呈基团两者分别通过硫酯基团、二硫键或可切割键结合所述第一和第二接受基团。
在一些实施方式中，所述第一递呈基团通过光可切割键结合所述第一接受基团。所述第一递呈基团还可以通过化学可切割键结合所述第一接受基团。所述第一递呈基团还可以通过酶促可切割键结合所述第一接受基团。在一些实施方式中，所述第二递呈基团通过光可切割键结合所述第二接受基团。所述第二递呈基团还可以通过化学可切割键结合所述第二接受基团。所述第二递呈基团还可以通过酶促可切割键结合所述第二接受基团。在一些实施方式中，所述第一和第二递呈基团两者分别通过光可切割键、化学可切割键或酶促可切割键结合所述第一和所述第二接受基团。
在一些实施方式中，本文提供了用于检测样品中分析物的系统，其包含：第一结合剂、第二结合剂、第一核酸标签(“第一标签”)、第二核酸标签(“第二标签”)、第一核酸捕获探针(“第一探针”)和第二核酸捕获探针(“第二探针”)；其中(i)所述第一和第二结合剂结合所述分析物上的非干扰表位；(ii)所述第一探针或其片段与所述第一标签或其片段互补；和(iii)所述第二探针或其片段与所述第二标签或其片段互补。
在一些实施方式中，本文所提供的系统还包括第一固体表面和第二固体表面。所述第一和第二固体表面分别可以与所述第一和第二探针偶联。在一些实施方式中，所述第一固体表面与所述第一探针偶联。在一些实施方式中，所述第二第一固体表面与所述第二探针偶联。在一些实施方式中，所述第一和第二固体表面分别与所述第一和第二探针偶联。
所述第一和第二结合剂分别可以缀合至所述第一和第二标签。在一些实施方式中，将所述第一结合剂缀合至所述第一标签。在一些实施方式中，所述第二结合剂缀合至所述第二标签。在一些实施方式中，所述第一和所述第二结合剂两者分别缀合至所述第一和第二标签。
在一些实施方式中，本文所提供的系统还包括通用探针。所述通用探针可以是(例如)多聚A或多聚T。在一些实施方式中，在本文所提供的系统中，所述第一固体表面与所述通用探针偶联。
在一些实施方式中，本文提供了用于实施本文所公开的用于检测分析物的NULISA测定的系统，其包括：(1)结合所述分析物的非干扰表位的第一抗体和第二抗体；(2)第一核酸标签(“第一标签”)、第二核酸标签(“第二标签”)、第一核酸捕获探针(“第一探针”)和第二核酸捕获探针(“第二探针”)；其中所述第一探针或其片段与所述第一标签或其片段互补；并且所述第二探针或其片段与所述第二标签或其片段互补。在一些实施方式中，所述第一标签和所述第一探针的互补片段由10-25个A/T对组成，并且所述第二标签和所述第二探针的互补片段由10-25个A/T对组成。
5.3.2使用单捕获结合剂的系统
在一些实施方式中，本文提供了用于检测样品中分析物的系统，其包含：第一结合剂、第二结合剂、第一递呈基团、第一接受基团和第二接受基团；其中(i)所述第一和第二结合剂结合所述分析物上的非干扰表位，(ii)所述第一递呈基团可以结合所述第一接受基团，和(iii)所述第二接受基团结合所述第一递呈基团。在一些实施方式中，所述第二接受基团与所述第一接受基团相同。
在一些实施方式中，本文所提供的系统还包括第一固体表面和第二固体表面。所述第一固体表面和第二固体表面分别可以与所述第一和第二接受基团偶联。在一些实施方式中，在本文所提供的系统中，所述第一固体表面与所述第一接受基团偶联。在一些实施方式中，在本文所提供的系统中，所述第二第一固体表面与所述第二接受基团偶联。在一些实施方式中，在本文所提供的系统中，所述第一和第二固体表面两者分别与所述第一和第二接受基团偶联。
在一些实施方式中，所述第一结合剂与所述第一递呈基团缀合。
在一些实施方式中，本文所提供的系统还包括可检测标志物。在一些实施方式中，在本文所提供的系统中，所述可检测标志物缀合至所述第二结合剂。在一些实施方式中，在本文所提供的系统中，所述第一结合剂缀合至所述第一结合剂。
所述递呈基团和接受基团可以是本文所公开的任何可释放和可再生结合对，包括(例如)抗体和抗原、配体和受体、互补核酸、生物素和抗生物素蛋白(或者链霉亲和素或中性抗生物素蛋白)、凝集素和碳水化合物，并且反之亦然。在一些实施方式中，所述第一递呈基团通过硫酯基团结合所述第一接受基团。所述第一递呈基团还可以通过二硫键结合所述第一接受基团。所述第一递呈基团还可以通过可切割键结合所述第一接受基团。在一些实施方式中，所述第一递呈基团通过硫酯基团结合所述第二接受基团。所述第一递呈基团还可以通过二硫键结合所述第二接受基团。所述第一递呈基团还可以通过可切割键结合所述第二接受基团。在一些实施方式中，所述第一递呈基团分别通过硫酯基团、二硫键或可切割键结合所述第一和第二接受基团两者。
在一些实施方式中，所述第一递呈基团通过光可切割键结合所述第一接受基团。所述第一递呈基团还可以通过化学可切割键结合所述第一接受基团。所述第一递呈基团还可以通过酶促可切割键结合所述第一接受基团。在一些实施方式中，所述第一递呈基团通过光可切割键结合所述第二接受基团。所述第一递呈基团还可以通过化学可切割键结合所述第二接受基团。所述第一递呈基团还可以通过酶促可切割键结合所述第二接受基团。在一些实施方式中，所述第一递呈基团分别通过光可切割键、化学可切割键或酶促可切割键结合所述第一和所述第二接受基团。
在一些实施方式中，本文提供了用于检测样品中分析物的系统，其包含：第一结合剂、第二结合剂、第一核酸标签(“第一标签”)、第一核酸捕获探针(“第一探针”)、第二核酸捕获探针(“第一标签”)；其中(i)所述第一和第二结合剂结合所述分析物上的非干扰表位；(ii)所述第一探针或其片段与所述第一标签或其片段互补；和(iii)所述第二探针或其片段与所述第一标签或其片段互补。在一些实施方式中，所述第二探针与所述第一探针相同。
在一些实施方式中，本文所提供的系统还包括第一固体表面和第二固体表面。所述第一固体表面可以与所述第一探针偶联。所述第二固体表面可以与所述第二探针偶联。在一些实施方式中，在本文所提供的系统中，所述第一固体表面与所述第一探针偶联。在一些实施方式中，在本文所提供的系统中，所述第二第一固体表面与所述第二探针偶联。
在本文所提供的系统中，所述第一结合剂可以缀合至所述第一标签。所述第一结合剂或所述第二结合剂中的任一个可以缀合至所述可检测标志物。在一些实施方式中，在本文所提供的系统中，将所述第一结合剂缀合至所述第一标签。在一些实施方式中，所述第一结合剂缀合至所述可检测标志物。在一些实施方式中，在本文所提供的系统中，所述第二结合剂缀合至所述可检测标志物。
在一些实施方式中，本文提供了用于实施本文所公开的用于检测分析物的NULISA测定的系统，其包括：(1)结合所述分析物的非干扰表位的第一抗体和第二抗体，和(2)核酸标签(“标签”)和核酸捕获探针(“探针”)，其中所述探针或其片段与所述标签或其片段互补。在一些实施方式中，所述标签缀合至所述第一抗体。在一些实施方式中，所述标签和所述探针的互补片段由10-25个A/T对组成，并且所述第二标签和所述第二探针的互补片段由10-25个A/T对组成。在一些实施方式中，本文所提供的系统还包括固体表面。在一些实施方式中，所述探针偶联至所述固体表面。
在一些实施方式中，本文所提供的系统还包括第二核酸标签(“第二标签”)。在一些实施方式中，所述第二标签缀合至所述第二抗体。
在一些实施方式中，本文所提供的系统还包括第二核酸捕获探针(“第二探针”)。在一些实施方式中，本文所提供的系统还包括第二固体表面。在一些实施方式中，所述第二探针偶联至所述第二固体表面。
在一些实施方式中，所述第二标签或其片段与所述探针或其片段互补。
在一些实施方式中，所述标签或其片段与所述第二探针或其片段互补。
5.3.3系统组分
本文所提供的用于检测分析物的系统含有结合所述分析物的非干扰表位的第一结合剂和第二结合剂。所述系统中的结合剂可以是本文所公开的任何结合剂，其可以是结合特异性靶标分析物的分子或分子的一部分。结合剂可以包括蛋白、肽、核酸、碳水化合物、脂质或小分子。在一些实施方式中，结合剂包括抗体。在一些实施方式中，结合剂包括抗体的抗原-结合片段。在一些实施方式中，结合剂包括抗体模拟物。在一些实施方式中，结合剂包括小分子。
在本文所公开的系统中使用的结合剂可以缀合至递呈基团(例如，核酸标签)。所述结合剂和递呈基团可以直接通过键或间接通过连接基团连接在一起。本文所提供的系统还可以包括连接基团。所述连接基团可以是本文所公开的或另外本领域中已知的任何连接基团。
在本文所公开的系统中使用的递呈基团和接受基团可以是本文所公开的或另外本领域中已知的任何结合对，其包括(但不限于)抗原和所述抗原的抗体(包括其片段、衍生物或模拟物)、配体及其受体、核酸的互补链、生物素和抗生物素蛋白(或者链霉亲和素或中性抗生物素蛋白)、凝集素和碳水化合物，并且反之亦然。“递呈基团”和“接受基团”的其它结合对包括荧光素和抗-荧光素、地高辛/抗-地高辛以及DNP(二硝基苯酚)/抗-DNP，并且反之亦然。在一些实施方式中，“递呈基团”和“接受基团”的结合对是核酸的互补链，并且称为“标记”和“探针”。在一些实施方式中，“递呈基团”和“接受基团”的结合对是抗原和抗体，或者抗原和抗体片段，并且反之亦然。
在一些实施方式中，本文所提供的系统包括核酸标签和核酸捕获探针，其中所述标签或其片段与所述探针或其片段互补。如本领域的常规技术人员将理解的，可以使用具有适当杂交强度的任何序列。
在一些实施方式中，在本文所提供的系统中所使用的所述标签和所述探针的互补片段的超过80％、超过85％、超过90％、超过95％或超过98％是腺嘌呤(“A”)和胸腺嘧啶(“T”)对。在一些实施方式中，所述第一标签和所述第一探针的互补片段的超过80％、超过85％、超过90％、超过95％或超过98％是A和T对。在一些实施方式中，所述第二标签和所述第二探针的互补片段的超过80％、超过85％、超过90％、超过95％或超过98％是A和T对。在一些实施方式中，所述第一标签和所述第一探针的互补片段的超过80％是A和T对，并且所述第二标签和所述第二探针的互补片段的超过80％是A和T对。在一些实施方式中，所述第一标签和所述第一探针的互补片段包含A和T对，并且所述第二标签和所述第二探针的互补片段包含A和T对。
在一些实施方式中，在本文所提供的系统中使用的核酸标签和核酸捕获探针的互补片段由10至30个碱基对、10至25个碱基对、12至20个碱基对或者10至16个碱基对组成。在一些实施方式中，在本文所提供的系统中使用的核酸标签和核酸捕获探针的互补片段由10至25个碱基对组成。在一些实施方式中，在本文所提供的系统中使用的核酸标签和核酸捕获探针的互补片段由12至20个碱基对组成。在一些实施方式中，在本文所提供的系统中使用的核酸标签和核酸捕获探针的互补片段由12至16个碱基对组成。在一些实施方式中，在本文所提供的系统中使用的核酸标签和核酸捕获探针的互补片段由12至14个碱基对组成。在一些实施方式中，所述第一标签和所述第一探针的互补片段由10至25个碱基对组成。在一些实施方式中，所述第二标签和所述第二探针的互补片段由10至25个碱基对组成。在一些实施方式中，所述第一标签和所述第一探针的互补片段由12至20个碱基对组成。在一些实施方式中，所述第二标签和所述第二探针的互补片段由12至20个碱基对组成。在一些实施方式中，所述第一标签和所述第一探针的互补片段由12至16个碱基对组成。在一些实施方式中，所述第二标签和所述第二探针的互补片段由12至16个碱基对组成。
在本文所公开的系统中使用的固体表面还可以包括本领域中已知的任何载体，在所述载体上可以用于分子的固定化。在一些实施方式中，所述固体表面可以是适合于连接核酸并有助于测定步骤的任何表面。固体表面的实例包括珠(例如，磁珠、
Figure BDA0003780256640001411
珠)、颗粒、胶体、单界面、管、芯片、多孔板、微量滴定板、载玻片、膜、比色皿、凝胶和树脂。示例性固体表面可以包括磁性颗粒的表面和微量滴定板的孔。当所述固相为颗粒材料(例如，珠)时，它可以在多孔板的孔中分布以允许平行处理。在一些实施方式中，所述固体表面是磁珠的表面。所述磁珠可以与递呈基团偶联。在一些实施方式中，所述磁珠可以是羧酸酯-修饰的磁珠、胺-封闭的磁珠、低聚(dT)-涂覆的磁珠、链霉亲和素-涂覆的磁珠、蛋白A/G涂覆的磁珠或者二氧化硅-涂覆的磁珠。在一些实施方式中，所述固体表面是微量滴定板的孔。在一些实施方式中，所述第一和第二固体表面是相同的。在一些实施方式中，所述第一和所述第二固体表面是不同的。在一些实施方式中，在本文所公开的测定方法中使用的所述第一和第二固体表面两者是磁性颗粒的表面。在一些实施方式中，在本文所公开的测定方法中使用的所述第一和第二表面两者是微量滴定板的表面。
本领域中已知的任何检测标志物可以包括在本发明公开的系统中。在一些实施方式中，所述检测标志物是比色检测试剂、荧光检测试剂或化学发光检测试剂。在一些实施方式中，所述比色检测试剂包括PNPP(磷酸对-硝基苯酯)、ABTS(2,2'-联氮-双(3-乙基苯并噻唑-6-磺酸))或者OPD(o-苯二胺)。在一些实施方式中，所述荧光检测试剂包括QuantaBluTM或者QuantaRedTM(Thermo Scientific,Waltham,MA)。在一些实施方式中，所述发光检测试剂包括luminol或萤光素。在一些实施方式中，所述检测试剂包括引发剂(例如，H2O2)和示踪剂(例如，异鲁米诺-缀合物)。
在一些实施方式中，本文所提供的系统还包括第二抗体。第二抗体可以是单克隆或多克隆抗体。第二抗体可以来源于任何哺乳动物，包括牛、小鼠、大鼠、仓鼠、山羊、骆驼、鸡、兔等。第二抗体可以包括(例如)抗-人IgA抗体、抗-人IgD抗体、抗-人IgE抗体、抗-人IgG抗体或者抗-人IgM抗体。第二抗体可以缀合至酶(例如，辣根过氧化物酶(HRP)、碱性磷酸酶(AP)、荧光素酶等)或者染料(例如，比色染料、荧光染料、荧光能量共振转移(FRET)-染料、时间分辨(TR)-FRET染料等)。在一些实施方式中，所述第二抗体是多克隆兔-抗-人IgG抗体，其是HRP-缀合的。
在一些实施方式中，本文所提供的用于检测分析物的系统包含在试剂盒中。在一些实施方式中，本发明公开所述的试剂盒可以包括辅助试剂。在一些实施方式中，本文所提供的试剂盒还包括固定化缓冲液、清洗缓冲液、释放缓冲液或它们的任意组合。
在一些实施方式中，所述辅助试剂是固定化缓冲液，它可以是本领域中已知的任何固定化试剂，包括共价和非共价固定化试剂。共价固定化试剂可以包括可以用于在表面上共价固定化肽或核酸的任何化学或生物学试剂。共价固定化试剂可以包括(例如)羧基-至-胺反应基团(例如，碳二亚胺，如EDC或DCC)、胺反应基团(例如，N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)酯、亚氨酸酯)、巯基反应性交联剂(例如，马来酰亚胺、卤代乙酰基、二硫吡啶)、羰基-反应性交联剂基团(例如，酰肼、烷氧基胺)、光反应性交联剂(例如，芳基叠氮化物、双吖丙啶)或者化学选择性连接基团(例如，史陶丁格反应对)。非共价固定化试剂包括可以用于在表面上非共价固定化肽或核酸的任何化学或生物学试剂，如亲合标签(例如，生物素)或捕获剂(例如，链霉亲和素或抗-标签抗体，如抗-His6或抗-Myc抗体)。
本发明公开所述的试剂盒可以包括固定化试剂的组合。这些组合包括(例如)EDC和NHS，其可以用于(例如)在表面，如羧化葡聚糖基质(例如，在BIAcoreTM CM5芯片或葡聚糖-基珠上)上固定化本发明公开的蛋白。可以将固定化试剂的组合作为预混合的试剂组合储存，或者将所述组合的一种或多种固定化试剂与其它固定化试剂分开储存。
大量清洗缓冲液在本领域中是已知的，如三(羟甲基)氨基甲烷(Tris)-基缓冲液(例如，Tris-缓冲盐水，TBS)或者磷酸盐缓冲液(例如，磷酸盐缓冲盐水，PBS)。清洗缓冲液可以包括去污剂，如离子或非离子型去污剂。在一些实施方式中，所述清洗缓冲液是包括
Figure BDA0003780256640001431
(例如，约0.05％
Figure BDA0003780256640001432
)的PBS缓冲液(例如，约pH 7.4)。
在一些实施方式中，本文所提供的试剂盒还包括20×SSC缓冲液储液。
在一些实施方式中，本文所提供的试剂盒还包括实施本文所提供的测定方法的说明书。
5.3.4具有靶标ID和/或样品ID的系统
在一个方面，本文提供了用于检测样品中分析物的系统，其包括：(i)第一结合部分，其包含第一结合剂、第一递呈基团和第一靶标标记；(ii)第二结合部分，其包含第二结合剂和第二靶标标记；和(iii)第一接受基团；和其中(i)所述第一和第二结合剂结合所述分析物上的表位；和(ii)所述第一递呈基团结合所述第一接受基团。
如第5.1节中所述，靶标标记可以提供可以与特定靶标相关联的识别符以帮助检测和鉴定靶标分子。照此，在本文所提供的系统，包括本节(第5.3.4节)和前段中的那些系统的一些实施方式中，每个靶标标记可以包含一个或多个靶标ID。在一个具体的实施方式中，所述第一靶标标记包含第一靶标ID。在另一个实施方式中，所述第二靶标标记包含第二靶标ID。在另一个实施方式中，所述第一靶标标记包含第一靶标ID，并且所述第二靶标标记包含第二靶标ID。
在一个方面，本文提供了用于检测样品中分析物的系统，其包括：(i)第一结合部分，其包含第一结合剂、第一递呈基团和第一靶标标记，所述第一靶标标记包含第一标识码(“ID”)，它是分析物特异的(“靶标ID”)；(ii)第二结合部分，其包含第二结合剂和第二靶标标记，所述第二靶标标记包含第二靶标ID；和(iii)第一接受基团；和其中(i)所述第一和第二结合剂结合所述分析物上的表位；和(ii)所述第一递呈基团结合所述第一接受基团。
在一个方面，本文提供了用于检测样品中分析物的系统，其包括：包含第一结合剂和第一递呈基团的第一结合部分、包含第二结合剂的第二结合部分，和第一接受基团；其中
(i)所述第一和第二结合剂结合所述分析物上的非干扰表位；
(ii)所述第一递呈基团结合所述第一接受基团；
(iii)所述第一结合部分，其包含第一靶标标记，所述第一靶标标记包含第一标识码(“ID”)，它是分析物特异的(“靶标ID”)；和
(iv)所述第二结合部分包含第二靶标标记，所述第二靶标标记包含第二靶标ID。
如以上第5.2.1.1节中所述，可以从来源于所述第一结合剂(即所述第一递呈基团和所述第一接受基团之间)的结合释放所述第一和第二结合剂和所述分析物，并且通过所述第二结合剂重新捕获以进一步提高信噪比。图21A-21F显示了包括这种双捕获的系统的示例性示意图。因此，在本文所提供的系统的一个实施方式中，所述第二结合部分还包含第二递呈基团、第二接受基团，并且其中所述第二递呈基团结合所述第二接受基团。照此，在一个实施方式中，本文所提供的系统包含：包含第一结合剂和第一递呈基团的第一结合部分、包含第二结合剂的第二结合部分、第二递呈基团、第一接受基团和第二接受基团；其中
(i)所述第一和第二结合剂结合所述分析物上的非干扰表位；
(ii)所述第一递呈基团结合所述第一接受基团；
(iii)所述第二递呈基团结合所述第二接受基团；
(iv)所述第一结合部分包含第一靶标标记，所述第一靶标标记包含第一标识码(“ID”)，它是分析物特异的(“靶标ID”)；和
(v)所述第二结合部分包含第二靶标标记，所述第二靶标标记包含第二靶标ID。
每个结合部分可以包含一个或多个靶标标记。在一个实施方式中，所述第一结合部分包含一个靶标标记。在另一个实施方式中，所述第一结合部分包含两个靶标标记。在其它实施方式中，所述第一结合部分包含3个靶标标记。在另一个实施方式中，所述第一结合部分包含4个靶标标记。在另一个实施方式中，所述第一结合部分包含5个或更多个靶标标记。在一个实施方式中，所述第二结合部分包含一个靶标标记。在另一个实施方式中，所述第二结合部分包含2个靶标标记。在其它实施方式中，所述第二结合部分包含3个靶标标记。在另一个实施方式中，所述第二结合部分包含4个靶标标记。在另一个实施方式中，所述第二结合部分包含5个或更多个靶标标记。在一些实施方式中，所述第一结合部分和所述第二结合部分之间的靶标标记是不同的。在某些实施方式中，所述第一结合部分和所述第二结合部分之间的靶标标记是相同的。在一些其它实施方式中，所述第一结合部分内的靶标标记是不同的。在其它实施方式中，所述第一结合部分内的靶标标记是相同的。在一些其它实施方式中，所述第二结合部分内的靶标标记是不同的。在其它实施方式中，所述第二结合部分内的靶标标记是相同的。在一些实施方式中，所述第一结合部分具有如本段中所提供的任何靶标标记，并且所述第二结合部分以任意组合具有如本段中所提供的任何靶标标记。在一个具体的实施方式中，所述第一结合部分包含第一靶标标记并且所述第二结合部分包含第二靶标标记，其中所述第一靶标标记和所述第二靶标标记是不同的。在另一个具体的实施方式中，所述第一结合部分包含第一靶标标记并且所述第二结合部分包含第二靶标标记，其中所述第一靶标标记和所述第二靶标标记是相同的。
另外，在本文所提供的系统，包括本节(第5.3.4节)和前段中的那些系统的一些实施方式中，每个靶标标记可以包含一个或多个靶标ID。在一个实施方式中，所述第一靶标标记包含第一靶标ID。在另一个实施方式中，所述第二靶标标记包含第二靶标ID。在一些实施方式中，所述第一靶标标记和所述第二靶标标记之间的靶标ID是不同的。在某些实施方式中，所述第一靶标标记和所述第二靶标标记之间的靶标ID是相同的。在一个具体的实施方式中，所述第一靶标标记包含第一靶标ID并且所述第二靶标标记包含第二靶标ID，其中所述第一靶标ID和所述第二靶标ID是不同的。在另一个具体的实施方式中，所述第一靶标标记包含第一靶标ID并且所述第二靶标标记包含第二靶标ID，其中所述第一靶标ID和所述第二靶标ID是相同的。
如以上在第5.2.5节中进一步描述的，除了分析物特异的“靶标ID”之外，在本文所提供的系统中所产生的核酸报告分子也可以包括样品特异的“样品ID”。图22和图23A-23B提供了产生具有样品ID的核酸报告分子的示例性示意图并且图24A-24B和25A-25C提供了显示这些多重测定的确实数据，其中通过经由如所述核酸报告分子中所产生的靶标标记中的靶标ID以及样品ID所确定的信号检测所述分析物，借此经由所述样品ID解析样品并且经由所述靶标ID解析分析物。因此，在一个实施方式中，本文所提供的系统还包括包含“样品ID”的样品标记，其中所述样品标记结合(i)至所述第一靶标标记，(ii)至所述第二靶标标记，或者(iii)至所述第一靶标标记和所述第二靶标标记两者。在一个具体的实施方式中，本文所提供的系统包括：包含第一结合剂和第一递呈基团的第一结合部分、包含第二结合剂的第二结合部分、第二递呈基团、第一接受基团、第二接受基团和样品标记；其中
(i)所述第一和第二结合剂结合所述分析物上的非干扰表位；
(ii)所述第一递呈基团结合所述第一接受基团；
(iii)所述第二递呈基团结合所述第二接受基团；
(iv)所述第一结合部分包含第一靶标标记，所述第一靶标标记包含第一标识码(“ID”)，它是分析物特异的(“靶标ID”)；
(v)所述第二结合部分包含第二靶标标记，所述第二靶标标记包含第二靶标ID；和
(vi)所述样品标记包含样品特异的ID(“样品ID”)，其中所述样品标记结合(i)至所述第一靶标标记，(ii)至所述第二靶标标记或者(iii)至所述第一靶标标记和所述第二靶标标记两者。
类似地，如以上第5.2.5节中进一步所描述的，在本文所提供的系统，包括本节(第5.3.4节)中的那些系统的一些实施方式中，每个核酸报告分子可以包含一个或多个靶标ID和/或样品ID。在一个实施方式中，在每个样品中所形成的核酸报告分子含有样品ID。在另一个实施方式中，在每个样品中所形成的核酸报告分子含有靶标ID。在其它实施方式中，在每个样品中所形成的核酸报告分子含有所述第一靶标ID。在另一个实施方式中，在每个样品中所形成的核酸报告分子含有所述第二靶标ID。
在另一个实施方式中，在每个样品中所形成的核酸报告分子含有样品ID和第一靶标ID。在一个实施方式中，在每个样品中所形成的核酸报告分子含有样品ID和第二靶标ID。在另一个实施方式中，在每个样品中所形成的核酸报告分子含有第一靶标ID和第二靶标ID。在其它实施方式中，在每个样品中所形成的核酸报告分子含有第一靶标ID和第二靶标ID，其中所述核酸报告分子缺少样品ID。在另一个实施方式中，在每个样品中所形成的核酸报告分子含有第一靶标ID、第二靶标ID和样品ID。
由于所述核酸报告分子是从由包含第一靶标标记的第一结合部分、包含第二靶标标记的第二结合部分、分析物和/或样品标记所形成的免疫复合物所产生的，因此在本文(包括在本节(第5.3.4节))所提供的系统中所形成的这种免疫复合物可以类似地包含一个或多个靶标ID和/或样品ID。在一个实施方式中，在每个样品中所形成的免疫复合物含有样品ID。在另一个实施方式中，在每个样品中所形成的免疫复合物含有靶标ID。在其它实施方式中，在每个样品中所形成的免疫复合物含有所述第一靶标ID。在另一个实施方式中，在每个样品中所形成的免疫复合物含有所述第二靶标ID。在另一个实施方式中，在每个样品中所形成的免疫复合物含有样品ID和第一靶标ID。在一个实施方式中，在每个样品中所形成的免疫复合物含有样品ID和第二靶标ID。在另一个实施方式中，在每个样品中所形成的免疫复合物含有第一靶标ID和第二靶标ID。在其它实施方式中，在每个样品中所形成的免疫复合物含有第一靶标ID和第二靶标ID，其中所述免疫复合物缺少样品ID。在另一个实施方式中，在每个样品中所形成的免疫复合物含有第一靶标ID、第二靶标ID和样品ID。
此外，由于样品ID包含在样品标记中并且靶标ID包含在靶标标记中，因此在本文所提供的系统(包括在本节(第5.3.4节)中)中所形成的免疫复合物可以包含一个或多个靶标标记和/或样品标记。在一个实施方式中，在每个样品中所形成的免疫复合物含有样品标记。在另一个实施方式中，在每个样品中所形成的免疫复合物含有靶标标记。在其它实施方式中，在每个样品中所形成的免疫复合物含有所述第一靶标标记。在另一个实施方式中，在每个样品中所形成的免疫复合物含有所述第二靶标标记。在另一个实施方式中，在每个样品中所形成的免疫复合物含有样品标记和第一靶标标记。在一个实施方式中，在每个样品中所形成的免疫复合物含有样品标记和第二靶标标记。在另一个实施方式中，在每个样品中所形成的免疫复合物含有第一靶标标记和第二靶标标记。在其它实施方式中，在每个样品中所形成的免疫复合物含有第一靶标标记和第二靶标标记，其中所述免疫复合物缺少样品标记。在另一个实施方式中，在每个样品中所形成的免疫复合物含有第一靶标标记、第二靶标标记和样品标记。
如根据本发明公开清楚地，在本文所提供的系统中，包括在本节(第5.3.4节)中所提供的那些系统中，所述第一结合部分中的递呈基团和所述第二结合部分中的递呈基团分别可以是在本发明公开中所提供的递呈基团，包括在第3、5.1、5.2.1至5.2.6、5.3.1至5.3.3和6节中所提供的那些递呈基团的任何实施方式。所述第一结合部分中的递呈基团和所述第二结合部分中的递呈基团的组合可以是在本发明公开中所提供的递呈基团，包括在第3、5.1、5.2.1至5.2.6、5.3.1至5.3.3和6节中所提供的那些递呈基团的任何实施方式。在本文所提供的系统的一个实施方式中，所述第一递呈基团是融合至所述第一结合剂的多肽。在本文所提供的系统的另一个实施方式中，所述第一递呈基团是缀合至所述第一结合剂的多核苷酸。在本文所提供的系统的另一个实施方式中，所述第一递呈基团是缀合至所述第一结合剂的化合物。在本文所提供的系统的一个实施方式中，所述第二递呈基团是融合至所述第二结合剂的多肽。在本文所提供的系统的另一个实施方式中，所述第二递呈基团是缀合至所述第二结合剂的多核苷酸。在本文所提供的系统的另一个实施方式中，所述第二递呈基团是缀合至所述第二结合剂的化合物。
在本文所提供的系统的一些实施方式中，所述第一递呈基团选自融合至所述第一结合剂的多肽、缀合至所述第一结合剂的多核苷酸或者缀合至所述第一结合剂的化合物；并且所述第二递呈基团选自融合至所述第二结合剂的多肽、缀合至所述第二结合剂的多核苷酸或者缀合至所述第二结合剂的化合物。在一个实施方式中，所述第一递呈基团是融合至所述第一结合剂的多肽，并且所述第二递呈基团是融合至所述第二结合剂的多肽。在一个实施方式中，所述第一递呈基团是融合至所述第一结合剂的多肽，并且所述第二递呈基团是缀合至所述第二结合剂的多核苷酸。在一个实施方式中，所述第一递呈基团是融合至所述第一结合剂的多肽，并且所述第二递呈基团是缀合至所述第二结合剂的化合物。在一个实施方式中，所述第一递呈基团是缀合至所述第一结合剂的多核苷酸，并且所述第二递呈基团是融合至所述第二结合剂的多肽。在一个实施方式中，所述第一递呈基团是缀合至所述第一结合剂的多核苷酸，并且所述第二递呈基团是缀合至所述第二结合剂的多核苷酸。在一个实施方式中，所述第一递呈基团是缀合至所述第一结合剂的多核苷酸，并且所述第二递呈基团是缀合至所述第二结合剂的化合物。在一个实施方式中，所述第一递呈基团是缀合至所述第一结合剂的化合物，并且所述第二递呈基团是融合至所述第二结合剂的多肽。在一个实施方式中，所述第一递呈基团是缀合至所述第一结合剂的化合物，并且所述第二递呈基团是缀合至所述第二结合剂的多核苷酸。在一个实施方式中，所述第一递呈基团是缀合至所述第一结合剂的化合物，并且所述第二递呈基团是缀合至所述第二结合剂的化合物。
本发明公开还提供所述系统还包括用于所述核酸报告分子的PCR扩增的试剂。如根据本发明公开清楚地，这种PCR可以是本节以及其它节，如第5.2.4(包括5.2.4.1和5.2.4.2)、5.2.5和6节中所提供的任何PCR，以及本领域已知且实践的任何适合的PCR。
本发明公开还提供本第5.3.4节中所提供的系统还包括用于DNA纯化的试剂。在一些实施方式中，本文所提供的系统还包含通过选择在本领域中已知且实践的给定尺寸的核酸片段用于DNA纯化的试剂。在一个实施方式中，本文所提供的系统还包含通过亲合纯化用于DNA纯化的试剂。在一个实施方式中，本文所提供的系统还包含使用与所述核酸报告分子或其片段互补的核酸亲和标签，通过亲合纯化用于DNA纯化的试剂。在一个实施方式中，本文所提供的系统还包含使用与所述核酸报告分子或其片段杂交的核酸亲和标签，通过亲合纯化用于DNA纯化的试剂。在其它实施方式中，本文所提供的系统还包含通过结合至亲和标签并在适当清洗后在低盐缓冲液或水中洗脱用于DNA纯化的试剂，其导致所述核酸报告分子不含污染核苷酸、引物、接头、接头二聚体、酶、缓冲液添加剂或盐。
如图8A-8G所示，本文所提供的用于所述系统的结合剂可以直接或间接结合至分析物。照此，在本文所提供的系统，包括本节(第5.3.4节)所述的系统的一些实施系统中，所述结合剂直接结合至所述分析物。在本文所提供的系统的其它实施方式中，所述结合剂间接结合至所述分析物。因此，在一些实施方式中，所述第一结合剂直接结合至所述分析物。在其它实施方式中，所述第二结合剂直接结合至所述分析物。在其它实施方式中，所述第一结合剂间接结合至所述分析物。在其它实施方式中，所述第二结合剂间接结合至所述分析物。此外，所述第一结合剂和所述分析物之间的结合关系的任何实施方式可以与所述第二结合剂和所述分析物之间的结合关系的任何实施方式组合。在一个具体的实施方式中，所述第一结合剂直接结合至所述分析物并且所述第二结合剂直接结合至所述分析物。在另一个实施方式中，所述第一结合剂直接结合至所述分析物并且所述第二结合剂间接结合至所述分析物。在另一个实施方式中，所述第一结合剂间接结合至所述分析物并且所述第二结合剂直接结合至所述分析物。在另一个实施方式中，所述第一结合剂间接结合至所述分析物并且所述第二结合剂间接结合至所述分析物。
如图8G所示，所述结合剂可以通过中间体，例如，抗所述分析物的一抗间接结合至分析物。照此，在本文所提供的系统，包括本节(第5.3.4节)所述的系统的一些实施方式中，所述结合剂结合至直接结合至分析物的一抗或其片段。因此，在一些实施方式中，所述第一结合剂结合至直接结合至分析物的第一一抗或其片段。在其它实施方式中，所述第二结合剂结合至直接结合至分析物的第二一抗或其片段。在其它实施方式中，所述第一结合剂结合至直接结合至分析物的第一一抗或其片段，并且所述第二结合剂结合至直接结合至分析物的第二一抗或其片段。在其它实施方式中，所述第一结合剂直接结合至所述分析物，并且所述第二结合剂结合至直接结合至分析物的第二一抗或其片段。在一些其它实施方式中，所述第一结合剂结合至直接结合至分析物的第一一抗或其片段，并且所述第二结合剂直接结合至所述分析物。
如根据两个结合剂可以同时结合至分析物的本发明公开清楚地，在本文所提供的系统，包括第5.1和5.2节所述的系统的一些实施系统中，所述第一和第二结合剂可以结合允许同时结合的所述分析物上的表位，借此提高检测的特异性。在一些实施方式中，所述第一和第二结合剂结合至所述分析物上的非干扰表位。在其它实施方式中，所述第一和第二结合剂结合至所述分析物上的非重叠表位。在其它实施方式中，所述第一和第二结合剂结合至所述分析物上的不同表位。在其它实施方式中，所述第一和第二结合剂结合至所述分析物上单独的表位。在其它实施方式中，所述第一和第二结合剂结合至所述分析物上两个结合剂可以同时但单独结合而无任何空间位阻的两个表位。
如本发明公开，包括第3、5.1、5.2.1至5.2.6、5.3.1至5.3.3和6节的公开内容中所提供的，在本文所提供的系统，包括本第5.3.4节中所提供的那些系统的一些实施方式中，所述递呈基团可以是核酸。类似地，在本文所提供的系统，包括本第5.3.4节中所提供的那些系统的一些实施方式中，所述接受基团可以是核酸。在一个实施方式中，作为核酸的所述递呈基团结合所述接受基团。在另一个实施方式中，所述第一递呈基团是第一核酸标签(“第一标签”)并且所述第一接受基团是第一核酸捕获探针(“第一探针”)。在其它实施方式中，所述第二递呈基团是第二核酸标签(“第二标签”)并且所述第二接受基团是第二核酸捕获探针(“第二探针”)。在另一个实施方式中，(i)所述第一递呈基团是第一核酸标签(“第一标签”)并且所述第一接受基团是第一核酸捕获探针(“第一探针”)；且(ii)所述第二递呈基团是第二核酸标签(“第二标签”)并且所述第二接受基团是第二核酸捕获探针(“第二探针”)。在一个实施方式中，所述第一探针是特异性结合至所述第一标签的蛋白。在另一个实施方式中，所述第一探针是特异性结合至所述第一标签的蛋白和核酸复合物。在另一个实施方式中，所述第一探针是核酸分子，其中所述第一探针或其片段与所述第一标签或其片段互补。在其它实施方式中，所述第一探针是核酸分子，其中所述第一探针或其片段与所述第一标签或其片段杂交。在一个实施方式中，所述第二探针是特异性结合至所述第二标签的蛋白。在另一个实施方式中，所述第二探针是特异性结合至所述第二标签的蛋白和核酸复合物。在另一个实施方式中，所述第二探针是核酸分子，其中所述第二探针或其片段与所述第二标签或其片段互补。在其它实施方式中，所述第二探针是核酸分子，其中所述第二探针或其片段与所述第二标签或其片段杂交。
另外，这种第一标签、第一探针、第二标签和第二探针可以如前段中所提供以多种方式组合。因此，在一个实施方式中，所述第一探针是特异性结合至所述第一标签的蛋白并且所述第二探针是特异性结合至所述第二标签的蛋白。在另一个实施方式中，所述第一探针是特异性结合至所述第一标签的蛋白并且所述第二探针是特异性结合至所述第二标签的蛋白和核酸复合物。在另一个实施方式中，所述第一探针是特异性结合至所述第一标签的蛋白并且所述第二探针是核酸分子，其中所述第二探针或其片段与所述第二标签或其片段互补。在其它实施方式中，所述第一探针是特异性结合至所述第一标签的蛋白并且所述第二探针是核酸分子，其中所述第二探针或其片段与所述第二标签或其片段杂交。
另外，在一个实施方式中，所述第一探针是特异性结合至所述第一标签的蛋白和核酸复合物，并且所述第二探针是特异性结合至所述第二标签的蛋白。在另一个实施方式中，所述第一探针是特异性结合至所述第一标签的蛋白和核酸复合物，并且所述第二探针是特异性结合至所述第二标签的蛋白和核酸复合物。在另一个实施方式中，所述第一探针是特异性结合至所述第一标签的蛋白和核酸复合物并且所述第二探针是核酸分子，其中所述第二探针或其片段与所述第二标签或其片段互补。在其它实施方式中，所述第一探针是特异性结合至所述第一标签的蛋白和核酸复合物并且所述第二探针是核酸分子，其中所述第二探针或其片段与所述第二标签或其片段杂交。
作为另外一种选择，在一个实施方式中，所述第一探针是核酸分子，其中所述第一探针或其片段与所述第一标签或其片段互补，并且所述第二探针是特异性结合至所述第二标签的蛋白。在另一个实施方式中，所述第一探针是核酸分子，其中所述第一探针或其片段与所述第一标签或其片段互补，并且所述第二探针是特异性结合至所述第二标签的蛋白和核酸复合物。在另一个实施方式中，所述第一探针是核酸分子，其中所述第一探针或其片段与所述第一标签或其片段互补，并且所述第二探针是核酸分子，其中所述第二探针或其片段与所述第二标签或其片段互补。在其它实施方式中，所述第一探针是核酸分子，其中所述第一探针或其片段与所述第一标签或其片段互补，并且所述第二探针是核酸分子，其中所述第二探针或其片段与所述第二标签或其片段杂交。
另外，在一个实施方式中，所述第一探针是核酸分子，其中所述第一探针或其片段与所述第一标签或其片段杂交，并且所述第二探针是特异性结合至所述第二标签的蛋白。在另一个实施方式中，所述第一探针是核酸分子，其中所述第一探针或其片段与所述第一标签或其片段杂交，并且所述第二探针是特异性结合至所述第二标签的蛋白和核酸复合物。在另一个实施方式中，所述第一探针是核酸分子，其中所述第一探针或其片段与所述第一标签或其片段杂交，并且所述第二探针是核酸分子，其中所述第二探针或其片段与所述第二标签或其片段互补。在其它实施方式中，所述第一探针是核酸分子，其中所述第一探针或其片段与所述第一标签或其片段杂交，并且所述第二探针是核酸分子，其中所述第二探针或其片段与所述第二标签或其片段杂交。
前段中所提供的互补性可以是多种水平的互补性，只要对于本文所提供的多种系统，互补片段的结合为捕获、清洗和/或释放提供充分结合。在本文，包括在本第5.3.4节中所提供的系统的一个实施方式中，所述互补性为至少80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％互补。在另一个实施方式中，所述互补性为约80％、约81％、约82％、约83％、约84％、约85％、约86％、约87％、约88％、约89％、约90％、约91％、约92％、约93％、约94％、约95％、约96％、约97％、约98％或约99％的互补。
对于本文所提供的系统，包括本节(第5.2.6节)中所提供的系统，可以通过在本发明公开的任何地方，包括第3、5.3.1、5.3.2和6节中所提供的结合、连接、偶联或另外连接所述递呈基团和所述接受基团的多种实施系统，将所述递呈基团和所述接受基团结合、连接、偶联或另外连接在一起。在本文所提供的系统的一个实施方式中，所述第一递呈基团通过硫酯基团、二硫键或可切割键结合所述第一接受基团。在本文所提供的系统的另一个实施方式中，所述第二递呈基团通过硫酯基团、二硫键或可切割键结合所述第二接受基团。在本文所提供的系统的另一个实施方式中，所述第一递呈基团通过硫酯基团、二硫键或可切割键结合所述第一接受基团；并且所述第二递呈基团通过硫酯基团、二硫键或可切割键结合所述第二接受基团。在本文所提供的系统的一个实施方式中，所述第一递呈基团通过光可切割键、化学可切割键或酶促可切割键结合所述第一接受基团。在本文所提供的系统的另一个实施方式中，所述第二递呈基团通过光可切割键、化学可切割键或酶促可切割键结合所述第二接受基团。在本文所提供的系统的另一个实施方式中，所述第一递呈基团通过光可切割键、化学可切割键或酶促可切割键结合所述第一接受基团；并且所述第二递呈基团通过光可切割键、化学可切割键或酶促可切割键结合所述第二接受基团。在本文所提供的系统的一个实施方式中，所述第一递呈基团通过蛋白-蛋白相互作用结合所述第一接受基团。在本文所提供的系统的另一个实施方式中，所述第二递呈基团通过蛋白-蛋白相互作用结合所述第二接受基团。在本文所提供的系统的另一个实施方式中，所述第一递呈基团通过蛋白-蛋白相互作用结合所述第一接受基团；并且所述第二递呈基团通过蛋白-蛋白相互作用结合所述第二接受基团。在本文所提供的系统的一个实施方式中，所述第一递呈基团通过生物素与链霉亲和素或抗生物素蛋白结合所述第一接受基团。在本文所提供的系统的另一个实施方式中，所述第二递呈基团通过生物素与链霉亲和素或抗生物素蛋白结合所述第二接受基团。在本文所提供的系统的另一个实施方式中，所述第一递呈基团通过生物素与链霉亲和素或抗生物素蛋白结合所述第一接受基团；并且所述第二递呈基团通过生物素与链霉亲和素或抗生物素蛋白结合所述第二接受基团。在一些实施方式中，所述第一递呈基团通过在本段中所提供的实施方式中的任一个结合所述第一接受基团，并且所述第二递呈基团通过在本段中所提供的实施方式中的任一个结合所述第二接受基团。照此，本发明公开提供在本段中所提供的用于所述第一递呈基团和所述第一接受基团之间的结合的任何实施方式可以与本段中所提供的用于所述第二递呈基团和所述第二接受基团之间的结合的任何其它实施方式组合。
如本发明公开，包括第3、5.1、5.2.1至5.2.6、5.3.1至5.3.3和6节的公开内容中所提供的，在本文所提供的系统，包括本第5.3.4节中所提供的那些系统的一些实施方式中，所述递呈基团可以是核酸。类似地，在本文所提供的系统，包括本第5.3.4节中所提供的那些系统的一些实施方式中，所述接受基团可以是核酸。在某些实施方式中，作为核酸的所述递呈基团结合或杂交至作为核酸的所述接受基团。因此，在一些实施方式中，所述第一递呈基团是第一核酸标签(“第一标签”)并且所述第一接受基团是第一核酸捕获探针(“第一探针”)，其中所述第一探针或其片段与所述第一标签或其片段互补。在某些实施方式中，所述第二递呈基团是第二核酸标签(“第二标签”)并且所述第二接受基团是第二核酸捕获探针(“第二探针”)，其中所述第二探针或其片段与所述第二标签或其片段互补。在一个实施方式中，所述第一递呈基团是第一核酸标签(“第一标签”)并且所述第一接受基团是第一核酸捕获探针(“第一探针”)，其中所述第一探针或其片段与所述第一标签或其片段互补；并且所述第二递呈基团是第二核酸标签(“第二标签”)并且所述第二接受基团是第二核酸捕获探针(“第二探针”)，其中所述第二探针或其片段与所述第二标签或其片段互补。
因此，在本文所提供的系统的一些具体实施方式中，其包括：包含第一结合剂和第一标签的第一结合部分、包含第二结合剂的第二结合部分、第二标签、第一探针、第二探针和样品标记；其中
(i)所述第一和第二结合剂结合所述分析物上的非干扰表位；
(ii)所述第一标签结合所述第一探针；
(iii)所述第二标签结合所述第二探针；
(iv)所述第一结合部分包含第一靶标标记，所述第一靶标标记包含第一标识码(“ID”)，它是分析物特异的(“靶标ID”)；
(v)所述第二结合部分包含第二靶标标记，所述第二靶标标记包含第二靶标ID；和
(vi)所述样品标记包含样品特异的ID(“样品ID”)，其中所述样品标记结合(i)至所述第一靶标标记，(ii)至所述第二靶标标记或者(iii)至所述第一靶标标记和所述第二靶标标记两者。
本发明公开还提供了并且本领域的常规技术人员通过阅读本发明公开将理解可以通过将所述接受基团与在本发明公开的任何地方，包括第3、5.2.3和6节中所提供的固体表面结合、连接、偶联或另外连接的多种实施方式，将所述接受基团结合、连接、偶联或另外连接至本文所提供的系统，包括本节(第5.3.4节)所提供的系统的所述固体表面。由于所述接受基团可以是核酸捕获探针，因此本发明公开提供可以通过将所述核酸捕获探针(例如，第一探针和/或第二探针)与在本发明公开的任何地方，包括第3、5.2.3和6节中所提供的固体表面结合、连接、偶联或另外连接的多种实施方式，将所述核酸捕获探针(例如，第一探针和/或第二探针)结合、连接、偶联或另外连接至本文所提供的系统，包括本节(第5.3.4节)所提供的系统的所述固体表面。在本文所提供的系统，包括本节(第5.3.4节)中所提供的系统的一个实施方式中，所述第一探针直接偶联至所述第一固体表面。在另一个实施方式中，所述第一探针与直接偶联至所述第一固体表面的通用探针杂交。在其它实施方式中，所述第一探针与生物素缀合，生物素结合直接偶联至所述第一固体表面的链霉亲和素或抗生物素蛋白。在另一个实施方式中，所述第一探针与化合物(例如，FITC)缀合，所述化合物结合特异性结合该化合物(例如，FITC)并且直接偶联至所述第一固体表面的抗体。在本文所提供的系统，包括本节(第5.3.4节)中所提供的系统的一个实施方式中，所述第二探针直接偶联至所述第二固体表面。在另一个实施方式中，所述第二探针与直接偶联至所述第二固体表面的通用探针杂交。在其它实施方式中，所述第二探针与生物素缀合，生物素结合直接偶联至所述第二固体表面的链霉亲和素或抗生物素蛋白。在另一个实施方式中，所述第二探针与化合物(例如，FITC)缀合，所述化合物结合特异性结合该化合物(例如，FITC)并且直接偶联至所述第二固体表面的抗体。
在某些实施方式中，前段中所提供的用于结合、连接、偶联或另外连接所述第一探针和所述第一固体表面的任何实施方式可以与前段中所提供的用于结合、连接、偶联或另外连接所述第二探针和所述第二固体表面的任何其它实施方式组合。因此，在本文所提供的系统，包括本节(第5.3.4节)中所提供的系统的一个实施方式中，所述第一探针直接偶联至所述第一固体表面，并且所述第二探针直接偶联至所述第二固体表面。在另一个实施方式中，所述第一探针直接偶联至所述第一固体表面，并且所述第二探针与直接偶联至所述第二固体表面的通用探针杂交。在其它实施方式中，所述第一探针直接偶联至所述第一固体表面，并且所述第二探针与生物素缀合，所述生物素结合直接偶联至所述第二固体表面的链霉亲和素或抗生物素蛋白。在另一个实施方式中，所述第一探针直接偶联至所述第一固体表面，并且所述第二探针与化合物(例如，FITC)缀合，所述化合物结合特异性结合该化合物(例如，FITC)并且直接偶联至所述第二固体表面的抗体。在一个实施方式中，所述第一探针与直接偶联至所述第一固体表面的通用探针杂交，并且所述第二探针直接偶联至所述第二固体表面。在另一个实施方式中，所述第一探针与直接偶联至所述第一固体表面的通用探针杂交，并且所述第二探针与直接偶联至所述第二固体表面的通用探针杂交。在其它实施方式中，所述第一探针与直接偶联至所述第一固体表面的通用探针杂交，并且所述第二探针与生物素缀合，所述生物素结合直接偶联至所述第二固体表面的链霉亲和素或抗生物素蛋白。在另一个实施方式中，所述第一探针与直接偶联至所述第一固体表面的通用探针杂交，并且所述第二探针与化合物(例如，FITC)缀合，所述化合物结合特异性结合该化合物(例如，FITC)并且直接偶联至所述第二固体表面的抗体。在一个实施方式中，所述第一探针与生物素缀合，所述生物素结合直接偶联至所述第一固体表面的链霉亲和素或抗生物素蛋白，并且所述第二探针直接偶联至所述第二固体表面。在另一个实施方式中，所述第一探针与生物素缀合，所述生物素结合直接偶联至所述第一固体表面的链霉亲和素或抗生物素蛋白，并且所述第二探针与直接偶联至所述第二固体表面的通用探针杂交。在其它实施方式中，所述第一探针与生物素缀合，所述生物素结合直接偶联至所述第一固体表面的链霉亲和素或抗生物素蛋白，并且所述第二探针与生物素缀合，所述生物素结合直接偶联至所述第二固体表面的链霉亲和素或抗生物素蛋白。在另一个实施方式中，所述第一探针与生物素缀合，所述生物素结合直接偶联至所述第一固体表面的链霉亲和素或抗生物素蛋白，并且所述第二探针与化合物(例如，FITC)缀合，所述化合物结合特异性结合该化合物(例如，FITC)并且直接偶联至所述第二固体表面的抗体。在一个实施方式中，所述第一探针与化合物(例如，FITC)缀合，所述化合物结合特异性结合该化合物(例如，FITC)并且直接偶联至所述第一固体表面的抗体，并且所述第二探针直接偶联至所述第二固体表面。在另一个实施方式中，所述第一探针与化合物(例如，FITC)缀合，所述化合物结合特异性结合该化合物(例如，FITC)并且直接偶联至所述第一固体表面的抗体，并且所述第二探针与直接偶联至所述第二固体表面的通用探针杂交。在其它实施方式中，所述第一探针与化合物(例如，FITC)缀合，所述化合物结合特异性结合该化合物(例如，FITC)并且直接偶联至所述第一固体表面的抗体，并且所述第二探针与生物素缀合，所述生物素结合直接偶联至所述第二固体表面的链霉亲和素或抗生物素蛋白。在另一个实施方式中，所述第一探针与化合物(例如，FITC)缀合，所述化合物结合特异性结合该化合物(例如，FITC)并且直接偶联至所述第一固体表面的抗体，并且所述第二探针与化合物(例如，FITC)缀合，所述化合物结合特异性结合该化合物(例如，FITC)并且直接偶联至所述第二固体表面的抗体。
如以上第3、5.2.3、5.2.4和5.2.5节所述，所述核酸捕获探针可以被协同捕获在所述固体表面上。在本文，包括在本节(第5.3.4节)中所提供的系统的一个实施方式中，所述第一标签和第二标签被协同捕获在所述第一固体表面上。在本文所提供的系统的另一个实施方式中，所述第一标签和第二标签被协同捕获在所述第二固体表面上。在本文所提供的系统的其它实施方式中，所述第一标签和第二标签被协同捕获在所述第一固体表面上。在本文所提供的系统的另一个实施方式中，所述第一标签和第二标签被协同捕获在所述第二固体表面上。在一些实施方式中，本节(第5.3.4节)，包括本段所述的用于本文所提供的系统的协同捕获可以采取不同形式，包括第3、5.2.3、5.2.4和5.2.5节中所述的任何实施方式。在一个具体的实施方式中，所述第一标签和第二标签以第3、5.2.3、5.2.4和5.2.5节中所体现的任何形式被协同捕获在所述第一固体表面上。在其它实施方式中，所述第一标签和第二标签以第3、5.2.3、5.2.4和5.2.5节中所体现的任何形式被协同捕获在所述第二固体表面上。在另一个实施方式中，所述第一标签和第二标签以第3、5.2.3、5.2.4和5.2.5节中所体现的任何形式在步骤(2b)中被协同捕获在所述第二固体表面上。在一些实施方式中，所述第一标签和第二标签以第3、5.2.3、5.2.4和5.2.5节中所体现的任何形式被协同捕获在所述第一固体表面上，并且所述第一标签和第二标签以第3、5.2.3、5.2.4和5.2.5节中所体现的任何形式被协同捕获在所述第二固体表面上。在某些实施方式中，所述第一标签和第二标签以第3、5.2.3、5.2.4和5.2.5节中所体现的任何形式在步骤(1)中被协同捕获在所述第一固体表面上，并且所述第一标签和第二标签以第3、5.2.3、5.2.4和5.2.5节中所体现的任何形式在步骤(2b)中被协同捕获在所述第二固体表面上。在一些实施方式中，所述第一固体表面与所述第一探针和其它核酸探针两者偶联，并且其中所述其它探针或其片段与所述第一标签或其片段互补。在某些实施方式中，所述第二固体表面与所述第二探针和其它核酸探针两者偶联，并且其中所述其它探针或其片段与所述第二标签或其片段互补。在其它实施方式中，所述第一固体表面与所述第一探针和其它核酸探针偶联，并且其中所述其它探针或其片段与所述第一标签或其片段互补，并且所述第二固体表面与所述第二探针和其它核酸探针两者偶联，并且其中所述其它探针或其片段与所述第二标签或其片段互补。
在包括核酸结合或杂交的本文所提供的系统的任何实施方式中，两个核酸的互补片段可以具有出于所述递呈基团(例如，所述第一标签和/或所述第二标签)和所述接受基团(例如，所述第一探针和/或所述第二探针)的结合或者所述接受基团(例如，所述第一探针和/或所述第二探针)和所述固体表面(例如，所述第一固体表面和/或所述第二固体表面)的结合的目的，提供足够的相互作用的任何长度。在本文所提供的系统的一些实施方式中，这些互补片段可以是10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49或50个或者更多个碱基对。在本文所提供的系统的一个实施方式中，所述第一标签和所述第一探针的互补片段由10至30个碱基对组成。在本文所提供的系统的另一个实施方式中，所述第一标签和所述第一探针的互补片段由20至30个碱基对组成。在本文所提供的系统的另一个实施方式中，所述第一标签和所述第一探针的互补片段由10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39或40个碱基对组成。在本文所提供的系统的一个实施方式中，所述第二标签和所述第二探针的互补片段由10至30个碱基对组成。在本文所提供的系统的另一个实施方式中，所述第二标签和所述第二探针的互补片段由20至30个碱基对组成。在本文所提供的系统的另一个实施方式中，所述第二标签和所述第二探针的互补片段由10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39或40个碱基对组成。在本文所提供的系统的一个实施方式中，所述第一标签和所述第一探针的互补片段由10至30个碱基对组成，并且所述第二标签和所述第二探针的互补片段由10至30个碱基对组成。在本文所提供的系统的另一个实施方式中，所述第一标签和所述第一探针的互补片段由20至30个碱基对组成，并且所述第二标签和所述第二探针的互补片段由20至30个碱基对组成。在本文所提供的系统的另一个实施方式中，所述第一标签和所述第一探针的互补片段由10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39或40个碱基对组成，并且所述第二标签和所述第二探针的互补片段由10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39或40个碱基对组成。
对于包括核酸结合或杂交的本文所提供的系统的任何实施方式，出于所述递呈基团(例如，所述第一标签和/或所述第二标签)和所述接受基团(例如，所述第一探针和/或所述第二探针)的结合或者所述接受基团(例如，所述第一探针和/或所述第二探针)和所述固体表面(例如，所述第一固体表面和/或所述第二固体表面)的结合的目的，两个核酸的互补片段可以是一对互补的A和/或T富集序列或者一对互补的G和/或C富集序列。在本文所提供的系统的一个实施方式中，所述第一标签包含A和/或T富集序列并且所述第一探针包含互补的T和/或A富集序列；在另一个实施方式中，所述第一标签包含多聚-A和/或多聚-T序列并且所述第一探针包含互补的多聚-T和/或多聚-A序列。在其它实施方式中，所述第一标签包含G和/或C富集序列并且所述第一探针包含互补的C和/或G富集序列。在另一个实施方式中，所述第一标签包含多聚-G和/或多聚-C序列并且所述第一探针包含互补的多聚-C和/或多聚-G序列。在本文所提供的系统的一个实施方式中，所述第二标签包含A和/或T富集序列并且所述第二探针包含互补的T和/或A富集序列；在另一个实施方式中，所述第二标签包含多聚-A和/或多聚-T序列并且所述第二探针包含互补的多聚-T和/或多聚-A序列。在其它实施方式中，所述第二标签包含G和/或C富集序列并且所述第二探针包含互补的C和/或G富集序列。在另一个实施方式中，所述第二标签包含多聚-G和/或多聚-C序列并且所述第二探针包含互补的多聚-C和/或多聚-G序列。
在本文所提供的系统的一个实施方式中，所述第一标签包含A和/或T富集序列并且所述第一探针包含互补的T和/或A富集序列，并且所述第二标签包含A和/或T富集序列并且所述第二探针包含互补的T和/或A富集序列。在另一个实施方式中，所述第一标签包含A和/或T富集序列并且所述第一探针包含互补的T和/或A富集序列，并且所述第二标签包含多聚-A和/或多聚-T序列并且所述第二探针包含互补的多聚-T和/或多聚-A序列。在其它实施方式中，所述第一标签包含A和/或T富集序列并且所述第一探针包含互补的T和/或A富集序列，并且所述第二标签包含G和/或C富集序列并且所述第二探针包含互补的C和/或G富集序列。在另一个实施方式中，所述第一标签包含A和/或T富集序列并且所述第一探针包含互补的T和/或A富集序列，并且所述第二标签包含多聚-G和/或多聚-C序列并且所述第二探针包含互补的多聚-C和/或多聚-G序列。
在本文所提供的系统的一个实施方式中，所述第一标签包含多聚-A和/或多聚-T序列并且所述第一探针包含互补的多聚-T和/或多聚-A序列，并且所述第二标签包含A和/或T富集序列并且所述第二探针包含互补的T和/或A富集序列。在另一个实施方式中，所述第一标签包含多聚-A和/或多聚-T序列并且所述第一探针包含互补的多聚-T和/或多聚-A序列，并且所述第二标签包含多聚-A和/或多聚-T序列并且所述第二探针包含互补的多聚-T和/或多聚-A序列。在其它实施方式中，所述第一标签包含多聚-A和/或多聚-T序列并且所述第一探针包含互补的多聚-T和/或多聚-A序列，并且所述第二标签包含G和/或C富集序列并且所述第二探针包含互补的C和/或G富集序列。在另一个实施方式中，所述第一标签包含多聚-A和/或多聚-T序列并且所述第一探针包含互补的多聚-T和/或多聚-A序列，并且所述第二标签包含多聚-G和/或多聚-C序列并且所述第二探针包含互补的多聚-C和/或多聚-G序列。
在本文所提供的系统的一个实施方式中，所述第一标签包含G和/或C富集序列并且所述第一探针包含互补的C和/或G富集序列，并且所述第二标签包含A和/或T富集序列并且所述第二探针包含互补的T和/或A富集序列。在另一个实施方式中，所述第一标签包含G和/或C富集序列并且所述第一探针包含互补的C和/或G富集序列，并且所述第二标签包含多聚-A和/或多聚-T序列并且所述第二探针包含互补的多聚-T和/或多聚-A序列。在其它实施方式中，所述第一标签包含G和/或C富集序列并且所述第一探针包含互补的C和/或G富集序列，并且所述第二标签包含G和/或C富集序列并且所述第二探针包含互补的C和/或G富集序列。在另一个实施方式中，所述第一标签包含G和/或C富集序列并且所述第一探针包含互补的C和/或G富集序列，并且所述第二标签包含多聚-G和/或多聚-C序列并且所述第二探针包含互补的多聚-C和/或多聚-G序列。
在本文所提供的系统的一个实施方式中，所述第一标签包含多聚-G和/或多聚-C序列并且所述第一探针包含互补的多聚-C和/或多聚-G序列，并且所述第二标签包含A和/或T富集序列并且所述第二探针包含互补的T和/或A富集序列。在另一个实施方式中，所述第一标签包含多聚-G和/或多聚-C序列并且所述第一探针包含互补的多聚-C和/或多聚-G序列，并且所述第二标签包含多聚-A和/或多聚-T序列并且所述第二探针包含互补的多聚-T和/或多聚-A序列。在其它实施方式中，所述第一标签包含多聚-G和/或多聚-C序列并且所述第一探针包含互补的多聚-C和/或多聚-G序列，并且所述第二标签包含G和/或C富集序列并且所述第二探针包含互补的C和/或G富集序列。在另一个实施方式中，所述第一标签包含多聚-G和/或多聚-C序列并且所述第一探针包含互补的多聚-C和/或多聚-G序列，并且所述第二标签包含多聚-G和/或多聚-C序列并且所述第二探针包含互补的多聚-C和/或多聚-G序列。
在本文所提供的系统，包括前5段中所提供的那些系统的某些实施方式中，所述互补序列具有短的长度，从而来自互补序列的结合弱于所述第一结合剂和所述分析物之间的结合以及所述第二结合剂和所述分析物之间的结合两者，借此使免疫复合物在从固体表面的任何释放中保持稳定。在一些具体的实施方式中，所述A和/或T富集序列具有短的长度，从而来自互补的A和/或T富集序列的结合弱于所述第一结合剂与所述分析物之间的结合以及所述第二结合剂和所述分析物之间的结合两者，借此使免疫复合物在从固体表面的任何释放中保持稳定。在其它具体的实施方式中，所述多聚-A和/或多聚-T序列具有短的长度，从而来自互补的多聚-A和/或多聚-T序列的结合弱于所述第一结合剂与所述分析物之间的结合以及所述第二结合剂和所述分析物之间的结合两者，借此使免疫复合物在从固体表面的任何释放中保持稳定。在其它具体的实施方式中，所述G和/或C富集序列具有短的长度，从而来自互补的G和/或C富集序列的结合弱于所述第一结合剂与所述分析物之间的结合以及所述第二结合剂和所述分析物之间的结合两者，借此使免疫复合物在从固体表面的任何释放中保持稳定。在一些其它具体实施方式中，所述多聚-G和/或多聚-C序列具有短的长度，从而来自互补的多聚-G和/或多聚-C序列的结合弱于所述第一结合剂与所述分析物之间的结合以及所述第二结合剂和所述分析物之间的结合两者，借此使免疫复合物在从固体表面的任何释放中保持稳定。
在本文所提供的系统，包括本第5.3.4节中所提供的系统中所检测的分析物可以是如第3、5.2.2和6节中所述的多种分子。在一个具体的实施方式中，所述分析物是两个分子的结合对；其中所述第一结合剂结合所述结合对的一个分子，并且所述第二结合剂结合所述结合对的另一个分子。在另一个实施方式中，所述分析物为核酸，并且用于核酸分析物的第一和第二结合剂包含与所述核酸分析物的不同片段互补的核酸。在另一个实施方式中，所述分析物是肽或蛋白，且(i)所述第一结合剂是特异性结合所述分析物的抗体或抗体片段；(ii)所述第二结合剂是特异性结合所述分析物的抗体或抗体片段；或者(i)和(ii)两者。
在本文所提供的系统，包括本第5.3.4节中所提供的系统中所检测的分析物可以来自如第3和6节中所述的多种样品。在本文所提供的系统的一些具体实施方式中，所述样品是体液样品。在一个实施方式中，所述样品是组织样品。在一个实施方式中，所述样品是细胞样品。在一个实施方式中，所述样品是血液样品。在一个实施方式中，所述样品是骨髓样品。在一个实施方式中，所述样品是血浆样品。在一个实施方式中，所述样品是血清样品。在一个实施方式中，所述样品是尿液样品。在一个实施方式中，所述样品是脑脊髓液样品。
本发明公开提供对于本文所提供的系统，包括本第5.3.4节和第3、5.2.1至5.2.5和6节中的那些系统的多种实施方式，所述靶标标记、所述结合剂和所述递呈基团可以在每个结合部分中具有多种构造。在本文所提供的系统，包括本第5.3.4节的那些系统的一个实施方式中，所述靶标标记直接结合至所述结合剂。在另一个实施方式中，所述靶标标记间接结合至所述结合剂。在另一个实施方式中，所述第一靶标标记直接结合至所述第一结合剂。在其它实施方式中，所述第一靶标标记间接结合至所述第一结合剂。在一些实施方式中，所述第二靶标标记直接结合至所述第二结合剂。在某些实施方式中，所述第二靶标标记间接结合至所述第二结合剂。在一个实施方式中，所述第一靶标标记直接结合至所述第一结合剂，并且所述第二靶标标记直接结合至所述第二结合剂。在另一个实施方式中，所述第一靶标标记直接结合至所述第一结合剂，并且所述第二靶标标记间接结合至所述第二结合剂。在另一个实施方式中，所述第一靶标标记间接结合至所述第一结合剂，并且所述第二靶标标记直接结合至所述第二结合剂。在其它实施方式中，所述第一靶标标记间接结合至所述第一结合剂，并且所述第二靶标标记间接结合至所述第二结合剂。在本文所提供的系统，包括本第5.3.4节的那些系统的一个实施方式中，所述靶标标记缀合至所述结合剂。在另一个实施方式中，所述靶标标记非共价结合至所述结合剂。在其它实施方式中，所述靶标标记缀合至所述递呈基团。在另一个实施方式中，所述靶标标记非共价结合至所述递呈基团。在另一个实施方式中，所述靶标标记是所述递呈基团的一部分，例如，所述靶标标记和所述递呈基团均为核酸，并且所述靶标标记是所述递呈基团序列内的核酸片段。在本文所提供的系统，包括本第5.3.4节的那些系统的一个实施方式中，所述第一靶标标记缀合至所述第一结合剂。在另一个实施方式中，所述第一靶标标记非共价结合至所述第一结合剂。在其它实施方式中，所述第一靶标标记缀合至所述第一递呈基团。在另一个实施方式中，所述第一靶标标记非共价结合至所述第一递呈基团。在另一个实施方式中，所述第一靶标标记是所述第一递呈基团的一部分，例如，所述第一靶标标记和所述第一递呈基团均为核酸分子并且所述第一靶标标记是所述第一递呈基团序列内的核酸片段。在本文所提供的系统，包括本第5.3.4节的那些系统的一个实施方式中，所述第二靶标标记缀合至所述第二结合剂。在另一个实施方式中，所述第二靶标标记非共价结合至所述第二结合剂。在其它实施方式中，所述第二靶标标记缀合至所述第二递呈基团。在另一个实施方式中，所述第二靶标标记非共价结合至所述第二递呈基团。在另一个实施方式中，所述第二靶标标记是所述第二递呈基团的一部分，例如，所述第二靶标标记和所述第二递呈基团均为核酸分子并且所述第二靶标标记是所述第二递呈基团序列内的核酸片段。
本发明公开提供对于本文所提供的系统，包括本第5.3.4节和第3、5.2.1至5.2.5和6节中的那些系统的多种实施方式，所述靶标标记、所述结合剂和所述递呈基团可以在每个结合部分中具有多种构造。在本文所提供的系统，包括本第5.3.4节的那些系统的一个实施方式中，所述靶标标记缀合至所述结合剂。在另一个实施方式中，所述靶标标记非共价结合至所述结合剂。在其它实施方式中，所述靶标标记缀合至所述递呈基团。在另一个实施方式中，所述靶标标记非共价结合至所述递呈基团。在另一个实施方式中，所述靶标标记是所述递呈基团的一部分，例如，所述靶标标记和所述递呈基团均为核酸，并且所述靶标标记是所述递呈基团序列内的核酸片段。在本文所提供的系统，包括本第5.3.4节的那些系统的一个实施方式中，所述第一靶标标记缀合至所述第一结合剂。在另一个实施方式中，所述第一靶标标记非共价结合至所述第一结合剂。在其它实施方式中，所述第一靶标标记缀合至所述第一递呈基团。在另一个实施方式中，所述第一靶标标记非共价结合至所述第一递呈基团。在另一个实施方式中，所述第一靶标标记是所述第一递呈基团的一部分，例如，所述第一靶标标记和所述第一递呈基团均为核酸分子并且所述第一靶标标记是所述第一递呈基团序列内的核酸片段。在本文所提供的系统，包括本第5.3.4节的那些系统的一个实施方式中，所述第二靶标标记缀合至所述第二结合剂。在另一个实施方式中，所述第二靶标标记非共价结合至所述第二结合剂。在其它实施方式中，所述第二靶标标记缀合至所述第二递呈基团。在另一个实施方式中，所述第二靶标标记非共价结合至所述第二递呈基团。在另一个实施方式中，所述第二靶标标记是所述第二递呈基团的一部分，例如，所述第二靶标标记和所述第二递呈基团均为核酸分子并且所述第二靶标标记是所述第二递呈基团序列内的核酸片段。
在所述第一结合部分中所述第一靶标标记、所述第一结合剂和所述第一递呈基团中的构造可以是本文，包括本第5.3.4节以及前段中所提供的任何实施方式，并且该实施方式可以与本文，包括本第5.3.4节和前段中所提供的所述第二结合部分中的所述第二靶标标记、所述第二结合剂和所述第二递呈基团中的构造的任何实施方式组合。在本文所提供的系统，包括本第5.3.4节的那些系统的一个具体实施方式中，所述第一靶标标记缀合至所述第一结合剂并且所述第二靶标标记缀合至所述第二结合剂。在另一个实施方式中，所述第一靶标标记缀合至所述第一结合剂，并且所述第二靶标标记非共价结合至所述第二结合剂。在其它实施方式中，所述第一靶标标记缀合至所述第一结合剂，并且所述第二靶标标记缀合至所述第二递呈基团。在另一个实施方式中，所述第一靶标标记缀合至所述第一结合剂，并且所述第二靶标标记非共价结合至所述第二递呈基团。在另一个实施方式中，所述第一靶标标记缀合至所述第一结合剂并且所述第二靶标标记是所述第二递呈基团的一部分，例如，所述第二靶标标记和所述第二递呈基团均为核酸分子并且所述第二靶标标记是所述第二递呈基团序列内的核酸片段。
在本文所提供的系统，包括本第5.3.4节的那些系统的一些具体实施方式中，所述第一靶标标记非共价结合至所述第一结合剂并且所述第二靶标标记缀合至所述第二结合剂。在另一个实施方式中，所述第一靶标标记非共价结合至所述第一结合剂，并且所述第二靶标标记非共价结合至所述第二结合剂。在其它实施方式中，所述第一靶标标记非共价结合至所述第一结合剂，并且所述第二靶标标记缀合至所述第二递呈基团。在另一个实施方式中，所述第一靶标标记非共价结合至所述第一结合剂，并且所述第二靶标标记非共价结合至所述第二递呈基团。在另一个实施方式中，所述第一靶标标记非共价结合至所述第一结合剂并且所述第二靶标标记是所述第二递呈基团的一部分，例如，所述第二靶标标记和所述第二递呈基团均为核酸分子并且所述第二靶标标记是所述第二递呈基团序列内的核酸片段。
在本文所提供的系统，包括本第5.3.4节的那些系统的一些具体实施方式中，所述第一靶标标记缀合至所述第一递呈基团并且所述第二靶标标记缀合至所述第二结合剂。在另一个实施方式中，所述第一靶标标记缀合至所述第一递呈基团，并且所述第二靶标标记非共价结合至所述第二结合剂。在其它实施方式中，所述第一靶标标记缀合至所述第一递呈基团，并且所述第二靶标标记缀合至所述第二递呈基团。在另一个实施方式中，所述第一靶标标记缀合至所述第一递呈基团，并且所述第二靶标标记非共价结合至所述第二递呈基团。在另一个实施方式中，所述第一靶标标记缀合至所述第一递呈基团并且所述第二靶标标记是所述第二递呈基团的一部分，例如，所述第二靶标标记和所述第二递呈基团均为核酸分子并且所述第二靶标标记是所述第二递呈基团序列内的核酸片段。
在本文所提供的系统，包括本第5.3.4节的那些系统的一些具体实施方式中，所述第一靶标标记非共价结合至所述第一递呈基团并且所述第二靶标标记缀合至所述第二结合剂。在另一个实施方式中，所述第一靶标标记非共价结合至所述第一递呈基团，并且所述第二靶标标记非共价结合至所述第二结合剂。在其它实施方式中，所述第一靶标标记非共价结合至所述第一递呈基团，并且所述第二靶标标记缀合至所述第二递呈基团。在另一个实施方式中，所述第一靶标标记非共价结合至所述第一递呈基团，并且所述第二靶标标记非共价结合至所述第二递呈基团。在另一个实施方式中，所述第一靶标标记非共价结合至所述第一递呈基团并且所述第二靶标标记是所述第二递呈基团的一部分，例如，所述第二靶标标记和所述第二递呈基团均为核酸分子并且所述第二靶标标记是所述第二递呈基团序列内的核酸片段。
在本文所提供的系统，包括本第5.3.4节的那些系统的一些具体实施方式中，所述第一靶标标记是所述第一递呈基团的一部分，例如，所述第一靶标标记和所述第一递呈基团均为核酸分子并且所述第一靶标标记是所述第一递呈基团序列内的核酸片段，并且所述第二靶标标记缀合至所述第二结合剂。在另一个实施方式中，所述第一靶标标记是所述第一递呈基团的一部分，例如，所述第一靶标标记和所述第一递呈基团均为核酸分子并且所述第一靶标标记是所述第一递呈基团序列内的核酸片段，并且所述第二靶标标记非共价结合至所述第二结合剂。在其它实施方式中，所述第一靶标标记是所述第一递呈基团的一部分，例如，所述第一靶标标记和所述第一递呈基团均为核酸分子并且所述第一靶标标记是所述第一递呈基团序列内的核酸片段，并且所述第二靶标标记缀合至所述第二递呈基团。在另一个实施方式中，所述第一靶标标记是所述第一递呈基团的一部分，例如，所述第一靶标标记和所述第一递呈基团均为核酸分子并且所述第一靶标标记是所述第一递呈基团序列内的核酸片段，并且所述第二靶标标记非共价结合至所述第二递呈基团。在另一个实施方式中，所述第一靶标标记是所述第一递呈基团的一部分，例如，所述第一靶标标记和所述第一递呈基团均为核酸分子并且所述第一靶标标记是所述第一递呈基团序列内的核酸片段，并且所述第二靶标标记是所述第二递呈基团的一部分，例如，所述第二靶标标记和所述第二递呈基团均为核酸分子并且所述第二靶标标记是所述第二递呈基团序列内的核酸片段。
类似地，对于本文所提供的系统，包括本第5.3.4节和第3、5.2.1至5.2.5和6节的那些系统的多种实施方式，所述结合剂和所述递呈基团可以在每个结合部分中具有多种构型。在本文所提供的系统，包括本第5.3.4节的那些系统的一个实施方式中，所述递呈基团直接结合至所述结合剂。在另一个实施方式中，所述递呈基团间接结合至所述结合剂。在另一个实施方式中，所述第一递呈基团直接结合至所述第一结合剂。在其它实施方式中，所述第一递呈基团间接结合至所述第一结合剂。在一些实施方式中，所述第二递呈基团直接结合至所述第二结合剂。在某些实施方式中，所述第二递呈基团间接结合至所述第二结合剂。在一个实施方式中，所述第一递呈基团直接结合至所述第一结合剂，并且所述第二递呈基团直接结合至所述第二结合剂。在另一个实施方式中，所述第一递呈基团直接结合至所述第一结合剂，并且所述第二递呈基团间接结合至所述第二结合剂。在另一个实施方式中，所述第一递呈基团间接结合至所述第一结合剂，并且所述第二递呈基团直接结合至所述第二结合剂。在其它实施方式中，所述第一递呈基团间接结合至所述第一结合剂，并且所述第二递呈基团间接结合至所述第二结合剂。在本文所提供的系统，包括本第5.3.4节的那些系统的一个实施方式中，所述递呈基团缀合至所述结合剂。在另一个实施方式中，所述递呈基团非共价结合至所述结合剂。在其它实施方式中，所述递呈基团缀合至所述递呈基团。在另一个实施方式中，所述递呈基团非共价结合至所述递呈基团。在另一个实施方式中，所述递呈基团是所述递呈基团的一部分，例如，所述递呈基团和所述递呈基团均为核酸，并且所述递呈基团是所述递呈基团序列内的核酸片段。在本文所提供的系统，包括本第5.3.4节的那些系统的一个实施方式中，所述第一递呈基团缀合至所述第一结合剂。在另一个实施方式中，所述第一递呈基团非共价结合至所述第一结合剂。在其它实施方式中，所述第一递呈基团缀合至所述第一递呈基团。在另一个实施方式中，所述第一递呈基团非共价结合至所述第一递呈基团。在另一个实施方式中，所述第一递呈基团是所述第一靶标标记的一部分，例如，所述第一递呈基团和所述第一靶标标记均为核酸分子并且所述第一递呈基团是所述第一靶标标记序列内的核酸片段。在本文所提供的系统，包括本第5.3.4节的那些系统的一个实施方式中，所述第二递呈基团缀合至所述第二结合剂。在另一个实施方式中，所述第二递呈基团非共价结合至所述第二结合剂。在其它实施方式中，所述第二递呈基团缀合至所述第二递呈基团。在另一个实施方式中，所述第二递呈基团非共价结合至所述第二递呈基团。在另一个实施方式中，所述第二递呈基团是所述第二靶标标记的一部分，例如，所述第二递呈基团和所述第二靶标标记均为核酸分子并且所述第二递呈基团是所述第二靶标标记序列内的核酸片段。
在所述第一结合部分中所述第一递呈基团、所述第一结合剂和所述第一递呈基团中的构造可以是本文，包括本第5.3.4节以及前段中所提供的任何实施方式，并且该实施方式可以与本文，包括本第5.3.4节和前段中所提供的所述第二结合部分中的所述第二递呈基团、所述第二结合剂和所述第二递呈基团中的构造的任何实施方式组合。在本文所提供的系统，包括本第5.3.4节的那些系统的一个具体实施方式中，所述第一递呈基团缀合至所述第一结合剂并且所述第二递呈基团缀合至所述第二结合剂。在另一个实施方式中，所述第一递呈基团缀合至所述第一结合剂，并且所述第二递呈基团非共价结合至所述第二结合剂。在其它实施方式中，所述第一递呈基团缀合至所述第一结合剂，并且所述第二递呈基团缀合至所述第二递呈基团。在另一个实施方式中，所述第一递呈基团缀合至所述第一结合剂，并且所述第二递呈基团非共价结合至所述第二递呈基团。在另一个实施方式中，所述第一递呈基团缀合至所述第一结合剂并且所述第二递呈基团是所述第二靶标标记的一部分，例如，所述第二递呈基团和所述第二靶标标记均为核酸分子并且所述第二递呈基团是所述第二靶标标记序列内的核酸片段。
在本文所提供的系统，包括本第5.3.4节的那些系统的一些具体实施方式中，所述第一递呈基团非共价结合至所述第一结合剂并且所述第二递呈基团缀合至所述第二结合剂。在另一个实施方式中，所述第一递呈基团非共价结合至所述第一结合剂，并且所述第二递呈基团非共价结合至所述第二结合剂。在其它实施方式中，所述第一递呈基团非共价结合至所述第一结合剂，并且所述第二递呈基团缀合至所述第二递呈基团。在另一个实施方式中，所述第一递呈基团非共价结合至所述第一结合剂，并且所述第二递呈基团非共价结合至所述第二递呈基团。在另一个实施方式中，所述第一递呈基团非共价结合至所述第一结合剂，并且所述第二递呈基团是所述第二靶标标记的一部分，例如，所述第二递呈基团和所述第二靶标标记均为核酸分子并且所述第二递呈基团是所述第二靶标标记序列内的核酸片段。
在本文所提供的系统，包括本第5.3.4节的那些系统的一些具体实施方式中，所述第一递呈基团缀合至所述第一递呈基团并且所述第二递呈基团缀合至所述第二结合剂。在另一个实施方式中，所述第一递呈基团缀合至所述第一递呈基团，并且所述第二递呈基团非共价结合至所述第二结合剂。在其它实施方式中，所述第一递呈基团缀合至所述第一递呈基团，并且所述第二递呈基团缀合至所述第二递呈基团。在另一个实施方式中，所述第一递呈基团缀合至所述第一递呈基团，并且所述第二递呈基团非共价结合至所述第二递呈基团。在另一个实施方式中，所述第一递呈基团缀合至所述第一递呈基团，并且所述第二递呈基团是所述第二靶标标记的一部分，例如，所述第二递呈基团和所述第二靶标标记均为核酸分子并且所述第二递呈基团是所述第二靶标标记序列内的核酸片段。
在本文所提供的系统，包括本第5.3.4节的那些系统的一些具体实施方式中，所述第一递呈基团非共价结合至所述第一递呈基团并且所述第二递呈基团缀合至所述第二结合剂。在另一个实施方式中，所述第一递呈基团非共价结合至所述第一递呈基团，并且所述第二递呈基团非共价结合至所述第二结合剂。在其它实施方式中，所述第一递呈基团非共价结合至所述第一递呈基团，并且所述第二递呈基团缀合至所述第二递呈基团。在另一个实施方式中，所述第一递呈基团非共价结合至所述第一递呈基团，并且所述第二递呈基团非共价结合至所述第二递呈基团。在另一个实施方式中，所述第一递呈基团非共价结合至所述第一递呈基团，并且所述第二递呈基团是所述第二靶标标记的一部分，例如，所述第二递呈基团和所述第二靶标标记均为核酸分子并且所述第二递呈基团是所述第二靶标标记序列内的核酸片段。
在本文所提供的系统，包括本第5.3.4节的那些系统的一些具体实施方式中，所述第一递呈基团是所述第一靶标标记的一部分，例如，所述第一递呈基团和所述第一靶标标记均为核酸分子并且所述第一递呈基团是所述第一靶标标记序列内的核酸片段，并且所述第二递呈基团缀合至所述第二结合剂。在另一个实施方式中，所述第一递呈基团是所述第一靶标标记的一部分，例如，所述第一递呈基团和所述第一靶标标记均为核酸分子并且所述第一递呈基团是所述第一靶标标记序列内的核酸片段，并且所述第二递呈基团非共价结合至所述第二结合剂。在其它实施方式中，所述第一递呈基团是所述第一靶标标记的一部分，例如，所述第一递呈基团和所述第一靶标标记均为核酸分子并且所述第一递呈基团是所述第一靶标标记序列内的核酸片段，并且所述第二递呈基团缀合至所述第二递呈基团。在另一个实施方式中，所述第一递呈基团是所述第一靶标标记的一部分，例如，所述第一递呈基团和所述第一靶标标记均为核酸分子并且所述第一递呈基团是所述第一靶标标记序列内的核酸片段，并且所述第二递呈基团非共价结合至所述第二递呈基团。在另一个实施方式中，所述第一递呈基团是所述第一靶标标记的一部分，例如，所述第一递呈基团和所述第一靶标标记均为核酸分子并且所述第一递呈基团是所述第一靶标标记序列内的核酸片段，并且所述第二递呈基团是所述第二靶标标记的一部分，例如，所述第二递呈基团和所述第二靶标标记均为核酸分子并且所述第二递呈基团是所述第二靶标标记序列内的核酸片段。
如根据本发明公开清楚地，在本文所提供的系统，包括本第5.3.4节以及第3、5.2.1至5.2.5和6节的系统的一些实施方式中，所述靶标标记(例如，所述第一靶标标记和/或所述第二靶标标记)可以是核酸分子。在一个实施方式中，所述第一靶标标记是核酸分子。在另一个实施方式中，所述第二靶标标记是核酸分子。在其它实施方式中，所述第一靶标标记是核酸分子，并且所述第二靶标标记是核酸分子。本发明公开还提供在本文所提供的系统，包括本第5.3.4节以及第3、5.2.1至5.2.5和6节的系统的一些实施方式中，当所述靶标标记为核酸分子时，所述靶标标记与也是核酸分子的所述接受基团杂交。在一个实施方式中，所述第一靶标标记与所述第一标签杂交。在另一个实施方式中，所述第二靶标标记与所述第二标签杂交。在其它实施方式中，所述第一靶标标记与所述第一标签杂交，并且所述第二靶标标记与所述第二标签杂交。
另外，本发明公开提供了包含样品ID的样品标记，其中对于本文所提供的系统，包括本第5.3.4节和第3、5.2.1至5.2.5和6节所述的系统的多种实施系统，所述样品标记结合至所述免疫复合物。所述样品标记可以结合至所述结合部分的任何组分，通过两种结合部分(例如，所述第一结合部分和所述第二结合部分)所形成的免疫复合物、所述接受基团或者偶联至所述固体表面的组分。在一个实施方式中，所述样品标记结合至靶标标记。在另一个实施方式中，所述样品标记结合至所述递呈基团(例如，作为核酸分子的递呈基团)。在其它实施方式中，所述样品标记结合至结合剂。在另一个实施方式中，所述样品标记结合至接受基团。在一个实施方式中，所述样品标记结合至所述第一靶标标记。在另一个实施方式中，所述样品标记结合至所述第一递呈基团(例如，作为核酸分子的递呈基团)。在另一个实施方式中，所述样品标记结合至所述第一标签。在其它实施方式中，所述样品标记结合至所述第一结合剂。在另一个实施方式中，所述样品标记结合至所述第一接受基团。在一个实施方式中，所述样品标记结合至所述第二靶标标记。在另一个实施方式中，所述样品标记结合至所述第二递呈基团(例如，作为核酸分子的递呈基团)。在另一个实施方式中，所述样品标记结合至所述第二标签。在其它实施方式中，所述样品标记结合至所述第二结合剂。在另一个实施方式中，所述样品标记结合至所述第二接受基团。
此外，所述样品标记与所述第一结合部分或所述第一接受基团的组分之间的结合的任何实施方式可以与所述样品标记与所述第二结合部分或所述第二接受基团的组分之间的结合的任何实施方式组合。因此，在一个实施方式中，所述样品标记结合至所述第一靶标标记和所述第二靶标标记。在另一个实施方式中，所述样品标记结合至所述第一靶标标记和所述第二递呈基团(例如，作为核酸分子的递呈基团)。在另一个实施方式中，所述样品标记结合至所述第一靶标标记和所述第二标签。在其它实施方式中，所述样品标记结合至所述第一靶标标记和所述第二结合剂。在另一个实施方式中，所述样品标记结合至所述第一靶标标记和所述第二接受基团。
在一个实施方式中，所述样品标记结合至所述第一递呈基团(例如，作为核酸分子的递呈基团)和所述第二靶标标记。在另一个实施方式中，所述样品标记结合至所述第一递呈基团(例如，作为核酸分子的递呈基团)和所述第二递呈基团(例如，作为核酸分子的递呈基团)。在另一个实施方式中，所述样品标记结合至所述第一递呈基团(例如，作为核酸分子的递呈基团)和所述第二标签。在其它实施方式中，所述样品标记结合至所述第一递呈基团(例如，作为核酸分子的递呈基团)和所述第二结合剂。在另一个实施方式中，所述样品标记结合至所述第一递呈基团(例如，作为核酸分子的递呈基团)和所述第二接受基团。
在一个实施方式中，所述样品标记结合至所述第一标签和所述第二靶标标记。在另一个实施方式中，所述样品标记结合至所述第一标签和所述第二递呈基团(例如，作为核酸分子的递呈基团)。在另一个实施方式中，所述样品标记结合至所述第一标签和所述第二标签。在其它实施方式中，所述样品标记结合至所述第一标签和所述第二结合剂。在另一个实施方式中，所述样品标记结合至所述第一标签和所述第二接受基团。
在一个实施方式中，所述样品标记结合至所述第一结合剂和所述第二靶标标记。在另一个实施方式中，所述样品标记结合至所述第一结合剂和所述第二递呈基团(例如，作为核酸分子的递呈基团)。在另一个实施方式中，所述样品标记结合至所述第一结合剂和所述第二标签。在其它实施方式中，所述样品标记结合至所述第一结合剂和所述第二结合剂。在另一个实施方式中，所述样品标记结合至所述第一结合剂和所述第二接受基团。
在一个实施方式中，所述样品标记结合至所述第一接受基团和所述第二靶标标记。在另一个实施方式中，所述样品标记结合至所述第一接受基团和所述第二递呈基团(例如，作为核酸分子的递呈基团)。在另一个实施方式中，所述样品标记结合至所述第一接受基团和所述第二标签。在其它实施方式中，所述样品标记结合至所述第一接受基团和所述第二结合剂。在另一个实施方式中，所述样品标记结合至所述第一接受基团和所述第二接受基团。
在本文，包括在本第5.3.4节和第3、5.2.1至5.2.5和6节中所提供的多个实施方式中，所述样品标记可以是核酸分子并且所述样品标记中的所述样品ID可以是识别样品或与样品相关联的核酸序列。在一个实施方式中，所述样品标记是单链核酸分子(“单链样品标记”)。在另一个实施方式中，所述样品标记是双链核酸分子(“双链样品标记”)。在本文，包括在本第5.3.4节和第3、5.2.1至5.2.5和6节中所提供的多个实施方式中，对于双链样品标记，本发明公开还提供所述样品标记对于样品可以不具有悬突(例如，两个平末端)、具有一个悬突(例如，一个平末端)或者具有两个悬突(无平末端)。在一个实施方式中，所述样品标记是包含两个5'悬突的双链核酸分子。在一个实施方式中，所述样品标记是包含两个3'悬突的双链核酸分子。在一个实施方式中，所述样品标记是包含5'悬突和3'悬突的双链核酸分子。在一个实施方式中，所述样品标记是包含5'悬突和平末端的双链核酸分子。在一个实施方式中，所述样品标记是包含3'悬突和平末端的双链核酸分子。
在本文所提供的系统的多个实施方式中，当所述样品标记为双链核酸分子并且具有一个或两个悬突时，则所述样品标记可以通过其悬突与所述结合部分的任何核酸组分、通过两个结合部分所形成的免疫复合物、所述接受基团或偶联至所述固体表面的核酸组分杂交。在本文所提供的系统的多个实施方式中，当所述样品标记为单链核酸分子时，则所述样品标记可以与所述结合部分的任何核酸组分、通过两个结合部分所形成的免疫复合物、所述接受基团或偶联至所述固体表面的核酸组分杂交。
如根据本发明公开清楚地，所述靶标标记、所述递呈基团、所述结合剂和/或所述接受基团中的每一个均可以是核酸分子。因此，当它们是核酸分子或者具有作为核酸分子的组分时，所述样品标记可以通过其悬突与所述靶标标记、所述递呈基团、所述结合剂和/或所述接受基团杂交。在一个实施方式中，所述样品标记与靶标标记杂交。在另一个实施方式中，所述样品标记与所述递呈基团(例如，作为核酸分子的递呈基团)杂交。在其它实施方式中，所述样品标记与结合剂杂交。在另一个实施方式中，所述样品标记与接受基团杂交。在一个实施方式中，所述样品标记与所述第一靶标标记杂交。在另一个实施方式中，所述样品标记与所述第一递呈基团(例如，作为核酸分子的递呈基团)杂交。在另一个实施方式中，所述样品标记与所述第一标签杂交。在其它实施方式中，所述样品标记与所述第一结合剂杂交。在另一个实施方式中，所述样品标记与所述第一接受基团杂交。在一个实施方式中，所述样品标记与所述第二靶标标记杂交。在另一个实施方式中，所述样品标记与所述第二递呈基团(例如，作为核酸分子的递呈基团)杂交。在另一个实施方式中，所述样品标记与所述第二标签杂交。在其它实施方式中，所述样品标记与所述第二结合剂杂交。在另一个实施方式中，所述样品标记与所述第二接受基团杂交。
此外，所述样品标记与所述第一结合部分或所述第一接受基团的组分之间的杂交的任何实施方式可以与所述样品标记与所述第二结合部分或所述第二接受基团的组分之间的杂交的任何实施方式组合。因此，在一个实施方式中，所述样品标记与所述第一靶标标记和所述第二靶标标记杂交。在另一个实施方式中，所述样品标记与所述第一靶标标记和所述第二递呈基团(例如，作为核酸分子的递呈基团)杂交。在另一个实施方式中，所述样品标记与所述第一靶标标记和所述第二标签杂交。在其它实施方式中，所述样品标记与所述第一靶标标记和所述第二结合剂杂交。在另一个实施方式中，所述样品标记与所述第一靶标标记和所述第二接受基团杂交。
在一个实施方式中，所述样品标记与所述第一递呈基团(例如，作为核酸分子的递呈基团)和所述第二靶标标记杂交。在另一个实施方式中，所述样品标记与所述第一递呈基团(例如，作为核酸分子的递呈基团)和所述第二递呈基团(例如，作为核酸分子的递呈基团)杂交。在另一个实施方式中，所述样品标记与所述第一递呈基团(例如，作为核酸分子的递呈基团)和所述第二标签杂交。在其它实施方式中，所述样品标记与所述第一递呈基团(例如，作为核酸分子的递呈基团)和所述第二结合剂杂交。在另一个实施方式中，所述样品标记与所述第一递呈基团(例如，作为核酸分子的递呈基团)和所述第二接受基团杂交。
在一个实施方式中，所述样品标记与所述第一标签和所述第二靶标标记杂交。在另一个实施方式中，所述样品标记与所述第一标签和所述第二递呈基团(例如，作为核酸分子的递呈基团)杂交。在另一个实施方式中，所述样品标记与所述第一标签和所述第二标签杂交。在其它实施方式中，所述样品标记与所述第一标签和所述第二结合剂杂交。在另一个实施方式中，所述样品标记与所述第一标签和所述第二接受基团杂交。
在一个实施方式中，所述样品标记与所述第一结合剂和所述第二靶标标记杂交。在另一个实施方式中，所述样品标记与所述第一结合剂和所述第二递呈基团(例如，作为核酸分子的递呈基团)杂交。在另一个实施方式中，所述样品标记与所述第一结合剂和所述第二标签杂交。在其它实施方式中，所述样品标记与所述第一结合剂和所述第二结合剂杂交。在另一个实施方式中，所述样品标记与所述第一结合剂和所述第二接受基团杂交。
在一个实施方式中，所述样品标记与所述第一接受基团和所述第二靶标标记杂交。在另一个实施方式中，所述样品标记与所述第一接受基团和所述第二递呈基团(例如，作为核酸分子的递呈基团)杂交。在另一个实施方式中，所述样品标记与所述第一接受基团和所述第二标签杂交。在其它实施方式中，所述样品标记与所述第一接受基团和所述第二结合剂杂交。在另一个实施方式中，所述样品标记与所述第一接受基团和所述第二接受基团杂交。
本领域的常规技术人员将理解当双链样品标记与如本第5.3.4节，包括本段和之前6段中所述的两个项目杂交时，在一些实施方式中，所述双链样品标记通过其5'悬突与第一项目杂交并且通过其3'悬突与第二项目杂交。在其它实施方式中，所述双链样品标记通过其3'悬突与第一项目杂交并且通过其5'悬突与第二项目杂交。在其它实施方式中，所述双链样品标记通过其5'悬突与第一项目杂交并且通过其5'悬突与第二项目杂交。在其它实施方式中，所述双链样品标记通过其3'悬突与第一项目杂交并且通过其3'悬突与第二项目杂交。当双链样品标记与如本第5.3.4节，包括本段和之前6段中所述的一个项目杂交时，在一些实施方式中，所述双链样品标记通过其5'悬突与所述项目杂交。在某些实施方式中，所述双链样品标记通过其3'悬突与所述项目杂交。当所述样品标记是单链样品标记时，这种样品标记可以通过任何部分或其核酸序列，包括任一端、两端(5'端和3'端)和任何内部序列，与如本第5.3.4节，包括本段和之前6段中所述的任一个项目或两个项目杂交。
在一些具体的实施方式中，所述样品标记通过所述样品标记的悬突(例如，5'悬突或3'悬突)与所述第一靶标标记杂交。在另一个具体的实施方式中，所述样品标记通过所述样品标记的悬突(例如，5'悬突或3'悬突)与所述第二靶标标记杂交。在另一个实施方式中，所述样品标记通过所述样品标记的悬突(例如，5'悬突或3'悬突)与所述第一靶标标记杂交并且通过所述样品标记的悬突(例如，5'悬突或3'悬突)与所述第二靶标标记杂交。在另一个实施方式中，所述样品标记通过所述样品标记的5'悬突与所述第一靶标标记杂交并且通过所述样品标记的3'悬突与所述第二靶标标记杂交。在一个实施方式中，所述样品标记通过所述样品标记的5'悬突与所述第一靶标标记杂交并且通过所述样品标记的5'悬突与所述第二靶标标记杂交。在其它实施方式中，所述样品标记通过所述样品标记的3'悬突与所述第一靶标标记杂交并且通过所述样品标记的5'悬突与所述第二靶标标记杂交。在另一个实施方式中，所述样品标记通过所述样品标记的3'悬突与所述第一靶标标记杂交并且通过所述样品标记的3'悬突与所述第二靶标标记杂交。
由于本文，包括本第5.3.4节中所提供的系统可以将每种分析物与本文所提供的一种或多种靶标ID相关联，因为所述系统可以通过同时检测与每种分析物相关联的靶标ID并将靶标ID与所述分析物相关联来同时检测所述样品中的至少两种分析物。因此，在一些实施方式中，本文所提供的系统通过同时检测与每种分析物相关联的独特靶标ID，同时检测所述样品中至少3、至少4、至少5、至少6、至少7、至少8、至少9、至少10、至少12、至少15、至少20、至少30、至少40、至少50、至少60、至少70、至少80、至少90或者至少100种分析物。在其它实施方式中，本文所提供的系统通过同时检测与每种分析物相关联的独特靶标ID，同时检测了所述样品中约3、约4、约5、约6、约7、约8、约9、约10、约12、约15、约20、约30、约40、约50、约60、约70、约80、约90或约100种分析物。在某些实施方式中，本文所提供的系统通过同时检测与每种分析物相关联的独特靶标ID，同时检测所述样品中至少100、至少150、至少200、至少250、至少300、至少350、至少400、至少450、至少500、至少550、至少600、至少650、至少700、至少750、至少800、至少850、至少900、至少950、至少1000、至少1100、至少1200、至少1300、至少1400、至少1500、至少1600、至少1700、至少1800、至少1900或至少2000种分析物。在其它实施方式中，本文所提供的系统通过同时检测与每种分析物相关联的独特靶标ID，同时检测所述样品中约100、约150、约200、约250、约300、约350、约400、约450、约500、约550、约600、约650、约700、约750、约800、约850、约900、约950、约1000、约1100、约1200、约1300、约1400、约1500、约1600、约1700、约1800、约1900或约2000种分析物。
本发明公开还提供并且本领域的常规技术人员通过阅读本发明申请将理解在本文，包括在本第5.3.4节中所提供的系统的一些实施系统中，所述系统还包括参比分析物，从而可以根据从所述参比分析物所产生的报告分子归一化样品间差异。在本文，包括在本第5.3.4节中所提供的系统的一个实施方式中，所述系统还包含参比分析物。在另一个实施方式中，所述系统的步骤(1)还包含参比分析物。在另一个实施方式中，所述参比分析物是在所述样品中不存在的分析物。在其它实施方式中，所述参比分析物是所述样品中不存在的蛋白、核酸或化合物。在一个实施方式中，所述参比分析物是病毒蛋白、细菌蛋白或昆虫蛋白。在另一个实施方式中，所述参比分析物是病毒核酸分子、细菌核酸分子或昆虫核酸分子。
如根据本发明公开清楚地，所述系统的多种实施方式提供了包含样品ID和/或靶标ID的核酸报告分子。照此，在一些实施方式中，本文所提供的系统包括通过同时检测与每种样品相关联的核酸报告分子中的独特样品ID，同时检测至少两个样品中的所述分析物。在其它实施方式中，本文所提供的系统包括通过同时检测与每种分析物相关联的独特样品ID和独特靶标ID以及与每种样品相关联的独特样品ID，同时检测至少两种样品中的至少两种分析物。在一些其它实施方式中，本文所提供的系统还包括同时检测任何数目的样品，如第3、5.2.5和6节中所提供的。在其它实施方式中，本文所提供的系统还包括同时检测与如第3、5.2.5和6节中所提供的任何数目的靶标任意组合的如第3、5.2.5和6节中所提供的任何数目的样品。
另外，在本文，包括在本第5.3.4节中所提供的系统的一些实施方式中，为了检测所述核酸报告分子，本文所公开的多重系统还可以包含用于多重qPCR、多重数字PCR或NGS的试剂和/或机器，照此在第3、5.2.5和6节中提供了多重qPCR、多重数字PCR或NGS。在具体的实施方式中，所述多重系统还可以包含用于NGS的试剂和/或机器。在第3、5.2.5和6节中进一步提供了这种NGS。
另外，本发明公开提供了并且本领域的常规技术人员通过阅读本发明公开将理解本第5.3.4节中所提供的系统的任何实施方式可以与本第5.3.4节以及本发明公开的其它节，包括第3、4、5.1、5.2.1至5.2.5、5.3、5.4和6节中所提供的任何其它实施方式组合。
在一些实施方式中，本文所提供的用于检测分析物的系统包含在试剂盒中。在一些实施方式中，本发明公开所述的试剂盒可以包括辅助试剂。在一些实施方式中，本文所提供的试剂盒还包括结合缓冲液、固定化缓冲液、清洗缓冲液、释放缓冲液或它们的任意组合。
在一个方面，本文提供了用于检测样品中分析物的系统，其包括：(1)第一结合部分，其包含第一结合剂、第一递呈基团和第一靶标标记，所述第一靶标标记包含第一标识码(“ID”)，它是分析物特异的(“靶标ID”)；(2)第二结合部分，其包含第二结合剂、第二递呈基团和第二靶标标记，所述第二靶标标记包含第二靶标ID；(3)第一接受基团、第一固体表面、第二接受基团和第二固体表面；(4)用于连接的试剂和包含样品特异的ID(“样品ID”)的样品标记；和(5)用于定量PCR的试剂；其中(i)所述第一和第二结合剂结合至所述分析物并形成免疫复合物；(ii)所述第一接受基团偶联至所述第一固体表面并配置以捕获所述第一递呈基团；(iii)所述第二接受基团偶联至所述第二固体表面并配置以捕获所述第二递呈基团；(iv)所述第一靶标标记直接或间接结合至所述第一结合剂并且所述第二靶标标记直接或间接结合至所述第二结合剂；(v)所述第一递呈基团直接或间接结合至所述第一结合剂并且所述第二递呈基团直接或间接结合至所述第二结合剂；和(vi)所述样品标记结合至所述第一靶标标记和所述第二靶标标记两者。
在一些实施方式中，本文所提供的用于检测分析物的系统包含在试剂盒中。在一些实施方式中，本发明公开所述的试剂盒可以包括辅助试剂。在一些实施方式中，本文所提供的试剂盒还包括结合缓冲液、固定化缓冲液、清洗缓冲液、释放缓冲液或它们的任意组合。
在一个方面，本文提供了用于检测样品中分析物的系统，其包括：(1)第一结合部分，其包含第一结合剂、第一递呈基团和第一靶标标记，所述第一靶标标记包含第一标识码(“ID”)，它是分析物特异的(“靶标ID”)；(2)第二结合部分，其包含第二结合剂、第二递呈基团和第二靶标标记，所述第二靶标标记包含第二靶标ID；(3)第一接受基团、第一固体表面、第二接受基团和第二固体表面；和(4)用于连接的试剂和包含样品特异的ID(“样品ID”)的样品标记；其中(i)所述第一和第二结合剂结合至所述分析物并形成免疫复合物；(ii)所述第一接受基团偶联至所述第一固体表面并配置以捕获所述第一递呈基团；(iii)所述第二接受基团偶联至所述第二固体表面并配置以捕获所述第二递呈基团；(iv)所述第一靶标标记直接或间接结合至所述第一结合剂并且所述第二靶标标记直接或间接结合至所述第二结合剂；(v)所述第一递呈基团直接或间接结合至所述第一结合剂并且所述第二递呈基团直接或间接结合至所述第二结合剂；和(vi)所述样品标记结合至所述第一靶标标记和所述第二靶标标记两者。
在一些实施方式中，本文所提供的用于检测分析物的系统包含在试剂盒中。在一些实施方式中，本发明公开所述的试剂盒可以包括辅助试剂。在一些实施方式中，本文所提供的试剂盒还包括结合缓冲液、固定化缓冲液、清洗缓冲液、释放缓冲液或它们的任意组合。
5.4核酸连接的免疫复合物
如以上所描述的，本文还提供了当体外实施所述测定方法时所形成的核酸接头免疫复合物(NULI)。在一些实施方式中，本文提供了NULI，其包含分析物、结合所述分析物上非干扰表位的两个结合剂，其中至少一个结合剂与核酸标签缀合、杂交至所述标签的捕获探针和固体表面。在一些实施方式中，所述捕获探针直接偶联至所述固体表面(图18A)。在一些实施方式中，所述捕获探针通过链霉亲和素/生物素结合对间接偶联至所述固体表面(图18B)。在一些实施方式中，所述捕获探针通过与直接偶联至所述表面的第二捕获探针杂交间接偶联至所述固体表面(图18C)。
在以上所描述的NULI的一些实施方式中，所述两个结合剂通过连续核酸分子共价连接(图19A)。在本文所提供的NULI的一些实施方式中，所述两个核酸标签通过杂交直接连接(图19B)。在本文所提供的NULI的一些实施方式中，所述两个核酸标签通过中间核酸分子间接连接(图19C)。在本文所提供的NULI的一些实施方式中，所述两个核酸标签通过不止一个中间核酸分子间接连接(图19D)。
应注意相对于本文所提供的任何多种方法和/或试剂盒，还考虑了以上所列实施方式的任意组合，例如，相对于一种或多种试剂，如(无限制地)核酸标签或探针、固体表面等。
一般地，在本文中使用肯定性语言公开了本发明以描述多种实施方式。本发明还具体地包括其中完全或部分排除特定主题，如物质或材料、方法步骤和条件、规程、程序、测定或分析的实施方式。因此，尽管通常在本文中未就本发明不包括的内容来表达本发明，但是尽管如此本文公开了未明确包括在本发明中的方面。
本文描述了本发明的具体实施方式，包括本发明人已知用于实施本发明的最佳方式。通过阅读以上描述，所公开的实施方式的变化形式应对于在本领域中工作的个体变得显而易见，并且预期那些技术人员可以根据情况使用这些变化形式。因此，预期除本文具体描述的之外实践本发明，并且本发明包括如通过适用法律所允许的，所附权利要求中列举的主题的所有修改和等价形式。此外，除非在本文中另外说明或者与上下文明显矛盾，否则本发明涵盖了上述元素以其所有可能的变化的任意组合。
在本说明书中所引用的所有专利公开、专利申请和登录号以及其它参考文献以每个单个专利公开或专利申请具体且单独表明作为参考并入的一样以其全部内容作为参考并入本文。仅对于它们在本发明申请提交日期之前的公开内容提供本文所讨论的专利公开。在本文中任何事物均不应被视为承认本发明因在先发明而无权先于这种专利公开。另外，所提供的公开日可以不同于实际公开日，这可以需要独立确认。
已描述了本发明的一些实施方式。尽管如此，将理解可以在不背离本发明的精神和范围的情况下做出多种改变。因此，实验部分中的描述旨在说明但不限制权利要求中所述的本发明的范围。
6.实施例
6.1NULISA测定
6.1.1免疫复合物的形成(图4B(a))
将两个结合剂(结合剂1和结合剂2)加入至样品，所述结合剂可以是抗体或者能够特异性结合至靶标分析物的任何其它结合部分。将每种结合剂分别与单-链核酸标签，标签1和标签2缀合。所述两个结合剂结合至靶标分析物并形成免疫复合物。
在一些实施方式中，结合剂1和结合剂2中的每一个在其中形成所述免疫复合物的溶液中的浓度在0.1nM至10nM的范围内。在一些实施方式中，结合剂1和结合剂2的浓度在0.1nM至8nM的范围内。在一些实施方式中，结合剂1和结合剂2的浓度分别在0.1nM至6nM的范围内。在一些实施方式中，结合剂1和结合剂2的浓度分别在0.1nM至4nM的范围内。在一些实施方式中，结合剂1和结合剂2的浓度分别在0.1nM至2nM的范围内。在另一个实施方式中，结合剂1和结合剂2的浓度分别在0.2nM至2nM的范围内。在另一个实施方式中，结合剂1和结合剂1的浓度分别在0.2nM至1nM的范围内。
在一些实施方式中，结合剂1的浓度为约0.1nM、约0.2nM、约0.4nM、约0.6nM、约0.8nM、约1nM、约1.2nM、约1.4nM、约1.6nM、约1.8nM、约2.0nM、约2.5nM、约3.0nM、约4.0nM、约5.0nM、约6.0nM、约7.0nM、约8.0nM、约9.0nM或约10.0nM。在一些实施方式中，结合剂2的浓度为约0.1nM、约0.2nM、约0.4nM、约0.6nM、约0.8nM、约1nM、约1.2nM、约1.4nM、约1.6nM、约1.8nM、约2.0nM、约2.5nM、约3.0nM、约4.0nM、约5.0nM、约6.0nM、约7.0nM、约8.0nM、约9.0nM或约10.0nM。
在一些实施方式中，所述样品是血液样品。在一些实施方式中，所述样品是血清样品。在一些实施方式中，所述样品是血浆样品。所述样品可以在0至1mL、0.001至0.9mL、0.001至0.8mL、0.001至0.7mL、0.001至0.6mL、0.001至0.5mL、0.001至0.4mL、0.001至0.3mL、0.001至0.2mL、0.001至0.1mL、0.001至0.08mL、0.001至0.05mL、0.001至0.02mL、0.001至0.01mL、0.001至0.008mL、0.001至0.005mL或0.001至0.002mL的范围内。在一些实施方式中，所述样品在0.005至0.4mL的范围内。
在一些实施方式中，在20至37℃之间的温度下实施结合反应。在一些实施方式中，在一些实施方式中，在室温下实施所述结合反应。在一些实施方式中，在约25℃实施所述结合反应。在一些实施方式中，在约22℃实施所述结合反应。
在一些实施方式中，用于结合反应的盐浓度在0.5×SSC至2×SSC的范围内。在一些实施方式中，用于结合反应的盐浓度在1×SSC至1.5×SSC的范围内。在一些实施方式中，用于结合反应的盐浓度为约0.5×SSC、约1.0×SSC、约1.5×SSC、约2.0×SSC或者约2.5×SSC。如本领域中已知的，将盐水-柠檬酸钠(SSC)缓冲液用作杂交缓冲液，以控制核酸分子杂交规程中清洗步骤的严格性。20×储液由3M氯化钠和300mM柠檬酸钠(用HCl调节至pH7.0)组成。
6.1.2免疫复合物在第一表面上的捕获(图4B(b))
含有免疫复合物的样品与第一固体表面接触，所述第一固体表面与第一核酸捕获探针分子(“CP1”或“第一探针”)偶联。CP1的节段与标签1的一部分的序列互补，其能够使所述免疫复合物捕获至所述第一表面上。实施清洗以除去溶液中任何过量的未结合的分子，其包括游离的结合剂2和任何非靶标蛋白或其它分子。
所述固体表面可以是适合连接核酸并且辅助测定步骤的任何表面，其包括(但不限于)磁性颗粒的表面、微量滴定板的孔等。设计标签1和CP1之间的互补序列以有助于标签1与CP1之间的特异性杂交，并同时有助于所述杂交的免疫复合物随后的解离。在一个实施方式中，可以使用长度适当、不具有G/C的序列，所述序列可以在杂交中提供足够的强度并且可以在释放期间在低盐条件下溶解而不会破坏所述免疫复合物。有用的序列的具体实例包括多聚T/A或多聚“TA”/“AT”等。如本领域的常规技术人员将理解的，可以使用具有适当杂交强度的任何序列。
可以改变实施例中以上所描述的步骤的工作流程。例如，结合剂1可以预结合至所述第一表面，其一旦接触所述样品，则捕获所述分析物。可以随后或与样品同时添加结合剂2，从而通过多轮添加/孵浴/清洗步骤在所述表面上形成所述免疫复合物。
在一些实施方式中，标签1和CP1之间的互补序列不具有G/C并且具有8至30个碱基对的范围内的长度。在一些实施方式中，所述互补序列在10至25个碱基对的范围内。在一些实施方式中，所述互补序列在12至20个碱基对的范围内。在一些实施方式中，所述互补序列在12至16个碱基对的范围内。在一个实施方式中，标签1和CP1之间的互补序列不具有G/C，并且具有8个碱基对、9个碱基对、10个碱基对、12个碱基对、14个碱基对、16个碱基对、18个碱基对、20个碱基对、22个碱基对、25个碱基对、28个碱基对或者30个碱基对。
在一些实施方式中，在20至37℃之间的温度下实施杂交反应。在一些实施方式中，在室温下实施所述杂交反应。在一些实施方式中，在25℃下实施所述杂交反应。在一些实施方式中，在22℃下实施所述杂交反应。
在一些实施方式中，用于杂交反应的盐浓度在0.5×SSC至2×SSC的范围内。在一些实施方式中，用于结合反应的盐浓度在1×SSC至1.5×SSC的范围内。在一些实施方式中，用于杂交反应的盐浓度为约0.5×SSC、约1.0×SSC、约1.5×SSC、约2.0×SSC或者约2.5×SSC。
6.1.3所述免疫复合物从所述第一表面的释放。(图4B(c))
使释放缓冲液与所述第一表面接触并设置测定参数以促进杂交的接触，从而将所述免疫复合物释放至所述溶液。所述测定参数可以包括适合的盐浓度和/或温度升高，或者有助于杂交键解除且不干扰所述免疫复合物中的抗体-蛋白结合的任何其它条件。本领域的常规技术人员可以通过常规实验确定适当的释放条件。
可以通过低盐浓度破坏标签1和CP1之间的杂交。在一些实施方式中，将含有0.02×SSC至0.30×SSC的范围内的盐浓度的释放缓冲液用作所述释放缓冲液。在一些实施方式中，释放缓冲液含有0.05×SSC至0.2×SSC的范围内的盐浓度。在一些实施方式中，释放缓冲液含有约0.02×SSC、约0.03×SSC、约0.04×SSC、约0.05×SSC、约0.06×SSC、约0.08×SSC、约0.1×SSC、约0.12×SSC、约0.14×SSC、约0.16×SSC、约0.18×SSC、约0.20×SSC、约0.22×SSC、约0.24×SSC、约0.26×SSC、约0.28×SSC或约0.30×SSC的盐浓度。
在一些实施方式中，在20至37℃之间的温度下实施所述免疫复合物从所述第一表面的释放。在一些实施方式中，在室温下实施所述免疫复合物从所述第一表面的释放。在一些实施方式中，在25℃下实施所述免疫复合物从所述第一表面的释放。在一些实施方式中，在22℃下实施所述免疫复合物从所述第一表面的释放。
在一些实施方式中，在它回到高至更高的盐浓度，通常(但不必需)在1×SSC至1.5×SSC的范围内的盐浓度之前，与所述释放缓冲液的孵浴时间在30分钟内。在一些实施方式中，与所述释放缓冲液的孵浴时间在25分钟内。在一些实施方式中，与所述释放缓冲液的孵浴时间在20分钟内。在一些实施方式中，与所述释放缓冲液的孵浴时间在15分钟内。在一些实施方式中，与所述释放缓冲液的孵浴时间在10分钟内。在一些实施方式中，与所述释放缓冲液的孵浴时间在8分钟内。
6.1.4免疫复合物在第二表面上的重新捕获(图4B(d))
使含有释放的免疫复合物的释放缓冲液回到更高的盐浓度，然后与干净的第二固体表面接触，所述第二固体表面预缀合了第二核酸捕获探针(“CP2”或“第二探针”)。由于CP2含有与标签2的序列互补的序列，因此将所述免疫复合物重新捕获至所述第二表面。可以实施额外的清洗以除去未结合的分子，所述未结合的分子包括不是所述免疫复合物的一部分的游离的结合剂1。
在一些实施方式中，CP1和CP2是分别与标签1和标签2的片段互补的不同序列。在一些实施方式中，CP1和CP2是仅与标签1互补的相同序列，因此通过结合剂1将所述免疫复合物重新捕获至表面2。在一些实施方式中，可以对任一种结合剂实施一次或另外一轮捕获/释放循环。在一些实施方式中，可以单独仅对一个结合剂实施捕获/释放循环。
6.2用于EGFR检测的NULISA(图16)
6.2.1结合剂1和结合剂2蛋白-寡核苷酸复合物的制备
结合剂1和结合剂2选自EGFR结合剂文库以占据EGFR表面上的非干扰表位。通过对C-末端半胱氨酸的寡核苷酸缀合使两种结合剂官能化。
将结合剂1与互补的、预杂交的寡核苷酸CP(/5AmMC6/AATGATACGGCGACCACCGAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAA)(SEQ ID NO.53)和R(/5Phos/TCGAGTCTTATCGGTGGTCGCCGTATCATT)(SEQ ID NO.54)缀合。
将结合剂2与互补的、预杂交的寡核苷酸L(/5AmMC6/CAAGCAGAAGACGGCATACGAACACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCTTATATTAATCTGCAC)(SEQ ID NO.55)和CP2(/5BiosG/GAGCGTCGTGTAGGGAAAGAGTGTTCGTATGCCG)(SEQ ID NO.56)缀合。
简要地，将等摩尔量的互补寡核苷酸在CB缓冲液(100mM磷酸钠、150mM氯化钠、5mMEDTA，pH 7.2)中混合，加热至94℃并以0.1℃/s的速率缓慢冷却至25℃。随后，将10倍摩尔过量的PEG化的SMCC接头(Thermo Scientific，目录号No.22102)加入至寡核苷酸双螺旋并在25℃孵浴30分钟。将寡核苷酸脱盐以除去过量的接头。通过在25℃与固定化的TCEP还原性凝胶(Thermo Scientific，目录号No.77712)孵浴1-小时使结合剂1和2的C末端半胱氨酸还原。通过将等摩尔量的还原蛋白与SMCC激活的寡核苷酸在25℃孵浴1小时来实施蛋白-寡核苷酸缀合。通过阴离子交换色谱法从未反应的蛋白和寡核苷酸分离结合剂1和结合剂2蛋白-寡核苷酸缀合物。
6.2.2NULISA免疫测定
将结合剂1和结合剂2蛋白-寡核苷酸缀合物混合并分别在封闭缓冲液(1×SSC、0.2％BSA、0.05％吐温20)中稀释至1nM和0.2nM。然后，将不同的量的EGFR(100pM-25aM)添加至100μl的结合剂1和2混合物，从而允许形成夹心免疫复合物。在25℃孵浴1h后，将1μl预封闭的Sera-Mag低聚(dT)-涂覆的磁性颗粒(GE Health,38152103010150)加入至每种样品以捕获所述免疫复合物。在25℃另外1小时后，用120μl清洗缓冲液(1×SSC、0.05％Tween20)清洗磁性颗粒4次以除去未结合的结合剂1。
将50μl洗脱缓冲液(0.1×SSC)加入至每种样品以释放所述免疫复合物10分钟。通过施加磁力收集所述磁性颗粒，并将含有游离的免疫复合物的上清液转移到含有2×体积的清洗缓冲液(2×SSC，0.1％吐温20)和1μl预封闭的Sera-Mag链霉亲和素-封闭的磁性颗粒的新管中10分钟。该步骤通过生物素-链霉亲和素相互作用将所述免疫复合物重新捕获至磁性颗粒。然后，用120μl清洗缓冲液清洗磁性颗粒两次以除去未结合的结合剂2。
通过添加20μl连接缓冲液(1×NEB T4连接缓冲液、1μM CNT寡核苷酸(TTTGACTCGAGTGCAGAATT)(SEQ ID NO.57)、0.05μl NEB T7连接酶)并在25℃孵浴5分钟来实施珠上连接。该步骤导致缀合的DNA序列在与EGFR一起形成免疫复合物的结合剂1和结合剂2上的连接。用120μl清洗缓冲液再清洗样品一次并且用20μl水，在70℃洗脱连接产物10分钟。
使用寡核苷酸P5(AATGATACGGCGACCACCGA)(SEQ ID NO.58)、P7(CAAGCAGAAGACGGCATACGA)(SEQ ID NO.59)和SBS3(/56-FAM/CACTCTTTCCCTACACGACGCTCTT/3IABkFQ/)(SEQ ID NO.60)，实施qPCR以定量每种样品中的连接产物的量。通过计算平均空白+3倍空白的标准偏差来确定LOD。图17显示了该实验的结果。如所示的，实现了渺摩尔(aM)水平的蛋白检测灵敏度。
6.3通过免疫复合物的释放的灵敏度的改善
如图20A-20D所示，使用了替代NULISA工作流程。在本实验中，通过可释放键将免疫复合物捕获至珠表面。在将或不将免疫复合物释放回到溶液中的情况下，实施信号产生。如图20E所示，当不释放免疫复合物时，信号被约1fM输入的背景掩盖。然而，在信号产生前将免疫复合物释放回到溶液显著降低了背景并改善了测定灵敏度。
6.4多重NULISAseq
将5对抗不同分析物的抗体与含有不同靶标ID的低聚物缀合，如序列表SEQ IDNo.1至20所示。将它们混合并在稀释剂缓冲液(1×SSC、0.2％BSA、0.05％吐温20)中稀释至20-200pM。然后，将不同的量的混合的分析物(分别为1pM至39aM)添加至抗体-低聚物缀合物的混合物中，从而允许形成夹心免疫复合物。在25℃孵浴1h之后，将样品转移到Kingfisher机，其中将1μl预封闭的Sera-Mag低聚(dT)-涂覆的磁性颗粒(GE Healthcare)加入至每种样品以捕获所述免疫复合物。在25℃另外1小时后，用100μl清洗缓冲液(1×SSC、0.05％吐温20)清洗所述磁性颗粒3次并转移至100μl洗脱缓冲液(0.2×SSC、0.05％吐温20)以释放所述免疫复合物10分钟。通过施加磁力除去Sera-Mag低聚(dT)-涂覆的磁性颗粒并将1μl预封闭的Sera-Mag链霉亲和素-封闭的磁性颗粒(GE Healthcare)加入至每种样品以通过生物素-链霉亲和素相互作用重新捕获所述免疫复合物10分钟。然后，用100μl清洗缓冲液清洗所述磁性颗粒两次并转移至100μl连接缓冲液(1×NEB T4连接缓冲液，200nM预杂交的CNT/SMI低聚物、0.25μl NEB T4连接酶)并在25℃孵浴10分钟。将含有独特样品ID的不同的CNT/SMI低聚物用于每种样品(参见序列表中的SEQ ID No.21至52)。该步骤通过在形成免疫复合物的捕获和检测抗体对上缀合的DNA序列的连接导致样品ID的掺入。用100μl清洗缓冲液再清洗样品一次并且用25μl的洗脱缓冲液，在70℃洗脱连接产物10分钟。将含有连接产物的洗脱液混合在一起以使用NEB DNA纯化试剂盒进行纯化和浓缩。然后，使用NEB Q5高保真度PCR试剂盒和引物P5(5'-AATGATACGGCGACCACCGA)、P7(5'-CAAGCAGAAGACGGCATACGA)的18个PCR循环扩增连接产物。使用NEB DNA纯化试剂盒纯化PCR产物并稀释至4nM。然后，将其在0.1N NaOH中变性并用HT1缓冲液(Illumina)稀释至20pM。将稀释的变性的PCR产物与等量的PhiX文库混合并加载至Illumina MiSeq试剂盒v3并使用MiSeq机测序(70循环，单一读序)。从测序回收约20M读序，其中将约10M读序鉴别为来自NULISA的连接产物。基于它们的靶标ID和样品ID对读序计数，这代表了每个样品中每个测定的信号。图25C以及表1和2提供了该实验的结果。如所示的，全部5个分析物的平均变异系数(CV)均小于30％。对全部5个测定实现了渺摩尔(aM)水平的蛋白检测灵敏度，它们中的3个小于50aM。来自非匹配抗体对的包含靶标ID的报告分子的测序读序可以不同于来自匹配对的那些。照此，可以从多种类型的噪音中解析出正确的信号。
表1
Figure BDA0003780256640001811
表2
测定 LOB(aM)* LOD(aM)*
IL-4 6.6 20.3
IL-6 4.0 16.7
IL-10 64.8 299.7
TNFα 28.3 95.1
P24 8.5 40.7
曲线拟合：4P-Logistic模型。
LoB＝平均空白+1.645(SD空白)
LoD＝LoB+1.645(SD低浓度样品)
来自临床和实验室标准研究所(CLSI)
序列表
Figure BDA0003780256640001821
序列表–续表
Figure BDA0003780256640001831
序列表–续表
Figure BDA0003780256640001841
序列表–续表
Figure BDA0003780256640001851
序列表–续表
Figure BDA0003780256640001861
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<160> 60
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<210> 1
<211> 41
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> P24捕获Ab的缀合物寡聚_1
<400> 1
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<210> 2
<211> 74
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> P24捕获Ab的缀合物寡聚_2
<400> 2
ccttagcact gaacttatct agacacaagc agaagacggc atacgagata aaaaaaaaaa 60
aaaaaaaaaa aaaa 74
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<211> 75
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> P24检测Ab的缀合物寡聚_1
<400> 3
aatgatacgg cgaccaccga gatctacact ctttccctac acgacgctct tccgatcttc 60
cacaagaatc tgcac 75
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<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> P24检测Ab的缀合物寡聚_2
<400> 4
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<211> 41
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<213> 人工序列
<220>
<223> IL-4捕获Ab的缀合物寡聚_1
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tcgagtctca cctcaggatc tcgtatgccg tcttctgctt g 41
<210> 6
<211> 74
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> IL-4捕获Ab的缀合物寡聚_2
<400> 6
ccttagcact gaacttatct agacacaagc agaagacggc atacgagata aaaaaaaaaa 60
aaaaaaaaaa aaaa 74
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<211> 75
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> IL-4检测Ab的缀合物寡聚_1
<400> 7
aatgatacgg cgaccaccga gatctacact ctttccctac acgacgctct tccgatcttc 60
acctcaggtc tgcac 75
<210> 8
<211> 33
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> IL-4检测Ab的缀合物寡聚_2
<400> 8
agatcggaag agcgtcgtgt agggaaagag tgt 33
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<220>
<223> IL-6捕获Ab的缀合物寡聚_1
<400> 9
tcgagtccag ttaatccatc tcgtatgccg tcttctgctt g 41
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<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> IL-6捕获Ab的缀合物寡聚_2
<400> 10
ccttagcact gaacttatct agacacaagc agaagacggc atacgagata aaaaaaaaaa 60
aaaaaaaaaa aaaa 74
<210> 11
<211> 75
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> IL-6检测Ab的缀合物寡聚_1
<400> 11
aatgatacgg cgaccaccga gatctacact ctttccctac acgacgctct tccgatctca 60
gttaatcctc tgcac 75
<210> 12
<211> 33
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> IL-6检测Ab的缀合物寡聚_2
<400> 12
agatcggaag agcgtcgtgt agggaaagag tgt 33
<210> 13
<211> 41
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> IL-10捕获Ab的缀合物寡聚_1
<400> 13
tcgagtcgaa cagctcaatc tcgtatgccg tcttctgctt g 41
<210> 14
<211> 74
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> IL-10捕获Ab的缀合物寡聚_2
<400> 14
ccttagcact gaacttatct agacacaagc agaagacggc atacgagata aaaaaaaaaa 60
aaaaaaaaaa aaaa 74
<210> 15
<211> 75
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> IL-10检测Ab的缀合物寡聚_1
<400> 15
aatgatacgg cgaccaccga gatctacact ctttccctac acgacgctct tccgatctga 60
acagctcatc tgcac 75
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<212> DNA
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<220>
<223> IL-10检测Ab的缀合物寡聚_2
<400> 16
agatcggaag agcgtcgtgt agggaaagag tgt 33
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<211> 41
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> TNF-阿尔法捕获Ab的缀合物寡聚_1
<400> 17
tcgagtccgc tataatgatc tcgtatgccg tcttctgctt g 41
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<211> 74
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> TNF-阿尔法捕获Ab的缀合物寡聚_2
<400> 18
ccttagcact gaacttatct agacacaagc agaagacggc atacgagata aaaaaaaaaa 60
aaaaaaaaaa aaaa 74
<210> 19
<211> 75
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> TNF-阿尔法检测Ab的缀合物寡聚_1
<400> 19
aatgatacgg cgaccaccga gatctacact ctttccctac acgacgctct tccgatctcg 60
ctataatgtc tgcac 75
<210> 20
<211> 33
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> TNF-阿尔法检测Ab的缀合物寡聚_2
<400> 20
agatcggaag agcgtcgtgt agggaaagag tgt 33
<210> 21
<211> 10
<212> DNA
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<220>
<223> 1pM的样品条形码1
<400> 21
cacctgtagt 10
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<212> DNA
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<223> 1pM的样品条形码2
<400> 22
cttcggcgaa 10
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<211> 10
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 1pM的样品条形码3
<400> 23
acaacgacaa 10
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<211> 10
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 1pM的样品条形码4
<400> 24
aagccaccaa 10
<210> 25
<211> 10
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 100fM的样品条形码1
<400> 25
tgtcgcggaa 10
<210> 26
<211> 10
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 100fM的样品条形码2
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gtcaggtgaa 10
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<212> DNA
<213> 人工序列
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<223> 100fM的样品条形码3
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<212> DNA
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<220>
<223> 100fM的样品条形码4
<400> 28
cacgactcaa 10
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<211> 10
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 10fM的样品条形码1
<400> 29
agatgtagga 10
<210> 30
<211> 10
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 10fM的样品条形码2
<400> 30
gtgagattga 10
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<211> 10
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 10fM的样品条形码3
<400> 31
tatccatcca 10
<210> 32
<211> 10
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 10fM的样品条形码4
<400> 32
acgagtcgta 10
<210> 33
<211> 10
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 2.5fM的样品条形码1
<400> 33
ttccttacga 10
<210> 34
<211> 10
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 2.5fM的样品条形码2
<400> 34
agctgttaca 10
<210> 35
<211> 10
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 2.5fM的样品条形码3
<400> 35
ccaaccgtca 10
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<211> 10
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 2.5fM的样品条形码4
<400> 36
cctcaatcta 10
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<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 625aM的样品条形码1
<400> 37
cctcagatga 10
<210> 38
<211> 10
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 625aM的样品条形码2
<400> 38
ggtagctgca 10
<210> 39
<211> 10
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 625aM的样品条形码3
<400> 39
cagtcctata 10
<210> 40
<211> 10
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 625aM的样品条形码4
<400> 40
ggcgatctta 10
<210> 41
<211> 10
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 156aM的样品条形码1
<400> 41
tccgtgatag 10
<210> 42
<211> 10
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 156aM的样品条形码2
<400> 42
tagaacatgg 10
<210> 43
<211> 10
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 156aM的样品条形码3
<400> 43
tggcagatcg 10
<210> 44
<211> 10
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 156aM的样品条形码4
<400> 44
tcggctgttg 10
<210> 45
<211> 10
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 39aM的样品条形码1
<400> 45
ggcataacgg 10
<210> 46
<211> 10
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 39aM的样品条形码2
<400> 46
gttgacctgg 10
<210> 47
<211> 10
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 39aM的样品条形码3
<400> 47
gtggtcgatg 10
<210> 48
<211> 10
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 39aM的样品条形码4
<400> 48
ccatataggc 10
<210> 49
<211> 10
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 0aM的样品条形码1
<400> 49
atacatccgg 10
<210> 50
<211> 10
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 0aM的样品条形码2
<400> 50
agagttggcg 10
<210> 51
<211> 10
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 0aM的样品条形码3
<400> 51
acagaggctg 10
<210> 52
<211> 10
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 0aM的样品条形码4
<400> 52
ttagttcacc 10
<210> 53
<211> 44
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> EGFR结合剂1的寡核苷酸CP
<400> 53
aatgatacgg cgaccaccga aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaa 44
<210> 54
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> EGFR结合剂1的寡核苷酸R
<400> 54
tcgagtctta tcggtggtcg ccgtatcatt 30
<210> 55
<211> 69
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> EGFR结合剂2的寡核苷酸L
<400> 55
caagcagaag acggcatacg aacactcttt ccctacacga cgctcttccg atcttatatt 60
aatctgcac 69
<210> 56
<211> 34
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> EGFR结合剂2的寡核苷酸CP2
<400> 56
gagcgtcgtg tagggaaaga gtgttcgtat gccg 34
<210> 57
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 在EGFR检测中使用的连接子（CNT）
<400> 57
tttgactcga gtgcagaatt 20
<210> 58
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 在EGFR的qPCR检测中所使用的引物P5
<400> 58
aatgatacgg cgaccaccga 20
<210> 59
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 在EGFR的qPCR检测中所使用的引物P7
<400> 59
caagcagaag acggcatacg a 21
<210> 60
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 在EGFR的qPCR检测中所使用的引物SBS3
<400> 60
cactctttcc ctacacgacg ctctt 25

Claims (284)

1.用于检测样品中分析物的测定方法，其包括：
(1)将包含第一结合剂和第一递呈基团的第一结合部分、包含第二结合剂的第二结合部分和样品在溶液中混合，其中：
(i)所述第一和第二结合剂结合至分析物并形成免疫复合物，
(ii)通过第一递呈基团和偶联至第一固体表面的第一接受基团之间的结合，将所述免疫复合物捕获至与溶液接触的第一固体表面上，并且
(iii)所述第一结合部分还包含第一靶标标记并且所述第二结合部分还包含第二靶标标记；
(2)清洗所述第一固体表面以除去未结合的分子；
(3)基于所述第一靶标标记和所述第二靶标标记之间的邻近性，从所述免疫复合物产生报告分子；且
(4)检测所述报告分子，借此检测所述分析物。
2.根据权利要求1所述的测定方法，其中(i)所述第一靶标标记包含第一标识码(“ID”)，它是分析物特异的(“靶标ID”)；(ii)所述第二靶标标记包含第二靶标ID；或者(iii)(i)和(ii)两者。
3.根据权利要求1或2所述的测定方法，其中(i)所述报告分子包含所述第一靶标ID；(ii)所述报告分子包含所述第二靶标ID；或者(iii)(i)和(ii)两者。
4.用于检测样品中分析物的测定方法，其包括：
(1)将包含第一结合剂和第一递呈基团的第一结合部分、包含第二结合剂的第二结合部分和样品在溶液中混合，其中：
(i)所述第一和第二结合剂结合至分析物并形成免疫复合物，
(ii)通过第一递呈基团和偶联至第一固体表面的第一接受基团之间的结合，将所述免疫复合物捕获至与溶液接触的第一固体表面上，并且
(iii)所述第一结合部分还包含第一靶标标记，所述第一靶标标记包含分析物特异的(“靶标ID”)第一标识码(“ID”)，并且所述第二结合部分还包含第二靶标标记，所述第二靶标标记包含第二靶标ID；
(2)清洗所述第一固体表面以除去未结合的分子；
(3)从所述免疫复合物产生报告分子，其中所述报告分子包含(i)所述第一靶标ID、(ii)所述第二靶标ID或者(iii)所述第一和所述第二靶标ID两者；和
(4)检测所述报告分子，借此检测所述分析物。
5.根据权利要求4所述的测定方法，其中基于所述第一靶标标记和所述第二靶标标记之间的邻近性，从所述免疫复合物产生所述报告分子。
6.根据权利要求1至5中任一项所述的测定方法，其中所述报告分子是核酸报告分子。
7.根据权利要求6所述的测定方法，其中：
(i)所述报告分子中的所述第一靶标ID是所述第一结合部分中的所述第一靶标ID的互补序列；
(ii)所述报告分子中的所述第二靶标ID是所述第一结合部分中的所述第二靶标ID的互补序列；
(iii)(i)和(ii)两者。
8.根据权利要求1至7中任一项所述的测定方法，还在步骤(2)和(3)之间包括步骤(2a)：通过破坏所述第一递呈基团和所述第一接受基团之间的结合，从所述第一固体表面释放所述免疫复合物，其中步骤(2a)在步骤(3)之前、之后或同时。
9.根据权利要求8所述的测定方法，其中所述第二结合部分还包含第二递呈基团。
10.根据权利要求9所述的测定方法，其中所述方法还在步骤2(a)和步骤(3)之间包括步骤2(b)：
(2b)引入第二固体表面并通过第二递呈基团和偶联至所述第二固体表面的第二接受基团之间的结合将所述免疫复合物重新捕获至所述第二固体表面上。
11.根据权利要求10所述的测定方法，其中所述方法还在步骤2(b)和步骤(3)之间包括步骤2(c)：
(2c)清洗所述第二固体表面以除去未结合的分子。
12.根据权利要求10或11所述的测定方法，还包括步骤(2d)：通过破坏所述第二递呈基团和所述第二接受基团之间的结合从所述第二固体表面释放所述免疫复合物。
13.根据权利要求12所述的测定方法，其中步骤(2d)在步骤(3)之前、之后或同时。
14.根据权利要求2至13中任一项所述的测定方法，其中(i)所述第一靶标ID和所述第二靶标ID是相同的；或者(ii)所述第一靶标ID和所述第二靶标ID是不同的。
15.根据以上权利要求中任一项所述的测定方法，还包括步骤(2e)：将包含样品特异的ID(“样品ID”)的样品标记结合(i)至所述第一靶标标记，(ii)至所述第二靶标标记或者(iii)至所述第一靶标标记和所述第二靶标标记两者。
16.根据权利要求15所述的测定方法，其中在每个样品中所形成的报告分子包含样品ID。
17.根据以上权利要求中任一项所述的测定方法，其中所述第一递呈基团是融合至所述第一结合剂的多肽、缀合至所述第一结合剂的多核苷酸或者缀合至所述第一结合剂的化合物。
18.根据权利要求9至17中任一项所述的测定方法，其中所述第二递呈基团是融合至所述第二结合剂的多肽、缀合至所述第二结合剂的多核苷酸或者缀合至所述第二结合剂的化合物。
19.根据以上权利要求中任一项所述的测定方法，其中所述方法还包括从所述免疫复合物释放所述报告分子。
20.根据权利要求6至19中任一项所述的测定方法，其中步骤(4)还包括核酸报告分子的PCR扩增。
21.根据权利要求6至20中任一项所述的测定方法，其中所述方法还包括纯化所述核酸报告分子。
22.根据以上权利要求中任一项所述的测定方法，其中步骤(1)包括在将所述免疫复合物捕获至所述第一固体表面上之前在溶液中形成所述免疫复合物。
23.根据权利要求1至21中任一项所述的测定方法，其中步骤(1)包括在所述第一固体表面上形成所述免疫复合物之前将所述第一结合剂预捕获至所述第一固体表面上。
24.根据权利要求1至21中任一项所述的测定方法，其中在步骤(1)中，在溶液中形成所述免疫复合物并同时被捕获至所述第一固体表面上。
25.根据以上权利要求中任一项所述的测定方法，其中：
(i)所述第一结合剂直接结合至分析物并且所述第二结合剂直接结合至分析物；
(ii)所述第一结合剂直接结合至分析物并且所述第二结合剂间接结合至分析物；
(iii)所述第一结合剂间接结合至分析物并且所述第二结合剂直接结合至分析物；或者
(iv)所述第一结合剂间接结合至分析物并且所述第二结合剂间接结合至分析物。
26.根据以上权利要求中任一项所述的测定方法，其中:
(i)所述第一结合剂结合至直接结合至分析物的第一一抗或其片段；
(ii)所述第二结合剂结合至直接结合至分析物的第二一抗或其片段；或者
(iii)(i)和(ii)两者。
27.根据权利要求1至25中任一项所述的测定方法，其中：
(i)所述第一和第二结合剂结合至分析物上的非干扰表位；
(ii)所述第一和第二结合剂结合至分析物上的非重叠表位；或者
(iii)所述第一和第二结合剂结合至分析物上的不同表位。
28.根据以上权利要求中任一项所述的测定方法，还包括：
(i)步骤(2)和(3)之间的至少一个其它重新捕获循环，其包括：从捕获它的固体表面上释放所述免疫复合物，在与所述第一接受基团偶联的其它固体表面上重新捕获所述免疫复合物，并清洗所述其它固体表面以除去未结合的分子；
(ii)步骤(2c)和(2d)之间的至少一个其它重新捕获循环，其包括：从捕获它的固体表面上释放所述免疫复合物，在与所述第一或所述第二接受基团偶联的其它固体表面上重新捕获所述免疫复合物，并清洗所述其它固体表面以除去未结合的分子；或者
(iii)(i)和(ii)两者。
29.根据权利要求8至28中任一项所述的测定方法，其中任何所述释放是通过将温度升高至70℃。
30.根据以上权利要求中任一项所述的测定方法，其中(i)所述第一递呈基团通过硫酯基团、二硫键或可切割键结合所述第一接受基团；(ii)所述第二递呈基团通过硫酯基团、二硫键或可切割键结合所述第二接受基团；或者(i)和(ii)两者。
31.根据权利要求30所述的测定方法，其中(i)所述第一递呈基团通过光可切割键、化学可切割键或酶促可切割键结合所述第一接受基团；(ii)所述第二递呈基团通过光可切割键、化学可切割键或酶促可切割键结合所述第二接受基团；或者(i)和(ii)两者。
32.根据权利要求1至29中任一项所述的测定方法，其中(i)所述第一递呈基团通过蛋白-蛋白相互作用结合所述第一接受基团；(ii)所述第二递呈基团通过蛋白-蛋白相互作用结合所述第二接受基团；或者(i)和(ii)两者。
33.根据权利要求1至29中任一项所述的测定方法，其中(i)所述第一递呈基团通过生物素与链霉亲和素或抗生物素蛋白结合所述第一接受基团；(ii)所述第二递呈基团通过生物素与链霉亲和素或抗生物素蛋白结合所述第二接受基团；或者(i)和(ii)两者。
34.根据权利要求1至29中任一项所述的测定方法，其中
(i)所述第一递呈基团是第一核酸标签(“第一标签”)并且所述第一接受基团是第一核酸捕获探针(“第一探针”)；或者
(ii)所述第二递呈基团是第二核酸标签(“第二标签”)并且所述第二接受基团是第二核酸捕获探针(“第二探针”)。
35.根据权利要求9至29中任一项所述的测定方法，其中(i)所述第一递呈基团是第一核酸标签(“第一标签”)并且所述第一接受基团是第一核酸捕获探针(“第一探针”)；和(ii)所述第二递呈基团是第二核酸标签(“第二标签”)并且所述第二接受基团是第二核酸捕获探针(“第二探针”)。
36.根据权利要求34或35所述的测定方法，其中：
(i)所述第一探针是特异性结合至所述第一标签的蛋白；
(ii)所述第一探针是特异性结合至所述第一标签的蛋白和核酸复合物；
(iii)所述第一探针是核酸分子，其中所述第一探针或其片段与所述第一标签或其片段互补；或者
(iv)所述第一探针是核酸分子，其中所述第一探针或其片段与所述第一标签或其片段杂交。
37.根据权利要求34至36中任一项所述的测定方法，其中
(i)所述第二探针是特异性结合至所述第二标签的蛋白；
(ii)所述第二探针是特异性结合至所述第二标签的蛋白和核酸复合物；
(iii)所述第二探针是核酸分子，其中所述第二探针或其片段与所述第二标签或其片段互补；或者
(iv)所述第二探针是核酸分子，其中所述第二探针或其片段与所述第二标签或其片段杂交。
38.根据权利要求36或37所述的测定方法，其中所述互补性为至少80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％互补。
39.根据权利要求34至38中任一项所述的测定方法，其中(i)所述第一探针直接偶联至所述第一固体表面；或者(ii)所述第二探针直接偶联至所述第二固体表面。
40.根据权利要求34至38中任一项所述的测定方法，其中(i)所述第一探针直接偶联至所述第一固体表面；并且(ii)所述第二探针直接偶联至所述第二固体表面。
41.根据权利要求34至38中任一项所述的测定方法，其中(i)所述第一探针与直接偶联至所述第一固体表面的通用探针杂交；或者(ii)所述第二探针与直接偶联至所述第二固体表面的通用探针杂交。
42.根据权利要求34至38中任一项所述的测定方法，其中(i)所述第一探针与直接偶联至所述第一固体表面的通用探针杂交；且(ii)所述第二探针与直接偶联至所述第二固体表面的通用探针杂交。
43.根据权利要求34至38中任一项所述的测定方法，其中(i)所述第一探针与生物素缀合，生物素结合直接偶联至所述第一固体表面的链霉亲和素或抗生物素蛋白；或者(ii)所述第二探针与生物素缀合，生物素结合直接偶联至所述第二固体表面的链霉亲和素或抗生物素蛋白。
44.根据权利要求34至38中任一项所述的测定方法，其中(i)所述第一探针与生物素缀合，生物素结合直接偶联至所述第一固体表面的链霉亲和素或抗生物素蛋白；且(ii)所述第二探针与生物素缀合，生物素结合直接偶联至所述第二固体表面的链霉亲和素或抗生物素蛋白。
45.根据权利要求34至44中任一项所述的测定方法，其中在步骤(1)中，所述第一标签和第二标签被协同捕获在所述第一固体表面上。
46.根据权利要求45所述的测定方法，其中所述第一探针的第一片段与所述第一标签或其片段互补，并且所述第一探针的第二片段与所述第二标签或其片段互补，其中所述互补区包括所述第一和所述第二标签的非缀合末端。
47.根据权利要求45所述的测定方法，其中所述第一探针的连续片段由第一片段和紧邻的第二片段组成，其中所述第一片段与所述第一标签或其片段互补，并且所述第二片段与所述第二标签或其片段互补，从而当所述第一和第二标签连接以形成连接的核酸时，所述连接的核酸的连接区与所述第一探针的连续片段互补。
48.根据权利要求45所述的测定方法，其中所述第一探针的第一片段与所述第一标签或其片段互补，并且其中所述第一探针的单独的第二片段与所述第二标签或其片段互补；并且其中所述互补区不包括所述第一和所述第二标签的非缀合末端。
49.根据权利要求45所述的测定方法，其中所述第一固体表面与所述第一探针和其它核酸探针两者偶联，并且其中所述其它探针或其片段与所述第一标签或其片段互补。
50.根据权利要求35至49中任一项所述的测定方法，其中在步骤(2b)中，所述第一标签和第二标签被协同捕获在所述第二固体表面上。
51.根据权利要求50所述的测定方法，其中所述第二探针的第一片段与所述第一标签或其片段互补，并且所述第二探针的第二片段与所述第二标签或其片段互补，其中所述互补区包括所述第一和所述第二标签的非缀合末端。
52.根据权利要求50所述的测定方法，其中所述第二探针的连续片段由第一片段和紧邻的第二片段组成，其中所述第一片段与所述第一标签或其片段互补，并且所述第二片段与所述第二标签或其片段互补，从而当所述第一和第二标签连接以形成连接的核酸时，所述连接的核酸的连接区与所述第二探针的连续片段互补。
53.根据权利要求50所述的测定方法，其中所述第二探针的第一片段与所述第一标签或其片段互补，并且其中所述第二探针的单独的第二片段与所述第二标签或其片段互补；并且其中所述互补区不包括所述第一和所述第二标签的非缀合末端。
54.根据权利要求50所述的测定方法，其中所述第二固体表面与所述第二探针和其它核酸探针两者偶联，并且其中所述其它探针或其片段与所述第二标签或其片段互补。
55.根据权利要求34至54中任一项所述的测定方法，其中(i)所述第一标签和所述第一探针的互补片段由10至30个碱基对组成；(ii)所述第二标签和所述第二探针的互补片段由10至30个碱基对组成；或者(i)和(ii)两者。
56.根据权利要求34至55中任一项所述的测定方法，其中(i)所述第一标签和所述第一探针的互补片段由20至30个碱基对组成；(ii)所述第二标签和所述第二探针的互补片段由20至30个碱基对组成；或者(i)和(ii)两者。
57.根据权利要求34至56中任一项所述的测定方法，其中(i)所述第一标签包含A和/或T富集序列并且所述第一探针包含互补的A和/或T富集序列；(ii)所述第二标签包含A和/或T富集序列并且所述第二探针包含互补的A和/或T富集序列；或者(i)和(ii)两者。
58.根据权利要求57所述的测定方法，其中所述A和/或T富集序列具有短的长度，从而来自互补的A和/或T富集序列的结合弱于所述第一结合剂与所述分析物之间的结合以及所述第二结合剂和所述分析物之间的结合，借此在释放步骤(2a)和/或(2d)中保持免疫复合物稳定。
59.根据以上权利要求中任一项所述的测定方法，其中所述分析物是两个分子的结合对；其中所述第一结合剂结合所述结合对的一个分子，并且所述第二结合剂结合所述结合对的另一个分子。
60.根据以上权利要求中任一项所述的测定方法，其中所述分析物为核酸，并且用于核酸分析物的第一和第二结合剂包含与所述核酸分析物的不同片段互补的核酸。
61.根据权利要求1或59中任一项所述的测定方法，其中所述分析物是肽或蛋白，且(i)所述第一结合剂是特异性结合所述分析物的抗体或抗体片段；(ii)所述第二结合剂是特异性结合所述分析物的抗体或抗体片段；或者(i)和(ii)两者。
62.根据以上权利要求中任一项所述的测定方法，其中所述样品是血清样品或血浆样品。
63.根据权利要求6至62中任一项所述的测定方法，其中
(i)在步骤(3)中，当所述免疫复合物被捕获至所述第一固体表面上时产生所述核酸报告分子；或者
(ii)在步骤(3)中，在所述免疫复合物从所述第一固体表面被释放之后产生所述核酸报告分子。
64.根据权利要求10至62中任一项所述的测定方法，其中
(i)在步骤(3)中，当所述免疫复合物被捕获至所述第二固体表面上时产生所述核酸报告分子；或者
(ii)在步骤(3)中，在所述免疫复合物从所述第二固体表面被释放之后产生所述核酸报告分子。
65.根据权利要求1至64中任一项所述的测定方法，其中(i)所述第一靶标标记直接结合至所述第一结合剂；或者(ii)所述第一靶标标记间接结合至所述第一结合剂。
66.根据权利要求1至65中任一项所述的测定方法，其中(i)所述第二靶标标记直接结合至所述第二结合剂；或者(ii)所述第二靶标标记间接结合至所述第二结合剂。
67.根据权利要求1至66中任一项所述的测定方法，其中
(i)将所述第一靶标标记缀合至所述第一结合剂；
(ii)所述第一靶标标记非共价结合至所述第一结合剂；
(iii)将所述第一靶标标记缀合至所述第一递呈基团；
(iv)所述第一靶标标记非共价结合至所述第一递呈基团；或者
(v)所述第一靶标标记是所述第一递呈基团的一部分。
68.根据权利要求1至67中任一项所述的测定方法，其中
(i)将所述第二靶标标记缀合至所述第二结合剂；
(ii)所述第二靶标标记非共价结合至所述第二结合剂；
(iii)将所述第二靶标标记缀合至所述第二递呈基团；
(iv)所述第二靶标标记非共价结合至所述第二递呈基团；或者
(v)所述第二靶标标记是所述第二递呈基团的一部分。
69.根据权利要求1至68中任一项所述的测定方法，其中(i)所述第一递呈基团直接结合至所述第一结合剂；或者(ii)所述第一递呈基团间接结合至所述第一结合剂。
70.根据权利要求9至69中任一项所述的测定方法，其中(i)所述第二递呈基团直接结合至所述第二结合剂；或者(ii)所述第二递呈基团间接结合至所述第二结合剂。
71.根据权利要求1至70中任一项所述的测定方法，其中
(i)将所述第一递呈基团缀合至所述第一结合剂；
(ii)所述第一递呈基团非共价结合至所述第一结合剂；
(iii)将所述第一递呈基团缀合至所述第一靶标标记；
(iv)所述第一递呈基团非共价结合至所述第一靶标标记；或者
(v)所述第一递呈基团是所述第一靶标标记的一部分。
72.根据权利要求9至71中任一项所述的测定方法，其中
(i)将所述第二递呈基团缀合至所述第二结合剂；
(ii)所述第二递呈基团非共价结合至所述第二结合剂；
(iii)将所述第二递呈基团缀合至所述第二靶标标记；
(iv)所述第二递呈基团非共价结合至所述第二靶标标记；或者
(v)所述第二递呈基团是所述第二靶标标记的一部分。
73.根据权利要求1至72中任一项所述的测定方法，其中
(i)所述第一靶标标记是核酸分子；
(ii)所述第二靶标标记是核酸分子；或者
(iii)(i)和(ii)两者。
74.根据权利要求34至73中任一项所述的测定方法，其中
(i)所述第一靶标标记与所述第一标签杂交；
(ii)所述第二靶标标记与所述第二标签杂交；或者
(iii)(i)和(ii)两者。
75.根据权利要求15至74中任一项所述的测定方法，其中所述样品标记是单链核酸分子(“单链样品标记”)。
76.根据权利要求15至74中任一项所述的测定方法，其中所述样品标记是双链核酸分子(“双链样品标记”)。
77.根据权利要求76所述的测定方法，其中所述样品标记是：
(i)包含两个5'悬突的双链核酸分子；
(ii)包含两个3'悬突的双链核酸分子；
(iii)包含5'悬突和3'悬突的双链核酸分子；
(iv)包含5'悬突和平末端的双链核酸分子；或者
(v)包含3'悬突和平末端的双链核酸分子。
78.根据权利要求77所述的测定方法，其中所述样品标记：
(i)通过所述样品标记的悬突与所述第一靶标标记杂交；
(ii)通过所述样品标记的悬突与所述第二靶标标记杂交；或者
(iii)(i)和(ii)两者。
79.根据权利要求34至78中任一项所述的测定方法，其中步骤(3)包括通过连接以下部分产生所述核酸报告分子：
(a)所述部分为所述第一标签和所述第二标签，并且检测由所述第一标签的片段和所述第二标签的片段所组成的所述核酸报告分子；
(b)所述部分为所述第一标签和所述第二标签的替代核酸(“第二替代物”)，并且检测由所述第一标签的片段和所述第二替代物的片段所组成的所述核酸报告分子；
(c)所述部分为第一标签的替代核酸(“第一替代物”)和所述第二标签，并且检测由所述第一替代物的片段和所述第二标签的片段所组成的所述核酸报告分子；或者
(d)所述部分为所述第一替代物和所述第二替代物，并且检测由所述第一替代物的片段和所述第二替代物的片段所组成的所述核酸报告分子；
其中所述第一标签或其片段与所述第一替代物或其片段互补，并且所述第二标签或其片段与所述第二替代物或其片段互补。
80.根据权利要求34至78中任一项所述的测定方法，其中步骤(3)包括通过连接以下部分产生所述核酸报告分子：
(a)所述部分为所述第一标签和所述第二靶标标记，并且检测由所述第一标签的片段和所述第二靶标标记的片段所组成的所述核酸报告分子；
(b)所述部分为所述第一标签和所述第二靶标标记的替代核酸(“第二替代物”)，并且检测由所述第一标签的片段和所述第二替代物的片段所组成的所述核酸报告分子；
(c)所述部分为第一标签的替代核酸(“第一替代物”)和所述第二靶标标记，并且检测由所述第一替代物的片段和所述第二靶标标记的片段所组成的所述核酸报告分子；或者
(d)所述部分为所述第一替代物和所述第二替代物，并且检测由所述第一替代物的片段和所述第二替代物的片段所组成的所述核酸报告分子；
其中所述第一标签或其片段与所述第一替代物或其片段互补，并且所述第二靶标标记或其片段与所述第二替代物或其片段互补。
81.根据权利要求34至78中任一项所述的测定方法，其中步骤(3)包括通过连接以下部分产生所述核酸报告分子：
(a)所述部分为所述第一靶标标记和所述第二标签，并且检测由所述第一靶标标记的片段和所述第二标签的片段所组成的所述核酸报告分子；
(b)所述部分为所述第一靶标标记和所述第二标签的替代核酸(“第二替代物”)，并且检测由所述第一靶标标记的片段和所述第二替代物的片段所组成的所述核酸报告分子；
(c)所述部分为第一靶标标记的替代核酸(“第一替代物”)和所述第二标签，并且检测由所述第一替代物的片段和所述第二标签的片段所组成的所述核酸报告分子；或者
(d)所述部分为所述第一替代物和所述第二替代物，并且检测由所述第一替代物的片段和所述第二替代物的片段所组成的所述核酸报告分子；
其中所述第一靶标标记或其片段与所述第一替代物或其片段互补，并且所述第二标签或其片段与所述第二替代物或其片段互补。
82.根据权利要求34至78中任一项所述的测定方法，其中步骤(3)包括通过连接以下部分产生所述核酸报告分子：
(a)所述部分为所述第一靶标标记和所述第二靶标标记，并且检测由所述第一靶标标记的片段和所述第二靶标标记的片段所组成的所述核酸报告分子；
(b)所述部分为所述第一靶标标记和所述第二靶标标记的替代核酸(“第二替代物”)，并且检测由所述第一靶标标记的片段和所述第二替代物的片段所组成的所述核酸报告分子；
(c)所述部分为第一靶标标记的替代核酸(“第一替代物”)和所述第二靶标标记，并且检测由所述第一替代物的片段和所述第二靶标标记的片段所组成的所述核酸报告分子；或者
(d)所述部分为所述第一替代物和所述第二替代物，并且检测由所述第一替代物的片段和所述第二替代物的片段所组成的所述核酸报告分子；
其中所述第一靶标标记或其片段与所述第一替代物或其片段互补，并且所述第二靶标标记或其片段与所述第二替代物或其片段互补。
83.根据权利要求79至82中任一项所述的测定方法，其中所述连接包括连接：
(i)(a)所述第一标签或其第一替代物，(b)所述第二标签或其第二替代物，和(c)单链样品标记的替代核酸(“样品替代物”)或双链样品标记的一条链；
(ii)(a)所述第一标签或其第一替代物，(b)所述第二靶标标记或其第二替代物，和(c)单链样品标记的替代核酸(“样品替代物”)或双链样品标记的一条链；
(iii)(a)所述第一靶标标记或其第一替代物，(b)所述第二标签或其第二替代物，和(c)单链样品标记的替代核酸(“样品替代物”)或双链样品标记的一条链；或者
(iv)(a)所述第一靶标标记或其第一替代物，(b)所述第二靶标标记或其第二替代物，和(c)单链样品标记的替代核酸(“样品替代物”)或双链样品标记的一条链；
其中所述样品标记或其片段与所述样品替代物或其片段互补。
84.根据权利要求83所述的测定方法，其中(i)至(iv)中每一个中的连接包括(a)和(b)之间的连接(c)。
85.根据权利要求79至84中任一项所述的测定方法，其中通过邻位连接形成所述核酸报告分子。
86.根据权利要求79至84中任一项所述的测定方法，其中通过邻位延伸形成所述核酸报告分子。
87.根据权利要求79至86中任一项所述的测定方法，其中所述核酸报告分子包括(a)所述第一靶标ID或所述第一靶标ID的替代核酸(“第一靶标ID替代物”)、(b)所述第二靶标ID或所述第二靶标ID的替代核酸(“第二靶标ID替代物”)和(c)样品ID。
88.根据权利要求2至87中任一项所述的测定方法，其包括通过同时检测与每种分析物有关的独特靶标ID，同时检测样品中至少两个分析物。
89.根据权利要求88所述的测定方法，其包括通过在步骤(1)中将无功能结合剂添加至所述溶液，从所述分析物中的至少一种按比例降低信号，其中所述无功能结合剂与所述第一结合剂竞争与所述分析物的结合，但是所述无功能结合剂未缀合或缀合至不结合所述第一接受基团的递呈基团。
90.根据权利要求2至89中任一项所述的测定方法，其中在步骤(4)中，检测所述分析物包括所述第一和所述第二靶标ID的共检测。
91.根据以上权利要求中任一项所述的测定方法，其中在步骤(1)中还包括混合参比分析物。
92.根据权利要求91所述的测定方法，其中所述参比分析物是在所述样品中不存在的分析物。
93.根据权利要求91或92所述的测定方法，其中所述参比分析物是所述样品中不存在的蛋白、核酸或化合物。
94.根据权利要求93所述的测定方法，其中所述参比分析物是病毒蛋白、细菌蛋白或昆虫蛋白。
95.根据权利要求15至94中任一项所述的测定方法，其包括通过同时检测与每种样品有关的所述核酸报告分子中的独特样品ID，同时检测至少两个样品中的所述分析物。
96.根据权利要求95所述的测定方法还包括在步骤(4)中的检测之前或同时混合来自所述至少两个样品的所述核酸报告分子。
97.根据权利要求15至95中任一项所述的测定方法，其包括通过同时检测与每种样品中的每种分析物有关的所述核酸报告分子中的独特样品ID和独特靶标ID，同时检测至少两个样品中的至少两个分析物。
98.根据权利要求97所述的测定方法还包括在步骤(4)中的检测之前或同时混合来自所述至少两个样品的用于所述至少两个分析物的所述核酸报告分子。
99.根据以上权利要求中任一项所述的测定方法，其中通过多重qPCR、多重数字PCR或NGS检测所述核酸报告分子。
100.根据以上权利要求中任一项所述的测定方法，其中通过NGS检测所述核酸报告分子。
101.根据权利要求91至100中任一项所述的测定方法，其中检测还包括将从所述样品的分析物所产生的报告分子对从所述参比分析物所产生的报告分子进行归一化。
102.根据以上权利要求中任一项所述的测定方法，其中(i)所述第一固体表面选自磁性颗粒表面和微量滴定板的孔；(ii)所述第二固体表面选自磁性颗粒表面和微量滴定板的孔；或者(i)和(ii)两者。
103.用于检测样品中分析物的测定方法，其包括：
(1)将包含第一结合剂和第一递呈基团的第一结合部分、包含第二结合剂和第二递呈基团的第二结合部分和样品在溶液中混合，其中：
(i)所述第一和第二结合剂结合至分析物并形成免疫复合物，
(ii)通过第一递呈基团和偶联至第一固体表面的第一接受基团之间的结合，将所述免疫复合物捕获至与溶液接触的第一固体表面上，并且
(iii)所述第一结合部分还包含第一靶标标记，所述第一靶标标记包含分析物特异的(“靶标ID”)第一标识码(“ID”)，并且所述第二结合部分还包含第二靶标标记，所述第二靶标标记包含第二靶标ID；
(2)清洗所述第一固体表面以除去未结合的分子；
(3)通过破坏所述第一递呈基团和所述第一接受基团之间的结合从所述第一固体表面释放所述免疫复合物；
(4)引入第二固体表面并通过所述第二递呈基团和偶联至所述第二固体表面的所述第二接受基团之间的结合将所述免疫复合物重新捕获至所述第二固体表面上；
(5)清洗所述第二固体表面以除去未结合的分子；
(6)将包含样品特异的ID(“样品ID”)的样品标记结合(i)至所述第一靶标标记，(ii)至所述第二靶标标记或者(iii)至所述第一靶标标记和所述第二靶标标记两者；
(7)基于所述第一靶标标记和所述第二靶标标记之间的邻近性从所述免疫复合物产生核酸报告分子，其中所述核酸报告分子包含所述第一靶标ID、所述第二靶标ID和所述样品ID；
(8)通过破坏所述第二递呈基团和所述第二接受基团之间的结合从所述第二固体表面释放所述免疫复合物；和
(9)通过qPCR检测所述核酸报告分子，借此检测所述分析物。
104.用于检测至少两个样品中的分析物的测定方法，其包括：
(1)将包含第一结合剂和第一递呈基团的第一结合部分、包含第二结合剂和第二递呈基团的第二结合部分和样品在溶液中混合，其中：
(i)所述第一和第二结合剂结合至分析物并形成免疫复合物，
(ii)通过第一递呈基团和偶联至第一固体表面的第一接受基团之间的结合，将所述免疫复合物捕获至与溶液接触的第一固体表面上，并且
(iii)所述第一结合部分还包含第一靶标标记，所述第一靶标标记包含分析物特异的(“靶标ID”)第一标识码(“ID”)，并且所述第二结合部分还包含第二靶标标记，所述第二靶标标记包含第二靶标ID；
(2)清洗所述第一固体表面以除去未结合的分子；
(3)通过破坏所述第一递呈基团和所述第一接受基团之间的结合从所述第一固体表面释放所述免疫复合物；
(4)引入第二固体表面并通过所述第二递呈基团和偶联至所述第二固体表面的所述第二接受基团之间的结合将所述免疫复合物重新捕获至所述第二固体表面上；
(5)清洗所述第二固体表面以除去未结合的分子；
(6)将包含样品特异的ID(“样品ID”)的样品标记结合(i)至所述第一靶标标记，(ii)至所述第二靶标标记或者(iii)至所述第一靶标标记和所述第二靶标标记两者；
(7)基于所述第一靶标标记和所述第二靶标标记之间的邻近性从所述免疫复合物产生核酸报告分子，其中所述核酸报告分子包含所述第一靶标ID、所述第二靶标ID和所述样品ID；
(8)混合来自所述至少两个样品的所述核酸报告分子；
(9)通过破坏所述第二递呈基团和所述第二接受基团之间的结合从所述第二固体表面释放所述免疫复合物；
(9)扩增所述核酸报告分子；
(10)纯化所述核酸报告分子；和
(11)通过下一代测序(NGS)检测所述核酸报告分子，借此检测所述分析物。
105.用于检测样品中分析物的系统，其包括：
(i)第一结合部分，其包含第一结合剂、第一递呈基团和第一靶标标记；
(ii)第二结合部分，其包含第二结合剂和第二靶标标记；和
(iii)第一接受基团；
并且其中
(i)所述第一和第二结合剂结合所述分析物上的表位；和
(ii)所述第一递呈基团结合所述第一接受基团。
106.根据权利要求105所述的系统，其中(i)所述第一靶标标记包含第一标识码(“ID”)，它是分析物特异的(“靶标ID”)；(ii)所述第二靶标标记包含第二靶标ID；或者(iii)(i)和(ii)两者。
107.用于检测样品中分析物的系统，其包括：
(i)第一结合部分，其包含第一结合剂、第一递呈基团和第一靶标标记，所述第一靶标标记包含第一标识码(“ID”)，它是分析物特异的(“靶标ID”)；
(ii)第二结合部分，其包含第二结合剂和第二靶标标记，所述第二靶标标记包含第二靶标ID；和
(iii)第一接受基团；
并且其中
(i)所述第一和第二结合剂结合所述分析物上的表位；和
(ii)所述第一递呈基团结合所述第一接受基团。
108.根据权利要求105至[00110]中任一项所述的系统，其中所述第二结合部分还包含第二递呈基团，其中所述系统还包含第二接受基团，并且其中所述第二递呈基团结合所述第二接受基团。
109.根据权利要求106至108中任一项所述的系统，其中(i)所述第一靶标ID和所述第二靶标ID是相同的；或者(ii)所述第一靶标ID和所述第二靶标ID是不同的。
110.根据权利要求105至109中任一项所述的系统，还包括包含样品特异的ID(“样品ID”)的样品标记，其中所述样品标记结合(i)至所述第一靶标标记，(ii)至所述第二靶标标记或者(iii)至所述第一靶标标记和所述第二靶标标记两者。
111.根据权利要求106至110中任一项所述的系统，还包括用于邻位连接或邻位延伸以产生核酸报告分子的试剂包含(i)所述第一靶标ID和所述第二靶标ID，或者(ii)所述第一靶标ID、所述第二靶标ID和所述样品ID。
112.根据权利要求105至111中任一项所述的系统，还包括第一固体表面。
113.根据权利要求108至112中任一项所述的系统，还包括第二固体表面。
114.根据权利要求112或113所述的系统，其中(i)所述第一固体表面是磁性颗粒表面和微量滴定板的孔；(ii)所述第二固体表面是磁性颗粒表面和微量滴定板的孔；或(i)和(ii)两者。
115.根据权利要求113或114所述的系统，其中所述第一固体表面与所述第一接受基团偶联，并且所述第二固体表面与所述第二接受基团偶联。
116.根据权利要求105至115中任一项所述的系统，其中所述第一递呈基团是融合至所述第一结合剂的多肽、缀合至所述第一结合剂的多核苷酸或者缀合至所述第一结合剂的化合物。
117.根据权利要求108至116中任一项所述的系统，其中所述第二递呈基团是融合至所述第二结合剂的多肽、缀合至所述第二结合剂的多核苷酸或者缀合至所述第二结合剂的化合物。
118.根据权利要求[00110]至117中任一项所述的系统，还包括用于所述核酸报告分子的PCR扩增的试剂。
119.根据权利要求[00110]至118中任一项所述的系统，还包括用于纯化所述核酸报告分子的试剂。
120.根据权利要求105至119中任一项所述的系统，其中
(i)所述第一结合剂直接结合至分析物并且所述第二结合剂直接结合至分析物；
(ii)所述第一结合剂直接结合至分析物并且所述第二结合剂间接结合至分析物；
(iii)所述第一结合剂间接结合至分析物并且所述第二结合剂直接结合至分析物；或者
(iv)所述第一结合剂间接结合至分析物并且所述第二结合剂间接结合至分析物。
121.根据权利要求105至120中任一项所述的系统，其中
(i)所述第一结合剂结合至直接结合至分析物的第一一抗或其片段；
(ii)所述第二结合剂结合至直接结合至分析物的第二一抗或其片段；或者
(iii)(i)和(ii)两者。
122.根据权利要求105至121中任一项所述的系统，其中
(i)所述第一和第二结合剂结合至分析物上的非干扰表位；
(ii)所述第一和第二结合剂结合至分析物上的非重叠表位；或者
(iii)所述第一和第二结合剂结合至分析物上的不同表位。
123.根据权利要求105至122中任一项所述的系统，其中(i)所述第一递呈基团通过硫酯基团、二硫键或可切割键结合所述第一接受基团；(ii)所述第二递呈基团通过硫酯基团、二硫键或可切割键结合所述第二接受基团；或者(i)和(ii)两者。
124.根据权利要求123所述的系统，其中(i)所述第一递呈基团通过光可切割键、化学可切割键或酶促可切割键结合所述第一接受基团；(ii)所述第二递呈基团通过光可切割键、化学可切割键或酶促可切割键结合所述第二接受基团；或者(i)和(ii)两者。
125.根据权利要求105至122中任一项所述的系统，其中(i)所述第一递呈基团通过蛋白-蛋白相互作用结合所述第一接受基团；(ii)所述第二递呈基团通过蛋白-蛋白相互作用结合所述第二接受基团；或者(i)和(ii)两者。
126.根据权利要求105至122中任一项所述的系统，其中(i)所述第一递呈基团通过生物素与链霉亲和素或抗生物素蛋白结合所述第一接受基团；(ii)所述第二递呈基团通过生物素与链霉亲和素或抗生物素蛋白结合所述第二接受基团；或者(i)和(ii)两者。
127.根据权利要求105至122中任一项所述的系统，其中
(i)所述第一递呈基团是第一核酸标签(“第一标签”)并且所述第一接受基团是第一核酸捕获探针(“第一探针”)；或者
(ii)所述第二递呈基团是第二核酸标签(“第二标签”)并且所述第二接受基团是第二核酸捕获探针(“第二探针”)。
128.根据权利要求108至122中任一项所述的系统，其中(i)所述第一递呈基团是第一核酸标签(“第一标签”)并且所述第一接受基团是第一核酸捕获探针(“第一探针”)；和(ii)所述第二递呈基团是第二核酸标签(“第二标签”)并且所述第二接受基团是第二核酸捕获探针(“第二探针”)。
129.根据权利要求127或128所述的系统，其中：
(i)所述第一探针是特异性结合至所述第一标签的蛋白；
(ii)所述第一探针是特异性结合至所述第一标签的蛋白和核酸复合物；
(iii)所述第一探针是核酸分子，其中所述第一探针或其片段与所述第一标签或其片段互补；或者
(iv)所述第一探针是核酸分子，其中所述第一探针或其片段与所述第一标签或其片段杂交。
130.根据权利要求127或129所述的系统，其中：
(i)所述第二探针是特异性结合至所述第二标签的蛋白；
(ii)所述第二探针是特异性结合至所述第二标签的蛋白和核酸复合物；
(iii)所述第二探针是核酸分子，其中所述第二探针或其片段与所述第二标签或其片段互补；或者
(iv)所述第二探针是核酸分子，其中所述第二探针或其片段与所述第二标签或其片段杂交。
131.根据权利要求129或130所述的系统，其中所述互补性为至少80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％互补。
132.根据权利要求127至131中任一项所述的系统，其中(i)所述第一探针直接偶联至所述第一固体表面；或者(ii)所述第二探针直接偶联至所述第二固体表面。
133.根据权利要求127至131中任一项所述的系统，其中(i)所述第一探针直接偶联至所述第一固体表面；并且(ii)所述第二探针直接偶联至所述第二固体表面。
134.根据权利要求127至131中任一项所述的系统，其中(i)所述第一探针与直接偶联至所述第一固体表面的通用探针杂交；或者(ii)所述第二探针与直接偶联至所述第二固体表面的通用探针杂交。
135.根据权利要求127至131中任一项所述的系统，其中(i)所述第一探针与直接偶联至所述第一固体表面的通用探针杂交；且(ii)所述第二探针与直接偶联至所述第二固体表面的通用探针杂交。
136.根据权利要求127至131中任一项所述的系统，其中(i)所述第一探针与生物素缀合，生物素结合直接偶联至所述第一固体表面的链霉亲和素或抗生物素蛋白；或者(ii)所述第二探针与生物素缀合，生物素结合直接偶联至所述第二固体表面的链霉亲和素或抗生物素蛋白。
137.根据权利要求127至131中任一项所述的系统，其中(i)所述第一探针与生物素缀合，生物素结合直接偶联至所述第一固体表面的链霉亲和素或抗生物素蛋白；且(ii)所述第二探针与生物素缀合，生物素结合直接偶联至所述第二固体表面的链霉亲和素或抗生物素蛋白。
138.根据权利要求127至137中任一项所述的系统，其中所述第一标签和第二标签被协同捕获在所述第一固体表面上。
139.根据权利要求138所述的系统，其中所述第一探针的第一片段与所述第一标签或其片段互补，并且所述第一探针的第二片段与所述第二标签或其片段互补，其中所述互补区包括所述第一和所述第二标签的非缀合末端。
140.根据权利要求138所述的系统，其中所述第一探针的连续片段由第一片段和紧邻的第二片段组成，其中所述第一片段与所述第一标签或其片段互补，并且所述第二片段与所述第二标签或其片段互补，从而当所述第一和第二标签连接以形成连接的核酸时，所述连接的核酸的连接区与所述第一探针的连续片段互补。
141.根据权利要求138所述的系统，其中所述第一探针的第一片段与所述第一标签或其片段互补，并且其中所述第一探针的单独的第二片段与所述第二标签或其片段互补；并且其中所述互补区不包括所述第一和所述第二标签的非缀合末端。
142.根据权利要求138所述的系统，其中所述第一固体表面与所述第一探针和其它核酸探针两者偶联，并且其中所述其它探针或其片段与所述第一标签或其片段互补。
143.根据权利要求127至142中任一项所述的系统，其中所述第一标签和第二标签被协同捕获在所述第二固体表面上。
144.根据权利要求143所述的系统，其中所述第二探针的第一片段与所述第一标签或其片段互补，并且所述第二探针的第二片段与所述第二标签或其片段互补，其中所述互补区包括所述第一和所述第二标签的非缀合末端。
145.根据权利要求143所述的系统，其中所述第二探针的连续片段由第一片段和紧邻的第二片段组成，其中所述第一片段与所述第一标签或其片段互补，并且所述第二片段与所述第二标签或其片段互补，从而当所述第一和第二标签连接以形成连接的核酸时，所述连接的核酸的连接区与所述第二探针的连续片段互补。
146.根据权利要求143所述的系统，其中所述第二探针的第一片段与所述第一标签或其片段互补，并且其中所述第二探针的单独的第二片段与所述第二标签或其片段互补；并且其中所述互补区不包括所述第一和所述第二标签的非缀合末端。
147.根据权利要求143所述的系统，其中所述第二固体表面与所述第二探针和其它核酸探针两者偶联，并且其中所述其它探针或其片段与所述第二标签或其片段互补。
148.根据权利要求127至147中任一项所述的系统，其中(i)所述第一标签和所述第一探针的互补片段由10至30个碱基对组成；(ii)所述第二标签和所述第二探针的互补片段由10至30个碱基对组成；或者(i)和(ii)两者。
149.根据权利要求127至148中任一项所述的系统，其中(i)所述第一标签和所述第一探针的互补片段由20至30个碱基对组成；(ii)所述第二标签和所述第二探针的互补片段由20至30个碱基对组成；或者(i)和(ii)两者。
150.根据权利要求127至149中任一项所述的系统，其中(i)所述第一标签包含A和/或T富集序列并且所述第一探针包含互补的A和/或T富集序列；(ii)所述第二标签包含A和/或T富集序列并且所述第二探针包含互补的A和/或T富集序列；或者(i)和(ii)两者。
151.根据权利要求150所述的系统，其中所述A和/或T富集序列具有短的长度，从而来自互补的A和/或T富集序列的结合弱于所述第一结合剂与所述分析物之间的结合以及所述第二结合剂和所述分析物之间的结合两者。
152.根据权利要求105至151中任一项所述的系统，其中所述分析物是两个分子的结合对；其中所述第一结合剂结合所述结合对的一个分子，并且所述第二结合剂结合所述结合对的另一个分子。
153.根据权利要求105至152中任一项所述的系统，其中所述分析物为核酸，并且用于核酸分析物的第一和第二结合剂包含与所述核酸分析物的不同片段互补的核酸。
154.根据权利要求105至152中任一项所述的系统，其中所述分析物是肽或蛋白，且(i)所述第一结合剂是特异性结合所述分析物的抗体或抗体片段；(ii)所述第二结合剂是特异性结合所述分析物的抗体或抗体片段；或者(i)和(ii)两者。
155.根据权利要求105至154中任一项所述的系统，其中所述样品是血清样品或血浆样品。
156.根据权利要求105至155中任一项所述的系统，(i)所述第一靶标标记直接结合至所述第一结合剂；或者(ii)所述第一靶标标记间接结合至所述第一结合剂。
157.根据权利要求105至156中任一项所述的系统，其中(i)所述第二靶标标记直接结合至所述第二结合剂；或者(ii)所述第二靶标标记间接结合至所述第二结合剂。
158.根据权利要求105至157中任一项所述的系统，其中
(i)将所述第一靶标标记缀合至所述第一结合剂；
(ii)所述第一靶标标记非共价结合至所述第一结合剂；
(iii)将所述第一靶标标记缀合至所述第一递呈基团；
(iv)所述第一靶标标记非共价结合至所述第一递呈基团；或者
(v)所述第一靶标标记是所述第一递呈基团的一部分。
159.根据权利要求105至158中任一项所述的系统，其中
(i)将所述第二靶标标记缀合至所述第二结合剂；
(ii)所述第二靶标标记非共价结合至所述第二结合剂；
(iii)将所述第二靶标标记缀合至所述第二递呈基团；
(iv)所述第二靶标标记非共价结合至所述第二递呈基团；或者
(v)所述第二靶标标记是所述第二递呈基团的一部分。
160.根据权利要求105至159中任一项所述的系统，其中(i)所述第一递呈基团直接结合至所述第一结合剂；或者(ii)所述第一递呈基团间接结合至所述第一结合剂。
161.根据权利要求108至160中任一项所述的系统，其中(i)所述第二递呈基团直接结合至所述第二结合剂；或者(ii)所述第二递呈基团间接结合至所述第二结合剂。
162.根据权利要求105至161中任一项所述的系统，其中
(i)将所述第一递呈基团缀合至所述第一结合剂；
(ii)所述第一递呈基团非共价结合至所述第一结合剂；
(iii)将所述第一递呈基团缀合至所述第一靶标标记；
(iv)所述第一递呈基团非共价结合至所述第一靶标标记；或者
(v)所述第一递呈基团是所述第一靶标标记的一部分。
163.根据权利要求108至162中任一项所述的系统，其中
(i)将所述第二递呈基团缀合至所述第二结合剂；
(ii)所述第二递呈基团非共价结合至所述第二结合剂；
(iii)将所述第二递呈基团缀合至所述第二靶标标记；
(iv)所述第二递呈基团非共价结合至所述第二靶标标记；或者
(v)所述第二递呈基团是所述第二靶标标记的一部分。
164.根据权利要求105至163中任一项所述的系统，其中
(i)所述第一靶标标记是核酸分子；
(ii)所述第二靶标标记是核酸分子；或者
(iii)(i)和(ii)两者。
165.根据权利要求127至164中任一项所述的系统，其中
(i)所述第一靶标标记与所述第一标签杂交；
(ii)所述第二靶标标记与所述第二标签杂交；或者
(iii)(i)和(ii)两者。
166.根据权利要求106至165中任一项所述的系统，其中所述样品标记是单链核酸分子(“单链样品标记”)。
167.根据权利要求106至165中任一项所述的系统，其中所述样品标记是双链核酸分子(“双链样品标记”)。
168.根据权利要求167所述的系统，其中所述样品标记是：
(i)包含两个5'悬突的双链核酸分子；
(ii)包含两个3'悬突的双链核酸分子；
(iii)包含5'悬突和3'悬突的双链核酸分子；
(iv)包含5'悬突和平末端的双链核酸分子；或者
(v)包含3'悬突和平末端的双链核酸分子。
169.根据权利要求168所述的系统，其中所述样品标记：
(i)通过所述样品标记的悬突与所述第一靶标标记杂交；
(ii)通过所述样品标记的悬突与所述第二靶标标记杂交；或者
(iii)(i)和(ii)两者。
170.根据权利要求106至169中任一项所述的系统，其中所述系统能够通过同时检测与每种分析物有关的独特靶标ID同时检测所述样品中的至少两个分析物。
171.根据权利要求105至170中任一项所述的系统，其中所述系统还包含参比分析物。
172.根据权利要求171所述的系统，其中所述参比分析物是在所述样品中不存在的分析物。
173.根据权利要求171或172所述的系统，其中所述参比分析物是所述样品中不存在的蛋白、核酸或化合物。
174.根据权利要求173所述的系统，其中所述参比分析物是病毒蛋白、细菌蛋白或昆虫蛋白。
175.根据权利要求110至174中任一项所述的系统，其中所述系统能够通过同时检测与每种样品有关的所述核酸报告分子中的独特样品ID来同时检测至少两个样品中的所述分析物。
176.根据权利要求109至175中任一项所述的系统，其中所述系统能够通过同时检测与每种样品中的每种分析物有关的所述核酸报告分子中的独特样品ID和独特靶标ID，同时检测至少两种样品中的至少两种分析物。
177.根据权利要求105至176中任一项所述的系统，其包括用于检测核酸报告分子的多重qPCR、多重数字PCR或NGS的试剂和/或机器。
178.根据权利要求105至176中任一项所述的系统，其包括用于检测所述核酸报告分子的NGS的试剂和/或机器。
179.根据权利要求105至178中任一项所述的系统，其中所述系统包含在试剂盒中。
180.根据权利要求179所述的系统，其中所述试剂盒还包含结合缓冲液、固定化缓冲液、清洗缓冲液、释放缓冲液或它们的任意组合。
181.用于检测样品中分析物的系统，其包括：(1)第一结合部分，其包含第一结合剂、第一递呈基团和第一靶标标记，所述第一靶标标记包含第一标识码(“ID”)，它是分析物特异的(“靶标ID”)；(2)第二结合部分，其包含第二结合剂、第二递呈基团和第二靶标标记，所述第二靶标标记包含第二靶标ID；(3)第一接受基团、第一固体表面、第二接受基团和第二固体表面；(4)用于连接的试剂和包含样品特异的ID(“样品ID”)的样品标记；和(5)用于定量PCR的试剂；其中
(i)所述第一和第二结合剂结合至所述分析物并形成免疫复合物；
(ii)所述第一接受基团偶联至所述第一固体表面并配置以捕获所述第一递呈基团；
(iii)所述第二接受基团偶联至所述第二固体表面并配置以捕获所述第二递呈基团；
(iv)所述第一靶标标记直接或间接结合至所述第一结合剂并且所述第二靶标标记直接或间接结合至所述第二结合剂；
(v)所述第一递呈基团直接或间接结合至所述第一结合剂并且所述第二递呈基团直接或间接结合至所述第二结合剂；和
(vi)所述样品标记结合至所述第一靶标标记和所述第二靶标标记两者。
182.根据权利要求181所述的系统，其中所述系统包含在试剂盒中。
183.根据权利要求182所述的系统，其中所述试剂盒还包含结合缓冲液、固定化缓冲液、清洗缓冲液、释放缓冲液或它们的任意组合。
184.用于检测样品中分析物的系统，其包括：(1)第一结合部分，其包含第一结合剂、第一递呈基团和第一靶标标记，所述第一靶标标记包含第一标识码(“ID”)，它是分析物特异的(“靶标ID”)；(2)第二结合部分，其包含第二结合剂、第二递呈基团和第二靶标标记，所述第二靶标标记包含第二靶标ID；(3)第一接受基团、第一固体表面、第二接受基团和第二固体表面；和(4)用于连接的试剂和包含样品特异的ID(“样品ID”)的样品标记；其中：
(i)所述第一和第二结合剂结合至所述分析物并形成免疫复合物；
(ii)所述第一接受基团偶联至所述第一固体表面并配置以捕获所述第一递呈基团；
(iii)所述第二接受基团偶联至所述第二固体表面并配置以捕获所述第二递呈基团；
(iv)所述第一靶标标记直接或间接结合至所述第一结合剂并且所述第二靶标标记直接或间接结合至所述第二结合剂；
(v)所述第一递呈基团直接或间接结合至所述第一结合剂并且所述第二递呈基团直接或间接结合至所述第二结合剂；和
(vi)所述样品标记结合至所述第一靶标标记和所述第二靶标标记两者。
185.根据权利要求184所述的系统，其中所述系统包含在试剂盒中。
186.根据权利要求185所述的系统，其中所述试剂盒还包含结合缓冲液、固定化缓冲液、清洗缓冲液、释放缓冲液或它们的任意组合。
187.用于检测样品中分析物的测定方法，其包括：
(1)将第一结合剂、第二结合剂和样品在溶液中混合，其中所述第一和第二结合剂结合所述分析物上的非干扰表位并形成免疫复合物，并且其中所述免疫复合物通过缀合至所述第一结合剂的第一递呈基团和偶联至所述第一固体表面的第一接受基团之间的结合捕获在与所述溶液接触的第一固体表面上；
(2)清洗所述第一固体表面以除去未结合的分子；
(3)通过破坏所述第一递呈基团和所述第一接受基团之间的结合从所述第一固体表面释放所述免疫复合物；
(4)引入第二固体表面并通过缀合至所述第二结合剂的第二递呈基团和偶联至所述第二固体表面的第二接受基团之间的结合将所述免疫复合物重新捕获至所述第二固体表面上；
(5)清洗所述第二固体表面以除去未结合的分子；和
(6)检测所述免疫复合物。
188.根据权利要求187所述的测定方法，其中步骤(1)包括在将所述免疫复合物捕获至所述第一固体表面上之前在溶液中形成所述免疫复合物。
189.根据权利要求187所述的测定方法，其中步骤(1)包括在所述第一固体表面上形成所述免疫复合物之前将所述第一结合剂预捕获至所述第一固体表面上。
190.根据权利要求187所述的测定方法，其中在步骤(1)中，在溶液中形成所述免疫复合物并同时捕获至所述第一固体表面上。
191.根据权利要求187至190中任一项所述的测定方法，还在步骤(5)和(6)之间包括至少一个其它重新捕获循环，其包括：从捕获它的固体表面上释放所述免疫复合物，在与所述第一或所述第二接受基团偶联的其它固体表面上重新捕获所述免疫复合物，并清洗所述其它固体表面以除去未结合的分子。
192.根据权利要求187至191中任一项所述的测定方法，其中(i)所述第一递呈基团通过硫酯基团、二硫键或可切割键结合所述第一接受基团；(ii)所述第二递呈基团通过硫酯基团、二硫键或可切割键结合所述第二接受基团；或者(i)和(ii)两者。
193.根据权利要求192所述的测定方法，其中(i)所述第一递呈基团通过光可切割键、化学可切割键或酶促可切割键结合所述第一接受基团；(ii)所述第二递呈基团通过光可切割键、化学可切割键或酶促可切割键结合所述第二接受基团；或者(i)和(ii)两者。
194.根据权利要求187至191中任一项所述的测定方法，其中(i)所述第一递呈基团是第一核酸标签(“第一标签”)并且所述第一接受基团是第一核酸捕获探针(“第一探针”)，其中所述第一探针或其片段与所述第一标签或其片段互补；或者(ii)所述第二递呈基团是第二核酸标签(“第二标签”)并且所述第二接受基团是第二核酸捕获探针(“第二探针”)，其中所述第二探针或其片段与所述第二标签或其片段互补。
195.根据权利要求194所述的测定方法，其中(i)所述第一递呈基团是所述第一标签并且所述第一接受基团是所述第一探针；且(ii)所述第二递呈基团是所述第二标签并且所述第二接受基团是所述第二探针。
196.根据权利要求194或195所述的测定方法，其中(i)所述第一探针直接偶联至所述第一固体表面；(ii)所述第二探针直接偶联至所述第二固体表面；或者(i)和(ii)两者。
197.根据权利要求194或195所述的测定方法，其中(i)所述第一探针与直接偶联至所述第一固体表面的通用探针杂交；(ii)所述第二探针与直接偶联至所述第二固体表面的通用探针杂交；或者(i)和(ii)两者。
198.根据权利要求194或195所述的测定方法，其中(i)所述第一探针与生物素缀合，所述生物素结合直接偶联至所述第一固体表面的链霉亲和素或抗生物素蛋白；(ii)所述第二探针与生物素缀合，所述生物素结合直接偶联至所述第二固体表面的链霉亲和素或抗生物素蛋白；或者(i)和(ii)两者。
199.根据权利要求195所述的测定方法，其中在步骤(1)中，所述第一标签和第二标签被协同捕获在所述第一固体表面上。
200.根据权利要求199所述的测定方法，其中所述第一探针的第一片段与所述第一标签或其片段互补，并且所述第一探针的第二片段与所述第二标签或其片段互补，其中所述互补区包括所述第一和所述第二标签的非缀合末端。
201.根据权利要求199所述的测定方法，其中所述第一探针的连续片段由第一片段和紧邻的第二片段组成，其中所述第一片段与所述第一标签或其片段互补，并且所述第二片段与所述第二标签或其片段互补，从而当所述第一和第二标签连接以形成连接的核酸时，所述连接的核酸的连接区与所述第一探针的连续片段互补。
202.根据权利要求199所述的测定方法，其中所述第一探针的第一片段与所述第一标签或其片段互补，并且其中所述第一探针的单独的第二片段与所述第二标签或其片段互补；并且其中所述互补区不包括所述第一和所述第二标签的非缀合末端。
203.根据权利要求199所述的测定方法，其中所述第一固体表面与所述第一探针和所述第二探针两者偶联。
204.根据权利要求194至203中任一项所述的测定方法，其中(i)所述第一标签和所述第一探针的互补片段由10至25个碱基对组成；(ii)所述第二标签和所述第二探针的互补片段由10至25个碱基对组成；或者(i)和(ii)两者。
205.用于检测样品中分析物的测定方法，其包括：
(1)将第一结合剂、第二结合剂和样品在溶液中混合；
其中所述第一和第二结合剂结合所述分析物上的非干扰表位并形成免疫复合物；和
其中所述免疫复合物通过缀合至所述第一结合剂的第一核酸标签(“第一标签”)和偶联至所述第一固体表面的第一核酸捕获探针(“第一探针”)之间的杂交捕获至与所述溶液接触的第一固体表面上；
(2)清洗所述第一固体表面以除去未结合的分子；
(3)通过所述第一标签和所述第一探针之间的杂交的解除，从所述第一固体表面释放所述免疫复合物；
(4)引入与第二核酸探针(“第二探针”)偶联的第二固体表面并且通过所述第一标签和所述第二探针之间的杂交在所述第二固体表面上重新捕获所述免疫复合物；
(5)清洗所述第二固体表面以除去未结合的分子；和
(6)检测所述免疫复合物。
206.根据权利要求205所述的测定方法，其中所述第二探针与所述第一探针相同。
207.根据权利要求205或206所述的测定方法，其中步骤(1)包括在将所述免疫复合物捕获至所述第一固体表面上之前在溶液中形成所述免疫复合物。
208.根据权利要求205或206所述的测定方法，其中步骤(1)包括在所述第一固体表面上形成所述免疫复合物之前将所述第一结合剂预捕获至所述第一固体表面上。
209.根据权利要求205或206所述的测定方法，其中在步骤(1)中，在溶液中形成所述免疫复合物并同时捕获至所述第一固体表面上。
210.根据权利要求205至209中任一项所述的测定方法，还在步骤(5)和(6)之间包括至少一个其它重新捕获循环，其包括：从捕获它的固体表面上释放所述免疫复合物；在与(a)第一探针、(b)第二探针或者(c)与第一标签杂交的另一种核酸探针偶联的其它固体表面上重新捕获所述免疫复合物；并清洗所述其它固体表面以除去未结合的分子。
211.根据权利要求205至210中任一项所述的测定方法，其中(i)所述第一探针直接偶联至所述第一固体表面；(ii)所述第二探针直接偶联至所述第二固体表面；或者(i)和(ii)两者。
212.根据权利要求205至210中任一项所述的测定方法，其中(i)所述第一探针与直接偶联至所述第一固体表面的通用探针杂交；(ii)所述第二探针与直接偶联至所述第二固体表面的通用探针杂交；或者(i)和(ii)两者。
213.根据权利要求205至210中任一项所述的测定方法，其中(i)所述第一探针与生物素缀合，所述生物素结合直接偶联至所述第一固体表面的链霉亲和素或抗生物素蛋白；(ii)所述第二探针与生物素缀合，所述生物素结合直接偶联至所述第二固体表面的链霉亲和素或抗生物素蛋白；或者(i)和(ii)两者。
214.根据权利要求205至213中任一项所述的测定方法，其中将所述第二结合剂缀合至第二核酸标签(“第二标签”)。
215.根据权利要求214所述的测定方法，其中在步骤(1)中，所述第一标签和第二标签被协同捕获在所述第一固体表面上。
216.根据权利要求215215所述的测定方法，其中所述第一探针的第一片段与所述第一标签或其片段互补，并且其中所述第一探针的第二片段与所述第二标签或其片段互补；其中所述互补区包括所述第一和所述第二标签的非缀合末端。
217.根据权利要求215所述的测定方法，其中所述第一探针的连续片段由第一片段和紧邻的第二片段组成，其中所述第一片段与所述第一标签或其片段互补，并且所述第二片段与所述第二标签或其片段互补，从而当所述第一和第二标签连接以形成连接的核酸时，所述连接的核酸的连接区与所述第一探针的连续片段互补。
218.根据权利要求215所述的测定方法，其中所述第一探针的第一片段与所述第一标签或其片段互补，并且其中所述第一探针的单独的第二片段与所述第二标签或其片段互补；其中所述互补区不包括所述第一和所述第二标签的非缀合末端。
219.根据权利要求215所述的测定方法，其中所述第一固体表面与所述第一探针和其它核酸探针两者偶联，并且其中所述其它探针或其片段与所述第二标签或其片段互补。
220.根据权利要求215至219中任一项所述的测定方法，其中在步骤(4)中，所述第一标签和第二标签被协同捕获在所述第二固体表面上。
221.根据权利要求220所述的测定方法，其中所述第二探针的第一片段与所述第一标签或其片段互补，并且其中所述第二探针的第二片段与所述第二标签或其片段互补；其中所述互补区包括所述第一和所述第二标签的非缀合末端。
222.根据权利要求220所述的测定方法，其中所述第二探针的连续片段由第一片段和紧邻的第二片段组成，其中所述第一片段与所述第一标签或其片段互补，并且所述第二片段与所述第二标签或其片段互补，从而当所述第一和第二标签连接以形成连接的核酸时，所述连接的核酸的连接区与所述第二探针的连续片段互补。
223.根据权利要求220所述的测定方法，其中所述第二探针的第一片段与所述第一标签或其片段互补，并且其中所述第二探针的单独的第二片段与所述第二标签或其片段互补；其中所述互补区不包括所述第一和所述第二标签的非缀合末端。
224.根据权利要求220所述的测定方法，其中所述第二固体表面与所述第二探针和其它核酸探针两者偶联，并且其中所述其它探针或其片段与所述第二标签或其片段互补。
225.根据权利要求205205至224中任一项所述的测定方法，其中所述第一标签和所述第一探针的互补片段由10至25个碱基对组成。
226.根据权利要求187至225中任一项所述的测定方法，其中所述样品是血清样品或血浆样品。
227.根据权利要求187至226中任一项所述的测定方法，其中所述分析物是两个分子的结合对；其中所述第一结合剂结合所述结合对的一个分子，并且所述第二结合剂结合所述结合对的另一个分子。
228.根据权利要求187至227中任一项所述的测定方法，其中(i)所述第一结合剂是特异性结合所述分析物的抗体或抗体片段；(ii)所述第二结合剂是特异性结合所述分析物的抗体或抗体片段，或(i)和(ii)两者。
229.根据权利要求187至228中任一项所述的测定方法，其中在步骤(6)中：所述免疫复合物在被捕获至固体表面上时被检测。
230.根据权利要求187至228中任一项所述的测定方法，其中在步骤(6)中：所述免疫复合物在从固体表面被释放至溶液之后被检测。
231.根据权利要求187至230中任一项所述的测定方法，其中所述第一结合剂或所述第二结合剂中的任一个与可检测标志物缀合。
232.根据权利要求231所述的测定方法，其中所述可检测标志物为核酸。
233.根据权利要求195至204和214至230中任一项所述的测定方法，其中步骤(6)包括通过连接所述第一标签和所述第二标签产生核酸报告分子，并且检测由所述第一标签的片段和所述第二标签的片段所组成的所述核酸报告分子。
234.根据权利要求195至204和214至230中任一项所述的测定方法，其中步骤(6)包括通过连接以下部分产生核酸报告分子：
(a)所述部分为所述第一标签和所述第二标签的替代核酸(“第二替代物”)，并且检测由所述第一标签的片段和所述第二替代物的片段所组成的所述核酸报告分子；
(b)所述部分为第一标签的替代核酸(“第一替代物”)和所述第二标签，并且检测由所述第一替代物的片段和所述第二标签的片段所组成的所述核酸报告分子；或者
(c)所述部分为所述第一替代物和所述第二替代物，并且检测由所述第一替代物的片段和所述第二替代物的片段所组成的所述核酸报告分子；其中所述第一标签或其片段与所述第一替代物或其片段互补，并且所述第二标签或其片段与所述第二替代物或其片段互补。
235.根据权利要求233或234所述的测定方法，其中通过邻位连接形成所述核酸报告分子。
236.根据权利要求233或234所述的测定方法，其中通过邻位延伸形成所述核酸报告分子。
237.根据权利要求233至236中任一项所述的测定方法，其中通过qPCR、数字PCR或下一代测序(NGS)检测所述核酸报告分子。
238.根据权利要求233至234中任一项所述的测定方法，其中通过滚环扩增(RCA)、链置换扩增(SDA)、环介导等温扩增(LAMP)、重组酶聚合酶扩增(RPA)或者QuantiGene测定检测所述核酸报告分子。
239.根据权利要求233或234所述的测定方法，其中在所述第一标签或其第一替代物或者在所述第二标签或其第二替代物中，所述核酸报告分子含有标识码(“ID”)片段，它是分析物特异的(“靶标ID”)。
240.根据权利要求233或234所述的测定方法，其中所述核酸报告分子在所述第一标签或所述第一替代物中含有第一靶标ID，并且在所述第二标签或所述第二替代物中含有第二靶标ID。
241.根据权利要求233或234所述的测定方法，其中在每个样品中所形成的核酸报告分子含有样品特异的ID(“样品ID”)，其中所述样品ID(1)插入在所述第一标签或其替代物和所述第二标签或其替代物之间，(2)包含在所述第一替代物或所述第二替代物中，或者(3)连接至所述第一标签或其替代物或者所述第二标签或其替代物。
242.根据权利要求233或234所述的测定方法，其中所述核酸报告分子包含(a)在所述第一标签或所述第一替代物或者在所述第二标签或所述第二替代物中的靶标ID，和(b)(1)插入在所述第一标签或其替代物和所述第二标签或其替代物之间，(2)包含在所述第一替代物或所述第二替代物中，或者(3)连接至所述第一标签或其替代物或者所述第二标签或其替代物的样品ID。
243.根据权利要求239或240所述的测定方法，其包括通过同时检测与每种分析物有关的独特靶标ID，同时检测样品中至少两个分析物。
244.根据权利要求243所述的测定方法，其包括通过在步骤(1)中将无功能结合剂添加至所述溶液，从所述分析物中的至少一种按比例降低信号，其中所述无功能结合剂与所述第一结合剂竞争与所述分析物的结合，但是所述无功能结合剂未缀合或缀合至不结合所述第一接受基团的递呈基团。
245.根据权利要求243所述的测定方法，其中至少一种分析物为核酸，并且用于核酸分析物的第一和第二结合剂包含与核酸分析物的不同片段互补的核酸。
246.根据权利要求240所述的测定方法，其中在步骤(6)中，检测所述分析物包括所述第一和所述第二靶标ID的共检测。
247.根据权利要求246所述的测定方法，其中所述分析物是两个分子的结合对；其中所述第一结合剂结合所述结合对的一个分子，并且所述第二结合剂结合所述结合对的另一个分子。
248.根据权利要求241所述的测定方法，其包括通过同时检测与每种样品有关的所述核酸报告分子中的独特样品ID，同时检测至少两个样品中的所述分析物。
249.根据权利要求242所述的测定方法，其包括通过同时检测与每种样品中的每种分析物有关的所述核酸报告分子中的独特样品ID和独特靶标ID，同时检测至少两个样品中的至少两个分析物。
250.根据权利要求243至249中任一项所述的测定方法，其中通过多重qPCR、多重数字PCR或NGS检测所述核酸报告分子。
251.根据权利要求187至250中任一项所述的测定方法，其中(i)所述第一固体表面是磁性颗粒表面和微量滴定板的孔；(ii)所述第二固体表面是磁性颗粒表面和微量滴定板的孔；或(i)和(ii)两者。
252.用于检测样品中分析物的系统，其包括：第一结合剂、第二结合剂、第一递呈基团、第二递呈基团、第一接受基团和第二接受基团；其中
(i)所述第一和第二结合剂结合所述分析物上的非干扰表位，和
(ii)所述第一和第二递呈基团分别结合所述第一和第二接受基团。
253.根据权利要求252所述的系统，还包括第一固体表面和第二固体表面。
254.根据权利要求253所述的系统，其中(i)所述第一固体表面是磁性颗粒表面和微量滴定板的孔；(ii)所述第二固体表面是磁性颗粒表面和微量滴定板的孔；或(i)和(ii)两者。
255.根据权利要求253或254所述的系统，其中所述第一固体表面与所述第一接受基团偶联，并且所述第二第一固体表面与所述第二接受基团偶联。
256.根据权利要求252至254中任一项所述的系统，还包括可检测标志物。
257.根据权利要求256所述的系统，其中将所述可检测标志物缀合至所述第一结合剂或所述第二结合剂。
258.根据权利要求252至257中任一项所述的系统，其中将所述第一结合剂缀合至所述第一递呈基团，并且将所述第二结合剂缀合至所述第二递呈基团。
259.根据权利要求252至258中任一项所述的系统，其中(i)所述第一递呈基团通过硫酯基团、二硫键或可切割键结合所述第一接受基团；(ii)所述第二递呈基团通过硫酯基团、二硫键或可切割键结合所述第二接受基团；或者(i)和(ii)两者。
260.根据权利要求259所述的系统，其中(i)所述第一递呈基团通过光可切割键、化学可切割键或酶促可切割键结合所述第一接受基团；(ii)所述第二递呈基团通过光可切割键、化学可切割键或酶促可切割键结合所述第二接受基团；或者(i)和(ii)两者。
261.用于检测样品中分析物的系统，其包括：第一结合剂、第二结合剂、第一核酸标签(“第一标签”)、第二核酸标签(“第二标签”)、第一核酸捕获探针(“第一探针”)和第二核酸捕获探针(“第二探针”)；其中
(i)所述第一和第二结合剂结合所述分析物上的非干扰表位；
(ii)所述第一探针或其片段与所述第一标签或其片段互补；和
(iii)所述第二探针或其片段与所述第二标签或其片段互补。
262.根据权利要求261所述的系统，还包括第一固体表面和第二固体表面。
263.根据权利要求262所述的系统，其中(i)所述第一固体表面是磁性颗粒表面和微量滴定板的孔；(ii)所述第二固体表面是磁性颗粒表面和微量滴定板的孔；或(i)和(ii)两者。
264.根据权利要求262或263所述的系统，其中所述第一固体表面与所述第一探针偶联，并且所述第二第一固体表面与所述第二探针偶联。
265.根据权利要求261至264中任一项所述的系统，其中将所述第一结合剂缀合至所述第一标签，并且将所述第二结合剂缀合至所述第二标签。
266.根据权利要求261至265中任一项所述的系统，其中(i)所述第一标签和所述第一探针的互补片段由10至25个碱基对组成；(ii)所述第二标签和所述第二探针的互补片段由10至25个碱基对组成；或者(i)和(ii)两者。
267.根据权利要求252至266中任一项所述的系统，其中(i)所述第一结合剂是特异性结合所述分析物的抗体或抗体片段；(ii)所述第二结合剂是特异性结合所述分析物的抗体或抗体片段；或(i)和(ii)两者。
268.用于检测样品中分析物的系统，其包括：第一结合剂、第二结合剂、第一核酸标签(“第一标签”)、第一核酸捕获探针(“第一探针”)和第二核酸捕获探针(“第二探针”)；其中
(i)所述第一和第二结合剂结合所述分析物上的非干扰表位；
(ii)所述第一探针或其片段与所述第一标签或其片段互补；和
(iii)所述第二探针或其片段与所述第一标签或其片段互补。
269.根据权利要求268所述的系统，其中所述第二探针与所述第一探针相同。
270.根据权利要求268或269所述的系统，其中将所述第一结合剂缀合至所述第一标签。
271.根据权利要求268至270中任一项所述的系统，还包括可检测标志物。
272.根据权利要求271所述的系统，其中将所述第一结合剂或所述第二结合剂中的任一个缀合至所述可检测标志物。
273.根据权利要求268至272中任一项所述的系统，还包括第二核酸标签(“第二标签”)。
274.根据权利要求273所述的系统，其中将所述第二标签缀合至所述第二结合剂。
275.根据权利要求273或274所述的系统，其中所述第一探针的片段与所述第二标签或其片段互补。
276.根据权利要求268至275中任一项所述的系统，还包括第一固体表面和第二固体表面。
277.根据权利要求276所述的系统，其中(i)所述第一固体表面是磁性颗粒表面和微量滴定板的孔；(ii)所述第二固体表面是磁性颗粒表面和微量滴定板的孔；或(i)和(ii)两者。
278.根据权利要求276或277所述的系统，其中(1)所述第一固体表面与所述第一探针偶联；(2)所述第二固体表面与所述第二探针偶联；或者(1)和(2)两者。
279.根据权利要求273或274所述的系统，还包括其它核酸探针，其中所述其它探针或其片段与所述第二标签或其片段互补。
280.根据权利要求279所述的系统，还包括第一固体表面和第二固体表面，其中所述第一固体表面与所述第一探针和所述其它探针偶联，并且所述第二固体表面与所述第二探针和所述其它探针偶联。
281.根据权利要求268至280中任一项所述的系统，其中(i)所述第一结合剂是特异性结合所述分析物的抗体或抗体片段；(ii)所述第二结合剂是特异性结合所述分析物的抗体或抗体片段；或(i)和(ii)两者。
282.根据权利要求268至281中任一项所述的系统，其中(i)所述第一标签和所述第一探针的互补片段由10至25个碱基对组成；(ii)所述第二标签和所述第二探针的互补片段由10至25个碱基对组成；或者(i)和(ii)两者。
283.根据权利要求252至282中任一项所述的系统，其中所述系统包含在试剂盒中。
284.根据权利要求283所述的系统，其中所述试剂盒还包含结合缓冲液、固定化缓冲液、清洗缓冲液、释放缓冲液或它们的任意组合。
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