JPH1183854A - 肝細胞増殖因子に対する抗体および肝細胞増殖因子の測定方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【課題】 ＨＧＦを免疫学的に高感度に測定するため
に、抗ＨＧＦ抗体、該抗体の製造法、及びＨＧＦの免疫
学的測定法を提供する。 【解決手段】 肝細胞増殖因子を免疫原として鳥類に投
与し、該鳥類が産卵した卵の卵黄中より肝細胞増殖因子
に結合する抗体を得、これを肝細胞増殖因子の免疫学的
測定に用いる。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明は、肝細胞増殖因子に
結合する抗体、この抗体の製造方法、及びこの抗体を用
いて肝細砲増殖因子を免疫学的に測定する方法に関す
る。肝細胞増殖因子の測定は、肝疾患以外の各種疾患の
診断等にも用いられる。

【０００２】

【従来の技術】肝細胞増殖因子（以下、「ＨＧＦ」と称
することもある）に関しては、ヒトにおけるＨＧＦ測定
系が開発され（Hepatology,13,1-5（1991））、種々の
肝疾患及びその他の疾患における生体内ＨＧＦ濃度が測
定されている。それによると、血中ＨＧＦ量は種々の肝
疾患において上昇することが認められ、ＨＧＦの診断意
義として、劇症肝炎早期診断、肝不全の早期予知、脳障
害程度の推定などが示唆された。さらに最近、妊娠中毒
症や腎疾患で血中ＨＧＦ高値が、リウマチで滑液、骨髄
液中ＨＧＦ高値が、各種白血病で骨髄液中ＨＧＦ高値が
認められ、それら疾患におけるＨＧＦ診断意義も議論さ
れている（第１回ＨＧＦ／ＳＦ研究会、１９９４年抄
録）。

【０００３】しかしながら、現在臨床上で実際に使用さ
れているヒトＨＧＦ（以下、「ｈＨＧＦ」と称すること
もある）のＥＬＩＳＡ（Enzyme-Linked Immuno-Sorbent
Assay）による測定法では、その感度が０．２ｎｇ／ｍ
ｌであり、これは健常人血清中のＨＧＦのほぼ平均値で
ある。換言すれば、現在の測定系では、健常人のほぼ半
数の血清中のＨＧＦレベルは、正確に測定できていない
ことになり、従って、健常人のＨＧＦのレベルは０．２
ｎｇ／ｍｌよりも低いと考えられる。また、ＨＧＦは、
種々の組織の再生・修復に関与していることが知られて
いるが、現在の測定系では局所で産生される微量なＨＧ
Ｆの濃度を測定することはできない。従って、さらに高
感度なＨＧＦの測定方法が望まれていた。尚、上記ＥＬ
ＩＳＡに用いられている抗ｈＨＧＦは、ｈＨＧＦで免疫
されたウサギ及びマウスの血清等から得られたものであ
る。

【０００４】ところで、ニワトリ等の鳥類に抗原を免疫
すると、その抗原と結合する特異抗体が黄卵に蓄積さ
れ、細胞培養や動物に免疫して生産するよりも効率が高
いことが知られている（細胞工学第１０巻第７号第５５
３頁〜第５６０頁，１９９１年、及び Nippon Nogeikag
aku Kaishi Vol.67, No.10, P.1421〜P.1432, 1993）。
また、鳥類を用いた作製された抗体は、トランスフォー
ミング成長因子βなど，これまでマウスやウサギなどで
抗体を作ることができなかった蛋白の測定に応用するこ
とができるため、試薬としての需要が出てきている。

【０００５】しかし、このような技術によって抗体を効
率よく生産できるようになったが、従来の方法により得
られる抗体と比べて親和性や特異性の高い抗体が得られ
ることについては知られていない。

【０００６】

【発明が解決しようとする課題】本発明は、従来の方法
では測定できなかったような、高感度なレベルでのＨＧ
Ｆの測定を可能とするために、好感度なＨＧＦの免疫学
的測定法、この方法に好適に用いることができる抗体、
及びこの抗体の製造法を提供することを課題とする。

【０００７】

【課題を解決するための手段】本発明者らは、上記課題
に鑑み鋭意研究を重ねた結果、ＨＧＦを抗原として鳥類
に投与し、該鳥類が産卵した卵の卵黄より得られる肝細
胞増殖因子に対する抗体を取得し、該抗体を使用してＨ
ＧＦを測定すると、従来知られていた方法では測定でき
なかった、さらに高感度なしベルの測定が可能であるこ
とを見出し、本発明を完成するに至った。

【０００８】即ち本発明の要旨は、肝細胞増殖因子で免
疫された鳥類が産卵した卵の卵黄より得られる肝細胞増
殖因子に結合する抗体、肝細胞増殖因子を免疫原として
鳥類に投与し、該鳥類が産卵した卵の卵黄中より肝細胞
増殖因子に結合する抗体を得ることを特徴とする、肝細
胞増殖因子に結合する抗体の製造方法、及び前記肝細砲
増殖因子に結合する抗体を用いることを特徴とする肝細
胞増殖因子の免疫学的測定方法、に存する。

【０００９】

【発明の実施の形態】以下、本発明に関しさらに詳細に
説明する。本発明の抗体は、ＨＧＦに結合する抗体であ
り、ＨＧＦを免疫原として鳥類に投与し、該鳥類が産卵
した卵の卵黄中よりＨＧＦに結合する抗体を得ることに
より製造することができる。鳥類の免疫に用いるＨＧＦ
としては、ＨＧＦを含有することの知られているヒトや
ラット等の哺乳動物由来の体液や組織、または自発的に
ＨＧＦを産生する細胞から単離された天然のＨＧＦでも
よいし、あるいは特開平３−２８５６９３号公報に記載
されているように遺伝子組換え法によりcDNAを細胞に導
入して得られる組換えＨＧＦを用いてもよい。本発明の
抗体を臨床目的に使用する場合は、ＨＧＦとしてはｈＨ
ＧＦが好ましい。

【００１０】また、免疫に用いるＨＧＦは、完全なＨＧ
Ｆの他、その前駆体蛋白質またはポリペプチド部分もし
くは部分ペプチド、あるいは鳥類に投与したときに免疫
源としての活性を損なわない範囲において一部のアミノ
酸を置換、欠失、挿入、修飾するなどの改変を行ったも
のも、使用することができる。かかる改変体としては、
特開平2-288899号公報、WO90/10651号国際公開パンフレ
ット、特開平3-130091号公報、同3-255096号公報、同4-
30000号公報、Nature,342,440‐443(1989)等に記載のも
のが挙げられる。

【００１１】ＨＧＦを投与する鳥類としては、特に限定
はされないが、産卵数が多く、継続的に産卵し、結果的
にＨＧＦに対する特異抗体の産生量が多くなる種が好ま
しく、ニワトリ、ウズラ等が挙げられる。特にニワトリ
は、抗体価が最大の時点で比較を行った場合には、その
卵黄中に蓄積された特異抗体の量が、血清中の特異抗体
の量の10倍以上であることが知られており（Laboratory
Animal science, 42,402-407(1992)）、かつ、養鶏技
術が確立されており大量かつ安価な飼育が可能であるた
め、本発明において好ましい鳥類として挙げられる。

【００１２】次に、本発明においてＨＧＦに対する抗体
を得る方法について述べる。まず、鳥類にＨＧＦを投与
する。この際、必要に応じてＨＧＦをアジュバントとと
もに投与する。接種にあたっては、鳥類の脚部、胸部等
へ皮下注射、筋肉注射等を行うことが好ましいが、鳥類
の健康を損なうものでなければ特に限定はされない。一
般的には、注射の容易さ、及び鳥類の健康に対する影響
等の理由から、皮下注射が好ましい。１回当たりの抗原
の摂取量は、抗体価が上昇し、鳥類の健康を損ねない範
囲であれば特に限定はされないが具体的には、０．０１
ｍｇ〜１０ｍｇ程度が好ましい。このようにして免疫を
行った鳥類の卵の卵黄中には、数週間以内に特異抗体が
産生される。なお、特異抗体産生の持続には２週間程度
の間隔で、さらに免疫を繰り返すことが望ましい。

【００１３】上記のようにして免疫を行った鳥類の卵の
卵黄中から抗体を抽出する。まず鳥類の卵から卵黄を分
離し、その卵黄からリポ蛋白質および脂質を除去する。
卵黄からリポ蛋白質および脂質を除去する方法としては
ジエチルエーテル、クロロホルム等の有機溶剤処理によ
り抽出する方法や、ラムダ（λ）−カラギーナン（特開
昭64−38098号公報）等の天然多糖類による処理によっ
て抽出する方法等が挙げられる。

【００１４】目的の抗体を効率よく蓄積している卵黄を
選択するためには、鳥類から毎朝卵を採取し、各々の卵
黄について上記と同様にしてリポ蛋白質および脂質を除
去し、得られた溶液の抗ＨＧＦ抗体価を測定し、最も抗
体価の高いものを選択すればよい。

【００１５】このようにして得られた卵黄の脱リポ蛋白
質・脂質溶液に対して、飽和硫酸アンモニウム水溶液を
加えて塩析沈降を行うか、ポリエチレングリコール等の
高分子を加えて抗体（ＩｇＹ）を凝集させ、遠心分離に
より回収し、生理的リン酸緩衝液等に溶解することで粗
精製抗体が得られる。粗精製抗体からのＨＧＦに対する
特異抗体の精製は、常法に従って、硫酸アンモニウム分
画、塩析、ゲル濾過法、イオン交換クロマトグラフィ
ー、ＨＧＦカラムクロマトグラフィー等のアフィニティ
ークロマトグラフィー等により精製して、精製抗体とす
ることができる。

【００１６】上記のような方法により得られた抗ＨＧＦ
抗体は、ＨＧＦの高感度測定に好適に使用することがで
きる。測定法としては、抗原を免疫学的に測定するのに
通常用いられている方法、例えば競合法やサンドイッチ
法等による酵素免疫測定法（ＥＩＡ法、ＥＬＩＳＡ
法）、蛍光免疫測定法（ＦＩＡ法）またはラジオイムノ
アッセイ（ＲＩＡ法）、あるいは凝集法等を適用するこ
とができる。これらの各方法の操作、手順等は常法に従
って行えばよい。特に本発明においては、「Ｆａｂ’化
酵素標識法」（石川 榮治著、「酵素標識法」、学会出
版センター、１９９１年）に記載されている方法が好ま
しいものとして挙げられる。本発明の抗体をサンドイッ
チ法に用いる場合には、本発明の抗体とともに、本発明
の抗体以外の従来知られている抗ＨＧＦ抗体を用いても
よい。

【００１７】具体的には、例えば、抗体をペプシン処理
してＦａｂ’フラグメントを調製し、これにチオール基
を付加し、マレイミド化したβ−Ｄ−ガラクトシダーゼ
等の酵素又はビオチン等のタンパク質と反応させること
によって、Ｆａｂ’フラグメントと酵素とを結合する。
得られた酵素標識抗体は、通常の酵素免疫測定法と同様
にしてＨＧＦの測定又は検出に使用することができる。

【００１８】本発明の抗体を用いてＨＧＦを測定する際
に用いる溶媒、反応条件等は、抗原抗体反応やそれに伴
う反応に悪影響を与えない限りは、通常使用されるいず
れの溶媒、反応条件を用いることができる。

【００１９】本発明のＨＧＦの測定法において、ＨＧＦ
を測定する検体としては、血清または血漿等の血液成分
が好ましいが、他に細胞組織液、リンパ液、胸腺水、腹
水、羊水、胃液、尿、膵臓液、骨髄液、唾液等の各種体
液を使用することができる。とくに、本発明において
は、従来よりも高感度の測定が可能であるため、尿中の
ＨＧＦレベルの測定が可能となり、各種腎疾患、泌尿器
科系の疾患の診断や予後判定に応用可能であり、唾液中
のＨＧＦレベルの高感度測定により、各種唾液腺疾患の
診断や予後判定に応用可能である。さらに、歯肉溝浸出
液のＨＧＦレベルの測定が可能となるため、歯肉炎（歯
槽膿漏）の診断や予後判定に応用可能である。また、健
常人の血清レベルを正確に測定することが可能となるた
め、現在はマスクされている肝疾患以外の疾患、例え
ば、動脈硬化症、心筋梗塞などの診断に適用可能であ
る。

【００２０】

【実施例】以下、実施例を挙げて本発明をさらに詳細に
説明するが、本発明は以下の実施例に限定されるもので
はない。

【００２１】

【実施例１】抗肝細胞増殖因子抗体（抗ｈＨＧＦ抗体）
の製造 ＜１＞ヒト肝細胞増殖因子（ｈＨＧＦ）による鶏の免疫 0.443mg組み換えヒト肝細胞増殖因子（ｒｈＨＧＦ）
（特開平３−７２８８３号公報に記載の方法により製造
した。以下、単に「ｈＨＧＦ」ともいう）を20mMナトリ
ウムリン酸緩衝液（pH7.2、O.1M NaCl及び0.013% Trito
n X-100を含む）に溶解した溶液１mlと1.5mlのアジュバ
ント（TiterMax, Norcross, GA）を混合し、シリンジに
て乳化させた。

【００２２】上記混合液を、一羽の鶏（ホワイトレグホ
ン(White Leghorn)、雌、２８週齢）の皮下に注入する
ことにより免疫した。二週間後、上記と同様の緩衝液に
等量のｈＨＧＦを含む溶液を皮下に注入することによ
り、免疫増強を行った。さらに、最初の免疫から一カ月
後、同様の方法にて再度免疫増強を行った。その後、毎
朝鶏卵を採取し、そのｈＨＧＦに対する抗体価を次に述
べる方法で測定した。

【００２３】＜２＞抗体価の測定 10ngのｒｈＨＧＦを含むリン酸緩衝液（Mg²⁺、Ca²⁺を含
まないが137mM NaClを含む：以下、「PBS(-)」という）
100μlを９６ウェルプレートの各ウェルに入れた。一時
間室温で放置した後、0.05% Tween20 を含むPBS(-)にて
５回洗浄した。次に、4％スキムミルク／PBS(-)を各ウ
ェルに200μlずつ入れ、一時間室温で放置してブロッキ
ングを行った後、各ウェルを0.05% Tween20 を含むPBS
(-)にて５回洗浄した。

【００２４】一方、鶏卵よりキムワイプを用いて卵黄を
分離し、10mlの蒸留水を加えた後ホモジネートを行っ
た。10mlの0.5% λ−カラギーナンを加え、30分間放置
した後、４℃、10,000×gにて１５分間遠心した後、上
清を採取し −20℃で凍結保存した。１ヶ月放置後、４
℃、10,000×gにて再度１５分間遠心して上清を採取し
た。

【００２５】上記の上清を4％スキムミルク／PBS(-)で1
000倍に希釈し、上記のプレートの各ウェルに100μlず
つ入れ、37℃で一時間インキュベートした。各ウェルを
0.05％ Tween20 を含むPBS(-)にて５回洗浄し、４％ス
キムミルク/PBS(-)で1000倍に希釈したペルオキシダー
ゼ結合ウサギ抗ニワトリＩｇＹ抗体（Biomakor社）を、
各ウェルに100μl づつ入れ、37℃で一時間インキュベ
ーションした。 次に、各ウェルを0.05% Tween20を含
むPBS(-)にて５回洗浄し、0.015%過酸化水素水及び0.05
% o‐フェニレンジアミンを含む0.486Mクエン酸−0.103
Mリン酸水素二ナトリウムを100μl加えた。30℃で10分
間反応させた後、100μlの１Ｎ硫酸を加え、反応停止を
行った。

【００２６】マイクロプレートリーダーにて、各反応液
について、620nmの吸収を対照にしながら492nmの吸光度
を測定した。その結果、２回目の免疫後、約３週間でそ
の抗体価がプラトーに達した。また、この活性は約五ヶ
月間継続し、その後減少した。

【００２７】＜３＞鶏卵抗体（ＩｇＹ）の精製 上記のようにして抗ｈＨＧＦ抗体価が確認された鶏卵由
来のλ−カラギーナン画分（卵８個分、320ml）を、等
量の20mMリン酸ナトリウム緩衝液（pH8.0）と混合し、2
0mMリン酸ナトリウム緩衝液（pH8.0）にて平衡化したDE
52カラム（5×10cm、Whattman）にかけ、4000mlの200mM
リン酸ナトリウム緩衝液（pH8.0）にて洗浄した後、200
mlの200 mMリン酸ナトリウム緩衝液（pH8.0）にて溶出
し、10mlづつ分画した。各画分の280nmの吸光度を測
り、タンパクの溶出を確認した。

【００２８】ピークを含む７画分を集め、１４ｇの硫酸
アンモニウムを加えた。11.4℃、３０分間スターラーに
て撹拌した後、10,000×にて３０分間遠心を行った。沈
殿を60mlの100mMリン酸ナトリウム緩衝液（pH8.0）に溶
解した後、９ｇの硫酸アンモニウムを加えた。４℃、３
０分間スターラーにて撹拌した後、10,000×gにて３０
分間遠心を行った。再び、沈殿を60mlの100mMリン酸ナ
トリウム緩衝液（pH8.0）に溶解した後、９ｇの硫酸ア
ンモニウムを加えた。４℃、３０分間スターラーにて撹
拌した後、10,000×gにて３０分間遠心を行った。得ら
れた沈殿を20mlの20mMリン酸ナトリウム緩衝液（pH8.
0）にて溶解し、ＩｇＹ画分とした。

【００２９】＜４＞抗ヒト肝細胞増殖因子（ｈＨＧＦ）
Ｆａｂ’フラグメントの調製 上記で得られたＩｇＹ画分の溶液を、50mM酢酸ナトリウ
ム緩衝液（pH4.2）に対して透析を一晩行った。pH試験
紙にて透析が完了したことを確認した後、終濃度10mg/m
lになるように50mM酢酸ナトリウム緩衝液（pH4.2）にて
希釈した。これに0.25mlの10mg/mlペプシン（475 units
/mg、Sigma社）を加え、４℃で９時間放置した後、10μ
lの 25μg/μlペプスタチンＡ（protein research foun
dation社）を加え、２０分、37℃ でインキュベーショ
ンし反応を止めた。

【００３０】ペプシン消化により生じたＩｇＹのＦａ
ｂ’フラグメントと小さなべプチドに裁断されたＦｃフ
ラグメントを分けるため、UltroGeI AcA44（Biosepra I
nc.社）力ラム（2.1×40cm）にてゲル濾過を行った。2.
2ｍｌずつ分画し、280nmの吸光度を測定した。二つのピ
ークが認められ、最初のピークを含む１３画分を集め
た。こうして得られた抗ｈＨＧＦ−Ｆａｂ’画分を、次
に示すようにしてアフィニティークロマトグラフィーに
よりさらに精製した。

【００３１】アフィニティーカラムは次のようにして調
製した。CNBr活性化セファロース（CNBr-activated Sep
harose4B、Pharmacia LKB Biotechnology、Tokyo）0.33
gを１mlの１mM HClにて１５分間膨潤させた。このゲル
懸濁液500μlに、10 mg/mlのｒｈＨＧＦをカップリング
緩衝液（0.5M NaCIを含む0.1M NaCO₃）で終濃度2mg/ml
に希釈した溶液１mlを加えた。室温で２時間、揺すりな
がらインキュベートした後、ゲルを10mlの0.2Mグリシン
緩衝液（pH8.0）に移し、４℃で一晩インキュベートし
反応を止めた。

【００３２】10mlのカップリング緩衝液で上記ゲルを洗
浄した後、5mlの0.5M NaCIを含む0.1M酢酸ナトリウム緩
衝液（pH4.0）で洗浄して共有結合していないｒｈＨＧ
Ｆを除いた。再び10mlのカップリング緩衝液でゲルを洗
浄した後、１mlのシリンジに詰め、ｈＨＧＦアフイニテ
ィーカラムを得た。

【００３３】上記の抗ｈＨＧＦ−Ｆａｂ’画分55mlをｈ
ＨＧＦアフイニティーカラムにかけた。素通りした溶液
を再度力ラムにかけ、これをもう２回繰り返した。20ml
のカップリング緩衝液で、力ラムに吸着していない Ｆ
ａｂ’を洗い流した。次に、10mlの2.5Mグアニジン塩酸
を含む0.1Mリン酸ナトリウム緩衝液（pH7.0）にて、カ
ラムに特異的に吸着した Ｆａｂ’を溶出させた。溶出
液を１mlずつ分画し、280mm の吸光度を測定した。第３
〜第７画分にピークが含まれていたので、これらの画分
を採取し、centricon-10（Amicon社）にて約１mg/mlに
なるまで濃縮し、0.1Mリン酸ナトリウム緩衝液（pH7.
0）に対して透析を行った。以上のようにして、抗ｈＨ
ＧＦ−Ｆａｂ’フラグメントを得た。

【００３４】

【実施例２】血清中のヒト抗肝細胞増殖因子（ｈＨＧ
Ｆ）の測定 実施例１で得られた抗ｈＨＧＦ−Ｆａｂ’フラグメント
を用いて、血清中のｈＨＧＦの測定を行った。

【００３５】＜１＞β−D−ガラクトシダーゼ標識抗ｈ
ＨＧＦ−Ｆａｂ’の調製 （１）チオール基付加抗ｈＨＧＦ−Ｆａｂ’の調製 570μgの抗ｈＨＧＦ−Ｆａｂ’を500μlの0.1Mリン酸ナ
トリウム緩衝液（pH7.0）に溶解し、４mM Ｎ−スクシニ
ミジル−Ｓ−アセチルチオアセテート（SATA）を溶解し
たＮ，Ｎ’−ジメチルホルムアミド（DMF）溶液26.3μl
を加え、30℃で３０分間インキュベートした。この溶液
に、25μlの100mM EDTA(pH7.0)、50μlの1M Tris-HCl(p
H7.0)、及び13μlの4Mヒドロキシルアミン塩酸(pH7.0)
を加え、３０分間放置することにより反応を止めた。

【００３６】5mlのスピンカラムに、5mM EDTAを含む0.1
Mリン酸ナトリウム緩衝液（pH6.0）（以下、「PB-EDT
A」という)にて平衡化したセファデックス（Sephadex）
G‐50fine（Pharmacia LKB Biotechnology、Tokyo）を
充填し、これを用いて上記の溶液のゲル濾過を行い、低
分子量の物質を除いた。素通り画分の重さを測定するこ
とにより容量を測定し、280nmの吸光度を測定すること
によりチオール化Ｆａｂ’の濃度を測定した。その結
果、11.7nmol/mlであった。尚、濃度の計算には、次式
を用いた。

【００３７】E_280nm＝1.5g^-1・l・cm^-1

【００３８】また、次に示すようにしてSATAにより付加
されたチオール基の量をはかり、Ｆａｂ’一分子あたり
導入されたチオール基の分子数を測定した。PB-EDTAに
て、素通り画分を10倍に希釈して500μlとし、324nmの
吸光度を測定した。この希釈液に20μlの5mM 4，4’‐
ジチオジピリジンを加え室温で５分間インキュベートし
た後、324nmの吸光度を測定した。この値から、インキ
ュベート前に測定した324nmの吸光度を引き、Ｆａｂ’
一分子あたりのチオール基の数を計算した。チオール基
の濃度の計算には、次式を用いた。その結果、Ｆａｂ’
一分子あたり、導入されたチオール基は1.0 個であっ
た。

【００３９】E_324nm＝1.19,800mol^-1・l・cm^-1

【００４０】（２）マレイミド化β−D−ガラクトシダ
ーゼの調製 5mgのβ−D−ガラクトシダーゼ（Boehringer社）を520
μlのPB-EDTAに溶かした。この溶液10μlをとり、50倍
希釈し 280nmの吸光度を測ることで正確な濃度を測定し
た。このβ−Dガラクトシダーゼ溶液470μlと、25μlの
60mM O-フェニレンジマレイミド/DMFを混合し、30℃で
２０分間インキュベートした。この反応液に100μlのPB
-EDTAを加えた後、前記と同様にスピンカラムを用いて
ゲル濾過を行い、低分子量の物質を除いた。得られた素
通り画分のうち10μlは、β−D−ガラクトシダーゼ活性
を測定し、50μlはマレイミド基を測定するのに用い
た。

【００４１】β−D−ガラクトシダーゼに導入されたマ
レイミド基の定量は、次のようにして行った。素通り画
分を15倍希釈した後、280mmの吸光度を測り、β−D−ガ
ラクトシダーゼ濃度を計算した結果、11.4nmol/mlであ
った。尚、濃度の計算には、次式を用いた。

【００４２】E_280nm＝2.09g^-1・l・cm^-1

【００４３】15倍希釈した素通り画分の324nmの吸光度
を測り、この値を（a）とした。一方、450μlのPB-EDT
A、または450μlの15倍希釈した素通り画分に、50μlの
50mMメルカプトエチルアミン／PB-EDTAを加え、30℃で
２０分間放置した。これに20μlの5mM 4,4'-ジチオジピ
リジンを加え、室温で５分間インキュベートした。324
nnn の吸光度を測定し、PB‐EDTA、及び15倍希釈した素
通り画分のそれぞれの値を（b）及び（c）とした。

【００４４】15倍希釈した素通り画分から先に求めたβ
−D−ガラクトシダーゼが持っている324nmの値(a)を引
き、次式に基づいてチオール基の数を計算した。

【００４５】E_324nm＝19,800mol・l・cm^-1

【００４６】そして、マレイミド基に結合したメルカプ
トエチルアミンの量を間接的に計算することにより、β
−D−ガラクトシダーゼに付加されたマレイミド基の量
を側定した。即ち、計算式は以下の通りである。

【００４７】 マレイミド基の濃度（M）＝{b-(c-a)}×19,800×15

【００４８】先に求めたβ−D−ガラクトシダーゼの濃
度から、β−D−ガラクトシダーゼ一分子あたりのマレ
イミド基の数を計算した。結果はβ−D−ガラクトシダ
ーゼ一分子あたり14.5個であった。

【００４９】（３）マレイミド化β−D−ガラクトシダ
ーゼとチオール基付加抗ｈＨＧＦ−Ｆａｂ’の結合 580μlの11.7nmol/mlチオール基付加抗ｈＨＧＦ−Ｆａ
ｂ’に121μlのPB-EDTAを加えた後、149μlのマレイミ
ド化β−D−ガラクトシダーゼを加え、4℃で２０時間イ
ンキュベートした。これに、100mMメルカプトエチルア
ミン／PB-DTAを10μl加え、30℃で5分間インキュベート
し、余ったマレイミド基とメルカプトエチルアミンのチ
オール基を反応させた。続いて、100mM Ｎ−エチルマレ
イミド／PB-EDTAを20μl加えてインキュベーションする
ことにより、余分なチオール基をＮ−エチルマレイミド
と反応させた。

【００５０】0.1g/L ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）、1
mM MgCl₂及び1g/Lのアジ化ナトリウムを含む10mMリン酸
ナトリウム緩衝液（pH7.0）（1/10 buffer A)にて平衡
化したUltrogel AcA22力ラム（1.5×60cm）に、上記の
反応液をかけた。溶出液を１mlずつ分画し、それぞれの
画分の280mmの吸光度、及び下記に述べる方法でガラク
トシダーゼ活性を測定した。ガラクトシダーゼ活性の測
定は、各画分を 0.1% BSA、1mM MgCl₂及び0.1％のアジ
化ナトリウムを含む10mMリン酸ナトリウム緩衝液（pH7.
0）（Buffer A）にて10,000 倍希釈した後、この希釈溶
液100μlに50μlの0.3mM ４‐メチルウンベリフェリル
−β−Ｄ−ガラクトシドを加え、30 ℃で１０分間イン
キュベートした後、50μlの0.1Mグリシン緩衝液（pH 1
0.9）と３μlの8N NaOHを加え、30分間30℃でインキュ
ベートして反応を止め、蛍光光度計を用い、355nmの励
起波長及び460nmの蛍光波長にて測定することにより行
った。第６０〜第７１分画を集め、β−D−ガラクトシ
ダーゼ結合抗ｈＨＧＦ−Ｆａｂ’溶液を得た。

【００５１】＜２＞血清中のｈＨＧＦの測定 ２μg/mlマウス抗ｈＨＧＦ単クローン抗体（大塚製薬
(株)）／PBS(-)を、96ウェルプレート（Maxisorp, Nun
c）の各ウェルに100μlずつ入れ、室温で４時間放置し
た後、0.05% Tween20を含むPBS(-)にて５回洗浄した。
これに、250μlの1%BSA を加え、一晩インキュベートす
ることによりブロッキングを行った。この後、0.05% Tw
een20 を含むPBS(-)にて５回洗浄した。

【００５２】ｈＨＧＦ測定キット（大塚アッセイ）に添
付してあるリン酸緩衝液50μlを上記プレートの各ウェ
ルに加えた。さらに、各ウェルに、ｈＨＧＦ測定キット
に添付してあるリン酸緩衝液にて希釈したｈＨＧＦ標準
液、または血清サンプルを50μl加え、揺すりながら室
温で１時間インキュベートした後、0.05% Tween20 を含
むPBS(-)にて５回洗浄した。上記操作は、ｈＨＧＦ標準
液については６連で、血清サンプルについては２連で行
った。

【００５３】前記のβ−D−ガラクトシダーゼ結合抗ｈ
ＨＧＦ−Ｆａｂ’を、β−D−ガラクトシダーゼ活性測
定により求めた各画分の濃度から、β−D−ガラクトシ
ダーゼの濃度として100、300、及び1000 fmol（ガラク
トシダーゼ）／100μl−0.01Mリン酸ナトリウム緩衝液
（pH7.4、10μg/mlヒトIgG、１％マウス血清、0.15M Na
Cl、0.1% CHAPS（3-[(3-cholamidepropyl)dimethylammo
nio]-1-propanesulfonate）、0.1 % BSA、0.1% Tween20
を含む）となるように希釈し、ｈＨＧＦ標準液の各希釈
系列２連づつに各々の濃度のβ−D−ガラクトシダーゼ
結合抗ｈＨＧＦ−Ｆａｂ’を加え、揺すりながら室温で
一時間インキュベートした。また、血清サンプルについ
ては、100 fmolに希釈したβ−D−ガラクトシダーゼ結
合抗ｈＨＧＦ−Ｆａｂ’を加え、同様にインキュベート
した。

【００５４】次に、各ウェルを0.05% Tween20を含むpBS
(-)にて５回洗浄し、基質として、100μlのBuffer A及
び50μlの0.3mM ４−メチルウンベリフェリル−β−D−
ガラクトシドを各ウェルに加え、30℃で２０時間インキ
ュベートした。反応を止めるため、50μlの0.1Mグリシ
ン緩衝液（pH 10.9）と3μlの8N NaOHを加え、３０分
間、30℃でインキュベーションを行った。蛍光光度計を
用い、355nmの励起波長及び、460nmの蛍光波長にて測定
した。ｈＨＧＦ標準液についての結果を表１及び図１
に、血清サンプルについての結果を、表２及び図２に示
す。この結果から明らかなように、本発明の抗体を用い
ると、従来法による測定感度（0.2ng/ml）よりも高感度
でＨＧＦを測定することができる。

【００５５】

【表１】 表１ ────────────────────────── β-D-カ゛ラクトシタ゛ーセ゛結合抗hHGF-Fab'濃度 (100 fmol) (300 fmol) (1000 fmol) ────────────────────────── hHGF(ng/ml) 蛍光強度 ────────────────────────── 0.000 0.66 0.93 1.69 0.000 0.76 0.86 1.58 0.004 0.87 1.00 2.02 0.004 0.76 0.97 1.82 0.020 1.03 1.04 3.25 0.020 0.84 1.34 3.07 0.196 3.43 5.82 13.91 0.196 3.49 7.05 14.23 ──────────────────────────

【００５６】

【表２】

【００５７】次に、肝硬変患者及び健常者各２名から血
液を採取し、血清またはその希釈液５０μｌを試料とし
て、上記と同様の反応を行った。尚、β−D−ガラクト
シダーゼ結合抗ｈＨＧＦ−Ｆａｂ’は100 fmolに希釈し
たものを用いた。測定した蛍光強度から、図２の標準曲
線を用いてｈＨＧＦの濃度を読みとった。その結果を表
３に示す。この結果から、本発明の抗体を用いると、希
釈倍率に応じた測定値が得られ、この抗体はｈＨＧＦに
高い特異性を有しているといえる。

【００５８】

【表３】

【００５９】

【発明の効果】本発明によれば、ＨＧＦに対する卵黄抗
体を得ることができ、この抗体を使用することにより、
従来よりも高感度なＨＧＦの測定系を確立することがで
きる。本発明のＨＧＦの測定法は、尿中のＨＧＦレベル
の測定等により、各種腎疾患、泌尿器系の疾患の診断や
予後判定に、唾液中のＨＧＦレベルの測定により、各種
唾液腺疾患の診断や予後判定に、さらに、歯肉溝浸出液
のＨＧＦレベルの測定により、歯肉炎の診断や予後判定
に応用可能である。また、現在はマスクされている肝疾
患以外の疾患の診断にも適用可能である。

【図面の簡単な説明】

【図１】 標準液のｈＨＧＦ濃度と蛍光強度との関係を
示す図。■、○及び●は、β−Ｄ−ガラクトシダーゼ結
合抗ｈＨＧＦ−Ｆａｂ’の濃度が各々100fmol、300fmo
l、及び1000fmolであることを示す。

【図２】 血清中のｈＨＧＦ濃度と蛍光強度との関係を
示す標準曲線。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 橋田 誠一 宮崎県宮崎市学園木花台南３丁目７番地６

Claims (4)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 肝細胞増殖因子で免疫された鳥類が産卵
   した卵の卵黄より得られる肝細胞増殖因子に結合する抗
   体。
2. 【請求項２】 前記肝細胞増殖因子が、ヒトの肝細胞増
   殖因子である請求項１記載の抗体。
3. 【請求項３】 肝細胞増殖因子を免疫原として鳥類に投
   与し、該鳥類が産卵した卵の卵黄中より肝細胞増殖因子
   に結合する抗体を得ることを特徴とする、肝細胞増殖因
   子に結合する抗体の製造方法。
4. 【請求項４】 請求項１記載の肝細砲増殖因子に結合す
   る抗体を用いることを特徴とする肝細胞増殖因子の免疫
   学的測定方法。