CN114292899B - 一种肝细胞生长因子检测及信号增敏探针、引物对及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开一种肝细胞生长因子检测及信号增敏探针，涉及肝细胞生长因子检测技术领域，所述探针5’端标修饰了荧光素(FITC)，所述探针的序列如SEQ ID NO.1所示。本发明还提供采用酶促重组等温扩增法扩增上述探针的引物对及其应用。本发明的有益效果在于：利用夹心法间接捕获目标探针，并且将酶促重组等温扩增技术(ERA)与侧向免疫层析技术相结合放大检测信号，从而提高检测灵敏度。
Description
技术领域
本发明涉及肝细胞生长因子检测技术领域，具体涉及一种肝细胞生长因子检测及信号增敏探针、引物对及其应用。
背景技术
心力衰竭是一种由心脏结构和/或功能异常引起相应症状和或/体征的临床综合征。其已成为21世纪全球范围的流行病，对卫生保健体系的影响日益增加。据统计2017年全球心衰年龄标准化患病率为0.83％，较1990年下降7.2％，但心衰患者绝对值数量却增加近一倍，其中增长量的90％来自于中国。中国高血压调查显示，2015年我国≥35岁居民中，加权后心衰患病率为1.3％，较2000年增加44.0％。这些数据均表明目前我国心力衰竭患病率呈持续上升趋势，疾病负担持续加重。就目前我国心力衰竭的患者基数大，长期预后差，成为我国最重要的心血管慢病之一。
虽然心力衰竭在现代医疗中出现的越来越频繁，但确保正确的诊断、评估患者的稳定性和选择最佳的治疗仍是具有挑战性的。尽管如此，对病理生理学的准确理解和对临床过程的预测及选择合适的治疗仍是非常重要的。虽然传统的超声心动图是最基本的诊断技术，但是最近提出的应用肝细胞生长因子(HGF)作为生物标志物在评估预后和作为鉴别诊断线索方面有一定的价值。据研究表明，心力衰竭患者的血清中HGF的含量较健康者明显上升，且HGF是晚期心力衰竭，特别是缺血性心力衰竭的一个强有力和独立的死亡率预测器，HGF与心力衰竭严重程度存在显著的关联。综合考虑，开发一种快速、可靠、方便监测患者体内HGF的含量对临床研究具有非常重要的意义。
实时监测患者血清中HGF含量有利于医务人员采取及时的诊断措施。目前较为成熟的检测方法是ELISA法，如公开号为CN1376923A的专利申请采用酶联免疫法检测肝细胞生长因子的浓度，但其检测周期长，且需要专业的操作人员。
公开号为CN112326956A的专利申请公开一种肿瘤特异性生长因子胶乳增强免疫比浊法检测试剂盒，具有较高的灵敏度和特异度，但是其在检测过程中需要使用全自动生化分析仪，对检测条件要求较高。
发明内容
本发明所要解决的技术问题在于如何实现无需特殊贵重仪器、快速、准确的检测HGF，建立了一种集成核酸等温扩增的增敏式夹心法胶体金免疫侧向层析技术定量及定性HGF的检测新方法。
具体提供一种肝细胞生长因子检测及信号增敏探针，以及针对该探针设计的引物对，通过抗原抗体夹心法捕获HGF，间接捕获目标探针，通过酶促重组等温扩增技术(ERA)放大信号与侧向免疫层析技术结合的检测方法。
本发明通过以下技术手段实现解决上述技术问题：
一种肝细胞生长因子检测及信号增敏探针，所述探针的5’端标修饰了荧光素(FITC)，所述探针的序列如SEQ ID NO.1所示。
有益效果：肝细胞生长因子与其抗体对的结合能够间接捕获本发明中的探针，可以利用夹心法间接捕获目标探针，然后将酶促重组等温扩增技术(ERA)与侧向免疫层析技术相结合放大检测信号，从而提高检测灵敏度。
一种采用酶促重组等温扩增法(ERA)扩增上述探针的引物对，所述引物对包括FITC修饰的上游引物和生物素修饰的下游引物，所述上游引物和下游引物的序列分别如SEQ ID NO.2和SEQ ID NO.3所示。
有益效果：针对探针基因型特异性的引物，能够实现对目标探针基因的特异性、有效扩增。FITC修饰的上游引物，生物素修饰的下游引物，为特异性设计针对上述目标探针的引物对，便于产生两端功能化扩增产物。实现对目标探针基因型有效扩增的同时，实现了扩增产物的两端同时标记，是基于扩增产物的侧向免疫层析同时筛查和检测HGF的关键设计。
酶促重组等温扩增技术(ERA)放大信号，将捕获的目标探针经ERA扩增获得大量的双功能化的双链DNA产物，即双链DNA两端分别由FITC和生物素修饰。
本发明提供所述的探针以及一对引物的设计并非仅限于此。
一种采用上述探针捕获待测物中肝细胞生长因子的方法，包括以下步骤：
(1)将FITC抗体、HGF抗体1和胶体金偶联，制得FITC抗体与HGF抗体1标记的胶体金溶液；
(2)将上述探针与步骤(1)标记两种抗体的胶体金上的FITC抗体结合；
(3)将HGF抗体2与羧基化的磁性纳米粒子偶联，制得HGF抗体2标记的磁性纳米粒子；
(4)将步骤(2)中结合FITC修饰的目标探针的胶体金溶液与HGF抗体2标记的磁性纳米粒子溶液混合；
(5)将待检物加入步骤(4)的混合物中，充分结合后，磁性分离，洗涤后，定量目标物HGF的含量间接转换为定量FITC修饰的目标探针。
有益效果：本发明利用双抗体夹心法捕获目标物HGF，通过目标物的量间接定量与目标物相连的胶体金上FITC抗体结合的探针量，间接捕获功能化目标探针。
优选地，所述步骤(1)具体包括以下步骤：
(a)调节pH：用K2CO3调节胶体金溶液的pH至偶联的两种抗体的等电点偏高处；
(b)偶联：分别加入适量的FITC抗体和HGF抗体1，室温孵育1～2h；
(c)封闭：加封闭剂BSA溶液，室温封闭0.5～1h，离心，去上清，复溶，制得FITC抗体与HGF抗体1标记的胶体金溶液。
优选地，所述胶体金为红色，粒径为20～55nm，所述K2CO3浓度为0.1mol/L；所述FITC抗体的浓度为1.0～3.0mg/mL，HGF抗体1浓度为1mg/mL；所述封闭剂BSA溶液的质量体积比为10％～20％，所述离心条件为：8500～12000g，4℃，10～15min。
优选地，所述复溶采用质量体积比为0.5～1.5％BSA的1×PBS溶液。
优选地，所述步骤(2)具体包括以下步骤：取适量步骤(1)中标记两种抗体的胶体金，向其中加入稍过量的探针，充分混合后静置一段时间，然后用缓冲溶液将混合物进行洗涤。
优选地，所述缓冲溶液为含1％～10％BSA的1×PBS溶液。
优选地，所述步骤(3)具体包括以下步骤：
(a)活化：往适量浓度的磁性纳米粒子溶液加入1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(EDC)和N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)的水溶液，室温避光活化15～60min；
(b)偶联：磁性分离，去上清，洗涤后，加入1×PBS缓冲液重悬，加入适量的HGF抗体2，室温孵育2～3h；
(c)封闭：加入封闭剂BSA溶液，室温封闭0.5～1h；
(d)重悬：磁性分离，去上清，洗涤后，加入质量体积比为0.5～1.5％BSA的1×PBS复溶，冷藏保藏。
优选地，所述磁性纳米粒子表面羧基、1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(EDC)和N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)的摩尔比为1：5：5～1：20：20，所述磁性纳米粒子的浓度为20～50mg/mL，所述HGF抗体2的浓度为1mg/mL，所述封闭剂BSA溶液的质量体积比为10％～20％。
优选地，所述步骤(5)中将待检物加入上述的混合物中，充分结合后，静止10～20min，磁性分离，1×PBS缓冲液洗涤三遍。
一种采用上述引物对扩增捕获细胞生长因子探针的方法，包括以下步骤：
(1)将FITC抗体、HGF抗体1和胶体金偶联，制得FITC抗体与HGF抗体1标记的胶体金溶液；
(2)将上述探针与步骤(1)标记两种抗体的胶体金上的FITC抗体结合；
(3)将HGF抗体2与羧基化的磁性纳米粒子偶联，制得HGF抗体2标记的磁性纳米粒子；
(4)将结合FITC修饰的目标探针的胶体金溶液与HGF抗体2标记的磁性纳米粒子溶液混合；
(5)将待检物加入上述的混合物中，充分结合后，磁性分离，洗涤后，用水复溶得到重悬液；
(6)将ERA检测试剂与上述上游引物和下游引物混合，加入步骤(5)中的重悬液，然后加入激活剂反应。
有益效果：本发明利用双抗体夹心法捕获目标物HGF，通过目标物的量间接定量与目标物相连的胶体金上FITC抗体结合的探针量，进而对获得的目标探针利用其修饰的上下游引物进行ERA扩增放大信号，然后将ERA扩增获得的双功能化的双链DNA上样，可以进行侧向免疫层析，实现灵敏筛查和检测的目的。
一种采用侧向免疫层析试纸条检测肝细胞生长因子的方法，包括以下步骤：
(1)所述侧向免疫层析试纸条包括支撑板，所述支撑板沿其轴线方向依次设置上样区、结合FITC抗体的抗体金的标记区、划线区和吸水区，所述上样区、标记区、划线区和吸水区上依次对应粘贴样品垫、标记垫、纤维素膜以及吸水垫；所述划线区内设有检测线T和质控线C，且所述检测线T和质控线C分别结合有链霉亲和素和二抗；
(2)采用上述引物对扩增捕获目标物HCF检测探针，将扩增得到的产物上样于试纸条的上样区，根据检测线的显色结果对肝细胞生长因子进行定性或定量检测。
有益效果：本发明利用双抗体夹心法捕获目标物HGF，通过目标物的量间接定量与目标物相连的胶体金上FITC抗体结合的探针量，进而对获得的目标探针利用其修饰的上下游引物进行ERA扩增放大信号，然后将ERA扩增获得的双功能化的双链DNA上样，可以进行侧向免疫层析，实现灵敏筛查和检测的目的。
本发明根据试纸条上检测线(T)的颜色深浅，从而建立起检测线颜色的深浅与对应的HGF含量之间的关系，进而实现对HGF灵敏检测的目的，适用于临床快速检测血清中HGF的含量。
本发明检测方法特异性好，灵敏度高，重复性好，操作简单，适用性强。
相比于传统的侧向免疫层析技术，本发明采用了抗体对夹心法间接捕获目标探针以及ERA扩增技术放大信号和侧向免疫层析技术相结合的检测方法。该方法相比于传统的侧向免疫层析技术，灵敏度有了极大的提高，其检测限低至50pg/mL，且重复性较好(δ≤5％)。为了确定该方法的特异性，分别检测了心房钠尿肽、肌钙蛋白、肾素血管紧张素2及C反应蛋白几种干扰物，结果显示其特异性为100％。
本发明的检测方法不需要特殊贵重仪器，仅需要普通的水浴锅和对应的侧向免疫层析试纸条，即可实现HGF的快速、准确的检测，适用于基层及检测硬件资源匮乏地区开展相关的HGF的检测工作。
优选地，所述FITC抗体选自FITC的单克隆抗体，浓度为1～3mg/mL，所述胶体金为红色，粒径为20～55nm，所述链霉亲和素的浓度为0.5～2mg/mL，所述二抗选自羊抗鼠二抗，浓度为1.0～4.0mg/mL。
优选地，所述支撑板包括不吸水或疏水的纸板或塑料板，但不仅限于此。所述样品垫的材质包括对样品吸附力弱的玻璃纤维棉或聚酯膜，但不仅限于此。所述纤维素膜包括纯纤维素膜或硝酸纤维素膜。所述吸水区的材质包括滤纸，但不仅限于此。
优选地，所述侧向免疫层析试纸条的制备方法包括以下步骤：将FITC抗体与胶体金偶联，制得FITC抗体标记的胶体金将链霉亲和素和羊抗鼠二抗分别制成划线区的检测线T以及质控线C；以及将上样区、标记区、划线区和吸水区沿设定方向依次设置在支撑板上，获得所述的侧向免疫层析试纸条。
优选地，将胶体金溶液调至合适的pH范围，之后加入FITC抗体孵育，再加入BSA溶液封闭，获得FITC抗体标记的胶体金。胶体金的粒径为30nm左右。
本发明的优点在于：肝细胞生长因子与其抗体对的结合能够间接捕获本发明中的探针，可以利用夹心法间接捕获目标探针，然后将酶促重组等温扩增技术(ERA)与侧向免疫层析技术相结合放大检测信号，从而提高检测灵敏度。
针对探针基因型特异性的引物，能够实现对目标探针基因的特异性、有效扩增。FITC修饰的上游引物，生物素修饰的下游引物，为特异性设计针对上述目标探针的引物对，便于产生两端功能化扩增产物。实现对目标探针基因型有效扩增的同时，实现了扩增产物的两端同时标记，是基于扩增产物的侧向免疫层析同时筛查和检测HGF的关键设计。
酶促重组等温扩增技术(ERA)放大信号，将捕获的目标探针经ERA扩增获得大量的双功能化的双链DNA产物，即双链DNA两端分别由FITC和生物素修饰。
本发明利用双抗体夹心法捕获目标物HGF，通过目标物的量间接定量与目标物相连的胶体金上FITC抗体结合的探针量，间接捕获功能化目标探针。
本发明利用双抗体夹心法捕获目标物HGF，通过目标物的量间接定量与目标物相连的胶体金上FITC抗体结合的探针量，进而对获得的目标探针利用其修饰的上下游引物进行ERA扩增放大信号，然后将ERA扩增获得的双功能化的双链DNA上样，可以进行侧向免疫层析，实现灵敏筛查和检测的目的。
本发明根据试纸条上检测线(T)的颜色深浅，从而建立起检测线颜色的深浅与对应的HGF含量之间的关系，进而实现对HGF灵敏检测的目的，适用于临床快速检测血清中HGF的含量。
本发明检测方法特异性好，灵敏度高，重复性好，操作简单，适用性强。
相比于传统的侧向免疫层析技术，本发明采用了抗体对夹心法间接捕获目标探针以及ERA扩增技术放大信号和侧向免疫层析技术相结合的检测方法。该方法相比于传统的侧向免疫层析技术，灵敏度有了极大的提高，其检测限低至50pg/mL，且重复性较好(δ≤5％)。为了确定该方法的特异性，分别检测了心房钠尿肽、肌钙蛋白、肾素血管紧张素2及C反应蛋白几种干扰物，结果显示其特异性为100％。
本发明的检测方法不需要特殊贵重仪器，仅需要普通的水浴锅和对应的侧向免疫层析试纸条，即可实现HGF的快速、准确的检测，适用于基层及检测硬件资源匮乏地区开展相关的HGF的检测工作。
附图说明
图1为本发明对比例1的检测结果；
图2为本发明实施例2的检测结果。
具体实施方式
为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合本发明实施例，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
下述实施例中所用的试验材料和试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径获得。
实施例中未注明具体技术或条件者，均可以按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。
实施例1
侧向免疫层析快速检测肝细胞生长因子的方法，具体包括以下步骤：
(1)FITC抗体、HGF抗体1和胶体金偶联
调节pH：取1000μL粒径为40nm的红色胶体金于1.5mL的离心管中，加入18μL0.1mol/L K2CO3水溶液混匀；
偶联：分别加入1.5μL 1mg/mL的FITC抗体和1mg/mL HGF抗体1，涡旋混匀之后，室温孵育1h。
封闭：加入100μL质量体积比为10％BSA的1×PBS溶液，涡旋混匀，室温孵育1h。
重悬：在8500g，4℃，15min条件下离心，去上清，然后将沉淀复溶在100μL 1％BSA的1×PBS溶液中，于4℃条件下保存，得到FITC抗体与HGF抗体1标记的胶体金溶液。
(2)FITC修饰的检测探针与标记两种抗体的胶体金上的FITC抗体结合
取步骤(1)10μL复溶后标记FITC抗体与HGF抗体1标记的胶体金溶液于1.5mL离心管中，加入一定量FITC修饰的目标探针至终浓度为1μmol/L，混匀于室温下静置10min，然后再加入胶体金的复溶液至500μL，在8500g，4℃，15min条件下离心，去上清，然后将沉淀重悬在10μL1％BSA的1×PBS溶液中，于4℃条件下保存，得到结合有FITC修饰的目标探针的胶体金偶联物。
(3)HGF抗体2与羧基化的磁性纳米粒子偶联
活化：取20mg/ml的磁性纳米粒子15μL，用10ug/mL EDC/NHS活化液重悬至1000μL，再向磁性纳米粒子溶液加入1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(EDC)和N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)的水溶液，使磁性纳米粒粒子表面羧基与EDC和NHS的摩尔比为1：10：10，室温避光活化30min；
偶联：磁性分离，去上清，加入1×PBS(pH值7.2～7.6)缓冲液重悬，加入4μL HGF抗体2，室温孵育2h；
封闭：加入100μL质量体积比为10％的BSA溶液，室温孵育1h；
重悬：磁性分离，去上清，用1×PBS溶液洗两遍，再加入100μL质量体积比为1％BSA的1×PBS(pH值7.2～7.6)缓冲液重悬，4℃保存。
(4)将结合有目标探针的胶体金与HGF抗体2标记的磁性纳米粒子混合，二者体积比为1:1
取10μL步骤(3)重悬后标记有HGF抗体2的磁性纳米粒子加入到步骤(2)洗涤后结合有FITC修饰的目标探针的胶体金偶联物中。
(5)加入待检物
取5μL待检物加入到(4)中的混合物中，充分混匀后，静置15min，然后通过磁性分离，用水洗三遍，最后用水复溶到一定体积，得到重悬液。
(6)ERA扩增放大信号
ERA干粉试剂(杭州众测基础型)用20μL溶解剂(水)溶解，加入10μM的FITC修饰检测探针的上下游引物各1.2μL，补水至46μL，混匀，分两管，再在每管中加入1μL步骤(5)中的重悬液，最后在每管中加入1μL激活剂(MgCl2)，39℃反应30min，得到ERA扩增产物。
其中，采用的FITC修饰的探针具体序列为：5’-FITC-CTTCTGAAGTGAAATCAGCGGTTGAATCGGCGATGGGTGAGAAGCTATCTGAGTTCTTGGTCGAAAACCCA-3’，FITC修饰的探针上游引物的具体序列为：5’-FITC-TGGGTTTTCGACCAAGAACTCAG-3’，下游引物的具体序列为：5’-BIO-CTTCTGAAGTGAAATCAGCGGTTG-3’。
(7)侧向免疫层析试纸条的制作
支撑板沿其轴线方向依次设置上样区、结合FITC抗体的抗体金的标记区、划线区和吸水区，上样区、标记区、划线区和吸水区上依次对应粘贴样品垫、标记垫、纤维素膜以及吸水垫；划线区内设有检测线T和质控线C，其中T靠近标记区，C远离标记区。本实施例中支撑板的材质为不吸水的纸板，样品垫的材质为玻璃纤维棉，纤维素膜为硝酸纤维素膜，吸水区的材质为滤纸。
标记区的制备：1)调节pH：取1000μL胶体金于1.5mL的离心管中，加入10μL0.1mol/L K2CO3水溶液混匀；2)偶联：加入1mg/mL的FITC抗体4μL，涡旋混匀之后，室温孵育1h。3)封闭：加入100μL 10％BSA，涡旋混匀，室温孵育30min。4)重悬：在9500r/min，4℃，15min条件下离心，去上清，然后将沉淀重悬在80μL 10％BSA溶液中，得到FITC抗体标记的胶体金溶液。5)标记区的制备：每个标记区滴加适量的FITC抗体标记的胶体金溶液，26℃烘箱中烘干并保存备用。
划线区的包埋：使用喷膜仪把2mg/mL链霉亲和素和1mg/mL羊抗鼠二抗分别印制到检测线T以及质控线C，26℃烘箱中烘干并保存备用。
试纸条的组装：分别将上样区、标记区、划线区和吸水区按顺序组装到支撑板上。
(8)侧向免疫层析检测
将ERA扩增产物取1μL于试纸条的样品垫上，再加50μL1×PBS缓冲液，15min后观察试纸条的显色区，使用单反相机拍摄图片，并利用ImageJ软件对检测线T的强度进行分析。
实施例2
侧向免疫层析快速检测肝细胞生长因子的方法，具体包括以下步骤：
(1)FITC抗体、HGF抗体1和胶体金偶联
调节pH：取1000μL粒径为18nm的红色胶体金于1.5mL的离心管中，加入18μL0.1mol/L K2CO3水溶液混匀；
偶联：分别加入1.5μL 1mg/mL的FITC抗体和1mg/mL HGF抗体1，涡旋混匀之后，室温孵育1h。
封闭：加入100μL质量体积比为10％BSA的1×PBS溶液，涡旋混匀，室温孵育1h。
重悬：在8500g，4℃，15min条件下离心，去上清，然后将沉淀复溶在100μL 1％BSA的1×PBS溶液中，于4℃条件下保存，得到FITC抗体与HGF抗体1标记的胶体金溶液。
(2)FITC修饰的探针与标记两种抗体的胶体金上的FITC抗体结合
取步骤(1)100μL复溶后标记FITC抗体与HGF抗体1标记的胶体金溶液于1.5mL离心管中，加入一定量FITC修饰的探针至终浓度为1μmol/L，混匀于室温下静置10min，然后再加入胶体金的复溶液至1000μL，在8500g，4℃，15min条件下离心，去上清，然后将沉淀复溶在100μL1％BSA的1×PBS溶液中，于4℃条件下保存，得到结合有FITC修饰的目标探针的胶体金偶联物。
(3)HGF抗体2与羧基化的磁性纳米粒子偶联
活化：取20mg/ml的磁性纳米粒子15μL，用10ug/mL EDC/NHS活化液重悬至1000μL，再向磁性纳米粒子溶液加入1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(EDC)和N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)的水溶液，使磁性纳米粒粒子表面羧基与EDC和NHS的摩尔比为1：10：10，室温避光活化30min；
偶联：磁性分离，去上清，用1×PBS缓冲液(pH值7.2～7.6)洗涤两遍，加入1×PBS缓冲液重悬至1000μL，加入4μL HGF抗体2，室温孵育2h；
封闭：加入100μL质量体积比为10％的BSA溶液，室温孵育1h；
重悬：磁性分离，去上清，用1×PBS溶液洗两遍，再加入100μL质量体积比为1％BSA的1×PBS(pH值7.2～7.6)缓冲液复溶，4℃保存。
(4)将结合目标探针的胶体金与HGF抗体2标记的磁性纳米粒子混合
取(3)中重悬至100μL标记有HGF抗体2的磁性纳米粒子加入到步骤(2)洗涤后结合有FITC修饰的目标探针的胶体金中。
(5)加入待检物
取20μL(4)中的混合物，加入5μL待检目标物，充分混匀后，静置15min，然后通过磁性分离，用水洗三遍，最后用水重悬到一定体积。
(6)ERA扩增放大信号
ERA干粉试剂(杭州众测基础款)用20μL水溶解，加入10μM实施例1中的FITC修饰探针的上下游引物各1.2μL，补水至46μL，混匀，分两管，再在每管中加入1μL(5)中的重悬液，最后在每管中加入1μL激活剂MgSO4，39℃反应30min。
(7)侧向免疫层析试纸条的制作
支撑板沿其轴线方向依次设置上样区、结合FITC抗体的抗体金的标记区、划线区和吸水区，上样区、标记区、划线区和吸水区上依次对应粘贴样品垫、标记垫、纤维素膜以及吸水垫；划线区内设有检测线T和质控线C，其中T靠近标记区，C远离标记区。本实施例中支撑板的材质为不吸水的纸板，样品垫的材质为玻璃纤维棉，纤维素膜为硝酸纤维素膜，吸水区的材质为滤纸。
标记区的制备：1)调节pH：取1000μL胶体金于1.5mL的离心管中，加入10μL0.1mol/L K2CO3水溶液混匀；2)偶联：加入1mg/mL的FITC抗体4μL，涡旋混匀之后，室温孵育1h。3)封闭：加入100μL 10％BSA，涡旋混匀，室温孵育30min。4)重悬：在9500r/min，4℃，15min条件下离心，去上清，然后将沉淀重悬在80μL 10％BSA溶液中，得到FITC抗体标记的胶体金溶液。5)标记区的制备：每个标记区滴加适量的FITC抗体标记的胶体金溶液，26℃烘箱中烘干并保存备用。
划线区的包埋：使用喷膜仪把2mg/mL链霉亲和素和1mg/mL羊抗鼠二抗分别印制到检测线T以及质控线C，26℃烘箱中烘干并保存备用。
试纸条的组装：分别将上样区、标记区、划线区和吸水区按顺序组装到支撑板上。
(8)侧向免疫层析检测
将ERA扩增产物取1μL于试纸条的样品垫上，再加50μL1×PBS缓冲液，15min后观察试纸条的显色区，使用单反相机拍摄图片，并利用ImageJ软件对检测线T的强度进行分析。
实施例3
侧向免疫层析快速检测肝细胞生长因子的方法，具体包括以下步骤：
(1)FITC抗体、HGF抗体1和胶体金偶联
调节pH：取1000μL粒径为20nm的红色胶体金于1.5mL的离心管中，加入18μL0.1mol/L K2CO3水溶液混匀；
偶联：分别加入2μL 1mg/mL的FITC抗体和1mg/mL HGF抗体1，涡旋混匀之后，室温孵育1h。
封闭：加入100μL质量体积比为15％BSA的1×PBS溶液，涡旋混匀，室温孵育1h。
重悬：在9500g，4℃，15min条件下离心，去上清，然后将沉淀复溶在100μL 0.5％BSA的1×PBS溶液中，于4℃条件下保存。
(2)FITC修饰的检测探针与标记两种抗体的胶体金上的FITC抗体结合
取步骤(1)100μL复溶后标记FITC抗体与HGF抗体1标记的胶体金溶液于1.5mL离心管中，加入一定量FITC修饰的探针至终浓度为1μmol/L，混匀于室温下静置20min，然后再加入胶体金的复溶液至1000μL，在9500g，4℃，15min条件下离心，去上清，然后将沉淀复溶在100μL0.5％BSA的1×PBS溶液中，于4℃条件下保存。
(3)HGF抗体2与羧基化的磁性纳米粒子偶联
活化：取20mg/ml的磁性纳米粒子15μL，用10ug/mL EDC/NHS活化液重悬至1000μL，再向磁性纳米粒子溶液加入1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(EDC)和N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)的水溶液，使磁性纳米粒粒子表面羧基与EDC和NHS的摩尔比为1：20：20，室温避光活化15min；偶联：磁性分离，去上清，加入1×PBS(pH值7.2～7.6)缓冲液重悬，加入3μL 1mg/mL HGF抗体2，室温孵育2h；
封闭：加入100μL质量体积比为15％的BSA溶液，室温孵育1h；
重悬：磁性分离，去上清，用1×PBS溶液洗两遍，再加入100μL质量体积比为0.5％BSA的1×PBS(pH值7.2～7.6)缓冲液重悬，4℃保存。
(4)将结合目标探针的胶体金与HGF抗体2标记的磁性纳米粒子混合
取(3)中重悬至100μL标记有HGF抗体2的磁性纳米粒子加入到步骤(2)中洗涤后结合有FITC修饰的探针的胶体金中。
(5)加入待检物
取10μL(4)中的混合物中，加入5μL待检目标物，充分混匀后，静置20min，然后通过磁性分离，用水洗三遍，最后用水重悬到一定体积。
(6)ERA扩增放大信号
ERA干粉试剂(杭州众测基础款)用20μL水溶解，加入10μM的FITC修饰探针的上下游引物各1.2μL，补水至46μL，混匀，分两管，再在每管中加入2μL(5)中的重悬液，最后在每管中加入1μL激活剂MgSO4，39℃反应25min。
(7)侧向免疫层析试纸条的制作
支撑板沿其轴线方向依次设置上样区、结合FITC抗体的抗体金的标记区、划线区和吸水区，上样区、标记区、划线区和吸水区上依次对应粘贴样品垫、标记垫、纤维素膜以及吸水垫；划线区内设有检测线T和质控线C，其中T靠近标记区，C远离标记区。本实施例中支撑板的材质为不吸水的纸板，样品垫的材质为玻璃纤维棉，纤维素膜为硝酸纤维素膜，吸水区的材质为滤纸。
标记区的制备：1)调节pH：取1000μL胶体金于1.5mL的离心管中，加入10μL0.1mol/L K2CO3水溶液混匀；2)偶联：加入1mg/mL的FITC抗体4μL，涡旋混匀之后，室温孵育1h。3)封闭：加入100μL 10％BSA，涡旋混匀，室温孵育30min。4)重悬：在9500r/min，4℃，15min条件下离心，去上清，然后将沉淀重悬在80μL 10％BSA溶液中，得到FITC抗体标记的胶体金溶液。5)标记区的制备：每个标记区滴加适量的FITC抗体标记的胶体金溶液，26℃烘箱中烘干并保存备用。
划线区的包埋：使用喷膜仪把2mg/mL链霉亲和素和1mg/mL羊抗鼠二抗分别印制到检测线T以及质控线C，26℃烘箱中烘干并保存备用。
试纸条的组装：分别将上样区、标记区、划线区和吸水区按顺序组装到支撑板上。
(8)侧向免疫层析检测
将ERA扩增产物取1μL于试纸条的样品垫上，再加50μL1×PBS缓冲液，15min后观察试纸条的显色区，使用单反相机拍摄图片，并利用ImageJ软件对检测线T的强度进行分析。
对比例1
只使用侧向免疫层析技术检测
标记区的制备：1)调节pH：取1000μL胶体金于1.5mL的离心管中，加入15μL0.1mol/L K2CO3水溶液混匀；2)偶联：加入3μL 1mg/mL的HGF抗体1，涡旋混匀之后，室温孵育1h。3)封闭：加入100μL 10％BSA，涡旋混匀，室温孵育1h。4)重悬：在8500r/min，4℃，15min条件下离心，去上清，然后将沉淀复溶在80μL含1％海藻糖和0.5％Casein的1×PBS。5)标记区的制备：每个标记区滴加适量的HGF抗体1标记的胶体金溶液，26℃烘箱中烘干并保存备用。
划线区的包埋：使用喷膜仪把1mg/mL HGF抗体2和1mg/mL羊抗鼠二抗分别印制到检测线T以及质控线C，26℃烘箱中烘干并保存备用。
试纸条的组装：分别将上样区、标记区、划线区和吸水区按顺序组装到支撑板上，各区域及支撑板的材质与实施例1相同。
上样：将待检物滴于试纸条的上样区，15min后观察试纸条的显色区，使用单反相机拍摄图片，并利用ImageJ软件对检测线T的强度进行分析。
本对比例测试结果如图1和图2所示，直接使用夹心法侧向免疫层析技术检测HGF，其灵敏度较低，远远达不到检测要求。
以上实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的精神和范围。
Claims (10)
1.一种非诊断目的采用侧向免疫层析试纸条检测肝细胞生长因子的方法，其特征在于：
（1）将FITC抗体、HGF抗体1和胶体金偶联，制得FITC抗体与HGF抗体1标记的胶体金溶液；
（2）将探针与步骤（1）标记两种抗体的胶体金上的FITC抗体结合；所述探针的5’端标修饰了FITC，探针具体序列为：5’-FITC-CTTCTGAAGTGAAATCAGCGGTTGAATCGGCGATGGGTGAGAAGCTATCTGAGTTCTTGGTCGAAAACCCA-3’，得到结合探针的胶体金溶液；
（3）将HGF抗体2与羧基化的磁性纳米粒子偶联，制得HGF抗体2标记的磁性纳米粒子；具体包括以下步骤：
A）活化：往磁性纳米粒子溶液加入1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐和N-羟基琥珀酰亚胺的水溶液，室温避光活化15~ 60 min；磁性纳米粒子表面羧基、1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐和N-羟基琥珀酰亚胺的摩尔比为1：10：10；
B）偶联：磁性分离，去上清，洗涤后，加入1×PBS缓冲液重悬，加入适量HGF抗体2，室温孵育2~ 3 h；
C）封闭：加入封闭剂BSA溶液，室温封闭0.5~ 1 h；
D）重悬：磁性分离，去上清，洗涤后，加入质量体积比为1% BSA的1×PBS复溶，冷藏保藏；
（4）将所述结合探针的胶体金溶液与所述HGF抗体2标记的磁性纳米粒子溶液混合；
（5）将待检物加入步骤（4）的混合物中，充分结合后，磁性分离，洗涤后，用水复溶得到重悬液；
（6）将ERA检测试剂与FITC修饰的上游引物和生物素修饰的下游引物混合，加入步骤（5）中的重悬液，然后加入激活剂反应；所述上游引物和下游引物的具体序列分别为：
5’-FITC-TGGGTTTTCGACCAAGAACTCAG- 3’和
5’-BIO-CTTCTGAAGTGAAATCAGCGGTTG-3’；
（7）采用侧向免疫层析试纸条检测肝细胞生长因子。
2.根据权利要求1所述的非诊断目的采用侧向免疫层析试纸条检测肝细胞生长因子的方法，其特征在于：所述步骤（1）具体包括以下步骤：
（a）调节pH：用K2CO3调节胶体金溶液的pH至偶联的两种抗体的等电点偏高处；
（b）偶联：分别加入适量的FITC抗体和HGF抗体1，室温孵育1~2 h；
（c）封闭：加封闭剂BSA溶液，室温封闭0.5~1 h，离心，去上清，复溶，制得FITC抗体与HGF抗体1标记的胶体金溶液。
3.根据权利要求2所述的非诊断目的采用侧向免疫层析试纸条检测肝细胞生长因子的方法，其特征在于：所述步骤（b）中FITC抗体的浓度为1 mg/mL。
4.根据权利要求2所述的非诊断目的采用侧向免疫层析试纸条检测肝细胞生长因子的方法，其特征在于：所述步骤（b）中HGF抗体1的浓度为1 mg/mL。
5.根据权利要求1所述的非诊断目的采用侧向免疫层析试纸条检测肝细胞生长因子的方法，其特征在于：所述步骤（2）具体包括以下步骤：取适量步骤（1）中标记两种抗体的胶体金，向其中加入过量的探针，充分混合后静置一段时间，然后用缓冲溶液将混合物进行洗涤。
6.根据权利要求1所述的非诊断目的采用侧向免疫层析试纸条检测肝细胞生长因子的方法，其特征在于：所述步骤A）中磁性纳米粒子溶液的浓度为20 mg/mL。
7.根据权利要求1所述的非诊断目的采用侧向免疫层析试纸条检测肝细胞生长因子的方法，其特征在于：所述步骤C）中封闭剂BSA溶液的质量体积比为10%。
8.根据权利要求1所述的非诊断目的采用侧向免疫层析试纸条检测肝细胞生长因子的方法，其特征在于：所述侧向免疫层析试纸条包括支撑板，所述支撑板沿其轴线方向依次设置上样区、结合FITC抗体的抗体金的标记区、划线区和吸水区。
9.根据权利要求8所述的非诊断目的采用侧向免疫层析试纸条检测肝细胞生长因子的方法，其特征在于：所述上样区、标记区、划线区和吸水区上依次对应粘贴样品垫、标记垫、纤维素膜以及吸水垫；所述划线区内设有检测线T和质控线C，且所述检测线T和质控线C分别结合有链霉亲和素和二抗。
10.根据权利要求1所述的非诊断目的采用侧向免疫层析试纸条检测肝细胞生长因子的方法，其特征在于：所述步骤（7）具体为：将步骤（6）的产物上样于试纸条的上样区，根据检测线的显色结果对肝细胞生长因子进行定性或定量检测。
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